DE60103863T2

DE60103863T2 - Lipidnanokapseln, seine herstellungsverfahren sowie verwendung als medizin

Info

Publication number: DE60103863T2
Application number: DE60103863T
Authority: DE
Inventors: Beatrice Heurtault; Patrick Saulnier; Jean-Pierre Benoit; Jacques-Emile Proust; Brigitte Pech; Joel Richard
Original assignee: Universite dAngers; Mainelab SA
Current assignee: Universite dAngers; Ethypharm SAS
Priority date: 2000-03-02
Filing date: 2001-03-02
Publication date: 2005-06-30
Anticipated expiration: 2021-03-03
Also published as: US20090238865A1; FR2805761B1; AU2001240753B2; HUP0300209A2; CA2401766A1; BR0108921B1; BR0108921A; CN1257011C; EP1265698A1; CN1419472A; US20030152635A1; IL151560A0; CA2401766C; DE60103863D1; BRPI0108921B8; NO20024181L; PT1265698E; JP4790187B2; FR2805761A1; KR100638527B1

Description

Die Erfindung hat lipidische Nanokapseln, ein Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels, welches insbesondere dazu bestimmt ist, auf injizierbarem, oralem oder nasalem Wege verabreicht zu werden, zum Gegenstand.
In den letzten Jahren haben zahlreiche Gruppen die Rezeptur von festen lipidischen Nanokapseln oder lipidischen Nanosphären (Nanokugeln) entwickelt (Müller, R. H., und Mehnert, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 41(1): 62–69, 1995; W., Gasco, M. R., Pharmaceutical Technology Europe: 52–57, Dezember 1997; EP 605 497 ). Es handelt sich um eine Alternative zur Verwendung von Liposomen oder polymeren Teilchen. Diese lipidischen Teilchen weisen den Vorteil auf, dass sie in Abwesenheit von Lösemittel formuliert werden. Sie haben es beispielsweise erlaubt, zugleich lipophile und hydrophile Produkte in Form von Ionenpaaren zu verkapseln (Cavalli, R., et al., S. T. P. Pharma Sciences, 2(6): 514–518, 1992; und Cavalli, R., et al., International Journal of Pharmaceutics, 117: 243–246, 1995). Diese Teilchen können vor Licht geschützt bei 8°C mehrere Jahre stabil sein (Freitas, C., und Müller, R. H., Journal of Microencapsulation, 1(16): 59–71, 1999).
Üblicherweise werden zwei Techniken eingesetzt, um lipidische Nanoteilchen herzustellen:

– die Homogenisierung einer warmen (Schwarz, C., et al., Journal of Controlled Release, 30: 83–96, 1994; Müller, R. H., et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 41(1): 62–69, 1995) oder kalten Emulsion (Zur Mühlen, A., und Mehnert, W., Pharmazie, 53: 552–555, 1998; EP 605 497 ) oder
– das Abschrecken einer Mikroemulsion in Gegenwart von grenzflächenaktiven Co-Reagenzien, wie Butanol. Die Größe der erhaltenen Nanoteilchen liegt im allgemeinen über 100 nm (Cavalli, R., et al., European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 43(2): 110–115, 1996; Morel, S., et al., International Journal of Pharmaceutics, 132: 259–261, 1996).

Cavalli et al. (International Journal of Pharmaceutics, 2(6): 514–518, 1992; und Pharmazie, 53: 392–396, 1998) beschreiben die Verwendung eines nicht-toxischen biliären Salzes, Taurodesoxycholat, auf injizierbarem Wege für die Herstellung von Nanosphären (Nanokugeln) mit einer Größe über oder gleich 55 nm.
Die Erfindung betrifft Nanokapseln und nicht Nanosphären. Unter Nanokapseln versteht man Teilchen, die aus einem bei Umgebungstemperatur flüssigen oder halb-flüssigen Kern, welcher von einem bei Umgebungstemperatur festen Film überzogen sind, gebildet werden, im Gegensatz zu Nanosphären oder Nanokugeln, die matrixartige Teilchen sind, d. h. deren gesamte Masse fest ist. Wenn die Nanosphären einen pharmazeutisch aktiven Wirkstoff enthalten, ist dieser in der festen Matrix fein verteilt.
Im Rahmen der Erfindung versteht man unter Umgebungstemperatur eine Temperatur zwischen 15 und 25°C.
Die Erfindung hat Nanokapseln mit einer mittleren Größe unter 150 nm, vorzugsweise unter 100 nm, noch mehr bevorzugt unter 50 nm zum Gegenstand. Die Nanokapseln werden jeweils aus einem im wesentlichen lipidischen, bei Umgebungstemperatur flüssigen oder halbflüssigen Kern, welcher von einem im wesentlichen lipidischen, bei Umgebungstemperatur festen Film umhüllt ist, gebildet.
Berücksichtigt man ihre Größe sind die Nanokapseln der Erfindung kolloidale lipidische Teilchen.
Der Polydispersitätsindex der Nanokapseln der Erfindung beträgt vorteilhafterweise zwischen 5 und 15%.
Die Dicke des festen Films beträgt vorteilhafterweise zwischen 2 und 10 nm. Sie ist ungefähr ein Zehntel des Durchmessers der Teilchen.
Der Kern der Nanokapseln wird im wesentlichen aus einem bei Umgebungstemperatur flüssigen oder halbflüssigen Fett, beispiels weise einem Triglycerid oder einem Fettsäureester, welches bzw. welcher 20 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 25 bis 50 Gew.-% der Nanokapseln ausmacht, gebildet.
Der die Nanokapseln umhüllende feste Film wird vorzugsweise im wesentlichen aus einer lipophilen grenzflächenaktiven Substanz, beispielsweise einem Lecithin, dessen Anteil an Phosphatidylcholin zwischen 40 und 80% beträgt, gebildet. Der feste Film kann gleichfalls eine hydrophile grenzflächenaktive Substanz, beispielsweise Solutol^® HS15, enthalten.
Die in dem die Nanokapseln umhüllenden festen Film enthaltene hydrophile grenzflächenaktive Substanz macht vorzugsweise zwischen 2 und 10 Gew.-% der Nanokapseln, vorzugsweise ungefähr 8% aus.
Das Triglycerid, welches den Kern der Nanokapseln bildet, wird insbesondere ausgewählt unter den C₈- bis C₁₂-Triglyceriden, beispielsweise Triglyceriden der Caprin- und Caprylsäure und deren Mischungen.
Der Fettsäureester wird ausgewählt unter den C₈- bis C₁₈-Fettsäureestern, beispielsweise Ethylpalmitat, Ethyloleat, Ethylmyristat, Isopropylmyristat, Octyldodecylmyristat und deren Mischungen. Der Fettsäureester ist vorzugsweise ein C₈- bis C₁₂-Fettsäureester.
Die Nanokapseln der Erfindung sind insbesondere für die Formulierung von pharmazeutischen Wirkstoffen angepasst. In diesem Falle kann die lipophile grenzflächenaktive Substanz vorteilhafterweise bei 20°C fest und bei ungefähr 37°C flüssig sein.
Die Menge von lipophiler grenzflächenaktiver Substanz, die in dem die Nanokapseln umhüllenden festen Film enthalten ist, wird derart festgelegt, dass das Masseverhältnis flüssiges Fett/feste grenzflächenaktive Verbindung zwischen 1 und 15, vorzugsweise zwischen 1,5 und 13, mehr bevorzugt zwischen 3 und 8 ausgewählt wird.
Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung der zuvor beschriebenen Nanokapseln zum Gegenstand.
Das Verfahren der Erfindung basiert auf der Phasenumkehr einer Öl/Wasser-Emulsion, welche durch mehrere Zyklen von Temperaturanstieg und -abfall hervorgerufen wird.
Das Verfahren der Erfindung besteht darin:

a) – eine Öl/Wasser-Emulsion herzustellen, die eine ölartige Fettphase, eine hydrophile, nicht-ionische grenzflächenaktive Substanz, eine bei 20°C feste lipophile grenzflächenaktive Substanz und gegebenenfalls einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff, welcher in einer ölartigen Fettphase löslich oder dispergierbar ist, oder einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff, welcher in einer wässrigen Phase löslich oder dispergierbar ist, enthält,
– die Phasenumkehr der Öl/Wasser-Emulsion durch Erhöhung der Temperatur bis auf eine Temperatur T₂, welche höher als die Phasenumkehrtemperatur (TIP) ist, hervorzurufen, um eine Wasser/Öl-Emulsion zu erhalten, gefolgt von einer Verringerung der Temperatur bis auf eine Temperatur T₁, wobei T₁ < TIP < T₂,
– wenigstens einen oder mehrere Temperaturzyklen um die Phasenumkehrzone zwischen T₁ und T₂ herum auszuführen, bis eine durchscheinende Suspension beobachtet wird,
b) die Abschreckung der Öl/Wasser-Emulsion bei einer Temperatur nahe T₁, vorzugsweise über T₁ auszuführen, um stabile Nanokapseln zu erhalten,

Die gemäß dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Nanokapseln sind vorzugsweise frei von grenzflächenaktiven Coreagenzien, wie C₁-C₄-Alkoholen.
Die Anzahl von auf die Emulsion angewandten Zyklen hängt von der Energiemenge, welche erforderlich ist, um die Nanokapseln zu bilden, ab.
Die Phasenumkehr kann durch die Aufhebung der Leitfähigkeit der Formulierung, wenn die Wasser/Öl-Emulsion sich bildet, sichtbar gemacht werden.
Das Verfahren der Erfindung umfasst zwei Schritte.
Der erste Schritt besteht darin, die Gesamtheit der Bestandteile abzuwiegen, diese über eine Temperatur T₂ unter sanfter Bewegung (beispielsweise magnetischem Rühren) zu erwärmen, dann gegebenenfalls diese auf eine Temperatur T₁ (T₁ < T₂) abzukühlen. Nach einer bestimmten Anzahl von Temperaturzyklen erhält man eine Wasser/Öl-Emulsion.
Die Phasenumkehr zwischen der Öl/Wasser-Emulsion und der Wasser/Öl-Emulsion kommt durch eine Verringerung der Leitfähigkeit, wenn die Temperatur ansteigt, zum Ausdruck, bis diese aufgehoben wird. Die mittlere Temperatur der Phasenumkehrzone entspricht der Phasenumkehrtemperatur (TIP). Die Organisation des Systems in Form von Nanokapseln kommt visuell durch eine Veränderung des Aussehens des anfänglichen Systems, welches sich von weiß-undurchsichtig zu weiß-durchscheinend verändert, zum Ausdruck. Diese Veränderung erfolgt bei einer Temperatur unter der TIP. Diese Temperatur liegt im allgemeinen zwischen 6 und 15°C unter der TIP.
T₁ ist eine Temperatur, bei welcher die Leitfähigkeit wenigstens gleich 90–95% der bei 20°C gemessen Leitfähigkeit ist.
T₂ ist die Temperatur, bei der die Leitfähigkeit verschwindet.
Der zweite Schritt besteht in einer schlagartigen Abkühlung (oder Abschreckung) der Öl/Wasser-Emulsion bei einer Temperatur nahe T₁, vorzugsweise über T₁, unter magnetischem Rühren, indem mit Hilfe von entionisiertem Wasser bei 2°C +/– 1°C, welches in die feine Emulsion gegossen wird, zwischen 3- und 10-fach verdünnt wird. Die erhaltenen Teilchen werden dann 5 min weiter bewegt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsweise ist die Fettphase ein Fettsäuretriglycerid, ist die feste lipophile grenzflächenaktive Substanz ein Lecithin und ist die hydrophile grenzflächenaktive Substanz Solutol^® HS15. Unter diesen Bedingungen ist T₁ = 60°C, T₂ = 85°C und ist die Anzahl von Zyklen gleich 3.
Das Verhältnis flüssiges Fett/feste grenzflächenaktive Verbindung wird zwischen 1 und 15, vorzugsweise zwischen 1,5 und 13, mehr bevorzugt zwischen 3 und 8 ausgewählt.
Die Öl/Wasser-Emulsion enthält vorteilhafterweise 1 bis 3% lipophile grenzflächenaktive Substanz, 5 bis 15% hydrophile grenzflächenaktive Substanz, 5 bis 15% ölartiges Fett, 64–89% Wasser (die Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen ausgedrückt).
Je höher der HLB-Index des flüssigen Fetts ist, umso höher ist die Phasenumkehrtemperatur. Im Gegenzug scheint der Wert des HLB-Index des Fetts keinen Einfluss auf die Größe der Nanokapseln zu haben.
So nimmt, wenn die Größe der terminalen Gruppen der Triglyceride zunimmt, deren HLB-Index ab und die Phasenumkehrtemperatur nimmt ab.
Der HLB-Index oder das Hydrophile-Lipophile-Gleichgewicht ist, wie von C. Larpent im Lehrbuch ("Traité") K.342 der Ausgaben ("Editions") TECHNIQUES DE L'INGENIEUR" definiert.
Die Größe der Teilchen nimmt ab, wenn der Anteil an hydrophiler grenzflächenaktiver Substanz zunimmt und wenn der Anteil an (hydrophilen und lipophilen) grenzflächenaktiven Substanzen zunimmt. Tatsächlich bringt die grenzflächenaktive Substanz eine Verringerung der Grenzflächenspannung und folglich eine Stabilisierung des Systems, was die Gewinnung von kleinen Teilchen begünstigt, mit sich.
Andererseits nimmt die Größe der Teilchen zu, wenn der Ölanteil zunimmt.
Gemäß einer bevorzugten Herstellungsweise besteht die Fettphase aus Labrafac^® WL 1349, ist die lipoprhile grenzflächenaktive Substanz Lipoid^® S75-3 und ist die nicht-ionische hydrophile grenzflächenaktive Substanz Solutol^® HS15. Diese Verbindungen weisen die folgenden Eigenschaften auf:

– Lipophiles Labrafac WL 1349 (Gattefosse, Saint-Priest, Frankreich). Es handelt sich um ein Öl, welches aus Triglyceriden mit mittlerer Kettenlänge aus Caprin- und Caprylsäure (C₈ und C₁₀) gebildet wird. Seine Dichte beträgt 0,930 bis 0,960 bei 20°C. Sein HLB-Index liegt in der Größenordnung von 1.
– Lipoid^® S75-3 (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Deutschland). Lipoid^® S75-3 entspricht Sojalecithin. Dieses letztere enthält ungefähr 69% Phosphatidylcholin und 9% Phosphatidylethanolamin. Dies sind folglich grenzflächenaktive Substanzen. Dieser Bestandteil ist der einzige Bestandteil in der Formulierung, welcher bei 37°C und bei Umgebungstemperatur fest ist. Er wird für die Formulierung von injizierbaren Teilchen geläufig verwendet.
– Solutol^® HS15 (BASF, Ludwigshafen, Deutschland). Es handelt sich um ein Polyethylenglycol-660-2-hydroxystearat. Es spielt folglich in der Formulierung die Rolle einer nicht-ionischen hydrophilen grenzflächenaktiven Substanz. Es ist auf injizierbarem Wege einsetzbar (bei der Maus i. v. LD50 > 3,16 g/kg, bei der Ratte 1,0 < LD50 < 1,47 g/kg).

Die wässrige Phase der Öl/Wasser-Emulsion kann gleichfalls 1 bis 4% eines Salzes, wie Natriumchlorid, enthalten. Die Modifizierung der Salzkonzentration bringt eine Verschiebung der Phasenumkehrzone mit sich. Je mehr die Salzkonzentration zunimmt, umso niedriger ist die Phasenumkehrtemperatur. Dieses Phänomen wird für die Verkapselung von hydrophoben wärmeempfindlichen Wirkstoffen interessant sein. Ihre Inkorporation könnte bei einer niedrigeren Temperatur erfolgen.
Die Nanokapseln der Erfindung können in vorteilhafter Weise einen Wirkstoff enthalten und in die Zusammensetzung eines Arzneimittels Eingang finden, welches dazu bestimmt ist, auf injizierbarem, insbesondere intravenösem Wege. auf oralem Wege oder auf nasalem Wege verabreicht zu werden.
Wenn der Wirkstoff in der ölartigen Phase wenig löslich ist, setzt man ein Colösemittel, beispielsweise N,N-Dimethylacetamid, zu.
Die Nanokapseln der Erfindung sind insbesondere für die Verabreichung der folgenden Wirkstoffe geeignet:

– die Antiinfektiosa, darunter die Antimykotika, die Antibiotika,
– die Antikrebsmittel,
– die für das Zentralnervensystem bestimmten Wirkstoffe, die die Blut-Hirn-Schranke passieren müssen, wie die Anti-Parkinson-Mittel, und allgemeiner die Wirkstoffe zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.

Der pharmazeutisch wirksame Wirkstoff kann zuallererst in einer ölartigen Fettphase löslich oder dispergierbar sein und in diesem Falle wird er in den Kern der Nanokapsel inkorporiert werden. Um dies zu tun, wird er im Stadium des ersten Schritts der Herstellung der Öl/Wasser-Emulsion, die außerdem die ölartige Fettphase, eine nicht-ionische hydrophile grenzflächenaktive Substanz und eine lipophile grenzflächenaktive Substanz, welche bei 20°C fest ist, enthält, inkorporiert.
Der pharmazeutisch wirksame Wirkstoff kann gleichfalls von wasserlöslicher oder in wässriger Phase dispergierbarer Natur sein und in einem solchen Falle wird er erst am Ende der letzten Herstellungsphase der stabilen Nanokapseln an die Oberfläche der Nanokapseln angeheftet. Ein solcher wasserlöslicher Wirkstoff kann von jeglicher Natur sein, einschließlich Proteinen, Peptiden, Oligonukleotiden und DNA-Plasmiden. Ein solcher Wirkstoff wird an die Oberfläche der Nanokapseln angeheftet durch Einbringen des Wirkstoffs in die Lösung, innerhalb von welcher sich die am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen stabilen Nanokapseln dispergiert befinden. Die Anwesenheit einer nicht-ionischen hydrophilen grenzflächenaktiven Substanz begünstigt die Wechselwirkungsbindungen zwischen dem wasserlöslichen Wirkstoff und der freien Oberfläche der Nanokapseln.
Der wasserlösliche Wirkstoff könnte gleichfalls in die wässrige Phase während des ersten Herstellungsschritts der anfänglichen Öl/Wasser-Zubereitung eingebracht werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele unter Bezugnahme auf die 1 bis 4 veranschaulicht.
Die 1 ist eine Photographie der Nanokapseln der Erfindung, welche in Beispiel 1 erhalten wurden. Der Maßstab ist 1 cm für 50 nm.
Die 2 stellt die Entwicklung der mittleren Größe der Teilchen abhängig von dem Anteil an hydrophiler grenzflächenaktiver Substanz (Solutol^®) dar.
Die 3 stellt die Entwicklung der Leitfähigkeit abhängig von der Temperatur für unterschiedliche Salzkonzentrationen dar. In der Kurve 1 beträgt die Salzkonzentration 2,0 Gew.-%. In der Kurve 2 beträgt die Konzentration 3,4 Gew.-%.
Die 4 stellt die Entwicklung der Leitfähigkeit einer Öl/Wasser-Emulsion (H/E), welche in Beispiel 1 beschrieben wird, abhängig von der Temperatur nach drei Zyklen von Temperaturanstieg und -abfall zwischen 60 und 85°C dar.
Beispiel 1: Nicht mit Wirkstoff beladene Nanokapseln
A) Herstellung der Nanokapseln
Man stellt 5 g einer Emulsion her, welche 75 mg Lipoid^® S75-3, 504 mg lipophiles Labrafac^® WL 1349, 504 mg Solutiol^® HS15, 3,829 g Wasser und 88 mg Natriumchlorid enthält.
Das Ganze wird in ein und demselben Becherglas vereinigt und unter magnetisches Rühren gesetzt. Es wird eine Erwärmung angewandt, bis eine Temperatur von 85°C erzielt wird. Stets unter magnetischem Rühren lässt man das System bis auf eine Temperatur von 60°C abkühlen. Dieser Zyklus (zwischen 85°C und 60°C) wird ausgeführt, bis man das Verschwinden der Leitfähigkeit in Abhängigkeit von der Temperatur beobachtet (4). Die Phasenum kehr erfolgt am Ende von drei Zyklen. Bei der letzten Abkühlung führt man ein Abschrecken aus, indem man 12,5 ml destilliertes Wasser bei 2°C +/– 1°C auf die Mischung bei 70°C gießt. Das System wird dann 5 min weiter magnetisch gerührt.
Die unter den zuvor beschriebenen Bedingungen nach drei Temperaturzyklen erhaltenen Teilchen haben eine mittlere Größe von 43 +/– 7 nm. Ihre Größen-Polydispersität beträgt 0,071. Die Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Phosphorwolframsäure hat es uns erlaubt, Teilchen mit einer mittleren Größe in der Größenordnung von 50 nm nachzuweisen (siehe 1). Außerdem zeigt eine mittels Atomkraft-Mikroskopie ("microscopie de force atomique") im Kontaktmodus (Anlage von Park Scientic Instruments, Genf, Schweiz) gemachte Beobachtung, dass die Nanokapseln bei einer Temperatur von 25°C effektiv fest sind.
B) Modifizierung der Anteile von hydrophiler grenzflächenaktiver Substanz
Die nachfolgende Tabelle I präsentiert verschiedene Formulierungen von Nanokapseln, welche mit verschiedenen Konzentrationen von hydrophiler grenzflächenaktiver Substanz hergestellt worden sind.
TABELLE I
Die Verringerung der Konzentration an Solutiol^® HS15 bringt eine Zunahme der mittleren Größe der Teilchen mit sich (2). Man beobachtet dann mittlere Größen, die für Anteile von Solutiol^®, welche von 30 bis 5% der gesamten Formulierung gehen, je weils von 23 bis 128 nm gehen. Die Größe hängt folglich von der Konzentration an hydrophiler grenzflächenaktiver Substanz ab.
A) Modifizierungen der Anteile der grenzflächenaktiven Substanzen Lipoid^® und Solutol^®
Die nachfolgende Tabelle II präsentiert Formulierungen von Nanokapseln, die mit verschiedenen Konzentrationen von grenzflächenaktiven Substanzen hergestellt worden sind.
TABELLE II
Die Erhöhung des Anteils an grenzflächenaktiven Substanzen in der Formulierung bringt eine Abnahme der mittleren Größe mit sich. Tatsächlich erlaubt die Formulierung A, Teilchen mit einer mittleren Größe von 85 +/– 7 nm (P = 0,124) zu erhalten. Für die Formulierungen B und C werden die mittleren Größen 43 +/– 7 nm (P = 0,071) bzw. 29 +/– 8 nm (P = 0,148).
D) Modifizierung der NaCl-Konzentration
Die nachfolgende Tabelle III präsentiert zwei Formulierungen von Nanokapseln, die mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen von NaCl-Salz hergestellt worden sind.
TABELLE III
Die Modifizierung der Salzkonzentration bringt eine Verschiebung der Phasenumkehrzone mit sich. Je mehr die Salzkonzentration zunimmt, umso niedriger ist die Phasenumkehrtemperatur (3). Dieses Phänomen wird für die Verkapselung von hydrophoben wärmeempfindlichen Wirkstoffen interessant sein. Ihre Inkorporation könnte bei einer niedrigeren Temperatur erfolgen.
Diese Formulierungen erlauben es, Teilchen von ähnlicher Größe zu den vorangegangenen Größen trotz unterschiedlicher Salzkonzentrationen zu erhalten.
Beispiel 2: Verkapselung eines lipophilen Wirkstoffs, Soudan III
Die Formulierung entspricht jener von Beispiel 1: man stellt 5 g der anfänglichen Emulsion her, indem man 75 mg Lipoid^® S75-3, 504 mg lipophiles Labrafac^® und 504 mg Solutol^®, 3,829 g Wasser und 88 mg Natriumchlorid abwiegt. Man setzt 200 mg in Vaseline-Öl solubilisiertes Soudan III zu. Das Ganze wird in ein und dasselbe Becherglas abgewogen und magnetisch gerührt. Eine Erwärmung wird angewandt, bis eine Temperatur von 85°C erzielt wird. Stets unter magnetischem Rühren lässt man das System bis auf eine Temperatur von 60°C abkühlen. Dieser Zyklus (zwischen 85°C und 60°C) wird dreimal ausgeführt. Bei der letzten Abkühlung führt man bei 70°C ein Abschrecken aus, indem man 12,5 ml destilliertes Wasser bei 2°C +/– 1°C daraufgießt. Das System wird dann 5 min weiter magnetisch gerührt.
Die Verkapselung von Soudan III hat es uns erlaubt, Teilchen von ähnlicher Größe zu den Teilchen des Beispiels 1 bei den gleichen Anteilen von grenzflächenaktiven Substanzen und von Fettphase, nämlich 45 +/– 12 nm (P = 0,138), zu erhalten. Mit bloßem Auge erscheint die Probe homogen rosafarben.
Beispiel 3: Verkapselung von Progesteron
Die Formulierung entspricht jener von Beispiel 1: man stellt 5 g der anfänglichen Emulsion her, indem man 75 mg Lipoid^® S75-3, 504 mg lipophiles Labrafac^® und 504 mg Solutol^®, 3,829 g Wasser und 88 mg Natriumchlorid abwiegt. Man setzt 10 mg Progesteron zu. Das Ganze wird in ein und dasselbe Becherglas abgewogen und magnetisch gerührt. Eine Erwärmung wird angewandt, bis eine Temperatur von 85°C erzielt wird. Stets unter magnetischem Rühren lässt man das System bis auf eine Temperatur von 60°C abkühlen. Dieser Zyklus (zwischen 85°C und 60°C) wird dreimal ausgeführt. Bei der letzten Abkühlung führt man bei 70°C ein Abschrecken aus, indem man 12,5 ml destilliertes Wasser bei 2°C +/– 1°C daraufgießt. Das System wird dann 5 min weiter magnetisch gerührt.
Die Verkapselung von Progesteron erlaubt es, Teilchen von ähnlicher Größe zu den Teilchen des Beispiels 1, nämlich 45 +/– 12 nm (P = 0,112), zu erhalten. Progesteron wird in der wässrigen Phase nicht in einer Konzentration über seiner Löslichkeit angetroffen. Tatsächlich erlaubt eine 30-minütige Zentrifugation bei 200000 U/min, einen leichten Niederschlag zu erhalten, dessen Zusammensetzung durch DSC untersucht worden ist. Dieser Niederschlag enthält kein Progesteron. Da Progesteron in Wasser praktisch unlöslich ist, zeigt dies eine Inkorporation des Wirkstoffs in die Nanokapseln an.
Beispiel 4: Verkapselung einer Busulfan-Suspension
A) Suspendierung von Busulfan (zu einer Konzentration von 0,25 mg/ml)
Der erste Schritt der Verkapselung von Busulfan besteht darin, dieses in N,N-Dimethylacetamid zu solubilisieren. Man stellt folglich eine Lösung mit 24 mg Busulfan pro ml N,N-Dimethylacetamid her. Man nimmt 175 mg von dieser Lösung ab, die man zu 504 mg Labrafac^® hinzusetzt. Man wiegt gleichfalls 75 mg Lipoid^® S75-3, 504 mg Solutol^®, 3,829 g Wasser und 88 mg Natriumchlorid ab. Die anfängliche Emulsion hat folglich eine Konzentration von 0,88 mg/g Emulsion. Das Ganze wird in ein und demselben Becherglas vereinigt und magnetisch gerührt. Eine Erwärmung wird angewandt, bis eine Temperatur von 85°C erzielt wird. Stets unter magnetischem Rühren lässt man das System bis auf eine Temperatur von 60°C abkühlen. Dieser Zyklus (zwischen 85°C und 60°C) wird dreimal ausgeführt. Bei der letzten Abkühlung führt man bei 70°C ein Abschrecken aus, indem man 12,5 ml destilliertes Wasser bei 2°C +/– 1°C daraufgießt. Das System wird dann 5 min weiter magnetisch gerührt. Die Endkonzentration, d. h. nach Abschrecken und folglich Verdünnung, beträgt 0,25 mg/ml.
Die Größe der erhaltenen Teilchen ist geringfügig größer als jene des Beispiels 1 aufgrund des bedeutenderen Anteils der Fettphase (63 +/– 5 nm). Wie für Progesteron findet sich in der wässrigen Phase kein Busulfan in einer höheren Konzentration als seiner Löslichkeit. Tatsächlich ist anhand von optischer Mikroskopie in der wässrigen Phase nach der Verkapselung keinerlei Kristall sichtbar. Da Busulfan in Wasser praktisch unlöslich ist, zeigt dies folglich eine Inkorporation des Busulfans in die Nanokapseln an.
B) Suspendierung von Busulfan (zu einer Konzentration von 5 0 mg/ml)
Eine Suspension von Teilchen mit einer Konzentration von 0,50 mg/l wird unter den gleichen Bedingungen wie zuvor hergestellt, nachdem man 50 mg Busulfan in 1 ml N,N-Dimethylacetamid solubilisiert hat. Man nimmt 175 mg von dieser Lösung ab, die man zu 504 mg Labrafac^® hinzusetzt. Man wiegt gleichfalls 75 mg Lipoid^® S75-3, 504 mg Solutol^®, 3,829 g Wasser und 88 mg Natriumchlorid ab. Die anfängliche Emulsion hat folglich eine Konzentration von 1,76 mg/ml Emulsion. Das Ganze wird in ein und demselben Becherglas vereinigt und magnetisch gerührt. Eine Erwärmung wird angewandt, bis eine Temperatur von 85°C erzielt wird. Stets unter magnetischem Rühren lässt man das System bis auf eine Temperatur von 60°C abkühlen. Dieser Zyklus (zwischen 85°C und 60°C) wird dreimal ausgeführt. Bei der letzten Abkühlung führt man bei 70°C ein Abschrecken aus, indem man 12,5 ml destilliertes Wasser bei 2°C +/– 1°C daraufgießt. Das System wird dann 5 min weiter ma gnetisch gerührt. Die Endkonzentration, d. h. nach Abschrecken und folglich Verdünnung, beträgt 0,50 mg/ml.
Beispiel 5: Einfluss der Natur des Fetts auf die Phasenumkehrtemperatur
Man vergleicht Labrafac^®, ein aus Triglyceriden von Caprinsäure und Caprylsäure zusammengesetztes Öl, mit Fettsäureestern. Man konnte die Bedeutung der Größe von deren terminalen Gruppen auf die Phasenumkehrtemperatur nachweisen. Man beobachtet eine Erhöhung der Phasenumkehrtemperatur bei einer Zunahme der Größe der Gruppen. So ist bei der Reihe der Myristate die Veränderung des Aussehens für den Ethylester bei 69,5°C, für den Isopropylester bei 71,5°C und für den Octyldodecylester bei 86,5°C sichtbar. Diese Zunahme bringt zum Ausdruck, dass wir leichter eine Öl-in-Wasser-Emulsion erhalten, wenn das Öl einen niedrigeren HLB-Index aufweist (lipophiler ist). Tatsächlich bringt dieser ausgeprägtere lipophile Charakter eine Betonung der hydrophoben Bindungen zwischen der grenzflächenaktiven Substanz und dem Öl mit sich und es bedarf folglich mehr Energie, um dieses System umzukehren. Andererseits beeinflusst die Länge der kohlenstoffhaltigen Kette der Fettsäure die Größe der Teilchen nicht und auch nicht die Phasenumkehrtemperatur (zwischen C₁₄ und C₁₈). Es scheint indessen, dass die in Ethyloleat vorhandene Doppelbindung die Phasenumkehrtemperatur merklich erhöht.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
TABELLE IV
Der Wert des HLB des Fetts scheint die Größe der Teilchen nicht auf signifikante weise zu beeinflussen.
Beispiel 6: Einfluss der Natur der lipophilen grenzflächenaktiven Substanz auf die Größe der Nanokapseln
Es wurden unterschiedliche Arten von Lecithin, deren Anteile an Phosphatidylcholin von 40 bis 90% variierten, eingesetzt. Die mittlere Größe der Teilchen nimmt mit dem Gehalt an Phosphatidylcholin in dem Lecithin zu (Tabelle V unten). Tatsächlich beträgt bei 40% Phosphatidylcholin die Größe der Nanokapseln 35 +/– 8 nm, wohingegen sie bei einem Anteil von 75 bzw. 90% Phosphatidylcholin im Lecithin 43 +/– 7 nm bzw. 78 +/– 12 nm beträgt. Im Gegenzug hat die Verwendung von geladenen Molekülen es nicht erlaubt, Nanokapseln zu erhalten.
TABELLE V
Beispiel 7: Lipidische Nanokapseln, die einen wasserlöslichen Wirkstoff angeheftet an ihre Oberfläche aufweisen
Man stellt 500 mg einer Dispersion von nicht mit Wirkstoff beladenen lipidischen Nanokapseln, wie in Beispiel 1 beschrieben, her, indem man die folgende Rezeptur verwendet:

– Lipoid^® S75-3 : 1,51 Masse-%

– Labrafac^® W1.1349 : 10,08 Masse-%

– Solutol^® HS15 : 10,08 Masse-%

– Wasser : 76,6 Masse-%

– NaCl : 1,76 Masse-%
Die erhaltenen lipidischen Nanokapseln weisen eine Größe von 43 ± 7 nm auf. 50 mg der Dispersion von erhaltenen lipidischen Nanokapseln werden mit 1 ml Wasser verdünnt und unter sanfter Bewegung mit einer wässrigen Lösung, welche 50 μg DNA (pSV-β-Galactosidase, Promega, Frankreich) enthält, 1 h in Gegenwart einer Mischung von aus Kalbsthymus stammenden Histonen (Boehringer Mannheim, Deutschland) inkubiert. Man erhält lipidische Nanokapseln, die mit den Proteinen kondensierte DNA-Moleküle adsorbiert auf ihrer Oberfläche aufweisen.

Claims

Nanokapseln mit einer mittleren Größe von unter 150 nm, vorzugsweise unter 100 nm, noch mehr bevorzugt unter 50 nm, welche aus einem im wesentlichen lipidischen, bei Umgebungstemperatur flüssigen oder halbflüssigen Kern, welcher von einem im wesentlichen lipidischen, bei Umgebungstemperatur festen Film umhüllt ist, gebildet werden.
Lipidische Nanokapseln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ihr Polydispersitätsindex zwischen 5 und 15% beträgt.
Lipidische Nanokapseln nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke des festen Films zwischen 2 und 10 nm beträgt.
Lipidische Nanokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Kern der Nanokapseln im wesentlichen aus einem Fett, wie einem Triglycerid oder einem Fettsäureester, welches bzw. welcher 20 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 25 bis 50 Gew.-% der Nanokapseln ausmacht, gebildet wird.
Lipidische Nanokapseln nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Triglycerid, welches den Kern der Nanokapseln bildet, ausgewählt wird unter den C₈- bis C₁₂-Triglyceriden, beispielsweise Triglyceriden der Caprin- und Caprylsäure und deren Mischungen.
Lipidische Nanokapseln nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, der Fettsäureester, welcher den Kern der Nanokapseln bildet, ausgewählt wird unter den C₈- bis C₁₈-Fettsäureestern, beispielsweise Ethylpalmitat, Ethyloleat, Ethylmyristat, Isopropylmyristat, Octyldodecylmyristat und deren Mischungen.
Lipidische Nanokapseln nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Fettsäureester ein C₈- bis C₁₂-Fettsäureester ist.
Lipidische Nanokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Film im wesentlichen aus einer lipophilen grenzflächenaktiven Substanz gebildet wird.
Nanokapseln nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis Fett/lipophile grenzflächenaktive Verbindung zwischen 1 und 15, vorzugsweise zwischen 1,5 und 13, mehr bevorzugt zwischen 3 und 8 ausgewählt wird.
Lipidische Nanokapseln nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile grenzflächenaktive Substanz ein Lecithin ist, dessen Anteil an Phosphatidylcholin zwischen 40 und 90% beträgt.
Lipidische Nanokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Film außerdem eine hydrophile, nicht-ionische grenzflächenaktive Substanz, beispielsweise Solutol^® HS15, welche 2 bis 10 Gew.-% der Nanokapseln ausmacht, enthält.
Lipidische Nanokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff enthalten.
Verfahren zur Herstellung der Nanokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches die Verfahrensschritte umfasst, bestehend darin: a) – eine Öl/Wasser-Emulsion herzustellen, die eine ölartige Fettphase, eine hydrophile, nicht-ionische grenzflächenaktive Substanz, eine bei 20°C feste lipophile grenzflächenaktive Substanz und gegebenenfalls einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff, welcher in einer ölartigen Fettphase löslich oder dispergierbar ist, oder einen pharmazeutisch wirksamen Wirkstoff, welcher in einer wässrigen Phase löslich oder dispergierbar ist, enthält, – die Phasenumkehr der Öl/Wasser-Emulsion durch Erhöhung der Temperatur bis auf eine Temperatur T₂, welche höher als die Phasenumkehrtemperatur (TIP) ist, hervorzurufen, um eine Wasser/Öl-Emulsion zu erhalten, gefolgt von einer Verringerung der Temperatur bis auf eine Temperatur T₁, wobei T₁ < TIP < T₂, – wenigstens einen oder mehrere Temperaturzyklen um die Phasenumkehrzone zwischen T₁ und T₂ herum auszuführen, bis eine durchscheinende Suspension beobachtet wird, b) die Abschreckung der Öl/Wasser-Emulsion bei einer Temperatur nahe T₁, vorzugsweise über T₁ auszuführen, um stabile Nanokapseln zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die ölartige Fettphase ein C₈- bis C₁₂-Triglycerid ist, beispielsweise Triglyceride der Caprin- und Caprylsäure und deren Mischungen oder ein C₈-C₁₈-Fettsäureester, beispielsweise Ethylpalmitat, Ethyloleat, Ethylmyristat, Isopropylmyristat, Octyldodecylmyristat und deren Mischungen.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile, nicht-ionische grenzflächenaktive Substanz Solutol^® HS15 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile grenzflächenaktive Substanz ein Lecithin, dessen Anteil an Phosphatidylcholin zwischen 40 und 90% beträgt, beispielsweise Labrafac^® WL 1349, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Öl/Wasser-Emulsion enthält: 1 bis 3% lipophile grenzflächenaktive Substanz, 5 bis 15% hydrophile grenzflächenaktive Substanz, 5 bis 15% ölartiges Fett, 64 bis 89% Wasser, wobei die Prozentsätze auf das Gewicht bezogen ausgedrückt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Öl/Wasser-Emulsion außerdem 1 bis 4% eines Salzes, wie Natriumchlorid, enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile grenzflächenaktive Substanz bei 37°C fest ist.
Verfahren zur Herstellung von Nanokapseln nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein wasserlöslicher, pharmazeutisch wirksamer Wirkstoff auf der freien Oberfläche der stabilen Nanokapseln, die am Ende von Schritt b) erhalten werden, adsorbiert wird.
Verwendung der Nanokapseln nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches durch Injektion, insbesondere auf intravenösem Wege, auf oralem Wege oder auf nasalem Wege verabreicht wird.