DE60123833T2 - Entwurf und verwendung von verbesserten zink-chelatbildenden peptiden zur regulation von matrix-metalloproteinasen - Google Patents

Entwurf und verwendung von verbesserten zink-chelatbildenden peptiden zur regulation von matrix-metalloproteinasen Download PDF

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Description

  • BEREICH DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen MMP-Regulator, Zusammensetzungen, die diesen enthalten, und seine Verwendung zum Herstellen von Zusammensetzungen für eine erhöhte Wundheilung, speziell von chronischen Wunden (z.B. diabetischen Wunden, Wunden durch Druckstellen). Mehr speziell bezieht sich die Erfindung auf eine verbesserte Wundheilung durch Regulierung der Matrixmetalloproteinase-Aktivität.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • In normalen Geweben wird die zelluläre Bindegewebssynthese durch extrazellulären Matrixabbau ausgelöst, diese zwei gegensätzlichen Effekte existieren in dynamischem Gleichgewicht. Der Abbau der Matrix wird durch den Einfluss von Matrixmetalloproteinasen (MMPs), die von dort ansässigen Bindegewebszellen und eindringenden inflammatorischen Zellen freigelassen werden, ausgelöst. Normalerweise werden diese Stoffwechselenzyme gezielt auf der Ebene ihrer Synthese und Sekretion reguliert und ebenso auf der Ebene ihrer extrazellulären Aktivität. Extrazelluläre Kontrolle tritt hauptsächlich durch Regulierung mit spezifischen Enzymen, wie beispielsweise TIMPs (Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen) ein, die Komplexe mit MMPs bilden. Diese Komplexe verhindern die Wirkung der MMPs. Kontrolle der MMP-Aktivität auf zellulärer Ebene tritt hauptsächlich durch das Regulieren der MMP-Genexpression und durch das Herabregulieren der Expression der Membran-gebundenen MMPs (MT-MMP) auf, das die ausgeschiedene Pro-Enzym-Form von MMP aktiviert.
  • MMPs sind eine Familie von neutralen Metalloenzymen, die fähig sind extrazelluläre Matrix(EZM)-Makromoleküle abzubauen. Mitglieder dieser Familie, die isoliert und charakterisiert wurden, umfassen interstitielle Fibroblasten-Collagenase, Stromelysin und Typ IV-Collagenase. Andere potentielle Mitglieder umfassen eine wenig charakterisierte 94.000 Dalton Gelatinase und mehrere Gelatinasen mit niedrigem Molekulargewicht und Telopeptidasen ein. Strukturell enthalten MMPs eine Zink(II)-Ionenbindungsstelle an der Aktivierungsstelle des Proteins. Die Bindung von Zink an die Ionenbindungsstelle ist eine Voraussetzung für hydrolytische Aktivität.
  • TIMPs sind Glykoproteine, die spezifisch interstitielle Collagenase auf einer stöchiometrischen Basis von 1:1 regulieren. Das heißt, TIMPs bilden sehr spezifische regulatorische Komplexe mit MMPs, dabei regulieren sie nur eine spezifische Unterart der MMPs. Kein natürlich vorkommendes TIMP-Molekül reguliert allein alle Arten von MMPs.
  • In chronischen Wunden ist das Verhältnis von MMPs zu TIMPs derart hoch, dass die meisten MMPs unreguliert bleiben. Diese unregulierte MMP-Aktivität ergibt eine beschleunigte Beschädigung der EZM, was zu einer Zerstörung des neu gebildeten Wundbettes führt. Zusätzlich bewirkt die gleichzeitige Erhöhung von Proteinasespiegeln Hydrolisation von TIMP-Molekülen, wodurch das Verhältnis von MMP zu TIMP weiter erhöht wird.
  • Viele Individuen leiden an chronischen Wunden. Offene Hautwunden repräsentieren eine Hauptkategorie von derartigen Wunden und umfassen Brandwunden, neuropatische Geschwüre, Wunden durch Druckstellen, Venostasegeschwüre und diabetische Geschwüre. Weltweit haben 8 Mio. Menschen chronische Beingeschwüre und 7 Mio. Menschen haben Wunden durch Druckstellen (Clinica 559, 14–17, 1993. Alleine in den USA beträgt das Vorkommen von Hautgeschwüren 4,5 Mio., einschließlich 2 Mio. Druckschmerzpatienten, 900.000 Venengeschwür-Patienten und 1,6 Mio. Patienten mit diabetischem Geschwür (Med Pro Month, Juni 1992, 91–94). Die in der Behandlung dieser Wunden involvierten Kosten sind erschreckend und erreichen bei durchschnittlich $ 3.000,00 pro Patient über $ 13 Milliarden pro Jahr alleine in den USA.
  • Brandwunden haben eine berichtete Häufigkeit von 7,8 Mio. Fällen pro Jahr weltweit, 0,8 Mio. davon benötigen einen Krankenhausaufenthalt (Clinica 559). In den USA gibt es 2,5 Mio. Brandpatienten pro Jahr, 100.000 davon benötigen einen Krankenhausaufenthalt und 20.000 davon haben Brandwunden, die mehr als 20% der gesamten Körperoberfläche betreffen (MedPro Month, Juni 1992).
  • Aus der unkontrollierten Beschädigung von Bindegeweben durch MMPs ergeben sich auch viele andere Probleme. Diese Probleme umfassen, z.B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Osteopenien, wie beispielsweise Osteoporose, Periodontitis, Gingivitis, Hornhautepiderm- und Magengeschwürbildung, Tumormetastase, -invasion und -wachstum, neuroinflammatorische Störungen, einschließlich die in, die in Myelinabbau involviert sind, z.B. Multiple Sklerose, und Angiogenese-abhängige Erkrankungen, welche Angiofibrome, Hemangiom, solide Tumore, von Blut übertragene Tumore, Leukämie, Metastase, Telangiektasie, Psoriasis, Sklerodermie, pyogenes Granulom, Herzmuskelangiogenese, Plaque-Neovaskularisation, koronare Collateralis, ischämische Syndrom-Angiogenese, Hornhauterkrankungen, Rubeose, neovaskuläres Glaukom, diabetische Retinopathie, retrolentale Fibroplasie, Arthritis, diabetische Neovaskularisation, Makuladegeneration, Wundheilung, Magen- und Zwölffingerdarmgeschwür, Knochenbrüche, Keloide, Vaskulogenese, Blutbildung, Ovulation, Menstruation und Plazentation umfassen.
  • In Bezug auf die große Anzahl von Erkrankungen, die mit MMP-Aktivität einhergehen, besteht ein Bedarf, die MMP-Aktivität zu kontrollieren. Mehrere Vorgehensweisen sind vorgeschlagen worden, solch eine Regulierung zu bewerkstelligen. Ein Ansatz hat sich auf die katalytische Rolle von Zink in MMPs konzentriert und Zink-chelatbildende Regulatoren entwickelt. Wirksame Regulatoren wurden durch das Einführen von Zink-chelatbildenden Gruppen, wie beispielsweise Peptidhydroxamate und Thiol-enthaltende Peptide, in Substrate hergestellt. Peptidhydroxamate und TIMPs wurden erfolgreich in Tiermodellen eingesetzt, um Krebs und Entzündungen zu behandeln. Während diese Hydroxamate durch das Binden an Zink wirksam an Regulatoren der MMPs sind, sind sie toxisch für Menschen, da sie an alle Zink-enthaltenden Enzyme binden. Da viele biochemische Reaktionen, die im Körper auftreten, Zink erfordern, wirkt sich die Verwendung von den Hydroxamaten schädlich auf diese anderen Funktionen aus und kann zum Tod führen.
  • Andere bekannte Zink-chelatbildende MMP-Regulatoren sind Peptidderivate, die auf natürlich auftretende Aminosäuren basieren und Analoge der Spaltstelle in dem Collagenmolekül sind (Odake et al. (1994) Biophys. Res. Comm. 119, 14426). Manche MMP-Regulatoren haben eine weniger peptidische Struktur und können besser als Pseudopeptide oder Peptidmimetika betrachtet werden. Derartige Verbindungen haben für gewöhnlich eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, an das Zink-(II) zu binden, das in der MMP gebunden ist. Bekannte Verbindungen umfassen jene, in welcher die Zink-Bindungsgruppe eine Hydroxamsäure, Carbonsäure, Sulphydryl ist oder mit Sauerstoff angereicherte Phosphorgruppen sind (z.B., Phosphinsäure und Phosphonamidat, einschließlich Aminophosphonsäure).
  • Andere Ansätze umfassen das Regulieren kleiner Moleküle (Levy et al. (1998) J. Med. Chem. 41, 199–223; Wojtowicz-Praga et al. (1997) Invest. New Drugs 15, 61–75; Duivenvoorden, et al. (1997) Invasion und Metas. 17, 312–22) und Regulierung über anti-MMP-Antikörper (Su et al. (1995) Hybridoma. 14, 383–90).
  • Mehr spezifisch offenbart U.S. Patent Nr. 5,734,014 von Ishima et al. einen Elastaseinhibitor. Elastase, das von Neutrophilen sekretiert wird, bewirkt Gewebeschäden und erzeugt in diesem Prozess einen aktiven Überfluss an Sauerstoff. Elafin, das aus Psoriasepatienten isoliert wurde, besitzt Elastase-inhibierende Aktivität. Jedoch ist dieses natürlich vorkommende Elafin Oxidations-instabil. Ishima entwickelte Elafin-Derivate, die Oxidations-stabil sind, so dass Elastase-Regulierung effizienter sein kann. Das Oxidations-stabile Derivat wird durch eine teilweise Modifizierung der Aminosäuresequenz von natürlichem Elafin erzeugt. Die Modifikation kann entweder durch chemische Synthese oder ortsspezifische Mutagenese („site-directed mutagenesis") durchgeführt werden.
  • U.S. Patent Nr. 5,464,822 von Christophers et al. offenbart ein Polypeptid, das inhibitorische Aktivität gegen humane Leukozyten-Elastase besitzt. Die Polypeptide besitzen inhibitorische Aktivität, die für Serinproteasen spezifisch ist. Zum Beispiel besitzen sie inhibitorische Aktivität gegen Proteasen, wie beispielsweise humane Leukozyten-Elastase und Schweine ähnliche Bauchspeicheldrüsenelastase, besitzen aber keine signifikante inhibitorische Aktivität gegen Trypsin. Diese Polypeptide können durch Gentechnik hergestellt werden oder aus psoriatischen Schuppen der menschlichen Haut isoliert werden.
  • U.S. Patent No. 5,698,671 von Stetler-Stevenson et al. offenbart ein Protein, das durch die Gegenwart von spezifischen Cystein-enthaltenden Aminosäuresequenzen definiert ist und aus einem Kontrollmedium („conditioned media") von kultivierten humanen Tumorzellen isoliert wurde, das mit einer hohen Affinität an MMPs und Analoge davon bindet. Der bestimmte Inhibitor wird durch Herstellen von Peptiden und Proteinen, die einen Cysteinrest in demselben Bereich wie die verschiedenen Gewebeinhibitoren der Metalloproteinasen (TIMPs) aufweisen, hergestellt. Die Peptide müssen mindestens zwei Cysteine in angemessenem Abstand aufweisen, um inhibitorische Aktivität aufgrund der Bildung einer Disulfidbrücke sicherzustellen. Zusätzlich veröffentlicht die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung natürlicher MMP-Inhibitoren durch MMP-Affinitätschromatographie.
  • WO 99/47550 von Koivunen et al. offenbart Inhibitoren und Herab-Regulatoren von MMP, welche auf einer Ringstruktur basieren, die das Peptidmotif "CXXHWGFXXC" aufweist, worin X eine beliebige Aminosäure ist. Die Ringstruktur wird durch Disulfidbindungen zwischen den Cysteinen erreicht. Die Inhibitoren sind spezifisch für MMP-9 und MMP-2. Ferner offenbart WO 99/47550 die Verwendung der MMP-Inhibitoren und Herab-Regulatoren für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen und Zusammensetzungen für die Forschung sowie für die biochemische Isolierung und Reinigung von MMPs.
  • Trotz dieser unterschiedlichen Ansätze wird im jetzigen Stand der Technik die MMP-Aktivität nicht selektiv reguliert. Herkömmlicherweise wurden Hochaffinitäts-Regulatoren eingesetzt, die zu vollständiger MMP-Hemmung führten. Jedoch ist das Ausschalten jedweder MMP-Aktivität sogar zerstörerisch für den Heilungsprozess, da eine gewisse MMP-Aktivität für die Wiederherstellung von Gewebe erforderlich ist. Zum Beispiel ist eine wirksame Hemmung, die auf die Zink(II)-Stelle zielt, toxisch für Menschen, da sie das Binden an alle Zink-enthaltenden Enzyme ausschaltet. Daher ist es notwendig, eine selektive Regulierung bereitzustellen.
  • Folglich besteht ein Bedarf in der Technik für eine verbesserte Regulierung der MMPs, um die Heilung von chronischen und akuten Wunden zu fördern.
  • Ebenso besteht ein Bedarf in der Technik für einen Inhibitor, der eine relativ gute, selektive Affinität aufweist.
  • Weiterhin besteht ein Bedarf in der Technik für MMP-Inhibitoren, die nicht toxisch für das Individuum sind, an das sie verabreicht werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einer Hinsicht stellt die vorliegende Erfindung durch das Verwenden eines neuartigen Ansatzes zur Handhabung der Proteinase an Wundstellen eine neue Klasse von MMP-Regulatoren bereit. Diese Regulatoren umfassen einen Zink-Chelator, der kovalent an ein Peptid gebunden ist, das mit einer Region eines TIMP-Proteins korrespondiert, die direkt mit einem MMP-Molekül in der Nähe des katalytischen Zinkmoleküls interagiert, um die Wundstellenproteinasen zu binden. Die Bindungsspezifität des Peptids bringt den Zink-Chelator in einer derartigen Art und Weise in eine molekulare Nähe des MMP-gebundenen Zinks, um das Binden zuzulassen. Zusätzlich zu dieser Affinität wird die genaue Sequenz des Peptids das Zielen auf spezifische MMPs zulassen. Diese chemische Eigenschaft reguliert den Grad der MMP-Aktivität auf eine Art und Weise, die Heilung begünstigt. Dadurch wird ein MMP-Regulator bereitgestellt, der, anders als bekannte MMP-Regulatoren, mit hoher Affinität selektiv die MMP-Aktivität regulieren kann.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen der neuen Klasse der MMP-Regulatoren bereit. Das Verfahren umfasst das Binden eines Zink-Chelators an synthetische Peptide. Die ausgewählten Peptidsequenzen waren der Teil des TIMPs, die die genaueste Annäherung an das MMP in der Nähe des katalytischen Zink erzielten. Die Sequenz ist ein herkömmliches strukturelles Merkmal der Bindungsstelle.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des neuartigen MMP-Regulators der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung chronischer und/oder akuter Hautwunden und anderer Erkrankungen, in welchen MMPs eine Rolle spielen, bereit. Die neuen MMP-Regulatoren der vorliegenden Erfindung sind dadurch vorteilhaft gegenüber konventionellen Inhibitoren, da sie sowohl eine verbesserte Selektivität als auch eine verbesserte Affinität bereitstellen. Zusätzlich binden die MMP-Regulatoren der vorliegenden Erfindung selektiv an MMPs, ohne dem zu behandelnden Individuum einen potentiellen Schaden zuzufügen. Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die die neuartigen MMP-Regulatoren der Erfindung umfassen, welche einen Zink-Chelator enthalten, der an ein TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist. Diese Zusammensetzungen binden MMP besonders wirksam, ohne andere Zink-abhängige biochemische Aktivitäten zu beeinträchtigen. Letztendlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der neuartigen MMP-Regulatoren der Erfindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Kontrollieren von Erkrankungen, die durch unkontrollierte MMP-Aktivität verursacht werden, bereit, worin die neuartigen MMP-Regulatoren ohne die Verwendung von toxischen Inhibitoren an einer zu behandelnden Stelle verabreicht werden.
  • Daher ist es eine Aufgabe der Erfindung neue MMP-Regulatoren bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, MMP-Regulatoren bereitzustellen, die einen Zink-Chelator umfassen, der kovalent an synthetische Peptide gebunden ist, die neuartige Aminosäuresequenzen enthalten, die an die TIMP-Bindungsstelle der MMP binden.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, neuartige synthetische Peptide zur Verwendung in der Herstellung der MMP-Regulatoren der Erfindung bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuartigen Zink-Chelator für die Verwendung in der Herstellung der MMP-Regulatoren der Erfindung bereitzustellen.
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, synthetische Peptide, die die SEQ ID Nrn. 1, 2 und 3 aufweisen, bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, MMP-Regulatoren bereitzustellen, die Peptide umfassen, die die SEQ ID Nrn. 1, 2 oder 3 und einen Zink-Chelator aufweisen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung MMP-Regulatoren bereitzustellen, die Peptide enthalten, die mindestens einen Cysteinrest enthalten.
  • Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, die Verwendung der MMP-Regulatoren der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von chronischen und akuten Wunden bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen MMP-Regulator umfasst, worin der MMP-Regulator einen Zink-Chelator enthält, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 stellt einen zeitlichen Reaktionsablauf der MMP-9 Hydrolyse von mit Fluoreszein versehenem Collagen in der Gegenwart von ansteigenden Mengen der Zink-chelatbildenden Peptiden dar. Die Kurven (von oben nach unten) zeigen MMP-9:ChePep-1 in molaren Stöchiometrien von 1:0, 1:0,25, 1:0,5 und 1:1. ChePep-1 ist zusammengesetzt aus PSDE, gebunden mit dem Peptid, das die SEQ ID Nr. 4 aufweist. Der Graph zeigt die Fluoreszenz als eine Funktion der Zeit in dem fortlaufenden Assay.
  • 2 stellt ChePep-2 Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay dar. ChePep-2 ist zusammengesetzt aus IDA, gekoppelt mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 5 aufweist. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen wurden zu den angegebenen Zeiten durchgeführt. Die Kurven zeigen ChePep-2:MMP-9 in molaren Stöchiometrien von 0:1 (geschlossener Kreis), 0,1:1 (offener Kreis), 0,2:1 (geschlossenes Quadrat), 0,3:1 (offenes Quadrat).
  • 3 zeigt ChePep-3 (geschlossenes Quadrat) und ChePep-4 (offener Kreis) Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay. ChePep-3 wird hergestellt durch Koppeln von PSDE mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 6 aufweist, und ChePep-4 wird hergestellt durch Koppeln von IDA mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 6 aufweist. Die ChePeps wurden mit MMP-9 für 10 Minuten inkubiert, um das Binden zu bewirken. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen wurden zu den angegebenen Zeiten durchgeführt. MMP-9, nur als Kontrolle, ist gezeigt als Referenz (geschlossener Kreis). Die molare Stöchiometrie von ChePep:MMP-9 ist 0,25:1.
  • 4 erläutert ChePep-5 Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay. ChePep-5 ist zusammengesetzt aus einem AFTA, gekoppelt mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr: 7 aufweist. ChePep-5 wurde mit MMP-9 für 10 Minuten inkubiert, um das Binden zu bewirken. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen wurden zu den angegebenen Zeiten durchgeführt. Die Kurven repräsentieren ChePep-5:MMP-9 in molaren Stöchiometrien von 0:1 (geschlossene Kreise), 0,1:1 (offene Kreise), 0,2:1 (geschlossene Quadrate), 0,3:1 (offene Quadrate). Anregung war bei 365 nm und Emission war unveränderlich bei 450 nm.
  • 5 zeigt ChePep-6 Regulierung von MMP-9 mittels FRET Assay. ChePep-6 ist hergestellt durch Koppeln von AFTA mit einem Peptid, das die SEQ ID Nr. 8 aufweist. ChePep-6 wurde mit MMP-9 für 10 Minuten inkubiert, um das Binden zu bewirken. Dieses Gemisch wurde zu dem FRET Substratpeptid in Reaktionspuffer hinzugefügt. Fluoreszenzmessungen (Anregungsmessungen 365 nm, Emission 450 nm) wurden zu den angegebenen Zeiten ausgeführt. Die Kurven zeigen ChePep-6:MMP-9 in molaren Stöchiometrien von 0:1 (geschlossene Kreise), 0,1:1 (offene Krise).
  • 6 stellt eine SPR Analyse von ChePep-6 Bindung an immobilisiertes MMP-9, das auf der Oberfläche eines BiaCore CM-5 Chips gelagert ist, dar. Das Sensorgramm zeigt das relative SPR Signal als eine Funktion der Zeit für eine 400 Sekunden dauernde Assoziationsphase und eine 800 Sekunden dauernde Dissoziationsphase. Die Durchflussrate wurde bei einer Rate von 20 μl pro Minute gehalten.
  • 7 zeigt einen Assay der Lebensfähigkeit der Verbindungen. Die grafische Darstellung zeigt die prozentuale Lebensfähigkeit der in dieser Studie eingesetzten Peptide relativ zu einer PBS Kontrolle. Balken in Messabweichungen sind +/–SD. Proben (von links nach rechts) sind wie folgt: PBS Positivkontrolle, 1% Triton X-100 Negativkontrolle. ChePep-1, ChePep-2, ChePep-3, ChePep-4, ChePep-5 und ChePep-6.
  • 8 ist ein Reaktionsschema der Modifikation von EDTA zu PSDE, um das Koppeln des EDTA-Chelatbildners an die Peptide der Erfindung zu gewähren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • MMPs enthalten ein im aktiven Zentrum lokalisiertes Zinkmolekül. Dieses Zinkmolekül nimmt eng an der Chemie des degradierenden Collagens teil. Als ein Ergebnis, falls das Zink blockiert oder entfernt wird, kann die enzymatische Aktivität der MMP gehemmt werden. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen (hierin beschrieben als ChePeps) für die Regulierung von MMP-Aktivität dar. Diese Zusammensetzungen umfassen einen Zink-Chelatbildner, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist. Der Zink-Chelatbildner kann eine beliebige Verbindung sein die Zink bindet, egal ob das Molekül ein echter Chelatbildner ist oder nicht. Das von TIMP-abgeleitete Peptid entspricht einer Region des TIMP-Proteins, die direkt mit dem MMP-Molekül in der Nähe des katalytischen Zinkmoleküls interagiert. Die Bindungsspezifität dieses Pep tids hilft den Zink-Chelatbildner in einer Art und Weise in eine molekulare Nähe mit dem MMP-gebundenen Zink zu bringen, um das Binden des Zinks der MMP zu gewähren. Zusätzlich zu dieser Affinität wird die genaue Peptidsequenz das Zielen („targeting") auf spezifische MMPs gewähren. Diese Chemie reguliert den Grad der MMP-Aktivität bis zu einem Punkt, der das Heilen fördert.
  • Vorzugsweise wird moderne molekulare Modellmethodik eingesetzt, um die neuartigen Peptide der vorliegenden Erfindung zu entwickeln, die an die Zink(II)-Stelle der MMPs binden können und daher ein umfassendes Spektrum der MMPs regulieren. Eine Analyse der dreidimensionalen Struktur der verschiedenen MMPs und TIMPs und die chemische Beschaffenheit und eine Identifizierung der konservierten und abweichenden Aminosäuren in der MMP-TIMP Kontaktstelle wird bevorzugt mittels molekularer Modelle unter Einsatz von zwei Visualisierungsprogrammen, Swiss PDB Viewer (Guex und Peitsch, 1997) und Rasmol (Sayle und Milner-White, 1995), vollzogen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben durch Visualisierung der TIMP~MMP Komplexe herausgefunden, dass die TIMP-Moleküle einen erheblichen Kontakt mit dem Bereich herstellen, die die MMP-aktive Stelle umgibt.
  • Andere Forscher haben die Interaktion zwischen MMPs und TIMPs untersucht (Butler et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 20391–96; Overall et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 4421–29; Meng et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 10184–89). In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Ableitung der Peptide von TIMP-Proteinen, die Strukturen in Übereinstimmung mit den drei Regionen der TIMP-Proteine umfassen, die in nächster Nähe zu dem MMP-katalytischem Zink liegen.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die neuartigen synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung relative kurze Strecken der Aminosäuren, die der TIMP/MMP Bindungsdomäne entsprechen. Diese Peptide können an einen Zink-Chelatbildner gekoppelt werden und sind fähig, viele MMP-Enzyme in dem Bereich des katalytischen Zinks zu bilden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung drei Peptide, die von TIMP-Regionen abgeleitet werden, die eine große Anzahl an spezifischen Seitenketten-Interaktionen mit MMPs aufweisen. Die genaue Sequenz der eingesetzten Peptide gewährt ein Zielen auf spezifische MMPs. Diese Sequenzen werden von drei separaten Regionen der TIMPs I-IV, die MMPs binden, abgeleitet.
  • Diese bevorzugten Peptide umfassen die Aminosäuresequenzen bezeichnet als SEQ ID Nrn. 1 bis 3. Diese Sequenzen werden in nachstehender Tabelle 1 gezeigt. Das Peptid mit der SEQ ID Nr. 1 erstreckt sich auf die MMP-Aminosäuren 2–9. Diese Peptide weisen eine Länge von sieben Aminosäuren auf. Das Peptid mit der SEQ ID Nr. 2 erstreckt sich auf die MMP-Aminosäuren 62–73 und weist eine Länge von 12 Aminosäuren auf. Das Peptid mit der SEQ ID Nr. 3 weist eine Länge von 9 Aminosäuren auf und umfasst MMP-Rest 97–105.
  • Innerhalb dieser bevorzugten Peptide besteht ein hohes Maß an Sequenzvariationen, gezeigt durch die Positionen in Klammem. Diese Variabilität kann als ein Werkzeug benutzt werden, um die Bindungsaffinität und die Spezifität der TIMP-Bindungsinteraktionen anzupassen. Die genaue Sequenz des Peptids kann durch Anpassen der Bindungsaffinität und/oder -spezifität geändert werden, solange lediglich ein Cysteinrest in dem Peptid vorkommt. Diese drei bevorzugten Peptide können durch C-ter Amidierung und N-ter Acetylierung weiter modifiziert werden. Es wird häufig beobachtet, dass diese Ladungsneutralisation die Bindungsaffinität erhöht, da es vortäuscht, dass das Peptid im Zusammenhang des ganzen Proteins vorliegt. Zusammenfassend, diese spezifischen Peptide gewähren den Grad der spezifischen MMPs in einer koordinierten Art und Weise abzuändern. Tabelle 1. Peptidfamilie-Sequenzen
    Figure 00110001
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die synthetischen Peptide der vorliegenden Erfindung mindestens einen Cysteinrest.
  • Obwohl es nicht erwünscht ist, an die folgende Theorie gebunden zu sein, scheint es, dass die bevorzugten ChePep-Komplexe die Iminocarboxylatgruppen mittels Zink- Chelatbildung blockieren, bevor sie die verbleibende Carboxylgruppe aktiviert an die Peptide zu binden. Einmal an das Zink-Ion gebunden sind diese Carboxylgruppen nicht mehr fähig an der Aktivierungsreaktion teilzunehmen. Die Zink-Bindungsaffinität ist hoch genug, um eine langsame Reaktionsgeschwindigkeit zu garantieren, so dass die bindenden Carboxylgruppen während der NHS/EDC-Reaktion an das Zink gebunden werden (siehe Beispiele). Das Zink-Ion wird dann durch umfangreiche Dialyse entfernt. Zum Beispiel kann das Material durch eine 500 MWCO Celluloseacetat-Dialysesonde gegen 50% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/Wasser, für 48 Stunden vorzugsweise bei Raumtemperatur, dialysiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zink-Chelatbildner ein Molekül, das einen Di-Essigsäure-Anteil enthält und daher ein guter Chelatbildner für bestimmte zweiwertige Kationen, einschließlich Zink, ist. Obwohl diese Verbindungen bevorzugt werden, kann jedes kleine organische Molekül, das die Fähigkeit aufweist, an ein Zinkmolekül zu binden oder zu chelatieren, räumlich in das MMP-aktive Zentrum eintreten (ohne jegliche zerstörerische elektrostatische Interaktionen auszuführen) und ist der Aufnahme in ein Chelat-bildendes Peptid (ChePep) fähig. Der Vorgang der Chelatbildung selbst ist dadurch, dass jegliches Zink ein potentielles Ziel zur Chelatbildung darstellt, nicht spezifisch. Mögliche Chelatbildner umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, Zitronensäure, Salicylsäure, und Hydroxybernsteinsäure. Andere Chelatbildner umfassen Peptide, die an Zink binden können. Zum Beispiel, Peptide mit der SEQ ID Nr. 9 (CDIC) oder SEQ ID Nr. 10 (HTITI-) chelatieren die Zinkanteile durch Interaktionen mit den zwei Cysteinen (SEQ ID Nr. 9) oder den zwei Histidinen (SEQ ID Nr. 10). Diese Sequenzen werden von der Konsensus-Struktur des Zinkfingermotifs, beschrieben von Berg (Berg et al., Ann Rev Biophys Biomol Struct, 1997, 26: 357–71), abgeleitet. Diese Peptide können an das Zielpeptid mittels Standardpeptidsynthese gekoppelt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist eines der drei Zink-chelatbildenden Moleküle kovalent an eines von den verschiedenen TIMP-abgeleiteten Peptiden, die die vorliegende Erfindung umfassen, verknüpft. Die chemische Struktur dieser drei Zink-chelatbildenden Moleküle: Pyridindisulfidethylendiamintetraessigsäure (PSDE), Aminoiminodiessigsäure (IDA) und 2-Amino-4-Fluorophenol-N,N,O-tri-Essigsäure (AFTA), sind nachfolgend in Struktur 1 dargestellt. Struktur 1
    Figure 00130001
  • Die Pyridindisulfidethylendiamintetraessigsäure (PSDE) der vorliegenden Erfindung wird in einer aus der Literatur bekannten Synthese hergestellt (Hayward et al. (1995), J. Org. Chem. 60, 3924–27). Kovalentes Koppeln von PDSE an das Peptid wird durch einen einfachen stöchiometrischen Disulfidaustausch mit einem Cystein an dem Aminoende ausgeführt. Für gewöhnlich führt der Prozess zu einem wesentlich reinen Produkt mit einer Gesamtausbeute von etwa 10 bis 25%.
  • Die in nachfolgender Struktur 2 gezeigte Peptidsequenz ist eine Modifikation von SEQ ID Nr. 1, worin das Cystein in Position 3 durch ein Alanin ausgetauscht wurde. Dieses Molekül kann direkt an ein beliebiges freies Thiol mittels einer einfachen Disulfidaustauschreaktion gekoppelt werden. Struktur 2
    Figure 00130002
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung PSDE gekoppelt mit SEQ ID Nr. 4 (CSAVPVH) mit einer Gesamtausbeute von 80% bereit. Das Reaktionsprodukt wird dann mittels RP-HPLC aufgereinigt, wie in den Beispielen beschrieben. Das Einführen dieses Moleküls, ChePep-1, in MMP-9 unterbindet das Enzym mit Fluoreszein versehenes Collagen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise, wie in 1 gezeigt, abzubauen.
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Bildung eines zusammengeschlossenen Regulators (Bindungsspezifität durch das Peptid und Zink-Chelatbildung durch das kleine Molekül) durch kovalentes Verbinden von EDTA oder IDA an eine von TIMP-abgeleitete Peptidsequenz, bereit. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Iminoessigsäure (IDA) sind wirksame Chelatbildner von Zink. Jedoch benötigt ein EDTA-Chelatbildner etwas vorhergehende, aus der Literatur bekannte, Synthese um eine Kopplungsreaktion, die von der vorliegenden Erfindung bevorzugt wird, auszuführen. Diese Synthese ist von Hayward et al. (J. Org. Chem., Vol. 60 (12), 1995, 3924–3927) beschrieben und in 8 dargestellt. Eine derartige Synthese ist für IDA nicht notwendig, da es relativ leicht ist, IDA an die Carboxylatgruppe eines Aspartats zu koppeln, das durch Reaktion mit N-Hydroxybernsteinsäureimid (NHS/N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)carbo-diimid (EDC) (EDC/NHS) in ein Bernsteinsäureimidester umgewandelt wurde.
  • Durch das Koppeln von IDA an ein ähnliches Peptid, SEC ID Nr. 5 (DSAVPVH), kann der Einfluss der Größe des EDTA-Anteiles an ChePep-1 (PSDE und SEQ ID Nr. 4) bestimmt werden. In diesem Augenblick wird die Carboxylatgruppe der N-ter Peptidasparaginsäure in ein Succiminidester mittels Inkubation mit EDC/NHS aktiviert. Diese einfache Reaktion wird normalerweise verwendet, um freie Aminogruppen mit aktivierten Carboxylaten zu verbinden. Die Allgemeinstruktur eines Peptids, das durch ein aktiviertes Asparaginsäurecarboxylat kovalent an IDA gebunden ist, ist in nachfolgender Struktur 3 gezeigt. Struktur 3
    Figure 00150001
  • Vorzugsweise läuft das gesamte Syntheseschema, das IDA an das Peptid koppelt und das Endprodukt reinigt, mit einer Gesamtausbeute von 49% ab. Um mögliche Verunreinigungen in der Reaktion zu vermeiden, wird ein Peptid mit einer C-ter Amidgruppe verwendet. Daher sollte die einzige freie Carboxylgruppe in dem Peptid eine Asparaginsäure-Seitenkette sein.
  • Das Molekül ChePep-2 (IDA und SEQ ID Nr. 5) reguliert MMP-9 in dem Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Assay in einer Dosis-abhängigen Art und Weise. Das Konstrukt ist wesentlich wirksamer in der Regulation von MMP-9 als es ChePep-1 war, wie in 2 gezeigt. Dies kann an der Fähigkeit eines IDA-Anteiles liegen, das aktive Zentrum von Zink aufgrund der räumlichen Berücksichtigung wirksamer als PSDE zu binden, als auch aus dem Bedarf die Ladungsinteraktionen mit der zweiten Chelat-bildenden Gruppe auf PSDE zufriedenzustellen. Zusätzlich kann die Neutralisation der C-ter negativen Ladung des Peptids mittels der Amidierung ebenso die Bindungsaffinität verändern.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist PSDE an ein Peptid der SEQ ID Nr. 2 gekoppelt. Spezifischer ist PSDE an ein Peptid gekoppelt, das die SEC ID Nr. 10 aufweist, das an dem Amino-Ende (IYTACMSAV-NH2) mittels der gleichen, vorgehend beschriebenen, Disulfidaustauschreaktion mit einem Amin versehen wurde. Die Ausbeute des Endprodukts betrug 37%. Die allgemeine Struktur eines Chelat-bildenden Peptids (ChePep) zusammengesetzt aus PSDE und SEQ ID Nr. 2 ist nachfolgend gezeigt. Struktur 4
    Figure 00160001
  • Sollte der Cysteinrest in der fünften Position des oben aufgeführten Moleküls zu Asparaginsäure umgebaut sein, dann kann IDA an der gleichen Position in die Struktur eingebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist IDA, mittels der EDC/NHS Reaktion wie in den Beispielen beschrieben, an SEQ ID Nr. 2, spezifischer an das Peptid von SEQ ID Nr. 11, gekoppelt. Die Ausbeute des Endprodukts betrug 75%. Die RP-HPLC Chromatogramme beider ChePep-Moleküle zeigten einen einzigen Absorptionspeak bei 214 nm.
  • Sowohl ChePep-3 (PSDE und SEQ ID Nr. 6) und ChePep-4 (IDA und SED ID Nr. 6) zeigen nahezu eine identische Fähigkeit MMP-9 in dem Standard FRET Assay zu regulieren. Der zeitabhängige Regulierungsablauf wird in 3 gezeigt. Trotz der Tatsache, dass es Unterschiede zwischen IDA und PSD gibt, zeigt das molekulare Modellverfahren, das die Chelat-bildenden Gruppen beider ChePep-Konstrukte eine ähnliche Zugänglichkeit an das aktive Zink-Zentrum in MMP besitzen. Tatsächlich macht die zweite Chelat-bildende Gruppe von PSDE keine energetisch ungünstigen Interaktionen, die die Bindungsaffinität herabsetzen würden. Es wird angenommen, dass ChePep-3 einige Bindungsenergie durch die Interaktion des Carboxylatsauerstoffs mit dem freien Ligandenanteil eines MMP-9 Hauptamids („backbone amide") gewinnt.
  • Moleküle, wie 2-Amino-4-fluorophenol-N,N,O-tri-Essigsäure (AFTA) sind gemäß der wissenschaftlichen Literatur nicht allgemeinen bekannt oder werden als Metall-Chelatbildner verwendet, können aber in dieser Anwendung tatsächlich leicht Zink-Chelate bilden. Es wurde herausgefunden, dass AFTA gut an das aktive Zentrum von MMP-ähnlichen Enzymen bindet. Die Diacetatgruppe an der zweiten Ringposition bildet das Zink-Chelat. Die dritte Acetatgruppe kann verwendet werden, um ein Peptid an das Molekül zu koppeln. Das elektronegative Fluor kann durch spezifische Interaktionen in dem aktiven Zentrum des Enzyms auch an der Regulierung von MMP mitwirken. Die Allgemeinstruktur von SEQ ID Nr. 3, kovalent an AFTA gebunden, ist nachfolgend gezeigt. Struktur 5
    Figure 00170001
  • Die oben aufgeführte Struktur wird durch Koppeln eines Peptides mit der SEQ ID Nr. 7 (VHTHLCD) an einen AFTA Zink-Chelatbildner, unter Verwendung der gleichen, vorstehend beschriebenen EDC/NHS Reaktion, zusammengesetzt, mit dem Unterschied, dass die aktivierte Carboxylgruppe durch den AFTA-Anteil bereitgestellt wurde. Da sich an AFTA drei freie Carboxylgruppen befinden, wovon nur zwei an der Zinkbindung (siehe Struktur 1) teilnehmen können, ist es notwendig, diese Chelat-bildenden Gruppen der EDC/NHS Behandlung gegenüber unreaktiv zu machen. Dies kann durch Mischen von AFTA mit Zinksulfat vor der EDC/NHS Aktivierung erreicht werden. Das Zink-Ion wird durch den Iminodiessigsäureanteil Chelat-gebunden, dabei bleibt ein einziges freies Carboxylat übrig. Der Bernsteinsäureimidester wird dann an dieser Gruppe, wie in den Beispielen beschrieben, gebildet. Der aktivierte AFTA-Zink-Komplex wird an die N-ter Aminogruppe des Peptids gekoppelt und das daraus resultierende Molekül (ChePep-5) wird mittels RP-Phase HPLC bis zur Homogenität gereinigt. Vorzugsweise betrug die Gesamtausbeute 61% und der am Ende erhaltene Stoff wird als 97% rein betrachtet. Die allgemeine Struktur dieses in Struktur 5 gezeigten Typs des Regulators ist fähig, die Hydrolyse des FRET-Peptids in einer Dosis-abhängigen Art und Weise zu verhindern.
  • Tatsächlich stellte sich ChePep-5 gemäß der in 4 gezeigten molaren Stöchiometrie-Tests als ein besserer Regulator als IDA oder die PSDE-basierenden Chelat-bildenden Peptide heraus. Sein Erfolg kann von vier Faktoren kommen, ist aber nicht auf diese limitiert: die Fluorgruppe, die aufgrund seiner Elektronennegativität hartnäckig an die Proteine bindet; der Ring selbst, der hydrophob ist und daher gut an das hydrophobe, aktive Zentrum der MMP bindet; die Gegenwart von drei zu bindenden Carboxylgruppen, um die Zink-Chelatbildung zu gewähren; und die Aminogruppen, um Spezifizität zu erzeugen.
  • In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein zweites AFTA-Peptidkonstrukt synthetisiert. Dieses Peptid (ChePep-6) umfasst die SEQ ID Nr. 8 (CTCVP) und ein AFTA, in dem das AFTA-Molekül an das Aminoende des Peptids gekoppelt ist. Die Kopplung wird vorzugsweise durch vorhergehendes Mischen von gleichen Mengen Zinksulfat und AFTA hergestellt. Der sich daraus ergebende Komplex wird dann mit NHS/EDC aktiviert. Eine Amidkopplung wird dann durch die Verwendung der N-ter Region des Peptids hergestellt. Hilfsweise kann AFTA an das Cysteinthiol mittels einer Disulfidaustauschreaktion gebunden werden. Die Struktur des bevorzugten Chelat-bildenden Peptids ist nachfolgend in Struktur 6 gezeigt. Struktur 6
    Figure 00190001
  • Dieses Chelat-bildende Peptid besitzt die Fähigkeit, die Hydrolyse des FRET Substratpeptids in dem Standardassay zu verhindern. Wie aus 5 ersichtlich ist, ist ChePep-6 ein effektiver MMP-9 Regulator bei niedrigmolaren Stöchiometrien. Zusätzlich bindet ChePep-6 schnell und mit hoher Affinität; und, wie aus 6 ersichtlich, erst einmal gebunden, dissoziiert ChePep-6 nicht. Tatsächlich ergab die Kombination von Peptiden der Gruppe I mit einem AFTA-Anteil den wirksamsten Regulator von all den ChePeps.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung des MMP Regulators der Erfindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von chronischen und akuten Wunden. Durch Verabreichen der Zusammensetzung auf die chronische Wunde kann die MMP-Aktivität reguliert werden. Spezifischer umfasst die Zusammensetzung ein Peptid mit Bindungsspezifität, um den Zink-Chelatbildner in einer derartigen Art und Weise in molekulare Umgebung des MMP-gebundenen Zinks zu bringen, um das Binden zu erlauben. Zusätzlich zu dieser Affinität wird die genaue Sequenz des Peptids das Zielen der spezifischen MMPs gewähren. Die Reaktion reguliert den Grad der MMP-Aktivität bis zu einem Punkt, der Heilung fördert.
  • Ein herausragender Punkt dieser auf Peptid basierenden Therapie ist die Plastizität, in welcher dieses Material auf chronische Wunden aufgetragen werden kann. Wenn die Infektion auf der Haut sitzt, ist eine bevorzugte Formulierung eine Salbe, Lotion oder eine andere topische Formulierung. Die Zusammensetzung für topische Verabreichung, die sich nützlich für die vorliegende Erfindung erweist, kann in einer Vielfalt von Produktarten hergestellt werden. Diese umfassen, sind aber nicht limitiert auf, Cremes, Gels, Sticks, Sprays, Pasten, Schäume oder jedes beliebige wässrige Medium. Diese Produktarten können verschiedene Arten von Trägersystemen umfassen, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Lösungen, Dispersionen, Emulsionen, Gele, Feststoffe und Liposome. Zusätzlich können die Peptide mittels Abgabe durch das Wundbandmaterial selbst in einer kontinuierlichen Art und Weise in das Wundbett eingebracht werden. Bevorzugte Dosierungen zum Behandeln von chronischen Wunden betragen zwischen ungefähr 0,01 und 1,0 mg/ml.
  • Schließlich ist es eine weitere Ausführungsform der Erfindung, spezifisch die MMP-Aktivität zu kontrollieren. Bestimmte Erkrankungen werden durch unkontrollierbare MMP-Aktivität verursacht. Tatsächlich werden manche Erkrankungen nur durch ein bestimmtes der neun MMP-Moleküle verursacht. Durch das Herstellen von Peptiden, die einem aktiven Zentrum von spezifischen MMPs entsprechen und nachfolgendem Koppeln eines Zink-Chelatbildners an das Peptid, wird nur zielgerichtete MMP-Aktivität mit einem hohen Grad an Affinität und Spezifität reguliert.
  • Die MMP-Regulatoren der vorliegenden Erfindung sind nicht toxisch in einem Hautähnlichen Modell. Die allgemeinen toxischen Auswirkungen eines nicht-spezifischen Zink-Chelatbildners sind durch die Tatsache, dass der Peptidteil des ChePep- Konstruktes direkt auf das Konstrukt des MMP-aktiven Zentrums in einer derartigen Art und Weise zielt, um die Chelatbildung an sekundären (nicht MMP-) Zielen herabzusetzen, abgeschwächt.
  • HERSTELLVERFAHREN
  • Alle Peptide wurden unter Verwendung konventioneller Verfahren durch Sigma-Genosys, Inc. synthetisiert. Die freigesetzten Peptide wurden bis zu einer mehr als 95%igen Homogenität mittels RP-HPLC durch die Firma gereinigt. Das am Peak gesammelte eluierte Material wurde entsalzt und lyophilisiert. Massenspektronomieanalysen bestätigten das molekulare Gewicht und die Reinheit der Peptide. Wenn nicht anders vermerkt, wurden alle chemischen Mittel von Sigma-Chemical Corp. oder von Fluka Chemikal Co. bezogen. Aktive MMP-9 Enzyme wurden von Calbiochem bezogen.
  • Die molekularen Modellverfahren verwendeten zwei Visualisierungsprogramme. Swiss PDB Viewer (Guex und Peitsch, 1997) und Rasmol (Sayle und Milner-White, 1995). Die Modellerstellung wurde an einem Compaq PC mit Windows 95 sowie an einer Silicongraphics, Inc. Octane UNIX Workstation ausgeführt. Zusätzlich wurde das Cerius2 Molekularpaket von Molecular Simulations, Inc. an der Octane Workstation eingesetzt. Dreidimensionale Strukturdaten wurden von der Protein Datenbank wie folgt heruntergeladen (Dateiname, Referenz): MMP-1 (1FBL, Li et al., 1995), MMP-2 (1GEN, Libson et al., 1995), MMP-8 (1JAO, 1JAN, Grams, et al., 1995; Reinemer et al., 1994), MMP-9 (1MMQ, Browner et al., 1995), TIMP-2/MT-1 MMP-Komplex (1BUV, Fernandez-Catalan et al., 1998), TIMP-2 (1BR9, Tuuttila et al., 1998), und TIMP-1/MMP-Komplex (1UEA, Gomis-Ruth et al., 1997; Huang et al., 1996; Becker et al., 1995). Diese Dateien wurden verwendet, um die dreidimensionale Struktur der Proteine und die chemische Natur und Identifizierung von konservierten und abweichenden Aminosäuren an der MMP-TIMP-Kontaktstelle zu analysieren. Diese Information wurde verwendet, um ein minimalistisches Peptid herzustellen, das an einen Zink-Chelatbildner gekoppelt werden konnte, und das viele MMP-Enzyme in dem Bereich des katalytischen Zinks binden würde.
  • BEISPIEL 1: IDA Chelat-bildende Peptide
  • Das Peptid wurde in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 100 mM resuspendiert. Die Aminoform von IDA wurde in einer kleinen Menge DMSO gelöst, gefolgt von der langsamen Zugabe von Wasser bis die Verbindung eine Konzentration von 150 mM erreichte. Zu der IDA-Lösung wurden N-Hydroxybernsteinsäureimid (NHS) bis zu einer Endkonzentration von 175 mM und N-Ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) bis zu einer Endkonzentration von 400 mM hinzugefügt. Die Lösung wurde bei 37°C unter schonendem Rühren für 30 Minuten inkubiert. Die vorher hergestellte Peptidlösung wurde dieser Reaktion langsam über einen Zeitraum von 5 Minuten hinzugefügt. Rühren wurde für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Ethanolamin-HCl bis zu einer Endkonzentration von 1,0 M abgeschreckt. Das Endgemisch wurde über eine Zeitdauer von 10 Stunden in einem Rotovac getrocknet. Das feste Material wurde dann in 500 μl Wasser resuspendiert und das Chelat-bildende Peptid wurde von nicht-reagierenden Arten mittels RP-HPLC aufgereinigt. Eine Chromatographie mit einer 250 mm × 100 mm, 5 ml Hypersil ODS-2 RP Säule wurde mit einer mobilen Phase von: A: 0,1% TFA/Wasser, B: 0,1% TFA/Acetonitril durchgeführt. Nach Probeninjektion wurde ein Gradient von 100% A (0 bis 2 min.) and 0–60% B (2 bis 25 min.) eingesetzt. Das Chelat-bildende Peptid wurde durch Integration am Peak bei 214 nm nachgewiesen und wies eine Reinheit von 96% auf. Die eluierten Peaks wurden zusammengefasst, mit 3 Volumen Wasser gemischt und gefriergetrocknet. Das entstehende Pulver wurde in Wasser resuspendiert und durch eine 500 MWCO Zelluloseazetatdialyse-Sonde gegen 50% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)/Wasser dialysiert. Das Chelat-bildende Peptid wurde aliquotiert und gefroren bei –20°C aufbewahrt.
  • BEISPIEL 2: AFTA Chelat-bildende Peptide
  • AFTA (50 mg) wurde in einer kleinen Menge DMSO gelöst, gefolgt von der langsamen Zugabe von Wasser bis die Verbindung eine Konzentration von 200 mM erreichte. Zu dieser Lösung wurde Zinksulfat bis zu einer Endkonzentration von 300 mM hinzugefügt. Diese Lösung wurde langsam bei Raumtemperatur gerührt. Die Probe wurde dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit EDC/NHS behandelt. Der entstehende AFTA-Bernsteinsäureimidester wurde mit einem Peptid mit der SEQ ID No. 7 oder 8, gekoppelt und das entstehende Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgereinigt. Nach dem Gefriertrocknen wurde das AFTA-Peptid in Wasser resuspendiert und es wurde umfangreich gegen Wasser in einer 500 MWCO Zelluloseacetatdialyse-Sonde dialysiert. Die Abwesenheit eines Zink-Ions wurde durch atomare Absorptionsspektroskopie bestätigt.
  • BEISPIEL 3: PSDE Chelat-bildende Peptide
  • PSDE wurde gemäß dem Verfahren von Hayward et al. (1995) hergestellt. Dieses Material wurde direkt mit einer stöchiometrischen Menge eines Cystein-enthaltenden Peptids mit der SEQ ID Nr. 4 oder 6, mittels der folgenden Disulfidaustauschreaktion gekoppelt. PSDE in einer Menge von 100 mM in Wasser und Peptid in einer Menge von 100 mM in 25 mM Tris-HCl (pH 7,2) wurden gemischt und für 45 Minuten bei 30°C gewährt zu reagieren. Das Produkt wurde mittels Dialyse gegen 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) in einer 500 MWCO Zelluloseacetatdialyse-Sonde von den Reaktionspartnern gereinigt. Das Produkt wurde weiter mittels RP-HPLC, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt.
  • BEISPIEL 4: Regulierung der MMPs
  • Zwei enzymatische Assays wurden ausgeführt. Mit dem ersten Assay wurde die enzymatische Hydrolyse von mit Fluoreszein versehenem Collagen durch MMP-9 als eine Funktion der Zeit gemessen. Mit Fluoreszein versehenes Collagen (Molecular Probes, Inc.) mit einer Konzentration von 5 μM wurde zu Reaktionspuffer hinzugefügt (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,1 mM NaN3) und in eine Spectrosil Quarz Fluormeter-Kuvette überführt. MMP in einer Konzertration von 0,1 μM wurde mit variierenden Mengen von Chelat-bildenden Peptiden mit den SEQ ID Nrn. 4 oder 6 gemischt und für 10 min. bei 25°C inkubiert um eine Bindung hervorzurufen. Das Proteingemisch wurde zu dem Collagen-Substrat hinzugefügt und rasch vermischt. Fluoreszenzemissionsintensität wurde bei 520 nm in einem Shimadzu RF5301 Fluormeter als eine Funktion der Zeit (Anregungswellenlänge 495 nm) gemessen. Der Fluoreszeinfreisetzungs-Assay wurde zur Bestimmung der inhibitorischen Konstante (Ki) des chelat-bildenden Peptidinhibitors ([I]) nach Segel (1993) gemäß der Verwendung von Dixonplots (1/v vs. [I]) derart verwendet, dass: Steigung = Km/(VmaxKi[S]) (1) worin Km die Michaelis Konstante, Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit und [S] die Substratkonzentration ist.
  • Der zweite Assay setzte das Verfahren des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) ein. Die Substratpeptide (Calbiochem #444221) umfassten sieben Aminosäuren, die an einen Carboxy-terminalen Dinitrophenylakzeptor und einen Amino-terminalen 2-Aminobenzoanthraniloyl(Abz)-Donorrest gekoppelt waren. Spaltung dieses Substrats durch MMP-9 ergab die Freisetzung eines Fluoreszenzproduktes (365 nm Anregung, 450 nm Emission). Peptide in einer Konzentration von 5 μM wurden zu Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,1 mM NaN3) hinzugegeben und in eine schwarze Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen („96-well") überführt, die vorhergehend mit 1% BSA blockiert wurde. MMP in einer Konzentration von 0,1 μM wurde mit variierenden Mengen eines Chelat-bildenden Peptids gemischt (0, 0,01, 0,02, 0,04, and 0,1 μM) und für 10 min. bei 25°C inkubiert um eine Bindung hervorzurufen. Das Proteingemisch wurde zu dem Peptidsubstrat hinzugefügt und rasch vermischt. Fluoreszenzintensität wurde mit einem Dynex MFX Fluoreszenz-Microtiterplatten-Lesegerät als eine Funktion der Zeit gemessen. Fluoreszenzintensität wurde auf die Molanzahl der gespaltenen Peptide mittels Herstellen einer Standardkurve mit einem Abz-enthaltenen Nicht-FRET-Peptid rückbezogen. Inhibitorische Konstanten wurden von den Kurven abgeleitet und sind nachfolgend in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Inhibitorkonstanten
    Figure 00240001
  • Beispiel 5: Oberflächen-Plasmon-Resonanz
  • Das BiaCore-X Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR) Gerät wurde verwendet, um die Interaktion zwischen dem Chelat-bildenden Peptid (CP) und MMP-9 zu messen. Für diese Experimente wurde ein Carboxymethyldextran Sensorchip (BiaCore, AB; CM-5, Lofas et al., 1993) mit 50 mM N-Hydroxybernsteinsäureimid, 0,2 M N-ethyl-N'-(dimethylaminopropyl)-carbodiimid mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl pro Minute für zehn Minuten aktiviert. MMP-9 mit einer Konzentration von 75 ng/μl wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 μl pro Minute für zehn Minuten mit der aktivierten Oberfläche gekoppelt. Die abschließende Oberfläche wurde dadurch inaktiviert, dass 1 M Ethanolamin-HCl mit einer Geschwindigkeit von 10 μl pro Minute für fünf Minuten über die Sensoroberfläche geleitet wurde. CP wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 μl pro Minute und mit Konzentrationen von 10, 25 und 50 nM über die Sensoroberfläche geleitet. Die Bindungsisotherme wurden durch gleichzeitiges Anpassen der vorwärts (ka) und rückwärts (kd) Geschwindigkeitskonstanten an die folgende Formel bewertet: d[CP~MMP-9]/dt = (ka[CP][MMP-9]) – (kd[CP~MMP-9]) (2)
  • (Karlsson und Falt, 1997), worin [CP], [MMP-9] und [CP~MMP-9] die Konzentrationen der freien Chelat-bildenden Peptide, freien MMP-9 bzw. des Komplexes darstellen. Die Gleichgewichtsaffinitätskonstante (KA) ist definiert als: KA = ka/kd (3)
  • Gleichung 3 wird in Form des SPR Signals (Mortonet et al., 1995) ausgedrückt als: dR/dt = kaCRmax – (kaC + kd)R (4)worin R das SPR Signal (in Ausgabeeinheiten, "response units", RU) zu einer Zeit t ist, Rmax ist das Maximum der MMP-9 Bindungskapazität in RU, und C ist die Chelat-bildende Peptidkonzentration. Kinetische Analysen (O'Shannessy et al., 1993) wurden unter Verwendung von Origin von Microcal, Inc. durchgeführt.
  • BEISPIEL 6: Lebensfähigkeits-Assays
  • Die relative Toxizität der Chelat-bildenden Peptide und der Substratpeptide wurde mittels Verwendung des Hautmodells Epiderm, welches kommerziell von MatTek Corp. verfügbar ist, getestet. Die einzelnen Hautprobenbehälter wurden vor der Zugabe der Peptidkonstrukte für zwei Stunden in Kulturmedium bei 37°C unter 5% CO2 inkubiert. Die Probenbehälter wurden auf Platten mit 6 Vertiefungen mit frischem Medium übertragen. Alle Peptide wurden in PBS mit einer Endkonzentration von 10 mM gelöst, und jeweils 100 μl Peptidlösung wurden auf die Oberfläche der Epiderm-Probenbehälter pipettiert. Inkubation wurde für 12 Stunden bei 37°C unter 5% CO2 fortgesetzt. Nach der Inkubationszeit wurden die Probenbehälter dreimal mit PBS gewaschen und die Probenbehälter wurden auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 300 μl des MTT Assay Mediums pro Vertiefung (MTT Konzentration war 1 mg/ml) enthielt, übertragen. Der kolorimetrische Assay wurde während drei Stunden (Inkubation bei 37°C unter 5% CO2) entwickelt. Die Probenbehälter wurden dann auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 2 ml Isopropanol pro Vertiefung enthielt, übertragen. Extraktion des farbigen Niederschlags trat über eine Zeitdauer von vier Stunden bei Raumtemperatur auf. Absorptionsmessungen wurden für jede Probe bei 570 nm und 650 nm abgelesen. Die prozentuale Lebensfähigkeit einer jeden Probe relativ zur PBS-Kontrolle wurde berechnet als: 100 × (OD570 sam – OD650 sam)/(OD570 con – OD650 con) (5)
  • Jede Peptidprobe wurde routinemäßig zweifach oder dreifach getestet.
  • BEISPIEL 7:
  • Ein Haut-ähnliches Toxizitätsmodell (Epiderm) wurde eingesetzt, um die gesamte zelluläre Lebensfähigkeit in der Gegenwart der sechs Peptidkonstrukte zu messen. Eine einzelne Dosis von 10 mM Peptide (in PBS) wurde auf die Epiderm Proben über einen Zeitraum von 12 Stunden aufgetragen. Die resultierende Lebensfähigkeit ist in 7 gezeigt. Eine PBS-Kontrolle ist an einen Wert von 100 Prozent Lebensfähigkeit angepasst. Der oberflächenaktive Stoff Triton X-100 diente als Negativkontrolle, d.h. die Anwendung von einer 1%-igen Tritonlösung sollte zu einem Zelltod von über 90% der Zellen führen. Wie in 7 gesehen werden kann, zeigten alle sechs Peptide ungefähr 94,2 +/– 3,8 Prozent. AFTA, eines der drei Zink-Chelatbildner, scheint ein wenig mehr toxisch zu sein (90,5% Lebensfähigkeit) als IDA (94,8% Lebensfähigkeit) oder PSDE (96,5% Lebensfähigkeit), obwohl die Unterschiede in der Lebensfähigkeit nicht signifikant sind. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00270001
    Figure 00280001
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    Figure 00320001
    Figure 00330001

Claims (23)

  1. Ein MMP Regulator umfassend einen Zink-Chelatbildner, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist.
  2. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, Zitronensäure, Salicylsäure und Hydroxybernsteinsäure.
  3. Der Regulator gemäß Anspruch 2, worin der Zink-Chelatbildner IDA, PSDE oder AFTA ist.
  4. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 9 und 10.
  5. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin das Peptid die SEQ ID Nr. 1–3 umfasst.
  6. Der Regulator gemäß Anspruch 4, worin das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 5, 6, 7, 8 und 11.
  7. Der Regulator gemäß Anspruch 1, worin das Peptid mindestens einen Cysteinrest enthält.
  8. Die Verwendung eines MMP Regulators, umfassend einen Zink-Chelatbildner, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von chronischen oder akuten Wunden.
  9. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, Zitronensäure, Salicylsäure und Hydroxybernsteinsäure.
  10. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zink-Chelatbildner IDA, PSDE oder AFTA ist.
  11. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 9 und 10.
  12. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Peptid die SEQ ID Nr. 1–3 umfasst.
  13. Die Verwendung gemäß Anspruch 12, worin das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 5, 6, 7, 8 und 11.
  14. Die Verwendung gemäß Anspruch 8, worin das Peptid mindestens einen Cysteinrest enthält.
  15. Eine Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen MMP Regulator, worin der MMP Regulaator einen Zink-Chelatbildner umfasst, der kovalent an ein von TIMP-abgeleitetes Peptid gebunden ist.
  16. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin die Zusammensetzung in topischer Form vorliegt.
  17. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin die Zusammensetzung in Form einer Lotion, Salbe, Creme, Gel, Stift, Spray, Paste, Schaum, Lösung, Dispersion, Emulsion, fester Form und als Liposom vorliegt.
  18. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EGTA, DTPA, CDTA, HEDTA, NTA, IDA, PSDE, AFTA, Zitronensäure, Salicylsäure und Hydroxybernsteinsäure.
  19. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 18, worin der Zink-Chelatbildner IDA, PSDE oder AFTA ist.
  20. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin der Zink-Chelatbildner ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 9 und 10.
  21. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin das Peptid die SEQ ID Nr. 1–3 umfasst.
  22. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 21, worin das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nrn. 4, 5, 6, 7, 8 und 11.
  23. Die Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin das Peptid mindestens einen Cysteinrest enthält.
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