DE60128093T2

DE60128093T2 - Interferon-ähnliches protein zcyto21

Info

Publication number: DE60128093T2
Application number: DE60128093T
Authority: DE
Inventors: Paul O. Granite Falls SHEPPARD; Scott R. Tacoma PRESNELL; Brian A. Seattle FOX; Teresa Seattle GILBERT; Betty A. Seattle HALDEMAN; Francis J. Seattle GRANT
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2021-06-30
Also published as: BR0112119A; US20070049736A1; US20070042468A1; US7655223B2; ATE404670T1; DK1294888T3; CA2413258C; US20040146988A1; US20100222266A1; CN1443240A; DK1717316T3; US7498154B2; US20120036590A1; EP2132984A3; AU2001271786A1; ES2311253T3; WO2002002627A3; CA2413258A1; US20050106682A1; EP1294888B1

Description

STAND DER TECHNIK
Die zelluläre Differenzierung multizellulärer Organismen wird durch Hormone und Polypeptidwachstumsfaktoren gesteuert. Diese diffusiblen Moleküle ermöglichen die Kommunikation zwischen den Zellen und wirken zusammen, um Gewebe und Organe zu bilden und beschädigtes Gewebe zu reparieren und regenerieren. Beispiele von Hormonen und Wachstumsfaktoren sind u.a. Steroidhormone, Parathyroidhormon, Follicle-Stimulating-Hormon, die Interferone, die Interleukine, Platelet-Derived-Wachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor und Granulozyt-Makrophage-Colony-Stimulating Faktor u.a.
Hormone und Wachstumsfaktoren beeinflussen den zellulären Stoffwechsel durch ihre Bindung an Rezeptorproteine. Bestimmte Rezeptoren sind integrierte Membranproteine, die außerhalb der Zelle an das Hormon oder den Wachstumsfaktor binden und die mit Signalwegen innerhalb der Zelle verknüpft sind; gerade wie zweite Botensysteme. Weitere Klassen von Rezeptoren sind lösliche intrazelluläre Moleküle.
Zytokine stimulieren generell die Proliferation oder Differenzierung von Zellen der hämatopoetischen Zellreihe oder sie sind an den Immun- und Entzündungsreaktionsmechanismen des Körpers beteiligt. Beispiele von Zytokinen mit Auswirkung auf die Hämatopoese sind Erythropoietin (EPO), welches die Entwicklung der Erythrozyten stimuliert; Thrombopoietin (TPO), welches die Entwicklung von Zellen der Megakaryozyten-Zellreihe stimuliert; und Granulozyt-Colony-Stimulating-Faktor (G-CSF), welcher die Entwicklung von Neutrophilen stimuliert. Diese Zytokine eignen sich für die Wiederherstellung normaler Blutzellenkonzentrationen bei Patienten, die an Anämie, Thrombozytopenie und Neutropenie leiden oder deren Krebs mit Chemotherapie behandelt wird. Zytokine spielen wichtige Rollen bei der Regelung der Hämatopoese und Immunreaktionen und können die Lymphozytenentwicklung beeinflussen.
Zur humanen Klasse-II-Zytokinfamilie gehören Interferon-α (IFN-α) Subtypen, Interferon-β (IFN-β), Interferon-γ (IFN-γ), IL-10, IL-19 (US-Patent 5.985.614), MDA-7 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-20 (Jiang et al., Oncogene 11, 2477-2486, (1995)), IL-22 (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)) und AK-155 (Knappe et al., J. Virol. 74 3881-3887, (2000)). Die meisten Zytokine binden und wandeln Signale entweder durch Zytokinrezeptoren der Klasse I oder der Klasse II. Zu den Mitgliedern der humanen Klasse-II-Zytokinrezeptorfamilie gehören Interferon-αR1 (IFN-αR1), Interferon-γ-R2 (IFN-γ-R2), Interferon-γR1 (IFN-γ-R1), Interferon-γR2 (IFN-γR2), IL-1OR (Liu et al., J. Immunol. 152, 1821-1829, (1994)), CRF2-4 (Lutfalla et al. Genomics 16, 366-373, (1993)), IL-20Rβ (Blumberg et al., Cell 104, 9-19, (2001)) (auch bekannt als Zcytor7 (US-Patent 5.945.511) und CRF2-8 (Kotenko et al., Oncogene 19 2557-2565, (2000)), IL-20Rβ (Blumberg et al., ibid, (2001)) (auch bekannt als DIRS1 (PCT WO 99/46379)), IL-22RA1 (IL-22 Rezeptor-α1, zur Genehmigung an die HUGO eingereicht) (auch bekannt als IL-22R (Xie et al., J. Biol. Chem. 275, 31335-31339, (2000)), Zcytor11 (US-Patent 5.965.704) und CRF2-9 (Kotenko et al., Oncogene 9 2557-2565, (2000)) und Gewebefaktor.
Klasse-II-Zytokinrezeptoren sind normalerweise Heterodimere, die sich aus zwei unterschiedlichen Rezeptorketten, den α- und β-Rezeptoruntereinheiten, zusammensetzen (Stahl et al., Cell 74, 587-590, (1993)). Generell sind die α-Untereinheiten die primären zytokinbindenden Proteine und die β-Untereinheiten werden für die Bildung von Stellen mit hoher Bindungsaffinität sowie für die Signalumwandlung benötigt. Eine Ausnahme ist der IL-20-Rezeptor, in dem beide Untereinheiten für die IL-20-Bindung benötigt werden (Blumberg et al., ibid, (2001)).
Die Klasse-II-Zytokinrezeptoren werden durch eine konservierte zytokinbindende Domäne mit ca. 200 Aminosäuren (D200) im extrazellulären Teil des Rezeptors identifiziert. Diese zytokinbindende Domäne setzt sich aus zwei Fibronectin-III-Domänen (FnIII) mit je ca. 100 Aminosäuren zusammen (Bazan J.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 6934-6938, (1990); Thoreau et al., FEBS Lett. 282, 16-31, (1991)). Jede FnIII-Domäne enthält konservierte Cys-, Pro- und Trp-Reste, welche ein charakteristisches Faltmuster aus sieben β-Strängen bestimmen, ähnlich der konstanten Domäne des Immunglobulins (Uze et al., J. Interferon Cytokine Res. 15, 3-26, (1995)). Die konservierten strukturellen Elemente der Klasse-II-Zytokinrezeptorfamilie ermöglichen die Identifizierung neuer Mitglieder dieser Familie auf Basis der Homologie in der primären Aminosäurensequenz. Bisher haben wir unter Verwendung dieses Ansatzes erfolgreich zwei neue Mitglieder der Klasse-II-Zytokinrezeptorfamilie identifiziert, nämlich Zcytor7 (US-Patent 5.945.511) (auch bekannt als IL-20R α (Blumberg et al., ibid, (2001)) und Zcytor11 (US-Patent 5.965.704) (auch bekannt als IL-22R (Blumberg et al., ibid, (2001)). Die Identifizierung weiterer neuer Mitglieder der Klasse-11-Zytokinrezeptorfamilie ist von Interesse, da Zytokine eine wichtige Rolle bei der Regelung biologischer Reaktionen spielen.
IL-22, auch bekannt als IL-TIF (IL-10-verwandter, aus T-Zellen abgeleiteter induzierbarer Faktor) (Dumoutier et al., J. Immunology 164, 1814-1819, (2000)), ist ein vor kurzem beschriebenes IL-10-Homolog. Maus-IL-22 wurde ursprünglich als ein von IL-9 in T-Zellen und Mastzellen in-vitro induziertes Gen identifiziert (Dumoutier et al., J. Immunology 164, 1814-1819, (2000)). Induktionsaktivitäten einer Akut-Phasen-Reaktion wurden nach IL-22-Injektion in der Mausleber beobachtet und die IL-22-Expression wurde nach der Lipopolysaccharid(LPS)-Injektion rapide induziert, was darauf hinweist, dass IL-22 in-vivo zur Entzündungsreaktion beiträgt (Dumoutier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 10144-10149, (2000)).
Die Interleukine sind eine Familie von Zytokinen, die immunologische Reaktionen, einschließlich Entzündung, vermitteln. Interleukine vermitteln eine Vielfalt von inflammatorischen Pathologien. Der Mittelpunkt einer Immunreaktion ist die T-Zelle, welche viele Zytokine und adaptive Immunität gegen Antigene produziert. Die von der T-Zelle produzierten Zytokine wurden als Typ 1 und Typ 2 klassifiziert (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Zu den Typ-1-Zytokinen gehören IL-2, IFN-γ, LT-α; sie sind an den inflammatorischen Reaktionen, viraler Immunität, intrazelluläre Parasitenimmunität und Allograftabstoßung beteiligt. Zu den Typ-2-Zytokinen gehören IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13; sie sind an humoralen Reaktionen, Helminthen-Immunität und allergischen Reaktionen beteiligt. Zwischen Typ 1 und Typ 2 gemeinsame Zytokine sind IL-3, GM-CSF und TNF-α. Es gibt einige Nachweise, die andeuten, dass Typ-1- und Typ-2-produzierende T-Zellpopulationen bevorzugt in verschiedene entzündete Gewebearten wandern.
Von besonderem Interesse aus therapeutischer Sicht sind die Interferone (Untersuchungen zu Interferonen von De Maeyer und De Maeyer-Guignard, „Interferone" in The Cytokine Handbook, 3. Ausgabe, Thompson (ed.), S. 491-516 (Academic Press Ltd. 1998) und von Walsh, Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology, S. 158-188 (John Wiley & Sons 1998)). Interferone weisen verschiedene biologische Aktivitäten auf und eignen sich für die Behandlung von bestimmten Autoimmunerkrankungen, insbesondere für Karzinome, und für die Verbesserung der Immunreaktion gegen infektiöse Agenzien, einschließlich Viren, Bakterien, Pilze und Protozoa. Bisher wurden sechs Interferonformen identifiziert, die in zwei Hauptgruppen unterteilt wurden. Zu den so genannten „Typ-I"-Interferonen gehören Interferon-α, Interferon-β, Interferon-ω, Interferon-δ und Interferon-τ. Derzeit sind Interferon-γ und eine Unterklasse von Interferon-α die einzigen Typ-II-Interferone.
Typ-I-Interferone, von denen man annimmt, dass sie von dem gleichen Vorfahrensgen abgeleitet sind, haben eine ausreichend ähnliche Struktur beibehalten, um durch den gleichen Zelloberflächenrezeptor zu agieren. Die α-Kette des humanen Interferon-α/β-Rezeptors umfasst eine extrazelluläre N-Terminusdomäne, welche die Charakteristiken eines Klasse-II-Zytokinrezeptors aufweist. Interferon-γ weist keine signifikante Homologie mit den Typ-I-Interferonen oder dem Typ-II-Interferon-α-Subtyp auf, teilt aber eine Reihe von biologischen Aktivitäten mit den Typ-I-Interferonen.
Bei den Menschen kodieren mindestens 16 nichtallele Gene für verschiedene Subtypen von Interferon-α, während die Interferone β und ω von einzelnen Genen kodiert werden. Typ-I-Interferongene sind im kurzen Arm des Chromosoms 9 in Clustern anwesend. Im Gegensatz zu strukturellen humanen Genen fehlen bei Interferon-α, Interferon-β und Interferon-ω die Introne. Ein einzelnes Gen für humanes Interferon-γ befindet sich auf Chromosom 12 und enthält drei Introne. Bisher wurde Interferon-τ nur in Rindern und Schafen beschrieben, während Interferon-δ nur in Schweinen beschrieben wurde.
Kliniker nutzen die mehrfachen Aktivitäten der Interferone, indem sie die Proteine für die Behandlung vieler verschiedener Krankheitszustände einsetzen. So wurde z. B. eine Form von Interferon-α in über 50 Ländern für die Verwendung zur Behandlung von Krankheitszuständen zugelassen, wie z. B. Haarzellleukämie, Nierenzellkarzinom, Basalzellkarzinom, malignes Melanom, AIDS-bezogenes Kaposisarkom, Multiples Myelom, chronische myelogene Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, laryngeale Papillomatose, Mycosis fungoides, Condyloma acuminata, chronischer Hepatitis B, Hepatitis C, chronischer Hepatitis D und chronischer Nicht-A-Nicht-B/C-Hepatitis. Die US-Arzneimittelaufsichtsbehörde (U.S. Food and Drug Administration/FDA) hat die Verwendung von Interferon-β zur Behandlung von Multipler Sklerose, einer chronischen Erkrankung des Nervensystems, zugelassen. Interferon-γ wird für die Behandlung von chronischen Granulomatose-Erkrankungen verwendet, wobei das Interferon die Immunreaktion des Patienten zur Zerstörung infektiöser bakterieller, fungaler und protozoaler Pathogene verbessert. Klinische Studien weisen auch darauf hin, dass Interferon-γ auch für die Behandlung von AIDS, Leishmaniose und lepromatöse Leprose nützlich sein könnte.
Brack et al., (Gene 15:379-394, 1981) kamen zu dem Schluss, dass mindestens 11 eindeutige Gene oder genähnliche Sequenzen der Interferon-α-Typen im menschlichen Genom vorhanden sind. EP 0.032.134 bezieht sich auf DNA-Sequenzen und Prozesse für die Herstellung von Interferon und interferonähnlichen Polypeptiden. WO 021092762 bezieht sich auf IMX129840-Zytokinpolypeptide und Methoden für deren Herstellung und Verwendung.
Sheppard, P. et al., Nature Immunology (2003), 4(1), S. 63-68 beschreiben IL-28, IL-29 und deren Klasse-II-Zytokinrezeptor IL-28R.
Kotenko, SV. et al., Nature Immunology (2003), 4(1), S. 69-77 beschreiben, wie IFN-λ über einen eindeutigen Klasse-II-Zytokinrezeptorkomplex antiviralen Schutz vermitteln.
Vilcek, J., Nature Immunology (2003), 4(1), S. 8-9 beschreibt die Identifizierung einer Familie von Interferonen, die ähnliche Eigenschaften wie die Typ-I-INF aufweisen, sich aber strukturell und genetisch unterscheiden.
Burge, C. and Karlin, S., J. Mol. Biol. (1997), 268, S. 78-94 beschreiben die Vorhersage von kompletten Genstrukturen in der humanen genomischen DNA.
Die nachgewiesenen in-vivo-Aktivitäten dieser Zytokinfamilie verdeutlicht das enorme klinische Potenzial von und den Bedarf für andere Zytokine, Zytokinagonisten und Zytokinantagonisten. Die vorliegende Erfindung spricht diesen Bedarf an, indem sie ein neues Zytokin bereitstellt, das Zellen der hämatopoetischen Zellreihe stimuliert, sowie verwandte Zusammensetzungen und Methoden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid bereit, das die Aminosäurereste 20 bis 200 der SEQ ID-NR:2 umfasst.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäurensequenz umfasst, welche mindestens 90 % identisch mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 200 der SEQ ID-NR:2 oder den Aminosäureresten 1 bis 200 der SEQ ID-NR:2 ist, wobei das isolierte Polypeptid eine antivirale Aktivität aufweist.
Die Figur zeigt ein Hopp/Woods Hydrophilitätsprofil der in SEQ ID-NR:2 gezeigten Zcyto21-Proteinsequenz. Das Profil basiert auf einem gleitenden Fenster mit sechs Aminosäureresten. Verborgene G-, S- und T-Reste und exponierte H- Y- und W-Reste wurden ignoriert. Diese Reste sind in der Figur durch Kleinbuchstaben dargestellt.
Vor Beginn der detaillierten Beschreibung sind eventuell die folgenden Begriffserläuterungen hilfreich:
Der in dieser Schrift verwendete Begriff „Affinitäts-Tag" bezeichnet ein Polypeptidsegment, das an ein zweites Polypeptid angefügt werden kann, um die Reinigung oder Erkennung des zweiten Polypeptids zu bewirken oder Stellen für das Anfügen des zweiten Polypeptids an ein Substrat bereitzustellen. Grundsätzlich kann jedes Peptid oder Protein, für das ein Antikörper oder ein anderer spezifischer bindender Wirkstoff verfügbar ist, als Affinitäts-Tag verwendet werden.
Affinitäts-Tags umfassen ein Polyhistidin-Trakt, Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), Glutathion-S-Transferase (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu-Affinitäts-Tag (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), Substanz P, Flag^TM-Peptid (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), streptavidinbindendes Peptid oder anderes Antigenepitop oder bindende Domäne. Siehe allgemein Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991. Affinitäts-Tag-kodierende DNA sind im Fachhandel erhältlich (z. B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Der in dieser Schrift verwendete Begriff „Allelvariante" bezeichnet jede der zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, das denselben chromosomalen Locus belegt. Allelvariationen entstehen auf natürliche Weise durch Mutation und können zu phänotypischen Polymorphismen innerhalb von Population führen. Genmutationen können stille Mutationen sein (keine Veränderung im kodierten Polypeptid) oder sie können Polypeptide mit veränderter Aminosäurensequenz kodieren. Der in dieser Schrift verwendete Begriff Allelvariante wird auch zur Bezeichnung eines von einer Allelvariante eines Gens kodierten Proteins verwendet.
Die in dieser Schrift verwendeten Begriffe „aminoterminal" und „carboxylterminal" bezeichnen die Positionen innerhalb der Polypeptide. Wenn im Zusammenhang angebracht, werden diese Begriffe in Bezug auf eine bestimmte Sequenz oder einen Anteil eines Polypeptids verwendet, um die Nähe oder relative Position zu bezeichnen. Zum Beispiel eine bestimmte Sequenz carboxylterminal zu einer Referenzsequenz innerhalb eines Polypeptids, befindet sich proximal zum Carboxylterminus der Referenzsequenz, liegt aber nicht unbedingt am Carboxylterminus des kompletten Polypeptids.
Der Begriff „Komplement-/Antikomplement-Paar" bezeichnet nicht-identische Untereinheiten, die ein nicht-kovalent verbundenes, stabiles Paar unter den entsprechenden Bedingungen bilden. Biotin und Avidin (oder Streptavidin) sind z. b. prototypische Mitglieder eines Komplement-/Antikomplement-Paares. Weitere beispielhafte Komplement-/Antikomplement-Paare sind u.a. Rezeptor/Ligand-Paare, Antikörper/Antigen-(oder Hapten oder Epitop)Paare, Sense/Antisense-Polynukleotid-Paare u.a. Wenn eine anschließende Dissoziation des Komplement-/Antikomplement-Paares wünschenswert ist, sollte das Komplement-/Antikomplement-Paar vorzugsweise eine Bindungsaffinität von <10⁹ M^–1 aufweisen.
Der Begriff „Komplemente eines Polynukleotidmoleküls" bezeichnet ein Polynukleotidmolekül, das eine komplementäre Basensequenz und umgekehrte Ausrichtung im Vergleich zu einer Referenzsequenz aufweist. Die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' ist beispielsweise komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Begriff „degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die eine oder mehrere degenerierte Codone umfasst (im Vergleich zu einem Polypeptid-kodierenden Referenzpolynukleotidmolekül). Degenerierte Codone enthalten verschiedene Nukleotiddrillinge, kodieren jedoch den gleichen Aminosäurerest (d. h. sowohl GAU- als auch GAC-Drillinge kodieren Asp).
Der Begriff „Expressionsvektor" wird zur Bezeichnung eines linearen oder ringförmigen DNA-Moleküls verwendet, das ein Segment umfasst, welches ein Polypeptid von Interesse kodiert, das mit weiteren Segmenten funktionell verknüpft ist, welche für dessen Transkription sorgen. Solche zusätzliche Segmente beinhalten Promoter- und Terminatorsequenzen und können auch einen oder mehrere Replikationsquellen, einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Verstärker, ein Polyadenylationssignal usw. enthalten. Expressionsvektoren werden generell aus Plasmid oder viralem DNA abgeleitet oder können Elemente aus beiden enthalten.
Der Begriff „isoliert", wenn auf ein Polynukleotid angewandt, bezeichnet, dass das Polynukleotid aus seinem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder unerwünschten Kodiersequenzen ist und eine Form aufweist, die für die Verwendung innerhalb von gentechnischen Proteinproduktionssystemen geeignet ist. Solche isolierten Moleküle sind von ihrem natürlichen Umfeld getrennt und umfassen cDNA und genomische Klone. Erfindungsgemäße isolierte DNA-Moleküle sind frei von den Genen, mit denen sie normalerweise verbunden sind, können jedoch natürlich auftretende nicht translatierte 5'- und 3'-Regionen aufweisen, wie z. B. Promoter und Terminatoren. Die Identifizierung der verbundenen Regionen ist fachkundigen Personen bekannt (siehe z. B. Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985).
Ein „isoliertes" Polypeptid oder Protein ist ein Polypeptid oder Protein, das in einem Zustand außerhalb seines natürlichen Umfeldes gefunden wird, wie z. B. getrennt von Blut und Tiergewebe. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, insbesondere von anderen Polypeptiden tierischen Ursprungs. Es wird bevorzugt, die Polypeptide in einer hochreinen Form bereitzustellen, d. h. eine Reinheit von mehr als 95 %, vorzugsweise mehr als 99 %. Bei Verwendung in diesem Zusammenhang schließt der Begriff „isoliert" nicht die Gegenwart des gleichen Polypeptids in alternativen physischen Formen aus, wie z. B. Dimere oder alternativ glykosylierte oder derivatisierte Formen.
Der Begriff „neoplastisch", wenn in Bezug auf Zellen verwendet, verweist auf Zellen mit neuer oder abnormaler Proliferation, insbesondere in einem Gewebe, in dem die Proliferation unkontrolliert und progressiv fortschreitet und in Neoplasma resultiert. Die neoplastischen Zellen können entweder bösartig, d. h. invasiv und metastasierend, oder gutartig sein.
„Funktionell verknüpft", wenn in Bezug auf DNA-Segmente verwendet, bedeutet, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie im Einklang für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, d. h. die Transkription beginnt im Promoter und setzt sich durch das Kodiersegment zum Terminator fort.
Der Begriff „Ortholog" bezeichnet ein aus einer Spezies gewonnenes Polypeptid oder Protein, welches das funktionelle Gegenstück eines Polypeptids oder Proteins aus einer anderen Spezies ist. Sequenzunterschiede unter Orthologen sind das Resultat der Speziation.
„Paraloge" sind eindeutige aber strukturell verwandte Proteine, die aus Organismen erzeugt wurden. Man nimmt an, dass Paraloge durch Genduplizierung entstehen. So sind z. B. α-Globin, β-Globin und Myoglobin Paraloge von einander.
Ein „Polynukleotid" ist ein ein- oder zweisträngiges Polymer aus Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidbasen, das vom 5'- zum 3'-Ende gelesen wird. Polynukleotide umfassen RNA und DNA und können von natürlichen Quellen isoliert, in-vitro synthetisiert oder aus einer Kombination aus natürlichen und synthetischen Molekülen präpariert werden. Die Größen der Polynukleotide werden als Basenpaare (Abkürzung „bp"), Nukleotide („nt") oder Kilobasen („kb") ausgedrückt. Wenn es der Zusammenhang erlaubt, können die letzten zwei Begriffe zur Beschreibung von Polynukleotiden verwendet werden, die ein- oder doppelsträngig sind. Wird der Begriff auf doppelsträngige Moleküle angewandt, bezeichnet er die Gesamtlänge und ist als gleichwertig zu dem Begriff „Basenpaare" zu verstehen. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die zwei Stränge eines doppelsträngigen Polynukleotids eine leicht unterschiedliche Länge aufweisen können und dass die Enden aufgrund der enzymatischen Spaltung versetzt sein können; somit können eventuell nicht alle Nukleotide innerhalb eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls gepaart werden.
Ein „Polypeptid" ist ein Polymer der Aminosäurereste, das durch Peptidverbindungen angefügt wird, ob natürlich oder synthetisch produziert. Polypeptide mit weniger als 10 Aminosäureresten werden generell als „Peptide" bezeichnet.
Der Begriff „Promoter" hat seine unter Fachleuten anerkannte Bedeutung der Denotierung eines Teils von genhaltigen DNA-Sequenzen, die für die Bindung der RNA-Polymerase und Einleitung der Transkription sorgen. Promotersequenzen sind oft, aber nicht immer, in den nicht-kodierenden 5'-Regionen von Genen aufzufinden.
Ein „Protein" ist ein Makromolekül, das eine oder mehrere Polypeptidketten umfasst. Ein Protein kann auch Nicht-Peptid-Komponenten umfassen, wie z. B. Kohlenhydratgruppen. Kohlenhydrate und andere Nicht-Peptid-Substituenten können einem Protein durch die Zelle, die das Protein produziert, zugefügt werden, und sie unterscheiden sich je nach Zelltyp. Proteine werden in dieser Schrift in Bezug auf ihre Aminosäuren-Backbone-Strukturen definiert; Substituenten wie Kohlenhydratgruppen werden generell nicht spezifiziert, können aber trotzdem vorhanden sein.
Der Begriff „Rezeptor" bezeichnet ein zellverbundenes Protein, das an ein bioaktives Molekül (d. h. einen Liganden) bindet und die Wirkung des Liganden an die Zelle vermittelt. Membrangebundene Rezeptoren sind durch eine Multipeptidstruktur gekennzeichnet, welche eine extrazelluläre ligandbindende Domäne und eine intrazelluläre Effektordomäne, die normalerweise an der Signaltransduktion beteiligt ist, umfasst. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor resultiert in einer Konformationsveränderung im Rezeptor, welche die Wechselwirkung zwischen der Effektordomäne und anderen Molekül(en) in der Zelle verursacht. Diese Wechselwirkung führt wiederum zu einer Veränderung im Stoffwechsel der Zelle. Die mit Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Ligand verknüpften Stoffwechselereignisse sind u.a. Gentranskription, Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Erhöhung der zyklischen AMP-Produktion, Mobilisierung von zellulärem Kalzium, Mobilisierung der Membranlipide, Zelladhäsion, Hydrolyse von Inositollipiden und Hydrolyse von Phospholipiden. Rezeptoren können generell membrangebunden, zytosolisch oder nukleär, monomer (z. B. TSH-Rezeptor, betaadrenerger Rezeptor) oder multimer (z. B. PDGF-Rezeptor, Wachstumshormonrezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietinrezeptor und IL-6-Rezeptor) sein.
Der Begriff „sekretorische Signalsequenz" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „sekretorisches Peptid") kodiert, das als Komponente eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid durch einen sekretorischen Signalweg einer Zelle leitet, in dem es synthetisiert wird. Das größere Polypeptid wird meistens gespalten, um das sekretorische Peptid während des Transportes durch den sekretorischen Signalweg zu entfernen.
Der Begriff „Spleißvariante" bezeichnet alternative Formen des von einem Gen transkribierten RNA. Spleißvarianten entstehen auf natürlichem Wege durch die Verwendung von alternativen Spleißstellen innerhalb eines transkribierten RNA-Moleküls, oder weniger häufig zwischen separat transkribierten RNA-Molekülen, und können dazu führen, dass mehrere mRNA von dem gleichen Gen transkribiert werden.
Spleißvarianten können Polypeptide kodieren, die eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen. Der in dieser Schrift verwendete Begriff Spleißvariante wird auch zur Bezeichnung eines Proteins verwendet, das durch eine Spleißvariante eines von einem Gen transkribierten mRNA kodiert wird.
Molekulargewichte und Polymerlängen, die durch ungenaue analytische Methoden (z. B. Gelelektrophorese) ermittelt werden, sind als ungefähre Werte zu verstehen. Wenn ein solcher Wert als „ungefähr" X oder „ca." X angegeben wird, ist der genannte Wert X mit einer Genauigkeit von ± 10 % zu verstehen.
Alle zitierten Verweise werden per Verweis in ihrer Gesamtheit in diese Schrift aufgenommen.
Das Zcyto21-Gen kodiert ein Polypeptid von 200 Aminosäuren, wie in SEQ ID-NR:2 gezeigt. Die Signalsequenz für Zcyto21 umfasst vorhersehbar Aminosäurereste 1 (Met) bis Aminosäurerest 19 (Ala) der SEQ ID-NR:2. Das reife Peptid für Zcyto21 beginnt bei Aminosäurerest 20 (Gly).
Das Zcyto21-Gen ist in den BAC-Sequenzen AC011445 und AC018477 eingeschlossen, welche dem humanen Chromosom 19q13.13 zugeteilt wurden. Diese Region des Chromosoms 19 kann auch einen Cluster von Interferon-ähnlichen Genen umfassen. Eine Consensus-cDNA mit einer Polynukleotidsequenz von Zcyto21 ist in SEQ ID-NR:6 gezeigt und das von ihr kodierte Polypeptid ist in SEQ ID-NR:7 gezeigt.
Die vorliegende Erfindung bietet wie unten beschrieben isolierte Polypeptide mit einer Aminosäurensequenz, welche mindestens 90 % oder 95 % identisch mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 200 der SEQ ID-NR:2 oder den Aminosäureresten 1 bis 200 der SEQ ID-NR:2 ist. Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren isolierte Polypeptide mit einer Aminosäurensequenz, welche mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 219 der SEQ ID-NR:9 oder den Aminosäureresten 1 bis 219 der SEQ ID-NR:9 ist. Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren isolierte Polypeptide mit einer Aminosäurensequenz, welche mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 203 der SEQ ID-NR:12 oder den Aminosäureresten 1 bis 203 der SEQ ID-NR:9 ist. Die vorliegende Erfindung bietet auch ein Polypeptid, das des Weiteren eine sekretorische Signalsequenz umfasst, die in einer aminoterminalen Position relativ zur ersten Aminosäurensequenz resident ist, wobei die sekretorische Signalsequenz die Aminosäurenreste 1 bis 19 der Aminosäurensequenz von SEQ ID-NR:2 umfasst.
Generell wird bei Zytokinen eine 4-Helixstruktur angenommen, wobei A, C und D die wichtigsten Helixe für die Ligandenrezeptor-Wechselwirkung sind und unter den Mitgliedern der Familie stärker konserviert werden. Die Interferone (INF) dagegen, insbesondere Interferon-alpha und Interferon-tau, sind als 6-Helixbündel charakterisiert. INF-Helix A ist äquivalent zu Helix A von Zcyto21; INF-Helix B ist äquivalent zu Helix C von Zcyto21; INF-Helix C ist äquivalent zu Helix D von Zcyto21 und INF-Helix D ist äquivalent zu Helix F von Zcyto21. Somit wird die Schleife zwischen der AB-Schleife und der CD-Schleife des INF in Zcyto21 expandiert, um kurze Helixe B und E von Zcyto21 einzuschließen.
Zcyto21-Helixe werden wie folgt vorhergesagt: Helix A ist definiert als Aminosäurereste 49 (Ser) bis 63 (Leu); Helix B durch Aminosäurereste 76 (Asn) bis 84(Val); Helix C durch Aminosäurereste 89 (Val) bis 104 (Ala); Helix D durch Aminosäurereste 111 (Glu) bis 133 (Gln); Helix E durch Aminosäurereste 137 (Thr) bis 158 (Lys); und Helix F durch Aminosäurereste 163 (Gly) bis 189 (Leu); wie in SEQ ID-NR:2 gezeigt. Die Cysteinreste werden zwischen Zcyto21 und INF-α konserviert und können eine intermolekulare Disulfidverbindung bilden, insbesondere um Homodimere mit zusätzlichen Zcyto21-Molekülen zu bilden. Eine weitere Analyse von Zcyto21, die auf multiplen Alignments basiert, prognostiziert, dass Cysteine an den Aminosäureresten 34 und 131 sowie 68 und 164, (wie in SEQ ID-NR:2 gezeigt) intramolekulare Disulfidverbindungen bilden. Das Cystein am Rest 190 ist frei und kann eine intermolekulare Disulfidassoziation bilden. Die entsprechenden Polynukleotide, welche die hier beschriebenen Zcyto21-Polypeptidregionen, -domänen, -motife, -reste und -sequenzen kodieren, sind in SEQ ID-NR:1 gezeigt. Die degenerierte Polynukleotidsequenz von SEQ ID-NR:2 ist in SEQ ID-NR:3 gezeigt. Die degenerierte Polynukleotidsequenz von SEQ ID-NR:9 ist in SEQ ID-NR:10 gezeigt. Die degenerierte Polynukleotidsequenz von SEQ ID-NR:12 ist in SEQ ID-NR:13 gezeigt.
Eine detaillierte Mutationsanalyse von murinem IL-2 (Zurawski et al., EMBO J. 12:5113-5119, 1993) zeigt, dass die Reste in den Helixen A und C wichtig für die Bindung an IL-2Rβ sind; sehr wichtige Reste sind Asp₃₄, Asn₉₉ und Asn₁₀₃. Multiple Reste innerhalb der murinen IL-2-Schleife A/B und Helix B sind wichtig für die IL-2Rα-Bindung, während nur der einzelne Rest Gln₁₄₁ in Helix D für die Bindung an IL-2Rα sehr wichtig ist. Auf ähnliche Weise sind die Helixe A und C Wechselwirkungsstellen zwischen IL-4 und IL-4Rα (mit struktureller Ähnlichkeit zu IL-2Rα) und die Reste innerhalb von Helix D sind wichtig für die R-2Rα – Wechselwirkung (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J. 11:3237-3244, 1992). Insbesondere erzeugt die Mutation von Tyr₁₂₄ zu Asp in humanem IL-4 einen Antagonisten, welcher an IL-4Rα bindet, aber nicht an IL-2Rα, und deshalb nicht signalisieren kann (Kruse et al. ibid. 1992).
4-Helixbündel-Zytokine sind auch durch die Länge ihrer Komponentenhelixe gruppiert. Zytokine mit „langer Helixform" enthalten generell 24-30 Restehelixe und umfassen IL-6, den ciliären neutrotrophen Faktor (CNTF), den Leukämie-Inhibitions-Faktor (LIF) und das humane Wachstumshormon (hGH). Zytokine mit „kurzer Helixform" enthalten generell 18-21 Restehelixe und umfassen IL-2, IL-4 und GM-CSF. Studien mit CNTF und IL-6 zeigten, dass ein CNTF-Helix gegen das äquivalente Helix in IL-6 ausgetauscht werden kann, wobei die CTNF-bindenden Eigenschaften auf die Chimäre übertragen werden. Somit erscheint es, dass funktionelle Domänen von 4-Helix-Zytokinen unabhängig von der Sequenzidentität auf Basis der strukturellen Homologie bestimmt werden und die funktionelle Integrität in einer Chimäre erhalten können (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Deshalb eignen sich die Helixdomänen von Zcyto21 für die Präparation von chimären Fusionsmolekülen, insbesondere mit anderen Interferonen, um die rezeptorbindende Spezifität zu bestimmen und zu modulieren. Von besonderem Interesse sind Fusionsproteine, welche Helix- und Schleifendomänen aus Interferonen und Zytokinen, wie INF-α, IL-10, humanes Wachstumshormon, kombinieren.
Zcyto21-mRNA wurde im Gewebe von Gehirn, Inselchen, Prostata, Hoden, Nebenniere, Plazenta, Eierstocktumor, Lungentumor, Rektaltumor und Eierstocktumor sowie als eine aktivierte Immunzelllinie (CD3+) und eine Prostataepithelzelllinie, welche mit humanem Papillomavirus IV (HPVS) transformiert wurde, identifiziert.
Die vorliegende Erfindung bietet Polynukleotidmoleküle, einschließlich DNA- und RNA-Moleküle, welche die hier offen gelegten Zcyto21-Polypeptide kodieren. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass angesichts der Degeneration des genetischen Codes eine beachtliche Sequenzvariation unter den Polynukleotidmolekülen möglich ist. SEQ ID-NR:3, 10 und 13 sind degenerierte DNA-Sequenzen, die alle DNA umfassen, die jeweils Zcyto21-Polypeptide der SEQ ID-NR:2, 9 und 12 kodieren. Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die degenerierte Sequenz von SEQ ID-NR:3 z. B. auch alle RNA-Sequenzen liefert, die SEQ ID-NR:2 kodieren, indem U gegen T ausgetauscht wird. Die Zcyto21-Polypeptid-kodierenden Polynukleotide, welche das Nukleotid 1 oder 58 bis Nukleotid 603 der SEQ ID-NR:3 und deren RNA-Äquivalente umfassen, werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. In Tabelle 1 sind die in SEQ ID-NR:3 verwendeten einstelligen Buchstabencodes zur Bezeichnung der degenerierten Nukleotid-Positionen aufgeführt. „Auflösungen" sind die mit einem Buchstabencode bezeichneten Nukleotide. „Komplement" ist der Code für das(die) Komplement-Nukleotid(e). Beispiel: Der Code Y bezeichnet entweder C oder T, und sein Komplement R bezeichnet A oder G, wobei A komplementär zu T und G komplementär zu C ist.
TABELLE 1
Die in SEQ ID-NR:3, 10 und 13 verwendeten degenerierten Codone, die alle für eine gegebene Aminosäure möglichen Codone umfassen, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
TABELLE 2
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass bei der Bestimmung eines degenerativen Codons, das für die möglichen alle aminosäurekodierenden Codone repräsentativ ist, eine leichte Zweideutigkeit auftreten kann. Ein degeneratives Codon für Serin (WSN) kann z. B. unter bestimmten Umständen Arginin (AGR) kodieren, und das degenerative Codon für Arginin (MGN) kann unter bestimmten Umständen Serin (AGY) kodieren. Eine ähnliche Beziehung besteht zwischen Codonen, die Phenylalanin und Leucin kodieren. Bestimmte Polynukleotide, die zur degenerativen Sequenz gehören, können somit variante Aminosäurensequenzen kodieren, die fachkundige Person kann jedoch solche variante Sequenzen durch Bezugnahme auf die Aminosäurensequenz der SEQ ID-NR:2 leicht erkennen. Variante Sequenzen lassen sich wie in dieser Schrift beschrieben leicht auf ihre Funktionalität prüfen.
Der fachkundigen Person ist auch bewusst, dass sich bei verschiedenen Spezies ein „bevorzugter Codongebrauch" zeigen kann. Siehe allgemein Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. In Sinne dieser Schrift bezieht sich der Begriff „präferenzieller Codongebrauch" oder „präferenzielle Codone" auf einen Fachbegriff, der sich auf die Proteintranslationscodone bezieht, die am häufigsten in den Zellen einer bestimmten Spezies verwendet werden und somit eine Bevorzugung eines oder mehrerer Vertreter der möglichen Codone, die jede Aminosäure kodieren (siehe Tabelle 3) darstellen. Die Aminosäure Threonin (Thr) kann z. B. von ACA, ACC, ACG oder ACT kodiert werden, doch in Säugetierzellen ist ACC das am häufigsten verwendete Codon; in andern Spezies, z. B. in Insektenzellen, Hefe, Viren oder Bakterien, können andere Thr-Codone die präferenziellen Codone sein. Bevorzugte Codone für eine bestimmte Spezies können durch verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Methoden in die erfindungsgemäßen Polynukleotide eingeführt werden. Die Einführung von bevorzugten Codonsequenzen in rekombinante DNA kann z. B. die Proteinproduktion verbessern, indem die Proteintranslation innerhalb eines bestimmten Zelltyps oder einer Spezies effizienter gemacht wird. Deshalb dienen die in SEQ ID-NR:3 offen gelegten Codonsequenzen als Vorlage für die Optimierung der Polynukleotidexpression in verschiedene Zelltypen und Spezies, die im Stand der Technik häufig verwendet werden und hier offen gelegt sind. Die Sequenzen, die bevorzugte Codone enthalten, können wie hier beschrieben für die Expression in verschiedene Spezies optimiert und auf ihre Funktionalität geprüft werden.
Wie oben erwähnt, umfassen die erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotide DNA und RNA. Methoden für die Präparation von DNA und RNA sind aus dem Stand der Technik bekannt. Generell wird RNA aus einem Gewebe oder einer Zelle isoliert, welche(s) große Mengen Zcyto21-RNA produziert. Solche Gewebe und Zellen werden durch Northern Blotting identifiziert (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) oder durch das Screening von konditioniertem Medium aus verschiedenen Zelltypen auf Aktivitäten auf den Zielzellen oder -geweben. Nach der Identifizierung der Aktivität oder der RNA-produzierenden Zellen oder Gewebe kann die Total RNA durch Guanidinium-Isothiocyanat-Extraktion gefolgt von einer Abtrennung durch Zentrifugieren in einem CsCl-Gradient präpariert werden (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poly (A)⁺ RNA wird aus der Total RNA präpariert, wobei die Methode von Aviv und Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972) verwendet wird. Komplementäre DNA (cDNA) wird unter Einsatz bekannter Methoden aus der poly(A)⁺ RNA präpariert. Als Alternative kann genomische DNA isoliert werden. Anschließend werden die Polynukleotid-kodierenden Zcyto21-Polypeptide identifiziert und beispielsweise durch Hybridisierung oder PCR isoliert.
Ein Gesamtklon-kodierendes Zcyto21 kann durch konventionelle Klonierungsverfahren erhalten werden. Komplementäre DNA(cDNA)-Klone werden bevorzugt, obwohl für einige Anwendungen (z. B. Expression in transgene Tiere) eventuell die Verwendung eines genomischen Klons zu bevorzugen ist, oder die Modifizierung eines cDNA-Klons, um mindestens ein genomisches Intron einzuschließen. Methoden für die Präparation von cDNA und genomischen Klonen sind bekannt und liegen im Wissen der fachkundigen Person, und umfassen die Verwendung der hier offen gelegten Sequenz, bzw. Teilen davon, für das Probing oder Priming einer Bibliothek. Expressionsbibliotheken können mit Antikörpern gegen Zcyto21-Rezeptorfragmente oder anderen spezifisch bindenden Partnern sondiert werden.
Die vorliegende Erfindung bietet des Weiteren Gegenpolypeptide und Polynukleotide aus anderen Spezies (Orthologe). Diese Spezies umfassen ohne Eingrenzung Säugetiere, Vögel, Amphibien, Reptilien, Fische, Insekten und andere Wirbeltiere sowie wirbellose Tierarten. Von besonderem Interesse sind Zcyto21-Polypeptide aus anderen Säugetierspezies, einschließlich Maus/Ratte, Schwein, Schaf, Rind, Hund, Katze, Pferd und anderen Primatenpolypeptiden. Orthologe der humanen Zcyto21 können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Informationen und Zusammensetzungen in Kombination mit konventionellen Kloningmethoden kloniert werden. cDNA kann beispielsweise unter Verwendung der mRNA aus einem Gewebe- oder Zelltyp, der die hier offen gelegten Zcyto21 exprimiert, kloniert werden. Geeignete mRNA-Quellen können identifiziert werden, indem Northern Blots mit Sonden aus den hier offen gelegten Sequenzen beprobt werden. Anschließend wird aus der mRNA einer positiven Gewebe- oder Zelllinie eine Bibliothek erstellt. Eine Zcyto21-kodierende cDNA kann dann unter Anwendung verschiedener Methoden isoliert werden, wie z. B. durch Probing mit einer kompletten oder partiellen humanen cDNA oder mit einem oder mehreren Sätzen von degenerierten Sonden basierend auf den offen gelegten Sequenzen. Eine cDNA kann auch unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion oder PCR (Mullis, US-Patentnr. 4.683.202) und Primern, die aus den hier offen gelegten repräsentativen humanen Zcyto21-Sequenzen konstruiert wurden, kloniert werden. In einer weiteren Methode kann die cDNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder transfektieren, und die Expression der cDNA von Interesse kann dann mit einem Antikörper gegen das Zcyto21-Polypeptid, Bindungsuntersuchungen oder Aktivitätsanalysen erkannt werden. Ähnliche Methoden können auch auf die Isolierung von genomischen Klonen angewandt werden.
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass die in SEQ ID-NR:1 offen gelegte Sequenz ein Einzelallel des humanen Zcyto21-Bandes darstellt und dass Allelvarianten und alternative Spleißung auftreten können. Allelvarianten dieser Sequenz können durch cDNA-Probing oder Genombibliotheken von verschiedenen Personen gemäß den Standardverfahren kloniert werden. Allelvarianten der in SEQ ID-NR:1 gezeigten DNA-Sequenz, einschließlich derer mit stummen Mutationen und jener, bei denen Mutationen in Aminosäurensequenz-Veränderungen resultieren, liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung, ebenso wie Proteine, die Allelvarianten von SEQ ID-NR:2 sind. cDNA, die aus alternativ gespleißten mRNA generiert werden, welche die Eigenschaften des Zcyto21-Polypeptids erhalten, sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten, ebenso wie Polypeptide, die von solchen cDNA und mRNA kodiert werden. Allelvarianten und Spleißvarianten dieser Sequenzen können durch cDNA-Probing oder Genombibliotheken von verschiedenen Personen gemäß den Standardverfahren kloniert werden. Beispiele für alternativ gespleißte Varianten sind in SEQ ID-NR:8 (SEQ ID-NR:9 für das entsprechende Polypeptid) und in SEQ ID-NR:11 (SEQ ID-NR:12 für das entsprechende Polypeptid) gezeigt. Ein Beispiel einer Allelvariante ist in SEQ ID-NR:4 gezeigt, welche der Polypeptidsequenz in SEQ ID-NR:5 entspricht. Zwischen der in SEQ ID-NR:1 and der in SEQ ID-NR:4 gezeigten Polypeptidsequenz besteht ein Polymorphismus an der Nukleotidnummer 572. Dieser Polymorphismus kann einen Antagonisten des Zcyto21 oder ein Molekül mit reduzierter oder veränderter Funktion erzeugen, was zu einer höheren Wahrscheinlichkeit der Krankheitsanfälligkeit führen kann.
Die vorliegende Erfindung bietet auch Reagenzien, die in diagnostischen Anwendungen zum Einsatz kommen können. Es kann z. B. das Zcyto21-Gen, eine aus Zcyto21-DNA oder RNA oder einer Teilsequenz davon bestehende Probe, verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Zcyto21-Gen auf einem humanen Chromosom, wie dem Chromosom 19, vorhanden ist oder ob eine Mutation eingetreten ist. Zcyto21 befindet sich an der q13.13-Region von Chromosom 19. Erkennbare chromosomale Aberrationen des Zcyto21-Gen-Lokus umfassen ohne Eingrenzung Aneuploidie, Veränderungen der Genkopieanzahl, Verlust der Heterogenität (LOH), Translokationen, Insertionen, Deletionen, Veränderungen und Neuanordnungen der Restriktionsstelle. Solche Aberrationen können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polynukleotide erkannt werden, indem molekulare Gentechniken eingesetzt werden, wie z. B. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse, Short Tandem Repeat (STR) Analyse unter Einsatz von PCR-Techniken und andere genetische Verknüpfungsanalysetechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (Sambrook et al., ibid.; Ausubel et. al., ibid.; Marian, Chest 108:255-65, 1995).
Die exakte Kenntnis der Position eines Gens kann für eine Reihe von Zwecken nützlich sein, einschließlich: 1) Bestimmung, ob eine Sequenz Teil eines bestehenden Contigs ist und Erhalt zusätzlicher umgebender genetischer Sequenzen in verschiedenen Formen, wie z. B. YAC, BAC oder cDNA-Klone; 2) Bereitstellung eines potenziellen Kandidatengens für eine vererbliche Krankheit, welches eine Verknüpfung zur gleichen chromosomalen Region aufweist; und 3) Querverweisung von Modellorganismen, wie z. B. Maus, die bei der Bestimmung der Funktion eines bestimmten Gens helfen können.
Delague et al., (Am. J. Hum. Genet. 67:236-243, 2000) identifzierte z. B., dass die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit auf 19q13.1-13.3 lokalisiert ist (Delague et al., Am. J. Hum. Genet. 67:236-243, 2000).
Ein Diagnostikum könnte Ärzten bei der Bestimmung des Krankheitstyps und der entsprechenden verbundenen Therapie helfen oder Unterstützung bei der genetischen Beratung bieten. Als solches können die erfindungsgemäßen Anti-Zcyto21-Antikörper, Polynukleotide und Polypeptide für die Erkennung von Zcyto21-Polypeptid, mRNA oder Anti-Zcyto21-Antikörper verwendet werden, wobei sie als Marker dienen und direkt für die Erkennung von genetischen Krankheiten oder Karzinomen eingesetzt werden gemäß der hier enthaltenen Beschreibung und unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten und hier beschriebenen Methoden. Des Weiteren können Zcyto21-Polynukleotidproben verwendet werden, um Abnormalitäten oder Genotypen zu erkennen, die mit Chromosom-19-Deletionen in Zusammenhang stehen, und Translokationen, die mit Humankrankheiten in Zusammenhang stehen oder anderen Translokationen, die an der Progression von Tumoren oder anderen 19q13.13 Mutationen beteiligt sind, von denen angenommen wird, dass sie an Chromosomneuanordnungen bei Malignitäten oder anderen Krebsarten beteiligt sind. Auf ähnliche Weise können Zcyto21-Polynukleotidproben verwendet werden, um Abnormalitäten oder Genotypen zu erkennen, die mit der Chromosom 19q13.13 Trisomie verbunden sind, sowie Chromosomverlust, der mit Humankrankheiten oder einem Spontanabort verbunden ist. Die Zcyto21-Polynukleotidproben können somit für die Erkennung der mit diesen Defekten verbundenen Abnormalitäten oder Genotypen verwendet werden.
Die in der genetischen Verknüpfungsanalyse verwendeten Diagnosemethoden zur Erkennung einer genetischen Abnormalität oder Aberration in einem Patienten sind aus dem Stand der Technik bekannt. Analytische Proben sind generell mindestens 20 nt lang, obwohl auch etwas kürzere Proben verwendet werden können (z. B. 14-17 nt). PCR-Primer sind mindestens 5 nt lang, vorzugsweise 15 nt oder länger, am besten 20-30 nt. Für die grobe Analyse von Genen oder chromosomaler DNA, kann eine Zcyto21-Polynukleotidprobe ein komplettes Exon oder mehr enthalten. Exone können von einer fachkundigen Person leicht bestimmt werden, indem die Zcyto21-Sequenzen (SEQ ID-NR:1) mit der genomischen DNA für Zcyto21 verglichen werden. Die in der genetischen Verknüpfungsanalyse verwendeten Diagnosemethoden zur Erkennung einer genetischen Abnormalität oder Aberration in einem Patienten sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die meisten Diagnosemethoden umfassen die folgenden Schritte: (a) Gewinnung einer genetischen Probe von einem potenziell erkrankten Patienten, einem erkrankten Patienten oder einem potenziell nicht-erkrankten Träger eines rezessiven Krankheitsallels; (b) Erzeugung eines ersten Reaktionsproduktes durch Inkubation der genetischen Probe mit einer Zcyto21-Polynukleotidprobe, wobei das Polynukleotid an eine komplementäre Polynukleotidsequenz hybridisiert, wie z. B. in der RFLP-Analyse, oder durch Inkubation der genetischen Probe mit Sense- und Antisense-Primern in einer PCR-Reaktion unter entsprechenden PCR-Reaktionsbedingungen; (iii) Visualisierung des ersten Reaktionsproduktes durch Gelelektrophorese und/oder eine andere bekannte Methode, wie die Visualisierung des ersten Reaktionsproduktes mit einer Zcyto21-Polynukleotidprobe, wobei das Polynukleotid an die komplementäre Polynukleotidsequenz der ersten Reaktion hybridisiert; und (iv) Vergleich des visualisierten ersten Reaktionsproduktes mit einem zweiten Kontrollreaktionsproduktes einer genetischen Probe von einem wildtypischen Patienten. Eine Differenz zwischen dem ersten Reaktionsprodukt und dem Kontrollreaktionsprodukt ist indikativ für eine genetische Abnormalität in dem erkrankten oder potenziell erkrankten Patienten, oder die Gegenwart eines heterozygoten rezessiven Trägerphänotyps bei einem nicht-erkrankten Patienten, oder die Gegenwart eines genetischen Defekts in einem Tumor eines erkrankten Patienten, oder die Gegenwart einer genetischen Abnormalität in einem Fötus oder Präimplantationsembryo. So sind z. B. Differenzen im Restriktionsfragmentmuster, in der Länge der PCR-Produkte, Länge der repetitiven Sequenzen am genetischen Lokus von Zcyto21 u.ä. Indikativ für eine genetische Abnormalität, genetische Aberration oder Allel-Differenzen im Vergleich zur normalen wildtypischen Kontrolle. Die Kontrollen können je nach Art des Tests und Verfügbarkeit der Proben von nicht-betroffenen Familienmitgliedern oder unverwandten Personen gewonnen werden. Genetische Proben für die erfindungsgemäße Verwendung sind u.a. aus einem beliebigen Gewebe isolierte genomische DNA, mRNA und cDNA oder eine biologische Probe von einem Patienten, wie z. B., jedoch ohne Einschränkung, Blut, Speichel, Sperma, embryonische Zellen, Fruchtwasser u.ä. Die Polynukleotidprobe oder der Primer kann RNA oder DNA sein und umfasst einen Teil von SEQ ID-NR:1, das Komplement von SEQ ID-NR:1 oder ein RNA-Äquivalent davon. Solche Methoden für die genetische Verknüpfungsanalyse an humanen Krankheitsphänotypen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Für Referenzmaterial zu PCR-gestützten Methoden in der Diagnose siehe allgemein Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998) und Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).
Mit dem Zcyto21-Lokus in Verbindung stehende Mutationen können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle erkannt werden, indem Standardmethoden für die direkte Mutationsanalyse eingesetzt werden, wie z. B. Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus-Analyse, Short Tandem Repeat (STR) Analyse unter Einsatz von PCR-Techniken, Amplification-Refractory Mutation System-Analyse, einsträngige Anordnungspolymorphismuserkennung, RNase-Spaltungsmethoden, Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese, Fluoreszenzgestützte Mismatch-Analyse und andere genetische Analysetechniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (siehe z. B. Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), und Richards and Ward, „Molecular Diagnostic Testing" in Principles of Molecular Medicine, S. 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)). Die direkte Analyse eines Zcyto21-Gens auf eine Mutation kann unter Verwendung der genomischen DNA eines Probanden durchgeführt werden. Methoden für die Amplifizierung von genomischer DNA, welche z. B. aus peripheren Blutlymphozyten gewonnen wird, sind fachkundigen Personen bekannt (siehe z. B. Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, S. 7.1.6-7.1.7 (John Wiley & Sons 1998).
In Ausführungsbeispielen der Erfindung können isolierte Zcyto21-kodierende Nukleinsäuremoleküle unter strengen Bedingungen an Nukleinsäuremoleküle, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID-NR:1 haben, an Nukleinsäuremoleküle, welche die Nukleotidsequenz der Nukleotide 58 bis 603 von SEQ ID-NR:1 haben, oder an Nukleinsäuremoleküle, welche eine komplementäre Nukleotidsequenz von SEQ ID-NR:1 haben, hybridisieren. Generell sind die gewählten strengen Bedingungen ungefähr 5 °C niedriger als der thermale Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einem festgelegten ionischen Stärkewert und pH-Wert. T_m ist die Temperatur (unter der festgelegten ionischen Stärke und dem pH-Wert), bei der 50 % der Zielsequenz an eine perfekt übereinstimmende Probe hybridisiert werden.
Ein Paar Nukleinsäuremoleküle, wie z. B. DNA-DNA, RNA-RNA und DNA-RNA, können hybridisieren, wenn die Nukleotidsequenzen einen bestimmten Grad von Komplementarität aufweisen. Hybride können nicht übereinstimmende Paare im Doppelhelix tolerieren, aber die Stabilität des Hybrids wird durch den Grad der Nichtübereinstimmung beeinflusst. Die T_m des nicht-übereinstimmenden Hybrids nimmt für jede Basenpaar-Nichtübereinstimmung von 1-1,5 % um 1 °C ab. Durch eine Variierung der Strenge der Hybridisierungsbedingungen kann der Grad der Nichtübereinstimmung im Hybrid kontrolliert werden. Der Grad der Strenge erhöht sich mit dem Anstieg der Hybridisierungstemperatur und die ionische Stärke des Hybridisierungspuffers verringert sich.
Fachkundige Personen haben die Fähigkeiten, diese Bedingungen für die Verwendung mit einem bestimmten Polypeptidhybrid anzupassen. Die T_m für eine spezifische Zielsequenz ist die Temperatur (unter der festgelegten Bedingungen), bei der 50 % der Zielsequenz an eine perfekt übereinstimmende Probe hybridisiert werden. Diese Bedingungen, die sich auf die T_m auswirken, sind u.a. die Größe und der Basenpaarinhalt der Polynukleotidprobe, die ionische Stärke der Hybridisierungslösung und die Gegenwart von destabilisierenden Agenzien in der Hybridisierungslösung. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Gleichungen für die Berechnung der T_m bekannt und spezifisch für DNA, RNA und DNA-RNA-Hybride und Polynukleotidprobesequenzen verschiedener Längen (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et ad., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); und Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mod. Baol. 26:227 (1990)). Sequenzanalysensoftware wie z. B. OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) und Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA) sowie Internet-Sites sind für die Analyse einer gegebenen Sequenz und Berechnung der T_m basierend auf benutzerdefinierten Kriterien verfügbar. Solche Programme können auch eine gegeben Sequenz unter definierten Bedingungen und analysieren und geeignete Probesequenzen identifizieren. Normalerweise wird die Hybridisierung von längeren Polynukleotidsequenzen mit >50 Basenpaaren bei Temperaturen von etwa 20-25 °C unter der berechneten T_m durchgeführt. Bei kleineren Proben mit <50 Basenpaaren wird die Hybridisierung meistens bei T_m oder 5-10 °C unter der kalkulierten T_m durchgeführt. Dadurch wird die maximale Hybridisierungsrate für DNA-DNA und DNA-RNA Hybride ermöglicht.
Nach der Hybridisierung können die Nukleinsäuremoleküle unter strengen oder hoch-strengen Bedingungen gewaschen werden, um nicht-hybridisierte Nukleinsäuremoleküle zu entfernen. Typische strenge Waschbedingungen umfassen das Waschen in einer Lösung aus 0,5x-2x SSC mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 55-65 °C. Das heißt, Nukleinsäuremoleküle, die ein variantes Zcyto21-Polypeptid kodieren, hybridisieren unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,5x-2x SSC mit 0,1 % SDS bei 55-65 °C, einschließlich 0,5x SSC mit 0,1 % SDS bei 55 °C oder 2x SSC mit 0,1 % SDS bei 65 °C entspricht. Die fachkundige Person kann leicht äquivalente Bedingungen entwickeln, z. B. durch Substitution von SSPE gegen SSC in der Waschlösung.
Typische hoch-strenge Waschbedingungen umfassen das Waschen in einer Lösung aus 0,1x-0,2x SSC mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 50-65 °C. Das heißt, Nukleinsäuremoleküle, die ein variantes Zcytor21-Polypeptid kodieren, hybridisieren unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,1x-0,2x SSC mit 0,1 % SDS bei 50-65 °C, einschließlich 0,1x SSC mit 0,1 % SDS bei 50 °C oder 0,2x SSC mit 0,1 % SDS bei 65 °C entspricht.
Die vorliegende Erfindung bietet auch isolierte Zcytor21-Polypeptide, die eine im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität aufweisen wie die Polypeptide der SEQ ID-NR:2 oder deren Orthologen. Der hier verwendete Begriff „im Wesentlichen ähnliche Sequenzidentität" bedeutet, dass Polypeptide eine Sequenzidentität von mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % zu den Sequenzen in SEQ ID-NR:2 oder deren Orthologen aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Polypeptide, die eine Aminosäurensequenz beinhalten, welche mindestens 90 % oder 95 % oder mehr als, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Sequenzidentität zur Sequenz der Aminosäurereste 1 bis 200 oder 20 bis 200 der SEQ ID-NR:2 aufweisen. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren Nukleinsäuremoleküle, welche solche Polypeptide kodieren. Methoden für die Bestimmung der Prozentidentität sind unten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung zieht auch variante Zcyto21-Nukleinsäuremoleküle in Betracht, die unter Verwendung von zwei Kriterien identifiziert werden können: die Bestimmung der Ähnlichkeit zwischen den kodierten Polypeptiden und den Aminosäuresequenzen aus SEQ ID-NR:2 und einem Hybridisierungs-Assay (wie oben beschrieben). Solche Zcyto21-Varianten umfassen Nukleinsäuremoleküle, die: (1) unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,5x-2x SSC mit 0,1 % SDS bei 55-65 °C entspricht, und (2) die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID-NR:2 aufweist. Alternativ können Zcyto21-Varianten als Nukleinsäuremoleküle gekennzeichnet sein, die: (1) unter strengen Waschbedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül hybridisieren, das die Nukleotidsequenz aus SEQ ID-NR:1 (oder deren Komplement) enthält, wobei die Strenge der Waschbedingungen 0,1x-0,2x SSC mit 0,1 % SDS bei 50-65 °C entspricht, und (2) die ein Polypeptid kodieren, das mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mehr als 95 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID-NR:2 aufweist.
Die prozentuale Sequenzidentität wird durch konventionelle Methoden bestimmt. Siehe zum Beispiel Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), und Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Kurz zusammengefasst, es werden zwei Aminosäuresequenzen aliniert, um die Alignment-Scores zu optimieren, wobei 10 Strafpunkte für das Einfügen einer Lücke (Gap Opening Penalty), 1 Strafpunkt für die Erweiterung einer Lücke (Gap Extension Penalty) und die „BLOSUM62" Scoring-Matrix von Henikoff and Henikoff (ibid.) wie in Tabelle 3 gezeigt verwendet werden (Aminosäuren sind mit ihren standardmäßigen Buchstabencodes aufgeführt).
Fachkundigen Personen ist bewusst, dass für das Alignment von zwei Aminosäuresequenzen viele etablierte Algorithmen zur Verfügung stehen. Der „FASTA" Ähnlichkeit-Suchalgorithmus von Pearson and Lipman ist eine geeignete Protein-Alignmentmethode für die Prüfung der Identitätsebene zwischen der hier offen gelegten Aminosäuresequenz und der Aminosäuresequenz einer putativen Variante Zcyto21. Der FASTA-Algorithmus wird beschrieben von Pearson and Lipman, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) und Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
Kurz zusammengefasst, FASTA charakterisiert zuerst die Sequenzähnlichkeit durch Identifizierung der Regionen, die von der Abfragesequenz (z. B. SEQ ID-NR:2) gemeinsam verwendet werden, und einer Testsequenz, welche entweder die höchste Dichte von Identitäten (wenn die ktup-Variable 1 ist) oder Identitätspaare (wenn ktup=2) aufweisen, ohne konservative Aminosäuresubstitutionen, -insertionen oder -deletionen zu berücksichtigen. Die zehn Regionen mit der höchsten Identitätsdichte werden dann durch einen Vergleich der Ähnlichkeit aller gepaarter Aminosäuren neu bewertet, wozu eine Aminosäuresubstitutionsmatrix verwendet wird, und die Enden der Regionen werden „zugeschnitten", so dass sie nur noch die Reste enthalten, die zum höchsten Score beitragen. Wenn mehrere Regionen mit Scores über dem „Abgrenzwert" auftreten (berechnet durch eine festgelegte Formel basierend auf der Länge der Sequenz und des ktup-Wertes), werden die ursprünglichen zugeschnittenen Regionen geprüft, um zu bestimmen, ob die Regionen zur Bildung eines ungefähren Alignments mit Lücken verbunden werden können. Schließlich werden die Regionen der zwei Aminosäuresequenzen mit dem höchsten Score aliniert, wozu eine Modifizierung des Needleman-Wunsch-Sellers Algorithmus (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)) verwendet wird, welche Insertionen und Deletionen von Aminosäuren erlaubt. Die bevorzugten Parameter für die FASTA-Analyse sind: ktup=1, Strafpunkte für das Einfügen einer Lücke=10, Strafpunkte für die Erweiterung einer Lücke=1 und Substitutionsmatrix=BLOSUM62. Diese Parameter können durch Modifizierung der Scoring-Matrix-Datei („SMATRIX"), wie in Anhang 2 von Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990) erklärt, in ein FASTA-Programm eingefügt werden.
FASTA kann auch zur Bestimmung der Sequenzidentität von Nukleinsäuremolekülen verwendet werden, wobei das oben offen gelegte Verhältnis Anwendung findet. Für Nukleotidsequenzvergleiche kann der ktup-Wert im Bereich von eins bis sechs, vorzugsweise im Bereich von drei bis sechs liegen und am besten drei betragen, wobei die anderen Parameter als Standardeinstellung eingestellt werden.
Variante Zcyto21-Polypeptide oder Polypeptide mit im Wesentlichen ähnlicher Sequenzidentität sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen aufweisen. Diese Veränderungen sind vorzugsweise minimal, d. h. konservative Aminosäuresubstitutionen (siehe Tabelle 4) und andere Substitutionen, die keine bedeutenden Auswirkungen auf die Faltung oder Aktivität des Polypeptids haben; kleine Deletionen, normalerweise bestehend aus einem bis etwa 30 Aminosäuren; und amino- oder carboxylterminale Erweiterungen wie ein aminoterminaler Methioninrest, ein kleines Linker-Peptid bis zu etwa 20-25 Resten oder ein Affinitäts-Tag. Die vorliegende Erfindung umfasst somit Polypeptide, die von 149 bis 230 Aminosäurereste beinhalten mit einer Sequenz, die mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 90 % oder am besten 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität zur entsprechenden Region der SEQ ID-NR:2 aufweisen. Polypeptide, die Affinitäts-Tags umfassen, können des Weiteren eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem Zcyto21-Polypeptid und dem Affinitäts-Tag umfassen. Solche Stellen umfassen vorzugsweise Thrombinspaltstellen und Faktor-Xa-Spaltstellen.
Tabelle 4
Aminosäurereste, welche die für die Erhaltung der strukturellen Integrität wichtigen Regionen oder Domänen umfassen, können bestimmt werden. Innerhalb dieser Regionen können spezifische Reste bestimmt werden, die mehr oder weniger änderungstolerant sind und die tertiäre Gesamtstruktur des Moleküls aufrechterhalten. Methoden für die Analyse der Sequenzstruktur sind u.a. ohne Einschränkung Alignment von mehreren Sequenzen mit hoher Aminosäuren- oder Nukleotid-Identität, sekundäre Strukturtendenzen, binäre Muster, komplementäre Packung und verborgene polare Wechselwirkungen (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 und Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). Bei der Konstruktion von Modifizierungen an Molekülen oder bei der Identifizierung spezifischer Fragmente muss generell bei der Bestimmung der Struktur auch die Aktivität der modifizierten Moleküle beurteilt werden.
Aminosäurensequenzänderungen werden in den Zcyto21-Polypeptiden so vorgenommen, dass die Störung der für die biologische Aktivität notwendigen übergeordneten Struktur minimal gehalten wird. Wenn das Zcyto21-Polypeptid z. B. eines oder mehrere Helixe umfasst, werden Änderungen in den Aminosäureresten so vorgenommen, dass die Helixgeometrie und andere Komponenten des Moleküls, in dem Veränderungen der Anordnung eine wichtige Funktion schwächen würden, z. B. die Bindung des Moleküls an seine Bindungspartner, nicht gestört werden. Die Auswirkungen von Veränderungen der Aminosäurensequenz können vorhergesagt werden, z. B. durch das oben offen gelegte Computer-Modeling oder durch eine Analyse der Kristallstruktur (siehe z. B. Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995). Weitere aus dem Stand der Technik bekannt Methoden sind ein Vergleich der Faltung eines varianten Proteins mit einem Standardmolekül (z. B. das native Protein). So kann z. B. ein Vergleich des Cysteinmusters in einem varianten und in Standardmolekülen durchgeführt werden. Massenspektrometrie und chemische Modifizierungen unter Verwendung von Reduktion und Alkylierung sind Methoden für die Bestimmung von Cysteinresten, welche mit Disulfidverbindungen in Verbindung stehen oder die frei von solchen Verbindungen sind (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; und Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Es wird generell angenommen, dass die Faltung betroffen wird, wenn ein modifiziertes Molekül nicht das gleiche Cysteinmuster wie das Standardmolekül hat. Eine weitere gut bekannte und akzeptierte Methode für die Messung der Faltung ist der zirkuläre Dichroismus (Circular Dichroism/CD). Die Messung und der Vergleich der von einem modifizierten Molekül und einem Standardmolekül generierten CD-Spektren ist ein routinemäßiges Verfahren (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). Kristallographie ist eine weitere gut bekannte Methode für die Analyse der Faltung und Struktur. Kernmagnetische Resonanz (NMR), digestives Peptidmapping und Epitopmapping sind ebenfalls bekannte Methoden für die Analyse der Faltung und struktureller Ähnlichkeiten zwischen Proteinen und Polypeptiden (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992).
Es kann auch ein Hopp/Woods Hydrophilitätsprofil der in SEQ ID-NR:2 gezeigten Zcyto21-Proteinsequenz generiert werden (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 und Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). Das Profil basiert auf einem gleitenden Fenster mit sechs Aminosäureresten. Verborgene G-, S- und T-Reste und exponierte H-, Y- und W-Reste wurden ignoriert. Im Zcyto21 enthalten die hydrophilen Regionen z. B. die Reste 155 (Glu) bis 160 (Glu); Reste 51 (Lys) bis 56 (Ala); Reste 50 (Phe) bis 55 (Asp); Reste 140 (Pro) bis 145 (Arg); und Reste 154 (Gln) bis 159 (Lys); wie in SEQ ID-NR: 2 gezeigt.
Fachkundige Personen erkennen, dass Hydrophilität oder Hydrophobität bei der Konstruktion von Modifizierungen in der Aminosäurensequenz eines Zcyto21-Polypeptids berücksichtigt werden, um eine Störung der Gesamtstruktur und des biologischen Profils zu vermeiden. Von besonderem Interesse für den Austausch sind hydrophobe Reste, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die Val, Leu und Ile enthält, oder der Gruppe, die Met, Gly, Ser, Ala, Tyr und Trp enthält.
Die Identitäten essenzieller Aminosäuren können auch aus der Analyse von Sequenzähnlichkeiten zwischen INF-α und anderen Interferonen ermittelt werden. Unter Verwendung von Methoden wie der oben beschriebenen „FASTA"-Analyse, werden Regionen mit hoher Ähnlichkeit innerhalb einer Familie von Proteinen identifiziert und für die Analyse der Aminosäurensequenz für konservierte Regionen herangezogen. Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung eines varianten Zcyto21-Polynukleotids auf Basis der Struktur ist die Bestimmung, ob ein Nukleinsäuremolekül, das ein potenzielles variantes Zcyto21-Gen kodiert, an ein Nukleinsäuremolekül hybridisieren kann, das, wie oben besprochen, die Nukleotidsequenz der SEQ ID-NR:1 enthält.
Andere Methoden zur Identifizierung essenzieller Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Polypeptiden stehen unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Verfügung, wie z. B. ortsspezifische Mutagenese oder Alaninscanning-Mutagenese (Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, „Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering," in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), S. 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). Bei der letzteren Methode werden einzelne Alaninmutationen an jedem Rest im Molekül eingefügt und die resultierenden mutierten Moleküle werden wie unten offen gelegt auf biologische oder biochemische Aktivität geprüft, um die für die Aktivität des Moleküls wichtigen Aminosäurereste zu identifizieren. Siehe auch Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch „funktionelle Fragmente" der Zcytor21-Polypeptide und Nukleinsäuremoleküle, die solche funktionellen Fragmente kodieren. Ein „funktionelles" Zcyto21 oder ein Fragment davon gemäß der hier beschriebenen Definition ist gekennzeichnet durch seine proliferative oder differenzierende Aktivität, durch seine Fähigkeit zur Induktion oder Inhibition spezialisierter Zellfunktionen, oder durch seine Fähigkeit zur spezifischen Bindung an einen Anti-Zcyto21-Antikörper oder Zcyto21-Rezeptor (entweder löslich oder immobilisiert). Wie oben beschrieben ist Zcyto21 durch eine 6-Helix-Bündelstruktur gekennzeichnet, die Folgendes umfasst: Helix A ist definiert als Aminosäurereste 49 (Ser) bis 63 (Leu); Helix B durch Aminosäurereste 76 (Asn) bis 84(Val); Helix C durch Aminosäurereste 89 (Val) bis 104 (Ala); Helix D durch Aminosäurereste 111 (Glu) bis 133 (Gln); Helix E durch Aminosäurereste 137 (Thr) bis 158 (Lys); und Helix F durch Aminosäurereste 163 (Gly) bis 189 (Leu); wie in SEQ ID-NR:2 gezeigt. Die vorliegende Erfindung bietet somit des Weiteren Fusionsproteine, die Folgendes umfassen: (a) Polypeptidmoleküle, die eines oder mehrere der oben beschriebenen Helixe umfassen; und (b) funktionelle Fragmente, die eines oder mehrere dieser Helixe umfassen. Der andere Polypeptidanteil des Fusionsproteins kann von einem anderen Helixbündel-Zytokin oder Interferon, wie z. B. INF-α, oder von einem nicht-nativen und/oder unverwandten sekretorischen Signalpeptid beigetragen werden, das die Sekretion des Fusionsproteins ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen Zcyto21-Polypeptide, einschließlich Gesamt-Polypeptide, biologisch aktive Fragmente und Fusionspolypeptide können gemäß konventioneller Methoden unter Verwendung von Zellen, in die ein Polypeptidkodierender Expressionsvektor eingefügt wurde, produziert werden. Im Sinne dieser Schrift sind „Zellen", in die ein Expressionsvektor eingefügt wurde, sowohl direkt durch die Einfügung exogener DNA-Moleküle manipulierte Zellen als auch Nachkommen dieser Zellen, welche die eingefügte DNA enthalten. Geeignete Wirtszellen sind jene Zelltypen, die mit exogener DNA transformiert oder transfektiert und in einem Nährmedium kultiviert werden können, u.a. Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere Eukaryonten. Methoden für die Manipulation von klonierten DNA-Molekülen und Einführung von exogener DNA in verschiedene Wirtszellen wurden von Sambrook et ad., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, und Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987, offen gelegt.
Eine Zcyto21-Polypeptid-kodierende DNA-Sequenz ist generell mit anderen für ihre Expression notwendigen genetischen Elementen funktionell verknüpft und umfasst generell einen Transkriptionspromoter und -terminator innerhalb eines Expressionsvektors. Der Vektor umfasst generell auch einen oder mehrere Marker und eine oder mehrere Replikationsquellen, obwohl dem Fachmann bewusst ist, dass innerhalb bestimmter Systeme selektierbare Marker auf separaten Vektoren bereitstehen können, und dass die Replikation von exogener DNA durch Integration in das Wirtszellgenom ermöglicht werden kann. Die Selektion von Promotern, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist Sache der routinemäßigen Konstruktion im Rahmen der Fachkundigkeit. Viele solche Elemente sind in der Fachliteratur beschrieben und über den Fachhandel erhältlich.
Um ein Zcyto21-Polypeptid in den sekretorischen Signalweg einer Wirtszelle zu leiten, ist im Expressionsvektor eine sekretorische Signalsequenz (auch als Leitsequenz, Präpro-Sequenz oder Präsequenz bekannt) vorgesehen. Die sekretorische Signalsequenz kann die eines Zcyto21 sein, oder sie kann aus einem anderen sekretierten Protein (z. B. t-PA; siehe US-Patent 5.641.655) abgeleitet oder de-novo synthetisiert werden. Die sekretorische Signalsequenz ist mit der Zcyto21-DNA-Sequenz funktionell verknüpft, d. h. die zwei Sequenzen sind im korrekten Lese-Frame verbunden und so positioniert, dass sie das neu synthetisierte Polypeptid in den sekretorischen Signalweg der Wirtszelle leiten. Sekretorische Signalsequenzen werden generell am 5'-Ende der DNA-Sequenz positioniert, welche das Polypeptid von Interesse kodiert, obwohl bestimmte Signalsequenzen auch an anderer Stelle in der DNA-Sequenz von Interesse positioniert sein können (siehe z. B. Welch et al., US-Patentnr. 5.037.743; Holland et al., US-Patentnr. 5.143.830).
Kultivierte Säugetierzellen sind geeignete Wirte innerhalb der vorliegenden Erfindung. Methoden für die Einfügung von exogener DNA in Säugetierwirtszellen umfassen kalziumphosphatvermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), DEAE-dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al. ibid.) und liposomvermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Die Produktion von rekombinanten Polypeptiden in kultivierten Säugetierzellen ist beispielsweise offen gelegt von Levinson et al., US-Patentnr. 4.713.339; Hagen et al., US-Patentnr. 4.784.950; Palmiter et al., US-Patentnr. 4,579,821; und Ringold, US-Patentnr. 4,656,134. Geeignete kultivierte Säugetierzellen sind u.a. die Zelllinien COS-1 (ATCC-Nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC-Nr. CRL 1651), BHK (ATCC-Nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC-Nr. CRL 10314), 293 (ATCC-Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) und Eierstock des chinesischen Hamsters (z. B. CHO-K1; ATCC-Nr. CCL 61); oder CHO DG44, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986) Zelllinien. Weitere geeignete Zelllinien sind aus dem Stand der Technik bekannt und in öffentlichen Depositorien wie American Type Culture Collection, Manassas, VA, erhältlich. Generell werden starke Transkriptionspromoter bevorzugt, wie z. B. Promoter aus SV-40 oder Cytomegalovirus. Siehe z. B. US-Patentnr. 4.956.288. Weitere geeignete Promoter sind u.a. jene aus Metallothionein-Genen (US-Patentnr. 4.579.821 und 4.601.978) und der späte Adenovirus-Hauptpromoter. Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierzellen sind u.a. pZP-1 und pZP-9, welche in der American Type Culture Collection, Manassas, VA USA unter den Accession-Nummern 98669 und 98668 abgelegt sind, und Derivate davon.
Zur Selektion für kultivierte Säugetierzellen, in die fremde DNA eingefügt wurde, wird generell die Arzneimittelselektion verwendet. Solche Zellen werden allgemein als „Transfektanten" bezeichnet. Zellen, die in Gegenwart des selektiven Wirkstoffes kultiviert wurden und das Gen von Interesse an ihre Nachkommen weiterleiten können, werden als „stabile Transfektanten" bezeichnet. Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist eine gen-kodierende Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin. Die Selektion wird in Gegenwart eines Neomycin-Arzneimittels, wie z. B. G-418 o. ä., durchgeführt. Selektionssysteme können auch verwendet werden, um den Expressionsgrad des Gens von Interesse zu erhöhen; ein Prozess, der als „Amplifizierung" bezeichnet wird. Zur Amplifizierung werden Transfektanten in Gegenwart einer geringen Konzentration des selektiven Agens kultiviert und anschließend wird die Menge des selektiven Agens erhöht, um für die Zellen, die hohe Konzentrationen der in die Gene eingeführten Produkte erzeugen, zu selektieren. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist Dihydrofolatreduktase, welche Resistenz gegen Methotrexat überträgt. Andere Arzneimittelresistenz-Gene (z. B. Hygromycin-Resistenz, Multiple Arzneimittelresistenz, Puromycinacetyltransferase) können ebenfalls verwendet werden.
Das Adenovirussystem kann auch für die in-vitro Proteinproduktion genutzt werden. Durch die Kultivierung von mit dem Adenovirus infizierten Nicht-293-Zellen unter Bedingungen, bei denen sich die Zellen nicht rapide teilen, können die Zellen für lange Zeiträume Proteine produzieren. BHK-Zellen werden z. B. bis zur Konfluenz in Zell-Factories gezüchtet und dann an den adenoviralen Vektor, der das sekretierte Protein von Interesse kodiert, ausgesetzt. Die Zellen wachsen dann unter serumfreien Bedingungen, wodurch die infizierten Zellen mehrere Wochen ohne signifikante Zellteilung überleben können. Alternativ können mit dem Adenovirusvektor infizierte 293-Zellen als adhärente Zellen oder in einer Suspensionskultur bei relativ hoher Zelldichte gezüchtet werden, um signifikante Mengen Protein zu erzeugen (siehe Garnier et al., Cytotechnol. 15:145-55, 1994). In jedem dieser Protokolle kann ein exprimiertes, sekretiertes heterologes Protein wiederholt aus dem Zellkulturüberstand, Lysat oder aus Membranfraktionen isoliert werden, je nach der Disposition des exprimierten Proteins in der Zelle. Im Protokoll zur Produktion infizierter 293-Zellen können auch nicht-sekretierte Proteine effektiv gewonnen werden.
Insektenzellen können mit rekombinantem Baculovirus infiziert werden, welches häufig unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden aus dem Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) gewonnen wird. In einer bevorzugten Methode wird rekombinantes Baculovirus unter Verwendung eines Transposon-Basis-System, das von Luckow (Luckow, et al., J. Virol. 67:4566-4579, (1993)) beschrieben wurde, produziert. Dieses System nutzt Transfervektoren und ist im Handel in Kit-Form erhältlich (Bac-to-Bac^TM Kit von Life Technologies, Rockville, MD). Der Transfervektor (z. B. pFastBacl^TM von Life Technologies) enthält ein Tn7-Transposon, um die DNA, die das Protein von Interesse kodiert, in ein Baculovirusgenom zu bewegen, das in E. coli als ein großes Plasmid namens „Bacmid" erhalten wird. Siehe Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; und Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995. Des Weiteren können Transfervektoren eine In-Frame-Fusion mit der DNA beinhalten, welche eine Polypeptidverlängerung oder ein Affinitäts-Tag kodiert. Mittels der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden wird ein Transfervektor, der eine Zcyto21-kodierende Sequenz enthält, in E. coli-Wirtszellen transformiert und die Zellen werden für Bacmide gescreent, welche ein unterbrochenes, für rekombinantes Baculovirus indikatives lacZ-Gen enthalten. Die Bacmid-DNA, die das rekombinante Baculovirusgenom enthält, wird mittels allgemein bekannter Methoden isoliert und zum Transfektieren der Spodoptera frugiperda Zellen, z. B. Sf9-Zellen, verwendet. Anschließend wird das rekombinante Zcyto21-Proteinexprimierende Virus produziert. Rekombinante Virenbestände werden mittels der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt.
Für die Proteinproduktion wird das rekombinante Virus zum Infizieren der Wirtszellen verwendet, meistens eine aus dem Fall Army Worm, Spodoptera frugiperda, gewonnene Zelllinie (z. B. Sf9- oder Sf21-Zellen) oder Trichoplusia ni (z. B. High Five^TM-Zellen; Invitrogen, Carlsbad, CA). Siehe z. B. US-Patentnr. 5.300.435. Zum Züchten und Erhalten der Zellen werden serumfreie Medien verwendet. Geeignete Medienformulierungen sind aus dem Stand der Technik bekannt und im Handel erhältlich. Die Zellen werden von einer Inokulationsdichte von ca. 2-5 × 10⁵ Zellen auf eine Dichte von 1-2 × 10⁶ Zellen gezüchtet und zu diesem Zeitpunkt wird dann ein rekombinanter Virenbestand bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1 bis 10, am typischsten nahe 3, hinzugefügt. Die dazu verwendeten Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Andere höhere Eukaryonten können ebenfalls als Wirte verwendet werden, einschließlich Pflanzen- und Vogelzellen. Die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektor für die Expression von Genen in Pflanzenzellen wurde von Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987, untersucht.
Funguszellen, einschließlich Hefezellen, können ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Hefespezies von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang sind u.a. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris und Pichia methanolica. Methoden für die Transformation von S. cerevisiae-Zellen mit exogener DNA und die Produktion rekombinanter Polypeptide daraus wurden offen gelegt z. B. von Kawasaki, US-Patentnr. 4.599.311; Kawasaki et al., US-Patentnr. 4.931.373; Brake, US-Patentnr. 4.870.008; Welch et al., US-Patentnr. 5.037.743; und Murray et al., US-Patentnr. 4.845.075. Die transformierten Zellen werden nach Phänotyp ausgewählt, der durch den selektierbaren Marker, meistens Arzneimittelresistenz oder Fähigkeit zum Wachsen in Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffes (z. B. Leucin), bestimmt wird. Ein bevorzugtes Vektorsystem für die Verwendung in Saccharomyces cerevisiae ist das POT1-Vektorsystem, das von Kawasaki et al. (US-Patentnr. 4.931.373) offen gelegt wurde und das die Selektion von transformierten Zellen nach Wachstum in glukosehaltigem Medium ermöglicht. Geeignete Promoter und Terminatoren für die Verwendung in Hefe sind u.a. jene aus glykolytischen Enzymgenen (siehe z. B. Kawasaki, US-Patentnr. 4.599.311; Kingsman et al., US-Patentnr. 4.615.974; und Bitter, US-Patentnr. 4.977.092) und Alkoholdehydrogenase-Gene. Siehe auch US-Patentnr. 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 und 4.661.454. Transformationssysteme andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind aus dem Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, US-Patentnr. 4.882.279; und Raymond et al., Yeast 4 11-23, 1998. Aspergilluszellen können gemäß den Methoden von McKnight et al., US-Patentnr. 4.935.349 verwendet werden. Methoden für die Transformation von Acremonium chrysogenum wurden von Sumino et al., US-Patentnr. 5.162.228 offen gelegt. Methoden für die Transformation von Neurospora wurden von Lambowitz, US-Patentnr. 4.486.533 offen gelegt. Die Produktion von rekombinanten Proteinen in Pichia methanolica wurde in den US-Patenten Nr. 5.716.808, 5.736.383, 5.854.039 und 5.888.768 offen gelegt.
Prokaryotische Wirtszellen, einschließlich Stränge der Bakterien Escherichia coli, Bacillus und anderen Gattungen sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung brauchbare Wirtszellen. Methoden für die Transformation dieser Wirte und die Expression der darin klonierten fremden DNA-Sequenzen sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., ibid.). Bei der Expression eines Zcytor21-Polypeptids in Bakterien wie E. coli kann das Polypeptid im Zytoplasma erhalten werden, typisch als unlösliches Granulat oder es kann durch eine bakterielle Sekretionssequenz an den periplasmischen Raum geleitet werden. Im ersteren Fall werden die Zellen lysiert und das Granulat wird zurückgewonnen und z. B. mittels Guanidinisothiocyanat oder Harnstoff denaturiert. Das denaturierte Polypeptid kann dann erneut gefaltet und durch Verdünnung des Denaturierungsmittels dimerisiert werden, z. B. durch Dialyse gegen eine Lösung aus Harnstoff und einer Kombination aus reduziertem und oxidiertem Gluthation, gefolgt von eine Dialyse gegen eine gepufferte Kochsalzlösung. Im letzteren Fall kann das Polypeptid in einer löslichen und funktionellen Form aus dem periplasmischen Raum zurückgewonnen werden, indem die Zellen unterbrochen werden (z. B, durch Ultraschall oder osmotischen Schock), um den Inhalt des periplasmischen Raums freizusetzen und das Protein zurückzugewinnen, wobei der Bedarf für eine Denaturierung und erneute Faltung vermieden wird.
Transformierte oder transfektierte Wirtszellen werden gemäß konventioneller Verfahren in einem Kulturmedium kultiviert, das die für das Wachstum der gewählten Wirtszellen erforderlichen Nährstoffe enthält. Eine Vielfalt von geeigneten Medien, einschließlich definierte Medien und komplexe Medien, sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen generell eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, essenzielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralstoffe. Medien können je nach Bedarf auch Bestandteile wie Wachstumsfaktoren oder -serum enthalten. Das Kulturmedium selektiert generell für Zellen, die das exogen hinzugefügte DNA enthalten, beispielsweise nach Arzneimittelselektion oder Mangel eines essenziellen Nährstoffes, was durch den auf dem Expressionsvektor getragenen oder in die Wirtszelle cotransfektierten selektierbaren Marker komplementiert wird. Flüssige Kulturen werden mit ausreichender Belüftung durch konventionelle Mittel, wie Schütteln von kleinen Flaschen oder Agitation von Fermentatoren, versorgt.
Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Polypeptide und Proteine auf eine Reinheit von ≥80 % gereinigt, besser auf ≥90 % Reinheit und am besten auf ≥95 % Reinheit, und insbesondere wird ein pharmazeutische reiner Zustand von mehr als 99,9 % Reinheit bevorzugt in Bezug auf kontaminierende Makromoleküle, insbesondere andere Proteine und Nukleinsäuren, sowie völlige Freiheit von infektiösen und pyrogenen Stoffen. Ein gereinigtes Polypeptid oder Protein ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen, insbesondere von jenen tierischen Ursprungs.
Exprimierte rekombinante Zcyto21-Proteine (einschließlich chimäre Polypeptide und multimere Proteine) werden durch konventionelle Proteinreinigungsmethoden gereinigt, typischerweise durch eine Kombination von chromatographischen Methoden. Siehe allgemein Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988; und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994. Proteine, die ein Polyhistidin-Affinitäts-Tag umfassen (typischerweise ca. 6 Histidinreste) werden durch Affinitätschromatographie auf einem Nickelchelatharz aufgereinigt. Siehe z. B. Houchuli et al., Bio/Technol. 6:1321-1325, 1988. Proteine, die ein Glu-Glu-Tag umfassen, können durch Immunaffinitätschromatographie gemäß konventionellen Methoden aufgereinigt werden. Siehe z. B. Grussenmeyer et al., ibid. Maltosebindende Proteinfusionen werden auf eine Amylosesäule gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden aufgereinigt.
Zcyto21-Polypeptide können auch durch chemische Synthese gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden präpariert werden, einschließlich exklusive Festphasensynthese, partielle Festphasenmethoden, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese. Siehe z. B. Merrifield, J. Am. Chem. Sac. 85:2149, 1963; Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2. Ausgabe), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; und Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989. In-vitro-Synthese ist insbesondere vorteilhaft für die Präparation von kleineren Polypeptiden.
Unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden können Zcyto21-Proteine als Monomere oder Multimere; glycolisiert oder nicht-glycolisiert; pegyliert oder nicht-pegyliert präpariert werden und können einen ersten Methioninaminosäurerest enthalten oder nicht enthalten.
Zielzellen für die Verwendung in Zcyto21-Aktivitätsassays umfassen ohne Einschränkung Gefäßzellen (insbesondere Endothelzellen und Glattmuskelzellen), hämatopoetische (Myeloid und Lymphoid) Zellen, Leberzellen (einschließlich Hepatozyten, fenestrierte Endothelzellen, Kupffer-Zellen und Ito-Zellen), Fibroblasten (einschließlich humane dermale Fibroblasten und Lungenfibroblasten), fötale Lungenzellen, artikuläre Synoviozyten, Perizyten, Chondrozyten, Osteoblasten und Prostata-Epithelzellen. Endothelzellen und hämatopoetische Zellen werden von einer gemeinsamen Vorfahrenzelle abgeleitet, dem Hämangioblast (Choi et al., Development 125:725-732, 1998).
Die erfindungsgemäßen Zcyto21-Proteine sind durch ihre Aktivität gekennzeichnet, d. h. Modulation der Proliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion oder Stoffwechsel der ansprechenden Zelltypen. Die biologische Aktivität der Zcyto21-Proteine wird unter Verwendung von in-vitro oder in-vivo Assays analysiert, die für die Erkennung von Zellproliferation, Differenzierung, Migration, Adhäsion oder Veränderungen im zellulären Stoffwechsel (z. B. Produktion von anderen Wachstumsfaktoren oder anderen Makromolekülen) ausgelegt sind. Viele geeignete Assays sind aus dem Stand der Technik bekannt und in dieser Schrift werden repräsentative Assays offen gelegt. Assays, die kultivierte Zellen enthalten, eignen sich besonders gut für das Screening, z. B. für die Bestimmung der Auswirkungen auf Aminosäuresubstitionen, -deletionen oder -insertionen. Angesichts der Komplexität von Entwicklungsprozessen (z. B. Angiogenese, Wundheilung) werden jedoch generell in-vivo Assays eingesetzt, um die biologische Aktivität zu bestätigen und weiter zu charakterisieren. Bestimmte in-vitro Modelle, wie das dreidimensionale Collagengelmatrix-Modell von Pepper et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 189:824-831, 1992), bieten eine ausreichende Komplexität für die Analyse der histologischen Auswirkungen. Assays können unter Verwendung exogen produzierter Proteine oder in-vivo oder in-vitro unter Verwendung von Zellen, die das/die Polypeptid/e von Interesse exprimieren, durchgeführt werden. Zur Durchführung der Assays können Zcyto21-Proteine allein oder in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren, wie z. B. Mitglieder der VEGF-Familie oder hämatopoetischer Zytokine (z. B. EPO, TPO, G-CSF, Stammzellfaktor) verwendet werden. Repräsentative Assays werden unten offen gelegt.
Die Aktivität der Zcyto21-Proteine kann in-vitro gemessen werden unter Verwendung kultivierter Zellen oder in-vivo durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Moleküle an ein entsprechendes Tiermodell. Assays zur Messung der Zellproliferation oder Differenzierung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Proliferationmessende Assays umfassen beispielsweise Chemosensibilität gegen neutralen roten Farbstoff (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990), Einfügung von radiomarkierten Nukleotiden (wie z. B. offen gelegt von Raines and Ross, Methods Enzymol. 109:749-773, 1985; Wahl et al., Mol. Cell Biol. 8:5016- 5025, 1988; und Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989), Einfügung von 5-Bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) in die DNA von proliferierenden Zellen (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985), und Verwendung von Tetrazoliumsalzens (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; und Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988). Die Differenzierung kann unter Verwendung geeigneter Vorläuferzellen, die zur Differenzierung in einem reiferen Phänotyp induziert werden, analysiert werden. Assays für die Messung der Differenzierung umfassen die Messung der Zelloberflächenmarker in Verbindung mit stufenspezifischer Expression eines Gewebes, enzymatische Aktivität, funktioneller Aktivität oder morphologischer Veränderungen (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; alle durch Verweis in diese Schrift aufgenommen).
Die Zcyto21-Aktivität kann auch unter Verwendung von Assays erkannt werden, die für eine Messung der Zcyto21-induzierten Produktion von einem oder mehreren zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder anderen Makromolekülen konzipiert sind. Solche Assays umfassen vorzugsweise jene zur Bestimmung der Gegenwart von Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), transformierendem Wachstumsfaktor alpha (TGFα), Interleukin-6 (IL-6), VEGF, saurem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF), Angiogenin und anderen von der Leber produzierten Makromolekülen. Geeignete Assays umfassen Mitogenese-Assays unter Verwendung von Zielzellen, die auf das Makromolekül von Interesse ansprechen, rezeptorbindende Assays, kompetitive Bindungsassays (z. B. ELISA) und andere aus dem Stand der Technik bekannte Formate. Die Metalloproteasesekretion wird in behandelten primären humanen dermalen Fibroblasten, Synoviozyten und Chondrozyten gemessen. Die relativen Konzentrationen von Collagenase, Gelatinase und Stromalysin, die als Reaktion auf die Kultivierung in Gegenwart eines Zcyto21-Proteins produziert werden, werden unter Verwendung von Zymogram-Gelen gemessen (Loita and Stetler-Stevenson, Cancer Biology 1:96-106, 1990). Procollagen/Collagen-Synthese durch dermale Fibroblasten und Chondrozyten als Reaktion auf ein Testprotein werden durch den ³H-Prolin-Einbau in naszierendes sekretiertes Collagen gemessen. ³H-markiertes Collagen wird durch SDS-PAGE visualisiert, gefolgt von eine Autoradiographie (Unemori and Amento, J. Biol. Chem. 265:10681-10685, 1990). Glykosaminoglykan (GAG)-Sekretion aus dermalen Fibroblasten und Chondrozyten wird unter Verwendung eines 1,9-Dimethyhnethylen-Blau-Bindungsassays gemessen (Farndale et al., Biochim. Biophys. Acta 883:173-177, 1986). Collagen- und GAG-Assays werden auch in Gegenwart von IL-1α oder TGF-α durchgeführt, um die Fähigkeit des Zcyto21-Proteins zur Modifizierung der etablierten Reaktionen auf diese Zytokine zu untersuchen.
Monozytenaktivierungs-Assays werden ausgeführt, um (1) die Fähigkeit der Zcyto21-Proteine zur weiteren Stimulierung der Monozytenaktivierung zu bestimmen, und (2) die Fähigkeit der Zcyto21-Proteine zur Modulation von Attachment-induzierter oder Endotoxin-induzierter Monozytenaktivierung zu untersuchen (Fuhlbrigge et al., J. Immunol. 138:3799-3802, 1987). Die als Reaktion auf die Aktivierung produzierten IL-1α- und TNFα-Konzentrationen werden durch ELISA gemessen (Biosource, Inc. Camarillo, CA). Monozyten-/Makrophagenzellen reagieren aufgrund des CD14 (LPS-Rezeptors) außergewöhnliche empfindlich auf Endotoxin, und Proteine mit mäßigen Konzentrationen von Endotoxin-ähnlicher Aktivität aktivieren diese Zellen.
Die hämatopoetische Aktivität der Zcyto21-Proteine kann auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen in einer Kultur analysiert werden. Bevorzugte Assays umfassen primäre Knochenmarkkolonie-Assays und spätere Stufen von zellreihenbegrenzten Kolonie-Assays, die aus dem Stand der Technik bekannt sind (z. B. Holly et al., WIPO Publikation WO 95/21920). Die auf einem geeigneten halbfesten Medium (z. B. 50 % Methylcellulose, die 15 % fötales Rinderserum, 10 % Rinderserumalbumin und 0,6 % PSN-Antibiotikamischung enthält) plattierten Knochenmarkzellen werden in Gegenwart des Testpolypeptids induziert und dann mikroskopisch auf Koloniebildung untersucht. Bekannte hämatopoetische Faktoren werden als Kontrollen verwendet. Die mitogene Aktivität der Zcyto21-Polypeptide auf hämatopoetischen Zelllinien kann wie oben offen gelegt gemessen werden.
Die Zellmigration wird im Wesentlichen gemäß dem von Kähler et al. (Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17:932-939, 1997) offen gelegten Verfahren analysiert. Ein Protein wird als chemotaktisch angesehen, wenn es die Migration von Zellen von einem Bereich einer niedrigen Proteinkonzentration in einen Bereich mit hoher Proteinkonzentration induziert. Es wird ein typischer Assay durchgeführt, bei dem modifizierte Boyden-Kammern verwendet werden und die zwei Kammern durch eine Polystryrolmembrane getrennt sind (Transwell; Corning Costar Corp.). Die Testprobe wird in einem Medium, das 1 % Rinderserumalbumin enthält, verdünnt und der unteren Kammer auf eine 24-Well-Platte mit Transwells gegeben. Die Zellen werden dann auf den Transwell-Einsatz gegen, der mit 0,2 % Gelatine vorbehandelt wurde. Die Zellmigration wird nach 4 Stunden Inkubation bei 37 °C gemessen. Nicht-migrierende Zellen werden von der Oberseite der Transwell-Membran abgewischt, und die an der Unterseite der Membran haftenden Zellen werden fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Die gefärbten Zellen werden dann mit 10 % Essigsäure extrahiert und die Extinktion wird bei 600 nm gemessen. Die Migration wird dann aus einer Standardkalibrationskurve berechnet. Die Zellmigration kann auch unter Verwendung der Matrigelmethod von Grant et al. („Angiogenesis as a component of epithelial-mesenchymal interactions" in Goldberg and Rosen, Epithelial-Mesenchymal Interaction in Cancer, Birkhäuser Verlag, 1995, 235-248; Baatout, Anticancer Research 17:451-456, 1997) gemessen werden.
Die Zelladhäsionsaktivität wird im Wesentlichen gemäß dem von LaFleur et al. (J. Biol. Chem. 272:32798-32803, 1997) offen gelegten Verfahren analysiert. Kurz gefasst, die Mikrotiterplatten werden mit dem Testprotein beschichtet, nicht-spezifische Stellen werden mit RSA blockiert und die Zellen (wie Glattmuskelzellen, Leukozyten oder Endothelzellen) werden mit einer Dichte von etwa 10⁴-10⁵ Zellen/Well plattiert. Die Wells werden bei 37 °C inkubiert (normalerweise etwa 60 Minuten), und dann werden nicht-adhärente Zellen durch ein sanftes Waschen entfernt. Adhärente Zellen werden anhand konventioneller Methoden quantifiziert (z. B. durch Färbung mit Kristallviolett, Lysieren der Zellen und Bestimmung der optischen Dichte des Lysats). Die Kontroll-Wells werden mit einem bekannten Haftprotein beschichtet, wie z. B. Fibronectin oder Vitronectin.
Die Aktivität eines Zcyto21-Proteins kann durch ein auf Silizium basierendes Biosensormikrophysiometer gemessen werden, welches die extrazelluläre Azidifizierungsrate oder Protonexkretion in Verbindung mit der Rezeptorbindung und die anschließenden physiologischen zellulären Reaktionen misst. Ein exemplarisches Gerät ist das Cytosensor^TM Microphysiometer, das von Molecular Devices, Sunnyvale, CA, hergestellt wird. Eine Vielzahl von zellulären Reaktionen, wie Zellproliferation, Ionentransport, Energieproduktion, inflammatorische Reaktion, regulatorische und Rezeptoraktivierung u.ä. können durch diese Methode gemessen werden. Siehe z. B. McConnell et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; und Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. Das Mikrophysiometer kann für die Analyse adhärenter oder nicht-adhärenter eukaryotischer oder prokaryotischer Zellen verwendet werden. Durch die Messung extrazellulärer Azidifizierungsveränderungen über einen Zeitraum im Zellmedium misst das Mikrophysiometer direkt die zellulären Reaktionen auf verschiedene Stimuli, einschließlich Zcyto21-Proteine, deren Agonisten und Antagonisten. Das Mikrophysiometer wird vorzugsweise verwendet für die Messung der Reaktionen einer Zcyto21-ansprechenden eukaryotischen Zelle im Vergleich zu einem Kontrolleukaryont, das nicht auf das Zcyto21-Polypeptid anspricht. Zcyto21-ansprechende eukaryotische Zellen umfassen Zellen, in welche ein Rezeptor für Zcyto21 transfektiert wurde, um eine Zelle zu erzeugen, die auf Zcyto21 anspricht sowie Zellen, die natürlich auf Zcyto21 ansprechen. Unterschiede, die durch eine Veränderung in der Reaktion der an das Zcyto21-Polypeptid ausgesetzten Zellen (z. B. eine Erhöhung oder Verringerung in der extrazellulären Azidifizierung) relativ zu einer nicht an Zcyto21 ausgesetzten Kontrolle gemessen werden, sind eine direkte Messung der Zcyto21-modulierten zellulären Reaktionen. Des Weiteren können solche Zcyto21-modulierten Reaktionen unter Einsatz verschiedener Stimuli analysiert werden. Die vorliegende Erfindung bietet eine Methode zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten des Zcyto21-Proteins und umfasst die Bereitstellung von Zellen, die auf ein Zcyto21-Polypeptid ansprechen, Kultivierung eines ersten Anteils der Zellen in Abwesenheit einer Testverbindung, Kultivierung eines zweiten Anteils der Zellen in Gegenwart einer Testverbindung und Erkennung einer Veränderung (z. B. Erhöhung oder Verringerung) in einer zellulären Reaktion des zweiten Anteils der Zellen im Vergleich zum ersten Anteil der Zellen. Die Veränderung in der zellulären Reaktion wird als messbare Veränderung in der extrazellulären Azidifizierungsrate gezeigt. Die Kultivierung eines dritten Anteils der Zellen in Gegenwart des Zcyto21-Proteins und die Abwesenheit einer Testverbindung bietet eine positive Kontrolle für die Zcyto21-ansprechenden Zellen und eine Kontrolle zum Vergleich der Agonistenaktivität einer Testverbindung mit der des Zcyto21-Polypeptids. Antagonisten des Zcyto21 können identifiziert werden durch die Exponierung der Zellen an das Zcyto21-Protein in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung, wobei eine Reduzierung in der Zcyto21-stimulierten Aktivität auf eine Agonistenaktivität in der Testverbindung hinweist.
Die Expression der Zcyto21-Polynukleotide in Tiere liefert Modelle für die weitere Untersuchung der biologischen Auswirkungen der Überproduktion oder Inhibition der Proteinaktivität in-vivo. Zcyto21-kodierende Polynukleotide und Antisense-Polynukleotide können unter Verwendung von viralen Vektoren oder nackter DNA, in Testtiere, z. B. Mäuse, eingeführt werden, oder es können transgene Tiere produziert werden.
Ein in-vivo-Ansatz für den Assay der erfindungsgemäßen Proteine setzt virale Abgabesysteme ein. Exemplarische Viren für diesen Zweck sind Adenovirus, Herpesvirus, Retrovirus, Vacciniavirus und Adeno-Assoziiertes Virus (AAV). Adenovirus, ein doppelsträngiges DNA-Virus, ist der derzeit am besten untersuchte Gentransfervektor für die Lieferung von heterologen Nukleinsäuren. Siehe Untersuchung in Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; und Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997. Das Adenovirussystem bietet mehrere Vorteile. Das Adenovirus kann (i) relativ große DNA-Einsätze aufnehmen; (ii) in einem hohen Titer wachsen; (iii) einen weiten Bereich von Säugetierzelltypen infizieren; und (iv) mit einer großen Anzahl verschiedener Promoter, einschließlich ubiquitäre, gewebespezfische und regulierbare Promoter, verwendet werden. Da Adenoviren im Blutstrom stabil sind, können sie durch intravenöse Injektion verabreicht werden.
Durch die Deletion von Teilen des Adenovirusgenoms können größere Einsätze (bis zu 7 kb) heterologer DNA aufgenommen werden. Diese Einsätze können durch direkte Ligation oder durch homologe Rekombination mit einem cotransfektierten Plasmid in die virale DNA eingebunden werden. In einem exemplarischen System wurde das essenzielle E1-Gen aus dem viralen Vektor deletiert und das Virus wird nicht replizieren, außer das E1-Gen wird von der Wirtszelle geliefert (z. B. die humane Zelllinie 293). Wenn intakten Tieren intravenös verabreicht, zielt das Adenovirus primär auf die Leber ab. Wenn das adenovirale Abgabesystem eine E1-Gendeletion aufweist, ist keine Replikation des Virus in den Wirtszellen möglich. Jedoch das Wirtsgewebe (z. B. die Leber) exprimiert und verarbeitet (und sekretiert, wenn eine Signalsequenz vorhanden ist) das heterologe Protein. Sekretierte Proteine treten in die Zirkulation in die hoch-vaskularisierte Leber ein und die Auswirkungen am infizierten Tier können bestimmt werden.
Eine alternative Methode der Genlieferung umfasst die Entfernung von Zellen vom Körper und die Einführung eines Vektors in die Zellen als nacktes DNA-Plasmid. Die transformierten Zellen werden dann wieder in den Körper implantiert. Nackte DNA-Vektoren werden in die gewünschten Wirtszellen eingeführt unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten Methoden, wie z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphatpräzipitation, Verwendung einer Genpistole oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters. Siehe Wu et al., J. Biol. Chem 263:14621-14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem 267:963-967, 1992; und Johnston and Tang, Meth. Cell Biol. 43:353-365, 1994.
Transgene Mäuse, die für die Expression des Zcyto21-Gens entwickelt werden, sowie Mäuse mit einer vollständigen Abwesenheit der Zcyto21-Genfunktion, so genannte „Knockout"-Mäuse (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992) können ebenfalls generiert werden (Lowell et al., Nature 366:740-742, 1993). Diese Mäuse können zur Untersuchung des Zcyto21-Gens und des davon kodierten Proteins in einem in-vivo System verwendet werden. Transgene Mäuse sind besonders nützlich für die Untersuchung der Rolle der Zcyto21 -Proteine in der frühen Entwicklung, da sie die Identifizierung von Entwicklungsabnormalitäten oder der aus einer Über- oder Unterexpression eines spezifischen Faktors resultierenden Blöcke ermöglichen. Siehe auch Maisonpierre et al., Science 277:55-60, 1997 und Hanahan, Science 277:48-50, 1997. Bevorzugte Promoter für transgene Expression umfassen Promoter aus Metallothionein- und Albumingenen.
Ein Verlust der normalen inhibitorischen Kontrolle der Muskelkontraktion wurde mit Schäden oder mit einer Störung der selektierten Gamma-Aminobuttersäure-sekretierenden Neuronen in Verbindung gebracht. Beim Stiff-man-Syndrom zeigt sich z. B. eine bemerkenswerte Steilheit der Muskulatur, wobei man annimmt, dass diese durch die Störung der Funktion der Gamma-Aminobuttersäure(GABA)-produzierenden Neuronen vermittelt wird. Weitere verwandte neuromuskuläre Störungen umfassen Myotonie, metabolische Myopathien, Isaac-Syndrom, Dystonie und tetanische Krämpfe (Valldeoriola, J. Neurol 246:423-431, 1999).
Auf ähnliche Weise kann die direkte Messung des Zcyto21-Polypeptids oder dessen Expressionsverlust in einem Gewebe in den von einer Tumorprogression betroffenen Geweben oder Zellen bestimmt werden. Eine Steigerung der Infiltration und Motilität der Zellen oder die Verstärkung oder der Verlust der Expression von Zcyto21 in einem prämalignen oder malignen Zustand im Vergleich zu normalem Gewebe kann als Diagnostikum für die Transformation, Invasion und Metastase in der Tumorprogression dienen. Die Kenntnis der Progressionsstufe oder der Metastase eines Tumors hilft dem Arzt bei der Wahl der am besten geeigneten Therapie oder der Aggressivität der Behandlung für einen gegebenen Krebspatienten. Methoden für die Messung der Verstärkung oder des Verlusts der Expression (von mRNA oder Protein) sind aus dem Stand der Technik bekannt und in dieser Schrift beschrieben und können auf die Zeyto21-Expression angewandt werden. Das Erscheinen oder Verschwinden von Polypeptiden, welche die Zellmotilität regulieren, kann z. B. für die Diagnose und Prognose von Prostatakrebs herangezogen werden (Banyard, J. and Zeller, B.R., Cancer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). Als ein Effektor der Zellmotilität oder als leberspezifischer Marker kann die Verstärkung/der Verlust der Zcyto21-Expression als Diagnostikum für Gehirn- und andere Karzinome herangezogen werden. Analog zum prostataspezifischen Antigen (PSA) können des Weiteren erhöhte Konzentrationen der Zcyto21-Polypeptide oder Anti-Zcyto21-Antikörper in einem Patienten relativ zu einer normalen Kontrolle eine Indikation für Gehirn- und andere Karzinome sein (siehe z. B. Mulders, TMT, et al., Eur. J. Surgical Oncol. 16:37-41, 1990). Eine starke Zcyto21-Expression in Gewebe, das normalerweise keine Zcyto21-Expression aufweist, würde als Diagnostik einer Abnormalität im Zell- der Gewebetyp, Invasion oder Metastase von malignem Lebergewebe in Nicht-Lebergewebe dienen und könnte dem Arzt bei der Steuerung der weiteren Tests oder Untersuchungen oder bei der Steuerung der Therapie helfen.
Zusätzlich können Zcyto21-Polynukleotidproben, Anti-Zcyto21-Antikörper und die Erkennung der Gegenwart von Zcyto21-Polypeptiden in Gewebe verwendet werden, um zu beurteilen, ob normalerweise Zcyto21-exprimierendes Gehirn- oder anderes Gewebe vorhanden ist, z. B. nach einer Operation mit Exzision einer erkrankten oder malignen Leber oder von neuronalem Gewebe. In diesem Fall können die erfindungsgemäßen Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper als Hilfsmittel verwendet werden, um nach einer Operation wegen Gehirn- oder anderem Krebs das gesamte Gewebe exzidiert worden ist. In einem solchen Fall ist es besonders wichtig, dass das gesamte potenziell erkrankte Gewebe entfernt wird, um die Erholung vom Krebs zu maximieren und die Möglichkeit eines Rezidivs zu minimieren. Bevorzugte Ausführungsbeispiele umfassen Fluoreszenz-, radioaktiv oder kalorimetrisch markierte Anti-Zcyto21-Antikörper und Zcyto21-Polypeptid-bindende Partner, die histologisch oder in situ eingesetzt werden können.
Des Weiteren können die Aktivität und die Wirkung von Zcyto21 auf die Tumorprogression und Metastase in-vivo gemessen werden. Mehrere syngenetische Mausmodelle wurden entwickelt, um den Einfluss der Polypeptide, Verbindungen oder anderen Behandlungen auf die Tumorprogression zu untersuchen. Bei diesen Modellen werden die durch eine Kultur passierten Tumorzellen in Mäuse des gleichen Strangs wie der Tumorspender implantiert. Die Zellen entwickeln sich zu Tumoren mit ähnlichen Charakteristiken wie in den Empfängermäusen und die Metastase erfolgt ebenfalls in einigen der Modelle. Geeignete Tumormodelle für unsere Studie umfassen u.a. das Lewis-Lungenkarzinom (ATCC-Nr. CRL-1642) und B16-Melanom (ATCC-Nr. CRL-6323). Beides sind häufig verwendete Tumorreihen, syngenetisch zur C57BL6-Maus und leicht in-vitro kultivierbar und manipulierbar. Tumoren, die aus der Implantation einer dieser Zelllinien resultieren, sind fähig zur Metastase in die Lunge von C57BL6-Mäusen. Das Lewis-Lungenkarzinommodell wurde vor kurzem in Mäusen verwendet, um einen Angiogenesehemmer zu identifizieren (O'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328,1994). C57BL6/J-Mäuse werden mit einem experimentellen Agens behandelt, entweder durch die tägliche Injektion des rekombinanten Proteins, Agonisten oder Antagonisten, oder durch eine einmalige Injektion des rekombinanten Adenovirus. Drei Tage nach dieser Behandlung werden 10⁵ bis 10⁶ Zellen unter die dorsale Haut implantiert. Alternativ können vor der Implantation die Zellen selbst mit rekombinanten Adenovirus, z. B. einem Zcyto-21-exprimierendem Adenovirus, infiziert werden, damit das Protein am Tumorsitus oder intrazellulär und nicht systematisch synthetisiert wird. Bei den Mäusen entwickeln sich normalerweise innerhalb von 5 Tagen sichtbare Tumoren. Die Tumoren wachsen für einen Zeitraum bis zu 3 Wochen und erreichen in diesem Zeitraum in der Kontrollbehandlungsgruppe Größen von 1500 bis 1800 mm³. Tumorgröße und Körpergewicht werden während des gesamten Experiments sorgfältig überwacht. Am Tag der Opferung wird der Tumor zusammen mit der Lunge und Leber entfernt und gewogen. Es zeigte sich, dass das Lungengewicht mit der metastatischen Tumorbelastung korreliert. Als zusätzliche Maßnahme werden die Lungenoberflächenmetastasen gezählt. Die resezierten Tumoren, Lungen und Lebern werden unter Verwendung der aus dem Stand der Technik bekannten und hier beschriebenen Methoden für die histopathologische Untersuchung, Immunhistochemie und in-situ Hybridisierung präpariert. Der Einfluss des untersuchten exprimierten Polypeptids, z. B. Zcyto21, auf die Fähigkeit des Tumors zur Rekrutierung der Vaskulatur und Metastasierung kann somit beurteilt werden. Neben der Verwendung von Adenovirus können die implantierten Zellen auch transient mit Zcyto21 transfektiert werden. Die Verwendung von stabilen Zcyto21-Transfektanten sowie die Verwendung von induzierbaren Promotern zur Aktivierung der Zcyto21-Expression in-vivo sind aus dem Stand der Technik bekannt und können in diesem System verwendet werden, um die Zcyto21-Induktion der Metastase zu beurteilen. Des Weiteren kann aufgereinigtes Zcyto21- oder Zcyto21-konditioniertes Medium direkt in dieses Mausmodell injiziert werden und somit in diesem System verwendet werden. Zur allgemeinen Bezugnahme siehe O'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994; und Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995.
Die Antisense-Methodik kann verwendet werden, um die Zcyto21-Gentranskription zu hemmen und die Auswirkungen einer solchen Hemmung in-vivo zu untersuchen. Polynukleotide, die komplementär zu einem Segment eines Zcyto21-kodierenden Polynukleotids sind (z. B. ein Polynukleotid gemäß SEQ ID-NR:1), sind für die Bindung an die Zcyto21-kodierende mRNA und die Hemmung der Translation dieser mRNA konzipiert. Solche Antisense-Oligonukleotide können auch verwendet werden, um die Expression der Zcyto21-Polypeptid-kodierenden Gene in einer Zellkultur zu hemmen.
Die meisten Zytokine sowie andere von aktivierten Lymphozyten produzierte Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung, Aktivierung, Rekrutierung und Homöostase der Zellen im gesamten Körper. Man erwartet für Zcyto21 und Hemmer der Zcyto21-Aktivität eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen. Diese therapeutischen Anwendungen umfassen die Behandlung von Krankheiten, welche eine Immunregulierung erfordern, u.a. Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Lupus erythmatosus und Diabetes. Zcyto21 ist eventuell auch wichtig für die Regulierung von Entzündungen und wäre deshalb auch für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, Asthma und Sepsis nützlich. Zcyto21 spielt eventuell eine Rolle bei der Vermittlung der Tumorgenese, wobei ein Zcyto21-Antagonist in der Krebsbehandlung nützlich wäre. Zcyto21 ist eventuell nützlich in der Modulierung des Immunsystems, wobei Zcyto21 und Zcyto21-Antagonisten für die Reduzierung der Transplantatabstoßung, Verhinderung der Graft-vs-Host-Erkrankung, Stärkung der Immunität gegen infektiöse Erkrankungen, Behandlung von Patienten mit beeinträchtigtem Immunsystem (z. B. HIV⁺-Patienten) oder zur Verbesserung von Impfstoffen verwendet werden können.
Als ein interferonähnliches Polypeptid im Gewebe von Gehirn, Inselchen, Prostata, Hoden, Nebenniere, Plazenta, Eierstocktumor, Lungentumor, Rektaltumor und Eierstocktumor sowie als eine CD3+ Zelllinie und eine viral infizierte Prostataepithelzelllinie ist Zcyto21 nützlich für die Modulation von Virusinfektion, Tumorgenese und Metastase in diesen und anderen Geweben. In solchen Fällen kann das interferonähnliche Molekül am Situs der Infektion oder des abnormalen Zellwachstums freigesetzt werden oder als ein sekretiertes Molekül von einem entfernten Gewebe zum Situs migrieren.
Die antiviralen Eigenschaften von Zcyto21 sind besonders nützlich bei der Behandlung einer Infektion mit Papillomaviren in-vitro und in-vivo. Die von humanen Papillomaviren verursachten Tumoren verursachen z. B. gutartige Tumoren (d. h. genitale Warzen) sowie maligne Tumoren wie Plattenepithelkarzinome. Diese Zustände müssen durch eine Operation oder durch Zerstörung des Gewebes behandelt werden. Es gibt jedoch derzeit einige antivirale/immunmodulierende Arzneimittel, einschließlich Interferon-alpha, die sich als wirksame Mittel für die Tumorverkleinerung erwiesen haben. Siehe Baker, G.Eet al., Dermatol. Clin. Apr. 15: 331-340, 1997. Des Weiteren, wie von Rockley, P.F. et al., (Pharmacol. Ther. 65(2): 265-287, 1995) erläutert, kann die immunologische Therapie mit Interferonen auf alle Infektionssiten gerichtet werden, einschließlich klinische, subklinische und latente Krankheiten. In diesem Beispiel wurden IFN-alpha, IFN-beta und IFN-gamma als Monotherapie und auch in Kombination mit anderen Therapien erfolgreich für die Behandlung von anogenitale Feigwarzen (Condyloma acuminatum) eingesetzt. Zcyto21 wird bei dieser Behandlung ähnlich wie IFN-alpha, IFN-beta und IFN-gamma eine nützliche Therapie sein. Des Weiteren besteht eine starke Verbindung zwischen bestimmten Typen des humanen Papillomavirus und dem Zervixkarzinom. Zcyto21 kann zur Erkennung, Überwachung und Behandlung von Zervixkarzinomen verwendet werden.
Als ein kleines, sekretiertes Protein in Inselchenzellen kann Zcyto21 das Wachstum und die Differenzierung dieser Zellen modulieren. Zusätzlich kann Zcyto21 für die Behandlung von Diabetes und immunologischen Zuständen in Verbindung mit dem Wachstum und der Differenzierung der Zellen nützlich sein.
Die Gegenwart von Zcyto21 in den Gehirn- und Nebennierenzellen zeigt an, dass es eventuell auch in Bezug auf das Wachstum und die Differenzierung dieser Zellen nützlich sein kann. Des Weiteren sind die erfindungsgemäßen Moleküle eventuell für die nutritive Homöostase verantwortlich, einschließlich Verhaltensstörungen in Bezug auf Nahrungsaufnahme- und Appetitunterdrückung. Zusätzlich können Zcyto21-Moleküle auch Anwendung bei der Behandlung von Fortpflanzungsstörungen allgemein nützlich sein.
Zcyto21-Polypeptide können allein oder in Kombination mit anderen vaskulogenen oder angiogenen Agenzien, einschließlich VEGF, verabreicht werden. Bei Verwendung von Zcyto21 in Kombination mit einem zusätzlichen Agens können die zwei Verbindungen je nach Eignung für die jeweilige behandelte Krankheit gleichzeitig oder sequenziell verabreicht werden.
Zcyto21 wird nützlich sein für die Behandlung von Tumorgenese und folglich auch für die Behandlung von Krebs. Eine Zcyto21-Hemmung von anti-IgM stimulierte normale B-Zellen und eine ähnliche Wirkung wird in B-Zelltumorlinien beobachtet, was andeutet, dass die Behandlung von Patienten mit Zcyto21 für die Induzierung der B-Zelltumorzellen in einen weniger proliferierenden Zustand von therapeutischen Nutzen sein kann. Der Ligand könnte in Kombination mit anderen, bereits verwendeten Agenzien verabreicht werden, einschließlich konventionelle chemotherapeutische Agenzien und auch Immunmodulatoren wie Interferon-alpha. Alpha/beta-Interferone haben sich bei der Behandlung von bestimmten Leukämien und Tierkrankheitsmodellen als wirksam erwiesen, und die wachstumshemmenden Wirkungen von Interferon-alpha und Zcyto21 können für B-Zelltumor-abgeleitete Zelllinien additiv sein.
Die vorliegende Erfindung bietet eine Methode für die Reduzierung der Proliferation einer neoplastischen B- oder T-Zellen und umfasst die Verabreichung eines B- oder T-Zellneoplasmas an ein Säugetier in einer Menge der Zcyto21-Zusammensetzung, die ausreicht, um die Proliferation der neoplastischen B- oder T-Zellen zu reduzieren. Die Zcyto21-Stimulation von lytischen NK-Zellen aus Knochenmarkprogenitoren und die Proliferation der T-Zellen nach Aktivierung der Antigenrezeptoren würde die Behandlung von Patienten verbessern, welche allogene Knochenmarktransplantate erhalten, und folglich wird Zcyto21 die Generierung von Anti-Tumorreaktionen mit oder ohne Infusion der Spenderlymphozyten verbessern.
In einem anderen Aspekt bietet die vorliegende Erfindung eine Methode für die Reduzierung der Proliferation einer neoplastischen B- oder T-Zellen und umfasst die Verabreichung eines B- oder T-Zellneoplasmas an ein Säugetier in einer Menge der Zcyto21-Antagonisten-Zusammensetzung, die ausreicht, um die Proliferation der neoplastischen B- oder T-Zellen zu reduzieren. Des Weiteren kann der Zcyto21-Antagonist ein Ligand/Toxinfusionsprotein sein.
Ein Zcyto21-Saporinfusionstoxin kann gegen einen ähnlichen Satz von Leukämien und Lymphoma eingesetzt werden, wodurch der Bereich von Leukämien, die mit Zcyto21 behandelt werden können, erweitert wird. Die Fusionstoxin-vermittelte Aktivierung des Zcyto21-Rezeptors bietet zwei unabhängige Mittel zur Hemmung des Wachstums der Zielzellen, wobei das erste identisch zu den Wirkungen ist, die nur mit dem Liganden zu sehen sind, und das zweite aufgrund der Abgabe des Toxins durch die Rezeptorinitialisierung erfolgt.
Basierend auf den Erläuterungen dieser Schrift sind die erfindungsgemäßen interferonähnlichen Zcyto21-Moleküle nützlich für die Erkennung, Überwachung oder Behandlung diverser Krankheiten, wie z. B. Haarzellleukämie, Nierenzellkarzinom, Basalzellkarzinom, malignes Melanom, AIDS-bezogenes Kaposisarkom, Multiples Myelom, chronische myelogene Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, laryngeale Papillomatose, Mycosis Fungoides, Condyloma acuminata, Papillomavirus-induzierte Epidermodysplasia verruciformis, chronische Hepatitis B, Hepatitis C, chronische Hepatitis D und chronische Nicht-A-Nicht-B/C-Hepatitis. Die US-Arzneimittelaufsichtsbehörde (U.S. Food and Drug Administration/FDA) hat die Verwendung von Interferon-β zur Behandlung von Multipler Sklerose, einer chronischen Erkrankung des Nervensystems, zugelassen. Interferon-γ wird für die Behandlung von chronischen Granulomatose-Erkrankungen verwendet, wobei das Interferon die Immunreaktion des Patienten zur Zerstörung infektiöser bakterieller, fungaler und protozoaler Pathogene verbessert. Klinische Studien weisen auch darauf hin, dass Interferon-γ auch für die Behandlung von AIDS, Leishmaniose und lepromatöse Leprose nützlich sein könnte.
Für den pharmazeutischen Gebrauch werden Zcyto21-Proteine für topische oder parenterale Gabe, insbesondere intravenöse oder subkutane Verabreichung gemäß konventioneller Methoden formuliert. Pharmazeutische Formulierungen umfassen generell ein Zcyto21-Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger wie z. B. Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, 5 % Dextrose in Wasser o. ä. Formulierungen können des Weiteren einen oder mehrere Exzipienten, Konservierungsstoffe, Solubilisatoren, Pufferstoffe, Albumin zur Verhinderung des Proteinverlusts auf lebensfähigen Oberflächen usw. Methoden zur Formulierung sind aus dem Stand der Technik bekannt und z. B. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19. Ausgabe, 1995 offen gelegt. Zcyto21 wird vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10 bis 100 µg/ml des Gesamtvolumens verwendet, obwohl auch Konzentrationen im Bereich von 1 ng/ml bis 1000 µg/ml verwendet werden können. Für die topische Anwendung, z. B. zur Förderung der Wundheilung, wird das Protein mit einer Dosis im Bereich von 0,1 bis 10 µg/cm² Wundfläche aufgetragen, wobei die exakte Dosis gemäß den akzeptierten Standards und unter Berücksichtigung der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands sowie der Eigenschaften des Patienten usw. vom Kliniker bestimmt wird. Die Bestimmung der Dosis liegt innerhalb des Wissens der fachkundigen Person. Die Dosierung kann täglich oder intermittierend über den Behandlungszeitraum erfolgen. Die intravenöse Gabe erfolgt mittels Bolusinjektion oder Infusion über einen typischen Zeitraum von einer bis mehreren Stunden. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung können ebenfalls eingesetzt werden. Eine therapeutisch wirksame Menge des Zcyto21 ist generell eine Menge, die ausreicht, um eine klinisch signifikante Veränderung in dem behandelten Zustand zu bewirken, z. B. eine klinisch signifikante Veränderung in der hämatopoetischen oder Immunfunktion, eine signifikante Reduzierung in der Morbidität oder eine signifikante Erhöhung des histologischen Score.
Zcyto21-Proteine, -agonisten und -antagonisten sind nützlich für die Modulation der Ausbreitung, Proliferation, Aktivierung, Differenzierung, Migration oder des Stoffwechsels von ansprechenden Zelltypen, wozu sowohl primäre Zellen als auch kultivierte Zelllinien gehören. Von besonderem Interesse in dieser Hinsicht sind hämatopoetische Zellen, mesenchymale Zellen (einschließlich Stammzellen und reife Myeloid- und Lymphoidzellen), Endothelzellen, Epithelzellen, Glattmuskelzellen, Fibroblasten, Hepatozyten, neurale Zellen und embryotische Stammzellen. Zcyto21-Polypeptide werden dem Gewebekulturmedium für diese Zelltypen mit einer Konzentration von etwa 10 pg/ml bis etwa 100 ng/ml zugegeben. Fachkundige Personen erkennen, dass Zcyto21-Proteine vorteilhaft mit anderen Wachstumsfaktoren in Kulturmedien kombiniert werden können.
Innerhalb des Laborforschungsbereichs können Zcyto21-Proteine auch als Molekulargewichtsstandards oder als Reagenzien in Assays zur Bestimmung der zirkulierenden Konzentrationen des Proteins verwendet werden, z. B. für die Diagnose von Krankheiten, die durch eine Über- oder Unterproduktion des Zcyto21-Proteins gekennzeichnet sind, oder in der Analyse des Zellphänotyps.
Zcyto21-Proteine können auch zur Identifizierung von Inhibitoren ihrer Aktivität verwendet werden. Testverbindungen werden den oben offen gelegten Assays hinzugefügt, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität des Zcyto21-Proteins hemmen. Zusätzlich zu den oben offen gelegten Assays können Proben auf die Hemmung der Zcyto21-Aktivität innerhalb verschiedener Assays, die zum Messen der Rezeptorbindung oder Stimulation/Inhibition Zcyto21-abhängiger zellulärer Reaktionen konzipiert sind, verwendet werden. Zcyto21-ansprechende Zelllinien können z. B. mit einem Reportergen-Konstrukt transfektiert werden, das auf einen Zcyto21-stimulierten zellulären Signalweg anspricht. Reportergenkonstrukte dieses Typs sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen generell ein Zcyto21-aktiviertes Serum-Response-Element (SRE), das funktionell mit einem Gen verknüpft ist, welches ein analysierbares Protein, wie z. B. Luciferase, kodiert. Potenzielle Verbindungen, Lösungen, Mischungen oder Extrakte werden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Zcyto21-Aktivität an den Zielzellen geprüft, was sich durch eine Abnahme der Zcyto21-Stimulierung der Reportergen-Expression zeigt. Assays dieses Art erkennen Verbindungen, welche die Zcyto21-Bindung an Zelloberflächenrezeptoren direkt hemmen sowie Verbindungen, welche die Prozesse im zellulären Signalweg nach der Rezeptor-Ligandenbindung hemmen. Alternativ können Verbindungen oder andere Proben auf die direkte Hemmung der Zcyto21-Bindung an ein Integrin geprüft werden, wobei ein Zcyto21, das mit einem erkennbaren Label (z. B. ¹²⁵I, Biotin, Meerrettich-Peroxidase, FITC u.ä.) gekennzeichnet ist, verwendet wird. Innerhalb der Assays dieses Typs weist die Fähigkeit einer Probe zur Hemmung der Bindung des gekennzeichneten Zcyto21 an den Rezeptor auf inhibitorische Aktivität hin, die durch sekundäre Assays bestätigt werden kann. Die innerhalb der Bindungsassays verwendeten Rezeptoren können zelluläre Rezeptoren, lösliche Rezeptoren oder isolierte, immobilisierte Rezeptoren sein.
In dieser Schrift beinhaltet der Begriff „Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, antigenbindende Fragmente davon wie F(ab')₂ und Fab-Fragmente, einkettige Antikörper u.ä., einschließlich gentechnische Antikörper. Nicht-humane Antikörper können durch Verpflanzung von nicht-humanen CDR auf das humane Framework und konstante Regionen humanisiert werden, oder durch Integration der gesamten nicht-humanen variablen Domänen (wahlweise „Ummantelung" dieser mit einer humantypischen Oberfläche durch Austausch der exponierten Reste, wobei das Ergebnis ein „furnierter" Antikörper ist). In einigen Fällen können humanisierte Antikörper nicht-humane Reste innerhalb der Framework-Domänen der humanen variablen Region zurückbehalten, um die richtigen Bindungscharakteristiken zu verbessern. Durch die Humanisierung von Antikörpern kann die biologische Halbwertzeit erhöht und das Potenzial unerwünschter Immunantworten nach Verabreichung an den Menschen reduziert werden. Eine fachkundige Person kann humanisierte Antikörper mit spezifischen und konstanten Domänen (d. h. verschiedene Ig-Subklassen) generieren, um verschiedene Immunfunktionen, die mit bestimmten konstanten Antikörperdomänen in Verbindung stehen, zu ermöglichen oder zu hemmen. Antikörper werden als spezifisch bindend bestimmt, wenn sie an ein Zcyto21-Polypeptid oder -Protein binden mit einer Bindungsaffinität, die mindestens um das 10-Fache höher ist als die Bindungsaffinität an ein Kontroll-(Nicht-Zcyto21)-Polypeptid oder -Protein. Die Affinität eines monoklonalen Antikörpers lasst sich von der fachkundigen Person leicht bestimmen (siehe z. B. Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949).
Methoden für die Präparation von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sind aus dem Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982, durch Verweis in diese Schrift aufgenommen). Von besonderem Interesse ist die Generierung von Antikörpern gegen hydrophile antigene Siten, welche z. B. die Reste 155 (Glu) bis 160 (Glu); Reste 51 (Lys) bis 56 (Ala); Reste 50 (Phe) bis 55 (Asp); Reste 140 (Pro) bis 145 (Arg); und Reste 154 (Gln) bis 159 (Lys); wie in SEQ ID-NR:2 enthalten. Wie der fachkundigen Person bewusst ist, können polyklonale Antikörper von verschiedenen warmblütigen Tieren generiert werden, wie z. B. Pferde, Rinder, Geißen, Schafe, Hunde, Hühner, Kaninchen, Mäuse und Ratten. Die Immunogenität eines Zcyto21-Polypeptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie Alum (Aluminiumhydroxid) oder ein komplettes oder nicht-komplettes Freund-Adjuvans erhöht werden. Für die Impfung nützliche Polypeptide sind u.a. auch Fusionspolypeptide, wie z. B. Fusionen von Zcyto21 oder einem Teil davon mit einem Immunglobulinpolypeptid oder mit einem maltosebindenden Protein. Das Polypeptid-Immunogen kann ein Gesamtmolekül oder ein Teil davon sein. Wenn der Polypeptidteil „Hapten-ähnlich" ist, kann dieser Teil vorteilhaft für die Impfung mit einem makromolekulären Träger (z. B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Bovine Serum Albumin (BSA) oder Tetanustoxoid) verbunden oder verknüpft werden.
Alternative Methoden für die Generierung oder Selektierung von in diesem Zusammenhang nützlichen Antikörpern, umfassen in-vitro Exponierung der Lymphozyten an das Zcyto21-Polypeptid und die Selektion von Antikörper-Display-Bibliotheken in Phage- oder ähnlichen Vektoren (z. B. durch die Verwendung eines immobilisierten oder markierten Zcyto21-Polypeptids). Humane Antikörper können in transgenen, nicht-humanen Tieren produziert werden, die so entwickelt werden, dass sie die in der WIPO Publikation WO 98/24893 offen gelegten humanen Immunglobulin-Gene enthalten. Es wird bevorzugt, dass die endogenen Immunglobulin-Gene in diesen Tieren deaktiviert oder eliminiert werden, z. B. durch homologe Rekombination.
Eine Vielfalt der aus dem Stand der Technik bekannten Assays können verwendet werden, um Antikörper zu erkennen, die spezifisch an Zcyto21-Polypeptide binden. Exemplarische Assays sind ausführlich beschrieben in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Repräsentative Beispiele solcher Assays sind u.a.: parallele Immunelektrophorese, Radioimmunpräzipitation, Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Dot-Blot oder Western Blot-Assay, Inhibition- oder Competition-Assay und Sandwich-Assay.
Antikörper gegen Zcyto21 eignen sich zur Verwendung für die Affinitätsaufreinigung des Proteins, innerhalb von diagnostischen Assays zur Bestimmung der zirkulierenden Konzentrationen des Proteins; Erkennung oder Quantifizierung des löslichen Zcyto21-Polypeptids als Marker der zugrunde liegenden Pathologie oder Krankheit; Immunlokalisierung innerhalb ganzer Tiere oder Gewebeschnitte, einschließlich Immundiagnostik anwenden; Immunhistochemie und als Antagonisten zur Hemmung der Proteinaktivität in-vitro und in-vivo. Antikörper gegen Zcyto21 eignen sich auch zur Verwendung für die Kennzeichnung (Tagging) von Zcyto21-exprimierenden Zellen; Affinitätsaufreinigung der Zcyto21-Polypeptide und -Proteine; in analytischen Methoden unter Verwendung von FACS; zum Screenen von Expressionsbibliotheken; und für die Generierung von antiidiotypischen Antikörpern. Antikörper können unter Verwendung der bekannten Methoden mit anderen Verbindungen verknüpft werden, um ein Targeting dieser Verbindungen auf die Zellen, die Rezeptoren für Zcyto21 exprimieren, zu bieten. Für bestimmte Anwendungen, einschließlich in-vitro und in-vivo Diagnostikanwendungen, ist die Verwendung von markierten Antikörpern vorteilhaft. Geeignete direkte Tags oder Markierungen sind u.a. Radionuklide, Enzyme, Substrate, Co-Faktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzmarker, Chemilumineszenzmarker, magnetische Partikel u.ä.; indirekte Tags oder Markierungen können die Verwendung von Biotin-Avidin oder anderen Komplement/Anti-Komplement-Paaren als Zwischenprodukte beinhalten. Die erfindungsgemäßen Antikörper können auch direkt oder indirekt an Arzneimittel, Radionuklide u.ä. konjugiert werden, und diese Konjugate können für in-vivo diagnostische oder therapeutische Anwendungen verwendet werden (z. B. Hemmung der Zellproliferation). Siehe allgemein Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56:1324-1330, 1996.
Polypeptide und Proteine der vorliegenden Erfindung können für die Identifizierung und Isolierung von Rezeptoren verwendet werden. Zcyto21-Rezeptoren können an der Wachstumsregelung in der Leber, Blutgefäßbildung und anderen Entwicklungsprozessen beteiligt sein. Zcyto21-Proteine und -Polypeptide können z. B. auf einer Säule immobilisiert werden und es können Membranpräparationen über die Säule gefahren werden (wie generell in Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, S. 195-202 offen gelegt). Proteine und Polypeptide können auch radioaktiv markiert (Methods in Enzymol., vol. 182, „Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ed., Academic Press, San Diego, 1990, 721-737) oder durch Photoaffinität markiert (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62:483-514, 1993 und Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33:1167-1180, 1984) werden, um spezifische Zelloberflächenproteine zu kennzeichnen. Auf ähnliche Weise können radioaktiv markierte Zcyto21-Proteine und -Polypeptide verwendet werden, um den kognaten Rezeptor in Bindungsassays unter Verwendung von Zellen, die mit einer Expressions-cDNA-Bibliothek transfektiert wurden, zu klonieren.
Zcyto21-Polypeptide eignen sich auf zur Verwendung für das Lehren von analytischen Fähigkeiten wie z. B. Massenspektrometrie, Circulardichroismus, zur Bestimmung der Anordnung, vor allem der vier Alpha-Helixe, Röntgenkristallographie zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur in anatomischem Detail, kernmagnetische Resonanzspektroskopie zum Aufzeigen der Struktur der Proteine in Lösung. So kann z. B. einem Studenten ein Kit zur Analyse gegeben werden, das Zcyto21 enthält. Da die Aminosäurensequenz der Lehrkraft bekannt ist, kann das Protein dem Studenten übergeben werden, um dessen Fähigkeiten zu prüfen oder weiterzuentwickeln und die Lehrkraft könnte feststellen, ob der Student das Polypeptid richtig analysiert hat. Da jedes Polypeptid einzigartig ist, wäre die Nutzung von Zcyto21 an sich einzigartig.
Die Antikörper, die spezifisch an Zcyto21 binden, können als technisches Hilfsmittel verwendet werden, um Studenten die Präparation von Affinitätschromatographiesäulen zur Aufreinigung von Zcyto21, Klonieren und Sequenzieren des Antikörper-kodierenden Polynukleotids zu lehren und somit ein Praktikum für die Konstruktion von humanisierten Antikörpern zu bieten. Das Zcyto21-Gen, -Polypeptid oder der Antikörper würden dann von Reagenzienherstellern verpackt und an Lehranstalten verkauft, damit Studenten die Kunst der molekularen Biologie erlernen können. Da jedes Gen und Protein einzigartig ist, bringt jedes Gen und Protein einzigartige Herausforderungen und Lernerfahrungen für die Studenten in einem Laborpraktikum. Solche Lehrkits mit dem Zcyto21-Gen, -Polypeptid oder Antikörper werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Die vorliegende Erfindung, die hier nur generell beschrieben ist, wird durch Bezugnahme auf das folgende Beispiel verständlicher gemacht, wobei dieses Beispiel lediglich zur besseren Darstellung dient und die Erfindung in keiner Weise einschränken soll.
BEISPIELE
Beispiel 1
Ein Expressionsplasmid, das alles oder einen Teil eines Polynukleotidkodierenden Zcyto21 enthält, wird durch homologe Rekombination konstruiert. Ein Fragment der Zcyto21-cDNA wird unter Verwendung der Polynukleotidsequenz von SEQ ID-NR:1 durch eine PCR isoliert mit Flankenregionen an den 5'- und 3'-enden entsprechend den Vektorsequenzen an den Flanken des Zcyto21-Einfügungspunktes. Jeder Primer für die PCR umfasst vom 5'- bis zum 3'-Ende: 40 bp der Flankensequenz vom Vektor und 17 bp entsprechend den Amino- und Carboxyltermini vom offenen Leserahmen des Zcyto21.
Zehn μl der 100 μl PCR-Reaktionsmischung wird für die Analyse auf einem 0,8%-igen Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur (SeaPlaque GTG^®; FMC BioProducts, Rockland, ME) mit 1 × TBE-Puffer gefahren. Die restlichen 90 µl der Reaktionsmischung werden durch Zusatz von 5 μl 1 M NaCl und 250 μl absolutes Ethanol ausgefällt. Das Plasmid pZMP6, welches mit SmaI geschnitten wurde, wird für die Rekombination mit dem PCR-Fragment verwendet. Das Plasmid pZMP6 ist ein Säugetierexpressionsvektor, der eine Expressionskassette enthält mit dem frühen Cytomegalovirus-Zwischenpromoter, mehreren Restriktionsorten für die Einfügung der Kodiersequenzen, einem Stoppcodon und einem humanen Wachstumshormonterminator; einer E. coli-Replikationsquelle, einer Säugetierexpressionseinheit mit selektierbarem Marker bestehend aus einem SV40-Promoter, Verstärker und einer Replikationsquelle, einem DHFR-Gen und dem SV40-Terminator; und URA3- und CEN-ARS-Sequenzen, die für die Selektion und Replikation in S. cerevisiae notwendig sind. Er wurde konstruiert aus pZP9 (gelagert in der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, unter Accession-Nr. 98668) wobei die Hefegenelemente aus pRS316 (gelagert in der American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, unter Accession-Nr. 77145) genommen wurden, einem internen Ribosom-Einfügungssituselement (IRES) vom Poliovirus und der extrazellulären Domäne von CD8, gekürzt am C-terminalen Ende der Transmembrandomäne.
Hundert Mikroliter der kompetenten Hefezellen (S. cerevisiae) werden unabhängig kombiniert mit 10 μl der verschiedenen o. g. DNA-Mischungen und in eine 0,2-cm-Elektroporationsküvette transferiert. Die Hefe/DNA-Mischungen werden unter Verwendung der Netzteileinstellung (BioRad Laboratories, Hercules, CA) von 0,75 kV (5 kV/cm), „endlose" Ohm, 25 µF elektropulsiert. Jeder Küvette werden 600 μl von 1,2 M Sorbitol zugegeben und die Hefe wird in zwei 300-µl Aliquote auf zwei URA-D- Platten plattiert und bei 30 °C inkubiert. Nach etwa 48 Stunden werden die Ura⁺ Hefetransformanten aus einer Platte in 1 ml H₂O resuspendiert und kurz geschleudert, um die Hefezellen zu pelletieren. Das Zellpellet wird in 1 ml Lysepuffer (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) resuspendiert. Fünfhundert Mikroliter der Lysemischung werden in Eppendorf-Röhrchen gegeben, das 300 μl säuregewaschene Glasperlen und 200 μl Phenolchloroform enthält, dann in 1-Minuten-Intervallen zwei- oder dreimal gewirbelt und dann 5 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge bei maximaler Drehzahl geschleudert. Dreihundert Mikroliter der wässrigen Phase werden in ein frisches Röhrchen transferiert und die DNA wird mit 600 μ1 Ethanol (EtOH) ausgefällt, gefolgt von einer Zentrifugation für 10 Minuten bei 4 °C. Das DNA-Pellet wird in 10 μl H₂O resuspendiert.
Die Transformation der elektrokompetenten E. coli-Wirtszellen (Electromax DH10B^TM Zellen von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) wird mit 0,5-2 ml Hefe-DNA-Präparation und 40 μl der Zellen durchgeführt. Die Zellen werden bei 1.7 kV, 25 µF und 400 Ohm elektropulsiert. Nach der Elektroporation werden 1 ml SOC (2 % Bacto^TM Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5 % Hefeextrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM Glucose) in 250-µl-Aliquoten auf vier LB AMP-Platten (LB Broth (Lennox), 1,8 % Bacto^TM Agar (Difco), 100 mg/L Ampicillin) plattiert.
Einzelne Klone, die das richtige Expressionskonstrukt für Zcyto21 enthalten, werden durch Restriktionsverdauung identifiziert, um die Gegenwart von Zcyto21-Einsätzen zu verifizieren und zu bestätigen, dass die verschiedenen DNA-Sequenzen richtig miteinander verbunden wurden. Die Einsätze positiver Klone wird einer Sequenzanalyse unterzogen. Eine großangelegte Plasmid-DNA-Isolation wird unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (QIAGEN Plasmid Maxi Kit, Qiagen, Valencia, CA) gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Das korrekte Konstrukt wird als pZMP6/Zcyto21 bezeichnet.
Beispiel 2
CHO DG44-Zellen (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-666, 1986) werden in 10-cm-Gewebekulturschalen plattiert, wo sie über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ in Hams F12/FBS-Medium (Hams F12-Medium (Life Technologies), 5 % fötalem Rinderserum (Hyclone, Logan, UT), 1 % L-Glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 % Natriumpyruvat (Life Technologies)) auf etwa 50 % bis 70 % Konfluenz wachsen gelassen werden. Anschließend werden die Zellen mit dem Plasmid Zcyto21/pZMP6 durch eine liposomvermittelte Transfektion transfektiert unter Verwendung einer 3:1 (w/w) Liposomformulierung des polykationischen Lipids 2,3- Dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propaniminiumtrifluoroacetat und des neutralen Lipids Dioleoylphosphatidylethanolamin in membrangefiltertem Wasser (Lipofectamine^TM Reagenz, Life Technologies), in serumfreier (SF) Medienformulierung (Harns F 12, 10 mg/ml Transferrin, 5 mg/ml Insulin, 2 mg/ml Fetuin, 1 % L-Glutamin und 1 % Natriumpyruvat). Das Zcyto21/pZMP6 wird in 15-ml-Röhrchen auf ein endgültiges Volumen von 640 μl mit SF-Medium verdünnt. 35 μl Lipofectamine^TM wird mit 605 μl SF-Medium gemischt. Die resultierende Mischung wird der DNA-Mischung zugegeben und etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Fünf ml des SF-Mediums werden der DNA-Lipofectamine^TM-Mischung zugegeben. Die Zellen werden einmal mit 5 ml des SF-Mediums gespült, aspiriert und die DNA-Lipofectamine^TM-Mischung wird zugegeben. Die Zellen werden bei 37 °C fünf Stunden inkubiert, dann werden jeder Platte 6,4 ml Harns F12/10 % FBS, 1 % PSN-Medium zugegeben. Die Platten werden bei 37 °C über Nacht inkubiert und am nächsten Tag wird die DNA:Lipofectamine^TM-Mischung gegen frisches 5%-iges FBS/Hams Medium ausgetauscht. Am 3. Tag nach der Transfektion werden die Zellen in T-175-Fläschchen in Wachstumsmedium geteilt. Am 7. Tag nach der Transfektion werden die Zellen mit FITC-Anti-CD8 monoklonalem Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA) gefärbt, gefolgt von Anti-FITC-konjugierten Magnetperlen (Miltenyi Biotec). Die CD8-positiven Zellen werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen Säulen (mini-MACS Säulen; Miltenyi Biotec) gemäß Herstelleranweisungen getrennt und in DMEM/Hams F12/5%-ige FBS ohne Nukleoside aber mit 50 nM Methotrexat (Selektionsmedium) platziert.
Die Zellen werden für die Subklonierung bei einer Dichte von 0,5, 1 und 5 Zellen pro Well in 96-Well-Platten in Selektionsmedium plattiert und etwa zwei Wochen wachsen gelassen. Die Wells werden auf eine Verdampfung des Mediums geprüft und während dieses Prozesses bei Bedarf stets wieder auf 200 μl pro Well aufgefüllt. Wenn sich eine große Prozentzahl der Kolonien in der Platte kurz vor der Konfluenz befindet, werden 100 μl des Medium aus jedem Well für eine Dot-Blot-Analyse entnommen und die Zellen werden mit frischem Selektionsmedium genährt. Der Überstand wird auf ein Nitrocellulosen-Filter in einem Dot-Blot-Apparat aufgetragen und das Filter wird bei 100 °C in einem Vakuumofen behandelt, um das Protein zu denaturieren. Das Filter wird in 625 mM Tris-Glycin, pH 9,1, 5 mM β-Mercaptoethanol bei 65 °C 10 Minuten lang inkubiert und anschließend in 2,5 % Western-A-Puffer mit fettfreier Trockenmilch (0,25 % Gelatine, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05 % Igepal CA-630) über Nacht bei 4 °C auf einem rotierenden Schüttler. Das Filter wird mit dem Antikörper-HRP-Konjugat in 2,5 % Western-A-Puffer mit fettfreier Trockenmilch für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Schüttler inkubiert. Anschließend wird das Filter bei Raumtemperatur drei Mal in PBS plus 0,01 % Tween 20 gewaschen, wobei jede Wäsche 15 Minuten dauert. Das Filter wird mit Chemilumineszenz-Reagenzien (ECL^TM Direct Labelling Kit; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) gemäß Herstelleranweisungen entwickelt und etwa 5 Minuten auf Film belichtet (Hyperfilm ECL, Amersham Corp.). Positive Klone werden aus der 96-Well-Platte trypsinisiert und für die Scale-Up- und Western-Blot-Analyse in 6-Well-Platten in Selektionsmedium transferiert.
Beispiel 3
Zcyto21-Gesamtprotein wird in BHK-Zellen produziert, die mit pZMP6/Zcyto21 transfektiert wurden (Beispiel 1). BHK 570-Zellen (ATCC CRL-10314) werden in 10-cm-Gewebekulturschalen plattiert, wo sie über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂, in DMEM/FBS-Medium (DMEM, Gibco/BRL High Glucose; Life Technologies), 5 % fötalem Rinderserum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-Glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM Natriumpyruvat (Life Technologies) auf etwa 50 % bis 70 % Konfluenz wachsen gelassen werden. Anschließend werden die Zellen mit pZMP6/Zcyto21 durch eine liposomvermittelte Transfektion (unter Verwendung von Lipofectamine^TM; Life Technologies), in serumfreiem (SF) Medium (DMEM ergänzt mit 10 mg/ml Transferrin, 5 mg/ml Insulin, 2 mg/ml Fetuin, 1 % L-Glutamin und 1 % Natriumpyruvat) transfektiert. Das Plasmid wird in 15-ml-Röhrchen auf ein endgültiges Volumen von 640 μl mit SF-Medium verdünnt. 35 μl oder Lipidmischung werden mit 605 μl des SF-Mediums vermischt und die resultierende Mischung wird etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Fünf ml des SF-Mediums werden der DNA-Lipidmischung zugegeben. Die Zellen werden einmal mit 5 ml des SF-Mediums gespült, aspiriert und die DNA-Lipidmischung wird zugegeben. Die Zellen werden bei 37 °C fünf Stunden inkubiert, dann werden jeder Platte 6,4 ml DMEM/10 % FBS, 1 % PSN-Medium zugegeben. Die Platten werden bei 37 °C über Nacht inkubiert und am nächsten Tag wird die DNA:Lipidmischung gegen frisches 5%-iges FBS/DMEM-Medium ausgetauscht. Am 5. Tag nach der Transfektion werden die Zellen in T-162-Fläschchen in Selektionsmedium (DMEM + 5 % FBS, 1 % L-Gln, 1 % NaPyr, 1 µM Methotrexat) geteilt. Etwa 10 Tage nach der Transfektion werden zwei 150-mm-Kulturschalen mit methotrexat-resistenten Kolonien aus jeder Transfektion trypsinisiert und die Zellen werden gepoolt und in ein T-162-Fläschchen plattiert und auf eine großangelegte Kultur transferiert.
Beispiel 4
Für die Konstruktion von Adenovirusvektoren wird die proteinkodierende Region des humanen Zcyto21 durch PCR amplifiziert, wozu Primer verwendet werden, die PmeI- und AscI-Restriktionssiten jeweils an den 5'- und 3'-Termini hinzufügen. Die Amplifizierung wird mit einer Gesamt-Zcyto21-cDNA-Vorlage wie folgt in einer PCR durchgeführt: ein Zyklus bei 95 °C für 5 Minuten; gefolgt von 15 Zyklen bei 95 °C für 1 Minute, 61 °C für 1 Minute und 72 °C für 1.5 Minuten, gefolgt von 72 °C für 7 Minuten, gefolgt von einer Einweichung bei 4 °C. Das Produkt der PCR-Reaktion wird auf ein 1,2%-iges Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA) geladen. Das Zcyto21 PCR-Produkt wird aus dem Gel exzidiert und unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits mit einer Silicagel-Membran-Spin-Säule (QIAquick^® PCR Purification Kit und Gel Cleanup Kit; Qiagen, Inc.) gemäß den Kitherstelleranweisungen aufgereinigt. Das PCR-Produkt wird dann mit PmeI und AscI verdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit EtOH ausgefällt und in 20 ml TE (Tris/EDTA pH 8) rehydriert. Das Zcyto21-Fragment wird dann in die PmeI-AscI-Siten des transgenen Vektors pTG12-8 ligiert und durch Elektroporation in E. coli DH10B^TM-kompetente Zellen transformiert. Der Vektor pTG12-8 wurde aus p2999B4 gewonnen (Palmiter et al., Mol. Cell Biol. 13:5266-5275, 1993), indem ein Ratteninsulin II-Intron (ca. 200 bp) und Polylinker (Fse I/Pme I/Asc I) in den Nru I-Situs eingeführt wurden. Der Vektor umfasst einen Mausmetallothionein (MT-1)-Promoter (ca. 750 bp) und eine nicht-translantierte humane Wachstumsfaktor (hGH)-Region und ein Polyadenylationssignal (ca. 650 bp), geflankt von 10 kb der MT-1 5'-Flankensequenz und 7 kb der MT-1 3'-Flankensequenz. Die cDNA wird zwischen den Insulin-II- und hGH-Sequenzen eingefügt. Die Zcyto21-enthaltenden Klone werden identifiziert durch eine Plasmid-DNA-Minipräp gefolgt von einer PmeI- und AscI-Verdauung. Ein positiver Klon wird sequenziert, um sicherzustellen, dass in dem Konstrukt keine Deletionen oder andere Abnormalitäten vorlagen.
Die DNA wird unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Maxi Kit, Qiagen, Inc.) präpariert und die Zcyto21-cDNA wird unter Verwendung von PmeI- und AscI-Enzymen aus dem pTG12-8-Vektor freigesetzt. Die cDNA wird auf einem 1%-igen Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur isoliert und aus dem Gel exzidiert. Die Gelscheibe wird bei 70 µC geschmolzen und die DNA wird mit einem gleichen Volumen von Tris-gepuffertem Phenol extrahiert, mit EtOH ausgefällt und in 10 μl H₂O resuspendiert.
Die Zcyto21-cDNA wird in die EcoRV-AscI-Siten eines modifizierten pAdTrack-CMV (He, T-C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998) kloniert. Das Konstrukt enthält das grüne Fluoreszenzprotein (GFP)-Marker-Gen. Der CMV-Promoter, der die GFP-Expression treibt, wird gegen den SV40-Promoter ausgetauscht und das SV40-Polyadenylierungssignal wird gegen das hGH-Polyadenylierungssignal ausgetauscht. Zusätzlich wird der native Polylinker gegen FseI-, EcoRV- und AscI-Siten ausgetauscht. Diese modifizierte Form des pAdTrack-CMV wird als pZyTrack bezeichnet. Die Ligation wird unter Verwendung eines im Handel erhältlichen DNA Ligation und Screening Kits (Fast-Link^® Kit; Epicentre Technologies, Madison, WI) durchgeführt. Die Zcyto21-enthaltenden Klone werden identifiziert durch eine Verdauung der Minipräp-DNA mit -FseI und AscI. Für die Linearisierung des Plasmids werden ca. 5 µg des resultierenden pZyTrack Zcyto21-Plasmids mit PmeI verdaut. Etwa 1 µg des linearisierten Plasmids wird mit 200 ng von Supercoiled pAdEasy (He et al., ibid.) in E. coli BJ5183-Zellen (He et al., ibid.) cotransformiert. Die Cotransformation erfolgt unter Verwendung eines Bio-Rad Gen-Pulsers bei 2,5 kV, 200 Ohm und 25 µFa. Die gesamte Cotransformationsmischung wird auf 4 LB-Platten plattiert, die 25 µg/ml Kanamycin enthalten. Die kleinsten Kolonien werden ausgewählt und in LB/Kanamycin expandiert und die rekombinante Adenovirus-DNA wird durch standardmäßige DNA-Minipräp-Verfahren identifiziert. Die rekombinante Adenovirus-Minipräp-DNA wird in E. coli DH10B^TM-kompetente Zellen transformiert und die DNA wird unter Verwendung eines Maxi Kits (Qiagen, Inc.) gemäß Herstelleranweisungen präpariert.
Etwa 5 µg der rekombinanten adenoviralen DNA wird mit PacI-Enzym (New England Biolabs) 3 Stunden lang bei 37 °C in ein Reaktionsvolumen von 100 μl mit 20-30U PacI verdaut. Die verdaute DNA wird mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform zweimal extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das DNA-Pellet wird in 10 μl destilliertem Wasser resuspendiert. Ein T25-Fläschchen mit QBI-293A-Zellen (Quantum Biotechnologies, Inc. Montreal, Qc. Kanada), das am Tag zuvor inokuliert und auf 60-70 % Konfluenz wachsen gelassen wurde, wird mit der PacI-verdauten DNA transfektiert. Die PacI-verdaute DNA wird mit steriler HBS (150 mM NaCl, 20 mM HEPES) auf ein Gesamtvolumen von 50 μl verdünnt. In einem separaten Röhrchen werden 20 μl of 1 mg/ml N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumsalze (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) mit HBS auf ein Gesamtvolumen von 100 μl verdünnt. Die DNA wird dem DOTAP zugegeben, durch Auf- und Ab-Pipettierung sanft gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Medium wird von den 293A-Zellen entfernt und mit 5 ml serumfreiem Minimum-Essential-Medium (MEM) alpha, das 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM MEM Non-Essential-Aminosäuren und 25 mM HEPES-Puffer enthält (Reagenzien von Life Technologies, Gaithersburg, MD) gewaschen. 5 ml serumfreies MEM wird den 293A- Zellen hinzugegeben und bei 37 °C gehalten. Die DNA/Lipid-Mischung wird tropfenweise dem T25-Fläschchen mit 293A-Zellen hinzugegeben, sanft gemischt und 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach 4 Stunden wird das Medium, das die DNA/Lipid-Mischung enthält, abgesaugt und gegen 5 ml komplettes MEM, das 5 % fötales Rinderserum enthält, ausgetauscht. Die transfektierten Zellen werden auf GFP-Expression und Foci-Bildung (virale Plaque) beobachtet.
Sieben Tage nach der Transfektion der 293A-Zellen mit der rekombinanten adenoviralen DNA exprimieren die Zellen das GFP-Protein und beginnen die Foci-Bildung (virale Plaque). Das rohe virale Lysat wird unter Verwendung eines Zellschabers aufgenommen, um alle 293A-Zellen zu erfassen. Das Lysat wird in ein konisches 50-ml-Röhrchen transferiert. Zur Freisetzung des Großteils der Viruspartikel aus den Zellen werden drei Gefrier-/Auftauzyklen in einem Trockeneis-/Ethanolbad und einem 37 °C Wasserbad durchgeführt.
Das rohe Lysat wird amplifiziert (Primäre (1 °) Amplifizierung), um einen „Arbeitsbestand" des Zcyto21 rAdV-Lysats zu gewinnen. Zehn 10-cm-Platten von konfluenznahen (80-90 %) 293A-Zellen werden 20 Stunden vorher eingerichtet, jeder 10-cm-Platte werden 200 ml des rohen rAdV-Lysats zugegeben und die Zellen werden 48 bis 72 Stunden auf CPE (zytopathischer Effekt) unter dem Weißlichmikroskop und auf GFP-Expression unter dem Fluoreszenzmikroskop überwacht. Wenn sich bei allen 293A-Zellen ein CPE zeigt, wird dieses Bestandslysat gewonnen und den oben beschriebenen Gefrier-/Auftauzyklen unterzogen.
Anschließend wird eine sekundäre (2 °) Amplifizierung des Zcyto21 rAdV durchgeführt. Zwanzig 15-cm-Gewebekulturschalten der 293A-Zellen werden so präpariert, dass die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % aufweisen. Bis auf einen Rest von 20 ml wird das gesamt 5%-ige MEM-Medium entfernt und jede Schale wird mit 300-500 ml des 1 °-amplifizierten rAdv-Lysats inokuliert. Nach 48 Stunden werden die 293A-Zellen aus der Virusproduktion lysiert, das Lysat wird in 250-ml-Polypropylen-Zentrifugenflaschen gesammelt und das rAdV wird aufgereinigt.
Zur Lysierung aller Zellen wird den Rohlysat-Flaschen NP-40-Detergens zugegeben bis eine endgültige Konzentration von 0,5 % erreicht ist. Die Flaschen werden zur Agitation 10 Minuten auf eine rotierenden Plattform, die sich so schnell wie möglich drehen sollte, ohne dass die Flaschen umstürzen. Die Verunreinigungen werden durch 15 Minuten Zentrifugieren bei 20.000 X G pelletiert. Der Überstand wird in 250-ml-Polycarbonat-Zentrifugenflaschen transferiert und 0,5 Volumen der 20%-igen PEG8000/2,5 M NaCl-Lösungt wird zugegeben. Die Flaschen werden über Nacht auf Eis geschüttelt. Die Flaschen werden 15 Minuten lang bei 20.000 X G zentrifugiert und der Überstand wird in eine Bleichelösung entsorgt. Unter Verwendung eines sterilen Zellschabers wird die weiße Virus/PEG-Ausfällung von 2 Flaschen in 2,5 ml PBS resuspendiert. Die resultierende Viruslösung wird in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und 10 Minuten lang bei 14.000 X G in der Mikrozentrifuge zentrifugiert, um jegliche weiteren Zellverunreinigungen zu entfernen. Der Überstand aus den 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen wird in ein 15-ml-Polypropylen-Röhrchen mit Schnappverschluss transferiert und mit CsCl auf eine Dichte von 1,34 g/ml justiert. Die Lösung wird in dickwandige 3.2-ml-Polycarbonat-Zentrifugenröhrchen transferiert und 3-4 Stunden bei 348.000 X G und 25 µC geschleudert. Das Virus bildet ein weißes Band. Unter Verwendung von Pipettenspitzen mit weiten Bohrungen wird das Virusband gewonnen.
Im Handel erhältliche ionenaustauschende Säulen (z. B. PD-10 Säulen mit Sephadex^® G-25M Vorfüllung; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) werden zur Entsalzung der Viruspräparation verwendet. Die Säule wird mit 20 ml PBS equlibriert. Das Virus wird geladen und in die Säule laufen gelassen. Der Säule werden 5 ml PBS zugegeben und Fraktionen von 8-10 Tropfen werden gewonnen. Die optischen Dichten von 1-zu-50-Verdünnungen jeder Fraktion werden bei 260 nm auf einem Spektrophotometer bestimmt. Spitzenfraktionen werden gepoolt und die optische Dichte (OD) einer 1-zu-25-Verdünnung wird bestimmt. Die OD wird unter Verwendung folgender Formel in die Viruskonzentration umgerechnet: (OD bei 260 nm)(25)(1,1 × 10¹²) = Virionen/ml.
Zur Lagerung des Virus wird dem aufgereinigten Virus Glycerol zugefügt bis auf eine endgültige Konzentration von 15 %, dann wird sanft aber effektiv gemischt und in Aliquoten bei –80 µC gelagert.
Zur Messung der rekombinanten Virusinfektiosität wird das von Quantum Biotechnologies, Inc. (Montreal, Canada) entwickelte Protokoll verwendet. Kurz gefasst, es werden zwei 96-Well-Gewebekulturplatten mit 1 × 10⁴ 293A-Zellen pro Well in MEM-haltigem 2%-igem fötalem Rinderserum für jedes zu analysierende rekombinate Virus angesetzt. Nach 24 Stunden werden 10-fache Verdünnungen jedes Virus aus 1 × 10² bis 1 × 10¹⁴ in MEM-haltigem 2%-igem fötalem Rinderserum hergestellt. 100 μl jeder Verdünnungen wird in jede von 20 Wells gegeben. Nach 5 Tagen bei 37 °C werden die Wells als positiv oder negativ für CPE abgelesen und es wird ein Wert für „Plaque-bildende Einheiten/ml" (PFU) berechnet.
Beispiel 5
Für die Produktion von transgenen Tieren, die Zcyto-21-Gene exprimieren, werden erwachsene, fruchtbare männliche Tiere (Studs) (B6C3f1, 2-8 Monate alt (Taconic Farms, Germantown, NY), vasektomisierte männliche Tiere (Duds) (CD1, 2-8 Monate alt, (Taconic Farms)), präpubeszente fruchtbare weibliche Tiere (Donors) (B6C3f1, 4-5 Wochen, (Taconic Farms)) und erwachsene fuchtbare weibliche Tiere (Recipients) (CD1, 2-4 Monate, (Taconic Farms)) verwendet.
Die Donors werden 1 Woche akklimatisiert und erhalten dann eine Injektion von ca. 8 IE/Maus Pregnant Mare Serum Gonadotrophin (Sigma; St. Louis, MO) I.P. und 46-47 Stunden später 8 IU/Maus Human Chorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)) I.P., um eine Superovulation einzuleiten. Donors werden anschließen an Hormoninjektionen mit den Studs gepaart. Die Ovulation tritt generell innerhalb von 13 Stunden nach der hCG-Injektion ein. Die Kopulation wird durch die Gegenwart eines Vaginalplugs am Morgen nach der Paarung bestätigt.
Die befruchteten Eier werden unter einem chirurgischen Mikroskop gewonnen (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, DE). Die Oviducts werden gewonnen und die Eier werden in Urinanalyse-Objektträger, die Hyaluronidase (Sigma) enthalten, freigesetzt. Die Eier werden einmal in der Hyaluronidase und zweimal in Whitten W640 Medium gewaschen (Tabelle 4), das mit 5 % CO₂, 5 % O₂ und 90 % N₂ bei 37 °C inkubiert wurde. Anschließend werden die Eier bis zur Mikroinjektion bei 37 °C/5 % CO₂ in einem Inkubator aufbewahrt.
10-20 Mikrogramm Plasmid-DNA, welches eine cDNA des Zcyto21-Gens enthält, werden linearisiert, gel-aufgereinigt und in 10 mM Tris pH 7,4, 0,25 mM EDTA pH 8,0 mit einer Endkonzentration von 5-10 Nanogramm pro Mikroliter für die Mikroinjektion resuspendiert.
Plasmid-DNA wird in die geernteten Eier mikroinjiziert, welche in einem Tropfen W640-Medium, das von warmem CO₂-equilibriertem Mineralöl überlagert ist, enthalten sind. Die DNA wird in eine Injektionsnadel aufgezogen (aus einem ID von 0,75 mm und AD von 1 mm Borsilikatglaskapillar) und in die einzelnen Eier injiziert. Jedes Ei wird mit der Injektionsnadel in einen oder beide Haploid pronuclei durchstochen.
Picoliter der DNA werden in die Pronuclei injiziert und die Injektionsnadel wird zurückgezogen, ohne mit den Nucleoli in Kontakt zu kommen. Das Verfahren wird wiederholt, bis alle Eier injiziert wurden. Die erfolgreich mikroinjizierten Eier werden in eine Organgewebekulturplatte mit vorbelüftetem W640-Medium übertragen und bei 37 °C/5 % CO₂ im Inkubator aufbewahrt.
Am nächsten Tag werden 12-17 gesunde zweizellige Embryos von der Injektion des Vortages in den Recipient transferiert. Die geschwollene Ampulla wird lokalisiert und der Oviduct wird zwischen Ampulla und Bursa gehalten, und mit einer 28 g-Nadel wird nahe an der Bursa der Oviduct angeritzt, wobei darauf zu achten ist, dass Ampulla oder Bursa nicht eingerissen werden. Durch diese eingeritzte Kerbe werden die Embryos implantiert, wobei die peritoneale Wand gehalten und die Reproduktionsorgane wieder in die Bauchhöhle geführt werden.
Die Recipients werden in Paaren in Käfige zurück gebracht für eine Gestationszeit von 19-21 Tagen. Nach der Geburt werden 19-21 Tage postpartum vor der Entwöhnung erlaubt. Die frisch entwöhnten Mäuse werden nach Geschlecht sortiert, in separate geschlechtsspezifische Käfige gesetzt, und es wird eine 0,5 cm Biopsie (für die Genotypisierung) mit einer sauberen Schere vom Schwanz abgeschnitten.
Die genomische DNA wird unter Verwendung eines Qiagen Dneasy Kits, das nach Herstelleranweisung verwendet wird, aus den Schwanzschnitten präpariert. Die genomische DNA wird durch PCR unter Verwendung von Primern, die für den hGH-3' UTR-Anteil des transgenen Vektors entwickelt wurden, analysiert. Eine für die humane Sequenz eindeutige Region wurde aus einem Alignment der 3' UTR-DNA-Sequenzen des humanen und Mauswachstumshormons identifiziert, wodurch sichergestellt wird, dass die PCR-Reaktion keine Amplifizierung der Maussequenz verursacht. Primer, die ein 368-Basenpaarfragment des hGH amplifizieren und Primer, die an Vektorsequenzen hybridisieren und den cDNA-Einsatz amplifizieren, werden oft zusammen mit den hGH-Primern verwendet. Bei diesen Experimenten generiert die DNA von transgen-positiven Tieren zwei Bänder, ein 368-Basenpaarband, das dem hGH 3' UTR-Fragment entspricht, und ein Band variabler Größe, das dem cDNA-Einsatz entspricht.
Nachdem die Transgenität (TG) der Tiere bestätigt wurde, werden sie durch Platzierung eines transgenen Weibchens mit einem wildtypischen Männchen, oder eines transgenen Männchens mit einem wildtypischen Weibchen in einen Inzuchtstrang zurückversetzt. Nach der Geburt und Entwöhnung der Jungen (Pups) werden die Geschlechter getrennt und ihre Schwänze werden für die Gentotypisierung beschnitten.
Die Analyse der mRNA-Expressionskonzentration jedes Transgens wird unter Verwendung eines RNA-Lösungshybridisierungs-Asasys oder Echtzeit-PCR auf einem ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt.
Tabelle 5
Beispiel 6
1. Stimulation der Expression von einem Interferon-ansprechenden Promoter
In einer Reihe von Experimenten wird konditioniertes Medium (CM), welches das Zcyto21-Protein enthält generiert, indem 293A-Zellen mit rekombinantem Adenovirus mit dem cDNA für Zcyto21 (AdZy-Zcyto21) mit einer Infektionsmultiplizität von 400 Partikeln pro Zelle infiziert werden. Das CM wird an Zeitpunkten zwischen 40 Stunden nach der Infektion geerntet und bei –20 °C gelagert. Das CM wird auch von einer Infektion mit einem rekombinanten Adenovirus ohne eine cDNA (AdZy-parental) generiert. Vor der Verwendung wird ein Teil des CM in einem Millipore Ultrafree-15 (nominale Molekulargewichtsgrenze von 5.000) Zentrifugenfilter 14-fach konzentriert, um die Menge der im Medium vorhandenen viralen Partikel zu reduzieren, und zum Schluss durch ein Millipore 0,2 µm Spritzenfilter gefiltert, um das CM zu sterilisieren. Die konzentrierten CM-Proben werden 1-zu-2 in Bindungspruffer verdünnt und mit Zellen aus einer murinen Zelllinie 5 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
2. Antivirale Aktivität von Zcyto21
In einer weiteren Reihe von Experimenten wird die antivirale Aktivität von Zcyto21 untersucht. In diesen Studien wird der antivirale Assay durchgeführt, indem L929-Zellen (ATCC-Nr. CCL-1) in Wachstumsmedium RPMI-Medium 1640, das 10 % fötales Rinderserum, Penicillin, Streptomycin und L-Glutamin enthält, im 96-Wellformat bei 50.000 Zellen pro Well plattiert werden. Adenovirus-CM aus 293A-Zellen, die entweder mit AdZy-Zcyto21 m oder AdZy-parental wir oben beschrieben infiziert wurden, werden mit den Zellen über Nacht inkubiert. Eine positive Kontrolle im Assay wurde durch murines Interferon-α bereit gestellt, das im Verhältnis 1:10 seriell verdünnt wird, beginnend mit 100 ng/ml. L929-Zellen mit Wachstumsmedium alleine dienen als negative Kontrolle. Die behandelten Zellen werden 24 Stunden lang inkubiert. Die Medien werden entsorgt, frisches Medium wird hinzugefügt und Encephalomyocarditisvirus (ATCC-Nr. vr129b) wird mit einer Infektionsmultiplizität von 0,1 (d. h. ein Viruspartikel für jeweils zehn L929-Zellen) eingeführt. Die Zellen werden in Gegenwart des Virus 24 Stunden inkubiert und dann werden die Wells auf ihren prozentualen zytopathischen Effekt (CPE) bewertet.
3. Antiproliferations-Assay unter Verwendung einer BAF3-Zelllinie
BaF3 wird verwendet, um zu bestimmen, ob Zcyto21 proliferative Eigenschaften aufweist. Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK) werden stabil transfektiert mit einem Expressionsvektor, der den CMV-Promoter enthält plus Intron A stromaufwärts von der Zcyto21-cDNA oder einer unverwandten cDNA, die als Zα30 bezeichnet wird, unter Verwendung von BRL-Lipofectamine. Stabil transfektierte Zellen werden in einer Zell-Factory in serumfreiem Medium angesetzt und drei Tage wachsen gelassen, bevor das konditionierte Medium geerntet und in einem 5K-Filter 10fach konzentriert wird. Konzentrierte konditionierte Meidumproben werden bei 4 °C gelagert.
Der folgende Assay wird zum Testen auf Antiproliferation von BaF3 verwendet. In einer 96-Well-Platte werden acht serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:2 aus Wachstumsmedium alleine (RPMI 1640, 10 % fötales Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin) oder murinem IL-3 (beginnend bei 50 pg/ml in Wachstumsmedium) hergestellt mit einem Endvolumen von 100 μl. Fünfzig Mikroliter des Folgenden werden den alleinigen Wachstumsmedien-Lanes oder den mIL-3-verdünnten Lanes zugegeben: humanes Interferon-α (100 ng/ml, 10 ng/ml, oder 1 ng/ml verdünnt in Wachstumsmedium), humanes Interferon-β (100 ng/ml, 10 ng/ml oder 1 ng/ml verdünnt in Wachstumsmedium), murines Interferon-α (100 ng/ml, 10 ng/ml oder 1 ng/ml verdünnt in Wachstumsmedium), murines Interferon-β (100 ng/ml, 10 ng/ml oder 1 ng/ml verdünnt in Wachstumsmedium), Zcyto21 (bei 2,5x, 0,5x oder 0,1x) und murines Zα30 (bei 2,5x, 0,5x oder 0,1x).
Die BaF3-Zelllinie wird drei Mal in Wachstumsmedium gewaschen, die Pellets werden in Wachstumsmedium resuspendiert, die Zellen werden gezählt und in Wachstumsmedium auf 5.000 Zellen/50 μl verdünnt. Fünfzig Mikroliter der verdünnten Zellen werden dann jeder Verdünnung der Proben hinzugegeben. Die Assay-Platten werden in einem Inkubator bei 37 °C drei oder vier Tage lang inkubiert. Zwanzig Mikroliter Alomar-Blau werden dann in jedes Well gegeben und die Platte wird über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Platten werden auf dem Fluoreszenz-Plattenleser mit einer Enegungswellenlänge von 544 und einer Emissionswellenlänge von 590 abgelesen.
Beispiel 7
Gewebeverteilung von humanem Zcyto21 in Gewebepanels unter Verwendung der PCR
Ein Panel cDNA-Proben aus humanen Geweben wurde unter Verwendung der PCR auf Zcyto21-Expression untersucht. Das Panel wurde intern erstellt und enthielt 77 Marathon-cDNA- und cDNA-Proben aus verschiedenen normalen und karzinogenen humanen Geweben und Zelllinien, die in Tabelle 6 unten aufgeführt sind. Die cDNA-Proben stammten aus hausinternen Bibliotheken oder Marathon-cDNA-Präparation von RNA, die im Haus präpariert wurden, oder von einem kommerziellen Lieferanten wie z. B. Clontech (Palo Alto, CA) oder Invitrogen (Carlsbad, CA). Die Marathon cDNA wurden unter Verwendung des Marathon cDNA Amplification Kits (Clontech) -hergestellt. Zur Gewährleistung der Qualität der Panel-Proben wurden drei Qalitätskontrolltests (QC) durchgeführt: (1) Zur Beurteilung der RNA-Qualität der für die Bibliotheken verwendeten RNA wurden die hausinternen cDNA auf ihre durchschnittliche Einsatzgröße geprüft, wozu PCR mit Vektoroligos verwendet wurden, die spezifisch für die Vektorsequenz für eine individuelle cDNA-Bibliothek waren; (2) Standardisierung der Konzentration der cDNA in Panel-Proben wurde unter Verwendung standardmäßiger PCR-Methoden erreicht, um das Gesamt-Alpha-Tubulin oder G3PDH cDNA zu amplifzieren; und (3) eine Probe wurde für die Sequenzierung eingesandt, um auf potenzielle ribosomale oder mitochondriale DNA-Kontaminierung zu prüfen. Das Panel wurde im 96-Well-Format eingerichtet, das eine für humane genomische DNA (Clontech) positive Kontrollprobe enthielt. Jedes Well enthielt ca. 0,2-100 pg/µl cDNA. Die ersten PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der Oligos ZC39,270 (SEQ ID-NR:14) und ZC39,272 (SEQ ID-NR:15), Advantage 2 DNA Polymerase Mix (Clontech) und Rediload-Farbstoff (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) eingerichtet. Die Amplifizierungen wurden wie folgt durchgeführt: 1 Zyklus bei 94 ° für 1 Minute, dann 35 Zyklen bei 94 °, 10 Sekunden; 67 °, 45 Sekunden und zum Schluss mit einer 3 Minuten langen Verlängerung bei 72 °. Die korrekte DNA-Fragmentgröße wurde beobachtet im Gehirn, Inselchen, Prostata, Hoden, Nebenniere, Plazenta, Eierstocktumor, Lungentumor, CD3+ und HPVS. Eine weitere PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der Oligos ZC39,270 (SEQ ID-NR:14) und ZC39,271 (SEQ ID-NR:16), Advantage 2 DNA Polymerase Mix (Clontech) und Rediload-Farbstoff (Research Genetics) eingerichtet. Die Amplifizierungen wurden wie folgt durchgeführt: 1 Zyklus bei 94 ° für 1 Minute, dann 35 Zyklen bei 94 °, 10 Sekunden; 65 °, 30 Sekunden 72 °, 30 Sekunden und zum Schluss mit einer 3 Minuten langen Verlängerung bei 72 °. Die korrekte DNA-Fragmentgröße wurde in Nebenniere, Rektaltumor und Eierstocktumor beobachtet.
TABELLE 6
SEQUENZAUFFÜHRUNG

Claims

Isoliertes Polypeptid, umfassend die Aminosäurereste 20 bis 200 von SEQ ID NO:2.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid weiterhin eine sekretorische Signalsequenz umfasst.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die sekretorische Signalsequenz die Aminosäurereste 1-19 von SEQ ID NO:2 umfasst.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90 % mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 200 von SEQ ID NO:2 oder den Aminosäureresten 1 bis 200 von SEQ ID NO:2 identisch ist, wobei das isolierte Polypeptid antivirale Aktivität aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die Aminosäuresequenz zu mindestens 95 % mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 200 von SEQ ID NO:2 oder den Aminosäureresten 1 bis 200 von SEQ ID NO:2 identisch ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid antivirale Aktivität gegenüber dem Hepatitis-Virus aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid antivirale Aktivität gegenüber dem Hepatitis-B-Virus aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 6, wobei das Polypeptid antivirale Aktivität gegenüber dem Hepatitis-C-Virus aufweist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid aus einer rekombinant hergestellten prokaryontischen Zelle isoliert ist, die eine rekombinante heterologe Nukleinsäure trägt, die für ein Polypeptid gemäß Anspruch 4 kodiert.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid aus Escherichia coli isoliert ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid aus einer eukaryontschen Zelle isoliert ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 12, wobei das Polypeptid aus einer Säugetierzelle isoliert ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid aus Ovarien-Zellen des chinesischen Hamsters isoliert ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid weiterhin Polyethylenglykolumfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend für das Polypeptid von jedem beliebigen der Ansprüche 4-15.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein Polypeptid, wobei das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 90 % mit den Aminosäureresten 20-200 von SEQ ID NO:2 identisch ist, und wobei das kodierte Polypeptid antivirale Aktivität aufweist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei jeder Unterscheid zwischen dem kodierten Polypeptid und den entsprechenden Aminosäureresten 20-200 von SEQ ID NO:2 aufgrund einer konservativen Aminosäure-Substitution auftritt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül die Nukleotide 58 bis 603 von SEQ ID NO:1 umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17, wobei das isolierte Nukleinsäuremolekül die Nukleotide 1 bis 603 von SEQ ID NO:1 umfasst.
Expressionsvektor, umfassend die folgenden operabel miteinander verknüpften Elemente: einen Transkriptionspromotor; das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 17 und einen Transkriptionsterminator.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu mindestens 95 % mit den Aminosäureresten 20-200 von SEQ ID NO:2 identisch ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei das kodierte Polypeptid die Aminosäurereste 20-200 von SEQ ID NO:2 umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei das kodierte Polypeptid die Aminosäurereste 1-200 von SEQ ID NO:2 umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei das Nukleinsäuremolekül die Nukleotide 58-6O3 von SEQ ID NO:1 umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei das Nukleinsäuremolekül weiterhin für eine sekretorische Signalsequenz kodiert, die operabel mit dem Polypeptid verknüpft ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei die kodierte sekretorische Signalsequenz die Aminosäurereste 1-19 von SEQ ID NO:2 umfasst.
Isolierte rekombinante Wirtszelle, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 21, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Bakterium, Hefezelle, Pilzzelle, Insektenzelle, Säugetierzelle und Pflanzenzelle.
In-Vitro-Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 90 % mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 200 von SEQ ID NO:2 oder den Aminosäureresten 1 bis 200 von SEQ ID NO:2 identisch ist, wobei das Verfahren den Schritt umfasst: Kultivieren von rekombinanten Wirtszellen, die den Expressionsvektor nach Anspruch 21 umfassen und die das Polypeptid produzieren; wobei das Polypeptid antivirale Aktivität aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 29, wobei die Aminosäuresequenz zu mindestens 95 % mit entweder den Aminosäureresten 20 bis 200 von SEQ ID NO:2 oder den Aminosäureresten 1 bis 200 von SEQ ID NO:2 identisch ist.
Verfahren nach Anspruch 29, weiterhin umfassend den Schritt der Isolierung des Polypeptids aus den kultivierten rekombinanten Wirtszellen.
Antikörper oder Antikörperfragment, der/das spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 4 bindet.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend: das isolierte Polypeptid nach Anspruch 4 oder Anspruch 5 und ein pharmazeutisch akzeptables Vehikel.
Formulierung nach Anspruch 33, wobei das Polypeptid weiterhin Polyethylenglykol umfasst.