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Diese
Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Ortung und Konzentrierung
polarer Analyten unter Verwendung eines elektrischen Wechselfeldes.
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Ein
neuerer Trend auf dem Gebiet der analytischen Messtechnik besteht
in der Entwicklung integrierter mikrofluidischer Vorrichtungen,
bei denen mehrere Vorgänge
in einem einzigen Gerät
ausgeführt
werden, z.B. Harrison et al., "Micromachining
a Miniaturized Capillary Electrophoresis-Based Chemical Analysis System on a
Chip", Science,
261: 895 (1992). Derartige Vorrichtungen bieten gegenüber herkömmlichen
Analyseformaten etliche Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, mit sehr kleinen
Volumina zu arbeiten; leichte und ökonomische Herstellung der
Vorrichtung; die Möglichkeit,
mehrere Vorgänge
in einer einzigen integrierten Vorrichtung zu integrieren; und die
Möglichkeit,
einen hohen Automatisierungsgrad zu erreichen.
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Bei
vielen chemischen und biochemischen Analyseverfahren, die unter
Verwendung mikrofluidischer Vorrichtungen durchgeführt werden,
ist es vorteilhaft, einen Analyten im Rahmen des Analysevorgangs
zu konzentrieren. Beispielsweise führt eine erhöhte Analytkonzentration
im allgemeinen zu erhöhten
chemischen Reaktionsgeschwindigkeiten, zu erhöhten Stoffübertragungsgeschwindigkeiten
und einer verbesserten Detektierbarkeit. Da jedoch herkömmliche
Konzentrierungsverfahren einen Festphasenextraktionsschritt (z.B.
Adsorption) oder einen Phasenwechsel des Analyten (z.B. Fällung) oder
einen Phasenwechsel des Lösungsmittels
(z.B. Verdampfung) erfordern, eignen sich diese Verfahren nicht
gut für
die Verwendung in einer mikrofluidischen Vorrichtung.
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Darüber hinaus
spielen Verfahren zum Steuern der Position eines Analyten eine wichtige
Rolle bei der Entwicklung von Verfahren, die mikrofluidische Vorrichtungen
einsetzen. So mag es beispielsweise vor einem Separationsschritt
wünschenswert sein,
ein Probevolumen in einem räumlich
begrenzten Injektionsbereich zu orten.
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Es
wäre daher
wünschenswert, über ein
Verfahren zur Ortung und Konzentrierung eines Analyten zu verfügen, das
sich gut für
die Verwendung in integrierten mikrofluidischen Systemen eignet.
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US 5 344 535 offenbart eine
Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff
von Anspruch 18.
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Die
vorliegende Erfindung ist auf unsere Entdeckung von Verfahren und
Vorrichtungen zur Ortung und Konzentrierung polarer Analyten unter
Verwendung eines elektrischen Wechselfeldes gerichtet.
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Gemäß einem
ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Konzentrierung eines polaren Analyten nach Anspruch 1 bereit.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung
zur Konzentrierung eines polaren Analyten nach Anspruch 18 bereit.
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Es
ist eine erste Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Konzentrierung
eines polaren Analyten bereitzustellen, das keinen Festphasenextraktionsschritt
oder Phasenwechsel des polaren Analyten oder eines Lösungsmittels
erfordert.
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Es
ist eine zweite Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Manipulation
oder Ortung eines polaren Analyten bereitzustellen, das keinen Festphasenextraktionsschritt
oder Phasenwechsel des polaren Analyten oder eines Lösungsmittels
erfordert.
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Es
ist eine dritte Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Konzentrierung
oder Manipulation eines polaren Analyten bereitzustellen, das keinen
manuellen Eingriff erfordert und sich daher gut für die Automatisierung
eignet.
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Es
ist eine vierte Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Konzentrierung
oder Manipulation eines polaren Analyten bereitzustellen, das sich
gut für die
Verwendung in einer mikrofluidischen Vorrichtung eignet.
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Die
vorliegende Erfindung wird besser verständlich unter Bezugnahme auf
die folgende schriftliche Beschreibung, die Zeichnungen sowie die
angehängten
Ansprüche.
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1 zeigt
eine schematische Darstellung eines bevorzugten Verfahrens gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2A zeigt
eine schematische Darstellung einer bevorzugten mikrofluidischen
Konzentrierungs- und Detektionsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
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2B zeigt
eine schematische Darstellung einer bevorzugten mikrofluidischen
Konzentrierungs-, Hybridisierungs- und Nachweisvorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2C zeigt
eine schematische Darstellung einer bevorzugten mikrofluidischen
Konzentrierungsvorrichtung mit einer in dem Konzentrationsbereich bzw.
der Konzentrationszone befindlichen Fritte.
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3A zeigt
eine schematische Darstellung einer bevorzugten mikrofluidischen
Konzentrierungs- und elektrokinetischen Separationsvorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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3B zeigt
eine schematische Darstellung einer alternativen bevorzugten mikrofluidischen
Konzentrierungs- und elektronkinetischen Separationsvorrichtung
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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4 zeigt
eine schematische Darstellung mehrerer beispielhafter Elektrodenausführungen,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ausgebildet sind.
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Nun
wird im einzelnen auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung Bezug genommen, die in den begleitenden Zeichnungen beispielhaft
dargestellt sind. Zwar wird die Erfindung in Verbindung mit ausgewählten bevorzugten
Ausführungsformen
beschrieben, es versteht sich jedoch, dass diese Ausführungsformen
keineswegs den Umfang der Erfindung beschränken sollen. Die Erfindung
soll vielmehr auch jene Alternativen, Modifizierungen und Äquivalente
umfassen, die in den durch die angehängten Ansprüche definierten Schutzbereich
der Erfindung fallen mögen.
Darüber hinaus
schließen
sich nach dem Sprachgebrauch dieser Offenbarung Plural und Singular
gegenseitig ein; "oder" ist nicht ausschließend und "beinhalten" sowie "beinhaltend/einschließlich" sind nicht beschränkend zu
verstehen.
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Generell
umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zum
Orten und Konzentrieren eines polaren Analyten an einem festgelegten Ort
durch Bewirken der relativen Translation bzw. Verschiebung des polaren
Analyten im Hinblick auf ein elektrisches Wechselfeld entlang eines Translationspfades
in der Weise, dass der polare Analyt in einem durch die Überschneidung
bzw. Kreuzung des Translationspfades und des elektrischen Wechselfeldes
gebildeten Konzentrationsbereich konzentriert wird.
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Die
Erfindung beruht zum Teil auf der Entdeckung, dass ein polarer Analyt,
wenn er in ein elektrisches Wechselfeld mit geeigneten Eigenschaften
gelangt, in einem durch das elektrische Wechselfeld gebildeten Konzentrationsbereich
gefangen bzw. eingeschlossen wird. Während die theoretische Erklärung dieses
höchst
unerwarteten und günstigen
Phänomens
nicht gut verstanden wird und die vorliegende Erfindung keineswegs
durch die nachstehenden oder irgendwelche anderen theoretischen
Erläuterungen beschränkt werden
soll, gehen die Erfinder davon aus, dass dieses Einschließphänomen mit
dem Winslow-Effekt zusammenhängt,
der auch als elektrorheologischer Effekt bezeichnet wird, bei dem
sich polare Gebilde "Kopf
an Schwanz" (engl.
head-to-tail) entlang der Feldlinien eines elektrischen Feldes ausrichten
und dabei fadenförmige
Strukturen bilden, siehe z.B. Winslow, J. Applied Physics (1947);
sowie Winslow, US-Patent Nr. 2 417 850.
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I. DEFINITIONEN
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Sofern
nichts anderes angegeben ist, haben die folgenden, hier verwendeten
Begriffe und Wendungen die folgende Bedeutung:
"Translationspfad" meint einen Pfad,
der als Ergebnis einer relativen Translation eines elektrischen
Wechselfeldes und eines Mediums, das eventuell einen polaren Analyten
enthält,
durchlaufen wird. Der Translationspfad kann irgendeine Form besitzen,
d.h. geradlinig, gekrümmt
oder dergleichen.
"Separationskanal" meint einen Kanal,
der zum Ausführen
eines Separationsprozesses verwendet wird, wie z.B. Separationen, die
auf elektrokinetischen, chromatographischen oder anderen ähnlichen
Prozessen beruhen.
"Elektrokinetische
Translation" meint
die Bewegung eines Gebildes als Reaktion auf ein elektrisches Feld. Beispielhafte
elektrokinetische Translationsprozesse umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf Elektrophorese, Dielektrophorese, Elektroendoosmose, mizellare
elektrokinetische Chromatographie, Isotachophorese sowie Kombinationen
der vorstehenden Prozesse.
"Elektrokinetisches
Translationssystem" meint
eine Vorrichtung, deren Wirkung darin besteht, die elektrokinetische
Translation eines polaren Analyten zu verursachen. Typischerweise
umfasst ein elektrokinetisches Translationssystem einen Kanal zum
Führen
eines Mediums, eine Spannungsversorgung, einen Satz von zwei oder
mehr Elektroden, die in elektrischer Verbindung mit dem Kanal stehen,
sowie elektrische Verbindungen zwischen der Spannungsversorgung
und den zwei oder mehr Elektroden.
"Dipolmoment" meint das Produkt aus q·R, wobei
q und –q
Ladungen entgegengesetzter Polarität sind, die durch einen Abstand
R voneinander getrennt sind. Im Sprachgebrauch der nachfolgenden
Erörterung
umfasst ein Dipolmoment ein permanentes Dipolmoment, ein Dipolmoment,
das aus der durch ein elektrisches Feld induzierten Polarisierung
eines Gebildes mit begrenzter Polarisierbarkeit resultiert, ein Dipolmoment,
das aus der Orientierung eines Gebildes resultiert, wie z.B. der
Orientierungspolarisation, ein Dipolmoment, das aus der durch ein
elektrisches Feld induzierten Raumladungsverzerrung einer ein Gebilde
umgebenden Gegenion-Atmosphäre
resultiert, z.B. einer Debye-Schicht,
oder ein Dipolmoment, das aus irgendeiner Kombination der vorstehenden
Mechanismen resultiert.
"Elektrisches
Wechselfeld" meint
ein elektrisches Feld, das durch einen Vektor gekennzeichnet ist, dessen
Größe oder
Richtung mit der Zeit variiert. Die Definition eines elektrischen
Wechselfelds beinhaltet auch ein mehrphasiges elektrisches Feld.
Die Grenzen der räumlichen
Erstreckung eines elektrischen Wechselfeldes bildet jener Bereich,
in dem die elektrische Feldstärke
des elektrischen Wechselfeldes größer ist als jene, die erforderlich
ist, um einen interessierenden polaren Analyten im Hinblick auf
das elektrische Wechselfeld einzuschließen und zu konzentrieren.
"Polarer Analyt" meint einen Analyten
mit einem Dipolmoment.
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II. VERFAHREN
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Bezugnehmend
auf 1 umfasst das Verfahren der Erfindung in einer
bevorzugten Ausführungsform
ein Verfahren zur Ortung und Konzentrierung eines polaren Analyten 5,
umfassend die Schritte des Bewirkens der Translation des polaren
Analyten 5 entlang eines Translationspfades 10 und
des Bewirkens eines elektrischen Wechselfeldes 20, das den
Translationspfad 10 derart schneidet, dass der polare Analyt 5 teilweise
oder vollständig
in einem Konzentrationsbereich 30 gefangen und konzentriert wird,
der durch die Überschneidung
bzw. Kreuzung des Translationspfades 10 und des elektrischen Wechselfeldes 20 gebildet
wird.
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Der
polare Analyt 5 zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung kann irgendein Analyt mit einem Dipolmoment sein. Der
polare Analyt kann geladen oder ungeladen sein, und wenn der Analyt
geladen ist, dann kann er eine Gesamtnettoladung aufweisen oder
neutral sein. Vorzugsweise liegt der polare Analyt in einer gepufferten
Elektrolytlösung
vor und noch bevorzugter in einer Elektrolytlösung mit geringer Ionenstärke. Beispielhafte
polare Analyten umfassen sowohl einsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren, Proteine,
Karbohydrate, Viruse, Zellen, Organellen, organische Polymere, Partikel
und dergleichen. Ein besonders bevorzugter polarer Analyt zur Verwendung
in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine ein- oder doppelsträngige, in
einem Elektrolyten gelöste
Nukleinsäure.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein elektrisches Feld zum Bewirken der Translation
des polaren Analyten durch einen elektrokinetischen Translationsprozess
verwendet.
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Während des
Konzentrationsprozesses dürfen
die zur Bewirkung der Translation verwendeten Kräfte nicht so stark sein, dass
sie die Einschlusskräfte
(engl. "trapping
forces") des elektrischen Wechselfeldes überwiegen.
Vielmehr sollten die zum Bewirken der Translation entlang des Translationspfades
verwendeten Kräfte
auf die Einschlusskräfte abgestimmt
werden, die zum Einschließen
des polaren Analyten in dem nachstehend näher erörterten Konzentrationsbereich
verwendet werden.
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Das
elektrische Wechselfeld 20, das dazu verwendet wird, den
polaren Analyten einzuschließen,
kann irgendein elektrisches Wechselfeld sein, das einen polaren
Analyten wirksam einschließt
und konzentriert. Generell lässt
sich das elektrische Wechselfeld der Erfindung durch ein Zeit-über-Feldstärkenprofil,
eine Frequenz und eine maximale Feldstärke charakterisieren. Die Eigenschaften
des elektrischen Wechselfeldes, die zum Einschließen des polaren
Analyten erforderlich sind, hängen
von einer Reihe leicht zugänglicher
experimenteller Parameter, einschließlich der Größe des Dipolmoments
des polaren Analyten, der dielektrischen Konstante des Trägermediums
und – im
Falle eines polaren Analyten mit einem induzierten Dipolmoment – der Polarisierbarkeit
des polaren Analyten oder der umgebenden Gegenion-Atmosphäre.
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Das
Zeit-über-Feldstärkenprofil
des elektrischen Wechselfelds kann sinusförmig, sägezahnförmig, rechteckig sein, auch Überlagerungen
hiervon sind möglich,
es kann periodisch, nichtperiodisch oder irgendein anderes Profil
sein, das sich unter Verwendung eines modernen Funktionsgenerators erzeugen
lässt,
wie z.B. eines Modells 33120A, 15-MHz-Funktion/Arbiträrer Signalgenerator
der Firma Agilent Technologies. Vorzugsweise ist das Zeit-über-Feldstärkenprofil
des elektrischen Wechselfeldes rechteckig. Das rechteckige Profil
ist deshalb bevorzugt, da es im wesentlichen keine Nullfeld-Komponente besitzt,
was zu einem höchst
wirksamen Arbeitszyklus führt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Zeit-über-Feldstärkenprofil
des elektrischen Wechselfeldes dergestalt, dass die zeitlich gemittelte
integrierte Feldstärke
null ist, wenn das Mittel über
einen vollständigen
Zyklus genommen wird. Dieses Profil ist deshalb bevorzugt, weil
es die Translation eines in dem Konzentrationsbereich befindlichen
polaren Analyten innerhalb des Konzentrationsbereichs in einer anderen
Richtung als entlang des Translationspfades minimiert und die an
der Oberfläche
der Elektroden erzeugten elektrochemischen Reaktionsprodukte, wie
z.B. Gasblasen, reduziert.
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Die
Frequenz des elektrischen Wechselfeldes ist vorzugsweise niedriger
als ca. 100 Megahertz (MHz) und beträgt noch bevorzugter zwischen
ca. 1 Kilohertz (KHz) und 100 KHz.
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Vorzugsweise
beträgt
die maximale Feldstärke
des elektrischen Wechselfeldes gemessen an der Spitzenfeldstärke des
elektrischen Wechselfeldes zwischen ca. 100 V/cm und 10.000 V/cm
und noch bevorzugter zwischen ca. 1.000 V/cm und 20.000 V/cm.
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Das
elektrische Wechselfeld kann räumlich gleichmäßig oder
ungleichmäßig sein.
So kann das elektrische Wechselfeld beispielsweise verwendet werden,
um einen dielektrophoretischen Transport zu bewirken.
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Ein
eingeschlossener polarer Analyt kann aus einem Konzentrationsbereich
freigesetzt werden, indem entweder die Einschlussstärke des
elektrischen Wechselfeldes reduziert oder die Kraft erhöht wird,
die verwendet wird, um die relative Translation des polaren Analyten
im Hinblick auf das elektrische Wechselfeld zu bewirken. Die Einschlussstärke des
elektrischen Wechselfeldes kann durch Verändern der Frequenz, der Feldstärke oder
der beiden moduliert werden. Alternativ kann der polare Analyt aus
dem Konzentrationsbereich freigesetzt werden durch Erhöhen der
Kräfte,
die verwendet werden zum Bewirken der relativen Translation des
polaren Analyten und des elektrischen Wechselfeldes, beispielsweise
durch Verstärken
des elektrischen Feldes, das zum Antreiben der elektrokinetischen
Translation des polaren Analyten verwendet wird, durch Erhöhen des Druckes,
der zum Antreiben eines druckgetriebenen Flusses des polaren Analyten
verwendet wird, oder durch Erhöhen
der Translationsgeschwindigkeit des elektrischen Wechselfeldes.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird im Anschluss an einen Analyten-Konzentrierungsschritt gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung ein weiterer Analyseschritt durchgeführt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der polare Analyt, nachdem er in einem Konzentrationsbereich konzentriert
wurde, in einen analytischen Separationsprozess, beispielsweise
einen elektrokinetischen oder chromatographischen Separationsprozess,
geführt.
Die Konzentrierungs- und Ortungsverfahren der vorliegenden Erfindung
sind besonders vorteilhaft, wenn der anschließende analytische Separationsprozess
eine Elektrophorese ist, da der der Separation vorausgehende Konzentrierungsschritt
einen konzentrierten und engen Injektionsbereich bereitzustellen
vermag, was sowohl zu einer erhöhten
Separationsleistung, z.B. verringerter Plattenhöhe, als auch zu einer verbesserten
Detektierbarkeit der abgetrennten Komponenten führt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, in der der polare Analyt eine Nukleinsäure ist,
wird der Nukleinsäure-Analyt
im Anschluss an oder während
der Konzentrierung des Nukleinsäure-Analyten
in dem Konzentrationsbereich einer Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion unterzogen,
in der der konzentrierte Nukleinsäure-Analyt mit einer oder mehreren
komplementären
Nukleinsäuren unter
Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die sich für eine sequenzspezifische Hybridisierung
eignen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die komplementären Nukleinsäuren an
einen festen Träger
gebunden, z.B. eine Gruppierung trägergebundener Nukleinsäuren mit
einer oder mehreren möglicherweise
komplementären
Nukleinsäuren. Die
trägergebundenen
Nukleinsäuren
können
synthetische Polynukleotidsonden, cDNA-Moleküle oder irgendeine andere zur
sequenzspezifischen Hybridisierung geeignete Nukleinsäure oder
Nukleinsäureanalogon
sein. Beispielhafte Gruppierungen trägergebundener Nukleinsäuren sind
andernorts beschrieben, z.B. in Singh-Gasson et al., Nature Biotechnology,
17: 974–978
(1999); Blanchard and Friend, Nature Biotechnology, 17: 953 (1999);
Brown et al., US-Patent Nr. 5 807 522. Der der Hybridisierung vorangehende
Konzentrierungsschritt der vorliegenden Erfindung kann zu einer
erhöhten
Hybridisierungsgeschwindigkeit führen,
der Fähigkeit,
eine weniger konzentrierte Probe zu verwenden, oder einer Verbesserung
der Detektierbarkeit der Produkte der Hybridisierungsreaktion. Zwar
wurde diese Ausführungsform
im Zusammenhang mit der Nukleinsäurehybridisierung
beschrieben, für
einen Fachmann im Bereich der biochemischen Mess- und Analysetechnik
wird jedoch ersichtlich, dass diese Ausführungsform ebenfalls auf andere
Verfahren angewendet werden könnte,
in denen ein polarer Analyt mit einem komplementären Bindungspartner in Kontakt
gebracht wird, z.B. Antikörper-Antigen-Paare,
Rezeptor-Liganden-Paare, Biotin-Avidin-Paare
und dergleichen.
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In
noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verfahren der
vorliegenden Erfindung wird während
oder im Anschluss an die Konzentrierung des polaren Analyten in
einem Konzentrationsbereich der polare Analyt unter Verwendung eines Detektors,
beispielsweise eines Fluoreszenzdetektors, detektiert. In dieser
Ausführungsform
kann der der Detektion vorangehende Konzentrierungsschritt zu einer
verbesserten Detektierbarkeit des polaren Analyten führen und
dadurch zu einer empfindlicheren Messung, oder zu der Möglichkeit,
ein weniger hoch entwickeltes oder teures Detektionssystem, wie z.B.
UV-Absorption anstelle von laserinduzierter Fluoreszenz, zu verwenden.
Sofern die Detektion während
des Konzentrierungsprozesses erfolgt, kann der Konzentrierungsprozess
in Echtzeit überwacht
werden.
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In
noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
der konzentrierte polare Analyt während oder im Anschluss an
die Konzentrierung des polaren Analyten mit einem Reaktanten in
Kontakt gebracht und eine chemische Reaktion wird zwischen dem Reaktanten
und dem konzentrierten polaren Analyten durchgeführt. Derartige Reaktionen können chemische,
immunologische oder enzymatische Prozesse, wie z.B. Markieren des
Analyten, Proteinverdau, DNA-Verdau oder -Fragmentierung, DNA-Synthese
und dergleichen, umfassen. Der Konzentrierungsschritt kann zu einer
erhöhten Reaktionsgeschwindigkeit
oder einer verbesserten Detektierbarkeit der Reaktionsprodukte führen.
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III. VORRICHTUNGEN
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Wie
aus der vorstehenden Erörterung
der verschiedenen bevorzugten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
ersichtlich, können
eine breite Vielzahl von Vorrichtungen zum Ausführen der Verfahren konstruiert
werden. Die zur Konstruktion und Bedienung der Vorrichtungen der
Erfindung verwendeten besonderen Elemente, das Layout bzw. der Aufbau,
die Abmessungen, Materialien und Versuchsbedingungen können je
nach dem jeweiligen bestimmten Verfahren bzw. der bestimmten Anwendung
variieren.
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Generell
umfasst eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung eine Einrichtung zum Erzeugen eines elektrischen Wechselfeldes
und eine Einrichtung zum Bewirken der relativen Translation eines
polaren Analyten im Hinblick auf das elektrische Wechselfeld entlang
eines Translationspfades. Die Vorrichtung ist derart konstruiert,
dass während des
Betriebs ein Konzentrationsbereich an der Schnittstelle bzw. Kreuzung
des Translationspfades und des elektrischen Wechselfeldes gebildet
wird. Mehrere beispielhafte Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung
werden nachfolgend beschrieben.
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2A zeigt
eine schematische Darstellung einer beispielhaften mikrofluidischen
Konzentrierungs- und Detektionsvorrichtung 119 gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die Vorrichtung 119 umfasst ein Analytenfüllreservoir 120,
einen Translationskanal 130 und ein Abfallreservoir 125,
und zwar derart, dass das Analytenfüllreservoir 120 durch
den Translationskanal 130 in flüssiger Verbindung mit dem Abfallreservoir 125 steht.
Sowohl das Analytenfüllreservoir 120 als
auch das Abfallreservoir 125 enthalten Elektroden 150a und 150b zum
Bewirken der elektrokinetischen Translation eines Analyten entlang
des Translationskanals 130. Die Elektroden 150a und 150b sind
jeweils mit einer Spannungsversorgung 170 verbunden zum
Bereitstellen einer Spannungsdifferenz zwischen den Elektroden 150a und 150b und
dadurch Bewirken eines elektrischen Feldes entlang des Translationspfades 130,
das ausreicht, die elektrokinetische Translation eines Analyten
entlang des Translationskanals 130 zu verursachen. Die
Vorrichtung 119 umfasst ferner ein zweites Paar Elektroden 140a und 140b,
die sich auf entgegengesetzten Seiten des Translationskanals 130 befinden,
derart, dass ein elektrisches Wechselfeld über die Breite des Translationskanals 130 bewirkt
wird. Die Elektroden 140a und 140b sind mit einer
Wechselfeld-Spannungsversorgung 160 verbunden zum Bereitstellen einer
zeitvarianten Spannungsdifferenz zwischen den Elektroden 140a und 140b und
dadurch Bewirken eines elektrischen Wechselfeldes im wesentlichen
durch den Translationskanal 130 hindurch. Ein Konzentrationsbereich 181 befindet
sich zwischen den Elektroden 140a und 140b. Optional
umfasst die Vorrichtung 119 ferner einen Detektor (nicht
gezeigt), der so positioniert ist, dass in dem Konzentrationsbereich 181 befindliches
Material detektiert werden kann. Darüber hinaus umfasst die Vorrichtung 119 weiterhin
optional einen Computer 180, der an die Spannungsversorgung 170,
die Wechselfeld-Spannungsversorgung 160 und
den Detektor (nicht gezeigt) angeschlossen ist, zum Steuern und Überwachen
des Betriebs der Vorrichtung und zum Verwalten der Erfassung, Analyse
und Präsentation
von Daten.
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2B zeigt
eine Variante der in 2A beschriebenen Vorrichtung 191,
bei der sich ein Polynukleotidhybridisierungs-Array bzw. eine Polynukleotidhybridisierungs-Anordnung 192 oder
eine Anordnung irgendeiner anderen trägergebundenen Bindungskomponente
in dem zwischen den Elektroden 140a und 140b befindlichen
Konzentrationsbereich 181 befindet. Die Hybridisierungs-Anordnung 192 ist
derart positioniert, dass ein mit der Anordnung in Kontakt zu bringender
Analyt vor der Hybridisierung in dem an die Anordnung angrenzenden
Konzentrationsbereich 181 konzentriert wird, um die Stoffübertragungsgeschwindigkeit
des Analyten zu der Anordnung zu erhöhen und die Detektierbarkeit
des hybridisierten Analyten zu verbessern.
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Während des
Betriebs arbeitet die Vorrichtung 191 im allgemeinen folgendermaßen. Der Translationskanal 130 und
das Abfallreservoir 125 sind mit einem Trägermedium
gefüllt,
wie z.B. einer gepufferten Elektrolytlösung niedriger Ionenstärke, und
ein polarer Analyt wird in das Analytenfüllreservoir 120 platziert,
z.B. unter Verwendung einer herkömmlichen
Mikropipette. Dann wird die Spannungsversorgung 170 aktiviert,
wodurch die elektrokinetische Translation des Analyten aus dem Analytenfüllreservoir 120 heraus
und in den Translationskanal 130 hinein bewirkt wird. Als
nächstes,
bevor der Analyt den im allgemeinen zwischen dem Elektrodenpaar 140a und 140b befindlichen
Konzentrationsbereich 181 erreicht, wird die Wechselfeld-Spannungsversorgung 160 aktiviert.
Während
der Analyt durch den Translationskanal 130 hindurch in
den Konzentrationsbereich 181 wandert, der durch die Überschneidung
des elektrischen Wechselfeldes und des Translationskanals 130 gebildet
wird, wird der polare Analyt in dem Konzentrationsbereich eingeschlossen und
konzentriert. Dieser Prozess wird so lange fortgesetzt, bis sich
die gewünschte
Menge des Analyten in dem Konzentrationsbereich befindet. Schließlich wird
die Menge des polaren Analyten in dem Konzentrationsbereich durch
den Detektor erfasst. Alternativ überwacht der Detektor den Konzentrationsbereich den
gesamten Prozess hindurch, um den zeitlichen Verlauf des Konzentrierungsprozesses
zu erfassen. Oder der Konzentrierungsprozess wird in der in 2B gezeigten
Vorrichtung 191 so lange fortgesetzt, bis die Konzentration
des polaren Analyten ausreicht, um den Hybridisierungsschritt durchzuführen.
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2C zeigt
eine weitere Variante der in 2A beschriebenen
Vorrichtung 192, bei der eine Fritte 193 in dem
zwischen den Elektroden 140a und 140b befindlichen
Konzentrationsbereich 181 angeordnet ist. Während die
theoretische Erklärung
dieses höchst
unerwarteten und günstigen
Phänomens nicht
gut verstanden wird und die vorliegende Erfindung keineswegs durch
die nachstehende oder irgendwelche anderen theoretischen Erläuterungen beschränkt werden
soll, gehen die Erfinder davon aus, dass die Fritte 193 räumliche
Ungleichmäßigkeiten
in dem elektrischen Wechselfeld hervorruft, was unter bestimmten
Umständen
der Verbesserung des Konzentrierungseffektes der Erfindung dient.
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Die
Fritte 193 weist eine poröse Struktur auf mit Durchgangsporen,
die ein flüssiges
Medium enthalten, derart, dass Material durch die Fritte transportiert
werden kann. Vorzugsweise weist die Porenstruktur der Fritte Poren
mit einem effektiven Innendurchmesser von zwischen 0,5 und 50 μm auf.
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In
einer Ausführungsform
besteht die Fritte aus einer isolierenden Matrix, derart, dass die
Wechselstromleitfähigkeit
der isolierenden Matrix im wesentlichen geringer ist als die Wechselstromleitfähigkeit
des in den Poren der Fritte enthaltenen flüssigen Mediums. Vorzugsweise
ist die elektrische Leitfähigkeit
des flüssigen
Mediums dreimal so groß wie
die der isolierenden Matrix, und noch bevorzugter zwischen 10 und
1.000 mal größer als
die der isolierenden Matrix. Die isolierende Matrix kann aus irgendeinem
isolierenden Material gebildet sein, aus dem sich eine Fritte herstellen
lässt.
Beispielhafte Materialien umfassen Kunststoff, Keramik und dergleichen. Vorzugsweise
ist die isolierende Matrix ein Kunststoff wie z.B. Polymethylmethacrylat.
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In
einer alternativen Ausführungsform
enthält
die Fritte elektrisch leitfähige
Partikel, die derart in der isolierenden Matrix suspendiert sind,
dass eine Vielzahl elektrisch isolierter Bereiche existiert, die
jeweils einen oder mehrere leitfähige
Partikel enthalten. Idealerweise ist jeder Partikel durch die isolierende
Matrix von allen anderen Partikeln elektrisch isoliert. Die leitfähigen Partikel
können
aus irgendeinem leitfähigen
oder halbleitfähigen
Material gebildet sein, vorzugsweise sind die Partikel jedoch aus
Metall, z.B. Silber, Gold, Platin, Kupfer und dergleichen, oder
aus Halbleitermaterialien, z.B. Galliumarsenid. In einer bevorzugten
Ausführungsform
sind die Partikel im wesentlichen kugelförmig und weisen einen Durchmesser
von zwischen ca. 0,5 μm
bis ca. 50 μm
auf.
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Verfahren
zum Herstellen von Fritten gemäß der vorliegenden
Erfindung sind wohlbekannt. Kurz zusammengefasst verläuft ein
beispielhaftes bevorzugtes Frittenherstellungsverfahren folgendermaßen. Auflösen von
1 Gramm Plexiglas in 250 ml Chloroform bei Zimmertemperatur zum
Bilden einer Plexiglas-/Chloroformmischung. Anschließend Vermengen
von 20 Gramm Kupferpartikeln auf einer 150-mesh (99,5%-igen) Kupferbasis
(Alfa AESAR, Bestellnummer 10160) mit 2 ml der Plexiglas-/Chloroformmischung
zum Bilden einer Partikelsuspension. Die Metallpartikel sollten
einen Durchmesser von ca. 2–10 μm aufweisen.
Das Vermengen sollte bei Zimmertemperatur etwa 5 Minuten lang unter
Verwirbeln der Suspension erfolgen, bis diese gleichmäßig durchmischt
ist. Zum Bilden der Fritte Absaugen einer Länge von 2–5 mm der Mischung in eine
Mikropipette (kalibrierte, farbkodierte Einwegmikropipetten, VWR
Scientific, Kat.-Nr. 53432-921, Größe 100 μl) unter Verwendung eines herkömmlichen
Pipettenkolbens. Teilweises Trocknenlassen der abgesaugten Suspension
für etwa
5 Minuten und dann Schieben der Suspension weiter hinein in die
Mikropipette unter Verwendung eines steifen Drahts oder Stabs. Schließlich Trocknenlassen
der Fritte für
weitere 30 Minuten bei Zimmertemperatur. Die Fritte kann dann in
situ verwendet oder mechanisch aus der Mikropipette entfernt werden.
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3A zeigt
eine schematische Darstellung einer anderen beispielhaften mikofluidischen
Vorrichtung 200 gemäß der vorliegenden
Erfindung. Die Vorrichtung 200 umfasst ein Analytenfüllreservoir 205, einen
elektrokinetischen Separationskanal 225 und ein Abfallreservoir 210,
derart, dass das Analytenfüllreservoir 205 in
flüssiger
Verbindung mit dem Abfallreservoir 210 über den elektrokinetischen
Separationskanal 225 steht. Das Analytenfüllreservoir 205 und
das Abfallreservoir 210 enthalten Elektroden 215a bzw. 215b zum
Bewirken einer elektrokinetischen Translation eines polaren Analyten
entlang des elektrokinetischen Separationskanals 225. Die Elektroden 215a und 215b sind
an die Spannungsversorgung 240 angeschlossen. Die Vorrichtung
umfasst ferner Einfangelektroden 220a und 220b zum Bewirken
eines elektrischen Wechselfeldes zwischen den Elektroden 220a und 220b.
Die Elektroden 220a und 220b sind an eine Wechselspannungsversorgung 230 angeschlossen.
Die Vorrichtung umfasst ferner einen Detektor 245, der
sich an einem distalen Ende des elektrokinetischen Separationskanals 225 bezüglich des
Füllreservoirs 205 befindet, zum
Detektieren des polaren Analyten in einem Detektionsbereich 246,
nachdem die elektrokinetische Separation im wesentlichen beendet
ist. Optional enthält
die Vorrichtung 200 einen Computer 235, der an
die Spannungsversorgung 230, die Spannungsversorgung 240 und
den Detektor 245 angeschlossen ist, zum Steuern und Überwachen
des Betriebs der Vorrichtung und zum Verwalten der Erfassung, Analyse
und Präsentation
von Daten. Optional kann die Vorrichtung 200 ferner eine
zweite Wechselspannungsversorgung und ein Elektrodenpaar (nicht
gezeigt) enthalten, das sich in der Nähe des Detektionsbereichs 246 befindet,
zum Einfangen und Konzentrieren der abgetrennten Komponenten des
polaren Analyten vor oder während
der Detektion, um die Detektierbarkeit der abgetrennten Komponenten
weiter zu erhöhen.
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Während des
Betriebs arbeitet die Vorrichtung 200 folgendermaßen. Zuerst
werden der elektrokinetische Separationskanal 225 und das
Abfallreservoir 210 mit einer Elektrolytlösung gefüllt, die
fähig ist,
die elektrokinetische Translation des polaren Analyten entlang des
elektrokinetischen Separationskanals 225 zu unterstützen. Dann
wird das Analytenfüllreservoir 205 mit
einem Analyten gefüllt,
beispielsweise unter Verwendung einer herkömmlichen Mikropipette. Als
nächstes
wird die Spannungsversorgung 240 mit Vorwärtspolarität aktiviert
zum Initiieren der elektrokinetischen Translation des polaren Analyten
entlang des elektrokinetischen Separationskanals 225. Darüber hinaus
wird die Spannungsversorgung 230 aktiviert zum Errichten
des elektrischen Wechselfeldes, das verwendet wird zum Einfangen
und Konzentrieren des polaren Analyten in dem Konzentrationsbereich 181,
der sich in etwa zwischen den Elektroden 220a und 220b befindet.
Optional kann zum Erhöhen
der Menge des in dem Konzentrationsbereich eingeschlossenen Analyten
die Polarität
der Spannungsversorgung 240 zyklisch zwischen der Vorwärtspolarität und einer
umgekehrten Polarität
variiert werden, so dass der polare Analyt durch den Konzentrationsbereich
vor- und zurücktranslatiert
wird. Sobald eine ausreichende Menge des polaren Analyten in dem
Konzentrationsbereich vorliegt und konzentriert ist, wird die Spannungsversorgung 240 mit
umgekehrter Polarität
aktiviert, wodurch nicht eingefangenes Material aus dem elektrokinetischen
Separationskanal 225 heraus- und in das Füllreservoir 205 zurückgezogen
wird. Nun kann etwaiger in dem Analytenfüllreservoir 205 verbleibender
Analyt entfernt und durch eine geeignete Elektrolytlösung ersetzt
werden. Als nächstes
wird die Spannungsversorgung 230 abgeschaltet und der elektrokinetische
Separationsprozess wird entlang des elektrokinetischen Separationskanals 225 fortgesetzt,
bis die Komponenten des polaren Analyten zu dem Detektionsbereich 246 transportiert
und von dem Detektor 245 detektiert werden.
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3B zeigt
eine schematische Darstellung noch einer anderen beispielhaften
mikrofluidischen Vorrichtung 420 gemäß der vorliegenden Erfindung. Die
Vorrichtung 420 ist eine Variante der Vorrichtung 200 der 3A,
bei der das einzelne Analytenfüllreservoir 205 in
der Vorrichtung 200 durch ein Reservoir-Paar ersetzt ist:
ein Analytenfüllreservoir 405 und
ein Analytenabfallreservoir 410. Das Analytenfüllreservoir 405 enthält eine
Elektrode 400 und das Analytenabfallreservoir 410 enthält eine
Elektrode 415. Das Analytenfüllreservoir 405 ist
durch den Nebenkanal 406 mit dem elektrokinetischen Separationskanal 225 verbunden,
und das Analytenabfallreservoir 410 ist durch den Nebenkanal 407 mit
dem elektrokinetischen Separationskanal 225 verbunden. Weitere
Elemente der Vorrichtung 420 entsprechen den mit Bezug
auf die Vorrichtung 200 in 3A beschriebenen.
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Während des
Betriebs arbeitet die Vorrichtung 420 folgendermaßen. Zuerst
werden der elektrokinetische Separationskanal 225, das
Abfallreservoir 210, die Nebenkanäle 407 und 406 sowie
das Analytenabfallreservoir 410 mit einer Elektrolytlösung gefüllt, die
fähig ist,
die elektrokinetische Translation des polaren Analyten entlang des
elektrokinetischen Separationskanals 225 zu unterstützen. Dann wird
das Analytenfüllreservoir 205 mit
einem Analyten gefüllt,
beispielsweise unter Verwendung einer herkömmlichen Mikropipette. Als
nächstes
wird die Spannungsversorgung 240 mit einer Vorwärtspolarität aktiviert,
zum Bewirken einer Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 400 und 215b,
um die elektrokinetische Translation des polaren Analyten durch den
Nebenkanal 406, entlang des elektrokinetischen Separationskanals 225 und
in den Konzentrationsbereich 181 zu initiieren. Wie zuvor,
wird die Spannungsversorgung 230 zum Errichten des elektrischen
Wechselfeldes aktiviert, das verwendet wird, um den polaren Analyten
in dem Konzentrationsbereich 181 einzufangen und zu konzentrieren,
der sich im wesentlichen zwischen den Elektroden 220a und 220b befindet.
Optional kann die Polarität
der Spannungsversorgung 240 zyklisch zwischen der Vorwärtspolarität und einer
umgekehrten Polarität
variiert werden, so dass der polare Analyt durch den Konzentrationsbereich
vor- und zurücktranslatiert wird.
Sobald eine ausreichende Menge des polaren Analyten in dem Konzentrationsbereich
vorliegt und konzentriert ist, wird die Spannungsversorgung 240 mit
umgekehrter Polarität
aktiviert, um eine Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 415, 400 und 215b derart
zu bewirken, dass nicht eingefangenes Material aus dem elektrokinetischen
Separationskanal 225 und dem Analytenfüllreservoir 405 heraus- und
in das Analytenabfallreservoir 410 hineingezogen wird.
Optional kann nach dem Spülen
des nicht eingefangenen Analyten in ein Analytenabfallreservoir 410 in
dem Abfallreservoir 415 vorhandener Analyt entfernt und
durch eine geeignete Elektrolytlösung ersetzt
werden. Als nächstes
wird die Spannungsversorgung 230 abgeschaltet und der elektrokinetische Separationsprozess
wird entlang des elektrokinetischen Separationskanals 225 zwischen
den Elektroden 400 und 215b fortgesetzt, bis die
Komponenten des polaren Analyten zu dem Detektionsbereich 246 transportiert
und von dem Detektor 245 detektiert werden.
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Die
in vielen der bevorzugten Vorrichtungen der Erfindung eingesetzten
Fluidkanäle
können
irgendwelche Kanäle
sein, die zum Führen
einer Probe imstande sind, welche einen polaren Analyten und ein
Lösungsmittel
oder andere Trägermedien
enthält, die
zum Ausführen
eines Verfahrens der Erfindung nötig
sind. Die Kanäle
können
voneinander getrennt sein, beispielsweise einzelne Kapillarrohre,
oder als Teil einer integrierten mikrofluidischen Vorrichtung gebildet
sein, z.B. in ein Glasssubstrat geätzte Kanäle. Vorzugsweise sind die Fluidkanäle als Teil
einer integrierten mikrofluidischen Vorrichtung mit einem oder mehreren
einander kreuzenden Kanälen
und Reservoirs gebildet. Beispielhafte mikrofluidische Vorrichtungen
sowie mehrere alternative Verfahren für die Herstellung der Vorrichtung
sind in Soane and Soane, US-Patent Nr. 5 750 015 und 5 126 022; Manz,
US-Patent Nr. 5
296 114 und 5 180 480; Junkichi et al., US-Patent Nr. 5 132 012; und Pace, US-Patent
Nr. 4 908 112 offenbart. Weitere Referenzen, die mikrofluidische
Vorrichtungen beschreiben, sind u.a. Harrison et al., Science, 261:
895 (1992); Jacobsen et al., Anal. Chem. 66: 2949 (1994); Effenhauser
et al., Anal. Chem. 66: 2949 (1994); und Woolley and Mathies, P.
N. A. S. USA, 91: 11348 (1994). Eine generelle Erörterung
von Mikrofabrikationstechniken wird von Madou in Fundamentals of
Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, FL (1997) bereitgestellt.
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Die
Fluidkanäle
können
in der Vorrichtung entsprechend der jeweiligen besonderen Anwendung
in den unterschiedlichsten Ausgestaltungen vorliegen. Das innere
Volumen eines Kanals liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 1 nl
bis etwa 10 μl und
bevorzugter im Bereich von etwa 10 nl bis etwa 2 μl. Die Länge eines
Kanals liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 1 mm bis etwa 50
cm, gewöhnlich zwischen
etwa 5 cm und 30 cm. In bestimmten Anwendungen können Kanäle jedoch eine Länge von bis
zu oder mehr als 100 cm aufweisen, z.B. in den Fällen, in denen der Kanal als
elektrokinetischer oder chromatographischer Separationskanal verwendet wird.
Die Querschnittsabmessungen (z.B. Breite, Höhe, Durchmesser) liegen im
Bereich von etwa 1 μm bis
etwa 400 μm,
gewöhnlich
im Bereich von etwa 20 μm
bis etwa 200 μm.
Die Querschnittsform des Kanals kann jede beliebige Querschnittsform
sein, einschließlich
aber nicht begrenzt auf kreisförmige,
ellipsoide, rechteckige, trapezförmige,
quadratische oder Kombinationen der vorgenannten Formen. Die Fluidkanäle können geradlinig,
gewunden, schraubenförmig,
spiralförmig
sein oder irgendeine andere Ausgestaltung aufweisen, je nach den
Erfordernissen einer bestimmten Anwendung. So mag es beispielsweise dann,
wenn ein langer Fluidkanal in einem kleinen Substrat errichtet werden
soll, vorteilhaft sein, einen Kanal mit spiralförmiger oder gewundener Form
zu errichten.
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Die
Fluidkanäle
der Vorrichtung können
optional umfassen – und
umfassen gewöhnlich – Fluidreservoirs
an einem oder beiden Enden des Kanals. Falls Reservoirs vorgesehen
sind, können
diese vielfältigen
Zwecken dienen, einschließlich
einer Einrichtung zum Einführen
verschiedener Fluide in den Kanal, z.B. Puffer, Elutionslösungsmittel,
Siebmedien, Reagenten, Spül-
oder Waschlösungen;
einer Einrichtung zum Empfangen von flüssigen Abfällen aus einem Kanal, z.B.
einem elektrokinetischen Fließweg;
oder als Elektrodenreservoirs zum Kontaktieren einer Elektrode mit
einem Elektrolyten und zum Zuführen
von Ionen, um einen elektrokinetischen Prozess zu unterstützen. Generell
weisen die Reservoirs ein Volumen von zwischen 1 μl und 100 μl auf, vorzugsweise
zwischen etwa 1 μl
und 10 μl.
Größere Reservoirs
mögen wünschenswert
sein, wenn die Reservoirs mehreren Fluidkanälen dienen.
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Die
gegenständlichen
Vorrichtungen können optional
auch ein Schnittstellensystem umfassen, zum Unterstützen des
Einbringens eines Analyten in die Vorrichtung. Beispielsweise kann
das Schnittstellensystem, wenn der Analyt unter Verwendung einer Spritze
in die Vorrichtung eingebracht werden soll, eine Spritzenschnittstelle
aufweisen, die als Führung beim
Einbringen der Spritzennadel in die Vorrichtung dient, z.B. als
Versiegelung über
einem Analyteneinlassreservoir.
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Je
nach der besonderen Anwendung, der Ausgestaltung und den Materialien,
aus denen die Vorrichtung hergestellt ist, kann in die Vorrichtung
ein Detektionsbereich zum Detektieren des Vorliegens eines bestimmten
Analyten aufgenommen werden, z.B. das Element 246 in 3. Beispielsweise enthält bevorzugt mindestens ein
Bereich des elektrokinetischen Kanals einen Detektionsbereich, der
aus einem optisch transparenten Material hergestellt ist, das im
allgemeinen die Übertragung
von Licht mit Wellenlängen
im Bereich von 180 bis 1500 nm, gewöhnlich 250 bis 800 nm, durch
das Material mit geringen Übertragungsverlusten,
d.h. von weniger als etwa 20%, vorzugsweise von weniger als etwa
5%, erlaubt. Geeignete optisch transparente Materialien umfassen
Kieselglas (engl. fused silica), bestimmte optisch klare Kunststoffe,
Quarzglas, Borosilicatglas und dergleichen.
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Die
gegenständlichen
Vorrichtungen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
aus einer breiten Vielzahl von Materialien, einschließlich Glas,
Kieselglas bzw. Quarzglas, Akrylharzderivaten, thermoplastischen
Werkstoffen, Silizium und dergleichen hergestellt sein. Vorzugsweise
haben die Materialien ein hohes dielektrisches Durchbruchspotential, z.B. höher als
etwa 100 kV/cm, sind mechanisch steif sowie chemisch kompatibel
mit dem polaren Analyten und jeglichen damit zusammenhängenden
Lösungsmitteln
oder Medien, und sie weisen einen niedrigen dielektrischen Verlustfaktor
auf, z.B. geringer als etwa 0,05 bei 1 MHz. Die verschiedenen Komponenten
der integrierten Vorrichtung können
aus denselben oder aus unterschiedlichen Materialien hergestellt
sein, je nach der besonderen Verwendung der Vorrichtung, wirtschaftlichen
Belangen, Lösungsmittelkompatibilität, optischer
Klarheit, Farbe, mechanischer Stärke,
mechanischen Merkmalen, elektrischen Eigenschaften, thermischen
Eigenschaften und dergleichen. Beispielsweise kann ein planares Substrat
mit mikrofluidischen Fließwegen
und einer Abdeckplatte aus demselben Material, z.B. Polymethylmethacrylat
(PPMA), oder unterschiedlichen Materialien, z.B. einem Substrat
aus PPMA und einer Abdeckplatte aus Glas, hergestellt sein. Bei
Anwendungen, bei denen wegen der leichteren Herstellbarkeit und
aufgrund der Materialkosten eine integrierte Vorrichtung zum Einmalgebrauch
gewünscht
ist, wird die Vorrichtung typischerweise aus einem Kunststoff gefertigt.
Zur leichten Detektierbarkeit und Herstellbarkeit wird die gesamte
Vorrichtung typischerweise aus einem Kunststoffmaterial gefertigt,
das bezüglich der
für die
Detektion verwendeten optischen Wellenlängen optisch transparent ist.
Ebenso sind Kunststoffe mit einer geringen Oberflächenladung
unter Elektrophoresebedingungen für gewisse Anwendungen von Interesse.
Bestimmte Kunststoffe, die für
die Herstellung von Wegwerfvorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung
brauchbar sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Polymethylmethacrylate,
Polycarbonate, Polyethylenterephthalate, Polystyrol oder Styrolcopolymere.
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Optional
können
die Oberflächeneigenschaften
der für
die Herstellung der Vorrichtungen verwendeten Materialien verändert werden,
um Analyt-Wand-Interaktionen, Elektroendoosmose, Bindungseigenschaften
oder jegliche andere durch die Oberfläche vermittelte Eigenschaft
der Materialien zu steuern. Den Oberflächenmodifikationen können die kovalente
Anbindung von Beschichtungsmitteln oder eine physikalische Anbindung,
beispielsweise durch ionische, hydrophobische oder van-der-Waals-Interaktionen,
zugrundeliegen. Beispielhafte Oberflächenmodifikationstechniken
werden an anderer Stelle beschrieben, z.B. in Hjerten, US-Patent
Nr. 4 680 201; Cobb et al., Anal. Chem., 62: 2478–2483 (1990); van
Alstine et al., US-Patent Nr. 4 690 749; sowie Belder und Schomburg,
Journal of High Resolution Chromatography, 15: 686–693 (1992).
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Die
Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung
können
unter Verwendung jeglicher für
die Herstellung ähnlicher
Vorrichtungen geeigneter Mittel bzw. Einrichtungen hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden herkömmliche
Form- und Gusstechniken zur Herstellung der Vorrichtungen verwendet.
Beispielsweise kann für
aus einem Kunststoffmaterial gefertigte Vorrichtungen eine Silizium-Formvorlage,
die ein Negativ für
die Kanalstruktur in dem planaren Substrat der Vorrichtung darstellt,
durch Ätzen
oder Lasermikrobearbeitung erzeugt werden. Neben einem erhöhten Grat,
der den Kanal in dem Substrat bilden wird, kann die Silizium-Form
einen erhöhten
Bereich aufweisen, der für
eine Kavität
in dem planaren Substrat zum Bilden von Reservoirs oder anderen
Fluidmerkmalen sorgen wird. Soweit angebracht, können die im US-Patent Nr. 5
110 514 beschriebenen Verfahren eingesetzt werden. Eine Abdeckplatte
kann unter Verwendung irgendwelcher geeigneter Mittel, einschließlich Ultraschallschweißen, Klebstoffe,
etc., auf dem Substrat versiegelt werden.
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Alternativ
können
die Vorrichtungen unter Verwendung von photolithographischen Techniken, wie
sie bei der Herstellung von mikroelektronischen Computer-Chips zur
Anwendung kommen, folgendermaßen
hergestellt werden. Zuerst wird ein Substratträger, wie z.B. eine Polymethylacrylat-Karte
mit annähernd
der Größe einer
herkömmlichen
Kreditkarte, bereitgestellt. Die Oberfläche der Karte an sich ist nicht
elektrisch leitend, genausowenig wie die Karte. Auf die Karte wird
zunächst
eine dünne
Schicht eines elektrisch leitenden Materials, z.B. eines Metalls, aufgetragen.
Die Beschichtung kann mittels einer Vielzahl von unterschiedlichen,
in der Fachwelt bekannten Techniken aufgebracht werden und aus einer
Vielzahl von unterschiedlichen Materialarten bestehen, vorausgesetzt,
diese sind zum Leiten von Elektrizität imstande und chemisch inert,
z.B. Platin, Gold und dergleichen. Die Schicht ist vorzugsweise dünn; mit
einer Dicke in der Größenordnung
von 100 Angstrom bis einige Mikrometer. Die elektrisch leitende
Schicht wird sodann mit einer Schicht aus einem Material überzogen,
das sowohl lichtempfindlich als auch nichtleitend ist. Sobald die
lichtempfindliche, nichtleitende Schicht die elektrisch leitende
Schicht vollständig
bedeckt, wird eine Maske auf die Oberfläche der lichtempfindlichen,
nichtleitenden Schicht aufgebracht. Nachdem die Maske die Schicht
bedeckt, wird sie belichtet, was zu einem Muster aus lösungsmittellöslichen
Abschnitten und lösungsmittelunlöslichen
Abschnitten des lichtempfindlichen Materials führt. Die löslichen Abschnitte werden weggewaschen
und das belichtete elektrisch leitende Material weggeätzt, was
Spuren von Drähten
und Anschlüssen
zu den Drähten
unter dem unlöslichen
Teil des lichtempfindlichen Materials hinterlässt. Das darunter liegende
elektrisch leitende Material stellt Elektrodenverbindungen zu den
Fluidkanälen
und den Reservoirs her. Durch Entfernen eines Teils des unlöslichen
Materials von den Enden oder Anschlüssen der elektrisch leitenden
Spuren, die von der elektrisch leitenden Schicht übrig geblieben
sind, lässt sich
mit den Elektrodenanschlüssen
eine elektrische Verbindung zu den Fluidelementen herstellen. Des weiteren
sind die Elektrodenspuren durch die Schutzbeschichtung vor Verschleiß und Abnutzung geschützt. Wie
für Fachleute
ersichtlich, kann die in dem obigen Herstellungsverfahren verwendete
Maske so gefertigt werden, dass sie eine im wesentlichen unbegrenzte Anzahl
von verschiedenen Elektrodenverbindungen zu der Vorrichtung bereitstellt,
siehe z.B. S. M. Sze, VLSI Technology, Second Edition, McGraw-Hill,
New York, NY (1988).
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Falls
die Vorrichtungen aus Glas gebildet sind, können Standard-Ätzverfahren
verwendet werden, siehe z.B. K. Fluri et al., Anal. Chem., 66: 4285–4290 (1996);
Z. Fan und D. J. Harrison, Anal. Chem., 66: 177–184 (1994).
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Alternativ
ist es möglich,
anstatt die vorstehend allgemein beschriebenen photolithographischen
oder Form- und Gusstechniken zur Herstellung der Vorrichtungen der
vorliegenden Erfindung zu verwenden, andere Herstellungstechniken
einzusetzen, wie verschiedene Arten von Lasertechnologien und/oder
andere Technologien, wie Siebdruck und Aufdampfen, welche die Bereitstellung
extrem kleiner (größenmäßig) und
einer großen
Zahl von Elektroden und Fluidkanälen
ermöglichen,
oder Laminieren oder Extrusionstechniken.
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Im
allgemeinen enthalten die Fluidkanäle ein Trägermedium zum Tragen des Analyten.
Das Medium kann ein organisches Lösungsmittel, eine Pufferlösung, eine
Polymerlösung,
eine mizellare Tensiddispersion oder ein Gel der generell in Verbindung mit
biochemischen Separationstechniken verwendeten Art sein. Bevorzugt
weist das Medium eine geringe Ionenstärke auf, z.B. unterhalb von
ca. 100 mM Salz, noch bevorzugter unterhalb von ca. 10 mM Salz,
und es umfasst ein Lösungmittel
mit einer niedrigen Dielektrizitätskonstante,
z.B. unterhalb von ca. 80. Ein besonders bevorzugtes Medium umfasst
eine wässrige
Lösung
aus verwickelten Polymeren, z.B. Madabhushi et al., US-Patent Nr.
5 567 292.
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Die
in den Vorrichtungen der Erfindung z.B. zum Bewirken des elektrischen
Wechselfeldes verwendeten Elektroden können unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren aus herkömmlichen
Materialien hergestellt werden. Beispielhafte Verfahren zum Herstellen
der Elektroden umfassen Photolithographie, Siebdruck-Techniken und
eine einfache Drahtelektrode. Bevorzugt sind die zur Bildung der
Elektroden verwendeten Materialien elektrisch leitend und chemisch
inert. Besonders bevorzugte Materialien umfassen Gold, Platin, Wolfram
und dergleichen.
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Bevorzugt
weisen die zum Bewirken des elektrischen Wechselfeldes verwendeten
Elektroden eine Form auf, die zum Bilden eines elektrischen Feldes
dient, das in einem einzigen, genau definierten Konzentrationsbereich
mit den erwünschten
Abmessungen resultiert. 4 zeigt mehrere beispielhafte Elektrodengeometrien; 300, 305, 310, 315 und 320. Der
Abstand der Elektroden ist so gewählt, dass ein elektrisches
Feld erzeugt wird, das stark genug ist, einen interessierenden polaren
Analyten einzufangen, aber nicht so stark, dass es eine übermäßige Blasenbildung
an den Elektroden verursacht, siehe z.B. Washizu et al., IEEE Transactions
on Industry Applications, 30 (4): 835–843 (1994). Im allgemeinen beträgt der Abstand
zwischen den Elektroden vorzugsweise zwischen ca. 50 μm und 2 mm.
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Vorzugsweise
ragen die zum Bewirken des elektrischen Wechselfeldes verwendeten
Elektroden nicht in den Translationspfad hinein und kommen auch
nicht anderweitig in direkte physikalische Berührung mit dem Translationspfad.
Vielmehr sind die Elektroden bevorzugt so positioniert, dass das
zwischen den Elektroden erzeugte elektrische Wechselfeld den Translationspfad
kreuzt, die Elektroden selbst jedoch physikalisch von dem Translationspfad entfernt
werden, z.B. durch die Verwendung einer Isolationsschicht oder einer
elektrischen Verbindung durch eine leitende Brücke. Beispielhafte Materialien, die
zum Bilden einer Isolationsschicht brauchbar sind, umfassen SiO2, Al2O3,
Polyimid, Diamant, Glas und dergleichen. Das Isolieren der Elektroden
vom Translationspfad wird bevorzugt, weil es dazu dient, den Grad
einer möglichen
Verschmutzung der Elektroden durch die Analyten oder irgendein anderes
in dem Translationspfad befindliches Material oder einer möglichen
Passivierung der Elektroden aufgrund von Oxidation oder einer anderen
chemischen Transformation der Elektrodenoberfläche zu minieren.
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Die
Einrichtung bzw. die Mittel zum Bewirken eines elektrischen Wechselfeldes
können
irgendeine herkömmliche
Wechselstromversorgung unter Verwendung von herkömmlichen elektrischen Anschlüssen umfassen.
Eine beispielhafte Wechselstromversorgung, die zur Verwendung in
der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist der Funktionsgenerator
der Firma Agilent Technologies, Modell 33120A, 15 MHz-Funktion/Arbiträrer Signalgenerator.
Die Einrichtung zum Bewirken eines elektrischen Wechselfeldes umfasst
ferner die oben beschriebenen Elektroden und elektrischen Verbindungen
zwischen den Elektroden und der Wechselstromversorgung.
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Die
Elektroden können
unter Verwendung irgendeiner aus einer Reihe von herkömmlichen
Techniken hergestellt und in die Vorrichtung der Erfindung integriert
werden. Beispielsweise können
Drahtelektroden mechanisch an der Vorrichtung befestigt werden,
Elektroden können
während
eines Laminierungsschrittes oder eines Gussschrittes in die Vorrichtung
aufgenommen werden, Elektroden können anhand
von Plasmaabscheidung oder elektrochemischen Abscheidungstechniken
auf die Vorrichtung aufgetragen werden.
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Wie
oben erörtert,
umfassen bestimmte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ein Detektionssystem zum Detektieren
eines Analyten während
oder im Anschluss an eine Analyse. Für die vorliegende Erfindung
kann irgendeine Art eines herkömmlichen
Detektionssystems verwendet werden, einschließlich Systeme zum Messen von
Fluoreszenz, Radioaktivität,
optischer Absorption, Fluoreszenzpolarisation, elektrischer Leitfähigkeit, elektrochemischen
Eigenschaften, Brechungsindex und dergleichen. Ein besonders bevorzugtes
Detektionssystem bedient sich der laserangeregten Fluoreszenz.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die Kanäle, Reservoirs oder der Konzentrationsbereich
der mikrofluidischen Vorrichtung unter Verwendung eines Temperiersystems
auf einer kontrollierten Temperatur gehalten. Beispielsweise kann
die Temperierung wünschenswert
sein, um die Wiederholbarkeit einer Analyse zu erhöhen, um
die Eigenschaften eines Mediums oder Analyten zu steuern oder eine
Analyse zu beschleunigen. Ein bevorzugtes Temperiersystem kann ein
Heizelement, z.B. ein Widerstandsheizelement in Kombination mit
einem Ventilator, eine Kühlvorrichtung,
z.B. eine Peltier-Vorrichtung oder eine andere herkömmliche
Kühlvorrichtung,
eine eingeschlossene, thermisch isolierte Kammer, einen oder mehrere
Temperaturmesssensoren und ein programmierbares rückgekoppeltes
Regelsystem umfassen. Bevorzugt ist das Temperiersystem an einen
Computer angeschlossen, zum Steuern und Überwachen des Gesamtsystems.
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Die
Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit Robotersystemen verwendet
werden, zum Automatisieren von bestimmten Schritten eines Prozesses,
z.B. kann ein Roboter verwendet werden zum Betätigen einer Vielzahl mikrofluidischer
Vorrichtungen für
Hochdurchsatzanwendungen mit mehreren Geräten oder zum Einführen eines
Analyten in eine Vorrichtung der Erfindung oder zum Übertragen
eines Mediums in die Vorrichtung oder aus ihr heraus. Bei derartigen
Robotern kann es sich um irgendeine Art von herkömmlichen Laborrobotern handeln,
bevorzugt mit der Fähigkeit,
Flüssigkeiten
zu handhaben, wie z.B. ein Beckman-BioMek-System.
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In
einigen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird ein Computer zum Überwachen oder
Steuern verschiedener Aspekte der Vorrichtung verwendet, darunter:
Steuerung des Betriebs der Komponenten der Vorrichtung, z.B. Netzgeräte, Temperaturregler,
Pumpen, etc.; der mit der Vorrichtung zusammenhängenden Steuersysteme, z.B.
Laborroboter; Überwachung
der Leistung der Vorrichtung, z.B. Messen der elektrischen Feldstärken, Temperaturen
oder Drücke;
Verwalten der Datenerfassungs-, Datenanalyse- und Datenpräsentationsaktivitäten; oder
Bereitstellen einer angemessenen Benutzerschnittstelle für die programmierbare
Bedienung der Vorrichtung. Der Computer der vorliegenden Erfindung
kann irgendeine Art eines herkömmlichen
programmierbaren elektronischen Computers sein, z.B. ein Personalcomputer.
Der Computer kann durch herkömmliche
Vorrichtungen, z.B. einen A/D-Umsetzer, an andere Elemente eines
Systems angeschlossen sein.
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Obwohl
vorstehend nur einige wenige Ausführungsformen detailliert beschrieben
worden sind, wird ein Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der chemischen
Messtechnik ganz klar verstehen, dass bei den bevorzugten Ausführungsformen
etliche Modifikationen möglich
sind, ohne von den Lehren derselben abzuweichen. Sämtliche
derartigen Modifikationen gelten als vom Umfang der folgenden Ansprüche umfasst.