DE60116506T9 - Methoden und reagenzien für molekulares klonieren - Google Patents

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Stewart New York Shuman
Knut R. Carlsbad Madden
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Sloan Kettering Institute for Cancer Research
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen und Verfahren zur Erleichterung der Konstruktion rekombinanter Nukleinsäuremoleküle und insbesondere Zusammensetzungen, die für ein gerichtetes bzw. direktionales Verbinden von zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen nützlich sind, und Verfahren, um solche kovalent verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen.
  • HINTERGRUNDINFORMATIONEN
  • Die Fähigkeit, große Anzahlen von Nukleotidsequenzen zu klonieren, darunter Gensequenzen und offene Leserahmen, ermöglicht, viele Informationen über die Genexpression und ihre Regulierung zu erlangen. Zudem können derartige Sequenzen für das Verständnis der Ätiologie von Krankheitszuständen nützlich sein und im Idealfall Mittel zum Diagnostizieren und Behandeln derartiger Krankheiten liefern. Während es jedoch eine verhältnismäßig einfache Sache ist, große Anzahlen von exprimierten Nukleotidsequenzen zu klonieren, ist es ein schwierigeres Unterfangen, beispielsweise die regulatorischen Elemente, die an der Expression einer solchen Sequenz beteiligt sind, zu charakterisieren und ein durch die Sequenz codiertes Polypeptid richtig zu exprimieren. Insbesondere besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zum Ligieren von Nukleinsäuremolekülen und Klonieren von Nukleinsäuremolekülen, derart, dass ein funktionsfähiges rekombinantes Nukleinsäuremolekül erzeugt wird. Es besteht ein besonderer Bedarf an gerichteten Klonierungsverfahren, wobei ein Insert in einen Vektor kloniert werden kann oder in einer vorgegebenen Orientierung mit einem oder mehreren weiteren Nukleinsäuremolekülen verbunden werden kann.
  • Die Verwendung von Topoisomerasen stellt ein geeignetes Mittel zur Verbesserung von Klonierungs- und Ligierungsverfahren dar. Beispielsweise hat die Verwendung von Topoisomerase, um ein schnelles Ligieren von Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Produkten in einen Vektor auszuführen, herkömmlich aufwändige Klonierungsverfahren auf einen Vorgang von fünf Minuten verkürzt. An sich ist Topoisomerase besonders vorteilhaft für Klonierungsanwendungen mit hohem Durchsatz. Jedoch ist bei der derzeitigen Forderung nach einer Expression offener Leserahmen (ORFs) bei molekularen Klonierungsprozeduren vom Genom-Ausmaß nach wie vor eine bessere Steuerung der Orientierung erforderlich, in welcher zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle derart miteinander verbunden werden, dass funktionsfähige rekombinante Nukleinsäuremoleküle, wie etwa exprimierbare, klonierte Nukleinsäuremoleküle, hergestellt werden können.
  • Eine Expression klonierter offener Leserahmen (ORFs) erfordert, dass das PCR-Produkt in seiner korrekten Orientierung in den Vektor eingefügt wird, so dass sie in Übereinstimmung mit den funktionellen Expressionsdomänen, die sich auf dem Vektor befinden, funktionieren. Im derzeitigen Stand der Technik für die topoisomerase-vermittelte Klonierung werden ORFs mittels PCR unter Verwendung verschiedener DNA-Polymerasen amplifiziert. Üblicherweise wird eine Polymerase benutzt, die keine Korrekturlesefunktion hat und an sich eine inhärente terminale Transferaseaktivität aufweist, wie etwa Taq, und die PCR-Produkte erzeugt, die einen einzigen, nicht von der Matrize abgeleiteten 3'-A-Überhang an jedem Ende enthalten. Diese Amplifikationsprodukte können effizient in topoisomerase-modifizierte Vektoren kloniert werden, die einen einzigen 3'T-Überhang an jedem Ende aufweisen (TOPO TA Cloning® Kit, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Im Vergleich dazu erzeugt eine Polymerase wie etwa Pfu, die an sich eine 3'-zu-5'-Exonuclease-Korrekturlese-Aktivität aufweist, PCR-Produkte mit stumpfen Enden. Topoisomerase-modifizierte Vektoren, die stumpfe Enden aufweisen, stehen für ein Klonieren von PCR-Produkten, die mit Korrekturlese-Polymerasen erzeugt sind, zur Verfügung (Zero Blunt TOPO® PCR Cloning Kit, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Eine Inkubation eines PCR-Produktes und des passenden topoisomerase-modifizierten Vektors führt zu einer Ligation innerhalb von fünf Minuten. Allerdings ist die Orientierung des Inserts, das mit solchen Klonierungsverfahren erzielt wird, zufällig.
  • Da die Orientierung der DNA-Fragmentinsertion in topoisomerase-modifizierte Klonierungsvektoren zufällig ist, müssen die Anwender die Klone einem Screening unterziehen, um jene herauszufinden, die die richtige Orientierung haben. Die Insert-Orientierung kann mit verschiedenen Verfahren bestimmt werden, darunter beispielsweise die Restriktionsenzymanalyse, die in vitro-Transkription von vektorcodierten Promotorelementen und PCR unter Verwendung beispielsweise eines insertspezifischen Primers und eines vektorspezifischen Primers. Wie offensichtlich ist, erfordert jedoch die notwendige Bestimmung der Insert-Orientierung Zeitaufwand und kann die Kosten der Identifizierung eines Nukleinsäuremoleküls von Interesse wesentlich erhöhen, insbesondere, wenn ein Klonierungsverfahren mit hohem Durchsatz angewendet wird. An sich sind die derzeitigen Klonierungsverfahren aus verschiedenen Gründen stark eingeschränkt, insbesondere bei der einen hohen Durchsatz aufweisenden Genexpressionsanalyse, da zahlreiche aufwändige Schritte ausgeführt werden müssen, um Klone mit richtig orientierten Inserts zu selektieren, wobei es erforderlich ist, nicht weniger als acht Kolonien jedes Klons zu prüfen, um eine zu identifizieren, die die richtige Orientierung hat. Folglich besteht ein Bedarf an Verfahren und Reagenzien, die für ein kovalentes Verbinden von zwei oder mehreren Nukleinsäuremolekülen in einer gerichteten Orientierung verwendbar sind. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und sorgt für zusätzliche Vorteile.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Unter einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zum Erzeugen eines gerichtet bzw. direktional verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: das Kontaktieren
    • a) eines topoisomerase-beladenen ersten doppelsträngigen (ds) Nukleinsäuremoleküls, das eine erste Topoisomerase, die kovalent an oder nahe bei einem ersten Ende gebunden ist, und eine zweite Topoisomerase enthält, die kovalent an oder nahe bei einem zweiten Ende gebunden ist, wobei das erste Ende weiters einen 5'-Überhang aufweist und wobei das zweite Ende weiters ein stumpfes Ende, einen 3'-Thymidin-Überhang oder einen zweiten 5'-Überhang aufweist; und
    • b) eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende an seinem 5'-Terminus eine Nukleotidsequenz aufweist, die zum ersten 5'-Überhang komplementär ist, unter solchen Bedingungen, dass die Nukleotidsequenz, die zum ersten 5'-Überhang komplementär ist, selektiv zum ersten 5'-Überhang hybridisieren kann; wobei die erste Topoisomerase kovalent den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbinden kann, und wobei die zweite Topoisomerase den 3'-Terminus des zweiten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann, wobei ein gerichtet bzw. direktional verbundenes Nukleinsäuremolekül erzeugt wird.
  • Die erste und zweite Topoisomerase können gleich sein, beispielsweise zwei Topoisomerasen vom Typ IB, wie etwa zwei Vaccinia-Typ-IB-Topoisomerasen, oder können verschieden sein, einschließlich zweier Typ-IB-Topoisomerasen von verschiedenen Organismen, oder eine Topoisomerase vom Typ IB und eine Topoisomerase vom Typ IA oder eine Topoisomerase vom Typ II.
  • In einer Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung weist das zweite Ende des ersten topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ein stumpfes Ende auf, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist ein stumpfes Ende auf. In einer weiteren Ausführungsform weist das zweite Ende des topoisomerase-beladenen ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 3'-Thymidin-Überhang auf, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist einen 3'-Adenosin-Überhang auf, oder das zweite Ende des topoisomerase-beladenen ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist einen 3'-Uridin- (oder eine modifizierte Form davon, beispielsweise Deoxyuridin) Überhang auf, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist einen 3'-Adenosin-Überhang auf. In noch einer weiteren Ausführungsform weist das topoisomerase-beladene erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül einen zweiten 5'-Überhang an dem zweiten Ende auf, und das zweite Ende der zweiten doppelsträngige Nukleinsäure weist eine Nukleotidsequenz auf, die zu dem zweiten 5'-Überhang komplementär ist.
  • Unter einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet bzw. direktional verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls bereit, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: das Kontaktieren
    • a) eines ersten doppelsträngigen (ds) Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls, das ein erstes Ende, das an dem 5'-Terminus eine erste 5'-Zielsequenz und an dem 3'-Terminus eine Topoisomerase-Erkennungsstelle aufweist, und ein zweites Ende aufweist, das an dem 3'-Terminus eine Topoisomerase-Erkennungsstelle aufweist;
    • b) eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende enthält, wobei das erste stumpfe Ende an dem 5'-Terminus eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der 5'-Zielsequenz komplementär ist; und
    • c) einer Topoisomerase, die für die Topoisomerase-Erkennungsstelle spezifisch ist,
    unter Bedingungen, die Topoisomerase-Aktivität ermöglichen und die eine Hybridisierung der ersten 5'-Zielsequenz und der Nukleotidsequenz, die zu der Zielsequenz komplementär ist, erlauben, wodurch ein gerichtet bzw. direktional verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül erzeugt wird.
  • Das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül, das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül und die Topoisomerase werden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Topoisomeraseaktivität zulassen, d.h. derart, dass die Topoisomerase an die Erkennungsstelle binden und diese spalten kann, um einen topoisomerase-beladenen 3'-Terminus zu erzeugen, und den 3'-Terminus an einen entsprechenden 5'-Terminus ligieren kann. Solche Bedingungen ermöglichen außerdem eine Hybridisierung des Abschnitts der ersten 5'-Zielsequenz, der nach dem Spalten durch die Topoisomerase zurückbleibt, und der 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, wobei die 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes komplementär zu diesem Abschnitt der 5'-Zielsequenz ist.
  • In einer Ausführungsform des zweiten Aspekts der Erfindung wird das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls ein stumpfes Ende nach dem Spalten durch die Topoisomerase, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ist ein stumpfes Ende. In einer weiteren Ausführungsform weist das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls eine 3'-Thymidin-Verlängerung nach dem Spalten durch die Topoisomerase auf, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist einen 3'-Adenosin- oder 3'-Uridin-Überhang, beispielsweise einen Deoxyuridin-Überhang, auf. In noch einer weiteren Ausführungsform weist das erste doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremolekül eine zweite 5'-Zielsequenz an dem zweiten Ende auf, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist eine 5'-Nukleotidsequenz auf, die zu der zweiten 5'-Zielsequenz komplementär ist.
  • Gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der Erfindung kann das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein Vektor sein, wie z.B. ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. Wo der Vektor im Allgemeinen in einer Ringform zur Verfügung steht, kann er durch die Wirkung der Topoisomerase linearisiert werden, oder er kann linearisiert werden, indem beispielsweise ein oder zwei Restriktionsendonucleasen eingebunden werden, die den Vektor linearisieren, so dass bei Kontakt mit der Topoisomerase das erste und zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gemäß einem Verfahren der Erfindung gerichtet bzw. direktional verbunden werden können. Ein Verfahren gemäß dem ersten und zweiten Aspekt der Erfindung kann weiters das Einbringen des gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle einschließen, die eine prokaryotische Zelle sein kann, wie etwa ein Bakterium, oder eine eukaryotische Zelle, wie etwa eine Säugetierzelle. Folglich kann eine Zelle erhalten werden, die solch ein gerichtet bzw. direktional verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül enthält, und aus solch einer Zelle kann ein transgener, nicht menschlicher Organismus erzeugt werden.
  • Das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann ein oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 usw.) Expressionsregulationselemente aufweisen, die funktionsfähig miteinander verbunden sein können, und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann einen offenen Leserahmen aufweisen, wobei das Expressionsregulationselement mit dem offenen Leserahmen in dem gerichtet bzw. direktional verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung hergestellt ist, funktionsfähig verbunden ist. Das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann ein Amplifikationsprodukt aufweisen, und die Topoisomerase kann eine Typ-IB-Topoisomerase sein. Das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann eines aus einer Vielzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen aufweisen, die sich voneinander unterscheiden können. Die Vielzahl der zweiten doppelsträngigen Nukleotidmoleküle kann eine cDNA-Bibliothek oder eine kombinatorische Bibliothek aufweisen.
  • Gemäß einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet bzw. direktional verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren Folgendes aufweist: das Kontaktieren
    • a) eines topoisomerase-beladenen ersten doppelsträngigen (ds) Nukleinsäuremoleküls, das eine erste Topoisomerase aufweist, die kovalent an den 3'-Terminus eines ersten Endes des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebunden ist, wobei das erste Ende weiters einen ersten 5'-Überhang aufweist; und
    • b) eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende eine 5' Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang komplementär ist, unter solchen Bedingungen, dass die 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes selektiv mit dem ersten 5'-Überhang hybridisieren kann, wobei die erste Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann.
  • Das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann wirkungsmäßig mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden sein. Das erste doppelsträngige Molekül kann ein Expressionsregulationselement aufweisen, und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann einen offenen Leserahmen aufweisen.
  • Ein Verfahren des dritten Aspekts kann weiters ein Kontaktieren des topoisomerase-beladenen ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül aufweisen, wobei ein erstes Ende des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 5'-Überhang und eine zweite Topoisomerase aufweist, die kovalent an dem 3'-Terminus gebunden ist, und wobei das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül weiters ein zweites stumpfes Ende enthält, das eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem zweiten 5'-Überhang komplementär ist, und wobei das Kontaktieren unter solchen Bedingungen erfolgt, dass die 5'-Nukleotidsequenz des zweiten stumpfen Endes der zweiten doppelsträngigen Nukleinsäure selektiv mit dem 5'-Überhang des ersten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, wobei die zweite Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann. In gleicher Weise kann das Verfahren angewendet werden, um ein viertes, fünftes, sechstes oder weiteres doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül gerichtet oder ungerichtet anzubinden, wobei die Enden solcher doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle wie hier beispielhaft angegeben gewählt sind. Die erste und zweite (oder weitere) Topoisomerase können gleich oder verschieden sein, und auf Wunsch kann das erste oder dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül, statt topoisomerase-beladen zu sein, eine Topoisomerase-Erkennungsstelle enthalten, wobei das Verfahren weiters das Inkontaktbringen der Reaktionspartner mit einer Topoisomerase einschließen kann.
  • Ein Verfahren der Erfindung kann simultan oder sequenziell ausgeführt werden. Ein Verfahren der Erfindung kann sequenziell ausgeführt werden, beispielsweise derart, dass das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet verbunden wird und danach, z.B. zu einem späteren Zeitpunkt oder in einem anderen Reaktionsgefäß, das dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit dem zweitem doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet verbunden wird. Alternativ kann das Verfahren simultan ausgeführt werden, wobei alle Reaktionspartner gleichzeitig einbezogen werden.
  • Verfahren der Erfindung sind besonders zweckmäßig, um zwei oder mehrere (z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 usw.) doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle funktionsfähig zu verbinden, eingeschlossen dabei ist beispielsweise ein funktionsfähiges Verbinden eines Expressionsregulationselements mit einem offenen Leserahmen oder ein funktionsfähiges Verbinden eines ersten und zweiten offenen Leserahmens, um ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das ein Fusionsprotein codiert, das weiters mit einem oder mehreren Expressionsregulationselementen funktionsfähig verbunden sein kann. Beispielsweise kann bei der Anwendung eines Verfahrens der Erfindung ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül ein Expressionsregulationselement enthalten, ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül kann einen offenen Leserahmen codieren und ein drittes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül kann ein Peptid codieren, wobei in dem gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremolekül das Expressionsregulationselement mit dem offenen Leserahmen funktionsfähig verbunden ist und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit dem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül funktionsfähig verbunden ist, und wobei das erste und dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül, die funktionsfähig verbunden sind, ein Fusionsprotein codieren, das den offenen Leserahmen und das Peptid aufweist. Das Peptid kann irgendein Peptid oder Polypeptid einschließlich eines Genproduktes oder eines weiteren offenen Leserahmens, einem Tag (z.B. einem Affinitätstag), eines detektierbaren Markers und/oder dergleichen sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, die Folgendes aufweist: a) ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine Topoisomerase aufweist, die an dem 3'-Terminus kovalent gebunden ist; und b) ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende eine erste 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, und eine erste 3'-Nukleotidsequenz, die zu der ersten 5'-Nukleotidsequenz komplementär ist. Bei einer solchen Zusammensetzung kann die erste 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem ersten 5'-Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls hybridisiert werden, und die erste 3'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verdrängt wird. Das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in solch einer Zusammensetzung kann weiters einen zweiten 5'-Überhang an dem zweiten Ende aufweisen, wobei das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weiters eine zweite 5'-Nukleotidsequenz, die zu dem zweiten 5'-Überhang komplementär ist, und eine zweite 3'-Nukleotidsequenz, die zu der zweiten 5'-Nukleotidsequenz komplementär ist, aufweisen kann.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Sätze, die ein oder mehrere Reagenzien enthalten, die für das gerichtete bzw. direktionale Verbinden von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen nützlich sind. In einer Ausführungsform enthält ein Satz der Erfindung ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine erste Topoisomerase, die kovalent an dem 3'-Terminus gebunden ist, aufweist, und das zweite Ende eine zweite Topoisomerase, die kovalent an dem 3'-Terminus gebunden ist, enthält und einen zweiten 5'-Überhang, ein stumpfes Ende oder einen 3'-Thymidin-Überhang aufweist, wobei der erste 5'-Überhang von dem zweiten 5'-Überhang verschieden ist. Die Topoisomerasen können gleich oder verschieden sein, und das doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann ein Vektor sein und kann ein Expressionsregulationselement enthalten.
  • Folglich schafft die vorliegende Erfindung unter einem vierten Aspekt ein Satz, der Folgendes aufweist:
    • a) ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine erste Topoisomerase aufweist, die kovalent an einem 3'-Terminus eines ersten Endes gebunden ist, und eine zweite Topoisomerase, die kovalent an einem 3'-Terminus eines zweiten Endes gebunden ist, wobei das erste Ende weiters einen ersten 5'-Überhang aufweist und das zweite Ende weiters ein stumpfes Ende, einen 3'-Thymidin-Überhang oder einen zweiten 5'-Überhang aufweist, wobei der erste 5'-Überhang, falls vorhanden, von dem zweiten 5'-Überhang verschieden ist; und
    • b) eine Vielzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, wobei jedes doppelsträngige Nukleinsäuremolekül der Vielzahl ein erstes stumpfes Ende aufweist und wobei das erste stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist. Die zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle aus der Mehrzahl können transkriptionsregulierende Elemente, translationsregulierende Elemente oder eine Kombination davon aufweisen und/oder können Nukleotidsequenzen aufweisen, die ein Peptid codieren, wie etwa ein Peptid-Tag, eine Zellkompartimentierungsdomäne und dergleichen.
  • Ein Satz der Erfindung kann ein oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 usw.) topoisomerase-beladene doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle enthalten, die bei der Erfindung verwendbar sind, beispielsweise einen oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 usw.) topoisomerase-beladene Vektoren, ein oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 usw.) doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremoleküle, die mit einer Topoisomerase in Kontakt gebracht werden können, um ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das bei der Erfindung verwendbar ist, oder eine Kombination davon. Außerdem kann der Satz Folgendes enthalten: einen oder mehrere Primer oder Primerpaare, um beispielsweise mit einer Amplifikationsreaktion ein oder mehrere zweite doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle herzustellen; ein oder mehrere doppelsträngige Kontroll-Nukleinsäuremoleküle, um die Komponenten des Satzes zu testen oder zu standardisieren; eine oder mehrere Zellen, wobei es sich beispielsweise um kompetente Zellen handeln kann, in die ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung hergestellt ist, eingebracht werden kann; einen oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 usw.) Reaktionspuffer zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung; Anweisungen zur Durchführung des Verfahrens und dergleichen.
  • Ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet oder ungerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls kann unter Verwendung eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem einzelsträngigen Überhang und einer Topoisomerasestelle oder einer daran gebundenen Topoisomerase ausgeführt werden. Es kann ein drittes Nukleinsäuremolekül einbezogen werden. Es können einzigartige Überhangsequenzen für die verschiedenen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, die verbunden werden sollen, hergestellt werden, wobei diese einzigartige Überhänge aufweisen sollen, damit die Nukleinsäuremoleküle gerichtet und in einer gewünschten Reihenfolge verbunden werden können. In ähnlicher Weise kann das Verfahren angewendet werden, um eine beliebige Anzahl von Nukleinsäuremolekülen zu verbinden, eingeschlossen ist dabei eine gerichtete Verbindung zweier oder mehrerer der Anzahl von Nukleinsäuremolekülen. Da in bestimmten Ausführungsformen ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül einbezogen wird, das ein Expressionsregulationselement enthält, kann eine dritte (oder weitere) doppelsträngige Nukleotidsequenz außerdem ein, zwei oder mehrere Expressionsregulationselemente oder weitere Sequenzen, die von Interesse sind, aufweisen.
  • Es kann ein Verfahren für die gerichtete bzw. direktionale Insertion von DNA-Fragmenten in Klonierungs- oder Expressionsvektoren mit der Leichtigkeit und Effizienz des topoisomerase-vermittelten Klonierens geschaffen werden. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber derzeitigen Klonierungssystemen, da es das aufwendige Screening-Verfahren, das notwendig ist, um klonierte Inserts in der gewünschten Orientierung zu identifizieren, reduziert. Das Verfahren kann einen linearisierten Expressionsvektor benutzen, der ein einziges Topoisomerasemolekül aufweist, das an beiden 3'-Enden kovalent angelagert ist. Ein erstes Ende des linearisierten Vektors kann außerdem einen einzelsträngigen 5'-Überhang enthalten, und das zweite Ende kann entweder stumpf sein, kann eine einzige 3'-Thymidin-Verlängerung für eine T/A-Klonierung aufweisen oder kann selbst eine zweite einzelsträngige 5'-Überhangsequenz enthalten. Die einzelsträngigen Überhangsequenzen können beliebige geeignete oder gewünschte Sequenzen sein.
  • Eine Konstruktion eines topoisomerase-beladenen Klonierungsvektors kann durch Endonucleaseverdauung des Vektors, gefolgt von einem komplementären Annealing synthetischer Oligonukleotide und einer ortsspezifischen Spaltung des Heteroduplex durch Vaccinia-Topoisomerase I erreicht werden. Ein Verdauen eines Vektors mit einer kompatiblen Endonuclease bringt spezifische klebrige Enden hervor. An diesen klebrigen Enden lässt man maßgeschneiderte Oligonukleotide reassoziieren, wobei sie Sequenzen aufweisen, die nach einer Modifikation mit Topoisomerase I maßgeschneiderte Enden des Vektors bilden. Die Sequenz und die Länge des einzelsträngigen Überhangs werden je nach den Wünschen des Anwenders verschieden sein.
  • Bei einer bevorzugten Anwendung der einzelstrangsequenz-topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäurevektoren, die durch die vorliegende Erfindung geschaffen werden, ist das DNA-Fragment, das in den Vektor einzufügen ist, ein Amplifikationsreaktionsprodukt, wie etwa ein PCR-Produkt. Im Anschluss an eine PCR-Amplifikation mit maßgeschneiderten Primern kann das Produkt direktional bzw. gerichtet in einen topoisomerase-I-beladenen Klonierungsvektor eingefügt werden, der eine Einzelstrangsequenz an einem Ende oder an beiden Enden der Insertionsstelle aufweist. Die maßgeschneiderten Primer können so konstruiert sein, dass mindestens ein Primer eines bestimmten Primerpaares eine zusätzliche Sequenz an seinem 5'-Ende aufweist. Die zusätzliche Sequenz ist so aufgebaut, dass sie komplementär zur Sequenz des einzelsträngigen Überhangs in dem Vektor ist. Die Komplementarität des 5'-Einzelstrang-Überhangs in dem Vektor und des 5'-Endes des PCR-Produktes vermittelt die gerichtete Insertion des PCR-Produktes in den topoisomerase-vermittelten Vektor. Speziell ist, da nur ein Ende des Vektors und ein Ende des PCR- Produktes komplementäre einzelsträngige Sequenzbereiche aufweisen, die Insertion des Produktes in diesem Fall gerichtet, und die Topoisomerase kann die Ligation des PCR-Produktes an den Vektor katalysieren.
  • Folglich schafft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zum gerichteten bzw. direktionalen kovalenten Verbinden zweier oder mehrerer (z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw.) doppelsträngiger ("ds") Nukleinsäuremoleküle. Die Nukleinsäuremoleküle, die gemäß der Erfindung verwendet werden, weisen vorzugsweise ein erstes Ende und ein zweites Ende auf. Das erste und/oder zweite Ende derartiger Moleküle hat vorzugsweise eine 5'- und/oder 3'-Verlängerung oder Überhang. Folglich kann ein Ende oder können beide Enden der Nukleinsäuremoleküle, die bei der Erfindung benutzt werden, einen 3'- und/oder 5'-Überhang aufweisen. Die Überhangsequenzen an beiden Enden des Moleküls können gleich oder verschieden sein, wobei sie gleichen oder verschiedenen Typs sein können (z.B. 3'- oder 5'-Überhang). Außerdem kann, während ein Ende des Nukleinsäuremoleküls eine 3'-Verlängerung und eine 5'-Verlängerung aufweisen kann, auch das andere Ende des Moleküls eine Verlängerung aufweisen, muss dies jedoch nicht. In mancher Hinsicht kann ein Ende des Nukleinsäuremoleküls einen 3'-Überhang oder einen 5'-Überhang aufweisen, während das andere Ende stumpf endend sein kann (d.h. dass es keinen Überhang aufweist). Gemäß der Erfindung können die 3'- und/oder 5'-Verlängerungssequenzen (d.h. Überhänge) an jedem Terminus von beliebiger Länge (d.h. von beliebiger Anzahl von Nukleotiden) sein und eine beliebige Sequenz aufweisen. Folglich betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die einen einzigen Nukleotid-Überhang oder mehrere Nukleotid-Überhänge aufweisen. Unter bestimmten Aspekten können die Nukleinsäuremoleküle und ihre Termini modifizierte oder markierte Nukleotide enthalten. Bei der Anwendung der Erfindung können Topoisomerasen (einschließlich der Typen IA, IB, II usw.) benutzt werden, die in der Lage sind, Nukleinsäuremoleküle zu fusionieren, zu verbinden oder zu ligieren. Folglich können zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle, die gleich oder verschieden sein können, unter Verwendung derartiger Topoisomerasen gerichtet verbunden werden.
  • Bei den Verfahren der Erfindung kann der 3'- oder 5'-Überhang eines Terminus des ersten Nukleinsäuremoleküls Homologie (oder ist komplementär dazu) zumindest einer Sequenz am oder in der Nähe des Terminus von zumindest einem zweiten Nukleinsäuremoleküls aufweisen. Folglich ermöglicht die Erfindung durch Basenpaarung oder Hybridisierung des 3'- oder 5'-Überhangs oder Verlängerung, mit der homologen oder komplementären Sequenz des zweiten Moleküls eine gerichtete bzw. direktionale Assoziation oder Verbindung von zwei verschiedenen Molekülen. Unter einem bevorzugten Aspekt kann der 3'- oder 5'-Überhang eines Terminus mindestes eines ersten Moleküls bei einer Stranginvasion in Eingriff gelangen, da er mit seiner komplementären Sequenz am oder in der Nähe des Terminus des zweiten Moleküls assoziiert oder hybridisiert. Unter einem Aspekt ermöglicht ein solches Stranginvasionsereignis dem 3'- oder 5'-Überhang, mit einem gewünschten Ende des Partnermoleküls in gerichteter Weise zu assoziieren. Durch entsprechendes Gestalten der Überhänge und der Termini der zu verbindenden Moleküle, können zwei oder mehr Partnermoleküle in Gegenwart einer oder mehrerer Topoisomerasen gemäß der Erfindung verbunden werden. Folglich schafft die Erfindung Verfahren zum Verbinden von zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen (z.B. doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen), die mit einem kovalenten Binden mindestens eines Strangs eines Moleküls an mindestens einen Strang eines anderen Moleküls einhergehen. Die Erfindung schafft weiters Zusammensetzungen für eine Herstellung von durch Verfahren der Erfindung verbundenen Nukleinsäuremolekülen und durch Verfahren der Erfindung erzeugte Zusammensetzungen.
  • Verfahren der Erfindung werden durch die hier beschriebenen Methoden erläutert, die mit der kovalenten Verbindung von Strängen verschiedener Nukleinsäuremoleküle, katalysiert durch Topoisomerase, einhergehen. Ein isoliertes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül kann ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweisen, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine erste Topoisomerase, die kovalent am 3'-Terminus gebunden ist, aufweist, und das zweite Ende eine zweite Topoisomerase, die kovalent am 3'-Terminus gebunden ist, enthält und einen zweiten 5'-Überhang, ein stumpfes Ende oder einen 3'-Thymidin-Überhang aufweist, wobei der erste 5'-Überhang von dem zweiten 5'-Überhang verschieden ist. Die erste Topoisomerase und die zweite Topoisomerase können gleich oder verschieden sein. Der erste 5'-Überhang kann jede Nukleotidsequenz aufweisen, die beispielsweise die Nukleotidsequenz 5-GGTG-3' einschließt.
  • Das doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann ein Vektor sein, der ein linearer Vektor, wie etwa ein Lambda-Vektor, oder ein linearisierter Vektor, wie etwa ein linearisiertes Plasmid, ist. Der Vektor kann ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein und kann beispielsweise eine oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6 usw.) Rekombinase-Erkennungsstellen, wie etwa eine oder mehrere lox-Stellen oder eine oder mehrere att-Stellen, ein oder mehrere transkriptionsregulierende Elemente, ein oder mehrere translationsregulierende Elemente, eine oder mehrere Nukleotidsequenzen, die ein Peptid von Interesse codieren, wie etwa einen oder mehrere selektierbare Marker oder eine oder mehrere Tags oder Kombinationen davon, enthalten. Beispielsweise kann der Vektor ein pUni/V5-His-Vektor, Version A (SEQ ID Nr:16) oder ein pCR®2.1-Vektor (SEQ ID Nr:17) sein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum gerichteten oder ungerichteten Verbinden von zwei, drei, vier oder mehr Nukleinsäuremolekülen, einschließlich, auf Wunsch, eines funktionsfähigen Verbindens von zwei oder mehreren Nukleinsäuremolekülen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1A bis 1B zeigen eine Anzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, die benutzt werden können, um verschiedene Aspekte der Erfindung anzuwenden. Die Kreis- und Kästchenflächen, die in diesen Darstellungen gezeigt sind, geben Regionen an, die eine Nukleotidsequenz-Komplementarität aufweisen, die ausreicht, um bei einer Stranginvasion miteinander in Eingriff zu gelangen.
  • 1A zeigt zwei doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle (als "erstes" und "zweites" Molekül bezeichnet), die jeweils einen Terminus aufweisen, der in der Lage ist, bei einer Stranginvasion mit einem Terminus des zweiten Moleküls (siehe Kästchen) in Eingriff zu gelangen. Wenn eine Topoisomerase benutzt wird, um Stränge jedes Moleküls kovalent zu verbinden (z.B. zu ligieren), wird im Allgemeinen der zurückgesetzte 3'-Strang des Terminus des ersten Moleküls mit Topoisomerase beladen. Weiters wird diese Topoisomerase im Allgemeinen die kovalente Bindung des zurückgesetzten 3'-Strangs des Terminus des ersten Moleküls an den 5'-Strang des zweiten Moleküls, mit dem es bei einer Stranginvasion in Eingriff gelangt (d.h. dem 5'-Terminus des zweiten Nukleinsäuremoleküls, das in dem Kästchen gezeigt ist), katalysieren.
  • 1B zeigt zwei doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle (als "erstes" und "zweites" Molekül bezeichnet), wovon jedes zwei Termini aufweist, die in der Lage sind, bei einer Stranginvasion mit Termini des anderen Moleküls in Eingriff zu gelangen. Weiters hat jedes dieser zwei Nukleinsäuremoleküle einen stumpfen Terminus und einen Terminus mit einem einzelsträngigen 5'-Überhang (siehe Kreise und Kästchen). Die Nukleinsäuremoleküle in dieser Darstellung können folglich bei zwei verschiedenen Stranginvasionsereignissen in Eingriff gelangen, die auf Grund der kovalenten Bindung der Nukleinsäurestränge an jedem Terminus zur Bildung eines einzigen, ringförmigen Nukleinsäuremoleküls führen. Die kovalente Verbindung der Termini kann beispielsweise wie oben für 1A beschrieben erfolgen.
  • 1C zeigt zwei doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle (als "erstes" und "zweites" Molekül bezeichnet), wovon jedes zwei Termini aufweist, die in der Lage sind, bei einer Stranginvasion mit verschiedenen Termini des anderen Moleküls in Eingriff zu gelangen. Weiters weist eines dieser Moleküle zwei stumpfe Termini auf, und das andere Molekül weist einzelsträngige 5'-Überhänge an jedem Terminus auf. Die Moleküle in dieser Darstellung können folglich bei zwei separaten Stranginvasionsereignissen in Eingriff gelangen, die auf Grund der kovalenten Bindung des Nukleinsäurestrangs an jedem Terminus zur Bildung eines ringförmigen Nukleinsäuremoleküls führen. Die kovalente Verbindung der Termini kann beispielsweise wie oben für 1A beschrieben erfolgen.
  • 1D zeigt drei doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle (als "erstes", "zweites" und "drittes" Molekül bezeichnet). Zwei dieser Moleküle (das "erste" und das "dritte" Molekül) enthalten einzelsträngige 5'-Überhänge, die in der Lage sind, bei einer Stranginvasion mit verschiedenen stumpfen Termini des anderen Moleküls ("zweiten" Moleküls) in Eingriff zu gelangen. Die Moleküle in dieser Darstellung können folglich bei zwei separaten Stranginvasionsereignissen in Eingriff gelangen, was zur Erzeugung eines linearen Nukleinsäuremoleküls führt, das aus allen drei Molekülen gebildet ist. Die kovalente Verbindung der Termini kann beispielsweise wie oben für 1A beschrieben durchgeführt werden.
  • 1E zeigt Nukleinsäuremoleküle, die den oben in 1D dargestellten ungefähr gleich sind, nur dass eines der Nukleinsäuremoleküle (das "zweite" Molekül) 5'-Überhänge an beiden Termini aufweist und die zwei anderen Nukleinsäuremoleküle (das "erste" und "zweite" Molekül) jeweils zwei stumpfe Termini aufweisen.
  • 2 veranschaulicht einen Aspekt der Erfindung, der mit einer Stranginvasion eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem im Wesentlichen stumpfen Ende, das eine Topoisomerase an einem 3'-Terminus eines ersten Strangs, der einen 5'-Schwanz stromaufwärts einer Topoisomerase-Erkennungsstelle enthält, aufweist, und eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das einen zu dem 5'-Schwanz komplementären 3'-Überhang aufweist, einhergeht (siehe Cheng und Shuman, Mol. Cell. Biol. 20: 8059–8068, 2000). Die Kästchenflächen, die in diesen Darstellungen gezeigt sind, geben Regionen an, die eine Nukleotidsequenz-Komplementarität aufweisen, die ausreicht, um bei einer Stranginvasion miteinander in Eingriff zu gelangen.
  • 3 liefert die Nukleotidsequenz und den Ort der Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenzen der Mehrfachklonierungsstelle von pUni/V5-His, Version A (SEQ ID Nr:18) sowie eine Plasmid-Kartierung dieses 2,3 kb-Vektors. Eine EcoRI-Klonierungsstelle befindet sich bei dem Nukleotid 471, und eine SacI-Klonierungsstelle befindet sich bei dem Nukleotid 528.
  • 4 liefert die Nukleotidsequenz und die Stelle der Restriktionsendonuclease-Erkennungssequenzen der Mehrfachklonierungsstelle von pCR2.1 und eine Plasmid-Kartierung dieses Vektors. Eine HindIII-Klonierungsstelle befindet sich bei dem Nukleotid 234, SpeI ist bei dem Nukleotid 258 und EcoRI ist bei den Nukleotiden 283 und 299. Der Vektor weist 3906 Nukleotide auf. LacZ-Alpha-Fragment: Basen 1–587; M13-Reverse Priming-Stelle: Basen 205–221; Mehrfachklonierungsstelle: Basen 234–355; T7-Promotor-/Priming-Stelle: Basen 362–381; M13-Forward (–20)-Priming-Stelle: Basen 389–404; M13-Forward (–40)-Priming-Stelle: Basen 408–424; f1-Origin: Basen 546–960; Kanamycin-Resistenz-ORF: Basen 1294–2088; Ampicillin-Resistenz-ORF: Basen 2106–2966; Co1E1-Ursprung: Basen 3111–3784. Der dargestellte Vektor stellt den pCR®2.1-Vektor mit einem durch TA Cloning® eingefügten PCR-Produkt dar. Es ist zu beachten, dass das eingefügte PCR-Produkt an jeder Seite von EcoRI-Stellen flankiert ist. Der Pfeil gibt den Start der Transkription für die T7-RNA-Polymerase an.
  • 5 liefert die Nukleotidsequenz des Vektors pUni/V5-His Version A (SEQ ID Nr:16).
  • 6 veranschaulicht die Verdauung von pUni/V5-His, Version A, mit EcoRI und SacI sowie die resultierenden kohäsiven Endsequenzen. Das resultierende kohäsive Ende auf der linken Seite der Figur, nahe dem loxP-Element ist das kohäsive Ende, das sich nach einer EcoRI-Verdauung ergibt. Das resultierende kohäsive Ende auf der rechten Seite der Figur, nahe dem V5-Element ist das resultierende kohäsive Ende nach SacI-Verdauung. Es sind sowohl Vektorelemente, einschließlich des loxP-, V5- und 6XHis-Elements, als auch ein Stoppcodon im Rahmen mit diesen Elementen angegeben.
  • 7 veranschaulicht das Hinzufügen von Adapter-Oligonukleotiden zu dem verdauten Vektor in Gegenwart von DNA-Ligase. Die Reaktion liefert den gezeigten linearisierten, angepassten Vektor. Zur Abgrenzung sind die Adaptersequenzen unterstrichen. Die vier Adapter-Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen:
    TOPO D1: 5'-AATTGATCCCTTCACCGACATAGTACAG-3' (SEQ ID Nr:5)
    TOPO D2: 3'-CTAGGGAAGTGG-5' (SEQ ID Nr:6)
    TOPO D3: 3'-GACATGATACAGTTCCCGC-5' (SEQ ID Nr:8)
    TOPO D4: 5'-AAGGGCGAGCT-3' (SEQ ID Nr:7)
  • Die T4-Ligationsreaktion wird den angegebenen linearisierten Klonierungsvektor liefern; zur Abgrenzung sind die Adaptersequenzen unterstrichen.
  • 8 veranschaulicht eine Topoisomerase-Spaltungsreaktion, wobei nach der Topoisomerase-Spaltung des leicht spaltbaren Strangs eine Phosphatbindung in dem nicht spaltbaren Strang die Abgangsgruppe mit dem Vektor assoziiert hält. Bei der gezeigten Reaktion wird Topoisomerase zu dem gezeigten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül hinzugefügt. Die Topoisomerase bindet CCCTT und bricht die benachbarte Phosphodiesterbindung auf. Phosphodiesterbindungen zwischen dem angepassten Vektor und dem Annealing-Oligo in dem nicht spaltbaren Strang verhindern das Abtrennen der Abgangsgruppe nach der Spaltung. In dem gezeigten doppelsträngigen DNA-Modell stellen X und x komplementäre Nukleotidbasen dar.
  • 9 veranschaulicht eine Topoisomerase-Spaltungsreaktion, wobei nach der Topoisomerase-Spaltung des leicht spaltbaren Strangs das Fehlen einer Phosphatbindung in dem nicht spaltbaren Strang ermöglicht, dass sich die Abgangsgruppe von dem Vektor trennt. Bei der gezeigten Reaktion wird Topoisomerase zu dem gezeigten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül hinzugefügt. Die Topoisomerase bindet CCCTT und bricht die benachbarte Phosphodiesterbindung auf. Das Fehlen einer Phosphodiesterbindung zwischen dem angepassten Vektor und dem Annealing-Oligo in dem nicht spaltbaren Strang ermöglicht das Abtrennen der Abgangsgruppe nach der Spaltung. In dem gezeigten doppelsträngigen DNA-Modell stellen X und x komplementäre Nukleotidbasen dar.
  • 10 veranschaulicht, dass das Hinzufügen eines Annealing-Oligonukleotids zu dem linearisierten, angepassten Vektor in Abwesenheit von DNA-Ligase den gezeigten linearisierten, angepassten und wieder verbundenen Vektor hervorbringt. Es ist zu beachten, dass das Annealing-Oligonukleotid nicht durch eine Phosphatbindung an den Vektor gebunden ist und folglich eine Abtrennung nach der topoisomerase-vermittelten Spaltung ermöglicht. Adapter-Oligonukleotide sind durch einen einzigen Unterstrich abgegrenzt, während Annealing-Oligonukleotide durch einen doppelten Unterstrich abgegrenzt sind. Es gibt keine Phosphodiesterbindungen zwischen jeder der TOPO D3s und ihren benachbarten Oligonukleotiden TOPO D2 und TOPO D5. Das Annealing-Oligonukleotid hat die folgende Sequenz und ist sowohl zu dem TOPO D1-Einzelstrangüberhang als auch zu dem TOPO D4-Einzelstrangüberhang komplementär:
    TOPO D3 3'-CTGTATCATGTCAAC-5' (SEQ ID Nr:10).
  • 11 zeigt ein Beispiel eines linearisierten topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektor, der bei der Erfindung nützlich ist. Der einzelsträngige Überhang entspricht einer Kozak-Transkriptionssequenz. Der gezeigte Vektor ist ein so genannter linearisierter TOPO Flap-Klonierungsvektor, ein modifizierter pUni/His, Version A.
  • 12 ist die Nukleotidsequenz des Vektors pCR2.1-Sequenz (SEQ ID Nr:17).
  • 13A und 13B zeigen Formen des pCR2.1®-Vektors.
  • 13A zeigt pCR2.1® nach einer Restriktionsverdauung mit EcoRI und HindIII (es sind die sich ergebenden klebrigen Enden zu beachten). Vier Adapter-Oglionukleotide wurden an den linearisierten Vektor ligiert. Die TOPO-Bindungsstellen an den Oligonukleotiden haben die Sequenz CCCTT (unterstrichen). Die zu den klebrigen Enden komplementären Basen sind fett dargestellt. Die vier Adapter-Oligonukleotide hatten die folgenden Sequenzen:
    TOPO H: 5'-AGCTCGCCCTTATTCCGATAGTG-3' (SEQ ID Nr:11);
    TOPO 16: 3'-GCGGGAATAAG (SEQ ID Nr:12);
    TOPO 1: 5'-AATTCGCCCTTATTCCGATAGTG-3' (SEQ ID Nr:13); und
    TOPO 2: 3'-GCGGGAA-5'
  • TOPO H und TOPO 1 haben 5'-Enden, die das klebrige HindIII- bzw. EcoRI-Ende ergänzen.
  • 13B zeigt die angepasste Version des pCR2.1® nach einer Inkubation mit Adapter-Oligos in Gegenwart von T4-Ligase.
  • 14 veranschaulicht das Hinzufügen von Annealing-Oligonukleotiden zu dem angepassten pCR2.1®-Vektor, gefolgt von dem Binden von Topoisomerase I und der topoisomerase-vermittelten Spaltung des doppelsträngigen Vektors. Der resultierende Vektor ist linear und an beiden Enden mit Topoisomerase I beladen. Außerdem hat ein Ende des Vektors die maßgeschneiderte, 4 bp Einzelstrangsequenz, während das andere Ende stumpf ist. Bei der gezeigten Startreaktion bindet die Topoisomerase und spaltet die doppelsträngige DNA am 5'-Ende der kovalenten Bindungsstelle, die sich nahe den Enden des pCR2.1® befindet, der die gebundenen Adapter- und Annealing-Oligonukleotide enthält. Dieser Schritt wird in Gegenwart von T4-Polynukleotidkinase ausgeführt. Die Annealing-Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen:
    TOPO 3: 3'-TAAGGCTATCACAAC-5' (SEQ ID Nr:15); und
    TOPO 17: 3'-GCTATCAC-5'
  • Es gibt keine zwischen TOPO 3 und TOPO 2 oder zwischen TOPO 17 und TOPO 16 ausgebildeten Phosphodiesterbindungen. Die Annealing-Oligonukleotide sind zur Abgrenzung doppelt unterstrichen.
  • 15 veranschaulicht ein zweites Beispiel eines linearisierten, topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektors, der bei der vorliegenden Erfindung nützlich ist. In diesem Beispiel ist die einzelsträngige Überhangsequenz 3'-TAAG-5'. Dieser Vektor ist der linearisierte, TOPO-beladene FLAP-Vektor, ein modifizierter pCR2.1®.
  • 16 veranschaulicht eine PCR-Amplifikation eines betreffenden Gens unter Verwendung von Primern, die für ein gerichtetes Klonieren ausgelegt sind. Das resultierende Produkt besitzt den einzelsträngigen Überhang, der für ein gerichtetes Klonieren unter Verwendung eines bei der Erfindung nützlichen Vektors erforderlich ist. Der in der oberen Darstellung gezeigte Primer CACC ist zu dem codierenden Strang des betreffenden Gens homolog und hat die "FLAP"-Sequenz an sein 5'-Ende angefügt. Eine Standard PCR-Amplifikation des betreffenden Gens in der Gegenwart der entsprechenden Primer, einschließlich des CACC enthaltenden Primers, ergibt das in der unteren Darstellung gezeigte Produkt. Das Produkt ist ein doppelsträngiges Gen des Amplicons, dem das Interesse gilt, mit der FLAP-Sequenz an seinem 5'-Ende.
  • 17 veranschaulicht bei der vorliegenden Erfindung nützliche doppelsträngige Nukleinsäurevektoren, einschließlich eines TOPO-FLAP-Klonierungsvektors, der einen einzelsträngigen Überhang besitzt, der die Insertion amplifizierter DNA in der richtigen Orientierung erleichtern kann. Nach der korrekten Insertion wird die Topoisomerase das Produkt an den Vektor ligieren.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zur Anwendung einer Stranginvasion, um zwei oder mehr doppelsträngige (ds) Nukleinsäuremoleküle gerichtet bzw. direktional zu verbinden bereit. In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende bereit, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine erste Topoisomerase, die kovalent am 3'-Terminus gebunden ist, aufweist, und das zweite Ende eine zweite Topoisomerase, die kovalent am 3'-Terminus gebunden ist, enthält und einen zweiten 5'-Überhang, ein stumpfes Ende, einen 3'-Uridin-Überhang oder einen 3'-Thymidin-Überhang enthält, wobei der erste 5'- Überhang von dem zweiten 5'-Überhang verschieden ist. Die erste Topoisomerase und die zweite Topoisomerase können gleich oder verschieden sein. Der erste 5'-Überhang kann irgendeine Nukleotidsequenz aufweisen, darunter beispielsweise die Nukleotidsequenz 5-GGTG.
  • Aspekte der vorliegenden Erfindung modifizieren ein topoisomerase-vermitteltes Klonieren, um so zu ermöglichen, dass DNA-Fragmente, einschließlich mittels PCR erzeugte ORFs in Klonierungsvektoren gerichtet eingefügt werden, während gleichzeitig die Vorteile, die durch Ligieren unter Verwendung von Topoisomerase erbracht werden, beibehalten werden. Die Methode verringert den Arbeitsaufwand, den das Screening zur Identifizierung von Klonen, die Inserts in der gewünschten Orientierung enthalten, mit sich bringt, außerordentlich, indem Effizienzen der gerichteten Klonierung ermöglicht werden, die routinemäßig 90% übersteigen. Die vorliegende Erfindung rationalisiert Genexpressionsvorgänge mit hohem Durchsatz, vermindert die Kosten, die mit dem Screening-Verfahren verbunden sind, und bietet weitere Vorteile.
  • Ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das bei der Erfindung nützlich ist, weist im Allgemeinen einen einzelsträngigen Überhang und eine erste Topoisomerase, die an oder nahe bei einem Terminus eines ersten Endes kovalent gebunden ist, auf. Außerdem kann ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das bei der Erfindung nützlich ist, eine zweite Topoisomerase enthalten, die an oder nahe bei einem Terminus des zweiten Endes gebunden ist. Der einzelsträngige Überhang kann ein 5'-Überhang sein, und jede Topoisomerase kann an oder nahe bei einem oder beiden 3'-Termini gebunden sein. Wo eine Topoisomerase an einem 3'-Terminus oder vorzugsweise an beiden 3'-Termini gebunden ist, ist das zweite Ende des topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung typisch ein stumpfes Ende, ein 3'-Thymidin-Überhang oder ein zweiter 5'-Überhang, der von dem ersten 5'-Überhang verschieden ist.
  • So wie er hier gebraucht wird, bedeutet der Verweis auf ein Nukleinsäuremolekül, das ein "erstes Ende" und ein "zweites Ende" aufweist, dass das Nukleinsäuremolekül linear ist. Der Ausdruck "einzelsträngiger Überhang" oder "Überhang" wird hierin benutzt, um auf einen Strang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu verweisen, der sich über den Terminus des komplementären Strangs des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hinaus erstreckt. Der Ausdruck "5'-Überhang" oder "5'-Überhangsequenz" wird hierin benutzt, um auf einen Strang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu verweisen, der sich in einer 5'-Richtung über den 3'-Terminus des komplementären Strangs des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hinaus erstreckt. Der Ausdruck "3'-Überhang" oder "3'-Überhangsequenz" wird hierin benutzt, um auf einen Strang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu verweisen, der sich in einer 3'-Richtung über den 5'-Terminus des komplementären Strangs des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hinaus erstreckt. Vorteilhaft kann ein 5'-Überhang als Ergebnis einer ortsspezifischen Spaltung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch eine Typ-IB-Topoisomerase erzeugt werden (siehe Beispiele 1 und 2). Gleichermaßen kann ein 3'-Überhang bei einem Spalten eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch eine Typ-IA- oder Typ-II-Topoisomerase erzeugt werden.
  • Der 3'-Überhang und der 5'-Überhang können eine beliebige Nukleotidsequenz aufweisen und können eine beliebige Länge haben (z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc. Nukleotide), wobei sie im Allgemeinen aber mindestens zwei Nukleotide aufweisen werden. Die Überhangsequenzen können derart ausgewählt sein, dass sie eine Ligation eines vorbestimmten Endes eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu einem vorbestimmten Ende eines zweiten Nukleinsäuremoleküls gemäß einem Verfahren der Erfindung ermöglichen. Wo die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle gerichtet verbunden werden, sind die 3'- oder 5'-Überhänge im Allgemeinen nicht palindromisch, da doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle mit palindromischen Überhängen miteinander assoziieren können, wodurch sich die Ausbeute an einem gerichtet gebundenen rekombinanten Nukleinsäuremolekül, das zwei oder mehr doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle in einer vorbestimmten Orientierung enthält, verringert. Der Überhang kann beispielsweise eine Nukleotidsequenz eines transkriptions- oder translationsregulierenden Elements, wie etwa einen Promotor, eine Kozak-Sequenz, ein Startcodon oder dergleichen, oder das Komplement zu einer solchen Nukleotidsequenz aufweisen.
  • Ein 3'-Überhang oder 5'-Überhang kann nahezu jedes Nukleotid oder Nukleotid-Analogon oder modifiziertes Nukleotid enthalten, das mit einem komplementären Nukleotidrest hybridisieren kann, vorausgesetzt, dass mindestens ein Abschnitt der Nukleotidsequenz des Überhangs mit der komplementären Sequenz hybridisieren kann. Folglich können die Nukleoside in einem Überhang natürlich vorkommende Nukleotide wie etwa Purine (Guanosin (G) oder Adenosin (A)) oder Pyrimidine (Thymidin (T), Uridin (U) oder Cytidin (C)) enthalten. Außerdem kann der Überhang Substitute für die Nukleoside enthalten, beispielsweise ein Nukleosid wie etwa Inosin, oder eine modifizierte Form eines Nukleosids wie etwa Methylguanosin oder ein 5-halogeniertes Pyrimidin-Nukleosid (z. B. 5-Bromdeoxyuridin oder 5-Methyl-deoxycytidin). Wenn gewünscht, kann der Überhang einen relativ hohen GC-Gehalt haben, beispielsweise kann der Überhang einen GC-Gehalt von über 50%, wie etwa einen 66-%igen GC-Gehalt oder 75-%igen GC-Gehalt oder 80-%igen GC-Gehalt oder 100-%igen GC-Gehalt haben. In einer Ausführungsform hat der Überhang die Sequenz 5-GGTG-3'.
  • Ein 5' oder 3'-Überhang eines ersten Nukleinsäuremoleküls kann beispielsweise ein oder zwei oder ein paar Nukleotidreste enthalten, beispielsweise am freien Terminus des Überhangs, für den kein komplementärer Nukleotidrest in der Komplementärsequenz an oder nahe bei dem im Wesentlichen stumpfen Ende des zweiten (oder weiteren) doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, an das er gebunden wird, vorhanden ist. Trotzdem kann der Überhang am Ende des ersten Nukleinsäuremoleküls aufgrund der anderen Nukleotidreste in dem Überhang selektiv zu der Komplementärsequenz des zweiten Nukleinsäuremoleküls hybridisieren. Beispielsweise brauchen dort, wo ein 5'-Überhang aus sechs Nukleotiden besteht, ein oder zwei Nukleotide, die dem 5'-Ende am Nächsten sind, nicht zu den entsprechenden Nukleotiden in der komplementären Nukleotidsequenz in dem zweiten Nukleinsäuremolekül komplementär zu sein, eine selektive Hybridisierung kann auf Grund der Komplementarität der verbleibenden vier Nukleotidreste dennoch geschehen. Die Anzahl oder die spezifischen Positionen nicht komplementärer Nukleotidreste, die in einem Überhang (oder in der "Komplementärsequenz" in dem zweiten Nukleinsäuremolekül) sein können, ohne die Hybridisierungsspezifität herabzusetzen oder zu inhibieren, kann unter Verwendung von routinemäßigen Hybridisierungsverfahren bestimmt werden.
  • Die Nukleotidreste des Überhangs können geschlossene Nukleinsäure- (LNA-) Analoga (Proligo; Boulder CO) enthalten. LNA-Monomere sind bicyclische Verbindungen, die strukturell Ribonukleosiden ähnlich sind. Der Begriff "geschlossene Nukleinsäure" wurde geprägt, um zu betonen, dass die Furanosering-Konformation bei einer LNA durch einen Methylenlinker, der die 2'-O-Position mit der 4'C-Position verbindet, beschränkt ist. Hierin werden alle Nukleinsäuremoleküle, die eine oder mehrere LNA-Modifikationen enthalten, als LNA-Moleküle bezeichnet. LNA-Oligomere folgen Watson-Crick-Basenpaarungsregeln und hybridisieren zu komplementären Oligonukleotiden. In etlichen Situationen können LNA eine weit bessere Hybridisierung und Stabilität sowie eine bessere thermische Stabilität als DNA oder andere Nukleinsäurederivate bieten (Koshkin et al., Tetrahedron 54: 3607–30, 1998; Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc. 120: 13252–53, 1998; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 97: 5633–38, 2000).
  • Es sollte anerkannt werden, dass die Bezugnahme auf ein erstes Ende oder ein zweites Ende eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls nicht auf eine bestimmte Orientierung des Nukleinsäuremoleküls schließen lassen soll, und es nicht beabsichtigt ist, den Enden eine relative Wichtigkeit in Bezug aufeinander zu unterstellen. Wo ein Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül ist, weist jedes Ende einen 5'-Terminus und einen 3'-Terminus auf. Folglich wird hier beispielsweise auf ein Nukleinsäuremolekül verwiesen, das eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an einem 3'-Terminus und eine Hydroxylgruppe an dem 5'-Terminus desselben Endes aufweist, welches das erste Ende oder das zweite Ende sein kann.
  • Topoisomerase wird, wenn sie an ein Nukleinsäuremolekül gebunden wird, im Allgemeinen "an oder nahe bei" einem Terminus eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebunden werden. Der Ausdruck "an oder nahe bei" bedeutet, wenn er in Bezug auf eine Topoisomerase gebraucht wird, dass die Topoisomerase kovalent an einen Strang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebunden ist, so dass sie den Terminus des Strangs, woran sie gebunden ist, an ein zweites Nukleinsäuremolekül, das eine freie 5'-terminale Hydroxylgruppe enthält, ligieren kann. Im Allgemeinen ist die Topoisomerase aufgrund der kovalenten Bindung an einen Terminus des Endes "an oder nahe bei" einem Ende. Beispielsweise ist die Topoisomerase dort, wo sie vom Typ IB ist, etwa eine Vaccinia-Topoisomerase, an den 3'-Terminus eines Endes eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebunden. Jedoch kann ein Ende, das eine Topoisomerase aufweist, die kovalent am Terminus des Endes gebunden ist, auch eine einzelsträngige Überhangsequenz in dem komplementären Strang aufweisen und sich folglich über den Terminus, an dem die Topoisomerase gebunden ist, hinaus erstrecken. Eine solche Topoisomerase ist ein Beispiel für eine Topoisomerase nahe bei einem Ende des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls.
  • So wie der Ausdruck "isoliert" hier gebraucht wird, wenn er mit Bezug auf ein Molekül benutzt wird, bedeutet er, dass das Molekül in einer Form ist, die von jener, in der es in der Natur vorkommt, verschieden ist. Im Allgemeinen kann beispielsweise ein isoliertes Nukleinsäuremolekül irgendein Nukleinsäuremolekül sein, das nicht Teil eines Genoms in einer Zelle ist oder das räumlich von einer Zelle getrennt ist, die normalerweise das Nukleinsäuremolekül enthält. Es sollte anerkannt werden, dass verschiedene Zusammensetzungen der Erfindung ein Gemisch aus isolierten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen aufweisen. An sich ist selbstverständlich, dass der Ausdruck "isoliert" nur in Bezug auf die Isolierung des Moleküls von seinem natürlichen Zustand gebraucht wird, jedoch nicht darauf schließen lässt, dass das Molekül ein einziger Bestandteil ist.
  • Topoisomerasen sind eine Klasse von Enzymen, die den topologischen Zustand von DNA durch Aufbrechen und Wiederzusammenfügen von DNA-Strängen modifizieren (Shuman et al., US-Patent Nr. 5,766,891). Topoisomerasen werden unterteilt in Typ I, einschließlich der Typ-IA- und Typ-IB-Topoisomerasen, die einen Einzelstrang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls spalten, und Typ-II-Topoisomerasen (Gyrasen), die beide Stränge eines Nukleinsäuremoleküls spalten. Wie hier offenbart ist, sind sowohl Topoisomerasen vom Typ I und II als auch katalytische Domänen und mutierte Formen davon nützlich, um gerichtet verbundene rekombinante Nukleinsäuremoleküle gemäß einem Verfahren der Erfindung zu erzeugen. Topoisomerasen vom Typ II sind generell nicht für die Erzeugung rekombinanter Nukleinsäuremoleküle oder für Klonierungsverfahren benutzt worden, wohingegen Topoisomerasen vom Typ IB in verschiedensten Verfahren benutzt werden.
  • Typ-IA- und -IB-Topoisomerasen spalten einen Strang eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls. Das Spalten eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch Topoisomerasen vom Typ IA erzeugt ein 5'-Phoshat und ein 3'-Hydroxyl an der Spaltstelle, wobei die Topoisomerase vom Typ IA kovalent am 5'-Terminus eines gespaltenen Strangs bindet. Im Vergleich dazu liefert ein Spalten eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch Topoisomerasen vom Typ IB ein 3'-Phoshat und ein 5'-Hydroxyl an der Spaltstelle, wobei die Topoisomerase vom Typ IB kovalent am 3'-Terminus eines gespaltenen Strangs bindet. Topoisomerasen vom Typ IA schließen beispielsweise E. coli Topoisomerase I und Topoisomerase III, eukaryotische Topoisomerase II und archeale Reverse Gyrase ein (siehe Berger, Biochim, Biophys. Acta 1400: 3–18, 1998).
  • Topoisomerasen vom Typ IB schließen Kern-Topoisomerasen vom Typ I, die in allen eukaryotischen Zellen vorkommen, und jene, die durch Vaccinia und andere zelluläre Poxviren codiert werden, ein (siehe Cheng et al., Cell 92: 841–850, 1998, durch die Bezugnahme dieses Patents aufgenommen). Beispiele für eukaryotische Topoisomerasen vom Typ IB sind jene, die in Hefe-, Drosophila- und Säugetierzellen, humane Zellen eingeschlossen, exprimiert werden (siehe Caron und Wang, Adv. Pharmacol. 29B: 271–297, 1994; Gupta et al., Biochim. Biophys. Acta 1262: 1–14, 1995; siehe außerdem Berger, supra, 1998). Beispiele für virale Topoisomerasen vom Typ IB sind jene, die durch die Poxviren der Vertebraten erzeugt werden (Vaccinia, Shope Fibromvirus, ORFvirus, Geflügelpocken-Virus und Molluscum Contagiosum-Virus), und das Insekten-Poxvirus (Amsacta moorei Entomopoxvirus) (siehe Shuman, Biochim. Biophys. Acta 1400: 321–337, 1998; Petersen et al., Virology 230: 197–206, 1997; Shuman und Prescott, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7478–7482, 1987; Shuman, J. Biol. Chem. 269: 32678–32684, 1994; US-Patent Nr. 5,766,891; PCT/US 95/16 099; PCT/US 98/12 372; siehe außerdem Cheng et al., supra, 1998).
  • Topoisomerasen vom Typ II schließen beispielsweise bakterielle Gyrase, bakterielle DNA-Topoisomerase IV, eukaryotische DNA-Topoisomerase II und T-even-Phagen-codierte DNA-Topoisomerasen ein (Roca und Wang, Cell 71: 833–840, 1992; Wang, J. Biol. Chem. 266: 6659–6662, 1991; Berger, supra, 1998). Wie die Topoisomerasen vom Typ IB zeigen die Topoisomerasen vom Typ II sowohl Spalt- als auch Ligationsaktivitäten. Außerdem können wie bei Topoisomerasen vom Typ IB Substrate doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle so zubereitet sein, dass die Topoisomerase vom Typ II eine kovalente Bindung zu einem Strang an einer Spaltstelle ausbilden kann. Beispielsweise kann Kalb-Thymus-Typ II-Topoisomerase ein Substrat doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle spalten, die eine 5'-zurückgesetzte Topoisomerase-Erkennungsstelle enthalten, die sich drei Nukleotide von dem 5'-Ende entfernt befindet, was eine Dissoziation der drei Nukleinsäuremoleküle 5' zu der Spaltstelle und ein kovalentes Binden der Topoisomerase am 5'-Terminus des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zur Folge hat (Andersen et al., supra, 1991). Außerdem kann die Typ-II-Topoisomerase, wenn ein solches mit einer Typ-II-Topoisomerase beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül, das eine 3'-Hydroxylgruppe enthält, in Kontakt gebracht wird, die Sequenzen miteinander ligieren und wird dann von dem rekombinanten Nukleinsäuremolekül freigesetzt. An sich sind Topoisomerasen vom Typ II ebenfalls für die Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich.
  • Die Strukturanalyse der Topoisomerase lässt erkennen, dass die Mitglieder jeder einzelnen Topoisomerasefamilie, einschließlich der Topoisomerasen vom Typ IA, IB und II, mit anderen Mitgliedern der Familie gemeinsame Strukturmerkmale haben (Berger, supra, 1998). Außerdem deutet die Sequenzanalyse verschiedener Topoisomerasen vom Typ IB darauf hin, dass die Strukturen stark konserviert sind, insbesondere in der katalytischen Domäne (Shuman, supra, 1998; Cheng et al., supra, 1998; Petersen et al., supra 1997). Beispielsweise hat eine Domäne mit den Aminosäuren 81 bis 314 der Vaccinia-Topoisomerase mit 324 Aminosäurem im Wesentlichen eine Homologie mit anderen Topoisomerasen vom Typ IB gemeinsam, und die isolierte Domäne hat im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie die Topoisomerase der vollen Länge, wenngleich die isolierte Domäne eine niedrigere Umsatzgeschwindigkeit und eine geringere Bindungsaffinität an die Erkennungsstelle hat (siehe Shuman, supra, 1998; Cheng et al., supra, 1998). Außerdem zeigt eine mutierte Vaccinia-Topoisomerase, die in der aminoterminalen Domäne (bei den Aminosäureresten 70 und 72) mutiert ist, völlig gleiche Eigenschaften wie die Topoisomerase voller Länge (Cheng et al., supra, 1998). In der Tat offenbart eine Mutationsanalyse von Vaccinia-Typ-IB-Topoisomerase eine große Anzahl von Aminosäureresten, die mutiert sein können, ohne dass die Aktivität der Topoisomerase beeinflusst wird, und hat verschiedene Aminosäuren identifiziert, die für eine Aktivität erforderlich sind (Shuman, supra, 1998). Angesichts der starken Homologie der katalytischen Domäne der Vaccinia-Topoisomerase mit den anderen Topoisomerasen vom Typ IB und der detaillierten Mutationsanalyse der Vaccinia-Topoisomerase wird anerkannt werden, dass isolierte katalytische Domänen der Topoisomerasen vom Typ IB und Topoisomerasen vom Typ IB mit verschiedenen Aminosäuremutationen bei den Verfahren der Erfindung benutzt werden können und folglich als Topoisomerasen für die Zwecke der Erfindung angesehen werden.
  • Die verschiedenen Topoisomerasen zeigen einen Bereich an Sequenzspezifität. Beispielsweise können Toposiomerasen vom Typ II an verschiedenste Sequenzen binden, aber an einer hochspezifischen Erkennungsstelle spalten (siehe Andersen et al., J. Biol. Chem., 266: 9203–9210, 1991). Im Vergleich dazu schließen die Topoisomerasen vom Typ IB ortsspezifische Topoisomerasen ein, die an eine spezifische Nukleotidsequenz binden und diese spalten ("Topoisomerase-Erkennungsstelle"). Bei einer Spaltung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch eine Topoisomerase, beispielsweise eine Topoisomerase vom Typ IB, bleibt die Energie der Phosphodiesterbindung durch die Ausbildung einer Phosphotyrosylbindung zwischen einem spezifischen Tyrosinrest in der Topoisomerase und dem 3'-Nukleotid der Topoisomerase-Erkennungsstelle erhalten. Wo die Topoisomerase-Spaltstelle nahe bei dem 3'-Terminus des Nukleinsäuremoleküls ist, kann die stromabwärts gelegene Sequenz (3' zu der Spaltstelle) dissoziieren und ein Nukleinsäuremolekül hinterlassen, in dem die Topoisomerase kovalent an das frisch erzeugte 3'-Ende gebunden ist (siehe 9).
  • Die kovalent gebundene Topoisomerase kann auch die Rückreaktion katalysieren, beispielsweise eine kovalente Verbindung des 3'-Nukleotids der Erkennungssequenz, woran eine Topoisomerase vom Typ IB durch die Phosphotyrosylbindung gebunden ist, und eines Nukleinsäuremoleküls, das eine freie 5'-Hydroxylgruppe enthält. An sich sind Verfahren entwickelt worden, die eine Topoisomerase vom Typ IB zur Erzeugung von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen benutzen. An sich sind Klonierungsvektoren, die eine gebundene Typ-IB-Topoisomerase enthalten, entwickelt worden und im Handel erhältlich (Invitrogen Corp., Carlsbad CA). Derartige Klonierungsvektoren enthalten, wenn sie linearisiert sind, eine kovalent gebundene Topoisomerase vom Typ IB an jedem 3'-Ende ("topoisomerase-beladen"). Nukleinsäuremoleküle, wie etwa jene, die eine cDNA-Bibliothek aufweisen, oder Restriktionsfragmente oder abgeschnittene genomische DNA-Sequenzen, die in einen solchen Vektor zu klonieren sind, werden dann beispielsweise mit einer Phosphatase behandelt, um 5'-Hydroxyl-Termini zu erzeugen, und anschließend zu dem linearisierten Vektor unter Bedingungen zugegeben, die zulassen, dass die Topoisomerase die Nukleinsäuremoleküle an dem 5'-Terminus, der die Hydroxylgruppe enthält, und dem 3'-Terminus, der die kovalent gebundene Topoisomerase enthält, ligiert. Ein Nukleinsäuremolekül, wie etwa ein PCR-Amplifikationsprodukt, das so erzeugt ist, dass es 5'-Hydroxylenden aufweist, kann in einer schnellen Verbindungsreaktion (ungefähr 5 min bei Raumtemperatur) in einen topoisomerase-beladenen Vektor kloniert werden. Das schnelle Verbinden und der breite Temperaturbereich, die der Topoisomerase-Verbindungsreaktion eigen sind, machen die Verwendung von topoisomerase-beladenen Vektoren für Anwendungen mit hohem Durchsatz, die im Allgemeinen unter Verwendung automatisierter Systeme ausgeführt werden, ideal.
  • Das Vaccinia-Virus codiert ein 314-Aminosäure-Typ I-Topoisomeraseenzym, das sowohl zu einem ortsspezifischen Einzelstrangschnitt einer doppelsträngigen DNA als auch zu einer durch das 5'-Hydroxyl getriebenen erneuten Ligation in der Lage ist. Ortsspezifische Typ-I-Topoisomerasen schließen virale Topoisomerasen wie etwa Poxvirus-Topoisomerase ein, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Beispiele für Poxvirus-Topoisomerasen schließen das Shope-Fibromvirus und das ORF-Virus ein. Dem Fachmann sind weitere ortsspezifische Topoisomerasen wohlbekannt, die verwendet werden können, um diese Erfindung auszuführen.
  • Die Vaccinia-Topoisomerase bindet an doppelsträngige DNA und spaltet das Phosphodiester-Rückgrat eines Strangs auf, während sie gleichzeitig einen hohen Grad an Sequenzspezifität zeigt. Die Spaltung findet an einem Konsensus-Pentapyrimidin-Element 5'-(C/T)CCTT↓, oder verwandten Sequenzen in dem leicht spaltbaren Strang statt. In einer Ausführungsform befindet sich die leicht aufspaltbare Bindung im Bereich von 2 bis 12 Basenpaaren vom 3'-Ende der doppelsträngigen DNA entfernt. In einer weiteren Ausführungsform erfordert die Ausbildung eines spaltbaren Komplexes mittels Vaccinia-Topoisomerase sechs doppelsträngige Nukleotide stromaufwärts und zwei Nukleotide stromabwärts der Spaltstelle. Beispiele für mittels Vaccinia-Topoisomerase spaltbare Sequenzen schließen
    +6/–6 doppelsträngiges GCCCTTATTCCC (SEQ ID Nr:1),
    +8/–4 doppelsträngiges TCGCCCTTATTC (SEQ ID Nr:2),
    +10/–2 doppelsträngiges TGTCGCCCTTAT (SEQ ID Nr:3),
    +11/–1 doppelsträngiges GTGTCGCCCTTA (SEQ ID Nr:4) ein, ohne hierauf beschränkt zu sein.
  • Beispiele für weitere ortsspezifische Topoisomerasen vom Typ I sind im Fachgebiet wohlbekannt. Diese Enzyme werden von vielen Organismen codiert, darunter, jedoch nicht hierauf beschränkt, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe und Tetrahymena, wobei jedoch die Topoisomerase-I-Enzyme dieser Spezies eine geringere Spezifität für eine Konsensussequenz als die Vaccinia-Topoisomerase aufweisen (Lynn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3559–3563, 1989; Eng et al., J. Biol. Chem. 264: 13373–13376, 1989; Busk et al., Nature 327: 638–640, 1987).
  • Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung werden hier allgemein erläutert, wobei auf die Verwendung von Topoisomerase vom Typ IB, wie etwa die Vaccinia-Topoisomerase, Bezug genommen wird. Es wird jedoch anerkannt werden, dass die Verfahren auch unter Verwendung anderer Topoisomerasen ausgeführt werden können, indem lediglich die Komponenten dementsprechend eingestellt werden. Beispielsweise sind, wie weiter unten ausführlicher beschrieben ist, Verfahren offenbart, um an einem 3'-Terminus oder an beiden 3'-Termini eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Typ-IB-Topoisomerase-Erkennungsstelle einzubauen. Dementsprechend wird der Fachmann angesichts der vorliegenden Darstellung erkennen, dass eine Topoisomerase-Erkennungsstelle für eine Topoisomerase vom Typ IA oder Typ II auf ähnliche Weise in ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül eingebaut werden kann.
  • Ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem 5'-Überhang an einem ersten Ende enthält im Allgemeinen eine kovalent an den 3'-Terminus des ersten Endes gebundene Topoisomerase. Eine doppelsträngige Nukleinsäure, die einen 5'-Überhang und eine erste Topoisomerase an einem ersten Ende aufweist, kann außerdem eine zweite Topoisomerase enthalten, die kovalent am zweiten Ende gebunden ist. Die kovalent am ersten Ende gebundene Topoisomerase kann der kovalent am zweiten Ende gebundenen Topoisomerase gleich sein oder sich von dieser unterscheiden. Folglich kann eine Vaccinia-Topoisomerase am ersten Ende kovalent gebunden sein, und eine andere Poxvirus-Topoisomerase oder eine Topoisomerase vom eukaryotischen Kerntyp IB kann am zweiten Ende gebunden sein. Im Allgemeinen sind die Topoisomerasen, wenn sie an jedem Ende verschieden sind, Mitglieder derselben allgemeinen Familie, beispielsweise Topoisomerasen vom Typ IA oder Typ IB oder Typ II.
  • In einer Ausführungsform ist ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Vektor, der ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein kann. Der Vektor kann Elemente wie etwa einen bakteriellen Replikationsursprung, einen eukaryotischen Replikationsursprung, Antibiotika-Resistenzgene und dergleichen enthalten, wobei er weiters Topoisomerase-Erkennungsstellen oder topoisomerase-beladene Enden oder eine Kombination davon aufweisen kann. Solche Vektoren der Erfindung können vorteilhaft in Sätze zusammengepackt werden, wie hier offenbart ist. Ein Vektor der Erfindung kann ein Plasmidvektor, ein Cosmidvektor, ein künstliches Chromosom (z.B. ein künstliches Bakterien-Chromosom, ein künstliches Hefechromosom, ein künstliches Säugetier-Chromosom usw.) oder ein viraler Vektor wie etwa ein Bakteriophage-, Baculovirus-, Retrovirus-, Lentivirus-, Adenovirus-, Vaccinia-Virus-, Semliki-Forest-Virus- und Adeno-assoziiertes Virus (AAV)-Vektor sein, die alle wohlbekannt sind und im Handel erworben werden können (Promega, Madison WI; Stratagene, La Jolla CA; GIBCO/BRL, Gaithersburg MD). Virale Expressionsvektoren können dort besonders geeignet sein, wo ein Verfahren der Erfindung zum Zwecke der Erzeugung eines gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das in eine Zelle, insbesondere eine Zelle eines Lebewesens, einzubringen ist, ausgeführt wird. Virale Vektoren bieten den Vorteil, dass sie Wirtszellen mit einer relativ hohen Wirksamkeit infizieren können und spezifische Zelltypen infizieren können oder so modifiziert werden können, dass sie bestimmte Zellen in einem Wirt infizieren.
  • Virale Vektoren sind zur Verwendung in speziellen Wirtssystemen entwickelt worden und schließen beispielsweise Baculovirus-Vektoren, die Insektenzellen infizieren, retrovirale Vektoren, weitere Lentivirus-Vektoren, wie etwa jene, die auf dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) beruhen, Adenovirus-Vektoren, Adeno-assoziertes Virus (AAV)-Vektoren, Herpesvirus-Vektoren, Vaccinia-Virus-Vectoren und dergleichen, die Säugerzellen infizieren (siehe Miller und Rosman, BioTechniques 7: 980–990, 1992; Anderson et al., Nature 392: 25–30 Suppl., 1998; Verma und Somia, Nature 389: 239–242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med., 334: 1185–1187, 1996), ein. Beispielsweise kann ein auf dem HIV basierender viraler Vektor benutzt werden, um T-Zellen zu infizieren, ein auf einem Adenovirus basierender viraler Vektor kann beispielsweise benutzt werden, um respiratorische Epithelzellen zu infizieren, und ein viraler Vektor auf der Basis eines Herpesvirus kann benutzt werden, um neuronale Zellen zu infizieren. Andere Vektoren, wie etwa AAV-Vektoren, können eine größere Bandbreite an Wirtszellen haben, weshalb sie benutzt werden können, um verschiedene Zelltypen zu infizieren, obwohl virale oder nichtvirale Vektoren auch mit spezifischen Rezeptoren oder Liganden modifiziert werden können, um die Zielspezifität durch rezeptorvermittelte Ereignisse zu verändern.
  • Ein bei der Erfindung verwendbarer linearisierter Vektor, der topoisomerase-beladen ist oder Topoisomerase-Erkennungsstellen enthält, kann unter Verwendung von Verfahren erzeugt werden, wie sie hierin offenbart oder sonst im Fach bekannt sind. Beispielsweise kann ein zirkulärer Vektor linearisiert und durch Ligieren oder Hybridisieren eines oder mehrerer Oligonukleotide modifiziert werden, um eine Topoisomerase-Erkennungsstelle oder ein Spaltprodukt davon und eine 5'-Zielsequenz oder einen 5'-Überhang an einem Ende oder an beiden Enden zu erzeugen (siehe Beispiele 1 und 2). Der Vektor kann außerdem beispielsweise Expressionsregulationselemente enthalten, die für eine Replikation in einer prokaryotischen Wirtszelle, einer eukaryotischen Wirtszelle oder beiden erforderlich sind, und kann eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein Polypeptid codiert, das Antibiotika-Resistenz oder dergleichen verleiht, oder solche Elemente können unter Verwendung der Verfahren der Erfindung in den Vektor eingeführt werden. Außerdem kann der Vektor eine, zwei oder mehr ortsspezifische Integrationserkennungsstellen, wie etwa eine att-Stelle oder eine lox-Stelle, enthalten. Der Einbau beispielsweise von attB- oder attP-Sequenzen in ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ermöglicht die günstige Manipulation des Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung des GATEWAYTM-Klonierungssystems (Invitrogen Corp., La Jolla CA).
  • Es kann ein modifizierter Klonierungsvektor mit einem überhängenden einzelsträngigen DNA-Stück, der mit Topoisomerase beladen ist, bereitgestellt werden. Der modifizierte Vektor ermöglicht die gerichtete Insertion von linearen doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, die beispielsweise mittels PCR amplifiziert sind, oder anderer geeigneter ORFs für eine nachfolgende Expression, und nutzt die Topoisomerase-Klonierungseffizienz aus. So, wie der Ausdruck Donator hier gebraucht wird, bezeichnet er Moleküle wie eine doppelsträngige DNA, die eine 5'-CCCTT-Spaltstelle nahe bei dem 3'-Ende aufweist, und der Ausdruck Akzeptor bezeichnet eine doppelsträngige DNA, die einen 5'-OH-Terminus aufweist. Wenn er erst einmal durch die Topoisomerase kovalent aktiviert worden ist, wird der Donator zu diesen Akzeptoren transferiert, zu denen er eine einzelsträngige Sequenzkomplementierung besitzt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind in besonderen Ausführungsformen topoisomerase-modifizierte Vektoren weiters so beschaffen, dass sie mindestens eine einzelsträngige 5'-Überhangsequenz aufweisen, um das gerichtete Einfügen von DNA-Segmenten zu erleichtern. Ein in einen derartigen Vektor zu klonierendes Nukleinsäuremolekül kann ein PCR-Produkt sein, das einen ORF darstellt, der aus dem resultierenden rekombinanten Vektor exprimiert werden kann. Die für das Amplifizieren des offenen Leserahmens benutzten Primer sind so konstruiert, dass mindestens ein Primer des Primerpaares eine zusätzliche Sequenz an seinem 5'-Ende enthält. Diese Sequenz ist so konstruiert, dass sie komplementär zu der in dem topoisomerase-modifizierten Vektor der vorliegenden Erfindung vorhandenen Sequenz des einzelsträngigen 5'-Überhangs ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt allgemein Verfahren zur Erzeugung eines gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung eines Stranginvasionsereignisses und eines Ligationsereignisses bereit, um in einer gerichteter Weise ein erstes Nukleinsäuremolekül mit mindestens einem zweiten Nukleinsäuremolekül zu verbinden. So, wie der Ausdruck "Stranginvasion" hier gebraucht wird, verweist er auf die Verdrängung eines Strangs eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch einen einzelsträngigen Abschnitt eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, wobei der Einzelstrang eine Nukleotidsequenz aufweist, die dem verdrängten Strang im Wesentlichen gleich ist und selektiv zu dem Strang hybridisieren kann, der zu dem verdrängten Strang komplementär ist.
  • Ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet oder ungerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls kann beispielsweise ausgeführt werden, beispielsweise indem ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Überhang an einem ersten Strang (z.B. einem 3'- oder 5'-Strang) an einem ersten Ende und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, im Wesentliches stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei eine Nukleotidsequenz, die zu dem ersten Überhang des ersten Ende des ersten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, an oder nahe bei dem ersten im Wesentlichen stumpfen Ende vorhanden ist, in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass der erste Überhang selektiv zu der komplementären Nukleotidsequenz des ersten, im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, und das erste Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und das erste Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden werden können. Der erste Überhang kann ein 3'-Überhang oder ein 5'-Überhang sein. Es können Vorläufer-Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, um Moleküle herzustellen, die sich zur Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren eignen.
  • 1 veranschaulicht Beispiele für die Art und Weise, in der die Verfahren der Erfindung genutzt werden können, um ein kovalent verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen. Die Kästchen und Kreise in 1 werden benutzt, um Regionen mit Sequenzkomplementarität darzustellen, die derart ist, dass ein Strangverdrängungsereignis stattfinden kann. Das andere Ende der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, das nicht unbedingt an einem Strangverdrängungsereignis beteiligt ist (aber beteiligt sein kann), kann eine beliebige Struktur haben, wobei es im Wesentlichen stumpf sein kann oder einen 3' oder 5'-Überhang enthalten kann. Es können weitere Kombinationen aus stumpfen Enden und/oder Überhängen an dem ersten, zweiten, dritten usw. doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gemäß den Verfahren der Erfindung verbunden werden, wie dem Fachmann auf der Grundlage, zum Teil, der in 1 gegebenen Beispiele offensichtlich sein wird.
  • Wie in 1A gezeigt ist, kann ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet oder ungerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls beispielsweise ausgeführt werden, indem ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen ersten Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende aufweist; ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, im Wesentlichen stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste, im Wesentlichen stumpfe Ende eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist; und ein Reagens, das die Nukleinsäuremoleküle ligiert (z.B. ein Reagens, das eine Topoisomerase, eine Ligase oder eine Rekombinase enthält) in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass der erste Überhang selektiv zu der komplementären Nukleotidsequenz des ersten, im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann. Außerdem wird das Verfahren in Gegenwart eines Reagens durchgeführt, das einen 5'-Strang eines Nukleinsäuremoleküls an einen 3'-Strang eines zweiten Nukleinsäuremoleküls ligieren kann, und unter solchen Bedingungen, dass der 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und der 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden werden. Sowohl bei verschiedenen Abwandlungen des oben beschriebenen Verfahrens als auch bei anderen obenen beschriebenen Verfahren, kann der erste Überhang ein 3'-Überhang oder ein 5'-Überhang sein.
  • Wie in 1B gezeigt ist, kann ein Verfahren zum Erzeugen eines verbundenen, beispielsweise gerichtet bzw. direktional verbundenen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls ausgeführt werden, indem ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende und einem zweiten, im Wesentlichen stumpfen Ende und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, im Wesentlichen stumpfes Ende und ein zweites Ende mit einem zweiten Überhang hat, wobei das erste im Wesentlichen stumpfe Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, und wobei das zweite im Wesentlichen stumpfe Ende des ersten Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem zweiten Überhang des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass der erste Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des ersten, im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, wobei der zweite Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des zweiten, im Wesentlichen stumpfen Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann. Außerdem kann das Verfahren in Gegenwart eines Reagens ausgeführt werden, das die Ligation eines 3'-Strangs eines Nukleinsäuremoleküls an einen 5'-Strang eines anderen Nukleinsäuremoleküls katalysieren kann, und unter solchen Bedingungen, dass der 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird, und der 3'-Terminus des zweiten, im Wesentlichen stumpfen Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird. Bei verschiedenen Abwandlungen des oben beschriebenen Verfahrens kann einer der Überhänge, oder Beide, der erste und der zweite Überhang, ein 3'-Überhang oder 5'-Überhang sein. Die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle können folglich bei zwei getrennten Stranginvasionsereignissen in Eingriff gelangen, die auf Grund der kovalenten Bindung der Nukleinsäurestränge an jedem Terminus zur Bildung eines ringförmigen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls führen.
  • Wie in 1C gezeigt ist, kann ein Verfahren zum Erzeugen eines verbundenen, beispielsweise gerichtet bzw. direktional verbundenen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls ausgeführt werden, indem beispielsweise ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende und mit einem zweiten Ende, das einen zweiten Überhang aufweist; und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, im Wesentlichen stumpfes Ende und ein zweites, im Wesentlichen stumpfes Ende aufweist, wobei das erste, im Wesentlichen stumpfe Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, und wobei das zweite, im Wesentlichen stumpfe Ende des zweiten Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem zweiten Überhang des zweiten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren kann unter solchen Bedingungen ausgeführt werden, dass der erste Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des ersten, im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, wobei der zweite Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des zweiten, im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann. Weiters wird das Verfahren unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass das erste Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem ersten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird und das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem zweiten im Wesentlichen stumpfen Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird. Bei verschiedenen Abwandlungen des oben beschriebenen Verfahrens kann einer oder Beide der Überhänge, der erste und der zweite Überhang, ein 3'-Überhang oder 5'-Überhang sein. Die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle können folglich bei zwei getrennten Stranginvasionsereignissen in Eingriff gelangen, die auf Grund der kovalenten Bindung der Nukleinsäurestränge an jedem Termini zur Bildung eines ringförmigen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls führen.
  • Wie in 1D gezeigt ist, kann ein Verfahren zum Erzeugen eines verbundenen, beispielsweise gerichtet bzw. direktional verbundenen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls ausgeführt werden, indem beispielsweise ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen ersten Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende aufweist; ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, im Wesentlichen stumpfes Ende und ein zweites, im Wesentlichen stumpfes Ende aufweist; und ein drittes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen zweiten Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende aufweist, wobei das erste im Wesentlichen stumpfe Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten Überhang komplementär ist, und das zweite im Wesentlichen stumpfe Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem zweiten Überhang komplementär ist, in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass der erste Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des ersten im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, wobei der zweite Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des zweiten im Wesentlichen stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann. Außerdem kann das Verfahren unter solchen Bedingungen ausgeführt werden, dass das erste Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem ersten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird und das erste Ende des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem zweiten, im Wesentlichen stumpfen Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird. Bei verschiedenen Abwandlungen des oben beschriebenen Verfahrens kann sowohl einer als auch Beide, der erste und/oder der zweite Überhang, ein 3'-Überhang oder 5'-Überhang sein.
  • Wie in 1E gezeigt ist, kann ein Verfahren zum Erzeugen eines verbundenen, beispielsweise gerichtet bzw. direktional verbundenen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls ausgeführt werden, indem beispielsweise ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes im Wesentlichen stumpfes Ende aufweist; ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen ersten Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende und einen zweiten Überhang an einem zweiten Strang an einem zweiten Ende aufweist; und ein drittes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein zweites im Wesentliches stumpfes Ende aufweist, wobei das erste im Wesentlichen stumpfe Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten Überhang des ersten Endes des zweiten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist und wobei das zweite im Wesentlichen stumpfe Ende eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem zweiten Überhang des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass der erste Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des ersten im Wesentlichen stumpfen Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, und wobei der zweite Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des zweiten im Wesentlichen stumpfen Endes hybridisieren kann. Außerdem kann das Verfahren unter solchen Bedingungen ausgeführt werden, dass das erste im Wesentlichen stumpfe Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem ersten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird und das zweite im Wesentlichen stumpfe Ende, das sich an dem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül befindet, mit dem zweiten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbunden wird. Bei verschiedenen Abwandlungen des oben beschriebenen Verfahrens kann einer oder Beide, der erste und/oder der zweite Überhang, ein 3'-Überhang oder 5'-Überhang sein.
  • Ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet oder ungerichtet verbundenen, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls kann ausgeführt werden, indem beispielsweise ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine erste Topoisomerase aufweist, die kovalent an oder nahe bei einem ersten, im Wesentlichen stumpfen Ende gebunden ist; und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen ersten 3'-Überhang an einem ersten Strang an einem ersten Ende aufweist, wobei das erste, im Wesentlichen stumpfe Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 3'-Überhang komplementär ist (siehe 2), in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, dass der erste 3'-Überhang selektiv mit der komplementären Nukleotidsequenz des ersten, im Wesentlichen stumpfen Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann. Außerdem wird das Verfahren derart ausgeführt, dass Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent mit dem 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten Nukleinsäuremoleküls verbinden kann (Cheng and Shuman, Mol. Cell. Biol., 20: 8059–8068, 2000).
  • Die Fähigkeit einer an oder nahe bei einem ersten, im Wesentlichen stumpfen Ende eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent gebundenen Topoisomerase, an ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem 3'-Überhang (2) kovalent gebunden zu werden, bietet eine zuvor ungeahnte Flexibilität der Konformation der kovalent gebundenen Topoisomerase in Bezug auf ihre DNA-Kontakte an der 5'-Seite des leicht spaltbaren Phosophodiesters. Bei der Katalyse der Entspannung der DNA-Superhelix setzt kovalent gebundene Topoisomerase vom Typ IB den stromabwärtigen Doppelstrang frei und ermöglicht ein Drehen des Doppelstrangs um die Phosphodiesterbindung gegenüber dem leicht spaltbaren Phosphat, bevor das Grundgerüst wieder dichtmacht.
  • Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einer Weise ausgeführt werden, die die Notwendigkeit, eine zusätzliche Reaktion auszuführen, um einen nach der homolgieabhängigen Ligation verbleibenden Bruch zu reparieren, umgeht, indem ein Strang eines Nukleinsäuremoleküls im Wesentlichen ersetzt wird (siehe 2). Beispielsweise können die Verfahren so ausgeführt werden, dass sich die Überhangsequenz eines Nukleinsäuremoleküls über die gesamte Länge eines Strangs erstreckt und bei einer Stranginvasion einen Strang des anderen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ersetzt. Folglich gibt es bei dieser Ausführungsform keinen Bruch in dem Strang, der nicht durch die Topoisomerase ligiert wurde.
  • Die Termini der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, die unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung verbunden werden, können unter Verwendung eines beliebigen Reagens, das für ein Verbinden eines 5'-Terminus eines Nukleinsäuremoleküls mit einem 3'-Terminus eines zweiten Nukleinsäuremoleküls verwendbar ist, kovalent verbunden werden. So kann das Reagens zum kovalenten Verbinden der Termini beispielsweise eine Topoisomerase, einschließlich einer Topoisomerase vom Typ IA, Typ IB oder Typ II; eine Ligase wie etwa T4-DNA-Ligase; eine Rekombinase, einschließlich einer FLIP-Rekombinase, Int-Integrase oder Cre-Rekombinase; oder ein anderes Mitglied der INT-Familie sein (siehe beispielsweise: Nucl. Acids Res. 26: 391–406, 1998). Außerdem kann dort, wo nach einer Ligation eines Strangs ein Bruch bleibt, dieser durch eine in vivo-Ligation geschlossen werden, beispielsweise indem das einen Bruch aufweisende doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in eine Zelle, wie etwa E. coli, eingebracht wird. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen geht das Verbinden von zwei Enden, die an einem Strangverdrängungsereignis beteiligt sind, mit einer Topoisomerase-Ligation einher. Außerdem kann bei einem Verfahren, wie es für ein Verbinden eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem zweiten Nukleinsäuremolekül offenbart worden ist, an ein Ende des ersten oder zweiten Nukleinsäuremoleküls auch ein drittes Nukleinsäuremolekül gebunden werden, das nicht an einem Strangverdrängungsereignis beteiligt ist.
  • Verfahren der vorliegenden Erfindung können ausgeführt werden, um ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit zumindest einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül in einer ungerichteten oder vorzugsweise einer gerichteten Art und Weise zu verbinden. Die Verfahren können jedoch benutzt werden, um das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in Ausführungsformen, in denen Komplementarität zwischen Nukleotidsequenzen an oder nahe bei einem Terminus beider Enden eines der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle und Nukleotidsequenzen an oder nahe bei einem Terminus von zumindest einem Ende des anderen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls vorhanden ist, ungerichtet zu verbinden. Eine derartige Komplementarität zwischen Nukleotidsequenzen an oder nahe bei einem Terminus beider Enden eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und mindestens eines Strangs des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kann erzielt werden, indem beispielsweise identische Nukleotidsequenzen an dem gleichen Terminus (d.h. 5' oder 3') beider Enden eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls berücksichtigt werden. Dies kann beispielsweise verwirklicht werden, indem Zielsequenzen konstruiert werden, die mit demselben Restriktionsenzym gespalten werden können und die gleiche Nukleotidsequenz enthalten.
  • Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum gerichteten bzw. direktionalen Verbinden eines ersten und zumindest eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, einschließlich, auf Wunsch, eines funktionsfähigen Verbindens zweier oder mehrerer (d.h. 2, 3, 4, 5, 6, 7 usw.) Nukleinsäuremoleküle. Ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet oder ungerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls kann ausgeführt werden, indem beispielsweise ein topoisomerase-beladenes erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine erste Topoisomerase an einem ersten Ende und eine zweite Topoisomerase an einem zweiten Ende kovalent gebunden hat und außerdem einen 5'-Überhang an dem ersten Ende und ein stumpfes Ende, einen 3'-Uridin-Überhang, einen 3'-Thymidin-Überhang oder einen zweiten 5'-Überhang an dem zweiten Ende enthält; und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste, stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, in Kontakt gebracht werden. Die erste und zweite Topoisomerase können gleich sein, beispielsweise zwei Typ-IB-Topoisomerasen, einschließlich zweier Vaccinia-Typ-IB-Topoisomerasen, oder können verschieden sein, einschließlich zweier Typ-IB-Topoisomerasen von verschiedenen Organismen, oder eine Typ-IB-Topoisomerase und eine Typ-IA- oder Typ-II-Topoisomerase.
  • Bei der Ausführung eines Verfahrens der Erfindung werden das erste und zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, dass die 5'-Nukleotidsequenz des zweiten Nukleinsäuremoleküls selektiv mit dem ersten 5'-Überhang hybridisieren kann, wodurch die erste Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann und die zweite Topoisomerase den 3'-Terminus des zweiten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann, um ein gerichtet oder ungerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein gerichtet oder ungerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das durch ein solches Verfahren hergestellt wird, bereit.
  • Wie hier offenbart ist, kann ein Verfahren der Erfindung Mittel liefern, um zwei oder mehr doppelsträngige Nukleotide in einer vorbestimmten Richtungsorientierung zu verbinden. Der Ausdruck "gerichtet verbinden" bzw. "direktional verbinden" wird hierin gebraucht, um auf die kovalente Verbindung von zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen in einer bestimmten, vorgegebenen Anordnung und/oder Orientierung zu verweisen. Folglich liefert ein Verfahren der Erfindung Mittel, um beispielsweise ein Promotor-Expressionsregulationselement stromaufwärts einer codierenden Sequenz kovalent zu binden und ein Polyadenylierungssignal stromabwärts der codierenden Region kovalent zu binden, um ein funktionsfähiges, exprimierbares, rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen; oder um zwei codierende Sequenzen kovalent zu verbinden, so dass sie transkribiert und im Raster translatiert werden können, um ein Fusionspolypeptid herzustellen. Der Ausdruck "ungerichtet verbinden" wird hierin verwendet, um auf die kovalente Verbindung von zwei oder mehr Nukleinsäuremolekülen in einer zufälligen Anordnung zu verweisen, d.h. dass entweder das erste oder das zweite Ende des Nukleinsäuremoleküls mit einem Ende des anderen Nukleinsäuremoleküls verbunden werden kann.
  • Der Ausdruck "im Wesentlichen stumpf" bedeutet, wenn er mit Bezug auf ein Ende eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebraucht wird, dass das Ende stumpf sein kann oder einen kurzen Überhang aufweisen kann, der ein Stranginvasionsereignis durch ein zweites Nukleinsäuremolekül, das einen Überhang aufweist, nicht reduziert oder inhibiert. Beispielsweise kann ein im Wesentlichen stumpfes Ende ein Ende einschließen, das einen Überhang von 1, 2 oder einigen Nukleotiden hat, vorausgesetzt, der Überhang an dem im Wesentlichen stumpfen Ende blockiert nicht die Stranginvasion. Beispielsweise kann das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül einen 5'-Adenosin- oder 5'-Inosin-Überhang aufweisen.
  • Es sollte anerkannt werden, dass hier ein "erstes Nukleinsäuremolekül", "zweites Nukleinsäuremolekül", "drittes Nukleinsäuremolekül" und dergleichen nur erwähnt werden, um dafür zu sorgen, dass erkennbar ist, auf welches von mehreren Nukleinsäuremolekülen gerade Bezug genommen wird. Folglich sollen bei Abwesenheit jeder spezifisch definierten Eigenschaft in Bezug auf ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül die Ausdrücke "erstes", "zweites", "drittes" und dergleichen, wenn sie mit Bezug auf ein Nukleinsäuremolekül oder eine Population oder Vielfalt von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, keine besondere Anordnung, Bedeutung oder andere Information über das Nukleinsäuremolekül angeben. Folglich wird anerkannt werden, dass dort, wo ein beispielhaftes Verfahren beispielsweise auf die Verwendung einer PCR verweist, um ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu amplifizieren, damit das Amplifikationsprodukt eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an einem Ende oder an beiden Enden aufweist, auf ähnliche Weise kann auch ein zweites (oder weiteres) doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül amplifiziert werden.
  • Der Ausdruck "mindestens ein zweites" bedeutet, wenn er mit Bezug auf ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül gebraucht wird, ein oder weitere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw. Nukleinsäuremoleküle) zusätzlich zu einem ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül. Folglich kann der Ausdruck auf nur ein zweites Nukleinsäuremolekül oder auf ein zweites Nukleinsäuremolekül und ein drittes Nukleinsäuremolekül (oder weitere) verweisen. An sich wird der Ausdruck "zweites (oder weiteres) doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül" oder "zweite (und weitere) doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle" hier in Anerkennung der Tatsache gebraucht, dass der Ausdruck "mindestens ein zweites Nukleinsäuremolekül" auf ein zweites, drittes oder weiteres Nukleinsäuremolekül verweisen kann. Es sollte anerkannt werden, dass, sofern nichts anderes angegeben ist, ein Nukleinsäuremolekül, das in der Bedeutung des Ausdrucks "mindestens ein zweites Nukleinsäuremolekül" eingeschlossen ist, dem ersten Nukleinsäuremolekül gleich oder im Wesentlichen gleich sein kann. Beispielsweise können ein erstes und zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, abgesehen davon, dass nur eines der Moleküle, beispielsweise das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül, eine Topoisomerase-Erkennungsstelle hat, oder abgesehen davon, dass es komplementäre 5'-Überhangsequenzen hat, die beispielsweise bei einer Spaltung durch eine Topoisomerase erzeugt worden sind, derart, dass das erste und zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit einem Verfahren der Erfindung gerichtet bzw. direktional verbunden werden können, gleich sein. An sich kann ein Verfahren der Erfindung benutzt werden, um eine Verknüpfung des ersten und zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu erzeugen, die gegebenenfalls durchsetzt sein kann, beispielsweise mit einem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, wie etwa einem Expressionsregulationselement, und die die gerichtet verbundenen Sequenzen in einer vorbestimmten Orientierung enthalten kann, beispielsweise jeweils in einer 5'- zu 3'-Orientierung in Bezug aufeinander.
  • Es wird anerkannt werden, dass jedes der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, beispielsweise eine Sequenz, die als ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül bezeichnet wird, im Allgemeinen eine Population derartiger Nukleinsäuremoleküle aufweist, die identisch oder im Wesentlich identisch sind. Folglich sollte klar sein, dass der Ausdruck "verschieden" beim Vergleich beispielsweise eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls (oder einer Population erster doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle) mit einem zweiten (und weiterem) doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gebraucht wird. Der Ausdruck "verschieden" bedeutet, wenn er hier mit Bezug auf die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, die bei der Erfindung benutzt werden, gebraucht wird, dass die doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle jeweils weniger als 95% Sequenzidentität aufweisen, wenn sie optimal ausgerichtet sind, im Allgemeinen weniger als 90% Sequenzidentität und gewöhnlich weniger als 70% Sequenzidentität. Folglich werden doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die sich beispielsweise nur dadurch unterscheiden, dass sie polymorphe Varianten voneinander sind oder dass sie lediglich verschiedene 5'- oder 3'-Überhangsequenzen enthalten, für die Zwecke der Erfindung nicht als "verschieden" angesehen. Im Vergleich dazu werden verschiedene doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle beispielhaft als eine erste Sequenz, die ein Polypeptid codiert, und eine zweite Sequenz, die ein Expressionsregulationselement aufweist, oder eine erste Sequenz, die ein erstes Polypeptid codiert, und eine zweite Sequenz, die ein nicht homologes Polypeptid codiert, dargestellt.
  • Der Ausdruck "rekombinant" wird hier gebraucht, um auf ein Nukleinsäuremolekül zu verweisen, das durch Verbinden von mindestens zwei Nukleinsäuremolekülen erzeugt wird. An sich ist ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das bei einem Verfahren der Erfindung eingeschlossen ist oder gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt wird, von einem Nukleinsäuremolekül, das in der Natur, beispielsweise während der Meiose, erzeugt sein kann, unterscheidbar. Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist, kann beispielsweise anhand des Vorhandenseins der komplementären Nukleinsäuresequenz in unmittelbarer Nähe, im Allgemeinen direkt benachbart und gewöhnlich direkt 3' zu einer Topoisomerase-Bindungsstelle in einem doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül identifiziert werden.
  • Wie hier offenbart ist, kann ein Verfahren der Erfindung benutzt werden, um ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet bzw. direktional zu verbinden. Das Verfahren kann in vielen Ausführungsformen angewendet werden, um ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül und ein zweites (oder weiteres) doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül gerichtet zu verbinden. Jedoch bietet die Anwendung des Verfahrens, um ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem zweiten (oder weiteren) doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül ungerichtet zu verbinden, ebenfalls Vorteile. Ein ungerichtetes Verbinden kann beispielsweise dort vollzogen werden, 1) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus des zweiten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine zweite Nukleotidsequenz vorhanden ist, die den gesamten zweiten Überhang oder einen Teil davon bilden kann und in der Lage ist, zu der komplementären 5'-Nukleotidsequenz des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren; und 2) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus sowohl des ersten Endes als auch des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz vorhanden ist, die in der Lage ist mit dem 5'-Überhang des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren. In diesen Ausführungsformen können das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls entweder stumpf sein oder einen Überhang enthalten.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet bzw. direktional verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls ausgeführt werden, indem beispielsweise ein erstes doppelsträngiges Vorläufer-Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Ende, das eine erste 5'-Zielsequenz an dem 5'-Terminus und eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an oder nahe bei dem 3'-Terminus aufweist; ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes, stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste, stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu der 5'-Zielsequenz des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls ist; und eine Topoisomerase, die für die Topoisomerase- Erkennungsstelle spezifisch ist, in Kontakt gebracht werden. So wie er hier gebraucht wird, bedeutet der Verweis auf ein doppelsträngiges "Vorläufer"-Nukleinsäuremolekül ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine Topoisomerase-Erkennungsstelle enthält und das bei einer Spaltung durch eine Topoisomerase, die für die Erkennungsstelle spezifisch ist, ein Ende hervorbringt, das eine erwünschtes 5'-terminale Nukleotidsequenz, 3'-terminale Nukleotidsequenz oder beide aufweist. Solch ein erwünschtes Ende wird zum Teil durch das Vorhandensein der 5'-Zielsequenz erzeugt, die, da sie nach einer Spaltung des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls die 5'-Zielsequenz enthält, in eine 5'-Nukleotidsequenz überführt wird, die ein gerichtetes Verbinden des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül ermöglicht.
  • Gemäß einem Verfahren der Erfindung werden das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül, ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül und Topoisomerase unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die Topoisomeraseaktivität zulassen, d.h. dass die Topoisomerase an die Erkennungsstelle binden und diese spalten kann, um einen topoisomerase-beladenen 3'-Terminus zu erzeugen, und den 3'-Terminus an einen entsprechenden 5'-Terminus ligieren kann. Solche Bedingungen ermöglichen außerdem ein Hybridisieren des Abschnitts der ersten 5'-Zielsequenz, der nach dem Spalten durch die Topoisomerase zurückbleibt, und der 5'-Nukleotidsequenz des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, die komplementär zu diesem Abschnitt der 5'-Zielsequenz ist.
  • Bei Ausführung eines Verfahrens der Erfindung kann ein doppelsträngiges Vorläufer-Nukleinsäuremolekül in dem gleichen Reaktionsgefäß gleichzeitig mit der Topoisomerase und dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül kombiniert werden, bevor das doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremolekül in ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül überführt ist, das gerichtet mit einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden werden kann. Durch das Kombinieren der Topoisomerase in demselben Reaktionsgefäß wie die doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäure und die zweite Nukleinsäure werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung vereinfacht. Alternativ kann ein erstes doppelsträngiges Vorläufer-Nukleinsäuremolekül mit Topoisomerase unter Bedingungen kombiniert werden, die eine Topoisomerase-Spaltung und -Bindung zulassen, dann kann ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zugesetzt werden.
  • Ein doppelsträngiges Vorläufer-Nukleinsäuremolekül kann linear oder ringförmig sein, supergeknäult eingeschlossen, und als Ergebnis des Spaltens durch eine oder mehrere Topoisomerasen und, falls gewünscht, eine Restriktionsendonuclease wird ein lineares, topoisomerase-beladenes erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül erzeugt. Beispielsweise kann ein ringförmiges, doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das zwei Typ-IB-Topoisomerase-Erkennungsstellen innerhalb von etwa 100 Nukleotiden voneinander und in den komplementären Strängen, vorzugsweise innerhalb von etwa zwanzig Nukleotiden voneinander und in den komplementären Strängen, enthält, mit einer ortsspezifischen Topoisomerase vom Typ IB in Kontakt gebracht werden, so dass jeder Strang gespalten wird und die dazwischenliegende Sequenz dissoziiert, wodurch ein lineares doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül erzeugt wird, das eine an jedes Ende kovalent gebundene Topoisomerase aufweist.
  • Im Allgemeinen wird eine topoisomerase-beladene doppelsträngige Nukleinsäure, die gerichtet an ein zweites oder weiteres doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül gebunden werden kann, erzeugt, indem Topoisomerase mit einer doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäure in Kontakt gebracht wird, die mindestens eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an oder nahe bei einem Ende und eine erste Zielsequenz aufweist. So, wie der Ausdruck "Topoisomerase-Erkennungsstelle" hierin verwendet wird, hat er die Bedeutung einer definierten Nukleotidsequenz, die von einer ortsspezifischen Topoisomerase erkannt und gebunden wird. Beispielsweise ist die Nukleotidsequenz 5'-(C/T)CCTT-3' eine Topoisomerase-Erkennungsstelle, die in spezifischer Weise von den meisten Poxvirus-Topoisomerasen, einschließlich der Vaccinia-Virus-DNA-Topoisomerase I, gebunden wird, die dann den Strang nach dem Thymidin der Erkennungsstelle, das sich am weitesten 3' befindet, spalten können, um ein Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das 5'-(C/T)CCTT-PO4-TOPO, d.h. einen Komplex aus der Topoisomerase, der über einen Tyrosinrest in der Topoisomerase kovalent an das 3'-Phosphat gebunden ist (siehe: Shuman, J. Biol. Chem., 266: 11372–11379, 1991; Sekiguchi und Shuman, Nucl. Acids Res. 22: 5360–5365, 1994; siehe außerdem: US-Patent Nr. 5,766,891; PCT/US 95/16 099; PCT/US 98/12 372).
  • Ein Vorteil der Konstruktion eines doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls, das beispielsweise eine Typ-IB-Topoisomerase-Erkennungsstelle ungefähr 2 bis 15 Nukleotide (z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 15 oder 20 Nukleotide) von einem Ende oder von beiden Enden aus aufweist, ist, dass nach einer Spaltung des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls durch eine ortsspezifische Topoisomerase ein 5'-Überhang erzeugt wird. Eine solche 5'-Überhangsequenz, die dementsprechend 2 bis 20 Nukleotide enthalten würde, kann unter Verwendung eines PCR-Verfahrens wie hier offenbart so konstruiert werden, dass sie eine Sequenz nach Wunsch aufweist. Folglich kann dort, wo ein gespaltenes erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ausgewählten zweiten (oder weiteren) doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gemäß einem Verfahren der Erfindung gerichtet verbunden werden soll und wo die ausgewählte Sequenz eine 5'-Überhangsequenz aufweist, der 5'-Überhang an dem ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül komplementär zu dem 5'-Überhang an der ausgewählten zweiten (oder weiteren) doppelsträngigen Sequenz konstruiert sein, so dass die zwei (oder mehr) Sequenzen infolge der Komplementarität der 5'-Überhänge in einer vorgegebenen Orientierung gerichtet verbunden werden. Wie weiter oben erörtert worden ist, können ähnliche Verfahren im Hinblick auf 3'-Überhangsequenzen angewendet werden, die bei einer Spaltung durch eine Topoisomerase vom Typ IA oder Typ II erzeugt werden.
  • So wie der Ausdruck "Spaltprodukt" hier mit Bezug auf eine Topoisomerase-Erkennungsstelle verwendet wird, verweist er auf ein Nukleinsäuremolekül, das durch eine Topoisomerase, im Allgemeinen an seiner Erkennungsstelle, gespalten worden ist und einen Komplex aufweist, in dem die Topoisomerase kovalent gebunden ist, im Falle einer Typ-IB-Topoisomerase an die 3'-Phospatgruppe des 3'-terminalen Nukleotids in der Topoisomerase-Erkennungsstelle oder im Falle einer Typ-IA- oder Typ-II-Topoisomerase an die 5'-Phosphatgruppe des 5'-terminalen Nukleotids in der Topoisomerase-Erkennungsstelle. Solch ein Komplex, der ein topoisomerase-gespaltenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül aufweist, woran die Topoisomerase kovalent gebunden ist, wird hier als ein "topoisomerase-aktiviertes" oder "topoisomerase-beladenes" Nukleinsäuremolekül bezeichnet. Topoisomerase-aktivierte doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle können bei einem Verfahren der Erfindung wie doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle benutzt werden, die eine nicht gespaltene Topoisomerase-Erkennungsstelle und eine Topoisomerase enthalten, wobei die Topoisomerase das doppelsträngige Nukleinsäuremolekül an der Spaltstelle spalten kann und daran kovalent gebunden wird.
  • Wie aus der vorliegenden Darstellung ohne weiteres ersichtlich sein wird, können die Enden der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle, die gemäß einem Verfahren der Erfindung zu verbinden sind, verschiedene Eigenschaften aufweisen. Beispielsweise ist unter einem Aspekt das zweite Ende einer ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäure ein stumpfes Ende nach einer Spaltung durch die Topoisomerase, und das zweite Ende eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ist ein stumpfes Ende. Unter einem weiteren Aspekt hat das zweite Ende eines ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls eine 3'-Thymidin-Verlängerung nach einer Spaltung durch die Topoisomerase, und das zweite Ende eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hat einen 3'-Adenosin-Überhang oder die Termini können 3'-Adenosin- und 3'-Deoxyuridin-Überhänge aufweisen (siehe US-Patente Nr. 5,487,993 und 5,856,144). Bei noch einem weiteren Aspekt weist ein erstes doppelsträngiges Vorläufer-Nukleinsäuremolekül eine zweite 5'-Zielsequenz an dem zweiten Ende auf, und das zweite Ende eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls weist eine 5'-Nukleotidsequenz auf, die zumindest zu einem Abschnitt der zweiten 5'-Zielsequenz komplementär ist. Das erste doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremolekül kann ein Vektor sein, einschließlich eines Klonierungsvektors und eines Expressionsvektors, und kann, wo es im Allgemeinen in einer zirkulären Form vorliegt, durch die Wirkung der Topoisomerase linearisiert werden oder kann linearisiert werden, dadurch dass beispielsweise ein oder zwei Restriktionsendonucleasen enthalten sind, die den Vektor linearisieren, so dass bei Kontakt mit der Topoisomerase das erste und zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gemäß einem Verfahren der Erfindung gerichtet verbunden werden können.
  • So, wie der Ausdruck "an oder nahe bei" hier mit Bezug auf die Nähe einer Topoisomerase-Erkennungsstelle zu dem 3'- (Typ IB-) oder 5'- (Typ IA- oder Typ II-) Terminus eines Nukleinsäuremoleküls gebraucht wird, bedeutet er, dass sich die Stelle ungefähr 1 bis 100 Nukleotide von dem 3'-Terminus bzw. 5'-Terminus, im Allgemeinen ungefähr 1 bis 20 Nukleotide von dem Terminus und insbesondere ungefähr 2 bis 12 Nukleotide von dem entsprechenden Terminus entfernt befindet. Ein Vorteil der Anordnung der Topoisomerase-Erkennungsstelle ungefähr 10 bis 15 Nukleotide von einem Terminus entfernt ist, dass bei einer Spaltung durch die Topoisomerase sich der Abschnitt der Sequenz stromabwärts der Spaltstelle spontan von dem übrigen Nukleinsäuremolekül loslösen kann, der die kovalent gebundene Topoisomerase enthält (im Allgemeinen als "Suizidabspaltung" bezeichnet, siehe beispielsweise Shuman, supra, 1991; Andersen et al., supra, 1991). Dort, wo eine Topoisomerase-Erkennungsstelle mehr als ungefähr 12 bis 15 Nukleotide von dem Terminus entfernt ist, kann das Nukleinsäuremolekül stromaufwärts oder stromabwärts der Spaltstelle veranlasst werden, sich vom Rest der Sequenz zu trennen, indem die Reaktionsbedingungen modifiziert werden, beispielsweise indem ein Inkubationsschritt bei einer Temperatur oberhalb der Schmelztemperatur des Abschnitts des Doppelstrangs, der die Topoisomerase-Spaltstelle enthält, vorgesehen wird.
  • Es kann ein Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls mit einer 5'-Zielsequenz und einer Topoisomerase an einem ersten Ende und einem zweiten Ende ausgeführt werden, um ein erstes doppelsträngiges Vorläufer-Nukleinsäuremolekül mit einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet zu verbinden. Das Verfahren wird typisch benutzt, um das erste doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremolekül mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül zu verbinden, und kann auch benutzt werden, um das erste doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremolekül mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül ungerichtet zu verbinden. Ein ungerichtetes Verbinden kann beispielsweise dort vollzogen werden, 1) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus des zweiten Endes des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls eine zweite Nukleotidsequenz vorhanden ist, die mit der komplementären 5'-Nukleotidsequenz des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann; und 2) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus sowohl des ersten Endes als auch des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleinsäuresequenz vorhanden ist, die zu den 5'-Zielsequenzen an oder nahe bei dem ersten Ende des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann. In diesen Ausführungsformen können das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls entweder stumpf sein oder einen Überhang enthalten.
  • Ein Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet oder ungerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls kann außerdem ausgeführt werden, indem ein topoisomerase-beladenes erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das an einem ersten Ende einen ersten 5'-Überhang und eine erste Topoisomerase, die kovalent an den 3'-Terminus gebunden ist, aufweist, und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz enthält, die zu dem ersten 5'-Überhang komplementär ist, in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren wird unter solchen Bedingungen ausgeführt, sodass die 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes selektiv mit dem ersten 5'-Überhang hybridisieren kann, wodurch die erste Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des ersten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann.
  • Ein solches Verfahren kann weiters das Kontaktieren des topoisomerase-beladenen ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül einschließen, wobei ein erstes Ende des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 5'-Überhang und eine zweite Topoisomerase, die kovalent am 3'-Terminus gebunden ist, aufweist, und wobei das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein zweites stumpfes Ende aufweist, das eine 5'-Nukleotidsequenz enthält, die zu dem 5'-Überhang des dritten Nukleinsäuremoleküls komplementär ist. Das Kontaktieren kann beispielsweise unter solchen Bedingungen vorgenommen werden, dass die 5'-Nukleotidsequenz des zweiten stumpfen Endes der zweiten doppelsträngigen Nukleinsäure selektiv mit dem 5'-Überhang des ersten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, wodurch die zweite Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann. Die erste und zweite Topoisomerase können gleich oder verschieden sein, und auf Wunsch kann das erste oder dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül statt topoisomerase-beladen zu sein, eine Topoisomerase-Erkennungsstelle enthalten, wobei das Verfahren weiters das Kontaktieren der Reaktionspartner mit einer Topoisomerase einschließen kann. Ein Verfahren der Erfindung kann derart ausgeführt werden, dass das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet verbunden wird und danach das dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gerichtet oder ungerichtet mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden wird oder alle Reaktionspartner gleichzeitig eingebunden werden können.
  • Ein Verfahren der Erfindung liefert Mittel, um einen offenen Leserahmen von einer cDNA- oder einer isolierten genomischen DNA-Sequenz exprimierbar zu machen, indem ein oder mehrere Expressionsregulationselemente mit der mutmaßlichen Codierungssequenz funktionsfähig verbunden werden. Beispiele für Expressionsregulationselemente, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, werden hierin offenbart und schließen transkriptionale Expressionsregulationselemente, translationale Expressionsregulationselemente, Elemente, die den Transport oder die Lokalisierung eines Nukleinsäuremoleküls oder Polypeptids in einer Zelle (oder aus dieser heraus) erleichtern, Elemente, die einen detektierbaren Phänotyp verleihen, und dergleichen ein. Transkriptionale Expressionsregulationselemente schließen beispielsweise Promotoren, wie etwa jene vom Cytomegalievirus, Moloney Leukemia Virus und Herpesvirus als auch jene von den Genen, die Metallothionein, skelettales Aktin, Phosphoenolpyruvatcarboxylase, Phosphoglycerat, Dihydrofolatreductase und Thymidinkinase codieren, als auch Promotoren von viralen langen terminalen Wiederholungen (LTRs: long terminal repeats (engl.)), wie etwa Rous-Sarcoma-Virus-LTR, Enhancer, die konstitutiv wirksam sein können, wie etwa ein Immunglobulin-Enhancer, oder induzierbar sein können, wie etwa SV40-Enhancer, und dergleichen ein. Beispielsweise ist ein Metallothionein-Promotor ein konstitutiv wirksamer Promotor, der außerdem zu einem höheren Grad der Expression veranlasst werden kann, wenn er einem Metallion, wie etwa einem Kupfer-, Nickel- oder Cadmium-Ion ausgesetzt wird. Im Vergleich dazu ist ein Tetracyclin (tet) induzierbarer Promotor ein Beispiel für einen Promotor, der induziert wird, wenn er Tetracyclin oder einem Tetracyclin-Analogon ausgesetzt ist, aber ansonsten inaktiv ist.
  • Ein transkriptionales Expressionsregulationselement kann außerdem ein gewebespezifisches Expressionsregulationselement sein, beispielsweise ein muskelzellenspezifisches Expressionsregulationselement, so dass eine Expression eines codierten Produktes auf die Muskelzellen in einem Individuum oder auf Muskelzellen in einer Mischpopulation von Zellen in einer Kultur, beispielsweise einer Organkultur, beschränkt ist. Muskelzellenspezifische Expressionsregulationselemente schließen beispielsweise den Muskel-Kreatinkinase-Promotor (Sternberg et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2896–2909, 1988, durch die Bezugnahme Bestandteil dieses Patents) und den Myosinleichtketten-Enhancer/Promotor (Donoghue et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 5847–5851, 1991) ein, die im Fach wohlbekannt sind. Sowohl weitere gewebespezifische Promotoren als auch Expressionsregulationselemente, die nur während bestimmter Entwicklungsstadien einer Zelle oder eines Organismus exprimiert werden, sind im Fach wohlbekannt.
  • Expressionsregulationselemente oder andere Elemente, die bei der Erzeugung eines Konstrukts gemäß einem Verfahren der Erfindung nützlich sind, können auf verschiedenste Weise erhalten werden. Insbesondere sind viele der Elemente in im Handel erhältlichen Vektoren enthalten und können von diesen isoliert werden und beispielsweise mit einem PCR-Verfahren, wie hierin offenbart ist, so modifiziert werden, dass sie eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an einem Ende oder an beiden Enden enthalten. Außerdem sind die Sequenzen von oder Codierungen für die hier verwendbaren Elemente im Allgemeinen wohlbekannt und in Veröffentlichungen offenbart. In vielen Fällen sind sowohl die Elemente, beispielsweise transkriptionale und translationale Expressionsregulationselemente, als auch Zellkompartimentierungsdomänen relativ kurze Sequenzen und daher für eine chemische Synthese des Elements oder einer das Element codierenden Nukleotidsequenz zugänglich. Folglich kann in einer Ausführungsform ein Element, das eine Zusammensetzung aufweist, die bei der Erzeugung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls gemäß einem Verfahren der Erfindung nützlich ist, oder das in einem Satz der Erfindung enthalten ist, chemisch synthetisiert werden, und kann auf Wunsch so synthetisiert werden, dass es eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an einem oder an beiden Enden des Elements enthält und weiters nach einer Spaltung durch eine ortsspezifische Topoisomerase eine Überhangsequenz aufweist.
  • Wo doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle gemäß einem Verfahren der Erfindung gerichtet zu verbinden sind, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen funktionsfähig verbunden, so dass das rekombinante Nukleinsäuremolekül, das erzeugt wird, eine gewünschte Struktur hat, eine gewünschte Funktion erfüllt, ein gewünschtes Expressionsprodukt codiert oder dergleichen. So, wie der Ausdruck "funktionsfähig verbunden" hier gebraucht wird, bedeutet er, dass zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle in Bezug aufeinander derart angeordnet sind, dass sie als eine Einheit wirksam werden, um eine Funktion zu erfüllen, die einer Sequenz oder beiden Sequenzen oder einer Kombination davon zugeschrieben werden kann. Beispielsweise kann ein Nukleinsäuremolekül, das einen offenen Leserahmen enthält, mit einem Promotor funktionsfähig verbunden sein, derart, dass der Promotor seine Regulationswirkung auf den offenen Leserahmen überträgt, ähnlich der Art und Weise, in der er eine Expression eines offenen Leserahmens herbeiführen würde, der normalerweise einem Genom in einer Zelle zugeordnet ist. Auf die gleiche Weise können zwei oder mehr Nukleinsäuremoleküle, die offene Leserahmen aufweisen, funktionsfähig im Raster verbunden werden, derart, dass bei einer Transkription und Translation ein chimäres Fusionspolypeptid erzeugt wird.
  • Ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen offenen Leserahmen aufweist, kann unter Verwendung eines beliebigen Amplifikationsverfahrens amplifiziert werden, beispielsweise mittels PCR unter Verwendung eines Primerpaares, um ein amplifiziertes erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu einem 5'-Überhang eines topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung komplementär ist. Wo beide Enden des amplifizierten ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls Gegenstücke der zwei Überhänge an dem topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül sind, unterscheiden sich die 5'-Überhänge voneinander. Die amplifizierten ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle können dann mit dem topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das ein gewünschtes Expressionsregulationselement wie etwa einen Promotor aufweist, so in Kontakt gebracht werden, dass das zweite Nukleinsäuremolekül gemäß einem Verfahren der Erfindung funktionsfähig an das 5'-Ende der codierenden Sequenz gebunden wird.
  • Bei einem Verfahren der Erfindung können verschiedenste Kombinationen von Komponenten verwendet werden. Beispielsweise kann das Verfahren ausgeführt werden, indem ein topoisomerase-aktiviertes erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem ersten Ende und einem zweiten Ende, wobei das zweite Nukleinsäuremolekül an dem ersten oder dem zweiten Ende oder an beiden Enden eine Hydroxylgruppe am 5'-Terminus desselben Endes und einen 5'-Überhang aufweist, in Kontakt gebracht werden. Wo der 5'-Terminus eines zu verbindenden Endes oder beider zu verbindender Enden eine 5'-Phosphatgruppe aufweist, kann außerdem eine Phosphatase mit den Komponenten des Reaktionsgemischs in Kontakt gebracht werden. Beim Kontaktieren kann die Phosphatase erforderlichenfalls eine 5'-Hydroxylgruppe an demselben Ende erzeugen, und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann dann mit dem topoisomerase-aktivierten ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet verbunden werden. Der Fachmann wird weitere Kombinationen von Komponenten erkennen, die bei der Ausführung eines Verfahrens der Erfindung verwendbar sind.
  • Ein Verweis auf ein Kontaktieren eines ersten Nukleinsäuremoleküls und eines zweiten Nukleinsäuremoleküls "unter solchen Bedingungen, dass alle Komponenten in Kontakt sind" hat, wie er hier gebraucht wird, die Bedeutung, dass die Reaktionsbedingungen geeignet sind, dass ein topoisomerase-gespaltenes Ende eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls in hinreichende Nähe gelangt, so dass eine Topoisomerase ihre Enzymaktivität entfalten kann und den 3'-Terminus des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einer 5'-Hydroxylgruppe am Terminus eines zweiten Nukleinsäuremoleküls kovalent verbindet. Beispiele für solche Bedingungen schließen beispielsweise die Reaktionstemperatur, die Ionenstärke und den pH-Wert ein. Außerdem können solche Bedingungen empirisch oder unter Verwendung von Formeln, die Bedingungen für spezifische Hybridisierungen von Nukleinsäuremolekülen vorhersagen, wie im Fach wohlbekannt ist (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1987 und Nachträge im Jahre 1995), bestimmt werden.
  • Wie hier offenbart ist, liefert ein PCR-Verfahren unter Verwendung von Primern, die so konstruiert sind, dass sie komplementäre Nukleotidsequenzen an einem Ende oder an beiden Enden eines amplifizierten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einbauen, ein Beispiel für ein geeignetes Mittel, um doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen, die in einem Verfahren der Erfindung verwendbar sind. Zumindest einer der Primer eines Primerpaares ist so konstruiert, dass er in einer 5'- zu 3'-Orientierung eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu einem ersten Überhang an dem topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung komplementär ist. Der zweite Primer des PCR-Primerpaares kann zu einer gewünschten Sequenz des zu amplifizierenden Nukleinsäuremoleküls komplementär sein und kann eine zweite komplementäre Sequenz aufweisen.
  • Ein Primer kann eine weitere Sequenz, der das Interesse gilt, enthalten oder codieren, einschließlich, z.b. einer ortsspezifischen Integrationserkennungsstelle, wie etwa eine att-Stelle, eine lox-Stelle oder dergleichen, oder kann, wie weiter oben erörtert ist, einfach benutzt werden, um eine Topoisomerase-Erkennungsstelle in ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül einzubringen, das eine solche Sequenz, der das Interesse gilt, aufweist. Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist und eine ortsspezifische Integrationserkennungsstelle wie etwa eine att-Stelle oder eine lox-Stelle enthält, kann spezifisch an einen gewünschten Ort, etwa in einen Vektor, an einen Genlocus oder dergleichen, der die erforderliche Integrationsstelle, beispielsweise eine att-Stelle bzw. eine lox-Stelle, enthält, und nach dem in Kontakt mit den entsprechenden Enzymen, die für das ortsspezifische Ereignis erforderlich sind, beispielsweise Lambda Int- und IHF-Proteine bzw. Cre-Rekombinase, integriert werden. Der Einbau beispielsweise von attB- oder attP-Sequenzen in ein gerichtet oder ungerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül gemäß einem Verfahren der Erfindung ermöglicht die zweckmäßige Manipulation des Nukleinsäuremoleküls unter Verwendung des GATEWAYTM-Klonierungssystems (Invitrogen Corp., La Jolla, CA). Ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das in einem Verfahren der Erfindung benutzt wird, kann ein linearisierter Vektor sein, der zwei ortsspezifische Integrationsstellen aufweist, beispielsweise ein "Einbringungsvektor" (GATEWAYTM-Klonierungssystem), und ein Verfahren der Erfindung kann angewendet werden, um ein zweites (oder weitere) doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zwischen den ortsspezifischen Integrationsstellen einzubauen.
  • Ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zur Verwendung in einem Verfahren oder einem Satz der Erfindung kann mit einer beliebigen Amplifikationsreaktion, beispielsweise mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), so amplifiziert werden, dass es eine komplementäre Nukleotidsequenz an einem 5'-Ende aufweist. Obwohl die PCR als Beispiel dient, können auch andere Amplifikationsverfahren benutzt werden, um ein Nukleinsäuremolekül so zu amplifizieren, dass das amplifizierte Nukleinsäuremolekül eine komplementäre Sequenz am 5'-Terminus eines seiner Enden aufweist. Die komplementäre Nukleotidsequenz ist zu dem 5'-Überhang an der topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure, woran die amplifizierte Nukleinsäure ligiert wird, komplementär. Diese Komplementarität erleichtert die Assoziation der Nukleinsäuremoleküle in einer vorbestimmten Orientierung, woraufhin sie durch Topoisomerase gemäß einem Verfahren der Erfindung verbunden werden können.
  • Die Amplifikationsprimer können so ausgelegt sein, dass sie einem gewünschten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, beispielsweise einem doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das ein transkriptionales oder translationales Expressionsregulationselement codiert, oder einer codierenden Sequenz, der das Interesse gilt, wie etwa einem Epitoptag oder einer Zellkompartimentierungsdomäne, besondere Eigenschaften verleiht. Gemäß diesem Aspekt sind die Amplifikationsprimer so konstruiert, dass nach einer Amplifikation das doppelsträngige Nukleinsäuremolekül eine komplementäre 5'-Sequenz, wie gewünscht, an einem Ende oder an beiden Enden aufweist.
  • Außerdem können Amplifikationsprimer benutzt werden, um ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu amplifizieren, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt worden ist. Beispielsweise kann ein Verfahren der Erfindung aus drei doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, darunter ein Nukleinsäuremolekül, das einen Promotor aufweist, ein Nukleinsäuremolekül, das eine codierende Sequenz aufweist, und ein Nukleinsäuremolekül, das ein Polyadenylierungssignal aufweist, ein exprimierbares, rekombinantes Nukleinsäuremolekül erzeugen. Die Erzeugung des Nukleinsäuremoleküls wird durch den Einbau komplementärer 5'- (oder 3'-) Sequenzen an den Enden der zu verbindenden doppelsträngigen Nukleotidsequenzen, wobei vorzugsweise eine der komplementären Sequenzen eine Überhangsequenz ist, erleichtert.
  • An sich wird, indem ein PCR-Primerpaar konstruiert wird, das einen ersten Primer enthält, der für einen Überhang des den Promotor enthaltenden Nukleinsäuremoleküls, der stromaufwärts des Promotors ist, spezifisch ist, und einen zweiten Primer enthält, der für einen Überhang des das Polyadenylierungssignal aufweisenden Nukleinsäuremoleküls, der stromabwärts des Signals ist, spezifisch ist, nur ein die volle Länge aufweisendes funktionsfähiges, rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das den Promotor, die codierende Sequenz und das Polyadenylierungssignal in der korrekten (vorbestimmten) Orientierung enthält, amplifiziert werden. Insbesondere werden Teilreaktionsprodukte, die beispielsweise nur einen Promotor enthalten, der an die codierende Sequenz gebunden ist, und Reaktionsprodukte, die Brüche enthalten, nicht amplifiziert. Folglich kann eine PCR benutzt werden, um gezielt ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu konstruieren, derart, dass es in einem Verfahren der Erfindung verwendbar ist, und um selektiv nur jene Reaktionsprodukte zu amplifizieren, die die gewünschten Komponenten und Eigenschaften aufweisen.
  • Ein Verfahren der Erfindung kann derart ausgeführt werden, dass ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das gerichtet an ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül zu ligieren ist, eines von einer Vielzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle ist. So wie der Ausdruck "Vielzahl" hier mit Bezug auf ein erstes oder zumindest ein zweites Nukleinsäuremolekül gebraucht wird, verweist er darauf, dass die Nukleinsäuremoleküle verwandt, jedoch verschieden sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind die Nukleinsäuremoleküle einer Vielzahl insofern "verwandt", als jedes Nukleinsäuremolekül in der Vielzahl beispielsweise eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu einer 5'-Überhangsequenz ist, die an einem topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül vorhanden ist, woran die zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle gerichtet gebunden werden sollen. Außerdem sind die Nukleinsäuremoleküle einer Vielzahl insofern "verschieden", als sie beispielsweise eine cDNA-Bibliothek, eine kombinatorische Bibliothek von Nukleinsäuremolekülen, eine bunt gemischte Population von Nukleinsäuremolekülen oder dergleichen enthalten können. Verfahren, um cDNA-Bibliotheken, kombinatorische Bibliotheken, bunt gemischte Populationen von Nukleinsäuremolekülen enthaltende Bibliotheken und dergleichen zu schaffen, sind im Fach wohlbekannt (siehe beispielsweise: US-Patent Nr. 5,837,500; US-Patent Nr. 5,622,699; US-Patent Nr. 5,206,347; Scott and Smith, Science, 249: 386–390, 1992; Markland et al., Gene 109: 13–19, 1991; O'Connell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 5883–5887, 1996; Tuerk und Gold, Science 249: 505–510, 1990; Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 64: 763–797, 1995).
  • Wo ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül eines aus einer Population von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen ist, kann ein Verfahren der Erfindung weiters eine Population erster doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle verwenden, wovon jedes eine andere und zufällig erzeugte Nukleotidsequenz an oder nahe bei einem 3' und/oder 5'-Terminus eines ersten und/oder zweiten Endes, beispielsweise zufällig erzeugte 3'- und/oder 5'-Überhänge an oder nahe bei einem ersten Ende aufweist. Solch eine Population von zufällig erzeugten Nukleotidsequenzen nahe einem Ende wird Sequenzen, die zu Nukleotidsequenzen an oder nahe bei den Enden vieler oder aller zweiter doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle der Vielzahl komplementär sind, einschließen. Folglich kann das Verfahren benutzt werden, um verbundene rekombinante Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen, einschließlich vieler oder aller Nukleinsäuremoleküle in der Vielzahl zweiter doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle.
  • Die Verfahren der Erfindung finden breite Anwendung auf dem Gebiet der Molekularbiologie. Wie weiter unten ausführlicher erörtert ist, können die Verfahren der Erfindung beispielsweise benutzt werden, um DNA- oder RNA-Sonden zu markieren, um sense- oder antisense-RNA zu erzeugen, um Köder- oder Beute-Konstrukte für die Durchführung von 2-Hybrid-Assays bereitzustellen, um lineare Expressionselemente bereitzustellen, um Konstrukte bereitzustellen, die für gekoppelte in vitro-Transkriptions/Translations-Assays verwendbar sind, und um ein gerichtetes Klonieren durchzuführen.
  • Ein gerichtet oder ungerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das gemäß diesem Aspekt der Erfindung erzeugt wird, kann linear sein, ist jedoch vorzugsweise ringförmig, insbesondere ein Vektor, wie oben beschrieben ist. Das ringförmige rekombinante Nukleinsäuremolekül kann derart erzeugt werden, dass es die Eigenschaften eines Vektors hat und beispielsweise Expressionsregulationselemente enthält, die für eine Replikation in einer prokaryotischen Wirtszelle, einer eukaryotischen Wirtszelle oder beiden erforderlich sind, und kann eine Nukleotidsequenz enthalten, die eine Polypeptid codiert, das Antibiotika-Resistenz oder dergleichen verleiht.
  • Ein Verfahren der Erfindung kann weiters das Einbringen eines gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle einschließen, die eine prokaryotische Zelle sein kann, wie etwa ein Bakterium, oder eine eukaryotische Zelle, wie etwa eine Säugerzelle. Aus einer solchen Zelle kann ein nicht menschlicher transgener Organismus hervorgebracht werden. Ein Vorteil eines solchen Verfahrens ist, dass das erzeugte rekombinante Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung zirkularisiert wird, in eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert werden kann, worin das Konstrukt amplifiziert wird. Folglich kann ein in vivo-Verfahren unter Verwendung einer Wirtszelle benutzt werden, um eine große Menge von einem zirkularisierten Produkt zu erhalten, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist.
  • Es sollte anerkannt werden, dass ein Verfahren der Erfindung teilweise dadurch gekennzeichnet ist, dass ein verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das dadurch erzeugt ist, entweder einen Bruch in einem Strang aufweist, da eine Topoisomerase nur an einen 3'-Terminus der zu verbindenden Enden angefügt ist, oder einen Strang aufweist, der vollständig von nur einem von zwei Nukleinsäuremolekülen stammt, die gemäß dem Verfahren verbunden sind. Wo das rekombinante Nukleinsäuremolekül einen Bruch aufweist, kann der Bruch, falls gewünscht, in eine Phosphodiesterbindung überführt werden, indem beispielsweise das den Bruch aufweisende rekombinante Nukleinsäuremolekül mit einer DNA-Ligase in Kontakt gebracht wird, indem das den Bruch aufweisende rekombinante Nukleinsäuremolekül in eine Zelle, eingebracht wird wie etwa ein Bakterium, die den Bruch reparieren kann, oder, falls gewünscht, durch jedes andere Verfahren. Folglich schließt ein Verfahren der Erfindung in einer Ausführungsform ein Stranginvasionsereignis und eine Ligation ein.
  • Wo ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist, keinen Strang aufweist, der vollständig von nur einem der anfänglichen Nukleinsäuremoleküle stammt, kann das Verfahren weiters einen Spaltungsschritt einschließen, in dem die verdrängte Nukleotidsequenz von dem Produkt abgespalten wird. Ein solcher Spaltungsschritt kann unter Verwendung irgendeines Verfahrens ausgeführt werden, das dafür bekannt ist, dass es eine einzelsträngige Nukleotidsequenz abspaltet oder abbaut, einschließlich beispielsweise des in Kontakt bringen eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das den verdrängten Strang aufweist, mit einem Enzym, das (in Abhängigkeit von der Orientierung des verdrängen Strangs) eine 5'-zu-3'- oder 3'-zu-5'-Einzelstrangnukleinsäure-Exonucleaseaktivität besitzt. Ein solches Verfahren kann in geeigneter Weise in vitro ausgeführt werden. Alternativ kann das rekombinante doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in eine Zelle eingebracht werden, beispielsweise eine E. coli-Zelle, worin die verdrängte Nukleotidsequenz abgespaltet wird.
  • Ein Verfahren der Erfindung kann benutzt werden, um ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das ein chimäres Fusionspolypeptid codiert. Um ein derartiges rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen können ein erstes und zweites (oder weitere) doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül die jeweils den offenen Leserahmen vollständig oder teilweise codieren können, und das erste und zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit ersten und/oder zweiten Enden, wie hier offenbart, werden gerichtet verbunden. Das chimäre Polypeptid kann ein Fusionspolypeptid aufweisen, bei dem zwei (oder mehr) codierte Peptide (oder Polypeptide) in ein einziges Produkt translatiert sind, d.h. dass die Peptide durch eine Peptidbindung kovalent verbunden sind.
  • Beispielsweise kann ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül eine Zellkompartimentierungsdomäne wie etwa eine Plasmamembran-Lokalisationsdomäne, ein Kernlokalisationssignal, ein Signal zur Lokalisation der mitochondrialen Membran, ein Signal zur Lokalisation des endoplasmatischen Retikulums oder dergleichen, oder eine Protein-Transduktionsdomäne wie etwa die Transduktionsdomäne des HIV- (humanes Immundefizienzvirus) TAT-Proteins, die eine Translokation eines daran gebundenen Peptids in eine Zelle erleichtern kann (siehe Schwarze et al., Science 285: 1569–1572, 1999; Derossi et al., J. Biol. Chem. 271: 18188, 1996; Hancock et al., EMBO J. 10: 4033–4039, 1991; Buss et al., Mol. Cell. Biol. 8: 3960–3963, 1988; US-Patent Nr. 5,776,689), codieren. Eine solche Domäne kann nützlich sein, um auf ein Fusionspolypeptid abzuzielen, das die Domäne und ein durch ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül codiertes Polypeptid aufweist, woran sie gemäß einem Verfahren der Erfindung gerichtet gebunden ist, für ein bestimmtes Kompartiment in der Zelle oder für eine Sekretion aus einer Zelle oder einen Eintritt in eine Zelle. An sich liefert die Erfindung Mittel, um gerichtet verbundene rekombinante Nukleinsäuremoleküle zu erzeugen, die ein chimäres Polypeptid codieren.
  • Ein Fusionspolypeptid, das von einem gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremolekül exprimiert wird, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist, kann außerdem ein Peptid aufweisen, das die Eigenschaft eines detektierbaren Markers oder eines Tags hat, so dass das exprimierte Fusionspolypeptid detektiert, isoliert oder dergleichen werden kann. Beispielsweise kann ein erstes, zweites oder weiteres doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine Topoisomerase-Erkennungsstelle enthält, oder ein Spaltprodukt davon, wie hier offengelegt ist, ein Enzym codieren, wie etwa alkalische Phosphatase, ϑ-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Luciferase oder andere Enzyme, oder kann eine Peptidtag wie etwa eine Polyhistidinsequenz (z.B. Hexahistidin), ein V5-Epitop, ein c-myc-Epitop, ein Hämagglutinin-A-Epitop, ein FLAG-Epitop oder dergleichen codieren. Eine Expression eines Fusionspolypeptids, das einen detektierbaren Marker enthält, kann mit einem geeigneten Reagens detektiert werden, beispielsweise durch Detektieren der Lichtausstrahlung nach Zugabe von Luciferin zu einem Luciferase enthaltenden Fusionspolypeptid oder durch Detektieren der Nickelionenbindung an ein Fusionspolypeptid, das einen Polyhistidin-Tag aufweist.
  • Ein Polyhistidin-Tag kann etwa zwei bis etwa zehn aneinander grenzende Histidinreste (z.B. zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn aneinander grenzende Histidinreste) aufweisen. Der Tag kann auch ein Peptidtag sein, die sowohl Nickelionen als auch andere Metallionen (z.B. ein Kupferion) bindet, und kann für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie benutzt werden. Beispiele für solche Tags, schließen Peptide ein, die die Formel R1-(His-X)n-R2 haben, wobei (His-X)n ein metallchelatbildendes Peptid darstellt und n eine Zahl zwischen zwei bis zehn (z.B. zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun oder zehn) ist, und X eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Asparagin, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin besteht. Weiters kann R2 ein Polypeptid sein, das kovalent an das metallchelatbildende Peptid gebunden ist, und R1 kann entweder Wasserstoff oder ein oder mehrere (z.B. ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, zwanzig, dreißig, fünfzig, sechzig usw.) Aminosäurereste darstellen. Außerdem kann R1 ein Polypeptid sein, das kovalent an das metallchelatbildende Peptid gebunden ist, und R2 kann entweder Wasserstoff oder ein oder mehrere (z.B. ein, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, zwanzig, dreißig, fünfzig, sechzig usw.) Aminosäurereste sein. Tags dieser Art sind in dem US-Patent Nr. 5,594,115 beschrieben.
  • Gleichermaßen kann eine Isolation eines Fusionspolypeptids, das einen Tag aufweist, durchgeführt werden, indem beispielsweise ein Fusionspolypeptid, das ein myc-Epitop aufweist, über eine Säule geschickt wird, die einen daran gebundenen anti-c-myc-Epitop-Antikörper aufweist, und dann das gebundene Fusionspolypeptid eluiert wird, oder indem ein Fusionspolypeptid, das einen Polyhistidin-Tag aufweist, über eine Nickelionen- oder Kobaltionen-Affinitätssäule geschickt wird und das gebundene Fusionspolypeptid eluiert wird. Verfahren zum Detektieren oder Isolieren solcher Fusionspolypeptide, basierend auf dem gewählten selektierbaren Marker oder dem Tag, werden dem Fachmann wohlbekannt sein (siehe beispielsweise Hopp et al., BioTechnology 6: 1204, 1988; US-Patent Nr. 5,011,912).
  • In einer Ausführungsform codieren die gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle chimäre Polypeptide, die zum Durchführen eines 2-Hybrid-Assays verwendbar sind. Bei einem solchen Verfahren codiert das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein Polypeptid oder eine relevante Domäne davon, das bzw. die vermutlich fähig ist, oder auf diese Fähigkeit geprüft wird, in spezifischer Weise mit einem oder mehreren (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw.) weiteren Polypeptiden zu interagieren. Das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül, mit dem das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gemäß einem Verfahren der Erfindung gerichtet zu verbinden ist, kann eine Transkriptionsaktivierungsdomäne oder eine DNA-Bindungsdomäne codieren. Ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das gerichtet zu verbinden ist, wird beispielsweise so modifiziert, dass es einen 5'-Überhang an einem ersten Ende und eine Topoisomerase-Erkennungsstelle oder ein Spaltprodukt davon an oder nahe bei dem ersten Ende aufweist. Ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das zu verbinden ist, enthält eine 5'-Sequenz oder wird so modifiziert, dass sie eine 5'-Sequenz enthält, die zu dem 5'-Überhang am ersten Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist. Bei Kontakt des ersten und zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einer Topoisomerase codiert das gerichtet verbundene Nukleinsäuremolekül eine erste Hybride, die zum Durchführen eines 2-Hybrid-Assays verwendbar ist (siehe beispielsweise Fields und Song, Nature 340: 245–246, 1989; US-Patent Nr. 5,283,173; Fearon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89: 7958–7962, 1992; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578–9582, 1991; Young, Biol. Reprod. 58: 302–311 (1998)). Ähnliche Verfahren werden angewendet, um das zweite Hybridprotein zu erzeugen, das eine Vielzahl von Polypeptiden aufweisen kann, die auf die Fähigkeit, mit dem Polypeptid des ersten Hybridproteins oder einer Domäne davon zu interagieren, zu prüfen sind. In ähnlicher Weise können solche Verfahren angewendet werden, um gerichtet verbundene Nukleinsäuremoleküle zu konstruieren, die ein Fusionsprotein codieren, das für eine modifizierte Form eines 2-Hybrid-Assays, wie etwa das reverse 2-Hybrid-Assay (Leanna und Hannink, Nucl. Acids Res. 24: 3341–3347, 1996), das reprimierte Transaktivatorsystem (US-Patent Nr. 5,885,779), das Proteinrekrutierungssystem (US-Pat. Nr. 5,776,689) und dergleichen, verwendbar ist.
  • Wie hier offenbart ist, kann ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül eines aus einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, beispielsweise aus einer cDNA-Bibliothek, einer kombinatorischen Bibliothek von Nukleinsäuremolekülen oder einer Population von bunt gemischten Nukleinsäuremolekülen, sein. An sich sind die Verfahren der Erfindung besonders nützlich zur Erzeugung rekombinanter Polynukleotide, die chimäre Polypeptide zum Durchführen eines 2-Hybrid-Assays mit hohem Durchsatz zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen, die in Populationen von Polypeptiden auftreten, codieren (siehe US-Patent Nr. 6,057,101 und US-Patent Nr. 6,083,693). Bei einem solchen Verfahren wird jedes der Hybridproteine des 2-Hybrid-Assays unter Verwendung einer anderen von zwei Populationen (Vielzahl) von Nukleinsäuremolekülen, die Polypeptide codieren, erzeugt, wobei jede Vielzahl eine Komplexität aufweist, die von wenigen verwandten, jedoch verschiedenen Nukleinsäuremolekülen bis zu mehreren zehntausend solchen Molekülen reicht. Durch Ausführen eines Verfahrens der Erfindung, beispielsweise unter Verwendung eines PCR-Primerpaares, um jedes Nukleinsäuremolekül in einer Vielzahl zu amplifizieren, können ohne weiteres gerichtet verbundene rekombinante Polynukleotide erzeugt werden, die eine Population von chimären Köder-Polypeptiden und eine Population von chimären Beute-Polypeptiden codieren. Derartige Populationen werden erzeugt, indem die amplifizierten Vielfalt von Nukleinsäuremolekülen, wovon jedes ein angemessenes Ende aufweist, mit einer Topoisomerase und einem Nukleinsäuremolekül, das eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an oder nahe bei seinen Enden aufweist und eine Transkriptionsaktivierungsdomäne oder eine DNA-Bindungsdomäne codiert, in Kontakt gebracht werden.
  • Ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das in einem Verfahren der Erfindung verwendbar ist, kann auch ein Ribonukleinsäure- (RNA) Molekül codieren, das beispielsweise als Ribosonde, antisense-Nukleinsäuremolekül, Ribozym oder ein Triplexing-Nukleinsäuremolekül funktionieren kann, oder kann in einer in vitro-Translationsreaktion verwendet werden, und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül kann ein Expressionsregulationselement codieren, das für ein Exprimieren einer RNA von dem ersten Nukleinsäuremolekül verwendbar ist. Wenn es beispielsweise gewünscht ist, eine große Menge RNA zu erzeugen, kann eine zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül-Komponente zur Durchführung eines Verfahrens der Erfindung einen RNA-Polymerase-Promotor, wie etwa einen T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase-Promotor, enthalten. Wenn das RNA-Molekül in einer Zelle exprimiert werden soll, beispielsweise ein antisense-Molekül in einer Säugetierzelle exprimiert werden soll, kann das zweite (oder weitere) doppelsträngige Nukleinsäuremolekül einen Promotor enthalten, der in einer Säugetierzelle aktiv ist, insbesondere einen gewebespezifischen Promotor, der nur in einer Zielzelle aktiv ist. Außerdem kann, wenn das RNA-Molekül translatiert werden soll, beispielsweise in einer gekoppelten in vitro- Transkriptions/Translations-Reaktion, das erste Nukleinsäuremolekül oder das zweite (oder weitere) Nukleinsäuremolekül geeignete translationale Expressionsregulationselemente enthalten.
  • Ein gerichtet oder ungerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist, kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, für die im Allgemeinen rekombinante Vektoren, die ein gerichtet oder ungerichtet eingefügtes Nukleinsäuremolekül enthalten, benutzt werden. Folglich kann das gerichtet oder ungerichtet verbundene Nukleinsäuremolekül beispielsweise benutzt werden, um ein Polypeptid in einer Zelle zu exprimieren, um einen pathologischen Zustand oder dergleichen zu diagnostizieren oder zu behandeln. Für eine Verabreichung an ein lebendes Lebewesen wird das gerichtet oder ungerichtet verbundene rekombinante Nukleinsäuremolekül im Allgemeinen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert, die für eine Verabreichung an das Lebewesen geeignet ist. An sich ist das Nukleinsäuremolekül als Medikament zum Behandeln eines Lebewesens, das an einem pathologischen Zustand leidet, verwendbar.
  • Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Fach wohlbekannt und schließen beispielsweise wässrige Lösungen wie etwa Wasser oder physiologisch-gepufferte Kochsalzlösung oder andere Lösungsmittel oder Vehikel wie etwa Glykole, Glycerin, Öle wie etwa Olivenöl oder injizierbare organische Ester ein. Ein pharmazeutisch akzeptabler Träger kann physiologisch akzeptable Verbindungen enthalten, die beispielsweise eine Stabilisierung oder eine Erhöhung der Absorption des Konjugats bewirken. Solche physiologisch akzeptablen Verbindungen schließen beispielweise Kohlenhydrate wie etwa Glucose, Saccharose oder Dextrane, Antioxidantien wie etwa Ascorbinsäure oder Glutathion, Chelatbildner, Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht oder weitere Stabilisatoren oder Excipienten ein. Dem Fachmann wird bekannt sein, dass die Wahl eines pharmazeutisch akzeptablen Träger, einschließlich einer physiologisch akzeptabelen Verbindung, beispielsweise vom Verabreichungsweg der Zusammensetzung abhängt, der beispielsweise oral oder parenteral, wie etwa intravenös und mittels Injektion, Intubation oder weiteren derartigen Verfahren, die im Fach bekannt sind, sein kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann außerdem ein zweites Reagens wie etwa ein diagnostisches Reagens, einen Nährstoff, ein Toxin oder einen therapeutischen Wirkstoff, wie etwa ein Krebs-Chemotherapeutikum, enthalten.
  • Ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül kann in ein Verkapselungsmaterial wie etwa eine Öl-in-Wasser-Emulsion, eine Mikroemulsion, eine Mizelle, eine Mischmizelle, ein Liposom, ein Mikrokügelchen oder eine andere Polymermatrix eingebettet werden (siehe beispielsweise Gregoriadis, Liposome Technology, Bd. 1 (CRC Press, Boca Raton, FL 1984); Fraley et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77 (1981)). Beispielsweise sind Liposomen, die aus Phospholipiden oder anderen Lipiden bestehen, nicht toxische, physiologisch akzeptable und metabolisierbare Träger, die relativ einfach herzustellen und zu verabreichen sind. "Stealth"-Liposomen (siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 5,882,679; 5,395,619 und 5,225,212) sind ein Beispiel für solche Verkapselungsmaterialien, die zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung besonders nützlich sind, und andere "maskierte" Liposomen können gleichermaßen benutzt werden, wobei derartige Liposomen die Zeit verlängern, die ein Nukleinsäuremolekül im Kreislauf bleibt. Kationische Liposomen beispielsweise können auch mit spezifischen Rezeptoren oder Liganden modifiziert sein (Morishita et al., J. Clin. Invest., 91: 2580–2585 (1993)). Außerdem können die Nukleinsäuremoleküle in eine Zelle eingebracht werden, indem sie mit einem Adenovirus-Polylysin-Komplex komoplexiert werden (siehe beispielsweise Michael et al., J. Biol. Chem. 268: 6866–6869 (1993)). Solche Zusammensetzungen können besonders nützlich sein, um ein Nukleinsäuremolekül in vivo oder in vitro, ex vivo eingeschlossen, in eine Zelle einzubringen, wobei die Zelle, die das Nukleinsäuremolekül enthält, dem Lebewesen wieder verabreicht wird. (siehe US-Patent Nr. 5,399,346). Ein gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugtes Nukleinsäuremolekül kann auch mit einem biolistischen Verfahren in eine Zelle eingebracht werden (siehe beispielsweise Sykes und Johnston, supra, 1999).
  • Wie hier offenbart ist, enthält ein gerichtet verbundenes Nukleinsäuremolekül, das gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt ist, einen Bruch, der beispielsweise behoben werden kann, indem das unterbrochene rekombinante Nukleinsäuremolekül mit einer Ligase in Kontakt gebracht wird. Solch ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das in beiden Strängen kovalent gebunden ist, kann als Matrize für eine Amplifikationsreaktion wie etwa PCR benutzt werden. An sich kann eine große Menge des Konstrukts erzeugt werden. Außerdem kann eine Amplifikationsreaktion für ein in vitro-Selektionsverfahren sorgen, um nur ein gewünschtes Produkt zu erhalten, ohne Teilreaktionsprodukte zu erhalten. Beispielsweise kann ein Verfahren der Erfindung benutzt werden, um ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erzeugen, das in einer 5'-zu-3'-Orientierung funktionsfähig verbunden ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das einen Promotor aufweist, ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine codierende Region aufweist, und ein drittes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein Polyadenylierungssignal enthält, aufweist, wobei die Brüche in dem erzeugten rekombinanten Nukleinsäuremolekül ligiert sind.
  • Durch Auswählen eines PCR-Primerpaares, das einen ersten Primer, der zu einer Nukleotidsequenz stromaufwärts der Promotorsequenz komplementär ist, und einen zweiten Primer, der zu einer Nukleotidsequenz stromabwärts des Polyadenylierungssignals komplementär ist, enthält, kann ein funktionsfähiges Amplifikationsprodukt erzeugt werden, das den Promotor, die codierende Region und ein Polyadenylierungssignal enthält. Im Gegensatz dazu werden Teilreaktionsprodukte, denen entweder das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül oder das dritte doppelsträngige Nukleotid fehlt, nicht amplifiziert, da entweder der erste oder der zweite Primer nicht mit dem Teilprodukt hybridisieren wird. Außerdem würde kein Konstrukt erzeugt werden, dem das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül fehlt, was auf das Nichtvorhandensein der Komplementarität der 5'-Überhangsequenzen des ersten und dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zurückzuführen ist. An sich liefert die Erfindung, zum Teil, Mittel, um ein gewünschtes funktionsfähiges, gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu erhalten.
  • Die Verwendung einer Amplifikationsreaktion wie etwa PCR in dieser Weise liefert außerdem Mittel, um eine große Anzahl von Nukleinsäuremolekülen, die gemäß einem Verfahren der Erfindung erzeugt sind, zu durchsuchen, um Konstrukte, von Interesse, zu identifizieren. Da Verfahren zur Anwendung einer PCR bei automatisierten Analysen mit hohem Durchsatz wohlbekannt und Routine sind, wird anerkannt werden, dass die Verfahren der Erfindung ohne weiteres an eine Verwendung in einem System mit hohem Durchsatz angepasst werden können. Mit einem solchen System kann eine große Anzahl von Konstrukten parallel einem Screening unterzogen werden, und Teilreaktionsprodukte oder Produkte einer unvollständigen Reaktion können identifiziert und beseitigt werden, wodurch ein Vergeuden von Zeit und Geld vermieden wird, da es ansonsten erforderlich wäre, in weiteren Versuchen die Konstrukte zu charakterisieren oder ihre Funktionalität zu untersuchen.
  • Rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die durch ein Verfahren der Erfindung erzeugt sind, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül eine erste Topoisomerase enthält, jedoch keine zweite Topoisomerase oder Topoisomerase-Bindungsstelle, sind im Allgemeinen linear, wohingegen gemäß anderen Aspekten die Verfahren der Erfindung ringförmige rekombinante Nukleinsäuremoleküle erzeugen können. Jedoch kann ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das als ein lineares Molekül erzeugt worden ist, zirkularisiert werden, beispielsweise um es als einen Vektor zu verwenden. Außerdem kann ein lineares, gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül, das durch ein Verfahren der Erfindung erzeugt ist, in einen Vektor kloniert werden, der ein Plasmidvektor oder ein viraler Vektor, wie etwa ein Bakteriophage-, Baculovirus-, Retrovirus-, Lentivirus-, Adenovirus-, Vaccinia-Virus, Semliki-Forest-Virus- und Adeno-assoziiertes Virus-Vektor, sein kann, die alle wohlbekannt sind und im Handel (Invitrogen Corp., La Jolla, CA; Promega, Madison, WI; Stratagene, La Jolla CA; GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) käuflich erworben werden können.
  • Die Verfahren der Erfindung können außerdem angewendet werden, um ein Nukleinsäuremolekül mit einer chemischen oder einem kleinen organischen oder anorganischen Anteil detektierbar zu markieren, so dass das Nukleinsäuremolekül als Sonde verwendbar ist. Beispielsweise kann ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das eine Topoisomerase-Erkennungsstelle oder ein Spaltprodukt davon an einem 3'-Terminus aufweist, daran gebunden eine detektierbaren Anteil wie etwa ein Biotin, das unter Verwendung von Avidin oder Streptavidin detektiert werden kann, eine fluoreszierende Komponente (z.B. Cy3, Cy5, FAM, Fluorescein oder Rhodamin), ein Radionuklid (z.B. Schwefel-35, Technicum-99, Phosphor-32 oder Tritium), einen paramagnetischen Spinmarker (z.B. Kohlenstoff-13), eine chemilumineszente Verbindung, ein Epitop wie beispielsweise ein Peptid-Epitop, das unter Verwendung eines Antikörpers, der das Epitop erkennt, detektiert werden kann, oder dergleichen haben, so dass bei einem Erzeugen eines gerichtet verbundenen doppelsträngigen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls gemäß einem Verfahren der Erfindung das erzeugte Nukleinsäuremolekül markiert sein wird. Verfahren zum detektierbaren Markieren eines Nukleinsäuremoleküls mit solchen Anteilen sind im Fach wohlbekannt (siehe beispielsweise Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Academic Press 1996)). Es sollte anerkannt werden, das derartige Elemente, wie sie hierin offenbart sind oder sonst im Fach bekannt sind, Nukleinsäuremoleküle einschließen, die Zellkompartimentierungsdomänen oder detektierbare Marker oder Tags codieren oder transkriptionale oder translationale Expressionsregulationselemente enthalten, für einen Satz verwendbare Bestandteile sein können, wie hier offenbart ist.
  • Ein Verfahren der Erfindung, bei dem ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einer ersten Topoisomerase, jedoch nicht mit einer zweiten Topoisomerase oder Topoisomerase- Erkennungsstelle benutzt wird, kann besonders nützlich zum Erzeugen eines exprimierbaren, rekombinanten Nukleinsäuremoleküls sein, das auf ortsspezifische Weise in eine Ziel-DNA-Sequenz eingefügt werden kann. Die Ziel-DNA-Sequenz kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, insbesondere eine genomische DNA-Sequenz und vorzugsweise ein Gen, für das ein Teil oder die gesamte Nukleotidsequenz bekannt ist. Das Verfahren kann unter Verwendung eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ausgeführt werden, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist und ein Polypeptid codiert, beispielsweise einen selektierbaren Marker, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül eine komplementäre Sequenz an beiden Enden aufweist; und durch gerichtetes Verbinden des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem ersten und zweiten PCR-Amplifikationsprodukt, die aus Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der Stelle erzeugt sind, an welcher das Konstrukt einzufügen ist, wobei jedes Amplifikationsprodukt jeweils eine Topoisomerase-Erkennungsstelle und eine 5'-Zielsequenz, die auf der Grundlage der in der vorliegenden Beschreibung dargestellten Faktoren ausgewählt ist, enthält. Beispielsweise haben das erste und zweite Amplifikationsprodukt verschiedene 5'-Zielsequenzen, so dass bei einem Spalten durch eine Topoisomerase jedes an ein vorbestimmtes Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebunden werden kann.
  • Das erste und zweite Amplifikationsprodukt wird unter Verwendung von zwei PCR-Primerpaar-Sätzen erzeugt. Die zwei PCR-Primerpaar-Sätze sind so gewählt, dass in Gegenwart einer geeigneten Polymerase, wie etwa Taq-Polymerase, und einer Matrize, welche die zu amplifizierenden Sequenzen aufweist, die Primer Abschnitte einer Ziel-DNA-Sequenz amplifizieren, die stromaufwärts der Stelle für die Insertion des selektierbaren Markers und an diese angrenzend und stromabwärts dieser Stelle und an diese angrenzend sind. Außerdem sind die PCR-Primerpaar-Sätze so konstruiert, dass die Amplifikationsprodukte eine Topoisomerase-Erkennungsstelle und, nach einem Spalten durch die ortsspezifische Topoisomerase, eine 5'-Überhangsequenz an dem Ende, das gerichtet mit dem selektierbaren Marker zu verbinden ist enthalten. An sich enthält das erste PCR-Primerpaar 1) einen ersten Primer, der in einer Orientierung von 5' zu 3' eine Nukleotidsequenz, die zu einer 5'-Komplementärsequenz des Endes des selektierbaren Markers komplementär ist, an welches das Amplifikationsprodukt gerichtet gebunden werden soll, eine Nukleotidsequenz, die zu einer Topoisomerase-Erkennungsstelle komplementär ist, und eine Nukleotidsequenz, die zu einer 3'-Sequenz einer Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts der Insertionsstelle komplementär ist, aufweist; und 2) einen zweiten Primer, der eine Nukleotidsequenz der genomischen Ziel-DNA stromaufwärts der 3'-Sequenz, zu welcher der erste Primer komplementär ist, d.h. stromabwärts der Insertionsstelle, aufweist. Das zweite PCR-Primerpaaar enthält 1) einen ersten Primer, der von 5' zu 3' eine Nukleotidsequenz, die zu der 5'-Komplementärsequenz des Endes des selektierbaren Markers, an welche sie gerichtet zu binden ist, komplementär ist, eine Nukleotidsequenz, die zu einer Topoisomerase-Erkennungsstelle komplementär ist, und eine Nukleotidsequenz einer 5'-Sequenz einer Ziel-DNA-Sequenz aufweist, wobei die 5'-Sequenz der genomischen Ziel-DNA stromabwärts der 3'-Sequenz der Ziel-DNA-Sequenz ist, zu welcher der erste Primer des ersten PCR-Primerpaares komplementär ist; und der zweite Primer des zweiten Primerpaares enthält eine Nukleotidsequenz, die zu einer 3'-Sequenz der Ziel-DNA-Sequenz, die stromabwärts der 5'-Sequenz der genomischen Ziel-DNA, die in dem ersten Primer enthalten ist, komplementär ist. Der Fachmann wird anerkennen, dass die Sequenzen des Primers, die zu der genomischen Ziel-DNA komplementär sind, auf der Grundlage der Sequenz der Ziel-DNA ausgewählt sind.
  • Bei einem Zusammentreffen des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das den selektierbaren Marker aufweist, des ersten und zweiten Amplifikationsproduktes (d.h. eines zweiten und dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls) und einer Topoisomerase (sofern die Moleküle nicht topoisomerase-beladen sind) wird ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül erzeugt. Nach einem Ligieren der Brüche kann das erzeugte rekombinante Nukleinsäuremolekül auf Wunsch weiter amplifiziert werden, wobei PCR-Primer benutzt werden, die für eine stromaufwärtige und stromabwärtige Sequenz der genomischen Ziel-DNA spezifisch sind, wodurch sichergestellt ist, dass nur funktionsfähige Konstrukte amplifiziert werden. Solch ein erzeugtes, gerichtet verbundenes Nukleinsäuremolekül ist zum Ausführen einer homologen Rekombination in einem Genom verwendbar, beispielsweise um die Funktion eines Gens in einer Zelle auszuschalten oder um der Zelle, die das erzeugte rekombinante Nukleinsäuremolekül enthält, einen neuartigen Phänotyp zu verleihen. Das Verfahren kann weiters angewendet werden, um einen transgenen, nicht menschlichen Organismus herzustellen, der das erzeugte rekombinante Nukleinsäuremolekül stabil in seinem Genom bewahrt.
  • Ein Verfahren der Erfindung, das eine erste doppelsträngige Nukleinsäure mit einer Topoisomerase oder einer Topoisomerase-Erkennungsstelle beispielsweise an einem ersten Ende, nicht jedoch an dem zweiten Ende beteiligt, kann außerdem verwendbar sein, um eine Adapter- oder Linker-Sequenz an ein Ende oder an beide Enden eines zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, dem das Interesse gilt, jedes einer Vielzahl von zweiten (oder weiteren) doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen eingeschlossen, kovalent zu binden. Wenn es beispielsweise gewünscht ist, Linker an beide Enden eines ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu setzen, kann das Verfahren ausgeführt werden, indem eine Topoisomerase mit einem ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das eine 5'-Komplementärsequenz an oder nahe bei jedem 5'-Terminus aufweist, die zu einer Überhangsequenz an einem 5'-Terminus jeweils des zweiten und dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist; einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül und einem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, wovon jedes eine Topoisomerase-Erkennungsstelle an dem passenden 3'-Terminus und eine 5'-Überhangsequenz an oder nahe bei dem Ende aufweist, das die Topoisomerase-Erkennungsstelle enthält, in Kontakt gebracht wird. Ein passender Terminus ist jener, an dem der Linker mit dem ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet zu verbinden ist. Bei der Ausführung eines solchen Verfahrens können die Linker-Sequenzen, die das zweite und zumindest dritte Nukleinsäuremolekül enthalten, gleich oder verschieden sein.
  • Ein Verfahren der Erfindung, das ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einer 5'-Zielsequenz und einer Topoisomerase an einem ersten Ende beteiligt, kann ausgeführt werden, um ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül gerichtet mit zumindest einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül zu verbinden. Das Verfahren wird typisch angewendet, um das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gerichtet zu verbinden. Jedoch kann das Verfahren auch angewendet werden, um in den folgenden Ausführungsformen das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ungerichtet zu verbinden: 1) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus des zweiten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine zweite Nukleotidsequenz vorhanden ist, die in der Lage ist, mit der komplementären 5'-Nukleotidsequenz am zweiten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren; und 2) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus sowohl des ersten Endes als auch des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz vorhanden ist, die in der Lage ist, mit dem 5'-Überhang des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren. In diesen Ausführungsformen, die zu einem ungerichteten Verbinden führen, können das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls entweder stumpf sein oder einen Überhang aufweisen.
  • In Ausführungsformen, die zu einem Verbinden eines dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül führen, können die Verfahren angewendet werden, um die zwei Nukleinsäuremoleküle gerichtet oder ungerichtet zu verbinden. Das Verfahren wird typisch angewendet, um das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül mit dem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül gerichtet zu verbinden. Jedoch kann das Verfahren auch angewendet werden, um in den folgenden Ausführungsformen das dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ungerichtet zu verbinden: 1) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus des zweiten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine zweite Nukleotidsequenz vorhanden ist, die in der Lage ist, mit der komplementären 5'-Nukleotidsequenz an dem zweiten Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren; und 2) wo an oder nahe bei dem 5'-Terminus sowohl des ersten Endes als auch des zweiten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls eine Nukleotidsequenz vorhanden ist, die in der Lage ist, mit dem 5'-Überhang am ersten Ende des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren. In diesen Ausführungsformen, die zu einem ungerichteten Verbinden führen, können das zweite Ende des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls entweder stumpf sein oder einen Überhang enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Zusammensetzung bereit, die Folgendes aufweist: ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine Topoisomerase, die an dem 3'-Terminus kovalent gebunden ist, aufweist; und ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende eine erste 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, und eine erste 3'-Nukleotidsequenz, die zu der ersten 5'-Nukleotidsequenz komplementär ist. Bei einer solchen Zusammensetzung kann die erste 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem ersten 5'-Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls hybridisiert werden, wobei die erste 3'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verdrängt wird. Das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in solch einer Zusammensetzung kann weiters einen zweiten 5'-Überhang am zweiten Ende aufweisen, und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kann weiters eine zweite 5'-Nukleotidsequenz aufweisen, die zu dem zweiten 5'-Überhang komplementär ist, und eine zweite 3'-Nukleotidsequenz, die zu der zweiten 5'-Nukleotidsequenz komplementär ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Sätze bereit, die ein oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw.) Reagenzien enthalten, die zum gerichteten oder ungerichteten Verbinden doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle nützlich sind. In einer Ausführungsform enthält ein Satz der Erfindung ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine erste Topoisomerase, die kovalent an dem 3'-Terminus gebunden ist, aufweist und das zweite Ende eine zweite Topoisomerase, die kovalent an dem 3'-Terminus gebunden ist, enthält und einen zweiten 5'-Überhang, ein stumpfes Ende, einen 3'-Uridin-Überhang oder einen 3'-Thymidin-Überhang aufweist, wobei der erste 5'-Überhang von dem zweiten 5'-Überhang verschieden ist. Die Topoisomerasen, die gleich oder verschieden sein können, können ebenfalls ein Bestandteil des Satzes sein. Das doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in dem Satz kann, muss aber nicht, ein Vektor sein und kann sowohl ein oder mehrere (z.B. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 usw.) Expressionsregulationselemente als auch Anweisungen für die Verwendung der Bestandteile des Satzes enthalten.
  • Ein Satz der Erfindung kann außerdem eine Vielzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen enthalten, wobei jedes doppelsträngige Nukleinsäuremolekül in der Vielzahl ein erstes stumpfes Ende hat, und wobei das erste stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist. Die zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle in der Vielzahl können eine Vielzahl transkriptionsregulierender Elemente, translationsregulierender Elementen oder Kombinationen davon sein oder können eine Vielzahl von Peptiden wie etwa Peptidtags, Zellkompartimentierungsdomänen und dergleichen codieren.
  • Ein doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das Bestandteil eines Satzes ist, kann beispielsweise ein linearisierter Vektor sein, wie z.B. ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor. Auf Wunsch kann ein solcher Satz eine Vielzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen enthalten, wovon jedes ein anderes Expressionsregulationselement oder ein anderes Element wie etwa, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eine Sequenz, die ein Tag oder ein anderes detektierbares Molekül codiert, oder eine Zellkompartimentierungsdomäne enthält. Die verschiedenen Elemente können verschiedene Typen eines bestimmten Expressionsregulationselements sein, beispielsweise konstitutive oder induzierbare Promotoren oder gewebespezifische Promotoren, oder können verschiedene Typen von Elementen sein, die beispielsweise transkriptionale und translationale Expressionsregulationselemente, Epitoptags und dergleichen einschließen. Solche doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle können topoisomerase-aktiviert sein oder können mit Topoisomerase aktiviert werden, wobei sie 5'-Überhangsequenzen oder Sequenzen, die nach einer Topoisomerase-Aktivierung zu 5'-Überhangsequenzen werden, enthalten. Außerdem kann die Vielzahl von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen 5'-Überhangsequenzen aufweisen, die für ein bestimmtes Expressionsregulationselement einzigartig sind oder die mehreren verwandten Expressionsregulationselementen, beispielsweise einer Vielzahl von verschiedenen Promotorelementen, gemeinsam sind. Die 5'-Überhangsequenzen der doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle können so konstruiert sein, dass ein oder mehrere Expressionsregulationselemente, die in dem doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül enthalten sind, funktionsfähig gerichtet verbunden werden können, um eine sinnvolle Funktion bereitzustellen, beispielsweise können ein Element, das eine Kozak-Sequenz aufweist, und ein Element, das eine Translationsstartstelle enthält, komplementäre 5'-Überhänge aufweisen, so dass die Elemente gemäß einem Verfahren der Erfindung in funktionsfähiger Weise gerichtet verbunden werden können.
  • Die Erfindung stellt weiters Sätze bereit, um Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren zu verbinden. Folglich können die Sätze der Erfindung eine oder mehrere Bestandteile zur Ausführung der hierin beschriebenen Verfahren enthalten. In besonderen Ausführungsformen können die Sätze der Erfindung eine oder mehrere Bestandteile aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Gebrauchsanweisungen für die Bestandteile des Satzes, einem oder mehreren Puffern, einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen (z.B. einem oder mehreren Nukleinsäuremolekülen mit einem 5'-Überhang, einem 3'-Überhang, einem 5'-Überhang und einem 3'-Überhang, zwei 3'-Überhängen, zwei 5'-Überhängen usw.), einer oder mehreren Topoisomerasen, einer oder mehreren Ligasen, einer oder mehreren Rekombinasen, einem oder mehreren Adapter-Linkern zur Herstellung von Molekülen mit einem 5'-Überhang und/oder einem 3'-Überhang, und/oder einem oder mehreren Behältern, in welchen die Verfahren der Erfindung ausgeführt werden können, besteht.
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein topoisomerase-beladenes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül hergestellt, indem zunächst ein im Handel erhältlicher Klonierungsvektor erworben wird. Ein solcher Vektor ist pUni/V5-His, Version A, (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), ein zirkulärer, supergeknäulter Vektor, der einzigartig konstruierte Elemente aufweist. Diese Elemente schließen eine BGH-Polyadenylierungssequenz zur Erhöhung der mRNA-Stabilität in eukaryotischen Wirten, eine T7-Transkriptionsterminationsregion, einen R6Kγ-DNA-Replikationsursprung und ein Kanamycin-Resistenz-Gen und einen Promotor für eine Antibiotika-Resistenz-Selektion ein. Außerdem enthält pUni/V5-His, Version A, eine Mehrfachklonierungsstelle, die eine synthetische DNA-Sequenz ist, die eine Folge von Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen codiert. Diese Stellen sind gentechnisch für ein Klonieren von DNA in einen Vektor an einer spezifischen Position hergestellt. Außerdem ist in der Mehrfachklonierungsstelle des Vektors eine loxP-Stelle 5' zu der Endonuclease-Erkennungsstelle eingefügt, wodurch eine durch Cre-Rekombinase vermittelte Fusion in verschiedenste andere Expressionsvektoren (EchoTM Cloning System, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) erleichtert wird. Für eine einfache Detektion der exprimierten Fusionsproteine unter Verwendung eines anti-V5-Antikörpers ist ein gegebenenfalls C-terminale V5-Epitop-Tag vorhanden. Außerdem ist ein gegebenenfals C-terminaler Polyhistidin- (6 × His) Tag vorhanden, um eine schnelle Reinigung und Detektion der exprimierten Proteine zu ermöglichen. Eine bakterielle ribosomale Bindungsstelle stromabwärts der loxP-Stelle macht eine Transkriptionsinitiation in E. coli möglich. Obwohl diese Kombination von Elementen für den Klonierungsvektor pUni/V5-His, Version A, spezifisch ist, sind viele ähnliche Klonierungs- und Expressionsvektoren im Handel erhältlich oder können aus Sequenzen mit Verfahren, die im Fach wohlbekannt sind, zusammengesetzt werden. pUni/V5-His, Version A, ist ein doppelsträngiges Plasmid mit 2,2 kb (siehe 3 und 5).
  • Die Konstruktion eines mit Topoisomerase I beladenen Klonierungsvektors aus pUni/V5-His, Version A, wird durch Verdauen des Vektors mit Endonuclease, gefolgt von einem komplementären Annealing synthetischer Oligonukleotide und einer ortsspezifischen Spaltung des Heteroduplex durch Vaccinia- Topoisomerase I erreicht. SacI und EcoRI sind zwei der vielen Restriktionsendonuclease-Stellen, die in der Mehrfachklonierungsstelle des Vektors pUni/V5-His, Version A, vorhanden sind (siehe 3). Ein Verdauen des Vektors pUni/V5-His, Version A, mit den entsprechenden Restriktionsenzymen SacI und EcoRI wird kohäsive Enden an dem Vektor hinterlassen (5'-AGCT-3' und 5'-AATT-3', 6). Diese Enzyme sind jederzeit von zahlreichen Lieferanten zu haben, darunter New England Biolabs, (Beverly, MA, Katalog-Nr. RO156S, SacI und RO101S, EcoRI). Der verdaute pUni/V5-His, Version A, wird durch Isopropanolfällung leicht von den verdauten Fragmenten getrennt. Diese und weitere Verfahren zum Verdauen und Isolieren von DNA sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Zweite Auflage. Cold Spring Harbor Laboratory Press; S. 5.28–5.32.)
  • Der gereinigte, verdaute Vektor wird dann mit zwei spezifischen Oligonukleotidadaptern und T4-DNA-Ligase inkubiert. Die Adapter sind Oligonukleotid-Doppelstränge, die Enden aufweisen, die mit den SacI- und EcoRI-Enden des Vektors kompatibel sind. Der Fachmann wird ohne weiteres verstehen, dass für andere Vektoren, die andere Restriktionsorte aufweisen, andere Adpater-Oligonukleotide mit entsprechenden Sequenzen hergestellt werden können. Nach der Inkubation mit T4-DNA-Ligase wird der Vektor, der die ligierten Adapter enthält, mit Isopropanol gereinigt.
  • Der Adapter-Doppelstrang, der aus dem Annealing von TOPO D1 und TOPO D2 resultiert, weist einen einzelsträngigen EcoRI-Überhang an einem Ende und einen 12 Nukleotide umfassenden einzelsträngigen Überhang am anderen Ende auf.
  • Das erste Adapter-Oligonukleotid (TOPO D1) hat eine Komplementierung zu dem EcoRI-kohäsiven Ende 3'-TTAA-5'. Außerdem hat TOPO D1 weitere 24 Basenpaare, einschließlich des Topoisomerase-Konsensus-Pentapyrimidin-Element 5'-CCCTT, das sich 16 Basenpaare stromaufwärts des 3'-Endes befindet. Die verbleibende Sequenz und Größe des TOPO D1-Adapteroligos sind variabel und können so modifiziert werden, um die speziellen Anforderungen der Forscher zu erfüllen. In der gegenwärtigen Ausführungsform ist 5'-AATTGATCCCTTCACCGACATAGTACAG-3' (SEQ ID Nr:5) die vollständige Sequenz des verwendeten Adapters.
  • Das zweite Adapter-Oligonukleotid (TOPO D2) muss die vollständige Komplementierung zu TOPO D1 haben. TOPO D2 komplementiert direkt 5' des EcoRI-kohäsiven Anhängsels, das sich vom unteren Strang des linearisierten Vektors aus erstreckt. Außerdem enthält TOPO D2 die Sequenz 3'-GTGG, welche die Zielsequenz ist, und einen Einzelstrang-Überhang nach einer Topoisomerase-Spaltung für ein gerichtetes Klonieren. In dieser Ausführungsform wurde der Einzelstrang-Überhang so gewählt, dass er die Kozak-Sequenz komplementiert, die dafür bekannt ist, dass sie die Expression von offenen Leserahmen (ORFs) in eukaryotischen Zellen begünstigt, indem sie die Wirksamkeit der Ribosomenbindung an die mRNA erhöht, wobei jedoch die Sequenz und die Länge sehr variabel sind, um die speziellen Anforderungen einzelner Benutzer zu erfüllen. Die vollständige Sequenz von TOPO D2 ist 3'-CTAGGGAAGTGG-5' (SEQ ID Nr:6).
  • Dem Obigen ähnlich weist der Adapter-Doppelstrang, der aus dem Annealing von TOPO D4 und TOPO D5 resultiert, einen einzelsträngigen SacI-Überhang an einem Ende und einen 12 Nukleotide umfassenden einzelsträngigen Überhang am anderen Ende auf.
  • Das dritte Adapter-Oligonukleotid (TOPO D5) hat eine Komplementierung zu dem SacI-kohäsiven Ende 3'-TCGA-5'. Ähnlich wie TOPO D1 weist TOPO D5 zusätzliche Basen auf, die einen Einzelstrang-Überhang erzeugen. Die Länge und die Sequenz können basierend auf den Anforderungen der Anwender variieren. In der gegenwärtigen Ausführungsform ist die TOPO D5-Sequenz 5'-AAGGGCGAGCT-3' (SEQ ID Nr:7).
  • Das vierte Adapter-Oligonukleotid (TOPO D4) hat die vollständige Komplementierung zu TOPO D5 und komplementiert direkt 5' des SacI-kohäsiven Anhängsels, das sich vom oberen Strang des linearisierten Vektors aus erstreckt. TOPO D4 enthält außerdem die Topoisomerase-Konsensus-Sequenz 5'-CCCTT. Die verbleibende Sequenz und die Größe des TOPO D4-Adapteroligos sind variabel und können so modifiziert werden, um die speziellen Anforderungen der Forscher zu erfüllen. In der gegenwärtigen Ausführungsform ist die Sequenz von TOPO D4 3'-GACATGATACAGTTCCCGC-5' (SEQ ID Nr:8), die einen zusätzlichen 12 Basenpaare umfassender Einzelstrang-Überhang aufweist.
  • Diese Adapter-Oligonukleotide können unter Verwendung zahlreicher Techniken einschließlich des Phosphoramadite-Verfahrens (Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154: 287–313, 1987) synthetisiert werden. Diese und weitere Verfahren für die chemische Synthese von Oligos sind dem Fachmann wohlbekannt.
  • Ein komplementäres Annealing des gereinigten, verdauten Vektors und der Adapter-Oligonukleotide erfolgt durch Inkubieren der DNA in Gegenwart von T4-DNA-Ligase. Typische Verbindungsreaktionen werden durch Inkubieren eines Klonierungsvektors mit geeigneten DNA-Fragmenten in Gegenwart von Ligase und einem entsprechenden Reaktionspuffer durchgeführt. Puffer für Ligationsreaktionen sollten sowohl ATP enthalten, das Energie für die Reaktion liefert, als auch Reduktionsmittel wie Dithiothreitol und pH-Stabilisatoren wie Tris-HCl. Das Verhältnis der Konzentrationen von Klonierungsvektor und DNA-Fragmenten ist von jeder einzelnen Reaktion abhängig, wobei es in der Literatur zahlreiche Formeln für ihre Bestimmung gibt (siehe z.B. Protocols and Applications Guide (1991), Promega Corporation, Madison, WI, S. 45). Die T4-Ligase wird die Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten 5'-Phosphaten und 3'-Hydroxyl-Termini während der Inkubation katalysieren. Die Ligation der kohäsiven Enden kann im Allgemeinen in 30 Minuten bei 12 bis 15°C erreicht werden, während die Ligation stumpfer Enden 4 bis 16 Stunden bei Raumtemperatur braucht (Ausubel et al., (1992) Zweite Auflage; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, S. 3.14–3.37), jedoch varriert der Parameterbereich für jeden Versuch. In der gegenwärtigen Ausführungsform wurden der gereinigte, verdaute Vektor pUni/V5-His, Version A, und die Adapteroligos in der Gegenwart von T4-Ligase und eines geeigneten Puffers sechzehn Stunden lang bei 12,5°C inkubiert. Der resultierende linearisierte und angepasste Vektor weist den gereinigten Klonierungsvektor, der durch eine Basenpaar-Komplementierung und T4-Ligase-katalysierter Phosphodiesterbindungen (siehe 7) an die Adapter-Oligonukleotide angelagert ist, auf.
  • Eine wirksame Modifikation des angepassten Vektors mit Topoisomerase erfordert das Hinzufügen eines Annealing-Oligos, um doppelsträngige DNA an den TOPO D1- und TOPO D4-Einzelstrang-Überhängen zu erzeugen. Vaccinia-Topoisomerase I bindet zunächst nichtkovalent an die doppelsträngige DNA. Das Enzym diffundiert dann entlang des Doppelstrangs, bis es die Konsensus-Pentapyrimidin-Sequenz 5'-CCCTT lokalisiert und kovalent bindet, wodurch der topoisomerase-angepasste Komplex gebildet wird (siehe Shuman et al., US-Patent Nr. 5,766,891). Die Modifikation des angepassten Vektors findet in Abwesenheit von DNA-Ligase statt, um die Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen dem angepassten Vektor und dem Annealing-Oligo zu vermeiden, da Phosphodiesterbindungen in dem nicht leicht-spaltbaren Strang die Dissoziation der Abgangsgruppe nach der Spaltung verhindern werden (siehe 8 und 9).
  • Das Annealing-Oligonukleotid (TOPO D3) muss die Komplementierung zu den einzelsträngigen DNA-Überhängen von TOPO D1 und TOPO D4 haben. In der gegenwärtigen Ausführungsform teilen die beiden Überhänge die folgende Sequenz 5'-GACATAGTACAG-3' (SEQ ID Nr:9) gemeinsam. Folglich hat TOPO D3 die Sequenz 3'-CTGTATCATGTCAAC-5' (SEQ ID Nr:10), welche die vollständige Komplementierung zu dem Einzelstrangüberhang des Adapteroligos und einen zusätzlichen, drei Basenpaare umfassenden Überhang 3'-AAC-5' aufweist.
  • Die Inkubation des angepassten Vektors mit dem Annealing-Oligo in der Gegenwart von Topoisomerase wird doppelsträngige DNA hervorbringen, an welche Topoisomerase nichtkovalent binden kann (10). Die gebundene Topoisomerase wird die doppelsträngige DNA mittels eines möglich gemachten Diffusionsmechanismus absuchen, bis das 5'-CCCTT-Erkennungsmotiv lokalisiert ist. Die Spaltung des Phosphodiester-Rückgrades des leicht spaltbaren Strangs 3' des Motivs wird durch einen nukleophilen Angriff auf das 3'-Phosphoratom der bevorzugten Oligonukleotidspaltungssequenz 5'-CCCTT↓ katalysiert, was eine kovalente Bindung der DNA an das Enzym mittels einer 3'-Phosphotyrosyl-Bindung zur Folge hat (siehe Shuman u.a., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 9793–9796). Die Spaltung des leicht spaltbaren Strangs erzeugt eine doppelsträngige Abgangsgruppe, die das 3'-Ende-Adapteroligo stromabwärts des 5'-CCCTT-Motivs und das Annealing-Oligo TOPO D3 aufweist. Obwohl die Abgangsgruppe durch einen 5'-hydroxyl-vermittelten Angriff der Phosphotyrosyl-Bindung erneut an das topoisomerase-modifizierte Ende des Vektors binden kann, ist diese Reaktion nicht begünstigt, wenn die Abgangsgruppe nicht länger kovalent an den Vektor gebunden ist. Das Hinzufügen von T4-Polynucleotid-Kinase und ATP zu der Spaltungs/Religationsreaktion verschiebt das Gleichgewicht weiter in Richtung der Anhäufung von gefangener Topoisomerase, da die Kinase das 5'-Hydroxyl der Abgangsgruppe phosphorylieren kann, um das Stattfinden eines Wiederverbindens zu verhindern (Ausubel et al., (1992) Zweite Auflage; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, S. 3.14–3.30) Der resultierende linearisierte Vektor weist ein stumpfes Ende von der TOPO D4/D3-Abgangsgruppe und ein einen Einzelstrang-Überhang tragendes Ende von der TOPO D1/D3-Abgangsgruppe auf (11). Beide Enden des linearisierten Klonierungsvektors sind mit Topoisomerase beladen, was eine schnelle, effiziente und gerichtete topoisomerase-vermittelte Insertion eines Akzeptormoleküls ermöglicht.
  • Obwohl das obige Beispiel die Modifikation von pUni/V5-His, Version A, um den topoisomerase-modifizierten Vektor für ein gerichtetes Klonieren zu bilden, genau beschreibt, wird ein Durchschnittsfachmann verstehen, wie diese Verfahren auf eine beliebige Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder andere DNA anzuwenden sind. Außerdem sollte beachtet werden, dass dieses Beispiel einen Vektor dargestellt, der einen einzelsträngigen 5'-Überhang enthält, der die Sequenz 5'-GGTG-3' aufweist, jedoch die Konstruktion von Adapter-Doppelsträngen und Annealing-Oligonukleotiden einem Fachmann ermöglichen würde, Überhänge mit einer beliebigen Sequenz oder Länge an einem Ende oder an beiden Enden eines gegebenen Vektors maßgeschneidert zu konstruieren.
  • Speziell kann jede Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder andere DNA so modifiziert werden, dass sie einen Einzelstrang-Überhang von jeder geeigneten Sequenz und Länge besitzt. Dies sind die Grundschritte: Der Vektor wird zuerst einer Behandlung unterzogen, die bekannt ist, die DNA zu linearisieren. Übliche Verfahren schließen eine Restriktionsverdauung und eine Behandlung mit Topoisomerase II ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Nach der Linearisierung wird ein maßgeschneiderter einzelsträngiger Überhang hinzugefügt. In dem obigen Beispiel werden komplementäre Oligonukleotide zu den klebrigen Enden einer Restriktionsverdauung hinzugefügt, was den gewünschten einzelsträngigen Überhang ergibt, wobei jedoch ebenso gut einen Einzelstrang formende Oligonukleotide an dem stumpfen Ende durch T4-Ligation hinzugefügt werden können. Die Einzelstrang-Überhangsequenz wird einem topoisomerase-I-vermittelten Einzelstrangschnitt bzw. -bruch ausgesetzt. Dieser Einzelstrang-Überhang kann wiederum benutzt werden, um in gerichteter Weise ein PCR-Produkt einzufügen, das eine oder mehrere komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist.
  • Ebenso kann eine Topoisomerasemodifikation auf jede doppelsträngige Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder andere DNA-Stück angewendet werden. Verfahren zur Anlagerung von Topoisomerase I an doppelsträngige DNA sind im Fach wohlbekannt (siehe Shuman et al., US-Patent Nr. 5,766,891). Die strategische Platzierung von Topoisomerase auf einem Stück doppelsträngiger DNA ist durch den Einbau einer Topoisomerase I-Konsensussequenz bestimmt (siehe Shuman et al., US-Patent Nr. 5,766,891). Die Topoisomerase I wird an die doppelsträngige DNA binden, den leicht spaltbaren Strang spalten, wodurch die vorbestimmte einzelsträngige Überhangsequenz offengelegt wird, und das eingehende PCR-Produkt in der korrekten, durch den Einzelstrangüberhang vermittelten Orientierung ligieren.
  • BEISPIEL 2
  • Als ein Beispiel für die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf ein anderes Plasmid wurde pCR® 2.1 (4 und 12) so modifiziert, um ein topoisomerase I-angepasster Vektor mit einer maßgeschneiderten einzelsträngigen Sequenz zu erzeugen.
  • Das pCR®2.1-Plasmid ist ein 3,9 kb-T/A-Klonierungsvektor. In der Sequenz dieses Vektors sind viele einzigartig konstruierte Elemente. Diese Elemente schließen einen f1-Ursprung, einen Co1E1-Ursprung, ein Kanamycin-Resistenzgen, ein Ampicillin-Resistenzgen, ein LacZ-alpha-Fragment und eine Mehrfachklonierungssequenz, die innerhalb des LacZ-alpha-Fragment lokalisiert ist und die so genannte Blau-Weiß-Selektion ("BLUE/WHITE Selection" (engl.)) des rekombinanten Plasmids ermöglicht, ein. Die Mehrfachklonierungssequenz (4) des pCR®2.1-Plasmids enthält zahlreiche Restriktionsstellen, darunter, ohne jedoch darauf beschrenkt zu sein, HindIII, SpeI und EcoRI; M13-Forward/Reverse-Primer und einen T7-RNA-Polymerase-Promotor.
  • Die Konstruktion des topoisomerase I-beladenen Vektors, der eine maßgeschneiderte einzelsträngige Sequenz besitzt, besteht aus einer Verdauung durch Endonuclease, gefolgt von einem komplementären Annealing synthetischer Oligonukleotide und dem ortsspezifischen Spalten des Heteroduplex durch Vaccinia-Topoisomerase I. Eine Verdauung des pCR®2.1-Plasmids mit den Restriktionsenzymen HindIII, SpeI und EcoRI hinterlässt HindIII- und EcoRI-kohäsive Enden an dem Vektor (13). Das dissozierte Fragment von pCR®2.1 stromabwärts der HindIII-Spaltstelle wird mit SpeI weiter gespalten, um seine Größe zu verringern. Durch das Verringern der Größe des Fragments wird der verdaute Vektor durch Isopropanolfällung leicht von den kleineren verdauten Bruchstücken gereinigt. Diese Enzyme sind leicht von zahlreichen Lieferanten erhältlich, einschließlich New England Biolabs, (Beverly, MA, Katalog-Nr. RO104S, HindIII; RO133S, SpeI; RO101S, EcoRI). Verfahren zur Verdauung und Isolation von DNA sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook et al., supra, 1989).
  • Der gereinigte, verdaute Vektor wird mit vier Adapter-Oligonukleotiden und T4-DNA-Ligase inkubiert. Diese Adapter-Oligonukleotide sind so konstruiert, dass sie entweder zu dem HindIII-kohäsiven Ende, dem EcoRI-kohäsiven Ende oder zueinander eine Komplementierung haben. Nach der Inkubation mit T4-DNA-Ligase wird der angepasste Vektor mit Isopropanol gereinigt.
  • Das erste Adapter-Oligonukleotid (TOPO H) hat eine Komplementierung zu dem HindIII-kohäsiven Ende 3'-TCGA-5'. Außerdem hat TOPO H weitere 24 Basenpaare, einschließlich dem Topoisomerase-Konsensus-Pentapyrimidin-Element 5'-CCCTT, das sich 19 Basenpaare stromaufwärts des 3'-Endes befindet. Die verbleibende Sequenz und Größe des TOPO H-Adapteroligos sind variabel und können so modifiziert werden, dass sie die speziellen Anforderungen der Forscher erfüllen. In der gegenwärtigen Ausführungsform ist 5'-AGCTCGCCCTTATTCCGATAGTG-3' (SEQ ID Nr: 11) die vollständige Sequenz des verwendeten Adapters.
  • Das zweite Adapter-Oligonukleotid (TOPO 16) muss die vollständige Komplementierung zu TOPO H haben. TOPO 16 komplementiert direkt 5' des HindIII-kohäsiven Endes, wobei es sich von dem unteren Strang des linearisierten Vektors aus erstreckt. Außerdem enthält TOPO 16 die Sequenz 3'-TAAG, die die gewählte Einzelstrangsequenz für das gerichtete Klonieren ist. Die vollständige Sequenz von TOPO 16 ist 3'-GCGGGAATAAG-5' (SEQ ID Nr:12).
  • Das dritte Adapter-Oligonukleotid (TOPO 1) hat eine Komplementierung zu dem EcoRI-kohäsiven Ende 3'-TTAA-5'. Ähnlich wie TOPO H weist TOPO 1 zusätzliche Basen auf, welche die Topoisomerase-I-Konsensussequenz CCCTT aufweisen, die 12 Basenpaare stromaufwärts des 3'-Endes angeordnet ist. Die Länge und Sequenz von TOPO 1 kann je nach den Erfordernissen der Anwender variieren. In der gegenwärtigen Ausführungsform ist die TOPO 1-Sequenz 5'-AATTCGCCCTTATTCCGATAGTG-3' (SEQ ID Nr:13).
  • Das vierte Adpater-Oligonukleotid (TOPO 2) weist die vollständige Komplementierung zu TOPO 1 auf und komplementiert direkt 5' des EcoRI-kohäsiven Endes, wobei es den oberen Strang des linearisierten Vektors erweitert. In der gegenwärtigen Ausführungsform ist die Sequenz von TOPO 2 3'-GCGGGAA-5'.
  • Das komplementäre Annealing des gereinigten, verdauten Vektors und der Adapter-Nukleotide geschieht durch Inkubieren der DNA in der Gegenwart von T4-DNA-Ligase. Die T4-Ligase wird die Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten 5'-Phosphaten und 3'-Hydroxyl-Termini während der Inkubation katalysieren. In der gegenwärtigen Ausführungsform wurden der gereinigte, verdaute Vektor pCR®2.1 und die Adapteroligos in Gegenwart von T4-Ligase und eines geeigneten Puffers sechzehn Stunden lang bei 12,5°C inkubiert. Der resultierende linearisierte und angepasste Vektor weist den gereinigten Klonierungsvektor, der durch eine Basenpaar-Komplementierung und T4-Ligase-katalysierte Phosphodiesterbindungen (siehe 13) an die Adapter-Oligonukleotide angelagert ist, auf. Ligationstechniken sind in großer Zahl in der Literatur beschrieben (siehe Ausubel et al., (1992) Zweite Auflage; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York, NY, S. 3.14–3.37).
  • Das Beladen des angepassten Vektors mit Topoisomerase erfordert das Hinzufügen von Annealing-Oligonukleotiden, um doppelsträngige DNA an den einzelsträngigen Überhängen von TOPO H und TOPO 1 zu erzeugen. Das Beladen des angepassten Vektors findet in Abwesenheit von DNA-Ligase statt, um die Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen dem angepassten Vektor und dem Annealing-Oligo zu vermeiden, da Phosphodiesterbindungen in dem nicht leicht- spaltbaren Strang die Dissoziation der Abgangsgruppe nach der Spaltung verhindern werden (siehe 9).
  • Das Annealing-Oligonukleotid (TOPO 17) muss eine Komplementierung zu dem einzelsträngigen DNA-Überhang von TOPO H aufweisen. In der gegenwärtigen Ausführungsform hat der Überhang die folgende Sequenz: 5'-CGATAGTG-3'. Deshalb hat TOPO 17 die folgende Sequenz 3'-GCTATCAC-5', welche die vollständige Komplementierung zu dem einzelsträngigen Überhang der Adapter-Nukleotide aufweist.
  • Die Annealing-Oligonukleotide (TOPO 3) müssen die Komplementierung zu dem einzelsträngigen DNA-Überhang von TOPO 1 aufweisen. In der gegenwärtigen Ausführungsform hat der Überhang die folgende Sequenz: 3'-GTGATAGCCTTA-5' (SEQ ID Nr:14). Folglich hat TOPO 3 die Sequenz 5'-CAACACTATCGGAAT-3' (SEQ ID Nr:15), welche die vollständige Komplementierung zu dem Einzelstrangüberhang des Adapteroligonukleotids und einen zusätzlichen, drei Basenpaare aufweisenden Überhang 5'-CAA-3' aufweist.
  • Die Inkubation des angepassten Vektors mit dem Annealing-Oligo in Gegenwart von Topoisomerase wird doppelsträngige DNA erzeugen, an welche Topoisomerase nichtkovalent binden kann (14). Die gebundene Topoisomerase wird die doppelsträngige DNA mittels eines möglich gemachten Diffusionsmechanismus absuchen, bis das 5'-CCCTT-Erkennungsmotiv lokalisiert ist. Die Spaltung des Phosphodiester-Rückgrads des leicht spaltbaren Strangs 3' des Motivs wird die kovalente Anlagerung der DNA an das Enzym mittels einer 3'-Phosphotyrosyl-Bindung zur Folge haben (Shuman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 9793–9796, 1989). Das Spalten des leicht spaltbaren Strangs erzeugt eine doppelsträngige Abgangsgruppe, die das 3'-Ende des Adapteroligos stromabwärts des 5'-CCCTT-Motivs und das komplementäre Annealing-Oligonukleotid enthält. Die Abgangsgruppe kann durch ihren 5'-Hydroxyl Angriff auf die Phosphotyrosyl-Bindung, der ebenfalls durch Topoisomerase katalysiert wird, wieder an den Topoisomerase angepassten Vektor anbinden. Eine Zugabe von T4-Polynucleotidkinase zu der Gleichgewichtsreaktion verhindert die Rückreaktion über die kinase-vermittelte Phosphorylierung des 5'-Hydroxyls der Abgangsgruppe (Ausubel et al., (1992) Zweite Auflage; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York, NY, S. 3.14–3.30). Der resultierende linearisierte Vektor weist ein stumpfes Ende von der TOPO 1/3-Abgangsgruppe und ein Einzelstrangsequenz Ende von der TOPO H/17-Abgangsgruppe auf (15). Beide Enden des linearisierten Klonierungsvektors sind mit Topoisomerase beladen, was eine schnelle, effiziente und gerichtete topoisomerase-vermittelte Insertion eines Akzeptormoleküls ermöglicht.
  • Gerichtetes Klonieren gemäß der Erfindung
  • Diese Erfindung schafft außerdem ein Verfahren zum gerichteten Klonieren von DNA. In dem folgenden Beispiel wurde der topoisomerase-beladene doppelsträngige Nukleinsäurevektor, der gemäß der vorliegenden Erfindung aus pUni/V5-His, Version A, konstruiert war, für die gerichtete Insertion offener Leserahmen (ORFs) von GeneStormTM Expression Ready Clones, (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) benutzt. Der modifizierte pUni-Vektor wurde für das Klonieren dieser ORFs ausgewählt, weil die hinzugefügte Zielsequenz, die bei einer Spaltung des Vektors durch Topoisomerase zu einem einzelsträngigen Überhang wird, Homologie zu der Kozak-Sequenz aufweist, von der bekannt ist, dass sie die ORF-Expression verstärkt. Es ist jedoch zu beachten, dass wie zuvor eine beliebige Plasmid-, Cosmid-, Virus- oder andere DNA so modifiziert werden könnte, um die erforderliche einzelsträngige Sequenz zu besitzen. Genauso könnte irgendein DNA-Fragment derart modifiziert werden, dass es eine zu einem beliebigen einzelsträngigen Überhang eines Vektors homologe Sequenz besitzt. Als ein Punkt von Interesse: Die Sequenz des einzelsträngigen Überhangs kann die Wirksamkeiten des gerichteten Klonierens beeinflussen. Beispielsweise werden einzelsträngige Überhänge mit niedrigem GC-Gehalt eine niedrigere Annealing-Stabilität aufweisen; außerdem werden einzelsträngige Überhänge, die eine hohe Komplementarität zu beiden Enden eines DNA-Fragments, das zu klonieren ist, aufweisen, die Fähigkeit, diese DNA-Insertionen zu steuern, verlieren. Folglich sollte die Sequenz eines einzelsträngigen Überhangs mit Sorgfalt konstruiert werden, um diese und ähnliche Probleme zu vermeiden.
  • BEISPIEL 3
  • Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich bei der gerichteten Insertion von PCR-Produkten in Vektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert sind. Bei der PCR-Amplifikation des gewünschten Inserts sind die PCR-Primer so konstruiert, dass sie identifizierte Sequenzen des bzw. der Inserts komplementieren, die gerichtet in den topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäurevektor der vorliegenden Erfindung kloniert werden sollen. Der Primer, der so konstruiert ist, dass er stromaufwärts des codierenden DNA-Strangs anbindet, wird mit einer zusätzlichen, komplementären Nukleotidsequenz an seinem 5'-Ende modifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wird eine komplementäre Sequenz besitzen, die eine durch den einzelsträngigen Überhang vermittelte gerichtete Insertion in den topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektor der vorliegenden Erfindung und eine nachfolgende Expression des Produktes ermöglicht.
  • Eine Ausführungsform schließt ein Einbringen einer Einzelstrang-Überhangstelle in ein Donator-Doppelstrang-DNA-Substrat durch PCR-Amplifikation des Donator-Doppelstrang-DNA-Moleküls mit dem 5'-Oligonukleotid-Primer, der den einzelsträngigen Überhang enthält, ein. Eine PCR-Amplifikation einer DNA-Region wird dadurch erreicht, dass Oligonukleotid-Primer konstruiert werden, die einen bekannten Bereich außerhalb der gewünschten Region komplementieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Primer, der Homologie zu dem codierenden Strang des doppelsträngigen Bereichs der DNA aufweist, eine zusätzliche Nukleotidsequenz besitzen, die zu dem Einzelstrangüberhang des topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektors der vorliegenden Erfindung komplementär ist.
  • Bei Anwendung der vorliegenden Erfindung bei einem Format mit hohem Durchsatz wurden zweiundachtzig bekannte offene Leserahmen (ORFs) aus dem GeneStormTM-Expressionssystem (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) für ein gerichtetes Klonieren in den topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäurevektor der vorliegenden Erfindung ausgewählt, wobei jedoch eine beliebige DNA-Sequenz, wie gewünscht, von einzelnen Anwendern ausgewählt werden kann. Für jeden dieser ORFs wurden Primer mit Homologie zu dem codierenden und dem nicht codierenden Strang konstruiert. Um PCR-Produkte in einer gerichteten Art und Weise in den modifizierten pUni/V5-His, Version A, topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäurevektor der vorliegenden Erfindung wie im Beispiel 1 beschrieben ist, zu klonieren, wurde ein Primer eines gegebenen Paares so modifiziert, dass er die Nukleotidsequenz enthielt, die komplementär zu dem in dem Vektor enthaltenen einzelsträngigen Überhang war. In dem gegenwärtigen Beispiel enthielt der codierende Primer die hinzugefügte Sequenz 5'-CACC-3', die den "einzelsträngigen Überhang" 3'-GTGG-5' des topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektors der vorliegenden Erfindung komplementiert. Eine PCR-Amplifikation der obigen ORFs mit ihren jeweiligen Primern wird doppelsträngige DNA-Fragmente erzeugen, die den einzelsträngigen Überhang an ihrem 5'-Ende aufweisen (16). Hier wurde Pfu-Polymerase bei der PCR-Amplifikation benutzt, es ist jedoch wohlbekannt, dass PCR-Reaktionen entweder mit einer nicht thermophilen Polymerase wie etwa Pfu oder mit einer thermophilen Polymerase wie etwa Taq durchgeführt werden können, worauf ein Reaktionsschritt zur Ausbildung von stumpfen Enden folgt, um das nicht der Matrize entsprechende Nukleotid, das von diesen Enzymen am Ende des PCR-Produktes hinterlassen wird, zu entfernen.
  • Bei dem vorliegenden Beispiel wurden 0,1 Mikrogramm jedes Primers mit 0,05 Mikrogramm einen ORF enthaltender DNA in einem PCR-Reaktionsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern kombiniert. Neben den Primern und dem Vektor enthielt das Reaktionsgemisch noch Wasser, PCR-Puffersalze, 10 mM dNTPs und 1,25 Einheiten Pfu-Polymerase. Die Temperaturen des thermalen Zyklus waren wie folgt: anfänglich 94°C zur Denaturierung, gefolgt von 25 Wiederholungen von 94°C zur Denaturierung, 55°C zum Primer-Annealing und 72°C zur Verlängerung, jeweils für eine Minute, und mit 72°C für eine abschließende fünfzehnminütige Verlängerung. Diese Parameter werden jedoch für jedes zu amplifizierende DNA-Fragment variieren. PCR-Amplifikationstechniken sind dem Fachmann wohlbekannt (Ausubel et al., (1992) Zweite Auflage; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York, NY, S. 15.3–15.4), ebenso auch Techniken für die Überführung von 3'-Überhängen in stumpf endende Termini (Protocols and Applications Guide, Promega Corp.; Madison WI, S. 43–44, 1989).
  • Die Inkubation der PCR-amplifizierten Donator-Doppelstrang-DNA, die die komplementäre Nukleotidsequenz mit dem modifizierten pUni/V5-His-, Version A, topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäurevektor der vorliegenden Erfindung enthält, führt zu dem gerichteten Klonieren der Donator-DNA. Beispielsweise wurden die zweiundachtzig ORFs der GeneStormTM-Klonsammlung (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) unter Verwendung angepasster Primer, die eine komplementäre Nukleotidsequenz enthalten, amplifiziert. Die Amplifikation der 82 GeneStormTM-ORFs mit den beschriebenen modifizierten Primerpaaren führte zu PCR-Produkten, die die komplementäre Nukleotidsequenz an ihrem 5'-Ende hatten. Dieses ORF-PCR-Produkt wird mit 10 ng des topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektors der vorliegenden Erfindung entweder in sterilem Wasser oder in einer Salzlösung kombiniert. Das Reaktionsgemisch wird behutsam gemischt und für fünf Minuten bei Raumtemperatur (22 bis 23°C) inkubiert. Nach fünf Minuten wurde die Reaktion auf Eis gelegt, dann wurde zu der chemischen One Shot®-Umwandlung oder Elektroporation weitergegangen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Katalog-Nr. C4040-10 bzw. C4040-50), (Invitrogen TOPO Cloning Protocol, Invitrogen Corp.). Die Topoisomerase hatte die angrenzenden Stränge des Vektors und Produktes durch Katalysieren einer Wiedervereinigungsreaktion vereinigt (17). Die mit der komplementären Nukleotidsequenz an ihren 5'-Enden konstruierten DNA-Fragmente wurden folglich mit hoher Effizienz korrekt in topoisomerase-beladene doppelsträngige Nukleinsäure-Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung eingefügt.
  • Die gerichtete Insertion von DNA-Fragmenten mit 5'-Sequenzkomplementarität in doppelsträngige Nukleinsäure-Klonierungsvektoren gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung geschieht mit einer Effizienz von mehr als 90%, wie durch Sequenzanalyse mehrerer Kolonien transformierter Wirtzellen gezeigt worden ist. In dem aktuellen Beispiel wurden die topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektoren der vorliegenden Erfindung, die die GeneStormTM-ORFs enthielten, mit transformationskompetenten E. coli-Wirtszellen inkubiert. Bei vierundsiebzig Transformationsreaktionen fand das gerichtete Klonieren der ORFs in den topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektor der vorliegenden Erfindung in mindestens sieben der acht ausgewählten Kolonien statt, und neun und fünfzig dieser Klonierungsreaktionen waren in allen acht ausgewählten Kolonien gerichtet. Das Gesamtergebnis der gerichteten Klonierung war 609 von 656; folglich lag bei über 93% der entnommenen Klone eine gerichtete Insertion vor (siehe nachstehend Tabelle I).
  • BEISPIEL 4
  • In einem ähnlichen Beispiel wurde unter Verwendung des oben beschriebenen modifizierten pCR®2.1- topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäurevektors der vorliegenden Erfindung ein mittels PCR erzeugter ORF, der ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) codiert, in gerichteter Weise in Rahmen, mit dem lacZ-α-Fragment kloniert, das in dem Vektor vorhanden war (siehe 4). Die Primer, die benutzt wurden, um das GFP-Gen zu amplifizieren, enthielten die notwendige komplementäre Nukleotidsequenz 5'-ATTC-3' und die bekannte Sequenz für translationsinitiierendes Methionin, 5'-ATG-3'. Mit den erforderlichen Klonierungsschritten, wie oben angegeben, wurde das PCR-amplifizierte GFP in den Vektor eingefügt, und transformierte Zellen wurden auf festen Agarplatten kultiviert. Leuchtende Kolonien zeigten ein korrekt eingefügtes PCR-Produkt an (siehe nachstehende Tabelle 2).
  • Diese Daten stellen eine wesentliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik des Klonierens dar, und präsentieren eine Erfindung in Bezug auf das Klonieren, die mit Techniken mit hohem Durchsatz sehr gut vereinbar ist. Angesichts von Effizienzen des gerichteten Klonierens, die höher als 90% sind, braucht ein Anwender nur zwei Kolonien für jedes klonierte DNA-Fragment zu screenen. Folglich können auf einer 96-Kammer-Platte achtundvierzig separate Klone auf eine gerichtete Insertion durchsucht werden, 400% mehr als bei derzeitigen Klonierungstechniken. Die Anwendung dieser Erfindung wird viele Genexpressionsprozesse mit hohem Durchsatz rationalisieren und ermöglichen, dass sie zu einem Bruchteil ihrer derzeitigen Kosten ausgeführt werden.
  • Tabelle 1: Gerichtetes Klonieren von ORFs unter Verwendung eines topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektors der vorliegenden Erfindung
    Figure 00840001
  • Tabelle 2: In-Rahmen- und gerichtete Insertion von GFP in den modifizierten pCR2.1-topoisomerase-beladenen doppelsträngigen Nukleinsäure-Klonierungsvektor der vorliegenden Erfindung
    Figure 00840002
  • Dementsprechend ist die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
  • Sequenzauflistung:
    Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001

Claims (35)

  1. Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren das Kontaktieren aufweist von: a) einem topoisomerase-geladenen ersten doppelsträngigen (ds) Nukleinsäuremolekül, das eine erste Topoisomerase, die kovalent an oder nahe bei einem ersten Ende gebunden ist, und eine zweite Topoisomerase enthält, die kovalent an oder nahe bei einem zweiten Ende gebunden ist, wobei das erste Ende ferner einen 5'-Überhang aufweist und wobei das zweite Ende ferner ein stumpfes Ende, einen 3'-Thymidin-Überhang oder einen zweiten 5'-Überhang aufweist; und b) einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende an seinem 5'-Terminus eine Nukleotidsequenz aufweist, die zum ersten 5'-Überhang komplementär ist, unter solchen Bedingungen, dass die Nukleotidsequenz, die zum ersten 5'-Überhang komplementär ist, selektiv mit dem ersten 5'-Überhang hybridisieren kann; wobei die erste Topoisomerase kovalent den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verbinden kann, und wobei die zweite Topoisomerase den 3'-Terminus des zweiten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten Endes des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann, wobei ein direktional verbundenes Nukleinsäuremolekül erzeugt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ein stumpfes Ende und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ein stumpfes Ende aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 3'-Thymidin-Überhang und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 3'-Adenosin-Überhang aufweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül einen zweiten 5'-Überhang an dem zweiten Ende und die zweite doppelsträngige Nukleinsäure an dem zweiten Ende eine Nukleotidsequenz aufweist, die zum zweiten 5'-Überhang komplementär ist.
  5. Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren das Kontaktieren aufweist von: a) einem ersten doppelsträngigen (ds) Vorläufer-Nukleinsäuremolekül, das ein erstes Ende, das an dem 5'-Terminus eine erste 5'-Zielsequenz und an dem 3'-Terminus eine Topoisomerase-Erkennungsstelle aufweist, und ein zweites Ende aufweist, das an dem 3'-Terminus eine Topoisomerase-Erkennungsstelle aufweist; b) einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende enthält, wobei das erste stumpfe Ende an dem 5'-Terminus eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu der 5'-Zielsequenz komplementär ist; und c) einer Topoisomerase, die für die Topoisomerase-Erkennungsstelle spezifisch ist, unter Bedingungen, die Topoisomerase-Aktivität ermöglichen und die eine Hybridisierung der ersten 5'-Zielsequenz und der Nukleotidsequenz erlauben, die zu der Zielsequenz komplementär ist, wodurch ein gerichtet verbundenes rekombinantes Nukleinsäuremolekül erzeugt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zweite Ende der ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäure ein stumpfes Ende beim Spalten durch die Topoisomerase wird und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ein stumpfes Ende ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zweite Ende des ersten doppelsträngigen Vorläufer-Nukleinsäuremoleküls eine 3'-Thymidin-Erweiterung beim Spalten durch die Topoisomerase und das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 3'-Adenosin-Überhang aufweist.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das erste doppelsträngige Vorläufer-Nukleinsäuremolekül eine zweite 5'-Zielsequenz aufweist, die an dem zweiten Ende angeordnet ist, und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle an dem zweiten Ende eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die zu der zweiten 5'-Zielsequenz komplementär ist.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein Vektor ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor ein Expressionsvektor ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor ein Klonierungsvektor ist.
  12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner das Einführen des gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle aufweist.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle eine eukaryotische Zelle ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zelle ein Bakterium ist.
  16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein Expressionssteuerungselement und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül einen offenen Leserahmen aufweist, wobei in dem direktional verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremolekül das Expressionssteuerungselement wirkungsmäßig mit dem offenen Leserahmen verbunden ist.
  17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein Amplifizierungsprodukt aufweist.
  18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Topoisomerase eine Typ-IB-Topoisomerase ist.
  19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül eines aus einer Mehrzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen aufweist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei zweite doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle in der Mehrzahl voneinander unterschiedlich sind.
  21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Mehrzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleotidmolekülen eine cDNA-Bibliothek enthält.
  22. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Mehrzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleotidmolekülen eine kombinatorische Bibliothek enthält.
  23. Verfahren zum Erzeugen eines gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, wobei das Verfahren das Kontaktieren aufweist von: a) einem, topoisomerase-geladenen ersten doppelsträngigen (ds) Nukleinsäuremolekül, das eine erste Topoisomerase aufweist, die kovalent an den 3'-Terminus eines ersten Endes des doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls gebunden ist, wobei das erste Ende ferner einen ersten 5'-Überhang aufweist; und b) einem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang komplementär ist, unter solchen Bedingungen, dass die 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes selektiv mit dem ersten 5'-Überhang hybridisieren kann, wobei die erste Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des ersten Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül wirkungsmäßig mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei die erste doppelsträngige Nukleinsäure ein Expressionssteuerungselement und die zweite doppelsträngige Nukleinsäure einen offenen Leserahmen aufweist.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25, das ferner das Kontaktieren des topoisomerase-geladenen ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls und des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit einem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül aufweist, wobei ein erstes Ende des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls einen 5'-Überhang und eine zweite Topoisomerase aufweist, die kovalent an dem 3'-Terminus gebunden ist, und wobei das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ferner ein zweites stumpfes Ende enthält, das eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem zweiten 5'-Überhang komplementär ist, und wobei das Kontaktieren unter solchen Bedingungen erfolgt, dass die 5'-Nukleotidsequenz des zweiten stumpfen Endes der zweiten doppelsträngigen Nukleinsäure selektiv mit, dem 5'-Überhang des ersten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann, wobei die zweite Topoisomerase den 3'-Terminus des ersten Endes des dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls mit dem 5'-Terminus des zweiten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls kovalent verbinden kann.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gerichtet mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden wird und danach das dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül gerichtet mit dem zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden wird.
  28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wenn an Anspruch 25 angehängt, wobei das dritte doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ein Peptid codiert, wobei in dem gerichtet verbundenen rekombinanten Nukleinsäuremolekül das Expressionssteuerungselement wirkungsmäßig mit dem offenen Leserahmen verbunden ist und das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül wirkungsmäßig mit dem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden ist, und wobei das zweite doppelsträngige Nukleinsäuremolekül wirkungsmäßig mit dem dritten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül verbunden ist, um ein Fusionsprotein zu codieren, das den offenen Leserahmen und das Peptid enthält.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Peptid eine Markierung aufweist.
  30. Zusammensetzung, die Folgendes aufweist: a) ein erstes doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste Ende einen ersten 5'-Überhang und eine Topoisomerase aufweist, die an dem 3'-Terminus kovalent gebunden ist, und b) ein zweites doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül, das ein erstes stumpfes Ende und ein zweites Ende aufweist, wobei das erste stumpfe Ende eine erste 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist, und eine erste 3'-Nukleotidsequenz, die zu der ersten 5'-Nukleotidsequenz komplementär ist.
  31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei die erste 5'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls an den ersten 5'-Überhang des ersten Endes des ersten Nukleinsäuremoleküls hybridisiert und die erste 3'-Nukleotidsequenz des ersten stumpfen Endes des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls verdrängt wird.
  32. Zusammensetzung nach Anspruch 30 oder 31, wobei das erste doppelsträngige Nukleinsäuremolekül ferner einen zweiten 5'-Überhang an dem zweiten Ende aufweist, wobei das zweite Ende des zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ferner eine zweite 5'-Nukleotidsequenz, die zu dem zweiten 5'-Überhang komplementär ist, und eine zweite 3'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu der zweiten 5'-Nukleotidsequenz komplementär ist.
  33. Ausrüstungssatz, der Folgendes aufweist: a) ein erstes doppelsträngiges (ds) Nukleinsäuremolekül, das eine erste Topoisomerase aufweist, die kovalent an einem 3'-Terminus eines ersten Endes gebunden ist, und eine zweite Topoisomerase, die kovalent an einem 3'-Terminus eines zweiten Endes gebunden ist, wobei das erste Ende ferner einen ersten 5'-Überhang und das zweite Ende ferner ein stumpfes Ende, einen 3'-Thymidin-Überhang oder einen zweiten 5'-Überhang aufweist, wobei der erste 5'-Überhang sich von dem zweiten 5'-Überhang unterscheidet; und b) eine Mehrzahl von zweiten doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, wobei jedes doppelsträngige Nukleinsäuremolekül aus der Mehrzahl ein erstes stumpfes Ende aufweist und wobei das erste stumpfe Ende eine 5'-Nukleotidsequenz aufweist, die zu dem ersten 5'-Überhang des ersten doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls komplementär ist.
  34. Ausrüstungssatz nach Anspruch 33, wobei die zweiten aus der Mehrzahl stammenden doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle transkriptionale regulatorische Elemente, translationale regulatorische Elemente oder eine Kombination davon aufweisen.
  35. Ausrüstungssatz nach Anspruch 33 oder 34, wobei die zweiten aus der Mehrzahl stammenden doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküle Nukleotidsequenzen aufweisen, die ein Peptid codieren.
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