DE60125240T2

DE60125240T2 - Hcv-antigen/antikörper-kombinations-assay

Info

Publication number: DE60125240T2
Application number: DE60125240T
Authority: DE
Inventors: Y. David Alamo CHIEN; Phillip Oakland ARCANGEL; Laura San Leandro TANDESKE; Carlos Walnut Creek GEORGE-NASCIEMENTO; Doris Petaluma COIT; Angelica San Francisco MEDINA-SELBY
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2021-06-15
Also published as: WO2001096875A3; BR0111731A; PT1350105E; JP2004506878A; US6630298B2; CA2413003A1; HU228873B1; CY1107537T1; PL365599A1; US7241879B2; EP1354204A2; BRPI0111731C1; EP1350105A2; NO20025878L; PT1354204E; DK1350105T3; DK1354204T3; US20040096822A1; DE60129598D1; WO2001096875A2

Description

Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein virale Diagnostika. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Antigen/Antikörper-Kombinationstest für die genaue Diagnose einer Hepatitis-C-Virusinfektion.
Stand der Technik
Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist das auslösende Agens der parenteralen Non-A-Non-B-Hepatitis (NANBH), die größtenteils durch Bluttransfusion und Sexualkontakt übertragen wird. Das Virus liegt bei 0,4 bis 2,0% der Blutspender vor. In etwa 50% der Infektionen entwickelt sich eine chronische Hepatitis, und hiervon bekommen etwa 20% der infizierten Individuen eine Leberzirrhose, die manchmal zu einem hepatozellulären Karzinom führt. Demgemäß ist die Untersuchung und Kontrolle der Krankheit für die Medizin ein wichtiges Thema.
HCV wurde erstmals von Houghten et al. identifiziert und als eine Ursache der NANBH charakterisiert. Die virale genomische Sequenz von HCV ist bekannt, wie auch Verfahren, mit denen die Sequenz erhalten werden kann. Vgl. z.B. Internationale Veröffentlichungen Nr. WO 89/04669; WO 90/11089; und WO 90/14436. HCV hat ein 9,5 kb positiv-strängiges („positive sense") einzelsträngiges RNA-Genom und ist ein Mitglied der Virusfamilie der Flaviviridae. Mindestens sechs verschiedene, jedoch verwandte Genotypen von HCV wurden anhand von phylogenetischen Analysen identifiziert (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993), 74: 2391–2399). Das Virus codiert ein einzelnes Polyprotein, das mehr als 3000 Aminosäurereste aufweist (Choo et al., Science (1989), 244: 359–362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88: 2451–2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88: 1711–1715). Das Polyprotein wird co- und post-translational zu sowohl Struktur- als auch Nicht-Struktur-(NS-)Proteinen prozessiert.
Insbesondere werden mehrere Proteine durch das HCV-Genom codiert, wie in 1 dargestellt. Die Reihenfolge und Nomenklatur der Spaltprodukte des HCV-Polyproteins sind wie folgt: NH₂-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b- COOH. Eine anfängliche Spaltung des Polyproteins wird durch Proteasen des Wirts katalysiert, wodurch drei Strukturproteine, das N-terminale Nucleokapsid-Protein (genannt „Core") und zwei Hüll-Glykoproteine, „E1" (auch als E bekannt) und „E2" (auch als E2/NS1 bekannt), sowie Nicht-Struktur-(NS-)Proteine, welche die viralen Enzyme enthalten, freigesetzt werden. Die NS-Bereiche werden mit NS2, NS3, NS4 und NS5 bezeichnet. NS2 ist ein integrales Membranprotein mit proteolytischer Aktivität. NS2 spaltet, entweder alleine oder in Kombination mit NS3, die NS2-NS3-„Sissle"-Bindung, so dass hierdurch der N-Terminus von NS3 erzeugt wird und ein großes Polyprotein freigesetzt wird, das sowohl Serin-Protease- als auch RNA-Helicase-Aktivitäten einschließt. Die NS3-Protease dient dazu, das restliche Polyprotein zu prozessieren. Der vollständige Ablauf der Polyprotein-Reifung wird durch eine autokatalytische Spaltung am NS3-NS4a-Übergang initiiert, die durch die NS3-Serin-Protease katalysiert wird. Anschließende NS3-vermittelte Spaltungen des HCV-Polyproteins scheinen eine Erkennung von Polyprotein-Spaltungs-Übergängen durch ein NS3-Molekül eines anderen Polypeptids zu beinhalten. In diesen Reaktionen setzt NS3 einen NS3-Cofaktor (NS4a), zwei Proteine (NS4b und NS5a) und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5b) frei.
Eine Reihe von allgemeinen und spezifischen Polypeptiden wurde beschrieben, die als immunologische und diagnostische Reagenzien für HCV nützlich sind und die von dem HCV-Polyprotein stammen. Vgl. z.B. Houghton et al., Europäische Veröffentlichungen Nr. 318 216 und 388 232; Choo et al., Science (1989), 244: 359–362; Kuo et al., Science (1989), 244: 362–364; Houghton et al., Hepatology (1991), 14: 381–388; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89: 10011–10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778. Diese Veröffentlichungen stellen einen umfangreichen Hintergrund über HCV im Allgemeinen und außerdem über die Herstellung und Verwendungen von immunologischen Reagenzien des HCV-Polypeptids bereit.
Empfindliche spezifische Methoden zum Durchmustern und Identifizieren von Trägern von HCV und HCV-verunreinigtem Blut oder Blutprodukten würden einen wichtigen Fortschritt in der Medizin bedeuten. Eine Post-Transfusions-Hepatitis (PTH) tritt in etwa 10% der transfundierten Patienten auf, und HCV wurde für bis zu 90% dieser Fälle verantwortlich gemacht. Sowohl für die Betreuung von Patienten als auch für die Prophylaxe einer Übertragung von HCV durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen Kontakt sind eine verlässliche Diagnose und prognostische Werkzeuge erforderlich. Demgemäß wurden verschiedene Tests für die Serodiagnose einer HCV-Infektion entwickelt. Vgl. z.B. Choo et al., Science (1989), 244: 359–362; Kuo et al., Science (1989), 244: 362–364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990), 46: 423–441; Ebeling et al., Lancet (1990), 335: 982–983; van der Poel et al., Lancet (1990), 335: 558–560; van der Poel et al., Lancet (1991), 337: 317–319; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; Valenzuela et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/44469; und Kashiwakuma et al., US Patent Nr. 5 871 904.
Ein signifikantes Problem, das bei einigen Serum-basierten Tests auftritt, besteht darin, dass zwischen der Infektion und dem Nachweis des Virus eine signifikante Zeitspanne liegt, die häufig mehr als 80 Tage beträgt. Durch diese Zeitspanne beim Test kann ein großes Risiko für die Empfänger von Bluttransfusionen entstehen. Um dieses Problem zu beheben, wurden Nucleinsäure-basierte Tests (NAT), die virale RNA direkt nachweisen, und HCV-Core-Antigen-Tests entwickelt, die virales Antigen anstelle einer Antikörperantwort testen. Vgl. z.B. Kashiwakuma et al., US Patent Nr. 5 871 904; Beld et al., Transfusion (2000), 40: 575–579.
Jedoch bleibt noch der Bedarf für empfindliche, genaue diagnostische und prognostische Werkzeuge, um sowohl eine adäquate Versorgung von Patienten bereitzustellen als auch die Übertragung von HCV durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen Kontakt zu verhindern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf dem Ergebnis, dass HCV-Serokonversions-Antikörper typischerweise gegen Core und gegen NS3 (Helicase) gerichtet sind. Demgemäß stellt die Erfindung einen HCV-Core-Antigen- und NS3-Antikörper-Kombinationstest bereit, der sowohl HCV-Antigene als auch Antikörper, die in einer Probe vorliegen, unter Verwendung einer einzelnen festen Matrix nachweisen kann.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen festen Träger für einen Immuntest, umfassend daran gebunden mindestens einen HCV-Anti-Core-Antikörper und mindestens ein isoliertes HCV-NS3/4a-Epitop. Der Antikörper und das NS3/4a-Epitop können beliebige der hier beschriebenen Moleküle sein. Zusätzlich kann der feste Träger ein beliebiges der hier beschriebenen multiplen Epitopfusionsantigene einschließen, wie das multiple Epitopfusionsantigen, das die Aminosäuresequenz wie in den 7A bis 7F dargestellt umfasst.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der feste Träger daran gebunden mindestens zwei HCV-Anti-Core-Antikörper. Außerdem kann der Anti-Core-Antikörper ein monoclonaler Antikörper sein. Zusätzlich kann das NS3/4a-Epitop ein Konformationsepitop sein, wie ein Konformations-NS3/4a-Epitop, das die Aminosäuresequenz wie in den 4A bis 4D dargestellt umfasst.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen festen Träger für einen Immuntest, umfassend daran gebunden mindestens zwei monoclonale HCV-Anti-Core-Antikörper und mindestens ein HCV-NS3/4a-Konformationsepitop, welches die Aminosäuresequenz wie in den 4A bis 4D dargestellt umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers für einen Immuntest wie vorstehend beschrieben; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an den mindestens einen Anti-Core-Antikörper bzw. das NS3/4a-Epitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als der mindestens eine Anti-Core-Antikörper, welcher an den festen Träger gebunden ist; (ii) eines Antigens, welches mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe, welcher mit dem NS3/4a-Epitop reaktiv ist, reagiert; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit dem Antigen aus (ii) reaktiv ist; und (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe. Das NS3/4a-Epitop kann ein Konformationsepitop sein, wie ein Konformationsepitop, welches die NS3/4a-Sequenz wie in den 4A bis 4D dargestellt aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers für einen Immuntest mit mindestens zwei daran gebundenen HCV-Anti-Core-Antikörpern wie vorstehend beschrieben; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper bzw. das NS3/4a-Epitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als die Anti-Core-Antikörper, welche an den festen Träger gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, fusioniert mit einer hSOD-Aminosäuresequenz; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv ist; und (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe. Das NS3/4a-Epitop kann ein Konformationsepitop sein, wie ein Konformationsepitop, welches die NS3/4a-Sequenz wie in den 4A bis 4D dargestellt aufweist.
In einer beliebigen der vorstehenden Ausführungsformen kann der Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein, wie gegen die Aminosäuren 10 bis 53 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und/oder der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper kann gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein, wie die Aminosäuren 120 bis 130 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz. Außerdem kann das Antigen, das mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, aus der NS3-Region stammen, wie ein Epitop aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, und es kann mit einer Aminosäuresequenz der menschlichen Superoxid-Dismutase (hSOD) fusioniert sein. In dieser Ausführungsform ist der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers für einen Immuntest, einschließlich zweier monoclonaler HCV-Anti-Core-Antikörper und eines Konformationsepitops, umfassend die Aminosäuresequenz wie in den 4A bis 4D dargestellt; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper bzw. das NS3/4a-Konformationsepitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche an den festen Träger gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, fusioniert mit einer hSOD-Aminosäuresequenz; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv ist; das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
In bestimmten Ausführungsformen sind die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet, wie gegen die Aminosäuren 10 bis 53 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper ist gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet, wie gegen die Aminosäuren 120 bis 130 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers für einen Immuntest, der ein multiples Epitopfusionsantigen einschließt; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an den mindestens einen Anti-Core-Antikörper, das NS3/4a-Epitop und das multiple Epitopfusionsantigen zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als der mindestens eine Anti-Core-Antikörper, welcher an den festen Träger gebunden ist; (ii) eines ersten und eines zweiten Antigens, welche mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe, welcher mit dem NS3/4a-Epitop bzw. dem multiplen Epitopfusionsantigen reaktiv ist, reagieren; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit den Antigenen aus (ii) reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
Der Anti-Core-Antikörper kann gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein, und der erste nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper kann gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein, wie vorstehend beschrieben. Außerdem kann das erste Antigen, das mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, ein Epitop aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins umfassen und mit einer hSOD-Aminosäuresequenz fusioniert sein. In diesem Zusammenhang ist der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv. Außerdem kann das zweite Antigen, das mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, ein Epitop aus der c22- Region des HCV-Polyproteins umfassen, wie ein Epitop, das die Aminosäuren Lys₁₀ bis Ser₉₉ des HCV-Polyproteins umfasst, mit einer Deletion von Arg₄₇ und einer Substitution von Leu für Trp an Position 44, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz. Das Epitop kann mit einer hSOD-Aminosäuresequenz fusioniert sein. Wenn das so ist, ist der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv. Das multiple Epitopfusionsantigen kann die Aminosäuresequenz wie in den 7A bis 7F dargestellt umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion in einer biologischen Proben, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers für einen Immuntest, der daran gebunden zwei monoclonale HCV-Anti-Core-Antikörper, ein HCV-NS3/4a-Konformationsepitop, welches die Aminosäuresequenz wie in den 4A bis 4D dargestellt umfasst, und ein multiples Epitopfusionsantigen, umfassend die Aminosäuresequenz wie in den 7A bis 7F dargestellt, umfasst; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, das NS3/4a-Konformationsepitop bzw. das multiple Epitopfusionsantigen zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche an den festen Träger gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, fusioniert mit einer hSOD-Aminosäuresequenz, und eines Epitops aus der c22-Region des HCV-Polyproteins, fusioniert mit einer hSOD-Aminosäuresequenz; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit den hSOD-Aminosäuresequenzen reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
In dieser Ausführungsform können die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein, wie gegen die Aminosäuren 10 bis 53 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper ist gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet, wie gegen die Aminosäuren 120 bis 130 von HCV, nummeriert in Bezug auf das HCV1-Polyproteinsequenz. Außerdem kann das Epitop aus der c22-Region die Aminosäuren Lys₁₀ bis Ser₉₉ des HCV-Polyproteins umfassen, mit einer Deletion von Arg₄₇ und einer Substitution von Leu für Trp an Position 44, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung immundiagnostische Testkits, die den vorstehend beschriebenen festen Träger für einen Immuntest umfassen, und Anleitungen zur Durchführung des immundiagnostischen Tests.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers für einen Immuntest, umfassend (a) das Bereitstellen eines festen Trägers; und (b) das Binden mindestens eines HCV-Anti-Core-Antikörpers, wie eines oder zweier oder mehrerer, und mindestens eines isolierten HCV-NS3/4a-Epitops hieran, und gegebenenfalls eines multiplen Epitopfusionsantigens hieran. Die Anti-Core-Antikörper, NS3/4a-Epitope und multiplen Epitopfusionsantigene sind wie vorstehend beschrieben.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein multiples Epitopfusionsantigen, umfassend die Aminosäuresequenz wie in den 7A bis 7F dargestellt, oder eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 80%, wie 90% oder mehr, hierzu, das spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, die in einer biologischen Probe von einem HCV-infizierten Individuum vorliegen. In bestimmten Ausführungsformen besteht das multiple Epitopfusionsantigen aus der Aminosäuresequenz wie in den 5A bis 5F dargestellt.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Polynucleotid, das eine codierende Sequenz für das vorstehende multiple Epitopfusionsantigen umfasst, rekombinante Vektoren, welche die Polynucleotide umfassen, Wirtszellen, welche mit den rekombinanten Vektoren transformiert sind, und Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten multiplen Epitopfusionsantigens, umfassend: (a) das Bereitstellen einer Population von Wirtszellen wie vorstehend; und (b) das Züchten der Population von Zellen unter Bedingungen, wodurch das multiple Epitopfusionsantigen, das durch die im rekombinanten Vektor vorliegende codierende Sequenz codiert ist, exprimiert wird.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden genauen Beschreibung und der angefügten Zeichnungen klar ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine diagrammartige Darstellung des HCV-Genoms, in der die verschiedenen Regionen des Polyproteins angegeben sind, von denen die vorliegenden Testreagenzien (Proteine und Antikörper) hergeleitet sind.
2 ist eine schematische Zeichnung eines repräsentativen Antikörper/Antigen-Kombinationstests gemäß der Erfindung.
3 zeigt die Aminosäuresequenz eines repräsentativen NS3/4a-Konformationsantigens für die Verwendung in den vorliegenden Tests. Das hervorgehobene Alanin an Position 182 ist für das native Serin, das normalerweise an dieser Position vorliegt, substituiert.
Die 4A bis 4D zeigen die DNA- und die entsprechende Aminosäuresequenz eines anderen repräsentativen NS3/4a-Konformationsantigens zur Verwendung in den vorliegenden Tests. Die Aminosäuren an den Positionen 403 und 404 der 4A bis 4D stellen Substitutionen von Pro für Thr und Ile für Ser der nativen Aminosäuresequenz von HCV-1 dar.
5 ist ein schematische Darstellung der Konstruktion von pd.HCV1a.ns3ns4aPI.
6 ist eine schematische Darstellung von MEFA 12.
Die 7A bis 7E zeigen die DNA- und die entsprechende Aminosäuresequenz von MEFA 12.
8 ist eine schematische Darstellung eines repräsentativen Immuntests gemäß der Erfindung unter Verwendung von MEFA 12.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Verfahren der Chemie, Biochemie, DNA-Rekombinationstechnik und Immunologie eingesetzt, die dem Fachmann geläufig sind. Solche Verfahren werden in der Literatur vollständig erklärt. Vgl. z.B. „Fundamental Virology", 2. Aufl., Bd. I und II (B. N. Fields and D. M. Knipe, Hrsg.); „Handbook of Experimental Immunology", Bd. I bis IV (D. M: Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., Blackwell Scientific Publications); T. E. Creighton, „Proteins: Structures and Molecular Properties" (W. H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, „Biochemistry" (Worth Publisher, Inc., aktuelle Auflage); Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2. Aufl., 1989); „Methods in Enzymology" (S. Colowick und N. Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc.).
Es muss angemerkt werden, dass die in dieser Beschreibung und den angefügten Patentansprüchen verwendeten Singularformen „ein", „eine" und „der", „die", „das" mehrere Vertreter einschließen, sofern aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht. So schließt z.B. der Bezug auf „ein Antigen" ein Gemisch aus zwei oder mehreren Antigenen ein, und dergleichen.

Die folgenden Abkürzungen für Aminosäuren werden im ganzen Text verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Asparagin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gln (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)
Tyrosin: Tyr (Y)	Valin: Val (V)

I. Definitionen
Beim Beschreiben der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet und sollen wie nachstehend angegeben definiert sein.
Die Begriffe „Polypeptid" und „Protein" beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäureresten und sind nicht auf eine minimale Länge des Produkts beschränkt. Somit sind Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und dergleichen in der Definition eingeschlossen. Sowohl vollständige Proteine als auch Fragmente davon sind in der Definition enthalten. Außerdem schließen die Begriffe Postexpressions-Modifikationen des Polypeptids, z.B. Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen, ein. Weiterhin bezieht sich ein „Polypeptid" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auf ein Protein, das Modifikationen, wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur), an der nativen Sequenz einschließt, so lange das Protein die gewünschte Aktivität beibehält. Diese Modifikationen können gezielt erfolgen, wie durch eine stellenspezifische Mutagenese, oder sie können zufällig erfolgen, wie durch Mutationen von Wirten, welche die Proteine produzieren, oder durch Fehler aufgrund von PCR-Amplifikation.
Ein HCV-Polypeptid ist ein Polypeptid wie vorstehend definiert, das von dem HCV-Polyprotein hergeleitet ist. Das Polypeptid muss nicht physikalisch von HCV hergeleitet werden, sondern es kann synthetisch oder rekombinant produziert werden. Außerdem kann das Polypeptid von einem beliebigen der verschiedenen HCV-Stämmen, wie von den Stämmen 1, 2, 3 oder 4 von HCV, stammen. Eine Reihe von konservierten und variablen Regionen zwischen diesen Stämmen sind bekannt, und im Allgemeinen weisen die Aminosäuresequenzen von Epitopen, die von diesen Regionen stammen, einen hohen Grad an Sequenzhomologie auf, z.B. eine Aminosäuresequenzhomologie von mehr als 30%, vorzugsweise von mehr als 40%, wenn ein Alignment der zwei Sequenzen erfolgt. So bezieht sich z.B. der Begriff „NS3/4a"-Polypeptid auf natives NS3/4a aus einem beliebigen der verschiedenen HCV-Stämme sowie auf NS3/4a-Analoga, Muteine und immunogene Fragmente, wie nachstehend noch definiert. Die vollständigen Genotypen von vielen dieser Stämme sind bekannt. Vgl. z.B. US Patent Nr. 6 150 087 und GenBank Hinterlegungsnummern AJ238800 und AJ238799.
Die Begriffe „Analogon" und „Mutein" beziehen sich auf biologisch aktive Derivate des Referenzmoleküls oder auf Fragmente solcher Derivate, welche die gewünschte Aktivität, wie die Immunreaktivität in den hier beschriebenen Tests, beibehalten. Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff „Analogon" auf Verbindungen, die eine native Polypeptidsequenz und Struktur mit einer oder mehreren Aminosäure-Additionen, Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur) und/oder Deletionen, bezogen auf ihr natives Molekül, aufweisen, so lange die Modifikationen die immunogene Aktivität nicht zerstören. Der Begriff „Mutein" bezieht sich auf Peptide, die einen oder mehrere Peptid-Nachahmer aufweisen („Peptoide"), wie diejenigen, die in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 91/04282 beschrieben sind. Vorzugsweise hat das Analogon oder Mutein mindestens die gleiche Immunaktivität wie das native Molekül. Verfahren zum Herstellen von Polypeptidanaloga und Muteinen sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden nachstehend beschrieben.
Besonders bevorzugte Analoga schließen Substitutionen ein, die konservativer Natur sind, d.h. solche Substitutionen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die in ihren Seitenketten verwandt sind. Insbesondere sind Aminosäuren allgemein in vier Familien eingeteilt: (1) saure – Aspartat, und Glutamat; (2) basische – Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht-polare – Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladene polare – Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Z.B. kann man voraussagen, dass ein isoliertes Ersetzen von Leucin durch Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonin durch ein Serin oder ein ähnliches konservatives Ersetzen einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keinen entscheidenden Effekt auf die biologischen Aktivität haben wird. Z.B. kann das Polypeptid von Interesse bis zu etwa 5 bis 10 konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubsitutionen oder sogar bis zu etwa 15 bis 25 konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen oder eine Zahl zwischen 5 und 25 einschließen, so lange die gewünschte Funktion des Moleküls intakt bleibt. Der Fachmann kann ohne Weiteres Bereiche des Moleküls von Interesse bestimmen, welche eine Änderung tolerieren können, indem er auf Hopp/Woods- und Kyte-Doolittle-Plots Bezug nimmt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Mit „Fragment" ist ein Polypeptid gemeint, das nur aus einem Teil der intakten vollständigen Polypeptidsequenz und Struktur besteht. Das Fragment kann eine C-terminale Deletion und/oder eine N-terminale Deletion des nativen Polypeptids einschließen. Ein „immunogenes Fragment" eines bestimmten HCV-Proteins wird im Allgemeinen mindestens etwa 5 bis 10 aneinandergrenzende Aminosäurereste des vollständigen Moleküls, vorzugsweise mindestens etwa 15 bis 25 aneinandergrenzende Aminosäurereste des vollständigen Moleküls und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 20 bis 50 oder mehr aneinandergrenzende Aminosäurereste des vollständigen Moleküls, welche ein Epitop definieren, oder eine Zahl zwischen fünf Aminosäuren und der vollständigen Sequenz, einschließen, mit der Maßgabe, dass das betreffende Fragment die Immunreaktivität in den hier beschriebenen Tests beibehält. Z.B. schließen bevorzugte immunogene Fragmente ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Fragmente von HCV-Core, umfassend z.B. die Aminosäuren 10 bis 45, 10 bis 53, 67 bis 88 und 120 bis 130 des Polyproteins, Epitop 5-1-1 (in der NS3-Region des viralen Genoms) und außerdem definierte Epitope, die von den Regionen E1, E2, c33c (NS3), c100 (NS4), NS3/4a und NS5 des HCV-Polyproteins stammen, sowie beliebige der anderen verschiedenen identifizierten Epitope aus dem HCV-Polyprotein. Vgl. z.B. Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011–10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39: Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; US Patente Nr. 6 150 087 und 6 121 020.
Der wie hier verwendete Begriff „Epitop" bezieht sich auf eine Sequenz von mindestens etwa 3 bis 5, vorzugsweise etwa 5 bis 10 oder 15 und nicht mehr als etwa 1000 Aminosäuren (oder eine Zahl dazwischen), die eine Sequenz definieren, die selbst oder als Teil einer größeren Sequenz an einen Antikörper bindet, der als Antwort auf eine solche Sequenz hervorgebracht wird. Es gibt keine kritische obere Grenze für die Länge des Fragments, das annähernd die vollständige Länge der Proteinsequenz oder sogar ein Fusionsprotein, umfassend zwei oder mehrere Epitope aus dem HCV-Polyprotein, umfassen kann. Ein Epitop zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht auf ein Polypeptid beschränkt, welches die exakte Sequenz des Teils des parentalen Proteins aufweist, aus dem es hergeleitet ist. Tatsächlich liegen Virusgenome in einem Zustand eines konstanten Flusses vor und enthalten mehrere variable Domänen, die ein relativ hohes Ausmaß an Variabilität zwischen Isolaten zeigen. Somit umfasst der Begriff „Epitop" Sequenzen, die zu der nativen Sequenz identisch sind, und außerdem Modifikationen der nativen Sequenz, wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur).
Regionen eines bestimmten Polypeptids, die ein Epitop umfassen, können identifiziert werden, indem beliebige Epitop-Kartierungstechniken verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z.B. „Epitope Mapping Protocols", in: „Methods in Molecular Biology", Bd. 66 (Glenn, E. Morris, Hrsg., 1996), Humana Press, Totowa, New Jersey. Z.B. können lineare Epitope bestimmt werden, indem z.B. gleichzeitig eine große Zahl von Peptiden auf festen Trägern synthetisiert wird, wobei die Peptiden Teilen des Proteinmoleküls entsprechen, und indem die Peptide sodann mit Antikörpern umgesetzt werden, während die Peptide noch an den Trägern angeheftet sind. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden z.B. beschrieben im US Patent Nr. 4 708 871; Geysen et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998–4002; Geysen et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 178–182; Geysen et al. (1986), Molec. Immunol. 23: 709–715.
Unter Verwendung solcher Verfahren wurde eine Reihe von Epitopen von HCV identifiziert. Vgl. z.B. Chien et al., „Viral Hepatitis and Liver Disease", (1994), S. 320–324, und weiterhin nachstehend. Genauso werden Konformationsepitope einfach identifiziert, indem die räumliche Konformation von Aminosäuren bestimmt wird, wie z.B. durch Röntgenkristallographie und zweidimensionale magnetische Kernresonanz. Vgl. z.B. „Epitop Mapping Protocols", vorstehend. Antigene Bereiche von Proteinen können auch identifiziert werden, indem herkömmliche Antigenitäts- und Hydropathie-Darstellungen verwendet werden, wie solche, die unter Verwendung z.B. des Softwareprogramms Omiga Version 1.0 berechnet werden, das von der Oxford Molecular Group verfügbar ist. Dieses Computerprogramm nutzt das Hopp/Woods-Verfahren, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78: 3824–3828, zum Bestimmen von Antigenitäts-Profilen und das Kyte-Doolittle-Verfahren für Hydropathie-Darstellungen, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982), 157: 105–132.
Der wie hier verwendete Begriff „Konformationsepitop" bezieht sich auf einen Teil eines vollständigen Proteins oder ein Analogon oder Mutein davon, der/das Strukturmerkmale aufweist, die zu der Aminosäuresequenz, welche das Epitop innerhalb des vollständigen natürlichen Proteins codiert, nativ sind. Native Strukturmerkmale schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Glykosylierung und dreidimensionale Struktur. Die Länge der Epitop-definierenden Sequenz kann großen Variationen unterliegen, da man annimmt, dass diese Epitope durch die dreidimensionale Gestalt des Antigens (z.B. die Faltung) gebildet werden. Somit können Aminosäuren, welche das Epitop definieren, in einer relativ kleinen Zahl vorliegen, jedoch entlang der Länge des Moleküls (oder sogar auf verschiedenen Molekülen im Fall von Dimeren, usw.) stark verteilt sein, wobei sie durch Faltung in eine korrekte Epitopkonformation gebracht werden. Die Teile des Antigens zwischen den Resten, welche das Epitop definieren, sind möglicherweise für die Konformationsstruktur des Epitop nicht kritisch. Z.B. kann es sein, dass eine Deletion oder Substitution dieser dazwischen liegenden Sequenzen das Konformationsepitop nicht beeinflusst, vorausgesetzt, dass Sequenzen, die für die Epitopkonformation kritisch sind, erhalten bleiben (z.B. Cysteine, die an einer Disulfidbindung beteiligt sind, Glykosylierungsstellen usw.).
Konformationsepitope, die in der NS3/4a-Region vorliegen, werden unter Verwendung der vorstehend besprochenen Verfahren ohne Weiteres identifiziert. Außerdem kann das Vorliegen oder die Abwesenheit eines Konformationsepitops in einem bestimmten Polypeptid einfach bestimmt werden, indem das Antigen von Interesse mit einem Antikörper (polyclonales Serum oder monoclonaler Antikörper gegen das Konformationsepitop) durchgemustert wird und seine Reaktivität mit derjenigen einer denaturierten Version des Antigens verglichen wird, bei der nur lineare Epitope erhalten bleiben (falls vorhanden). Bei einem solchen Screening unter Verwendung polyclonaler Antikörper kann es vorteilhaft sein, das polyclonale Serum zuerst mit dem denaturierten Antigen zu absorbieren und zu sehen, ob es Antikörper gegen das Antigen von Interesse zurückhält. Außerdem wird, im Fall von NS3/4a, ein Molekül, das die native Konformation beibehält, auch Protease- und gegebenenfalls Helicase-Enzymaktivitäten aufweisen. Solche Aktivitäten können unter Verwendung von Enzymtests wie nachstehend beschrieben nachgewiesen werden.
Vorzugsweise wird ein Konformationsepitop rekombinant hergestellt und in einer Zelle exprimiert, aus der es unter Bedingungen extrahiert werden kann, bei denen seine gewünschten Strukturmerkmale bestehen bleiben, z.B. ohne Denaturierung des Epitops. Solche Zellen schließen Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen ein. Die Expression und die Isolierung rekombinanter Konformationsepitope aus dem HCV-Polyprotein sind z.B. in den Internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734 beschrieben. Alternativ ist es möglich, die Antigene zu exprimieren und weiterhin das Protein nach der Gewinnung zu renaturieren. Außerdem ist es so zu verstehen, dass auch durch eine chemische Synthese Konformationsantigen-Mimitope bereitgestellt werden können, die mit dem Konformationsepitop des „nativen" Antigens kreuzreagieren.
Der wie hier verwendete Begriff „multiples Epitopfusionsantigen" oder „MEFA" steht für ein Polypeptid, in dem multiple HCV-Antigene Teil einer einzelnen fortlaufenden Kette von Aminosäuren sind, wobei die Kette nicht in der Natur vorkommt. Die HCV-Antigene können direkt miteinander durch Peptidbindungen verbunden sein, oder sie können durch dazwischen liegende Aminosäuresequenzen getrennt sein. Die Fusionsantigene können auch Sequenzen enthalten, die in Bezug auf das HCV-Polyprotein exogen sind. Außerdem können die vorliegenden HCV-Sequenzen von mehreren Genotypen und/oder Isolaten von HCV stammen. Beispiele von bestimmten MEFAs zur Verwendung in den vorliegenden Immuntests sind z.B. ausführlich beschrieben in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 und werden nachstehend noch weiter beschrieben.
Ein „Antikörper" steht für ein Molekül, das durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an ein Polypeptid von Interesse bindet. Somit ist ein HCV-Core-Antikörper ein Molekül, das spezifisch an das HCV-Core-Protein bindet. Der wie hier verwendete Begriff „Antikörper" schließt Antikörper ein, die sowohl aus polyclonalen als auch aus monoclonalen Präparaten erhalten wurden, sowie die folgenden: hybride (chimäre) Antikörpermoleküle (vgl. z.B. Winter et al., (1991), Nature 349: 293–299; und US Patent Nr. 4 816 567; F(ab')₂- und F(ab)-Fragmente; Fv-Moleküle (nicht-kovalente Heterodimere, vgl. z.B. Inbar et al., (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659–2662; und Ehrlich et al., (1980), Biochem. 19: 4091–4096); Einzelketten-Fv-Moleküle (sFv) (vgl. z.B. Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883); dimere und trimere Antikörperfragmentkonstrukte; Minibodies (vgl. z.B. Pack et al., (1992), Biochem. 31: 1579–1584; Cumber et al., (1992), J. Immunology 149B: 120–126); humanisierte Antikörpermoleküle (vgl. z.B. Riechmann et al., (1988), Nature 332: 323–327; Verhoeyan et al., (1988), Science 239: 1534–1536; und U.K. Patent Veröffentlichung Nr. GB 2 276 169 , veröffentlicht am 21. September 1994); und beliebige funktionelle Fragmente, die aus solchen Molekülen erhalten werden, wobei solche Fragmente die immunologischen Bindungseigenschaften des parentalen Antikörpermoleküls beibehalten.
Der wie hier verwendete Begriff „monoclonaler Antikörper" bezieht sich auf eine Antikörperzusammensetzung, die eine homogene Antikörperpopulation aufweist. Der Begriff ist nicht hinsichtlich der Art oder der Quelle des Antikörpers eingeschränkt, außerdem soll er nicht durch die Art und Weise eingeschränkt sein, durch die er gemacht wird. Somit umfasst der Begriff Antikörper, die aus murinen Hybridomen erhalten werden, und außerdem menschliche monoclonale Antikörper, die unter Verwendung menschlicher, und nicht muriner Hybridome erhalten werden. Vgl. z.B. Cote et al., „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, 1985, S. 77.
Ein „rekombinantes" Protein ist ein Protein, das die gewünschte Aktivität beibehält und das durch DNA-Rekombinationstechniken wie hier beschrieben hergestellt wurde. Im Allgemeinen wird das Gen von Interesse cloniert und danach in transformierten Organismen exprimiert, wie nachstehend noch weiter beschrieben.
Der Wirtsorganismus exprimiert das fremde Gen unter Expressionsbedingungen, wodurch das Protein produziert wird.
Mit „isoliert" ist gemeint, wenn es sich auf ein Polypeptid bezieht, dass das angegebene Molekül getrennt und einzeln von dem ganzen Organismus, mit dem das Molekül in der Natur zusammen gefunden wird, vorliegt oder dass es im Wesentlichen in Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen des gleichen Typs vorliegt. Der Begriff „isoliert" bezieht sich hinsichtlich eines Polynucleotids auf ein Nucleinsäuremolekül, dem insgesamt oder teilweise Sequenzen fehlen, mit denen es normalerweise in der Natur assoziiert ist; oder auf eine Sequenz, wie sie in der Natur existiert, die jedoch heterologe Sequenzen in Assoziation damit aufweist; oder auf ein Molekül, das aus dem Chromosom abgetrennt ist.
Mit „äquivalente antigene Determinante" ist eine antigene Determinante aus anderen Unterarten oder Stämmen von HCV, wie aus den Stämmen 1, 2 oder 3 von HCV, gemeint. Insbesondere sind Epitope bekannt, wie 5-1-1, und solche Epitope variieren zwischen den Stämmen 1, 2 und 3. Somit handelt es sich beim Epitop 5-1-1 aus den drei verschiedenen Stämmen um äquivalente antigene Determinanten und deshalb um „Kopien", obwohl ihre Sequenzen nicht identisch sind. Im Allgemeinen werden die Aminosäuresequenzen äquivalenter antigener Determinanten einen hohen Grad an Sequenzhomologie aufweisen, z.B. eine Aminosäure-Sequenzhomologie von mehr als 30%, vorzugsweise von mehr als 40%, wenn ein Alignment der zwei Sequenzen erfolgt.
„Homologie" bezieht sich auf die prozentuale Ähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotid- oder zwei Polypeptideinheiten. Zwei DNA- oder zwei Polypeptidsequenzen sind „im Wesentlichen homolog" zueinander, wenn die Sequenzen eine Sequenzähnlichkeit über eine definierte Länge der Moleküle von mindestens etwa 50%, vorzugsweise von mindestens etwa 75%, stärker bevorzugt von mindestens etwa 80 bis 85%, vorzugsweise von mindestens etwa 90% und am stärksten bevorzugt von mindestens etwa 95 bis 98% aufweisen. Im Wesentlichen homolog, wie hier verwendet, bezieht sich auch auf Sequenzen, die eine vollständige Identität zu der spezifizierten DNA- oder Polypeptidsequenz zeigen.
Im Allgemeinen bezieht sich „Identität" auf eine exakte Nucleotid-zu-Nucleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Übereinstimmung von zwei Polynucleotiden bzw. Polypeptidsequenzen. Eine prozentuale Identität kann durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformationen zwischen zwei Molekülen bestimmt werden, indem ein Alignment der Sequenzen erfolgt, die exakte Zahl von Übereinstimmungen zwischen den zwei alignierten Sequenzen gezählt wird, durch die Länge der kürzeren Sequenz geteilt wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird.
Einfach verfügbare Computerprogramme können verwendet werden, um die Analyse der Ähnlichkeit und Identität zu unterstützen, wie ALIGN, Dayhoff, M. O., in: „Atlas of Protein Sequence and Structure", M. O. Dayhoff, Hrsg., 5 Suppl. 3: 353–358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, wobei der lokale Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482–489, 1981, für die Peptidanalyse angepasst wird. Programme zum Bestimmen der Ähnlichkeit und Identität von Nucleotidsequenzen sind verfügbar in Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (verfügbar von Genetics Computer Group, Madison, WI), z.B. die Programme BESTFIT, FASTA und GAP, die auch auf dem Algorithmus von Smith und Waterman beruhen. Diese Programme werden einfach mit den Standardparametern eingesetzt, die vom Hersteller empfohlen und in dem vorstehend angesprochenen Wisconsin Sequence Analysis Package beschrieben sind. Z.B. kann eine prozentuale Ähnlichkeit einer bestimmten Nucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz bestimmt werden, indem der Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman mit einer Standard-Bewertungstabelle und einem „Gap Penalty" von sechs Nucleotidpositionen eingesetzt wird.
Ein weiteres Verfahren zur Feststellung einer prozentualen Ähnlichkeit im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des MPSRCH-Pakets von Programmen, Copyright der University of Edinburgh, entwickelt von John F. Collins und Shane S. Sturrok, und vertrieben von IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Bei dieser Reihe von Paketen kann der Smith-Waterman-Algorithmus angewendet werden, wobei für die Bewertungstabelle Standardparameter verwendet werden (z.B. „gap open penalty" von 12, „gap extension penalty" von 1 und eine Lücke („gap") von sechs). Der aus den Daten erzeugte „Übereinstimmungs"-Wert („match value") spiegelt die „Sequenzähnlichkeit" wider. Andere geeignete Programme zum Berechnen der prozentualen Identität oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt, z.B. ist BLAST ein anderes Alignment-Programm, das mit Standardparametern verwendet wird. Z.B. können BLASTN und BLASTP unter Verwendung der folgenden Standardparameter eingesetzt werden: genetischer Code = Standard; Filter = keines; Strang = beide; Ausschluss = 60; Erwartung = 10; Matrix = BLOSUM62; Beschreibungen = 50 Sequenzen; Sortiert durch = HIGH SCORE; Datenbanken = nicht-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS Translations + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Einzelheiten dieser Programme finden sich unter der folgenden Internet-Adresse: http://www.ncbi.nlm.gov/cgibin/BLAST.
Alternativ kann eine Homologie bestimmt werden, indem eine Hybridisierung von Polynucleotiden unter Bedingungen, die stabile Doppelstränge zwischen homologen Regionen bilden, erfolgt, worauf die Spaltung mit Einzelstrang-spezifischer Nuclease(n) und eine Größenbestimmung der gespaltenen Fragmente folgen. DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter z.B. stringenten Bedingungen, wie sie für dieses bestimmte System definiert sind, identifiziert werden. Das Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z.B. Sambrook et al., vorstehend; „DNA Cloning", vorstehend; „Nucleic Acid Hybridisation", vorstehend.
Eine „codierende Sequenz" oder eine Sequenz, die ein ausgewähltes Polypeptid „codiert", ist ein Nucleinsäuremolekül, das in vitro oder in vivo transkribiert (im Fall von DNA) und zu einem Polypeptid translatiert wird (im Fall von RNA), wenn es unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Start-Codon am 5'-Ende (Aminoende) und ein Translations-Stopp-Codon am 3'-Ende (Carboxyende) bestimmt. Eine Transkriptions-Terminations-Sequenz kann 3' zur codierenden Sequenz liegen.
„Funktionell verbunden" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, wobei die auf diese Weise beschriebenen Komponenten so konfiguriert sind, dass sie ihre gewünschte Funktion ausüben. Somit ist ein bestimmter Promotor, der mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden ist, in der Lage, die Expression der codierenden Sequenz zu bewirken, wenn die richtigen Transkriptionsfaktoren usw. vorliegen. Der Promotor muss nicht an die codierenden Sequenz angrenzen, so lange er so funktioniert, dass er ihre Expression steuert. So können z.B. dazwischen liegende untranslatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen der Promotorsequenz und der codierenden Sequenz vorliegen, wie transkribierte Introns, und die Promotorsequenz kann immer noch als mit der codierenden Sequenz „funktionell verbunden" angesehen werden.
Ein „Kontrollelement" bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, welche die Expression einer codierenden Sequenz, mit der es verbunden ist, unterstützt. Der Begriff schließt Promotoren, Transkriptions-Terminations-Sequenzen, stromaufwärts liegende regulatorische Domänen, Polyadenylierungssignale, untranslatierte Regionen, einschließlich 5'-UTRs und 3'-UTRs, und gegebenenfalls Leadersequenzen und Enhancer ein, die zusammen die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle ermöglichen.
Ein wie hier verwendeter „Promotor" ist eine regulatorische DNA-Region, die in der Lage ist, RNA-Polymerase in einer Wirtszelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts liegenden (3'-Richtung) codierenden Sequenz, die hiermit funktionell verbunden ist, zu initiieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließt eine Promotorsequenz die Mindestzahl von Basen oder Elementen ein, die erforderlich sind, um die Transkription eines Gens von Interesse in Spiegeln, die über dem Hintergrund nachweisbar sind, zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz liegt eine Transkriptions-Initiationsstelle, und außerdem Protein-Bindungsdomänen (Konsensussequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren werden häufig, jedoch nicht immer, „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen enthalten.
Eine Kontrollsequenz „steuert die Transkription" einer codierenden Sequenz in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase an die Promotorsequenz bindet und die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die sodann in das Polypeptid translatiert wird, das durch die codierende Sequenz codiert wird.
„Expressionskassette" oder „Expressionskonstrukt" bezieht sich auf eine Anordnung, die in der Lage ist, die Expression der Sequenz(en) oder Gen(e) von Interesse zu steuern. Die Expressionskassette schließt Kontrollelemente, wie vorstehend beschrieben, ein, wie einen Promotor, der mit der Sequenz (den Sequenzen) oder dem Gen (den Genen) von Interesse funktionell verbunden ist (so dass die Transkription hiervon gesteuert wird), und schließt häufig außerdem eine Polyadenylierungssequenz ein. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann die hier beschriebene Expressionskassette innerhalb eines Plasmidkonstrukts enthalten sein. Das Plasmidkonstrukt kann zusätzlich zu den Komponenten der Expressionskassette auch noch einen oder mehrere selektierbare Marker, ein Signal, das ermöglicht, dass das Plasmidkonstrukt als einzelsträngige DNA vorliegt (z.B. einen M13-Replikationsursprung), mindestens eine multiple Clonierungsstelle und einen „Säuger"-Replikationsursprung (z.B. einen SV40- oder Adenovirus-Replikationsursprung) einschließen.
„Transformation" bezieht sich wie hier verwendet auf die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von der für die Insertion verwendeten Verfahren: z.B. Transformation durch direkte Aufnahme, Transfektion, Infektion und dergleichen. Für bestimmte Verfahren der Transfektion, vgl. noch weiter nachstehend. Das exogene Polynucleotid kann als ein nicht-eingebauter Vektor aufrechterhalten bleiben, z.B. ein Episom, oder alternativ kann es in das Wirtsgenom eingebaut werden.
Eine „Wirtszelle" ist eine Zelle, die durch eine exogene DNA-Sequenz transformiert wurde oder die zu einer Transformation hierdurch in der Lage ist.
„Üblicher fester Träger" bedeutet eine einzelne feste Matrix, an die die in den vorliegenden Immuntests verwendeten HCV-Polypeptide kovalent oder durch nicht-kovalente Mittel, wie hydrophobe Adsorption, gebunden sind.
„Immunologisch reaktiv" bedeutet, dass das betreffende Antigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern, die in einer biologischen Probe von einem HCV-infizierten Individuum vorliegen, reagieren wird.
„Immunkomplex" bedeutet eine Kombination, die gebildet wird, wenn ein Antikörper an ein Epitop oder ein Antigen bindet.
Eine „biologische Probe" wie hier verwendet bezieht sich auf eine Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, die aus einem Individuum isoliert wurde, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf z.B. Blut, Plasma, Serum, Fäzes, Urin, Knochenmark, Galle, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Proben der Haut, Ausscheidungen der Haut, des Respriations-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Organe, Biopsien und auch Proben von Bestandteilen von in vitro-Zellkulturen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf konditionierte Medien, die aus dem Wachstum von Zellen und Geweben in Kulturmedium resultieren, z.B. rekombinanten Zellen, oder Zellbestandteilen.
Die Begriffe „Markierung" und „nachweisbare Markierung" beziehen sich wie hier verwendet auf ein Molekül, das zum Nachweis in der Lage ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf radioaktive Isotope, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende Stoffe, Chromophore, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzym-Inhibitoren, Chromophore, Farbstoffe, Metallionen, Metallsole, Liganden (z.B. Biotin, Streptavidin oder Haptene) und dergleichen. Der Begriff „fluoreszierender Stoff" bezieht sich auf eine Substanz oder einen Teil davon, die/der in der Lage ist, eine Fluoreszenz im nachweisbaren Bereich zu zeigen. Bestimmte Beispiel von Markierungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Meerrettich-Peroxidase (HRP), Fluorescein, FITC, Rhodamin, Dansyl, Umbelliferon, Dimethylacridiniumester (DMAE), Texas-Rot, Luminol, NADPH und α-β-Galactosidase.
II. Art und Weise zum Durchführen der Erfindung
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, muss gesagt werden, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Formulierungen oder Prozessparameter beschränkt ist, die natürlich variieren können. Außerdem ist es so zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie lediglich dem Zweck dient, bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu beschreiben, und in keiner Weise eine Einschränkung darstellen soll.
Obwohl für die Durchführung der Erfindung verschiedene Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden können, die gleich sind wie die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren oder ihnen ähnlich sind, werden hier die bevorzugten Materialien und Methoden beschrieben.
Wie vorstehend angegeben beruht die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung neuer diagnostischer Verfahren zum genauen Nachweisen einer frühen HCV-Infektion. Die Verfahren basieren auf der Identifizierung und Verwendung von hoch-immunogenen HCV-Antikörpern und Antigenen, die während der frühen Stadien der HCV-Serokonversion vorliegen, wodurch die Nachweisgenauigkeit erhöht und die Häufigkeit von falschen Ergebnissen reduziert wird. Die Verfahren können einfach in einem Einzeltestformat durchgeführt werden.
Genauer gesagt wird der Test auf einem festen Träger durchgeführt, an den ein oder mehrere HCV-Anti-Core-Antikörper (die gegen entweder die gleichen oder verschiedene HCV-Core-Epitope gerichtet sind) und ein Epitop, das von der NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins stammt, gebunden wurden. Beispiele von bestimmten Anti-Core-Antikörpern, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Antikörpermoleküle, wie monoclonale Antikörper, die gegen Epitope in der Core-Region gerichtet sind, die zwischen den Aminosäuren 10 bis 53; den Aminosäuren 10 bis 45; den Aminosäuren 67 bis 88; den Aminosäuren 120 bis 130 zu finden sind, oder Antikörper, die gegen ein beliebiges der Core-Epitope gerichtet sind, die z.B. identifiziert wurden in Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89: 10011–10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; und zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelder Serien-Nr. 08/403 590 und 08/444 818.
Die NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins wurde beschrieben, und die Aminosäuresequenz und die Gesamtstruktur des Proteins sind offenbart z.B. in Yao et al., Structure (November 1999), 7: 1353–1363; Sali et al., Biochem. (1998), 37: 3392–3401; und Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999), 6: 165–181. Vgl. auch Dasmahapatra et al., US Patent Nr. 5 843 752. Die vorliegenden Immuntests nutzen mindestens ein Konformationsepitop, das von der NS3/4a-Region hergeleitet ist, welches in der Konformation vorliegt, wie sie in dem natürlich vorkommenden HCV-Partikel oder seinem infektiösen Produkt gefunden wird, der Beweis hierfür ist das Aufrechterhalten von Protease- und gegebenenfalls Helicase-Enzymaktivitäten, die das NS3/4a-Genprodukt normalerweise besitzt, und/oder die Immunreaktivität des Antigens mit Antikörpern in einer biologischen Probe von einem HCV-infizierten Individuum sowie ein Verlust der Immunreaktivität des Epitops bei Denaturierung des Antigens. Z.B. kann das Konformationsepitop durch Erhitzen, Verändern des pH-Werts auf einen extrem sauren oder basischen Wert oder durch Zufügen bekannter organischer Denaturierungsmittel, wie Dithiothreitol (DTT), oder eines geeigneten Detergens zerstört werden, vgl. z.B. „Protein Purification Methods, A Practical Approach" (E. L. V. Harris und S. Angal, Hrsg., IRL Press), und das denaturierte Produkt kann sodann mit dem Produkt, das nicht wie vorstehend behandelt wurde, verglichen werden.
Protease- und Helicaseaktivität können unter Verwendung herkömmlicher Enzymtests bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Z.B. kann die Proteaseaktivität unter Verwendung von Tests bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z.B. Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997), 247: 242–246; Kakiuchi et al., J. Biochem (1997), 122: 749–755; Sali et al., Biochemistry (1998), 37: 3392–3401; Cho et al., J. Virol. Meth. (1998), 72: 109–115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999), 266: 192–197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999), 270; 268–275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999), 80: 77–84; Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000), 5: 153–158; und Kim et al., Anal. Biochem. (2000), 284: 42–48. Ein besonders günstiger Test zum Testen der Proteaseaktivität ist in den nachstehenden Beispielen angegeben.
Genauso sind Tests der Helicaseaktivität auf dem Fachgebiet bekannt, wobei die Helicaseaktivität eines NS3/4a-Epitops bestimmt werden kann, z.B. unter Verwendung eines ELISA-Tests, wie in z.B. Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998), 253: 594–599, beschrieben, eines „Scintillation Proximity Assay"-Systems, wie in Kyono et al., Anal. Biochem. (1998), 257: 120–126, beschrieben; von Hochdurchsatz-Screeningtests, wie z.B. in Hicham et al., Antiviral Res. (2000), 46: 181–192, und Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000), 24: 97–116, beschrieben; und außerdem durch andere Testverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z.B. Khu et al., J. Virol. (2001), 75: 205–214; Utama et al., Virology (2000), 273: 316–324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000), 81: 1335–1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000), 39: 5174–5183; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998), 19: 353–364; und Hesson et al., Biochemistry (2000), 39: 2619–2625.
Die Länge des Antigens ist ausreichend, um ein immunreaktives Konformationsepitop aufrechtzuerhalten. Häufig wird das Polypeptid, welches das verwendete Antigen enthält, annähernd die vollständige Länge aufweisen, jedoch kann das Polypeptid auch verkürzt sein, um z.B. die Löslichkeit zu steigern oder die Sekretion zu verbessern. Im Allgemeinen wird das in NS3/4a vorliegende Konformationsepitop in einer Zelle als ein rekombinantes Polypeptid exprimiert, und dieses Polypeptid stellt das Epitop in einer gewünschten Form bereit, wie nachstehend ausführlich beschrieben wird.
Repräsentative Aminosäuresequenzen für NS3/4a-Polypeptide sind in 3 und den 4A bis 4D dargestellt. Das hervorgehobene Alanin, das an Position 182 von 3 zu sehen ist, ist für das an dieser Position vorliegende native Serin substituiert, um eine Autokatalyse des Moleküls zu verhindern, die ansonsten auftreten könnte. Die an den Positionen 2 bis 686 der 4A bis 4D angegebene Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäurepositionen 1027 bis 1711 von HCV-1. Ein Initiatorcodon (ATG), das Met codiert, ist an Position 1 dargestellt. Außerdem ist das Thr, das normalerweise an Position 1428 von HCV-1 (Aminosäureposition 403 von 4) steht, zu Pro mutiert, und das Ser, das normalerweise an Position 1429 von HCV-1 (Aminosäureposition 404 von 4) steht, ist zu Ile mutiert. Jedoch können in den vorliegenden Tests die native Sequenz, mit oder ohne ein N-terminales Met, das dargestellte Analogon, mit oder ohne das N-terminale Met, oder andere Analoga und Fragmente verwendet werden, so lange das Epitop unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt wird, bei dem seine native Konformation erhalten bleibt oder wiederhergestellt wird, so dass die Proteaseaktivität und gegebenenfalls Helicaseaktivität aufrechterhalten bleibt. Dasmahapatra et al., US Patent Nr. 5 843 752 und Zhang et al., US Patent Nr. 5 990 276, beide beschreiben Analoga von NS3/4a.
Die NS3-Protease von NS3/4a liegt etwa an den Positionen 1027 bis 1207, nummeriert in Bezug auf HCV-1, Positionen 2 bis 182 von 4, vor. Die Struktur der NS3-Protease und ihre Wirkstelle sind bekannt. Vgl. z.B. De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998), 3: 99–109; Koch et al., Biochemistry (2001), 40: 631–640. Änderungen an der nativen Sequenz, die normalerweise toleriert werden, sind solche, die außerhalb der Wirkstelle des Moleküls liegen. Insbesondere ist es wünschenswert, die Aminosäuren 1 oder 2 bis 155 von 4 mit geringen oder nur konservativen Substitutionen beizubehalten. Aminosäuren, die hinter 155 liegen, werden stärkere Änderungen tolerieren. Wenn Fragmente der NS3/4a-Sequenz, die in 4 dargestellt ist, verwendet werden, werden außerdem diese Fragmente im Allgemeinen mindestens die Aminosäuren 1 oder 2 bis 155, vorzugsweise die Aminosäuren 1 oder 2 bis 175 und am stärksten bevorzugt die Aminosäuren 1 oder 2 bis 182, mit oder ohne das N-terminale Met, einschließen. Die Helicasedomäne liegt etwa an den Positionen 1193 bis 1657 von HCV-1 (Positionen 207 bis 632 von 4) vor. Wenn also eine Helicaseaktivität gewünscht wird, wird dieser Teil des Moleküls mit geringen oder nur konservativen Änderungen beibehalten. Der Fachmann kann aufgrund der bekannten Struktur von NS3/4a ohne Weiteres andere Regionen bestimmen, welche eine Änderung tolerieren werden.
Der feste Träger kann auch andere Antigene umfassen. Z.B. können multiple Epitopfusionsantigene (bezeichnet mit „MEFAs"), wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 beschrieben, an den festen Träger zur Verwendung in den vorliegenden Tests gebunden werden. Solche MEFAs schließen multiple Epitope ein, die von zwei oder mehreren der verschiedenen viralen Regionen stammen, wie in 1 und Tabelle 1 dargestellt. Wie insbesondere in
1 und Tabelle 1 dargestellt ist, entstehen aus einem HCV-Polyprotein bei Spaltung mindestens zehn unterschiedliche Produkte in der Größenordnung von NH₂-Core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Das Core-Polypeptid liegt an den Positionen 1 bis 191 vor, nummeriert in Bezug auf HCV-1 (vgl. Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455, für das HCV-1-Genom). Dieses Polypeptid wird weiter bearbeitet, um ein HCV-Polypeptid mit etwa den Aminosäuren 1 bis 173 herzustellen. Die Hüllpolypeptide, E1 und E2, liegen an den Positionen 192 bis 383 bzw. 384 bis 746 vor. Die P7-Domäne befindet sich etwa an den Positionen 747–809. NS2 ist ein integrales Membranprotein mit proteolytischer Aktivität und liegt etwa an den Positionen 810 bis 1026 des Polyproteins vor. NS2, entweder alleine oder in Kombination mit NS3 (gefunden etwa an den Positionen 1027 bis 1657), spaltet die NS2-NS3-„Sissle"-Bindung, wodurch wiederum der N-Terminus von NS3 erzeugt und ein großes Polyprotein freigesetzt wird, das sowohl Serin-Protease- als auch RNA-Helicase-Aktivitäten einschließt. Die NS3-Protease, die etwa an den Positionen 1027 bis 1207 zu finden ist, dient dazu, das restliche Polyprotein zu prozessieren. Die Helicaseaktivität ist etwa an den Positionen 1193 bis 1657 zu finden. Der vollständige Ablauf der Polypeptid-Reifung wird durch eine autokatalytische Spaltung am NS3-NS4a-Übergang initiiert, welche durch die NS3-Serin-Protease katalysiert wird. Anschließende NS3-vermittelte Spaltungen des HCV-Polyproteins scheinen die Erkennung von Polyprotein-Spaltungs-Übergänge durch ein NS3-Molekül eines andere Polypeptids zu beinhalten. In diesen Reaktionen setzt NS3 einen NS3-Cofaktor (NS4a, das etwa an den Positionen 1658 bis 1711 vorliegt), zwei Proteine (NS4b, das etwa an den Positionen 1712 bis 1972 vorliegt, und NS5a, das etwa an den Positionen 1973 bis 2420 vorliegt), und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5b, das etwa an den Positionen 2421–3011 vorliegt) frei.

* Nummeriert in Bezug auf HCV-1. Vgl. Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455.

Die multiplen HCV-Antigene sind Teil einer einzelnen kontinuierlichen Kette von Aminosäuren, wobei die Kette in der Natur nicht vorkommt. Somit ist die lineare Reihenfolge der Epitope anders als ihre lineare Reihenfolge im Genom, in dem sie vorkommen. Die lineare Reihenfolge der Sequenzen der MEFAs zur Verwendung hier ist vorzugsweise so angeordnet, dass eine optimale Antigenität entsteht. Vorzugsweise stammen die Epitope von mehr als einem HCV-Stamm, so dass die zusätzliche Fähigkeit bereitgestellt wird, mehrere Stämme von HCV in einem einzelnen Test nachzuweisen. So können die MEFAs zur Verwendung hier verschiedene immunogene Regionen umfassen, die von dem vorstehend beschriebenen Polypeptid stammen. Außerdem kann ein Protein, das durch eine Verschiebung des Leserasters („Frameshift") in der Core-Region des Polyproteins zustande kommt, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 99/63941 beschrieben, in den MEFAs verwendet werden. Sofern es gewünscht wird, können mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder mehr von einem oder mehreren Epitopen, die von dem HCV-Polyprotein stammen, in dem Fusionsprotein vorkommen.
Z.B. können Epitope, die z.B. aus der hypervariablen Region von E2 stammen, wie eine Region, welche die Aminosäuren 384 bis 410 oder 390 bis 410 überspannt, in dem MEFA-Antigen eingeschlossen sein. Ein besonders wirksames E2-Epitop ist eines, welches eine Konsensussequenz einschließt, die aus dieser Region stammt, wie die Konsensussequenz Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, welche eine Konsensussequenz für die Aminosäuren 390 bis 410 des Genoms von HCV Typ 1 darstellt. Ein repräsentatives E2-Epitop, das in einem MEFA der Erfindung vorliegt, kann ein hybrides Epitop umfassen, welches die Aminosäuren 390 bis 444 überspannt. Ein solches hybrides E2-Epitop kann eine Konsensussequenz einschließen, welche die Aminosäuren 390 bis 410 darstellt, fusioniert mit der nativen Aminosäuresequenz für die Aminosäuren 411 bis 444 von HCV E2.
Außerdem können die Antigene von verschiedenen HCV-Stämmen hergeleitet sein. Mehrere Virusstämme von HCV sind bekannt, wobei Epitope, die von einem beliebigen dieser Stämme stammen, in einem Fusionsprotein verwendet werden können. Es ist bekannt, dass eine beliebige bestimmte Organismus-Art von einem individuellen Organismus zu einem anderen variiert, und dass außerdem ein bestimmter Organismus, wie ein Virus, eine Reihe von verschiedenen Stämmen aufweisen kann. Z.B. schließt, wie vorstehend erklärt, HCV mindestens sechs Genotypen ein. Jeder dieser Genotypen schließt äquivalente antigene Determinanten ein. Insbesondere schließt jeder Stamm mehrere antigene Determinanten ein, die auf allen Stämmen des Virus vorliegen, sich jedoch von einem bestimmten Virusstamm zu einem anderen etwas unterscheiden. Z.B. schließt HCV die antigene Determinante ein, die als 5-1-1 bekannt ist (vgl. 1). Diese bestimmte antigene Determinante kommt auf den drei verschiedenen Virusstämmen von HCV in drei verschiedenen Formen vor. Demgemäß liegen in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung alle drei Formen von 5-1-1 auf dem multiplen Epitopfusionsantigen vor, das in den vorliegenden Immuntests verwendet wird. Genauso können auch äquivalente antigene Determinanten aus der Core-Region von unterschiedlichen HCV-Stämmen vorliegen. Im Allgemeinen haben äquivalente antigene Determinanten bezüglich der Aminosäuresequenz einen hohen Homologiegrad, wobei dieser Homologiegrad beim Alignment im Allgemeinen 30% oder mehr, vorzugsweise 40% oder mehr beträgt. Das Mehrkopie-Epitop der vorliegenden Erfindung kann auch mehrere Kopien einschließen, die exakte Kopien des gleichen Epitops sind.
Repräsentative MEFAs zur Verwendung in den vorliegenden Tests sind in der Internationalen Veröffentlichung WO 97/44469 beschrieben. Weitere repräsentative MEFAs zur Verwendung hier schließen diejenigen ein, die mit MEFA 12, MEFA 13 und MEFA 13.1 bezeichnet sind. Es ist so zu verstehen, dass diese MEFAs bloß repräsentativ sind und auch andere Epitope, die vom HCV-Genom stammen, in den vorliegenden Tests verwendet werden können und in diese oder andere MEFAs eingebaut werden können.
Die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von MEFA 12 ist in den 7A bis 7F dargestellt. Die allgemeine Strukturformel für MEFA 12 ist in 6 dargestellt und sieht wie folgt aus: hSOD-E1(Typ 1)-E2 HVR Konsensus(Typ 1a)-E2 HVR Konsensus(Typen 1 und 2)-c33c kurz(Typ1)-5-1-1(Typ 1)-5-1-1(Typ 3)-5-1-1(Typ 2)-c100(Typ 1)-NS5(Typ 1)-NS5(Typ1)-Core(Typen 1 und 2)-Core(Typen 1 und 2). Dieses Mehrkopie-Epitop schließt die folgende Aminosäuresequenz ein, die in Bezug auf HCV-1 nummeriert ist (die Nummerierung der nachstehend angegebenen Aminosäuren erfolgt gemäß der Nummerierungs-Bezeichnung wie in Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455, bereitgestellt, wobei die Aminosäure Nr. 1 das erste Methionin ist, das durch die codierende Sequenz der Core-Region codiert ist): Aminosäuren 1 bis 69 von Superoxid-Dismutase (SOD, verwendet, um die rekombinante Expression des Proteins zu steigern); Aminosäuren 303 bis 320 des Polyproteins aus der E1-Region; Aminosäuren 390 bis 410 des Polyproteins, welche eine Konsensussequenz für die hypervariable Region von HCV-1 a E2 darstellen; Aminosäuren 384 bis 414 des Polyproteins aus der Region E2, welche eine Konsensussequenz für die hypervariablen E2-Regionen von HCV-1 und HCV-2 darstellen; Aminosäuren 1211 bis 1457 des HCV1-Polyproteins, welche die Helicase definieren; drei Kopien eines Epitops aus 5-1-1, Aminosäuren 1689 bis 1735, eine aus HCV-1, eine aus HCV-3 und eine aus HCV-2, wobei diese Kopien äquivalente antigene Determinanten aus den drei verschiedenen Virusstämmen von HCV sind; HCV-Polypeptid C100 von HCV-1, Aminosäuren 1901 bis 1936 des Polyproteins; zwei exakte Kopien eines Epitops aus der NS5-Region von HCV-1, jede mit den Aminosäuren 2278 bis 2313 des HCV-Polyproteins; und zwei Kopien von drei Epitopen aus der Core-Region, zwei aus HCV-1 und eine aus HCV-2, wobei die Kopien äquivalente antigene Determinanten sind, die durch die Aminosäuren 9 bis 53 und 64 bis 88 von HCV-1 und 67 bis 84 von HCV-2 dargestellt werden.
Tabelle 2 zeigt die Aminosäurepositionen der verschiedenen Epitope in MEFA 12 in Bezug auf die 7A bis 7F. Die Nummerierung in den Tabellen bezieht sich auf HCV-1. Vgl. Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455. MEFAs 13 und 13.1 haben auch die gleiche allgemeine Formel, die vorstehend für MEFA 12 angegeben ist, mit den wie in den Tabellen 3 bzw. 4 bezeichneten Modifikationen.

* Das SOD-Protein ist so verkürzt, dass das Nachweis-Konjugat, ein HRP-markierter Anti-SOD-Antikörper, nicht an das MEFA bindet. Das Core-Epitop ist so mutiert, dass verhindert wird, dass die Antikörper gegen HCV-Core, die zum Nachweis eingesetzt werden, an das MEFA binden.

* Die 5-1-1-Epitope werden modifiziert, indem mögliche Spaltstellen (CS oder CA) entfernt werden, auf welche das rekombinante NS3/4a-Protein zielt. Anstelle von CS oder CA wurde die Sequenz zu PI geändert. Außerdem ist das SOD-Protein so mutiert, dass das Nachweis-Konjugat, ein HRP-markierter Anti-SOD-Antikörper, nicht an das MEFA bindet. Das Core-Epitop ist so mutiert, dass verhindert wird, dass die Antikörper gegen HCV-Core, die zum Nachweis verwendet werden, an das MEFA binden.

In einem Testformat wird die Probe mit dem festen Träger kombiniert, wie weiter unten beschrieben wird. Wenn die Probe mit HCV infiziert ist, werden Core-Antigene und auch HCV-Antikörper gegen diejenigen Epitope, die auf dem festen Träger vorliegen, an die Komponenten des festen Trägers binden. Anschließend wird ein nachweisbar markierter Anti-Core-Antikörper zugegeben. Der markierte Anti-Core-Antikörper ist gegen ein anderes Epitop gerichtet als der Anti-Core-Antikörper, der an den festen Träger gebunden ist. Dieser Anti-Core-Antikörper bindet an das Core-Antigen, das durch die Anti-Core-Antikörper am festen Träger eingefangen ist.
Außerdem wird ein Antigen zugegeben, das mit dem eingefangenen HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, wobei der eingefangene HCV-Antikörper der Probe mit dem NS3/4a-Epitop reaktiv ist. Dieses Antigen ist vorzugsweise ein Epitop, das aus der NS3-Region des HCV-Polyproteins stammt. Dieses Antigen bindet an den eingefangenen HCV-Antikörper aus der Probe. Verschiedene Antigene sind bekannt, die solche Epitope umfassen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Antigene, die von den c33c- und c100-Regionen hergeleitet sind, und außerdem Fusionsproteine, umfassend ein NS3-Epitop, wie c25. Diese und andere NS3-Epitope können in den vorliegenden Tests eingesetzt werden und sind auf dem Fachgebiet bekannt und beschrieben in z.B. Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671; Chien et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89: 10011–10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; und die zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelder Serien-Nr. 08/403 590 und 08/444 818.
Ein zweiter markierter Antikörper, der gegen das vorstehend beschriebene Antigen gerichtet ist, wird zugegeben. Dieser Antikörper kann gegen ein beliebiges Epitop gerichtet sein, das in dem Antigen eingeschlossen ist. Z.B. kann der Antikörper gegen die im Antigen vorliegende NS3-Region gerichtet sein. Alternativ, wenn das vorstehende Antigen als ein Fusionsprotein exprimiert wird, kann der zweite markierte Antikörper gegen den Fusionspartner gerichtet sein. Weitere Antigene und Antikörper können zu dem Test zugegeben werden, insbesondere wenn der feste Träger ein MEFA einschließt. Diese Testformate werden nachstehend noch weiter erläutert.
Ein repräsentativer Test gemäß der Erfindung ist in 2 dargestellt. Wie in der Figur gezeigt wird, schließt der feste Träger zwei monoclonale Anti-Core-Antikörper ein, die mit c11-3 und c11-7 bezeichnet sind. Diese Antikörper sind gegen ein Epitop gerichtet, das in der N-terminalen Region des Core-Proteins an den Aminosäuren 10 bis 53, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz. vorliegt. Außerdem schließt der feste Träger ein Epitop bzgl. NS3/4a ein. Die biologische Probe wird zu dem festen Träger zugegeben. Sowohl HCV-Core-Antigen als auch Antikörper, die gegen das NS3/4a-Epitop gerichtet sind, die beide in der Probe vorliegen, werden an die Einfang-Reagenzien auf dem festen Träger binden.
Anschließend wird der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierte monoclonale Anti-Core-Antikörper c11-14 zugegeben, der gegen eine C-terminale Region des Core gerichtet ist, welche an den Aminosäurepositionen 120 bis 130 vorliegt, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz. Ein Fusionsprotein, das eine Sequenz aus menschlicher SOD (hSOD) und ein Epitop aus der c33c-Region umfasst, wird zugegeben, sowie ein zweiter HRP-markierter Antikörper, der gegen den SOD-Teil des Fusionsproteins gerichtet ist. Die SOD-c33c-Fusion wird an den Anti-NS3-Antikörper binden, und der Anti-SOD-Antikörper wird seinerseits an das SOD-c33c-Fusionsprotein binden. Der Nachweis der Markierung zeigt das Vorliegen einer HCV-Infektion an.
Ein weiterer repräsentativer Test gemäß der Erfindung ist in 8 dargestellt. Die Antikörper-Testkonfiguration ist ein Antigen-Antikörper-Antigen-Sandwich-Einfangtest, bei dem sowohl NS3/4a als auch MEFA 12 verwendet werden. Der feste Träger schließt die vorstehend beschriebenen zwei monoclonalen Anti-Core-Antikörper, ein Epitop bzgl. NS3/4a und außerdem ein repräsentatives MEFA, MEFA 12, ein, das eine verkürzte Version der menschlichen SOD einschließt. Wie beim vorstehenden Test wird die biologische Probe zu dem festen Träger zugegeben. Das HCV-Core-Antigen und außerdem Antikörper, die gegen das NS3/4a-Epitop sowie Epitope des MEFA gerichtet sind, welche in der Probe vorliegen, werden an die Einfang-Reagenzien auf dem festen Träger binden. Zwei Antigene werden zugegeben, eines, das mit Proben-Antikörpern reaktiv ist, welche an NS3/4a binden (wie vorstehend beschrieben), und eines, das mit Proben-Antikörpern reaktiv ist, welche an MEFA 12 binden. In 8 ist das Antigen, das mit dem MEFA-12/Proben-Antikörper-Komplex reaktiv ist, eine Fusion zwischen einem SOD-Molekül und c22ks Δ47-L44W. Das c22ks-Antigen stammt aus der Core-Region und schließt die Aminosäuren Lys₁₀ bis Ser₉₉ des Polyproteins ein, sowie eine Deletion von Arg₄₇, das normalerweise vorliegt, und eine Substitution von Leu für Trp an Position 44. Das Antikörper-Nachweiskonjugat ist der zweite HRP-markierte monoclonale Anti-SOD-Antikörper wie vorstehend beschrieben.
Die vorstehend beschriebenen Antigen/Antikörper-Kombinationstests sind besonders vorteilhaft, da sowohl das HCV-Core-Antigen als auch Antikörper gegen NS3/4a und/oder Core durch den selben Träger im selben Test nachgewiesen werden können. Außerdem können wie vorstehend beschrieben zusätzliche HCV-Epitope, wie SOD, fusioniert an c100, 5-1-1, NS5-Antigene, sowie ein Protein, das durch eine Verschiebung des Leserasters („Frameshift") in der Core-Region des Polyproteins zustande kommt, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 99/63941 beschrieben, in dem Kombinationscocktail eingesetzt werden, um andere Nicht-Struktur-Epitope von HCV abzudecken.
Um die Erfindung noch besser verständlich zu machen, wird nachstehend eine genauere Diskussion bereitgestellt, wobei die Herstellung von Antikörpern zur Verwendung in den vorliegenden Immuntests, die Herstellung von Polypeptiden zur Verwendung in den Immuntests, und Verfahren zum Durchführen der Immuntests erläutert werden.
Herstellung von Antikörpern zur Verwendung in den HCV-Immuntests
Wie vorstehend erklärt, werden in dem Test verschiedene Antikörper eingesetzt, die an einen festen Träger gebunden sind (z.B. ein oder mehrere Anti-Core-Antikörper) und die Antigen/Antikörper-Komplexe nachweisen, welche gebildet werden, wenn eine HCV-Infektion in der Probe vorliegt. Diese Antikörper können polyclonale oder monoclonale Antikörperpräparate, monospezifische Antiseren, menschliche Antikörper sein, oder sie können hybride oder chimäre Antikörper, wie humanisierte Antikörper, veränderte Antikörper, F(ab')₂-Fragmente, F(ab)-Fragmente, Fv-Fragmente, Einzeldomäne-Antikörper, dimere oder trimere Antikörperfragmentkonstrukte, Minibodies oder funktionelle Fragmente davon sein, die an das Antigen von Interesse binden.
Antikörper werden unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind und die offenbart sind in z.B. den US Patenten Nr. 4 011 308; 4 722 890; 4 016 043; 3 876 504; 3 770 380 und 4 372 745. Z.B. werden polyclonale Antikörper erzeugt, indem ein geeignetes Tier, wie eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Schaf oder eine Ziege, mit einem Antigen von Interesse immunisiert wird. Um die Immunogenität zu steigern, kann das Antigen vor der Immunisierung an einen Träger gebunden werden. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt. Die Immunisierung erfolgt im Allgemeinen, indem das Antigen in Kochsalzlösung, vorzugsweise in einem Adjuvans, wie komplettem Freundschem Adjuvans, gemischt oder emulgiert wird und das Gemisch oder die Emulsion parenteral (im Allgemeinen subkutan oder intramuskulär) injiziert wird. Das Tier wird im Allgemeinen zwei bis sechs Wochen später mit einer oder mehreren Injektionen des Antigens in Kochsalzlösung, vorzugsweise unter Verwendung von inkomplettem Freundschem Adjuvans, geboostert. Außerdem können Antikörper durch in vitro-Immunisierung unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erzeugt werden. Sodann wird aus dem immunisiertes Tier ein polyclonales Antiserum erhalten. Vgl. z.B. Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671, für eine Beschreibung der Herstellung von polyclonalen Anti-HCV-Antikörpern.
Monoclonale Antikörper werden im Allgemeinen unter Verwendung des Verfahrens von Köhler und Milstein (1975), Nature 256: 495–497, oder einer Modifikation davon hergestellt. Typischerweise wird eine Maus oder eine Ratte wie vorstehend beschrieben immunisiert. Jedoch wird anstelle der Blutabnahme von dem Tier zum Extrahieren von Serum die Milz (und gegebenenfalls mehrere große Lymphknoten) entfernt und zu Einzelzellen dissoziiert. Sofern es gewünscht wird, können die Milzzellen durchgemustert werden (nach Entfernung von unspezifisch anhaftenden Zellen), indem eine Zellsuspension auf eine Platte oder in eine Vertiefung, welche mit dem Antigen beschichtet ist, aufgetragen wird. B-Zellen, die ein membrangebundenes Immunglobulin exprimieren, das für das Antigen spezifisch ist, binden dann an die Platte und werden nicht mit dem Rest der Suspension weggespült. Danach werden die resultierenden B-Zellen oder alle dissoziierten Milzzellen induziert, mit Myelomzellen zu fusionieren, wodurch Hybridome gebildet werden, und sie werden in einem Selektivmedium gezüchtet (z.B. Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium, „HAT"). Die resultierenden Hybridome werden durch Grenzwert-Verdünnung plattiert und auf die Produktion von Antikörpern getestet, die spezifisch an das immunisierende Antigen binden (und die nicht an nicht damit zusammenhängende Antigene binden). Anschließend werden die ausgewählten, monoclonale Antikörper-sekretierenden Hybridome entweder in vitro (z.B. in Gewebekulturflaschen oder Hohlfaserreaktoren) oder in vivo (z.B. als Aszitesflüssigkeiten in Mäusen) gezüchtet.
Die Herstellung verschiedener monoclonaler Anti-HCV-Antikörper wurde beschrieben z.B. in: Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelden Serien-Nr. 08/403 590 und 08/444 818; und Kashiwakuma et al., US Patent Nr. 5 871 904.
Wie vorstehend erklärt, können in den vorliegenden Immuntests auch Antikörperfragmente verwendet werden, welche die Fähigkeit beibehalten, das Antigen von Interesse zu erkennen. Auf dem Fachgebiet sind verschiedene Antikörperfragmente bekannt, die Antigen-Bindungsstellen umfassen, welche in der Lage sind, immunologische Bindungseigenschaften eines intakten Antikörpermoleküls zu zeigen. Z.B. können funktionelle Antikörperfragmente hergestellt werden, indem eine konstante Region, die nicht für die Antigenbindung verantwortlich ist, vom Antikörpermolekül unter Verwendung von z.B. Pepsin abgespalten wird, wodurch F(ab')₂-Fragmente hergestellt werden. Diese Fragmente enthalten dann zwei Antigen-Bindungsstellen, ihnen fehlt jedoch ein Teil der konstanten Region aus jeder der schweren Ketten. Auf ähnliche Weise können Fab-Fragmente hergestellt werden, die eine einzelne Antigen-Bindungsstelle umfassen, sofern dies gewünscht wird, z.B. indem polyclonale oder monoclonale Antikörper mit Papain gespalten werden. Außerdem können funktionelle Fragmente hergestellt werden, die nur die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten einschließen, indem Standardverfahren verwendet werden, wie die rekombinante Herstellung oder bevorzugte proteolytische Spaltung von Immunglobulinmolekülen. Diese Fragmente sind als F_v bekannt. Vgl. z.B. Inbar et al. (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659–2662; Hochman et al. (1976), Biochem. 15: 2706–2710; und Ehrlich et al. (1980), Biochem. 19: 4091–4096.
Ein Einzelketten-Fv- („sFv" oder „scFv") Polypeptid ist ein kovalent gebundenes V_H-V_L-Heterodimer, das aus einer Genfusion exprimiert wird, einschließlich V_H- und V_L-codierender Gene, gebunden durch einen Peptid-codierenden Linker. Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883. Verschiedene Verfahren wurden beschrieben, um chemische Strukturen (Linker) zu finden und zu entwickeln, mit denen die natürlich aggregierten, jedoch chemisch getrennten, leichten und schweren Polypeptidketten aus einer Antikörper-V-Region zu einem sFv-Molekül umgewandelt werden können, das sich dann zu einer dreidimensionalen Struktur faltet, die im Wesentlichen ähnlich ist wie die Struktur einer Antigen-Bindungsstelle. Vgl. z.B. die US Patente Nr. 5 091 513, 5 132 405 und 4 946 778. Die sFv-Moleküle können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Vgl. z.B. Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883; US-Patente Nr. 5 091 513, 5 132 405 und 4 946 778. Die Entwurfkriterien schließen ein, dass die geeignete Länge bestimmt wird, welche die Entfernung zwischen dem C-Terminus der einen Kette und dem N-Terminus der anderen überspannt, wobei der Linker im Allgemeinen aus kleinen hydrophilen Aminosäureresten gebildet wird, die nicht dazu neigen, zu verknäueln oder Sekundärstrukturen zu bilden. Solche Verfahren wurden auf dem Fachgebiet beschrieben. Vgl. z.B. die US Patente Nr. 5 091 513, 5 132 405 und 4 946 778. Geeignete Linker umfassen im Allgemeinen Polypeptidketten von abwechselnden Sätzen von Glycin- und Serinresten und können Glutaminsäure- und Lysinreste einschließen, die zur Erhöhung der Löslichkeit eingefügt werden.
„Mini-Antikörper" oder „Minibodies" können auch gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Minibodies sind sFv-Polypeptidketten, die an ihren C-Enden Oligomerisierungsdomänen einschließen, die vom sFv durch eine Scharnierregion getrennt sind. Pack et al. (1992), Biochem. 31: 1579–1584. Die Oligomerisierungsdomäne umfasst selbst-assoziierende α-Helices, z.B. Leucin-Zipper, welche durch zusätzliche Disulfidbindungen noch weiter stabilisiert werden können. Die Oligomerisierungsdomäne ist so entworfen, dass sie mit einer vektoriellen Faltung durch eine Membran hindurch kompatibel ist, wobei es sich um einen Prozess handelt, von dem angenommen wird, dass er die in vivo-Faltung des Polypeptids in ein funktionelles Bindungsprotein erleichtert. Im Allgemeinen werden Minibodies unter Verwendung von Rekombinationsverfahren hergestellt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z.B. Pack et al. (1992), Biochem. 31: 1579–1584; Cumber et al. (1992), J. Immunology 149B: 120–126.
Herstellung von Antigenen zur Verwendung in den HCV-Immuntests
Wie vorstehend erklärt werden die Moleküle der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen rekombinant hergestellt. Somit können Polynucleotide, welche HCV-Antigene zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung codieren, anhand von Standardverfahren der Molekularbiologie hergestellt werden. Z.B. können Polynucleotidsequenzen, welche die vorstehend beschriebenen Moleküle codieren, unter Verwendung von Rekombinationsverfahren erhalten werden, wie durch Durchmusterung von cDNA und genomischen Banken aus Zellen, welche das Gen exprimieren, oder durch Herleiten des Gens aus einem Vektor, von dem bekannt ist, dass er dieses enthält. Weiterhin kann das gewünschte Gen direkt aus viralen Nucleinsäuremolekülen isoliert werden, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet beschrieben sind, wie in Houghton et al., US Patent Nr. 5 530 671. Das Gen von Interesse kann auch synthetisch hergestellt werden, anstatt dass es cloniert wird. Die Moleküle können mit geeigneten Codons für die bestimmte Sequenz entworfen werden. Sodann wird die vollständige Sequenz aus überlappenden Oligonucleotiden zusammengebaut, die durch Standardverfahren hergestellt und zu einer vollständigen codierenden Sequenz zusammengebaut werden. Vgl. z.B. Edge (1981), Nature 292: 756; Nambair et al. (1984), Science 223: 1299; und Jay et al. (1984), J. Biol. Chem. 259: 6311.
Auf diese Weise können bestimmte Nucleotidsequenzen aus Vektoren erhalten werden, welche die gewünschten Sequenzen beinhalten, oder sie können vollständig oder zum Teil synthetisiert werden, wobei verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren der Oligonucleotidsynthese verwendet werden können, wie Verfahren der positionsgerichteten Mutagenese und Polymerasekettenreaktion (PCR), sofern sie geeignet sind. Vgl. z.B. Sambrook, vorstehend. Insbesondere besteht ein Verfahren zum Erhalten von Nucleotidsequenzen, welche die gewünschten Sequenzen codieren, darin, komplementäre Sätze von überlappenden synthetischen Oligonucleotiden, die in einem herkömmlichen automatischen Polynucleotid-Synthesizer hergestellt wurden, zu anelieren, worauf eine Ligierung mit einer geeigneten DNA-Ligase und eine Amplifikation der ligierten Nucleotidsequenz anhand von PVR folgen. Vgl. z.B. Jayaraman et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4084–4088.
Außerdem können eine Oligonucleotid-vermittelte Synthese (Jones et al. (1986), Nature 54: 75–82), eine Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese von vorher existierenden Nucleotidregionen (Riechmann et al. (1988), Nature 332: 323–327; und Verhoeyen et al. (1988), Science 239: 1543–1536) und ein enzymatisches Auffüllen von fehlenden Oligonucleotiden unter Verwendung von T₄-DNA-Polymerase (Queen et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033) gemäß der Erfindung eingesetzt werden, um Moleküle bereitzustellen, die veränderte oder gesteigerte Antigen-Bindungseigenschaften und/oder eine reduzierte Immunogenität aufweisen.
Sobald codierende Sequenzen hergestellt oder isoliert wurden, können solche Sequenzen in einen beliebigen geeigneten Vektor oder in ein beliebiges geeignetes Replicon cloniert werden. Zahlreiche Clonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Clonierungsvektors kann jeweils nach den Gegebenheiten erfolgen. Geeignete Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Plasmide, Phagen, Transposons, Cosmide, Chromosomen oder Viren, die zur Replikation fähig sind, wenn sie mit den richtigen Kontrollelementen assoziiert werden.
Danach wird die codierende Sequenz unter die Kontrolle von geeigneten Kontrollelementen gestellt, abhängig vom System, das für die Expression verwendet werden soll. So kann die codierende Sequenz unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle (für eine bakterielle Expression) und gegebenenfalls eines Operators gestellt werden, so dass die DNA-Sequenz von Interesse durch eine geeignete Transformante in RNA transkribiert wird. Die codierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz, das/die später durch den Wirt in der posttranslationalen Prozessierung entfernt wird, enthalten, dies muss jedoch nicht der Fall sein. Vgl. z.B. die US Patente Nr. 4 431 739, 4 425 437 und 4 338 397.
Es kann wünschenswert sein, zusätzlich zu Kontrollsequenzen noch regulatorische Sequenzen zuzufügen, die eine Regulation der Expression der Sequenzen in Bezug auf das Wachstum der Wirtszelle erlauben. Regulatorische Sequenzen sind dem Fachmann bekannt, und Beispiele schließen diejenigen ein, welche die Expression eines Gens bewirken, die als Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich des Vorliegens einer regulatorischen Verbindung, an oder abgeschaltet werden soll. Im Vektor können auch andere Typen von regulatorischen Elementen vorliegen. Z.B. können hier Enhancerelemente verwendet werden, um Expressionsspiegel der Konstrukte zu erhöhen. Beispiele umfassen den frühen SV40-Gen-Enhancer (Dijkema et al. (1985), EMBO J. 4: 761), den Enhancer/Promotor, der von der langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR) des Rous-Sarkom-Virus stammt (Gorman et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777) und Elemente, die vom menschlichen CMV stammen (Boshart et al. (1985), Cell 41: 521), wie Elemente, die in der CMV-Intron-A-Sequenz eingeschlossen sind (US Patent Nr. 5 688 688). Die Expressionskassette kann weiterhin einen Replikationsursprung für die autonome Replikation in einer geeigneten Wirtszelle, einen oder mehrere selektierbare Marker, eine oder mehrere Restriktionsstellen, eine Möglichkeit für eine hohe Kopienzahl und einen starken Promotor einschließen.
Ein Expressionsvektor wird so konstruiert, dass die bestimmte codierende Sequenz zusammen mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen in dem Vektor liegt, wobei die Positionierung und Orientierung der codierenden Sequenz in Bezug auf die Kontrollsequenz so ist, dass die codierende Sequenz unter der „Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert wird (d.h. die RNA-Polymerase, die an das DNA-Molekül an den Kontrollsequenzen bindet, transkribiert die codierende Sequenz). Modifikationen der Sequenzen, welche das Molekül von Interesse codieren, können wünschenswert sein, um dieses Ziel zu erreichen. Z.B. kann es in einigen Fällen erforderlich sein, die Sequenz so zu modifizieren, dass sie an die Kontrollsequenzen in der geeigneten Orientierung angehängt werden kann, d.h. um das Leseraster aufrechtzuerhalten. Die Kontrollsequenzen und andere regulatorische Sequenzen können vor der Insertion in einen Vektor an die codierende Sequenz gebunden werden. Alternativ kann die codierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor cloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle enthält.
Wie vorstehend erklärt kann es auch wünschenswert sein, Mutanten oder Analoga des Antigens von Interesse zu produzieren. Dies trifft teilweise auf NS3/4a zu. Verfahren hierfür sind beschrieben z.B. in: Dasmahapatra et al., US Patent Nr. 5 843 752; und Zhang et al., US Patent Nr. 5 990 276. Mutanten oder Analoga hiervon und von anderen HCV-Proteinen zur Verwendung in den vorliegenden Tests können hergestellt werden durch die Deletion eines Teils der Sequenz, welche das Polypeptid von Interesse codiert, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden innerhalb der Sequenz. Verfahren zum Modifizieren von Nucleotidsequenzen, wie positionsgerichtete Mutagenese und dergleichen, sind dem Fachmann bekannt. Vgl. z.B. Sambrook et al., vorstehend; Kunkel, T. A., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 448; Geisselsoder et al. (1987), BioTechniques 5: 786; Zoller und Smith (1983), Methods Enzymol. 100: 468; Dalbie-McFarland et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409.
Die Moleküle können in einer großen Vielfalt von Systemen exprimiert werden, einschließlich Insekten-, Säuger-, Bakterien-, Viren- und Hefe-Expressionssysteme, die alle auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Z.B. sind Insektenzellen-Expressionssysteme, wie Baculovirus-Systeme, dem Fachmann bekannt und z.B. in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987), beschrieben. Material und Methoden für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind im Handel in Kitform von, u.a., Invitrogen, San Diego, CA, („MaxBac" Kit) verfügbar. Genauso sind Bakterien- und Säugerzellen-Expressionssysteme auf dem Fachgebiet bekannt und z.B. in Sambrook et al., vorstehend, beschrieben. Auch sind Hefe-Expressionssysteme auf dem Fachgebiet bekannt und z.B. in „Yeast Genetic Engineering" (Barr et al., Hrsg., 1989), Butterworths, London, beschrieben.
Außerdem sind verschiedene geeignete Wirtszellen bekannt, die zusammen mit den vorstehenden Systemen eingesetzt werden können. Z.B. sind Säugerzelllinien auf dem Fachgebiet bekannt und schließen immortalisierte Zelllinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) verfügbar sind, wie, jedoch nicht beschränkt auf Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen), Affennierenzellen (COS), menschliche embryonale Nierenzellen, menschliche hepatozelluläre Karzinomzellen (z.B. Hep G2), Madin-Darby Rindernierenzellen („MDBK"-Zellen) und andere. Genauso können bakterielle Wirte, wie E. coli, Bacillus subtilis und Streptococcus spp., in Verbindung mit den vorliegenden Expressionskonstrukten eingesetzt werden. Hefewirte, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen u.a. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis; Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica ein. Insektenzellen zur Verwendung in Verbindung mit den Baculovirus-Expressionsvektoren schließen u.a. Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni ein.
Nucleinsäuremoleküle, die Nucleotidsequenzen von Interesse umfassen, können in ein Wirtszellengenom stabil integriert sein oder sie können auf einem stabilen episomalen Element in einer geeigneten Wirtszelle aufrechterhalten bleiben, wobei verschiedene Gen-Transportsysteme verwendet werden können, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z.B. das US Patent 5 399 346.
Abhängig vom ausgewählten Expressionssystem und vom ausgewählten Wirt werden die Moleküle hergestellt, indem Wirtszellen, welche durch einen vorstehend beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind, unter Bedingungen gezüchtet werden, durch welche das Protein exprimiert wird. Anschließend wird das exprimierte Protein aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem das Protein in Wachstumsmedien ausscheidet, kann das Produkt direkt aus den Medien gereinigt werden. Wenn es nicht ausgeschieden wird, kann es aus Zelllysaten isoliert werden. Die Auswahl der geeigneten Wachstumsbedingungen und Methoden zur Gewinnung sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die rekombinante Produktion von verschiedenen HCV-Antigenen wurde beschrieben. Vgl. z.B. Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778.
Immundiagnostische Tests
Die vorstehenden Anti-Core-Antikörper und NS3/4a-Antigene werden, sobald sie produziert wurden, für die Verwendung in den vorliegenden Immuntests auf einen geeigneten festen Träger aufgebracht. Ein fester Träger für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Material sein, das eine unlösliche Matrix darstellt, und kann eine starre oder halbstarre Oberfläche aufweisen. Beispielhafte feste Träger schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Substrate, wie Nitrocellulose (z.B. in Form von Membranen oder Mikrotitervertiefungen); Polyvinylchlorid (z.B. Folien oder Mikrotitervertiefungen); Polystyrol-Latex (z.B. Perlen oder Mikrotiterplatten); Polyvinylidinfluorid; diazotiertes Papier; Nylonmembranen; aktivierte Perlen, magnetisch reagierende Perlen und dergleichen. Bestimmte Träger schließen Platten, Pellets, Scheiben, Kapillaren, Hohlfasern, Nadeln, Spitzen, feste Fasern, Celluloseperlen, Porenglasperlen, Silicagele, Polystyrolperlen, gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetzt, Pfropf-Copolymer-Perlen, Polyacrylamid-Perlen, Latex-Perlen, Dimethylacrylamid-Perlen, gegebenenfalls vernetzt mit N-N'-bis-Acryloylethylendiamin, und Glaspartikel, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer.
Die Moleküle, die zu dem festen Träger zugefügt werden sollen, können, sofern es gewünscht wird, ohne Weiteres funktionalisiert werden, so dass Styrol- oder Acrylatreste erzeugt werden, wodurch der Einbau der Moleküle in Polystyrol, Polyacrylat oder andere Polymere, wie Polyimid, Polyacrylamid, Polyethylen, Polyvinyl, Polydiacetylen, Polyphenylenvinylen, Polypeptid, Polysaccharid, Polysulfon, Polypyrrol, Polyimidazol, Polythiophen, Polyether, Epoxidprodukte, Silicaglas, Silicagel, Siloxan, Polyphosphat, Hydrogel, Agarose, Cellulose und dergleichen, möglich gemacht wird.
In einem bestimmten Zusammenhang wird ein fester Träger zuerst mit den HCV-Anti-Core-Antikörpern und dem NS3/4a-Epitop (hier zusammen als „die Festphasen-Komponenten" bezeichnet) und gegebenenfalls mit einem oder mehreren MEFAs unter geeigneten Bindungsbedingungen umgesetzt, so dass die Moleküle an den Träger ausreichend immobilisiert werden. Manchmal kann die Immobilisierung an den Träger gesteigert werden, indem das Antigen und/oder der Antikörper zuerst an ein Protein mit besseren Festphasen-Bindungseigenschaften gekoppelt werden/wird. Geeignete Kopplungsproteine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Makromoleküle, wie Serumalbumine, einschließlich Rinderserumalbumin (BSA), Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Immunglobulin-Moleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere Proteine, die dem Fachmann bekannt sind.
Andere Reagenzien, die verwendet werden können, um Moleküle an den Träger zu binden, schließen Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere und dergleichen ein. Solche Moleküle und Methoden zur Kopplung dieser Moleküle an Antigene sind dem Fachmann bekannt. Vgl. z.B. Brinkley, M. A., (1992), Bioconjugate Chem. 3: 2–13; Hashida et al. (1984), J. Appl. Biochem. 6: 56–63; und Anjaneyulu und Staros (1987), International J. of Peptide and Protein Res. 30: 117–124.
Nach Umsetzen des festen Trägers mit den Festphasen-Komponenten werden jegliche nicht-immobilisierte Festphasen-Komponenten vom Träger durch Waschen entfernt, und danach werden die Träger-gebundenen Komponenten mit einer biologischen Probe, von der man annimmt, dass sie HCV-Antikörper und Antigene enthält (hier zusammen „Ligandenmoleküle" genannt), unter geeigneten Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht. Nach Waschen zum Entfernen jeglicher nicht-gebundener Ligandenmoleküle wird ein zweiter Anti-Core-Antikörper, der gegen ein anderes Epitop gerichtet ist als der an den Träger gebundene Anti-Core-Antikörper, unter geeigneten Bindungsbedingungen zugegeben. Der zugegebene Anti-Core-Antikörper schließt eine nachweisbare Markierung wie vorstehend beschrieben ein und wirkt so, dass er an ein möglicherweise in der Probe vorliegendes Core-Antigen bindet, das mit dem Träger-gebundenen Anti-Core-Antikörper reagiert hat. Außerdem wird/werden ein oder mehrere Antigene zugegeben, die mit in der Probe vorliegenden Antikörpern reagieren können, die ihrerseits mit dem NS3/4a-Epitop reagiert haben. Wie vorstehend erklärt, stammt das Antigen typischerweise aus der NS3-Region des HCV-Polyproteins und insbesondere aus der c33c-Region von HCV. Vgl. Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 89: 10011–10015; Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; und zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelder Serien-Nr. 08/403 590 und 08/444 818; für eine Beschreibung dieser Region und von daraus stammenden Epitopen. Außerdem wird ein markierter Antikörper zugegeben, der gegen dieses Antigen gerichtet ist. Deshalb bindet der Antikörper dann an das Antigen, welches mit in der Probe vorliegenden Anti-NS3-Antikörpern reagiert hat. Für diesen Zweck kann das c33c-Epitop einfach als eine Fusion zwischen c33c und menschlicher Superoxid-Dismutase (hSOD) bereitgestellt werden, die rekombinant erzeugt wird, z.B. durch Verfahren, die in Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671 beschrieben sind. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen für die menschliche SOD sind bekannt und in Hallewell et al., US Patent Nr. 5 710 033, angegeben. Somit kann ein markierter Antikörper, der gegen menschliche SOD gerichtet ist, verwendet werden, um das Vorliegen von Komplexen nachzuweisen, die zwischen dem NS3/4a-Epitop, jeglichen Antikörpern in der Probe, die mit diesem Epitop reagieren, und HCV-Polypeptiden, die ihrerseits an den Antikörper in der Probe binden, gebildet werden.
Wenn ein MEFA auf dem festen Träger vorliegt, kann/können zu dem Test auch ein oder mehrere zusätzliche Antigene zugegeben werden, die mit Antikörpern aus der biologischen Probe reaktiv sind, welche an Antigene gebunden sind, die auf dem MEFA vorliegen. Besonders geeignet ist in diesem Zusammenhang ein Antigen, das aus der Core-Region von HCV stammt, und insbesondere aus dem c22-Antigen, das 119 N-terminale Core-Aminosäuren des HCV-Polyproteins einschließt. Ein bestimmtes Antigen, das von c22 stammt, ist c22ks Δ47-L44W, das die Aminosäuren Lys₁₀ bis Ser₉₉ des Polyproteins einschließt, sowie eine Deletion von Arg₄₇, das normalerweise vorliegt, und eine Substitution von Leu für Trp an Position 44. Wie beim vorstehend beschriebenen c33c-Epitop kann dieses Antigen als eine Fusion mit hSOD bereitgestellt werden, und der gleiche markierte Antikörper, der gegen menschliche SOD gerichtet ist, kann eingesetzt werden, um das Vorliegen von Komplexen nachzuweisen, die zwischen in der Probe vorliegenden Antikörpern und dem NS3/4a-Epitop und/oder dem MEFA gebildet werden, wobei diese Komplexe auch an die HCV-Antigene gebunden sind (z.B. c33c und c22).
Insbesondere kann ein ELISA-Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit den Festphasen-Komponenten beschichtet sind. Sodann wird eine biologische Probe, welche Ligandenmoleküle enthält oder von der angenommen wird, dass sie Ligandenmoleküle enthält, zu den beschichteten Vertiefungen zugegeben. Nach einem ausreichenden Inkubationszeitraum, um die Bindung von Ligandenmolekül an die immobilisierte Festphasen-Komponente zuzulassen, kann (können) die Platte(n) gewaschen werden, um ungebundene Einheiten zu entfernen, und sodann werden ein nachweisbar markiertes sekundäres Bindungsmolekül (markierter Anti-Core-Antikörper), ein NS3-Epitop-enthaltendes Molekül und ein gegen das NS3-Epitop-enthaltende Molekül gerichteter Antikörper zugegeben. Diese Moleküle lässt man mit jeglichen eingefangenen Proben-Antigen und Antikörper reagieren, die Platte wird gewaschen und das Vorliegen der markierten Antikörper wird unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, nachgewiesen.
Die vorstehend beschriebenen Testreagenzien, einschließlich des festen Trägers für einen Immuntest mit gebundenen Antikörpern und Antigenen, und außerdem Antikörper und Antigene, die mit der eingefangenen Probe umgesetzt werden sollen, können in Kits zusammen mit geeigneten Anweisungen und anderen erforderlichen Reagenzien bereitgestellt werden, so dass Immuntests wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden können. Das Kit kann auch, abhängig von dem bestimmten verwendeten Immuntest, geeignete Markierungen und andere verpackte Reagenzien und Stoffe (d.h. Waschpuffer und dergleichen) enthalten. Unter Verwendung dieser Kits können Standard-Immuntests wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind, durchgeführt werden.
III. Methodik
Nachstehend sind Beispiele von spezifischen Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beispiele sollen lediglich der Erläuterung dienen und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Es wurde großer Wert darauf gelegt, dass hinsichtlich der verwendeten Zahlenangaben (z.B. Mengen, Temperaturen usw.) auf Genauigkeit geachtet wurde, jedoch sollten natürlich ein gewisser experimenteller Fehler und eine gewisse Abweichung erlaubt sein.
Beispiel 1
HCV-Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntest
Der vorliegende HCV-Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntest wurde mit anderen HCV-Tests verglichen, wobei wie folgt die Serokonversion-Testgrenzen getestet und diese Grenzen mit denjenigen in anderen im Handel verfügbaren Tests verglichen wurden.
A. Material und Methoden
Blutproben: Repräsentative Gruppen („Panels") von im Handel verfügbaren menschlichen Blutproben wurden verwendet. Solche Panels sind z.B. von Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); und North American Biologics, Inc., BocoRatan, FL (NABI), verfügbar. Die in den Tabellen 5 und 6 angegebenen Tage sind die Tage, an denen von den Individuen Blut abgenommen wurde.
Monoclonale Antikörper: Die monoclonalen Antikörper c11-3, c11-7 und c11-14 wurden von Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey, bezogen. Die Antikörper c11-3 und c11-7 sind gegen einen N-terminalen Teil des Core gerichtet (Aminosäuren 10 bis 53, nummeriert in Bezug auf das HCV1-Polyprotein). Der monoclonale Antikörper c11-14 ist gegen einen C-terminalen Teil des Core gerichtet (Aminosäuren 120 bis 130, nummeriert in Bezug auf das HCV1-Polyprotein). Der Antikörper c11-14 wurde unter Verwendung von Standardverfahren an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert.
Der monoclonale Antikörper 5A-3 ist ein Anti-SOD-Antikörper, der gegen die Aminosäuren 1 bis 65 von SOD gerichtet ist, und wurde unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Der Antikörper wurde wie vorstehend beschrieben an HRP konjugiert.
B. Antigene
Das Antigen c33c (266 Aminosäuren, Aminosäuren 1192 bis 1457 des HCV1-Polyproteins) wurde als ein inneres SOD-Fusionspolypeptid in E. coli durch Verfahren exprimiert, die für die Synthese des Antigens 5-1-1 beschrieben sind (Choo et al., Science (1989), 244: 359–362). Das rekombinante Antigen wurde wie in Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989), 89: 10011–10015, beschrieben gereinigt. Vgl. auch Houghton et al., US Patent Nr. 5 350 671 für Herstellungsprotokolle für SOD-c33c.
Das im Test verwendete NS3/4a-Epitop ist ein Konformationsepitop, das die in 3 angegebene Sequenz aufweist.
C. Immuntest-Formate
Der „Abbott PRISM Assay" (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) ist kommerziell verfügbar und stellt einen Antikörper-basierten Nachweistest dar. Der Test wurde unter Verwendung der Anleitungen des Herstellers durchgeführt.
Das „ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System" (hier als Ortho-3.0-Test bezeichnet, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ist ein Antikörper-basierter Nachweistest. Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Der „Roche Amplicor Assay" (Roche, Pleasant, CA) ist ein kommerziell verfügbarer PCR-basierter Test. Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Der „Gen-Probe TMA Assay" (San Diego, CA) ist ein kommerziell verfügbarer Transkriptions-vermittelter Amplifikationstest. Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Der „Ortho Antigen Assay" (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ist ein Antigen-basierter Nachweistest. Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Der vorliegende HCV-Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntest wurde wie folgt durchgeführt. 4 mg/ml jeweils der gereinigten monoclonalen Antikörper C11-7 und C11-3 in 1 × Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, wurden miteinander kombiniert und gut gemischt. 90 ng des rekombinanten NS3/4a-Antigens wurden zu dem gleichen Beschichtungspuffer zugegeben. Die Lösung wurde vor der Beschichtung 30 Min gemischt. 200 μl der vorstehenden Lösung wurden pro Vertiefung zu Medium-Bindungs-Costar-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Corining, Inc.) zugegeben. Die Platten wurden 16 bis 24 Stunden bei 15 bis 30°C inkubiert. Die Platten wurden zweimal mit dH₂O, anschließend mit 300 μl/Vertiefung Nachbeschichtungspuffer („postcoat buffer") (1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 × PBS) eine Stunde und mit 300 μl/Vertiefung Stabilitätspuffer (1 × PBS, 1% BSA, Mannit, Polyethylenglykol (PEG), Gelatine) eine Stunde gewaschen. Die Platten wurden abgesaugt und 24 Stunden bei 4°C in einem Gefriertrockner getrocknet. Die Platten wurden mit einem Trocknungsmittel geliefert.
Zur Durchführung des Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntests wurden 100 μl verstärkter Lysepuffer (1% N-Laurylsarconin, 0,65 M NaCl, 50 mg/ml Maus-IgG, technische Qualität (Sigma, St. Louis, MO), 1% BSA Sulfhydryl-modifiziert (Bayer), 0,1% Casein) zu der Platte zugegeben. Sodann wurden 100 μl Probe zugefügt. Dies wurde auf einem Schüttler eine Stunde bei 40°C inkubiert. Die Platten wurden sechsmal mit 1 × PBS, 0,1% Tween-20, auf einer Ortho-Plattenwaschvorrichtung („Ortho Plate Washer") gewaschen. 200 μl Konjugatlösung (1:75-Verdünnung c11-14-HRP mit 250 ng/Test SOD-c33c-Antigen plus 1:5000-Verdünnung Maus-Anti-SOD-HRP in HCV 3.0-Probenverdünnungsmittel („HCV 3.0 sample diluent") (von ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ohne SOD-Extrakt, wobei alle 30 Minuten vor der Zugabe hergestellt wurden). Die Lösung wurde 45 Minuten unter Schütteln bei 40°C inkubiert. Anschließend wurde sie sechsmal wie vorstehend gewaschen und sodann mit 200 μl Substratlösung (1 OPD-Tablette/10 ml) versetzt. Die OPD-Tablette enthält o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid und Wasserstoffperoxid für die Farbentwicklung der Meerrettich-Peroxidase-Reaktion und ist von Sigma, St. Louis, MO, verfügbar. Das Ganze wurde 30 Minuten bei 15 bis 30°C im Dunkeln inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 50 ml 4 N H₂SO₄ beendet und die Platten bei 492 nm mit Bezug auf Absorption bei 690 nm als Kontrolle abgelesen.
D. Ergebnisse
Die Ergebnisse der verschiedenen Tests sind in den Tabellen 5 und 6 dargestellt, welche zwei getrennte Experimente zeigen, die an einer HCV-Infektion ausgesetzten Blutproben wie angegeben durchgeführt wurden. Die schattierten Flächen zeigen einen Nachweis des Virus. Wie nachstehen angegeben wies der Kombinations-Antigen/Antikörper-Test von Chiron in allen Proben eine Serokonversion nach, während alle anderen Antikörper- und Antigen-basierten Tests beim Nachweis der Serokonversion in mindestens einer Probe versagten. Insbesondere wies keiner der Antikörper-basierten Tests bis zu mindestens Tag 18 eine Serokonversion nach (Tabelle 5). Tabelle 6 zeigt, dass keiner der Antikörper-basierten Tests am Tag 22 das Vorliegen einer HCV-Infektion nachwies. Außerdem versagte der Antigen-basierte Test von Ortho beim Nachweis der Serokonversion vom Tag 85 ab.
Somit ist aufgrund der vorstehenden Ergebnisse klar, dass der neue Antikörper/Antigen-Kombinationstest die Zahl von falsch negativen Ergebnissen reduziert, die unter Verwendung anderer herkömmlicher Antikörper- und Antigen-basierter Tests erhalten werden.
Beispiel 2
Produktion eines NS3/4a-Konformationsepitops mit Thr-zu-Pro- und Ser-zu-Ile-Substitutionen
Ein Konformationsepitop von NS3/4a wurde wie folgt erhalten. Dieses Epitop hat die in den 4A bis 4D angegebene Sequenz und unterscheidet sich von der nativen Sequenz in den Positionen 403 (Aminosäure 1428 der vollständigen HCV-1-Sequenz) und 404 (Aminosäure 1429 der vollständigen HCV-1-Sequenz). Insbesondere wurde das Thr, das normalerweise an Position 1428 der nativen Sequenz vorliegt, zu Pro mutiert, und Ser, das normalerweise an Position 1429 der nativen Sequenz vorliegt, wurde zu Ile mutiert.
Insbesondere wurde der Hefe-Expressionsvektor pBS24.1 wie vorstehend beschrieben verwendet. Das Plasmid pd.hcv1a.ns3ns4aPI, welches ein repräsentatives NS3/4a-Epitop codierte, das in den vorliegenden Immuntest verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt. Ein zweistufiges Verfahren wurde eingesetzt. Zuerst wurden die folgenden DNA-Stücke miteinander verbunden: (a) synthetische Oligonucleotide, die eine 5' HindIII-Clonierungsstelle bereitstellen würden, gefolgt von der Sequenz ACAAAACAAA, dem Initiator-ATG und Codons für HCV1a, beginnend mit Aminosäure 1027 und fortsetzend bis zu einer BglI-Stelle an Aminosäure 1046; (b) ein 683 bp BglI-ClaI-Restriktionsfragment (welches die Aminosäuren 1046 bis 1274 codiert) aus pAcHLTns3ns4aPI; und (c) ein pSP72-Vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Hinterlegungsnummer X65332), der mit HindIII und ClaI gespalten, dephosphoryliert und Gel-gereinigt worden war. Das Plasmid pAcHLTns3ns4aPI wurde von pAcHLT hergeleitet, einem Baculovirus-Expressionsvektor, der von BD Pharmingen (San Diego, CA) kommerziell verfügbar ist. Insbesondere wurde ein pAcHLT-EcoRI-PstI-Vektor hergestellt, und außerdem die folgenden Fragmente: EcoRI-AlwnI, 935 bp, entsprechend den Aminosäuren 1027 bis 1336 des HCV-1-Genoms; AlwnI-SacII, 247 bp, entsprechend den Aminosäuren 1336 bis 1419 des HCV-1-Genoms; HinfI-BglI, 175 bp, entsprechend den Aminosäuren 1449 bis 1509 des HCV-1-Genoms; BglI-PstI, 619 bp, entsprechend den Aminosäuren 1510 bis 1711 des HCV-1-Genoms, plus das Transkriptions-Terminations-Codon. Ein synthetisch erzeugtes SacII-HinfI-Fragment von 91 bp, entsprechend den Aminosäuren 1420 bis 1448 des HCV-1-Genoms und enthaltend die PI-Mutationen (Thr-1428 mutiert zu Pro, Ser-1429 mutiert zu Ile), wurde mit dem 175 bp HinfI-BglI-Fragment und dem 619 bp BglI-PstI-Fragment wie vorstehend beschrieben ligiert und in einen pGEM-5Zf(+)-Vektor subcloniert, der mit SaclI und PstI gespalten worden war. pGEM-5Zf(+) ist ein kommerziell verfügbarer E. coli-Vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Hinterlegungsnummer X65308). Nach der Transformation kompetenter HB101-Zellen, einer Miniscreen- Analyse einzelner Clone und einem Verifizieren der Sequenz wurde ein 885 bp SaclI-PstI-Fragment aus pGEM5.PI Clon 2 Gel-gereinigt. Dieses Fragment wurde mit dem 935 bp EcoRI-AlwnI-Fragment, dem 247 bp AlwnI-SaclI-Fragment und dem pAcHLT-EcoRI-PstI-Vektor wie vorstehend beschrieben ligiert. Das resultierende Konstrukt wurde mit pAcHLTns3ns4aPI bezeichnet.
Das vorstehende Ligierungsgemisch wurde in kompetente HB101-Zellen transformiert und auf Luria-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Anhand von Miniprep-Analysen einzelner Clone wurden mutmaßliche positive Clone identifiziert, von denen zwei amplifiziert wurden. Die Plasmid-DNA für pSP72 1aHC, Clone Nr. 1 und Nr. 2, wurden mit einem Qiagen Maxiprep-Kit hergestellt und sequenziert.
Als nächstes wurden die folgenden Fragmente miteinander ligiert: (a) ein 761 bp HindIII-ClaI-Fragment aus pSP721aHC Nr. 1 (pSP72.1aHC wurde erzeugt, indem die folgenden miteinander ligiert wurden: pSP72, der mit HindIII und ClaI gespalten worden war, synthetische Oligonucleotide, die eine 5' HindIII-Clonierungsstelle bereitstellen würden, gefolgt von der Sequenz ACAAAACAAA, dem Initiationscodon ATG und Codons für HCV1a, beginnend mit Aminosäure 1027 und fortsetzend bis zu einer BglII-Stelle an Aminosäure 1046, und ein 683 bp BglII-ClaI-Restriktionsfragment (das die Aminosäuren 1046 bis 1274 codiert) aus pAcHLTns3ns4aPI); (b) ein 1353 bp BamHI-HindIII-Fragment für den Hefe-Hybrid-Promotor ADH2/GAPDH; (c) ein 1320 bp ClaI-SalI-Fragment (welches die Aminosäuren 1046 bis 1711 von HCV1a codiert, wobei Thr-1428 zu Pro mutiert ist und Ser-1429 zu Ile mutiert ist) aus pAcHLTns3ns4aPI; und (d) der Hefe-Expressionsvektor pBS24.1, der mit BamHI und SalI gespalten, dephosphoryliert und Gel-gereinigt worden war. Das Ligierungsgemisch wurde in kompetente HB101-Zellen transformiert und auf Luria-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Anhand von Miniprep-Analysen einzelner Kolonien wurden Clone mit dem erwarteten 3446 bp BamHI-SalI-Insert identifiziert, bestehend aus dem ADH2/GAPDH-Promotor, dem Initiator-Codon ATG und HCV1aNS3/4a aus den Aminosäuren 1027 bis 1711 (dargestellt als Aminosäuren 1 bis 686 der 4A bis 4D), wobei Thr-1428 (Aminosäureposition 403 der 4A bis 4D) zu Pro mutiert ist, und Ser-1429 (Aminosäureposition 404 der 4A bis 4D) zu Ile mutiert ist. Das Konstrukt wurde mit pd.HCV1a.ns3ns4aPI bezeichnet (vgl. 5).
S. cerevisiae-Stamm AD3 wurde mit pd.HCV1a.ns3ns4aPI transformiert, und einzelne Transformanten wurden nach Weglassen von Glucose im Medium auf eine Expression untersucht. Das rekombinante Protein wurde in Hefe mit hohen Raten exprimiert, wie durch Coomassie-Blau-Färbung nachgewiesen und durch Immunblot- Analyse unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers gegen die Helicase-Domäne von NS3 bestätigt wurde.
Beispiel 3
Reinigung des NS3/4a-Konformationsepitops
Das NS3/4a-Konformationsepitop wurde wie folgt gereinigt. S. cerevisiae-Zellen von vorstehend, welche das NS3/4a-Epitop exprimierten, wurden wie vorstehend beschrieben geerntet. Die Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin) suspendiert und in einer Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Schweiz) oder einer gleichwertigen Apparatur unter Verwendung von Glasperlen bei einem Verhältnis von 1:1:1 Zellen:Puffer:0,5-mm-Glasperlen lysiert. Das Lysat wurde 30 Min. bei 4°C bei 30100 × g zentrifugiert und das Pellet, welches die unlösliche Proteinfraktion enthielt, wurde zu Waschpuffer zugegeben (6 ml/g Zellpellet-Ausgangsgewicht) und 15 Min. bei Raumtemperatur gerüttelt. Der Waschpuffer bestand aus 50 mM NaPO₄, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 0,05% Octylglucosid, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 30100 × g für 30 Min. bei 4°C entfernt. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zurückbehalten.
Protein wurde wie folgt aus dem Pellet extrahiert. 6 ml/g Extraktionspuffer wurde zugegeben und 15 Min. bei Raumtemperatur gerüttelt. Der Extraktionspuffer bestand aus 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin. Dieses wurde 30 Min. bei 4°C bei 30100 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückbehalten und Ammoniumsulfat bis zu 17,5% zugegeben, wobei die folgende Formel verwende wurde: Volumen des Überstands (ml) multipliziert mit x% Ammoniumsulfat/(1 – x% Ammoniumsulfat) = ml von 4,1 M gesättigtem Ammoniumsulfat, die zum Überstand zugegeben werden müssen. Das Ammoniumsulfat wurde tropfenweise unter Rühren auf Eis zugefügt und die Lösung zehn Minuten auf Eis gerührt. Die Lösung wurde bei 17700 × g 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert und das Pellet zurückbehalten und bis zu 48 Stunden bei 2°C bis 8°C gelagert.
Das Pellet wurde resuspendiert und auf einer Poly-U-Säule (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) bei 4°C wie folgt laufengelassen. Das Pellet wurde in 6 ml Poly-U-Äquilibrierungspuffer pro g Pelletgewicht resuspendiert. Der Äquilibrierungspuffer bestand aus 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM NaCl, 5 mM DTT (frisch zugegeben), 10% Glycerin, 1,2 Octylglucosid. Die Lösung wurde 15 Min. bei 4°C gerüttelt und 30 Min. bei 4°C bei 31000 × g zentrifugiert.
Eine Poly-U-Säule (1 ml Harz pro g Pellet-Ausgangsgewicht) wurde hergestellt. Die lineare Fließrate betrug 60 cm/Std., und die Pack-Fließrate betrug 133% von 60 cm/Std. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer äquilibriert und der Überstand des resuspendierten Ammoniumsulfat-Pellets auf die äquilibrierte Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer auf eine Grundlinie gewaschen und sodann das Protein mit einer Stufenelution im folgenden Poly-U-Elutionspuffer eluiert: 25 mM HEPES, pH 8,0, 1 M NaCl, 5 mM DTT (frisch zugegeben), 10% Glycerin, 1,2 Octylglucosid. Das Säuleneluat wurde auf einer SDS-PAGE laufen gelassen (Coomassie gefärbt), und Aliquots wurden eingefroren und bei –80°C gelagert. Das Vorliegen des NS3/4a-Epitops wurde durch Western-Blot bestätigt, wobei ein polyclonaler Antikörper, der gegen die NS3-Protease-Domäne gerichtet war, und ein monoclonaler Antikörper gegen das 5-1-1-Epitop (HCV-4a) verwendet wurden.
Zusätzlich wurde die Protease-Enzymaktivität während der Reinigung wie folgt überwacht. Ein NS4A-Peptid (KKGSVVTVGRIVLSGKPAIIPKK) und die Probe, die das NS3/4a-Konformationsepitop enthielt, wurden in 90 μl Reaktionspuffer (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,05 n-Dodecyl-B-D-Maltosid, 5 mM DTT) verdünnt und ihre Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur zugelassen. 90 μl des Gemisches wurden zu einer Mikrotiterplatte (Costar, Inc., Corning, NY) zugefügt, und 10 μl HCV-Substrat (AnaSpec, Inc., San Jose, CA) wurden zugegeben. Die Platte wurde gemischt und auf einem Fluostar-Plattenlesegerät („Fluostar plate reader") abgelesen. Die Ergebnisse wurden als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU) pro Minuten angegeben.
Bei Verwendung dieser Verfahren enthielt das Produkt der Extraktion mit 1 M NaCl eine Aktivität von 3,7 RFU/Min., der Ammoniumsulfat-Niederschlag wies eine Aktivität von 7,5 RFU/Min. auf, und das Produkt der Poly-U-Reinigung zeigte eine Aktivität von 18,5 RFU/Min.
Beispiel 4
Kompetitionsuntersuchungen
Die folgende Kompetitionsuntersuchung wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das NS3/4a-Konformationsepitop unterschiedliche Antikörper als andere HCV-Antigene nachwies. Insbesondere wurde das NS3/4a-Antigen mit dem c200-Antigen wie folgt verglichen.
0,5 μg und 1,0 μg von NS3/4a, hergestellt wie vorstehend beschrieben, oder c200 (Hepatology (1992), 15: 19–25, verfügbar in dem ORTHO HCV Version 3,0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) wurden mit 20 μl der Probe PHV914-5 (eine frühe Serokonversions-Blutprobe, erhalten aus dem Blut eines infizierten Individuums) in einem Gesamtvolumen von 220 μl (1 × PBS) gemischt. Das Gemisch wurde in Mikrovertiefungen eine Stunde bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Gemisch auf NS3/4a-beschichtete Platten überführt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden wie folgt gewaschen und getestet.
1 μg des c200-Antigens wurde zu 10 μl der Probe PHV914-5 in einem Gesamtvolumen von etwa 220 μl zugegeben. Das Gemisch wurde in einer Mikrovertiefung eine Stunde bei 37°C inkubiert, sodann wurden 200 μl auf eine NS3/4a-beschichtete Platte (100 ng/Test) überführt und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden fünfmal mit 1 × PBS, 0,1% Tween-20, gewaschen. 200 μl der Konjugatlösung (wie vorstehend beschrieben) wurden zugegeben und die Platten inkubiert und getestet. Außerdem wurden Kontrollen, die aus PHV914-5 und 1 × PBS (ohne Antigen) bestanden, wie vorstehend behandelt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Ergebnisse der prozentualen Hemmung, wie in Spalte 4 angegeben, werden berechnet aus Spalte 3 minus (Spalte 2 geteilt durch Spalte 3 mal 100). Wie zu sehen ist, zeigen die Daten, dass NS3/4a durch Antikörper der frühen Serokonversion neutralisiert wird und dass dies bei c200 nicht der Fall ist. Ein starkes Signal wurde erhalten, wenn Antikörper in einem PHV914-5-c33c-Panel-Mitglied der frühen Serokonversion mit dem auf der Platte beschichteten NS3/4a reagierten. Das c200-Antigen wurde durch diese Antikörper nicht neutralisiert. Dies ist in der oberen Abbildung von Tabelle 7 dargestellt. Wenn NS3/4a mit der Probe PHV914-5 gemischt wurde, wurde es neutralisiert und deshalb lagen in der Probe keine Antikörper vor, die mit NS3/4a reagierten, das auf die Mikroplatte beschichtet war. Die Daten zeigen, dass NS3/4a möglicherweise eine andere Klasse von Antikörpern nachweist als diejenigen, die durch c200 nachgewiesen werden.
Beispiel 5
Stabilitätsuntersuchungen des NS3/4a-Konformationsepitops
Um festzustellen, welche Rolle die Stabilität des NS3/4a-Epitops auf die Ausführung des Tests spielt, wurde die folgende Untersuchung durchgeführt, wobei die NS3/4a-Immunreaktivität, bezogen auf die Zeit, bei Raumtemperatur bestimmt wurde. Kleine Aliquots eines NS3/4a-Stammpräparats ließ man bei Raumtemperatur absetzen, und anschließend wurden sie in Abständen, wie in Tabelle 8 dargestellt, eingefroren. Alle Gläschen wurden gleichzeitig beschichtet und auf zwei frühe NS3-Serokonversions-Panels getestet.
Wie in Tabelle 8 zu sehen ist, ist das NS3/4a-Stammpräparat nicht stabil, wobei die Immunreaktivität mit der Zeit abnimmt. Außerdem ist es für die Immunreaktivität erforderlich, dass die Konformation von NS3/4a aufrechterhalten bleibt.
Weitere Stabilitätsuntersuchungen wurden wie folgt durchgeführt. Zwei monoclonale Konformationsantikörper, die unter Verwendung von Standardverfahren gegen NS3/4a hergestellt wurden, wurden anstelle von Anti-HCV-frühen-Serokonversions-Panels verwendet. Gläschen mit NS3/4a-Stammpräparaten wurden bei Raumtemperatur in Abständen von 3, 6 und 24 Stunden eingefroren. Das NS3/4a aus den gefrorenen Gläschen wurde mit 90 ng/ml beschichtet und unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens getestet. Die Ergebnisse legten nahe, dass die zwei Monoclonalen tatsächlich konformationsgemäß vorlagen, wobei ihre Reaktivität gegenüber einer Bearbeitung des NS3/4a-Antigen-Stammpräparats bei Raumtemperatur empfindlich war. Die Reaktivität eines monoclonalen Antikörpers der positiven Kontrolle änderte sich nicht.
Beispiel 6
Immunreaktivität des NS3/4a-Konformationsepitops zu denaturiertem NS3/4a
Die Immunreaktivität des NS3/4a-Konformationsepitops, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wurde mit NS3/4a verglichen, das durch Zugabe von SDS zu dem NS3/4a-Konformationsepitop-Präparat auf eine Endkonzentration von 2% denaturiert worden war. Das denaturierte NS3/4a und das Konformations-NS3/4a wurden wie vorstehend beschrieben auf Mikrotiterplatten beschichtet. Das c200-Antigen (Hepatology (1992), 15: 19–25, verfügbar in der ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) wurde auch auf Mikrotiterplatten beschichtet. Das c200-Antigen wurde als Vergleich verwendet, wobei angenommen wird, dass es aufgrund des Vorliegens von Reduktionsmittel (DTT) und Detergens (SDS) in seiner Formulierung nicht-konformationsgemäß vorliegt.
Die Immunreaktivität wurde gegenüber zwei frühen HCV-Serokonversions-Panels, PHV 904 und PHV 914 (kommerziell verfügbare menschliche Blutproben von Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA), getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Die Daten legen nahe, dass die denaturierte und linearisierte Form von NS3/4a (und auch c200) frühe Serokonversions-Panels nicht so früh nachweist wie das NS3/4a-Konformationsepitop.
Tabelle 9
Die Immunreaktivität des Konformationsepitops wurde auch unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern gegen NS3/4a getestet, die durch Standardverfahren hergestellt wurden. Diese monoclonalen Antikörper wurden sodann in dem ELISA-Format auf NS3/4a und denaturiertes NS3/4a sowie auf c200-Antigen getestet. Die Daten zeigen, dass die gegen NS3/4a gerichteten monoclonalen Antikörper mit dem NS3/4a und dem denaturierten NS3/4a in ähnlicher Weise wie die Serokonversions-Panels wie in Tabelle 10 dargestellt reagieren. Dieses Ergebnis ist auch ein weiterer Beweis dafür, dass das NS3/4a konformationsgemäß vorliegt, da monoclonale Antikörper hergestellt werden können, die in der Reaktivität ähnlich sind wie die frühen c33c-Serokonversions-Panels.

Claims

Fester Träger für einen Immuntest, umfassend daran gebunden mindestens einen Hepatitis-C-Virus (HCV)-Anti-Core-Antikörper und mindestens ein isoliertes HCV NS3/4a-Epitop.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 1, umfassend daran gebunden mindestens zwei HCV-Anti-Core-Antikörper.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet ist.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 3, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 10–53 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 1, wobei das NS3/4a-Epitop ein Konformationsepitop ist und die Aminosäuresequenz wie in den 4A–4D dargestellt umfasst.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 1, weiter umfassend ein daran gebundenes multiples Epitopfusionsantigen.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 7, wobei das multiple Epitopfusionsantigen die Aminosäuresequenz wie in den 7A–7F dargestellt umfasst.
Fester Träger für einen Immuntest umfassend daran gebunden zwei monoclonale Hepatitis-C-Virus (HCV)-Anti-Core-Antikörper und ein HCV NS3/4a-Konformationsepitop, welches die Aminosäuresequenz wie in den 4A–4D dargestellt umfasst.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 9, wobei die zwei Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sind.
Fester Träger für einen Immuntest nach Anspruch 10, wobei die zwei Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 10–53 von HCV gerichtet sind, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Fester Träger für einen Immuntest, umfassend daran gebunden zwei monoclonale Hepatitis-C-Virus (HCV)-Anti-Core-Antikörper, ein HCV NS3/4a-Konformationsepitop, welches die Aminosäuresequenz wie in den 4A–4D dargestellt umfasst, und ein multiples Epitopfusionsantigen, welches die Aminosäuresequenz wie in den 7A–7F dargestellt umfasst.
Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Träges für einen Immuntest nach Anspruch 1; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an den mindestens einen Anti-Core-Antikörper bzw. das NS3/4a-Epitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als der mindestens eine Anti-Core-Antikörper, welcher an den festen Träger gebunden ist; (ii) eines Antigens, welches mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe, welcher mit dem NS3/4a-Epitop reaktiv ist, reagiert; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit dem Antigen aus (ii) reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet ist, und wobei der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 10–53 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und wobei der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 120–130 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Antigen, welches mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, ein Epitop aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das c33c-Epitop mit einer Aminosäuresequenz der menschlichen Superoxiddismutase (hSOD) fusioniert ist, und wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD- Aminosäuresequenz reaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das NS3/4a-Epitop ein Konformationsepitop ist und die Aminsäuresequenz wie in den 4A–4D dargestellt umfasst.
Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Träges für einen Immuntest nach Anspruch 2; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper bzw. das NS3/4a-Epitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der nachweisbar markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche an den festen Träger gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, welches an eine hSOD-Aminosäuresequenz fusioniert ist; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das NS3/4a-Epitop ein Konformationsepitop ist und die Aminosäuresequenz wie in den 4A–4D dargestellt umfasst.
Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Träges für einen Immuntest nach Anspruch 9; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper bzw. das NS3/4a-Konformationsepitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der nachweisbar markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche an den festen Träger gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, welches an eine hSOD-Aminosäuresequenz fusioniert ist; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sind, und wobei die nachweisbar markierten HCV-Anti-Core-Antikörper gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sind.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 10–53 von HCV gerichtet sind, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und wobei der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 120–130 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Träges für einen Immuntest nach Anspruch 7; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an den mindestens einen Anti-Core-Antikörper, das NS3/4a-Epitop, und das multiple Epitopfusionsantigen zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der nachweisbar markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als der mindestens eine Anti-Core-Antikörper, welcher an den festen Träger gebunden ist; (ii) eines ersten und eines zweiten Antigens, welche mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe, welcher mit dem NS4/4a-Epitop bzw. dem multiplen Epitopfusionsantigen reaktiv ist, reagieren; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit den Antigenen aus (ii) reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet ist, und wobei der erste nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der mindestens eine Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 10–53 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und wobei der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 120–130 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das erste Antigen, welches mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, ein Epitop aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das c33c-Epitop mit einer Aminosäuresequenz der menschlichen Superoxiddismutase (hSOD) fusioniert ist, und wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das zweite Antigen, welches mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe reagiert, ein Epitop aus der c22-Region des HCV-Polyproteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Epitop aus der c22-Region die Aminosäuren Lys₁₀ bis Ser₉₉ des HCV-Polyproteins umfasst, mit einer Deletion von Arg47 und einer Substitution von Leu für Trp an Position 44, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, wobei das Epitop mit einer Aminosäuresequenz der menschlichen Superoxiddismutase (hSOD) fusioniert ist, und wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz reaktiv ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das multiple Epitopfusionsantigen die Aminosäuresequenz wie in den 7A–7F dargestellt umfasst.
Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines festen Träges für einen Immuntest nach Anspruch 12; (b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, das NS3/4a-Konformationsepitop bzw. das multiple Epitopfusionsantigen zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist, wobei der nachweisbar markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche an den festen Träger gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, welches mit einer hSOD-Aminosäuresequenz fusioniert ist, und eines Epitops aus der c22-Region des HCV-Polyproteins, welches mit einer hSOD-Aminosäuresequenz fusioniert ist; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit den hSOD-Aminosäuresequenzen reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden. als Hinweis auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sind, und wobei der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen einen C- terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 10–53 von HCV gerichtet sind, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, und wobei der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper gegen die Aminosäuren 120–130 von HCV gerichtet ist, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Epitop aus der c22-Region die Aminosäuren Lys₁₀ bis Ser₉₉ des HCV-Polyproteins umfasst, mit einer Deletion von Arg47 und einer Substitution Leu für Trp an Position 44, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Immundiagnostisches Testkit umfassend den festen Träger für einen Immuntest nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und Instruktionen zur Durchführung des immundiagnostischen Tests.
Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers für einen Immuntest, umfassend: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers; und (b) das Binden von mindestens einem Hepatitis-C-Virus (HCV)-Anti-Core-Antikörper und mindestens einem isolierten HCV NS3/4a-Konformationsepitop daran.
Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers für einen Immuntest, umfassend: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers; und (b) das Binden von zwei Hepatitis-C-Virus (HCV)-Anti-Core-Antikörpern und einem isolierten HCV NS3/4a-Konformationsepitop daran.
Verfahren nach einem der Ansprüche 38 oder 39, weiter umfassend das Binden von mindestens einem multiplen Epitopfusionsantigen an den festen Träger.