DE60104810T2

DE60104810T2 - Zellfreies Verfahren zur Herstellung von posttranslational veränderten Proteinen

Info

Publication number: DE60104810T2
Application number: DE60104810T
Authority: DE
Inventors: Cha Yong Gwanak-gu Choi; Sang Hyeon Kang; Taek Jin Kang; Ji Hyoung Woo; Sang Kil Seocho-gu Lee; Seung Woo Mapo-Gu Cho
Original assignee: DreamBiogen Co Ltd
Current assignee: DreamBiogen Co Ltd
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2001-02-22
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2021-02-23
Also published as: US20020106719A1; EP1231278B1; ES2227097T3; EP1231278A1; JP2002238595A; KR100399337B1; DE60104810D1; KR20020065769A; US6780607B2; US20050084926A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren der Herstellung von vollständig posttranslational modifizierten Proteinen durch eine Kombination von zellfreier Proteinsynthese und zellfreier, vollständiger posttranslationaler Modifizierung.
HINTERGRUND
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Proteinen von therapeutischem, wissenschaftlichem und kommerziellem Wert, die eine posttranslationale Modifizierung nicht durch ein Zellkulturverfahren, sondern durch ein zellfreies Syntheseverfahren von vollständig posttranslational modifiziertem Protein erfordert. Näher erklärt, wird ein wertvolles Protein unter Benutzung eines zellfreien Syntheseverfahrens von vollständig posttranslational modifiziertem Protein hergestellt, das einen Zellextrakt einschliesslich der Proteinsynthese-Maschinerie sowie einen Zellmembranextrakt einschliesslich der vollständigen posttranslationalen Modifizierungsmaschinerie umfasst.
Viele pharmakologische Proteine erleiden posttranslationale Modifizierungen wie Glykosylierung, Phosphorylierung, Amidierung usw., die für ihre Aktivität unabdingbar sind. Darüber hinaus sind die meisten von Säugerzellen abgesonderten Proteine posttranslational modifiziert. Viele Proteine werden posttranslational während des „Sekretionsprozesses" modifiziert, der einen Weg von ihrem Syntheseort im rauen endoplasmatischen Retikulum (ER) durch den Golgi-Apparat zu den verschiedenen zellulären oder extrazellulären Bestimmungsorten umfasst. Bei der posttranslationalen Modifizierung eines Proteins wird anorganisches Phosphat durch Phosphorylierung an Proteine angefügt, die Amidgruppe wird am Terminus von Polypeptiden durch Amidierung erzeugt, und Kohlenhydrate werden durch Glykosylierung an Proteine angefügt. Von diesen ist Glykosylierung die komplizierteste Prozedur, in die mehrere Enzyme einbezogen sind. Daher sind Glykoproteine die meistgestaltige Gruppe biologischer Verbindungen, die allgegenwärtige Bestandteile fast aller lebender Organismen sind. Sie finden sich in den Zellen sowohl in löslichen als auch in membran-gebundenen Formen, ebenso in der extrazellulären Matrix und in interzellulären Flüssigkeiten und erfüllen eine Vielfalt von Funktionen. Diese Proteine besitzen Oligosaccharide, die kovalent durch eine Asparagin- (Asn) Seitenkette („asparagin-verknüpft" oder „N-verknüpft") oder durch eine Threonin- oder Serin-Seiten kette („O-verknüpft") angefügt sind. Ein gegebenes Glykoprotein kann nur N-verknüpfte Oligosaccharidketten, nur O-verknüpfte Oligosaccharidketten oder beide enthalten. Die Kohlenhydrateinheiten der Glykoproteine weisen beträchtliche Unterschiede in ihrer Grösse und Struktur auf und reichen vom Mono- oder Disaccharid bis zu aus vielleicht bis zu 20 Monosaccharidgruppen zusammengesetzten, verzweigten Oligosacchariden.
Zusammengefasst, beginnt die N-verknüpfte Glykosylierung mit der Synthese einer lipid-verknüpften Oligosaccharidgruppe und ihrer Überführung als Ganzes zu einer naszierenden Polypeptidkette im ER. Die Anfügung erfolgt durch Asn, und zwar allgemein an der Tripeptid-Erkennungssequenz Asn-X-Ser/The, wobei X jede der natürlich vorkommenden Aminosäuren sein kann. Eine Reihe von Trimmingreaktionen wird im ER durch Exoglykosidase katalysiert. Die Verarbeitung von N-verknüpften Oligosacchariden durch Säugerzellen wird im Golgi-Kompartment fortgesetzt, wo durch eine Folge von durch Exoglykosidase und Glykosyltransferase katalysierten Reaktionen mannosereiche Oligosaccharidstrukturen vom Hybrid- und Komplextyp erzeugt werden.
Für die Biosynthese von posttranslational modifizierten Proteinen mit biologischer Aktivität müssen eukaryontische Zellen kultiviert werden, die in der Lage sind, sich der posttranslationalen Modifizierung einschliesslich der Glykosylierung zu unterziehen. Die Herstellung von posttranslational modifizierten Proteinen durch die Kultur solcher Zellen ist aber sehr aufwändig, zum Beispiel bei den Kosten für Rechte auf Kulturmedien, Betriebskosten, Gerätekosten usw. Dieser Prozess ist auch sehr zeitintensiv, und viele zellfreie Proteinsynthesesysteme sind entwickelt worden, um den Prozess zu vereinfachen und Zeit zu sparen.
Eine zellfreie Proteinsynthese ist als ein experimentelles Instrument für die Erforschung der In-vitro-Genexpression insbesondere für Proteine verwendet worden, die wegen ihrer Toxizität für die Wirtszellen nicht in vivo erzeugt werden können. Ausserdem können mit diesem Verfahren neben den 20 natürlichen Aminosäuren verschiedene künstliche Aminosäuren für spezielle Zwecke wirksam in Proteinstrukturen eingeführt werden (C. J. Noren und Mitautoren, Science, 244: 182 – 188 (1989)). Darüber hinaus ist die zellfreie Proteinsynthese in der letzten Zeit als eine Alternative für die Herstellung kommerziell wichtiger rekombinanter Proteine neu beurteilt worden, hauptsächlich auf Grund der kürzlich erfolgten Entwicklung eines neuen Reaktorsystems und der umfassenden Optimierung der Reaktorbetriebsbedingungen (D. M. Kim und Mitautoren, Eur. J. Biochem., 239: 881 – 886 (1996); T. Kigawa und Mitautoren, FEBS Lett., 442: 15 – 19 (1999)). Daher hat die Entwicklung von zellfreien Proteinsynthesesystemen die nächste Stufe erreicht, nämlich die Herstellung aktiver Proteine im kommerziellen Massstab.
Entsprechend sind einige Verfahren entwickelt worden, um die kotranslational modifizierten und die ersten post-translational modifizierten Proteine herzustellen, indem für die kotranslationale und erste translationale Modifizierung relevante Organellen zu diesen zellfreien Proteinsynthesesystemen hinzugefügt wurden. Als ein repräsentatives Verfahren wird im US-Patent 6 103 489 offenbart, dass zellfreie Assaysysteme für Proteine mit der kotranslationalen und der ersten posttranslationalen Modifizierung durch Kombination eines eukaryontischen, zellfreien Translationssystems mit rauen Mikrosomen aufgebaut worden sind. In einem anderen Verfahren wurde der Extrakt mit translationalen Komponenten und posttranslationalen Modifizierungskomponenten wie ER durch eine Einschritt-Extraktion aus einer Einzelquelle hergestellt (T. Hiroshi und Mitautoren, J. Biosci. Bioeng., 5: 508 – 514 (2000)). Die Biosynthese vieler Proteine in Zellen verlangt zur richtigen Verarbeitung eine kotranslationale Translokation einer ER genannten Organelle durch Membranen. In zellfreien Systemen werden anstelle des ER mikrosomale Membranen verwendet, die dem ER gleichwertig sind, indem sie einen hohen Prozentsatz von ER-Membranen enthalten, die durch Zentrifugieren isoliert worden sind. Diese rekonstituierten Assaysysteme für eine Beurteilung von Proteintranslation und von erster posttranslationaler Verarbeitung in höheren Eukaryonten haben eine Charakterisierung der translokationalen Maschinerie ermöglicht und werden intensiv genutzt, um die Topologie von Membranproteinen zu definieren und die Regulierung der N-verknüpften Kernglykosylierung aufzuklären. Sie erzeugen aber nicht die vollständig posttranslational modifizierten Proteine. Da Proteine, die nicht vollständig translational modifiziert sind, nicht die vollständige und korrekte Struktur besitzen, können sie nicht verwendet werden, um die Nützlichkeit und Eigenschaften von Proteinen einschliesslich ihrer pharmakologischen Aktivität zu studieren. Dies beruht auf der Tatsache, dass Proteine mit unvollständiger oder fehlender posttranslationaler Modifizierung keine oder nur eine geringe biologische Aktivität besitzen und daher therapeutisch nicht verwendet werden können. Derzeitige zellfreie Proteinsyntheseverfahren können keine Proteine mit einer vollständigen Struktur erzeugen und genügen daher nicht, um damit die posttranslationalen Modifizierungen der Funktionen von Genen zu studieren.
Inzwischen ist aus den Ergebnissen des Humangenom-Projekts sehr viel Information über die Genetik des Menschen gewonnen worden. In naher Zukunft wird die vollständige Genomkarte des Menschen verfügbar sein. Wir haben nunmehr die Postgenome Ära erreicht, in der die Funktionen von Genen und ihren kodierten Proteinen studiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden in der Bioinformatik Computerprogramme verwendet, die Information über die Sequenz eines Gens verwenden können, um die Struktur des kodierten Proteins vorherzusagen. Aus der vorhergesagten Struktur des Proteins und der Gensequenz kann die Funktion des Proteins aufgeklärt werden. Dieser Prozess, die Funktion des Proteins durch Vorhersage zu gewinnen, ist kein ganz zufriedenstellendes Verfahren. Ein besseres Verfahren wäre, das Protein zu exprimieren und die Funktion durch Experimente zu untersuchen. Das zu untersuchende Protein sollte die vollständigen ko- und posttranslationalen Modifizierungen besitzen. Um diese Proteine zu erzeugen, sollten die interessierenden Gene in einer eukaryontischen Wirtszelle exprimiert werden. Dieser Prozess ist sehr zeitintensiv, und zellfreie Proteinsynthese kann eingesetzt werden, um den Prozess zu vereinfachen und Zeit zu sparen. Bis jetzt ist ein zellfreies Proteinsynthesesystem mit einer vollständigen posttranslationalen Modifizierung nicht entwickelt worden. Daher muss ein zellfreies Proteinsynthesesystem entwickelt werden, das in der Lage ist, ein Protein zu erzeugen, das den vollständigen posttranslationalen Modifizierungen unterworfen worden ist.
Um das Problem des bisherigen Standes der Technik zu lösen, dass zellfreie Proteinsynthesesysteme nur unvollständig posttranslational modifizierte Proteine hergestellt haben, liefert die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von vollständig posttranslational modifizierten Proteinen durch ein weiter fortgeschrittenes zellfreies Proteinsynthesesystem und insbesondere durch die Kombination von zellfreier Proteinsynthese und zellfreier, vollständiger posttranslationaler Modifizierung.
Wir erwarten, dass die Verfahren der zellfreien Proteinsynthese gemäss vorliegender Erfindung ein nützliches Instrument für die Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine für die Funktionsanalyse von Proteinen und für die Herstellung therapeutisch wichtiger Proteine im grossen Massstab werden und als ein Modellsystem für die Aufklärung der Rolle von Proteinen und der Mechanismen der posttranslationalen Modifizierung dienen können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um ein solches Ziel zu erreichen, liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung vollständig posttranslational modifizierter Proteine über eine gekoppelte, zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine, daraus bestehend,
ein DNA-Template zu einem Zellextrakt hinzuzufügen,
Ribonucleotid-Triphosphate zum Extrakt hinzuzufügen und
eine genügende Menge von ko- und posttranslationaler Modifizierungsmaschinerie wie ER/Golgi-Apparat, ER/Golgi-Apparat/Plasmamembranen oder zusätzlich zu diesen noch andere Organellen zum Extrakt hinzuzufügen, um die Erzeugung des vollständig posttranslational modifizierten Proteins zu stimulieren,
oder über eine nicht gekoppelte, zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine, daraus bestehend,
ein RNA-Template zu einem Zellextrakt hinzuzufügen und
eine genügende Menge von ko- und posttranslationaler Modifizierungsmaschinerie wie ER/Golgi-Apparat, ER/Golgi-Apparat/Plasmamembranen oder zusätzlich zu diesen noch andere Organellen zum Extrakt hinzuzufügen, um die Erzeugung des vollständig posttranslational modifizierten Proteins zu stimulieren.
Der komplizierteste posttranslationale Modifizierungsprozess, der mehrere Enzyme erfordert, ist die Glykosylierung. Eine korrekte Glykosylierung bedeutet, dass die meisten posttranslationalen Modifizierungen mit dem gleichen Verfahren möglich sind.
Bei Betrachtung des Glykosylierungsprozesses von Proteinen in Zellen erfolgt die Glykosylierung in den meisten Eukaryonten üblicherweise im ER, d.h. Hefe-, Insekten-, Pflanzen- und Säugerzellen haben gemeinsame Merkmale der Verarbeitung von N-ver knüpften Oligosacchariden im ER. Obwohl die anfallenden Glykoproteine im ER eine nahezu identische Kohlenhydratstruktur besitzen, können Glykoproteine mit therapeutischer Wirksamkeit mit nur einer ersten Glykosylierung im ER nicht vollständig hergestellt werden.
Die Herstellung eines frühen Glykoproteins, das nicht die vollständige posttranslationale Modifizierung durchmacht, kann durch Mangelhaftigkeit der Maschinerie für die terminale Glykosylierung wie zum Beispiel des Golgi-Apparats verursacht sein. In anderen Worten kann die Oligosaccharidverarbeitung im Golgi-Apparat bei verschiedenen Zelltypen abweichend sein. Der Anfangsschritt in der O-Glykosylierung durch Säugerzellen ist die kovalente Anfügung von N-Acetylgalactosamin an Serin oder Threonin. Keine zu dem für die N-Glykosylierung erforderlichen Asn-X-Ser/Thr-Template analoge O-Glykosylierungssequenz ist identifiziert worden. Weiter ist im Gegensatz zur N-Glykosylierung kein vorgebildeter, lipid-gekoppelter Oligosaccharid-Vorläufer an der Initiierung der O-Glykosylierung bei Säugern beteiligt. Zuckernucleotide dienen als die Substrate für den ersten und alle weiteren Schritte in der O-verknüpften Verarbeitung. Auf die kovalente Anfügung von N-Acetylgalactosamin an Serin oder Threonin folgend sind für O-verknüpfte Säuger-Oligosaccharide im Golgi mehrere verschiedene Verfahrenswege möglich. Die Oligosaccharidstrukturen von Glykoproteinen können einen tiefgreifenden Einfluss auf Eigenschaften haben, die für therapeutische Verwendung beim Menschen kritisch sind, darunter die Plasmaclearance, die Antigenität, die Immunogenität, die spezifische Aktivität, die Löslichkeit, der Widerstand gegenüber thermischer Inaktivierung und der Widerstand gegenüber Proteaseangriff. Damit eine zellfreie Proteinsynthese für eine Herstellung von Glykoprotein im grossen Massstab angewendet werden kann und damit schnell Erkenntnisse über die Rolle der Proteinglykosylierung gewonnen werden können, um die Beziehungen zwischen Stabilität, Konformation, Funktion des Proteins und Glykosylierung zu verstehen, muss daher ein wirksames zellfreies Synthesesystem für vollständig posttranslational modifizierte Proteine entwickelt werden, bei dem das Protein vollständig posttranslational modifiziert wird.
Für die Herstellung von Proteinen mit der vollständigen und korrekten Struktur umfasst die vorliegende Erfindung die Kombination eines zellfreien Proteinsynthese systems und die ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie einschliesslich der von Zellen abgetrennten Organellen, die für eine ko- und posttranslationale Modifizierung relevant sind. Dieses zellfreie Syntheseverfahren für vollständig posttranslational modifizierte Proteine ist ein neues Vorgehen, das durch niemanden versucht worden ist. Dieses Verfahren eignet sich speziell für eine Herstellung wirksamer und nützlicher Proteine im grossen Massstab. Zusätzlich kann dieses Verfahren direkt auf die posttranslationalen Modifizierungsprozesse angewendet werden, die neben der Glykosylierung erforderlich sind, um ein biologisch aktives Protein herzustellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Autoradiogramme von mit dem in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren vollständig posttranslational modifiziertem EPO und von nicht modifiziertem EPO, die durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt worden sind;
2 zeigt die Ergebnisse eines Western-Blottings von EPO-Mustern, die mit einem herkömmlichen Zellkulturverfahren und mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden.
3 zeigt ein Autoradiogramm von mit Glykosidase behandeltem EPO.
4 zeigt Autoradiogramme von EPO-Mustern, die mit einer ungekoppelten zellfreien Synthese vollständig translational modifizierter Proteine und mit einer gekoppelten zellfreien Synthese vollständig translational modifizierter Proteine hergestellt wurden.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wegen der Unfähigkeit von Prokaryonten, Proteine ko- oder posttranslational zu modifizieren, muss das in der vorliegenden Erfindung verwendete zellfreie Proteinsynthesesystem von Eukaryonten abgeleitet werden. Bisher sind verschiedene Quellen von eukaryontischem Lysat (Proteine synthetisierender Maschinerie), darunter Pilze, Säugerzellen (zum Beispiel Retikulozyten, Endothelzellen und Lymphozyten), immortalisierte Zelllinien (zum Beispiel Krebszelllinien), Pflanzenzellen (wie Weizenkeim- oder embryozellen), verwendet worden. Ein leistungsfähiges gekoppeltes eukaryontisches System für zellfreie Transkription und Translation ist unter Verwendung von Bakteriophagen-RNA-Polymerase und Kaninchen-Retikulozytenlysat (RRL) entwickelt worden (US-Patent 5 324 637). Die Ausdrücke „gekoppeltes System für Transkription und Translation" und „gekoppeltes zellfreies Proteinsynthesesystem" definieren den Prozess, in dem Transkriptions- und Translationschritte sequentiell in einem zellfreien System ausgeführt werden. Die Ausdrücke „ungekoppeltes zellfreies Proteinsynthesesystem" und „zellfreies Translationssystem" beziehen sich auf den Prozess, in dem transkribierte mRNA nach dem anfänglichen Transkriptionsschritt gereinigt und die gereinigte mRNA dann in ein getrenntes Reaktionssystem überführt wird, in dem die Proteinsynthese stattfindet.
Wie oben erwähnt, muss ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie, die an der abschliessenden Glykosylierung beteiligt ist, hinzugefügt werden, da vollständig posttranslational modifizierte Proteine durch alleinige Zugabe von ER nicht erzeugt werden können. Ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie, die Signalerkennungs-Partikel, ER, Golgi-Apparat, Plasmamembran usw. enthält, stimuliert bei ihrer Zugabe zum zellfreien Proteinsynthese-Reaktionsgemisch die Produktion von vollständig posttranslational modifiziertem Protein. Ein komplettes Inkubationsgemisch (das die Komponenten der zellfreien Proteinsynthese und die ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie enthält) liefert die vollständig posttranslational modifizierten Proteine. Die Ereignisse des ko- und posttranslationalen Modifizierungsprozesses konnten in vitro getreu reproduziert werden. Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Ergebnisse haben die Möglichkeit einer zellfreien Proteinsynthese als Alternative zur In-vivo-Produktion pharmakologischer Proteine eröffnet und das Verständnis des ko- und posttranslationalen Modifizierungsprozesses vertieft.
Die Zellquellen für die Zubereitung des Extrakts oder Lysats für das zellfreie Proteinsynthesesystem können die gleichen sein wie die für die ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie, oder sie können unterschiedlich sein. Wenn die gleichen Zellen verwendet werden, dann können der Extrakt bzw. das Lysat für das zellfreie Proteinsynthesesystem und die ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie getrennt oder zusammen zubereitet werden.
Die ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie kann aus Geweben und kultivierten Zelllinien hergestellt werden. Bei der Glykosylierung ist es günstig, eine Zollquelle für ein verstärktes Expressionsniveau der glykosylierungs-bezogenen Enzyme und/oder für eine Bereicherung des Vorrats an Zuckernucleotiden, die als Zuckerdonatoren bei der Glykosylierung dienen, gentechnisch zu erzeugen. Diese Art genetischer Manipulation kann von Fachleuten ausgeführt werden; daher wird die eingehende Erklärung in dieser Beschreibung weggelassen.
Als Beispiele für die Gewinnung von Zellextrakt für das zellfreie Proteinsyntheseverfahren werden die Zubereitung eines nuclease-behandelten RRL und eines rohen Homogenisats aus Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO) eingehend in Beispiel Nr. 1 bzw. Beispiel Nr. 2 beschrieben. Die Zubereitung von ER-haltigen Signalerkennungspartikeln, Golgi-Apparat und Plasmamembran aus einem rohen Homogenisat ist eingehend in Beispielen Nr. 3, Nr. 4 bzw. Nr. 5 beschrieben.
Wenn erforderlich, können die mit dem zellfreien Proteinsyntheseverfahren gemäss vorliegender Erfindung hergestellten Glykoproteine weiter durch eine Kohlenhydrate addierende Reaktion und/oder eine Kohlenhydrate entfernende Reaktion und/oder eine Kohlenhydrate ersetzende Reaktion mit Enzymen modifiziert werden, die für eine Modifizierung der Seitenketten relevant sind, zum Beispiel Glykosyltransferase, Glykosidase, Transglykosidase usw. Das bedeutet, dass Kohlenhydrat-Seitenketten hinzugefügt, entfernt oder ausgetauscht werden können. Weiter ist es möglich, Kohlenhydrat-Seitenketten einzuführen, die in den allgemeinen Glykoproteinstrukturen nicht bekannt sind, oder neuartige Glykoproteinstrukturen künstlich zu synthetisieren, so dass die Entwicklung neuer Glykoproteine erwartet wird. Zum Beispiel wird im Austrag der Kohlenhydrate addierenden Reaktion selbst oder im Erythropoietin (EPO), das daraus isoliert wurde, Sialinsäure durch Transglykosidase – eines der Enzyme, die Kohlenhydratketten addieren – weiter an deren endständige Kette angefügt, und die Leistungsfähigkeit des Glykoproteins erhöht sich mit der Addition von Sialinsäure zu dessen endständiger Kette.
Die vorliegende Erfindung kann auf die Herstellung von Proteinen von therapeutischem, kommerziellem oder wissenschaftlichem Wert angewendet werden. Dazu gehören Proteine wie Wachstumshormone, der Granulozytenkolonien stimulierende Faktor, Interleukin, Interferon, Thrombopoietin, Gewebeplasminogen-Aktivator und humanisierte monoklonale Antikörper. Des Weiteren liefert die vorliegende Erfindung nicht nur das vollständig posttranslational modifizierte Protein, sondern kann auch als ein Forschungswerkzeug in Gestalt eines Bausatzes für die ko- und posttranslationale Modifizierung verwendet werden, um die Funktion eines Gens aufzufinden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist EPO durch zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine erzeugt worden. Jedoch ist zu verstehen, dass sich die vorliegende Erfindung nicht auf diese konkreten Beispiele beschränkt, sondern verschiedene Abwandlungen erfahren kann, die durch den Fachmann in der vorliegenden Erfindung erkenntlich sind. Lediglich ein Beispiel von EPO-Glykosylierung wird offenbart, aber dieses Beispiel ist repräsentativ für jede der verschiedenen ko- und posttranslationalen Modifizierungen. Daher schliesst die vorliegende Erfindung alle Arten einer ko- und posttranslationalen Modifizierung ein.
EPO ist ein therapeutisches Glykoprotein, das heute zur Behandlung von Anämien verwendet wird, die auf verschiedene Ursachen zurückgehen, darunter chronisches Nierenversagen. EPO ist ein hauptsächlicher Regulator der Erzeugung roter Blutkörperchen in Säugern und Vögeln. Konkret fördert dieses Glykoproteinhormon das rasche Wachstum von Progenitoren der roten Blutkörperchen im Knochenmark, in der Milz und in der Fötusleber und wird anschliessend für deren abschliessende Differenzierung zu Erythrozyten des Kreislaufs benötigt. Tierzellenkulturen werden heute zur Erzeugung des therapeutischen EPO verwendet.
Die Herstellung von EPO über eine gekoppelte, zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine wird eingehend im Beispiel Nr. 6 beschrieben. Die Herstellung von EPO über eine ungekoppelte, zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine wird eingehend im Beispiel Nr. 7 beschrieben. Die Herstellung von EPO über eine Kombination von zellfreier Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine und einer enzymatischen In-vitro-Glykosylierung wird eingehend im Beispiel Nr. 8 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die dazu dienen, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht so auszulegen sind, dass sie deren Umfang einschränken.
Beispiel Nr. 1: Zubereitung von nuclease-behandeltem Kaninchenretikulozyten-Lysat
Jedem Tier wurden an Tagen 1, 2 und 3 des Plans täglich 4 – 5 ml einer 1,25-%igen Lösung (Gew./Vol.) von Acetylphenylhydrazin (APH) ins Genick injiziert. Eine Vorratslösung von 1,25% APH in Wasser (Gew./Vol.) wurde auf einem Heizrührer zubereitet und bei –20°C aufbewahrt. Die Kaninchen wurden normalerweise am Tag 8 des Plans zur Ader gelassen. Hypnorm (0,5 ml) wurde in den Oberschenkelmuskel injiziert. Nachdem das Hypnorm seine Wirkung entfaltet hatte und die Kaninchen ziemlich benommen waren, wurde der Rand eines der Ohren rasiert, um die grosse marginale Vene freizulegen, in die 2 – 2,5 ml Nembutal oder Sagatal mit 2000 Einheiten Heparin injiziert wurden. Wenn das Tier ganz bewusstlos war, wurde seine Brust mit 95-%igem Ethanol (Vol./Vol.) befeuchtet und die Haut mit einer scharfen Schere weggeschnitten. Wenn der Brustkorb gut freigelegt war, wurde ein Einschnitt quer an der Unterseite und dann von unten aus entlang der Mittellinie in Richtung auf den Kopf ausgeführt, was einen dreieckigen Lappen aus Fleisch und Knochen mit einer Seitenlänge von etwa einem Zoll ergab. Dieser Lappen wurde aufgefaltet, und entweder das Herz selbst oder eines der grossen, vom Herz wegführenden Gefässe wurde aufgeschnitten. Die Brusthöhle sollte sich rasch mit Blut füllen, das mit einer Spritze von 30 bis 50 ml, die an einem drei Zoll langen Stück Silicongummi- oder Tygonschlauch angebracht war, entfernt und in ein gekühltes Becherglas in einem Eimer mit Eis gegeben wurde. Von jedem Kaninchen wurden im Durchschnitt 100 ml Blut gewonnen.
Das Blut wurde durch Leinentuch oder Nylonnetz filtriert, um Haare und Bruchstücke zu entfernen. Die Zellen wurden durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 500-ml-Polycarbonatflaschen bei 2000 U/min vom Blut geerntet. Nach Absaugen des Überstehenden wurden die Zellen in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (5,5 mM KOAc, 25 mM Tris/Acetat, 137 mM NaCl, 0,28 mM Na₂HPO₄·12 H₂O, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM Dithiothreit (DTT)), die 5 mM Glucose enthielt, erneut suspendiert und nochmals wie vorher zentrifugiert. Die Zellen wurden weitere drei Male gewaschen, d.h. insgesamt viermal langsam zentrifugiert; beim letzten Waschen wurde das Volumen der Zellen bestimmt, indem sie in einem abgemessenen Volumen der Kochsalzlösung erneut suspendiert wurden und das Gesamtvolumen gemessen wurde. Nach dem letzten Zentrifugieren wurde von der Kochsalzlösung so viel wie möglich entfernt, dann wurden 1,5 Volumina (bezüglich des Volumens der zusammengepressten Zellen) eiskalten, destillierten Wassers hinzugefügt. Die Zellen wurden gründlich mit dem Wasser vermischt, und die Inhalte der verschiedenen Flaschen wurden vermischt. Das Lysat wurde während 20 min bei 10 000 U/min (etwa 15 000 g) und 2°C zentrifugiert. Das Überstehende wurde durch ein feines Nylonnetz (53 μm Nitex) in einen Becher gegossen, um zu verhindern, dass losgelöste Klumpen von klebrigem Stroma in das Lysat gelangten; es enthält Proteinsynthese-Inhibitor.
Je 400 μl des Lysats wurden 8 μl 1 mM Hämin, 4 μl einer Kreatinkinaselösung (10 mg/ml), 3,2 μl 125 mM CaCl₂ und 16 μl einer Mikrokokken-Nucleaselösung (15 000 Einheiten pro ml) hinzugefügt und gründlich vermischt. Die Mischung wurde während 30 min bei 20°C inkubiert. Der Aufschluss wurde durch Hinzufügen von 8,8 μl 500 mM Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N'-tetraessigsäure (EGTA) abgebrochen; 4,8 μl einer tRNA-Lösung (10 mg/ml) wurden hinzugefügt und gut vermischt. Das Lysat wurde in geeigneten aliquoten Mengen von etwa 85 μl abgefüllt. Das Lysat wurde in flüssigem Stickstoff gefroren, um die schnellstmögliche Abkühlung zu erzielen. Auf diese Weise aufbewahrte Lysate verloren während wenigstens drei Jahren keine Aktivität. Aufbewahrung in einem Gefrierschrank bei –70°C schien für Zeiträume von wenigstens einigen Monaten befriedigend.
Beispiel Nr. 2: Zubereitung eines rohen Homogenisats aus Ovarienzellen chinesischer Hamster
Die CHO-Zellen wurden bei 34°C in zwei Litern des Zellkulturmediums in 30 Kulturplatten (15 cm Durchmesser) über mindestens drei Generationen (die Verdop pelungszeit betrug etwa 20 h) zu einer Dichte von etwa 5 × 10⁵ Zellen/ml (4–6 × 10⁷ Zellen je Platte) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Trypsinierung von den Platten entfernt. Das Medium wurde weggesaugt, und jede Platte wurde mit 10 ml Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (5,5 mM KOAc, 25 mM Tris/Acetat, 137 mM NaCl, 0,28 mM Na₂PO₄·12 H₂O, 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (pH 7,4)) gespült. Dann wurde jede Platte schnell mit 5 ml Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gespült, die 0,05% Trypsin (Gew./Vol.) und 0,02% Na₂EDTA (Gew./Vol.) enthielt. Nach 5 min bei Zimmertemperatur wurden die Zellen auf jeder Platte durch Pipettieren in 2 ml eiskaltem komplettem Medium aufgeschlämmt und dann durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 4°C und 600 g pelletiert. Die Zellpellets wurden dreimal durch wiederholtes Wiederaufschlämmen mit 50 – 100 ml Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung und Zentrifugieren gewaschen, und das Volumen der zusammengepressten Zellen wurde vermerkt. Die Zellpellets wurden in Homogenisatpuffer (250 mM Sucrose, 10 mM Tris/Acetat, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF (pH 7,4)) erneut aufgeschlämmt, um ein endgültiges Volumen zu erzielen, das das Fünffache des Volumens des Zellpellets betrug. Ein rohes Homogenisat wurde aus dieser Zellenaufschlämmung hergestellt, indem mit einem sehr eng passenden 15-ml-Dounce-Homogenisator (Wheaton Co., Milliville NJ) 30 Hübe ausgeführt wurden. Das anfallende rohe Homogenisat konnte unmittelbar verwendet oder bequemer in flüssigem N₂ gefroren und für spätere subzelluläre Fraktionierung bei –80°C aufbewahrt werden.
Beispiel Nr. 3: Zubereitung eines Signalerkennungspartikel enthaltenden endoplasmatischen Retikulums aus einem rohen Homogenisat
Gefrorenes Homogenisat wurde unmittelbar vor der subzellulären Fraktionierung rasch bei 30°C aufgetaut und sodann in Eis aufbewahrt. Dieses rohe Homogenisat wurde während 15 min bei 4°C und 5000 g zentrifugiert. Das Überstehende aus der ersten differentiellen Zentrifugierung wurde weiter fraktioniert, um die ER-Fraktion zu gewinnen. Das ER-Membranen enthaltende Überstehende wurde gesammelt, mit vier Volumina des Homogenisatpuffers verdünnt und während 5 min bei 4°C und 8500 g zentrifugiert, um verunreinigende Mitochondrien zu entfernen. Das Überstehende wurde auf einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten aufgegeben, der aus 2,0 M Sucrose – 10 mM Tris/Acetat (pH 7,4), 1,5 M Sucrose – 10 mM Tris/Acetat (pH 7,4) und 1,3 M Sucrose – 10 mM Tris/Acetat (pH 7,4) in einem Volumenverhältnis von 3:4:4 bestand. Dieser Gradient wurde während 150 min bei 4°C und 90 000 g zentrifugiert (Beckmann-Rotor SW 28 bei 23 000 U/min), und ER-Fraktionen wurden an der 1,3 mM/1,5 mM- und an der 1,5 mM/2,0 mM-Grenzfläche gesammelt. Die Gradientenschichten wurden mit drei Volumina Verdünnungspuffer (55 mM Tris/Acetat und 5 mM Mg(OAc) ₂ (pH 7,0)) verdünnt und während 45 min bei 4°C und 90 000 g zentrifugiert. Das abgesetzte Pellet wurde mit Aufbewahrungspuffer (50 mM Triethanolamin, 2 mM DTT, 50 mM Sucrose) solubilisiert.
Das ER kann mit Staphylokokken-Nuclease (EC 3.1.31.1) behandelt werden, um es von endogener mRNA-Aktivität zu befreien. Zu einer 0,1 ml-Fraktion von ER wurden 8 μl 12,5 mM CaCl₂-Lösung hinzugefügt. Staphylokokken-Nuclease wurde zu einer Endkonzentration von 600 Einheiten/ml hinzugefügt. Der Aufschluss wurde während 30 min bei 20°C ausgeführt und durch Hinzufügen von 2,2 μl 0,5 M EGTA-Lösung (mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt) abgebrochen. Dieses nuclease-behandelte ER wurde in 50-μl-Mengen in flüssigem N₂ gefroren und bei –80°C aufbewahrt. Vor seiner Verwendung wurde das gefrorene ER rasch aufgetaut, indem es kurze Zeit bei 30°C gehalten wurde, und danach in Eis aufbewahrt.
Beispiel Nr. 4: Zubereitung des Golgi-Apparats aus einem rohen Homogenisat
Das gewonnene rohe, gefrorene Homogenisat wurde unmittelbar vor der subzellulären Fraktionierung rasch bei 30°C aufgetaut und danach in Eis aufbewahrt. Diese rohe Homogenisat wurde während 15 min bei 4°C und 5000 g zentrifugiert. Nach einem anfänglichen Zentrifugieren bei 5000 g wurde der grösste Teil des Überstehenden entfernt, und der gelbbraune Anteil (das obere Drittel) des Pellets wurde in einer kleinen Menge des Überstehenden erneut aufgeschlämmt. Nach der Vermischung wurde die Sucrosekonzentration von 6-ml-Anteilen des rohen Homogenisats auf 1,4 M eingestellt, indem 6 ml einer eiskalten 2,3 M Sucrose hinzugefügt wurden, die 10 mM Tris/Acetat (pH 7,4) enthielt. Die Na₂EDTA-Konzentration wurde auf 1 mM eingestellt, indem 100 mM Vorratslösung hinzugefügt wurde. Die Mischung wurde kräftig gerührt (Vortex-Rührer), um gleich förmige Durchmischung zu gewährleisten, dann in ein SW 28-Rohr (Beckman) gegeben und mit 14 ml 1,2 M Sucrose – 10 mM Tris/Acetat (pH 7,4), sodann mit 8 ml 0,8 M Sucrose – 10 mM Tris/Acetat (pH 7,4) überschichtet. Dieser Gradient wurde während 150 min bei 4°C und 90 000 g ultrazentrifugiert (Beckmann-Rotor SW 28 bei 23 000 U/min). Das trübe Band an der 0,8 M/1,2 M-Sucrose-Grenzfläche wurde in einem minimalen Volumen (≤ 1,5 ml) durch Einstechen einer Spritze geerntet. Die Gradientenschichten wurden mit drei Volumina eines Verdünnungspuffers (55 mM Tris/Acetat und 5 mM Mg(OAc) ₂ (pH 7,0)) verdünnt und während 45 min bei 4°C und 90 000 g zentrifugiert. Das abgesetzte Pellet wurde mit Aufbewahrungspuffer (50 mM Triethanolamin, 2 mM DTT, 250 mM Sucrose) solubilisiert. Die Fraktion wurde unmittelbar verwendet oder bequemer in geeigneten aliquoten Mengen in flüssigem N₂ gefroren und bei –80°C aufbewahrt. Die gefrorenen Golgi-Apparat-Fraktionen sollten erst kurz vor dem Versuch aufgetaut werden, indem sie eine minimale Zeit bei 30°C gehalten werden, und vor ihrer Verwendung in Eis aufbewahrt werden.
Beispiel Nr. 5: Zubereitung von Plasmamembranen aus rohem Homogenisat
Das rohe Homogenisat wurde während 30 min bei 4°C und 25 000 g zentrifugiert, um eine membran-angereicherte Mikrosomenfraktion zuzubereiten. Das Überstehende wurde verworfen und die Pellets wurden erneut in 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) aufgeschlämmt, und zwar in einem Verhältnis von etwa 1 ml je Pellet aus 5 × 10⁸ Zellen. Die wieder aufgeschlämmten Membranen wurden dann auf das Zweiphasensystem mit einem Polymergemisch aufgegeben, das 6,6% Dextran T500 (Pharmacia Biotech), 6,6% Polyethylenglykol 3350 (Gew./Gew.) (Fisher Scientific) und 0,2 M Kaliumphosphat (pH 7,2) enthielt. Die Rohre wurden in der Kälte (4°C) 40-mal kräftig umgekehrt. Die Phasen wurden durch fünfminütiges Zentrifugieren bei 4°C und 1150 g getrennt. Die obere Phase, die hauptsächlich Plasmamembranen enthielt, wurde mit 1 mM Bicarbonat verdünnt und durch Zentrifugieren während 15 min bei 30 000 g gesammelt.
Beispiel Nr. 6: Herstellung von EPO über gekoppelte zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine
Das Plasmid p64T-EPO, das die cDNA von menschlichem EPO mit seiner authentischen Signalsequenz enthält (J. P. Boissel und Mitautoren, J. Biol. Chem., 268: 15983 -15993 (1993)), wurde durch Cäsiumchloridgradienten-Ultrazentrifugieren gereinigt und als Template für eine gekoppelte zellfreie Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein verwendet. Die zellfreie Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein wurde in Gegenwart der ko- und posttranslationalen Modifizierungsmaschinerie ausgeführt, die neben den Komponenten der zellfreien Proteinsynthese auch die Glykosylierungsmaschinerie enthielt. Das Reaktionsgemisch enthielt etwa 53% (Vol./Vol.) nuclease-behandeltes RRL, die Endkonzentrationen der anderen Schlüsselbestandteile waren: 17 mM Kreatinphosphat, 48 μg/ml Kreatinphosphokinase, 40 μM von jeder Aminosäure, 260 Einheiten/ml SP6 RNA-Polymerase, 75 μg/ml zirkuläre Plasmid-DNA, 1,8 mM ATP, 1,3 mM GTP, je 1 mM UTP und CTP, 50 mM Kaliumacetat, 3,6 mM Magnesiumacetat, 0,4 mM Spermidin, 5 mM HEPES/KOH (pH 7,3), 1600 Einheiten/ml Ribonuclease-Inhibitor, 2,7 mM DTT, 9,5 μM Hämin und 57 μg/ml Kalbsleber-Gesamt-tRNA-Mischung. Das Reaktionsgemisch wurde während 60 min bei 30°C inkubiert.
1 zeigt Autoradiogramme von EPO, das mit dem in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren vollständig posttranslational modifiziert wurde, und von nicht modifiziertem EPO, die mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt wurden. Bahn 1 zeigt EPO, das durch zellfreie Proteinsynthese ohne ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie erzeugt wurde, Bahn 2 zeigt EPO, das durch zellfreie Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein erzeugt wurde. In Bahn 2 bedeutet das erhöhte Molekulargewicht des EPO-Moleküls, dass EPO glykosyliert worden ist.
2 zeigt das Ergebnis des Western-Blottings von EPO, das mit einem herkömmlichen Zellkulturverfahren erzeugt wurde, und von EPO, das mit einer zellfreien Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein der vorliegenden Erfindung erzeugt wurde. Bahn 1 zeigt EPO, das mit einem herkömmlichen Zellkulturverfahren erzeugt wurde, Bahn 2 zeigt EPO, das mit einer zellfreien Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein erzeugt wurde. Wie Bahn 2 zeigt, hat das mit der vorliegenden Erfindung erzeugte EPO das gleiche Molekulargewicht wie EPO, das durch das herkömmliche Zellkulturverfahren erzeugt wurde, und weist die charakteristische Aktivität gegenüber EPO-spezifischen Antikörpern auf.
3 zeigt ein Autoradiogramm von mit Glykosidase behandeltem EPO. Glykosidase spaltet selektiv die Kohlenhydratkette vom Protein ab. Bahn 1 zeigt nicht glykosyliertes EPO, Bahnen 2 und 3 zeigen glykosyliertes EPO, Bahnen 4 und 5 zeigen mit Glykosidase F behandeltes EPO, und Bahn 6 zeigt mit Glykosidase II behandeltes EPO. Es wird berichtet, dass biologisch aktives EPO ein Oligosaccharid des komplexen Typs besitzt. Dieses Oligosaccharid des komplexen Typs wird bekanntermassen durch Glykosidase F, aber nicht durch Glykosidase H abgespalten. Wie 3 zeigt, ist das durch zellfreie Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein erzeugte EPO gegenüber Glykosidase H resistent, aber wird durch Glykosidase F gespalten und enthält daher die korrekte und vollständige, komplexe Oligosaccharidstruktur.
Wie die Ergebnisse in 2 und 3 zeigen, kann gefolgert werden, dass das mit der zellfreien Synthese von vollständig posttranslational modifizierter Protein der vorliegenden Erfindung erzeugte EPO die gleiche Struktur wie das durch herkömmliche Zellkulturverfahren erzeugte EPO enthält.
Zur Solubilisierung der Membranen wurde das Reaktionsgemisch mit 0,5% Triton X-100 behandelt. Dann wurde das synthetisierte EPO unter Verwendung der allgemeinen Prozedur mit monoklonalen Antikörpern zu EPO immungereinigt.
Nach Dialyse in Refolding-Lösung (50 mM Natriumdihydrogenphosphat, 2% Natriumlaurylsarcosylat (Vol./Vol.), 40 μM Kupfer(II)sulfat) wurde das EPO lyophilisiert. Das gereinigte EPO wurde einer biologischen Aktivitätsprüfung unterworfen, die wie folgt beschrieben wird.
Die biologischen Aktivitäten des gereinigten EPO in vitro und in vivo wurden über das Wachstum der EPO-abhängigen menschlichen Zelllinie TF-1, die in RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert wurde (T. Kitamura und Mitautoren, Blood, 73: 375 – 380 (1989)), bzw. über den Einbau von ⁵⁹Fe in Erythroblastenzellen von exhypoxämischen polyzythämischen Mäusen (E. Goldwasser und M. Gross, Methods in Enzymol., 37: 109 – 121 (1975)) geprüft. Die Werte wurden mit einem Parallel-Line-Assay (C. D. R. Dunn und J. A. P. Napier, Exp. Hematol. (N.Y.), 6: 577 – 584 (1978)) unter Verwendung von neun Dosierungen je Muster und zwei Löchern je Dosierung in der In-vitro-Prüfung und von mehr als drei Dosierungen je Muster und drei Mäusen je Dosierung in der In-vivo-Prüfung bestimmt. Zusatzstoffe in den EPO-Zubereitungen wie Salze störten die Prüfung nicht, wenn sie in einer 1 : 500-Verdünnung mit dem Medium verwendet wurden. Das hochgereinigte rekombinante humane EPO (rHuEPO), das durch die zweite Internationale Referenzpräparation geeicht worden war, wurde als Standard verwendet. Wie vorhergesagt, zeigen die Ergebnisse, dass das gereinigte EPO ähnliche In-vitro- und In-vivo-Aktivitäten wie das intakte rHuEPO aufwies.
Beispiel Nr. 7: Erzeugung von EPO über ungekoppelte zellfreie Synthese vollständig posttranslational modifizierter Proteine
Das Plasmid p64T-EPO, das die cDNA von menschlichem EPO mit seiner authentischen Signalsequenz enthält, wurde durch Cäsiumchloridgradienten-Ultrazentrifugieren gereinigt und als Template für eine In-vitro-Transkription verwendet. Die In-vitro-Transkription wurde mit der Kappenstruktur ⁷mG(5')ppp(5')G oder ohne sie ausgeführt. Die optimierten Endkonzentrationen der Bestandteile für eine In-vitro-Transkription ohne Kappenstruktur waren: 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, je 1 mM NTP und Ribonuclease-Inhibitor (1000 Einheiten pro ml), 2 mM Spermidin, 1000 Einheiten pro ml SP6 RNA-Polymerase, 10 mM Natriumchlorid und 0,1 mg/ml zirkuläres Plasmid. Die optimierten Endkonzentrationen der Bestandteile für die In-vitro-Transkription mit Kappenstruktur waren: 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, je 1 mM ATP, CTP und UTP, 0,5 mM GTP, 1000 Einheiten pro ml Ribonuclease-Inhibitor, 2 mM Spermidin, 1000 Einheiten pro ml SP6 RNA-Polymerase, 10 mM Natriumchlorid, 0,5 mM Kappenanalog und 0,1 mg/ml zirkuläres Plasmid. Um eine Ausfällung von DNA mit Spermidin zu vermeiden, wurde das Reaktionsgemisch vor der Zugabe von DNA auf 37°C vorgewärmt. Die Transkriptionsreaktion wurde während 4 h bei 37°C ausgeführt. Zur Isolierung der synthetisierten RNA wurde das Reaktionsgemisch mit Phenol/Chloroform und dann mit Chloroform allein extrahiert. Die RNA wurde selektiv durch Zugabe eines gleichen Volumens von 5 M LiCl und einstündigem Inkubieren in Eis ausgefällt. Dann wurde das Gemisch während 15 min bei 4°C und 5000 g zentrifugiert. Das anfallende Pellet wurde mit 75% Ethanol (Vol./Vol.) gewaschen und in RNase-freiem Wasser erneut aufgelöst. Die ungekoppelte zellfreie Proteinsynthese in Gegenwart der ko- und posttranslationalen Modifizierungsmaschinerie einschliesslich der Glykosylierungsmaschinerie wurde ausgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt etwa 53% nuclease-behandeltes RRL (Vol./Vol.), während die Endkonzentrationen der anderen Schlüsselbestandteile wie folgt waren: 17 mM Kreatinphosphat, 48 μg/ml Kreatinphosphokinase, 40 μM von jeder Aminosäure, 30 μg/ml RNA, 0,8 mM ATP, 0,3 mM GTP, 50 mM Kaliumacetat, 0,5 mM Magnesiumacetat, 0,4 mM Spermidin, 4 mM HEPES/KOH (pH 7,3), 1600 Einheiten pro ml Ribonuclease-Inhibitor, 2,7 mM DTT, 9,5 μM Hämin und 57 μg/ml Kalbsleber-Gesamt-tRNA-Mischung. Das Reaktionsgemisch wurde während 60 min bei 30°C inkubiert.
Das mit diesem Verfahren erzeugte EPO ist 4 zufolge das gleiche wie das in Beispiel Nr. 6 erzeugte EPO. In 4 zeigt Bahn 1 das EPO, das durch zellfreie Proteinsynthese ohne ko- und posttranslationale Modifizierungsmaschinerie erzeugt wurde, Bahn 2 zeigt das EPO, das mit einer ungekoppelten zellfreien Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein erzeugt wurde, und Bahn 3 zeigt EPO, das mit einer gekoppelten zellfreien Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein erzeugt wurde.
Zur Solubilisierung der Membranen wurde das Reaktionsgemisch mit 0,5% Triton X-100 behandelt. Dann wurde das synthetisierte EPO unter Verwendung der allgemeinen Prozedur mit monoklonalen Antikörpern zu EPO immungereinigt. Nach Dialyse in Refolding-Lösung (50 mM Natriumdihydrogenphosphat, 2% Natriumlaurylsarcosylat (Vol./Vol.) und 40 μM Kupfer(II)sulfat) wurde das EPO lyophilisiert. Das gereinigte EPO wurde wie in Beispiel Nr. 6 beschrieben einer biologischen Aktivitätsprüfung unterworfen. Im Ergebnis zeigte das gereinigte EPO ähnliche In-vitro- und In-vivo-Aktivitäten wie das intakte rHuEPO.
Beispiel Nr. 8: Erzeugung von EPO über eine Kombination von zellfreier Synthese von vollständig posttranslational modifiziertem Protein und enzymatischer In-vitro-Glykosylierung
Das entweder mit dem gekoppelten oder mit dem ungekoppelten Synthesesystem für vollständig posttranslational modifizierte Proteine wie in Beispielen Nr. 6 und Nr. 7 erzeugte EPO kann durch Enzyme wie Glykosyltransferase, Glykosidase und Transglykosidase weiter modifiziert werden.
Nach der zellfreien Synthese des vollständig posttranslational modifizierten Proteins wurde das Reaktionsgemisch mit 0,5% Triton X-100 behandelt, um die Membranen zu solubilisieren. Dann wurde das Reaktionsgemisch oder das affinitäts-gereinigte EPO mit anderen modifizierenden Enzymen behandelt. Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von Transsialidase. Eine rohe Zubereitung von Transsialidase wurde wie früher beschrieben gewonnen (R. Cavallesco und M. E. A. Pereira, J. Immunol., 140: 617 – 625 (1988); R. P. Prioli und Mitautoren, J. Immunol., 144: 4384 – 4391 (1990)).
Fünf μl Transsialidaselösung (0,5 μg/ml) wurden zu 15 μl des zellfreien Synthesereaktionsgemischs für vollständig posttranslational modifiziertes Protein hinzugegeben, das 0,25 μMol 2,3-Sialyllactose oder p-Nitrophenyl-α-N-acetylneuraminsäure enthielt. Im Falle von affinitätsgereinigtem EPO wurden 10 μl Transsialidaselösung (0,5 μg/ml) zu 40 μl 50 mM Kakodylat-HCl-Puffer (pH 6,9) hinzugefügt, der 0,25 μMol 2,3-Sialyllactose oder p-Nitrophenyl-α-N-acetylneuraminsäure enthielt. Nach einer Inkubation während 18 Stunden bei 30°C wurde das sialylierte EPO durch Affinitätschromatographie gereinigt, wie in der in Beispiel Nr. 6 vorerwähnten Prozedur, und einer Methylierungsanalyse unterworfen. Das sialylierte Produkt wurde ins entsprechende permethylierte Monosaccharid-Alditolacetat umgewandelt, wie früher beschrieben (P. Scudder und Mitautoren, Eur. J. Biochem., 168: 585 – 593 (1987)). Die derivatisierten Muster wurden auf einem Kapillar-Gaschromatographen 5890A von Hewlett-Packard analysiert, der mit einer 0,25 mm × 30 m-Kapillarsäule DBS aus geschmolzenem Quarz (J & W Scientific) ausgestattet war. Nach einer fünfminütigen Wartezeit wurde mit einer Geschwindigkeit von 2°C/min von 150 auf 230°C hochgefahren. Das mit Transsialidase behandelte EPO wies eine 10-%ige Er höhung seines Sialinsäuregehalts und eine 15-%ige Erhöhung seiner biologischen Aktivität auf. Im Durchschnitt stieg die Sialinsäure von 11,9 Mol auf 13 Mol pro Mol EPO.
Es sollte aus dem oben Gesagten offensichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung ein leistungsfähiges und einheitliches Synthesesystem für vollständig posttranslational modifizierte Proteine zur Verfügung stellt.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines das korrekte und vollständige, komplexe Oligosaccharid enthaltenden Glykoproteins über eine gekoppelte zellfreie Proteinsynthese, umfassend: – Hinzufügen eines DNA-Templates zu einem Zellextrakt, – Hinzufügen der Komponenten zellfreier Synthese zum Extrakt, – Hinzufügen co- und post-translationaler Modifizierungsmaschinen zum Extrakt, darunter endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat und Plasmamembran, um die Erzeugung des das korrekte und vollständige, komplexe Oligosaccharid enthaltenden Glykoproteins zu stimulieren, und – Inkubieren des Reaktionsgemischs, oder über entkoppelte zellfreie Proteinsynthese, umfassend: – Hinzufügen eines RNA-Templates zum Zellextrakt, – Hinzufügen post-translationaler Modifizierungsmaschinen zum Extrakt, darunter endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat und Plasmamembran, um die Erzeugung des das korrekte und vollständige, komplexe Oligosaccharid enthaltenden Glykoproteins zu stimulieren, und – Inkubieren des Reaktionsgemischs.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ursprung der Zellen für die Herstellung des Extrakts für das zellfreie Proteinsynthesesystem der gleiche wie oder ein anderer als der der Zellen für die co- und post-translationalen Modifizierungsmaschinen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die co- und posttranslationalen Modifizierungsmaschinen aus Geweben und/oder kultivierten Zelllinien extrahiert werden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die co- und posttranslationalen Modifizierungsmaschinen aus gentechnisch kultivierten Zelllinien herge stellt werden, um das Expressionsniveau von Glykosylierungsenzymen zu erhöhen und/oder die Gesamtbestände an Zuckernucleotiden zu bereichern.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein EPO ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das erzeugte Protein durch eine Kohlenhydrat-Additionsreaktion und/oder eine Kohlenhydrat-Eliminierungsreaktion und/oder eine Kohlenhydrat-Substitutionsreaktion mit Enzymen, die aus der aus Glykosyltransferase, Glykosidase und Transglykosidase bestehenden Gruppe ausgewählt werden, weiter modifiziert wird.
Zellfreies Proteinsynthesesystem zur Herstellung eines das korrekte und vollständige, komplexe Oligosaccharid enthaltenden Glykoproteins, einen Zellextrakt und co- und post-translationale Modifizierungsmaschinen mit endoplasmatischem Retikulum, Golgi-Apparat und Plasmamembran umfassend.
Zellfreies Proteinsynthesesystem nach Anspruch 7, weiter die Komponenten zellfreier Synthese enthaltend.
Zellfreies Proteinsynthesesystem nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die co- und post-translationalen Modifizierungsmaschinen aus Geweben und/oder kultivierten Zelllinien extrahiert werden.
Zellfreies Proteinsynthesesystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykosylierungsmaschinen aus gentechnisch kultivierten Zelllinien hergestellt werden, um das Expressionsniveau von Glykosylierungsenzymen zu erhöhen und/oder die Gesamtbestände an Zuckernucleotiden zu bereichern.