DE60127939T2

DE60127939T2 - Nukleinsäure-Nachweisverfahren mit universellem Priming

Info

Publication number: DE60127939T2
Application number: DE60127939T
Authority: DE
Inventors: Jian-Bing San Diego FAN; Xiang-Dong San Diego FU
Original assignee: University of California; Illumina Inc
Current assignee: University of California; Illumina Inc
Priority date: 2000-02-07
Filing date: 2001-02-07
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2021-02-08
Also published as: CA2401962A1; WO2001057268A3; EP1255865A2; AU2001238067B2; WO2001057268A2; US6812005B2; DE60127939D1; ATE360095T1; AU3806701A; US20020172946A1; EP1255865B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf die Bereitstellung empfindlicher und genauer Assays zur Gendetektion, Genom-weiten Genexpressions-Profilierung und Überwachung des alternativen Spleißens mit einer minimalen zielspezifischen Amplifikation oder deren Fehlen gerichtet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der Nachweis von spezifischen Nukleinsäuren ist ein wichtiges Werkzeug für die diagnostische Medizin und in der molekularbiologischen Forschung. Gensondenassays spielen derzeit eine Rolle beim Identifizieren infektiöser Organismen, wie Bakterien und Viren, beim Sondieren der Expression von normalen und Mutantengenen und Identifizieren von Mutantengenen, wie Onkogenen, beim Typisieren von Gewebe hinsichtlich der Kompatibilität, die der Gewebetransplantation vorausgeht, beim Anpassen von Gewebe- oder Blutproben für die Gerichtsmedizin und zum Untersuchen der Homologie zwischen Genen aus unterschiedlichen Spezies.
Idealerweise sollte ein Gensondenassay empfindlich, spezifisch und leicht automatisierbar sein (für einen Überblick siehe Nickerson, Current Opinion in Biotechnology 4: 48-51 (1993)). Durch die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und andere Amplifikationstechnologien wurden die Forderungen hinsichtlich der Empfindlichkeit (d. h. untere Nachweisgrenze) weitgehend erfüllt, was es Forschern erlaubt, eine spezifische Nukleinsäuresequenz vor der Analyse exponentiell zu amplifizieren (für einen Überblick siehe Abramson et al., Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47 (1993)).
Die Spezifität bleibt dagegen ein Problem in vielen derzeit verfügbaren Gensondenassays. Das Ausmaß der molekularen Komplementarität zwischen Sonde und Ziel definiert die Spezifität der Interaktion.
Änderungen der Konzentrationen von Sonden, von Zielen und von Salzen in dem Hybridisierungsmedium, der Reaktionstemperatur und der Länge der Sonde können die Spezifität der Sonden/Ziel-Interaktion verändern oder beeinflussen.
Gene in höheren Eukaryoten enthalten Introns, die während des RNA-Processings entfernt werden, so daß reife funktionelle mRNAs erzeugt werden. In den meisten Fällen ist die Entfernung von Introns effizient, und daher sind diese Spleißvorgänge konstitutiv. Jedoch werden viele Transkripte alternativ verarbeitet, so daß mehrere mRNAs aus einem einzelnen mRNA-Präkursor (pre-mRNA) durch die Verwendung von unterschiedlichen 5'- oder 3'-Spleißstellen, Exoneinschluß oder -ausschluß und Intronretention erzeugt werden. Die Komplexität der Genexpression wird in vielen Fällen durch Verknüpfen alternativen Spleißens mit alternativen Promotoren und der Verwendung von alternativen Polyadenylierungsstellen weiter erhöht. Basierend auf einem Vergleich zwischen exprimierten Sequenzmarkierungen (ESTs) in Datenbanken wird geschätzt, daß bis zu 30 % der Gene in Menschen alternatives Spleißen zeigen (Gelfand, M. S., Dubchak, I., Dralyuk, I., & Zorn, M. (1999). ASDB: database of alternatively spliced genes. Nucleic Acids Research 27: 301-302). In Anbetracht der Tatsache, daß ein Transkript oftmals mehr als zwei Isoformen hervorruft, kann die Zahl von alternativ gespleißten mRNAs die Gesamtzahl an Genen, die in einem höheren eukaryotischen Organismus exprimiert werden, übertreffen. Da alternativ gespleißte Transkripte Proteinisoformen kodieren können, die unterschiedliche Funktionen haben, wird es eine Hauptherausforderung in der funktionellen molekularen Genomforschung sein, eine biologische Funktion nicht nur mit der Expression von spezifischen Genen, sondern ebenso mit ihren Isoformen, die aus posttranskriptionalem Processing resultieren, in Verbindung zu bringen. Dies ist für die Krebsforschung besonders relevant, da molekulare Veränderungen während der Malignität aus Veränderungen nicht nur in der Genexpression, sondern ebenso in RNA-Processing resultieren können.
Die funktionellen Konsequenzen von alternativem Spleißen spielen eine entscheidende Rolle in der Biologie und Medizin, was durch eine Vielzahl allgemein bekannter Beispiele veranschaulicht wird.
Epithelzellen sekretieren den azidischen Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), der seinen Rezeptor FGFR2 an der Zelloberfläche von Fibroblasten bindet und aktiviert. Umgekehrt sekretieren Fibroblasten den Keratinozytwachstumsfaktor (KGF), der KGFR an Epithelzellen bindet und aktiviert. Interessanterweise werden FGFR2 und KGFR aus derselben pre-mRNA durch alternatives Spleißen erzeugt (Miki T., et al., (1992). Determination of Ligand-binding specificity by alternative splicing: two distinct growth factor receptors encoded by a single gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 246-250). Dieses zellspezifische alternative Spleißen muß streng geregelt sein, da Zellen, die sowohl einen Wachstumsfaktor als auch seinen spezifischen Rezeptor exprimieren, zu unkontrolliertem Wachstum übergehen werden.
Eine Anzahl von apoptotischen Regulatoren, wie Bcl-x, Ced-4 und Caspase-2 (Ich. 1) hat zwei Isoformen, erzeugt durch alternatives Spleißen (einen Überblick geben Jiang, Z. H., Zhang, W. J., Rao, Y., & Wu, J. Y. (1998) Regulation of Ich-I pre-mRNA alternative splicing and apoptosis by mammalian splicing factors. Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 9155-9160). In jedem Fall beschleunigt eine Form den programmierten Zelltod und die andere verhindert den Zelltod. Daher stellt alternatives Spleißen eine Entscheidung zwischen Leben und Tod beim Bestimmen und Regeln des Verhältnisses dieser Isoformen bereit.
CD44 ist ein wichtiges Zelloberflächenmolekül, das an dem gewebespezifischen Targeting von T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen im Immunsystem sowie an der Zelladhäsion und Signaltransduktion beteiligt ist. Das Transkript weist 10 alternative Exons auf, die in Kombination einbezogen/ausgeschlossen sind, so daß zahlreiche Isoformen erzeugt werden. Veränderungen beim CD44-Spleißen gehören zu den besten Tumormarkern (einen Überblick geben Goodison, S. & Tarin, D. (1998). Current status of CD44 variant isoforms as cancer diagnostic markers. Histopathology 32: 16). Alternatives CD44-Spleißen scheint durch Zytokine und durch onkogene Aktivierung reguliert zu werden, und es wurde gezeigt, daß der Einschluß eines spe zifischen Exons (v6) die Tumor-Metastasenbildung in einem Modelsystem verursacht (Gunthert et al., 1992. A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells. Cell 65: 13-24).
AML1 ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Granulozytendifferenzierung erforderlich ist. Das Protein enthält eine N-terminale DNA-Bindungs- und Proteindimerisierungsdomäne und eine C-terminale Transkriptionsaktivierungsdomäne. Bei 20 % der Patienten mit akuter Myelozytenleukämie (AML) wird die N-terminale Sequenz von AML1 an Sequenzen von anderen Chromosomen über Chromosomentranslokation fusioniert. Jedoch wird in vielen AML-Fällen keine Chromosomentranslokation nachgewiesen, aber statt dessen tritt eine Veränderung im alternativen Spleißen von AML1-pre-mRNA auf. Alternatives Spleißen führt zu einer abgestumpften Version von AML1, von der gezeigt wird, daß sie die Granulozytendifferenzierung unterdrückt (Tanaka, T. et al., (1995). An Acute myeloid leukemia gene, AML1, regulates hemopoietic myoloid cell differentiation and transcriptional activation antagonistically by two alternative spliced forms. EMBO J. 14: 341-350.) Daher kann ein gewisser Anteil von AML-Fällen durch eine Fehlfunktion in der Spleißkontrolle und Regulierung ausgelöst werden.
Schließlich ist das alternative Spleißen mit wichtigen biologischen Vorgängen verbunden, und in vielen Fällen können das Muster oder die Änderung des alternativen Spleißens Marker für spezifische Krankheiten und/oder Ziele bei der Krankheitsvorbeugung und -intervention sein.
Alternatives RNA-Spleißen ist in höheren eukaryotischen Zellen weit verbreitet und spielt eine entscheidende Rolle bei der Genexpression. Jedoch beruhen der Nachweis und die Analyse von alternativem Spleißen derzeit auf RNase-Protection- und RT-PCR-Assays, die arbeitsaufwendig und ineffizient sind und nur im kleinen Maßstab durchführbar sind, speziell in dem Bereich der funktionellen molekularen Genomforschung.
Carrino, et al., WO 96/15271 offenbaren ein Verfahren zur Amplifikation, das durch eine Vielzahl von Spaltsondenreagenzien gekennzeichnet ist, wobei die 3'- und 5'-Enden der Spaltsondenreagenzien nach der Hybridisierung und vor der Amplifikation miteinander ligiert werden.
Mitsuhashi, US 5,976,797 , beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung der gesamten mRNA in einer Probe, umfassend das Markieren hybridisierter mRNA und Messen der Menge an eingefangener Markierung.
Folglich ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen sehr empfindlichen und genauen Ansatz zur Genom-weiten Genexpressions-Profilierung und Überwachung des alternativen Spleißens mit einer minimalen zielspezifischen Amplifikation oder deren Fehlen bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer ersten Zielsequenz, umfassend eine Poly(A)-Sequenz in einer Probe, wie in Anspruch 1 definiert, bereit. Das Verfahren umfaßt das Hybridisieren einer ersten Sonde mit der Zielsequenz, um einen ersten Hybridisierungskomplex zu bilden. Die erste Sonde umfaßt eine universelle Stromaufwärts-Primingstelle (UUP), eine Adaptersequenz, eine erste zielspezifische Sequenz und eine universelle Stromabwärts-Primingstelle (DUP). Die Poly(A)-Sequenz bleibt einzelsträngig. Das Verfahren umfaßt außerdem das Inkontaktbringen des ersten Hybridsierungskomplexes mit einem Träger, welcher eine Poly(T)-Sequenz umfaßt, so daß die Poly(A)-Sequenz mit der Poly(T)-Sequenz hybridisiert. Außerdem umfaßt das Verfahren das Entfernen unhybridisierter erster Sondensequenzen, das Denaturieren des ersten Hybridisierungskomplexes, das Verstärken der ersten Sonde, um eine Vielzahl von Amplicons zu erzeugen, das Inkontaktbringen der Amplicons mit einer Anordnung von Fängersonden, um Assaykomplexe zu bilden, und das Nachweisen der Assaykomplexe.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 und 2 stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar.
7 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung eines Poly(A)-Poly(T)-Fängers dar, um unhybridisierte Sonden und Ziele zu entfernen. Zielsequenz 5, umfassend eine Poly(A)-Sequenz 6, wird mit Zielsonde 115 hybridisiert, umfassend eine zielspezifische Sequenz 70, eine Adaptersequenz 20, eine universelle Stromaufwärts-Primingstelle 25 und eine universelle Stromabwärts-Primingstelle 26. Der resultierende Hybridisierungskomplex wird mit einem Kügelchen 51, umfassend einen Linker 55 und eine Poly(T)-Fängersonde 61, kontaktiert.
11 stellt Ziele des alternativen Spleißens dar, die für eine Mikroanordnungsanalyse ausgewählt wurden. Abkürzungen sind: GAPGH, D-Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-glyceraldehydphosphatdehydrogenase; FGFR2, Fibroblastenwachstumsfaktorrezeptorgen; KGF, Keratinozytwachstumsfaktor; CASP bezieht sich auf Caspasen; NOS, Stickoxidsynthase; PCD bezieht sich auf programmierten Zelltod.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf den Nachweis und die Quantifikation einer Vielzahl von Nukleinsäurereaktionen speziell unter Verwendung von Mikrokügelchenanordnungen gerichtet. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Gendetektion, Genexpressions-Profilierung und Überwachung des alternativen Spleißens, ohne vorherige Amplifikation der spezifischen Ziele. Außerdem kann die Erfindung mit Adaptersequenzen verwendet werden, um universelle Anordnungen zu erzeugen.
Die Erfindung kann im allgemeinen folgendermaßen beschrieben werden. Eine Vielzahl von Sonden (manchmal hierin als „Zielsonden" bezeichnet) sollen mindestens drei unterschiedliche Teile haben: einen ersten Teil, der zielspezifisch für ein mRNA-Ziel ist, und zwei „universelle Priming"-Teile, eine universelle Stromaufwärts- und eine Stromabwärts-Primingsequenz. Diese Zielsonden werden mit Ziel-mRNA-Sequenzen aus einer Probe ohne vorherige Amplifikation hybridisiert, um Hybridisierungskomplexe zu bilden. Die Hybridisierungskomplexe (und nicht-hybridisierte Ziel-mRNA-Sequenzen) werden dann entfernt. Dies wird unter Verwendung eines PolyA-Selektionsverfahrens erreicht, wie der Verwendung von Poly(T)-Sequenzen auf einem Träger, die spezifisch die gesamte mRNA, einschließlich der Hybride, zurückbehalten können. Sobald die unhybridisierten Zielsonden entfernt werden, werden die Hybride denaturiert. Alle Zielsonden können dann gleichzeitig unter Verwendung universeller Primer amplifiziert werden, die mit den universellen Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primingsequenzen hybridisieren werden. Die resultierenden Amplicons, die direkt oder indirekt markiert werden können, können dann auf Anordnungen, speziell auf Mikrokügelchenanordnungen, nachgewiesen werden. Dies erlaubt den Nachweis und die Quantifikation der mRNA-Zielsequenzen.
Der Fachmann erkennt, daß das System eine große Zahl an Konstellationen in Abhängigkeit von dem Assay annehmen kann. Beispielsweise kann, wenn eine Expressionsprofilierung oder eine Analyse alternierender Spleißstellen durchgeführt werden soll, eine Einzelzielsonde verwendet werden. Daher kann eine Einzelsonde für jede mRNA-Sequenz mit einem universellen Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primer konstruiert werden. Nach der Trennung der Hybridisierungskomplexe und der Amplifikation verläuft der Nachweis der mRNA-Sequenz, wie nachstehend dargestellt. In Falle einer Spleißstellenanalyse hat der zielspezifische Teil der Sonde eine erste Domäne, die mit dem ersten Exon hybridisiert, und eine zweite Domäne, die mit dem zweiten Exon hybridisiert, und der Assay verläuft unter Bedingungen, bei denen sich nur dann, wenn beide Domänen mit der Ziel-mRNA hybridisieren, der Hybridisierungskomplex bildet.
Außerdem kann jede der obigen Ausführungsformen eine oder mehrere „Adaptersequenzen" nutzen (manchmal in der Technik als „Zip-Codes" bezeichnet), um die Verwendung von „universellen Anordnungen" zu ermöglichen. Das heißt, Anordnungen werden erzeugt, die Fängersonden enthalten, die nicht zielspezifisch sind, sondern eher spezifisch für einzelne künstliche Adaptersequenzen. Ein Strang der Adaptersequenzen wird zu den Zielsonden hinzugefügt (im Fall von Ligationssonden kann jede Sonde die Adaptersequenz enthalten), angeordnet zwischen den Primingsequenzen, und ist daher in den Amplicons enthalten. Die Adapter werden dann mit den Fängersonden auf der Anordnung hybridisiert, und der Nachweis schreitet fort. In einigen Ausführungsformen, wie nachstehend dargestellt, kann es zwei Adaptersequenzen geben, die in den Zielsonden verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt mehrere signifikante Vorteile bereit. Das Verfahren kann verwendet werden, um Genexpression oder alternative Spleißvorgänge aus einer einzelnen Zelle oder mehreren Zellen aufgrund der Signalamplifikation von angelagerten Sonden nachzuweisen. Es erlaubt ebenso die direkte Hybridisierung der Sonden mit RNA-Zielen, wodurch ein cDNA-Umwandlungsschritt weggelassen wird. Außerdem tritt die Hybridisierungsreaktion eher in Lösung als auf einer Oberfläche auf, so daß RNA vorhersehbarer und mit günstigen Kinetiken gemäß ihrer thermodynamischen Eigenschaften hybridisiert. Aufgrund der Entfernung von überschüssigen Sonden und Zielen spiegeln die isolierten Ziele das Niveau an einzelnen Genexpressionsniveaus oder Spleißvorgängen in Zellen wider und wird das Hintergrundsignal (aufgrund von nicht-spezifischen Interaktionen) verringert. Schließlich vermeidet die Verwendung von universellen Primern die gerichtete Signalamplifikation in PCR.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis, Quantifizieren und/oder Identifizieren spezifischer polyadenylierter mRNA-Nukleinsäuresequenzen in einer Probe bereit. Der Fachmann erkennt, daß die Probenlösung alles umfassen kann, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Körperflüssigkeiten (einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Blut, Urin, Serum, Lymphe, Speichel, Anal- und Vaginalsekretionen, Schweiß und Sperma, von so gut wie jedem Organismus, wobei Säugerproben bevorzugt sind und menschliche Proben besonders bevorzugt sind). Die Probe kann einzelne Zellen, einschließlich primäre Zellen (einschließlich Bakterien), und Zellinien, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Tumorzellen von allen Typen (speziell Melanom, myeloische Leukämie, Karzinome der Lunge, Brust, Eierstöcke, Dickdarm, Niere, Prostata, Pankreas und Hoden), Herzmuskelzellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Lymphozyten (T-Zelle und B-Zelle), Mastzellen, Eosinophilen, vaskuläre Intimazellen, Hepatozyten, Leukozyten, einschließlich mononukleare Leukozyten, Stammzellen, wie hämopoetische, Nerven-, Haut-, Lungen-, Nieren-, Leber- und Myozytenstammzellen; Osteoklasten, Chondrozyten und andere Bindegewebszellen, Keratinozyten, Melanozyten, Leberzellen, Nierenzellen und Adipozyten umfassen. Geeignete Zellen umfassen ebenso bekannte Forschungszellen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Jurkat-T-Zellen, NIH3T3-Zellen, CHO, Cos, 923, HeLa, WI-38, Weri-1, MG-63 usw. Siehe den ATCC-Zellinienkatalog, hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von Ziel-mRNA-Nukleinsäuresequenzen in einer Probe bereit. „Zielsequenz" oder grammatische Äquivalente, wie hierin verwendet, bedeuten eine polyadenylierte mRNA-Sequenz oder ein sekundäres Ziel, wie ein Amplicon. Wie hierin dargestellt, kann die Zielsequenz eine polyadenylierte mRNA-Zielsequenz aus einer Probe sein, oder ein sekundäres Ziel, wie ein Amplicon, das das Produkt einer Amplifikationsreaktion wie PCR ist. Daher wird beispielsweise eine polyadenylierte mRNA-Zielsequenz aus einer Probe amplifiziert, um ein Amplicon zu erzeugen, das detektiert wird. Die polyadenylierte mRNA-Zielsequenz kann jede Länge haben, unter der Voraussetzung, daß längere Sequenzen spezifischer sind. Wie nachstehend ausführlicher dargestellt, werden Sonden hergestellt, die mit polyadenylierten mRNA-Zielsequenzen hybridisieren, um die Gegenwart, Abwesenheit, Menge oder Sequenz einer polyadenylierten mRNA-Zielsequenz in einer Probe zu bestimmen. Im allgemeinen wird dieser Ausdruck vom Fachmann verstanden.
Die polyadenylierte mRNA-Zielsequenz kann ebenso aus unterschiedlichen Zieldomänen bestehen, die nachbarständig (d. h. benachbart) oder getrennt sein können.
Die Ausdrücke „erste" und „zweite" sollen keine Richtung der Sequenzen in bezug auf die 5'-3'-Richtung der Ziel-mRNA-Sequenz bedeuten. Geht man beispielsweise von einer 5'-3'-Richtung der komplementären Zielsequenz aus, kann die erste Zieldomäne entweder 5' zu der zweiten Domäne oder 3' zu der zweiten Domäne lokalisiert sein. Außerdem erkennt der Fachmann, daß die Sonden auf der Oberfläche der Anordnung (z. B. angelagert an Mikrokügelchen) in jede Richtung gebunden sein können, entweder so, daß sie ein freies 3'-Ende oder ein freies 5'-Ende aufweisen; in einigen Ausführungsformen können die Sonden an eine oder mehrere innere Stellen oder an beiden Enden gebunden sein.
Wenn erforderlich, wird die polyadenylierte mRNA-Zielsequenz unter Verwendung von bekannten Techniken hergestellt. Beispielsweise kann die Probe behandelt werden, um die Zellen zu lysieren, unter Verwendung von bekannten Lysepuffern, Beschallung, Elektroporation usw., wobei die Reinigung und Amplifikation, wie nachstehend dargestellt, nach bedarf stattfinden, was der Fachmann erkennen wird. Au ßerdem können die hierin dargestellten Reaktionen in einer Vielzahl von Wegen erreicht werden, was der Fachmann erkennt. Komponenten der Reaktion können gleichzeitig oder nacheinander in jeder Reihenfolge zugegeben werden, wobei die bevorzugten Ausführungsformen nachstehend dargestellt sind. Außerdem kann die Reaktion eine Vielzahl von anderen Reagenzien umfassen, die in den Assays enthalten sein können. Diese umfassen Reagenzien, wie Salze, Puffer, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergenzien usw., die verwendet werden können, um die optimale Hybridisierung und den Nachweis zu erleichtern und/oder nicht-spezifische oder Hintergrundinteraktionen zu reduzieren. Ebenso können Reagenzien, die die Wirksamkeit des Assays anderweitig verbessern, wie Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel usw., in Abhängigkeit der Probenherstellungsverfahren und der Reinheit des Ziels verwendet werden.
Es sollte angemerkt werden, daß in einigen Fällen zwei Poly(T)-Schritte verwendet werden. In einer Ausführungsform wird ein Poly(T)-Träger verwendet, um nicht-umgesetzte Zielsonden aus der Probe zu entfernen. Jedoch kann ein Poly(T)-Träger verwendet werden, um Poly(A)-mRNA aus einer Probe vor der Durchführung des Assays zu reinigen oder zu konzentrieren. Beispielsweise kann die Gesamt-RNA aus einer Zellpopulation isoliert und dann die Poly(A)-mRNA aus der Gesamt-RNA isoliert und den nachstehend beschriebenen Assaysystemen zugeführt werden.
Außerdem werden in den meisten Ausführungsformen doppelsträngige Zielnukleinsäuren denaturiert, um sie einzelsträngig zu machen, um so die Hybridisierung der Primer und anderen Sonden der Erfindung zu ermöglichen. Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt einen thermischen Schritt im allgemeinen durch Erhöhen der Temperatur der Reaktion auf etwa 95 °C, obwohl pH-Änderungen und andere Techniken ebenso verwendet werden können.
Wie hierin dargestellt, offenbart die vorliegende Anmeldung eine Vielzahl von unterschiedlichen Nukleinsäureprimern und -sonden. Unter „Nukleinsäure" oder „Oligonukleotid" oder grammatischen Äquivalenten versteht man hierin mindestens zwei Nukleotide, die kovalent miteinander verbunden sind. Eine Nukleinsäure der vorliegenden Anmeldung wird im allgemeinen Phosphodiesterbindungen enthalten, ob wohl in einigen Fällen, wie nachstehend dargestellt, speziell zur Verwendung mit Sonden, Nukleinsäureanaloga enthalten sind, die alternierende Hauptketten aufweisen können, umfassend beispielsweise Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10): 1925 (1993) und Verweise darin; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1966); Sawal et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470(1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 (1986)), Phosphorthioat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); und US-Patent Nr. 5,644,048 ), Phosphordithioat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989), O-Methylphophoroamiditverknüpfungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), und Peptidnukleinsäurehauptketten und Verknüpfungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Garlsson et al., Nature 380: 207 (1996).
Andere analoge Nukleinsäuren umfassen die mit positiven Hauptketten (Denpoy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995); nicht-ionische Hauptketten ( US-Patente Nr. 5,386,023 , 5,637,684 , 5,602,240 , 5,216,141 und 4,469,863 ; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Hauptketten, einschließlich denen, beschrieben in US-Patenten Nr. 5,235,033 und 5,034,506 , und Kapitel 6 und 7, ASC Symposium Series 580, „Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Sanghui und P. Dan Cook. Nukleinsäuren, enthaltend ein oder mehrere carbocyclische Zucker, sind innerhalb der Definition für Nukleinsäuren ebenso enthalten (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) S. 169-176). Mehrere Nukleinsäureanaloga werden in Ravels, C & E Neves 2. Juni 1997 Seite 35 beschrieben. Die Nukleinsäuren können ebenso „verschlossene Nukleinsäuren" sein.
Diese Modifikationen der Ribose-Phosphat-Hauptkette können durchgeführt werden, um die Zugabe von Markierungen zu erleichtern, oder um die Stabilität und Halbwertszeit derartiger Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen.
Der Fachmann erkennt, daß alle dieser Nukleinsäureanaloga Verwendung als Sonden in der vorliegenden Erfindung finden können. Außerdem können Gemische aus natürlich vorkommenden Nukleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Alternativ können Gemische aus unterschiedlichen Nukleinsäureanaloga und Gemische aus natürlich vorkommenden Nukleinsäuren und Analoga hergestellt werden.
Besonders bevorzugt sind Peptidnukleinsäuren (PNA), die Peptidnukleinsäureanaloga umfassen. Diese Hauptketten sind unter neutralen Bedingungen im wesentlichen nicht-ionisch im Gegensatz zu der stark geladenen Phosphodiesterhauptkette der natürlich vorkommenden Nukleinsäuren. Dies führt zu zwei Vorteilen. Zunächst zeigt die PNA-Hauptkette verbesserte Hybridisierungskinetiken. PNAs weisen größere Veränderungen der Schmelztemperatur (Tm) bei nicht übereinstimmenden gegenüber perfekt übereinstimmenden Basenpaaren auf. DNA und RNA zeigen typischerweise einen Abfall der Tm von 2 bis 4 °C bei einer fehlenden internen Übereinstimmung. Bei der nicht-ionischen PNA-Hauptkette liegt der Abfall näher bei 7 bis 9 °C. Ebenso ist aufgrund ihrer nicht-ionischen Beschaffenheit die Hybridisierung der Basen, die an diese Hauptketten gebunden sind, relativ unempfindlich für die Salzkonzentration.
Die Sondennukleinsäuren können, wie beschrieben, einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder enthalten Teile von sowohl doppelsträngiger als auch einzelsträngiger Sequenz. Daher weist beispielsweise, wenn die Zielsequenz eine polyadenylierte mRNA ist, der Hybridisierungskomplex, der die Zielsonde umfaßt, einen doppelsträngigen Teil, wo die Zielsonde hybridisiert wird, und einen oder mehrere einzelsträngige Teile, einschließlich des Poly(A)-Teils, auf. Die Nukleinsäure kann jede Kombination von Desoxyribo- und Ribo-nukleotiden und jede Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xathanin, Hypoxathanin, Isocytosin, Isoguanin usw., enthalten. Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt Isocytosin und Isoguanin in Nukleinsäuren, die so konstruiert sind, das sie eher zu anderen Sonden als zu Zielsequenzen komplementär sind, da dies die nicht-spezifische Hybridisierung reduziert, wie im allgemeinen in US-Patent Nr. 5,681,702 beschrieben. Wie hierin verwendet, umfaßt der Ausdruck „Nukleosid" Nukleotide sowie Nukleosid- und Nukleotidanaloga und modifizierte Nukleoside, wie Aminomodifizierte Nukleoside. Außerdem umfaßt „Nukleosid" nicht-natürlich vorkommende analoge Strukturen. Daher werden beispielsweise die einzelnen Einheiten einer Peptidnukleinsäure, die jeweils eine Base enthalten, hierin als ein Nukleosid bezeichnet.
Sonden und Primer der vorliegenden Anmeldung sollen mindestens einen Teil aufweisen, der zu einer polyadenylierten mRNA-Zielsequenz (entweder die polyadenylierte mRNA-Zielsequenz der Probe oder zu anderen Sondensequenzen, wie Teile von Amplicons, wie nachstehend beschrieben) komplementär ist, so daß die Hybridisierung der polyadenylierten mRNA-Zielsequenz und der Sonden der vorliegenden Anmeldung stattfindet. Wie nachstehend dargestellt, muß diese Komplementarität nicht perfekt sein; es kann eine Vielzahl fehlender Basenpaarübereinstimmungen geben, die mit der Hybridisierung zwischen der polyadenylierten mRNA-Zielsequenz und der einzelsträngigen Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung interferieren werden. Wenn die Anzahl an Mutationen jedoch so groß ist, daß keine Hybridisierung sogar unter am wenigsten strengen Hybridisierungsbedingungen stattfinden kann, ist die Sequenz nicht komplementär zu der polyadenylierten mRNA-Zielsequenz. Daher ist hier unter „im wesentlichen komplementär" zu verstehen, daß die Sonden zu den polyadenylierten mRNA-Zielsequenzen ausreichend komplementär sind, so daß sie unter normalen Reaktionsbedingungen hybridisieren und bevorzugt die erforderliche Spezifität ergeben.
Eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich starken, mäßigen und geringen stringenten Bedingungen; siehe beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Auflage, 1989, und Short Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel, et al, die hierin durch Verweis aufgenommen sind. Stringente Bedingungen sind Sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren speziell bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Übersicht für die Hybridisierung von Nukleinsäuren wird in Tijssen, Techniques in Bio chemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) gefunden. Im allgemeinen werden die stringenten Bedingungen so ausgewählt, daß sie etwa 5 bis 10 °C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH sind. Der Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH und Nukleinsäurekonzentration), bei der 50 % der Sonden, die zu dem Ziel komplementär sind, mit der polyadenylierten mRNA-Zielsequenz bei Gleichgewicht hybridisieren (da die Zielsequenzen bei Tm im Überschuß vorliegen, werden 50 % der Sonden bei Gleichgewicht genutzt). Stringente Bedingungen werden die sein, bei denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,0 M Natriumionen-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 beträgt, und die Temperatur mindestens etwa 30 °C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nukleotide) und mindestens etwa 60 °C für lange Sonden (z. B. mehr als 50 Nukleotide) beträgt. Stringente Bedingungen können ebenso mit der Zugabe von Helix-destabilisierenden Mitteln wie Formamid erreicht werden. Die Hybridisierungsbedingungen können ebenso variieren, wenn eine nicht-ionische Hauptkette, d. h. PNA verwendet wird, was in der Technik bekannt ist. Außerdem können Vernetzungsmittel nach der Bindung an das Ziel zugegeben werden, um die beiden Stränge des Hybridisierungskomplexes zu vernetzen, d. h. kovalent zu binden.
Daher werden die Assays im allgemeinen unter stringenten Bedingungen durchgeführt, was die Bildung des ersten Hybridisierungskomplexes nur in Gegenwart des Ziels ermöglicht. Die Stringenz kann durch Verändern eines Schrittparameters, der eine thermodynamische Variable ist, kontrolliert werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Temperatur, Formamidkonzentration, Salzkonzentration, Konzentration an chaotropem Salz, pH, Konzentration an organischem Lösungsmittel usw.
Diese Parameter können ebenso verwendet werden, um nicht-spezifische Bindung zu kontrollieren, wie im allgemeinen in US-Patent Nr. 5,681,697 dargestellt. Daher kann es wünschenswert sein, bestimmte Schritte bei höheren stringenten Bedingungen durchzuführen, um nicht-spezifische Bindung zu reduzieren.
Die Größe der Primer- und Sondennukleinsäure kann variieren, was der Fachmann erkennt, wobei jeder Teil der Sonde und die Gesamtlänge der Sonde im allgemeinen von 5 bis 500 Nukleotiden in der Länge variieren. Jeder Teil weist bevorzugt zwischen 10 und 100, was bevorzugt ist, zwischen 15 und 50, was besonders bevorzugt ist, und 10 und 35, was besonders bevorzugt ist, in Abhängigkeit der Verwendung und Amplifikationstechnik auf. Daher weisen beispielsweise die universellen Primingstellen der Sonden jeweils bevorzugt etwa 15 bis 20 Nukleotide in der Länge auf, wobei 18 besonders bevorzugt ist. Die Adaptersequenzen der Sonden weisen bevorzugt 15 bis 25 Nukleotide in der Länge auf, wobei 20 besonders bevorzugt sind. Der zielspezifische Teil der Sonde weist bevorzugt 15 bis 50 Nukleotide in der Länge auf, wobei 30 bis 40 besonders bevorzugt sind.
Folglich offenbart die vorliegende Anmeldung erste Zielsondengruppen. Unter „Sondengruppe" ist hierin eine Vielzahl von Zielsonden zu verstehen, die in einem speziellen Multiplex-Assay verwendet werden. In diesem Kontext bedeutet eine Vielzahl mindestens zwei, wobei mehr als 10 bevorzugt sind, in Abhängigkeit des Assays, der Probe und des Zwecks des Tests.
Folglich offenbart die vorliegende Anmeldung erste Zielsondengruppen, die universelle Primingstellen umfassen. Unter „universellen Primingstellen" ist hierin eine Sequenz der Sonde zu verstehen, die einen PCR-Primer zur Amplifikation binden wird. Jede Sonde umfaßt bevorzugt eine universelle Stromaufwärts-Primingstelle (UUP) und eine Stromabwärts-Primingstelle (DUP). Außerdem bedeuten „stromaufwärts" und „stromabwärts" nicht, daß eine spezielle 5'-3'-Richtung ausgedrückt werden soll, sondern hängen von der Richtung des Systems ab. Bevorzugt werden nur eine einzelne UUP-Sequenz und eine einzelne DUP-Sequenz in einer Sondengruppe verwendet, obwohl, wie der Fachmann erkennt, unterschiedliche Assays oder unterschiedliche Multiplex-Analysen eine Vielzahl von universellen Primingsequenzen nutzen können. Außerdem sind die universellen Primingstellen bevorzugt an den 5'- und 3'-Enden der Zielsonde lokalisiert (oder der ligierten Sonde), da nur Sequenzen, flankiert durch Primingsequenzen, amplifiziert werden.
Außerdem werden universelle Primingsequenzen im allgemeinen so ausgewählt, daß sie so einmalig wie möglich sind, was spezielle Assays und Wirtsgenome ergibt, um die Spezifität des Assay zu sichern. Im allgemeinen liegen die universellen Primingsequenzen in der Größe zwischen etwa 5 und etwa 35 Basenpaaren vor, wobei etwa 15 bis etwa 20 besonders bevorzugt sind.
Der Fachmann erkennt, daß die Richtung der zwei Primingstellen unterschiedlich ist. Das heißt, ein PCR-Primer wird direkt mit der ersten Primingstelle hybridisieren, während der andere PCR-Primer mit dem Komplement der zweiten Primingstelle hybridisieren wird. Anders ausgedrückt, ist die erste Primingstelle in Sense-Richtung und die zweite Primingstelle in Antisense-Richtung.
Zusätzlich zu den universellen Primingstellen umfassen die Zielsonden mindestens eine erste zielspezifische Sequenz, die im wesentlichen zu der polyadenylierten mRNA-Zielsequenz komplementär ist. Wie nachstehend dargestellt, umfassen die Ligationssonden jeweils eine zielspezifische Sequenz. Der Fachmann erkennt, daß die zielspezifische Sequenz eine breite Vielzahl an Formaten in Abhängigkeit von der Verwendung der Sonde annehmen kann. Beispielsweise umfaßt die zielspezifische Sondensequenz für eine normale Detektion einer polyadenylierte mRNA-Zielsequenz oder für die Genexpressionsüberwachung oder -Profilierung einen Teil, der mit der gesamten polyadenylierten mRNA-Zielsequenz oder einem Teil davon hybridisieren wird. Außerdem ist eine Vielzahl von speziellen polyadenylierten mRNA-Zielsequenzen bevorzugt, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Zielsequenzen, die sich über Spleißstellen erstrecken.
In einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich die zielspezifische Sequenz über eine Spleißstelle von Interesse. Wie hierin dargestellt, sind die zielspezifischen Sequenzen so gestaltet, daß sie im wesentlichen komplementär zu Sequenzen am Ende von einzelnen alternativen Exons sind. Unter im wesentlichen komplementär ist hierin zu verstehen, daß die Sonden zu den Zielsequenzen ausreichend komplementär sind, so daß sie unter normalen Reaktionsbedingungen hybridisieren und bevorzugt die erforderliche Anlagerungsspezifität ergeben. Da Exons durch Introns getrennt werden, bleiben die Detektionssequenzen auf unterschiedlichen Teilen des RNA-Moleküls zurück. Daher besteht eine zielspezifische Sequenz aus zwei Teilen: einem Stromaufwärtsteil, komplementär zu dem Ende eines ersten Exons, und einem Stromabwärtsteil, komplementär zu dem Ende eines zweiten Exons. Nur wenn Spleißen auftrat und das Intron entfernt wurde, wird die zielspezifische Sequenz mit der Zielsequenz unter den Bedingungen des Assays hybridisieren.
Zusätzlich zu den universellen Primingstellen und der/den zielspezifischen Sequenz(en) umfassen die Zielsonden der Erfindung ferner eine oder mehrere Adaptersequenzen. Eine „Adaptersequenz" ist eine Sequenz, die im allgemeinen zu den Zielsequenzen exogen, z. B. künstlich, und so gestaltet ist, daß sie im wesentlichen zu einer Fängersonde auf der Anordnung komplementär (und bevorzugt perfekt komplementär) ist. Die Verwendung von Adaptersequenzen erlaubt die Erzeugung von mehreren „universellen" Oberflächen; das heißt, eine Standardanordnung, umfassend eine begrenzte Gruppe von Fängersonden, kann hergestellt und in jeder Anwendung verwendet werden. Der Endverbraucher kann die Anordnung durch Gestalten unterschiedlicher löslicher Zielsonden anpassen, das, wie der Fachmann erkennen wird, im allgemeinen einfacher und weniger aufwendig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Anordnung von unterschiedlichen und normalerweise künstlichen Fängersonden hergestellt; das heißt, die Fängersonden weisen keine Komplementarität für die bekannten Zielsequenzen auf. Die Adaptersequenzen können in die Zielsonden eingeführt werden.
Der Fachmann erkennt, daß die Länge der Adaptersequenzen in Abhängigkeit von der gewünschten Stärke der Bindung und der Anzahl an unterschiedlichen gewünschten Adaptern variieren wird. In einer bevorzugten Ausführungsform reichen Adaptersequenzen von etwa 6 bis etwa 50 Basenpaaren in der Länge, wobei etwa 8 bis etwa 30 bevorzugt ist, und etwa 15 bis etwa 25 besonders bevorzugt ist.
Der Fachmann erkennt, daß die Plazierung und Orientierung der Adaptersequenzen weitgehend in Abhängigkeit von der Konfiguration des Assays und dem Assay selbst variieren kann.
Der Fachmann erkennt, daß grundsätzlich die unterschiedlichen Komponenten der Zielsonden in jeder Reihenfolge plaziert werden können, genau so lange wie die universellen Primingstellen auf dem äußersten Ende der Sonde bleiben, damit alle Sequenzen dazwischen amplifiziert werden können. Im allgemeinen werden die Adaptersequenzen ähnliche Hybridisierungseigenschaften haben, z. B, dieselbe oder ähnliche Schmelztemperatur und ähnlichen (G+C)-Gehalt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei Adaptersequenzen pro ligierter Zielsonde verwendet.
Es ist ebenso möglich, zwei Adaptersequenzen für einzelne Zielsonden, wenn gewünscht, zu verwenden.
In einigen Ausführungsformen ist es möglich, einen oder beide der universellen Primer als eine Adaptersequenz zu verwenden. Das heißt, einer der universellen Primer kann verwendet werden, um mit einer Fängersonde auf der Oberfläche zu hybridisieren. Jedoch muß in dieser Ausführungsform einer der universellen Primer zielspezifisch sein; Z. B. ist einer der universellen Primer nicht wirklich „universell", vielmehr muß ein Primer für jedes Ziel die Anlagerung an eine andere Fängersonde erlauben.
Daher offenbart die vorliegende Anmeldung Zielsonden, die universelle Primingsequenzen, zielspezifische Sequenz(en) und Adaptersequenzen umfassen. Diese Zielsonden werden dann zu den Zielsequenzen unter Bildung von Hybridisierungskomplexen zugegeben. Der Fachmann erkennt, daß die Hybridisierungskomplexe Teile enthalten, die doppelsträngig sind (die zielspezifische Sequenzen der Zielsonden, hybridisiert mit einem Teil der Ziel-mRNA-Sequenz), und Teile, die einzelsträngig sind (die Enden der Zielsonden, umfassend die universellen Primingsequenzen und die Adaptersequenzen, und jeder unhybridisierter Teil der Zielsequenz, wie Poly(A)-Schwänze, wie hierin dargestellt).
Bevorzugte Assayformate der vorliegenden Erfindung werden in den Figuren gezeigt.
Sobald die Hybridisierungskomplexe gebildet sind, werden unhybridisierte Sonden entfernt. Dies ist wichtig, da alle Zielsonden eine gewisse unvorhersehbare Struktur bilden können, was die Amplifikation unter Verwendung der universellen Primingsequenzen verkomplizieren wird. Um daher Spezifität sicherzustellen (z. B. daß Zielsonden, gerichtet auf Zielsequenzen, die in der Probe nicht vorliegen, nicht amplifiziert und nachgewiesen werden), ist es wichtig, alle nicht hybridisierten Sonden zu entfernen. Die Trennung von unhybridisierten Zielsonden wird unter Verwendung von Trägern durchgeführt, die Poly(T)-Sequenzen umfassen.
Daher werden beispielsweise Träger (wie nachstehend definiert), speziell magnetische Kügelchen, umfassend Poly(T)-Sequenzen, zu dem Gemisch, das die Zielsequenzen und die Zielsonden umfaßt, zugegeben. In dieser Ausführungsform umfassen die ersten Hybridisierungskomplexe einen einzelsträngigen Teil, umfassend eine Poly(A)-Sequenz, im allgemeinen zwischen 10 und 100te Adenosine. Der Poly(T)-Träger wird dann verwendet, um die unhybridisierten Zielsonden von den Hybridisierungskomplexen zu entfernen. Wenn beispielsweise magnetische Kügelchen verwendet werden, können sie aus dem Gemisch entfernt und gewaschen werden; nicht-magnetische Kügelchen können über Zentrifugation entfernt und gewaschen werden usw. Alternativ können die Poly(T)-Träger in eine Säule gepackt werden und das Assaygemisch läuft durch. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Poly-A-Sequenz an der Innenseite eines Rohrs, d. h. eines PCR-Rohrs, das mit Poly(T) beschichtet ist, immobilisiert. Die Hybridisierungskomplexe werden dann aus den Kügelchen unter Verwendung eines Denaturierungsschrittes, wie eines thermischen Schrittes, freigesetzt (und denaturiert).
Sobald die nicht-hybridisierten Sonden (und außerdem, wenn bevorzugt, andere Sequenzen aus der Probe, die nicht von Interesse sind) entfernt sind, werden die Hybridisierungskomplexe denaturiert und die Zielsonden unter Bildung von Amplicons amplifiziert, die dann nachgewiesen werden. Dies kann in einem von mehreren Wegen durchgeführt werden, einschließlich PCR-Amplifikation und „Rolling circle"-Amplifikation. Außerdem können, wie nachstehend dargestellt, Markierungen in die Amplicons in einer Vielzahl von Wegen eingeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielamplifikationstechnik PCR. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird allgemein verwendet und beschrieben, und umfaßt die Verwendung von Primerextension, kombiniert mit einer thermischen Kreislaufführung, um eine Zielsequenz zu amplifizieren; siehe US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202 , und PCR Essential Data, J. W. Wiley & Sons, Hrsg. C. R. Newton, 1995.
Im allgemeinen kann PCR folgendermaßen kurz beschrieben werden. Der doppelsträngige Hybridisierungskomplex wird denaturiert, im allgemeinen durch Erhöhen der Temperatur, und dann in Gegenwart eines Überschusses eines PCR-Primers abgekühlt, der dann mit der ersten universellen Primingstelle hybridisiert. Eine DNA-Polymerase fungiert dann so, daß der Primer mit dNTPs verlängert wird, was zur Synthese eines neuen Strangs unter Bildung eines Hybridisierungskomplexes führt. Die Probe wird dann erneut erhitzt, um den Hybridisierungskomplex zu spalten, und das Verfahren wird wiederholt. Unter Verwendung eines zweiten PCR-Primers für den komplementären Zielstrang, der mit der zweiten universellen Primingstelle hybridisiert, findet eine schnelle und exponentielle Amplifikation statt. Daher sind PCR-Schritte Denaturierung, Anlagerung und Extension. Die Besonderheiten von PCR sind allgemein bekannt, und umfassen die Verwendung einer thermostabilen Polymerase, wie Taq-I-Polymerase, und thermische Kreislaufführung. Geeignete DNA-Polymerasen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1, SEQUENASE 1.0 und SEQUENASE 2.0 (U. S. Biochemical), T5-DNA-Polymerase und Phl29-DNA-Polymerase.
Die Reaktion wird initiiert durch Einführen der Zielsonde in eine Lösung, umfassend die universellen Primer, eine Polymerase und eine Gruppe von Nukleotiden. Unter „Nukleotid" ist in diesem Kontext hierin ein Desoxynukleosid-triphosphat zu verstehen (ebenso Desoxynukleotide oder dNTPs genannt, z. B. dATP, dTTP, dCTP und dGTP). In einigen Ausführungsformen, wie nachstehend dargestellt, können ein oder mehrere der Nukleotide eine nachweisbare Markierung umfassen, die entweder eine primäre oder sekundäre Markierung sein kann. Außerdem können die Nukleotide Nukleotidanaloga in Abhängigkeit von der Konfiguration des Systems sein. Ebenso können die Primer eine primäre oder sekundäre Markierung umfassen.
Folglich erfordert die PCR-Reaktion mindestens einen und bevorzugt zwei PCR-Primer, eine Polymerase und eine Gruppe von dNTPs. Wie hierin dargestellt, können die Primer die Markierung umfassen, und ein oder mehrere der dNTPs können eine Markierung umfassen.
Außerdem wird der Fachmann erkennen, daß andere Amplifikationsreaktionen verwendet werden können; siehe WO 00/63437 .
Daher offenbart die vorliegende Anmeldung die Erzeugung von Amplicons (manchmal hierin als sekundäre Ziele bezeichnet).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Amplicons mit einer Nachweismarkierung markiert. Unter „Nachweismarkierung" oder „nachweisbare Markierung" ist hierin eine Komponente zu verstehen, die den Nachweis ermöglicht. Dies kann eine primäre Markierung oder sekundäre Markierung sein. Folglich können Nachweismarkierungen primäre Markierungen (d. h. direkt nachweisbar) oder sekundäre Markierungen (indirekt nachweisbar) sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nachweismarkierung eine primäre Markierung. Eine primäre Markierung ist eine, die direkt nachgewiesen werden kann, wie ein Fluorophor. Im allgemeinen fallen die Markierungen in drei Klassen: a) isotope Markierungen, die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) magnetische, elektrische, thermische Markierungen; und c) gefärbte oder lumineszierende Farbstoffe. Markierungen können ebenso Enzyme (Meerrettichperoxidase usw.) und magnetische Teilchen umfassen. Bevorzugte Markierungen umfassen Chromophore oder Phosphore, sind aber bevorzugt fluoreszierende Farbstoffe. Geeignete Farbstoffe zur Verwendung in der Erfindung umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, fluoreszierende Lanthanidkomplexe, einschließlich denen von Europium und Terbium, Fluoreszein, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin, Erythrosin, Coumarin, Methyl-coumarine, Quantenpunkte (ebenso bezeichnet als „Nanokristalle"), Pyren, Ma lacite-Grün, Stilben, Lucifer Yellow, Cascade Blue, Texas Red, Cy-Farbstoffe (Cy3, Cy5 usw.), Alexa-Farbstoffe, Phycoerythin, Bodipy und andere, die in der 6. Auflage des Molecular Probes Handbook von Richard P. Haugland beschrieben werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine sekundäre nachweisbare Markierung verwendet. Eine sekundäre Markierung ist eine, die indirekt nachgewiesen wird; beispielsweise kann eine sekundäre Markierung mit einer primären Markierung zum Nachweis binden oder reagieren, kann auf ein weiteres Produkt einwirken, um eine primäre Markierung (z. B. Enzyme) zu erzeugen, oder kann die Trennung der Verbindung, die die sekundäre Markierung umfaßt, von den markierten Materialien usw. erlauben. Sekundäre Markierungen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, einen Bindungspartner eines Paars von Bindungspartnern wie Biotin/Streptavidin; chemisch modifizierbare Komponenten; Nukleaseinhibitoren, Enzyme, wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatasen, Luciferasen usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Markierung ein Bindungspartnerpaar. Beispielsweise kann die Markierung ein Hapten oder Antigen sein, das seinen Bindungspartner binden wird. Beispielsweise umfassen geeignete Bindungspartnerpaare, sind aber nicht darauf beschränkt: Antigene (wie Proteine (einschließlich Peptide)) und Antikörper (einschließlich Fragmente davon (FAbs usw.)); Proteine und kleine Moleküle, einschließlich Biotin/Streptavidin; Enzyme und Substrate oder Inhibitoren; andere Protein-Protein-interagierende Paare; Rezeptor-Liganden und Kohlenhydrate und ihre Bindungspartner. Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindungsproteinpaare sind ebenso verwendbar. Im allgemeinen wird der kleinere Teil des Paars an das NTP zur Einführung in den Primer gebunden. Bevorzugte Bindungspartnerpaare umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Biotin (oder Imino-biotin) und Streptavidin, Digeoxinin und Abs, und Prolinx^TM-Reagenzien (siehe www.prolinxinc.com/ie4/home.hmtl).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindungspartnerpaar Biotin oder Imino-biotin und ein fluoreszent markiertes Streptavidin. Imino-biotin ist besonders bevorzugt als Imino-biotin, das sich von Streptavidin in Puffer mit pH 4,0 löst, wäh rend Biotin scharfe Denaturierungsmittel erfordert (z. B. 6 M Guanidin HCl, pH 1,5, oder 90%iges Formamid bei 95 °C).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Bindungspartnerpaar eine primäre Nachweismarkierung (beispielsweise gebunden an NTP und deshalb an das Amplicon) und einen Antikörper, der spezifisch an die primäre Nachweismarkierung bindet. Unter „spezifisch binden" ist hierin zu verstehen, daß die Partner mit ausreichender Spezifität binden, um zwischen dem Paar und anderen Komponenten oder Kontaminanten des Systems zu unterscheiden. Die Bindung sollte ausreichend sein, um unter den Bedingungen des Assays gebunden zu bleiben, einschließlich Waschschritten zur Entfernung nicht-spezifischer Bindung. In einigen Ausführungsformen werden die Dissoziationskonstanten des Paars weniger als etwa 10^–4 bis 10^–6 M^–1 betragen, wobei weniger als etwa 10^–5 bis 10^–9 M^–1 bevorzugt sind und weniger als etwa 10^–7-10^–9 M^–1 besonders bevorzugt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die sekundäre Markierung eine chemisch modifizierbare Komponente. In dieser Ausführungsform werden Markierungen, die reaktive funktionelle Gruppen umfassen, in die Nukleinsäure eingeführt. Die funktionelle Gruppe kann dann anschließend mit einer primären Markierung markiert werden. Geeignete funktionelle Gruppen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Aminogrupppen, Carboxygruppen, Maleimidgruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, wobei Aminogruppen und Thiolgruppen besonders bevorzugt sind. Beispielsweise können primäre Markierungen, die Aminogruppen umfassen, an sekundäre Markierungen, die Aminogruppen umfassen, beispielsweise unter Verwendung von Linkern, wie in der Technik bekannt, gebunden werden; beispielsweise homo- oder heterobifunktionelle Linker, wie allgemein bekannt (siehe Katalog 1994 der Pierce Chemical Company, technischer Abschnitt über Vernetzer, Seiten 155-200).
Wie hierin dargestellt, kann die Markierung in einer Vielzahl von Wegen auftreten, was der Fachmann erkennt. Im allgemeinen kann die Markierung auf einem von zwei Wegen erfolgen: Markierungen werden in Primer eingeführt, so daß die Amplifikationsreaktion zu Amplicons führt, die die Markierungen umfassen, und die Markierun gen werden an dNTPs gebunden und durch die Polymerase in die Amplicons eingeführt.
Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt einen Primer, umfassend ein Biotin, das verwendet wird, um ein fluoreszent markiertes Streptavidin zu binden.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die beim Nachweis von Nukleinsäuren, speziell den markierten, hierin dargestellten Amplicons verwendbar sind. Wie nachstehend ausführlicher dargestellt, arbeiten bevorzugte Systeme der Erfindung folgendermaßen. Amplicons werden (via Hybridisierung) an eine Anordnungsstelle gebunden. Dies Anlagerung kann entweder direkt an eine Fängersonde auf der Oberfläche durch die Verwendung von Adaptern oder indirekt unter Verwendung von Fängerextendersonden, wie hierin dargestellt, erfolgen. In einigen Ausführungsformen umfaßt die Zielsequenz selbst die Markierungen. Alternativ wird dann eine Markierungssonde unter Bildung eines Assaykomplexes hinzugefügt. Die Anlagerung der Markierungssonde kann direkt (d. h. Hybridisierung mit einem Teil der Zielsequenz) oder indirekt (d. h. Hybridisierung mit einer Amplifikationssonde, die mit der Zielsequenz hybridisiert) erfolgen, wobei alle erforderlichen Nukleinsäuren einen Assaykomplex bilden.
Folglich offenbart die vorliegende Anmeldung Anordnungszusammensetzungen, umfassend mindestens ein erstes Substrat mit einer Oberfläche, umfassend einzelne Stellen. Unter „Anordnung" oder „Biochip" ist hierin eine Vielzahl von Nukleinsäuren in einem Anordnungsformat zu verstehen, die Größe der Anordnung wird von der Zusammensetzung und der Endverwendung der Anordnung abhängen. Nukleinsäureanordnungen sind in der Technik bekannt, und können in einer Vielzahl von Wegen klassifiziert werden; sowohl geordnete Anordnungen (z. B. die Fähigkeit, Chemien an diskreten Stellen zu lösen) als auch zufällige Anordnungen sind enthalten.
Geordnete Anordnungen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die, die unter Verwendung von Photolithographietechniken (Affymetrix Gene-Chip^TM), Spotbildungstechniken (Syntent und andere), Drucktechniken (Hewlett Packard und Rosetta), dreidimensionale „Gelpad"-Anordnungen usw. hergestellt sind. Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt Mikrokügelchen auf einer Vielzahl von Substraten, einschließlich Lichtwellenleiterbündeln, wie in WO 99/18434 , WO 99/67641 , WO 98/40726 und WO 98/150782 dargestellt.
Obwohl sich der größte Teil der nachstehenden Erläuterungen auf die Verwendung von Mikrokügelchenanordnungen auf Lichtwellenleiterbündel bezieht, kann jedes Anordnungsformat von Nukleinsäuren auf festen Trägern verwendet werden.
Anordnungen, enthaltend etwa 2 unterschiedliche bioaktive Mittel (z. B. unterschiedliche Kügelchen, wenn Kügelchen verwendet werden) bis zu vielen Millionen, können hergestellt werden, wobei sehr große Anordnungen möglich sind. Im allgemeinen wird die Anordnung zwei bis zu einer Milliarde oder mehr in Abhängigkeit von der Größe der Kügelchen und des Substrats sowie der Endverwendung der Anordnung umfassen, daher können Anordnungen mit sehr hoher Dichte, hoher Dichte, mittlerer Dichte, geringer Dichte und sehr geringer Dichte hergestellt werden. Bevorzugte Bereiche für Anordnungen mit sehr hoher Dichte betragen etwa 10.000.000 bis etwa 2.000.000.000, wobei etwa 100.000.000 bis etwa 1.000.000.000 bevorzugt ist (alle Zahlen sind in cm² angegeben). Anordnungen mit hoher Dichte liegen zwischen etwa 100.000 und etwa 10.000.000, wobei etwa 1.000.000 bis etwa 5.000.000 besonders bevorzugt sind. Anordnungen mit mittlerer Dichte liegen zwischen etwa 10.000 und etwa 100.000, was besonders bevorzugt ist, und etwa 20.000 und etwa 50.000, was besonders bevorzugt ist. Anordnungen mit geringer Dichte betragen im allgemeinen weniger als 10.000, wobei etwa 1.000 bis etwa 6.000 bevorzugt ist. Anordnungen mit sehr geringer Dichte betragen weniger als 1.000, wobei etwa 10 bis etwa 1000 bevorzugt sind, und etwa 100 bis etwa 500 besonders bevorzugt sind. In einigen Ausführungsformen brauchen die Zusammensetzungen der Erfindung nicht in einem Anordnungsformat vorliegen; das heißt, bei einige Ausführungsformen können Zusammensetzungen, umfassend ein einzelnes bioaktives Mittel, ebenso hergestellt werden. Außerdem können in einigen Anordnungen mehrere Substrate verwendet werden, entweder mit unterschiedlichen oder identischen Zusammensetzungen. Daher können beispielsweise große Anordnungen eine Vielzahl von kleineren Substraten umfassen.
Außerdem ist es ein Vorteil der offenbarten Zusammensetzungen, daß speziell durch die Verwendung der Lichtwellenleitertechnologie Anordnungen mit extrem hoher Dichte hergestellt werden können. Da Kügelchen von 200 μm oder weniger (mit Kügelchen von 200 nm möglich) verwendet werden können, und sehr kleine Fasern bekannt sind, ist es somit beispielsweise möglich, daß 1 mm² Lichtwellenleiterbündel bis zu 40.000 oder mehr (in einigen Fällen 1 Million) unterschiedliche Elemente (z. B. Fasern und Kügelchen) aufweist, wobei Dichten von mehr als 25.000.000 einzelnen Kügelchen und Fasern (außerdem in einigen Fällen bis zu 50 bis 100 Millionen) pro 0,5 cm² erhältlich sind (4 Millionen pro cm² für 5 μm Mittenabstand und 100 Millionen pro cm² für 1 μm Mittenabstand).
Unter „Substrat" oder „fester Träger" oder anderen grammatischen Äquivalenten ist hierin jedes Material zu verstehen, das modifiziert werden kann, so daß diskrete einzelne Stellen enthalten sind, die für die Anlagerung oder Verbindung von Kügelchen geeignet sind, und für mindestens ein Nachweisverfahren geeignet ist. Der Fachmann erkennt, daß die Anzahl an möglichen Substraten sehr groß ist. Mögliche Substrate umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (einschließlich Acryl, Polystyrol und Copolymere von Styrol und andere Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, Teflon usw.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Silciumdioxid oder Siliciumdioxid-basierende Materialien, einschließlich Silicium und modifiziertes Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Gläser, Kunststoffe, Lichtwellenleiterbündel und eine Vielzahl von anderen Polymeren. Im allgemeinen erlauben die Substrate den optischen Nachweis und fluoreszieren selbst nicht merklich.
Im allgemeinen ist das Substrat flach (eben), obwohl, was der Fachmann erkennt, andere Konfigurationen der Substrate ebenso verwendet werden können; beispielsweise können dreidimensionale Konfigurationen verwendet werden, beispielsweise durch Einbetten der Kügelchen in einen porösen Block aus Kunststoff, der Proben Zugang zu den Kügelchen erlaubt, und Verwendung eines konfokalen Mikroskops für den Nachweis. Ebenso können die Kügelchen zur Durchflußprobenanalyse auf der Innenseite eines Rohrs plaziert werden, um das Probenvolumen zu minimieren.
Bevorzugte Substrate umfassen Lichtwellenleiterbündel, wie nachstehend erläutert, und flache ebene Substrate, wie Glas, Polystyrol und andere Kunststoffe und Acryl.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat ein Lichtwellenleiterbündel oder eine Lichtwellenleiterbündelanordnung, wie sie im allgemeinen in WO98/40726 , WO98/50782 beschrieben werden. Bevorzugte Ausführungsformen nutzen vorgeformte unitäre Lichtwellenleiteranordnungen. Unter „vorgeformter unitärer Lichtwellenleiteranordnung" ist hierin eine Anordnung von diskreten einzelnen Lichtwellenleitersträngen zu verstehen, die koaxial angeordnet und entlang ihrer Längen verbunden sind. Die Faserstränge sind im allgemeinen einzeln überzogen. Jedoch ist ein Merkmal, das eine vorgeformte unitäre Anordnung von anderen Lichtwellenleiterformaten unterscheidet, daß die Fasern nicht einzeln physikalisch manipulierbar sind; das heißt, ein Strang kann im allgemeinen an irgendeinem Punkt entlang seiner Länge von einem anderen Faserstrang nicht physikalisch getrennt werden.
Im allgemeinen kann die Anordnung von Anordnungszusammensetzungen der Erfindung in mehreren Wegen konfiguriert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, wird ein „Einkomponentensystem" verwendet. Das heißt, ein erstes Substrat, umfassend eine Vielzahl von Assaylokationen (manchmal hierin als „Assaylöcher" bezeichnet), wie eine Mikrotiterplatte, wird so konfiguriert, daß jede Assaylokation eine einzelne Anordnung enthält. Das heißt, die Assaylokation und die Anordnungslokation sind dieselben. Beispielsweise kann das Kunststoffmaterial der Mikrotiterplatte so gebildet werden, daß eine Vielzahl von „Kugellöchern" im Boden von jedem der Assaylöcher enthalten ist. Kügelchen, enthaltend die Fängersonden der Erfindung, können dann in die Kugellöcher in jeder Assaylokation geladen werden, wie nachstehend ausführlicher dargestellt.
Alternativ kann ein „Zweikomponentensystem" verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden die einzelnen Anordnungen auf einem zweiten Substrat gebildet, das dann angepaßt oder in das erste Mikrotiterplattensubstrat „getaucht" werden kann. Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt Lichtwellenleiterbündel als die einzelnen Anordnungen, im allgemeinen mit „Kugellöchern", die in eine Oberfläche von jeder einzelnen Faser geätzt sind, so daß die Kügelchen, die die Fängersonden ent halten, auf das Ende des Lichtwellenleiterbündels geladen werden. Die zusammengesetzte Anordnung umfaßt daher eine Vielzahl von einzelnen Anordnungen, die so konfiguriert sind, daß sie in die Löcher einer Mikrotiterplatte passen.
Unter „zusammengesetzter Anordnung" oder „Kombinationsanordnung" oder grammatischen Äquivalenten ist hierin eine Vielzahl von einzelnen Anordnungen zu verstehen, wie oben dargestellt. Im allgemeinen wird die Anzahl an einzelnen Anordnungen durch die Größe der verwendeten Mikrotiterplatte bestimmt; daher nutzen 96-Loch-, 384-Loch- und 1536-Loch-Mikrotiterplatten zusammengesetzte Anordnungen, umfassend 96, 384 und 1536 einzelne Anordnungen, obwohl, was der Fachmann erkennt, nicht jedes Mikrotiterloch eine einzelne Anordnung enthalten muß. Es sollte angemerkt werden, daß die zusammengesetzten Anordnungen einzelne Anordnungen, die identisch, ähnlich oder unterschiedlich sind, umfassen können. Das heißt, es kann in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein, dieselben 2.000 Assays auf 96 unterschiedlichen Proben durchzuführen; alternativ kann die Durchführung von 192.000 Experimenten auf derselben Probe (d. h. dieselbe Probe in jedem der 96 Löcher) wünschenswert sein. Alternativ zur Redundanz/Qualitäts-Kontrolle könnte jede Reihe oder Säule der zusammengesetzten Anordnung dieselbe sein. Der Fachmann erkennt, daß es eine Vielzahl an Wegen gibt, das System zu konfigurieren. Außerdem kann die zufällige Beschaffenheit der Anordnungen bedeuten, daß dieselbe Population an Kügelchen zu zwei unterschiedlichen Oberflächen zugegeben werden kann, was zu im wesentlichen ähnlichen, aber möglicherweise nicht identischen Anordnungen führt.
Mindestens eine Oberfläche des Substrats wird modifiziert, um diskrete, einzelne Stellen für die spätere Anbindung von Mikrokügelchen zu enthalten. Diese Stellen können physikalisch veränderte Stellen umfassen, d. h. physikalische Konfigurationen, wie Löcher oder kleine Vertiefungen in dem Substrat, die die Kügelchen rückhalten können, so daß ein Mikrokügelchen in dem Loch verbleiben kann, oder die Verwendung von anderen Kräften (magnetisch oder kompressiv), oder chemisch veränderte oder aktive Stellen, wie chemisch funktionalisierte Stellen, elektrostatisch veränderte Stellen, hydrophob/hydrophil funktionalisierte Stellen, Haftpunkte usw.
Die Stellen können ein Muster bilden, d. h. eine regelmäßige Gestalt oder Konfiguration, oder zufällig verteilt. Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt ein regelmäßiges Muster von Stellen, so daß die Stellen in der X-Y-Koordinatenebene adressiert werden können. „Muster" in diesem Sinne umfaßt eine sich wiederholende Einheitszelle, bevorzugt eine, die eine hohe Dichte an Kügelchen auf dem Substrat erlaubt. Jedoch sollte angemerkt werden, daß diese Stellen keine diskreten Stellen sein brauchen. Das heißt, es ist möglich, eine einheitliche Oberfläche von adhäsiven oder chemischen Funktionalitäten zu verwenden, die beispielsweise die Anlagerung von Kügelchen an jeder Stelle erlauben. Das heißt, die Oberfläche des Substrats ist so modifiziert, daß die Anlagerung von Mikrokügelchen an einzelnen Stellen möglich ist, unabhängig davon, ob die Stellen an andere Stellen angrenzen oder nicht. Daher kann die Oberfläche des Substrats so modifiziert werden, daß diskrete Stellen gebildet werden, die nur ein einzelnes verbundenes Kügelchen aufweisen können, oder alternativ wird die Oberfläche des Substrats modifiziert und die Kügelchen können irgendwo nach unten gehen, aber sie enden an diskreten Stellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche des Substrats modifiziert, so daß sie Löcher enthält, d. h. Vertiefungen in der Oberfläche des Substrats. Dies kann, wie allgemein in der Technik bekannt, unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken durchgeführt werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Photolithographie, Stanztechniken, Formungstechniken und Mikroätztechniken. Der Fachmann erkennt, daß die verwendete Technik von der Zusammensetzung und der Form des Substrats abhängen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden physikalische Veränderungen in einer Oberfläche des Substrats durchgeführt, um die Stellen zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat ein Lichtwellenleiterbündel und die Oberfläche des Substrats ist ein terminales Ende des Faserbündels, wie im allgemeinen in US-Patent 6023540 (8. Febr. 2000) beschrieben. In dieser Ausführungsform werden die Löcher in einem terminalen oder distalen Ende eines Lichtwellenleiterbündels, umfassend einzelne Fasern, hergestellt. Hinsichtlich des Überziehens werden in dieser Ausführungsform die Kerne der einzelnen Fasern geätzt, so daß kleine Löcher oder Vertiefungen an einem Ende der Fasern gebildet werden. Die erforderliche Tiefe der Löcher wird von der Größe der Kügelchen, die zu den Löchern zugegeben werden sollen, abhängen.
Im allgemeinen werden in dieser Ausführungsform die Mikrokügelchen nicht-kovalent in den Löchern gebunden, obwohl die Löcher außerdem chemisch funktionalisiert werden können, wie im allgemeinen nachstehend beschrieben, Vernetzungsmittel verwendet werden können, oder eine physikalische Barriere, d. h. ein Film oder eine Membran, über den Kügelchen verwendet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche des Substrats so modifiziert, daß chemisch modifizierte Stellen enthalten sind, die verwendet werden können, um die Mikrokügelchen der Erfindung entweder kovalent oder nicht-kovalent an den diskreten Stellen oder Lokationen auf dem Substrat zu befestigen. „Chemisch modifizierte Stellen" in diesem Kontext umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Hinzufügung eines Musters von chemischen funktionellen Gruppen, einschließlich Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, die verwendet werden können, um kovalent Mikrokügelchen zu binden, die im allgemeinen ebenso entsprechende reaktive funktionelle Gruppen enthalten; die Hinzufügung eines Musters eines Adhäsivs, das verwendet werden kann, um Mikrokügelchen zu binden (entweder durch vorherige chemische Funktionalisierung für die Zugabe des Adhäsivs oder direkte Zugabe des Adhäsivs); die Hinzufügung eines Musters von geladenen Gruppen (ähnlich den chemischen Funktionalitäten) für die elektrostatische Anlagerung der Mikrokügelchen, d. h. wenn die Mikrokügelchen entgegengesetzt zu den Stellen geladene Gruppen umfassen; die Hinzufügung eines Musters von chemischen funktionellen Gruppen, die die Stellen unterschiedlich hydrophob oder hydrophil machen, so daß die Zugabe von ähnlichen hydrophoben oder hydrophilen Mikrokügelchen unter geeigneten experimentellen Bedingungen zur Verbindung der Mikrokügelchen mit den Stellen auf der Grundlage der Hydroaffinität führt. Beispielsweise treibt in einem wässerigen System die Verwendung von hydrophoben Stellen mit hydrophoben Kügelchen die Anbindung der Kügelchen bevorzugt auf den Stellen an. Wie oben dargestellt, umfaßt das „Muster" in diesem Sinne die Verwendung einer einheitlichen Behandlung der Oberfläche, um die Anlagerung der Kügelchen an diskrete Stellen sowie die Behandlung der Oberfläche zu ermöglichen, was zu diskreten Stellen führt. Der Fachmann erkennt, daß dies auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden kann.
In einigen Ausführungsformen werden die Kügelchen nicht mit einem Substrat verbunden. Das heißt, die Kügelchen sind in Lösung oder werden nicht auf einem gemusterten Substrat verteilt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung ferner eine Population von Mikrokügelchen. Unter „Population" ist hierin eine Vielzahl von Kügelchen zu verstehen, wie oben für die Anordnungen dargestellt. Innerhalb der Population sind separate Unterpopulationen, die ein einzelnes Mikrokügelchen oder mehrere identische Mikrokügelchen sein können. Das heißt, in einigen Ausführungsformen kann, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, die Anordnung nur ein einzelnes Kügelchen für jede Fängersonde enthalten; bevorzugte Ausführungsformen nutzen eine Vielzahl von Kügelchen von jedem Typ.
Unter „Mikrokügelchen" oder „Kügelchen" oder „Teilchen" oder grammatischen Äquivalenten sind hierin kleine diskrete Teilchen zu verstehen. Die Zusammensetzung der Kügelchen wird in Abhängigkeit von der Klasse der Fängersonde und dem Syntheseverfahren variieren. Geeignete Kügelchenzusammensetzungen umfassen die, die bei der Peptidsynthese, Nukleinsäuresynthese und der Synthese der organischen Komponente verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Kunststoffe, Keramiken, Glas, Polystyrol, Methylstyrol, Acrylpolymere, paramagnetische Materialien, Thoriumoxidsol, Graphitkohle, Titandioxid, Latex oder vernetzte Dextrane, wie Sepharose, Cellulose, Nylon, vernetzte Mizellen und Teflon. „Microsphere Detection Guide" von Bangs Laborstories, Fishers IN ist eine hilfreiche Richtlinie.
Die Kügelchen müssen nicht sphärisch sein; unregelmäßige Teilchen können verwendet werden. Außerdem können die Kügelchen porös sein, wodurch die Oberfläche der Kügelchen, die für die Fängersondenanlagerung oder Markierungsanlagerung zur Verfügung steht, erhöht wird. Die Kügelchengröße liegt zwischen Nanometern, d. h. 100 nm, und Millimetern, d. h. 1 mm, wobei Kügelchen mit etwa 0,2 μm bis etwa 200 μm bevorzugt sind, und etwa 0,5 bis etwa 5 μm besonders bevorzugt sind, obwohl in einigen Ausführungsformen kleinere Kügelchen verwendet werden können.
Es sollte angemerkt werden, daß eine Schlüsselkomponente der Erfindung die Verwendung eines Substrat/Kügelchen-Paars ist, das die Verbindung oder Anlagerung der Kügelchen an diskrete Stellen auf der Oberfläche des Substrats erlaubt, so daß sich die Kügelchen während des Verlaufs des Assays nicht bewegen.
Jedes Mikrokügelchen umfaßt eine Fängersonde, obwohl, was der Fachmann erkennt, es einige Mikrokügelchen, die keine Fängersonde enthalten, in Abhängigkeit von dem Syntheseverfahren geben kann.
Die Anlagerung der Nukleinsäuren kann auf einer Vielzahl von Wegen durchgeführt werden, was der Fachmann erkennt, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, chemisches oder Affinitätsfangen (beispielsweise einschließlich der Einführung von derivatisierten Nukleotiden, wie AminoLink oder biotinylierten Nukleotiden, die verwendet werden können, um die Nukleinsäure an eine Oberfläche zu binden, sowie Affinitätsfangen durch Hybridisierung), Vernetzen und elektrostatische Anlagerung usw. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Affinitätsfangen verwendet, um die Nukleinsäuren an die Kügelchen zu binden. Zum Beispiel können Nukleinsäuren beispielsweise mit einem Element eines Bindungspaars derivatisiert werden, wobei die Kügelchen mit dem anderen Element des Bindungspaars derivatisiert werden. Geeignete Bindungspaare sind, wie hierin beschrieben, IBL/DBL-Paare. Beispielsweise können die Nukleinsäuren biotinyliert werden (beispielsweise unter Verwendung enzymatischer Einführung von biotinylierten Nukleotiden, durch photoaktiviertes Vernetzen von Biotin). Biotinylierte Nukleinsäuren können dann auf Streptavidinbeschichteten Kügelchen eingefangen werden, was in der Technik bekannt ist. Ebenso können andere Hapten-Rezeptor-Kombinationen verwendet werden, wie Digoxigenin- und Anti-Digoxigenin-Antikörper. Alternativ können chemische Gruppen in Form von derivatisierten Nukleotiden hinzugefügt werden, die dann verwendet werden können, um die Nukleinsäure zu der Oberfläche hinzuzufügen.
Bevorzugte Anlagerungen sind kovalent, obwohl sogar relativ schwache Interaktionen (d. h. nicht-kovalent) ausreichend sein können, um eine Nukleinsäure an eine Oberfläche zu binden, wenn es mehrere Anlagerungsstellen für jede Nukleinsäure gibt. Daher können beispielsweise elektrostatische Interaktionen für die Anlagerung verwendet werden, beispielsweise durch Kügelchen, die die entgegengesetzte Ladung zu dem bioaktiven Mittel tragen.
Ebenso kann das Affinitätsfangen unter Verwendung von Hybridisierung verwendet werden, um Nukleinsäuren an Kügelchen zu binden. Alternativ kann chemisches Vernetzen beispielsweise durch photoaktiviertes Vernetzen von Thymidin mit reaktiven Gruppen durchgeführt werden, was in der Technik bekannt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt jedes Kügelchen einen einzelnen Typ einer Fängersonde, obwohl eine Vielzahl an einzelnen Fängersonden bevorzugt an jedes Kügelchen gebunden wird. Ebenso nutzen bevorzugte Ausführungsformen mehr als ein Mikrokügelchen, enthaltend eine einmalige Fängersonde; das heißt, es gibt eine Redundanz, die in das System durch die Verwendung von Unterpopulationen von Mikrokügelchen eingebaut ist, wobei jedes Mikrokügelchen in der Unterpopulation dieselbe Fängersonde enthält.
Der Fachmann erkennt, daß die Fängersonden entweder direkt auf den Kügelchen synthetisiert werden können, oder hergestellt und dann nach der Synthese angelagert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Linker verwendet, um die Fängersonde mit den Kügelchen zu verbinden, um sowohl gute Anlagerung als auch ausreichende Flexibilität zu ermöglichen, um gute Interaktion mit dem Zielmolekül zu ermöglichen, und um unerwünschte Bindungsreaktionen zu vermeiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fängersonden direkt auf den Kügelchen synthetisiert. Wie in der Technik bekannt, werden viele Klassen von chemischen Verbindungen derzeit auf festen Trägern synthetisiert, wie Peptide, organische Komponenten und Nukleinsäuren. Es ist eine relativ einfache Angelegenheit, die derzeitigen Synthesetechniken anzupassen, um Kügelchen zu verwenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fängersonden zunächst synthetisiert und dann kovalent an die Kügelchen gebunden. Der Fachmann erkennt, daß dies in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Fängersonden und den Kügelchen durchgeführt wird. Die Funktionalisierung von festen Trägeroberflächen, wie bestimmten Polymeren mit chemisch reaktiven Gruppen, wie Thiolen, Aminen, Carboxylen usw., ist in der Technik allgemein bekannt. Folglich können „pure" Mikrokügelchen verwendet werden, die Oberflächenchemien aufweisen, die die Anlagerung der gewünschten Funktionalität durch den Nutzer erleichtern. Einige Beispiele dieser Oberflächenchemien für pure Mikrokügelchen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Aminogruppen, einschließlich aliphatischen und aromatischen Aminen, Carbonsäuren, Aldehyden, Amiden, Chlormethylgruppen, Hydrazid, Hydroxylgruppen, Sulfonaten und Sulfaten.
Wenn zufällige Anordnungen verwendet werden, muß ein Kodierungs-/Dekodierungs-System verwendet werden. Beispielsweise, wenn Mikrokügelchenanordnungen verwendet werden, werden die Kügelchen im allgemeinen zufällig auf das Substrat gegeben; an sich gibt es mehrere Wege zur Korrelation der Funktionalität auf den Kügelchen mit ihrer Lokation, einschließlich der Einführung von einmaligen optischen Signaturen, im allgemeinen fluoreszierende Farbstoffe, die verwendet werden könnten, um die Nukleinsäure auf irgendeinem speziellen Kügelchen zu identifizieren. Dies ermöglicht die Synthese der Fängersonden, die von ihrem Platz auf einer Anordnung getrennt werden, d. h. die Fängersonden können auf den Kügelchen synthetisiert werden, und dann werden die Kügelchen zufällig auf einer gemusterten Oberfläche verteilt. Da die Kügelchen zunächst mit einer optischen Signatur kodiert werden, bedeutet dies, daß die Anordnung später „dekodiert" werden kann, d. h., daß, nachdem die Anordnung hergestellt worden ist, eine Korrelation der Lokation einer einzelnen Stelle auf der Anordnung mit dem Kügelchen oder der Sonde an der speziellen Stelle hergestellt werden kann. Dies bedeutet, daß die Kügelchen zufällig auf der Anordnung verteilt werden können, ein schnelles und preisgünstiges Verfahren im Vergleich zu entweder der in-situ-Synthese oder Spotbildungstechniken des Standes der Technik.
Jedoch ist der Nachteil dieser Verfahren, daß bei einer großen Anordnung das System eine große Vielzahl an unterschiedlichen optischen Signaturen erfordert, die schwierig oder zeitaufwendig zu nutzen sind. Folglich stellt die vorliegende Erfindung mehrere Verbesserungen gegenüber diesen Verfahren bereit, die im allgemeinen auf Verfahren zum Kodieren und Dekodieren der Anordnungen gerichtet sind. Das heißt, der Fachmann erkennt, daß die Plazierung der Fängersonden im allgemeinen zufällig ist, und daher ein Kodierungs-/Dekodierungsystem erforderlich ist, um die Sonde an jeder Lokation in der Anordnung zu identifizieren. Dies kann in einer Vielzahl von Wegen durchgeführt werden, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, und umfaßt im allgemeinen: a) die Verwendung eines dekodierenden Bindungsliganden (DBL), im allgemeinen direkt markiert, der entweder an die Fängersonde oder Identifikationsbindungsliganden (IBLs), die an die Kügelchen gebunden sind, bindet; b) Positionsdekodieren, beispielsweise durch entweder Targetieren der Plazierung von Kügelchen (beispielsweise unter Verwendung photoaktivierbarer oder photospaltbarer Komponenten, um die selektive Zugabe von Kügelchen zu speziellen Lokationen zu ermöglichen), oder durch die Verwendung von entweder Subbündeln oder selektiver Ladung der Stellen, wie nachstehend ausführlicher dargestellt; c) selektives Dekodieren, wobei nur die Kügelchen, die an ein Ziel binden, dekodiert werden; oder d) Kombinationen von diesen. In einigen Fällen, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, kann diese Dekodierung für alle Kügelchen erfolgen, oder nur für die, die eine spezielle Zielsequenz binden. Ebenso kann dies entweder vor oder nach der Zugabe einer Zielsequenz stattfinden. Außerdem, wie hierin dargestellt, können die nachgewiesenen Zielsequenzen entweder eine primäre Zielsequenz (z. B. eine Patientenprobe) oder ein Reaktionsprodukt aus einem der hierin beschriebenen Verfahren sein (z. B. eine verlängerte SBE-Sonde, eine ligierte Sonde, eine gespaltene Signalsonde usw.).
Sobald die Identität (d. h. das tatsächliche Mittel) und die Lokation von jedem Mikrokügelchen in der Anordnung festgestellt worden sind, wird die Anordnung den Proben, enthaltend die Zielsequenzen, ausgesetzt, obwohl, wie nachstehend dargestellt, dies ebenso vor oder während der Analyse durchgeführt werden kann. Die Zielsequenzen können mit den Fängersonden hybridisieren (entweder direkt oder indirekt), wie nachstehend ausführlicher dargestellt, was zu einer Veränderung in dem optischen Signal eines speziellen Kügelchens führt.
In der vorliegenden Erfindung beruht das „Dekodieren" nicht auf der Verwendung von optischen Signaturen, sondern vielmehr auf der Verwendung von dekodierenden Bindungsliganden, die während eines Dekodierungsschrittes hinzugeführt werden. Die dekodierenden Bindungsliganden werden an entweder einen anderen Identifikationsbindungsligandenpartner, der auf den Kügelchen plaziert ist, oder an die Fängersonde selbst binden. Die dekodierenden Bindungsliganden sind entweder direkt oder indirekt markiert, und daher erfolgt die Dekodierung durch Nachweisen der Gegenwart der Markierung. Unter Verwendung von Pools von dekodierenden Bindungsliganden in einer aufeinanderfolgenden Weise ist es möglich, die Anzahl an erforderlichen Dekodierungsschritten weitgehend zu minimieren.
In einigen Ausführungsformen können die Mikrokügelchen außerdem Identifikationsbindungsliganden zur Verwendung in bestimmten Dekodierungssystemen umfassen. Unter „Identifikationsbindungsliganden" oder „IBLs" ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die speziell einen entsprechenden Dekodierungsbindungsliganden (DBL) binden wird, um die Ermittlung der Identität der Fängersonde, die an dem Kügelchen anlagert ist, zu erleichtern. Das heißt, der IBL und der entsprechende DBL bilden ein Bindungspartnerpaar. Unter „speziell binden" ist hierin zu verstehen, daß IBL sein DBL mit einer Spezifität bindet, die ausreichend ist, um zwischen dem entsprechenden DBL und anderen DBLs (das heißt, DBLs für andere IBLs) oder anderen Komponenten oder Kontaminanten des Systems zu unterscheiden. Die Bindung sollte ausreichend sein, um unter den Bedingungen des Dekodierungsschrittes gebunden zu bleiben, einschließlich Waschschritten zur Entfernung nicht-spezifischer Bindung. In einigen Ausführungsformen werden beispielsweise, wenn die IBLs und entsprechenden DBLs Proteine oder Nukleinsäuren sind, die Dissoziationskonstanten des IBL zu seinem DBL weniger als etwa 10^–4 bis 10^–6 M^–1 betragen, wobei weniger als 10^–5 bis 10^–9 M^–1 bevorzugt ist und weniger als etwa 10^–7 bis 10^–9 M^–1 besonders bevorzugt ist.
IBL-DBL-Bindungspaare sind bekannt oder können ohne weiteres unter Verwendung bekannter Techniken gefunden werden. Beispielsweise umfassen, wenn das IBL ein Protein ist, die DBLs Proteine (speziell einschließlich Antikörpern oder Fragmenten davon (FAbs usw.)) oder kleine Moleküle, oder umgekehrt (der IBL ist ein Antiköper, und der DBL ist ein Protein). Metallionen-Metallionen-Liganden oder Chelatbildnerpaare sind ebenso nützlich. Antigen-Antikörper-Paare, Enzyme und Substrate oder Inhibitoren, andere Protein-Protein-interagierende Paare, Rezeptor-Liganden, komplementäre Nukleinsäuren und Kohlenhydrate und ihre Bindungspartner sind ebenso geeignete Bindungspaare. Paare aus Nukleinsäure und Nukleinsäure-bindendem Protein sind ebenso nützlich. Ebenso, wie im allgemeinen in den US-Patenten 5,270,163 , 5,475,096 , 5,567,588 , 5,595,877 , 5,637,459 , 5,683,867 , 6,705,337 und verwandten Patenten beschrieben, können Nukleinsäure-„Aptamere" zum Binden an so gut wie jedes Ziel entwickelt werden; ein solches Aptamer-Ziel-Paar kann als das IBL-DBL-Paar verwendet werden. Ebenso gibt es eine breite Palette an Literatur, die sich auf die Entwicklung von Bindungspaaren, basierend auf Verfahren der kombinatorischen Chemie, bezieht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der IBL ein Molekül, dessen Farbe oder Lumineszenzeigenschaften sich in Gegenwart eines selektiv-bindenden DBLs verändern. Beispielsweise kann der IBL ein fluoreszierender pH-Indikator sein, dessen Emissionsintensität sich mit dem pH verändert. Ebenso kann der IBL ein fluoreszierender Ionenindikator sein, dessen Emissionseigenschaften sich mit der Ionenkonzentration verändern.
Alternativ ist der IBL ein Molekül, dessen Farbe oder Lumineszenzeigenschaften sich in Gegenwart von verschiedenen Lösungsmitteln verändern. Beispielsweise kann der IBL ein fluoreszierendes Molekül, wie ein Ethidiumsalz sein, dessen Fluoreszenzintensität sich in hydrophoben Umgebungen erhöht. Ebenso kann der IBL ein Derivat oder Flureszein sein, dessen Farbe sich zwischen wässerigen und nicht-polaren Lösungsmitteln verändert.
In einer Ausführungsform kann der DBL an ein Kügelchen gebunden sein, d. h. ein „Dekodierungskügelchen", das eine Markierung, wie ein Fluorophor, tragen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das IBL-DBL-Paar im wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nukleinsäuren. In dieser Ausführungsform können die Bindungsliganden als „Identifikationssonden" oder „Dekodierungssonden" bezeichnet werden. Im allgemeinen haben die Identifikations- und Dekodierungssonden eine Länge von etwa 4 bis etwa 1000 Basenpaaren, wobei etwa 6 bis etwa 100 bevorzugt ist, und etwa 8 bis etwa 40 besonders bevorzugt ist. Was wichtig ist, ist, daß die Sonden lang genug sind, um spezifisch zu sein, d. h. um zwischen unterschiedlichen IBL-DBL-Paaren zu unterscheiden, jedoch kurz genug sind, um sowohl a) Dissoziation, wenn notwendig, unter geeigneten experimentellen Bedingungen als auch b) eine effiziente Hybridisierung zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, binden die IBLs nicht an DBLs. Die IBLs werden vielmehr als Identifikationskomponenten („IMs") verwendet, die direkt identifiziert werden, beispielsweise durch die Verwendung von Massenspektroskopie.
Alternativ sind in einer bevorzugten Ausführungsform der IRL und die Fängersonde dieselbe Komponente; daher kann beispielsweise, wie hierin dargestellt, speziell wenn keine optischen Signaturen verwendet werden, die Fängersonde sowohl als Identifikationsmittel als auch als Mittel dienen. Beispielsweise kann in dem Fall von Nukleinsäuren die Kügelchen-gebundene Sonde (die als die Fängersonden dient) ebenso Dekodierungssonden binden, um die Sequenz der Sonde auf dem Kügelchen zu identifizieren. Daher binden in dieser Ausführungsform die DBLs an die Fängersonden.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Mikrokügelchen eine optische Signatur enthalten. Das heißt, wie in US-Patent 6023540 (8. Feb. 2000) dargestellt, es war gemäß der vorherigen Arbeit vorgesehen, daß jede Unterpopulation von Mikrokügelchen eine einmalige optische Signatur oder optische Markierung umfaßt, die verwendet wird, um die einmalige Fängersonde der Unterpopulation von Mikrokügelchen zu identifizieren; das heißt, das Dekodieren nutzt die optischen Eigenschaften der Kügelchen, so daß ein Kügelchen, umfassend die einmalige optische Signatur, von Kügelchen an anderen Stellen mit anderen optischen Signaturen unterschieden werden kann. Daher wies die vorherige Arbeit jeder Fängersonde eine einmalige optische Signatur zu, so daß alle Mikrokügelchen, die die Fängersonden umfassen, auf der Grundlage der Signatur identifizierbar sind. Diese optischen Signaturen umfaßten Farbstoffe, normalerweise Chromophore oder Fluorophore, die eingefangen oder an die Kügelchen selbst gebunden wurden. Die Verschiedenheit von optischen Signaturen nutzten unterschiedliche Fluorochrome, unterschiedliche Verhältnisse an Gemischen aus Fluorochromen und unterschiedliche Konzentrationen (Intensitäten) von Fluorochromen.
In einer bevorzugten Ausführungsform beruht die vorliegende Erfindung nicht ausschließlich auf der Verwendung von optischen Eigenschaften, um die Anordnungen zu dekodieren. Jedoch ist es, was der Fachmann erkennt, in einigen Ausführungsformen möglich, optische Signaturen als ein zusätzliches Kodierungsverfahren zusammen mit dem vorhandenen System zu nutzen. Daher kann beispielsweise, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, die Größe der Anordnung effektiv erhöht werden, während eine einzelne Gruppe von Dekodierungskomponenten in mehreren Wegen verwendet wird, wobei einer davon die Verwendung von optischen Signaturen auf einigen Kügelchen ist. Unter Verwendung einer „Gruppe" von dekodierenden Molekülen ermöglicht daher die Verwendung von zwei Populationen von Kügelchen, eine mit einer optischen Signatur und eine ohne, beispielsweise die effektive Verdopplung der Anordnungsgröße. Die Verwendung von mehreren optischen Signaturen erhöht ebenso die mögliche Größe der Anordnung.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt jede Unterpopulation von Kügelchen eine Vielzahl von unterschiedlichen IBLs. Unter Verwendung einer Vielzahl von unterschiedlichen IBLs zum Kodieren jeder Fängersonde wird die Anzahl an möglichen einmaligen Codes wesentlich erhöht. Das heißt, unter Verwendung eines einmaligen IBL pro Fängersonde wird die Größe der Anordnung die Anzahl an einmaligen IBLs sein (vorausgesetzt, daß keine „Wiederverwendung" stattfindet, wie nachstehend dargestellt). Jedoch kann unter Verwendung einer Vielzahl an unterschiedlichen IBLs pro Kügelchen, n, die Größe der Anordnung auf 2ⁿ erhöht werden, wenn die Gegenwart oder Abwesenheit von jedem IBL als der Indikator verwendet wird. Beispiels weise erzeugt die Zuweisung von 10 IBLs pro Kügelchen einen binären Code von 10 Bit, wobei jedes Bit als „1" (IBL liegt vor) oder „0" (IBL liegt nicht vor) bezeichnet werden kann. Ein binärer Code von 10 Bit weist 2¹⁰ mögliche Varianten auf. Jedoch kann, wie nachstehend ausführlicher erläutert, die Größe der Anordnung weiter erhöht werden, wenn ein anderer Parameter einbezogen wird, wie die Konzentration oder Intensität; daher erhöht sich beispielsweise, wenn zwei unterschiedliche Konzentrationen des IBLs verwendet werden, dann die Anordnungsgröße auf 3ⁿ. Daher wird in dieser Ausführungsform jeder einzelnen Fängersonde in der Anordnung eine Kombination von ILBs zugeordnet, die zu den Kügelchen vor der Zugabe der Fängersonde nach oder während der Synthese der Fängersonde zugegeben werden kann, d. h. gleichzeitige Zugabe von IBLs und Fängersondenkomponenten.
Alternativ kann die Kombination von unterschiedlichen IBLs verwendet werden, um die Sequenz der Nukleinsäure zu ermitteln. Daher kann beispielsweise unter Verwendung von zwei unterschiedlichen IBLs (IBL1 und IBL2) die erste Position einer Nukleinsäure ermittelt werden; beispielsweise kann Adenosin durch die Gegenwart von sowohl IBL1 als auch IBL2 dargestellt werden; Thymidin kann durch die Gegenwart von IBL1, aber nicht IBL2 dargestellt werden; Cytosin kann durch die Gegenwart von IBL2, aber nicht IBL1 dargestellt werden, und Guanosin kann durch die Abwesenheit von beiden dargestellt werden. Die zweite Position der Nukleinsäure kann in ähnlicher Weise unter Verwendung von IBL3 und IBL4 bestimmt werden; daher ergibt die Gegenwart von IBL1, IBL2, IBL3 und IBL4 die Sequenz von AA; zeigen IBL1, IBL2 und IBL3 die Sequenz AT; ergeben IBL1, IBL3 und IBL4 die Sequenz TA usw. Die dritte Position nutzt IBL5 und IBL6 usw. In dieser Weise kann die Verwendung von 20 unterschiedlichen Identifizierungen einen einmaligen Code für jedes mögliche 10-mer ergeben.
In dieser Weise kann eine Reihe von „Strichcodes" für jede Sequenz konstruiert werden; die Gegenwart oder Abwesenheit von jedem unterschiedlichen IBL wird die Identifikation von jeder Fängersonde ermöglichen.
Außerdem erlaubt die Verwendung von unterschiedlichen Konzentrationen oder Dichten von IBLs eine „Wiederverwendung" der Sorten. Wenn beispielsweise das Kügelchen, umfassend ein erstes Mittel, eine einfache Konzentration von IBL aufweist, und ein zweites Kügelchen, umfassend ein zweites Mittel, eine zehnfache Konzentration von IBL aufweist, ermöglicht die Verwendung von sättigenden Konzentrationen des entsprechenden markierten DBL dem Nutzer, zwischen den zwei Kügelchen zu unterscheiden.
Sobald die Mikrokügelchen, die die Fängersonden umfassen, erzeugt werden, werden sie zu dem Substrat unter Bildung einer Anordnung zugegeben. Es sollte angemerkt werden, daß, während die meisten der hierin beschriebenen Verfahren die Kügelchen zu dem Substrat vor dem Assay zugeben, die Reihenfolge der Herstellung, Verwendung und Dekodierung der Anordnung variieren kann. Beispielsweise kann die Anordnung hergestellt, dekodiert und dann der Assay durchgeführt werden. Alternativ kann die Anordnung hergestellt, in einem Assay verwendet und dann dekodiert werden; dies kann spezielle Verwendung finden, wenn nur wenige Kügelchen dekodiert werden müssen. Alternativ können die Kügelchen zu dem Assaygemisch, d. h. der Probe, enthaltend die Zielsequenzen, vor der Zugabe der Kügelchen zu dem Substrat zugegeben werden; nach der Zugabe und dem Assay kann die Anordnung dekodiert werden. Dies ist besonders bevorzugt, wenn die Probe, umfassend die Kügelchen, gerührt oder gemischt wird; dies kann die Menge an Zielsequenz, die pro Zeiteinheit an die Kügelchen gebunden wurden, erhöhen, und erhöht daher (im Fall von Nukleinsäureassays) die Hybridisierungskinetiken. Dies kann spezielle Verwendung in Fällen finden, wo die Konzentration der Zielsequenz in der Probe niedrig ist; im allgemeinen müssen für niedrige Konzentrationen lange Bindungszeiten verwendet werden.
Im allgemeinen werden die Verfahren zur Herstellung von Anordnungen und zum Dekodieren der Anordnungen durchgeführt, um die Anzahl an unterschiedlichen möglichen Mitteln, die einmalig kodiert werden können, zu erhöhen. Die Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Wegen hergestellt werden. Im allgemeinen werden die Anordnungen durch Zugeben einer Lösung oder Aufschlämmung, umfassend die Kügelchen, zu einer Oberfläche, enthaltend die Anlagerungsstellen der Kügelchen, hergestellt werden. Dies kann in einer Vielzahl von Puffern, einschließlich wässerigen oder organischen Lösungsmitteln, und Gemischen durchgeführt werden. Das Lösungsmittel kann verdampfen, und überschüssige Kügelchen werden entfernt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird, wenn nicht-kovalente Verfahren verwendet werden, um die Kügelchen mit der Anordnung zu verbinden, ein neues Verfahren zum Laden der Kügelchen auf die Anordnung verwendet. Dieses Verfahren umfaßt das Aussetzen der Anordnung einer Lösung aus Teilchen (einschließlich Mikrokügelchen und Zellen) und dann das Anwenden von Energie, z. B. Rühren oder Schütteln des Gemisches. Dies führt zu einer Anordnung, umfassend fester gebundene Teilchen, wenn das Rühren mit ausreichend Energie durchgeführt wird, damit schwach gebunden Kügelchen abfallen (ausfallen in dem Fall von Löchern). Diese Stellen sind dann verfügbar, um ein anderes Kügelchen zu binden. In dieser Weise werden Kügelchen, die eine hohe Affinität für die Stellen aufweisen, ausgewählt. Anordnungen, die in dieser Weise hergestellt werden, haben zwei Hauptvorteile im Vergleich zu einer statischeren Beladung: zunächst kann ein höherer Prozentsatz der Stellen leicht gefüllt werden, und dann zeigen die so geladenen Anordnungen eine wesentlichen Verringerung im Kügelchenverlust während der Assays. Daher werden in einer bevorzugten Ausführungsform diese Verfahren verwendet, um Anordnungen zu erzeugen, die mindestens etwa 50 % an gefüllten Stellen aufweisen, wobei mindestens etwa 75 % bevorzugt sind, und mindestens etwa 90 % besonders bevorzugt sind. Ebenso verlieren Anordnungen, die in dieser Weise erzeugt werden, bevorzugt weniger als etwa 20 % der Kügelchen während eines Assays, wobei weniger als etwa 10 % bevorzugt sind und weniger als etwa 5 % besonders bevorzugt sind.
In dieser Ausführungsform wird das Substrat, umfassend die Oberfläche mit den diskreten Stellen, in eine Lösung eingetaucht, umfassend die Teilchen (Kügelchen, Zellen usw.). Die Oberfläche kann Löcher umfassen, wie hierin beschrieben, oder andere Typen von Stellen auf einer gemusterten Oberfläche, so daß es eine unterschiedliche Affinität für die Stellen gibt. Die unterschiedliche Affinität führt zu einem konkurrierenden Verfahren, so daß Teilchen, die stärker binden, ausgewählt werden. Bevorzugt ist die gesamte Oberfläche, die mit Kügelchen „beladen" werden soll, in Flüssigkeitskontakt mit der Lösung. Diese Lösung ist im allgemeinen eine Auf schlämmung von etwa 10.000:1 Kügelchen:Lösung (Vol.:Vol.) bis 1:1. Im allgemeinen kann die Lösung eine Vielzahl von Reagenzien umfassen, einschließlich wässerigen Puffern, organischen Lösungsmitteln, Salzen oder anderen Reagenzienkomponenten usw. Außerdem umfaßt die Lösung bevorzugt einen Überschuß an Kügelchen; das heißt, es gibt mehr Kügelchen als Stellen auf der Anordnung. Bevorzugte Ausführungsformen nutzen einen zweifachen bis milliardenfachen Überschuß an Kügelchen.
Das Eintauchen kann die Assaybedingungen simulieren; beispielsweise wenn die Anordnung von oben in eine Mikrotiterplatte, die die Proben umfaßt, „eingetaucht" werden soll, kann diese Konfiguration für das Beladen wiederholt werden, wodurch die Kügelchen minimiert werden, die wahrscheinlich aufgrund der Schwerkraft ausfallen.
Sobald die Oberfläche eingetaucht worden ist, werden das Substrat, die Lösung oder beide einem konkurrierenden Verfahren unterzogen, wobei die Teilchen mit niedriger Affinität von dem Substrat getrennt und durch Teilchen, die eine höhere Affinität für die Stelle zeigen, ersetzt werden können. Dieses konkurrierende Verfahren wird durch die Einführung von Energie in Form von Wärme, Beschallung, Rühren oder Mischen, Schütteln oder Bewegen der Lösung oder des Substrats oder beiden durchgeführt.
Eine bevorzugte Ausführungsform nutzt das Rühren oder Schütteln. Im allgemeinen wird die Menge an Manipulationen des Substrats minimiert, um den Schaden an der Anordnung zu verhindern; daher nutzen bevorzugte Ausführungsformen eher das Schütteln der Lösung als der Anordnung, obwohl beides möglich ist. Der Fachmann erkennt, daß dieses Schütteln eine Vielzahl von Formen annehmen kann, wobei eine bevorzugte Ausführungsform Mikrotiterplatten nutzt, umfassend Kügelchenlösungen, die unter Verwendung von Mikrotiterplattenschüttelvorrichtungen geschüttelt werden.
Das Schütteln verläuft für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um die Anordnung mit einer gewünschten Füllung zu beladen. In Abhängigkeit von der Größe und der Konzentration der Kügelchen und der Größe der Anordnung kann diese Zeit zwischen etwa 1 Sekunde und Tagen liegen, wobei etwa 1 Minute bis etwa 24 Stunden bevorzugt sind.
Es sollte angemerkt werden, daß nicht alle Stellen einer Anordnung ein Kügelchen umfassen brauchen; das heißt, es kann einige Stellen auf der Substratoberfläche geben, die leer sind. Außerdem kann es einige Stellen geben, die mehr als ein Kügelchen enthalten, obwohl es nicht bevorzugt ist.
In einigen Ausführungsformen ist es beispielsweise, wenn chemische Bindung durchgeführt wird, möglich, die Kügelchen in einer nicht-zufälligen oder geordneten Weise zu binden. Beispielsweise können unter Verwendung von photoaktivierbaren Bindungslinkern oder photoaktivierbaren Adhäsiven oder Masken ausgewählte Stellen auf der Anordnung nacheinander für die Bindung geeignet gemacht werden, so daß definierte Populationen an Kügelchen abgeschieden werden können.
Die Anordnungen werden so konstruiert, daß die Information über die Identität der Fängersonde in die Anordnung eingebaut wird, so daß die zufällige Abscheidung der Kügelchen in den Faserlöchern „dekodiert" werden kann, um die Identifikation der Fängersonde an allen Stellen zu ermöglichen. Dies kann auf einer Vielzahl von Wegen und sogar vor, während oder nach der Verwendung der Anordnung erfolgen, um Zielmoleküle nachzuweisen.
Nachdem die Anordnung hergestellt ist, wird sie daher „dekodiert", um die Lokation von einer oder mehreren der Fängersonden, d. h. jede Unterpopulation von Kügelchen, auf der Substratoberfläche zu identifizieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pyrosequenzierungstechniken verwendet, um die Anordnung zu dekodieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein selektives Dekodierungssystem verwendet. In diesem Fall werden nur die Mikrokügelchen, die eine Veränderung in dem optischen Signal infolge der Bindung einer Zielsequenz zeigen, dekodiert. Dies wird üblicherweise durchgeführt, wenn die Anzahl an „Treffern", d. h. die Anzahl an zu dekodierenden Stellen, im allgemeinen gering ist. Das heißt, die Anordnung wird zu nächst unter experimentellen Bedingungen in Abwesenheit der Zielsequenzen gescannt. Die Probe, die die Zielsequenzen enthält, wird zugegeben, und nur die Lokationen, die eine Veränderung in dem optischen Signal zeigen, werden dekodiert. Beispielsweise können die Kügelchen an entweder den positiven oder negativen Signallokationen entweder selektiv markiert oder aus der Anordnung freigesetzt sein (beispielsweise durch die Verwendung von photospaltbaren Linkern) und anschließend in einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiervorrichtung (FACS) sortiert oder angereichert werden. Das heißt, entweder werden alle negativen Kügelchen freigesetzt und dann die positiven Kügelchen entweder in situ freigesetzt oder analysiert, oder alternativ werden alle positiven freigesetzt und analysiert. Alternativ können die Markierungen halogenierte aromatische Verbindungen umfassen, und die Detektion der Markierung wird unter Verwendung von beispielsweise Gaschromatographie, chemischen Markierungen, isotopen Markierungen oder Massenspektralmarkierungen durchgeführt.
Der Fachmann erkennt, daß dies ebenso in Systemen durchgeführt werden kann, wo die Anordnung nicht dekodiert wird; d. h. es braucht nicht immer eine Korrelation der Kügelchenzusammensetzung mit der Lokation geben. In dieser Ausführungsform werden die Kügelchen auf die Anordnung geladen, und der Assay durchgeführt. Die „positiven", d. h. die Kügelchen, die eine Veränderung des optischen Signals zeigen, wie nachstehend ausführlicher dargestellt, werden dann „markiert", um sie von den „negativen" Kügelchen zu unterscheiden oder abzutrennen. Dies kann auf mehreren Wegen durchgeführt werden, bevorzugt unter Verwendung von faseroptischen Anordnungen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält jedes Kügelchen einen fluoreszierenden Farbstoff. Nach dem Assay und der Identifikation der „positiven" oder „aktiven Kügelchen" schien Licht entweder nur auf die positiven Fasern oder nur die negativen Fasern im allgemeinen in Gegenwart eines Lichtaktivierten Reagens (typischerweise gelösten Sauerstoff). In dem ersteren Fall werden alle aktiven Kügelchen lichtgebleicht. Daher können bei der nicht-selektiven Freisetzung aller Kügelchen mit anschließender Sortierung, beispielsweise unter Verwendung einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortiervorrichtung (FACS-Vorrichtung), die nicht-fluoreszierenden aktiven Kügelchen von den fluoreszierenden negativen Kügelchen sortiert werden. Alternativ, wenn Licht auf die negativen Fasern fällt, werden alle ne gativen nicht-fluoreszierend und die positiven fluoreszierend sein, und die Sortierung kann durchgeführt werden. Die Charakterisierung der gebundenen Fängersonde kann direkt durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von Massenspektroskopie.
Alternativ kann die Identifikation durch die Verwendung von Identifikationskomponenten („IMs") auftreten, die ähnlich IBLs sind, aber nicht notwendigerweise an DBLs binden. Das heißt, eher als die direkte Ermittlung der Struktur der Fängersonde, kann die Zusammensetzung der IMs als Identifikation dienen. Daher kann beispielsweise eine spezifische Kombination von IMs dazu dienen, das Kügelchen zu kodieren, und wird verwendet, um das Mittel auf dem Kügelchen bei der Freisetzung aus dem Kügelchen zu identifizieren, gefolgt von anschließender Analyse, beispielsweise unter Verwendung eines Gaschromatographen oder Massenspektroskopen.
Alternativ umfaßt jedes Kügelchen eher einen nicht-fluoreszierenden Präkursor für einen fluoreszierenden Farbstoff, als daß jedes Kügelchen einen fluoreszierenden Farbstoff enthält. Beispielsweise kann unter Verwendung von photospaltbaren Schutzgruppen, wie bestimmten ortho-Nitrobenzylgruppen, auf einem fluoreszierenden Molekül, die Photoaktivierung des Fluorochroms durchgeführt werden. Nach dem Assay werden entweder die „positiven" oder „negativen" Fasern erneut bestrahlt, um diese Populationen zu unterscheiden. Die beleuchteten Präkursoren werden dann chemisch zu einem fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt. Alle Kügelchen werden dann aus der Anordnung unter Sortierung freigesetzt, um Populationen von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Kügelchen zu bilden (entweder den positiven oder den negativen oder umgekehrt).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Anlagerungsstellen der Kügelchen (beispielsweise die Löcher) ein photopolymerisierbares Reagens, oder das photopolymerisierbare Mittel wird zu der vereinigten Anordnung zugegeben. Nach der Durchführung des Testassays werden entweder die „positiven" oder die „negativen" Fasern erneut bestrahlt, um diese Populationen zu unterscheiden. Infolge der Bestrahlung werden entweder alle positiven oder alle negativen polymerisiert und eingefangen oder an die Stellen gebunden, während die andere Population von Kügelchen aus der Anordnung freigesetzt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Lokation von jeder Fängersonde unter Verwendung von Dekodierungsbindungsliganden (DBLs) bestimmt. Wie oben dargestellt, sind DBLs Bindungsliganden, die entweder an Identifikationsbindungsliganden, wenn vorhanden, oder an die Fängersonden selbst binden, bevorzugt wenn die Fängersonde eine Nukleinsäure oder ein Protein ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet, wie oben dargestellt, der DBL an den IBL.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Fängersonden einzelsträngige Nukleinsäuren, und der DBL ist eine im wesentlichen komplementäre einzelsträngige Nukleinsäure, die an die Fängersonde bindet (hybridisiert), hierin als eine Dekodierungssonde bezeichnet. Eine Dekodierungssonde, die im wesentlichen komplementär zu jeder möglichen Sonde ist, wird hergestellt und verwendet, um die Anordnung zu dekodieren. In dieser Ausführungsform sollten die möglichen Sonden und die Dekodierungssonden von ausreichender Länge sein (und der Dekodierschritt verläuft unter geeigneten Bedingungen), um die Spezifität zu erlauben; d. h. jede mögliche Sonde bindet an ihre entsprechende Dekodierungssonde mit ausreichender Spezifität, um die Unterscheidung von jeder möglichen Sonde zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DBLs entweder direkt oder indirekt markiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DBL direkt markiert, das heißt, der DBL umfaßt eine Markierung. In einer anderen Ausführungsform ist der DBL indirekt markiert; das heißt, ein markierender Bindungsligand (LBL), der an DBL bindet, wird verwendet. In dieser Ausführungsform kann das markierende Bindungsliganden-DBL-Paar wie oben für IBL-DBL-Paare beschrieben sein.
Folglich wird die Identifikation der Lokation der einzelnen Kügelchen (oder Unterpopulationen von Kügelchen) unter Verwendung von ein oder mehreren Dekodierungsschritten durchgeführt, umfassend eine Bindung zwischen dem markierten DBL und entweder dem IBL oder der Fängersonde (d. h. eine Hybridisierung zwischen der möglichen Sonde und der Dekodierungssonde, wenn die Fängersonde eine Nukleinsäure ist). Nach dem Dekodieren können die DBLs entfernt werden, und die Anordnung kann verwendet werden; jedoch unter einigen Umständen, beispielsweise wenn der DBL an einen IBL und nicht an die Fängersonde bindet, ist die Entfernung des DBLs nicht erforderlich (obwohl es unter einigen Umständen wünschenswert sein kann). Außerdem kann, wie hierin dargestellt, das Dekodieren durchgeführt werden, entweder bevor die Anordnung in einem Assay, während des Assays oder nach dem Assay verwendet wird.
In einer Ausführungsform wird ein einzelner Dekodierungsschritt durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird jeder DBL mit einer einmaligen Markierung markiert, so daß die Anzahl an einmaligen Markierungen gleich oder größer als die Anzahl der Fängersonden ist (obwohl in einigen Fällen die „Wiederverwendung" der einmaligen Markierungen durchgeführt werden kann, wie hierin beschrieben; ebenso können kleinere Varianten von möglichen Sonden denselben Dekodierer teilen, wenn die Varianten in einer anderen Dimension kodiert werden, d. h. in der Kügelchengröße oder -markierung). Für jede Fängersonde oder IBL wird ein DBL hergestellt, der spezifisch daran binden wird, und eine einmalige Markierung enthält, beispielsweise einen oder mehrere Fluorochrome. Daher ist die Identität von jedem DBL, sowohl seine Zusammensetzung (d. h. seine Sequenz, wenn es eine Nukleinsäure ist) als auch seine Markierung, bekannt. Dann kann durch die Zugabe der DBLs zu der Anordnung, enthaltend die Fängersonden, unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen (als Hybridisierungskomplexe bezeichnet, wenn die Komponenten Nukleinsäuren sind) zwischen den DBLs und entweder den Fängersonden oder der IBLs erlauben, die Lokation von jedem DBL ermittelt werden. Dies ermöglicht die Identifikation der Lokation von jeder Fängersonde; die zufällige Anordnung wurde dekodiert. Die DBLs können, wenn notwendig, entfernt und die Zielprobe angebracht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anzahl an einmaligen Markierungen geringer als die Anzahl an einmaligen Fängersonden, und daher werden aufeinanderfolgende Reihen von Dekodierungsschritten verwendet. In dieser Ausführungs form werden Dekodieringssonden in n Gruppen zum Dekodieren unterteilt. Die Anzahl von Gruppen entspricht der Anzahl von einmaligen Markierungen. Jede Dekodierungssonde wird in n separaten Reaktionen mit n unterschiedlichen Markierungen markiert. Alle Dekodierungssonden teilen dieselben n Markierungen. Die Dekodierungssonden werden vereinigt, so daß jeder Pool nur eine der n Markierungsversionen von jedem Dekodierer enthält und keine zwei Dekodierungssonden dieselbe Sequenz an Markierungen über die gesamten Pools aufweisen. Die Anzahl an Pools, die erforderlich ist, damit dies zutrifft wird durch die Anzahl an Dekodierungssonden und n bestimmt. Die Hybridisierung von jedem Pool mit der Anordnung erzeugt ein Signal an jeder Adresse. Die aufeinanderfolgende Hybridisierung von jedem Pool wird wiederum einen einmaligen, Sequenzspezifischen Code für jede mögliche Sonde erzeugen. Dies identifiziert die mögliche Sonde an jeder Adresse in der Anordnung. Beispielsweise kann, wenn vier Markierungen verwendet werden, dann 4 X n aufeinanderfolgende Hybridisierungen idealerweise 4ⁿ Sequenzen unterscheiden, obwohl in einigen Fällen mehr Schritte erforderlich sein können. Nach der Hybridisierung von jedem Pool werden die Hybride denaturiert, und die Dekodierungssonden entfernt, so daß die Sonden für die nächste Hybridisierung einzelsträngig gemacht werden (Obwohl es ebenso möglich ist, begrenzte Mengen an Markierung zu hybridisieren, so daß die erhältliche Sonde nicht gesättigt ist. Aufeinanderfolgende Hybridisierungen können durchgeführt und durch Subtrahieren des vorher existierenden Signals von der vorherigen Hybridisierung analysiert werden).
Ein Beispiel ist illustrativ. Unter der Voraussetzung einer Anordnung mit 16 Sondennukleinsäuren (Zahlen 1 bis 16) und vier einmaligen Markierungen (vier unterschiedlichen Fluorophoren, beispielsweise; Markierungen A-D), werden die Dekodierungssonden 1 bis 16 hergestellt, die den Sonden auf den Kügelchen entsprechen. Der erste Schritt ist die Markierung der Dekodierungssonden 1 bis 4 mit Markierung A, der Dekodierungssonden 5 bis 8 mit Markierung B, der Dekodierungssonden 9 bis 12 mit Markierung C und der Dekodierungssonden 13 bis 16 mit Markierung D. Die Sonden werden gemischt, und der Pool mit der Anordnung kontaktiert, die die Kügelchen mit den gebundenen möglichen Sonden enthält. Die Lokation von jeder Markierung (und daher jedem Dekodierer und möglichen Sondenpaar) wird dann bestimmt. Die erste Gruppe an Dekodierungssonden wird dann entfernt. Eine zweite Gruppe wird zugegeben, aber jetzt werden die Dekodierungssonden 1, 5, 9 und 13 mit Markierung A markiert, die Dekodierungssonden 2, 6, 10 und 14 mit Markierung B markiert, die Dekodierungssonden 3, 7, 11 und 15 mit Markierung C markiert und die Dekodierungssonden 4, 8, 12 und 16 mit Markierung D markiert. Daher enthalten die Kügelchen, die Markierung A in beiden Dekodierungsschritten enthielten, die mögliche Sonde 1; die, die die Markierung A in dem ersten Dekodierungsschritt und Markierung B in dem zweiten Dekodierungsschritt enthielten, enthalten die mögliche Sonde 2; die, die die Markierung A in dem ersten Dekodierungsschritt und Markierung C in dem zweiten Schritt enthielten, enthalten die mögliche Sonde 3 usw.
In einer Ausführungsform werden die Dekodierungssonden in situ markiert; das heißt, sie müssen vor der Dekodierungsreaktion nicht markiert werden. In dieser Ausführungsform ist die eingehende Dekodierungssonde kürzer als die mögliche Sonde, was einen 5'-„Überhang" an der Dekodierungssonde erzeugt. Die Zugabe von markierten ddNTPs (jeweils markiert mit einer einmaligen Markierung) und einer Polymerase wird die Zugabe der Markierungen in einer Sequenzspezifischen Weise erlauben, wodurch ein Sequenzspezifisches Muster von Signalen erzeugt wird. Ebenso können andere Modifikationen durchgeführt werden, einschließlich Ligation usw.
Außerdem ist es, da die Größe der Anordnung durch die Anzahl an einmaligen dekodierenden Bindungsliganden eingestellt wird, möglich, eine Gruppe von einmaligen DBLs „wiederzuverwenden", um eine größere Anzahl an Teststellen zu ermöglichen. Dies kann auf mehreren Wegen durchgeführt werden; beispielsweise unter Verwendung von einigen Unterpopulationen, die optische Signaturen umfassen. Ebenso können bei der Verwendung eines Positionskodierungsschemas innerhalb einer Anordnung unterschiedliche Subbündel die Gruppe von DBLs wiederverwenden. Ebenso nutzt eine Ausführungsform die Kügelchengröße als eine Kodierungsmodalität, wodurch die Wiederverwendung der Gruppe von einmaligen DBLs für jede Kügelchengröße ermöglicht wird. Alternativ kann die aufeinanderfolgende Teilladung von Anordnungen mit Kügelchen ebenso die Wiederverwendung von DBLs ermöglichen. Außerdem kann „Codesharing" ebenso auftreten.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die DBLs wiederverwendet werden, indem einige Unterpopulationen von Kügelchen optische Signaturen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die optische Signatur im allgemeinen ein Gemisch aus Reporterfarbstoffen, bevorzugt fluoreszierend. Durch Verändern von sowohl der Zusammensetzung des Gemisches (d. h. dem Verhältnis von einem Farbstoff zum anderen) als auch der Konzentration des Farbstoffes (was zu Unterschieden in der Signalintensität führt) können Matrizes von einmaligen optischen Signaturen erzeugt werden. Dies kann durch kovalentes Binden der Farbstoffe an die Oberfläche der Kügelchen oder alternativ durch Einschließen des Farbstoffes innerhalb der Kügelchen erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Kodieren in einem Verhältnis von mindestens zwei Farbstoffen erreicht werden, obwohl beispielsweise mehr kodierende Dimensionen in der Größe der Kügelchen hinzugefügt werden können. Außerdem sind die Markierungen voneinander zu unterscheiden; daher können zwei unterschiedliche Markierungen unterschiedliche Moleküle umfassen (d. h. zwei unterschiedliche Fluorophore) oder alternativ eine Markierung bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen oder Intensitäten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe kovalent an die Oberfläche der Kügelchen gebunden. Dies kann, wie im allgemeinen für die Anlagerung der Fängersonden dargestellt, unter Verwendung funktioneller Gruppen auf der Oberfläche der Kügelchen durchgeführt werden. Der Fachmann erkennt, daß diese Anlagerungen durchgeführt werden, um die Wirkung auf den Farbstoff zu verringern.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe nicht-kovalent mit den Kügelchen verbunden, im allgemeinen durch Einschließen der Farbstoffe in die Poren der Kügelchen.
Außerdem ist das Kodieren in den Verhältnissen der zwei oder mehreren Farbstoffe, eher als einzelne Farbstoffkonzentrationen, bevorzugt, da es Unempfindlichkeit für die Intensität von Licht bereitstellt, das verwendet wird, um die Signatur des Reporterfarbstoffs und Detektorempfindlichkeit abzufragen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein räumliches oder Positionskodierungssystem durchgeführt. In dieser Ausführungsform gibt es Subbündel oder Unteranordnungen (d. h. Teile der Gesamtanordnung), die verwendet werden. Analog zu dem Telefonsystem ist jede Unteranordnung eine „Vorwahl", die dieselben Markierungen (d. h. Telefonnummern) von anderen Unteranordnungen aufweisen, die aufgrund der Lokation der Unteranordnung getrennt werden. Daher können beispielsweise dieselben einmaligen Markierungen von Bündel zu Bündel wiederverwendet werden. Daher kann die Verwendung von 50 einmaligen Markierungen in Kombination mit 100 unterschiedlichen Unteranordnungen eine Anordnung von 5000 unterschiedlichen Fängersonden bilden. In dieser Ausführungsform ist es wichtig, ein Bündel aus anderen identifizieren zu können; im allgemeinen wird dies entweder manuell oder durch die Verwendung von Markerkügelchen, d. h. Kügelchen, enthaltend einmalige Markierungen für jede Unteranordnung, durchgeführt.
In alternativen Ausführungsformen können zusätzliche Kodierungsparameter zugegeben werden, wie Mikrokügelchengröße. Beispielsweise kann die Verwendung von Kügelchen mit unterschiedlicher Größe ebenso die Wiederverwendung von Gruppen von DBLs erlauben; das heißt, es ist möglich, Mikrokügelchen von unterschiedlichen Größen zu verwenden, um die kodierenden Dimensionen der Mikrokügelchen zu erweitern. Lichtleitfaseranordnungen können hergestellt werden, enthaltend Pixel mit unterschiedlichen Faserdurchmessern oder Querschnitten; alternativ können zwei oder mehrere Lichtwellenleiterbündel, jeweils mit unterschiedlichen Querschnitten der einzelnen Fasern, zusammen zugegeben werden, um ein größeres Bündel zu bilden; oder Lichtwellenleiterbündel aus Fasern mit Querschnitte derselben Größe, aber noch mit unterschiedlich großen Kügelchen können verwendet werden. Mit unterschiedlichen Durchmessern können die größten Löcher mit den größten Mikrokügelchen gefüllt werden, und dann bewegen sich zunehmend kleinere Mikrokügelchen in kleinere Löcher, bis alle großen Löcher gefüllt sind. In dieser Weise konnte dasselbe Farbstoffverhältnis verwendet werden, um Mikrokügelchen mit unterschiedlichen Größen zu kodieren, wodurch die Zahl an unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen oder chemischen Funktionalitäten, die in der Anordnung vorliegen, erhöht wird. Obwohl für die Lichtwellenleitersubstrate dargestellt, kann dies sowie andere hierin dargestellte Verfahren mit anderen Substraten und mit anderen Anlagerungsmodalitäten ebenso verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Kodieren und Dekodieren durch aufeinanderfolgendes Laden der Mikrokügelchen in die Anordnung erreicht. Wie oben für räumliches Kodieren dargestellt, können in dieser Ausführungsform die optischen Signaturen „wiederverwendet" werden. In dieser Ausführungsform wird die Bibliothek von Mikrokügelchen, jeweils umfassend eine andere Fängersonde (oder die Unterpopulationen umfassen jeweils eine andere Fängersonde), in eine Vielzahl von Unterbibliotheken unterteilt; beispielsweise können in Abhängigkeit von der Größe der gewünschten Anordnung und der Anzahl an einmaligen Markierungen 10 Unterbibliotheken, jeweils umfassend grob 10 % der Gesamtbibliothek, hergestellt werden, wobei jede Unterbibliothek grob dieselben einmaligen Markierungen umfaßt. Dann wird die erste Unterbibliothek zu dem Lichtwellenleiterbündel, umfassend die Löcher, zugegeben, und die Lokation von jeder Fängersonde wird im allgemeinen durch die Verwendung von DBLs bestimmt. Die zweite Unterbibliothek wird dann zugegeben, und die Lokation von jeder Fängersonde wird erneut bestimmt. Das Signal wird in diesem Fall das Signal von dem „ersten" DBL und dem „zweiten" DBL umfassen; durch Vergleichen der zwei Matrizes kann die Lokation von jedem Kügelchen in jeder Unterbibliothek bestimmt werden. Ebenso wird das Zugeben der dritten, vierten usw. Unterbibliotheken nacheinander das Befüllen der Anordnung erlauben.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Codes auf mehreren Wegen „geteilt" werden. In einer ersten Ausführungsform kann ein einzelner Code (d. h. IBL/DBL-Paar) zwei oder mehreren Mitteln zugewiesen werden, wenn sich die Zielsequenzen in ihren Bindungsstärken ausreichend unterscheiden. Beispielsweise können zwei Nukleinsäuresonden, die in einem mRNA-Quantitationsassay verwendet werden, denselben Code teilen, wenn die Bereiche ihrer Hybridisierungssignalintensitäten nicht überlappen. Dies kann beispielsweise auftreten, wenn eine der Zielsequenzen stets bei einer viel höheren Konzentration als die andere vorliegt. Alternativ können die zwei Zielsequenzen stets bei einer ähnlichen Konzentration vorliegen, aber unterscheiden sich in der Hybridisierungswirksamkeit.
Alternativ kann ein einzelner Code mehreren Mitteln zugewiesen werden, wenn die Mittel funktionell äquivalent sind. Wenn beispielsweise eine Gruppe von Oligonukleotidsonden mit dem üblichen Zweck des Nachweises der Gegenwart eines speziellen Gens konstruiert ist, dann sind die Sonden funktionell äquivalent, selbst wenn sie sich in der Sequenz unterscheiden können. Ebenso konnte eine Anordnung von diesem Typ verwendet werden, um Homologa von bekannten Genen nachzuweisen. In dieser Ausführungsform wird jedes Gen durch eine heterologe Gruppe von Sonden dargestellt, die mit unterschiedlichen Bereichen des Gens hybridisieren (und sich daher in der Sequenz unterscheiden). Die Gruppe von Sonden teilt sich einen gemeinsamen Code. Wenn ein Homologon vorliegt, kann es mit einigen, aber nicht allen Sonden hybridisieren. Der Grad der Homologie kann durch den Anteil von hybridisierenden Sonden sowie die durchschnittliche Hybridisierungsintensität angegeben werden. Ebenso könnten sich mehrere Antikörper für dasselbe Protein denselben Code teilen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Dekodierung von selbst organisierten zufälligen Anordnungen auf der Basis der pH-Titration durchgeführt. In dieser Ausführungsform umfassen zusätzlich zu den Fängersonden die Kügelchen optische Signaturen, wobei die optischen Signaturen durch die Verwendung von pH-reaktionsfähigen Farbstoffen (manchmal als „PH-Farbstoffe" bezeichnet) wie Fluorophore erzeugt werden. Diese Ausführungsform ist ähnlich der, die in WO 98/40726 dargestellt ist, außer daß die Farbstoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, Veränderungen in der Fluoreszenzintensität (oder anderen Eigenschaften) zeigen, wenn der Lösungs-PH von unter dem pKa-Wert bis über dem pKa-Wert (oder umgekehrt) eingestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Gruppe von PH-Farbstoffen verwendet, jeweils mit einem unterschiedlichen pKa-Wert, bevorzugt getrennt durch mindestens 0,5 pH-Einheiten. Bevorzugte Ausführungsformen nutzen eine pH-Farbstoffgruppe mit pKa's von 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11 und 11,5. Jedes Kügelchen kann eine Untergruppe der P^H-Farbstoffe enthalten, und in dieser Weise wird ein einmaliger Code für die Fängersonde erzeugt. Daher wird die Dekodierung einer Anordnung durch Titrieren der Anordnung von pH 1 bis pH 13 und Messen des Fluoreszenzsignals aus jedem Kügelchen als eine Funktion des Lösungs-pHs erreicht.
Daher stellt die vorliegende Anmeldung Anordnungszusammensetzungen bereit, umfassend ein Substrat mit einer Oberfläche, die diskrete Stellen umfaßt. Eine Population von Mikrokügelchen wird auf den Stellen verteilt, und die Population umfaßt mindestens eine erste und eine zweite Unterpopulation. Jede Unterpopulation umfaßt eine Fängersonde, und außerdem mindestens einen optischen Farbstoff mit einem gegebenen pKa-Wert. Die pKa's der verschiedenen optischen Farbstoffe sind unterschiedlich.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Niveaus an Redundanz in die Anordnungen der Erfindung eingebaut. Das Einbauen von Redundanz in eine Anordnung ergibt mehrere signifikante Vorteile, einschließlich der Fähigkeit zur Erzeugung quantitativer Bestimmungen der Konfidenz über die Daten und signifikanten Erhöhungen der Empfindlichkeit. Daher nutzen bevorzugte Ausführungsformen Anordnungsredundanz. Der Fachmann erkennt, daß es mindestens zwei Typen von Redundanz gibt, die in eine Anordnung eingebaut werden können: die Verwendung von mehreren identischen Sensorelementen (hierin als „Sensorredundanz" bezeichnet) und die Verwendung von mehreren Sensorelementen, die auf denselben Zielanalyten gerichtet sind, aber unterschiedliche chemische Funktionalitäten umfassen (hierin als „Zielredundanz" bezeichnet). Beispielsweise nutzt für den Nachweis von Nukleinsäuren die Sensorredundanz eine Vielzahl von Sensorelementen, wie Kügelchen, die identische Bindungsliganden wie Sonden umfassen. Zielredundanz nutzt Sensorelemente mit unterschiedlichen Sonden für dasselbe Ziel: eine Sonde kann sich über die ersten 25 Basen des Ziels erstrecken, eine zweite Sonde kann sich über die zweiten 25 Basen des Ziels erstrecken usw. Durch Einbauen von einem oder beiden dieser Typen an Redundanz in eine Anordnung werden signifikante Vorteile erhalten. Beispielsweise kann eine Vielzahl von statistischen mathematischen Analysen durchgeführt werden.
Außerdem können, während dies im allgemeinen hierin für Kügelchenanordnungen beschrieben wird, was der Fachmann erkennt, diese Techniken für jeden Typ von Anordnungen, die Zielanalyten nachweisen sollen, verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sensorredundanz verwendet. In dieser Ausführungsform wird eine Vielzahl von Sensorelementen verwendet, z. B. werden Kügelchen, die identische bioaktive Mittel umfassen, verwendet. Das heißt, jede Unterpopulation umfaßt eine Vielzahl von Kügelchen, die identische bioaktive Mittel umfassen (z. B. Bindungsliganden). Unter Verwendung einer Vielzahl von identischen Sensorelementen für eine gegebene Anordnung kann das optische Signal von jedem Sensorelement kombiniert werden und jede Anzahl von statistischen Analysen durchgeführt werden, wie nachstehend dargestellt. Dies kann aus einer Vielzahl von Gründen erfolgen. Beispielsweise kann bei zeitlich veränderlichen Messungen die Redundanz das Rauschen in dem System signifikant reduzieren. Für Messungen, die nicht auf der Zeit basieren, kann die Redundanz die Konfidenz der Daten signifikant erhöhen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vielzahl von identischen Sensorelementen verwendet. Der Fachmann erkennt, daß die Anzahl an identischen Sensorelementen mit der Anwendung und der Verwendung der Sensoranordnung variieren wird. Im allgemeinen können von 2 bis Tausende verwendet werden, wobei 2 bis 100 bevorzugt sind, 2 bis 50 besonders bevorzugt sind und 5 bis 20 stärker bevorzugt sind. Im allgemeinen geben vorläufige Ergebnisse an, daß grob 10 Kügelchen einen ausreichenden Vorteil bieten, obwohl sie für einige Sensorelemente verwendet werden können.
Sobald erhalten, können die optischen Reaktionssignale aus einer Vielzahl von Sensorkügelchen innerhalb jeder Kügelchenunterpopulation manipuliert und auf einer breiten Vielzahl von Wegen analysiert werden, einschließlich der Nullinieneinstellung, Durchschnittsbildung, Standardabweichungsanalyse, Verteilung und Cluster-Analyse, Konfidenzintervallanalyse, Mittelwerttests usw.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Manipulation der optischen Reaktionssignale eine optionale Nullinieneinstellung. Bei einem typischen Verfahren werden die standardisierten optischen Reaktionen eingestellt, um bei einem Wert von 0,0 durch Subtrahieren der ganzen Zahl 1,0 von allen Datenpunkten zu beginnen. Dies ermöglicht es, die Nullinien-Schleifen-Daten auf null zu halten, selbst wenn sie miteinander summiert werden und das zufällige Reaktionssignalrauschen aufgehoben wird. Wenn die Probe eine Flüssigkeit ist, zeigt jedoch die temporale Flüssigkeitsimpuls-Schleifen-Region häufig eine charakteristische Veränderung der Reaktion, entweder positiv, negativ oder neutral, vor dem Probenimpuls und erfordert oftmals eine Nullinieneinstellung, um das Rauschen zu überwinden, das mit dem Drift in den ersten wenigen Datenpunkten aufgrund des Ladungsaufbaus in der CCD-Kamera verbunden ist. Wenn kein Drift vorliegt, wird typischerweise die Nullinie von dem ersten Datenpunkt für jeden Kügelchensensor von allen Reaktionsdaten für dasselbe Kügelchen subtrahiert. Wenn Drift beobachtet wird, wird die durchschnittliche Nullinie von den ersten zehn Datenpunkten für jeden Kügelchensensor von allen Reaktionsdaten für dasselbe Kügelchen subtrahiert. Durch Anwenden dieser Nullinieneinsteilung, wenn mehrere Kügelchenreaktionen miteinander addiert werden, können sie verstärkt werden, während die Nullinie bei null bleibt. Da alle Kügelchen gleichzeitig auf die Probe reagieren (z. B. den Probenimpuls), sehen sie alle den Impuls zu exakt derselben Zeit, und es ist keine Registrierung oder Einstellung für das Übereinanderlegen ihrer Reaktionen nötig. Außerdem können andere Typen der Nullinieneinstellung in Abhängigkeit von den Erfordernissen und der Ausgabe des verwendeten Systems durchgeführt werden.
Sobald die Nullinie eingestellt wurde, kann eine Vielzahl von möglichen statistischen Analysen durchgeführt werden, um bekannte statistische Parameter zu erzeugen. Analysen, basierend auf Redundanz, sind bekannt und allgemein in Lehrbüchern beschrieben, wie Freund and Walpole, Mathematical Statistics, Prentice Hall, Inc. New Jersey, 1980.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Signalsummierung durch einfaches Addieren der Intensitätswerte von allen Reaktionen zu jedem Zeitpunkt durchgeführt, was eine neue temporale Reaktion erzeugt, bestehend aus der Summe aller Kügelchenreaktionen. Diese Werte können auf Nullinien eingestellt oder unbearbeitet sein. Wie für alle hierin beschriebenen Analysen kann die Signalsummierung in Echtzeit oder während der Datenreduktion und -analyse nach der Erfassung der Daten durchgeführt werden. In einer Ausführungsform wird die Signalsummierung mit ei nem kommerziellen Tabellenkalkulationsprogramm (Excel, Microsoft, Redmond, WA) durchgeführt, nachdem optische Reaktionsdaten gesammelt wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden kumulative Reaktionsdaten durch einfaches Addieren aller Datenpunkte in aufeinanderfolgenden Zeitintervallen erzeugt. Diese fertige Säule, bestehend aus der Summe aller Datenpunkte bei einem speziellen Zeitintervall, kann dann mit den einzelnen Kügelchenreaktionen verglichen oder eingetragen werden, um das Ausmaß der Signalverbesserung oder verbesserten Signal-Rausch-Verhältnisse zu bestimmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bedeutung der Unterpopulation (d. h. die Mehrheit von identischen Kügelchen) unter Verwendung der allgemein bekannten Gleichung 1 bestimmt:
Gleichung 1.
In einigen Ausführungsformen kann die Unterpopulation neu bestimmt werden, um einige Kügelchen, wenn notwendig, auszuschließen (beispielsweise für offensichtliche Ausreißer, wie nachstehend erläutert).
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Standardabweichung der Unterpopulation im allgemeinen unter Verwendung der Gleichung 2 (für die gesamte Unterpopulation) und Gleichung 3 (für weniger als die gesamte Unterpopulation) bestimmt werden: Gleichung 2
Gleichung 3
Was den Mittelwert betrifft, kann die Unterpopulation neu bestimmt werden, um einige Kügelchen, wenn notwendig, auszuschließen (beispielsweise für offensichtliche Ausreißer, wie nachstehend erläutert).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden statistische Analysen, um zu bewerten, ob ein spezieller Datenpunkt statistische Gültigkeit innerhalb einer Unterpopulation aufweist, unter Verwendung von Techniken, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, t-Verteilung und Cluster-Analyse, durchgeführt. Dies kann für statistisch verworfene Ausreißer durchgeführt werden, die andernfalls das Ergebnis verzerren und das Signal-Rausch-Verhältnis von jedem speziellen Experiment erhöhen können. Dies kann unter Verwendung von Gleichung 4 durchgeführt werden: Gleichung 4
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Qualität der Daten unter Verwendung von Konfidenzintervallen bewertet, was in der Technik bekannt ist. Konfidenzintervalle können verwendet werden, um eine umfassendere Datenverarbeitung zu erleichtern, um die statistische Gültigkeit eines Ergebnisses zu bewerten.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden statistische Parameter einer Unterpopulation von Kügelchen verwendet, um Hypothesentests durchzuführen. Eine Anwendung sind Tests, die Mittelwerte betreffen, ebenso Mittelwertstests genannt. Bei dieser Anwendung wird die statistische Bewertung durchgeführt, um zu bestimmen, ob zwei Unterpopulationen unterschiedlich sind. Beispielsweise könnte eine Probe mit einer anderen Probe für jede Unterpopulation innerhalb einer Anordnung verglichen werden, um zu bestimmen, wenn die Abweichung statistisch signifikant ist.
Außerdem können Mittelwerttests ebenso verwendet werden, um zwei unterschiedliche Assays zu unterscheiden, die denselben Code teilen. Wenn die zwei Assays Ergebnisse erzielen, die sich statistisch voneinander unterscheiden, dann können die Unterpopulationen, die einen selben Code teilen, auf der Grundlage des Assays und des Mittelwerttests voneinander unterschieden werden, nachstehend in Gleichung 5 gezeigt: Gleichung 5
Außerdem kann das Analysieren der Verteilung von einzelnen Mitgliedern einer Unterpopulation von Sensorelementen durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine Unterpopulationsverteilung bewertet werden, um zu bestimmen, ob die Verteilung binomial, Poisson, hypergeometrisch usw. ist.
Zusätzlich zu der Sensorredundanz nutzt eine bevorzugte Ausführungsform eine Vielzahl von Sensorelementen, die auf einen einzelnen Zielanalyten gerichtet sind, aber dennoch nicht identisch sind. Beispielsweise kann ein einzelner Zielnukleinsäureanalyt zwei oder mehrere Sensorelemente aufweisen, jeweils umfassend eine unterschiedliche Sonde. Dies fügt eine statistische Sicherheit hinzu, da nicht-spezifische Bindungsinteraktionen statistisch minimiert werden können. Wenn Nukleinsäurezielanalyten bewertet werden sollen, können die redundanten Nukleinsäuresonden überlappend, nachbarständig oder räumlich getrennt sein. Jedoch ist es bevorzugt, daß zwei Sonden nicht um eine einzelne Bindungsstelle konkurrieren, daher sind nachbarständige oder getrennte Sonden bevorzugt. Ebenso nutzen, wenn proteinartige Zielanalyten bewertet werden sollen, bevorzugte Ausführungsformen bioaktive Bindemittel, die an unterschiedliche Teile des Ziels binden. Beispielsweise nutzen, wenn Antikörper (oder Antikörperfragmente) als bioaktive Mittel für das Binden der Zielproteine verwendet werden, bevorzugte Ausführungsformen Antikörper für unterschiedliche Epitope.
In dieser Ausführungsform kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Sensorelementen verwendet werden, wobei etwa 2 bis etwa 20 bevorzugt sind, und etwa 2 bis etwa 10 besonders bevorzugt sind, und 2 bis etwa 5 stärker bevorzugt, einschließlich 2, 3, 4 oder 5. Jedoch können, wie oben, in Abhängigkeit von der Anwendung ebenso mehr verwendet werden.
Wie oben, kann jede Zahl von statistischen Analysen mit den Daten von redundanten Zielsensoren durchgeführt werden.
Ein Vorteil der Sensorelementsummierung (hierin als „Kügelchensummierung" bezeichnet, wenn Kügelchen verwendet werden) ist die Erhöhung der Empfindlichkeit, die auftreten kann.
Der Fachmann erkennt, daß die vorliegende Erfindung Verwendung in einer großen Zahl an Anwendungen findet.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet die vorliegende Erfindung Verwendung bei der Genexpressionsüberwachung und -Profilierung in jeder mRNA-Probe, und insbesondere in dem Vergleich von unterschiedlichen Zellstadien, einschließlich des Vergleichs von erkranktem Gewebe, wie krebsartigem Gewebe, mit normalem Gewebe.
In einer bevorzugten Ausführungsform findet die vorliegende Erfindung Verwendung bei der alternativen Spleißanalyse, einschließlich sowohl Entdeckung von Spleißstellen und Detektion von alternativen Spleißstellen. In dieser Ausführungsform findet die Erfindung Verwendung bei der Korrelation von alternativen Spleißmustern für morphologische und klinische Parameter von Krebs. Ebenso kann der Mechanismus und die Regulierung von konstitutivem und alternativem Spleißen in einer Vielzahl von Zelltypen ermittelt werden, wie oben dargestellt.

Spezifische Spleißziele werden nachstehend in Tabelle 1 gezeigt (gefolgt von Verweisen). Tabelle I. Ausgewählte Spleißziele

	Genname	Funktionelle Bedeutung	Ausgewählte Referenz
1	Acetylcholinesterase	Synapsenreifung	1
2	Agrin	AChR-Clustering an Synapsen	2
3	AML1	Transkriptionsaktivierung	3
4	ASF/SF2	mRNA-Splicing-Regulierung	4
5	Bcl-x	Apoptose-Regulierung	5
6	BRCA1	Transkriptionsaktivierung	6
7	c-src	Signaltransduktionsregulierung	7
8	Calciumkanal, alpha 1A	Neurotransmitterfreisetzung	8
9	Calciumkanal, alpha 1B	Neurotransmitterfreisetzung	9
10	Caspase 1 (ICE)	apoptotische Regulierung	10
11	Caspase 2 (Ich-1)	apoptotische Regulierung	11
12	CD45	T-Zell-Reifung	12
13	Clathrin-Leichtkette B	Rezeptor-vermittelte Endozytose	13
14	Cytochrom P450, Aromatase	Steroidhormonsynthese	14
15	Östrogenrezeptor 1	Hormonreaktion	15
16	Östrogenrezeptor 2	Hormonreaktion	16
17	fas-Ligand	apoptotische Regulierung	17
18	FGFR2	Signaltransduktion	18
19	Fibronectin 1	Wundheilung	19
20	fyn	Wachstumskontrolle	20
21	Glutamatrezeptor NMDARI	Neurotransmission	21
22	Hel-N1	mRNA-Umsatz	22
23	Insulinrezeptor	Signaltransduktion	23
24	Integrin beta	Zelladhäsion	24
25	jun-Kinase 2	Transkriptionscofaktor	25
26	MUC1	Zelloberflächentumormarker	26
27	Myosin-Schwerkette	Muskelkontraktion	27
28	NCAM	Zelladhäsion	28
29	nNos	Neurotransmission	29
30	p15-CDK-Inhibitor 2B (INK 4b)	Zellzykluskontrolle	30
31	p16-CDK-Inhibitor 2A (ARF)	Zellzykluskontrolle	31
32	Presenilin 2	apoptotische Regulierung	32
33	Prostata-spezifisches Antigen	Zelloberflächentumormarker	33
34	SMN	spinalmotorisches Nervenzellenüberleben	34
35	SRp40	mRNA-Splicing-Regulierung	35
36	tau	neuronale Reifung	36
37	Telomerase	chromosomale Integrität und Wachstumskontrolle	37
38	Transformer 2 beta	mRNA-Splicing-Regulierung	38
39	Tropomyosin 1 (alpha)	Muskelkontraktion	39
40	Tropomyosin 2 (beta)	Muskelkontraktion	40
41	Troponin T3	Muskelkontraktion	41
42	VEGFR-1	Angiogenese und vaskuläre Permeabilität	42
43	Wilms-Tumor 1	Transkiptionsregulierung	43

Ausgewählte Referenzen für die Tabelle

1. Luo, Z. D., et al., J. Biol. Chem. 273: 28486-28495 (1998).
2. Ferns, M., et al, Neuron, 8: 1079-1086 (1992).
3. Tanaka, T., et al., Leukemia 11 Suppl 3: 299-302 (1997).
4. Ge, H., et al., Cell 66: 373-382 (1991).
5. Boise, L. H., et al., Cell 74: 597-608 (1993).
6. Cui, J. Q., et al, Oncol. Rep. 5: 585-589 (1998).
7. Modafferi, E. F., et al., RNA 5: 687-706 (1999).
8. Bourinet, E., et al., Nat. Neurosci. 2: 407-415 (1999).
9. Lin, Z., et al., J. Neurosci. 19: 5322-5331 (1999).
10. Alnemri, E. S., et al., J Biol. Chem. 270: 4312-4317 (1995).
11. Jiang, Z. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 9155-9160 (1998).
12. Ratech, H., et al., Cell. Immunol. 177: 109-118 (1997).
13. Daoud, R., et al., Eur. J Neurosci. 11: 788-802 (1999).
14. Utsumi, T., et al., J. Clin. Endo. Metab. 81: 2344-2349 (1996).
15. Balleine, R. L., et al., J. Clin. Endo. Metab. 84: 1370-1377 (1999).
16. Hanstein, B., et al., Mol. Endo. 13: 129-137 (1999).
17. Ruberti, G., et al., Adv. Exper. Med. Biol. 406: 125-134 (1996).
18. Luqmani, Y. A., et al., Intl. J. Cancer 64: 274-279 (1995).
19. Vogelezang, M. G., et al., J Neurosci. Res. 56: 323-333 (1999).
20. Weil, R., et al., J. Virol. 73: 3709-3717 (1999).
21. Koltchine, V. V., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 39: 99-108 (1996).
22. King, P. H., Gene 151: 261-265 (1994).
23. Moller, D. E., et al., Mol. Endo. 3: 1263-1269 (1989).
24. Meredith, J., Jr., et al., Science 269: 1570-1572 (1995).
25. Bost, F., et al., Mol. Cell. Biol. 19: 1938-1949 (1999).
26. Baruch, A., et al., Cancer Res. 59: 1552-1561 (1999).
27. Haase, H., et al., J. Cell. Biochem. 60: 521-528 (1996).
28. Rafuse, V. F., et al., J. Cell Biol. 132: 969-983 (1996).
29. Wang, Y., et al., Crit. Rev. Neurobiol. 13: 21-43 (1999).
30. Tsubari, M., et al., Cancer Res. 57: 2966-2973 (1997).
31. Robertson, K. D., et al., Oncogene 18: 3810-3820 (1999).
32. Sato, N., et al., J Neurochem. 72: 2498-505 (1999).
33. Su, S. L., et al., Cancer Res. 55: 1441-1443 (1995).
34. Lorson, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 6307-6311 (1999).
35. Du, K., et al., J. Biol. Chem. 273: 35208-35215 (1998).
36. Varani, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8229-8234 (1999).
37. Ulaner, G. A., et al., Cancer Res. 58: 4168-72 (1998).
38. Daoud, R., et al., Eur. J Neurosci. 11: 788-802 (1999).
39. Kashiwada, K., et al., J. Biol. Chem. 272: 15396-15404 (1997).
40. Gimona, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 9776-9780 (1995).
41. Ogut, O., et al., Am. J. Physiol. 276: C 1162-1170 (1999).
42. He, Y., et al., Mol. Endo. 13: 537-545 (1999).
43. Webster, N. J., et al., Biochem. Mo. Med. 62: 139-150 (1997).

Claims

Verfahren zum Nachweis einer oder mehrerer, eine Poly(A)-Sequenz enthaltenden Zielsequenz(en) in einer Probe, umfassend: (a) das Hybridisieren einer oder mehrerer Zielsonden mit einer oder mehreren Zielsequenzen, um einen oder mehrere Hybridisierungskomplexe zu bilden, wobei die Zielsonde umfasst: (i) eine universelle Stromaufwärts-Primingstelle (UUP), (ii) eine Adaptersequenz, (iii) eine zielspezifische Sequenz, und (iv) eine universelle Stromabwärts-Primingstelle (DUP), wobei die Poly(A)-Sequenz einzelsträngig bleibt und wobei die Adaptersequenz im wesentlichen komplementär zu einer Fängersonde ist, wobei die Adaptersequenz zwischen den Primingstellen angeordnet ist, (b) das Inkontaktbringen des einen oder mehrerer Hybridisierungskomplexe mit einem Träger, welcher eine Poly(T)-Sequenz umfasst, sodass die Poly(A)-Sequenz mit der Poly(T)-Sequenz hybridisiert, (c) das Entfernen unhybridisierter Zielsondensequenzen, (d) das Denaturieren des einen oder mehrerer Hybridisierungskomplexe, (e) das Verstärken der einen oder mehrerer Zielsonden, um eine Vielzahl von Amplicons zu erzeugen, wobei die Amplicons die Adaptersequenz oder -sequenzen umfassen, (f) das Inkontaktbringen der Amplicons mit einer Anordnung von Fängersonden, um Assaykomplexe zu bilden, und (g) das Nachweisen der Assaykomplexe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielsonde eine Markierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Markierung eine Markierung ist, welche befähigt ist, direkt nachgewiesen werden zu können.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die primäre Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Markierung eine Markierung ist, welche befähigt ist, indirekt nachgewiesen werden zu können.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Markierung Biotin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verstärkung durchgeführt wird durch: (a) das Hybridisieren eines ersten universellen Primers mit der UUP, (b) das Bereitstellen einer Polymerase und dNTPs, sodass der erste universelle Primer verlängert wird, (c) das Hybridisieren eines zweiten universellen Primers mit dem DUP, (d) das Bereitstellen einer Polymerase und dNTPs, sodass der zweite universelle Primer verlängert wird, und (e) das Wiederholen der Schritte (a) bis (d).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Anordnung (a) ein Substrat mit einer gemusterten Oberfläche, umfassend diskrete Stellen, und (b) eine Population von Mikrokügelchen, umfassend mindestens eine erste Unterpopulation, umfassend eine erste Fängersonde, und eine zweite Unterpopulation, umfassend eine zweite Fängersonde, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die diskreten Stellen Vertiefungen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Substrat ein Lichtwellenleiterbündel umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der eine Poly(T)-Sequenz umfassende Träger magnetische Kügelchen umfasst.