DE60038495T2 - Oligonukleotid n3'-p5' thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung - Google Patents

Oligonukleotid n3'-p5' thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung Download PDF

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    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide mit einem neuartigen Zucker-Phosphat-Grundgerüst, welche Internukleosid 3'-NHP(O)(S)O-5' Verbindungen enthalten. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Zusammensetzungen, ihre Verwendung als diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe und Verfahren zum Synthetisieren von Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Nukleinsäurepolymerchemie hat eine entscheidende Rolle in vielen sich entwickelnden Technologien in den pharmazeutischen, diagnostischen und analytischen Bereichen und insbesondere in den Unterbereichen von Antisense- und Antigen-Therapeutika, kombinatorischer Chemie, verzweigter DNA Signal-Amplifikation und Array-basierten DNA-Diagnostika und Analyse gespielt (z. B. Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews, 90: 543–584, 1990; Milligan et al., J. Med. Chem. 36: 1923–1937, 1993; DeMesmaeker et al., Current Opinion in Structural Biology, 5: 343–355, 1995; Roush, Science, 276: 1192–1193, 1997; Thuong et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 666–690, 1993; Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89: 5381–5383, 1992; Gold et al., Ann. Rev. Biochem., 64: 763–797, 1995; Gallop et al., J. Med. Chem. 37: 1233–1258, 1994; Gordon et al., J. Med. Chem. 37: 1385–1401, 1994; Gryaznov, Internationale Anmeldung PCT/US94/07557; Urdea et al., U.S.-Pat. Nr. 5124246 ; Southern et al., Genomics, 13: 1008–1017, 1992; McGall et al., U.S.-Pat. Nr. 5412087 ; Fodor et al., U.S.-Pat. Nr. 5424186 ; Pirrung et al., U.S.-Pat. Nr. 5405783 ).
  • Viel von dieser Chemie ist darauf gerichtet worden, die Bindungsstärke, Spezifität und die Nukleaseresistenz von natürlichen Nukleinsäure-Polymeren wie DNA zu verbessern. Unglücklicherweise beziehen Verbesserungen in einer Eigenschaft, wie Nukleaseresistenz, häufig Trade-Offs gegen andere Eigenschaften wie Bindungsstärke ein. Beispiele für solche Trade-Offs sind reichlich vorhanden: Peptidnukleinsäuren (PNAs) zeigen gute Nukleaseresistenz und Bindungsstärke, haben aber verringerte zelluläre Aufnahme in Testkulturen (z. B. Hanvey et al., Science, 258: 1481–1485, 1992); Phosphorthioate zeigen gute Nukleaseresistenz und Löslichkeit, aber werden typischerweise als P-chirale Gemi sche synthetisiert und zeigen mehrere Sequenz-unspezifische biologische Wirkungen (z. B. Stein et al., Science, 261: 1004–1012, 1993); Methylphosphonate zeigen gute Nukleaseresistenz und zelluläre Aufnahme, aber werden ebenfalls typischerweise als P-chirale Gemische synthetisiert und haben verringerte Duplex-Stabilität (z. B. Mesmaeker et al. (oben zitiert); und so weiter.
  • Kürzlich ist eine neue Klasse von Oligonukleotid-Analog mit sogenannten N3'->P5' Phosphoramidat-Internukleosid-Verbindungen entwickelt worden, welche vorteilhafte Bindungseigenschaften, Nukleaseresistenz und Löslichkeit zeigen (Gryaznov und Letsinger, Nucleic Acids Research, 20: 3403–3409, 1992; Chen et al., Nucleic Acids Research, 23: 2661–2668, 1995; Gryaznov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5798–5802, 1995; und Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc., 116: 3143–3144, 1994). Phosphoramidatverbindungen enthalten eine 3'-Aminogruppe an jedem der 2'-Deoxyfuranosenukleosidreste, welche ein 3'-Sauerstoffatom ersetzen. Die Synthese und Eigenschaften von Oligonukleotid N3'->P5' Phosphoramidaten werden ebenfalls in Gryaznov et al., U.S.-Pat. Nr. 5591607 ; 5599922 ; 5726297 ; und Hirschbein et al., U.S.-Pat. 5824793 beschrieben.
  • Die Oligonukleotid N3'->P5' Phosphoramidate bilden ungewöhnlich stabile Duplexe mit komplementärer DNA und insbesondere RNA-Strängen, als auch stabile Triplexe mit DNA-Duplexen, und sie sind ebenfalls resistent gegen Nukleasen (Chen et al., Nucleic Acids Research, 23: 2661–2668, 1995; Gryaznov et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 5798–5802 1995). Darüber hinaus sind Oligonukleotid N3'->P5' Phosphoramidate wirkkräftigere Antisense-Wirkstoffe, als Phosphorthioatderivate, sowohl in vitro, als auch in vivo (Skorski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 3966–3971, 1997). Zur gleichen Zeit haben die Phosphoramidate offenbar eine niedrige Affinität zu den intra- und extrazellulären Proteinen und erhöhte Säureanfälligkeit bezogen auf die natürlichen Phosphodiester-Gegenstücke (Gryaznov et al., Nucleic Acids Research, 24: 1508–1514, 1996). Diese Merkmale der Oligonukleotid-Phosphoramidate beeinträchtigen potentiell nachteilig ihre pharmakologischen Eigenschaften für einige Anwendungen. Insbesondere ist die Säurestabilität eines Oligonukleotids eine wichtige Qualität wenn gewünscht wird, Oligonukleotid-Wirkstoffe als orale Therapeutika zu verwenden.
  • Um die oben beschriebenen Probleme in Verbindung mit Oligonukleotid-Analoga zu umgehen, wurde eine neue Klasse von Verbindungen gesucht, die die besten Kennzeichen von sowohl Oligonukleotid-Phosphoramidaten, als auch Phosphorthioaten verkörpert. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Synthese, Eigenschaften und Verwendungen von Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidaten.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf Polynukleotide mit aneinander grenzenden Nukleosid-Untereinheiten, verbunden durch Interuntereinheit-Verbindungen. In den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung sind mindestens zwei aneinander grenzende Untereinheiten durch eine N3'->P5 Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindung verbunden, definiert durch die Formel 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5', worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung steht R für Wasserstoff oder ein Salz davon. Die Polynukleotide der Erfindung können so zusammengesetzt sein, dass alle Interuntereinheit-Verbindungen N3'->P5' Thiophosphoramidat sind. Alternativ können die Polynukleotide der Erfindung eine zweite Klasse von Interuntereinheit-Verbindungen enthalten, wie Phosphodiester, Phosphotriester, Methylphosphonat, P'3->N5' Phosphoramidat, N'3->P5' Phosphoramidat und Phosphorthioat-Verbindungen. Die Verbindungen der Erfindung können Telomeraseaktivität um mindestens 10% hemmen oder verringeren, verglichen mit einer Kontrolle, in welcher das Enzym nicht mit dem Oligonukleotid behandelt wird.
  • Eine beispielhafte N3'->P5' Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindung hat die Formel:
    Figure 00030001
    worin B ein Purin oder Pyrimidin oder ein Analog davon darstellt; Z für SR steht, worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl und Aryl und ihren Salzen; und R1 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, O-R2, S-R2 und Halogen, worin R2 für H, Alkyl oder (CH2)nW(CH2)mH steht, wo n zwischen 1–10 ist, m zwischen 0–10 ist und W für O, S oder NH steht. Die Nukleosid-Untereinheiten, welche die Polynukleotide bilden, können ausgewählt werden, in einer definierten Sequenz zu sein: wie eine Sequenz von Basen, komplementär zu einer Einzelstrang-Nukleinsäure-Zielsequenz oder eine Sequenz, die Bildung einer Triplex-Struktur zwischen dem Polynukleotid und einem Zielduplex ermöglichen wird. Die Nukleosid-Untereinheiten, verbunden durch mindestens eine N3'->P5' Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindung wie oben beschrieben, haben überlegene Resistenz gegen Säurehydrolyse, behalten jedoch die gleiche thermische Stabilität bei, verglichen mit Oligonukleotiden mit Phosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls ein Verfahren zum Synthetisieren eines Oligonucleotid N3'-P5' Thiophosphoramidats ein. In diesem Verfahren wird ein erstes Nukleosid 5'-Succinyl-3'-aminotrityl-2',3'-dideoxynukleosid an einen Festphasenträger gebunden. Das erste Nukleosid hat zusätzlich eine geschützte 3'-Aminogruppe. Die geschützte 3'-Aminogruppe wird dann entschützt, um eine freie 3'-Aminogruppe zu bilden, zu welcher ein zweites Nukleosid hinzugefügt wird. Die freie 3'-Aminogruppe des ersten Nukleosids wird mit einem 3'-geschützten Aminonukleosid-5'-O-cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphoramidit-Monomer umgesetzt, um eine Internukleosid N3'->P5' Phosphoramidit-Verbindung zu bilden. Die Internukleasid-Phosphoramidit-Gruppe wird dann mit Schwefel behandelt, um eine N3'->P5' Thiophosphoramidat-Internukleasid-Verbindung zwischen den ersten und zweiten Nukleosiden zu bilden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Hybridisieren eines Thiophosphoramidat-Oligonukleotids der Erfindung an ein DNA- oder RNA-Ziel vorgesehen. Das Thiophosphoramidat-Polynukleotid umfasst eine Sequenz aus Nukleosid-Untereinheiten, verbunden durch mindestens eine Untereinheit, definiert durch die Formel:
    Figure 00050001
    worin B ein Purin oder Pyrimidin oder ein Analog davon darstellt; Z für SR steht und R1 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, O-R2, S-R2 und Halogen, worin R2 für H, Alkyl oder (CH2)nW(CH2)mH steht, wo n zwischen 1–10 ist, m zwischen 0–10 ist und W für O, S oder NH steht. Das Thiophosphoramidat-Polynukleotid wird mit dem RNA-Ziel kontaktiert, um Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen dem Polynukleotid und dem RNA-Ziel zu ermöglichen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen und Kits ein, welche ein Polynukleotid mit mindestens einer N3'->P5' Thiophosphoramidat-Verbindung wie oben beschrieben einschließen. Die Oligonukleotide der Erfindung sind besonders brauchbar in oralen therapeutischen Anwendungen, basierend auf Hybridisierung, wie Antigen- und Antisense-Anwendungen, einschließlich der Hemmung von Telomeraseenzymaktivität.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die vorhergehenden Aspekte und viele der dazugehörigen Vorteile dieser Erfindung werden leichter anerkannt werden, wenn selbige durch Verweis auf die folgende detaillierte Beschreibung besser verstanden werden, wenn sie mit den begleitenden Zeichnungen zusammen genommen werden, worin:
  • 1A die Internukleosid-Verbindungsstruktur von Oligonukleotid-Phosphorthioaten zeigt;
  • 1B die Internukleosid-Verbindungsstruktur von Oligonukleotid-Phosphoramidaten zeigt;
  • 1C die Internukleosid-Verbindungsstruktur von beispielhaften Oligonukleotid-Thiophosphoramidaten der Erfindung zeigt.
  • 2 zeigt eine schematische Skizze der schrittweisen Synthese von gleichförmig modifizierten Oligonukleotid-Thiophosphoramidaten.
  • 3 zeigt eine schematische Skizze der Umwandlung eines Dinukleotid-Thiophosphoramidats in sein Phosphoramidat-Gegenstück, als auch die sich aus der Hydrolyse des Dinukleotid-Thiophosphoramidats ergebenden Produkte.
  • 4 zeigt die Ergebnisse eines in vitro Telomerasehemmungstests, durchgeführt unter Verwendung von steigenden Mengen von Thiophosphoramidat-Oligonukleotid von SEQ I.D. Nr. 2, das komplementär zu Telomerase-RNA ist; oder SEQ I.D. Nr. 4, das Nukleotid-Fehlpaarungen enthält.
  • 5 zeigt die Ergebnisse eines in vitro Telomerasehemmungstest, durchgeführt unter Verwendung von steigenden Mengen von Thiophosphoramidat-Oligonukleotid von SEQ I.D. Nr. 10, das komplementär zu Telomerase-RNA ist.
  • 6 zeigt die Ergebnisse von SEQ I.D. Nr. 2 und 10, die komplementär zu Telomerase-RNA sind, und SEQ ID Nr. 4, das Nukleotid-Fehlpaarungen enthält, auf das Wachstum von HME50-5E Zellen.
  • 7 zeigt die Ergebnisse der Thiophosphoramidat-Oligonukleotide auf die Telomerlänge von HME50-5E Zellen.
  • 8 veranschaulicht die IC50-Werte, gemessen für das Thiophosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 2.
  • Detaillierte Beschreibung
  • Definitionen
  • Eine „Alkylgruppe" verweist auf eine Alkyl- oder substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl und Ähnliche. Nied.-Alkyl verweist typischerweise auf C1 bis C5. Intermediäres Alkyl verweist typischerweise auf C6 bis C10.
  • Eine „Arylgruppe" verweist auf eine aromatische Ringgruppe mit 5–20 Kohlenstoffatomen, wie Phenyl, Naphthyl, Anthryl oder substituierte Arylgruppe wie Alkyl- oder Aryl-Substitutionen wie Tolyl, Ethylphenyl, Biphenyl usw. Ebenfalls eingeschlossen sind heterocyclische aromatische Ringgruppen mit einem oder mehreren Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen im Ring.
  • „Oligonukleotide" verweisen typischerweise auf Nukleosid-Untereinheit-Polymere mit zwischen etwa 3 und etwa 50 aneinander angrenzenden Untereinheiten. Die Nukleosid-Untereinheiten können durch eine Vielfalt an Interuntereinheit-Verbindungen verbunden sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf jene in 1A bis 1C gezeigten. Ferner schließt „Oligonukleotide" Modifikatio nen, welche einem Fachmann bekannt sind, am Zucker-Grundgerüst (z. B. Ribose- oder Deoxyribose-Untereinheiten), dem Zucker (z. B. 2'-Substitutionen), der Base und den 3'- und 5'-Termini ein. Der Begriff „Polynukleotid" wie hierin verwendet hat die gleiche Bedeutung, da „Oligonukleotid" austauschbar mit „Polynukleotid" verwendet wird.
  • Immer wenn ein Oligonukleotid durch eine Sequenz von Buchstaben dargestellt wird, wie „ATGUCCTG", wird man verstehen, dass die Nukleotide in 5'->3' Reihenfolge von links nach rechts sind.
  • Wie hierin verwendet schließt „Nukleosid" die natürlichen Nukleoside ein, einschließlich 2'-Deoxy- und 2'-Hydroxylformen, z. B. wie in Komberg und Baker, DNA Replication, 2. Aufl. (Freeman, San Francisco, 1992) beschrieben, und Analoga. „Analoga" mit Verweis auf Nukleoside schließt synthetische Nukleoside mit modifizierten Basekomponenten und/oder modifizierten Zuckerkomponenten ein, z. B. allgemein beschrieben durch Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley, New York, 1980). Solche Analoga schließen synthetische Nukleoside ein, welche entworfen wurden, um Bindungseigenschaften zu verstärken, z. B. Stabilität, Spezifität oder Ähnliches, wie durch Uhlmann und Peymann (Chemical Reviews, 90: 543–584, 1990) offenbart.
  • Eine „Base" ist hierin so definiert, dass sie (i) typische DNA- und RNA-Basen (Uracil, Thymin, Adenin, Guanin und Cytosin) und (ii) modifizierte Basen oder Base-Analoga (z. B. 5-Methylcytosin, 5-Bromuracil oder Inosin) einschließt. Ein Base-Analog ist eine Chemikalie, deren molekulare Struktur die einer typischen DNA- oder RNA-Base nachahmt.
  • Wie hierin verwendet meint „Pyrimidin" die Pyrimidine, welche in natürlichen Nukleosiden auftreten, einschließlich Cytosin, Thymin und Uracil, und übliche Analoga davon, wie jene, welche Oxy, Methyl, Propinyl, Methoxy, Hydroxyl, Amino, Thio, Halogen und ähnliche Substituenten enthalten. Der Begriff schließt wie hierin verwendet ferner Pyrimidine mit üblichen daran gebundenen Schutzgruppen ein, wie N4-Benzoylcytosin. Weitere übliche Pyrimidin-Schutzgruppen werden durch Beaucage und Iyer (Tetrahedron 48: 223–2311, 1992) offenbart.
  • Wie hierin verwendet meint „Purin" die Purine, welche in natürlichen Nukleosiden vorkommen, einschließlich Adenin, Guanin und Hypoxanthin, und übliche Analoga davon, wie jene, welche Oxy, Methyl, Propinyl, Methoxy, Hydroxyl, Amino, Thio, Halogen und ähnliche Substituenten enthalten. Der Begriff wie hierin verwendet schließt ferner Purine mit üblichen daran gebundenen Schutzgruppen ein, wie N2-Benzoylguanin, N2-Isobutyrylguanin, N6-Benzoyladenin und Ähnliche. Weitere übliche Purin-Schutzgruppen werden durch Beaucage und Iyer (oben zitiert) offenbart.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „geschützt" als Bestandteil eines chemischen Namens auf nach Stand der Technik anerkannte Schutzgruppen für einen bestimmten Bestandteil einer Verbindung, z. B. schließt „5'-geschütztes Hydroxyl" mit Verweis auf ein Nukleosid Triphenylmethyl (also Trityl), p-Anisyldiphenylmethyl (also Monomethoxytrityl oder MMT), Di-p-anisylphenylmethyl (also Dimethoxytrityl oder DMT) und Ähnliches ein. Nach Stand der Technik anerkannte Schutzgruppen schließen jene ein, welche in den folgenden Verweisen beschrieben werden: Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Amarnath und Broom, Chemical Reviews, 77: 183–217, 1977; Pon et al., Biotechniques, 6: 768–775, 1988; Ohtsuka et al., Nucleic Acids Research, 10: 6553–6570, 1982; Eckstein, Hrsg., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991), Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, zweite Auflage (John Wiley & Sons, New York, 1991), Narang, Hrsg., Synthesis and Applications of DNA and RNA (Academic Press, New York, 1987), Beaucage und Iyer (oben zitiert) und ähnliche Referenzen.
  • Der Begriff „Halogen" oder „Halo" wird in seinem herkömmlichen Sinn verwendet, um auf einen Chlor-, Brom-, Fluor- oder Iodsubstituenten zu verweisen. In den hierin beschriebenen und beanspruchten Verbindungen sind Halogensubstituenten im Allgemeinen Fluor, Brom oder Chlor, vorzugsweise Fluor oder Chlor.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Telomeraseenzymaktivität und/oder Proliferation von Zellen mit Telomeraseaktivität zu hemmen oder zu verringern. In diesen Kontexten bezieht sich Hemmung oder Verringerung der Enzymaktivität oder Zellproliferation auf einen niedrigeren Grad der gemessenen Aktivität bezogen auf einen Kontrollversuch, in welchem das Enzym oder die Zellen nicht mit der Testverbindung behandelt werden. In bestimmten Ausführungsformen ist die Hem mung oder Verringerung bei der gemessenen Aktivität mindestens eine 10% Verringerung oder Hemmung. Ein Fachmann wird anerkennen, dass Verringerung oder Hemmung der gemessenen Aktivität um mindestens 20%, 50%, 75%, 90% oder 100% für besondere Anwendungen bevorzugt werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich allgemein auf Oligonukleotide, welche mindestens eine Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindung enthalten, Verfahren zum Synthetisieren solcher Polynukleotide und Verfahren zum Verwenden der Oligonukleotide der Erfindung als therapeutische Verbindungen und in Diagnostiken.
  • Die Oligonukleotide werden beispielhaft mit der Formel:
    Figure 00090001
    dargestellt, worin jedes B unabhängig ausgewählt wird, ein Pyrin oder Pyrimidin oder ein Analog davon darzustellen, wie Uracil Thymin, Adenin, Guanin, Cytosin, 5-Methylcytosin, 5-Bromuracil und Inosin,
    Z1 für O oder NH steht,
    Z2 für OR, SR oder Methyl steht, worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon,
    R1 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, O-R2, S-R2, NHR2 und Halogen, worin R2 für H, Alkyl oder (CH2)nW(CH2)mH steht, wo n zwischen 1–10 ist, m zwischen 0–10 ist und W für O, S oder NH steht,
    R3 und R4 ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino und Wasserstoff, und
    m2 eine ganze Zahl zwischen 1 und 50 ist.
  • Die Nukleosid-Untereinheiten, welche die Polynukleotide-Nukleotide der vorliegenden Erfindung bilden, können ausgewählt werden, in einer definierten Sequenz zu sein, wie eine Sequenz aus Basen, welche in der Lage ist, spezifisch an eine Einzelstrang-Nukleinsäure-Zielsequenz zu hybridisieren, oder eine Sequenz, die Bildung einer Triplex-Struktur zwischen dem Polynukleotid und einem Zielduplex ermöglichen wird. Vorzugsweise wird die Sequenz von Nukleosid-Untereinheiten durch mindestens eine Untereinheit verbunden, die ein N3'->P5' Thiophosphoramidat ist, definiert durch die Formel:
    Figure 00100001
    worin B ein Purin oder Pyrimidin oder ein Analog davon darstellt;
    Z für SR steht, worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon; und
    R1 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, O-R2, S-R2 und Halogen, worin R2 für H, Alkyl oder (CH2)nW(CH2)mH steht, wo n zwischen 1–10 ist, m zwischen 0–10 ist und W für O, S oder NH steht.
  • Zum Beispiel können alle Interuntereinheit-Verbindungen des Polynukleotids N3'-P'5 Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen sein, definiert durch die Formel:
    Figure 00100002
  • Die Oligonukleotide der Erfindung können verwendet werden, um an Zielnukleinsäuresequenzen wie RNA und DNA zu hybridisieren. Wenn wünschenswert können die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung mit einer Reportergruppe wie radioaktiven Markierungen, Biotin-Markierungen, fluoreszierenden Markierungen und Ähnlichem markiert werden, um den Nachweis des Polynukleotids selbst und sein Vorhandensein in zum Beipsiel Hybridisierungskomplexen zu erleichtern.
  • Die Oligonukleotide können auch als pharmazeutische Hemmung von Transkription oder Translation in einer Zelle in einem Krankheitszustand bezogen auf Überexprimierung des Zielgens formuliert werden.
  • Vorzugsweise wird die Sequenz von Nukleosid-Untereinheiten durch mindestens eine Interuntereinheit-Verbindung verbunden, die ein N3'->P5' Thiophosphoramidat ist. Alternativ sind alle der Interuntereinheit-Verbindungen des Polynukleotids N3'->P'5 Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen, definiert durch die Formel:
    Figure 00110001
  • In weiteren Aspekten richtet sich die Erfindung auf ein Festphasenverfahren zum Synthetisieren von Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidaten unter Verwendung einer Modifikation der Phosphoramidit-Transfermethodik von Nelson et al., (J. Organic Chemistry 62: 7278–7287, 1997). Die synthetische Strategie setzte 3'-NH-Trityl-geschützte 3'-Aminonukleosid 5'-O-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphoramidite (Nelson et al., oben zitiert) ein, die von Cruachem und JBL Scientific, Inc. (Aston, PA, bzw. San Luis Obispo, CA) gekauft wurden. Jeder synthetische Zyklus (siehe 2) wurde unter Verwendung der folgenden chemischen Verfahren durchgeführt: 1) Detritylierung, 2) Kopplung; 3) Abdeckung; 4) Schwefelung. Für eine schrittweise Schwefelung der Internukleasid-Phosphoramidit-Gruppe, gebildet nach dem Kopplungsschritt, wurde das auf Iod/Wasser basierende Oxidationsmittel durch die schwefelnden Wirkstoffe ersetzt – entweder durch elementaren Schwefel S8 oder durch das gewöhnlich verwendete Beaucage-Reagens – 3H-1,2-Benzodithiol-3-an-1,1-dioxid (Iyer et al., J. Organic Chemistry 55: 4693–4699, 1990). Die Oligonukleotid-Synthesen wurden (1 μmol Synthesemaßstab) mit einer 1% Lösung aus Beaucage-Reagens in wasserfreiem Acetonitril oder 15% S8 in CS2/Et3N, 99/1 (Vol./Vol.) als schwefelndem Wirkstoff durchgeführt.
  • Chimäre N3'->P5' Phosphoramidat-Phosphorthioamidat-Oligonukleotide können durch Verwenden eines Oxidationsschritts(-e) nach dem Kopplungsschritt hergestellt werden, was Bildung einer Phosphoramidat-Internukleosid-Gruppe ergibt. Ähnlich können Phosphodiester-Phosphorthioamidate durch Verwenden von 5'-Phosphoramidit-3'-O-DMTr-geschützten Nukleotiden als monomere Bausteine hergestellt werden. Diese synthetischen Herangehensweisen sind nach Stand der Technik bekannt.
  • Das Modell Phosphoramidat-Thymidin-Dinukleosid TnpsTn wurde unter Verwendung beider Typen von schwefelnden Wirkstoffen hergestellt und hat eine 3'-NHP(O)(S–)O-5' Internukleosidgruppe. Die Umsetzungsgemische wurden analysiert und Struktur der Verbindung wurde durch Ionenaustausch (IE) und Umkehrphasen (RP) HPLC und 31P NMR bestätigt. Die Analyse offenbarte, dass Schwefelung der Internukleosid-Phosphoramidit-Gruppe mit Beaucage-Reagens Bildung von annähernd 10–15% des oxidierten Dinukleosids mit 3'-NHP(O)(O)O-5' Phosphoramidat-Verbindung ergab (31P NMR δ, ppm 7,0 in D2O). Alternativ erzeugte Schwefelung mit molekularem Schwefel S8 das gewünschte Dinukleotid, welches 3'-NHP(O)(S–)O-5' Internukleosidgruppe enthielt, mit praktisch quantitativer Ausbeute, wie durch 31P NMR und IE HPLC-Analyse bewertet (31P NMR δ, ppm 56,4, 59,6 in D2O, Rp, Sp Isomere).
  • Ähnliche Ergebnisse bezüglich der Schwefelungseffizienz wurden für die Synthese von Modell-Oligonukleotid 11-mer GTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 1) erhalten, wo Schwefelung mit Beaucage-Reagens das Produkt in voller Länge ergab, enthaltend ~15% Phosphoramidat-Verbindungen, wie durch 31P NMR-Analyse des Umsetzungsgemisches bewertet wurde. Chemische Verschiebungen für die Haupt-Peaks waren ~57 und 60 ppm (breite Doubletten) und 7 ppm (breites Singulett), entsprechend den Thiophosphoramidat, bzw. Phosphoramidat-Gruppen. Im Gegensatz dazu erzeugte Schwefelung mit S8 nur ~2% Phosphoramidat-Verbindungen in dem 11-mer Produkt gemäß der 31P NMR-Analyse. Die IE HPLC-Analyse des Oligomers war in guter Übereinstimmung mit dem 31P NMR-Spektrum. Struktur und Reinheit der endgültigen Oligonukleotidprodukte wurde durch MALDI-TOF Massenspektrenanalyse, durch 31P NMR und durch Polyacrylamid-gelelekrophoretische Analyse bestätigt. Die Molekülmasse für Thiophosphoramidat-Oligomere GT2AG3T2AG (SEQ I.D. Nr. 1) und TAG3T2AGACA2 (SEQ I.D. Nr. 2) wurde als 3577,11, bzw. 4202,69 berechnet. Die Molekülmasse für Thiophosphoramidat-Oligomere GT2AG3T2AG (SEQ I.D. Nr. 1) und TAG3T2AGACA2 (SEQ I.D. Nr. 2) wurde experimentell durch MALDI-TOF Massenspektroskopie als 3577, bzw. 4203 bestimmt; Mobilität in 15% PAGE bezogen auf isosequenzielle Phosphoramidate war 0,95, bzw. 0,97.
  • Das Modell Phosphoramidat-Nukleosid TnpsTn wurde durch Behandlung mit 0,1 M Iodlösung in Pyridin/THF/H2O 1/4/0,1 (Vol./Vol.), 55°C, 15 Min. quantitativ in das Phosphoramidat-Gegenstück TnpTn umgewandelt, wie durch IE HPLC und 31P NMR 31P NMR δ ppm 7,0) beurteilt (siehe 3). Behandlung des TnpsTn-Dinukleotids mit 10% Essigsäure, 55°C, 48 Std., ergab unerwartet nur teilweise Hydrolyse (~10%) von Internukleosid-Phosphoramidat-Verbindung. Für Vergleich unter diesen Bedingungen wurde das Stamm-Phosphoramidat-Dimer TnpTn vollständig hydrolysiert. Spaltung der N-P-Bindung im Dinukleotid-Thiophosphoramidat wurde durch gleichzeitiges Entschwefelungsverfahren (~15%) begleitet, gefolgt von einer schnellen Hydrolyse der sich ergebenden Phosphoramidat-NHP(O)(O–)O-Gruppe, wie durch IE HPLC und 31P NMR gezeigt (3).
  • Die 2'-R3 N3'->P5' Thiophosphoramidate können aus den entsprechenden Phosphoramidaten wie oben beschrieben erhalten werden. Die 2'-N3 N3'->P5' Phosphoramidate wurden durch die Phosphoramidit-Transfermethodik, entwickelt für die Synthese von Oligonukleotid N3'->P5' Phosphoramidaten erhalten. Die Synthese von 2-O-Alkyl N3'->P5' Thiophosphoramidaten wird als Veranschaulichung dieser Methodik detailliert beschrieben.
  • Die passend geschützten 2'-O-Alkyl-3'-aminonukleosid-5'-phosphoramidit-Bausteine 4, 6, 11 und 15, wo Alkyl für Methyl steht, wurden gemäß einer Abfolge von in Schemata 1–3 unten gezeigten chemischen Umwandlungen hergestellt. Ein erfinderischer Schritt für die Herstellung dieser Verbindungen war die selektive Methylierung der 2'-Hydroxylgruppe in Gegenwart von entweder der Imino-Funktionalität von Pyrimidinen, oder dem N-7 Atom der Purine. Die beiden Pyrimidin-basierten Monomere wurden von dem bekannten 3-Azido-2'-O-acetyl-5'-O-toluoyl-3'-deoxy-β-D-ribofuranosyluracil 1 erhalten. Typischerweise wurde der N-3/O-4 Imino-Stickstoff von 1 zuerst mit einer Schutzgruppe geschützt, wie durch die Umsetzung von Methylpropyolat in Gegenwart von Dimethylaminopyridin (Schema 1). Das rohe Umsetzungsprodukt wurde dann selektiv 2'-O-deacetyliert und die sich ergebende freie 2'-Hydroxylgruppe wurde dann alkyliert, Schema 1
    Figure 00140001
    wie durch Methylierung unter Verwendung von Iodmethan und Silberoxid. Die N-3 Schutzgruppe wurde entfernt und die 3'-Azidogruppe wurde zu Amin reduziert, welches dann sofort geschützt wurde, wie Umsetzung mit 4-Monomethoxytritylchlorid, um den Vorläufer 3 zu ergeben. Der 5'-Toluoylester wurden dann abgespalten unter Verwendung einer alkalischen Lösung, gefolgt von Phosphitylierung unter Verwendung bekannter Protokolle, um das gewünschte 2'-O-Methyluridinphosphoramiditmonomer 4 zu ergeben. Das 2'-O-Methylcytosinphosphoramidit wurde durch Umwandlung von Uridin-Zwischenverbindung 3 in 3'-Aminocytidin-Analog 5 erhalten.
  • Die Synthese des 2'-O-Alkyladenosin-Analogs erforderte die Verwendung von voluminösen Schutzgruppen, primär für exocyclisches Amin, um die Alkylierung von N-7 während der Methylierung der 2'-Hydroxylgruppe (Schema 2) zu verhindern. 3'-Azido-2'-O-acetyl-5'-O-toluoyl-N6-benzoyl-3'-deoxyadenosin 7 wurde zuerst entschützt, wie durch Umsetzung mit NH3/MeOH (1/1, Vol./Vol.), um 3'-Azido-3'-deoxyadenosin zu ergeben. Dann wurden die 5'-Hydroxylgruppe und die N-6 Komponente selektiv wieder mit voluminösen Schutzgruppen geschützt, wie der t-Butyldiphenylsilylgruppe oder der 4-Monomethoxytritylgruppe. Die Kombination der beiden großen Substituenten an den 5'-O und N-6 Positionen okkludierte N-7 sterisch, wodurch es die selektive Einführung einer Methylgruppe an der 2'-Position ermöglichte, um die Zwischenverbindung 8 herzustellen. Die N-6 4-Monomethoxytritylgruppe wurde dann entfernt, wie durch Behandlung mit 3% Trichloressigsäure in einem organischen Lösungsmittel wie Dichiormethan, gefolgt von erneutem Schützen von N-6. Die Verwendung von Benzoylchlorid für das erneute Schützen von N-6 ergab die Addition von zwei Benzoylgruppen. Die zweite Benzoylgruppe wurde nachfolgend durch Basebehandlung entfernt, um die Zwischenverbindung 9 herzustellen. Die Azidgruppe wurde dann reduziert und die sich ergebende 3'-Aminogruppe wurde mit 4-Monomethoxytrityl geschützt, um 10 zu bilden. Schließlich wurde die 5'-Silyl-Schutzgruppe abgespalten und Phosphitylierung ergab das 2'-O-Methylphosphoramidit-Monomer 11. Schema 2
    Figure 00150001
  • Die Synthese des Guanosin-basierten 2'-O-Alkylphosphoramidits 15 wird in Schema 3 skizziert. 3'-Azido-2'-O-acetyl-5'-O-toluoyl-N2-isobutryl-O6-diphenylcarbamoyl-3'-deoxyguanosin 12 wurde durch Behandlung mit einer Base entblockt. Das 5'O und O-6 wurden durch Umsetzung mit t-Butyldiphenylsilylchlorid wieder geschützt. Die bis-silylierte Zwischenverbindung wurde dann 2'-O alkyliert. Die O-6 Silylgruppe wurde selektiv entschützt, um Verbindung 13 zu ergeben. Die N-2 Gruppe wurde wieder geschützt, die 3'-Azidogruppe wurde reduziert und die sich ergebende 3'-Aminogruppe wurde geschützt, um das Nukleosid 14 zu ergeben. Schließlich wurde das 2'-O-Alkylguanosinphosphoramidit-Monomer 15 durch Entfernen der 5'-Schutzgruppe, gefolgt von Phosphitylierung des unmaskierten 5'- Hydroxyls erhalten. Schema 3
    Figure 00160001
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Säurestabilität von Oligonukleotiden durch Platzieren von Untereinheiten, verbunden durch N3'->P5' Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen in die Oligonukleotide erhöht. Die Hybridisierungseigenschaften der Thiophosphoramidat-Oligonukleotide wurden bezogen auf komplementäre DNA- oder RNA-Stränge mit Phosphodiester- oder Phosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen bewertet. Die thermischen Stabilitätsdaten für Duplexe, erzeugt aus Phosphoramidat-Oligonukleotiden und Phosphodiester-Oligomeren werden in TABELLE 1 (Beispiel 3) zusammengefasst.
  • Hybridisierung der Thiophosphoramidat-Oligonukleotide mit komplementären Nukleinsäuren ist Sequenz-spezifisch und wird durch die richtige Watson-Crick-Basepaarung bestimmt. Das Duplex, gebildet durch Phosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 3 mit einer einzelnen Base-Fehlpaarung mit einem RNA-Zielbestandteil von Telomerase (Beispiel 6, TABELLE 2, Versuch 2) ist wesentlich weniger stabil, als der mit Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 1 gebildete Duplex, welcher zum RNA-Bestandteil von Telomerase vollständig komplementär ist (Beispiel 6, TABELLE 2, Versuch 1).
  • Anwendungen von Oligonukleotiden, welche Internukleosid 3'-NHP (O) (S–) O-5' Thiophosphoramidat-Verbindungen enthalten
  • Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 2 3'-NHP(O)(S–)O-5' Thiophosphoramidat wurde synthetisiert. Die Verbindung war überraschend säurestabil und bildete einen stabilen Komplex mit einem komplementären RNA-Ziel. Die N3'->P5' Thiophosphoramidat-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung haben großes Potential für Antisense- und Antigen-diagnostische/therapeutische Anwendungen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Oligonukleotide Oligodeoxyribonukleotide.
  • A. Telomerasehemmungsanwendungen
  • Kürzlich begann sich ein Verständnis der Mechanismen zu entwicklen, durch welche normale Zellen den Status von Seneszenz erreichen, also den Verlust von proliferativer Leistungsfähigkeit, den Zellen normalerweise im zellulären Alterungsprozess unterlaufen. Die DNA an den Enden oder Telomeren der Chromosome von Eukaryonten besteht üblicherweise aus tandemartig wiederholten einfachen Sequenzen. Wissenschaftler haben seit langem gewusst, dass Telomere eine wichtige biologische Rolle beim Aufrechterhalten von Chromosomenstruktur und Funktion haben. Kürzlich haben Wissenschaftler spekuliert, dass der kumulative Verlust von telomerer DNA über wiederholte Zellteilungen als ein Auslöser für zelluläre Seneszenz und Alterung fungieren kann und dass die Regulierung von Telomerase, ein Enzym, welches bei der Aufrechterhaltung von Telomerlänge einbezogen ist, wichtige biologische Implikationen haben kann. Siehe Harley, 1991, Mutation Research, 256: 271–282. Versuche durch Bodnar et al. haben die Wichtigkeit von Telomeren und Telomerase beim Kontrollieren der replikativen Lebensdauer von kultivierten normalen menschlichen Zellen bestätigt. Siehe Bodnar et al., 1998, Science 279: 349–352.
  • Telomerase ist ein Ribonukleoproteinenzym, das einen Strang der telomeren DNA unter Verwendung einer Sequenz, welche innerhalb des RNA-Bestandteils des Enzyms enthalten ist, als Matrize synthetisiert. Siehe Blackburn, 1992, Annu. Rev. Biochem., 61: 113–129. Der RNA-Bestandteil von humanen Telomerasen ist sequenziert worden und ist 460 Nukleotide lang, enthaltend eine Folge von 11-Basesequenzwiederholungen, die zur Telomerwiederholung komplementär ist. Menschliche Telomeraseaktivität ist durch eine Vielfalt an Oligonukleotiden gehemmt worden, welche zum RNA-Bestandteil von Telomerase komplementär sind. Siehe Norton et al., Nature Biotechnology, 14: 615, 1996; Pitts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 11549–11554, 1998; und Glukhov et al., Bioch. Biophys. Res. Commun., 248: 368–371, 1999. Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind komplementär zu 10 bis 50 Nukleotiden von Telomerase-RNA. Vorzugsweise haben die Telomerasehemmer-Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der Erfindung eine 10 bis 20 konsekutive Basesequenz, die zu Telomerase-RNA komplementär ist.
  • Verfahren zum Nachweisen von Telomeraseaktivität, als auch zum Identifizieren von Verbindungen, die Telomeraseaktivität regulieren oder beeinflussen, zusammen mit Verfahren für Therapie und Diagnose von zellulärer Seneszenz und Immortalisierung durch Kontrollieren von Telomerlänge und Telomeraseaktivität sind ebenfalls beschrieben worden. Siehe Feng et al., 1995, Science, 269: 1236–1241; Kim et al., 1994, Science, 266: 2011–2014; PCT-Patentanmeldung Nr. 93/23572, veröffentlicht am 25. Nov. 1993; und U.S.-Patente Nr. 5656638 , 5760062 , 5767278 , 5770613 und 5863936 .
  • Die Identifizierung von Verbindungen, die Telomeraseaktivität hemmen, liefert wichtigen Nutzen für Anstrengungen, menschliche Krankheit zu behandeln. Verbindungen, die Telomeraseaktivität hemmen, können verwendet werden, um Telomerasevermittelten Störungen wie Krebs zu behandeln, da Krebszellen Telomeraseaktivität exprimieren und normale menschliche somatische Zellen keine Telomeraseaktivität bei biologisch relevanten Graden besitzen (also bei Graden, welche ausreichend sind, Telomerlänge über viele Zellteilungen beizubehalten). Unglücklicherweise sind wenige solcher Verbindungen, insbesondere Verbindungen mit hoher Wirkkraft oder Wirksamkeit und Verbindungen, die nach oraler Verabreichung biologisch verfügbar sind, identifiziert und gekennzeichnet worden. Somit bleibt ein Bedarf für Verbindungen, die als Telomerasehemmer wirken, die relativ hohe Wirkkraft oder Wirksamkeit haben und die oral biologisch verfügbar sind, und für Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln von Krebs und anderen Krankheiten, in welchen Telomeraseaktivität abnorm vorhanden ist.
  • Die neuartigen Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind säurestabil und haben daher viele wertvolle Verwendungen als Hemmer von schädlicher Telomeraseaktivität, wie zum Beispiel in der Behandlung von Krebs bei Menschen. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Thio phosphoramidat-Oligonukleotid können in Behandlungsplänen eingesetzt werden, in welchen Krebszellen in vivo gehemmt werden, oder können verwendet werden, um Krebszellen ex vivo zu hemmen. Somit sieht diese Erfindung therapeutische Verbindungen und Zusammensetzungen zum Behandeln von Krebs und Verfahren zum Behandeln von Krebs in Säugern (z. B. Kühen, Pferden, Schafen, Ochsen, Schweinen und Tieren von veterinärem Interesse wie Katzen und Hunden) vor. Zusätzlich können die Phosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um weitere Telomerase-vermittelte Zustände oder Krankheiten zu behandeln, wie zum Beispiel weitere hyperproliferative oder autoimmune Störungen.
  • Wie oben angemerkt bezieht Immortalisierung von Zellen unter anderem die Aktivierung von Telomerase ein. Spezieller ist die Verbindung zwischen Telomeraseaktivität und der Fähigkeit von vielen Tumorzelllinien, unsterblich zu bleiben, durch Analyse von Telomeraseaktivität gezeigt worden (Kim et al., siehe oben). Diese Analyse, ergänzt durch Daten, die anzeigen, dass die Verkürzung von Telomerlänge das Signal für replikative Seneszenz in normalen Zellen vorsehen kann, siehe PCT-Anmeldung Nr. 93/23572, zeigt, dass Hemmung von Telomeraseaktivität eine wirksame Antikrebstherapie sein kann. Somit kann Telomeraseaktivität den Beginn von ansonsten normaler replikativer Seneszenz durch Verhindern der normalen Verringerung von Telomerlänge und die gleichzeitige Beendigung von Zellreplikation, die in normalen somatischen Zellen nach vielen Zellteilungen auftritt, verhindern. In Krebszellen, wo der bösartige Phänotyp Folge von Verlust von Zellzyklus oder Wachstumskontrollen oder anderer genetischer Schädigung ist, erlaubt Abwesenheit von Telomeraseaktivität den Verlust von telomerer DNA während der Zellteilung, was chromosomale Neuanordnungen und Aberrationen ergibt, die schließlich zum Zelltod führen. Jedoch wird in Krebszellen mit Telomeraseaktivität telomere DNA während der Zellteilung nicht verloren, wodurch es den Krebszellen ermöglicht wird, unsterblich zu werden, was zu einer Endprognose für den Patienten führt. Wirkstoffe, welche in der Lage sind, Telomeraseaktivität in Tumorzellen zu hemmen, bieten therapeutischen Nutzen bezüglich einer großen Vielfalt an Krebsen und anderen Zuständen (z. B. Pilzinfektionen), bei welchen immortalisierte Zellen mit Telomeraseaktivität ein Faktor beim Krankheitsfortschritt sind oder bei welchen Hemmung von Telomeraseaktivität für Behandlungszwecke gewünscht wird. Die Telomerasehemmer der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um Telomeraseaktivität in Keimlinienzellen zu hemmen, was für empfängnisverhütende Zwecke brauchbar sein kann.
  • Zusätzlich wird anerkannt werden, dass therapeutischer Nutzen für Behandlung von Krebs durch Kombinieren eines Telomerasehemmers der Erfindung mit weiteren Antikrebsmitteln realisiert werden kann, einschließlich weiteren Hemmern von Telomerase, wie in U.S.-Patenten Nr. 5656638 , 5760062 , 5767278 , 5770613 und 5863936 beschrieben. Die Wahl solcher Kombinationen wird von verschiedenen Faktoren abhängen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf die Art der Erkrankung, das Alter und die allgemeine Gesundheit des Patienten, die Aggressivität des Krankheitsfortschreitens, der TRF-Länge und Telomeraseaktivität der erkrankten zu behandelnden Zellen und die Fähigkeit des Patienten, die Wirkstoffe zu tolerieren, die die Kombination umfassen. zum Beispiel kann es in Fällen, wo Tumorprogression ein fortgeschrittenes Stadium erreicht hat, ratsam sein, eine Telomerase hemmende Verbindung der Erfindung mit weiteren Wirkstoffen und therapeutischen Plänen zu kombinieren, die beim Verringern der Tumorgröße wirksam sind (z. B. Bestrahlung, Chirurgie, Chemotherapie und/oder hormonelle Behandlungen). Zusätzlich kann es in einigen Fällen ratsam sein, einen Telomerase hemmenden Wirkstoff der Erfindung mit einem oder mehreren Wirkstoffen zu kombinieren, die die Nebenwirkungen einer Krankheit behandeln, z. B. einem Analgetikum oder Wirkstoffen, die wirksam sind, die eigene Immunantwort des Patienten (z. B. Kolonie stimulierender Faktor) zu stimulieren.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen hemmende Wirksamkeit gegen Telomeraseaktivität in vivo, wie unten beschrieben gezeigt werden kann. Die in vitro Wirksamkeiten der Verbindungen der Erfindung sind ebenfalls unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren gezeigt worden. Wie hierin verwendet verweist der Begriff „in vitro" auf Tests, welche unter Verwendung von lebenden Zellen in Gewebekultur durchgeführt wurden. Solche Verfahren sind auch als „ex vivo" bekannt.
  • In diesem Abschnitt beschriebene Oligonukleotid-Telomerasehemmer umfassen typischerweise eine Sequenz, die zu Telomerase-RNA-Bestandteil komplementär ist. Die Sequenz von menschlichem Telomerase-RNA-Bestandteil wird in U.S.-Patent Nr. 5776679 vorgesehen. Der Telomerase-RNA-Bestandteil von anderen Arten kann ebenfalls verwendet werden, abhängig vom beabsichtigten Objekt der Therapie.
  • Im Allgemeinen wird das Oligonukleotid zwischen etwa 10 und 100 Nukleotide umfassen, die für Telomerase spezifisch sind (also sie hybridisieren mit Telomerase-RNA-Bestandteil bei niedrigeren Konzentrationen oder unter Bedingungen von größerer Stringenz als sie es mit anderen RNA-Enzymbestandteilen oder anderen RNA-Molekülen werden, von denen erwartet wird, dass sie in der Zielzelle oder therapeutischen Zuschauerzellen vorhanden und funktional aktiv sind). Eingeschlossen sind Oligonukleotide zwischen etwa 10 und 25 Nukleotiden, beispielhaft dargestellt durch Oligonukleotide zwischen 12 und 15 Nukleotiden, veranschaulicht in den Beispielen unten. In vielen Umständen wird das Oligonukleotid genau komplementär zu einer konsekutiven Sequenz der gleichen Länge in Telomerase-RNA sein. Dennoch versteht sich, dass Hybridisierung selbst dann noch spezifisch sein kann, wenn es fehlgepaarte Reste oder Lücken oder Additionen im Oligonukleotid gibt, insbesondere wenn die Länge der entsprechenden komplementären Sequenz in der RNA länger als 15 Nukleotide ist.
  • Ein Verfahren, welches verwendet wird, um Thiophosphoramidat-Polynukleotide der Erfindung mit spezifischen Sequenzen zu identifizieren, die Telomeraseaktivität hemmen, bezieht Platzieren von Zellen, Geweben oder vorzugsweise einem zellulären Extrakt oder anderem Telomerase enthaltenden Präparat in Kontakt mit mehreren bekannten Konzentrationen eines Thiophosphoramidat-Oligonukleotids, das zum RNA-Bestandteil von Telomerase komplementär ist, in einem Puffer, welcher mit Telomeraseaktivität kompatibel ist. Der Grad der Telomeraseaktivität für jede Konzentration des Thiophosphoramidat-Polynukleotids wird gemessen. Vor und nach Verabreichung eines Telomerasehemmers kann Telomeraseaktivität unter Verwendung von Standardreagenzien und Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann Telomeraseaktivität in kultivierten Zellen unter Verwendung des TRAP Aktivitätstests (Kim et al., Science 266: 2011, 1997; Weinrich et al., Nature Genetics 17: 498, 1997) gemessen werden. Die folgenden Testkits sind für Forschungszwecke im Handel erhältlich: TRAPeze® XK Te lomerase Detection Kit (Kat. S7707; Intergen Co., Purchase NY); und TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAplus (Kat., 201389; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN).
  • Der IC50 (die Konzentration des Polynukleotids, bei welcher von der beobachteten Aktivität für ein Probenpräparat beobachtet wird, dass sie auf die Hälfte seines ursprünglichen oder eines Kontrollwerts fällt) für das Polynukleotid wird unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt. Weitere Verfahren zum Bestimmen der hemmenden Konzentration einer Verbindung der Erfindung gegen Telomerase können eingesetzt werden, wie es den Fachleuten basierend auf den Offenbarungen hierin offensichtlich sein wird.
  • Mit den oben beschriebenen Verfahren wurden IC50-Werte für mehrere der Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung bestimmt und wurden gefunden, unter 10 nM zu sein (siehe TABELLE 2, Beispiel 6).
  • Bezüglich der Behandlung von bösartigen Krankheiten wird von der Verwendung von Thiophosphoramidat-Polynukleotiden, die zum RNA-Bestandteil von Telomerase komplementär sind, erwartet, dass sie eine Krise in Telomerase-positiven Zelllinien herbeiführen. Behandlung von HME50-5E epithelialen Zellen der menschlichen Brust, die spontan immortalisiert wurden, mit Thiophosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 2, ergab Hemmung von Telomeraseaktivität wie durch die Verringerung der Telomerlänge gezeigt (siehe Beispiel 6 und 4). Von Behandlung von anderen Telomerase-positiven Zelllinien, wie HEK-293 und HeLa Zellen, mit Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden der Erfindung, die komplementär zum RNA-Sequenzbestandteil von Telomerase sind, wird ebenfalls erwartet, dass sie eine Verringerung von Telomerlänge in den behandelten Zellen herbeiführt.
  • Von Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden der Erfindung wird ebenfalls erwartet, dass sie Telomerreduktion während Zellteilung in menschlichen Tumor-Zelllinien herbeiführen, wie Eierstocktumor-Zelllinien OVCAR-5 und SK-OV-3. Wichtigerweise wird jedoch bei normalen menschlichen Zellen, welche als Kontrolle verwendet werden, wie BJ-Zellen von Fibroblast-Ursprung, von der beobachteten Reduktion der Telomerlänge erwartet, dass sie nicht unterschiedlich von Zellen ist, welche mit einer Kontrollsubstanz behandelt wurden, z. B. einem Thiophosphoramidat-Oligonukleotid, das mindestens eine einzelne Base-Fehlpaarung mit dem komplementären Telomerase-RNA-Ziel hat. Von den Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden der Erfindung wird ebenfalls erwartet, dass sie keine signifikanten zytotoxischen Wirkungen bei Konzentrationen unter etwa 20 μM in den normalen Zellen zeigen.
  • Zusätzlich kann die Spezifität der Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung für Telomerase-RNA durch Durchführen von Hybridisierungstests mit und Vergleichen ihrer Wirksamkeit (IC50) bezüglich Telomerase und anderen Enzymen, von welchen bekannt ist, dass sie essentielle RNA-Bestandteile haben, wie Ribonuklease P bestimmt werden. Von Verbindungen mit niedrigeren IC50-Werten für Telomerase verglichen mit den IC50-Werten gegenüber den anderen Enzymen, welche gescreent werden, wird gesagt, dass sie Spezifität für Telomerase besitzen.
  • In vivo Tests können ebenfalls unter Verwendung eines Maus Xenograft Modells durchgeführt werden, zum Beispiel in welchem OVCAR-5 Tumorzellen auf nackte Mäuse transplantiert werden, wobei von mit einem Thiophosphoramidat-Oligonukleotid der Erfindung behandelten Mäusen erwartet wird, Tumormassen zu haben, die durchschnittlich für einen Zeitraum nach anfänglicher Dosierung steigen können, aber mit fortlaufender Behandlung in der Masse beginnen werden zu schrumpfen. Im Gegensatz dazu wird von Mäusen, die mit einer Kontrolle (z. B. einem Thiophosphoramidat-Oligonukleotid, das mindestens eine einzelne Base-Fehlpaarung mit dem komplementären Telomerase RNA-Ziel hat) behandelt wurden erwartet, Tumormassen zu haben, die sich fortgesetzt erhöhen.
  • Aus dem Vorhergehenden werden die Fachleute anerkennen, dass die vorliegende Erfindung ebenfalls Verfahren zum Auswählen von Behandlungsplänen unter Einbeziehung von Verabreichung eines Thiophosphoramidat-Oligonukleotids der Erfindung vorsieht. Für solche Zwecke kann es hilfreich sein, eine Terminalrestriktionsfragment (TRF) Analyse durchzuführen, in welcher DNA von Tumorzellen durch Verdau mit Restriktionsenzymen analysiert wird, welche für andere Sequenzen als die telomere (T2AG3)N-Sequenz spezifisch sind. Nach Verdau der DNA wird Gelelektrophorese durchgeführt, um die Restriktionsfragmente gemäß der Größe zu trennen. Die getrennten Fragmente werden dann mit Nukleinsäuresonden sondiert, welche für telomere Sequenzen spezifisch sind, um die Länge der terminalen Fragmente zu bestimmen, welche die Telomer- DNA der Zellen in der Probe enthalten. Durch Messen der Länge von telomerer DNA kann man schätzen, wie lange ein Telomerasehemmer verabreicht werden sollte und ob andere Therapieverfahren (z. B. Chirurgie, Chemotherapie und/oder Bestrahlung) ebenfalls eingesetzt werden sollten. Zusätzlich kann man während der Behandlung Zellen testen um zu bestimmen, ob eine Verringerung von Telomerlänge über progressive Zellteilungen stattfindet, um Behandlungswirksamkeit zu zeigen.
  • So sieht in einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung Verbindungen vor, die im Krieg gegen Krebs als wichtige Waffen gegen Telomerase exprimierende Malignitäten, Tumore einschließlich Haut-, Bindegewebs-, Fett-, Brust-, Lungen-, Magen-, Bauchspeicheldrüsen-, Eierstock-, Gebärmutterhals-, Gebärmutter-, Nieren-, Blasen-, Kolon-, Prostata-, zentrales Nervensystem (CNS), Retina- und zirkulierende Tumore (wie Leukämie und Lymphom) dienen können. Insbesondere können die Thiophosphoramidat-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung ein hochgradig allgemeines Verfahren zum Behandeln von vielen, falls nicht allen Malignitäten vorsehen, wie durch die hochgradig variierten menschlichen Tumorzelllinien und Tumore mit Telomeraseaktivität gezeigt. Wichtiger können die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung wirksam beim Vorsehen von Behandlungen sein, die zwischen bösartigen und normalen Zellen bis zu einem hohen Grad unterscheiden, was viele der schädlichen Nebenwirkungen vermeidet, welche bei den meisten geläufigen chemotherapeutischen Systemen vorhanden sind, welche auf Wirkstoffen beruhen, die sich teilende Zellen unterschiedslos töten.
  • B. Weitere Antisense-Anwendungen
  • Antisense-Therapie bezieht die Verabreichung von exogenen Oligonukleotiden ein, die sich an eine Zielnukleinsäure, typischerweise ein RNA-Molekül, welches sich innerhalb von Zellen befindet, binden. Der Begriff Antisense wird so gegeben, weil die Oligonukleotide typischerweise komplementär zu mRNA-Molekülen („Sense-Strängen") sind, welche für ein zelluläres Produkt kodieren.
  • Die hierin beschriebenen Thiophosphoramidat-Oligonukleotide sind brauchbar für Antisense-Hemmung von Genexpression (Matsukura et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4244–4248, 1989; Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 7790–7794, 1989; Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 4143–4146, 1986; Rittner und Sczakiel, Nucleic Acids Research, 19: 1421–1426, 1991; Stein und Cheng, Science, 261: 1004–1012, 1993). Oligonukleotide, welche N3'->P5' Thiophosphoramidat-Verbindungen enthalten, haben therapeutische Anwendungen für eine große Anzahl an medizinisch signifikanten Zielen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Hemmung von Krebszellenproliferation und Störung von infektiösen Viren. Die N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide sind für sowohl veterinäre, als auch humane Anwendungen brauchbar. Die hohe Säurestabilität der Oligonukleotide der Erfindung und ihre Fähigkeit, wirksam als Antisense-Moleküle bei niedrigen Konzentrationen (siehe unten) zu wirken, machen diese Oligonukleotide als therapeutische Antisense-Wirkstoffe hochgradig wünschenswert.
  • Anti-Sense Wirkstoffe müssen typischerweise alle Ziel-RNA-Moleküle kontinuierlich binden, um sie so zu inaktivieren oder alternativ ein Substrat für endogene Ribonuklease H (Rnase H) Wirksamkeit vorsehen. Empfindlichkeit von RNA/Oligonukleotid-Komplexen, erzeugt durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung, für Rnase H Verdau, kann durch Standardverfahren (Donia et al., J. Biol. Chem., 268: 14514–14522, 1993; Kawasaki et al., J. Medicinal Chem., 36: 831–841, 1993) bewertet werden.
  • Die Verbindungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung sehen mehrere Vorteile gegenüber den herkömmlicheren Antisense-Wirkstoffen vor. Zuerst binden Thiophosphoramidat-Oligonukleotide stärker an RNA-Ziele, als entsprechende Phosphodiester-Oligonukleotide. Zweitens sind die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide resistenter gegen Degradation durch saure Bedingungen. Drittens kann bei zellulärer Aufnahme der Verbindung ein ungeladenes Thiophosphoramidat-Polynukleotid-Grundgerüst effizienteren Eintritt des Phosphoramidat-Oligonukleotids in Zellen ermöglichen, als ein geladenes Oligonukleotid.
  • Wenn eine RNA durch einen hauptsächlich purinen Strang einer Duplex-Zielsequenz kodiert ist, haben auf das Duplex gezielte Phosphoramidat-Analog-Oligonukleotide auch ferner Potenzial zum Inaktivieren der DNA – also die Fähigkeit, ein Pathogen in sowohl einzelsträngigen, als auch doppelsträngigen Formen zu inaktivieren (siehe Diskussion von Antigentheraphien unten).
  • Sequenz-spezifische Thiophosphoramidat-Oligonukleotid- Moleküle sind potentiell wirkkräftige Therapeutika für im wesentlichen jede Krankheit oder Zustand, wo in irgendeiner Weise RNA involviert ist. Beispielhafte Weisen, durch welche auf solche Sequenzen für therapeutische Anwendungen gezielt werden können, schließen ein:
    • a) Zielen auf RNA-Sequenzen, welche Produkte exprimieren, welche in der Verbreitung und/oder Aufrechterhaltung infektiöser Wirkstoffe einbezogen sind, wie Bakterien, Vieren, Hefe und andere Pilze, zum Beispiel eine spezifische mRNA, kodiert durch einen infektiösen Wirkstoff;
    • b) Bildung eines Duplex-Moleküls, das Herbeiführen der Spaltung der RNA ergibt (z. B., Rnase H Spaltung von RNA/DNA Hybrid-Duplex-Molekülen);
    • c) Blockieren der Interaktion eines Proteins mit einer RNA-Sequenz (z. B. die Interaktion von TAT und TAR, siehe unten); und
    • d) Zielen auf Sequenzen, welche unangemessene Expression oder Proliferation von zellulären Genen verursachen: zum Beispiel Gene in Verbindung mit Zellzyklusregulation; entzündliche Prozesse; Glattmuskelzellen (SMC) Proliferation, Migration und Matrix-Bildung (Liu et al., Circulation, 79: 1374–1387, 1989); bestimmte genetische Störungen; und Krebse (Protoonkogene).
  • In einer Ausführungsform wird Translation von RNA-Verarbeitung von unangemessen exprimierten zellulären Genen blockiert. Beispielhafte potentielle Zielsequenzen sind Protoonkogene, zum Beispiel, einschließlich, aber nicht begrenzt auf die Folgenden: c-myc, c-myb, c-fos, c-kit, ras und BCR/ABL (z. B. Wickstrom, Hrsg., Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, Wiley-Liss, New York, N. Y., 1991; Zalewski et al., Circulation Res., 88: 1190–1195, 1993); Calabretta et al., Seminars in Cancer Biol., 3: 391–398, 1992; Calabretta et al., Cancer Treatment Rev. 19: 169–179, 1993), Onkogene (z. B. p53, Bayever et al., Antisense Research and Development, 3: 383–390, 1993), Transkriptionsfaktoren (z. B. NF.kappa.B, Cogswell et al., J. Immunol., 150: 2794–2804, 1993) und virale Gene (z. B. Papillomaviren, Cowsert et al., Antimicrob. Agents and Chemo., 37: 171–177, 1993; Herpes Simplex Virus, Kulka et al., Antiviral Res., 20: 115–130, 1993). Ein weiteres geeignetes Ziel für Antisense-Therapie in Hyperplasie ist der Proteinbestandteil von Telomerase (siehe WO-99/50279 ), welcher häufig der begrenzende Be standteil bei Telomeraseexpression ist. Die Sequenz von menschlicher Telomerase-Umkehrtranskriptase wird in erteiltem U.S.-Patent 6093809 , in WO-98/14592 und in pGRN121 (ATCC Eingangsnummer 209016) vorgesehen. Um weiter zu veranschaulichen, sind zwei RNA-Regionen des HIV-1 Proteins, auf die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung gezielt werden kann, das REV-Protein-Respons-Element (RRE) und das TAT-Protein-Transaktivierungsrespons-Element (TAR). REV-Aktivität erfordert die Gegenwart des REV-Respons-Elements (RRE), welches sich im HIV-Envelope-Gen befindet (Malim et al., Nature, 338: 254–257, 1989; Malim et al., Cell, 58: 205–214, 1989).
  • Das RRE ist auf einer 234-Nukleotid-Region abgebildet worden, von welcher angenommen wird, dass sie vier Stammschleifenstrukturen und eine verzweigte Stammschleifenstruktur bildet (Malim et al., Nature, 338: 254–257, 1989). Aus diesen Fußabdruck-Untersuchungen erhaltene Daten (Holland et al., J. Virol., 64: 5966–5975, 1990; Kjems et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 683–687, 1991) legen nahe, dass REV an sechs Basepaare in einer Stammstruktur und an drei Nukleotide in einer angrenzenden Stammschleifenstruktur des RRE bindet. Eine minimale REV-Bindungsregion von etwa 40 Nukleotiden in Stammschleife II ist durch Cook et al., (Nucleic Acids Research, 19: 1577–1583) identifiziert worden. Auf diese Bindungsregion kann für Erzeugung von RNA/DNA-Duplexen (z. B. Li et al., J. Virol., 67: 6882–6888, 1993) unter Verwendung von einem oder mehreren Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung gezielt werden.
  • Das HIV-1 TAT ist für Virusreplikation wesentlich und ist ein wirkkräftiger Transaktivator von Long Terminal Repeat (LTR)-gesteuerter viraler Genexpression (Dayton et al., Cell, 44: 941–947, 1986; Fisher et al., Nature, 320: 367–371, 1986). Transaktivierung, herbeigeführt durch TAT-Protein, erfordert die Anwesenheit des TAR-Elements (siehe U.S.-Pat. Nr. 5837835 ), welche sich in dem untranslatierten 5'-Ende des viralen mRNA Elements befindet.
  • Das TAR-Element ist in der Lage, eine stabile Stammschleifenstruktur zu bilden (Muesing et al., Cell, 48: 691–701, 1987). Von der Integrität des Stamms und einer 3 Nukleotid (nt) Ausbuchtung am Stamm von TAR ist gezeigt worden, dass sie wesent lich für spezifische und Hoch-Affinität Bindung des TAT-Proteins an das TAR-Element ist (Roy et al., Genes Dev., 4: 1365–1373, 1990; Cordingley et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 8985–8989, 1990; Dingwall et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 6925–6929, 1989; Weeks et al., Science, 249: 1281–1285, 1990). Auf diese Region kann für Anti-Sense Therapie dem Verfahren der vorliegenden Erfindung folgend gezielt werden.
  • Zusätzlich zum Zielen auf die RNA-Bindungsstellen der REV-, RRE- und TAT-Proteine kann auf die RNA-Kodierungssequenzen für die REV- und TAT-Proteine selbst gezielt werden, um Expression der Proteine zu blockieren.
  • Anfängliches Screening von N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden, gesteuert, um potentielle Antisense-Zielstellen zu binden, schließt typischerweise Testen der thermischen Stabilität von sich ergebenden RNA/DNA-Duplexen ein. Wenn ein Thiophosphoramidat-Oligonukleotid identifiziert wird, das eine gewählte RNA-Zielsequenz bindet, wird das Oligonukleotid weiter auf Hemmung von RNA-Funktion in vitro getestet. Zellkultur-Testsysteme werden für solche in vitro Analyse verwendet (z. B. Herpes Simplex Virus, Kulka et al., Antiviral Res., 20: 115–130, 1993; HIV-1, Li et al., J. Virol., 67: 6882–6888, 1993, Vickers et al., Nucleic Acids Research, 19: 3359–3368, 1991; koronare Glattmuskelzellenproliferation in Restenose, Zalewski et al., Nucleic Acids Research, 15: 1699–1715, 1987; IL-2R, Grigoriev et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 3501–3505, 1993; c-myb, Baer et al., Blood, 79: 1319–1326, 1992; c-fos, Cutry et al., J. Biol. Chem., 264: 19700–19705, 1989; BCR/ABL, Szczylik et al., Science, 253: 562–565, 1991).
  • C. Anti-Gen Anwendungen
  • Hemmung von Genexpression über Triplexbildung ist vorhergehend gezeigt worden (Cooney et al., Science, 241: 456–459, 1989; Orson et al., Nucleic Acids Research, 19: 3435–3441, 1991; Postel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 8227–8231, 1991). Die erhöhte Stabilität von Triplexstrukturen, welche unter Einsatz von dritten Strang Thiophosphoramidat-Analog-Oligonukleotiden gebildet wurden, sieht ein stärkeres Werkzeug für Antigen-Anwendungen vor, einschließlich veterinären und menschlichen therapeutischen Anwendungen.
  • Eine Zielregion der Wahl wird ausgewählt, basierend auf be kannten Sequenzen unter Verwendung von Standardregeln für Triplexbildung (Helene und Toulme, Biochem. Biophys. Acta, 1049: 99–125, 1990). Typischerweise wird die Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Sequenz gegen doppelsträngige genetische Sequenzen gezielt, in welchen ein Strang vorwiegend Purine enthält und der andere Strang vorwiegend Pyrimidine enthält.
  • Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung werden auf Triplexbildung gegen eine gewählte Duplex-Zielsequenzen unter Verwendung von Bandverschiebungstests getestet (siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 5726297 , Beispiel 4). Typischerweise werden hochprozentige Polyacrylamidgels für Bandverschiebungstests verwendet und die Grade von Denaturierungsbedingungen (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Hohn Wiley and Sons, Inc. Media Pa.; Sauer et al., Hrsg., Methods in Enzymology Protein/DNA Interactions, Academic Press, 1991; Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Vol. 2, 1989) werden angepasst, um nicht-spezifische Hintergrundbindung zu verringern.
  • Das Duplex-Ziel wird markiert (zum Beispiel unter Verwendung eines radioaktiven Nukleotids) und mit einem dritten Strang Oligonukleotid gemischt, welches auf seine Fähigkeit getestet wurde, Triplexstrukturen mit dem Zielduplex zu bilden. Eine Verschiebung der Mobilität des markierten Duplex-Oligonukleotids zeigt die Fähigkeit des Oligonukleotids an, Triplexstrukturen zu bilden.
  • Triplexbildung wird in dem Bandverschiebungstest durch eine verringerte Mobilität in dem Gel der markierten Triplexstruktur bezogen auf die markierte Duplexstruktur angezeigt.
  • Zahlreiche potentielle Zielstellen können durch dieses Verfahren bewertet werden, einschließlich Zielstellen, welche aus einer vollen Bandbreite von DNA-Sequenzen ausgewählt werden, die in der Länge, als auch Komplexität variieren. Sequenzspezifische Thiophosphoramidat-Analog Bindungsmoleküle sind potentiell wirkkräftige Therapeutika für im Wesentlichen jede Krankheit oder Zustand, der in irgendeiner Weise DNA einbezieht. Beispielhafte Zielsequenzen für solche Therapeutika schließen ein: a) DNA-Sequenzen, welche an der Verbreitung und/oder Aufrecherhaltung von infektiösen Wirkstoffen beteiligt sind, wie Bakterien, Viren, Hefe oder andere Pilze, zum Beispiel den Metabo lismus eines infektiösen Wirkstoffs unterbrechend; und b) Sequenzen, welche unangemessene Expression oder Proliferation von zellulären Genen verursachen, wie Onkogene zum Beispiel, Blockieren oder Verringern der Transkription von unangemessen exprimierten zellulären Genen (wie Gene, welche mit bestimmten genetischen Störungen in Verbindung gebracht werden).
  • Genexpression oder Replikation kann durch Erzeugen von Triplexstrukturen in Regionen blockiert werden, von welchen bekannt ist, dass erforderliche regulatorische Proteine (oder Moleküle) an sie binden (zum Beispiel HIV-Transkription assoziierte Faktoren wie Promoter-Initiationsstellen und SP1-Bindungsstellen, McShan et al., J. Biol. Chem., 267: 5712–5721, 1992). Alternativ kann auch auf spezifische Sequenzen innerhalb von Proteinkodierenden Regionen von Genen (z. B. Onkogenen) gezielt werden.
  • Wenn ein Thiophosphoramidat-Analog-Oligonukleotid identifiziert wird, das eine gewählte Duplex-Zielsequenz bindet, Test, zum Beispiel durch den oben beschriebenen Gelbandverschiebung-Mobilitätstest, wird das Analog weiter auf seine Fähigkeit getestet, stabile Triplexstrukturen in vitro zu bilden. Zellkultur und in vivo Testsysteme, wie jene, welche in U.S.-Patent 5631135 beschrieben werden, werden verwendet.
  • Zielstellen können in der Kontrollregion der Gene gewählt werden, z. B. in der Transkriptionsinitiationsstelle oder Bindungsregionen von regulatorischen Proteinen (Helene und Toulme, 1990; Birg et al., 1990; Postel et al., 1991; Cooney et al., 1988). Auch können Zielstellen so gewählt werden, dass das Ziel auch in mRNA-Sequenzen besteht (also einer transkribierten Sequenz), was es gegen die Stelle gerichteten Oligonukleotiden ermöglicht, auch als Antisense-Mediatoren zu fungieren (siehe oben).
  • Auch können Thiophosphoramidat-modifizierte DNA-Moleküle verwendet werden, um Triplexmoleküle mit einem dritten Strangziel zu erzeugen (also eine Einzelstrang-Nukleinsäure). Zum Beispiel kann ein DNA-Molekül mit zwei Regionen, welches in der Lage ist, eine Triplexstruktur mit einem gewählten dritten Strang Zielmolekül zu bilden, synthetisiert werden. Typischerweise werden zwei Regionen durch eine flexible Region verbunden, was die Assoziierung der beiden Regionen mit dem dritten Strang ermöglicht, um ein Triplex zu bilden.
  • Gelenkregionen können eine flexible Verbindung umfassen, die die beiden Triplex-bildenden Regionen zusammen hält, und es ihnen ermöglicht, mit dem dritten Strang zu assoziieren, um das Triplex zu bilden. Dritter-Strang Ziele werden ausgewählt, passenden Purin/Pyrimidin-Gehalt zu haben, um so Bildung von Triplexmolekülen zu ermöglichen.
  • Die flexible Verbindung kann zwei Triplex-bildende Regionen (typischerweise komplementäre DNA-Stränge) in einer gewählten Ausrichtung abhängig von der Natur der Basesequenz des Ziels verbinden. Zum Beispiel haben zwei Triplex-bildende Regionen jeweils 5' und 3' Enden, diese Enden können durch die flexible Gelenkregion in den folgenden Ausrichtungen verbunden werden: 5' zu 3', 3' zu 5', 3' zu 3' und 5' zu 5'.
  • Ferner können Duplex-DNA-Moleküle, welche mindestens eine Thiophosphoramidat-Verbindung in jedem Strang enthalten, als Ködermoleküle für Transkriptionsfaktoren oder DNA-bindende Proteine (z. B. c-myb) verwendet werden.
  • Einzelsträngige DNA kann ebenfalls als Zielnukleinsäure für Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von zum Beispiel Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindung enthaltenden Haarnadelstrukturen verwendet werden. Zwei Thiophosphoramidat-Analog-Oligonukleotide können für einzelsträngige DNA zielgerichtete Bindung gewählt werden. Bindung der beiden Phosphoramidat-Analog-Stränge an das einzelsträngige DNA-Ziel ergibt Bildung eines Triplex.
  • D. Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Die vorliegende Erfindung schließt pharmazeutische Zusammensetzungen ein, welche in Antisense- und Antigen-Therapien brauchbar sind. Die Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge von N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Ein oder mehr N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide (mit unterschiedlichen Basesequenzen oder Verbindungen) können in einer gegebenen Formulierung eingeschlossen werden.
  • Die N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können, wenn sie in therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden, rein oder mit der Zugabe eines pharmazeutischen Trägers formuliert werden. Der pharmazeutische Träger kann fest oder flüssig sein. Die Formulierung wird dann in einer therapeutisch wirksamen Dosis an ein Objekt verabreicht, das dessen bedarf.
  • Flüssige Träger können bei der Herstellung von Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und unter Druck stehende Zusammensetzungen verwendet werden. Die N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide werden in einem pharmazeutisch annehmbaren flüssigen Arzneimittelträger gelöst oder suspendiert. Geeignete Beispiele für flüssige Träger für parenterale Verabreichung von N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Präparate schließen Wasser (teilweise Zusatzstoffe enthaltend, z. B. Cellulosederivate, vorzugsweise Natriumcarboxymethylcelluloselösung), Alkohole (einschließlich einwertige Alkohole und mehrwertige Alkohole, z. B. Glycole) und ihre Derivate, und Öle (z. B. fraktioniertes Kokosöl und Arachisöl) ein. Der flüssige Träger kann weitere geeignete pharmazeutische Zusatzstoffe enthalten, einschließlich, aber nicht begrenzt auf die folgenden: Aufschlussmittel, Suspensionsmittel, Emulgatoren, Puffer, Verdickungsmittel, Farbstoffe, Viskositätsregulatoren, Konservierungsstoffe, Stabilisatoren und Osmolaritätsregulatoren.
  • Für parenterale Verabreichung von N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden kann der Träger auch ein öliger Ester wie Ethyloleat und Isopropylmyristat sein. Sterile Träger sind in Zusammensetzungen in steriler flüssiger Form für parenterale Verabreichung brauchbar.
  • Sterile flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen, Lösungen oder Suspensionen können durch zum Beispiel intraperitoneale Injektion, subkutane Injektion, intravenös oder topisch genutzt werden. Zum Beispiel können gegen retinale Zytomegalovirusinfektion gerichtete Antisense-Oligonukleotide topisch durch Augentropfen verabreicht werden. N3'->P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können ebenfalls intravaskulär oder durch einen vaskulären Stent, imprägniert mit Mycophenolsäure zum Beispiel während Ballon-Katheterisierung verabreicht werden, um lokalisierte Anti-Restenose-Wirkungen direkt nach Verletzung vorzusehen.
  • Der flüssige Träger für unter Druck stehende Zusammensetzungen kann halogenierter Kohlenwasserstoff oder anderes pharmazeutisch annehmbares Treibmittel sein. Solche unter Druck stehenden Zusammensetzungen können für Abgabe durch Inhalation auch Lipidverkapselt sein. Für Verabreichung durch intranasale oder in trabronchiale Inhalation oder Insufflation können N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide in eine wässerige oder teilweise wässerige Lösung formuliert werden, welche dann in Form eines Aerosols zum Beispiel für Behandlung von Infektionen der Lungen wie Pneumocystis carnii genutzt werden kann.
  • N3'-P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können topisch als eine Lösung, Creme oder Lotion durch Formulierung mit pharmazeutisch annehmbaren Vehikeln, welche die wirksame Verbindung enthalten, verabreicht werden. Zum Beispiel für die Behandlung von Genitalwarzen.
  • Die N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können in Liposomträgern verabreicht werden. Die Verwendung von Liposomen, um zelluläre Aufnahme zu erleichtern, wird zum Beispiel in U.S.-Patent Nr. 4897366 und U.S.-Patent Nr. 4394448 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die Formulierung und Herstellung von Liposomen.
  • Die Dosierungserfordernisse für Behandlung mit N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden variieren mit den besonderen eingesetzten Zusammensetzungen, dem Verabreichungsweg, der Schwere der gezeigte Symptome, der Form von N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden und dem besonderen behandelten Objekt.
  • Zur Verwendung als ein wirksamer Inhaltsstoff in einem pharmazeutischen Präparat wird ein Oligonukleotid dieser Erfindung im Allgemeinen von anderen reaktiven oder potentiell immunogenen Bestandteilen weg gereinigt, welche in dem Gemisch vorhanden sind, in welchem sie hergestellt werden. Typischerweise wird jeder wirksame Inhaltsstoff in mindestens etwa 90% Homogenität und bevorzugter 95% oder 99% Homogenität vorgesehen, wie durch funktionale Tests, Chromatographie oder Gel-Elektrophorese bestimmt. Der wirksame Inhaltsstoff wird dann in Übereinstimmung mit allgemein anerkannten Verfahren für die Herstellung von pharmazeutischen Präparaten in ein Medikament vermischt.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können in einer Formulierung und in einer Menge an ein Objekt verabreicht werden, welche wirksam ist, ein klinisch wünschenswertes Ergebnis zu erzielen. Für die Behandlung von Krebs schließen wünschenswerte Ergebnisse Verringerung der Tumormasse (wie durch Palpation oder Bildgebung bestimmt; z. B. durch Radiographie, CAT-Scan oder MRI), Verringerung der Rate des Tumorwachstums, Verringerung der Rate von Metastasenbildung (wie z. B. durch histochemische Analyse von Biopsieproben bestimmt), Verringerung an biochemischen Markern (einschließlich allgemeinen Markern wie ESR und Tumor-spezifischen Markern wie Serum-PSA) und Verbesserung von Lebensqualität (wie durch klinische Tests, z. B. Karnofsky-Bewertung bestimmt) ein. Für die Behandlung von Virusinfektion schließen wünschenswerte Ergebnisse Verringerung oder Beseitigung der Infektion, der Bildung von infektiösen Partikeln oder Auflösung von mit Krankheit in Verbindung stehenden Symptomen ein.
  • Die Menge an Oligonukleotid pro Dosis und die Anzahl an Dosen, welche erforderlich ist, solche Wirkungen zu erzielen, kann empirisch unter Verwendung von in vitro Tests und Tiermodellen bestimmt werden (veranschaulicht in Beispiel 9). Eine angemessene Bandbreite für das Testen kann von der 50% hemmenden Konzentration geschätzt werden, welche mit isolierter Telomerase oder kultivierten Zellen bestimmt wurde. Präparate von isolierter Telomerase können gemäß U.S.-Patent 5968506 erhalten werden. Typischerweise werden die Formulierung und der Verabreichungsweg eine lokale Konzentration an der Krankheitsstelle von zwischen 1 μM und 1 nM für ein stabiles Oligonukleotid von 12–15 Nukleosiden vorsehen, das 100% identisch ist mit einer Enzymspezifischen RNA-Zielsequenz. Die letztendliche Verantwortung zum Bestimmen des Verabreichungsprotokolls ist in den Händen des leitenden Arztes.
  • Im Allgemeinen werden N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide bei einer Konzentration verabreicht, die wirksame Ergebnisse bringt, ohne nachteilige oder schädliche Nebenwirkungen zu verursachen (z. B. eine wirksame Menge). Solch eine Konzentration kann durch Verabreichung von entweder einer einzelnen Einheitsdosis oder durch die Verabreichung der Dosis, geteilt in bequeme Untereinheiten bei geeigneten Intervallen über den Tag erreicht werden.
  • E. Diagnostische Anwendungen
  • Die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls in diagnostischen Tests für Nachweis von RNA oder DNA mit einer gegebenen Zielsequenz brauchbar. In einer allgemeinen Anwendung werden die Thiophosphoramidat- Oligonukleotide markiert (z. B. isotopisch oder andere nachweisbare Reportergruppe) und als Sonden für DNA- oder RNA-Proben verwendet, die an einen festen Träger (z. B. Nylonmembranen) gebunden sind.
  • Alternativ können die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide an einen festen Träger (zum Beispiel magnetische Perlen) und homologe RNA- oder DNA-Moleküle in einer Probe, getrennt von anderen Bestandteilen der Probe gebunden sein, basierend auf ihrer Hybridisierung an die immobilisierten Phosphoramidat-Analoga. Bindung von Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden an einen festen Träger kann durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden. Gegenwart der gebundenen RNA oder DNA kann durch Standardverfahren nachgewiesen werden, z. B. unter Verwendung eines zweiten markierten Reporters oder Polymerase-Kettenreaktion (siehe U.S.-Pat. Nr. 4683195 und 4683202 ).
  • Diagnostische Tests können gemäß Standardverfahren mit geeigneter Anpassung der Hybridisierungsbedingungen durchgeführt werden, um Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Hybridisierung an die Zielregion zu ermöglichen. Die Fähigkeit von Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden, bei erhöhter Temperatur zu binden, kann ebenfalls helfen, Wettbewerb für Bindung an eine Zielsequenz zwischen der Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Sonde und einem entsprechenden einzelsträngigen Phosphodiester-Oligonukleotid zu minimieren, der in der diagnostischen Probe vorhanden ist.
  • Thiophosphoramidat-Oligonukleotide, entworfen zur Verwendung in Hybridisierungstests und anderen Protokollen, welche in dieser Offenbarung beschrieben werden, können in Kit-Form verpackt sein. Das Oligonukleotid wird in einem Behälter vorgesehen, typischerweise in einem Puffer, der für Langzeitlagerung geeignet ist, und wird gegebenenfalls durch andere Reagenzien, Standards oder Kontrollen begleitet, welche beim Durchführen der Umsetzung brauchbar sind. Typischerweise wird das Kit ebenfalls durch schriftliche Angaben zur Verwendung des Oligonukleotids in einer Hybridisierungsumsetzung oder einem diagnostischen Tests entweder als eine Produkteinlage oder durch hinzugefügte Literatur beim Verteilen oder Vermarkten des Kits begleitet.
  • F. Weitere Anwendungen
  • In einem Aspekt können die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide in Verfahren verwendet werden, um Isolierung von RNA oder DNA aus Proben zu verstärken. Zum Beispiel können Thiophosphoramidat-Oligonukleotide wie oben diskutiert an einem festen Träger fixiert und verwendet werden, um komplementäre Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, zum Beispiel Reinigung einer spezifischen mRNA von einer polyA-Fraktion (Goldberg et al. Methods in Enzmology, 68: 206, 1979). Die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide sind für solche Anwendungen vorteilhaft, da sie stabilere Interaktionen mit RNA und Duplex-DNA bilden können, als Standard Phosphodiester-Oligonukleotide.
  • Eine große Anzahl an Anwendungen in der Molekularbiologie kann für Reporter-markierte Thiophosphoramidat-Oligonukleotide gefunden werden, insbesondere für den Nachweis von RNA in Proben. Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können mit radioaktiven Reportern (3H, 14C, 32P oder 35S Nukleosiden), Biotin oder fluoreszierenden Markierungen markiert werden (Gryaznov et al., Nucleic Acids Research, 20: 3403–3409, 1992). Markierte Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können als effiziente Sonden in zum Beispiel RNA-Hybridisierungsumsetzungen verwendet werden (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Hohn Wiley and Sons, Inc., Media, PA; Sambrook et al., In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 1989).
  • Doppelsträngige DNA-Moleküle, wo jeder Strang mindestens eine Thiophosphoramidat-Verbindung enthält, können ebenfalls für die Isolierung von DNA-Duplex Bindungsproteinen verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden die Duplex-enthaltenden Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen typischerweise an einen festen Träger angeheftet und Probe, welche ein vermutetes Bindungsprotein enthält, wir dann über den Träger unter Pufferbedingungen passiert, die die Bindung des Proteins an sein DNA-Ziel erleichtern. Das Protein wird typischerweise durch Verändern der Pufferbedingungen aus der Säule eluiert.
  • Die oben beschriebenen Triplex-bildenden DNA-Moleküle, welche Thiophosphoramidat-modifizierte Verbindungen enthalten, können ebenfalls als diagnostische Reagenzien verwendet werden, um zum Beispiel die Gegenwart eines DNA-Moleküls in einer Probe nachzuweisen.
  • Ferner können Komplexe, welche Oligonukleotide mit N3'->P5' Thiophosphoramidat-Interuntereinheit-Verbindungen enthalten, verwendet werden, um nach brauchbaren kleinen Molekülen oder Bindungsproteinen zu sieben: zum Beispiel können N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Komplexe mit Duplex-DNA verwendet werden, um nach kleinen Molekülen zu sieben, welche in der Lage sind, die Triplex-Struktur weiter zu stabilisieren. Ähnliche Screens sind mit N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotid-Komplexen, gebildet mit einzelsträngigen DNA- und RNA-Molekülen brauchbar.
  • G. Variationen
  • Variationen der Thiophosphoramidat-Oligonukleotide, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen Modifikationen ein, um Aufnahme des Oligonukleotids durch die Zelle zu erleichtern (z. B. die Addition einer Cholesterin-Komponente (Letsinger, U.S.-Pat. Nr. 4958013 ); Herstellung von chimeren Oligonukleotiden unter Verwendung anderer Interuntereinheit-Verbindungen (Goodchild, Bioconjugate Chem., 1: 165–187, 1990); Modifikationen mit interkalierenden Wirkstoffen (zum Beispiel Triplex-stabilisierende interkalierende Wirkstoffe, Wilson et al., Biochemistry, 32: 10614–10621, 1993); und Verwendung von Ribose statt Deoxyribose-Untereinheiten.
  • Weitere Modifikationen schließen 5'- und 3'-terminale Modifikationen der Oligonukleotide ein (z. B. --OH, --OR, --NHR, --NH2 und Cholesterin). Zusätzlich kann die Ribose 2'-Position die Stelle von zahlreichen Modifikationen sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Halogenierung (z. B. --F).
  • N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotide können ebenfalls durch Konjugation an ein Polypeptid modifiziert werden, das durch spezifische Zellen aufgenommen wird. Solche brauchbaren Polypeptide schließen Peptidhormone, Antigene und Antikörper ein. Zum Beispiel kann ein Polypeptid gewählt werden, das spezifisch durch eine neoplastische Zelle aufgenommen wird, was spezifische Abgabe von N3'->P5' Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden an diesen Zelltyp ergibt. Das Polypeptid und Oligonukleotid können durch Mittel gekoppelt werden, die nach Stand der Technik bekannt sind (siehe zum Beispiel PCT-Internationale Anmeldung Veröffentlichungsnummer PCT/US89/02363, WO8912110 , veröffentlicht am 14. Dez. 1989, Ramachandr, K. et al.).
  • Die Eigenschaften von solchen modifizierten Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden können, wenn sie auf die Verfahren der vor liegenden Erfindung angewendet werden, durch die hierin beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
  • Beispiel 1
  • Allgemeine Verfahren
  • 31P NMR Spektren wurden an einem Varian Mhz Spektrometer erhalten. 31P NMR Spektren wurden auf 85% wässerige Phosphorsäure bezogen. Anionenaustausch-HPLC wurde unter Verwendung eines Dionex DX 500 Chromatography Systems mit einer Pharmacia Bitotech Mono Q HR 5/5 oder 10/16 Ionenaustauschsäulen durchgeführt. Massenspektralanalyse wurde durch Mass Consortium, San Diego, CA durchgeführt. MALDI-TOF Analyse von Oligonukleotiden wurden unter Verwendung eines PerSpective Biosystems Voyager Elite Massenspektrometers mit verzögerter Extraktion erhalten. Thermische Dissoziationsversuche wurden an einem Cary Bio 100 UV-Vis Spektrometer durchgeführt.
  • Alle Umsetzungen wurden in ofengetrockneter Glasware unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt, sofern nicht anders angeführt. Kommerziell erhältliche DNA-Synthesereagenzien wurden von Glen Research (Sterling, VA) erworben. Wasserfreies Pyridin, Toluol, Dichlormethan, Diisopropylethylamin, Triethylamin, Essigsäureanhydrid, 1,2-Dichlorethan und Dioxan wurden von Aldrich (Milwaukee, WI) erworben.
  • Alle Nicht-Thiophosphoramidat-Oligonukleotide wurden an einem ABI 392 oder 394 DNA Synthetisierer unter Verwendung von Standardprotokollen für den Phosphoramidit-basierten Kopplungsansatz synthetisiert (Caruthers, Acc. Chem. Res., 24: 278–284, 1991). Der Kettenzusammenfügungszyklus für die Synthese von Oligonukleotid-Phosphoramidaten war wie folgt: (i) Detritylierung, 3% Trichloressigsäure in Dichlormethan, 1 Min.; (ii) Kopplung, 0,1 M Phosphoramidit und 0,45 M Tetrazol in Acetonitril, 10 Min.; (iii) Abdeckung, 0,5 M Isobuttersäureanhydrid in THF/Lutidin, 1/1, Vol./Vol., 15 Sek.; und (iv) Oxidation, 0,1 M Iod in THF/Pyridin/Wasser, 10/10/1, Vol./Vol./Vol., 30 Sek.
  • Chemischen Schritten innerhalb des Zyklus folgte Acetonitril-Wäsche und Spülen mit trockenem Argon für 0,2–0,4 Min. Abspaltung vom Träger und Entfernung der Base und Phosphoramidat-Schutzgruppen wurde durch Behandlung mit Ammoniak/EtOH, 3/1, Vol./Vol. für 6 Std. bei 55°C erreicht. Die Oligonukleotide wurden in vacuo zu Trockenheit konzentriert, wonach die 2'-t- Butyldimethylsilylgruppen durch Behandlung mit 1M TBAF in THF für 4–16 Std. bei 25°C entfernt wurden. Die Umsetzungsgemische wurden mit Wasser verdünnt und durch eine 0,45 Nylon Acrodisc (von Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) filtriert. Oligonukleotide wurden dann analysiert und durch IE HPLC gereinigt und schließlich unter Verwendung von Gelfiltration an einer Pharmacia NAP-5 oder NAP-25 Säule entsalzen. Gradientbedingungen für IE HPLC: Lösungsmittel A (10 mM NaOH), Lösungsmittel B (10 mM NaOH und 1,5 M NaCl); Lösungsmittel A für 3 Min., dann ein linearer Gradient 0–80% Lösungsmittel B innerhalb von 50 Min.
  • Beispiel 2
  • Synthese von Arabino-fluoroligonukleotid N3'->P5' Phosphoramidaten
  • Die Festphasensynthese von Oligo-2'-arabino-fluornukleotid N3'->P5' Phosphoramidaten basierte auf der Phosphoramidit-Transferreaktion unter Einsatz der Monomer-Bausteine – 5'-(O-Cyanoethyl-N,N'-diisopropylamino)-phosphoramidite von 3'-MMTr-geschützten-3'-amino-2'-ara-fluornukleosiden. Herstellung der Nukleosidmonomere wird in Schema 4 skizziert. Schema 4
    Figure 00390001
    • i. Hbr; ii. TMS-Basen, TMSOTf; iii. NH3/MeOH; iv. DIAD, PPH3 BzOH; V. LIN3 vi. H2/Pd; vii. MMTCI; viii. NaOH/EtOH; ix. CEOPCIN(iPr)
  • Zuckervorläufer 1 (von Pfanstiehl) wurde in die α-1-Brom Zwischenverbindung 2 mit Erhalt der Zucker C-1 Konfiguration umgewandelt. Verbindung 2 wurde dann ohne Isolierung für eine SN2- Typ Glycosylierungsumsetzung mit silylierten Uracil und Thyminbasen verwendet, was Bildung von Nukleosiden 3 ergab. Stereoselektivität der Glycosylierungsumsetzung war ziemlich hoch – mehr als 90% des gebildeten Nukleosid 3 hatten die gewünschte β-anomere Konfiguration, wie durch 1H NMR Analyse des Umsetzungsgemisches beurteilt wurde. Das reine β-Isomer von Nukleosid 3 wurde durch Kristallisation aus Ethanol isoliert. Nachfolgend wurden 5'- und 3'-O-Benzoyl-Schutzgruppen von 3 in nahe quantitativen Ausbeuten durch Behandlung mit methanolischem Ammoniak entfernt. Die sich ergebenden 5'-,3'-Hydroxylgruppen, welche Nukleosidprodukt enthielten, wurden dann unter Mitsunobu-Umsetzungsbedingungen in das 2,3'-Anhydronukleosid 4 umgewandelt. Die Behandlung der 2,3'-Anhydronukleoside mit Lithiumazid ergab den 3'-Azido Schlüsselvorläufer 5. Diese Verbindung wurde dann in Phosphoramidite 7t,u umgewandelt durch die katalytische Reduktion von 3'-Azido zu 3'-Aminogruppe durch Hydrierung, gefolgt von 3'-Tritylierung, 5'-O-Entschützung und 5'-O-Phosphitylierung. Cytidinphosphoramidit 7c wurde unter Verwendung des Uracil-zu-Cytosin Umwandlungsverfahrens aus dem 3'-Azido-Vorläufer erhalten. Gesamtausbeuten der Phosphoramidite 7c,t,u waren im Bereich von 8–12%, basierend auf dem anfänglichen Zuckervorläufer 1. Die Struktur der Monomere wurde durch 1H, 31P, 19F NMR und durch massenspektrometrische Analyse bestätigt. Oligonukleotidsynthese unter Verwendung des 2'-Arabinofluornukleotid-monomers wurde dann an einem automatisierten DNA/RNA ABI 394 Synthetisierer wie unten beschrieben durchgeführt.
  • Beispiel 3
  • Synthese von Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidaten
  • Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidate wurden durch die Amidit-Transferumsetzung an einem ABI 394 Synthetisierer hergestellt. Die vollständig geschützten Monomer-Bausteine waren 3'-Aminotritylnukleosid-5'-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)-phosphoramidit, wo Nukleosid 3'-Deoxy-thymidin, 2',3'-Dideoxy-N2-isobutyryl-guanosin, 2',3'-Dideoxy-N6-benzoyl-adenosin oder 2',3'-Dideoxy-N4-benzoyl-cytidin ist. 5'-Succinyl-3'-aminotrityl-2',3'-dideoxynukleoside wurden mit einer Aminogruppe gekoppelt, welche langkettig kontrolliertes Porenglas (LCAA-CPG) enthielt und als festen Träger verwendete. Die Synthese wurde in der Richtung von 5' zu 3' durchgeführt. Das folgende Protokoll wurde für das Zusammenfügen von Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidaten verwendet: (i) Detritylierung, 3% Dichloressigsäure in Dichlormethan; (ii) Kopplung, 0,1 M Phosphoramidit und 0,45 M Tetrazol in Acetonitril, 25 Sek.; (iii) Abdeckung, Isobuttersäureanhydrid/2,6-Lutidin/THF 1/1/8 Vol./Vol./Vol. als Cap A und Standard Cap B Lösung; (iv) Schwefelung, 15% S8 in Kohlendisulfid, welches 1% Triethylamin enthält, 1 Min. Vor und nach dem Schwefelungsschritt wurde die Säule mit reinem Kohlendisulfid gewaschen, um Ausfällung von elementarem Schwefel zu verhindern. Die Oligonukleotid-Thiophosphoramidate wurden vom festen Träger abgespalten und mit konzentriertem wässerigen Ammoniak entschützt. Die Verbindungen wurden durch HPLC analysiert und gereinigt. Ionenaustausch (IE) HPLC wurde unter Verwendung von DIONEX DNAPacTM-Ionenaustauschsäule bei pH 12 (10 mM NaOH) mit einem 1%/Min. linearen Gradienten von 10 mM NaOH in 1,5 M NaCl und einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. durchgeführt. Die Produkte wurden an Sephadex NAP-5 Gelfiltrationssäulen (Pharmacia) entsalzen und in vacuo lyophilisiert. 31P NMR Versuche wurden in Deuteriumoxid durchgeführt, um das Ausmaß der Schwefelungsanalyse zu analysieren (31P NMR δ, ppm 58, 60 breite Signale Rp, Sp Isomere).
  • Oligonukleotid-Thiophosphoramidat 5'-GTTAGGGTTAG-3' (SEQ I.D. Nr. 1) wurde auf folgende Weise synthetisiert: Ein ABI Model 394 Synthetisierer wurde mit 0,1 M Lösungen von 3'-Tritylamino-2',3'-dideoxy-N6-benzoyl-adenosin (N2-Isobutyrylguanosin und Thymidin) 5'-(2-Cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramiditen aufgesetzt. Die Reagensflasche von Station Nr. 10 wurde mit reinem Kohlendisulfid gefüllt und Reagensflasche Nr. 15 wurde mit einer Lösung aus 1% Triethylamin enthaltendem 15% S8 in Kohlendisulfid befüllt. Als Aktivator wurde die kommerziell erhältliche 0,45 M Lösung aus Tetrazol in Acetonitril verwendet. Cap A Lösung (Station Nr. 11) wurde durch Tetrahydrofuran/Isobuttersäureanhydrid/2,6-Lutidin 8/1/1 Vol./Vol./Vol. Lösung ersetzt. Cap B war ebenfalls das kommerziell erhältliche Reagens. Eine neue Funktion wurde erzeugt, um Kohlendisulfid von Station Nr. 10 zur Säule zu liefern. Der Standard-Schwefelsynthesezyklus wurde auf folgende Weise modifiziert: Schwefelungszeit wurde auf 1 Min. eingestellt und vor und nach Schwefelung wurde Kohlendisulfid für 20 S. zur Säule geliefert. Die Synthesesäule wurde mit 1 μmol auf festem Träger N2-Isobutyryl-3'-(trityl)amino-2',3'-dideoxyguanosin-5'-succinylgeladenem CPG (kontrolliertes Porenglas) gefüllt. Die Sequenz der Verbindung wurde als GATTGGGATTG (5'->3') (SEQ I.D. Nr. 11) programmiert. Die Tritylgruppe wurde am Ende der Synthese entfernt und die Säule wurde manuell mit Kohlendisulfid und Acetonitril gewaschen. Der feste Träger wurde aus der Säule entfernt und mit 1 ml konzentriertem wässerigen Ammoniak bei 55°C für 6 Std. in einer eng geschlossenen Glasviale behandelt. Nach Filtration wurde das meiste des Ammoniak abgedampft und die verbleibende Lösung wurde unter Verwendung von SephadexTM NAP-5 Gelfiltrationssäulen (Pharmacia) entsalzen, gefolgt von Lyophilisierung in vacuo. Das Produkt wurde wie oben beschrieben analysiert und gereinigt. Alle anderen in Tabelle 2 aufgelisteten Thiophosphoramidat-Oligonukleotide (SEQ I.D. Nr. 2–4) wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren synthetisiert.
  • Beispiel 4
  • Säurestabilität und Duplex-Bildungseigenschaften von Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidaten
  • Oligonukleotid-Thiophosphoramidate zeigten unerwarteterweise eine erhöhte Säurestabilität bezogen auf Phosphoramidat-Gegenstücke. Man könnte erwartet haben, dass Substitution des Nicht-Brücken Sauerstoffs in der Internukleotid-Phosphatgruppe mit Schwefel wegen dem Unterschied in den Elektronen-spendenden Eigenschaften von Schwefel gegenüber Sauerstoff, was die Protonierung des 3'-NH leichter gemacht haben könnte, eine Verringerung der Säurestabilität des Phosphoramidats hätte ergeben sollen. Jedoch wurde im Gegensatz zu dieser Vorhersage von den Thiophosphoramidat-Internukleotid-Verbindungen gefunden, dass sie säurestabiler sind, als ihre Oxo-Phosphoramidat-Gegenstücke.
  • Die Halbwertszeiten von Thiophosphoramidat TAG3T2AGACA2 (SEQ I.D. Nr. 2) und seinem Phosphoramidat-Gegenstück in 40% wässeriger Essigsäure bei Raumtemperatur waren annähernd 6 Stunden, beziehungsweise 0,5 Stunden gemäß IE HPLC Analyse (siehe Tabelle 1). Darüber hinaus war die Zusammensetzung der Hydrolyseprodukte zwischen dem Thiophosphoramidat und seinem Phosphoramidat-Gegenstück unterschiedlich. Die Säurehydrolyse des Thiophosphoramidats scheint anfänglich Entschwefelung zu ergeben, statt Ab spaltung von Internukleosid N-P-Gruppen, wie es bei den Phosphoramidaten auftritt. Diese Ergebnisse zeigen eine viel höhere Resistenz gegen saure Bedingungen der Thiophosphoramidate an, als die der Phosphoramidat-Oligonukleotide, was somit darauf hinweist, dass diese neuartige Klasse von Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden verbessertes Potential für die Entwicklung von oralen Oligonukleotid-Therapeutika hat im Vergleich mit anderen Phosphoramidat-Oligonukleotiden. TABELLE 1
    Vers. Oligomer Typa Tm, °Cb –Tm, °Cc Säurestabilitätd
    1. GTTAGGGTTAG SEQ I.D. Nr. 1 po 44,2 -
    2. TAGGGTTAGACAA SEQ I.D. Nr. 2 po 45,2 -
    3. Wie Vers. 1 np 72,1 27,9
    4. Wie Vers. 2 np 71,7 26,5 0,5 Std.
    5. Wie Vers. 1 nps 71,5 27,3
    6. Wie Vers. 2 nps 70,0 24,8 6 Std.
    • apo, np, nps entsprechen Phosphodiester, N3'->P5' Phosphoramidat, beziehungsweise Thiophosphoramidat-Gruppen;
    • bFließtemperatur, Tm (±0,5°C) der Duplexe, gebildet mit einem komplementären natürlichen RNA-Oligomer in 150 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4;
    • cErhöhung von Tm bezogen auf das natürliche Phosphodiester-Gegenstück;
    • dHalbwertzeit von Oligonukleotid in 40% wässeriger Essigsäure bei Raumtemperatur.
  • Duplex-Bildungseigenschaften von Oligonukleotid-Phosphoramidaten mit komplementärem RNA-Strang wurden unter Verwendung thermischer Dissoziationsversuche bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 zusammengefasst. Die gezeigten Daten zeigen, dass die Oligonukleotid-Thiophosphoramidate signifikant stabilere Komplexe bildeten, als die isosequenziellen natürlichen Phosphodiester-Oligomere, wobei der Unterschied in Tm ~25–27°C pro Oligomer war. Auch war die Erhöhung der thermischen Stabilität von Duplexen ähnlich der, welche für die Phosphoramidat-Oligomere beobachtet wurde. Dies zeigt an, dass die Substitution von nicht-überbrückendem Sauerstoff durch Schwefelatom in der Internukleosid-Phosphoramidatgruppe RNA-Bindungseigenschaften dieser Verbindungen nicht signifikant veränderte, was durch N-Typ Zuckerwinkelung der 3'-Aminonukleoside und durch erhöhte Zuckerphosphat-Grundgerüst-Hydrierung bestimmt wurde.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von Affinität-gereinigtem Extrakt mit Telomeraseak tivität
  • Extrakte, welche für Screening von Telomerasehemmern verwendet werden, wurden routinemäßig aus 293 Zellen hergestellt, welche die Protein-katalytische Untereinheit von Telomerase (hTERT) überexprimieren. Von diesen Zellen wurde gefunden, dass sie 2–5-mal mehr Telomeraseaktivität haben, als 293 Stammzellen. 200 ml gepackte Zellen (geerntet von etwa 100 Litern Kultur) wurden in einem gleichen Volumen an hypotonischem Puffer (10 mM Hepes pH 7,9, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 20 mM KCl, 1 mM PMSF) resuspendiert und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators lysiert. Die Glycerolkonzentration wurde auf 10% angepasst und NaCl wurde langsam zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,3 M zu ergeben. Die lysierten Zellen wurden für 30 Min. gerührt und dann bei 100000 × g für 1 Std. pelletiert. Festes Ammoniumsulfat wurde zum S100 Flüssigkeitsüberstand zugegeben, um 42% Sättigung zu erreichen. Das Material wurde zentrifugiert; das Pellet wurde in einem Fünftel des Ursprungsvolumens resuspendiert und gegen 50 mM NaCl enthaltenden Puffer „A" dialysiert. Nach Dialyse wurde das Extrakt für 30 Min. bei 25000 × g zentrifugiert. Vor Affinitätschromatographie wurden Triton X-100TM (0,5%), KCl (0,3 M) und tRNA (50 μg/ml) zugegeben. Affinität Oligo (5' BiotinTEG-BiotinTEG-BiotinTEG-GTA GAC CTG TTA CCA guu agg guu ag 3' [SEQ I.D. Nr. 5]; unterer Kasten stellt 2' O-Methylribonukleotide dar und oberer Kasten stellt Deoxynukleotide dar) wurde zum Extrakt zugegeben (1 nmol pro 10 ml Extrakt). Nach Inkubation für 10 Min. bei 30°C wurden Neutravidinperlen (Pierce; 250 μl einer 50% Suspension) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei 4°C rotiert. Die Perlen wurden pelletiert und dreimal mit 0,3 M KCl enthaltendem Puffer „B", zweimal mit 0,6 M KCl enthaltendem Puffer „B" und zweimal mehr mit 0,3 M KCl enthaltendem Puffer B gewaschen. Telomerase wurden in 0,3 M KCl, 0,15% Triton X-100TM und einen 2,5 molaren Überschuss von Verdrängungs-Oligo (5'-CTA ACC CTA ACT GGT AAC AGG TCT AC-3' [SEQ I.D. Nr. 6] bei 0,5 ml pro 125 μl von gepackten Neutravidinperlen) enthaltendem Puffer „B" für 30 Min. bei Raumtemperatur eluiert. Eine zweite Elution wurde durchgeführt und mit der ersten vereinigt. Gereinigte Extrakte hatten typischerweise spezifische Aktivitäten von 10 fmol Nukleotiden eingeschlossen/Min./μl Extrakt oder 200 Nukleotide/Min./mg Gesamtprotein.
    Puffer „A" Puffer „B"
    20 mM Hepes pH 7,9 20 mM Hepes pH 7,9
    1 mM MgCl2 1 mM EDTA
    1 mM DTT 1 mM DTT
    1 mM EGTA 10% Glycerol
    10% Glycerol 0,5 Triton X-100TM
  • Beispiel 6
  • Telomerasehemmung durch Oligonukleotid N3'->P5' Thiophosphoramidate
  • Drei getrennte 100 μl Telomerasetests werden mit den folgenden Pufferlösungen aufgestellt: 50 mM Tris-Acetat, pH 8,2, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 100 mM K-Acetat, 500 μM dATP, 500 μM TTP, 10 μM [32P-]dGTP (25 Ci/mmol) und 100 nM d(TTAGGG)3 [SEQ I.D. Nr. 7]. Zu den individuellen Umsetzungen werden 2,5, 5 oder 10 μl Affinität-gereinigte Telomerase (siehe Beispiel 4) zugegeben und die Umsetzungen werden bei 37°C inkubiert. Bei 45 und 90 Minuten werden 40 μl Aliquoten von jeder Umsetzung entfernt und zu 160 μl von Stop-Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Na-Pyrophosphat, 0,2% SDS, 2 mM EDTA, 100 μg/ml tRNA) zugegeben. 10 μl Trichloressigsäure (TCA) (100%) werden zugegeben und die Probe wird auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die Probe wird in einer Mikrozentrifuge (12000 × g Kraft) für 15 Minuten pelletiert. Das Pellet wird mit 1 ml 95% Ethanol gewaschen und wieder in der Mikrozentrifuge (12000 × g Kraft) für 5 Minuten pelletiert. Das Pellet wird in 50 μl dH2O resuspendiert und auf ein 12 × 75 Glastestrohr übertragen, welches 2,5 ml eiskalte Lösung aus 5% TCA und 10 mM Na-Pyrophosphat enthält. Die Probe wird auf Eis für 30 Minuten inkubiert. Die Probe wird durch eine 2,5 cm nasse (dH2O) GFC-Membran (S & S) auf einem Vakuumfiltration-Manifold filtriert. Der Filter wird dreimal unter Vakuum mit 5 ml eiskaltem TCA und einmal mit 5 ml 95% Ethanol gewaschen. Der Filter wird getrocknet und in einem Szintillationszähler unter Verwendung von Szintillationsflüssigkeit gezählt. Das fmol von eingeschlossenem Nukleotid wird aus der spezifischen Aktivität von radioaktivem Tracer bestimmt. Die Aktivität von Extrakt wird basierend auf dem eingeschlossenen dNTP berechnet und wird als fmol dNTP/Min./μl Extrakt ausgedrückt.
  • Telomeraseaktivitätstest
  • Bio-Tel FleshPlate Test
  • Ein Test für den Nachweis und/oder die Messung von Telomeraseaktivität durch Messen der Zugabe von TTAGGG telomeren Wiederholungen zu einem biotinyliertem Telomerase-Substrat-Primer wird vorgesehen; eine Umsetzung katalysiert durch Telomerase. Die biotinylierten Produkte werden in Streptavidin-überzogenen Mikrotiterplatten gefangen. Eine Oligonukleotid-Sonde, komplementär zu 3,5 Telomer-Wiederholungen, markiert mit 33P, wird zum Messen von Telomeraseprodukten verwendet, wie unten beschrieben. Ungebundene Sonde wird durch Waschen entfernt und die Menge an Sonde, eingebrannt an die gefangenen Telomeraseprodukte, wird durch Szintillationszählung bestimmt.
  • Verfahren:
    • I. Thiophosphoramidat-Oligonukleotide wurden als konzentrierte Vorräte gelagert und in PBS gelöst.
    • II. Zum Testen wurden die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide zu einem 15X Arbeitsvorrat in PBS verdünnt und 2 μl wurden in zwei Mulden einer 96-Mulden Mikrotiterschale (doppelt getestet) dispergiert.
    • III. Telomeraseextrakt wurde zu einer spezifischen Aktivität von 0,04–0,09 fmol dNTP eingeschlossen/Min./μl in Telomerase-Verdünnungspuffer verdünnt und 18 μl zu jeder Probenmulde zugegeben, um mit Verbindung für 30 Minuten bei Raumtemperatur vor zuinkubieren.
    • IV. Die Telomeraseumsetzung wurde durch Zugabe von 10 μl Master Mix zu den Mulden, welch zu testendes Telomeraseextrakt und Oligonukleotidverbindungen enthalten, begonnen. Die Platten wurden versiegelt und bei 37°C für 90 Min. inkubiert.
    • V. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 10 μl HCS gestoppt.
    • VI. 25 μl des Umsetzungsgemisches wurden auf eine 96-Mulden Streptavidin-überzogene FlashPlateTM (NEN) übertragen und für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit milder Bewegung inkubiert.
    • VII. Die Mulden wurden dreimal mit 180 μl 2X SSC ohne Inkubation gewaschen.
    • VIII. Die Menge an Sonde, angelagert an biotinylierten Telomeraseprodukten, wurde in einem Szintillationszähler nachgewiesen.
  • Puffer:
  • Telomerase-Verdünnungspuffer
    • 50 mM Tris-Acetat, pH 8,2
    • 1 mM DTT
    • 1 mM EGTA
    • 1 mM MgCl2
    • 830 mM BSA
  • Master Mix (MM)
    • 50 mM Tris-Acetat, pH 8,2
    • 1 mM DTT
    • 1 mM EGTA
    • 1 mM MgCl2
    • 150 mM K-Acetat
    • 10 μM dATP
    • 20 μM dGTP
    • 120 μM dTTP
    • 100 nM biotinylierter Primer (5'-Biotin-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') [SEQ I.D. Nr. 8]
    • 5,4 nM markierte Sonde [5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-(33P) A1-50-3'] [SEQ I.D. Nr. 9]; spezifische Aktivität annähernd 109 cpm/μg oder höher
  • Hybridisierungs-Capture-Lösung (HCS)
    • 12X SSC (1X = 150 nm NaCl/30 mM Na3 Citrat)
    • 40 mM EDTA
    • 40 mM Tris-HCl, pH 7,0
  • Unter Verwendung der vorhergehenden Tests wurde von den Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden, dargestellt durch SEQ I.D. Nr. 1 und SEQ I.D. Nr. 2, gezeigt, dass sie Telomerase-IC50-Werte unter 1,0 nM haben (siehe Tabelle 2, Versuche 1 und 3). TABELLE 2 BEWERTUNG VON OLIGOS 1–4 ALS TELOMERASEHEMMER IM VERGLEICH MIT PHOSPHORAMIDATEN:
    Vers. Oligonukleotid IC50 (nM) Phosphoramidat IC50 (nM) Thiophosphoramidat
    1. 5'-GTTAGGGTTAG-3' SEQ I.D. Nr. 1 1,9 0,89
    2. 5'-GTTGAGTGTAG-3' SEQ I.D. Nr. 3 1000 177,4
    3. 5'-TAGGGTTAGACAA-3' SEQ I.D. Nr. 2 1,64 0,41
    4. 5'-TAGGTGTAAGCAA-3' SEQ I.D. Nr. 4 1000 79,3
  • Oligonukleotidsequenz 2 (SEQ I.D. Nr. 3) ist eine fehlgepaarte Kontrolle für die in Versuch 1 verwendeten Oligonukleotide (SEQ I.D. Nr. 1). Ähnlich ist Oligonukleotid-Sequenz 4 (SEQ I.D. Nr. 4) eine fehlgepaarte Kontrolle für die Oligonukleotide (SEQ I.D. Nr. 2), welche in Versuch 3 verwendet werden.
  • Die in Tabelle 2 gezeigten Telomerase-Hemmungsdaten zeigen, dass die Thiophosphoramidat-Polynukleotide der vorliegenden Erfindung etwa 2-3-mal besser beim Hemmen von Telomeraseaktivität sind, bezogen auf Gegenstück Phosphoramidat-Oligonukleotide. So sind die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der Erfindung nicht nur wirksamer im Telomerase-Hemmungstest, verglichen mit ihren Phosphoramidat-Gegenstücken, sondern ebenfalls säureresistenter als diese. Diese Kombination aus Kennzeichen verleiht den Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden der Erfindung einen wichtigen Vorteil verglichen mit Phosphoramidat-Polynukleotiden.
  • Beispiel 7
  • Anti-Tumorwirksamkeit von Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden Ex-vivo Studien
  • a. Verringerung von Telomerlänge in Tumorzellen
  • Kolonien von menschlichen epithelialen Brustzellen (spontan immortalisiert) wurden unter Verwendung von Standardverfahren und Materialien hergestellt. Die Kolonien wurden durch Besäen von 15-Zentimeter-Schalen mit etwa 106-Zellen in jede Schale hergestellt. Die Schalen wurden inkubiert, um es den Zellkolonien zu erlauben, zu etwa 80% Konfluenz zu wachsen, zu welcher Zeit jede der Kolonien in zwei Gruppen geteilt wurde. Eine Gruppe wurde einer subakuten Dosis von Thiophosphoramidat-Polynukleotid SEQ I.D. Nr. 2 bei einer vorher bestimmten Konzentration (z. B. zwischen etwa 100 nM und etwa 20 μM) für einen Zeitraum von etwa 4–8 Stunden nach Plattieren nach der Teilung ausgesetzt. Die zweite Gruppe von Zellen wurde fehlgepaartem Kontrolloligonukleotid SEQ I.D. Nr. 4 ähnlich ausgesetzt.
  • Jede Gruppe von Zellen darf dann fortsetzen, sich zu teilen, und die Gruppen werden wieder gleichmäßig aufgeteilt (nahe Konfluenz). Die gleiche Anzahl an Zellen wurde für fortgesetztes Wachstum gesät. Das Test-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid oder Kontrolloligonukleotid wurde jeden vierten Tag bei der gleichen anfänglich gelieferten Konzentration zu den Proben zugegeben. In einem Versuch wurden die Zellen zusätzlich mit FuFENE6TM (Boehringer-Mannheim) nach Anweisungen des Herstellers behandelt. FuGENE6TM verstärkt Oligonukleotidaufnahme durch die Zellen.
  • Telomerlänge wurde durch Verdauen der DNA der Zellproben unter Verwendung von Restriktionsenzymen bestimmt, welche für andere Sequenzen als die repetitive T2AG3-Sequenz von menschlichen Telomeren spezifisch sind (TRF-Analyse). Die verdaute DNA wurde nach Größe unter Verwendung von Standardtechniken von Gelelektrophorese getrennt, um die Längen der telomeren Wiederholungen zu bestimmen, welche nach Sondieren mit einer Telomer-DNA-Sonde an dem Gel als ein Ausstrich von DNA mit hohem Molekulargewicht (annähernd 2 Kb–15 Kb) erscheinen. 4 und 5 zeigen Beispiele für solche Versuche.
  • Die in 4 gezeigten Ergebnisse zeigen an, dass das Thiophosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 2 ein wirkkräftiger in vitro Hemmer von Telomeraseaktivität ist. In Abwesenheit von FuGENE6TM induzierte das Thiophosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 2 eine große Verringerung der Telomerlänge, wenn es mit HME50-5E Zellen in Bereich von 1–20 μM inkubiert wurde. Wenn Zellen mit FuGENE6 und Thiophosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 2 co-inkubiert wurden, wurde die Telomergröße verglichen mit den Kontrollzellen bei sogar der niedrigsten getesteten Konzentration (100 nM) verringert.
  • Die in 5 präsentierten Ergebnisse zeigen an, dass das Thiophosphoramidat-Oligonukleotid mit der Sequenz CAGTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 10) ein wirkkräftiger in vitro Hemmer von Telomeraseaktivität ist. Wenn die Zellen mit dem Thiophosphoramidat-Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 10 inkubiert wurden, wurde die Telomergröße verglichen mit den Kontrollzellen bei sogar der niedrigsten getesteten Konzentration (1 nM) verringert. Somit sind Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der Erfindung wirkkräftige in vitro Hemmer von Telomeraseaktivität in immortalisierten menschlichen epithelialen Brustzellen.
  • In einem weiteren Versuch wurden HME50-5E Zellen mit einem der in SEQ I.D. Nr. 2 und 10 gezeigten Thiophosphoramidat-Polynukleotide inkubiert. Das fehlgepaarte Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 4 wurde als Kontrolle verwendet. Alle Polynukleotide wurden bei Konzentrationen zwischen etwa 0,1 μM und etwa 20 μM unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls verwendet. Die Daten für Zellwachstum, welche in 6 gezeigt werden, zeigten an, dass die Zelle innerhalb von etwa 100 Tagen nach Verabreichung der Test-Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der Erfindung in die Krise (also Beendigung von Zellfunktion) eintrat.
  • Zusätzlich zeigt TRF-Analyse der Zellen (7) unter Verwendung von Standardmethodik, dass die Test-Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der Erfindung wirksam beim Verringern von Telomerlänge waren. Die HME50-5E Zellen wurden mit einem der in SEQ I.D. Nr. 2 und 10 gezeigten Thiophosphoramidat-Polynukleotide inkubiert. Das fehlgepaarte Oligonukleotid SEQ I.D. Nr. 4 wurde als Kontrolle verwendet. Alle Polynukleotide wurden bei einer Konzentration von etwa 0,5 μM unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls verwendet. Die Länge der Telomere wurde an Tagen 10, 20, 40 und 80 gemessen. Für die Zellen mit dem fehlgepaarten Kontrolloligonukleotid wurde die Länge an Tag 90 gemessen und dieser Datenpunkt diente als Endpunkt. Zusätzlich zu den oben beschriebenen HME50-5E Zellen kann dieser Test mit jeder Telomerase-positiven Zelllinie durchgeführt werden, wie HeLa Zellen oder HEK-293 Zellen.
  • b. Spezifität
  • Thiophosphoramidat-Polynukleotide der Erfindung werden auf Wirksamkeit (IC50) gegen Telomerase und andere Enzyme, von welchen bekannt ist, dass sie RNA-Bestandteile haben, durch Durchführen von Hybridisierungstest oder Enzymhemmungstests unter Verwendung von Standardtechniken gescreent. Von Oligonukleotiden mit niedrigeren IC50-Werten für Telomerase verglichen mit den IC50-Werten gegenüber den anderen gescreenten Enzymen wird gesagt, dass sie Spezifität für Telomerase besitzen.
  • c. Zytotoxizität
  • Der Zelltod (XTT) Test für Zytotoxizität wurde unter Verwendung von HME50-5E, Caki-1, A431, ACHN und A549 Zelltypen durchgeführt. Die in diesem Test verwendeten Zellinien wurden dem Thiophosphoramidat-Oligonukleotid von SEQ I.D. Nr. 2 für 72 Stunden bei Konzentrationen im Bereich von etwa 1 μM bis etwa 100 μM in Gegenwart und Abwesenheit von Lipiden ausgesetzt. Während dieses Zeitraums wurde die optische Dichte (CD) der Proben für Licht bei 540 Nanometer (nm) bestimmt. Die für die verschiedenen Zelltypen erhaltenen IC50-Werte (in 8 gezeigt) waren im Allgemeinen geringer als 1 μM. So wird nicht erwartet, dass signifikante zytotoxische Wirkungen bei Konzentrationen geringer als etwa 100 μM beobachtet werden. Es wird anerkannt werden, dass andere Tumor-Zelllinien, wie die Eierstocktumor-Zelllinien OVCAR-5 und SK-OV-3 verwendet werden können, um Zytotoxizität zu bestimmen, zusätzlich zu Kontrollzelllinien wie normalen menschlichen BJ-Zellen. Andere Tests für Zytotoxizität, wie der MTT-Test (siehe Berridge et al., Biochemica 4: 14–19, 1996) und der alamarBlueTM-Test ( U.S.-Patent Nr. 5501959 ) können ebenfalls verwendet werden.
  • Um Telomerase-hemmende Wirkungen zu beobachten, sollten die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide vorzugsweise bei einer Konzentration unter dem Grad von Zytotoxizität verabreicht werden. Da sich die Wirksamkeit von vielen Krebs-Chemotherapeutika von ihren zytotoxischen Wirkungen ableitet, ist es nichtsdestotrotz innerhalb des Umfangs der Erfindung, dass die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung bei einer Dosis verabreicht werden, für welche chemotherapeutische Wirkungen beobachtet werden.
  • In vivo Tierstudien
  • Ein menschliches Tumor-Xenograft-Modell, in welchem OVCAR-5 Tumorzellen in nackte Mäuse transplantiert werden, kann unter Verwendung von Standardtechniken und Materialien konstruiert werden. Die Mäuse werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe wird intraperitoneal mit Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden der Erfindung behandelt. Die andere Gruppe wird mit einer Kontrolle behandelt, welche ein Gemisch aus Phosphatpufferlösung (PBS) und einem Oligonukleotid komplementär mit Telomerase-RNA umfasst, welches aber mindestens eine Base-Fehlpaarung mit der Sequenz von Telomerase-RNA hat. Die durchschnittliche Tumormasse für Mäuse in jeder Gruppe wird periodisch nach dem Xenograft unter Verwendung von Standardverfahren und Materialien bestimmt.
  • In der mit einem Thiophosphoramidat-Oligonukleotid der Erfindung behandelten Gruppe wird von der durchschnittlichen Tumormasse erwarte, dass sie sich nach anfänglicher Behandlung für einen Zeitraum erhöht, nach welcher Zeit von der Tumormasse erwartet wird, dass sie sich stabilisiert und dann beginnt zu sinken. Von Tumormassen in der Kontrollgruppe wird erwartet, dass sie sich durch die Studie hindurch erhöhen. Somit wird von den Thiophosphoramidat-Oligonukleotiden der Erfindung erwartet, dass sie die Rate von Tumorwachstum dramatisch zu verringern und schließlich Verringerung von Tumorgröße und Beseitigung des Tumors herbeiführen.
  • So sieht die vorliegende Erfindung neuartige Thiophosphoramidat-Oligonukleotide und Verfahren zum Hemmen von Telomeraseaktivität und Behandeln von Krankheitszuständen vor, in welchen Telomeraseaktivität schädliche Wirkungen hat, insbesondere Krebs. Die Thiophosphoramidat-Oligonukleotide der Erfindung sehen eine hochgradig selektive und wirksame Behandlung für bösartige Zellen vor, die erfordern, dass Telomeraseaktivität unsterblich bleibt; jedoch ohne die nicht-bösartigen Zellen zu beeinträchtigen.

Claims (28)

  1. Oligonukleotid, umfassend eine nicht-homopolymere Sequenz von Nukleosid-Untereinheiten, verbunden durch mindestens eine Interuntereinheit-Verbindung, die ein N3'->P5' Thiophosphoramidat ist, definiert durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon, worin das Oligonukleotid Telomeraseaktivität um mindestens 10% hemmen oder verringern kann, verglichen mit einer Kontrolle, in welcher das Enzym nicht mit dem Oligonukleotid behandelt wird.
  2. Oligonukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid spezifisch an einen RNA-Bestandteil von Telomerase hybridisieren kann.
  3. Oligonukleotid nach Anspruch 3, wobei das Oligonukleotid spezifisch an den RNA-Bestandteil von menschlicher Telomerase hybridisieren kann.
  4. Oligonukleotid nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid eine Nukleotidsequenz umfasst, die genau komplementär zu einer Sequenz des RNA-Bestandteils von Telomerase ist.
  5. Oligonukleotid nach Ansprüchen 4 oder 5, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz umfasst, die genau komplementär zum RNA-Bestandteil von menschlicher Telomerase ist.
  6. Oligonukleotid nach Ansprüchen 4 oder 5, wobei die Sequenz, die genau komplementär zur Sequenz des RNA-Bestandteils von Telomerase ist, zwischen etwa 10 und 25 Nukleotide lang ist.
  7. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 6, wobei alle Interuntereinheit-Verbindungen N3'->P5' Thiophosphoramidat-Verbindungen sind.
  8. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Oligonukleotid zwischen 10 und 100 Nukleotide lang ist.
  9. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 8, wobei das Oligonukleotid zwischen 10 und 25 Nukleotide lang ist.
  10. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 6, 8 oder 9, umfassend mindestens eine Interuntereinheit-Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphodiester, Phosphotriester, Methylphosphonat, P3'->N5'-Phosphoramidat, N3'->P5'-Phosphoramidat und Phosphorthioat.
  11. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 10, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GTTAGGGTTAG (SEQ. I.D. Nr. 1) TAGGGTTAGACAA (SEQ I.D. Nr. 2) CAGTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 10).
  12. N3'->P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid wie in Anspruch 1 beansprucht mit der folgenden Sequenz: GTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 1), worin die Thiophosphoramidat-Verbindung definiert ist durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon.
  13. N3'->P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid wie in Anspruch 1 beansprucht mit der folgenden Sequenz: TAGGGTTAGACAA (SEQ I.D. Nr. 2), worin die Thiophosphoramidat-Verbindung definiert ist durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon.
  14. N3'-P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid wie in Anspruch 1 beansprucht mit der folgenden Sequenz: CAGTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 10), worin die Thiophosphoramidat-Verbindung definiert ist durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon.
  15. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 14, worin das Oligonukleotid eine Modifikation einschließt, um Aufnahme des Oligonukleotids durch eine Zelle zu erleichtern.
  16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 10 oder 15, formuliert in einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger.
  17. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 16 beansprucht, umfassend ein N3'->P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz: GTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 1), formuliert in einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, worin die Thiophosphoramidat-Verbindung definiert ist durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon.
  18. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 16 beansprucht, umfassend ein N3'->P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz: TAGGGTTAGACAA (SEQ. I.D. Nr. 2), formuliert in einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, worin die Thiophosphoramidat-Verbindung definiert ist durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon.
  19. Pharmazeutische Zusammensetzung wie in Anspruch 16 beansprucht, umfassend ein N3'-P5'-Thiophosphoramidat-Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz: CAGTTAGGGTTAG (SEQ I.D. Nr. 10), formuliert in einem pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, worin die Thiophosphoramidat-Verbindung definiert ist durch die Formel: 3'-[-NH-P(=O)(-SR)-O-]-5': worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon.
  20. Verfahren zum Hemmen von Telomeraseenzymaktivität in einer Zelle in vitro, umfassend Kontaktieren der Zelle mit einem Oligonukleotid oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 19.
  21. Polynukleotid, umfassend ein Oligonukleotid wie in Anspruch 1 beansprucht, umfassend eine Sequenz von Nukleosid-Untereinheiten, enthaltend mindestens eine Untereinheit, definiert durch die Formel:
    Figure 00560001
    worin B ein Purin oder Pyrimidin oder ein Analog davon darstellt; Z für SR steht, worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl und Salzen davon; und R1 ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, O-R2, S-R2 und Halogen, worin R2 für H, Alkyl oder (CH2)nW(CH2)mH steht, wo n zwischen 1–10 ist, m zwischen 0–10 ist und W für O, S oder NH steht.
  22. Polynukleotid nach Anspruch 21, worin alle Untereinheiten durch die Formel:
    Figure 00560002
    definiert sind.
  23. Polynukleotid gemäß Ansprüchen 21 oder 22, wobei das Polynukleotid Telomeraseenzymaktivität hemmen oder verringern kann.
  24. Polynukleotid gemäß Anspruch 23, wobei das Polynukleotid spezifisch an einen RNA-Bestandteil von Telomerase hybridisieren kann.
  25. Polynukleotid nach Anspruch 23, wobei das Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfasst, die genau komplementär zu einer Sequenz des RNA-Bestandteils von Telomerase ist.
  26. Oligonukleotid gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 15 oder ein Polynukleotid gemäß einem von Ansprüchen 21 bis 25 zur Verwendung in Medizin.
  27. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 15 oder die Verwendung eines Polynukleotids gemäß einem von Ansprüchen 21 bis 25 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
  28. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem von Ansprüchen 1 bis 15 oder die Verwendung eines Polynukleotids gemäß einem von Ansprüchen 21 bis 25 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Telomerase-vermittelten Zustands.
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Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5523389A (en) * 1992-09-29 1996-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of human immunodeficiency virus
US20030032610A1 (en) 1996-06-03 2003-02-13 Gilchrest Barbara A. Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
AU758956B2 (en) 1999-02-12 2003-04-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
DE60038495T2 (de) * 1999-09-10 2009-04-09 Geron Corp., Menlo Park Oligonukleotid n3'-p5' thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung
EP2363133A1 (de) 2000-03-31 2011-09-07 Trustees of Boston University Zusammensetzung enhalted DNA-Fragmente und ihre medizinischen und kosmetischen Verwendungen
AU2002245717A1 (en) * 2001-03-23 2002-10-08 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
AU2003244338C1 (en) * 2001-03-23 2008-07-24 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US7563618B2 (en) * 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
DE10159904A1 (de) * 2001-12-06 2003-07-03 Adnagen Ag Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür
AU2003275593A1 (en) * 2002-10-23 2004-05-13 Sankyo Company, Limited Novel synthetic nucleic acids whose sugar moieties have s-configuration
DK1644009T3 (en) 2003-06-23 2018-03-05 Telomerase Activation Sciences Inc Compositions for increasing telomerase activity and treating HIV infection
WO2005000248A2 (en) 2003-06-25 2005-01-06 Geron Corporation Compositions and methods for skin conditioning
PL1667522T3 (pl) * 2003-09-09 2018-06-29 Geron Corporation Zmodyfikowane oligonukleotydy do hamowania telomerazy
DE602004031975D1 (de) * 2003-11-04 2011-05-05 Geron Corp Rna-amidate und thioamidateur rnai
WO2005116207A1 (ja) * 2004-05-28 2005-12-08 Sankyo Company, Limited テロメラーゼ阻害ｅｎａオリゴヌクレオチド
KR101279393B1 (ko) 2004-07-02 2013-07-04 제론 코포레이션 보호된 3'-아미노 뉴클레오시드 단량체의 합성
EP1828217A2 (de) * 2004-12-16 2007-09-05 Febit Biotech GmbH Polymeraseunabhängige analyse der sequenz von polynukleotiden
WO2006113426A2 (en) * 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of telomerase and tubulin activities
WO2007127163A2 (en) 2006-04-24 2007-11-08 Geron Corporation Cns-tumor treatment method and composition
TR201819789T4 (tr) * 2006-10-30 2019-01-21 Geron Corp Kanser tedavisine yönelik gemsitabin ve kombine telomeraz inhibitörü.
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
US8011527B2 (en) * 2007-08-10 2011-09-06 Rexam Beverage Can Company Can end with countersink
US8877723B2 (en) 2008-10-17 2014-11-04 Geron Corporation Method for identification of sensitivity of a patient to telomerase inhibition therapy
BRPI1004575A2 (pt) * 2009-01-09 2016-04-05 Inhibitex Inc composto, composição farmacêutica, método de tratamento de infecções virais, método de separação dos diaestereômeros de fósforo
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9593137B2 (en) 2011-12-22 2017-03-14 Geron Corporation Guanine analogs as telomerase substrates and telomere length affectors
US9717685B2 (en) 2012-03-26 2017-08-01 President And Fellows Of Harvard College Lipid-coated nucleic acid nanostructures of defined shape
US9228189B2 (en) 2012-10-26 2016-01-05 Geron Corporation C-myc antisense oligonucleotides and methods for using the same to treat cell-proliferative disorders
EP2912179A4 (de) * 2012-10-26 2016-10-12 Geron Corp C-myc-antisense-oligonukleotide und verfahren zur verwendung davon zur behandlung von auf das zellwachstum wirkenden erkrankungen
US9200327B2 (en) 2012-11-30 2015-12-01 Geron Corporation Diagnostic markers for treating cell proliferative disorders with telomerase inhibitors
US9375485B2 (en) 2012-12-07 2016-06-28 Geron Corporation Use of telomerase inhibitors for the treatment of myeloproliferative disorders and myeloproliferative neoplasms
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
EP2971165A4 (de) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc Entfernung von dna-fragmenten in mrna-herstellungsverfahren
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP2971161B1 (de) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Nukleinsäurereinigung
CN103382212B (zh) * 2013-07-06 2016-08-31 中国科学院成都生物研究所 5′位改性嘌呤霉素化合物及其制备方法和用途
JP7019233B2 (ja) 2013-07-11 2022-02-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチドおよび合成ｓｇＲＮＡを含む組成物ならびに使用方法
JP6794258B2 (ja) 2013-09-30 2020-12-02 ジェロン・コーポレーションＧｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ オリゴヌクレオチドについてのホスホロジアミデート骨格結合
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015070080A2 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Nucleic acid nanostructures for in vivo agent delivery
CN111729090A (zh) 2013-12-20 2020-10-02 通用医疗公司 与循环肿瘤细胞相关的方法和测定法
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP2017522028A (ja) 2014-07-16 2017-08-10 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 環状ポリヌクレオチド
CA2955250A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
TN2017000411A1 (en) 2015-04-23 2019-01-16 Geron Corp Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
EP3318276A1 (de) 2016-11-04 2018-05-09 Janssen Biotech, Inc. Zusammensetzungen aus einem telomerase-hemmer und einem bcl-2-hemmer zur behandlung von blutkrebs
AU2017326372B2 (en) * 2016-09-14 2023-12-07 Janssen Biopharma, Inc. Modified oligonucleotides and methods of use
AU2017330276B2 (en) * 2016-09-20 2022-01-20 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Synthesis of backbone modified morpholino oligonucleotides and chimeras using phosphoramidite chemistry
AU2017356221A1 (en) * 2016-11-11 2019-05-30 Janssen Biopharma, Inc. Oligonucleotide targeting strategy for HBV cccDNA
WO2018221735A1 (ja) * 2017-06-02 2018-12-06 富田製薬株式会社 新規オリゴヌクレオチド
PT3652187T (pt) 2017-07-10 2021-12-16 Geron Corp Processo melhorado para a preparação de imetelstat
EP3681894A1 (de) 2017-09-14 2020-07-22 Janssen BioPharma, Inc. Modifizierte nucleosidphosphoramidite
WO2019175260A2 (en) 2018-03-13 2019-09-19 Janssen Pharmaceutica Nv Modified oligonucleotides and methods of use in tauopathies
EP3802821A4 (de) * 2018-05-25 2022-06-08 New York Institute of Technology Verfahren zur direkten sequenzierung von nukleinsäuren
CN112384521A (zh) 2018-07-05 2021-02-19 安捷伦科技有限公司 用于寡核苷酸合成的双重偶联方法
US20230250125A1 (en) 2020-04-01 2023-08-10 Janssen Biopharma, Inc. Nucleic acid polymers

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4647529A (en) 1984-06-01 1987-03-03 Rodland Karin D Hybridization method of detecting nucleic acid sequences with probe containing thionucleotide
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5501959A (en) 1989-01-17 1996-03-26 Alamar Biosciences Laboratory, Inc. Antibiotic and cytotoxic drug susceptibility assays using resazurin and poising agents
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5506212A (en) 1990-01-11 1996-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides with substantially chirally pure phosphorothioate linkages
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5412087A (en) 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US6017895A (en) 1992-02-10 2000-01-25 Genzyme Corporation Oligonucleotides possessing zwitterionic moieties
US5645986A (en) * 1992-05-13 1997-07-08 Board Of Reagents, The University Of Texas System Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5489508A (en) 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5654286A (en) * 1993-05-12 1997-08-05 Hostetler; Karl Y. Nucleotides for topical treatment of psoriasis, and methods for using same
JPH09500378A (ja) 1993-07-02 1997-01-14 リンクス セラピューティクス，インコーポレイティド 枝分れされそして複雑に結合された高分子構造体の集中的合成
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
HUT76094A (en) * 1994-03-18 1997-06-30 Lynx Therapeutics Oligonucleotide n3'-p5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
US5726297A (en) 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
US5776679A (en) 1994-07-07 1998-07-07 Geron Corporation Assays for the DNA component of human telomerase
CZ3497A3 (en) 1994-07-07 1997-10-15 Geron Corp Rna component of mammal telomerase, oligonucleotide, recombinant expression plasmid containing the oligonucleotide, process for preparing eukaryotic host cell, process for preparing a recombinant telomerase enzyme
US5583016A (en) * 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5958680A (en) 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5972605A (en) 1994-07-07 1999-10-26 Geron Corporation Assays for regulators of mammalian telomerase expression
US5643890A (en) * 1995-01-31 1997-07-01 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Synthetic oligonucleotides which mimic telomeric sequences for use in treatment of cancer and other diseases
US5656638A (en) 1995-04-18 1997-08-12 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5760062A (en) 1995-04-18 1998-06-02 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5863936A (en) 1995-04-18 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US6004939A (en) 1995-07-06 1999-12-21 Ctrc Research Foundation Board Of Regents Methods for modulation and inhibition of telomerase
US5968506A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US5856096A (en) * 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
US5770613A (en) 1995-09-29 1998-06-23 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5767278A (en) 1995-10-06 1998-06-16 Geron Corporation Telomerase inhibitors
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
WO1997037891A1 (fr) 1996-04-05 1997-10-16 German Viktorovich Demidov Unite motrice et de transport comportant un module energetique
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
AU2445997A (en) 1996-04-10 1997-10-29 Lynx Therapeutics, Inc. Telomerase inhibitors
EP0912761A4 (de) * 1996-05-29 2004-06-09 Cornell Res Foundation Inc Bestimmung von unterschieden in der nukleisäuresequenz mittels einer kombination von ligasebestimmung und polymerase-kettenreaktion
US6444650B1 (en) 1996-10-01 2002-09-03 Geron Corporation Antisense compositions for detecting and inhibiting telomerase reverse transcriptase
DE69723531T3 (de) 1996-10-01 2012-09-06 Geron Corp. Katalytische Untereinheit der menschlichen Telomerase
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
DE19720151A1 (de) * 1997-05-02 1998-11-05 Max Delbrueck Centrum Chimäre Oligonucleotide und ihre Verwendung
JPH11228451A (ja) * 1998-02-10 1999-08-24 Kureha Chem Ind Co Ltd 抗癌性増強医薬組成物
DE60038495T2 (de) * 1999-09-10 2009-04-09 Geron Corp., Menlo Park Oligonukleotid n3'-p5' thiophosphoramidate: ihre synthese und verwendung
AU2001249723A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Geron Corporation Telomerase inhibitor polynucleotides
US6342358B1 (en) 2000-08-24 2002-01-29 The Regents Of The University Of California Human telomerase RNA elements
US7354706B2 (en) * 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event

Also Published As

Publication number Publication date
AU7360900A (en) 2001-04-10
KR100858465B1 (ko) 2008-09-16
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DE60038495D1 (de) 2008-05-15
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CA2382521A1 (en) 2001-03-15
US20050049408A1 (en) 2005-03-03
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US7138383B2 (en) 2006-11-21
AU2003262453A1 (en) 2003-12-18
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US6608036B1 (en) 2003-08-19
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US20030212032A1 (en) 2003-11-13
HK1049339A1 (en) 2003-05-09

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