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Technisches Fachgebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein virale Diagnostika. Insbesondere
betrifft die Erfindung einen Antigen/Antikörper-Kombinationstest für die genaue Diagnose einer
Hepatitis-C-Virusinfektion.
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Stand der Technik
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Das
Hepatitis-C-Virus (HCV) ist das auslösende Agens der parenteralen
Non-A-Non-B-Hepatitis (NANBH), die größtenteils durch Bluttransfusion
und Sexualkontakt übertragen
wird. Das Virus liegt bei 0,4 bis 2,0% der Blutspender vor. In etwa
50% der Infektionen entwickelt sich eine chronische Hepatitis, und
hiervon bekommen etwa 20% der infizierten Individuen eine Leberzirrhose,
die manchmal zu einem hepatozellulären Karzinom führt. Demgemäß ist die
Untersuchung und Kontrolle der Krankheit für die Medizin ein wichtiges
Thema.
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HCV
wurde erstmals von Houghten et al. identifiziert und als eine Ursache
der NANBH charakterisiert. Die virale genomische Sequenz von HCV
ist bekannt, wie auch Verfahren, mit denen die Sequenz erhalten werden
kann. Vgl. z. B. Internationale Veröffentlichungen Nr.
WO 89/04669 ;
WO 90/11089 ; und
WO 90/14436 . HCV hat ein 9,5 kb positiv-strängiges (”positive
sense”)
einzelsträngiges
RNA-Genom und ist ein Mitglied der Virusfamilie der Flaviviridae.
Mindestens sechs verschiedene, jedoch verwandte Genotypen von HCV
wurden anhand von phylogenetischen Analysen identifiziert (Simmonds
et al., J. Gen. Virol. (1993), 74: 2391–2399). Das Virus codiert ein
einzelnes Polyprotein, das mehr als 3000 Aminosäurereste aufweist (Choo et
al., Science (1989), 244: 359–362;
Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88: 2451–2455; Han
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991), 88: 1711–1715).
Das Polyprotein wird co- und post-translational zu sowohl Struktur-als auch
Nicht-Struktur-(NS-)Proteinen prozessiert.
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Insbesondere
werden mehrere Proteine durch das HCV-Genom codiert, wie in 1 dargestellt.
Die Reihenfolge und Nomenklatur der Spaltprodukte des HCV-Polyproteins
sind wie folgt: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH.
Eine anfängliche
Spaltung des Polyproteins wird durch Proteasen des Wirts katalysiert,
wodurch drei Strukturproteine, das N-terminale Nucleokapsid-Protein (genannt „Core”) und zwei
Hüll-Glykoproteine, „E1” (auch
als E bekannt) und „E2” (auch
als E2/NS1 bekannt), sowie Nicht-Struktur-(NS-)Proteine, welche
die viralen Enzyme enthalten, freigesetzt werden. Die NS-Bereiche werden
mit NS2, NS3, NS4 und NS5 bezeichnet. NS2 ist ein integrales Membranprotein
mit proteolytischer Aktivität.
NS2 spaltet, entweder alleine oder in Kombination mit NS3, die NS2-NS3-„Sissle”-Bindung,
so dass hierdurch der N-Terminus von NS3 erzeugt wird und ein großes Polyprotein
freigesetzt wird, das sowohl Serin-Protease- als auch RNA-Helicase-Aktivitäten einschließt. Die
NS3-Protease dient dazu, das restliche Polyprotein zu prozessieren.
Der vollständige
Ablauf der Polyprotein-Reifung wird durch eine autokatalytische Spaltung
am NS3-NS4a-Übergang
initiiert, die durch die NS3-Serin-Protease katalysiert wird. Anschließende NS3-vermittelte
Spaltungen des HCV-Polyproteins
scheinen eine Erkennung von Polyprotein-Spaltungs-Übergängen durch ein NS3-Molekül eines
anderen Polypeptids zu beinhalten. In diesen Reaktionen setzt NS3
einen NS3-Cofaktor (NS4a), zwei Proteine (NS4b und NS5a) und eine
RNA-abhängige
RNA-Polymerase (NS5b) frei.
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Eine
Reihe von allgemeinen und spezifischen Polypeptiden wurde beschrieben,
die als immunologische und diagnostische Reagenzien für HCV nützlich sind
und die von dem HCV-Polyprotein stammen. Vgl. z. B. Houghton et
al.,
Europäische Veröffentlichungen Nr. 318 216 und
388 232 ; Choo et al., Science
(1989), 244: 359–362;
Kuo et al., Science (1989), 244: 362–364; Houghton et al., Hepatology
(1991), 14: 381–388;
Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89: 10011–10015;
Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39; Chien
et al., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/00365 ; Chien,
D. Y., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 94/01778 . Diese
Veröffentlichungen
stellen einen umfangreichen Hintergrund über HCV im Allgemeinen und
außerdem über die
Herstellung und Verwendungen von immunologischen Reagenzien des HCV-Polypeptids
bereit.
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Empfindliche
spezifische Methoden zum Durchmustern und Identifizieren von Trägern von
HCV und HCV-verunreinigtem Blut oder Blutprodukten würden einen
wichtigen Fortschritt in der Medizin bedeuten. Eine Post-Transfusions-Hepatitis
(PTH) tritt in etwa 10% der transfundierten Patienten auf, und HCV
wurde für
bis zu 90% dieser Fälle
verantwortlich gemacht. Sowohl für
die Betreuung von Patienten als auch für die Prophylaxe einer Übertragung
von HCV durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen
Kontakt sind eine verlässliche
Diagnose und prognostische Werkzeuge erforderlich. Demgemäß wurden
verschiedene Tests für die
Serodiagnose einer HCV-Infektion entwickelt. Vgl. z. B. Choo et
al., Science (1989), 244: 359–362;
Kuo et al., Science (1989), 244: 362–364; Choo et al., Br. Med.
Bull. (1990), 46: 423–441;
Ebeling et al., Lancet (1990), 335: 982–983; van der Poel et al.,
Lancet (1990), 335: 558–560;
van der Poel et al., Lancet (1991), 337: 317–319; Chien, D. Y., Internationale
Veröffentlichung
Nr.
WO 94/01778 ; Valenzuela
et al., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 97/44469 ; und
Kashiwakuma et al.,
US Patent
Nr. 5 871 904 .
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Ein
signifikantes Problem, das bei einigen Serum-basierten Tests auftritt,
besteht darin, dass zwischen der Infektion und dem Nachweis des
Virus eine signifikante Zeitspanne liegt, die häufig mehr als 80 Tage beträgt. Durch
diese Zeitspanne beim Test kann ein großes Risiko für die Empfänger von
Bluttransfusionen entstehen. Um dieses Problem zu beheben, wurden
Nucleinsäure-basierte
Tests (NAT), die virale RNA direkt nachweisen, und HCV-Core-Antigen-Tests entwickelt,
die virales Antigen anstelle einer Antikörperantwort testen. Vgl. z.
B. Kashiwakuma et al.,
US Patent
Nr. 5 871 904 ; Beld et al., Transfusion (2000), 40: 575–579.
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Jedoch
bleibt noch der Bedarf für
empfindliche, genaue diagnostische und prognostische Werkzeuge, um
sowohl eine adäquate
Versorgung von Patienten bereitzustellen als auch die Übertragung
von HCV durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen
Kontakt zu verhindern.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf dem Ergebnis, dass HCV-Serokonversions-Antikörper typischerweise
gegen Core und gegen NS3 (Helicase) gerichtet sind. Demgemäß stellt
die Erfindung einen festen Träger
für einen
Immuntest bereit, der mindestens einen HCV-Anti-Core-Antikörper und
mindestens ein isoliertes HCV-NS3/4a-Epitop aufweist, die daran
gebunden sind, wobei das NS3/4a-Epitop ein Konformationsepitop ist
und die in den 4A–4D dargestellte
Aminosäuresequenz
aufweist. Der Antikörper
und das NS3/4a-Epitop können
beliebige der hier beschriebenen Moleküle sein. Zusätzlich kann
der feste Träger ein
beliebiges der hier beschriebenen multiplen Epitopfusionsantigene
einschließen,
wie das multiple Epitopfusionsantigen, das die Aminosäuresequenz
wie in den 7A bis 7F dargestellt
umfasst.
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In
bestimmten Ausführungsformen
umfasst der feste Träger
daran gebunden mindestens zwei HCV-Anti-Core-Antikörper. Außerdem kann
der Anti-Core-Antikörper
ein monoclonaler Antikörper
sein.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion
in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen
eines festen Trägers
für einen Immuntest
wie vorstehend beschrieben; (b) das Kombinieren einer biologischen
Probe mit dem festen Träger unter
Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn
in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an den mindestens
einen Anti-Core-Antikörper
bzw. das NS3/4a-Epitop zu binden; (c) das Hinzufügen zum festen Träger aus
Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten
nachweisbar markierten Antikörpers,
wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter HCV-Anti-Core-Antikörper ist,
wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop gerichtet
ist als der mindestens eine Anti-Core-Antikörper, welcher an den festen
Träger
gebunden ist; (ii) eines Antigens, welches mit einem HCV-Antikörper aus
der biologischen Probe, welcher mit dem NS3/4a-Epitop reaktiv ist,
reagiert; und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei
der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit dem Antigen aus (ii)
reaktiv ist; und (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den
Antikörpern
und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis
auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe. Das NS3/4a-Epitop
ist ein Konformationsepitop, das die NS3/4a-Sequenz aufweist, die
in den 4A bis 4D dargestellt
ist.
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In
einer beliebigen der vorstehenden Ausführungsformen kann der Anti-Core-Antikörper gegen
einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein,
wie gegen die Aminosäuren
10 bis 53 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz,
und/oder der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper kann
gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet
sein, wie die Aminosäuren
120 bis 130 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Außerdem
kann das Antigen, das mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe
reagiert, aus der NS3-Region stammen, wie ein Epitop aus der c33c-Region
des HCV-Polyproteins, und es kann mit einer Aminosäuresequenz
der menschlichen Superoxid-Dismutase (hSOD) fusioniert sein. In
dieser Ausführungsform
ist der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz
reaktiv.
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In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion
in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen
eines festen Trägers
für einen Immuntest,
einschließlich
zweier monoclonaler HCV-Anti-Core-Antikörper und eines Konformationsepitops, umfassend
die Aminosäuresequenz
wie in den 4A bis 4D dargestellt;
(b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter
Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn
in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens
zwei Anti-Core-Antikörper
bzw. das NS3/4a-Konformationsepitop
zu binden; (c) das Hinzufügen
zum festen Träger
aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten
nachweisbar markierten Antikörpers,
wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter
HCV-Anti-Core-Antikörper ist,
wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop
gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche
an den festen Träger
gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins, fusioniert
mit einer hSOD-Aminosäuresequenz;
und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei
der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit der hSOD-Aminosäuresequenz
reaktiv ist; das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den Antikörpern und
den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis auf
eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
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In
bestimmten Ausführungsformen
sind die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen einen N-terminalen
Bereich des HCV-Core-Antigens
gerichtet, wie gegen die Aminosäuren
10 bis 53 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz,
und der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper ist gegen
einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet, wie
gegen die Aminosäuren
120 bis 130 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
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In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion
in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen
eines festen Trägers
für einen Immuntest
gemäß der vorliegenden
Erfindung, der ferner ein multiples Epitopfusionsantigen aufweist;
(b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter
Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen und Antikörpern, wenn
in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an den mindestens
einen Anti-Core-Antikörper,
das NS3/4a-Epitop und das multiple Epitopfusionsantigen zu binden;
(c) das Hinzufügen
zum festen Träger
aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten
nachweisbar markierten Antikörpers,
wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter
HCV-Anti-Core-Antikörper ist,
wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop
gerichtet ist als der mindestens eine Anti-Core-Antikörper, welcher
an den festen Träger
gebunden ist; (ii) eines ersten und eines zweiten Antigens, welche
mit einem HCV-Antikörper
aus der biologischen Probe, welcher mit dem NS3/4a-Epitop bzw. dem
multiplen Epitopfusionsantigen reaktiv ist, reagieren; und (iii)
eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei der zweite nachweisbar
markierte Antikörper
mit den Antigenen aus (ii) reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen,
die zwischen den Antikörpern
und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis
auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
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Der
Anti-Core-Antikörper
kann gegen einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein,
und der erste nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper kann
gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet
sein, wie vorstehend beschrieben. Außerdem kann das erste Antigen,
das mit einem HCV-Antikörper
aus der biologischen Probe reagiert, ein Epitop aus der c33c-Region
des HCV-Polyproteins umfassen und mit einer hSOD-Aminosäuresequenz
fusioniert sein. In diesem Zusammenhang ist der zweite nachweisbar
markierte Antikörper
mit der hSOD-Aminosäuresequenz
reaktiv. Außerdem
kann das zweite Antigen, das mit einem HCV-Antikörper aus der biologischen Probe
reagiert, ein Epitop aus der c22-Region des HCV-Polyproteins umfassen,
wie ein Epitop, das die Aminosäuren
Lys10 bis Ser99 des
HCV-Polyproteins umfasst, mit einer Deletion von Arg47 und
einer Substitution von Leu für
Trp an Position 44, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Das Epitop kann mit einer hSOD-Aminosäuresequenz
fusioniert sein. Wenn das so ist, ist der zweite nachweisbar markierte
Antikörper
mit der hSOD-Aminosäuresequenz
reaktiv. Das multiple Epitopfusionsantigen kann die Aminosäuresequenz
wie in den 7A bis 7F dargestellt
umfassen.
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In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer HCV-Infektion
in einer biologischen Proben, wobei das Verfahren umfasst: (a) das
Bereitstellen eines festen Trägers
für einen
Immuntest, der daran gebunden zwei monoclonale HCV-Anti-Core-Antikörper, ein
HCV-NS3/4a-Konformationsepitop, welches die Aminosäuresequenz
wie in den 4A bis 4D dargestellt
umfasst, und ein multiples Epitopfusionsantigen, umfassend die Aminosäuresequenz
wie in den 7A bis 7F dargestellt, umfasst;
(b) das Kombinieren einer biologischen Probe mit dem festen Träger unter
Bedingungen, welche es den HCV-Antigenen
und Antikörpern,
wenn in der biologischen Probe vorhanden, erlauben, an die mindestens zwei
Anti-Core-Antikörper,
das NS3/4a-Konformationsepitop bzw. das multiple Epitopfusionsantigen
zu binden; (c) das Hinzufügen
zum festen Träger
aus Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen (i) eines ersten
nachweisbar markierten Antikörpers,
wobei der erste nachweisbar markierte Antikörper ein nachweisbar markierter
HCV-Anti-Core-Antikörper ist,
wobei der markierte Anti-Core-Antikörper gegen ein anderes HCV-Core-Epitop
gerichtet ist als die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper, welche
an den festen Träger
gebunden sind; (ii) eines Epitops aus der c33c-Region des HCV-Polyproteins,
fusioniert mit einer hSOD-Aminosäuresequenz,
und eines Epitops aus der c22-Region des HCV-Polyproteins, fusioniert
mit einer hSOD-Aminosäuresequenz;
und (iii) eines zweiten nachweisbar markierten Antikörpers, wobei
der zweite nachweisbar markierte Antikörper mit den hSOD-Aminosäuresequenzen
reaktiv ist; (d) das Nachweisen von Komplexen, die zwischen den
Antikörpern
und den Antigenen, falls vorhanden, gebildet wurden, als Hinweis
auf eine HCV-Infektion in der biologischen Probe.
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In
dieser Ausführungsform
können
die mindestens zwei Anti-Core-Antikörper gegen
einen N-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet sein, wie gegen die
Aminosäuren
10 bis 53 von HCV, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz,
und der nachweisbar markierte HCV-Anti-Core-Antikörper ist
gegen einen C-terminalen Bereich des HCV-Core-Antigens gerichtet,
wie gegen die Aminosäuren
120 bis 130 von HCV, nummeriert in Bezug auf das HCV1-Polyproteinsequenz.
Außerdem
kann das Epitop aus der c22-Region
die Aminosäuren
Lys10 bis Ser99 des
HCV-Polyproteins umfassen, mit einer Deletion von Arg47 und einer
Substitution von Leu für
Trp an Position 44, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
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In
anderen Ausführungsformen
betrifft die Erfindung immundiagnostische Testkits, die den vorstehend beschriebenen
festen Träger
für einen
Immuntest umfassen, und Anleitungen zur Durchführung des immundiagnostischen
Tests.
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In
weiteren Ausführungsformen
betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines festen Trägers für einen
Immuntest, die umfassen: (a) das Bereitstellen eines festen Trägers und
(b) das Binden mindestens eines HCV-Anti-Core-Antikörpers, wie
etwa von einem oder zwei oder mehr solchen Antikörpern, und mindestens eines
isolierten HCV-NS3/4a-Konformationsepitops hieran, das die in den 4A–4D dargestellte Aminosäuresequenz
aufweist, und gegebenenfalls eines multiplen Epitopfusionsantigens
hieran. Die Anti-Core-Antikörper
und die multiplen Epitopfusionsantigene sind wie vorstehend beschrieben.
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Diese
und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung
der folgenden genauen Beschreibung und der angefügten Zeichnungen klar ersichtlich.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine diagrammartige Darstellung des HCV-Genoms, in der die verschiedenen
Regionen des Polyproteins angegeben sind, von denen die vorliegenden
Testreagenzien (Proteine und Antikörper) hergeleitet sind.
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2 ist
eine schematische Zeichnung eines repräsentativen Antikörper/Antigen-Kombinationstests gemäß der Erfindung.
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3 zeigt
die Aminosäuresequenz
eines NS3/4a-Konformationsantigens.
Das hervorgehobene Alanin an Position 182 ist für das native Serin, das normalerweise
an dieser Position vorliegt, substituiert.
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Die 4A bis 4D zeigen
die DNA- und die entsprechende Aminosäuresequenz eines NS3/4a-Konformationsantigens
zur Verwendung in den vorliegenden Tests. Die Aminosäuren an
den Positionen 403 und 404 der 4A bis 4D stellen
Substitutionen von Pro für
Thr und Ile für
Ser der nativen Aminosäuresequenz
von HCV-1 dar.
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5 ist
eine schematische Darstellung der Konstruktion von pd.HCV1a.ns3ns4aPI.
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6 ist
eine schematische Darstellung von MEFA 12.
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Die 7A bis 7E zeigen die DNA- und die entsprechende
Aminosäuresequenz
von MEFA 12.
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8 ist
eine schematische Darstellung eines repräsentativen Immuntests gemäß der Erfindung
unter Verwendung von MEFA 12.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Bei
der Durchführung
der vorliegenden Erfindung werden, sofern nichts anderes angegeben
ist, herkömmliche
Verfahren der Chemie, Biochemie, DNA-Rekombinationstechnik und Immunologie
eingesetzt, die dem Fachmann geläufig
sind. Solche Verfahren werden in der Literatur vollständig erklärt. Vgl.
z. B. „Fundamental
Virology”,
2. Aufl., Bd. I und II (B. N. Fields and D. M. Knipe, Hrsg.); ”Handbook
of Experimental Immunology”,
Bd. I bis IV (D. M: Weir und C. C. Blackwell, Hrsg., Blackwell Scientific
Publications); T. E.
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Creighton, ”Proteins:
Structures and Molecular Properties” (W. H. Freeman and Company,
1993); A. L. Lehninger, ”Biochemistry” (Worth
Publisher, Inc., aktuelle Auflage); Sambrook et al., ”Molecular
Cloning: A Laboratory Manual” (2.
Aufl., 1989); ”Methods
in Enzymology” (S.
Colowick und N. Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc.).
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Es
muss angemerkt werden, dass die in dieser Beschreibung und den angefügten Patentansprüchen verwendeten
Singularformen ”ein”, ”eine” und ”der”, ”die”, ”das” mehrere
Vertreter einschließen
sofern aus dem Zusammenhang nicht eindeutig etwas anderes hervorgeht.
So schließt
z. B. der Bezug auf ”ein
Antigen” ein Gemisch
aus zwei oder mehreren Antigenen ein, und dergleichen.
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Die
folgenden Abkürzungen
für Aminosäuren werden
im ganzen Text verwendet:
Alanin:
Ala (A) | Arginin:
Arg (R) |
Asparagin:
Asn (N) | Asparaginsäure: Asp
(D) |
Cystein:
Cys (C) | Glutamin:
Gln (Q) |
Glutaminsäure: Glu
(E) | Glycin:
Gly (G) |
Histidin:
His (H) | Isoleucin:
Ile (I) |
Leucin:
Leu (L) | Lysin:
Lys (K) |
Methionin:
Met (M) | Phenylalanin:
Phe (F) |
Prolin:
Pro (P) | Serin:
Ser (S) |
Threonin:
Thr (T) | Tryptophan:
Trp (W) |
Tyrosin:
Tyr (Y) | Valin:
Val (V) |
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I. Definitionen
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Beim
Beschreiben der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe
verwendet und sollen wie nachstehend angegeben definiert sein.
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Die
Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” beziehen
sich auf ein Polymer von Aminosäureresten
und sind nicht auf eine minimale Länge des Produkts beschränkt. Somit
sind Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und dergleichen in
der Definition eingeschlossen. Sowohl vollständige Proteine als auch Fragmente
davon sind in der Definition enthalten. Außerdem schließen die
Begriffe Postexpressions-Modifikationen des Polypeptids, z. B. Glykosylierung,
Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen, ein. Weiterhin bezieht
sich ein ”Polypeptid” für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung auf ein Protein, das Modifikationen,
wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativer
Natur), an der nativen Sequenz einschließt, so lange das Protein die
gewünschte
Aktivität
beibehält.
Diese Modifikationen können
gezielt erfolgen, wie durch eine stellenspezifische Mutagenese,
oder sie können
zufällig
erfolgen, wie durch Mutationen von Wirten, welche die Proteine produzieren,
oder durch Fehler aufgrund von PCR-Amplifikation.
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Ein
HCV-Polypeptid ist ein Polypeptid wie vorstehend definiert, das
von dem HCV-Polyprotein hergeleitet ist. Das Polypeptid muss nicht
physikalisch von HCV hergeleitet werden, sondern es kann synthetisch oder
rekombinant produziert werden. Außerdem kann das Polypeptid
von einem beliebigen der verschiedenen HCV-Stämme,
wie von den Stämmen
1, 2, 3 oder 4 von HCV, stammen. Eine Reihe von konservierten und variablen
Regionen zwischen diesen Stämmen
sind bekannt, und im Allgemeinen weisen die Aminosäuresequenzen
von Epitopen, die von diesen Regionen stammen, einen hohen Grad
an Sequenzhomologie auf, z. B. eine Aminosäuresequenzhomologie von mehr
als 30%, vorzugsweise von mehr als 40%, wenn ein Alignment der zwei
Sequenzen erfolgt. So bezieht sich z. B. der Begriff ”NS3/4a”-Polypeptid
auf natives NS3/4a aus einem beliebigen der verschiedenen HCV-Stämme sowie
auf NS3/4a-Analoga, Muteine und immunogene Fragmente, wie nachstehend
noch definiert. Die vollständigen
Genotypen von vielen dieser Stämme
sind bekannt. Vgl. z. B.
US Patent
Nr. 6 150 087 und GenBank Hinterlegungsnummern AJ238800
und AJ238799.
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Die
Begriffe ”Analogon” und ”Mutein” beziehen
sich auf biologisch aktive Derivate des Referenzmoleküls oder
auf Fragmente solcher Derivate, welche die gewünschte Aktivität, wie die
Immunreaktivität
in den hier beschriebenen Tests, beibehalten. Im Allgemeinen bezieht
sich der Begriff ”Analogon” auf Verbindungen, die
eine native Polypeptidsequenz und Struktur mit einer oder mehreren
Aminosäure-Additionen,
Substitutionen (im Allgemeinen konservativer Natur) und/oder Deletionen,
bezogen auf ihr natives Molekül,
aufweisen, so lange die Modifikationen die immunogene Aktivität nicht
zerstören.
Der Begriff ”Mutein” bezieht
sich auf Peptide, die einen oder mehrere Peptid-Nachahmer aufweisen
(”Peptoide”), wie
diejenigen, die in der internationalen Veröffentlichung Nr.
WO 91/04282 beschrieben sind. Vorzugsweise
hat das Analogon oder Mutein mindestens die gleiche Immunaktivität wie das
native Molekül.
Verfahren zum Herstellen von Polypeptidanaloga und Muteinen sind
auf dem Fachgebiet bekannt und werden nachstehend beschrieben.
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Besonders
bevorzugte Analoga schließen
Substitutionen ein, die konservativer Natur sind, d. h. solche Substitutionen,
die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die in ihren
Seitenketten verwandt sind. Insbesondere werden Aminosäuren allgemein
in vier Familien eingeteilt: (1) saure – Aspartat und Glutamat; (2)
basische – Lysin,
Arginin, Histidin; (3) nichtpolare – Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin,
Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladene
polare – Glycin,
Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin,
Tryptophan und Tyrosin werden manchmal als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Z.
B. kann man voraussagen, dass ein isoliertes Ersetzen von Leucin
durch Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat,
eines Threonins durch ein Serin oder ein ähnliches konservatives Ersetzen
einer Aminosäure
durch eine strukturell verwandte Aminosäure keinen entscheidenden Effekt
auf die biologischen Aktivität
haben wird. Z. B. kann das Polypeptid von Interesse bis zu etwa
5 bis 10 konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubsitutionen
oder sogar bis zu etwa 15 bis 25 konservative oder nicht-konservative
Aminosäuresubstitutionen
oder eine Zahl zwischen 5 und 25 einschließen, so lange die gewünschte Funktion
des Moleküls
intakt bleibt. Der Fachmann kann ohne Weiteres Bereiche des Moleküls von Interesse
bestimmen, welche eine Änderung
tolerieren können,
indem er auf Hopp/Woods- und Kyte-Doolittle-Plots Bezug nimmt, die
auf dem Fachgebiet bekannt sind.
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Mit ”Fragment” ist ein
Polypeptid gemeint, das nur aus einem Teil der intakten vollständigen Polypeptidsequenz
und Struktur besteht. Das Fragment kann eine C-terminale Deletion
und/oder eine N-terminale Deletion des nativen Polypeptids einschließen. Ein ”immunogenes
Fragment” eines
bestimmten HCV-Proteins wird im Allgemeinen mindestens etwa 5 bis
10 aneinandergrenzende Aminosäurereste
des vollständigen
Moleküls,
vorzugsweise mindestens etwa 15 bis 25 aneinandergrenzende Aminosäurereste
des vollständigen Moleküls und am
stärksten
bevorzugt mindestens etwa 20 bis 50 oder mehr aneinandergrenzende
Aminosäurereste
des vollständigen
Moleküls,
welche ein Epitop definieren, oder eine Zahl zwischen fünf Aminosäuren und
der vollständigen
Sequenz, einschließen,
mit der Maßgabe,
dass das betreffende Fragment die Immunreaktivität in den hier beschriebenen
Tests beibehält.
Z. B. schließen
bevorzugte immunogene Fragmente ein, sind jedoch nicht beschränkt auf
Fragmente von HCV-Core, umfassend z. B. die Aminosäuren 10
bis 45, 10 bis 53, 67 bis 88 und 120 bis 130 des Polyproteins, Epitop
5-1-1 (in der NS3-Region des viralen Genoms) und außerdem definierte
Epitope, die von den Regionen E1, E2, c33c (NS3), c100 (NS4), NS3/4a
und NS5 des HCV-Polyproteins stammen, sowie beliebige der anderen
verschiedenen identifizierten Epitope aus dem HCV-Polyprotein. Vgl.
z. B. Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011–10015;
Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39: Chien
et al., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/00365 ; Chien, D.
Y., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 94/01778 ;
US Patente Nr. 6 150 087 und
6 121 020 .
-
Der
wie hier verwendete Begriff ”Epitop” bezieht
sich auf eine Sequenz von mindestens etwa 3 bis 5, vorzugsweise
etwa 5 bis 10 oder 15 und nicht mehr als etwa 1000 Aminosäuren (oder
eine Zahl dazwischen), die eine Sequenz definieren, die selbst oder
als Teil einer größeren Sequenz
an einen Antikörper
bindet, der als Antwort auf eine solche Sequenz hervorgebracht wird.
Es gibt keine kritische obere Grenze für die Länge des Fragments, das annähernd die
vollständige
Länge der
Proteinsequenz oder sogar ein Fusionsprotein, umfassend zwei oder
mehrere Epitope aus dem HCV-Polyprotein, umfassen kann. Ein Epitop
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht auf ein Polypeptid
beschränkt,
welches die exakte Sequenz des Teils des parentalen Proteins aufweist,
aus dem es hergeleitet ist. Tatsächlich
liegen Virusgenome in einem Zustand eines konstanten Flusses vor
und enthalten mehrere variable Domänen, die ein relativ hohes
Ausmaß an
Variabilität
zwischen Isolaten zeigen. Somit umfasst der Begriff ”Epitop” Sequenzen,
die zu der nativen Sequenz identisch sind, und außerdem Modifikationen
der nativen Sequenz, wie Deletionen, Additionen und Substitutionen
(im Allgemeinen konservativer Natur).
-
Regionen
eines bestimmten Polypeptids, die ein Epitop umfassen, können identifiziert
werden, indem beliebige Epitop-Kartierungstechniken
verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z. B. ”Epitope
Mapping Protocols”,
in: ”Methods
in Molecular Biology”,
Bd. 66 (Glenn, E. Morris, Hrsg., 1996), Humana Press, Totowa, New
Jersey. Z. B. können
lineare Epitope bestimmt werden, indem z. B. gleichzeitig eine große Zahl
von Peptiden auf festen Trägern
synthetisiert werden, wobei die Peptide Teilen des Proteinmoleküls entsprechen,
und indem die Peptide sodann mit Antikörpern umgesetzt werden, während die
Peptide noch an den Trägern
angeheftet sind. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt
und werden z. B. beschrieben im
US
Patent Nr. 4 708 871 ; Geysen et al., (1984), Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 3998–4002;
Geysen et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 178–182; Geysen
et al. (1986), Molec. Immunol. 23: 709–715.
-
Unter
Verwendung solcher Verfahren wurde eine Reihe von Epitopen von HCV
identifiziert. Vgl. z. B. Chien et al., ”Viral Hepatitis and Liver
Disease”,
(1994), S. 320–324,
und weiterhin nachstehend. Genauso werden Konformationsepitope einfach
identifiziert, indem die räumliche
Konformation von Aminosäuren
bestimmt wird, wie z. B. durch Röntgenkristallographie
und zweidimensionale magnetische Kernresonanz. Vgl. z. B. ”Epitop
Mapping Protocols”,
vorstehend. Antigene Bereiche von Proteinen können auch identifiziert werden, indem
herkömmliche
Antigenitäts-
und Hydropathie-Darstellungen verwendet werden, wie solche, die
unter Verwendung z. B. des Softwareprogramms Omiga Version 1.0 berechnet
werden, das von der Oxford Molecular Group verfügbar ist. Dieses Computerprogramm
nutzt das Hopp/Woods-Verfahren, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1981), 78: 3824–3828,
zum Bestimmen von Antigenitäts-Profilen
und das Kyte-Doolittle-Verfahren
für Hydropathie-Darstellungen,
Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982), 157: 105–132.
-
Der
wie hier verwendete Begriff ”Konformationsepitop” bezieht
sich auf einen Teil eines vollständigen Proteins
oder ein Analogon oder Mutein davon, der/das Strukturmerkmale aufweist,
die zu der Aminosäuresequenz,
welche das Epitop innerhalb des vollständigen natürlichen Proteins codiert, nativ
sind. Native Strukturmerkmale schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf Glykosylierung und dreidimensionale Struktur. Die Länge der
Epitop-definierenden Sequenz kann großen Variationen unterliegen,
da man annimmt, dass diese Epitope durch die dreidimensionale Gestalt
des Antigens (z. B. die Faltung) gebildet werden. Somit können Aminosäuren, welche
das Epitop definieren, in einer relativ kleinen Zahl vorliegen,
jedoch entlang der Länge des
Moleküls
(oder sogar auf verschiedenen Molekülen im Fall von Dimeren, usw.)
stark verteilt sein, wobei sie durch Faltung in eine korrekte Epitopkonformation
gebracht werden. Die Teile des Antigens zwischen den Resten, welche
das Epitop definieren, sind möglicherweise
für die
Konformationsstruktur des Epitops nicht kritisch. Z. B. kann es
sein, dass eine Deletion oder Substitution dieser dazwischen liegenden
Sequenzen das Konformationsepitop nicht beeinflusst, vorausgesetzt,
dass Sequenzen, die für
die Epitopkonformation kritisch sind, erhalten bleiben (z. B. Cysteine,
die an einer Disulfidbindung beteiligt sind, Glykosylierungsstellen
usw.).
-
Konformationsepitope,
die in der NS3/4a-Region vorliegen, werden unter Verwendung der
vorstehend besprochenen Verfahren ohne Weiteres identifiziert. Außerdem kann
das Vorliegen oder die Abwesenheit eines Konformation sepitops in
einem bestimmten Polypeptid einfach bestimmt werden, indem das Antigen
von Interesse mit einem Antikörper
(polyclonales Serum oder monoclonaler Antikörper gegen das Konformationsepitop)
durchgemustert wird und seine Reaktivität mit derjenigen einer denaturierten
Version des Antigens verglichen wird, bei der nur lineare Epitope
erhalten bleiben (falls vorhanden). Bei einem solchen Screening
unter Verwendung polyclonaler Antikörper kann es vorteilhaft sein,
das polyclonale Serum zuerst mit dem denaturierten Antigen zu absorbieren
und zu sehen, ob es Antikörper
gegen das Antigen von Interesse zurückhält. Außerdem wird, im Fall von NS3/4a,
ein Molekül,
das die native Konformation beibehält, auch Protease- und gegebenenfalls
Helicase-Enzymaktivitäten
aufweisen. Solche Aktivitäten
können
unter Verwendung von Enzymtests wie nachstehend beschrieben nachgewiesen
werden.
-
Vorzugsweise
wird ein Konformationsepitop rekombinant hergestellt und in einer
Zelle exprimiert, aus der es unter Bedingungen extrahiert werden
kann, bei denen seine gewünschten
Strukturmerkmale bestehen bleiben, z. B. ohne Denaturierung des
Epitops. Solche Zellen schließen
Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugerzellen ein. Die Expression
und die Isolierung rekombinanter Konformationsepitope aus dem HCV-Polyprotein
sind z. B. in den. Internationalen Veröffentlichungen Nr.
WO 96/04301 ,
WO 94/01778 ,
WO 95/33053 ,
WO 92/08734 beschrieben. Alternativ
ist es möglich,
die Antigene zu exprimieren und weiterhin das Protein nach der Gewinnung
zu renaturieren. Außerdem
ist es so zu verstehen, dass auch durch eine chemische Synthese
Konformationsantigen-Mimitope bereitgestellt werden können, die
mit dem Konformationsepitop des ”nativen” Antigens kreuzreagieren.
-
Der
wie hier verwendete Begriff ”multiples
Epitopfusionsantigen” oder ”MEFA” steht
für ein
Polypeptid, in dem multiple HCV-Antigene
Teil einer einzelnen fortlaufenden Kette von Aminosäuren sind,
wobei die Kette nicht in der Natur vorkommt. Die HCV-Antigene können direkt
miteinander durch Peptidbindungen verbunden sein, oder sie können durch
dazwischen liegende Aminosäuresequenzen
getrennt sein. Die Fusionsantigene können auch Sequenzen enthalten,
die in Bezug auf das HCV-Polyprotein exogen sind. Außerdem können die vorliegenden
HCV-Sequenzen von mehreren Genotypen und/oder Isolaten von HCV stammen.
Beispiele von bestimmten MEFAs zur Verwendung in den vorliegenden
Immuntests sind z. B. ausführlich
beschrieben in der Internationalen Veröffentlichung Nr.
WO 97/44469 und werden nachstehend
noch weiter beschrieben.
-
”Antikörper” steht
für ein
Molekül,
das durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an ein
Polypeptid von Interesse bindet. Somit ist ein HCV-Core-Antikörper ein
Molekül,
das spezifisch an das HCV-Core-Protein bindet. Der wie hier verwendete
Begriff ”Antikörper” schließt Antikörper ein,
die sowohl aus polyclonalen als auch aus monoclonalen Präparaten
erhalten wurden, sowie die folgenden: hybride (chimäre) Antikörpermoleküle (vgl.
z. B. Winter et al., (1991), Nature 349: 293–299; und
US Patent Nr. 4 816 567 ; F(ab')
2 und F(ab)-Fragmente;
Fv-Moleküle
(nicht-kovalente Heterodimere, vgl. z. B. Inbar et al., (1972),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659–2662; und Ehrlich et al.,
(1980), Biochem. 19: 4091–4096);
Einzelketten-Fv-Moleküle
(sFv) (vgl. z. B. Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 5879–5883);
dimere und trimere Antikörperfragmentkonstrukte;
Minibodies (vgl. z. B. Pack et al., (1992), Biochem. 31: 1579–1584; Cumber
et al., (1992), J. Immunology 149B: 120–126); humanisierte Antikörpermoleküle (vgl.
z. B. Riechmann et al., (1988), Nature 332: 323–327; Verhoeyan et al., (1988),
Science 239: 1534–1536;
und U.K. Patent Veröffentlichung
Nr.
GB 2 276 169 , veröffentlicht
am 21. September 1994); und beliebige funktionelle Fragmente, die
aus solchen Molekülen
erhalten werden, wobei solche Fragmente die immunologischen Bindungseigenschaften
des parentalen Antikörpermoleküls beibehalten.
-
Der
wie hier verwendete Begriff ”monoclonaler
Antikörper” bezieht
sich auf eine Antikörperzusammensetzung,
die eine homogene Antikörperpopulation
aufweist. Der Begriff ist nicht hinsichtlich der Art oder der Quelle
des Antikörpers
eingeschränkt,
außerdem
soil er nicht durch die Art und Weise eingeschränkt sein, durch die er gemacht
wird. Somit umfasst der Begriff Antikörper, die aus murinen Hybridomen
erhalten werden, und außerdem
menschliche monoclonale Antikörper,
die unter Verwendung menschlicher, und nicht muriner Hybridome erhalten
werden. Vgl. z. B. Cote et al., ”Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy”,
Alan R. Liss, 1985, S. 77.
-
Ein ”rekombinantes” Protein
ist ein Protein, das die gewünschte
Aktivität
beibehält
und das durch DNA-Rekombinationstechniken wie hier beschrieben hergestellt
wurde. Im Allgemeinen wird das Gen von Interesse cloniert und danach
in transformierten Organismen exprimiert, wie nachstehend noch weiter
beschrieben. Der Wirtsorganismus exprimiert das fremde Gen unter
Expressionsbedingungen, wodurch das Protein produziert wird.
-
Mit ”isoliert” ist gemeint,
wenn es sich auf ein Polypeptid bezieht, dass das angegebene Molekül getrennt
und einzeln von dem ganzen Organismus, mit dem das Molekül in der
Natur zusammen gefunden wird, vorliegt oder dass es im Wesentlichen
in Abwesenheit von anderen biologischen Makromolekülen des
gleichen Typs vorliegt. Der Begriff ”isoliert” bezieht sich hinsichtlich
eines Polynucleotids auf ein Nucleinsäuremolekül, dem insgesamt oder teilweise
Sequenzen fehlen, mit denen es normalerweise in der Natur assoziiert
ist; oder auf eine Sequenz, wie sie in der Natur existiert, die
jedoch heterologe Sequenzen in Assoziation damit aufweist; oder
auf ein Molekül,
das aus dem Chromosom abgetrennt ist.
-
Mit ӊquivalente
antigene Determinante” ist
eine antigene Determinante aus anderen Unterarten oder Stämmen von
HCV, wie aus den Stämmen
1, 2 oder 3 von HCV, gemeint. Insbesondere sind Epitope bekannt, wie
5-1-1, und solche Epitope variieren zwischen den Stämmen 1,
2 und 3. Somit handelt es sich beim Epitop 5-1-1 aus den drei verschiedenen
Stämmen
um äquivalente
antigene Determinanten und deshalb um ”Kopien”, obwohl ihre Sequenzen nicht
identisch sind. Im Allgemeinen werden die Aminosäuresequenzen äquivalenter
antigener Determinanten einen hohen Grad an Sequenzhomologie aufweisen,
z. B. eine Aminosäure-Sequenzhomologie
von mehr als 30%, vorzugsweise von mehr als 40%, wenn ein Alignment
der zwei Sequenzen erfolgt.
-
”Homologie” bezieht
sich auf die prozentuale Ähnlichkeit
zwischen zwei Polynucleotid- oder zwei Polypeptideinheiten. Zwei
DNA- oder zwei Polypeptidsequenzen sind ”im Wesentlichen homolog” zueinander, wenn
die Sequenzen eine Sequenzähnlichkeit über eine
definierte Länge
der Moleküle
von mindestens etwa 50%, vorzugsweise von mindestens etwa 75%, stärker bevorzugt
von mindestens etwa 80 bis 85%, vorzugsweise von mindestens etwa 90%
und am stärksten
bevorzugt von mindestens etwa 95 bis 98% aufweisen. Im Wesentlichen
homolog, wie hier verwendet, bezieht sich auch auf Sequenzen, die
eine vollständige
Identität zu
der spezifizierten DNA- oder Polypeptidsequenz zeigen.
-
Im
Allgemeinen bezieht sich ”Identität” auf eine
exakte Nucleotid-zu-Nucleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Übereinstimmung von zwei Polynucleotiden
bzw. Polypeptidsequenzen. Eine prozentuale Identität kann durch
einen direkten Vergleich der Sequenzinformationen zwischen zwei
Molekülen
bestimmt werden, indem ein Alignment der Sequenzen erfolgt, die
exakte Zahl von Übereinstimmungen
zwischen den zwei alignierten Sequenzen gezählt wird, durch die Länge der
kürzeren
Sequenz geteilt wird und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird.
-
Einfach
verfügbare
Computerprogramme können
verwendet werden, um die Analyse der Ähnlichkeit und Identität zu unterstützen, wie
ALIGN, Dayhoff, M. O., in: ”Atlas
of Protein Sequence and Structure”, M. O. Dayhoff, Hrsg., 5
Suppl. 3: 353–358,
National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, wobei der lokale
Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, Advances in Appl.
Math. 2: 482–489,
1981, für
die Peptidanalyse angepasst wird. Programme zum Bestimmen der Ähnlichkeit
und Identität
von Nucleotidsequenzen sind verfügbar
in Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (verfügbar von
Genetics Computer Group, Madison, WI), z. B. die Programme BESTFIT,
FASIA und GAP, die auch auf dem Algorithmus von Smith und Waterman
beruhen. Diese Programme werden einfach mit den Standardparametern
eingesetzt, die vom Hersteller empfohlen und in dem vorstehend angesprochenen
Wisconsin Sequence Analysis Package beschrieben sind. Z. B. kann
eine prozentuale Ähnlichkeit
einer bestimmten Nucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz bestimmt
werden, indem der Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman mit
einer Standard-Bewertungstabelle und einem ”Gap Penalty” von sechs
Nucleotidpositionen eingesetzt wird.
-
Ein
weiteres Verfahren zur Feststellung einer prozentualen Ähnlichkeit
im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung
des MPSRCH-Pakets von Programmen, Copyright der University of Edinburgh,
entwickelt von John F. Collins und Shane S. Sturrok, und vertrieben
von IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Bei dieser Reihe
von Paketen kann der Smith-Waterman-Algorithmus
angewendet werden, wobei für
die Bewertungstabelle Standardparameter verwendet werden (z. B. „gap open
penalty” von 12, „gap extension
penalty” von
1 und eine Lücke
(„gap”) von sechs).
Der aus den Daten erzeugte „Übereinstimmungs”-Wert („match
value”)
spiegelt die „Sequenzähnlichkeit” wider.
Andere geeignete Programme zum Berechnen der prozentualen Identität oder Ähnlichkeit
zwischen Sequenzen sind im Allgemeinen auf dem Fachgebiet bekannt,
z. B. ist BLAST ein anderes Alignment-Programm, das mit Standardparametern
verwendet wird. Z. B. können
BLASTN und BLASTP unter Verwendung der folgenden Standardparameter
eingesetzt werden: genetischer Code = Standard; Filter = keines;
Strang = beide; Ausschluss = 60; Erwartung = 10; Matrix = BLOSUM62;
Beschreibungen = 50 Sequenzen; Sortiert durch = HIGH SCORE; Datenbanken
= nicht-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS Translations
+ Swiss Protein + Spupdate + PIR. Einzelheiten dieser Programme
finden sich unter der folgenden Internet-Adresse: http://www.ncbi.nlm.gov/cgibin/BLAST.
-
Alternativ
kann eine Homologie bestimmt werden, indem eine Hybridisierung von
Polynucleotiden unter Bedingungen, die stabile Doppelstränge zwischen
homologen Regionen bilden, erfolgt, worauf die Spaltung mit Einzelstrang-spezifischer
Nuclease(n) und eine Größenbestimmung
der gespaltenen Fragmente folgen. DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen homolog
sind, können
in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter z. B. stringenten
Bedingungen, wie sie für
dieses bestimmte System definiert sind, identifiziert werden. Das
Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist auf dem Fachgebiet
bekannt. Vgl. z. B. Sambrook et al., vorstehend; ”DNA Cloning”, vorstehend; ”Nucleic
Acid Hybridisation”,
vorstehend.
-
Eine ”codierende
Sequenz” oder
eine Sequenz, die ein ausgewähltes
Polypeptid ”codiert”, ist ein
Nucleinsäuremolekül, das in
vitro oder in vivo transkribiert (im Fall von DNA) und zu einem
Polypeptid translatiert wird (im Fall von RNA), wenn es unter die
Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die
Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Start-Codon am
5'-Ende (Aminoende)
und ein Translations-Stopp-Codon am 3'-Ende (Carboxyende) bestimmt. Eine Transkriptions-Terminations-Sequenz
kann 3' zur codierenden
Sequenz liegen.
-
”Funktionell
verbunden” bezieht
sich auf eine Anordnung von Elementen, wobei die auf diese Weise beschriebenen
Komponenten so konfiguriert sind, dass sie ihre gewünschte Funktion
ausüben.
Somit ist ein bestimmter Promotor, der mit einer codierenden Sequenz
funktionell verbunden ist, in der Lage, die Expression der codierenden
Sequenz zu bewirken, wenn die richtigen Transkriptionsfaktoren usw.
vorliegen. Der Promotor muss nicht an die codierenden Sequenz angrenzen,
so lange er so funktioniert, dass er ihre Expression steuert. So
können
z. B. dazwischen liegende untranslatierte, jedoch transkribierte
Sequenzen zwischen der Promotorsequenz und der codierenden Sequenz
vorliegen, wie transkribierte Introns, und die Promotorsequenz kann
immer noch als mit der codierenden Sequenz ”funktionell verbunden” angesehen
werden.
-
Ein ”Kontrollelement” bezieht
sich auf eine Polynucleotidsequenz, welche die Expression einer
codierenden Sequenz, mit der es verbunden ist, unterstützt. Der
Begriff schließt
Promotoren, Transkriptions-Terminations-Sequenzen, stromaufwärts liegende
regulatorische Domänen,
Polyadenylierungssignale, untranslatierte Regionen, einschließlich 5'-UTRs und 3'-UTRs, und gegebenenfalls
Leadersequenzen und Enhancer ein, die zusammen die Transkription und
Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle ermöglichen.
-
Ein ”Promotor” wie hier
verwendet ist eine regulatorische DNA-Region, die in der Lage ist, RNA-Polymerase
in einer Wirtszelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts liegenden
(3'-Richtung) codierenden
Sequenz, die hiermit funktionell verbunden ist, zu initiieren. Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung schließt eine Promotorsequenz die
Mindestzahl von Basen oder Elementen ein, die erforderlich sind,
um die Transkription eines Gens von Interesse in Spiegeln, die über dem
Hintergrund nachweisbar sind, zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz
liegt eine Transkriptions-Initiationsstelle, und außerdem Protein-Bindungsdomänen (Konsensussequenzen),
die für
die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren
werden häufig,
jedoch nicht immer, ”TATA”-Boxen
und ”CAT”-Boxen
enthalten.
-
Eine
Kontrollsequenz ”steuert
die Transkription” einer
codierenden Sequenz in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase an die
Promotorsequenz bindet und die codierende Sequenz in mRNA transkribiert,
die sodann in das Polypeptid translatiert wird, das durch die codierende
Sequenz codiert wird.
-
”Expressionskassette” oder ”Expressionskonstrukt” bezieht
sich auf eine Anordnung, die in der Lage ist, die Expression der
Sequenz(en) oder Gen(e) von Interesse zu steuern. Die Expressionskassette
schließt Kontrollelemente,
wie vorstehend beschrieben, ein, wie einen Promotor, der mit der
Sequenz (den Sequenzen) oder dem Gen (den Genen) von Interesse funktionell
verbunden ist (so dass die Transkription hiervon gesteuert wird),
und schließt
häufig
außerdem
eine Polyadenylierungssequenz ein. In bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung kann die hier beschriebene Expressionskassette innerhalb
eines Plasmidkonstrukts enthalten sein. Das Plasmidkonstrukt kann
zusätzlich
zu den Komponenten der Expressionskassette auch noch einen oder mehrere
selektierbare Marker, ein Signal, das ermöglicht, dass das Plasmidkonstrukt
als einzelsträngige
DNA vorliegt (z. B. einen M13-Replikationsursprung),
mindestens eine multiple Clonierungsstelle und einen ”Säuger”-Replikationsursprung
(z. B. einen SV40- oder Adenovirus-Replikationsursprung) einschließen.
-
”Transformation” bezieht
sich wie hier verwendet auf die Insertion eines exogenen Polynucleotids
in eine Wirtszelle, unabhängig
von der für
die Insertion verwendeten Verfahren: z. B. Transformation durch
direkte Aufnahme, Transfektion, Infektion und dergleichen. Für bestimmte
Verfahren der Transfektion, vgl. noch weiter nachstehend. Das exogene
Polynucleotid kann als ein nicht-eingebauter
Vektor aufrechterhalten bleiben, z. B. ein Episom, oder alternativ
kann es in das Wirtsgenom eingebaut werden.
-
Eine ”Wirtszelle” ist eine
Zelle, die durch eine exogene DNA-Sequenz transformiert wurde oder die
zu einer Transformation hierdurch in der Lage ist.
-
ӆblicher
fester Träger” bedeutet
eine einzelne feste Matrix, an die die in den vorliegenden Immuntests verwendeten
HCV-Polypeptide
kovalent oder durch nicht-kovalente Mittel, wie hydrophobe Adsorption,
gebunden sind.
-
”Immunologisch
reaktiv” bedeutet,
dass das betreffende Antigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern, die
in einer biologischen Probe von einem HCV-infizierten Individuum
vorliegen, reagieren wird.
-
”Immunkomplex” bedeutet
eine Kombination, die gebildet wird, wenn ein Antikörper an
ein Epitop oder ein Antigen bindet.
-
Eine ”biologische
Probe” wie
hier verwendet bezieht sich auf eine Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, die
aus einem Individuum isoliert wurde, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf
z. B. Blut, Plasma, Serum, Fäzes,
Urin, Knochenmark, Galle, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit,
Proben der Haut, Ausscheidungen der Haut, des Respriations-, Intestinal-
und Urogenitaltrakts, Tranen, Speichel, Milch, Blutzellen, Organe,
Biopsien und auch Proben von Bestandteilen von in vitro-Zellkulturen,
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf konditionierte Medien, die aus dem Wachstum von Zellen und Geweben
in Kulturmedium resultieren, z. B. rekombinanten Zellen, oder Zellbestandteilen.
-
Die
Begriffe ”Markierung” und ”nachweisbare
Markierung” beziehen
sich wie hier verwendet auf ein Molekül, das zum Nachweis in der
Lage ist, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf radioaktive Isotope, fluoreszierende Stoffe, chemilumineszierende
Stoffe, Chromophore, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzym-Inhibitoren,
Chromophore, Farbstoffe, Metallionen, Metallsole, Liganden (z. B.
Biotin, Streptavidin oder Haptene) und dergleichen. Der Begriff ”fluoreszierender
Stoff” bezieht
sich auf eine Substanz oder einen Teil davon, die/der in der Lage
ist, eine Fluoreszenz im nachweisbaren Bereich zu zeigen. Bestimmte
Beispiele von Markierungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden
können,
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf Meerrettich-Peroxidase (HRP), Fluorescein, FITC, Rhodamin, Dansyl,
Umbelliferon, Dimethylacridiniumester (DMAE), Texas-Rot, Luminol,
NADPH und α-β-Galactosidase.
-
II. Arten der Durchführung der Erfindung
-
Bevor
die vorliegende Erfindung ausführlich
beschrieben wird, muss gesagt werden, dass diese Erfindung nicht
auf bestimmte Formulierungen oder Prozessparameter beschränkt ist,
die natürlich
variieren können.
Außerdem
ist es so zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie lediglich
dem Zweck dient, bestimmte Ausführungsformen
der Erfindung zu beschreiben, und in keiner Weise eine Einschränkung darstellen soll.
-
Obwohl
für die
Durchführung
der Erfindung verschiedene Zusammensetzungen und Verfahren verwendet
werden können,
die gleich sind wie die hier beschriebenen Zusammensetzungen und
Verfahren oder ihnen ähnlich
sind, werden hier die bevorzugten Materialien und Methoden beschrieben.
-
Wie
vorstehend angegeben beruht die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung
neuer diagnostischer Verfahren zum genauen Nachweisen einer frühen HCV-Infektion.
Die Verfahren basieren auf der Identifizierung und Verwendung von
hoch-immunogenen HCV-Antikörpern und
Antigenen, die während
der frühen Stadien
der HCV-Serokonversion vorliegen, wodurch die Nachweisgenauigkeit
erhöht
und die Häufigkeit
von falschen Ergebnissen reduziert wird. Die Verfahren können günstig in
einem einzigen Testformat durchgeführt werden.
-
Genauer
gesagt wird der Test auf einem festen Träger durchgeführt, an
den ein oder mehrere HCV-Anti-Core-Antikörper (die gegen entweder die
gleichen oder verschiedene HCV-Core-Epitope gerichtet sind) und ein Epitop,
das die in den
4A–
4D dargestellte
Aminosäuresequenz
aufweist und das von der NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins stammt,
gebunden wurden. Beispiele für
bestimmte Anti-Core-Antikörper,
die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf Antikörpermoleküle, wie
monoclonale Antikörper,
die gegen Epitope in der Core-Region gerichtet sind, die zwischen
den Aminosäuren
10 bis 53; den Aminosäuren
10 bis 45; den Aminosäuren
67 bis 88; den Aminosäuren
120 bis 130 zu finden sind, oder Antikörper, die gegen ein beliebiges
der Core-Epitope gerichtet sind, die z. B. identifiziert wurden
in Houghton et al.,
US Patent
Nr. 5 350 671 ; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1992), 89: 10011–10015;
Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993), 8: S33–39; Chien
et al., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/00365 ; Chien,
D. Y., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 94/01778 ; und
zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelder Serien-Nr. 08/403 590 und
08/444 818.
-
Die
NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins wurde beschrieben und die Aminosäuresequenz
und die Gesamtstruktur des Proteins sind offenbart z. B. in Yao
et al., Structure (November 1999), 7: 1353–1363; Sali et al., Biochem.
(1998), 37: 3392–3401;
und Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999), 6: 165–181. Vgl.
auch Dasmahapatra et al.,
US
Patent Nr. 5 843 752 . Die vorliegenden Immuntests nutzen
mindestens ein Konformationsepitop, das von der NS3/4a-Region stammt,
welche die in den
4A–
4D dargestellte
Aminosäuresequenz
aufweist und in der Konformation vorliegt, wie sie in dem natürlich vorkommenden
HCV-Partikel oder seinem infektiösen
Produkt gefunden wird; der Beweis hierfür ist das Aufrechterhalten
von Protease- und gegebenenfalls Helicase-Enzymaktivitäten, die das NS3/4a-Genprodukt
normalerweise besitzt, und/oder die Immunreaktivität des Antigens
mit Antikörpern
in einer biologischen Probe von einem HCV-infizierten Individuum
sowie ein Verlust der Immunreaktivität des Epitops bei Denaturierung
des Antigens. Z. B. kann das Konformationsepitop durch Erhitzen,
Verändern
des pH-Werts auf einen extrem sauren oder basischen Wert oder durch
Zufügen
bekannter organischer Denaturierungsmittel, wie Dithiothreitol (DTT),
oder eines geeigneten Detergens zerstört werden, vgl. z. B. ”Protein
Purification Methods, A Practical Approach” (E. L. V. Harris und S. Angal,
Hrsg., IRL Press), und das denaturierte Produkt kann sodann mit
dem Produkt, das nicht wie vorstehend behandelt wurde, verglichen
werden.
-
Protease-
und Helicaseaktivität
können
unter Verwendung herkömmlicher
Enzymtests bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Z. B. kann die Proteaseaktivität
unter Verwendung von Tests bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet
bekannt sind. Vgl. z. B. Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997),
247: 242–246;
Kakiuchi et al., J. Biochem (1997), 122: 749–755; Sali et al., Biochemistry
(1998), 37: 3392–3401; Cho
et al., J. Virol. Meth. (1998), 72: 109–115; Cerretani et al., Anal.
Biochem. (1999), 266: 192–197;
Zhang et al., Anal. Biochem. (1999), 270; 268–275; Kakiuchi et al., J. Virol.
Meth. (1999), 80: 77–84;
Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000), 5: 153–158; und Kim et al., Anal.
Biochem. (2000), 284: 42–48.
Ein besonders günstiger
Test zum Testen der Proteaseaktivität ist in den nachstehenden
Beispielen angegeben.
-
Genauso
sind Tests der Helicaseaktivität
auf dem Fachgebiet bekannt, wobei die Helicaseaktivität eines
NS3/4a-Epitops bestimmt werden kann, z. B. unter Verwendung eines
ELISA-Tests, wie in z. B. Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1998), 253: 594–599,
beschrieben, eines ”Scintillation
Proximity Assay”-Systems,
wie in Kyono et al., Anal. Biochem. (1998), 257: 120–126, beschrieben;
von Hochdurchsatz-Screeningtests, wie z. B. in Hicham et al., Antiviral
Res. (2000), 46: 181–192,
und Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000), 24: 97–116, beschrieben;
und außerdem
durch andere Testverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Vgl. z. B. Khu et al., J. Virol. (2001), 75: 205–214; Utama et al., Virology
(2000), 273: 316–324;
Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000), 81: 1335–1345; Preugschat et al., Biochemistry
(2000), 39: 5174–5183;
Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998), 19: 353–364; und
Hesson et al., Biochemistry (2000), 39: 2619–2625.
-
Im
Allgemeinen wird das in NS3/4a vorliegende Konformationsepitop in
einer Zelle als ein rekombinantes Polypeptid exprimiert, und dieses
Polypeptid stellt das Epitop in einer gewünschten Form bereit, wie nachstehend
ausführlich
beschrieben wird.
-
Die
an den Positionen 2 bis 686 der 4A bis 4D angegebene
Aminosäuresequenz
entspricht den Aminosäurepositionen
1027 bis 1711 von HCV-1. Ein Initiatorcodon (ATG), das Met codiert,
ist an Position 1 dargestellt. Außerdem ist das Thr, das normalerweise
an Position 1428 von HCV-1 (Aminosäureposition 403 von 4) steht, zu Pro mutiert, und das Ser,
das normalerweise an Position 1429 von HCV-1 (Aminosäureposition
404 von 4) steht, ist zu Ile mutiert.
-
Der
feste Träger
kann auch andere Antigene umfassen. Z. B. können multiple Epitopfusionsantigene (bezeichnet
mit ”MEFAs”), wie
in der Internationalen Veröffentlichung
Nr.
WO 97/44469 beschrieben,
an den festen Träger
zur Verwendung in den vorliegenden Tests gebunden werden. Solche
MEFAs schließen
multiple Epitope ein, die von zwei oder mehreren der verschiedenen
viralen Regionen stammen, wie in
1 und Tabelle
1 dargestellt. Wie insbesondere in
1 und Tabelle
1 dargestellt ist, entstehen aus einem HCV-Polyprotein bei Spaltung mindestens
zehn unterschiedliche Produkte in der Größenordnung von NH
2 Core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Das
Core-Polypeptid liegt an den Positionen 1 bis 191 vor, nummeriert
in Bezug auf HCV-1 (vgl. Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 2451–2455, für das HCV-1-Genom).
Dieses Polypeptid wird weiter bearbeitet, um ein HCV-Polypeptid
mit etwa den Aminosäuren
1 bis 173 herzustellen. Die Hüllpolypeptide,
E1 und E2, liegen an den Positionen 192 bis 383 bzw. 384 bis 746
vor. Die P7-Domäne
befindet sich etwa an den Positionen 747–809. NS2 ist ein integrales
Membranprotein mit proteolytischer Aktivität und liegt etwa an den Positionen
810 bis 1026 des Polyproteins vor. NS2, entweder alleine oder in
Kombination mit NS3 (gefunden etwa an den Positionen 1027 bis 1657),
spaltet die N52-N53-”Sissle”-Bindung, wodurch
wiederum der N-Terminus von NS3 erzeugt und ein großes Polyprotein
freigesetzt wird, das sowohl Serin-Protease- als auch RNA-Helicase-Aktivitäten einschließt. Die
NS3-Protease, die etwa an den Positionen 1027 bis 1207 zu finden
ist, dient dazu, das restliche Polyprotein zu prozessieren. Die
Helicaseaktivität
ist etwa an den Positionen 1193 bis 1657 zu finden. Der vollständige Ablauf
der Polypeptid-Reifung wird durch eine autokatalytische Spaltung
am NS3-NS4a-Übergang
initiiert, welche durch die NS3-Serin-Protease katalysiert wird.
Anschließende
NS3-vermittelte Spaltungen des HCV-Polyproteins scheinen die Erkennung
von Polyprotein-Spaltungs-Übergänge durch
ein N53-Molekül
eines andere Polypeptids zu beinhalten. In diesen Reaktionen setzt
NS3 einen NS3-Cofaktor (NS4a, das etwa an den Positionen 1658 bis
1711 vorliegt), zwei Proteine (NS4b, das etwa an den Positionen
1712 bis 1972 vorliegt, und N55a, das etwa an den Positionen 1973
bis 2420 vorliegt), und eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5b,
das etwa an den Positionen 2421–3011
vorliegt) frei.
Tabelle
1 |
Domäne | Ungefähre Grenzen* |
C(Core) | 1–191 |
E1 | 192–383 |
E2 | 384–746 |
P7 | 747–809 |
NS2 | 810–1026 |
NS3 | 1027–1657 |
NS4a | 1658–1711 |
NS4b | 1712–1972 |
NS5a | 1973–2420 |
NSSb | 2421–3011 |
- * Nummeriert in Bezug auf HCV-1. Vgl. Choo
et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455.
-
Die
multiplen HCV-Antigene sind Teil einer einzelnen kontinuierlichen
Kette von Aminosäuren,
wobei die Kette in der Natur nicht vorkommt. Somit ist die lineare
Reihenfolge der Epitope anders als ihre lineare Reihenfolge im Genom,
in dem sie vorkommen. Die lineare Reihenfolge der Sequenzen der
MEFAs zur Verwendung hier ist vorzugsweise so angeordnet, dass eine
optimale Antigenität
entsteht. Vorzugsweise stammen die Epitope von mehr als einem HCV-Stamm,
so dass die zusätzliche
Fähigkeit
bereitgestellt wird, mehrere Stämme
von HCV in einem einzelnen Test nachzuweisen. So können die
MEFAs zur Verwendung hier verschiedene immunogene Regionen umfassen,
die von dem vorstehend beschriebenen Polypeptid stammen. Außerdem kann
ein Protein, das durch eine Verschiebung des Leserasters (”Frameshift”) in der
Core-Region des Polyproteins zustande kommt, wie in der Internationalen
Veröffentlichung
Nr.
WO 99/63941 beschrieben,
in den MEFAs verwendet werden. Sofern es gewünscht wird, können mindestens
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder mehr von einem oder mehreren
Epitopen, die von dem HCV-Polyprotein stammen, in dem Fusionsprotein
vorkommen.
-
Z.
B. können
Epitope, die z. B. aus der hypervariablen Region von E2 stammen,
wie eine Region, welche die Aminosäuren 384 bis 410 oder 390 bis
410 überspannt,
in dem MEFA-Antigen eingeschlossen sein. Ein besonders wirksames
E2-Epitop ist eines, welches eine Konsensussequenz einschließt, die
aus dieser Region stammt, wie die Konsensussequenz Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn,
welche eine Konsensussequenz für
die Aminosäuren
390 bis 410 des Genoms von HCV Typ 1 darstellt. Ein repräsentatives E2-Epitop,
das in einem MEFA der Erfindung vorliegt, kann ein hybrides Epitop
umfassen, welches die Aminosäuren
390 bis 444 überspannt.
Ein solches hybrides E2-Epitop kann eine Konsensussequenz einschließen, welche
die Aminosäuren
390 bis 410 darstellt, fusioniert mit der nativen Aminosäuresequenz
für die
Aminosäuren
411 bis 444 von HCV E2.
-
Außerdem können die
Antigene von verschiedenen HCV-Stämmen hergeleitet
sein. Mehrere Virusstämme
von HCV sind bekannt, wobei Epitope, die von einem beliebigen dieser
Stämme
stammen, in einem Fusionsprotein verwendet werden können. Es
ist bekannt, dass eine beliebige bestimmte Organismus-Art von einem
individuellen Organismus zu einem anderen variiert, und dass außerdem ein
bestimmter Organismus, wie ein Virus, eine Reihe von verschiedenen
Stämmen
aufweisen kann. Z. B. schließt,
wie vorstehend erklärt, HCV
mindestens sechs Genotypen ein. Jeder dieser Genotypen schließt äquivalente
antigene Determinanten ein. Insbesondere schließt jeder Stamm mehrere antigene
Determinanten ein, die auf allen Stämmen des Virus vorliegen, sich
jedoch von einem bestimmten Virusstamm zu einem anderen etwas unterscheiden.
Z. B. schließt
HCV die antigene Determinante ein, die als 5-1-1 bekannt ist (vgl. 1).
Diese bestimmte antigene Determinante kommt auf den drei verschiedenen
Virusstämmen
von HCV in drei verschiedenen Formen vor. Demgemäß liegen in einer bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung alle drei Formen von 5-1-1 auf dem multiplen Epitopfusionsantigen
vor, das in den vorliegenden Immuntests verwendet wird. Genauso
können auch äquivalente
antigene Determinanten aus der Core-Region von unterschiedlichen
HCV-Stämmen
vorliegen. Im Allgemeinen haben äquivalente
antigene Determinanten bezüglich
der Aminosäuresequenz
einen hohen Homologiegrad, wobei dieser Homologiegrad beim Alignment
im Allgemeinen 30% oder mehr, vorzugsweise 40% oder mehr beträgt. Das
Mehrkopie-Epitop der vorliegenden Erfindung kann auch mehrere Kopien einschließen, die
exakte Kopien des gleichen Epitops sind.
-
Repräsentative
MEFAs zur Verwendung in den vorliegenden Tests sind in der Internationalen
Veröffentlichung
WO 97/44469 beschrieben.
Weitere repräsentative
MEFAs zur Verwendung hier schließen diejenigen ein, die mit
MEFA 12, MEFA 13 und MEFA 13.1 bezeichnet sind. Es ist so zu verstehen,
dass diese MEFAs bloß repräsentativ
sind und auch andere Epitope, die vom HCV-Genom stammen, in den
vorliegenden Tests verwendet werden können und in diese oder andere
MEFAs eingebaut werden können.
-
Die
DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von MEFA 12 ist
in den 7A bis 7F dargestellt.
Die allgemeine Strukturformel für
MEFA 12 ist in 6 dargestellt und sieht wie
folgt aus: hSOD-E1(Typ 1)-E2 HVR Konsensus(Typ 1a)-E2 HVR Konsensus(Typen
1 und 2)-c33c kurz(Typ 1)-5-1-1(Typ 1)-5-1-1(Typ 3)-5-1-1(Typ 2)-c100(Typ
1)-NS5(Typ 1)-NS5(Typ 1)-Core(Typen 1 und 2)-Core(Typen 1 und 2). Dieses Mehrkopie-Epitop
schließt
die folgende Aminosäuresequenz
ein, die in Bezug auf HCV-1 nummeriert ist (die Nummerierung der
nachstehend angegebenen Aminosäuren
erfolgt gemäß der Nummerierungs-Bezeichnung
wie in Choo et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455, bereitgestellt,
wobei die Aminosäure
Nr. 1 das erste Methionin ist, das durch die codierende Sequenz
der Core-Region codiert ist): Aminosäuren 1 bis 69 von Superoxid-Dismutase
(SOD, verwendet, um die rekombinante Expression des Proteins zu steigern);
Aminosäuren
303 bis 320 des Polyproteins aus der E1-Region; Aminosäuren 390
bis 410 des Polyproteins, welche eine Konsensussequenz für die hypervariable
Region von HCV-1 a E2 darstellen; Aminosäuren 384 bis 414 des Polyproteins
aus der Region E2, welche eine Konsensussequenz für die hypervariablen E2-Regionen
von HCV-1 und HCV-2 darstellen; Aminosäuren 1211 bis 1457 des HCV1-Polyproteins,
welche die Helicase definieren; drei Kopien eines Epitops aus 5-1-1,
Aminosäuren
1689 bis 1735, eine aus HCV-1, eine aus HCV-3 und eine aus HCV-2,
wobei diese Kopien äquivalente
antigene Determinanten aus den drei verschiedenen Virusstämmen von
HCV sind; HCV-Polypeptid 0100 von HCV-1, Aminosäuren 1901 bis 1936 des Polyproteins;
zwei exakte Kopien eines Epitops aus der N55-Region von HCV-1, jede mit den Aminosäuren 2278
bis 2313 des HCV-Polyproteins; und zwei Kopien von drei Epitopen
aus der Core-Region,
zwei aus HCV-1 und eine aus HCV-2, wobei die Kopien äquivalente
antigene Determinanten sind, die durch die Aminosäuren 9 bis
53 und 64 bis 88 von HCV-1 und 67 bis 84 von HCV-2 dargestellt werden.
-
Tabelle
2 zeigt die Aminosäurepositionen
der verschiedenen Epitope in MEFA 12 in Bezug auf die
7A bis
7F.
Die Nummerierung in den Tabellen bezieht sich auf HCV-1. Vgl. Choo
et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451–2455. MEFAs
13 und 13.1 haben auch die gleiche allgemeine Formel, die vorstehend
für MEFA
12 angegeben ist, mit den wie in den Tabellen 3 bzw. 4 bezeichneten
Modifikationen.
Tabelle
2 MEFA 12 |
MEFA
As Nr. | 5'-Endstelle | Epitop | HCV
As Nr. | Stamm |
1–69* | NcoI | hSOD | | |
72–89 | MluI | E1 | 303–320 | 1 |
92–112 | Hind111 | E2
HVR1a Konsensus | 390–410 | 1 |
113–143 | | E2
HVR1 + 2 Konsensus | 384–414 | 1,
2 |
146–392 | SpeI | C33C
kurz | 1211–1457 | 1 |
395–441 | SphI | 5-1-1 | 1689–1735 | 1 |
444–490 | NruI | 5-1-1 | 1689–1735 | 3 |
493–539 | ClaI | 5-1-1 | 1689–1735 | 2 |
542–577 | AvaI | C100 | 1901–1936 | 1 |
580–615 | XbaI | NS5 | 2278–2313 | 1 |
618–653 | BglII | NS5 | 2278–2313 | 1 |
654–741 | NcoI | Core-Epitope | 9–53, R47L
64–88 67–84 | 1
1 2 |
742–829 | BalI | Core-Epitope | 9–53, R47L
64–88 67–84 | 1
1 2 |
- * Das SOD-Protein ist so verkürzt, dass
das Nachweis-Konjugat, ein HRP-markierter Anti-SOD-Antikörper, nicht
an das MEFA bindet. Das Core-Epitop ist so mutiert, dass verhindert
wird, dass die Antikörper
gegen HCV-Core, die zum Nachweis eingesetzt werden, an das MEFA
binden.
Tabelle
3 MEFA 13 |
MEFA
As Nr. | 5'-End-Stelle | Epitop | HCV
As Nr. | Stamm |
1–156 | NcoI | mutierte
hSOD (As 70–72,
ALA) | | |
161–178 | MluI | E1 | 303–320 | 1 |
181–201 | HindIII | E2
HVR1a Konsensus | 390–410 | 1 |
202–232 | | E2
HVR1 + 2 Konsensus | 384–414 | 1,
2 |
235–451 | | C33C
kurz | 1211–1457 | 1 |
454–500 | HindIII | 5-1-1
PImut* | 1689–1735 | 1 |
503–549 | NruI | 5-1-1
PImut* | 1689–1735 | 3 |
552–598 | ClaI | 5-1-1
PImut* | 1689–1735 | 2 |
601–636 | AvaI | C100 | 1901–1936 | 1 |
639–674 | XbaI | NS5 | 2278–2313 | 1 |
677–712 | BglII | NS5 | 2278–2313 | 1 |
713–800 | | Core-Epitope | 9–53, R47L
64–88 67–84 | 1
1 2 |
801–888 | | Core-Epitope | 9–53, R47L
64–88 67–84 | 1
1 2 |
- * Die 5-1-1-Epitope werden modifiziert,
indem mögliche
Spaltstellen (CS oder CA) entfernt werden, auf welche das rekombinante
NS3/4a-Protein zielt.
Anstelle von CS oder CA wurde die Sequenz zu PI geändert. Außerdem ist
das SOD-Protein so mutiert, dass das Nachweis-Konjugat, ein HRP-markierter
Anti-SOD-Antikörper, nicht
an das MEFA bindet. Das Core-Epitop ist so mutiert, dass verhindert
wird, dass die Antikörper
gegen HCV-Core, die zum Nachweis verwendet werden, an das MEFA binden.
Tabelle
4 MEFA 13.1 |
MEFA
As Nr. | 5'-End-Stelle | Epitop | HCV
As Nr. | Stamm |
1–86 | NcoI | mutierte
hSOD (As 70–72,
ALA) | | |
89–106 | MluI | E1 | 303–320 | 1 |
109–129 | HindIII | E2
HVR1a Konsensus | 390–410 | 1 |
130–160 | | E2
HVR1 + 2 Konsensus | 384–414 | 1,
2 |
163–379 | | C33C
kurz | 1211–1457 | 1 |
382–428 | HindIII | 5-1-1
PImut* | 1689–1735 | 1 |
431–477 | NruI | 5-1-1
PImut* | 1689–1735 | 3 |
480–526 | ClaI | 5-1-1
PImut* | 1689–1735 | 2 |
529–564 | AvaI | C100 | 1901–1936 | 1 |
567–602 | XbaI | NS5 | 2278–2313 | 1 |
605–640 | BglII | NS5 | 2278–2313 | 1 |
641–728 | | Core-Epitope | 9–53, R47L
64–88 67–84 | 1
1 2 |
729–816 | | Core-Epitope | 9–53, R47L
64–88 67–84 | 1
1 2 |
- * Die 5-1-1-Epitope werden modifiziert,
indem mögliche
Spaltstellen (CS oder CA) entfernt werden, auf welche das rekombinante
NS3/4a-Protein zielt.
Anstelle von CS oder CA wurde die Sequenz zu PI geändert. Außerdem ist
das SOD-Protein so mutiert, dass das Nachweis-Konjugat, ein HRP-markierter
Anti-SOD-Antikörper, nicht
an das MEFA bindet. Das Core-Epitop ist so mutiert, dass verhindert
wird, dass die Antikörper
gegen HCV-Core, die zum Nachweis verwendet werden, an das MEFA binden.
-
In
einem Testformat wird die Probe mit dem festen Träger kombiniert,
wie weiter unten beschrieben wird. Wenn die Probe mit HCV infiziert
ist, werden Core-Antigene und auch HCV-Antikörper gegen diejenigen Epitope,
die auf dem festen Träger
vorliegen, an die Komponenten des festen Trägers binden. Anschließend wird
ein nachweisbar markierter Anti-Core-Antikörper zugegeben. Der markierte
Anti-Core-Antikörper
ist gegen ein anderes Epitop gerichtet als der Anti-Core-Antikörper, der
an den festen Träger
gebunden ist. Dieser Anti-Core-Antikörper bindet an das Core-Antigen,
das durch die Anti-Core-Antikörper
am festen Träger
eingefangen ist.
-
Außerdem wird
ein Antigen zugegeben, das mit dem eingefangenen HCV-Antikörper aus
der biologischen Probe reagiert, wobei der eingefangene HCV-Antikörper der
Probe mit dem NS3/4a-Epitop
reaktiv ist. Dieses Antigen ist vorzugsweise ein Epitop, das aus
der N53-Region des HCV-Polyproteins stammt. Dieses Antigen bindet
an den eingefangenen HCV-Antikörper
aus der Probe. Verschiedene Antigene sind bekannt, die solche Epitope
umfassen, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
darauf, Antigene, die von den c33c- und c100-Regionen hergeleitet
sind, und außerdem
Fusionsproteine, umfassend ein N53-Epitop, wie c25. Diese und andere
N53-Epitope können
in den vorliegenden Tests eingesetzt werden und sind auf dem Fachgebiet bekannt
und beschrieben in z. B. Houghton et al.,
US Patent Nr. 5 350 671 ; Chien et
al., Proc Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89: 10011–10015; Chien et al., J. Gastroent.
-
Hepatol.
(1993), 8: S33–39;
Chien et al., Internationale Veröffentlichung
WO 93/00365 ; Chien, D.
Y., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 94/01778 ; und
die zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelder Serien-Nr.
08/403 590 und 08/444 818.
-
Ein
zweiter markierter Antikörper,
der gegen das vorstehend beschriebene Antigen gerichtet ist, wird zugegeben.
Dieser Antikörper
kann gegen ein beliebiges Epitop gerichtet sein, das in dem Antigen
eingeschlossen ist. Z. B. kann der Antikörper gegen die im Antigen vorliegende
NS3-Region gerichtet sein. Alternativ, wenn das vorstehende Antigen
als ein Fusionsprotein exprimiert wird, kann der zweite markierte
Antikörper gegen
den Fusionspartner gerichtet sein. Weitere Antigene und Antikörper können zu
dem Test zugegeben werden, insbesondere wenn der feste Träger ein
MEFA einschließt.
Diese Testformate werden nachstehend noch weiter erläutert.
-
Ein
repräsentativer
Test gemäß der Erfindung
ist in 2 dargestellt. Wie in der Figur gezeigt wird, schließt der feste
Träger
zwei monoclonale Anti-Core-Antikörper
ein, die mit c11-3 und c11-7 bezeichnet sind. Diese Antikörper sind
gegen ein Epitop gerichtet, das in der N-terminalen Region des Core-Proteins
an den Aminosäuren
10 bis 53, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz, vorliegt. Außerdem schließt der feste
Träger
ein Epitop bzgl. NS3/4a gemäß der beanspruchten
Erfindung ein. Die biologische Probe wird zu dem festen Träger zugegeben.
Sowohl HCV-Core-Antigen
als auch Antikörper,
die gegen das NS3/4a-Epitop gerichtet sind, die beide in der Probe
vorliegen, werden an die Einfang-Reagenzien auf dem festen Träger binden.
-
Anschließend wird
der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markierte monoclonale Anti-Core-Antikörper c11-14
zugegeben, der gegen eine C-terminale Region des Core gerichtet
ist, welche an den Aminosäurepositionen
120 bis 130 vorliegt, nummeriert in Bezug auf die HCV1-Polyproteinsequenz.
Ein Fusionsprotein, das eine Sequenz aus menschlicher SOD (hSOD)
und ein Epitop aus der c33c-Region umfasst, wird zugegeben, sowie
ein zweiter HRP-markierter Antikörper,
der gegen den SOD-Teil des Fusionsproteins gerichtet ist. Die SOD-c33c-Fusion
wird an den Anti-NS3-Antikörper
binden, und der Anti-SOD-Antikörper
wird seinerseits an das SOD-c33c-Fusionsprotein
binden. Der Nachweis der Markierung zeigt das Vorliegen einer HCV-Infektion an.
-
Ein
weiterer repräsentativer
Test gemäß der Erfindung
ist in 8 dargestellt. Die Antikörper-Testkonfiguration ist
ein Antigen-Antikörper-Antigen-Sandwich-Einfangtest,
bei dem sowohl NS3/4a als auch MEFA 12 verwendet werden. Der feste
Träger
schließt
die vorstehend beschriebenen zwei monoclonalen Anti-Core-Antikörper, ein
Epitop bzgl. NS3/4a gemäß der beanspruchten
Erfindung und außerdem
ein repräsentatives MEFA,
MEFA 12, ein, das eine verkürzte
Version der menschlichen SOD einschließt. Wie beim vorstehenden Test
wird die biologische Probe zu dem festen Träger zugegeben. Das HCV-Core-Antigen
und außerdem
Antikörper,
die gegen das NS3/4a-Epitop sowie Epitope des MEFA gerichtet sind,
welche in der Probe vorliegen, werden an die Einfang-Reagenzien
auf dem festen Träger
binden. Zwei Antigene werden zugegeben, eines, das mit Proben-Antikörpern reaktiv
ist, welche an NS3/4a binden (wie vorstehend beschrieben), und eines,
das mit Proben-Antikörpern
reaktiv ist, welche an MEFA 12 binden. In 8 ist das
Antigen, das mit dem MEFA-12/Proben-Antikörper-Komplex reaktiv ist, eine
Fusion zwischen einem SOD-Molekül
und c22ks Δ47-L44W.
Das c22ks-Antigen stammt aus der Core-Region und schließt die Aminosäuren Lys10 bis Ser99 des Polyproteins
ein, sowie eine Deletion von Arg47, das
normalerweise vorliegt, und eine Substitution von Leu für Trp an
Position 44. Das Antikörper-Nachweiskonjugat
ist der zweite HRP-markierte monoclonale Anti-SOD-Antikörper wie
vorstehend beschrieben.
-
Die
vorstehend beschriebenen Antigen/Antikörper-Kombinationstests sind besonders vorteilhaft,
da sowohl das HCV-Core-Antigen
als auch Antikörper
gegen NS3/4a und/oder Core durch den selben Träger im selben Test nachgewiesen
werden können.
Außerdem
können
wie vorstehend beschrieben zusätzliche HCV-Epitope,
wie SOD, fusioniert an c100, 5-1-1, N55-Antigene, sowie ein Protein,
das durch eine Verschiebung des Leserasters (”Frameshift”) in der Core-Region des Polyproteins
zustande kommt, wie in der internationalen Veröffentlichung Nr.
WO 99/63941 beschrieben, in dem Kombinationscocktail
eingesetzt werden, um andere Nicht-Struktur-Epitope von HCV abzudecken.
-
Um
die Erfindung noch besser verständlich
zu machen, wird nachstehend eine genauere Diskussion bereitgestellt,
wobei die Herstellung von Antikörpern
zur Verwendung in den vorliegenden Immuntests, die Herstellung von
Polypeptiden zur Verwendung in den Immuntests, und Verfahren zum
Durchführen
der Immuntests erläutert
werden.
-
Herstellung von Antikörpern zur Verwendung in den
HCV-Immuntests
-
Wie
vorstehend erklärt,
werden in dem Test verschiedene Antikörper eingesetzt, die an einen
festen Träger
gebunden sind (z. B. ein oder mehrere Anti-Core-Antikörper) und
die Antigen/Antikörper-Komplexe nachweisen,
welche gebildet werden, wenn eine HCV-Infektion in der Probe vorliegt. Diese
Antikörper
können polyclonale
oder monoclonale Antikörperpräparate,
monospezifische Antiseren, menschliche Antikörper sein, oder sie können hybride
oder Chimäre
Antikörper,
wie humanisierte Antikörper,
veränderte
Antikörper, F(ab')2-Fragmente,
F(ab)-Fragmente, Fv-Fragmente, Einzeldomäne-Antikörper, dimere oder trimere Antikörperfragmentkonstrukte,
Minibodies oder funktionelle Fragmente davon sein, die an das Antigen
von Interesse binden.
-
Antikörper werden
unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt
sind und die offenbart sind in z. B. den
US Patenten Nr. 4 011 308 ;
4 722.890 ;
4 016 043 ;
3 876 504 ;
3 770 380 und
4 372 745 . Z. B. werden polyclonale
Antikörper
erzeugt, indem ein geeignetes Tier, wie eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen,
ein Schaf oder eine Ziege, mit einem Antigen von Interesse immunisiert
wird. Um die Immunogenität
zu steigern, kann das Antigen vor der Immunisierung an einen Träger gebunden
werden. Solche Träger sind
dem Fachmann bekannt. Die Immunisierung erfolgt im Allgemeinen,
indem das Antigen in Kochsalzlösung,
vorzugsweise in einem Adjuvans, wie komplettem Freundschem Adjuvans,
gemischt oder emulgiert wird und das Gemisch oder die Emulsion parenteral
(im Allgemeinen subkutan oder intramuskulär) injiziert wird. Das Tier
wird im Allgemeinen zwei bis sechs Wochen später mit einer oder mehreren
Injektionen des Antigens in Kochsalzlösung, vorzugsweise unter Verwendung
von inkomplettem Freundschem Adjuvans, geboostert. Außerdem können Antikörper durch
in vitro-Immunisierung unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten
Verfahren erzeugt werden. Sodann wird aus dem immunisiertes Tier
ein polyclonales Antiserum erhalten. Vgl. z. B. Houghton et al.,
US Patent Nr. 5 350 671 ,
für eine
Beschreibung der Herstellung von polyclonalen Anti-HCV-Antikörpern.
-
Monoclonale
Antikörper
werden im Allgemeinen unter Verwendung des Verfahrens von Köhler und Milstein
(1975), Nature 256: 495–497,
oder einer Modifikation davon hergestellt. Typischerweise wird eine Maus
oder eine Ratte wie vorstehend beschrieben immunisiert. Jedoch wird
anstelle der Blutabnahme von dem Tier zum Extrahieren von Serum
die Milz (und gegebenenfalls mehrere große Lymphknoten) entfernt und zu
Einzelzellen dissoziiert. Sofern es gewünscht wird, können die
Milzzellen durchgemustert werden (nach Entfernung von unspezifisch
anhaftenden Zellen), indem eine Zeltsuspension auf eine Platte oder
in eine Vertiefung, welche mit dem Antigen beschichtet ist, aufgetragen
wird. B-Zellen, die ein membrangebundenes Immunglobulin exprimieren,
das für
das Antigen spezifisch ist, binden dann an die Platte und werden
nicht mit dem Rest der Suspension weggespült. Danach werden die resultierenden
B-Zellen oder alle dissoziierten Milzzellen induziert, mit Myelomzellen
zu fusionieren, wodurch Hybridome gebildet werden, und sie werden
in einem Selektivm edium gezüchtet
(z. B. Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium, ”HAT”). Die resultierenden Hybridome
werden durch Grenzwert-Verdünnung
plattiert und auf die Produktion von Antikörpern getestet, die spezifisch
an das immunisierende Antigen binden (und die nicht an nicht damit
zusammenhängende
Antigene binden). Anschließend
werden die ausgewählten,
monoclonale Antikörper-sekretierenden
Hybridome entweder in vitro (z. B. in Gewebekulturflaschen oder
Hohlfaserreaktoren) oder in vivo (z. B. als Aszitesflüssigkeiten in
Mäusen)
gezüchtet.
-
Die
Herstellung verschiedener monoclonaler Anti-HCV-Antikörper wurde beschrieben z. B.
in: Houghton et al.,
US Patent
Nr. 5 350 671 ; Chien et al., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/00365 ; zugelassene US
Patentanmeldungen der gleichen Anmelderin Serien-Nr. 08/403 590
und 08/444 818; und Kashiwakuma et al.,
US Patent Nr. 5 871 904 .
-
Wie
vorstehend erklärt,
können
in den vorliegenden Immuntests auch Antikörperfragmente verwendet werden,
welche die Fähigkeit
beibehalten, das Antigen von Interesse zu erkennen. Auf dem Fachgebiet
sind verschiedene Antikörperfragmente
bekannt, die Antigen-Bindungsstellen umfassen, welche in der Lage
sind, immunologische Bindungseigenschaften eines intakten Antikörpermoleküls zu zeigen.
Z. B. können
funktionelle Antikörperfragmente
hergestellt werden, indem eine konstante Region, die nicht für die Antigenbindung
verantwortlich ist, vom Antikörpermolekül unter
Verwendung von z. B. Pepsin abgespalten wird, wodurch F(ab')2-Fragmente
hergestellt werden. Diese Fragmente enthalten dann zwei Antigen-Bindungsstellen,
ihnen fehlt jedoch ein Teil der konstanten Region aus jeder der
schweren Ketten. Auf ähnliche
Weise können Fab-Fragmente
hergestellt werden, die eine einzelne Antigen-Bindungsstelle umfassen,
sofern dies gewünscht
wird, z. B. indem polyclonale oder monoclonale Antikörper mit
Papain gespalten werden. Außerdem können funktionelle Fragmente
hergestellt werden, die nur die variablen Regionen der schweren
und leichten Ketten einschließen,
indem Standardverfahren verwendet werden, wie die rekombinante Herstellung
oder bevorzugte proteolytische Spaltung von Immunglobulinmolekülen. Diese
Fragmente sind als Fv bekannt. Vgl. z. B.
Inbar et al. (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659–2662; Hochman
et al. (1976), Biochem. 15: 2706–2710; und Ehrlich et al. (1980),
Biochem. 19: 4091–4096.
-
Ein
Einzelketten-Fv-(”sFv” oder ”scFv”)Polypeptid
ist ein kovalent gebundenes V
H-V
L-Heterodimer, das aus einer Genfusion exprimiert
wird, einschließlich
V
H- und V
L-codierender
Gene, gebunden durch einen Peptid-codierenden Linker. Huston et
al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883. Verschiedene Verfahren
wurden beschrieben, um chemische Strukturen (Linker) zu finden und
zu entwickeln, mit denen die natürlich
aggregierten, jedoch chemisch getrennten, leichten und schweren
Polypeptidketten aus einer Antikörper-V-Region
zu einem sFv-Molekül
umgewandelt werden können,
das sich dann zu einer dreidimensionalen Struktur faltet, die im
Wesentlichen ähnlich
ist wie die Struktur einer Antigen-Bindungsstelle. Vgl. z. B. die
US Patente Nr. 5 091 513 ,
5 132 405 und
4 946 778 . Die sFv-Moleküle können unter
Verwendung von auf dem Fachgebiet beschriebenen Verfahren hergestellt
werden. Vgl. z. B. Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 5879–5883;
US-Patente Nr. 5 091 513 ,
5 132 405 und
4 946 778 . Die Entwurfkriterien schließen ein, dass
die geeignete Länge
bestimmt wird, welche die Entfernung zwischen dem C-Terminus der
einen Kette und dem N-Terminus der anderen überspannt, wobei der Linker
im Allgemeinen aus kleinen hydrophilen Aminosäureresten gebildet wird, die
nicht dazu neigen, zu verknäueln
oder Sekundärstrukturen
zu bilden. Solche Verfahren wurden auf dem Fachgebiet beschrieben.
Vgl. z. B. die
US Patente Nr.
5 091 513 ,
5 132 405 und
4 946 778 . Geeignete Linker
umfassen im Allgemeinen Polypeptidketten von abwechselnden Sätzen von
Glycin – und Serinresten
und können
Glutaminsäure-
und Lysinreste einschließen,
die zur Erhöhung
der Löslichkeit eingefügt werden.
-
”Mini-Antikörper” oder ”Minibodies” können auch
gemäß der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden. Minibodies sind sFv-Polypeptidketten, die an ihren C-Enden
Oligomerisierungsdomänen
einschließen, die
vom sFv durch eine Scharnierregion getrennt sind. Pack et al. (1992),
Biochem. 31: 1579–1584.
Die Oligomerisierungsdomäne
umfasst selbst-assoziierende α-Helices,
z. B. Leucin-Zipper, welche durch zusätzliche Disulfidbindungen noch
weiter stabilisiert werden können.
Die Oligomerisierungsdomäne
ist so entworfen, dass sie mit einer vektoriellen Faltung durch
eine Membran hindurch kompatibel ist, wobei es sich um einen Prozess
handelt, von dem angenommen wird, dass er die in vivo-Faltung des
Polypeptids in ein funktionelles Bindungsprotein erleichtert. Im
Allgemeinen werden Minibodies unter Verwendung von Rekombinationsverfahren
hergestellt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z. B. Pack
et al. (1992), Biochem. 31: 1579–1584; Cumber et al. (1992),
J. Immunology 149B: 120–126.
-
Herstellung von Antigenen zur Verwendung
in den HCV-Immuntests
-
Wie
vorstehend erklärt
werden die Moleküle
der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen rekombinant hergestellt.
Somit können
Polynucleotide, welche HCV-Antigene zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung codieren, anhand von Standardverfahren der Molekularbiologie
hergestellt werden. Z. B. können
Polynucleotidsequenzen, welche die vorstehend beschriebenen Moleküle codieren,
unter Verwendung von Rekombinationsverfahren erhalten werden, wie
durch Durchmusterung von cDNA und genomischen Banken aus Zellen,
welche das Gen exprimieren, oder durch Herleiten des Gens aus einem
Vektor, von dem bekannt ist, dass er dieses enthält. Weiterhin kann das gewünschte Gen
direkt aus viralen Nucleinsäuremolekülen isoliert werden,
wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet beschrieben
sind, wie in Houghton et al.,
US
Patent Nr. 5 530 671 . Das Gen von Interesse kann auch synthetisch
hergestellt werden, anstatt dass es cloniert wird. Die Moleküle können mit
geeigneten Codons für
die bestimmte Sequenz entworfen werden. Sodann wird die vollständige Sequenz
aus überlappenden
Oligonucleotiden zusammengebaut, die durch Standardverfahren hergestellt
und zu einer vollständigen
codierenden Sequenz zusammengebaut werden. Vgl. z. B. Edge (1981),
Nature 292: 756; Nambair et al. (1984), Science 223: 1299; und Jay
et al. (1984), J. Biol. Chem. 259: 6311.
-
Auf
diese Weise können
bestimmte Nucleotidsequenzen aus Vektoren erhalten werden, welche
die gewünschten
Sequenzen beinhalten, oder sie können
vollständig
oder zum Teil synthetisiert werden, wobei verschiedene auf dem Fachgebiet
bekannte Verfahren der Oligonucleotidsynthese verwendet werden können, wie
Verfahren der positionsgerichteten Mutagenese und Polymerasekettenreaktion
(PCR), sofern sie geeignet sind. Vgl. z. B. Sambrook, vorstehend.
Insbesondere besteht ein Verfahren zum Erhalten von Nucleotidsequenzen,
welche die gewünschten
Sequenzen codieren, darin, komplementäre Sätze von überlappenden synthetischen
Oligonucleotiden, die in einem herkömmlichen automatischen Polynucleotid-Synthesizer
hergestellt wurden, zu anelieren, worauf eine Ligierung mit einer
geeigneten DNA-Ligase und eine Amplifikation der ligierten Nucleotidsequenz
anhand von PVR folgen. Vgl. z. B. Jayaraman et al. (1991), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88: 4084–4088.
-
Außerdem können eine
Oligonucleotid-vermittelte Synthese (Jones et al. (1986), Nature
54: 75–82), eine
Oligonucleotidvermittelte Mutagenese von vorher existierenden Nucleotidregionen
(Riechmann et al. (1988), Nature 332: 323–327; und Verhoeyen et al.
(1988), Science 239: 1543–1536)
und ein enzymatisches Auffüllen
von fehlenden Oligonucleotiden unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase
(Queen et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029–10033)
gemäß der Erfindung
eingesetzt werden, um Moleküle
bereitzustellen, die veränderte
oder gesteigerte Antigen-Bindungseigenschaften
und/oder eine reduzierte Immunogenität aufweisen.
-
Sobald
codierende Sequenzen hergestellt oder isoliert wurden, können solche
Sequenzen in einen beliebigen geeigneten Vektor oder in ein beliebiges
geeignetes Replicon cloniert werden. Zahlreiche Clonierungsvektoren
sind dem Fachmann bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Clonierungsvektors
kann jeweils nach den Gegebenheiten erfolgen. Geeignete Vektoren
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf Plasmide, Phagen, Transposons, Cosmide, Chromosomen oder Viren,
die zur Replikation fähig
sind, wenn sie mit den richtigen Kontrollelementen assoziiert werden.
-
Danach
wird die codierende Sequenz unter die Kontrolle von geeigneten Kontrollelementen
gestellt, abhängig
vom System, das für
die Expression verwendet werden soil. So kann die codierende Sequenz
unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomenbindungsstelle
(für eine
bakterielle Expression) und gegebenenfalls eines Operators gestellt
werden, so dass die DNA-Sequenz
von Interesse durch eine geeignete Transformante in RNA transkribiert
wird. Die codierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz, das/die
später
durch den Wirt in der posttranslationalen Prozessierung entfernt
wird, enthalten, dies muss jedoch nicht der Fall sein. Vgl. z. B.
die
US Patente Nr. 4 431 739 ,
4 425 437 und
4 338 397 .
-
Es
kann wünschenswert
sein, zusätzlich
zu Kontrollsequenzen noch regulatorische Sequenzen zuzufügen, die
eine Regulation der Expression der Sequenzen in Bezug auf das Wachstum
der Wirtszelle erlauben. Regulatorische Sequenzen sind dem Fachmann
bekannt, und Beispiele schließen
diejenigen ein, welche die Expression eines Gens bewirken, die als
Antwort auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich des
Vorliegens einer regulatorischen Verbindung, an oder abgeschaltet
werden soll. Im Vektor können
auch andere Typen von regulatorischen Elementen vorliegen. Z. B.
können
hier Enhancerelemente verwendet werden, um Expressionsspiegel der
Konstrukte zu erhöhen.
Beispiele umfassen den frühen SV40-Gen-Enhancer
(Dijkema et al. (1985), EMBO J. 4: 761), den Enhancer/Promotor,
der von der langen terminalen Sequenzwiederholung (LTR) des Rous-Sarkom-Virus
stammt (Gorman et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777)
und Elemente, die vom menschlichen CMV stammen (Boshart et al. (1985),
Cell 41: 521), wie Elemente, die in der CMV-Intron-A-Sequenz eingeschlossen
sind (
US Patent Nr. 5 688 688 ).
Die Expressionskassette kann weiterhin einen Replikationsursprung
für die
autonome Replikation in einer geeigneten Wirtszelle, einen oder
mehrere selektierbare Marker, eine oder mehrere Restriktionsstellen,
eine Möglichkeit für eine hohe
Kopienzahl und einen starken Promotor einschließen.
-
Ein
Expressionsvektor wird so konstruiert, dass die bestimmte codierende
Sequenz zusammen mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen in
dem Vektor liegt, wobei die Positionierung und Orientierung der codierenden
Sequenz in Bezug auf die Kontrollsequenz so ist, dass die codierende
Sequenz unter der ”Kontrolle” der Kontrollsequenzen
transkribiert wird (d. h. die RNA-Polymerase, die an das DNA-Molekül an den Kontrollsequenzen
bindet, transkribiert die codierende Sequenz). Modifikationen der
Sequenzen, welche das Molekül
von Interesse codieren, können
wünschenswert
sein, um dieses Ziel zu erreichen. Z. B. kann es in einigen Fällen erforderlich
sein, die Sequenz so zu modifizieren, dass sie an die Kontrollsequenzen
in der geeigneten Orientierung angehängt werden kann, d. h. um das
Leseraster aufrechtzuerhalten. Die Kontrollsequenzen und andere
regulatorische Sequenzen können
vor der Insertion in einen Vektor an die codierende Sequenz gebunden
werden. Alternativ kann die codierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor
cloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete
Restriktionsstelle enthält.
-
Wie
vorstehend erklärt
kann es auch wünschenswert
sein, Mutanten oder Analoga eines Antigens, das von Interesse ist,
zu produzieren. Verfahren hierfür
sind beschrieben z. B. in: Dasmahapatra et al.,
US Patent Nr. 5 843 752 ; und Zhang
et al.,
US Patent Nr. 5 990 276 .
Mutanten oder Analoga von anderen HCV-Proteinen zur Verwendung in den vorliegenden
Tests können
hergestellt werden durch die Deletion eines Teils der Sequenz, welche
das Polypeptid von Interesse codiert, durch Insertion einer Sequenz
und/oder durch Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden
innerhalb der Sequenz. Verfahren zum Modifizieren von Nucleotidsequenzen,
wie positionsgerichtete Mutagenese und dergleichen, sind dem Fachmann
bekannt. Vgl. z. B. Sambrook et al., vorstehend; Kunkel, T. A.,
(1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 448; Geisselsoder et al. (1987),
BioTechniques 5: 786; Zoller und Smith (1983), Methods Enzymol.
100: 468; Dalbie-McFarland et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79: 6409.
-
Die
Moleküle
können
in einer großen
Vielfalt von Systemen exprimiert werden, einschließlich Insekten-,
Säuger-,
Bakterien-, Viren- und Hefe-Expressionssysteme, die alle auf dem
Fachgebiet bekannt sind.
-
Z.
B. sind Insektenzellen-Expressionssysteme, wie Baculovirus-Systeme, dem Fachmann
bekannt und z. B. in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment
Station Bulletin Nr. 1555 (1987), beschrieben. Material und Methoden
für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme
sind im Handel in Kitform von, u. a., Invitrogen, San Diego, CA,
(”MaxBac” Kit) verfügbar. Genauso
sind Bakterien- und
Säugerzellen-Expressionssysteme
auf dem Fachgebiet bekannt und z. B. in Sambrook et al., vorstehend,
beschrieben. Auch sind Hefe-Expressionssysteme auf dem Fachgebiet
bekannt und z. B. in ”Yeast
Genetic Engineering” (Barr
et al., Hrsg., 1989), Butterworths, London, beschrieben.
-
Außerdem sind
verschiedene geeignete Wirtszellen bekannt, die zusammen mit den
vorstehenden Systemen eingesetzt werden können. Z. B. sind Säugerzelllinien
auf dem Fachgebiet bekannt und schließen immortalisierte Zelllinien
ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC) verfügbar sind,
wie, jedoch nicht beschränkt
auf Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), HeLa-Zellen,
Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen), Affennierenzellen (COS),
menschliche embryonale Nierenzellen, menschliche hepatozelluläre Karzinomzellen
(z. B. Hep G2), Madin-Darby
Rindernierenzellen (”MDBK”-Zellen)
und andere. Genauso können
bakterielle Wirte, wie E. coli, Bacillus subtilis und Streptococcus
spp., in Verbindung mit den vorliegenden Expressionskonstrukten
eingesetzt werden. Hefewirte, die in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
schließen
u. a. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa,
Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis;
Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombeund
Yarrowia lipolytica ein. Insektenzellen zur Verwendung in Verbindung
mit den Baculovirus-Expressionsvektoren schließen u. a. Aedes aegypti, Autographa
californica, Bombyxmori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda
und Trichoplusiani ein.
-
Nucleinsäuremoleküle, die
Nucleotidsequenzen von Interesse umfassen, können in ein Wirtszellengenom
stabil integriert sein oder sie können auf einem stabilen episomalen
Element in einer geeigneten Wirtszelle aufrechterhalten bleiben,
wobei verschiedene Gen-Transportsysteme verwendet werden können, die
auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vgl. z. B. das
US Patent 5 399 346 .
-
Abhängig vom
ausgewählten
Expressionssystem und vom ausgewählten
Wirt werden die Moleküle hergestellt,
indem Wirtszellen, welche durch einen vorstehend beschriebenen Expressionsvektor
transformiert sind, unter Bedingungen gezüchtet werden, durch welche
das Protein exprimiert wird. Anschließend wird das exprimierte Protein
aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Wenn das Expressionssystem
das Protein in Wachstumsmedien ausscheidet, kann das Produkt direkt
aus den Medien gereinigt werden. Wenn es nicht ausgeschieden wird,
kann es aus Zelllysaten isoliert werden. Die Auswahl der geeigneten
Wachstumsbedingungen und Methoden zur Gewinnung sind auf dem Fachgebiet
bekannt.
-
Die
rekombinante Produktion von verschiedenen HCV-Antigenen wurde beschrieben. Vgl. z.
B. Houghton et al.,
US Patent
Nr. 5 350 671 ; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993),
8: S33–39;
Chien et al., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/00365 ; Chien,
D. Y., Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 94/01778 .
-
Immundiagnostische Tests
-
Die
vorstehenden Anti-Core-Antikörper
und NS3/4a-Antigene werden, sobald sie produziert wurden, für die Verwendung
in den vorliegenden Immuntests auf einen geeigneten festen Träger aufgebracht.
Ein fester Träger
für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges Material sein,
das eine unlösliche Matrix
darstellt, und kann eine starre oder halbstarre Oberfläche aufweisen.
Beispielhafte feste Träger
schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf Substrate, wie Nitrocellulose (z. B. in Form von Membranen oder Mikrotitervertiefungen);
Polyvinylchlorid (z. B. Folien oder Mikrotitervertiefungen); Polystyrol-Latex
(z. B. Perlen oder Mikrotiterplatten); Polyvinylidinfluorid; diazotiertes
Papier; Nylonmembranen; aktivierte Perlen, magnetisch reagierende
Perlen und dergleichen. Bestimmte Träger schließen Platten, Pellets, Scheiben,
Kapillaren, Hohlfasern, Nadeln, Spitzen, feste Fasern, Celluloseperlen,
Porenglasperlen, Silicagele, Polystyrolperlen, gegebenenfalls mit
Divinylbenzol vernetzt, Pfropf-Copolymer-Perlen, Polyacrylamid-Perlen,
Latex-Perlen, Dimethylacrylamid-Perlen, gegebenenfalls vernetzt
mit N-N'-bis-Acryloylethylendiamin,
und Glaspartikel, beschichtet mit einem hydrophoben Polymer.
-
Die
Moleküle,
die zu dem festen Träger
zugefügt
werden sollen, können,
sofern es gewünscht
wird, ohne Weiteres funktionalisiert werden, so dass Styrol- oder
Acrylatreste erzeugt werden, wodurch der Einbau der Moleküle in Polystyrol,
Polyacrylat oder andere Polymere, wie Polyimid, Polyacrylamid, Polyethylen,
Polyvinyl, Polydiacetylen, Polyphenylenvinylen, Polypeptid, Polysaccharid,
Polysulfon, Polypyrrol, Polyimidazol, Polythiophen, Polyether, Epoxidprodukte,
Silicaglas, Silicagel, Siloxan, Polyphosphat, Hydrogel, Agarose,
Cellulose und dergleichen, möglich
gemacht wird.
-
In
einem bestimmten Zusammenhang wird ein fester Träger zuerst mit den HCV-Anti-Core-Antikörpern und
dem NS3/4a-Epitop (hier zusammen als ”die Festphasen-Komponenten” bezeichnet)
und gegebenenfalls mit einem oder mehreren MEFAs unter geeigneten
Bindungsbedingungen umgesetzt, so dass die Moleküle an den Träger ausreichend
immobilisiert werden. Manchmal kann die Immobilisierung an den Träger gesteigert werden,
indem das Antigen und/oder der Antikörper zuerst an ein Protein
mit besseren Festphasen-Bindungseigenschaften gekoppelt werden/wird.
Geeignete Kopplungsproteine schließen ein, sind jedoch nicht
beschränkt
auf Makromoleküle,
wie Serumalbumine, einschließlich
Rinderserumalbumin (BSA), Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Immunglobulin-Moleküle, Thyroglobulin,
Ovalbumin und andere Proteine, die dem Fachmann bekannt sind.
-
Andere
Reagenzien, die verwendet werden können, um Moleküle an den
Träger
zu binden, schließen Polysaccharide,
Polymilchsäuren,
Polyglykolsäuren,
polymere Aminosäuren,
Aminosäure-Copolymere
und dergleichen ein. Solche Moleküle und Methoden zur Kopplung
dieser Moleküle
an Antigene sind dem Fachmann bekannt. Vgl. z. B. Brinkley, M. A.,
(1992), Bioconjugate Chem. 3: 2–13;
Hashida et al. (1984), J. Appl. Biochem. 6: 56–63; und Anjaneyulu und Staros
(1987), International J. of Peptide and Protein Res. 30: 117–124.
-
Nach
Umsetzen des festen Trägers
mit den Festphasen-Komponenten
werden jegliche nicht-immobilisierte Festphasen-Komponenten vom Träger durch Waschen entfernt,
und danach werden die Träger-gebundenen
Komponenten mit einer biologischen Probe, von der man annimmt, dass
sie HCV-Antikörper
und Antigene enthält
(hier zusammen ”Ligandenmoleküle” genannt),
unter geeigneten Bindungsbedingungen in Kontakt gebracht. Nach Waschen
zum Entfernen jeglicher nicht-gebundener Ligandenmoleküle wird
ein zweiter Anti-Core-Antikörper,
der gegen ein anderes Epitop gerichtet ist als der an den Träger gebundene
Anti-Core-Antikörper,
unter geeigneten Bindungsbedingungen zugegeben. Der zugegebene Anti-Core-Antikörper schließt eine
nachweisbare Markierung wie vorstehend beschrieben ein und wirkt
so, dass er an ein möglicherweise
in der Probe vorliegendes Core-Antigen
bindet, das mit dem Träger-gebundenen
Anti-Core-Antikörper reagiert
hat. Außerdem
wird/werden ein oder mehrere Antigene zugegeben, die mit in der
Probe vorliegenden Antikörpern
reagieren können,
die ihrerseits mit dem NS3/4a-Epitop reagiert haben. Wie vorstehend
erklärt, stammt
das Antigen typischerweise aus der NS3-Region des HCV-Polyproteins
und insbesondere aus der c33c-Region von HCV. Vgl. Houghton et al.,
US Patent Nr. 5 350 671 ;
Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 89: 10011–10015;
Internationale Veröffentlichung
Nr.
WO 93/00365 ; und
zugelassene US Patentanmeldungen der gleichen Anmelder Serien-Nr.
08/403 590 und 08/444 818; für
eine Beschreibung dieser Region und von daraus stammenden Epitopen.
Außerdem
wird ein markierter Antikörper
zugegeben, der gegen dieses Antigen gerichtet ist. Deshalb bindet
der Antikörper
dann an das Antigen, welches mit in der Probe vorliegenden Anti-N53-Antikörpern reagiert
hat. Für
diesen Zweck kann das c33c-Epitop einfach als eine Fusion zwischen
c33c und menschlicher Superoxid-Dismutase (hSOD) bereitgestellt
werden, die rekombinant erzeugt wird, z. B. durch Verfahren, die
in Houghton et al.,
US Patent
Nr. 5 350 671 beschrieben sind. Die Nucleotid und Aminosäuresequenzen
für die
menschliche SOD sind bekannt und in Hallewell et al.,
US Patent Nr. 5 710 033 , angegeben.
Somit kann ein markierter Antikörper,
der gegen menschliche SOD gerichtet ist, verwendet werden, um das
Vorliegen von Komplexen nachzuweisen, die zwischen dem NS3/4a-Epitop,
jeglichen Antikörpern
in der Probe, die mit diesem Epitop reagieren, und HCV-Polypeptiden,
die ihrerseits an den Antikörper
in der Probe binden, gebildet werden.
-
Wenn
ein MEFA auf dem festen Träger
vorliegt, kann/können
zu dem Test auch ein oder mehrere zusätzliche Antigene zugegeben
werden, die mit Antikörpern
aus der biologischen Probe reaktiv sind, welche an Antigene gebunden
sind, die auf dem MEFA vorliegen. Besonders geeignet ist in diesem
Zusammenhang ein Antigen, das aus der Core-Region von HCV stammt,
und insbesondere aus dem c22-Antigen, das 119 N-terminale Core-Aminosäuren des
HCV-Polyproteins
einschließt.
Ein bestimmtes Antigen, das von c22 stammt, ist c22ks Δ47-L44W,
das die Aminosäuren
Lys10 bis Ser99 des
Polyproteins einschließt,
sowie eine Deletion von Arg47, das normalerweise
vorliegt, und eine Substitution von Leu für Trp an Position 44. Wie beim
vorstehend beschriebenen c33c-Epitop kann dieses Antigen als eine
Fusion mit hSOD bereitgestellt werden, und der gleiche markierte
Antikörper,
der gegen menschliche SOD gerichtet ist, kann eingesetzt werden,
um das Vorliegen von Komplexen nachzuweisen, die zwischen in der
Probe vorliegenden Antikörpern
und dem NS3/4a-Epitop und/oder dem MEFA gebildet werden, wobei diese
Komplexe auch an die HCV-Antigene gebunden sind (z. B. c33c und
c22).
-
Insbesondere
kann ein ELISA-Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte mit den Festphasen-Komponenten beschichtet sind. Sodann
wird eine biologische Probe, welche Ligandenmoleküle enthält oder
von der angenommen wird, dass sie Ligandenmoleküle enthält, zu den beschichteten Vertiefungen
zugegeben. Nach einem ausreichenden Inkubationszeitraum, um die
Bindung von Ligandenmolekül
an die immobilisierte Festphasen-Komponente zuzulassen, kann (können) die
Platte(n) gewaschen werden, um ungebundene Einheiten zu entfernen,
und sodann werden ein nachweisbar markiertes sekundäres Bindungsmolekül (markierter
Anti-Core-Antikörper),
ein NS3-Epitop-enthaltendes Molekül und ein gegen das NS3-Epitop enthaltende
Molekül
gerichteter Antikörper
zugegeben. Diese Moleküle
lässt man
mit jeglichen eingefangenen Proben-Antigen und Antikörper reagieren,
die Platte wird gewaschen und das Vorliegen der markierten Antikörper wird
unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind,
nachgewiesen.
-
Die
vorstehend beschriebenen Testreagenzien, einschließlich des
festen Trägers
für einen
Immuntest mit gebundenen Antikörpern
und Antigenen, und außerdem
Antikörper
und Antigene, die mit der eingefangenen Probe umgesetzt werden sollen,
können
in Kits zusammen mit geeigneten Anweisungen und anderen erforderlichen
Reagenzien bereitgestellt werden, so dass Immuntests wie vorstehend
beschrieben durchgeführt werden
können.
Das Kit kann auch, abhängig
von dem bestimmten verwendeten Immuntest, geeignete Markierungen
und andere verpackte Reagenzien und Stoffe (d. h. Waschpuffer und
dergleichen) enthalten. Unter Verwendung dieser Kits können Standard-Immuntests
wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind, durchgeführt werden.
-
III. Experimenteller Teil
-
Nachstehend
sind Beispiele für
spezielle Ausführungsformen
zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung angegeben. Die Beispiele sollen lediglich
der Erläuterung
dienen und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung
einschränken.
-
Es
wurde großer
Wert darauf gelegt, dass hinsichtlich der verwendeten Zahlenangaben
(z. B. Mengen, Temperaturen usw.) auf Genauigkeit geachtet wurde,
jedoch sollten natürlich
ein gewisser experimenteller Fehler und eine gewisse Abweichung
erlaubt sein.
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REFERENZBEISPIEL 1
-
HCV-Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntest
-
Ein
HCV-Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntest
wurde mit anderen HCV-Tests verglichen, wobei wie folgt die Serokonversion-Erfassungsgrenzen
getestet und diese Grenzen mit denjenigen in anderen im Handel verfügbaren Tests
verglichen wurden.
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A. Materialien und Methoden
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Blutproben:
Repräsentative
Gruppen (”Panels”) von im
Handel verfügbaren
menschlichen Blutproben wurden verwendet. Solche Panels sind z.
B. verfügbar
von Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical
Partners, Franklin, MA (BCP); und North American Biologics, Inc.,
BocoRatan, FL (NABI). Die in den Tabellen 5 und 6 angegebenen Tage
sind die Tage, an welchen den Individuen Blut abgenommen wurde.
-
Monoclonale
Antikörper:
Die monoclonalen Antikörper
c11-3, c11-7 und c11-14 wurden von Ortho Clinical Diagnostics, Raritan,
New Jersey, bezogen. Die Antikörper
c11-3 und c11-7 sind gegen einen N-terminalen Teil des Core gerichtet
(Aminosäuren
10 bis 53, nummeriert in Bezug auf das HCV1-Polyprotein). Der monoclonale
Antikörper
c11-14 ist gegen einen C-terminalen Teil des Core gerichtet (Aminosäuren 120
bis 130, nummeriert in Bezug auf das HCV1-Polyprotein). Der Antikörper c11-14
wurde unter Verwendung von Standardverfahren an Meerrettich-Peroxidase
(HRP) konjugiert.
-
Der
monoclonale Antikörper
5A-3 ist ein Anti-SOD-Antikörper,
der gegen die Aminosäuren
1 bis 65 von SOD gerichtet ist, und wurde unter Verwendung von Standardverfahren
hergestellt. Der Antikörper
wurde wie vorstehend beschrieben an HRP konjugiert.
-
B. Antigene
-
Das
Antigen c33c (266 Aminosäuren,
Aminosäuren
1192 bis 1457 des HCV1-Polyproteins) wurde als ein inneres SOD-Fusionspolypeptid
in E. coli durch Verfahren exprimiert, die für die Synthese des Antigens 5-1-1
beschrieben sind (Choo et al., Science (1989), 244: 359–362). Das
rekombinante Antigen wurde wie in Chien et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (1989), 89: 10011–10015,
beschrieben gereinigt. Vgl. auch Houghton et al.,
US Patent Nr. 5 350 671 für Herstellungsprotokolle
für SOD-c33c.
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Das
im Test verwendete NS3/4a-Epitop ist ein Konformationsepitop, das
die in 3 angegebene Sequenz aufweist.
-
C. Immuntest-Formate
-
Der ”Abbott
PRISM Assay” (Abbott
Laboratories, Abbott Park, IL) ist kommerziell verfügbar und
stellt einen Antikörper-basierten
Nachweistest dar. Der Test wurde unter Verwendung der Anleitungen
des Herstellers durchgeführt.
-
Das ”ORTHO HCV
Version 3.0 ELISA Test System” (hier
als Ortho-3.0-Test bezeichnet, Ortho Clinical Diagnostics, Raritan,
New Jersey) ist ein Antikörper-basierter
Nachweistest. Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des
Herstellers durchgeführt.
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Der ”Roche Amplicor
Assay” (Roche,
Pleasant, CA) ist ein kommerziell verfügbarer PCR-basierter Test.
Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers
durchgeführt.
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Der ”Gen-Probe
TMA Assay” (San
Diego, CA) ist ein kommerziell verfügbarer Transkriptions-vermittelter
Amplifikationstest. Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
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Der ”Ortho Antigen
Assay” (Ortho
Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ist ein Antigen-basierter Nachweistest.
Der Test wurde unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers
durchgeführt.
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Der
vorliegende HCV-Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntest wurde wie
folgt durchgeführt.
4 mg/ml jeweils der gereinigten monoclonalen Antikörper C11-7
und C11-3 in 1 × Phosphat-gepufferter
Kochsalzlösung
(PBS), pH 7,4, wurden miteinander kombiniert und gut gemischt. 90
ng des rekombinanten N53/4a-Antigens wurden zu dem gleichen Beschichtungspuffer
zugegeben. Die Lösung
wurde vor der Beschichtung 30 Min gemischt. 200 μ der vorstehenden Lösung wurden
pro Vertiefung zu Medium-Bindungs-Costar-Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen (Corining, Inc.) zugegeben. Die Platten wurden
16 bis 24 Stunden bei 15 bis 30°C
inkubiert. Die Platten wurden zweimal mit DH2O,
anschließend
mit 300 μ/Vertiefung Nachbeschichtungspuffer
(”postcoat
buffer”)
(1% Rinderserumalbumin (BSA), 1 × PBS) eine Stunde und mit 300 μ/Vertiefung
Stabilitätspuffer
(1 × PBS,
1% BSA, Mannit, Polyethylenglykol (PEG), Gelatine) eine Stunde gewaschen.
Die Platten wurden abgesaugt und 24 Stunden bei 4°C in einem
Gefriertrockner getrocknet. Die Platten wurden mit einem Trocknungsmittel
geliefert.
-
Zur
Durchführung
des Antigen/Antikörper-Kombinations-Immuntests wurden
100 μ verstärkter Lysepuffer
(1% N-Laurylsarconin,
0,65 M NaCl, 50 mg/ml Maus-IgG, technische Qualität (Sigma,
St. Louis, MO), 1% BSA Sulfhydryl-modifiziert (Bayer), 0,1% Casein)
zu der Platte zugegeben. Sodann wurden 100 μ Probe zugefügt. Dies wurde auf einem Schüttler eine
Stunde bei 40°C
inkubiert. Die Platten wurden sechsmal mit 1 × PBS, 0,1 Tween-20, auf einer
Ortho-Plattenwaschvorrichtung (”Ortho
Plate Washer”)
gewaschen. 200 μ Konjugatlösung (1:75-Verdünnung c11-14-HRP mit 250 ng/Test
SOD-c33c-Antigen plus 1:5000-Verdünnung Maus-Anti-SOD-HRP in
HCV 3.0-Probenverdünnungsmittel
(”HCV
3.0 sample diluent”)
(von ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinical Diagnostics,
Raritan, New Jersey) ohne SOD-Extrakt, wobei alle 30 Minuten vor
der Zugabe hergestellt wurden). Die Lösung wurde 45 Minuten unter
Schütteln
bei 40°C
inkubiert. Anschließend
wurde sie sechsmal wie vorstehend gewaschen und sodann mit 200 Al
Substratlösung
(1 OPD-Tablette/10 ml) versetzt. Die OPD-Tablette enthält o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
und Wasserstoffperoxid für
die Farbentwicklung der Meerrettich-Peroxidase-Reaktion und ist von Sigma,
St. Louis, MO, verfügbar. Das
Ganze wurde 30 Minuten bei 15 bis 30°C im Dunkeln inkubiert. Die
Umsetzung wurde durch Zugabe von 50 ml 4 N H2504 beendet und die
Platten bei 492 nm mit Bezug auf Absorption bei 690 nm als Kontrolle
abgelesen.
-
D. Ergebnisse
-
Die
Ergebnisse der verschiedenen Tests sind in den Tabellen 5 und 6
dargestellt, welche zwei getrennte Experimente zeigen, die an einer
HCV-Infektion ausgesetzten Blutproben wie angegeben durchgeführt wurden.
Die schattierten Flächen
zeigen einen Nachweis des Virus. Wie nachstehen angegeben wies der
Kombinations-Antigen/Antikörper-Test
von Chiron in allen Proben eine Serokonversion nach, während alle
anderen Antikörper-
und Antigen-basierten Tests beim Nachweis der Serokonversion in
mindestens einer Probe versagten. Insbesondere wies keiner der Antikörper-basierten
Tests bis zu mindestens Tag 18 eine Serokonver sinn nach (Tabelle
5). Tabelle 6 zeigt, dass keiner der Antikörperbasierten Tests am Tag
22 das Vorliegen einer HCV-Infektion nachwies. Außerdem versagte
der Antigen-basierte Test von Ortho beim Nachweis der Serokonversion
vom Tag 85 ab.
-
Somit
ist aufgrund der vorstehenden Ergebnisse klar, dass der neue Antikörper/Antigen-Kombinationstest
die Zahl von falsch negativen Ergebnissen reduziert, die unter Verwendung
anderer herkömmlicher Antikörper- und
Antigen-basierter Tests erhalten werden.
Tabelle
5 HCV-Serokonversion |
Tage | Abbott PRISM | Ortho
3.0 | Roche
Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho
Ag | Chiron Ag/Ab |
0 | 0,1 | 0,0 | > 5 × 105 | 9,25 | 18,6 | 2,8 |
4 | 0,1 | 0,0 | > 5 × 105 | 9,29 | 19,0 | 3,1 |
7 | 0,1 | 0,0 | > 5 × 105 | 9,52 | 22,3 | 1,5 |
13 | 0,3 | 0,1 | > 5 × 105 | 9,59 | 26,2 | 1,7 |
18 | 1,3 | 0,4 | > 5 × 105 | 9,70 | 15,9 | 1,2 |
21 | 2,2 | 1,0 | > 5 × 105 | 9,39 | 11,3 | 1,5 |
164 | 4,2 | 4,4 | 4 × 104 | 9,28 | 0,11 | 2,5 |
Tabelle
6 HCV-Serokonversion |
Tage | Abbott PRISM | Ortho
3.0 | Roche
Amplicor | Gen-Probe TMA | Ortho
Ag | Chiron Ag/Ab |
0 | 0,1 | 0,0 | BLD | | 0,11 | 0,5 |
13 | 0,1 | 0,0 | > 5 × 105 | | 44,0 | 3,0 |
20 | 0,1 | 0,0 | > 5 × 105 | | 24,2 | 1,3 |
22 | 0,3 | 0,0 | > 5 × 105 | | 29,2 | 1,6 |
85 | 5,4 | 4,7 | BQR | | 0,06 | 1,1 |
131 | 4,3 | 4,7 | BQR | | 0,09 | 1,0 |
135 | 4,6 | 4,7 | 3 × 103 | | 0,09 | 1,2 |
138 | 5,5 | 4,7 | BLD | | 0,08 | 1,2 |
146 | 5,9 | 4,7 | BLD | | 0,11 | 2,1 |
152 | 5,2 | 4,7 | BQR | | 0,07 | 1,8 |
-
BEISPIEL 2
-
Produktion eines NS3/4a-Konformationsepitops
mit Thr-zu-Pro- und Ser-zu-Ile-Substitutionen
-
Ein
Konformationsepitop von NS3/4a wurde wie folgt erhalten. Dieses
Epitop hat die in den 4A bis 4D angegebene
Sequenz und unterscheidet sich von der nativen Sequenz in den Positionen
403 (Aminosäure
1428 der vollständigen
HCV-1-Sequenz) und 404 (Aminosäure
1429 der vollständigen
HCV-1-Sequenz). Insbesondere wurde das Thr, das normalerweise an
Position 1428 der nativen Sequenz vorliegt, zu Pro mutiert, und
Ser, das normalerweise an Position 1429 der nativen Sequenz vorliegt,
wurde zu lle mutiert.
-
Insbesondere
wurde der Hefe-Expressionsvektor pBS24.1 wie vorstehend beschrieben
verwendet. Das Plasmid pd.hcvla.ns3ns4aPl, welches ein repräsentatives
NS3/4a-Epitop codierte, das in den vorliegenden Immuntest verwendet
wurde, wurde wie folgt hergestellt. Ein zweistufiges Verfahren wurde
eingesetzt. Zuerst wurden die folgenden DNA-Stücke miteinander verbunden:
(a) synthetische Oligonucleotide, die eine 5' HindIII-Clonierungsstelle bereitstellen
würden,
gefolgt von der Sequenz ACAAAACAAA, dem Initiator-ATG und Codons
für HCV1a,
beginnend mit Aminosäure
1027 und fortsetzend bis zu einer BglI-Stelle an Aminosäure 1046;
(b) ein 683 bp BglI-ClaI-Restriktionsfragment (welches die Aminosäuren 1046
bis 1274 codiert) aus pAcHLTns3ns4aPl; und (c) ein pSP72-Vektor (Promega,
Madison, WI, GenBank/EMBL Hinterlegungsnummer X65332), der mit HindIII
und ClaI gespalten, dephosphoryliert und Gel-gereinigt worden war.
Das Plasmid pAcHLTns3ns4aPl wurde von pAcHLT hergeleitet, einem
Baculovirus-Expressionsvektor,
der von BD Pharmingen (San Diego, CA) kommerziell verfügbar ist.
Insbesondere wurde ein pAcHLT-EcoRI-PstI-Vektor hergestellt, und außerdem die
folgenden Fragmente: Eco-RI-AlwnI,
935 bp, entsprechend den Aminosäuren
1027 bis 1336 des HCV-1-Genoms; AlwnI-SacII, 247 bp, entsprechend
den Aminosäuren
1336 bis 1419 des HCV-1-Genoms; HinfI-BglI, 175 bp, entsprechend
den Aminosäuren
1449 bis 1509 des HCV-1-Genoms; BglI-PstI, 619 bp, entsprechend
den Aminosäuren
1510 bis 1711 des HCV-1-Genoms,
plus das Transkriptions-Terminations-Codon. Ein synthetisch erzeugtes
SacII-HinfI-Fragment von 91 bp, entsprechend den Aminosäuren 1420
bis 1448 des HCV-1-Genoms und enthaltend die PI-Mutationen (Thr-1428
mutiert zu Pro, Ser-1429 mutiert zu lle), wurde mit dem 175 bp HinfI-BglI-Fragment
und dem 619 bp BglI-PstI-Fragment
wie vorstehend beschrieben ligiert und in einen pGEM-5Zf(+)-Vektor subcloniert,
der mit SacII und PstI gespalten worden war. pGEM-5Zf(+) ist ein
kommerziell verfügbarer
E. coli-Vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Hinterlegungsnummer
X65308). Nach der Transformation kompetenter HB101-Zellen, einer
Miniscreen-Analyse einzelner Clone und einem Verifizieren der Sequenz
wurde ein 885 bp SacII-PstI-Fragment aus pGEM5.PI Clon 2 Gel-gereinigt.
Dieses Fragment wurde mit dem 935 bp EcoRI-AlwnI- Fragment, dem 247 bp AlwnI-SacII-Fragment
und dem pAcHLT-EcoRI-PstI-Vektor
wie vorstehend beschrieben ligiert. Das resultierende Konstrukt
wurde mit pAcHLTns3ns4aPl bezeichnet.
-
Das
vorstehende Ligierungsgemisch wurde in kompetente HB101-Zellen transformiert
und auf Luria-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten,
plattiert. Anhand von Miniprep-Analysen einzelner Clone wurden mutmaßliche positive
Clone identifiziert, von denen zwei amplifiziert wurden. Die Plasmid-DNA
für pSP72
1aHC, Clone Nr. 1 und Nr. 2, wurden mit einem Qiagen Maxiprep-Kit
hergestellt und sequenziert.
-
Als
nächstes
wurden die folgenden Fragmente miteinander ligiert: (a) ein 761
bp HindIII-Clal-Fragment aus pSP721aHC Nr. 1 (pSP72.1aHC wurde erzeugt,
indem die folgenden miteinander ligiert wurden: pSP72, der mit HindIII
und ClaI gespalten worden war, synthetische Oligonucleotide, die
eine 5 HindIII-Clonierungsstelle bereitstellen würden, gefolgt von der Sequenz
ACAAAACAAA, dem Initiationscodon ATG und Codons für HCV1a,
beginnend mit Aminosäure
1027 und fortsetzend bis zu einer BglII-Stelle an Aminosäure 1046,
und ein 683 bp BglII-ClaI-Restriktionsfragment (das die Aminosäuren 1046
bis 1274 codiert) aus pAcHLTns3ns4aPl); (b) ein 1353 bp BamHI-HindIII-Fragment
für den
Hefe-Hybrid-Promotor
ADH2/GAPDH; (c) ein 1320 bp ClaI-SalI-Fragment (welches die Aminosäuren 1046
bis 1711 von HCV1a codiert, wobei Thr-1428 zu Pro mutiert ist und
Ser-1429 zu lle mutiert ist) aus pAcHLTns3ns4aPl; und (d) der Hefe-Expressionsvektor
pBS24.1, der mit BamHI und SalI gespalten, dephosphoryliert und
Gel-gereinigt worden war. Das Ligierungsgemisch wurde in kompetente
HB101-Zellen transformiert
und auf Luria-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten,
plattiert. Anhand von Miniprep-Analysen einzelner Kolonien wurden
Clone mit dem erwarteten 3446 bp BamHI-SalI-Insert identifiziert,
bestehend aus dem ADH2/GAPDH-Promotor,
dem Initiator-Codon ATG und HCV1aNS3/4a aus den Aminosäuren 1027
bis 1711 (dargestellt als Aminosäuren
1 bis 686 der 4A bis 4D), wobei
Thr-1428 (Aminosäureposition
403 der 4A bis 4D) zu
Promutiert ist, und Ser-1429 (Aminosäureposition 404 der 4A bis 4D)
zu lle mutiert ist. Das Konstrukt wurde mit pd.HCVla.ns3ns4aPl bezeichnet
(vgl. 5).
-
S.
cerevisiae-Stamm AD3 wurde mit pd.HCVla.ns3ns4aPl transformiert,
und einzelne Transformanten wurden nach Weglassen von Glucose im
Medium auf eine Expression untersucht. Das rekombinante Protein wurde
in Hefe mit hohen Raten exprimiert, wie durch Coomassie-Blau-Färbung nachgewiesen
und durch Immunblot-Analyse unter Verwendung eines polyclonalen
Antikörpers
gegen die Helicase-Domäne
von NS3 bestätigt
wurde.
-
BEISPIEL 3
-
Reinigung des NS3/4a-Konformationsepitops
-
Das
NS3/4a-Konformationsepitop wurde wie folgt gereinigt. S. cerevisiae-Zellen
von vorstehend, welche das NS3/4a-Epitop exprimierten, wurden wie
vorstehend beschrieben geerntet. Die Zellen wurden in Lysepuffer
(50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin,
1 μM Leupeptin) suspendiert
und in einer Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Schweiz) oder
einer gleichwertigen Apparatur unter Verwendung von Glasperlen bei
einem Verhältnis
von 1:1:1 Zellen:Puffer:0,5-mm-Glasperlen Iysiert.
Das Lysat wurde 30 Min. bei 4°C
bei 30100 × g
zentrifugiert und das Pellet, welches die unlösliche Proteinfraktion enthielt,
wurde zu Waschpuffer zugegeben (6 ml/g Zellpellet-Ausgangsgewicht)
und 15 Min. bei Raumtemperatur gerüttelt. Der Waschpuffer bestand
aus 50 mM NaPO4, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol,
10% Glycerin, 0,05% Octylglucosid, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin,
1 μM Leupeptin. Zelltrümmer wurden
durch Zentrifugation bei 30100 × g
für 30
Min. bei 4°C
entfernt. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet zurückbehalten.
-
Protein
wurde wie folgt aus dem Pellet extrahiert. 6 ml/g Extraktionspuffer
wurde zugegeben und 15 Min. bei Raumtemperatur gerüttelt. Der
Extraktionspuffer bestand aus 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol,
10% Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin.
Dieses wurde 30 Min. bei 4°C
bei 30100 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde zurückbehalten
und Ammoniumsulfat bis zu 17,5% zugegeben, wobei die folgende Formel
verwende wurde: Volumen des Überstands
(ml) multipliziert mit x% Ammoniumsulfat/(1 – x% Ammoniumsulfat) = ml von
4,1 M gesättigtem
Ammoniumsulfat, die zum Oberstand zugegeben werden müssen. Das
Ammoniumsulfat wurde tropfenweise unter Rühren auf Eis zugefügt und die
Lösung
zehn Minuten auf Eis gerührt.
Die Lösung
wurde bei 17700 × g
30 Minuten bei 4°C
zentrifugiert und das Pellet zurückbehalten
und bis zu 48 Stunden bei 2°C
bis 8°C
gelagert.
-
Das
Pellet wurde resuspendiert und auf einer Poly-U-Säule (Poly
U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) bei 4°C wie folgt laufengelassen.
Das Pellet wurde in 6 ml Poly-U-Äquilibrierungspuffer
pro g Pelletgewicht resuspendiert. Der Äquilibrierungspuffer bestand
aus 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM NaCl, 5 mM DTT (frisch zugegeben),
10% Glycerin, 1,2 Octylglucosid. Die Lösung wurde 15 Min. bei 4°C gerüttelt und
30 Min. bei 4°C
bei 31000 × g
zentrifugiert.
-
Eine
Poly-U-Säule
(1 ml Harz pro g Pellet-Ausgangsgewicht) wurde hergestellt. Die
lineare Fließrate betrug
60 cm/Std., und die Pack-Fließrate
betrug 133% von 60 cm/Std. Die Säule
wurde mit Äquilibrierungspuffer äquilibriert
und der Überstand
des resuspendierten Ammoniumsulfat-Pellets auf die äquilibrierte
Säule aufgetragen.
Die Säule
wurde mit Äquilibrierungspuffer
auf eine Grundlinie gewaschen und sodann das Protein mit einer Stufenelution
im Folgenden Poly-U-Elutionspuffer eluiert: 25 mM HEPES, pH 8,0,
1 M NaCl, 5 mM DTT (frisch zugegeben), 10% Glycerin, 1,2 Octylglucosid.
Das Säuleneluat
wurde auf einer SDS-PAGE
laufen gelassen (Coomassie gefärbt),
und Aliquots wurden eingefroren und bei –80°C gelagert. Das Vorliegen des NS3/4a- Epitops wurde durch
Western-Blot bestätigt,
wobei ein polyclonaler Antikörper,
der gegen die NS3-Protease-Domäne
gerichtet war, und ein monoclonaler Antikörper gegen das 5-1-1-Epitop
(HCV-4a) verwendet wurden.
-
Zusätzlich wurde
die Protease-Enzymaktivität
während
der Reinigung wie folgt überwacht.
Ein NS4A-Peptid (KKGSVVTVGRIVLSGKPAI I PKK) und die Probe, die das
NS3/4a-Konformationsepitop
enthielt, wurden in 90 μl
Reaktionspuffer (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 10%
Glycerin, 0,05 n-Dodecyl-B-D-Maltosid,
5 mM DTT) verdünnt
und ihre Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur zugelassen. 90 μl des Gemisches
wurden zu einer Mikrotiterplatte (Costar, Inc., Corning, NY) zugefügt, und
10 μl HCV-Substrat
(AnaSpec, Inc., San Jose, CA) wurden zugegeben. Die Platte wurde
gemischt und auf einem Fluostar-Plattenlesegerät (”Fluostar
plate reader”)
abgelesen. Die Ergebnisse wurden als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU)
pro Minuten angegeben.
-
Bei
Verwendung dieser Verfahren enthielt das Produkt der Extraktion
mit 1 M NaCl eine Aktivität
von 3,7 RFU/Min., der Ammoniumsulfat-Niederschlag wies eine Aktivität von 7,5
RFU/Min. auf, und das Produkt der Poly-U-Reinigung zeigte eine Aktivität von 18,5
RFU/Min.
-
BEISPIEL 4
-
Kompetitionsuntersuchungen
-
Die
folgende Kompetitionsuntersuchung wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das
NS3/4a-Konformationsepitop unterschiedliche Antikörper als
andere HCV-Antigene nachwies. Insbesondere wurde das NS3/4a-Antigen
mit dem c200-Antigen wie folgt verglichen.
-
0,5 μg und 1,0 μg von NS3/4a,
hergestellt wie vorstehend beschrieben, oder c200 (Hepatology (1992), 15:
19–25,
verfügbar
in dem ORTHO HCV Version 3,0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics,
Raritan, New Jersey) wurden mit 20 μl der Probe PHV914-5 (eine frühe Serokonversions-Blutprobe,
erhalten aus dem Blut eines infizierten Individuums) in einem Gesamtvolumen
von 220 μl
(1 × PBS)
gemischt. Das Gemisch wurde in Mikrovertiefungen eine Stunde bei
37°C inkubiert.
Danach wurde das Gemisch auf NS3/4a-beschichtete Platten überführt und
eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Platten wurden wie folgt gewaschen und getestet.
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1 μg des c200-Antigens
wurde zu 10 μl
der Probe PHV914-5 in einem Gesamtvolumen von etwa 220 μl zugegeben.
Das Gemisch wurde in einer Mikrovertiefung eine Stunde bei 37°C inkubiert,
sodann wurden 200 μl
auf eine NS3/4a-beschichtete Platte (100 ng/Test) überführt und
eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Platten wurden fünfmal
mit 1 × PBS,
0,1% Tween-20, gewaschen. 200 μl
der Konjugatlösung
(wie vorstehend beschrieben) wurden zugegeben und die Platten inkubiert
und getestet. Außerdem
wurden Kontrollen, die aus PHV914-5 und 1 × PBS (ohne Antigen) bestanden,
wie vorstehend behandelt.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Die Ergebnisse der prozentualen
Hemmung, wie in Spalte 4 angegeben, werden berechnet aus Spalte
3 minus (Spalte 2 geteilt durch Spalte 3 mal 100). Wie zu sehen ist,
zeigen die Daten, dass NS3/4a durch Antikörper der frühen Serokonversion neutralisiert
wird und dass dies bei c200 nicht der Fall ist. Ein starkes Signal
wurde erhalten, wenn Antikörper
in einem PHV914-5-c33c-Panel-Mitglied der frühen Serokonversion mit dem
auf der Platte beschichteten NS3/4a reagierten. Das c200-Antigen
wurde durch diese Antikörper
nicht neutralisiert. Dies ist in der oberen Abbildung von Tabelle
7 dargestellt. Wenn NS3/4a mit der Probe PHV914-5 gemischt wurde,
wurde es neutralisiert und deshalb lagen in der Probe keine Antikörper vor,
die mit NS3/4a reagierten, das auf die Mikroplatte beschichtet war.
Die Daten zeigen, dass NS3/4a möglicherweise
eine andere Klasse von Antikörpern
nachweist als diejenigen, die durch c200 nachgewiesen werden.
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BEISPIEL 5
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Stabilitätsuntersuchungen des NS3/4a-Konformationsepitops
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Um
festzustellen, welche Rolle die Stabilität des NS3/4a-Epitops auf die Ausführung des
Tests spielt, wurde die folgende Untersuchung durchgeführt, wobei
die NS3/4a-Immunreaktivität,
bezogen auf die Zeit, bei Raumtemperatur bestimmt wurde. Kleine
Aliquots eines NS3/4a-Stammpräparats
ließ man
bei Raumtemperatur absetzen, und anschließend wurden sie in Abständen, wie
in Tabelle 8 dargestellt, eingefroren. Alle Gläschen wurden gleichzeitig beschichtet
und auf zwei frühe
NS3-Serokonversions-Panels
getestet.
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Wie
in Tabelle 8 zu sehen ist, ist das NS3/4a-Stammpräparat nicht
stabil, wobei die Immunreaktivität mit
der Zeit abnimmt. Außerdem
ist es für
die Immunreaktivität
erforderlich, dass die Konformation von NS3/4a aufrechterhalten
bleibt.
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Weitere
Stabilitätsuntersuchungen
wurden wie folgt durchgeführt.
Zwei monoclonale Konformationsantikörper, die unter Verwendung
von Standardverfahren gegen NS3/4a hergestellt wurden, wurden anstelle von
Anti-HCV-frühen-Serokonversions-Panels verwendet.
Gläschen
mit NS3/4a-Stammpräparaten
wurden bei Raumtemperatur in Abständen von 3, 6 und 24 Stunden
eingefroren. Das NS3/4a aus den gefrorenen Gläschen wurde mit 90 ng/ml beschichtet
und unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens getestet.
Die Ergebnisse legten nahe, dass die zwei Monoclonalen tatsächlich konformationsgemäß vorlagen,
wobei ihre Reaktivität
gegenüber
einer Bearbeitung des NS3/4a-Antigen-Stammpräparats bei
Raumtemperatur empfindlich war. Die Reaktivität eines monoclonalen Antikörpers der
positiven Kontrolle änderte
sich nicht.
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BEISPIEL 6
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Immunreaktivität des NS3/4a-Konformationsepitops
zu denaturiertem NS3/4a
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Die
Immunreaktivität
des NS3/4a-Konformationsepitops, das wie vorstehend beschrieben
hergestellt wurde, wurde mit NS3/4a verglichen, das durch Zugabe
von SDS zu dem NS3/4a-Konformationsepitop-Präparat auf
eine Endkonzentration von 2% denaturiert worden war. Das denaturierte
NS3/4a und das Konformations-NS3/4a wurden wie vorstehend beschrieben
auf Mikrotiterplatten beschichtet. Das c200-Antigen (Hepatology
(1992), 15: 19–25,
verfügbar
in der ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics,
Raritan, New Jersey) wurde auch auf Mikrotiterplatten beschichtet.
Das c200-Antigen wurde als Vergleich verwendet, wobei angenommen
wird, dass es aufgrund des Vorliegens von Reduktionsmittel (DTT)
und Detergens (SDS) in seiner Formulierung nicht-konformationsgemäß vorliegt.
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Die
Immunreaktivität
wurde gegenüber
zwei frühen
HCV-Serokonversions-Panels,
PHV 904 und PHV 914 (kommerziell verfügbare menschliche Blutproben
von Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA), getestet. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt. Die Daten legen nahe,
dass die denaturierte und linearisierte Form von NS3/4a (und auch
c200) frühe
Serokonversions-Panels nicht so früh nachweist wie das NS3/4a-Konformationsepitop.
Tabelle
9
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Die
Immunreaktivität
des Konformationsepitops wurde auch unter Verwendung von monoclonalen
Antikörpern
gegen NS3/4a getestet, die durch Standardverfahren hergestellt wurden.
Diese monoclonalen Antikörper
wurden sodann in dem ELISA-Format auf NS3/4a und denaturiertes NS3/4a
sowie auf 200-Antigen getestet. Die Daten zeigen, dass die gegen
NS3/4a gerichteten monoclonalen Antikörper mit dem NS3/4a und dem
denaturierten NS3/4a in ähnlicher
Weise wie die Serokonversions-Panels wie in Tabelle 10 dargestellt
reagieren. Dieses Ergebnis ist auch ein weiterer Beweis dafür, dass
das NS3/4a konformationsgemäß vorliegt, da
monoclonale Antikörper
hergestellt werden können,
die in der Reaktivität ähnlich sind
wie die frühen c33c-Serokonversions-Panels.
Tabelle
10 |
| Platte |
NS3/4a | dNS3/4a | c200 |
Monoclonaler
Antikörper | | OD | OD | OD |
4B9/E3 | 1:100 | 1,820 | 0,616 | 0,369 |
| 1:1000 | 1,397 | 0,380 | 0,246 |
| 1:10000 | 0,864 | 0,173 | 0,070 |
| 1:20000 | 0,607 | 0,116 | 0,085 |
5B7/D7 | 1:100 | 2,885 | 0,898 | 0,436 |
| 1:1000 | 2,866 | 0,541 | 0,267 |
| 1:10000 | 1,672 | 0,215 | 0,086 |
| 1:20000 | 1,053 | 0,124 | 0,059 |
1A8/H2 | 1:100 | 1,020 | 0,169 | 0,080 |
| 1:1000 | 0,921 | 0,101 | 0,043 |
| 1:10000 | 0,653 | 0,037 | 0,013 |
| 1:20000 | 0,337 | 0,027 | 0,011 |