DE60128899T2

DE60128899T2 - Verwendung eines botulinumtoxins zur herstellung eines arzneimittels zur peripheren behandlung von schmerzen, die nicht mit muskelspasmen oder kopfschmerzen in verbindung stehen

Info

Publication number: DE60128899T2
Application number: DE60128899T
Authority: DE
Inventors: Kei Roger Coto de Caza AOKI; Minglei Mission Viejo CUI; Stephen Mission Viejo JENKINS
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: AU2001251546B9; DE60143061D1; EP1550456A2; US20060275326A1; CN1436085A; CA2406367A1; AU5154601A; ES2347256T3; TWI282282B; ATE480253T1; US20060039916A1; MXPA02009932A; ATE456375T1; EP1604678A1; US20080138364A1; BR0110030A; CA2406367C; KR20030009431A; US7067137B2; EP1604679B1

Description

Hintergrund
Die vorliegende Erfindung betrifft Medikamente zur Behandlung von Schmerzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Schmerzen durch peripher wirkende Verabreichung eines Neurotoxins.
Viele, wenn nicht die meisten Schädigungen des Körpers rufen Schmerzen hervor. Im Allgemeinen werden Schmerzen wahrgenommen, wenn die freien Nervenenden, die die Schmerzrezeptoren in der Haut sowie in bestimmten inneren Geweben darstellen, mechanischen, thermischen, chemischen oder anderen schädlichen Stimuli unterworfen werden. Die Schmerzrezeptoren können Signale entlang der afferenten Neuronen in das Zentralnervensystem und von dort zum Gehirn leiten.
Die Ursachen von Schmerzen können Entzündung, Verletzung, Krankheit, Muskelkrämpfe und den Anfang eines neuropatischen Ereignisses oder Syndroms einschließen. Ineffektiv behandelte Schmerzen können für die Person, die sie erleidet, zerstörend sein, indem sie die Funktion einschränken, die Mobilität reduzieren, den Schlaf komplizieren und dramatisch die Lebensqualität beeinflussen.
Ein Muskelkrampf kann zur Stimulierung von mechanosensitiven Schmerzrezeptoren führen, wodurch die Empfindung von Schmerz hervorgerufen wird. Daher können Schmerzen von einem Muskelkrampf herrühren oder von ihm verursacht werden. Zusätzlich kann der Krampf durch Drücken auf die Blutgefäße die Schmerzsensoren indirekt stimulieren, wodurch Ischämie in dem Gewebe hervorgerufen wird, was wiederum schmerzinduzierende Substanzen freisetzt, die die Schmerzrezeptoren stimulieren, um Schmerzempfindungen hervorzurufen. Außerdem kann ein Muskelkrampf eine lokalisierte pH-Reduktion hervorrufen, die als Schmerzsignale empfunden werden oder diese hervorrufen kann. Daher kann Schmerz ein sekundärer Effekt eines Muskelkrampfes oder von Muskelhypertonie sein.
Entzündliche Schmerzen können auftreten, wenn Gewebe verletzt ist, was aus Operationen oder aufgrund eines schädlichen physikalischen, chemischen oder thermischen Ereignisses oder aufgrund von Infektion durch ein biologisches Mittel resultieren kann. Wenn ein Gewebe verletzt ist, kann eine Menge von endogenen Schmerz induzierenden Substanzen, z.B. Bradykinin und Histamin, aus dem verletzten Gewebe freigesetzt werden. Die schmerzinduzierenden Substanzen können an Rezeptoren auf den Enden der sensorischen Nerven binden und dadurch afferente Schmerzsignale initiieren.
Zusätzlich können schmerzinduzierende Substanzen aus schmerzvermittelnden afferenten Enden freigesetzt werden, und aus sensorischen Enden freigesetzte Neuropeptide können eine entzündliche Antwort verstärken. Daher kann es während einer Entzündung ein Sprießen von peptidischen peripheren Fasern und einen erhöhten Gehalt an Peptid geben, wobei viele Fasern eine Koexistenz von Substanz P (SP) und mit dem Calcitoningen verbundenem Peptid (calcitonin gene related peptide; CGRP) aufweisen. Die Substanz P kann die Kontraktion von Endothelzellen hervorrufen, was wiederum zu Plasmaextravasation führt, um anderen Substanzen (Bradykinin, ATP, Histamin) zu ermöglichen, Zutritt zu der Stelle der Verletzung und den afferenten Nervenenden zu bekommen. Die Freisetzung von Substanz P durch das Ende der sensorischen Nerven kann auch Mastzellen degranulieren. Von diesem Prozess wurde angenommen, dass er ein wichtiger Faktor bei der neurogenen Entzündung aufgrund der Freisetzung von Entzündungsmediatoren, wie Histamin und Serotonin, und der Freisetzung von proteolytischen Enzymen, die die Herstellung von Bradykinin katalysieren, ist. CGRP ruft offensichtlich keine Plasmaextravasation hervor, ist aber ein leistungsfähiger Vasodilator und wirkt auch synergistisch mit SP und anderen Entzündungsmediatoren, um die Plasmaextravasation zu verstärken. All die oben aufgeführten Entzündungsmediatoren können entweder Nozizeptoren sensibilisieren oder Schmerz erzeugen.
Nach der Aktivierung der primären sensorisch afferenten Neuronen kann der nächste Schritt bei der Transduktion von sensorischen Signalen die Aktivierung von Projektionsneuronen sein, die das Signal über die Rückenmarkthalamusbahn zu höheren Teilen des Zentralnervensystems, wie den Thalamuskernen, tragen. Die Zellkörper dieser Neuronen (außer den mit den Kranialnerven verbundenen) sind im Hinterhorn des Rückenmarks angeordnet. Hier kann man auch die Synapsen zwischen den primären afferenten und den Projektionsneuronen finden. Das Hinterhorn ist in einer Serie von Schichten orgavisiert, die übereinander angeordnet sind, wobei die Schicht I die dorsalste ist, gefolgt von Schicht II usw. Die unterschiedlichen Klassen von primären afferenten Neuronen bilden in unterschiedlichen Schichten Synapsen. Bei kutanen primären afferenten Nerven bilden C-Fasern Synapsen in Schichten I und II, A-delta-Fasern in Schichten I, II und V, und A-beta-Fasern in Schichten III, IV und V. Von tieferen Schichten (V-VII, X) wird angenommen, dass sie in die sensorischen Wege involviert sind, die von tieferen Geweben, wie den Muskeln und den Eingeweiden, ankommen.
Die vorherrschenden Neurotransmitter an den Synapsen zwischen primären afferenten Neuronen und Projektionsneuronen sind Substanz P, Glutamat, CGRP und Neuropeptid Y. Die Effizienz der Übertragung von diesen Synapsen kann über absteigende Wege und durch lokale Interneuronen im Rückenmark verändert werden. Diese modulatorischen Neuronen können eine Anzahl von Mediatoren freisetzen, die entweder hemmend (z.B. Opioidpeptide, Glycin) oder anregend (z.B. Stickstoffoxid, Cholecystokinin) sind, um einen Mechanismus zur Steigerung oder Reduktion der Empfänglichkeit für Empfindungen bereitzustellen.
Obwohl Entzündungsschmerzen im Allgemeinen reversibel sind und nachlassen, wenn das verletzte Gewebe repariert oder der schmerzinduzierende Stimulus entfernt wurde, haben die derzeitigen Methoden zur Behandlung von Entzündungsschmerz viele Nachteile und Mängel. So kann die typische orale, parenterale oder topische Verabreichung eines analgetischen Arzneimittels, um die Symptome von Schmerz zu behandeln, oder z.B. eines Antibiotikums, um die den Entzündungsschmerz verursachenden Faktoren zu behandeln, zu einer weitausgebreiteten systemischen Verteilung des Arzneimittels und zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Zusätzlich leidet die derzeitige Therapie für Entzündungsschmerz an einer kurzen Dauer der Arzneimittelwirksamkeit, was häufige Wiederverabreichung des Arzneimittels erfordert mit einer möglicherweise daraus folgenden Arzneimittelresistenz, Antikörperentwicklung und/oder Arzneimittelabhängigkeit und Sucht, die alle unbefriedigend sind. Ferner erhöht die häufige Arzneimittelverabreichung die Kosten des Regimes für den Patienten und kann verlangen, dass der Patient sich daran erinnert, ein Dosisschema zu befolgen.
Beispiele von Behandlungen für Entzündungs- und Muskelschmerzen schließen nicht-steroide entzündungshemmende Arzneimittel (non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDS), einschließlich Aspirin und Ibuprofen; und Opioide, wie Morphin, ein.
NSAIDs lindern Schmerzen, indem sie die Produktion von Prostaglandinen hemmen, die durch das verletzte Gewebe freigesetzt werden. Von Prostaglandinen wurde gezeigt, dass sie peripher wirkende Mediatoren von Schmerz und Entzündung sind, wie bei arthritischen Krankheiten, und eine Reduktion ihrer Konzentration sorgt für eine Erleichterung bei den Patien ten. Es wurde vorgeschlagen, dass Prostaglandine in die Mediierung von Schmerz im Rückenmark und Gehirn involviert sind, was die schmerzlindernden Effekte von NSAIDS bei einigen Schmerzzuständen, die keine Entzündung oder keinen peripheren Gewebeschaden involvieren, erläutert. Prostaglandine sind jedoch nur einer von mehreren Schmerzmediatoren. Daher haben NSAIDS eine Aktivitätsgrenze, über der ansteigende Dosen nicht mehr Schmerzlinderung liefern. Außerdem haben sie Nebenwirkungen, die ihre Nützlichkeit beschränken. Zum Beispiel können NSAIDS Irritationen des Magendarmtrakts hervorrufen, und die längere Benutzung kann zur Entwicklung ausgedehnter Geschwüre im Darm führen. Dies trifft besonders bei älteren Patienten zu, die häufig NSAIDS für ihre arthritischen Zustände verwenden.
Die therapeutischen Wirkungen der Opioide sind im Rückenmark. Opioide inhibieren die Effizienz der Neurotransmission zwischen den primären sensorischen afferenten Neuronen (hauptsächlich C-Fasern) und den Projektionsneuronen. Sie erreichen dies, indem sie eine verlängerte Hyperpolarisation beider Elemente dieser Synapsen hervorrufen. Die Verwendung von Opioiden ist wirksam zur Linderung der meisten Arten von akuten Schmerzen und chronisch malignen Schmerzen. Es gibt jedoch eine Anzahl chronisch maligner Schmerzzustände, die teilweise oder vollständig resistent gegenüber dem Aufheben des Schmerzzustands durch Opioide sind, insbesondere diejenigen, die bei denen eine Kompression von Nerven, z.B. durch Tumorbildung, beteiligt ist. Unglücklicherweise haben Opioide auch unerwünschte Nebenwirkungen einschließlich: (1) Unterdrückung des Atmungssystems, (2) Verstopfung, (3) psychoaktive Effekte einschließlich Sedierung und Euphorie. Diese Nebeneffekte treten bei Dosen auf, die denjenigen, die Schmerzlinderung hervorrufen, ähnlich sind, und schränken daher die Dosen, die dem Patienten verabreicht werden können, ein. Zusätzlich sind Opioide, wie Morphium und Heroin, gut bekannte Suchtmittel, die zu physischer Abhängigkeit führen, was auch die Entwicklung der Toleranz mit sich bringt. Mit der Entwicklung der Toleranz steigen die Dosen eines Arzneimittels, die benötigt werden, um den gleichen schmerzlindernden Effekt hervorzurufen, mit der Zeit an. Dies kann zu einem Zustand führen, bei dem die zur Linderung der Schmerzen benötigten Dosen aufgrund der zuvor erwähnten Nebenwirkungen lebensbedrohend sind.
Obwohl von Entzündungen und Muskelkrämpfen herrührende Schmerzen durch mechanische oder chemische Stimulierung des freien Endes von primären sensorischen Neuronen initiiert werden können, benötigen neuropathische Schmerzen keinen anfänglichen Stimulus auf das periphere freie Nervenende.
Neuropathischer Schmerz ist ein persistentes oder chronisches Schmerzsyndrom, das aus der Schädigung des Nervensystems, der peripheren Nerven, des Ganglions der hinteren Rückenmarkswurzel, der hinteren Rückenmarkswurzel oder des Zentralnervensystems resultieren kann.
Neuropathische Schmerzsyndrome schließen Allodynie, verschiedene Neuralgien, wie post-herpetische Neuralgie und Trigeminusneuralgie, Phantomschmerzen und komplexe regionale Schmerzsyndrome, wie Sympathicus-Reflexdystrophie und Causalgie ein. Causalgie ist oft durch einen spontanen, brennenden Schmerz in Kombination mit Hyperalgesie und Allodynie gekennzeichnet.
Tragischerweise gibt es kein existierendes Verfahren zur adäquaten, vorhersagbaren und spezifischen Behandlung von etabliertem neuropathischem Schmerz (Woolf C. et al., Neuropathic Pain: Aetiology, Symptoms, Mechanisms and Management, Lancet 1999; 353: 1959-64), da derzeitige Behandlungsmethoden für neuropathischen Schmerz daraus bestehen, dass anstelle der Reduktion oder Eliminierung der empfundenen Schmerzen nur versucht wird, dem Patienten durch psychologische oder Verhaltenstherapie zu helfen, damit umzugehen.
Gängige Verfahren zur Behandlung von neuropathischem Schmerz schließen z.B. die Verabreichung von lokalen anästhetischen Blockierungen gezielt auf Triggerpunkte, periphere Nerven, Plexi, Dorsalwurzeln und das Sympathikusnervensystem ein. Diese Behandlungen haben jedoch nur kurzlebige schmerzlindernde Effekte. Zusätzlich bringen länger wirkende analgetische Behandlungsverfahren, wie Blockierungen durch Phenolinjektion oder Cryotherapie, ein bemerkenswertes Risiko der irreversiblen Funktionseinschränkung mit sich. Ferner hat die chronische epidurale oder intrathekale (zusammen "intraspinale") Verabreichung von Arzneimitteln, wie Clonidin, Steroiden, Opioiden oder Midazolam, signifikante Nebenwirkungen und eine fragliche Effizienz.
Botulinumtoxin
Das anaerobe, Gram-positive Bakterium Clostridium botulinum erzeugt ein potentes Polypeptid-Neurotoxin, Botulinumtoxin, das bei Menschen und Tieren eine neuroparalytische Krankheit hervorruft, die als Botulismus bezeichnet wird. Die Sporen von Clostridium botulinum werden in Erde gefunden und können in unzureichend sterilisierten und verschlossenen Nahrungsmittelbehältern von heimbasierten Konservenfabriken wachsen, die die Ursache von vielen der Fälle von Botulismus sind. Die Wirkungen von Botulismus treten typischerweise 18 bis 36 Stunden nach mit einer Clostridium botulinum-Kultur oder -Sporen infizierten Nahrungsmitteln auf. Das Botulinumtoxin kann offensichtlich ungestört die Auskleidung des Darms durchdringen und periphere Motorneuronen angreifen. Symptome der Botulinumtoxinvergiftung können von Schwierigkeiten beim Gehen, Schlucken und Sprechen bis zur Paralyse der Atemmuskel und dem Tod fortschreiten.
Botulinumtoxintyp A ist das tödlichste, natürliche biologische Mittel, das dem Menschen bekannt ist. Etwa 50 Pikogramm kommerziell erhältliches Botulinumtoxintyp A (gereinigter Neurotoxinkomplex) (erhältlich von Allergan, Inc., Irvine, Kalifornien, unter dem Handelsnamen BOTOX^® in 100-Einheiten-Ampullen) ist der LD₅₀ bei Mäusen (d.h. 1 Einheit). Eine Einheit von BOTOX^® enthält etwa 50 Pikogramm des Botulinumtoxintyp A-Komplexes. Interessanterweise ist, auf einer molaren Basis, Botulinumtoxintyp A etwa 1,8 Milliarden mal tödlicher als Diphtherie, etwa 600 Millionen mal tödlicher als Natriumcyanid, etwa 30 Millionen mal tödlicher als Cobratoxin und etwa 12 Millionen mal tödlicher als Cholera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, Seiten 63-84 (Kapitel 4) aus Natural Toxins II, herausgegeben durch B.R. Singh et al., Plenum Press, New York (1976) (wo der angegebene LD₅₀ von Botulinumtoxintyp A von 0,3 ng 1 U entspricht, wird aufgrund der Tatsache, dass etwa 0,05 ng BOTOX^® einer 1 Einheit entspricht, korrigiert). Eine Einheit (U) von Botulinumtoxin wird als der LD₅₀ bei intraperitonealer Injektion in weibliche Swiss Webster-Mäuse, die jede 18 bis 20 g wiegen, definiert.
Sieben immunologisch unterschiedliche Botulinumneurotoxine wurden charakterisiert, wobei diese die Botulinumneurotoxin-Serotypen A, B, C₁, D, E, F bzw. G sind, von denen jeder durch Neutralisation mit typspezifischen Antikörpern unterschieden wird. Die unterschiedlichen Serotypen von Botulinumtoxin unterscheiden sich durch die Tierspezies, die sie befallen und durch die Schwere und Dauer der Paralyse, die sie hervorrufen. Zum Beispiel wurde bestimmt, dass Botulinumtoxintyp A 500 Mal potenter ist, wie durch die in der Ratte hervorgerufenen Paralyserate gemessen, als es Botulinumtoxintyp B ist. Zusätzlich wurde von Botulinumtoxintyp B bestimmt, dass es in Primaten bei einer Dosis von 480 U/kg, was etwa 12 Mal dem Primaten LD₅₀ von Botulinumtoxintyp A entspricht, nicht toxisch ist. Botulinumtoxin bindet offensichtlich mit hoher Affinität an cholinerge Motorneuronen, wird in das Neuron transloziert und blockiert die Freisetzung von Acetylcholin.
Ungeachtet des Serotyps scheint der molekulare Mechanismus der Toxinvergiftung ähnlich zu sein und schließt zumindest drei Schritte oder Stufen ein. Im ersten Schritt des Prozesses bindet das Toxin an die präsy naptische Membran des Zielneurons durch eine spezifische Wechselwirkung zwischen der schweren Kette, H-Kette, und einem Zelloberflächenrezeptor; von dem Rezeptor wird angenommen, dass er bei jedem Typ Botulinumtoxin und Tetanustoxin unterschiedlich ist. Das Carboxylendsegment der H-Kette, H_C, scheint wichtig für das Angreifen des Toxins an der Zelloberfläche zu sein.
In dem zweiten Schritt quert das Toxin die Plasmamembran der vergifteten Zelle. Das Toxin wird zuerst von der Zelle durch Rezeptor-mediierte Endozytose aufgenommen, und ein das Toxin enthaltendes Endosom wird gebildet. Das Toxin verlässt dann das Endosom in das Zytoplasma der Zelle. Von diesem Schritt wird angenommen, dass er durch das Aminoendsegment der H-Kette, H_N, mediiert wird, das eine konformationelle Veränderung des Toxins als Antwort auf einen pH von etwa 5,5 oder niedriger triggert. Von Endosomen ist bekannt, dass sie eine Protonenpumpe besitzen, die den intraendosomalen pH erniedrigt. Der konformationelle Shift legt hydrophobe Reste in dem Toxin frei, was es dem Toxin ermöglicht, sich selbst in die endosomale Membran einzubetten. Das Toxin (oder als Minimum die leichte Kette) transloziert dann durch die endosomale Membran in das Zytoplasma.
Der letzte Schritt des Mechanismus der Botulinumtoxinaktivität scheint die Reduktion der Disulfidbindung, die die schwere Kette, H-Kette, und die leichte Kette, L-Kette, verbindet, mit sich zu bringen. Die gesamte toxische Aktivität von Botulinum- und Tetanustoxinen ist in der L-Kette des Holotoxins enthalten; die L-Kette ist eine Zink (Zn++)-Endopeptidase, die selektiv Proteine spaltet, die für die Erkennung und das Andocken von Neurotransmitter-enthaltenden Vesikeln an der zytoplasmischen Oberfläche der Plasmamembran und die Fusion der Vesikel mit der Plasmamembran essentiell sind. Tetanusneurotoxin, Botulinumtoxin B, D, F und G rufen den Abbau von Synaptobrevin (auch Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) genannt), ein synaptosomales Membranprotein, hervor. Das meiste des in der zytoplasmatischen Oberfläche des synaptischen Vesikels vorhandene VAMP wird als Folge jedes dieser Spaltungsvorgänge entfernt. Die Serotypen A und E spalten SNAP-25. Von dem Serotyp C₁ wurde ursprunglich angenommen, dass er Syntaxin spaltet, aber es wurde herausgefunden, dass er Syntaxin und SNAP-25 spaltet. Jedes Toxin spaltet spezifisch eine unterschiedliche Bindung (außer Tetanus und Typ B, die dieselbe Bindung spalten).
Botulinumtoxine wurden in klinischen Umgebungen für die Behandlung von neuromuskulären Störungen verwendet, die durch hyperaktive Skelettmuskeln gekennzeichnet sind. Botulinumtoxintyp A wurde durch die U.S. Food and Drug Administration für die Behandlung von Blepharospasmus, Strabismus und hämifacialen Spasmen zugelassen. Nicht-Typ A-Botulinumtoxin-Serotypen haben offensichtlich eine geringere Stärke und/oder eine kürzere Wirkdauer im Vergleich zu Botulinumtoxintyp A. Klinische Effekte von peripherem intramuskulärem Botulinumtoxintyp A werden gewöhnlich innerhalb einer Woche nach der Injektion beobachtet. Die typische Dauer der Entlastung von Symptomen aus einer einzelnen intramuskulären Injektion von Botulinumtoxintyp A beträgt durchschnittlich etwa drei Monate.
Obwohl all die Botulinumtoxinserotypen offensichtlich die Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin an der neuromuskulären Kontaktstelle hemmen, tun sie dies durch Beeinflussung unterschiedlicher neurosekretorischer Proteine und/oder Spalten dieser Proteine an unterschiedlichen Stellen. Zum Beispiel spalten die Botulinumtypen A und B beide das 25 kiloDalton (kD) synaptosomal assoziierte Protein (SNAP-25), aber sie greifen unterschiedliche Aminosäuresequenzen innerhalb dieses Proteins an. Die Botulinumtoxintypen B, D, F und G wirken auf Vesikel-assoziiertes Protein (VAMP, auch Synaptobrevin genannt) ein, wobei jeder Serotyp das Protein an einer unterschiedlichen Stelle spaltet. Schließlich wurde von Botulinumtoxintyp C₁ gezeigt, dass es sowohl Syntaxin als auch SNAP-25 spaltet. Diese Unterschiede im Wirkmechanismus können die relative Stärke und/oder Wirkdauer der verschiedenen Botulinumtoxinserotypen beeinflussen. Signifikanterweise ist bekannt, dass das Zytosol von Pankreas Insel-B-Zellen zumindest SNAP-25 (Biochem. J. 1; 339 (pt 1): 159-65 (April 1999)) und Synaptobrevin (Nov. Disord., Mai 1995; 10(3): 376) enthält.
Das Molekulargewicht des Botulinumtoxinproteinmoleküls ist bei allen sieben der bekannten Botulinumtoxinserotypen etwa 150 kD. Interessanterweise werden die Botulinumtoxine durch Closteriumbakterien als Komplexe, umfassend das 150 kD-Botulinumtoxinproteinmolekül zusammen mit assoziierten Nicht-Toxinproteinen, freigesetzt. Daher kann der Botulinumtoxintyp A-Komplex durch Clostridiumbakterium als 900 kD-, 500 kD- und 300 kD-Formen hergestellt werden. Die Botulinumtoxintypen B und C₁ werden offensichtlich nur als 500 kD-Komplex erzeugt. Der Botulinumtoxintyp D wird sowohl als 300 kD- als auch 500 kD-Komplex erzeugt. Schließlich werden die Botulinumtoxintypen E und F nur als etwa 300 kD-Komplex erzeugt. Von den Komplexen (d.h. Molekulargewicht größer als etwa 150 kD) wird angenommen, dass sie ein Nichttoxin-Hämaglutininprotein und ein Nichttoxin-Nichthämaglutininprotein enthalten. Diese zwei Nichttoxinproteine (die zusammen mit dem Botulinumtoxinmolekül den relevanten Neurotoxinkomplex umfassen) können dazu dienen, dem Botulinumtoxinmolekül Stabilität gegen Denaturierung und Schutz gegen Verdauungssäuren zu verleihen, wenn das Toxin aufgenommen wird. Zusätzlich ist es möglich, dass die größeren (größer als etwa 150 kD Molekulargewicht) Botulinumtoxinkomplexe zu einer niedrigeren Diffusionsrate des Botulinumtoxins weg von der Stelle der intramuskulären Injektion eines Botulinumtoxinkomplexes führen.
In vitro-Untersuchungen haben angezeigt, dass Botulinumtoxin die Kaliumkationen-induzierte Freisetzung sowohl von Acetylcholin als auch Norepinephrin aus primären Zellkulturen des Hirnstammgewebes hemmt. Zusätzlich wurde berichtet, dass Botulinumtoxin die gesteuerte Freisetzung sowohl von Glycin als auch von Glutamat in primären Kulturen von Rückenmarksneuronen hemmt und dass Botulinumtoxin in Hirnsynaptosompräparaten die Freisetzung jedes der Neurotransmitter Acetylcholin, Dopamin, Norepinephrin, CGRP und Glutamat hemmt.
Botulinumtoxintyp A kann durch Etablieren und Wachsenlassen von Kulturen von Clostridium botulinum in einem Fermenter und dann Ernten und Reinigen der fermentierten Mischung gemäß bekannten Vorgehensweisen erhalten werden. Alle Botulinumtoxinserotypen werden anfänglich als inaktive Einzelkettenproteine erzeugt, die durch Proteasen gespalten oder eingeschnitten werden müssen, um neuroaktiv zu werden. Die Bakterienstämme, die die Botulinumtoxinserotypen A und G herstellen, besitzen endogene Proteasen, und die Serotypen A und G können deshalb aus Bakterienkulturen überwiegend in ihrer aktiven Form gewonnenwerden. Im Gegensatz dazu werden die Botulinumtoxinserotypen C₁, D und E durch nicht-proteolytische Stämme synthetisiert und sind deshalb typischerweise nicht aktiviert, wenn sie aus der Kultur gewonnen werden. Die Serotypen B und F werden sowohl durch proteolytische als auch nicht-proteolytische Stämme hergestellt und können deshalb entweder in der aktiven oder der inaktiven Form gewonnen werden. Sogar die proteolytischen Stämme, die z.B. den Serotyp Botulinumtoxintyp B herstellen, spalten jedoch nur einen Teil des hergestellten Toxins. Der exakte Anteil der eingeschnittenen zu den nicht eingeschnittenen Molekülen hängt von der Länge der Inkubation und der Temperatur der Kultur ab. Daher ist ein bestimmter Prozentsatz jedes Präparats von z.B. Botulinumtoxintyp B-Toxin wahrscheinlich inaktiv, was möglicherweise für die bekannte, signifikant niedrigere Stärke von Botulinumtoxintyp B im Vergleich zum Botulinumtoxintyp A verantwortlich ist. Die Gegenwart von inaktiven Botulinumtoxinmolekülen in einem klinischen Präparat trägt zur Gesamtproteinbeladung des Präparats bei, die mit der gesteigerten Antigenizität in Verbindung gebracht wurde, ohne zu seiner klinischen Wirksamkeit beizutragen. Zusätz lich ist bekannt, dass Botulinumtoxintyp B nach intramuskulärer Injektion eine kürzere Wirkdauer hat und bei der gleichen Dosis auch weniger wirksam als Botulinumtoxintyp A ist.
Kristallines Botulinumtoxintyp A mit hoher Qualität kann aus dem Hall A-Stamm von Clostridium botulinum mit Eigenschaften von > 3 × 10⁷ U/mg, einem A₂₆₀/A₂₇₈ von weniger als 0,60 und einem eindeutigen Muster an Bändern in der Gelelektrophorese hergestellt werden. Das bekannte Shantz-Verfahren kann verwendet werden, um kristallines Botulinumtoxintyp A zu erhalten, wie in Shantz E.J. et al., Properties and Use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol. Rev., 56: 80-99 (1992) ausgeführt ist. Im Allgemeinen kann der Botulinumtoxintyp A-Komplex aus einer anaeroben Fermentation durch Kultivieren von Clostridium Botulinum Typ A in einem geeigneten Medium isoliert und gereinigt werden. Das bekannte Verfahren kann auch verwendet werden, um nach Abtrennung der Nicht-Toxinproteine reine Botulinumtoxine zu erhalten, wie z.B.: gereinigtes Botulinumtoxintyp A mit ungefähr 150 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1-2 × 10⁸ LD₅₀ U/mg oder größer; gereinigtes Botulinumtoxintyp B mit ungefähr 156 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1-2 × 10⁸ LD₅₀ U/mg oder größer, und gereinigtes Botulinumtoxintyp F mit ungefähr 155 kD Molekulargewicht mit einer spezifischen Stärke von 1-2 10⁷ LD₅₀ U/mg oder größer.
Botulinumtoxine und/oder Botulinumtoxinkomplexe können von List Biological Laborstories, Inc., Campbell, Kalifornien; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, GB; Wako (Osaka, Japan); Metabiologics (Madison, Wisconsin) sowie von Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, erhalten werden.
Reines Botulinumtoxin ist so unbeständig, dass es im Allgemeinen nicht verwendet wird, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Außerdem sind die Botulinumtoxinkomplexe, wie der Toxintyp A-Komplex, auch extrem anfällig für Denaturierung aufgrund von Oberflächendenaturierung, Wärme und alkalischen Bedingungen. Inaktiviertes Toxin bildet Toxoidproteine, die immunogen sein können. Die resultierenden Antikörper können einen Patient refraktär gegenüber Toxininjektion machen.
So wie bei Enzymen im Allgemeinen sind die biologischen Aktivitäten von Botulinumtoxine (die intrazelluläre Peptidasen sind) zumindest teilweise von ihrer dreidimensionalen Konformation abhängig. Daher wird Botulinumtoxintyp A durch Wärme, verschiedene Chemikalien, Oberflächenstrecken und Oberflächentrocknung enttoxifiziert. Zusätzlich ist bekannt, dass eine Verdünnung des durch das bekannte Kultivieren, Fermentieren und Reinigen erhaltenen Toxinkomplexes auf die viel, viel niedrigeren Toxinkonzentrationen, die zur Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, zu einer schnellen Enttoxifizierung des Toxins führt, außer ein geeignetes Stabilisierungsmittel ist zugegen. Die Verdünnung des Toxins von Milligrammmengen zu einer Lösung, enthaltend Nanogramm pro Milliliter bringt aufgrund des schnellen Verlusts der spezifischen Toxizität bei einer so großen Verdünnung signifikante Schwierigkeiten mit sich. Da das Toxin Monate oder Jahre, nachdem die toxinhaltige pharmazeutische Zusammensetzung formuliert wurde, verwendet werden kann, muss das Toxin mit einem Stabilisierungsmittel stabilisiert werden. Die einzigen erfolgreichen Stabilisierungsmittel zu diesem Zweck waren die aus Tieren stammenden Proteine Albumin und Gelatine. Und wie angegeben, bringt die Gegenwart von aus Tieren stammenden Proteinen in der Endformulierung potenzielle Probleme mit sich, da bestimmte stabile Viren, Prione oder andere infektiöse oder pathogene Verbindungen, die aus den Donoren durchgetragen wurden, das Toxin kontaminieren können.
Außerdem kann jede der harschen Bedingungen des pH-, Temperatur- und Konzentrationsbereichs, die benötigt werden, um eine Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung in ein Toxinversand- und -lagerungsformat (fertig zur Verwendung oder Rekonstitution durch einen Arzt) zu lyophilisieren (gefrierzutrocknen) oder vakuumzutrocknen, das Toxin enttoxifizieren. Daher wurden aus Tieren stammende oder Donorpoolproteine, wie Gelatine und Serumalbumin, mit einigem Erfolg verwendet, um Botulinumtoxin zu stabilisieren.
Eine kommerziell erhältliche Botulinumtoxin-haltige pharmazeutische Zusammensetzung wird unter der Marke BOTOX^® (erhältlich von Allergan, Inc., Irvine, Kalifornien) verkauft. BOTOX^® besteht aus einem gereinigten Botulinumtoxintyp A-Komplex, Albumin und Natriumchlorid, verpackt in steriler, vakuumgetrockneter Form. Das Botulinumtoxintyp A wird aus einer Kultur des Hall-Stamms von Clostridium botulinum hergestellt, die in einem Medium, enthaltend N-Z-Amin und Hefeextrakt, gezogen wurde. Der Botulinumtoxintyp A-Komplex wird aus der Kulturlösung durch eine Serie von Säurepräzipitationen zu einem kristallinen Komplex aufgereinigt, der aus dem aktiven Toxinprotein mit hohem Molekulargewicht und einem assoziierten Hämagglutininprotein besteht. Der kristalline Komplex wird in einer Lösung, enthaltend Kochsalzlösung und Albumin, wieder gelöst und vor der Vakuumtrocknung steril filtriert (0,2 μm). BOTOX^® kann vor der intramuskulären Injektion mit steriler, nicht-konzentrierter Kochsalzlösung rekonstituiert werden. Jede Ampulle BOTOX^® enthält etwa 100 Einheiten (U) Clostridium-Botulinumtoxintyp A-Komplex, 0,5 mg menschliches Serumalbumin und 0,9 mg Natriumchlorid in einer sterilen, vakuumgetrockneten Form ohne Konservierungsmittel.
Um vakuumgetrocknete BOTOX^®-sterile normale Kochsalzlösung ohne Konservierungsmittel zu rekonstituieren, wird 0,9 % Natriumchlorid-Injektion durch Aufziehen der richtigen Menge an Verdünnungsmittel in einer Spritze mit zweckmäßiger Größe verwendet. Da von BOTOX^® angenommen wird, dass es durch Blasenbildung oder ähnliche heftige Bewegung denaturiert wird, wird das Verdünnungsmittel sanft in die Ampulle injiziert. BOTOX^® sollte innerhalb von 4 Stunden nach Rekonstituierung verabreicht werden. Während dieser Zeitspanne wird rekonstituiertes BOTOX^® in einem Kühlschrank (2 bis 8°C) gelagert. Rekonstituiertes BOTOX^® ist klar, farblos und frei von Partikeln. Das vakuumgetrocknete Produkt wird in einem Gefrierschrank bei oder unter –5°C gelagert. BOTOX^® wird innerhalb von 4 h, nachdem die Ampulle aus dem Gefrierschrank entnommen und rekonstituiert wurde, verabreicht. Während dieser 4 Stunden kann rekonstituiertes BOTOX^® in einem Kühlschrank (2 bis 8°C) gelagert werden. Rekonstituiertes BOTOX^® ist klar, farblos und frei von Partikeln.
Es wurde berichtet, dass der Botulinumtoxintyp A in klinischem Rahmen wie folgt verwendet wurde:

(1) etwa 70 bis 125 Einheiten BOTOX^® pro intramuskulärer Injektion (mehrere Muskeln), um zervikale Dystonie zu behandeln;
(2) 5 bis 10 Einheiten BOTOX^® pro intramuskuläre Injektion, um Glabellarlinien (Stirnfalten) zu behandeln (5 Einheiten injiziert intramuskulär in den Procerus-Muskel und 10 Einheiten injiziert intramuskulär in jeden Corrugator supercilii-Muskel);
(3) etwa 30 bis 80 Einheiten BOTOX^®, um Verstopfung durch Intrasphincterinjektion des Puborectalismuskels zu behandeln;
(4) etwa 1 bis 5 Einheiten pro Muskel von intramuskulär injiziertem BOTOX^®, um Blepharospasmus durch Injektion des lateral pre-tarsal orbicularis Oculimuskels des Oberlids und des lateral pre-tarsal orbicularis Oculi des Unterlids zu behandeln;
(5) um Strabismus zu behandeln, wurden in die Extraokularmuskeln intramuskulär zwischen etwa 1 bis 5 Einheiten BOTOX^® injiziert, wobei die injizierte Menge basierend auf der Größe des zu injizierenden Muskels als auch des Ausmaßes der gewünschten Muskelparalyse (d.h. Menge der gewünschten Dioptrinkorrektur) variiert;
(6) um Spastizität der oberen Extremitäten, folgend auf Gehirnschlag, durch intramuskuläre Injektionen von BOTOX^® in fünf unterschiedlichen Flexormuskeln der oberen Extremitäten wie folgt: (a) Flexor digitorum profundus: 7,5 U bis 30 U (b) Flexor digitorum sublimus: 7,5 U bis 30 U (c) Flexor carpi ulnaris: 10 U bis 40 U (d) Biceps brachii: 50 U bis 200 U zu behandeln. In jeden der fünf angegebenen Muskeln wurde bei derselben Behandlungssitzung injiziert, so dass der Patient bei jeder Behandlungssitzung 90 U bis 360 U BOTOX^® in die Flexormuskeln der oberen Extremität durch intramuskuläre Injektion erhält;
(7) um Migräne zu behandeln, pericranial injiziert (symmetrisch in Glabellar-, Frontalis- und Temporalis-Muskeln injiziert), Injektion von 25 U BOTOX^® hat einen signifikanten Vorteil als prophylaktische Behandlung von Migräne im Vergleich zu Vehikel gezeigt, wie durch abnehmende Messungen von Migränefrequenz, maximale Schwere, begleitendem Erbrechen und akute Arzneimittelverwendung über die 3-Monatsperiode folgend auf die 25 U Injektion gemessen.

Es ist bekannt, dass Botulinumtoxintyp A eine Wirksamkeit für bis zu 12 Monate haben kann (European J. Neurology 6 (Supp. 4): S111-51150:1999, und unter bestimmten Umständen so lang wie 27 Monate (The Laryngoscope 109: 1344-1346: 1999)). Die gewöhnliche Dauer einer intramuskulären Injektion von BOTOX^® ist jedoch typischerweise etwa 3 bis 4 Monate.
Wie ausgeführt, wurden bestimmte Botulinumtoxine verwendet, um verschiedene Bewegungsstörungen, wie Zustände verkrampfter Muskeln, mit einer resultierenden Linderung von Schmerz zu behandeln. Zum Beispiel ist bekannt, ein Botulinumtoxin zu verwenden, um Muskelkrämpfe unter resultierender Linderung sowohl der spasmodischen Muskelhyperaktivität als auch des Schmerzes, der sekundär als Ergebnis von oder aufgrund der spasmodischen Muskelaktivität entsteht, zu behandeln. Zum Beispiel berichteten Cheshire et al., Pain, 1994; 59(1):65-69, dass Patienten mit myofaskialem Schmerzsyndrom eine Reduktion des Schmerzes nach Injektion von Botulinumtoxintyp A in Triggerpunkte wahrnahmen. Siehe auch WO 94/15629 . Es wird angenommen, dass Botulinumtoxin A Schmerz reduzieren kann, indem es die anhaltende Muskelkontraktion reduziert, die den Schmerz überhaupt erst verursacht oder im Wesentlichen verursacht. Daher kann der Schmerz, der aus einem Muskelkrampf resultieren oder ihn begleiten kann, auf dem niedrigeren, lokalen, durch den Krampf hervorgerufenen pH beruhen. Ein indirekter Effekt der durch ein Botulinumtoxin hervorgerufenen schlaffen Muskelparalyse ist, dass sie es dem pH ermöglicht, auf ein physiologisches Niveau zurückzukehren, wodurch die Schmerzreduktion als sekundärer Effekt der cholinergen Denervierung der Motorendplatten, die aufgrund der peripheren Botulinumtoxin-Verabreichung resultieren kann, hervorgerufen wird.
Botulinumtoxin kann verwendet werden, um Migräne-Kopfschmerz zu behandeln, der mit Muskelkrämpfen, vaskulären Störungen, Neuralgie und Neuropathie verbunden ist (Binder, US-Patent Nr. 5,714,468 ). Bemerkenswerterweise können Muskelkrampfschmerz, hypertoner Muskelschmerz, Myofaskialschmerz und Migräne-Kopfschmerz alle zumindest teilweise an der Herstellung und Freisetzung von einer oder mehreren nozizeptiven Substanzen aus den Muskeln selbst während Perioden von erhöhter Muskelspannung oder Kontraktion liegen.
Der Erfolg von Botulinumtoxin A bei der Behandlung einer Vielzahl von klinischen Zuständen hat zum Interesse an anderen Botulinumtoxinserotypen geführt. Eine Studie von zwei kommerziell erhältlichen Botulinumtyp A-Präparaten (BOTOX^® und Dysport^®) und Präparaten von Botulinumtoxintypen B und F (beide erhalten von Wako Chemicals, Japan) wurde durchgeführt, um die lokale, muskelschwächende Effizienz, Sicherheit und das antigene Potential zu bestimmen. Die Botulinumtoxinpräparate wurden in den Kopf des rechten Gastrocnemiusmuskels (0,5 bis 200,0 Einheiten/kg) injiziert und die Muskelschwäche wurde unter Verwendung des Maus "digit abduction scoring"-Assays (DAS) bewertet. ED₅₀-Werte wurden aus den Dosisantwortkurven berechnet. Zusätzlichen Mäusen wurden intramuskuläre Injektionen gegeben, um die LD₅₀-Dosen zu bestimmen. Der therapeutische Index wurde als LD₅₀/ED₅₀ berechnet. Separate Gruppen von Mäusen erhielten Injektionen von BOTOX^® in die hinteren Gliedmaßen (5,0 bis 10,0 Einheiten/kg) oder von Botulinumtoxintyp B (50,0 bis 400,0 Einheiten/kg) und wurden auf Muskelschwäche und erhöhten Wasserverbrauch untersucht, wobei letzterer ein putatives Modell für trockenen Mund ist. Das antigene Potential wurde durch monatliche intramuskuläre Injektionen bei Kaninchen untersucht (1,5 oder 6,5 ng/kg für Botulinumtoxintyp B oder 0,15 ng/kg für BOTOX^®). Die Peakmuskelschwäche und die Dauer waren für alle Serotypen dosisbezogen. DAS ED₅₀-Werte (Einheiten/kg) waren wie folgt: BOTOX^®: 6,7, Dysport^®: 24,7, Botulinumtoxintyp B: 27,0 bis 244,0, Botulinumtoxintyp F: 4,3. BOTOX^® hatte eine längere Wirkdauer als Botulinumtoxintyp B oder Botulinumtoxintyp F. Die Werte des therapeutischen Indexes waren wie folgt: BOTOX^®: 10,5, Dysport^®: 6,3, Botulinumto xintyp B: 3.2. Der Wasserkonsum war bei mit Botulinumtoxintyp B injizierten Mäusen größer als mit BOTOX^®, obwohl Botulinmitoxintyp B zum Schwächen der Muskeln weniger wirksam war. Nach vier Monaten der Injektion entwickelten 2 von 4 (wenn mit 1,5 ng/kg behandelt) und 4 von 4 (wenn mit 6,5 ng/kg behandelt) Kaninchen Antikörper gegen Botulinumtoxintyp B. In einer getrennten Untersuchung zeigten 0 von 9 BOTOX^® behandelten Kaninchen Antikörper gegen Botulinumtoxintyp A. DAS-Ergebnisse zeigen an, dass die relativen Peakstärken von Botulinumtoxintyp A und Botulinumtoxintyp F gleich sind, und von Botulinumtoxintyp F größer als bei Botulinumtoxintyp B sind. In Bezug auf die Wirkdauer war Botulinumtoxintyp A größer als Botulinumtoxintyp B, und die Wirkdauer von Botulinumtoxintyp B war größer als bei Botulinumtoxintyp F. Wie durch die Werte des therapeutischen Indexes gezeigt, sind die zwei kommerziellen Präparate von Botulinumtoxintyp A (BOTOX^® und Dysport^®) unterschiedlich. Das Verhalten des erhöhten Wasserkonsums, das folgend auf die Injektion von Botulinumtoxintyp B in die hinteren Extremitäten beobachtet wurde, zeigt, dass klinisch signifikante Mengen dieses Serotyps in die systemische Zirkulation der Maus eindrangen. Die Ergebnisse zeigen auch an, dass es nötig ist, die Dosen der anderen Serotypen zu erhöhen, um eine dem Botulinumtoxintyp A vergleichbare Effizienz zu erreichen. Eine erhöhte Dosis kann Sicherheit mit sich bringen. Ferner war bei Kaninchen der Typ B antigener als es BOTOX^® war, möglicherweise aufgrund der höheren Proteinbeladung, die injiziert wurde, um eine effektive Dosis von Botulinumtoxintyp B zu erreichen. Eur. J. Neurol., 1999, Nov., 6(Suppl. 4): S3-S10.
Zusätzlich dazu, dass sie pharmakologische Wirkungen an den peripheren Stellen haben, können Botulinumtoxine auch hemmende Effekte im Zentralnervensystem besitzen. Arbeiten von Weigand et al, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 1976; 292, 161-165, und Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56 zeigten, dass Botulinumtoxin in der Lage ist, durch retrograden Transport in das Rückenmarksgebiet aufzusteigen. Als solches kann an ein einem peripheren Ort injiziertes Botulinumtoxin, z.B. intramuskulär, retrograd in das Rückenmark transportiert werden. Die Autoren der hier zitierten Artikel waren jedoch nicht in der Lage zu zeigen, dass das radiomarkierte Material intaktes Botulinumtoxin war.
Wie oben diskutiert, kann mit Muskelstörungen verbundener Schmerz, z.B. Muskelkrampfschmerz und Kopfschmerz verbunden mit vaskulären Störungen, Neuralgie und Neuropathie, durch die Verwendung von Botulinumtoxin effektiv behandelt werden. Es gibt jedoch einen klaren Mangel an verfügbaren Mitteln für die Behandlung einer großen Anzahl anderer Arten von Schmerz. Solche Schmerzen schließen z.B. nicht mit Muskelstörungen verbundenen Schmerz, nicht-Kopfschmerz-Neuralgie und Neuropathieschmerz, Gewebeentzündungsschmerz, Gelenkentzündungsschmerz, Gewebeentzündungsschmerz, Krebsschmerz, postoperativen Schmerz, Verletzungsschmerz, ischämischen Schmerz usw. ein.
Versuche wurden unternommen, um die anderen Schmerzarten zu adressieren, aber ihr potentieller Erfolg und die mögliche klinische Verwendung sind derzeit unbestimmt. Zum Beispiel offenbart Foster et al. im US-Patent Nr. 5,989,545 , dass ein Clostridiumneurotoxin, bevorzugt ein Botulinumtoxin, das mit einer bestimmten angreifenden Einheit chemisch konjugiert oder rekombinant fusioniert ist, verwendet werden kann, um Schmerz zu behandeln.
Acetylcholin
Typischerweise wird nur eine einzige Art eines kleinmolekularen Neurotransmitters von jeder Art von Neuron im Nervensystem der Säuger freigesetzt. Der Neurotransmitter Acetylcholin wird durch Neuronen in vielen Gebieten des Gehirns abgegeben, aber spezifisch durch die großen Pyramidenzellen des Motorcortexes, durch mehrere unterschiedliche Neuronen im Basalganglion, durch die Motorneuronen, die die Skelettmuskeln innervieren, durch die präganglionischen Neuronen des autonomen Nervensystems (sowohl Sympathatikus als auch Parasympathikus), durch die postganglionischen Neuronen des Parasympathikusnervensystems und von einigen der postganglionischen Neuronen des Sympathikusnervensystems. Im Wesentlichen sind nur die postganglionisch Sympathikusnervenfasern zu den Schweißdrüsen, die Piloerectormuskeln und einige Blutgefäße cholinerg, da die meisten postganglionischen Neuronen des Sympathikusnervensystems den Neurotransmitter Norepinephin abgeben. In den meisten Fällen hat Acetylcholin einen anregenden Effekt. Von Acetylcholin ist jedoch bekannt, dass es hemmende Wirkungen auf einige der peripheren Parasympathikusnervenenden hat, wie die Hemmung der Herzfrequenz durch den Vagusnerv.
Die efferenten Signale des autonomen Nervensystems werden entweder durch das Sympathikusnervensystem oder das Parasympathikusnervensystem durch den Körper geleitet. Die präganglionischen Neuronen des Sympathikusnervensystems erstrecken sich von präganglionischen Symphatikus-Neuronenzellkörpern, die in dem Intermediolateralhorn des Rückenmarks angeordnet sind. Die präganglionischen Sympathikusnervenfasern, die sich vom Zellkörper erstrecken, bilden mit entweder in einem paravertebralen sympathischen Ganglion oder in einem prävertebralen Ganglion angeordneten postganglionischen Neuronen Synapsen. Da die präganglionischen Neuronen sowohl des Sympathikus- als auch Parasympathikusnervensystems cholinerg sind, regt die Anwendung von Acetylcholin in den Ganglien sowohl Sympathikus- als auch Parasympathikus-postganglionische Neuronen an.
Acetylcholin aktiviert zwei Arten von Rezeptoren, Muscarin- und Nicotinrezeptoren. Die Muscarinrezeptoren werden in allen Effektorzellen gefunden, die durch die postganglionischen Neuronen des Parasympathikusnervensystems angeregt werden, sowie in denjenigen, die durch die postganglionischen cholinergen Neuronen des Sympathikusnervensystems angeregt werden. Die Nicotinrezeptoren werden in den Synapsen zwischen den präganglionischen und postganglionischen Neuronen sowohl des Sympathikus- als auch des Parasympathikus gefunden. Die Nicotinrezeptoren sind auch in vielen Membranen der Skelettmuskelfasern an der neuromuskulären Kontaktstelle vorhanden.
Acetylcholin wird aus cholinergen Neuronen freigesetzt, wenn kleine, klare, intrazellulare Vesikel mit der präsynaptischen neuronalen Zellmembran fusionieren. Eine große Vielzahl von nicht-neuronalen sekretorischen Zellen, wie das Nebennierenmark (sowie die PC12-Zelllinie) und Pankreas-Inselzellen, setzen Catecholamine bzw. das Nebenschilddrüsenhormon aus großen Vesikeln mit dichtem Kern frei. Die PC12-Zelllinie ist ein Klon von Ratten-Pheochromocytomazellen, das weit verbreitet als Gewebekulturmodell für Studien der sympathoadrenalen Entwicklung verwendet wird. Botulinumtoxin hemmt die Freisetzung von beiden Arten von Verbindungen aus beiden Arten von Zellen in vitro, permeabilisiert (wie durch Elektroporation) oder durch direkte Injektion des Toxins in die denervierten Zellen. Von Botulinumtoxin ist auch bekannt, dass es die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat aus Kortikalsynaptosomzellkulturen blockiert.
Eine neuromuskuläre Kontaktstelle wird in Skelettmuskeln durch die Nähe von Axonen zu Muskelzellen gebildet. Ein durch das Nervensystem übermitteltes Signal führt zu einem Aktionspotential am terminalen Axon, unter Aktivierung von Ionenkanälen und der resultierenden Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin aus intraneuronalen synaptischen Vesikeln, z.B. an der Motorendplatte der neuromuskulären Kontaktstelle. Das Acetylcholin durchquert den extrazellulären Raum, um an Acetylcholinrezeptorproteine auf der Oberfläche der Muskelendplatte zu binden. Sobald ausreichend Bindung aufgetreten ist, ruft ein Aktionspotential der Muskelzellen spezifische Membranionenkanal-Veränderungen hervor, was zur Muskelzellkontraktion führt. Das Acetylcholin wird dann von den Muskelzellen freigesetzt und durch Cholinesterasen im extrazellulären Raum metabolisiert. Die Metaboliten werden in das terminale Axon zur Weiterverarbeitung in weiteres Acetylcholin zurückgeführt.
Was daher benötigt wird, ist eine effektive, langdauernde, nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Schmerz, insbesondere Schmerz, der nicht mit einer Muskelstörung oder Kopfschmerz verbunden sind.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis und erlaubt eine effektive, langdauernde, nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere Schmerzen, die nicht mit einer Muskelstörung oder Kopfschmerzen verbunden sind. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Botulinumtoxin für die Herstellung eines Medikaments zur peripher wirkenden Verabreichung an einem Säuger gerichtet, wobei das Medikament zur Behandlung von Schmerzen, die weder mit einem Muskelkrampf noch mit Kopfschmerzen verbunden sind, nützlich ist, worin das Botulinumtoxin eine neuronale Bindungsstelle umfasst, die für das Botulinumtoxin nativ ist.
Ein Verfahren zur Behandlung von Schmerzen kann den Schritt der peripher wirkenden Verabreichung eines Neurotoxins an einen Säuger umfassen. Die behandelten Schmerzen sind nicht mit einer Muskelstörung, wie einem Muskelkrampf, verbunden, da angenommen wird, dass der Mechanismus, durch den die vorliegende Erfindung wirkt, ein schmerzlindernder Effekt auf die peripheren, sensorisch afferenten Schmerzneuronen ist, anstelle davon, dass sie einen Effekt auf Motorneuronen hat.
Das Neurotoxin kann eine neuronale Bindungsstelle umfassen, die im Wesentlichen für das Neurotoxin nativ ist. Das Neurotoxin kann ein Botulinumtoxin sein, wie einer der Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F oder G. Bevorzugt ist das Botulinumtoxin Botulinumtoxintyp A.
Das Neurotoxin kann ein modifiziertes Neurotoxin sein, bei dem zumindest eine Aminosäure entfernt, modifiziert oder ersetzt ist. Zusätzlich kann das Neurotoxin zumindest teilweise durch ein rekombinantes Verfahren hergestellt sein.
Das Neurotoxin kann in einer Menge zwischen etwa 0,01 U/kg und etwa 35 U/kg verabreicht werden, und der behandelte Schmerz kann zwischen etwa 1 Monat und etwa 27 Monaten, z.B. von etwa 1 Monat bis etwa 6 Monaten, wesentlich gelindert sein.
Die peripher wirkende Verabreichung des Neurotoxins kann vor dem Beginn eines von dem Patienten wahrgenommenen schmerzvermittelnden Ereignisses oder Syndroms durchgeführt werden. Zusätzlich kann die peripher wirkende Verabreichung des Neurotoxins anschließend an den Beginn eines von dem Säuger wahrgenommenen schmerzvermittelnden Ereignisses durchgeführt werden.
Eine detaillierte Ausführungsform kann den Schritt der peripher wirkenden Verabreichung eines Botulinumtoxins an einen menschlichen Patienten umfassen, wodurch der Schmerz gelindert wird, wobei der Schmerz nicht mit einem Muskelkrampf oder Kopfschmerzen verbunden ist.
Ein weiteres Verfahren kann den Schritt der peripheren Verabreichung eines Neurotoxins an einen Säuger umfassen, wobei das Neurotoxin ein Polypeptid ist, umfassend: (a) eine erste Aminosäuresequenzregion, umfassend eine neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp, die im Wesentlichen vollständig von einem Neurotoxin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F, G und Mischungen davon, abgeleitet ist; (b) eine zweite Aminosäuresequenzregion, die effektiv ist, um das Polypeptid oder einen Teil davon über eine Endosommembran zu translozieren; und (c) eine dritte Aminosäuresequenz, die therapeutische Aktivität hat, wenn sie in das Zytoplasma einer Zielzelle freigesetzt wird, wobei die Schmerzen nicht mit einem Muskelkrampf verbunden sind.
Die erste Aminosäuresequenzregion des Polypeptids kann ein Carboxylende einer schweren Kette, abgeleitet von dem Neurotoxin, umfassen, und das Neurotoxin kann ein Botulinumtoxin, wie Botulinumtoxintyp A sein.
Die zweite Aminosäuresequenzregion des Polypeptids kann ein Aminende einer schweren Kette, abgeleitet von einem Neurotoxin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F, G und Mischungen davon, haben. Insbesondere kann die zweite Aminosäuresequenzregion des Polypeptids ein Aminende einer schweren Toxinkette, abgeleitet von Botulinumtoxintyp A, enthalten.
Schließlich kann die dritte Aminosäuresequenzregion des Polypeptids eine leichte Toxinkette, abgeleitet von einem Neurotoxin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Clostridiumberattitoxin, Butyricumtoxin; Tetanustoxin; Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F, G und Mischungen davon, umfassen. Die dritte Aminosäuresequenzregion des Polypeptids kann eine leichte Toxinkette, abgeleitet von Botulinumtoxintyp A enthalten.
Das Verfahren kann zur Verbesserung der Funktion des Patienten dienen, wobei das Verfahren den Schritt der peripher wirkenden Verabreichung eines Botulinumtoxin an einen Patienten umfasst, der einen nicht mit Muskelstörungen verbundenen Schmerz erlebt, wobei die Funktion des Patienten verbessert wird, wie aus der Verbesserung eines oder mehrerer der Faktoren des reduzierten Schmerzes, der reduzierten im Bett verbrachten Zeit, der Verbesserung des Hörens, des erhöhten Aufstehens, des gesünderen Verhalten und eines variierteren Lebensstils bestimmt wird.
Signifikanterweise umfassen die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendeten Neurotoxine eine native oder Wildtypbindungsstelle mit einer spezifischen Affinität für einen Nervenzellenoberflächenrezeptor. Die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendeten Neurotoxine schließen neuronal angreifende Einheiten aus, die für das Neurotoxin nicht nativ sind, da wir herausgefunden haben, dass die vorliegende Erfindung effektiv durchgeführt werden kann, ohne dass die Durchführung von Modifikation oder Entfernungen an der nativen oder Wildtyp-Bindungsstelle des verwendeten Neurotoxins nötig ist.
Daher ist die Verwendung eines Neurotoxins mit einem oder mehreren nicht-nativen Artefakten oder -konstrukten der angreifenden Einheit aus dem Umfang der vorliegenden Erfindung als unnötig ausgeschlossen, da wir, wie angegeben, überraschend entdeckt haben, dass die peripher wirkende Verabreichung eines Neurotoxins gemäß der vorliegenden Erfindung eine signifikante Schmerzlinderung bereitstellt, sogar wenn das Neurotoxin keine nicht native neuronal angreifende Einheit umfasst. Daher haben wir entdeckt, dass ein Neurotoxin, wie Botulinumtoxintyp A, nach peripher wirkender Verabreichung Linderung von Schmerz bereitstellen kann, sogar wenn dem Neurotoxin nicht künstlich oder manipulativ ein Anhängsel aus einer nicht-nativen neuronal angreifenden Einheit beigefügt wurde.
Überraschenderweise haben wir entdeckt, dass ein Neurotoxin, z.B. ein Clostridiumneurotoxin, mit einer neuronalen Bindungseinheit vom Wildtyp einem Säuger peripher wirkend verabreichend werden kann, um Schmerz zu behandeln. Die neuronale Bindungseinheit vom Wildtyp ist ursprünglich Teil des Neurotoxins. Zum Beispiel kann Botulinumtoxintyp A mit seiner ursprünglichen neuronalen Bindungseinheit vom Wildtyp peripher in Mengen zwischen etwa 0,01 U/kg bis etwa 35 U/kg verabreicht werden, um von einem Säuger, wie einem menschlichen Patienten, wahrgenommene Schmerzen zu lindern. Bevorzugt wird das verwendete Botulinumtoxin peripher in einer Menge zwischen etwa 0,1 U/kg bis etwa 3 U/kg verabreicht. Signifikanterweise kann die schmerzlindernde Wirkung der hier offenbarten Verfahren für einen Durchschnitt von 1 bis 6 Monaten und unter bestimmten Umständen länger an dauern. Es wurde berichtet, dass die Wirkung von Botulinumtoxin für bis zu 27 Monaten nach Verabreichung andauern kann.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Behandlung von Schmerz die Verabreichung eines Neurotoxins z.B. eines Clostridiumneurotoxins, an einen Säuger, wobei sich das Neurotoxin von einem natürlich vorkommenden Neurotoxin durch zumindest eine Aminosäure unterscheidet. Das Neurotoxin hat auch eine neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Behandlung von Schmerz die Verabreichung eines Neurotoxins, z.B. eines Clostridiumneurotoxins, an einen Säuger, wobei das Neurotoxin eine neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp eines anderen Neurotoxinsubtyps hat.
Das Verfahren kann auch zur Behandlung eines postoperativen Schmerzes dienen, wobei der Schmerz eine Folge des durchgeführten chirurgischen Eingriffs ist (d.h. der Schmerz wird zumindest teilweise durch den gemachten Schnitt verursacht). Das Verfahren kann den Schritt der peripher wirkenden Verabreichung einer wirksamen Menge eines Botulinumtoxins vor (d.h. bis zu 10 Tage vor der Operation), während oder unmittelbar nach (d.h. nicht länger als etwa 6 bis 12 Stunden nach der Operation) einem chirurgischen Eingriff umfassen, wodurch der postoperative Schmerz gelindert oder signifikant gelindert wird. Der Umfang unserer Erfindung schließt keine Verfahren ein, bei denen der chirurgische Eingriff durchgeführt wird, um einen Muskelkrampf zu behandeln.
Die Methode kann auch zur Behandlung eines viszeralen Schmerzes durch eine nicht-systemische, lokale Verabreichung eines Botulinumtoxins in einer wirksamen Menge dienen, um dadurch den viszeralen Schmerz zu lindern. Ein viszeraler Schmerz ist ein Schmerz, der von dem Patienten so wahrgenommen wird, als wenn er von einer Stelle in den Eingeweiden ausgeht, d.h. in einem Organ des Verdauungs-, Atmungs-, Urogenital- und endokrinen Systems sowie in der Milz, dem Herz und/oder den Gefäßen. Daher schließt viszeraler Schmerz Schmerz im Pankreas, Darm, Magen und den Bauchmuskeln ein.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Behandlung von Schmerz umfasst den Schritt der peripher wirkenden Verabreichung eines Neurotoxins an einen Säuger. Der behandelte Schmerz stammt im Wesentlichen nicht von einem Muskelkrampf, weil wir überraschenderweise entdeckt haben, dass ein Neurotoxin, das gemäß des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwenden werden kann, um Schmerz zu behandeln, der nicht einem Muskelkrampf sekundär ist. Daher ist die vorliegende Erfindung für die Behandlung von Schmerz anwendbar, der unabhängig von der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Muskelstörung, wie einem Muskelkrampf, auftritt. Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung auch für die Behandlung von Schmerz, der nicht einem Muskelkrampf sekundär ist, anwendbar. So kann ein Patient einen verkrampften oder hypertonen Muskel haben und auch Schmerz erleben, der nicht sekundär ist, d.h. nicht von dem Muskelkrampf herrührt oder von ihm verursacht wird. Zum Beispiel kann ein Patient einen verkrampften Gliedermuskel haben und gleichzeitig Schmerzen im Rumpf, wie Rückenschmerzen, erleben. In diesem Beispiel kann das Verfahren die Rückenschmerzen durch peripher wirkende (d.h. subkutane) Verabreichung eines Neurotoxins in den Rücken des Patienten behandeln.
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt und gelten hierin:
"Leichte Kette" meint die leichte Kette eines Clostridiumneurotoxins. Sie kann ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa haben und kann als L-Kette, L oder als die proteolytische Domäne (Aminosäuresequenz) eines Clostridiumneurotoxins bezeichnet werden.
"Schwere Kette" meint die schwere Kette eines Clostridiumneurotoxins. Sie kann ein Molekulargewicht von etwa 100 kDa haben und kann hierin als H-Kette oder als H bezeichnet werden.
"H_N" meint ein Fragment, das ein Molekulargewicht von etwa 50 kDa haben kann, von der H-Kette eines Clostridiumneurotoxins abgeleitet ist und das ungefähr mit dem aminoterminalen Segment der H-Kette oder dem Teil entsprechend diesem Fragment in der intakten H-Kette äquivalent ist. Von ihm wird angenommen, dass es den Teil des natürlichen oder Wildtyps Clostridiumneurotoxins enthält, der in die Translokation der L-Kette über eine intrazelluläre endosomale Membran involviert ist.
"H_C" meint ein Fragment (etwa 50 kDa), abgeleitet von der H-Kette eines Clostridiumneurotoxins, das ungefähr mit dem carboxylterminalen Segment der H-Kette oder dem Teil entsprechend diesem Fragment in der intakten H-Kette äquivalent ist. Von ihm wird angenommen, dass es immunogen ist und den Teil des natürlichen oder Wildtyp Clostridiumneurotoxins enthält, der in die präsynaptische Bindung an Motorneuronen mit hoher Affinität involviert ist.
"Neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp" meint den Teil eines Neurotoxins, der für das Neurotoxin nativ ist und der eine spezifische Bindungsaffinität für einen Rezeptor auf einem Neuron zeigt. Daher schließt die Wildtyp oder native neuronale Bindungseinheit eine Bindungseinheit aus, die dem Neurotoxin nicht nativ ist.
"Angreifende Einheit" meint ein Molekül, das eine spezifische Bindungsaffinität für einen Zelloberflächenreptor besitzt. Die angreifende Einheit ist kein Clostridiumneurotoxin H_C oder keine Peptide, die von H_C abgeleitet sind, wobei zumindest eine ihrer Aminosäuren entfernt, modifiziert oder ersetzt ist. Die angreifende Einheit ist ein Molekül, das kein Clostridiumneurotoxin ist, z.B. kann sie ein Bradykinin sein.
"Lokale Verabreichung" meint eine Verabreichung durch einen nicht-systemischen Weg an oder in der Nähe der Stelle einer Beschwerde, Störung oder des wahrgenommenen Schmerzes.
"Peripher wirkende (periphere) Verabreichung" meint eine Verabreichung mittels eines nicht-systemischen Wegs an eine periphere Stelle an einem Säuger. Eine periphere Stelle bedeutet im Allgemeinen unter die Haut oder in einen Skelettmuskel. Peripher wirkende Verabreichung schließt periphere intramuskuläre, intraglandulare und subkutane Verabreichungswege ein, aber schließt intravenöse oder orale Verabreichung aus und schließt ferner jede direkte Verabreichung an das Zentralnervensystem aus.
Zeichnungen
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung können aus der folgenden Beschreibung, den Ansprüchen und den begleitenden Zeichnungen besser verständlich werden, wo in den 1 und 2 "Injektion" periphere Injektion oder Verabreichung bedeutet.
1 ist ein Dosisantwortdiagramm, das zeigt, dass ein durch die vorliegende Erfindung erhältliches Medikament induzierten Entzündungsschmerz unter dem Rattenformalinmodell zumindest fünf Tage lindert. Die X-Achse stellt die Zeit in Minuten nach dem Beginn des Formalinmodells bei der Ratte dar. Die Y-Achse stellt die Zeit dar, die verwandt wird, um die formalininjizierte Pfote nach Verwendung von Kontrolle (Salzlösung, n = 7) und BOTOX^® (Botulinumtoxintyp A gereinigter Neurotoxinkomplex) Injektionen bei Konzentrationen von 7 U/kg (n = 8), 15 U/kg (n = 5) und 30 U/kg (n = 4) zu heben und zu lecken. Das BOTOX^® wurde 5 Tage vor Beginn der Formalinexposition injiziert.
2 ist ein Dosisantwortdiagramm, das zeigt, dass ein durch die vorliegende Erfindung erhältliches Medikament induzierten Entzündungsschmerz unter dem Rattenformalinmodell zumindest 12 Tage lindert. Die X-Achse stellt die Zeit in Minuten nach dem Beginn des Formalinmodells bei der Ratte dar. Die Y-Achse stellt die Zeit dar, die verwandt wird, um die formalininjizierte Pfote nach Verwendung von Kontrolle (Salzlösung, n = 3) und BOTOX^® (Botulinumtoxintyp A gereinigter Neurotoxinkomplex) Injektionen bei Konzentrationen von 3,5 U/kg (n = 7) und 7 U/kg (n = 8) zu heben und zu lecken. Das BOTOX^® wurde 12 Tage vor Beginn der Formalinexposition injiziert.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die peripher wirkende Verabreichung eines Neurotoxins eine wirksame Behandlung von chronischem Schmerz bereitstellen kann. Bemerkenswerterweise hat das Neurotoxin eine Wildtyp- oder neuronale Bindungsstelle. Der behandelte Schmerz wird weder durch einen Muskelkrampf verursacht noch ist der Schmerz Kopfschmerz. Chronischer Schmerz wird aufgrund des lang anhaltenden, schmerzlindernden Effekts des verwendeten Neurotoxins verwendet. Die Komponente der neuronalen Bindungsstelle des Neurotoxins ist eine neuronale Bindungsstelle, die für das ausgewählte Neurotoxin nativ ist, da wir entdeckt haben, dass die vorliegende Erfindung ohne Ersatz der neuronalen Bindungsstelle vom Wildtyp durch eine nicht native oder nicht Wildtyp-angreifende Einheit ausgeführt werden kann. Die Behandlung von Kopfschmerz liegt nicht innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, weil die erfindungsgemäß bevorzugten Stellen der peripher wirkenden Verabreichung eines Neurotoxins den Kopf und Nacken ausschließen.
Vor unserer Entdeckung wurde ein Neurotoxin, wie Botulinumtoxin, verwendet, um mit verschiedenen Muskelstörungen verbundene Schmerzen zu behandeln. Daher ist es bekannt, dass eine Muskelstörung, wie ein verkrampfter Muskel, Schmerz hervorrufen kann und dass durch Behandlung des Krampfes der Schmerz auch gelindert werden kann. Foster et al. offenbaren, dass das Neurotoxin zur Verwendung bei der Behandlung von Schmerz mit einer angreifenden Einheit verbunden sein soll, d.h., dass die Wildtypbindungsstelle eines Clostridiumneurotoxins vollständig entfernt und durch eine angreifende Einheit ersetzt sein soll.
Überraschenderweise haben wir entdeckt, dass ein Neurotoxin, das nicht mit einer neuronal angreifenden Einheit konjugiert, verbunden, verklebt oder fusioniert wurde, nach den erfindungsgemäßen Verfahren peripher verabreicht werden kann, um Schmerz zu behandeln. Bevorzugt beruht der behandelte Schmerz nicht auf einem Muskelkrampf, d.h. der Schmerz rührt nicht direkt von oder als sekundäre Folge von einem Muskelkrampf her. Unsere Erfindung kann verwendet werden, Schmerz zu behandeln, der aus einer großen Anzahl von neuropathischen, entzündlichen, krebsartigen und Traumazuständen resultiert.
Vor unserer Erfindung war nicht bekannt, dass ein Neurotoxin, wie ein Botulinumtoxin, verwendet werden könnte, um Schmerz wirksam zu behandeln, wenn der Schmerz nicht von einem Muskelkrampf oder einem hypertonen Muskelzustand herrührt. Der physiologische Mechanismus, durch den die periphere Verabreichung eines Neurotoxins zu einer langfristigen Linderung von Schmerz führen kann, ist unklar. Wir merken an, dass unsere Erfindung nicht von der Erhöhung eines lokalen, niedrigen pH-Niveaus herrührt und diese nicht verlangt, wogegen der Schmerz aufgrund eines Muskelkrampfs oder eines hypertonen Muskelzustands einen reduzierten, lokalen pH erzeugen kann. Während ein Muskelkrampf oder ein hypertoner Muskelzustand durch die anticholinerge Wirkung eines Neurotoxins, wie eines Botulinumtoxins, auf Motorneuronen gelindert werden kann, ist unsere Erfindung zusätzlich nicht abhängig von einem Effekt auf Motorneuronen. Ohne dass es erwünscht ist, an die Theorie gebunden zu sein, stellen wir die Hypothese auf, dass ein Effekt der peripheren Verabreichung eines Neurotoxins, wie eines Botulinumtoxins, gemäß der vorliegenden Erfindung ein schmerzlindernder Effekt auf ein peripheres, sensorisch afferentes Neuron sein kann. Signifikanterweise ist bei unserer Erfindung die Schmerzlinderung ein primärer, im Gegensatz zu einem sekundären, Effekt nach der peripheren Verabreichung eines Neurotoxins, wie eines Botulinumtoxins.
Daher basiert die vorliegende Erfindung zumindest zum Teil auf der Entdeckung, dass ein Neurotoxin mit einer neuronalen Bindungsstelle vom Wildtyp peripher einem Säuger verabreicht werden kann, um Schmerz zu lindern. Das erfindungsgemäße Neurotoxin ist nicht an eine nicht-native angreifende Einheit gekoppelt. Die erfindungsgemäße Wildtyp-Bindungsstelle kann ein natürlich vorkommendes H_C-Segment eines Clostridiumneurotoxins oder eine im Wesentlichen vollständig von dem H_C-Segment des Clostridiumneurotoxins abgeleitete Aminosäuresequenz sein.
Wie hiernach verwendet, meint eine Aminosäuresequenz, z.B. eine Wildtypbindungsstelle "abgeleitet von" einer anderen Aminosäuresequenz, z.B. dem H_C-Segment, dass die resultierende Aminosäuresequenz exakt so wie die Aminosäuresequenz, von der sie abgeleitet wird, dupliziert wird; oder dass die resultierende Aminosäuresequenz zumindest eine entfernte, modifizierte oder ersetzte Aminosäure im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, von der sie abgeleitet ist, besitzt.
Gemäß einem breitem Aspekt werden Methoden zur Behandlung von Schmerz bereitgestellt, die die Verabreichung von effektiven Dosen eines Neurotoxins, z.B. eines Clostridiumneurotoxins, mit einer neuronalen Bindungs stelle vom Wildtyp an einen Säuger umfassen. In einer Ausführungsform schließen die Methoden die Verabreichung eines Neurotoxins mit einer neuronalen Bindungsstelle vom Wildtyp, die ursprünglich bereits ein Teil des Neurotoxins ist, ein. Zum Beispiel kann solch ein Neurotoxin aus der Gruppe, bestehend aus Berattitoxin und Butyricumtoxin, ausgewählt werden, von denen jedes bereits eine neuronale Bindungsstelle hat. Das Neurotoxin kann auch ein Tetanustoxin sein, das auch eine neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp hat. Bevorzugt wird das dem Säuger verabreichte Neurotoxin aus der Gruppe, bestehend aus den Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F oder G, ausgewählt, von denen jedes seine eigene ursprüngliche neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp hat. Bevorzugter schließen die Methoden die Verabreichung von Botulinumtyp A mit seiner ursprünglichen neuronalen Bindungsstelle vom Wildtyp ein. Die Verfahren schließen auch die Verabreichung einer Mischung von zwei oder mehreren der obigen Neurotoxine an einen Säuger, um Schmerz zu behandeln, ein.
In einer anderen Ausführungsform umfassen die Methoden die Verabreichung eines Neurotoxins, z.B. eines Clostridiumneurotoxins, an einen Säuger, wobei sich das Neurotoxin von einem natürlich vorkommenden Neurotoxin durch zumindest eine Aminosäure unterscheidet. Zum Beispiel können Varianten von Botulinumtoxintyp A wie in Biochemistry 1995, 34, Seiten 15175-15181 und Eur. J. Biochem., 1989, 185, Seiten 197-203 (hierin durch das Zitat in seiner Gänze eingeschlossen) an einen Säuger verabreicht werden, um nicht krampfverbundenen Schmerz zu behandeln. Diese Varianten haben auch neuronale Bindungsstellen vom Wildtyp.
In einer anderen Ausführungsform werden Methoden bereitgestellt für die Verabreichung eines Neurotoxins an einen Säuger, um nicht-krampfverursachten Schmerz zu behandeln, wobei das Neurotoxin eine neuronale Bindungsstelle vom Wildtyp eines anderen Neurotoxins besitzt. Zum Beispiel umfasst das Verfahren den Schritt der Verabreichung eines Botulinumtoxintyps A mit einer Wildtyp-neuronalen Bindungsstelle vom Botulinumtoxintyp B an einen Säuger. Alle anderen solcher Kombinationen sind in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In einer anderen breiten Ausführungsform schließen Methoden, um nicht-krampfverbundene Schmerzen zu behandeln, die lokale, periphere Verabreichung des Neurotoxins an eine tatsächliche oder wahrgenommene Schmerzstelle im Säuger ein. In einer Ausführungsform wird das Neurotoxin subkutan an oder nahe der Stelle des wahrgenommenen Schmerzes verabreicht, z.B. an oder nahe eines chronisch schmerzenden Gelenks. In einer anderen Ausfüh rungsform wird das Neurotoxin intramuskulär an oder nahe der Stelle des Schmerzes verabreicht, z.B. an oder nahe eines Neoplasmas am Säuger. In einer anderen Ausführungsform wird das Neurotoxin direkt in das Gelenk eines Säugers injiziert, um durch arthritische Zustände hervorgerufenen Schmerz zu behandeln oder zu lindern. Auch häufige, wiederholte Injektionen oder Infusionen des Neurotoxins in eine Stelle von peripherem Schmerz liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung. Wegen des langanhaltenden therapeutischen Effekts der vorliegenden Erfindung können häufige Injektionen oder Infusionen des Neurotoxins jedoch unnötig sein. Zum Beispiel kann die Ausführung der vorliegenden Erfindung eine analgetische Wirkung pro Injektion für 2 Monate oder länger, z.B. 7 Monate, bei Menschen bereitstellen.
Ohne das erwünscht ist, die Erfindung auf einen Mechanismus oder auf eine Wirktheorie zu beschränken, wird angenommen, dass es die Freisetzung von Neurosubstanzen hemmt, z.B. Substanz P, aus den peripheren primären sensorischen Enden hemmt, wenn das Neurotoxin lokal an eine periphere Stelle verabreicht wird. Wie oben diskutiert, kann eine Freisetzung von Substanz P durch periphere primäre sensorische Enden den Schmerztransmissionsprozess hervorrufen oder zumindest verstärken. Deshalb wird die Hemmung seiner Freisetzung am peripheren primären sensorischen Ende den Schmerztransmissionsprozess dämpfen.
Zusätzlich dazu, dass es pharmakologische Wirkungen an der peripheren Stelle der Verabreichung hat, kann ein durch die vorliegende Erfindung erhältliches Medikament auch einen schmerzlindernden Effekt aufgrund des retrograden Transports des Neurotoxins von der Stelle der peripheren (d.h. subkutanen) Injektion zum Zentralnervensystem haben. Wir haben bestimmt, dass Botulinumtyp A retrograd von der peripheren Stelle der Verabreichung zurück zum Dorsalhorn des Rückenmarks transportiert werden kann. Vermutlich erfolgt der retrograde Transport über die primären afferenten Nerven. Dieser Befund ist konsistent mit der Arbeit durch Weigand et al., Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165, und Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56, die zeigte, dass Botulinumtoxin in der Lage ist, durch retrograden Transport in das Rückenmark aufzusteigen. Daher wurde berichtet, dass intramuskulär injiziertes Botulinumtoxintyp A retrograd von dem peripheren primären sensorischen Ende zum zentralen primären sensorischen Ende transportiert werden kann.
Unsere Entdeckung unterscheidet sich signifikant von der Diskussion in den im obigen Absatz zitierten Artikeln. Wir haben entdeckt, dass nach peripherer, subkutaner Verabreichung bei der Ratte Botulinumtoxin im hinteren Rückenmarkshorn des Tiers lokalisiert gefunden wurde, d.h. an der Stelle, wo die C-Fasern Synapsen bilden. Eine subkutane Injektion ist eine Injektion an einer Stelle, wo sich viele bipolare schmerzleitende Nervenfasern befinden. Diese sensorischen Fasern laufen von der Peripherie zum Hinterhorn des Rückenmarks. Im Gegensatz wurde bei einem oder mehreren der in dem obigen Absatz zitierten Artikel, nachdem eine intramuskuläre Toxininjektion durchgeführt wurde, etwas radiomarkiertes Botulinumtoxin in den Ventralwurzeln lokalisiert gefunden. Die ventrale Wurzel des Rückenmarks ist da, wo monopolare efferente (herausführende) Motorneuronen angeordnet sind. Daher führt das Fachwissen zu der Erwartung, dass Spastizität der peripheren Muskeln als Folge des retrograden Transports von Botulinumtoxin von der Peripherie an eine Stelle im Rückenmark erwartet werden kann.
Daher wurde von den Fachleuten erwartet, dass das Erscheinen eines Neurotoxins, wie eines Botulinumtoxins, Rückenmark eines Säugers: (1) signifikante Spastizität in dem Empfänger induzieren; und (2) schädigende Effekte auf die Rückenmarks- und Gehirnfunktionen fördern würde. Daher wurde in Bezug auf den zitierten nachteiligen Effekt (1) als Beispiele in Williamson et al., in Clostridial Neurotoxins and Substrate Proteolysis in Intact Neurons, J. of Biological chemistry 271:13; 7694-7699 (1996) berichtet, dass sowohl Tetanustoxin als auch Botulinumtoxintyp A die gesteuerte Freisetzung der Neurotransmitter Glycin und Glutamat aus Rückenmarkszellkulturen von fötalen Mäusen hemmen, während durch Hagenah et al., in Effects of Type A Botulinum Toxin an the cholinergic Transmission at Spinal Renshaw Cells and an the Inhibitory Action at Ia Inhibitory Interneurones, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 299, 267-272 (1977) berichtet wurde, dass eine direkte intraspinale Injektion von Botulinumtoxintyp A in experimentell hergestellten, anästhesierten Katzen die CNS-Renshaw-Zellaktivität hemmt. Die Hemmung der zentralen Glycin- und Glutamatneurotransmitterfreisetzung sowie die Herunterregulierung der Renshaw-Zellaktivität können wahrscheinlich beide in vivo zur Förderung einer signifikanten Hyperaktivität der Motorneuronen mit begleitender peripherer Muskelspastizität führen.
In Bezug auf den nachteiligen Effekt (2) wird angenommen, dass das zentrale (im Rückenmark) Vorhandensein eines Tetanusneurotoxins durch retrograde Bewegung des Tetanustoxins entlang der ZNS-Neuronen signifikante negative Effekte auf die Rückenmarks- und Gehirnfunktionen hervorruft, wo durch jeder Wunsch danach, dass ein verwandtes Neurotoxin, wie ein Botulinumtoxin, im Rückenmark erscheint (wie durch retrograden Transport), kontraindiziert ist. Bemerkenswerterweise werden Botulinumtoxin und Tetanustoxin beide von Clostridiumbakterien erzeugt, allerdings durch unterschiedliche Spezies von Clostridium. Signifikanterweise haben einige Forscher berichtet, dass Botulinumtoxin zumindest in gewissem Ausmaß die bekannte neural aufsteigende Eigenschaft von Tetanustoxin teilt. Siehe z.B. Habermann E., ¹²⁵I-Labeled Neurotoxin from Clostridium Botulinum A: Preparation, Einding to Synaptosomes and Ascent in the Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 281, 47-56 (1974).
Unsere Erfindung stößt überraschenderweise auf keinen der schädigenden Effekte (1) oder (2), und die offenbarten peripheren (subkutanen) Verabreichungsverfahren können ausgeführt werden, um eine wirksame langanhaltende Linderung von Schmerz bereitzustellen, der nicht von einem Muskelkrampf herrührt, und eine allgemeine Verbesserung der von dem behandelten Patienten erlebten Lebensqualität bereitzustellen. Der von dem Patienten erlebte Schmerz kann z.B. von Verletzung, Operation, Infektion, Unfall oder Krankheit (einschließlich Krebs und Diabetes), einschließlich neuropathischen Krankheiten und Störungen, herrühren, wobei der Schmerz nicht primär von einem Muskelkrampf oder einem hypertonen Muskelzustand herrührt.
Sobald es in dem im Hinterhorn des Rückenmarks angeordneten, zentralen, primären sensorischen Ende ist, kann das Neurotoxin ferner die Freisetzung des Neurotransmitters hemmen, der für die Transmission von Schmerzsignalen verantwortlich ist, z.B. von Substanz P. Diese Hemmung verhindert die Aktivierung der Projektionsneuronen in der Rückenmarksthalamusbahn und lindert dadurch Schmerz. Daher dient die periphere Verabreichung des Neurotoxins aufgrund ihres nun entdeckten zentralen schmerzlindernden Effekts als alternatives Verfahren zur zentralen (d.h. intraspinalen) Verabreichung eines Analgetikums, wodurch die mit der zentralen Verabreichung eines analgetischen Arzneimittels verbundenen Komplikationen verhindert werden.
Ferner wurde von Hambermann Experientia 1988; 44:224-226 gezeigt, dass Butuliniumtoxin die Freisetzung von Noradrenalin und GABA aus Gehirnhomogenisaten hemmen kann. Dieser Befund legt nahe, dass Botulinumtoxin in die adrenergen Sympathikusnervenenden und GABA-Nervenenden eindringen kann. Als solches kann Botulinumtoxin an das Sympathikussystem verabreicht werden, um eine langanhaltende Blockierung bereitzustellen und Schmerz zu lindern, z.B. neuropathischen Schmerz. Die Verabreichung eines Neurotoxins, bevorzugt Botulinumtoxintyp A, stellt den Vorteil einer andauernden Blockierung ohne das Risiko der permanenten funktionalen Schädigung bereit, was mit den derzeit verwendeten Pharmazeutika nicht möglich ist.
Die Menge des verabreichten Neurotoxins kann über einen weiten Bereich gemäß der bestimmten, zu behandelnden Störung, ihrer Schwere und anderen verschiedenen Patientenvariablen einschließlich Größe, Gewicht, Alter und Ansprechverhalten auf die Therapie variieren. Zum Beispiel wird von dem Ausmaß des Gebiets des peripheren Schmerzes angenommen, dass er dem Volumen des injizierten Neurotoxins proportional ist, während von der Menge der Analgesie für die meisten Dosisbereiche angenommen wird, dass sie proportional zur Konzentration des injizierten Neurotoxins ist. Ferner kann die bestimmte Stelle zur Neurotoxinverabreichung von der Stelle des zu behandelnden Schmerzes abhängen.
Im Allgemeinen wird die Dosis des zu verabreichenden Neurotoxins mit dem Alter, dem sich präsentierenden Zustand und dem Gewicht des zu behandelnden Säugers variieren. Die Stärke des Neurotoxins ist auch zu bedenken.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können die therapeutisch wirksamen Dosen eines Neurotoxins, z.B. Botulinumtoxintyp A, an einer peripheren Stelle bei Mengen zwischen 0,01 U/kg und etwa 35 U/kg liegen. Ein bevorzugter Bereich zur Verabreichung eines Neurotoxins mit einer neuronalen Bindungsstelle vom Wildtyp, wie dem Botulinumtoxintyp A, um eine schmerzlindernde Wirkung bei dem behandelten Patient zu erreichen, ist etwa 0,01 U/kg bis etwa 35 U/kg. Ein bevorzugterer Bereich zur peripheren Verabreichung eines Neurotoxins, wie Botulinumtoxintyp A, um eine schmerzlindernde Wirkung bei dem behandelten Patienten zu erreichen, ist etwa 1 U/kg bis etwa 15 U/kg. Weniger als etwa 0,1 U/kg kann dazu führen, dass der gewünschte therapeutische Effekt weniger als die optimale oder längstmögliche Dauer hat, während mehr als etwa 2 U/kg noch immer zu Symptomen der Muskelschlaffheit führen können. Der bevorzugteste Bereich zur peripheren Verabreichung eines Neurotoxins, wie des Botulinumtoxintys A, um eine schmerzlindernde Wirkung bei den behandelten Patienten zu erreichen, ist etwa 0,1 U/kg bis etwa 1 U/kg.
Obwohl Beispiele der Verabreichungswege und Dosierungen bereitgestellt werden, werden der zweckmäßige Verabreichungsweg und die Dosis im Allgemeinen von Fall zu Fall durch den behandelnden Arzt bestimmt. Solche Bestimmungen sind für den Fachmann Routine (siehe z.B. Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), herausgegeben durch Anthony Fauci et al., 14. Auflage, veröffentlicht durch McGraw Hill). Zum Beispiel können der Weg und die Dosis zur Verabreichung eines erfindungsgemäß verwendbaren Neurotoxins basierend auf Kriterien, wie den Lösungscharakteristika des ausgewählten Neurotoxins sowie der Intensität des wahrgenommenen Schmerzes, ausgewählt werden.
Bei einer anderen breiten Ausführungsform werden Methoden zur Behandlung von nicht-krampfverbundenem Schmerz bereitgestellt, die die Verabreichung wirksamer Dosen eines Neurotoxins umfassen, wobei das Neurotoxin ein einzelnes Polypeptid im Gegensatz zu einem Dipolypeptid wie oben beschrieben ist.
In einer Ausführungsform ist das Neurotoxin ein einzelnes Polypeptid mit drei Aminosäuresequenzregionen. Die erste Aminosäuresequenz enthält eine neuronale Bindungsstelle, die im Wesentlichen vollständig von einem Neurotoxin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Berattitoxin; Butyricumtoxin, Tetanustoxis; Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F und G abgeleitet ist. Bevorzugt ist die erste Aminosäuresequenzregion vom Carboxylende einer schweren Kette, H_C, eines Toxins abgeleitet. Bevorzugter ist die Aminosäuresequenz von der H_C von Botulinumtoxintyp A abgeleitet.
Die zweite Aminosäuresequenz ist effektiv, um das Polypeptid oder einen Teil davon über eine Endosommembran in das Zytoplasma eines Neurons zu translozieren. In einer Ausführungsform umfasst die zweite Aminosäuresequenzregion des Polypeptids ein Aminende einer schweren Kette, H_N, abgeleitet von einem Neurotoxin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Berattitoxin; Butyricumtoxin; Tetanustoxin; Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F und G. Bevorzugt umfasst die zweite Aminosäuresequenzregion des Polypeptids das Aminende einer schweren Kette, H_N, eines Toxins, abgeleitet von Botulinumtoxintyp A.
Die dritte Aminosäuresequenzregion besitzt eine therapeutische Aktivität, wenn sie in das Zytoplasma einer/eines Zielzelle oder -neurons freigesetzt wird. In einer Ausführungsform umfasst die dritte Aminosäuresequenzregion des Polypeptids eine leichte Kette des Toxins, L, abgeleitet von einem Neurotoxin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Berattitoxin; Butyricumtoxin; Tetanustoxin; Botulinumtoxintypen A, B, C₁, D, E, F und G. Bevorzugt umfasst die dritte Aminosäuresequenzregion des Polypeptids eine leichte Kette von Toxin, L, abgeleitet von Botulinumtoxintyp A.
In einer Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der H_C von Tetanustoxin, eine zweite Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der H_N von Botulinumtoxintyp B und eine dritte Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der L-Kette von Botulinumtyp A. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der H_C von Botulinumtoxintyp B, eine zweite Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der H_N von Botulinumtoxintyp A, und eine dritte Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der L-Kette von Botulinumtyp A. Alle anderen solcher Kombinationen sind in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der H_C des Botulinumtoxintyps A, wobei die Aminosäuresequenz zumindest eine entfernte, modifizierte oder ersetzte Aminosäure hat; eine zweite Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der H_N von Botulinumtoxintyp A und eine dritte Aminosäuresequenzregion, abgeleitet von der L-Kette von Botulinumtoxintyp A. Alle anderen solcher Kombinationen sind in den Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Wie oben angegeben, sind diese Polypeptide Einfachketten und können nicht so potent sein wie gewünscht. Um ihre Stärke zu erhöhen, kann die dritte Aminosäuresequenzregion durch ein proteolytisches Enzym, z.B. ein Trypsin, abgespalten werden. Die unabhängige dritte Aminosäuresequenzregion kann durch eine Disulfidbrücke wieder mit dem ursprünglichen Peptid verbunden werden. In einer Ausführungsform ist die dritte Aminosäuresequenzregion an der ersten Aminosäuresequenzregion wieder mit dem ursprünglichen Polypeptid verbunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die dritte Aminosäuresequenzregion wieder mit der zweiten Aminosäuresequenz verbunden.
Wenn ein urmodifiziertes Neurotoxin verwendet werden soll, um nicht-krampfverbundenen Schmerz wie hierin beschrieben zu behandeln, kann das Neurotoxin durch Kultivieren einer geeigneten Bakterienspezies erhalten werden. Zum Beispiel kann Botulinumtoxintyp A durch Etablieren und Wachsenlassen von Kulturen von Clostridium botulinum in einem Fermenter und dann Ernten und Reinigen der fermentierten Mischung gemäß bekannter Vorgehensweisen erhalten werden. Alle Botulinumtoxinserotypen werden ursprünglich als inaktive Einfachkettenproteine synthetisiert, die durch Proteasen gespalten oder eingeschnitten werden müssen, um neuroaktiv zu werden. Die Bakterienstämme, die die Botulinumtoxinserotypen A und G herstellen, besitzen endogene Proteasen, und die Serotypen A und G können daher aus Bakterienkulturen hauptsächlich in ihrer aktiven Form wiedergewonnen werden. Im Gegensatz werden die Botulinumtoxinserotypen C₁, D und E durch nicht-proteolytische Stämme synthetisiert und sind deshalb typischerweise nicht aktiviert, wenn sie aus der Kultur wiedergewonnen werden. Die Serotypen B und F werden sowohl durch proteolytische als auch nicht-proteolyti sche Stämme hergestellt und können daher entweder in ihrer aktiven oder inaktiven Form wiedergewonnen werden. Sogar die proteolytischen Stämme, die z.B. den B-Serotyp von Botulinumtoxin erzeugen, spalten jedoch nur einen Teil des erzeugten Toxins. Der exakte Anteil von eingeschnittenen zu nicht-eingeschnittenen Molekülen hängt von der Länge der Inkubation und der Temperatur der Kultur ab. Daher wird wahrscheinlich ein bestimmter Prozentsatz jedes Präparats z.B. des Botulinumtoxintyps B inaktiv sein, was möglicherweise für die bekannte signifikant niedrigere Stärke von Botulinumtoxintyp B im Vergleich zum Botulinumtoxintyp A verantwortlich ist. Das Vorhandensein von inaktiven Botulinumtoxinmolekülen in einem klinischen Präparat wird zur Gesamtproteinbeladung des Präparats beitragen, die mit Antigenizität verbunden wurde, ohne zu seiner klinischen Wirksamkeit beizutragen. Zusätzlich ist bekannt, dass Botulinumtoxintyp B nach intramuskulärer Injektion eine kürze Wirkdauer hat und auch weniger potent ist als Botulinumtoxintyp A derselben Dosis.
Wenn ein modifiziertes Neurotoxin erfindungsgemäß verwendet werden soll, um nicht-krampfverbundenen Schmerz zu behandeln, können rekombinante Techniken verwendet werden, um die gewünschten Neurotoxine herzustellen. Diese Technik enthält Schritte des Erhaltens von genetischem Material aus natürlichen Quellen oder synthetischen Quellen, die Codes für eine neuronale Bindungsstelle, eine zur Translokation des Neurotoxins oder eines Teils davon effektive Aminosäuresequenz und eine Aminosäuresequenz mit therapeutischer Aktivität bei Freisetzung in das Zytoplasma einer Zielzelle, bevorzugt eines Neurons, haben. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die genetischen Materialien Codes für die H_C-, H_N- und L-Kette von Clostridiumneurotoxinen, modifizierten clostridialen Neurotoxinen und Fragmenten davon. Die genetischen Konstrukte werden zur Amplifikation in Wirtszellen inkorporiert, indem zuerst das genetische Konstrukt mit einem Klonierungsvektor, wie Phagen oder Plasmiden, fusioniert wird. Dann werden die Klonierungsvektoren in die Wirte, bevorzugt E. coli, eingeführt. Auf die Expression der rekombinanten Gene in den Wirtszellen folgend können die resultierenden Proteine unter Verwendung herkömmlicher Techniken isoliert werden.
Obwohl rekombinante Techniken für die Herstellung von modifizierten Neurotoxinen bereitgestellt werden, können rekombinante Techniken auch eingesetzt werden, um nicht-modifizierte Neurotoxine, z.B. Botulinumtoxin A wie es natürlich vorkommt, herzustellen, da die genetische Sequenz vom Botulinumtoxintyp A bekannt ist.
Es gibt viele Vorteile der rekombinanten Herstellung dieser Neurotoxine. Zum Beispiel ist die Herstellung von Neurotoxin aus anaeroben Clostridiumkulturen ein mühsamer und zeitraubender Prozess, einschließlich eines mehrschrittigen Reinigungsprotokolls, das verschiedenen Präzipitationsschritte und entweder verlängerte und wiederholte Kristallisation des Toxins oder verschiedene Stufen der Säulenchromatographie mit sich bringt. Signifikanterweise diktiert die hohe Toxizität des Produkts, dass das Verfahren unter striktem Containment (BL-3) durchgeführt wird. Während des Fermentationsprozesses werden die gefalteten Einfachketten-Neurotoxine durch endogene Clostridiumproteasen durch einen Prozess, genannt Einschneiden, aktiviert. Dies bringt die Entfernung von ungefähr 10 Aminosäureresten aus der Einzelkette mit sich, um die Zweikettenform zu bilden, in der die zwei Ketten durch eine intraketten-Disulfidbindung kovalent verbunden bleiben.
Das eingeschnittene Neurotoxin ist viel aktiver als die nicht-eingeschnittene Form. Die Menge und die präzise Stelle des Einschneidens variieren mit den Serotypen der das Toxin produzierenden Bakterien. Die Unterschiede bei der Aktivierung des Einfachketten-Neurotoxins und daher die Ausbeute an eingeschnittenem Toxin werden durch Variationen des Typs und der Menge der von einem gegebenen Stamm gelieferten proteolytischen Aktivität hervorgerufen. Zum Beispiel werden mehr als 99 des Clostridiumbotulinumtoxintyp A-Einfachketten-Neurotoxins durch den Hall A-Clostridiumbotulinumstamm aktiviert, wogegen Typ B und E-Stämme Toxine mit geringerem Ausmaß der Aktivierung produzierten (0 bis 75 %, abhängig von der Fermentationszeit). Daher spielt die hohe Toxizität des reifen Neurotoxins eine Hauptrolle bei der kommerziellen Herstellung von Neurotoxinen als therapeutische Mittel.
Der Grad der Aktivierung von künstlich erzeugten Clostridiumtoxinen ist daher ein wichtiger Punkt bei der Herstellung dieser Materialien. Es wäre ein großer Vorteil, wenn Neurotoxine, wie Botulinumtoxin und Tetanustoxin, rekombinant in großer Ausbeute in schnellwachsenden Bakterien (wie heterologen E. coli-Zellen) als relativ nicht-toxische Einzelketten (oder Einzelketten mit reduzierter toxischer Aktivität), die sicher, einfach zu isolieren und einfach in die vollaktive Form umzuwandeln sind, exprimiert werden könnten.
Da die Sicherheit ein Hauptanliegen ist, wurden frühere Arbeiten auf die Expression in E. coli und die Reinigung von einzelnen H- und L-Ketten von Tetanus- und Botulinumtoxinen konzentriert; diese isolierten Ketten sind selbst nicht toxisch; siehe Li et al., Biochemistry 33:7014-7020 (1994); Zhou et al., Biochemistry 34:15175-15181 (1995); hierin durch das Zitat eingeschlossen. Der getrennten Produktion dieser Peptidketten folgend und unter strikt kontrollierten Bedingungen können die H- und L-Ketten durch oxidative Disulfidbindungsbildung kombiniert werden, um die neuroparalytischen Diketten zu bilden.
Es ist bekannt, dass postoperativer Schmerz, resultierend von (d.h. sekundär auf) einen Muskelkrampf durch präoperative Injektion von Botulinumtoxintyp A gelindert werden kann. Developmental Medicine & Child Neurology 42; 116-121:2000. Im Gegensatz umfasst unsere Erfindung Verfahren zur Behandlung von postoperativem Schmerz durch prä- oder perioperative, periphere Verabreichung eines Botulinumtoxins, wobei der Schmerz nicht durch einen verkrampften Muskel hervorgerufen wird.
Daher kann ein Patient entweder während der Operation oder bis zu etwa 10 Tage vor der Operation (wobei die Operation nicht mit der Korrektur oder Behandlung einer spasmodischen Muskelzustands verbunden ist) lokal und peripher durch Bolusinjektion etwa 20 Einheiten bis etwa 300 Einheiten eines Botulinumtoxins, wie Botulinumtoxintyp A, an oder in der Nähe der Stelle eines prospektiven Schnitts in die Dermis des Patienten verabreicht bekommen. Die Botulinumtoxininjektion kann subkutan oder intramuskulär sein. Die Operation wird nicht durchgeführt, um Schmerz zu behandeln oder zu lindern, der von einem hyperaktiven oder hypertonen Muskel stammt, da wir überraschenderweise entdeckt haben, dass viele Arten von Schmerz, die nicht von einem Muskelkrampf stammen oder aus ihm folgen, durch die Durchführung unserer offenbarten Erfindung signifikant gelindert werden können.
Zur Linderung von postoperativen Schmerz kann ein Patient, bei dem eine Operation zum Zwecke der Tumorentfernung, der Knochentransplantation, des Knochenersatzes, der Explorationsoperation, des Wundverschlusses, eine kosmetische Operation, wie Liposuktion, oder eine aus einer Vielzahl von anderen Arten von möglichen (Nichtmuskelstörungsbehandlung-) operativen Prozeduren vorgesehen ist, die einen oder mehreren Schnitten in und/oder durch die Dermis des Patienten verlangt, gemäß unserer Erfindung durch periphere Verabreichung von etwa 0,01 U/kg bis etwa 60 U/kg eines Botulinumtoxins, wie des Botulinumtoxintyps A oder B, behandelt werden. Die Dauer der signifikanten Linderung von postoperativem Schmerz kann etwa 2 bis etwa 6 Monaten oder länger betragen.
Ein erfindungsgemäß erhältliches Medikament kann verbesserte Funktion des Patienten bereitstellen. Eine "verbesserte Funktion des Patienten" kann als Verbesserung definiert werden, die durch Faktoren, wie reduzierter Schmerz, reduzierte im Bett verbrachte Zeit, verstärktes Aufstehen, gesünderes Auftreten, variierterer Lebensstil und/oder Heilung, ermöglicht durch den normalen Muskeltonus gemessen wird. Eine verbesserte Funktion des Patienten ist synonym mit einer verbesserten Lebensqualität (quality of life; QOL). QOL kann unter Verwendung z.B. der bekannten SF-12 oder SF-36 "health survey scoring"-Verfahren gemessen werden. SF-36 misst die physische und mentale Gesundheit eines Patienten in acht Domänen der physischen Funktion, der Rollenlimitierungen aufgrund von physischen Problemen, der sozialen Funktion, des körperlichen Schmerzes, der allgemeinen mentalen Gesundheit, der Rollenlimitierungen aufgrund von emotionalen Problemen, der Vitalität, der allgemeinen Gesundheitswahrnehmung. Die erhaltenen Punkte können mit publizierten Werten, die für verschiedene allgemeine und Patientenpopulationen erhältlich sind, verglichen werden.
Beispiele
Die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele statten die Fachleute mit spezifischen bevorzugten Methoden zur Behandlung von nicht-krampfverbundenem Schmerz innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung aus und sind nicht dazu vorgesehen, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Bei den folgenden Beispielen können verschiedene Moden der nicht-systemischen Verabreichung eines Neurotoxins durchgeführt werden. Zum Beispiel durch intramuskuläre Bolusinjektion, durch mehrfach-subkutane Injektionen an dermalen Stellen an oder im Bereich des Schmerzes oder durch Implantation eines Implantats mit kontrollierter Freisetzung.
Beispiel 1
Schmerzlinderung durch periphere Verabreichung von Botulinumtoxintyp A
Zwei Experimente wurden durchgeführt. Sprague-Dawley-Ratten (etwa 300 bis 350 g) wurden in beiden Experimenten verwendet. Das in beiden Experimenten verwendete Neurotoxin war BOTOX^® (Botulinumtoxintyp A, gereinigter Neurotoxinkomplex). In dem ersten Experiment gab es 4 Behandlungs(dosis) gruppen: Kontroll (injizierte Salzlösung)-Ratten (n = 4), 7 U BOTOX^®/kg- Ratten (n = 8), 15 U BOTOX^®/kg-Ratten (n = 5) und 30 U BOTOX^®/kg-Ratten (n = 4). Den Kontroll-Ratten wurden 25 Mikroliter 0,9%iger Salzlösung subkutan in die Plantaroberfläche der Hinterpfote des Tiers injiziert. Die Stelle und der Verabreichungsweg von BOTOX^® waren dieselben wie bei der Salzinjektionskontrollgruppe.
Fünf Tage nach entweder der Salzlösungs- oder BOTOX^®-Injektion wurden bei jeder der Ratten in allen vier Gruppen 50 Mikroliter 5%iges Formalin an der Stelle injiziert, wo zuvor entweder Salzlösung oder BOTOX^® injiziert wurden. Das Gliedmaßenheben/-lecken durch das Testtier wurde dann in 5-Minutenintervallen 1 Stunde aufgezeichnet.
Der zweite Satz des Experiments involvierte das gleiche Protokoll wie das erste Experiment. In dem zweiten Experiment gab es drei Behandlungs(dosis) gruppen: Kontroll (injizierte Salzlösung)-Ratten (n = 3), 3,5 U BOTOX^®/kg-Ratten (n = 7) und 7 U BOTOX^®/kg-Ratten (n = 8); und der Formalintest wurde am 12. Tag nach der ursprünglichen BOTOX^®- oder Salzlösungsinjektion durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser zwei Experimente sind in 1 bzw. 2 gezeigt. Die ersten 5 bis 10 Minuten können als Phase 1 bezeichnet werden, der Phase 2 folgt. Wie durch die 1 und 2 sowohl 5 Tage als auch 12 Tage nach Injektion zeigen, gab es eine signifikante dosisabhängige Schmerzlinderung bei den BOTOX^®-behandelten Tieren.
Beispiel 2
Periphere Verabreichung eines Botulinumtoxins, um Nichtkrampfschmerz zu lindern
Eine 46 Jahre alte Frau stellt sich mit Schmerz lokalisiert im Deltoidbereich aufgrund eines arthritischen Zustands vor. Der Muskel ist weder verkrampft noch zeigt er einen hypertonen Zustand. Die Patientin wird durch eine Bolusinjektion von zwischen etwa 50 Einheiten und 200 Einheiten intramuskulärem Botulinumtoxintyp A behandelt. Innerhalb 1 bis 7 Tagen nach Neurotoxinverabreichung ist der Schmerz der Patientin wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate. Schmerzen in der Schulter, dem Arm und der Hand aufgrund von Oesteoporose, Fixierung der Gelenke, Koronarinsuffizienz, zervikale Osteoarthritis, lokalisierter Schulterkrankheit oder aufgrund einer verlängerten Periode der Bettruhe können ähnlich behandelt werden.
Beispiel 3
Periphere Verabreichung eines Neurotoxins, um posttherapeutische Neuralgie zu behandeln.
Posttherapeutische Neuralgie ist eines der hartnäckigsten chronischen Schmerzprobleme. Die an diesen schrecklich schmerzhaften Prozess leidenden Patienten sind oft älter, haben kräftezehrende Krankheiten und sind nicht für größere chirurgische Eingriffe geeignet. Die Diagnose wird einfach mittels der Erscheinung der verheilten Herpesverletzungen und der Geschichte des Patienten gestellt. Der Schmerz ist intensiv und emotional störend. Posttherapeutische Neuralgie kann überall auftreten aber meist im Thorax.
Ein 76 Jahre alter Mann zeigt einen Schmerz vom posttherapeutischen Typ. Der Schmerz ist in der Abdomenregion lokalisiert. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion von zwischen etwa 50 Einheiten und 200 Einheiten Botulinumtoxintyp A subkutan in die abdominale Region behandelt. Innerhalb von 1-7 Tagen nach der Neurotoxinverabreichung ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate.
Beispiel 4
Periphere Verabreichung eines Neurotoxins, um Nasopharyngealtumorschmerz zu behandeln
Diese Tumoren, meistens schwammförmige Zellkarzinome, sind gewöhnlich in der Rosenmuller-Fossa und können in die Basis des Schädels eindringen. Schmerz im Gesicht ist häufig. Er hat eine konstante, dumpfschmerzende Natur.
Ein 35 Jahre alter Mann zeigt Schmerz vom Nasopharyngealtumortyp. Der Schmerz wird in der unteren linken Wange angegeben. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion von zwischen etwa 10 Einheiten und etwa 35 Einheiten Botulinumtoxintyp A intramuskulär in die Wange behandelt. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach Neurotoxinverabreichung ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate.
Beispiel 5
Periphere Verabreichung eines Neurotoxins, um chronischen Entzündungsschmerz zu behandeln
Ein Patient, Alter 45, zeigt chronischen Entzündungsschmerz in der Brustregion. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion von zwischen etwa 50 Einheiten und 200 Einheiten intramuskulärem Botulinumtoxintyp A behandelt. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach Neurotoxinverabreichung ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate.
Beispiel 6
Periphere Verabreichung eines Neurotoxins, um durch Verbrennungen verursachten Schmerz zu behandeln
Ein Patient, Alter 51, erlebt Schmerz anschließend an schwere und umfassende Verbrennungen 1. oder 2. Grades am Arm. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion von zwischen 30 Einheiten bis etwa 200 Einheiten Botulinumtoxintyp A subkutan in den Arm behandelt. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach Neurotoxinverabreichung ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monaten.
Beispiel 7
Periphere Verabreichung eines Neurotoxins, um Gelenkschmerz zu behandeln
Ein Patient, Alter 63, leidet an Gelenkschmerz, resultierend von Arthritis. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion von zwischen etwa 30 Einheiten und 150 Einheiten intramuskulärem Botulinumtoxintyp A in die Region des schmerzenden Gelenks behandelt. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach Neurotoxinverabreichung ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate.
Beispiel 8
Periphere Verabreichung eines Neurotoxins, um postoperativen Schmerz zu behandeln.
Einem Patienten, Alter 39, werden 1 Stunde bis zu 10 Tagen vor der Operation lokal und peripher durch Bolusinjektion oder subkutane Injektion etwa 20 Einheiten bis etwa 300 Einheiten eines Botulinumtoxins, wie eines Botulinumtoxintyps A, an oder in der Nähe der Stelle eines prospektiven Schnitts in die Dermis des Patienten verabreicht. Die Botulinumtoxininjektion kann subkutan oder intramuskulär sein. Die Operation wird nicht durchgeführt, um eine Muskelstörung, wie einen hyperaktiven oder hypertonen Muskel, zu behandeln oder zu lindern. Die Dauer der signifikanten Linderung des postoperativen Schmerzes beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate.
Beispiel 9
Behandlung von Visceralschmerz durch Verabreichung eines Neurotoxins
Ein männlicher Patient, Alter 46, stellt sich mit chronischem Abdominalschmerz von visceralem Ursprung aber von unbekannter Etiologie vor. Als Hypothese werden ein Tumor oder eine Röhrenverengung angenommen. Subkutanes oder Intraorganbotuliniumtoxin, wie von etwa 20 Einheiten bis etwa 300 Einheiten Botulinumtoxintyp A, werden subkutan oder in das Organ (an der Stelle des wahrgenommenen Schmerzes) verabreicht. Innerhalb von ein bis sieben Tagen ist der Schmerz wesentlich gelindert. Die Dauer der signifikanten Schmerzlinderung beträgt etwa 2 bis etwa 6 Monate.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Aspekte beschrieben wurde, sind andere Ausführungsformen, Versionen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung möglich. Zum Beispiel kann eine große Vielzahl an Neurotoxinen wirksam in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zusätzlich erlaubt die vorliegende Erfindung periphere Verabreichungsmethoden, um nicht mit Muskelstörungen verbundenen Schmerz zu lindern, wobei zwei oder mehr Neurotoxine, wie zwei oder mehr Botulinumtoxine, gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden. Zum Beispiel kann Botulinumtoxintyp A verabreicht werden, bis die klinischen Antwort verloren geht oder sich neutralisierende Antikörper entwickeln, gefolgt von der Verabreichung von Botulinumtoxintyp E. Alternativ kann eine Kombination von jeweils zwei oder mehreren der Botulinumtoxinserotypen A bis G lokal verabreicht werden, um den Beginn und die Dauer des gewünschten therapeutischen Ergebnisses zu steuern. Ferner können Nicht-Neurotoxinverbindungen vor, gleichzeitig mit oder anschließend an die Verabreichung des Neurotoxins verabreicht werden, um Begleitwirkungen, wie einen gesteigerten oder schnelleren Beginn der Denervierung, bereitzustellen, bevor das Neurotoxin, wie ein Botulinumtoxin, beginnt seine therapeutische Wirkung zu zeigen.

Claims

Verwendung von Botulinumtoxin für die Herstellung eines Medikaments zur peripher wirkenden Verabreichung an einen Säuger, wobei das Medikament zur Behandlung von Schmerzen, die weder mit Muskelkrämpfen noch Kopfschmerzen verbunden sind, nützlich ist, worin das Botulinumtoxin eine neuronale Bindungsstelle umfaßt, die für das Botulinumtoxin nativ ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Botulinumtoxin aus der Gruppe bestehend aus den Botulinumtoxin-Typen A, B, C₁, D, E, F und G ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Botulinumtoxin Botulinumtoxin-Typ A ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Botulinum ein modifiziertes Botulinumtoxin mit zumindest einer entfernten, modifizierten oder ersetzten Aminosäure ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Botulinumtoxin zumindest teilweise durch ein rekombinantes Verfahren hergestellt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Botulinumtoxin in einer Menge zwischen etwa 0,01 U/kg und etwa 35 U/kg verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Schmerz zwischen etwa 1 Monat und etwa 6 Monaten wesentlich gelindert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die peripher wirkende Verabreichung vor dem Beginn eines von dem Säuger wahrgenommenen schmerzvermittelnden Ereignisses oder Syndroms durchgeführt werden soll.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die peripher wirkende Verabreichung anschließend an den Beginn eines von dem Säuger wahrgenommenen schmerzvermittelnden Ereignisses durchgeführt werden soll.
Verwendung von Botulinumtoxin-Typ A für der Herstellung eines Medikaments zur peripher wirkenden Verabreichung an einen Säuger, wobei das Medikament zur Behandlung von Schmerzen, die weder mit Muskelkrämpfen noch Kopfschmerzen verbunden sind, nützlich ist, worin das Botulinumtoxin-Typ A eine neuronale Bindungsstelle umfaßt, die für das Botulinumtoxin nativ ist.
Verwendung von Botulinumtoxin-Typ B für der Herstellung eines Medikaments zur peripher wirkenden Verabreichung an einen Säuger, wobei das Medikament zur Behandlung von Schmerzen, die weder mit Muskelkrämpfen noch Kopfschmerzen verbunden sind, nützlich ist, worin das Botulinumtoxin-Typ B eine neuronale Bindungsstelle umfaßt, die für das Botulinumtoxin nativ ist.