DE60105288T2

DE60105288T2 - Verfahren zur vobereitung einer probe zur analyse ausgehend von einer probe mit sehr grossem volumen

Info

Publication number: DE60105288T2
Application number: DE60105288T
Authority: DE
Inventors: Emmanuelle Guillot; Laurence Durand-Bourlier; Stephane Bulteau
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA; Vigie Groupe SAS
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: US20030186428A1; WO2001094527A2; US7179636B2; FR2809969A1; DE60105288D1; AU6761901A; BR0111547A; AU2001267619B2; CN1303201C; ATE275189T1; CN1440453A; FR2809969B1; EP1287112A2; ES2227224T3; HK1054568A1; CA2411816C; JP2003536057A; CA2411816A1; JP4792590B2; HK1054568B

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Analyse von in flüssigen Medien vorhandenen Kontaminanten, die die Behandlung von Proben mit erheblichem Volumen erfordert, welche in verdünntem Zustand eine Vielzahl von Mikroorganismen verschiedener Größen (Viren, Bakterien, Parasiten), sowie verschiedene organische oder anorganische Makromoleküle aufweisen, um eine flüssige Endprobe mit kleinem Volumen zu erhalten, die in konzentriertem Zustand die gleiche relative Zusammensetzung an Kontaminanten aufweist.
Diese Anreicherung von Kontaminanten, insbesondere von Mikroorganismen, und das Erfordernis von kleinen zu analysierenden Volumina, sind wegen der Verwendung von biochemischen oder biologischen Analysetechniken notwendig, insbesondere Immunassays und Techniken der Molekularbiologie, beispielsweise über Multidetektion.
Es sind Mittel zur Abtrennung und Konzentrierung von Mikroorganismen, insbesondere von Viren, bekannt, beispielsweise durch Absorption. Neben der Tatsache, dass diese Mittel die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen nicht gewährleisten, ermöglichen sie es nicht Proben mit einem Volumen zu erhalten, das mit den vorstehend erwähnten Analysetechniken kompatibel ist.
Andere zur Rückgewinnung von Mikroorganismen in flüssigen Medien eingesetzte Mittel verwenden Filtrationsverfahren und analysieren nur einen Typ von Mikroorganismus, ermöglichen es jedoch nicht immer, quantitative Ergebnisse zu erzielen.
Für Bakterien und Parasiten wird man beispielsweise feststellen, dass gemäß der Empfehlungen normierter Verfahren ebene Membranen mit Poren von einer Größe, die in Abhängigkeit der Spezies bei 0,2 bis 1 μm liegen, verwendet werden.
Insbesondere ist die FR-B-2693474 bekannt, eine auf tangentialer Ultrafiltration basierende Technik, die auf klassische Art und Weise eine oder mehrere Membranen einsetzt und die Trennung von Mikroorganismen von verschiedenen Größen ermöglicht und die Lebensfähigkeit dieser Mikroorganismen gewährleistet.
Das Erfordernis hinsichtlich des Volumens der flüssigen Endprobe ermöglicht jedoch nicht deren Verwendung, um Proben zur Analyse mittels biochemischer oder biologischer Analysetechniken herzustellen.
Aus der GB 2339155 ist die Verwendung eines Filtrationsmittels bekannt, in dem parallel zueinander eine Mehrzahl von Fasern angeordnet sind, wobei dieses Mittel im internen Weg ohne einen zusätzlichen Rückspülschritt verwendet wird und lediglich eine sehr niedrige Ausbeute in der Größenordnung von 28 % im Vergleich zur Verwendung eines Mittels ermöglicht, in dem die Fasern U-förmig angeordnet sind, wobei dieses Mittel in seinem externen Weg verwendet wird, diese Verwendung es jedoch nicht ermöglicht, die erwarteten Ergebnisse zu erzielen.
Von Otaki et col. (Wat. Sci. Tech. 37, 10, 107–116, 1998) ist ferner die kontinuierliche Verwendung einer Ultrafiltrationsvorrichtung auf Hohlfasern mit der Analyse von Proben, die regelmäßig über Probennahmen aus der Einspeisung, dem Filtrat bzw. dem Konzentrat erfolgen, bekannt, um die Leistungen von Mikrofiltratinosmembranen zu validieren.
Die Verwendung von Filtrations- und Ultrafiltrationsmitteln im Tangentialmodus impliziert das Vorhandensein eines Kreislaufes, der die Rezirkulation des gesamten oder Teilen des Konzentrates ermöglicht, um eine Tangentialgeschwindigkeit an der Membran aufrecht zu erhalten, die die Filtration der in Suspension befindlichen Partikeln ermöglicht und das rasche Verschließen der verwendeten Membranen vermeidet ("Microfiltration and Ultrafiltration – Principles and Applications", Leos J. Zeman, Andrew L. Zydney, Marcel Dekker, Inc. New York – Basel – Hongkong 1996).
Die Rezirkulation der Flüssigkeiten, die filtriert werden, erfordert verlängerte Filtrationszeiten und vor allem zusätzliche Volumina, in denen ein Teil des Konzentrates oder der Mikroorganismen nicht ohne Auswirkung auf die Endvolumina rückgewonnen werden kann.
Die erheblichen Volumina des Konzentrates, die auf das Volumina der Rohrleitungen und gleichermaßen auf das Elutionsvolumen zurück zu führen sind, das notwendig ist, um die Mikroorganismen zu extrahieren, die auf den Wänden verblieben sein können, sowie die Verlängerung der Filtrationszeiten, machen diese Techniken mit den Analysemitteln inkompatibel, die kleine zu analysierende Volumina erfordern, und die es ermöglichen, rasch Ergebnisse zu liefern, beispielsweise um Fragen der Kontaminationen von Trinkwasser oder anderer Flüssigkeiten zu beantworten, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Filtrationsmittels, das es innerhalb einer begrenzten Zeit ausgehend von einer flüssigen Probe mit erheblichem und bestimmtem Volumen ermöglicht, eine zu analysierende Probe von ausreichend kleinem Volumen für biochemische oder biologische Analysetechniken zu erhalten, insbesondere Immunassays und Techniken der Molekularbiologie, beispielsweise über Multidetektion, die anschließend durchgeführt werden können, wobei die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen gewährleistet wird.
Das gemäß der Erfindung verwendete Filtrationsmittel basiert auf der Ultrafiltrationstechnik auf Hohlfasern in frontalem Modus.
Unter frontalem Modus wird im Gegensatz zu tangentialem Modus ein jegliches Hindurchtreten der flüssigen Ausgangsprobe innerhalb des Filtrationsmittels in einem Arbeitsgang verstanden, ohne eine Rückführung von wenigstens einem Teil derselben Probe zum Einlass des Filtrationsmittels.
Die Verwendung dieses Ultrafiltrationsmittels im frontalen Modus ermöglicht es, Konzentrate von kleinem Volumen zu erhalten, eine Probe im Zeitmaßstab in der Größenordnung von einer Stunde und höchstens einem einzigen Durchlauf zu konzentrieren, wobei die Lebensfähigkeit der Mikroorganismen vollständig gewährleistet wird, die Multirückgewinnung und die Ausbeuten in der Größenordnung von 100 % liegen.
Unter Multirückgewinnung wird die Möglichkeit verstanden, in der Endprobe praktisch sämtliche verschiedene Gattungen oder Spezies von Mikroorganismen zurück zu gewinnen, die in der Ausgangsprobe vorhanden sind.
Diese hohen Wirkungsgrade werden aufgrund des Fehlens von Volumina, sogenannten Todvolumina, die in anderen Vorrichtungen beispielsweise auf Grund des Vorhandenseins von anhängenden Rohrleitungen, beispielsweise zum Rückführen, existieren, und durch die Zuverlässigkeit der Porosität über die gesamte Länge der Hohlfaser, erreicht.
Die Eigenschaften des verwendeten Filtrationsmittels ergeben sich aus der Beschreibung, in der auf die beigefügte Zeichnung Bezug genommen wird, in der die 1 auf schematische Art und Weise und im Längsschnitt ein erfindungsgemäßes Filtrationsmittel, und die 2 eine Querschnittsansicht des gleichen Filtrationsmittels in vergrößertem Maßstab darstellt. Die Größe der Fasern ist zum Verständnis der Erfindung bewusst vergrößert worden.
Das Filtriermittel weist ein Gehäuse (2) auf, in dem parallel zueinander eine Mehrzahl von Hohlfasern (3) angeordnet ist, deren jeweilige poröse Wand (3a) ein Lumen (4) derart festlegt, dass das Mittel einen internen Weg (A), der aus der Mehrzahl von Lumina (4) parallel zu den jeweiligen Hohlfasern besteht, und einen externen Weg (B) aufweist, der dem zwischen den Fasern und dem Gehäuse verfügbaren Volumen entspricht.
Gemäß der Erfindung wird dieses Mittel zur Behandlung einer flüssigen Ausgangsprobe von erheblichem Volumen verwendet, die in verdünntem Zustand eine Mehrzahl von Mikroorganismen unterschiedlicher Größen aufweist, um eine flüssige Endprobe von kleinem Volumen zu erhalten, die in konzentriertem Zustand die gleiche Zusammensetzung an Mikroorganismen aufweist.
Bei der Verwendung dieses Mittels wird zumindest ein Konzentrierungsschritt durchgeführt, während dem:

a) ein einziges Filtrationsmittel bereitgestellt wird,
b) dieses Filtrationsmittel im frontalen Modus verwendet wird,
c) die Ausschlussgrenze der porösen Wand (3a) der Fasern derart festgelegt ist, dass der kleinste Mikroorganismus der Ausgangsprobe zurückgehalten wird, und auf diskontinuierliche Weise:
d) während einer Filtrationsphase, die Gesamtheit der flüssigen Ausgangsprobe durch einen der Wege (A, B) des Filtrationsmittels eingebracht wird, ein Filtrat über den anderen (B, A) der Wege des Filtrationsmittels entnommen wird, und ein Konzentrat in dem Weg, durch den die flüssige Probe eingebracht wird, akkumuliert wird, und
e) während einer Rückgewinnungsphase, nachdem die gesamte Probe zirkuliert ist, die Zirkulation der flüssigen Ausgangsprobe von dem einen Weg zu dem anderen Weg in dem Filtrationsmittel (1) gestoppt wird und eine flüssige Endprobe ausgehend von dem Konzentrat erhalten wird.

Die flüssige Endprobe, die durch das Konzentrat gebildet wird, kann entweder mittels einfacher Schwerkraft rückgewonnen werden, oder durch Verwendung eines verdichteten Gases, oder durch physikalisches Schütteln des Filtrationsmittels, aber auch durch Elution mit jeder geeigneten Substanz, bei Mikroorganismen beispielsweise mit einer Salinelösung vom Typ PBS (Bsp.: 120 mmol NaCl, 2,7 mmol KCl, 10 mmol NaH₂PO₄), die gegebenenfalls ein Detergenz vom Typ TWEEN 20 und/oder eine oberflächenaktive Substanz vom Typ BSA ("bovines Serumalbumin") enthält.
Nach einer weiteren Ausführungsform wird die flüssige Endprobe, die durch das Konzentrat gebildet wird, einem zweiten Konzentrierungsschritt unterzogen und bildet dann in dieser zweiten Konzentrierungsphase die flüssige Ausgangsprobe.
Die Wände der Hohlfasern (3a) können aus jeglichem Material gebildet sein, das die Herstellung von Hohlfasern mit definierter Porosität ermöglicht, wie organischen Membranen, beispielsweise aus Celluloseacetat, Ethylcellulose, Polyethersulfon, oder Polyacrylonitril, oder anorganischen Membranen, beispielsweise Keramik.
Die Ausschlussgrenze der porösen Wand (3a) der Fasern wird derart festgelegt, dass der kleinste Mikroorganismus der Ausgangsprobe zurückgehalten wird. Für den Bereich der Ultrafiltration werden also Fasern verwendet, die eine Porosität von 10 bis 100 nm haben, damit das Konzentrat sämtliche Mikroorganismen enthält, die eine Größe haben, die größer ist als jene von Viren, die aber mit erfasst werden, wenn es die Größe der gesuchten Partikel erfordert, insbesondere für Partikel unter 10 10 nm können für den Bereich der Nanofiltration Fasern mit einer Porosität von 1 bis 10 nm verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform ist der Weg zum Einbringen der Ausgangsprobe der interne Weg (A) und der Weg zur Extraktion der Endprobe ist der externe Weg (B), so dass sich die Mikroorganismen im Innern der Fasern akkumulieren, um das Konzentrat auszubilden, während das Filtrat außerhalb der Fasern in das zwischen den Fasern und dem Gehäuse (B) verfügbare Volumen übertritt.
Die zu behandelnde Probe bestehend aus einer Wasserprobe mit einem Volumen, das beispielsweise bei 10 bis 100 Litern liegt, wird über ein Ventil (C) in das Innere der Hohlfasern des Moduls eingebracht, was beispielsweise durch Aspiration mittels einer peristaltischen Pumpe oder jedes anderen Mittels bewirkt wird, wie einem Unterdruck, der auf der Seite des Filtrates durch das Ventil (E) errichtet wird, wobei die Ventile (D) und (F) geschlossen bleiben.
Wenn das gesamte zu behandelnde Volumen durch das Modul hindurch getreten ist, wird die Pumpe angehalten, das Ventil (C) geschlossen und von der Probenquelle getrennt.
Anschließend wird das Gehäuse geleert, um das Filtrat beispielsweise durch das Ventil (F) abzuziehen, indem das Modul atmosphärischem Druck ausgesetzt wird, beispielsweise indem das Ventil (E) geöffnet wird, anschließend indem dieses unter Druck gesetzt wird, beispielsweise unter 0,5 bar Druckluft, wobei das Ventil (E) dann wieder geschlossen wird.
Das Konzentrat wird anschließend über das Ventil (D) gesammelt, indem das Ventil (C) geöffnet wird, zunächst durch Schwerkraft und anschließend durch Schließen des Ventils (C) und der Injektion von Druckluft in das Innere der Fasern.
Gemäß einer weiteren Verwendungsform ist der Weg zum Einbringen der Ausgangsprobe der externe Weg (B) und der Weg zur Extraktion der Endprobe ist der interne Weg (A), so dass sich die Mikroorganismen außerhalb der Fasern in dem Volumen akkumulieren, das zwischen den Fasern und dem Gehäuse verfügbar ist, um das Konzentrat auszubilden und das Filtrat im Inneren der Fasern hindurchtritt, so dass dieses abgezogen werden kann.
Die zu behandelnde Probe bestehend aus einer Wasserprobe mit einem Volumen, das bei beispielsweise 10 bis 100 Litern liegt, wird über das Ventil (E) in das Innere des Gehäuses eingebracht, was beispielsweise durch Unterdruck bewirkt wird, welcher durch Aspiration beispielsweise mittels einer peristaltischen Pumpe oder jedes anderen Mittels errichtet werden kann, wobei der Unterdruck, der auf der Seite des Filtrates im Inneren der Hohlfasern beispielsweise über das Ventil (D) erzeugt wird und das Ventil (C) geschlossen bleibt.
Wenn das gesamte zu behandelnde Volumen durch das Modul hindurchgetreten ist, bleibt die Pumpe in Funktion, das Ventil (E) wird von der Probenquelle getrennt, um das Volumen des Konzentrates zu reduzieren, das in dem Gehäuse des Moduls enthalten ist; diese Reduzierung kann vollständig oder partiell sein.
Wenn das Konzentrierungsniveau des gewünschten Konzentrates erreicht ist, wird die Pumpe angehalten und das Ventil (D) sowie sämtliche anderen Ventile werden geschlossen.
Gegebenenfalls wird eine Elutionslösung in das Gehäuse eingebracht, danach wird das Modul geschüttelt und das Konzentrat oder das Eluat wird über das Ventil (F) gesammelt, was gegebenenfalls durch die Injektion von Druckluft über das Ventil (E) zum Abschluß gebracht wird.
Um Absorptionsphänomene zu begrenzen, können die Fasern zuvor beispielsweise mit einem Detergenz vom Typ TWEEN und/oder einem oberflächenaktiven Mittel vom Typ BSA ("bovines Serumalbumin") behandelt werden.
Gemäß einer Ausführungsform erfolgt die Filtrationsphase (C) ohne eine Vorfiltration der flüssigen Ausgangsprobe, wenn dies der Gehalt an in Suspension befindlichem Material der zu analysierenden Flüssigkeiten erlaubt.
Für den Modus, bei dem das Einbringen über den internen Weg (A) erfolgt, steht das Volumen des erhaltenen Konzentrates in direktem Zusammenhang mit den Abmessungen des Filtrationsmittels; für den Modus, bei dem das Einbringen über den externen Weg (B) erfolgt, hängt das Volumen des Konzentrates nicht von den Abmessungen des Filtrationsmittels ab, wohl aber von dem Volumen, das in dem Gehäuse belassen wurde, und/oder von dem Volumen des Elutionsmittels, das in dieses Gehäuse eingebracht wird.
Das Filtrationsmittel wird so dimensioniert, dass das Verhältnis zwischen dem Volumen der Ausgangsprobe und dem Volumen des erhaltenen Konzentrates bei Filtrationszeiten, die bei 20 Minuten bis einer Stunde liegen, zumindest 50 beträgt und vorzugsweise bei 150 bis 500 liegt.
Wenn die Anwendung dies erlaubt, kann das Modul wiederverwendet werden, nachdem es einer Rückspülung unterzogen wurde oder einer Behandlung mit einem Dekontaminationsmittel, beispielsweise mit einer 50 ppm Chlorlösung, gegebenenfalls verbunden mit einer enzymatischen Behandlung.
Es können zwei Rückwaschungsmodi verwendet werden, je nachdem, ob der Weg zum Einbringen der Probe der interne Weg (A) oder der externe Weg (B) ist, wobei das Spülwasser in Gegenrichtung zu der Richtung eingebracht wird, in der die zu analysierenden Probe eingebracht wird.
Wenn der Weg zum Einbringen der Probe der interne Weg (A) über das Ventil (C) ist, erfolgt das Rückspülen durch das Einbringen von Wasser aus dem Netz über das Ventil (F) durch ein Fördermittel, wie eine peristaltische Pumpe, die zwischen der Wasserquelle und dem Ventil angeordnet ist, wobei das Ventil (D) geschlossen bleibt und das Ventil (E) in diesem Moment geöffnet ist.
Wenn das Gehäuse gefüllt wird, wird das Ventil (E) geschlossen und das Wasser ist gezwungen, durch das Innere der Fasern hindurchzutreten, um durch das Ventil (C) oder (D) auszutreten.
Wenn der Weg zum Einbringen der Probe der externe Weg (B) ist, erfolgt das Rückwaschen durch das Einbringen von Wasser aus dem Netz über das Ventil (D), wobei dann die Ventile (E) und (F) geschlossen sind.
Wenn die Fasern mit Wasser gefüllt werden, d.h. wenn am Auslass über das Ventil (C) kein Vorhandensein von Luftblasen mehr zu beobachten ist, wird dieses geschlossen und das Wasser ist gezwungen, durch das Innere der Fasern in dem Gehäuse hindurchzutreten, um über das Ventil (E) oder das Ventil (F) auszutreten.
Es kann gegebenenfalls die einmalige Verwendung des Moduls, sowie die Anfangssterilität des Moduls durch Sterilisation über die Behandlung mit beispielsweise Gammastrahlen vorgesehen werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein dichtungsloses Modul verwendet, so dass jedes Risiko von externer Kontamination (Flüssigkeit außerhalb des Moduls, sowie Umgebungsluft) vermieden wird; dies vermeidet außerdem das Hindurchtreten von Kontaminanten des Konzentrates durch die Dichtungen in Richtung des Filtrates. Die Dichtigkeit wird geschaffen, indem die zwei jeweiligen Enden der Hohlfasern in ein Harz getränkt werden, wie in 1 dargestellt, so dass jegliche Leckage von Kontaminanten vermieden wird, was bei Systemen, die Dichtungen aufweisen, nicht der Fall ist.
In einer anderen Ausführungsform wird, um ein Konzentratvolumen zu erhalten, das mit den angewandten Analyseverfahren kompatibel ist, das erhaltene Konzentrat einem zweiten Konzentrierungsschritt unterzogen.
In diesem zweiten Konzentrierungsschritt kann das verwendeten Filtrationsmittel die gleiche Ausgestaltung haben wie jenes, das in dem ersten Schritt verwendet wurde, das jedoch von kleinerem Volumen ist, das in Abhängigkeit des Verhältnisses zwischen dem Ausgangsvolumen und dem Volumen des gewünschten Konzentrates berechnet wird.
Die behandelten Volumina haben die Größenordnung von 100 ml, wobei bekannte Mittel, wie Filtrationsvorrichtungen, benutzt werden können, die Trenntechniken durch Zentrifugation verwenden, wie die Vorrichtungen, die von der Firma Millipore vertrieben werden, wobei hier Centricon-Plus 80 erwähnt sei.
Diese Filtrationsmittel werden dimensioniert und es werden die Behandlungen für eine bestimmte Zeit durchgeführt, was derart erfolgt, dass das Verhältnis zwischen dem Volumen der Ausgangsprobe und dem Volumen der Endprobe zumindest 5000 beträgt und vorzugsweise bei 15000 bis 10000 liegt.
Die Verwendung des Filtrationsmittels weist gemäß der vorliegenden Erfindung demnach Vorteile auf, welche in der Multirückgewinnung von Mikroorganismen liegen, die in einem großen Volumen der zu analysierenden Flüssigkeit vorhanden sind, und dies mit einer Ausbeute von nahezu 100 % erfolgt, wobei die Gewährleistung der Lebensfähigkeit der so rückgewonnenen Mikroorganismen gegeben ist, ferner die Durchführung dieser Multirückgewinnung in Zeiten der Größenordnung von höchstens einer Stunde erfolgt, was mit den Erfordernissen, beispielsweise einer kontinuierlichen Gesundheitsüberwachung kompatibel ist, und wobei Volumina des zu analysierenden Konzentrates erhalten werden, die die Anwendung von biochemischen oder biologischen Analysetechniken erlauben, insbesondere Immunassays und Techniken der Molekularbiologie.
Mit den nachfolgenden Beispielen wird die erfindungsgemäße Verwendung eines Filtrationsmittels illustriert, ohne dass diese einschränkend wären.
BEISPIEL 1:
Material und Methode:
Verwendung eines Filtrationsmittels, das 1 m² Filtrationsoberfläche aus Hohlfasern aus Celluloseacetat aufweist.
Die aus 50 Litern Wasser aus dem Netz bestehende Probe, die mit dem Bakteriophagen MS2 angeimpft wurde, wird über den internen Weg eingebracht.
Die Rückgewinnung des Konzentrates erfolgt mittels Schwerkraft und unter Druck.
Die Analyse des Konzentrates erfolgt über die Technik der Lyseplaques, bei der sowohl die Lebensfähigkeit und Infektiösität des Bakteriophagen entweder quantitativ (nach Verdünnungen der Probe von 10 in 10) oder qualitativ (nach biologischer Amplifizierung durch Infektion einer für MS2 empfindlichen Bakterienkultur) gemessen wird.
Protokoll:
Vor der Animpfung und der Entnahme des Leitungswassers erfolgt eine Sonifizierung der Inokula in dem Behälter, um die Viruspartikel aufzuschließen.
Nach Zugabe von 20 mg/l Natriumthiosulfat (NTS (Merck 106516)), d.h. von 1 g in 50 1, wird die Probe mit MS2 angeimpft.
Es erfolgt ein Filtrationszyklus, dann wird das Gehäuse geleert, geschlossen und unter Luftdruck gesetzt (0,5 b). Anschließend wird das Konzentrat durch Schwerkraft rückgewonnen. Anschließend wird ebenfalls Druckluft (0,5b) in die Fasern injiziert, um die letzten in den Fasern zurückgebliebenen Milliliter an Konzentrat rückzugewinnen.
Anschließend erfolgt die Zählung mittels der Technik der Lyseplaques mit dem sensitiven Escherichia coli (E.coli)-Stamm Hfr, wobei die Konzentrate zuvor sonifiziert werden. Herstellung der Inokula:
PWS = Pepton in wässriger Saline; PFU = Plaque Forming Unit (infektiöse Viruseinheit); I10^x = Inokulum enthaltend 10^x PFU pro ml.
Filtration:
50 Liter Leitungswasser, das NTS neutralisiert wurde, werden filtriert und, nachdem das Gehäuse entleert wurde, wird ein Konzentrat rückgewonnen, das eine Referenz bildet = Referenz 1 (B1).
Nach dem Rückspülen zum Reinigen der Membran, werden 50 Liter Leitungswasser, das NTS neutralisiert wurde, filtriert, und nach Entleerung des Gehäuses wird ein Konzentrat rückgewonnen, das eine Referenz bildet = Referenz 2 (B2).
Nach dem Rückspülen zum Reinigen der Membran, werden 50 Liter Leitungswasser mit NTS neutralisiert.
Nach 15-minütiger Wartezeit wird 1 Liter entnommen, um das für den Behälter vorgesehene Inokulum zu verdünnen.
Das Animpfen erfolgt mit 1 ml von I10 (10 PFU), verdünnt in 1 Liter.
Nach einem Filtrationszyklus wird das Konzentrat wiedergewonnen (C10).
Es wird rückgespült.
In diesem Beispiel erfolgen die Rückspülungen mit zumindest 20 Litern Wasser.
Dann wird das gleiche Verfahren wiederholt, indem mit 1 ml I10⁴ (10⁴ PFU) angeimpft wird. Eine Entnahme des Filtrates während der Filtration bildet die Probe (F). Am Ende der Filtration wird das Konzentrat rückgewonnen (C10⁴).
Das Animpfen einer Fraktion von 100 ml von B1 mit 1 ml von I10⁴ (10⁴ PFU) ergibt die angeimpfte Kontrollreferenzprobe (IB10⁴).
Analyse:

– Quantitative Filtration von I100, I10, I1, C10⁴, IB10⁴.

Die Aliquote jeder unverdünnten Probe sowie der Inokula werden in Assayröhrchen gegeben und sonifiziert, bevor die Verdünnungen durchgeführt werden.
Die infektiösen Partikel werden über die Technik der Lyseplaques gemäß des nachfolgenden Protokolls gezählt:
2 ml eines unterkühlten (44°C), weichen Topagars (0,9%) werden mit 1 ml Virussuspension und 0,3 ml E.coli-Kultur Hfv in exponentieller Wachstumsphase vermischt. Der gesamte Ansatz wird rasch und vorsichtig gemischt und anschließend auf die gesamte Oberfläche eines festen Nähragars in einer Petrischale gegossen. Nach Inkubation bei 37°C werden am nächsten Tag die Lyseplaques ausgelesen. Erhaltene Ergebnisse:
C10⁴ 10^–1, beispielsweise, bezeichnet die Verdünnung 1/10 des Konzentrates, das ausgehend von der Probe erhalten wurde, die mit 10⁴ PFU angeimpft wurde.
Qualitativer Test:
Detektion des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Phagen auf I10⁷ (Positivkontrolle = T+), F (1 Entnahme von 50 ml), B2 (6 × 50 ml + Rest zum Bedecken der gesamten Probe), C10 (6 × 50 ml + Rest zum Bedecken der gesamten Probe).
Ein Volumen der Probe wird mit einem Volumen doppelt konzentrierter Nährlösung vermischt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wird mit einer E.coli Hfr-Kultur in exponentieller Phase angeimpft. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C (Virusvermehrungsphase), wird eine exponentielle Kultur von E.coli Hfr auf einem Nähragar in einer Petrischale verteilt und trocknen gelassen. Die Tropfen der Virusamplifizierungslösung werden darüber gegeben und es erfolgt eine Inkubation bei 37°C für mindestens sechs Stunden.
Das Vorhandensein von infektiösen Partikeln wird durch das Vorhandensein von mehr oder weniger konfluenten Lyseplaques an der Stelle des Aufbringens des Tropfens angezeigt.
N: negativ; P positiv, na: non applicable
Auswertung der Ergebnisse:
Die Referenz (B2) enthält keine infektiösen Bakteriophagen: Das Modul wird folglich nicht zuerst durch MS2 kontaminiert und die Konzentration von 10 PFU, die anschließend erfolgt wird bestätigt;
Die Entnahme des Filtrates (50 ml), die bei der Konzentration von 10⁴ PFU durchgeführt wird, enthält keinen detektierbaren MS2: Die Membran hält demnach wirksam den Virus mit einem Durchmesser von 25 nm zurück.
In C10 wurden vier infektiöse Einheiten detektiert, die Detektionsschwelle ist demnach kleiner als 10 PFU.
Die tatsächliche Ausbeute (d.h. jene, die sich auf den gemessenen Titer des Inokulums bezieht: C/I) beträgt 60 % für eine Impfung von 10⁴ PFU, und dies mangels eines besonderen Rückgewinnungsverfahrens (weder Schütteln noch Eluieren) und in Anbetracht der Lebensfähigkeit, denn die Messung richtet sich auf die Infektiösität des Bakteriophagen.
Das Verhältnis C/IB ist sehr nahe an der tatsächlichen Ausbeute, wodurch gezeigt wird, dass es keine Interferenz gibt, die auf das Konzentrat zurück zu führen ist.
BEISPIEL 2:
Material und Methode:
Verwendung eines Filtrationsmittels, das 0,6 m² Filtrationsoberfläche aus Hohlfasern aus Celluloseacetat aufweist.
Die Probe besteht aus 50 Litern Wasser aus dem Netz, angeimpft mit Oozysten des Parasiten Cryptosporidium parvum. Diese wird über den externen Weg eingebracht.
Die Rückgewinnung des Konzentrates erfolgt durch Schütteln und das Sammeln durch Schwerkraft und unter Druck.
Die Analyse erfolgt durch die IMS-IFA-Technik: Immuno Magnetic Separation – Immuno Fluorescence Assay (siehe normierte Methode 1622, EPA-EPA-821-R-99-001 der Agentur für Umweltschutz der USA) mit dem Dynabeads-Kit Anti-Cryptosporidium von Dynal, Ref. 730.01 (Erhalt der Integrität der Oozysten).
Protokoll:
Nach der Abgabe des Leitungswassers in den Behälter werden 20 mg/l Natriumthiosulfat (NTS (Merck 106551)), d.h. 1 g in 50 1, hinzugegeben.
Die Probe wird mit Oozysten von C.parvum angeimpft.
Die Filtration erfolgt nach dem Modus des externen Weges.
Nach teilweiser Entleerung des Gehäuses und Schütteln des Moduls, um sämtliche Oozysten, die sich wegen der im Gehäuse gelassenen Flüssigkeit, an der externen Oberfläche der Fasern befinden, rückzugewinnen, wird das Konzentrat durch Schwerkraft und anschließend, indem Druckluft (0,5b) in das Gehäuse injiziert wird, rückgewonnen.
Die Auszählung der Oozystenstammlösung und des Konzentrates erfolgt durch IMS-IFA.
Filtration:
Ablauf:
50 Liter Leitungswasser, das NTS neutralisiert wurde, werden filtriert, und nach der Entleerung wird ein Konzentrat rückgewonnen, das eine Referenz bildet (B); dieser Filtration folgt ein Rückspülen, um die Membran zu reinigen.
Anschließend werden 50 Liter Leitungswasser mit NTS neutralisiert, danach mit einer Verdünnung I10 der Oozystenstammlösung angeimpft (das bedeutet ungefähr 10 Oozysten).
Nach der Filtration wird entleert und ein Konzentrat rückgewonnen (C10).
Dieser Filtration folgt ein Rückspülen mit zumindest 10 Litern Wasser.
Dann wird das gleiche Verfahren wiederholt, indem I100 (ungefähr 100 Oozysten) geimpft werden, wobei das Konzentrat C100 erhalten wird, anschließend wird I1000 (ungefähr 1000 Oozysten) geimpft, um das Konzentrat C1000 zu erhalten;
Analyse:

– Auszählung durch IMS/IFA von I10, I100, I1000, B, C10, C100 und C1000.

Ergebnisse:
Die Ergenisse für C10 und C100, die über dem Wert liegen, der für das Inokulum gemessen wurde, überraschen nicht: Die Probennahme, um die Oozysten mikroskopisch auszuzählen, führt notwendigerweise zu Fluktuationen, was sich feststellen lässt, wenn die Zählungen ein und derselben Probe mehrfach wiederholt werden. Dieses Phänomen wird umso markanter, wenn wenig Oozysten vorliegen.
Somit ist für C10 und C100 festzustellen, dass die Größenordnung nach dem Filtrieren konstant ist.
Für C1000 ist es möglich, von Ausbeute zu reden.
Auswertung der Ergebnisse:
Die Filtrationsmethode über den externen Weg hat eine Empfindlichkeit von 10 Oozysten oder darunter.
Für ein Inokulum von 1000 Oozysten beträgt die erhaltene Ausbeute 70 % ohne Optimierung.
BEISPIEL 3:
Das verwendete Protokoll und die verwendete Methode sind mit Ausnahme der Filtrationsmittel identisch mit jenen, die in Beispiel 1 verwendet werden.
Die Filtration erfolgt, indem ein Filtrationsmittel verwendet wird, das 0,6 m² Filtrationsoberfläche aus Hohlfasern aus Celluloseacetat aufweist.
Die Probe besteht aus 50 Litern Wasser aus dem Netz, das mit dem Bakteriophagen MS2 angeimpft wurde, wobei diese über den internen Weg auf (A) eingebracht wird.
Die Rückgewinnung des Konzentrates erfolgt durch Schwerkraft und unter Druck.
Nur eine Referenz (B₁) wird hergestellt und das Animpfen erfolgt sukzessive mit 1, 10, 100 PFU.
Die Analyse erfolgt durch die Technik der Lyseplaques wie in Beispiel 1.
Es wird ein zweiter Schritt der Filtration des Konzentrates, das aus der vorherigen Filtration stammt, nach dem nachfolgend beschriebene Protokoll durchgeführt.
Das Referenzkonzentrat (B₁) und jedes der Phagenkonzentrate (C₁1, C₁10, C₁100), d.h. ungefähr je 230 ml, werden in drei gleiche Fraktionen (70 bis 80 ml) für eine zweite Konzentrierung in drei kommerziell erhältliche Module Centricon-Plus 80 (Millipore Ref. UFC5LGC08) aufgeteilt.
Die so für jede Impfung erhaltenen drei Konzentrate C₂ (< 1 ml) werden vermischt und in der quantitativen Titration durch Lyseplaques analysiert. So wird ebenfalls für die drei Referenzkonzentrate (B₂) vorgegangen, die aus der Konzentrierung von B₁ stammen.
Ergebnisse:

– Titration des Inokulums: I100 = 144 PFU (Gesamtmittelwert wie in Beispiel 1);
– Titration der nach der zweiten Filtration erhaltenen Konzentrate:

C₂1, beispielsweise, bezeichnet die Mischung aus drei Konzentraten, die am Ende des zweiten Konzentrierungsschrittes der Ausgangsprobe erhalten wurde, die mit 1 PFU angeimpft wurde.
Auswertung der Ergebnisse:
Über die gesamten beiden Konzentrierungsschritte reduziert sich das Probenvolumen von 50 Litern auf weniger als 3 ml, die Empfindlichkeit liegt nahe 1 PFU.
Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die beschriebenen und/oder dargestellten Ausführungsbeispiele beschränkt ist, sondern dass diese sämtliche Varianten davon umfasst, die im Umfang der beigefügten Patentansprüche liegen (insbesondere was die Natur und die Eigenschaften der Membranen betrifft, die für die Konzentrierung der Proben verwendet werden).
BEISPIEL 4:
Material und Methode:
Verwendung eines Filtrationsmittels, das 0,12 m² Filtrationsoberfläche aus Hohlfasern aus Celluloseacetat aufweist, für eine erste Filtrationsphase und Vivacell70-Verbrauchsmaterial (Sartorius Vivasciences Ref. VS6002) für eine zweite Filtrationsphase.
Die Probe besteht aus 30 Litern Wasser aus dem Netz, die gleichzeitig mit 300 Oozysten des Parasiten Cryptosporidium parvum und 300 CFU des Bakteriums E.coli angeimpft wurden.
Konzentrierung:
Nach der Abgabe von Leitungswasser in einen Behälter werden 20 mg/l Natriumthiosulfat (Merck 106516), d.h. 0,6 g in 30 1, hinzugegeben.
Die Probe wird mit Oozysten von C.parvum und Zellen von E.coli angeimpft;
Phase 1: von 30 Litern auf 70 ml
Die Filtration erfolgt nach dem Modus des externen Weges.
Nach teilweisem Entleeren des Gehäuses und Schütteln des Moduls wird das Retentat rückgewonnen, das die Mikroorganismen enthält, indem in das Gehäuse Druckluft (0,5b) injiziert wird, d.h. etwa 35 ml.
In das Gehäuse wird wieder nicht-angeimpftes neutralisiertes Wasser aus dem Netz (ungefähr 35 ml) durch die Fasern hindurch in das innere geschlossene Kompartiment durch Injektion eingebracht, anschließend wird geschüttelt und wie zuvor gesammelt.
Die beiden zusammengenommenen Entnahmen, d.h. 70 ml, bilden das Retentat R1.
Phase 2: von 70 ml auf 300 Mikroliter
Das Retentat R1 wird in dem Vivacell70-Verbrauchsmaterial wie vom Hersteller angegeben konzentriert, indem eine Zentrifugalkraft von 1000 g für 10 min bei 25°C angelegt wird. Um die Rückgewinnung zu verbessern, wird 1 ml des Filtrates auf das Konzentrat in der Filtrationskammer aufgetragen, anschließend wird das Filtrationselement kurz bei hoher Geschwindigkeit "gevortext". Eine neue Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor ermöglicht eine Rekonzentrierung, um 300 Mikroliter zu erreichen. So wird das Endretentat R2 erhalten.
Es werden drei Retentate R2 parallel hergestellt, um die Ergebnisse zu verdreifachen.
Analysen:
Suche von C.parvum:
Die Auszählung einer Stammlösung von Oozysten und einer Retentatfraktion erfolgt durch IMS ("immuno-magnetic separation", Dynabeads-Kit Anti-Cryptosporidium von Dynal, Ref. 730.01), danach durch IFA ("immuno fluorescence assay"), (siehe Methode 1622).
Eine Fraktion des Retentats wird durch IMS analysiert (siehe oben), anschließend durch PCR gemäß dem nachfolgenden Protokoll:

– Resuspendierung der Kugel/Oozysten-Komplexe, die aus der IMS stammen, in 10 μl hochreinem sterilem Wasser + 10 μl Chelex 100 bei 50 % in Wasser;
– Durchführung von 5 thermischen Schocks: 2 min bei 95°C / 2 min bei –80°C;
– Zentrifugieren, um die Kondensation zu initiieren;
– Zugabe von 30 μl Amplifizierungsmix (PCR-Puffer, MgCl₂: 1,5 mM, Rinderserumalbumin: 10 pg/μl, dNTP: 200 pmol/μl, Taq-DNA-Polymerase: 0,5 U, BB-3- und BB-4-Primer: jeweils 1 pmol/μl, qsp, 50 μl, hochreines Wasser).

Die Primer BB-3 und BB-4 sind in Balatbat A.B. et al., J. Clin. Microbiol. 1996, 34, 1769–1772, beschrieben.

– Durchführen des nachfolgenden PCR-Programms: 5 min bei 94°C, 40 Zyklen umfassend: [30 sec bei 94°C, 45 sec bei 60°C, 1 min bei 72°C], danach 5 min bei 72°C.
– Migration von 10 μl der PCR-Reaktion in einem 2 %-igen Agaroseelektrophoresegel in Gegenwart von Ethidiumbromid.

Suche von E.coli:
Die Auszählung der E.coli-Kultur und einer Retentatfraktion erfolgt mit der sogenannten "Coliert 18h"-Technik gemäß der Empfehlungen des Herstellers IDEXX. Diese Methode basiert auf der Detektion der Aktivität der Beta-Glucuronidase von Escherichia coli.
Eine Fraktion des Retentats wird durch verschachtelte PCR, die auf das Gen uidA angewendet wird, das für die beta-Glucuronidase codiert, gemäß dem nachfolgenden Protokoll analysiert:

– Filtration der Fraktion des Konzentrates durch eine Membran (Millipore, Durchmesser 13 mm, Porosität 0,2 μm, Durapore GVWP013 00);
– Einbringen der Membran in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen;
– Lysieren der Zellen durch thermische Schocks (6 Zyklen 85°C 1 min / Eis 1 min)
– erste Amplifizierung in dem Lyseröhrchen mit den Primern U270 und L1054 U270: 5'-ggT CAC TCA TTA Cgg CAA Ag-3' L1054: 5'-TTA AAg CCg ACA gCA gCA gT-3'

Amplifizierungsmix (150 μl), der in das PCR-Röhrchen gegeben wird, das die Membran enthält: PCR-Puffer, MgCl₂: 1,5 mM, dNTP: 200 pmol/μl, Taq-DNA-Polymerase: 1,5 U, Primer: jeweils 1 pMol/μl, 150 μl hochreines Wasser qsp.
PCR-Programm: 10 min bei 95°C, 30 Zyklen umfassend: [1 min bei 94°C, 1 min bei 60°C], danach Beibehalten von 4°C.

– 100-fache Verdünnung der erhaltenen Amplikons mit hochreinem Wasser und Verwendung von 1 μl dieser Lösung als Substrat der zweiten Amplifizierung (sogenannte "verschaltete PCR") mit den Primern Val 754 und Val 900: Val 754: 5'-AAA ACg gCA AgA AAA AgC Ag-3' Val 900: 5'-Acg CgT ggT TAC AgT CTT gCg-3'

Der Amplifizierungsmix (50 μl) wird in ein neues Röhrchen gegeben: PCR-Puffer MgCl₂: 1,5 mM, dNTP: 200 pmol/μl, Taq DNA-Polymerase: 0,5 U, Primer: jeweils 1 pmol/μl, 50 μl hochreines Wasser qsp.
PCR-Programm: identisch wie zuvor.

– Migration von 10 μl der PCR-Reaktion in einem 2 %-igen Agaroseelektrophoresegel in Gegenwart von Ethidiumbromid.

Behandlung des Retentats R2:
Das Retentat wird in drei Fraktionen von jeweils 100 Mikrolitern unterteilt: R2a, R2b, R2c.
Die Fraktion R2a wird nochmals in zwei Teile geteilt: 50 μl werden "Coliert 18h" behandelt (Auszählung E.coli), 50 μl durch IMS/IFA (Auszählung C.parvum).
Die Fraktion R2b wird in verschachtelter PCR uidA-analysiert (molekulare Detektion von E.co1i), die jedoch zuerst in zwei Teile aufgeteilt wird: 50 μl werden direkt analysiert, 50 μl werden genomische DNA von E.co1i hinzugegeben (Inhibitionstest).
Die Fraktion R2c wird mit IMS-PCR analysiert (molekulare Detektion von C.parvum), die jedoch zuvor in zwei Teile aufgeteilt wird: 50 μl werden direkt analysiert, 50 μl werden genomische DNA von C.parvum hinzugegeben (Inhibitionstest).
Die PCR umfasst jeweils eine Negativkontrolle (weder Ziel-DNA noch Retentat) und eine Positivkontrolle (mit Ziel-DNA, aber nicht mit Retentat).
Sämtliche Amplikons werden in Agarosegel durch Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Ergebnisse:
Jeder Punkt wird dreimal reproduziert und die wiederholten Ergebnisse werden durch das Zeichen "/" in der nachstehenden Tabelle getrennt:
Auswertung der Ergebnisse:
Die geringe Anzahl von E.coli-Zellen, die durch Colilert in dem Konzentrat festgestellt wurden, erklärt sich durch Stress, sogar durch Absterben der Bakterien während der Konzentrierung, denn dieser Test basiert auf der Detektion einer enzymatischen Aktivität.
Die uidA-PCR ist für drei Wiederholungen positiv, woraus sich eine reproduzierbare Empfindlichkeit des gesamten Verfahrens von 50 Bakterien in 5 Litern, d.h. 5 Bakterien pro Liter, ergibt.
Logischerweise ergibt der Zusatz von Bakterien-DNA in eine Fraktion als Inhibitionskontrolle ebenfalls positive Ergebnisse.
Für C.parvum ergibt die phenotypische Methode (IMS-IFA) signifikant kleinere Werte als der theoretisch erwartete Wert. Es ist auch möglich, dass ein Teil der Oozysten während der Konzentrierung eher verändert als in der Filtrationsvorrichtung zurückgehalten wird, denn andere Experimente, die auf Molekularbiologie basieren, zeigen eine reproduzierbare Rückgewinnung von einer Oozyste in 10 Litern (in diesem Patent nicht gezeigte Angaben).
Im übrigen ist die IMS-PCR für die drei Wiederholungen positiv, was eine minimale Empfindlichkeit von 50 Oozysten in 5 Litern, d.h. 5 Oozysten pro Liter, ergibt.
Schlussfolgerung:
Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Konzentrierungsvorrichtung in zwei Schritten zur Detektion eines Bakteriums und eines Parasiten durch Methoden der Molekularbiologie in derselben angeimpften Wasserprobe.

Claims

Verwendung eines Filtrationsmittels, aufweisend ein Gehäuse (2), in dem parallel zueinander eine Mehrzahl Hohlfasern (3) angeordnet ist, deren jeweilige poröse Wand (3a) ein Lumen (4) derart festlegt, dass das Mittel einen internen Weg (A), der aus einer Mehrzahl von Lumina (4) parallel zu den jeweiligen Hohlfasern besteht, und einen externen Weg (B) aufweist, der dem zwischen den Fasern und dem Gehäuse verfügbaren Volumen entspricht, zur Behandlung einer flüssigen Ausgangsprobe mit erheblichem Volumen, die in verdünntem Zustand eine Mehrzahl Mikroorganismen unterschiedlicher Größen aufweist, um eine flüssige Endprobe mit kleinem Volumen zu erhalten, die in konzentriertem Zustand die gleiche relative Zusammensetzung an Mikroorganismen aufweist, wobei gemäß der Verwendung während mindestens eines Konzentrierungsschrittes: a. ein einziges Filtrationsmittel vorgesehen ist, b. das Mittel im frontalen Modus verwendet wird, c. die Ausschlussgrenze der porösen Wand (3a) der Fasern derart festgelegt ist, dass der kleinste Mikroorganismus der Ausgangsprobe zurückgehalten wird, und auf diskontinuierliche Weise: d. während einer Filtrationsphase die Gesamtheit der flüssigen Ausgangsprobe durch den internen Weg (A) des Filtrationsmittels eingebracht wird, ein Filtrat durch den externen Weg (B) dem Filtrationsmittel entnommen wird und ein Konzentrat in dem Weg, durch den die flüssige Probe eingebracht wird, akkumuliert wird, e. während einer Rückgewinnungsphase, nachdem die gesamte flüssige Zirkulation der Letzteren (1) von dem einen Weg zu dem anderen Weg in dem Filtrationsmittel gestoppt wird und eine flüssige Endprobe, d.h. das Konzentrat, erhalten wird, und f. während einer Phase des Rückspülens ein flüssiger Strom, der frei von Mikroorganismen sein kann, von dem einen Weg zu dem anderen Weg zirkuliert wird.
Verwendung eines Filtrationsmittels, aufweisend ein Gehäuse (2), in dem parallel zueinander eine Mehrzahl Hohlfasern (3) angeordnet ist, deren jeweilige poröse Wand (3a) ein Lumen (4) derart festlegt, dass das Mittel einen internen Weg (A), der aus der aus einer Mehrzahl von Lumina (4) parallel zu den jeweiligen Hohlfasern besteht, und einen externen Weg (B) aufweist, der dem zwischen den Fasern und dem Gehäuse verfügbaren Volumen entspricht, zur Behandlung einer flüssigen Ausgangsprobe mit erheblichem Volumen, die in verdünntem Zustand eine Mehrzahl Mikroorganismen unterschiedlicher Größen aufweist, um eine flüssige Endprobe mit kleinem Volumen zu erhalten, die in konzentriertem Zustand die gleiche relative Zusammensetzung an Mikroorganismen aufweist, wobei gemäß der Verwendung während mindestens eines Konzentrierungsschrittes: a. ein einziges Filtrationsmittel vorgesehen ist, b. das Mittel im frontalen Modus verwendet wird, c. die Ausschlussgrenze der porösen Wand (3a) der Fasern derart festgelegt ist, dass der kleinste Mikroorganismus der Ausgangsprobe zurückgehalten wird, und auf diskontinuierliche Weise: d. während einer Filtrationsphase die Gesamtheit der flüssigen Ausgangsprobe auf dem externen Weg (B) des Filtrationsmittels eingebracht wird, ein Filtrat auf dem internen Weg (A) dem Filtrationsmittel entnommen wird und ein Konzentrat in dem Weg, auf dem die flüssige Probe eingebracht wurde, akkumuliert wird, und e. während einer Rückgewinnungsphase, nachdem die gesamte flüssige Ausgangsprobe zirkuliert ist, die Zirkulation der Letzteren von dem einen Weg zu dem anderen Weg in dem Filtrationsmittel (1) gestoppt wird und eine flüssige Endprobe, d.h. das Konzentrat, erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Filtrationsphase (d) und der Rückgewinnungsphase (e) der externe Weg evakuiert und gegebenenfalls unter Luftdruck gesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Rückgewinnungsphase (e) durch Ablaufenlassen des Konzentrats mittels Schwerkraft und/oder Zirkulation von Druckluft im internen Weg durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der Filtrationsphase (d) die Zirkulation der flüssigen Ausgangsprobe im internen Weg durch Anstauen am Einlass des internen Wegs und/oder Aspiration am Auslass des internen Wegs durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass während einer Rückspülphase ein flüssiger Strom, der frei von Mikroorganismen sein kann, von dem einen Weg zu dem anderen Weg zirkuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Filtrationsphase (d) und der Rückgewinnungsphase (e) der externe Weg teilweise oder völlig entleert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die flüssige Endprobe durch Elution des Konzentrats im externen Weg erhalten wird.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtrationsphase (d) ohne Vorfiltration der flüssigen Ausgangsprobe durchgeführt wird.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtrationsmittel ein Ultrafiltrationsmittel ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fasern des Filtrationsmittels aus einer organischen Membran (zum Beispiel Celluloseacetat, Ethylcellulose, Polyethersulfon oder Polyacrylnitril) oder einer anorganischen Membran, zum Beispiel einer Keramik, bestehen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hohlfasern des Filtrationsmittels an ihren beiden Enden jeweils in einem Harz eingebettet sind, um jeglichen Durchtritt von Verunreinigungen zwischen dem internen Weg (A) und dem externen Weg (B) und zwischen dem Filtrationsmittel und der Umgebung zu verhindern.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtrationsmittel derart dimensioniert ist und dass die Filtrationsphase während einer bestimmten Zeit derart durchgeführt wird, dass das Verhältnis zwischen dem Volumen der Ausgangsprobe und dem Volumen der Endprobe mindestens 50 ist und bevorzugt bei 150 bis 500 liegt.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei aufeinander folgende Konzentrierungsschritte einer flüssigen Probe durchgeführt werden, wobei die zwei Schritte mittels Verwendung eines Filtrationsmittels nach Anspruch 1 durchgeführt werden, wobei das am Ende des ersten Konzentrierungsschrittes erhaltene Konzentrat die flüssige Ausgangsprobe des zweiten Konzentrierungsschrittes bildet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei aufeinander folgende Behandlungen einer flüssigen Probe durchgeführt werden, und wobei mindestens eine der Behandlungen ein Konzentrierungsschritt nach Anspruch 1 oder 2 ist, wobei das am Ende der ersten Behandlung erhaltene Konzentrat die flüssige Ausgangsprobe der zweiten Behandlung bildet.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtrationsmittel derart dimensioniert sind und dass die Behandlungen während einer bestimmten Zeit derart durchgeführt werden, dass das Verhältnis zwischen dem Volumen der Ausgangsprobe und dem Volumen der Endprobe mindestens 5000 ist und bevorzugt bei 15000 bis 100000 liegt.