DE60129598T2

DE60129598T2 - Immunoassays für anti-hcv-antikörper

Info

Publication number: DE60129598T2
Application number: DE60129598T
Authority: DE
Inventors: David Y. Alamo Chien; Phillip Oakland ARCANGEL; Laura San Leandro TANDESKE; Carlos Walnut Creek GEORGE-NASCIEMENTO; Doris Petaluma COIT; Angelica San Francisco MEDINA-SELBY
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2021-06-15
Also published as: US6797809B2; CA2412035A1; US7319144B2; WO2001096875A2; BRPI0111682B8; WO2001096870A2; DE60125240D1; MXPA02012401A; HUP0500444A3; CY1107537T1; CN1466682A; ATE368221T1; BRPI0111731B8; EP1350105A2; US20040096822A1; JP2004506878A; WO2001096875A9; SI1354204T2; DK1354204T4; CY1106820T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die virale Diagnose. Die Erfindung betrifft insbesondere Immunassays, die mehrere HCV-Antigene verwenden, für die genaue Diagnose einer Infektion mit Hepatitis-C-Virus.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis-C-Virus (HCV) ist die Hauptursache einer parenteralen Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis (NANBH), die größtenteils durch Transfusion von Körperblut und Austausch von Körperflüssigkeit übertragen wird. Das Virus ist in 0,4 bis 2% der allgemeinen Population der Vereinigten Staaten vorhanden. Eine chronische Hepatitis entwickelt sich in etwa 50% der Infektionen, von denen ungefähr 20% der infizierten Individuen eine Leberzirrhose entwickeln, welche manchmal zu einem hepatozellulären Karzinom führt. Demgemäß ist die Untersuchung und die Kontrolle dieser Erkrankung von medizinischer Bedeutung.
HCV wurde erstmals von Houghton et al. identifiziert und als eine Ursache von NANBH charakterisiert. Die virale genomische Sequenz von HCV sowie Verfahren zur Gewinnung dieser Sequenz sind bekannt. Siehe beispielsweise internationale Veröffentlichungen Nr. WO 89/04669 ; WO 90/11089 und WO 90/14436 . HCV weist ein einzelsträngiges RNA-Genom mit positiver Polarität auf und ist ein Mitglied der Virusfamilie der Flaviridae. Mindestens sechs verschiedene Genotypen von HCV, die jedoch miteinander verwandt sind, wurden auf Basis von phylogenetischen Analysen identifiziert (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74:2391-2399). Das Virus kodiert für ein einzelnes Polyprotein mit mehr als 3000 Aminosäureresten (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Han et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:1711-1715). Das Polyprotein wird cotranslational und post-translational sowohl in strukturelle als auch in nicht-strukturelle (NS) Proteine prozessiert.
Wie in 1 gezeigt ist, werden mehrere Proteine durch das HCV-Genom kodiert. Die Reihenfolge und Nomenklatur der Spaltprodukte des HCV-Polyproteins sind wie folgt: NH₂-C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Die anfängliche Spaltung des Polyproteins wird durch Proteasen des Wirts katalysiert, die drei Strukturproteine freisetzen, das N-terminale Nukleocapsid-Protein (als "Core" bezeichnet) sowie zwei Glykoproteine der Hülle, "E1" (auch als E bekannt) und "E2" (auch als E2/NS1 bekannt), und nicht-strukturelle (NS) Proteine, die die viralen Enzyme enthalten. Die NS-Regionen werden als NS2, NS3, NS4, NS4a, NS4b, NS5a und NS5b bezeichnet. NS2 ist ein integrales Membranprotein mit proteolytischer Aktivität. NS2 spaltet entweder allein oder in Kombination mit NS3 die NS2-NS3-Bindung, was wiederum den N-Terminus von NS3 erzeugt und ein großes Polyprotein freisetzt, das sowohl eine Serinproteaseaktivität als auch eine RNA-Helicaseaktivität umfasst. Die NS3-Protease dient dazu, das verbleibende Polyprotein zu prozessieren. Die Komplettierung der Polyprotein-Reifung wird durch die autokatalytische Spaltung der NS3-NS4a-Verbindung ausgelöst, welche durch die NS3-Serinprotease katalysiert wird. Die nachfolgenden, von NS3 vermittelten Spaltungen des HCV-Polyproteins scheinen die Erkennung von Spaltverbindungen des Polyproteins durch ein NS3-Molekül eines anderen Polypeptids zu umfassen. In diesen Reaktionen setzt NS3 einen NS3-Cofaktor (NS4a), NS4b und NS5a (NSA5a weist eine Phosphorylierungsfunktion auf) frei, sowie eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5b).
Mehrere allgemeine und spezifische Polypeptide, die vom HCV-Polyprotein abgeleitet sind und die als immunologische und diagnostische Reagenzien für HCV nützlich sind, wurden be schrieben. Siehe beispielsweise Houghton et al., Europäische Veröffentlichungen Nr. 318,216 und 388,232 ; Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Houghton et al., Hepatology (1991)14:381-388; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:S.33-39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365 ; Chien, D.Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778 . Diese Veröffentlichungen stellen einen umfangreichen Hintergrund in Bezug auf HCV im allgemeinen sowie auf die Herstellung und Verwendung von HCV-Polypeptiden als immunologische Reagenzien bereit.
Empfindliche spezifische Verfahren für das Screening und für die Identifizierung von HCV-Trägern und von Blut oder Blutprodukten, das (die) mit HCV kontaminiert ist (sind), würden einen wichtigen Fortschritt in der Medizin darstellen. Eine Posttransfusionshepatitis (PTH) tritt in ungefähr 10% der Patienten auf, die einer Transfusion unterzogen wurden, und HCV machte bis zu 90% dieser Fälle aus. Die Patientenversorgung sowie die Vermeidung einer Verbreitung von HCV durch Blut oder Blutprodukte oder durch engen persönlichen Kontakt erfordern verläßliche diagnostische und prognostische Mittel. Demgemäß sind mehrere Assays für die Serodiagnose einer HCV-Infektion entwickelt worden. Siehe beispielsweise Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Kuo et al., Science (1989) 244:362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling et al., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel et al., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel et al., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778 ; Valenzuela et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 und Kashiwakuma et al., US-Patent Nr. 5,871,904 .
Ein bedeutendes Problem von einigen Assays, die auf Serum basieren, besteht darin, dass es eine signifikante Lücke zwischen Infektion und Virus-Nachweis gibt, die oftmals 80 Tage überschreitet. Diese Assay-Lücke kann zu einem hohen Risiko für Empfänger einer Bluttransfusion führen. Um dieses Problem zu beheben, sind Tests auf Basis von Nukleinsäuren (nucleic acid-based tests, NAT) entwickelt worden, welche die virale RNA direkt nachweisen, sowie HCV-Core-Antigentests, welche auf das virale Antigen abstellen, und nicht auf eine Antikörperantwort. Siehe beispielsweise Kashiwakuma et al., US-Patent Nr. 5,871,904 ).
Es bleibt jedoch ein Bedürfnis nach empfindlichen, genauen diagnostischen und prognostischen Mitteln, um eine geeignete Patientenversorgung bereitzustellen und die Ausbreitung von HCV durch Blut und Blutprodukte oder durch engen persönlichen Kontakt zu vermeiden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Erkenntnis, dass die Verwendung von NS3/4a-Konformationsepitopen in Kombination mit Mehr-Epitop-Fusionsantigenen ein empfindliches und verläßliches Verfahren zum Nachweis einer frühen HCV-Serokonversion bereitstellt. Die vorliegend beschriebenen Assays können darüber hinaus HCV-Infektionen nachweisen, die von irgendeinem der sechs bekannten Genotypen von HCV verursacht wurden. Die Verwendung von Mehr-Epitop-Fusionsproteinen hat den zusätzlichen Vorteil, dass Maskierungsprobleme verringert werden, dass die Sensitivität beim Nachweis von Antikörpern verbessert wird, indem eine größere Anzahl von Epitopen auf einer einheitlichen Fläche des Substrates ermöglicht wird, und dass die Selektivität verbessert wird.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen festen Immunassay-Träger, der im wesentlichen aus mindestens einem NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und einem Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht, die daran gebunden sind, wobei das NS3/4a-Epitop und/oder das Mehr-Epitop-Fusionsantigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagieren, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
Das NS3/4a-Epitop kann die in den 3A bis 3D dargestellte Aminosäuresequenz umfassen, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser, oder mit 90% Sequenzidentität zu dieser, oder mit mindestens 98% Sequenzidentität zu dieser, oder einem Zahlenwert dazwischen, solange die Sequenz eine Proteaseaktivität aufweist. In einigen Ausführungsformen besteht das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A bis 3D dargestellten Aminosäuresequenz.
In weiteren Ausführungsformen umfasst das Mehr-Epitop-Fusionsantigen die in den 5A bis 5F dargestellte Aminosäuresequenz, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser, oder mit 90% Sequenzidentität zu dieser, oder mit mindestens 98% Sequenzidentität zu dieser, oder einem Zahlenwert dazwischen, solange die Sequenz spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind. In einigen Ausführungsformen besteht das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A bis 5F dargestellten Aminosäuresequenz.
In einer noch weiteren Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein festen Immunassay-Träger, der im wesentlichen aus mindestens einem NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und einem Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht, die dar an gebunden sind, wobei das NS3/4a-Konformationsepitop die in den 3A bis 3D dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser umfasst, welche Proteaseaktivität aufweist, und wobei das Mehr-Epitop-Fusionsantigen die in den 5A bis 5F dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser umfasst, die spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern regiert, welche in der Probe eines mit HCV infizierten Individuums vorhanden sind. In bestimmten Ausführungsformen weisen das NS3/4a-Konformationsepitop und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen mindestens 90%, 98% Sequenzidentität (oder einen Zahlenwert dazwischen) zu den Aminosäuresequenzen der 3A bis 3D bzw. 5A bis 5F auf, solange die NS3/4a-Sequenz eine Proteaseaktivität aufweist und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe eines mit HCV infizierten Individuums vorhanden sind. In einigen Ausführungsformen besteht das NS3/4a-Konformationsepitop aus der Aminosäuresequenz, die in den 3A bis 3D dargestellt ist, und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht aus der Aminosäuresequenz, die in den 5A bis 5F dargestellt ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen festen Immunassay-Träger, der im wesentlichen aus mindestens einem NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und einem Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht, die daran gebunden sind, wobei das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A bis 3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht, und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A bis 5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, bei dem man:

(a) einen wie oben beschriebenen festen Immunassay-Träger bereitstellt;
(b) eine biologische Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen kombiniert, die es HCV-Antikörpern - sofern diese in der biologischen Probe vorhanden sind - erlauben, an das NS3/4a-Epitop und/oder an das Mehr-Epitop-Fusionsantigen zu binden, wobei ein erster Immunkomplex gebildet wird;
(c) zu dem festen Träger von Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen einen nachweisbar markierten Antikörper gibt, wobei der markierte Antikörper mit dem Immunkomplex reaktiv ist;
(d) zweite Immunkomplexe, die sich aus dem nachweisbar markierten Antikörper und dem ersten Immunkomplex gebildet haben, sofern diese vorhanden sind, in der biologischen Probe als Hinweis auf eine HCV-Infektion nachweist.

In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, bei dem man:

(a) einen festen Immunassay-Träger bereitstellt, der im wesentlichen aus mindestens einem NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und einem Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht, die daran gebunden sind, wobei das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A bis 3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht, und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A bis 5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht;
(b) eine biologische Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen kombiniert, die es HCV-Antikörpern - sofern diese in der biologischen Probe vorhanden sind - erlauben, an das NS3/4a-Epitop und/oder an das Mehr-Epitop-Fusionsantigen zu binden, wobei ein erster Immunkomplex gebildet wird;
(c) zu dem festen Träger von Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen einen nachweisbar markierten Antikörper gibt, wobei der markierte Antikörper mit dem Immunkomplex reaktiv ist;
(d) zweite Immunkomplexe, die sich aus dem nachweisbar markierten Antikörper und dem ersten Immunkomplex gebildet haben, sofern diese vorhanden sind, in der biologischen Probe als Hinweis auf eine HCV-Infektion nachweist.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein immundiagnostisches Testkit, das einen wie oben beschriebenen festen Immunassay-Träger sowie Instruktionen zur Durchführung des immundiagnostischen Tests umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines festen Immunassay-Trägers, bei dem man:

(a) einen festen Träger bereitstellt; und
(b) mindestens ein NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und ein Mehr-Epitop-Fusionsantigen an den festen Träger bindet, wobei das NS3/4a-Epitop und/oder das Mehr-Epitop-Fusionsantigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagieren, die in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.

In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Konformationsepitop die in den 3A bis 3D dargestellte Aminosäuresequenz, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser, oder mit 90% Sequenzidentität zu dieser, oder mit mindestens 98% Sequenzidentität zu dieser, oder einem Zahlenwert dazwischen, solange die Sequenz eine Proteaseaktivität aufweist; und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen umfasst die in den 5A bis 5F dargestellte Aminosäuresequenz, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser, oder mit 90% Sequenzidentität zu dieser, oder mit mindestens 98% Sequenzidentität zu dieser, oder einem Zahlenwert dazwischen, solange die Sequenz spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, die in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
In einer noch weiteren Ausführungsform besteht das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A bis 3D dargestellten Aminosäuresequenz, und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht aus der in den 5A bis 5F dargestellten Aminosäuresequenz.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines festen Immunassay-Trägers, bei dem man:

(a) einen festen Träger bereitstellt; und
(b) mindestens ein NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und ein Mehr-Epitop-Fusionsantigen an den festen Träger bindet, wobei das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A bis 3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht, und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A bis 5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht.

In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Mehr-Epitop-Fusionsantigen, das die in den 5A bis 5F dargestellte Aminosäuresequenz umfasst, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80% Sequenzidentität zu dieser, oder mit 90% Sequenzidentität zu dieser, oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 98% Sequenzidentität zu dieser, oder einem beliebigen Zahlenwert dazwischen, wobei die Sequenz spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
In bestimmten Ausführungsformen besteht das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A bis 5F dargestellten Aminosäuresequenz.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Polynukleotid, das eine für ein Mehr-Epitop-Fusionsantigen kodierende Sequenz umfasst, einen rekombinanten Vektor, der das Polynukleotid und Kontrollelemente umfasst, die in funktionsfähiger Weise mit dem Polynukleotid verknüpft sind, wodurch die kodierende Sequenz in einer Wirtszelle transkribiert und translatiert werden kann, eine Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Mehr-Epitop-Fusionsantigens, bei dem man eine Population der oben beschriebenen Wirtszellen bereitstellt, und diese Population aus Zellen unter Bedingungen kultiviert, bei denen das Mehr-Epitop-Fusionsantigen, das von der kodierenden Sequenz kodiert wird, welche in dem rekombinanten Vektor vorhanden ist, exprimiert wird.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden durch Bezugnahme auf die nachfolgende, ausführliche Beschreibung und die anliegenden Zeichnungen offensichtlich werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Diagrammdarstellung des HCV-Genoms, welche die verschiedenen Regionen des Polyproteins darstellt, von denen die vorliegenden Assay-Reagenzien (Proteine und Antikörper) abgeleitet sind.
2 ist eine schematische Darstellung eines repräsentativen Immunassays gemäß der vorliegenden Erfindung.
3A bis 3D zeigen die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz eines repräsentativen NS3/4a-Konformationsantigens für die Verwendung in den vorliegenden Assays. Die Aminosäuren an den Positionen 403 und 404 der 3A bis 3D entsprechen einem Austausch von Thr gegen Pro und Ser gegen Ile in der nativen Aminosäuresequenz von HCV-1.
4 ist eine Diagrammdarstellung von MEFA 7.1.
5A bis 5F zeigen die DNA-Sequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von MEFA 7.1.
6A bis 6C zeigen repräsentative MEFAs zur Verwendung mit dem vorliegenden Immunassays. Die 6A ist eine Diagrammdarstellung von MEFA 3. Die 6B ist eine Diagrammdarstellung von MEFA 5. Die 6C ist eine Diagrammdarstellung von MEFA 6.
7A bis 7D sind Darstellungen der Konstruktion von psMEFA7.
8 ist eine Darstellung der Konstruktion von psMEFA7.1.
9 ist eine Darstellung der Konstruktion von pd.HCV1a.ns4aPI.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird - sofern nicht anderweitig angegeben - herkömmliche Verfahren der Chemie, Biochemie, Gentechnik und Immunologie umfassen, die im Bereich des durchschnittlichen Fachwissen liegen. Solche Verfahren sind ausführlich in der Literatur beschrieben (siehe beispielsweise Fundamental Virology, 2. Auflage, Vol. I & II (B.N. Fields und D.M. Knipe, Hrsg.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell Hrsg., Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan Hrsg., Academic Press, Inc.).
Es ist anzumerken, dass in der vorliegenden Beschreibung und in den anliegenden Ansprüche, die Singularformen "ein/eine/einer" sowie "das/die/der" die Bezugnahme auf den Plural umfassen, sofern der Inhalt nicht eindeutig auf anderes verweist. Somit umfasst beispielsweise die Bezugnahme auf "ein Antigen" eine Mischung aus zwei oder mehr Antigenen, usw.

Die folgenden Aminosäure-Abkürzungen werden im Rahmen des Textes verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Asparagin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gin (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)
Tyrosin: Tyr (Y)	Valin: Val (V)

I. Definitionen
Im Rahmen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Begriffe verwendet, und diese sollen wie nachstehend angegeben definiert sein.
Die Begriffe "Polypeptid" und "Protein" betreffen ein Polymer aus Aminosäureresten und sind nicht auf eine minimale Länge des Produkts beschränkt. Somit umfasst diese Definition Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und ähnliches. Sowohl Proteine vollständiger Länge als auch Fragmente derselben sind von dieser Definition umfasst. Die Begriffe umfassen ferner nach der Expression erfolgende Modifikationen der Polypeptide, beispielsweise Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und ähnliches. Darüber hinaus betrifft ein "Polypeptid" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein Protein, das Modifikationen, wie beispielsweise Deletionen, Additionen und Substitutionen (im allgemeinen konservativer Art) in Bezug auf die native Sequenz umfasst, so lange das Protein die erwünschte Aktivität beibehält. Diese Modifikationen können freiwillig sein, wie beispielsweise durch zielgerichtete Mutagenese, oder sie können unbeabsichtigt sein, wie beispielsweise durch Muta tionen von Wirten, welche die Proteine erzeugen, oder durch Fehler bei der PCR-Amplifikation.
Ein HCV-Polypeptid ist ein wie oben definiertes Polypeptid, das von dem HCV-Polyprotein abgeleitet ist. Das Polypeptid braucht nicht im physikalischen Sinn von HCV abgeleitet sein, sondern es kann synthetisch oder rekombinant hergestellt sein. Des weiteren kann das Polypeptid von einem beliebigen der verschiedenen HCV-Stämme und HCV-Isolate abgeleitet sein, wie beispielsweise (jedoch nicht beschränkt auf) ein beliebiges Isolat von den Stämmen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 von HCV. Mehrere konservierte und variable Regionen sind zwischen diesen Stämmen bekannt, und im allgemeinen werden die Aminosäuresequenzen der aus diesen Regionen abgeleiteten Epitope einen hohen Grad an Sequenzhomologie aufweisen, z.B. eine Aminosäuresequenzhomologie von mehr als 30%, vorzugsweise mehr als 40%, wenn die beiden Sequenzen in einem Alignment miteinander verglichen werden. Somit bezeichnet der Begriff "NS3/4a"-Polypeptid beispielsweise das native NS3/4a von einem beliebigen der verschiedenen HCV-Stämme sowie auch NS3/4a Analoge, Muteine und immunogene Fragmente, wie sie nachfolgend weiter beschrieben wird. Die vollständigen Genotypen zahlreicher dieser Stämme sind bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 6,150,087 und Genbank-Zugriffsnummern AJ238800 und AJ238799.
Die Begriffe "Analog" und "Mutein" bezeichnen biologisch aktive Derivate der Referenzmoleküle oder Fragmente solcher Derivate, welche die gewünschte Aktivität beibehalten, wie beispielsweise die Immunreaktivität in den nachfolgend beschriebenen Assays. Im allgemeinen bezeichnet der Begriff "Analog" Verbindungen mit einer nativen Polypeptidsequenz und Struktur, die eine oder mehrere Aminosäureadditionen, Aminosäuresubstitutionen (im allgemeinen konservativer Art) und/oder Aminosäuredeletionen in Bezug auf das native Molekül aufweisen, solange die Modifikationen die immunogene Aktivität nicht zerstören. Der Begriff "Mutein" bezeichnet Peptide, die ein oder mehrere Peptidmimetika aufweisen ("Peptoide"), wie beispielsweise diejenigen, die in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 91/04282 beschrieben sind. Vorzugsweise weist das Analog oder Mutein mindestens die gleiche Immunaktivität wie das native Molekül auf. Verfahren zur Herstellung von Polypeptid-Analoga und Polypeptid-Muteinen sind im Stand der Technik bekannt und werden im folgenden genauer beschrieben.
Besonders bevorzugte Analoga umfassen Substitutionen, die konservativer Art sind, d.h. solche Substitutionen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren vorkommen, welche hinsichtlich ihrer Seitenketten miteinander verwandt sind. Aminosäuren werden im allgemeinen insbesondere in vier Familien eingeteilt: (1) saure - Aspartat und Glutamat; (2) basische - Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht-polare - Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin und Tryptophan; und (4) ungeladene polare - Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden zuweilen als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Beispielsweise ist es vernünftigerweise vorhersagbar, dass ein isolierter Austausch von Leucin gegen Isoleucin oder Valin, von Aspartat gegen Glutamat, von Threonin gegen Serin, oder ein ähnlicher konservativer Austausch einer Aminosäure gegen eine strukturell verwandte Aminosäure, keine wesentliche Wirkung auf die biologische Aktivität haben wird. Beispielsweise kann das Polypeptid von Interesse bis zu etwa 5 bis 10 konservative oder nicht-konservative Aminosäureaustausche aufweisen, oder sogar bis zu etwa 15 bis 25 konservative oder nicht-konservative Aminosäureaustausche, oder eine beliebige Zahl zwischen 5 bis 25, solange die erwünschte Funktion des Moleküls intakt bleibt. Der Fachmann kann problemlos Regionen des Moleküls von Interesse bestimmen, die eine Veränderung tolerieren, indem auf Hopp/Woods- und Kyte-Doolittle- Plots zurückgegriffen wird, die im Stand der Technik bekannt sind.
Mit "Fragment" ist ein Polypeptid gemeint, das lediglich aus einem Teil einer intakten Polypeptidsequenz und -struktur vollständiger Länge besteht. Das Fragment kann eine C-terminale Deletion und/oder eine N-terminale Deletion eines nativen Polypeptids umfassen. Ein "immunogenes Fragment" eines bestimmten HCV-Proteins wird üblicherweise mindestens etwa 5 bis 10 zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls vollständiger Länge umfassen, vorzugsweise mindestens etwa 15 bis 25 zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls vollständiger Länge, und besonders bevorzugt mindestens etwa 20 bis 50 oder mehr zusammenhängende Aminosäurereste des Moleküls vollständiger Länge, die ein Epitop definieren, oder eine beliebige Anzahl zwischen 5 Aminosäuren und der Sequenz vollständiger Lange, vorausgesetzt, dass das in Frage stehende Fragment seine Immunreaktivität in den nachfolgend beschriebenen Assays beibehält. Beispielsweise umfassen bevorzugte immunogene Fragmente (sind jedoch nicht beschränkt auf) Fragmente von HCV-Core, welche beispielsweise die Aminosäuren 10-45, 10-53, 67-88 und 120-130 des Polyproteins umfassen, Epitop 5-1-1 (in der NS4a/NS4b-Region des viralen Genoms), sowie auch definierte Epitope, die von einer beliebigen der anderen Regionen des in 1 gezeigten Polypeptids abgeleitet sind, wie beispielsweise (nicht einschränkend) von den Regionen E1, E2, NS3 (z.B. Polypeptid c33c aus der NS3-Region), NS4 (z.B. Polypeptid c100 aus der NS3/NS4-Region), NS3/4a und NS5 des HCV-Polyproteins, sowie ein beliebiges der verschiedenen Epitope, die ausgehend vom HCV-Polyprotein definiert wurden. Siehe beispielsweise Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Heptatol. (1993) 8:S33-39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365 ; Chien D.Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778 ; US-Patent Nrn. 6,150,087 und 6,121,020 .
Der Begriff "Epitop" bezeichnet wie vorliegend verwendet eine Sequenz aus mindestens etwa 3-5, vorzugsweise etwa 5-10 oder 15, und nicht mehr als 1000 Aminosäuren (oder eine beliebige Zahl dazwischen), die eine Sequenz definieren, welche allein oder als Teil einer größeren Sequenz an einen Antikörper bindet, der als Antwort auf eine solche Sequenz erzeugt wurde. Es gibt keine kritische Obergrenze im Hinblick auf die Länge des Fragments, das annähernd die vollständige Länge der Proteinsequenz umfassen kann, oder sogar ein Fusionsprotein, welches zwei oder mehr Epitope aus dem HCV-Polyprotein umfasst. Ein Epitop zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist nicht auf ein Polypeptid beschränkt, das die exakte Sequenz des Teils des Ausgangsproteins aufweist, von dem es abgeleitet ist. Tatsächlich sind virale Genome im Zustand dauerhafter Veränderungen und umfassen einige variable Domänen, die einen verhältnismäßig hohen Grad an Variabilität zwischen den Isolaten aufweisen. Somit umfasst der Begriff "Epitop" Sequenzen, die identisch zu der nativen Sequenz sind, sowie Modifikationen der nativen Sequenz, wie beispielsweise Deletionen, Additionen oder Substitutionen (im allgemeinen konservativer Art).
Regionen eines gegebenen Polypeptids, die ein Epitop umfassen, können unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Verfahren zur Kartierung von Epitopen identifiziert werden, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Siehe beispielsweise Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Hrsg., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Beispielsweise können lineare Epitope bestimmt werden, indem man gleichzeitig eine große Anzahl von Peptiden auf festen Trägern synthetisiert, wobei die Peptide Teilen des Proteinmoleküls entsprechen, und die Peptide mit Antikörpern reagieren läßt, wobei die Peptide weiterhin an die Träger gebunden sind. Solche Verfahren sind bekannt und werden im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise in US-Patent Nr. 4,708,871 ; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. Unter Verwendung dieser Verfahren sind eine Reihe von HCV-Epitope identifiziert worden. Siehe beispielsweise Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994), Seiten 320-324 sowie nachstehend. Auf ähnliche Weise werden problemlos Konformationsepitope identifiziert, indem man die räumliche Konformation von Aminosäuren bestimmt, beispielsweise durch Röntgen-Kristallographie und zweidimensionale nukleare Magnetresonanz. Siehe beispielsweise Epitope Mapping Protocols, oben angegeben. Antigene Regionen von Proteinen können darüber hinaus unter Verwendung von standardmäßigen Antigenitätsplots und Hydrophobizitätsplots identifiziert werden, wie beispielsweise mit denjenigen, die z.B. das Omegaversion 1.0-Softwareprogramm verwenden, das von der Oxford Molecular Group verfügbar ist. Dieses Computerprogramm verwendet das Verfahren nach Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824-3828 für die Bestimmung des Antigenitätsprofils und die Kyte-Doolittle-Methode (Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 für die Hydrophobizitätsplots.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Konformationsepitop" einen Teil eines Proteins vollständiger Länge, oder eines Analogs oder eines Muteins davon, das strukturelle Eigenschaften aufweist, die nativ in Bezug auf die Aminosäuresequenz sind, welche das Epitop innerhalb des natürlichen Proteins vollständiger Länge kodiert. Native strukturelle Eigenschaften umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Glykosylierung und dreidimensionale Struktur. Die Länge der Epitopdefinierenden Sequenz kann einer großen Vielzahl von Veränderungen unterliegen, da man annimmt, dass diese Epitope durch die dreidimensionale Form des Antigens gebildet werden (z.B. Faltung). Somit kann es sich bei den Aminosäuren, die das Epitop definieren, um eine verhältnismäßig geringe Anzahl han deln, die jedoch weit über die Länge des Moleküls verteilt sein können, wobei diese über Faltung in die korrekte Epitop-Konformation gebracht werden. Die Teile des Antigens zwischen den Resten, die das Epitop definieren, können für die Konformationsstruktur des Epitops unbedeutend sein. Beispielsweise ist es möglich, dass Deletionen oder Substitutionen dieser zwischenliegenden Sequenzen das Konformationsepitop nicht beeinflussen, vorausgesetzt, dass die für die Konformation des Epitops entscheidenden Sequenzen beibehalten werden (z.B. Cysteine, die an der Disulfidbindung beteiligt sind, Glykosylierungstellen, usw.).
Konformationsepitope, die in der NS3/4a-Region vorhanden sind, werden problemlos unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren identifiziert. Darüber hinaus kann das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Konformationsepitops in einem gegebenen Polypeptid problemlos durch Screening des Antigens von Interesse mit einem Antikörper (polyklonales Serum oder monoklonaler Antikörper gegen das Konformationsepitop) und Vergleich der Reaktivität mit der einer denaturierten Version des Antigens, das lediglich lineare Epitope (sofern vorhanden) beibehält, bestimmt werden. In einem solchen Screening unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern kann es vorteilhaft sein, das polyklonale Serum zunächst mit dem denaturierten Antigen zu absorbieren, und abzuwarten, ob es Antikörper gegen das Antigen von Interesse zurückhält. Darüber hinaus wird im Falle von NS3/4a ein Molekül, das die native Konformation erhält, auch eine Protease- und eventuell eine Helicase-Enzymaktivität aufweisen. Solche Aktivitäten können unter Verwendung von enzymatischen Assays nachgewiesen werden, wie sie im folgenden beschrieben werden.
Ein Konformationsepitop wird vorzugsweise rekombinant hergestellt und wird in einer Zelle exprimiert, aus der es unter Bedingungen extrahierbar ist, welche die gewünschten struktu rellen Eigenschaften beibehalten, z.B. ohne Denaturierung der Epitope. Solche Zellen umfassen Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen. Die Expression und Isolierung von rekombinanten Konformationsepitopen des HCV-Polyproteins wird beispielsweise in den internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 96/04301 , WO 94/01778 , WO 95/33053 , WO 92/08734 beschrieben. Alternativ dazu ist es möglich, die Antigene zu exprimieren und ferner das Protein nach der Gewinnung zu denaturieren. Es ist ferner verständlich, dass die chemische Synthese darüber hinaus Mimitope eines Konformationsantigens bereitstellen kann, die mit dem "nativen" Konformationsepitop des Antigens kreuzreagieren können.
Der Begriff "Mehr-Epitop-Fusionsantigen" oder "MEFA" bezeichnet wie vorliegend verwendet ein Polypeptid, in dem mehrere HCV-Antigene Teil einer einzelnen zusammenhängenden Kette von Aminosäuren sind, wobei die Kette in der Natur nicht vorkommt. Die HCV-Antigene können direkt über Peptidbindungen miteinander verbunden sein, oder sie können durch zwischenliegende Aminosäuresequenzen voneinander getrennt sein. Die Fusions-Antigene können darüber hinaus Sequenzen umfassen, die in Bezug auf das HCV-Polyprotein exogen sind. Darüber hinaus können die vorhandenen HCV-Sequenzen aus mehreren Genotypen und/oder Isolaten von HCV stammen. Beispiele für bestimmte MEFAs zur Verwendung in den vorliegenden Immunassays werden beispielsweise in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 angegeben und sind im folgenden genauer beschrieben.
Ein "Antikörper" bezeichnet ein Molekül, das durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an ein Polypeptid von Interesse bindet. So ist beispielsweise ein HCV-Core-Antikörper ein Molekül, das spezifisch an das HCV-Core-Protein bindet. Der Begriff "Antikörper" umfasst wie vorliegend verwendet Antikörper, die sowohl von polyklonalen als auch von monoklonalen Zubereitungen erhalten werden sowie auch die folgenden: hybride (chimäre) Antikörpermoleküle (siehe beispielsweise Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; und US-Patent Nr. 4,816,567 ); F(ab')₂- und F(ab)-Fragmente; Fv-Moleküle (nicht-kovalente Heterodimere, siehe beispielsweise Inbar et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; und Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); einzelsträngige Fv-Moleküle (sFv) (siehe beispielsweise Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); dimere und trimere Antikörperfragment-Konstrukte; Minibodies (siehe beispielsweise Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); humanisierte Antikörpermoleküle (siehe beispielsweise Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536 und UK-Patentveröffentlichung GB 2,276,169 , veröffentlicht am 21. September 1994); und beliebige funktionelle Fragmente, die von solchen Molekülen erhalten werden, wobei solche Fragmente die immunologischen Bindungseigenschaften der parentalen Antikörpermoleküle beibehalten.
Wie vorliegend verwendet, bezeichnet der Begriff "monoklonaler Antikörper" eine Antikörper-Zusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation. Der Begriff ist nicht einschränkend im Hinblick auf die Art oder Quelle des Antikörpers, und es ist auch keine Einschränkung in Bezug auf die Herstellung beabsichtigt. Somit umfasst der Begriff Antikörper, die von Maus-Hybridomen erhalten wurden, sowie monoklonale menschliche Antikörper, die unter Verwendung von humanen und nicht von murinen Hybridomen erhalten wurden. Siehe beispielsweise Cote et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, Seite 77.
Mit "isoliert" ist in Bezug auf ein Polypeptid gemeint, dass das bezeichnete Molekül getrennt und abgeschieden vom Gesamtorganismus ist, mit dem das Molekül in der Natur vorgefun den wird, oder, dass es im wesentlichen ohne andere biologische Makromoleküle derselben Art vorliegt. Der Begriff "isoliert" bezeichnet im Hinblick auf ein Polynukleotid ein Nukleinsäuremolekül, das gänzlich oder teilweise frei ist von Sequenzen, die normalerweise mit diesem in der Natur assoziiert sind; oder eine Sequenz, wie sie in der Natur existiert, die jedoch heterologe Sequenzen in Assoziation mit dieser aufweist; oder ein Molekül, das von einem Chromosom losgelöst ist.
Mit "äquivalenter antigenischer Determinante" ist eine antigenische Determinante von verschiedenen Subspezies oder Stämmen von HCV gemeint, wie beispielsweise von den Stämmen 1, 2 oder 3 von HCV. Insbesondere sind Epitope bekannt, wie beispielsweise 5-1-1, und solche Epitope variieren zwischen den Stämmen 1, 2 und 3. Somit ist das Epitop 5-1-1 von den drei unterschiedlichen Stämmen eine äquivalente antigenische Determinante, und es handelt sich bei diesen um "Kopien", obwohl ihre Sequenzen nicht identisch sind. Im allgemeinen werden die Aminosäuresequenzen von äquivalenten antigenischen Determinanten einen hohen Grad an Sequenzhomologie aufweisen, z.B. eine Aminosäuresequenzhomologie von mehr als 30%, vorzugsweise von mehr als 40%, wenn die beiden Sequenzen in einem Alignment miteinander verglichen werden.
"Homologie" bezeichnet die prozentuale Ähnlichkeit zwischen zwei Polynukleotid- oder zwei Polypeptidgruppen. Zwei DNA-Sequenzen oder zwei Polypeptidsequenzen sind "im wesentlichen homolog" zueinander, wenn die Sequenzen mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 75%, stärker bevorzugt mindestens etwa 80-85%, vorzugsweise mindestens etwa 90% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95-98% Sequenzähnlichkeit über eine definierte Länge der Moleküle aufweisen. Wie vorliegend verwendet bezeichnet "im wesentlichen homolog" ferner Se quenzen, die eine vollständige Identität zu der vorgegebenen DNA- oder Polypeptidsequenz aufweisen.
Im allgemeinen bezeichnet "Identität" eine genaue Übereinstimmung von zwei Polynukleotiden oder Polypeptidsequenzen auf einer Nukleotid-zu-Nukleotid-Basis oder auf einer Aminosäurezu-Aminosäure-Basis. Die prozentuale Identität kann durch direkten Vergleich der Sequenzinformation zwischen zwei Molekülen in einem Alignment der Sequenzen bestimmt werden, wobei die genaue Anzahl von Übereinstimmungen zwischen den beiden verglichenen Sequenzen gezählt und durch die Länge der kürzeren Sequenz geteilt wird, und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird.
Es können problemlos verfügbare Computerprogramme verwendet werden, die bei der Analyse von Homologie oder Identität helfen, wie beispielsweise ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff Hrsg., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, das den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981) für die Peptidanalyse adaptiert. Programme zur Bestimmung der Nukleotidsequenzhomologie sind im Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, WI) verfügbar, beispielsweise die Programme BESTFIT, FASIA und GAP, die ebenfalls auf dem Algorithmus von Smith und Waterman beruhen. Diese Programme werden problemlos mit den vorgegebenen Parametern, die von den Herstellern empfohlen werden und in dem oben genannten Wisconsin Sequence Analysis Package genannt werden, verwendet. Beispielsweise kann die prozentuale Homologie einer bestimmten Nukleotidsequenz in Bezug auf eine Referenzsequenz unter Verwendung des Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman mit einer vorgegebenen Scoring-Tabelle und einer Strafe für Lücken (gap penalty) von 6 Nukleotidpositionen bestimmt werden.
Ein weiteres Verfahren zur Feststellung der prozentualen Homologie im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des MPSRCH-Programmpakets, das urheberrechtlich für die Universität von Edinburgh geschützt ist, und das von John F. Collins und Shane S. Sturrock entwickelt wurde und durch IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) vertrieben wird. In dieser Gruppe von Paketen kann der Smith-Waterman-Algorithmus verwendet werden, wobei vorgegebene Parameter für die Scoring-Tabelle eingesetzt werden, beispielsweise eine Strafe für offene Lücken (open gap penalty) von 12, eine Strafe für die Erweiterung einer Lücke (gap extension penalty) von 1 und eine Lücke (gap) von sechs. Bei den erzeugten Daten spiegelt der Übereinstimmungswert ("match" value) die "Sequenzhomologie" wieder. Andere zur Berechnung der prozentualen Identität oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen geeignete Programme sind im Stand der Technik hinreichend bekannt; ein weiteres Alignmentprogramm ist beispielsweise BLAST, das mit vorgegebenen Parametern verwendet wird. Beispielsweise können BLASTN und BLASTP unter Verwendung der nachfolgenden voreingestellten Parameter verwendet werden: Genetischer Code = Standard; Filter = keiner; Strang = beide; Schwelle (cutoff) = 60; Erwartung = 10; Matrix = BLOSUM62; Beschreibungen = 50 Sequenzen; sortiert nach = hoher Trefferzahl; Datenbanken = nicht redundant; Gen-Bank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS Translations + Swiss Protein + Spupdate + PIR. Genauere Angaben zu diesen Programmen können unter der folgenden Internetadresse gefunden werden: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternativ dazu kann die Homologie durch Hybridisierung von Polynukleotiden unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen sich stabile Duplexe zwischen homologen Regionen ausbilden, gefolgt von einem Verdau mit Einzelstrang-spezifischer Nuklease (Einzelstrang-spezifischen Nukleasen) und Größenbestimmung der verdauten Fragmente. DNA-Sequenzen, die in einem wesentlichen Ausmaß homolog sind, können in einem Southern- Hybridiesierungsexperiment, beispielsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie für das jeweilige System definiert sind, verwendet werden. Die Definition von geeigneten Hybridisierungsbedingungen liegt im Bereich des durchschnittlichen Fachwissens. Siehe beispielsweise Sambrook et al., oben angegeben; DNA Cloning, oben angegeben; Nucleic Acid Hybridization, oben angegeben).
Eine "kodierende Sequenz" oder eine Sequenz, die für ein ausgewähltes Polypeptid "kodiert", ist ein Nukleinsäuremolekül, das in vitro oder in vivo (im Fall von DNA) transkribiert wird und (im Fall von mRNA) in ein Polypeptid translatiert wird, wenn es unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'(Amino-)Terminus und ein Translationsstopcodon am 3'(Carboxy-)Terminus festgelegt. Es kann eine Transkriptionsterminationssequenz 3' von der kodierenden Sequenz lokalisiert sein.
"In funktionsfähiger Weise verknüpft" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, bei der die so beschriebenen Bestandteile derart konfiguriert sind, dass sie ihre erwünschte Funktion ausführen. Somit ist ein Promotor, der in funktionsfähiger Weise mit einer kodierenden Sequenz verknüpft ist, in der Lage, die Expression der kodierenden Sequenz zu bewirken, wenn geeignete Transkriptionsfaktoren, usw., vorhanden sind. Der Promotor muß nicht mit der kodierenden Sequenz zusammenhängen, solange er die Expression derselben steuern kann. Somit können beispielsweise zwischenliegende untranslatierte, aber transkribierte Sequenzen zwischen der Promotorsequenz und der kodierenden Sequenz vorkommen, sowie auch transkribierte Introns, und die Promotorsequenz kann weiterhin als mit der kodierenden Sequenz "in funktionsfähiger Weise verknüpft" angesehen werden.
"Rekombinant" bezeichnet wie vorliegend zur Beschreibung eines Nukleinsäuremoleküls verwendet ein Polynukleotid von genomischen, cDNA, viralen, semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs, die aufgrund ihrer Herkunft oder durch Manipulation nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polynukleotids assoziiert ist, mit dem es natürlicherweise assoziiert ist. Der Begriff "rekombinant" bezeichnet wie vorliegend verwendet in Bezug auf ein Protein oder Polypeptid ein Polypeptid, das durch Expression eines rekombinanten Polynukleotids erzeugt wurde. Im allgemeinen wird das Gen von Interesse kloniert und anschließend in transformierten Organismen exprimiert, wie es weiter unten beschrieben wird. Der Wirtsorganismus exprimiert das fremde Gen, um das Protein unter Expressionsbedingungen zu erzeugen.
Ein "Kontrollelement" bezeichnet eine Polynukleotidsequenz, die bei der Expression einer kodierenden Sequenz hilft, mit der sie verbunden ist. Der Begriff umfasst Promotoren, Transkriptionsterminationssequenzen, stromaufwärts gelegene regulatorische Domänen, Polyadenylierungssignale, untranslatierte Regionen, einschließlich 5'-UTRs und 3'-UTRs und, sofern gegeben, Leader-Sequenzen und Enhancer, die zusammen für die Transkription und Translation einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgen.
Ein "Promotor" ist wie vorliegend verwendet eine regulatorische DNA-Region, die in der Lage ist, die RNA-Polymerase in einer Wirtszelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (in 3'-Richtung) gelegenen kodierenden Sequenz, welche mit dieser in funktionsfähiger Weise verknüpft ist, zu initiieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung umfasst eine Promotorsequenz eine minimale Anzahl von Basen oder Elementen, die notwendig sind, um die Transkription eines Gens von Interesse in Mengen zu initiieren, die gegenüber dem Hintergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotorsequenz befindet sich eine Transkriptionsinitiationsstelle sowie Proteinbindungsdomänen (Konsensus-Sequenzen), welche für die Bindung der RNA-Polymerase erforderlich sind. Eukaryontische Promotoren werden oftmals (jedoch nicht immer) "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen enthalten.
Eine Kontrollsequenz "steuert die Transkription" einer kodierenden Sequenz in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die Promotorsequenz bindet und die kodierende Sequenz in mRNA umschreibt, welche anschließend in das Polypeptid translatiert wird, das von der kodierenden Sequenz kodiert wird.
Eine "Expressionskassette" oder ein "Expressionskonstrukt" bezeichnet eine Anordnung, die in der Lage ist, die Expression einer Sequenz (von Sequenzen) oder eines Gens (von Genen) von Interesse zu steuern. Die Expressionskassette umfasst wie oben beschriebene Kontrollelemente, beispielsweise einen Promotor, der in funktionsfähiger Weise mit der Sequenz (den Sequenzen) oder dem Gen (den Genen) von Interesse verknüpft ist (sodass die Transkription derselben gesteuert wird), und sie umfasst oftmals auch eine Polyadenylierungssequenz. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann die vorliegend beschriebene Expressionskassette in einem Plasmidkonstrukt enthalten sein. Zusätzlich zu den Bestandteilen der Expressionskassette kann das Plasmidkonstrukt ferner einen oder mehrere selektierbare Marker, ein Signal, das es dem Plasmidkonstrukt ermöglicht, als einzelsträngige DNA zu existieren (z.B. ein M13 Replikationsursprung), mindestens eine MCS (multiple cloning site) sowie einen "Säugetier"-Replikationsursprung (z.B. einen SV40- oder einen Adenovirus-Replikationsursprung) umfassen.
Wie vorliegend verwendet, bezieht sich "Transformation" auf die Einbringung eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von dem verwendeten Verfahren für die Einbringung: z.B. Transformation durch direkte Aufnahme, Trans fektion, Infektion und ähnliches. Für bestimmte Verfahren der Transfektion, siehe nachstehend. Das exogene Polynukleotid kann als nicht integrierter Vektor beibehalten werden, beispielsweise ein Episom, oder es kann alternativ dazu in das Genom des Wirts integriert sein.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die mit einer exogenen DNA-Sequenz transformiert worden ist, oder die in der Lage ist, mit einer exogenen DNA-Sequenz transformiert zu werden.
Wie vorliegend verwendet, bezeichnet eine "biologische Probe" eine Gewebeprobe oder eine flüssige Probe, die von einem Subjekt isoliert worden ist, und die üblicherweise Antikörper umfasst, welche von dem Subjekt erzeugt werden. Übliche Proben, die solche Antikörper enthalten, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Blut, Plasma, Serum, Fäkalien, Urin, Knochenmark, Galle, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Hautproben, Sekrete von Haut, Respirationstrakt, Intestinaltrakt und Urogenitaltrakt, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Organe, Biopsien sowie Proben von in vitro Zellkulturbestandteilen, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) konditionierter Medien, die vom Wachstum von Zellen oder Geweben in Kulturmedium resultieren, z.B. rekombinante Zellen oder Zellbestandteile.
Ein "üblicher fester Träger" meint eine einzelne feste Matrix, auf die die HCV-Polypeptide, welche in dem vorliegenden Immunassays verwendet werden, kovalent oder durch nicht-kovalente Mittel, wie beispielsweise durch hydrophobe Adsorption, gebunden sind.
"Immunologisch reaktiv" bedeutet, dass das in Frage stehende Antigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern, die in der biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind, reagieren wird.
Mit "Immunkomplex" ist die Kombination gemeint, die gebildet wird, wenn ein Antikörper an ein Epitop auf einem Antigen bindet.
Wie vorliegend verwendet, betreffen die Begriffe "Markierung" und "nachweisbare Markierung" ein Molekül, das nachgewiesen werden kann, einschließlich (jedoch nicht beschränkt auf) radioaktiver Isotope, fluoreszenter Substanzen, chemilumineszenter Substanzen, Chromophore, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzym-Inhibitoren, Chromophore, Farbstoffe, Metallionen, Metall-Sole, Liganden (z.B. Biotin, Avidin, Strepavidin oder Haptene) und ähnlichem. Der Begriff "fluoreszente Substanz" bezeichnet eine Substanz oder einen Teil derselben, die (der) in der Lage ist, eine Fluoreszenz im nachweisbaren Bereich zu zeigen. Besondere Beispiele für Markierungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Meerrettichperoxidase (HRP), Fluorescein, FITC, Rhodamin, Dansyl, Umbelliferon, Dimethylacridiniumester (DMAE), Texas-Rot, Luminol, NADPH und α-β-Galaktosidase.
II. Verfahren zur Ausführung der Erfindung
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, sollte verstanden werden, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Formulierungen oder Verfahrensparameter beschränkt ist, da diese selbstverständlich abweichen können. Es sollte ferner verstanden werden, dass die vorliegend verwendete Terminologie lediglich dem Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen der Erfindung dient und nicht beschränkend wirken soll.
Obwohl mehrere Zusammensetzungen und Verfahren bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden können, die den vorliegenden Zusammensetzungen oder Verfahren ähnlich oder äquivalent sind, werden vorliegend die bevorzugten Materialien und Verfahren beschrieben.
Wie oben angemerkt, basiert die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung neuer diagnostischer Verfahren zum genauen Nachweis einer frühen HCV-Infektion. Die Verfahren beruhen auf der Identifizierung und Verwendung von stark immunogenen HCV-Antigenen, die während der frühen Phasen der HCV-Serokonversion vorhanden sind, wodurch die Nachweisgenauigkeit erhöht wird und das Auftreten von falschen Ergebnissen verringert wird. Die vorliegend beschriebenen Immunassays verwenden insbesondere stark immunogene Konformationsepitope, die aus der NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins abgeleitet sind, sowie Mehr-Epitop-Fusionsantigene, die verschiedene HCV-Polypeptide umfassen, entweder vom gleichen oder von unterschiedlichen HCV-Genotypen und HCV-Isolaten, wie beispielsweise mehrere immundominante Epitope, z.B. die wesentlichen linearen Epitope von HCV-Core, E1, E2, NS3, 5-1-1, c100-3 und der NS5-Sequenzen. Die Verfahren können praktischerweise in einem einzigen Assay angewendet werden, wobei ein beliebiges von mehreren Assayformaten, die nachfolgend beschrieben werden, verwendet werden kann, wie beispielsweise (jedoch nicht beschränkt auf) Assayformate, welche einen festen Träger verwenden, an den die HCV-Antigene gebunden sind.
Die NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins ist beschrieben worden, und die Aminosäuresequenz sowie die Gesamtstruktur des Proteins sind beispielsweise in Yao et al., Structure (November 1999) 7:1353-1363; Sali et al., Biochem. (1998) 37:3392-3401; und Bartenschlager, R., J. Viral Hepat. (1999) 6:165-181 offenbart. Siehe auch Dasmahapatra et al., US-Patent Nr. 5,843,752 . Die vorliegenden Immunassays verwenden mindestens ein Konformationsepitop, das aus der NS3/4a-Region abgeleitet ist und in der Konformation vorliegt, die auch im natürlich vorkommenden HCV-Partikel oder dessen infektiösem Produkt vorliegt, wie durch die Beibehaltung der enzymatischen Proteaseaktivität und (eventuell) der enzymatischen Helicaseaktivität, die normalerweise von dem NS3/4a-Genprodukt gezeigt werden, und/oder durch Immunreaktivität des Antigens mit Antikörpern in einer biologischen Probe aus einem mit HCV infizierten Subjekt, und durch einen Verlust der Immunreaktivität des Epitops bei Denaturierung des Antigens angezeigt wird. Beispielsweise kann das Konformationsepitop durch Erhitzen, Veränderung des pH-Werts zu extrem sauren oder extrem basischen Werten oder durch Zugabe bekannter organischer denaturierender Substanzen, wie beispielsweise Dithiothreitol (DTT), oder durch Zugabe eines geeigneten Detergens zerstört werden. Siehe beispielsweise Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V. Harris und S. Angal, Hrsg., IRL Press). Und das denaturierte Produkt kann mit dem Produkt verglichen werden, das nicht wie oben beschrieben behandelt wurde.
Die Proteaseaktivität und die Helicaseaktivität können durch Verwendung von Standardenzymassays, die im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt werden. Beispielsweise kann die Proteaseaktivität unter Verwendung des Verfahrens bestimmt werden, das in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, sowie unter Verwendung von Assays, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind. Siehe beispielsweise Takeshita et al., Anal. Biochem. (1997) 247:242-246; Kakiuchi et al., J. Biochem. (1997) 122:749-755; Sali et al., Biochemistry (1998) 37:3392-3401; Cho et al., J. Virol. Meth. (1998) 72:109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266:192-197; Zhang et al., Anal. Biochem. (1999) 270:268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (1999) 80:77-84; Fowler et al., J. Biomol. Screen. (2000) 5:153-158; und Kim et al., Anal. Biochem. (2000) 284:42-48. Gleichermaßen sind Assays zur Bestimmung der Helicaseaktivität im Stand der Technik hinreichend bekannt, und die Helicaseaktivität eines NS3/4a-Epitops kann beispielsweise bestimmt werden, indem man einen ELISA Assay verwendet, wie beispielsweise in Hsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1998) 253:594-599 beschrieben wird; ein Scintillationsnäherungsassaysystem, wie in Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257:120-126 beschrieben wird; einen Hochdurchsatz-Screeningassay, wie beispielsweise in Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 46:181-193 und in Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24:97-116 beschrieben wird; sowie andere Assayverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Siehe beispielsweise Khu et al., J. Virol. (2001) 75:205-214; Utama et al., Virology (2000) 273:316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81:1335-1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000) 39:5174-5183; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19:353-364; und Hesson et al., Biochemistry (2000) 39:2619-2625.
Die Länge des Antigens ist ausreichend, um ein immunreaktives Konformationsepitop zu erhalten. Oftmals wird das Polypeptid, welches das verwendete Antigen enthält, nahezu in vollständiger Länge vorliegen. Das Polypeptid kann jedoch auch trunkiert sein, um beispielsweise die Löslichkeit zu erhöhen oder die Sekretion zu verbessern. Üblicherweise wird das Konformationsepitop, das in NS3/4a vorgefunden wird, als rekombinantes Polypeptid in einer Zelle exprimiert, und dieses Polypeptid stellt das Epitop in der gewünschten Form bereit, wie nachfolgend ausführlich beschrieben wird.
Eine repräsentative Aminosäuresequenz für das NS3/4a-Polypeptid wird in den 3A bis 3D gezeigt. Die Aminosäuresequenz, die an den Positionen 2-686 der Figur gezeigt wird, entspricht den Aminosäure-Positionen 1027-1711 von HCV-1. Ein Startcodon (ATG), das für Met kodiert, ist an Position 1 gezeigt. Darüber hinaus ist das Thr, das normalerweise an Position 1428 von HCV-1 vorkommt (Aminosäureposition 403 von 3) zu Pro mutiert, und das Ser, welches normalerweise an Position 1429 von HCV-1 auftritt (Aminosäureposition 404 von 3) ist zu Ile mutiert. Es können jedoch entweder die native Sequenz (mit oder ohne einem N-terminalen Met), das dargestellte Analog (mit oder ohne einem N-terminalen Met) oder andere Analoga und Fragmente in den vorliegenden Assays verwendet werden, solange das Epitop unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt wird, welches dessen native Konformation erhält oder wieder herstellt, sodass die Proteaseaktivität und (eventuell) die Helicaseaktivität erhalten bleibt. Dasmahapatra et al., US-Patent Nr. 5,843,752 und Zhang et al., US-Patent Nr. 5,990,276 , die beide Analoga von NS3/4a beschreiben.
Die NS3-Protease von NS3/4a wird etwa an den Positionen 1027-1207 gefunden, wobei die Numerierung relativ zum HCV-1 erfolgt (siehe Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455), Positionen 2-182 von 3. Die Struktur der NS3-Protease und das Aktivitätszentrum sind bekannt. Siehe beispielsweise De Francesco et al., Antivir. Ther. (1998) 3:99-109; Koch et al., Biochemistry (2001) 40:631-640. Bei den Veränderungen der nativen Sequenz, die normalerweise toleriert werden, wird es sich um diejenigen handeln, die außerhalb des Aktivitätszentrums des Moleküls liegen. Es ist insbesondere erstrebenswert, die Aminosäuren 1- oder 2-155 von 3 zu erhalten, wobei wenige oder lediglich konservative Substitutionen vorgenommen werden. Die Aminosäuren, die hinter Position 155 vorkommen, werden stärkere Veränderungen tolerieren. Wenn darüber hinaus Fragmente der in 3 dargestellten NS3/4a-Sequenz verwendet werden, so werden diese Fragmente im allgemeinen mindestens die Aminosäuren 1- oder 2-155, vorzugsweise die Aminosäuren 1- oder 2-175, und stärker bevorzugt die Aminosäuren 1- oder 2-182 mit oder ohne dem N-terminalen Met umfassen. Die Helicasedomäne wird etwa an den Positionen 1193- 1657 von HCV-1 vorgefunden (Positionen 207-632 von 3). Wenn folglich eine Helicaseaktivität erwünscht ist, wird dieser Teil des Moleküls mit wenigen oder lediglich konservativen Veränderungen erhalten werden. Der Fachmann kann auf Basis der bekannten Struktur von NS3/4a problemlos andere Regionen bestimmen, die eine Veränderung tolerieren werden.
Die vorliegend beschriebenen Immunassays verwenden ferner Mehr-Epitop-Fusionsantigene (multiple epitope fusion antigens; "MEFAs" genannt), wie sie in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 beschrieben werden. Solche MEFAs umfassen mehrere Epitope, die von zwei oder von mehreren der verschiedenen viralen Regionen des HCV-Polyproteins abgeleitet sind, welches in 1 und in Tabelle 1 gezeigt ist. Wie insbesondere in 1 und in Tabelle 1 gezeigt wird, führt ein HCV-Polyprotein bei Spaltung zu mindestens 10 verschiedenen Produkten, in der Reihenfolge: NH₂-Core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Das Core-Polypeptid tritt an den Positionen 1-191 auf, wobei die Numerierung relativ zum HCV-1 erfolgt (siehe Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455, für das HCV-1-Genom). Dieses Polypeptid wird weiter prozessiert, wobei ein HCV-Polypeptid mit ungefähr den Aminosäuren 1-173 erzeugt wird. Die Hüll(Envelope)-Polypeptide E1 und E2 treten etwa an den Positionen 192-383 bzw. 384-746 auf. Die P7-Domäne wird etwa an den Positionen 747-809 gefunden. NS2 ist ein integrales Membranprotein mit proteolytischer Aktivität und wird etwa an den Positionen 810-1026 des Polyproteins vorgefunden. N2 spaltet entweder allein oder in Kombination mit NS3 (das etwa an den Positionen 1027-1657 gefunden wird), die NS2-NS3-Peptidbindung, was wiederum den N-Terminus von NS3 erzeugt und ein großes Polyprotein freisetzt, das sowohl die Serinproteaseaktivität als auch die RNA-Helicaseaktivität umfasst. Die NS3-Protease, die etwa an den Positionen 1027-1207 vorgefunden wird, dient zur Prozessierung des verbleibenden Polyproteins. Die Helicaseaktivität wird et wa an den Positionen 1193-1657 gefunden. Die Komplettierung der Reifung des Polyproteins wird durch eine autokatalytische Spaltung an der NS3/NS4a-Verbindungsstelle initiiert, die durch die NS3-Serinprotease katalysiert wird. Es scheint, dass an der anschließenden durch NS3 vermittelten Spaltung des HCV-Polyproteins die Erkennung der Spaltungsstellen des Polyproteins durch ein NS3-Molekül eines anderen Polypeptids beteiligt ist. In diesen Reaktionen setzt NS3 einen NS3-Cofaktor (NS4a, das etwa an den Positionen 1658-1711 gefunden wird), zwei Proteine (NS4b, das an den Positionen 1712-1972 gefunden wird, und NS5a, das etwa an den Positionen 1973-2420 gefunden wird) sowie eine RNA-abhängige RNA-Polymerase (NS5b, das etwa an den Positionen 2421-3011 gefunden wird) frei.

Tabelle 1

Domäne Ungefähre Grenzen

C (Core) 1-191

E1 192-383

E2 384-746

P7 747-809

NS2 810-1026

NS3 1027-1657

NS4a 1658-1711

NS4b 1712-1972

NS5a 1973-2420

NS5b 2421-3011

* Numerierung relativ zu HCV-1 (siehe Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455.

Die verschiedenen HCV-Antigene sind Teil einer einzelnen, zusammenhängenden Kette von Aminosäuren, wobei diese Kette in der Natur nicht vorkommt. Somit unterscheidet sich die lineare Reihenfolge der Epitope von der linearen Reihenfolge im Genom, in dem diese vorkommen. Die lineare Reihenfolge der Sequenzen der MEFAs für die vorliegende Verwendung ist vorzugsweise im Hinblick auf eine optimale Antigenität angeordnet. Die Epitope stammen vorzugsweise von mehr als einem HCV-Stamm, wodurch die zusätzliche Möglichkeit bereitgestellt wird, mehrere Stämme von HCV in einem einzigen Assay nachzuweisen. Somit können die MEFAs für die vorliegende Verwendung verschiedene immunogene Regionen umfassen, die von dem oben beschriebenen Polyprotein abgeleitet sind. Darüber hinaus kann ein Protein in den MEFAs verwendet werden, das aus einer Leserahmenverschiebung in der Core-Region des Polyproteins resultiert, wie es in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 99/63941 beschrieben wird. Sofern dies erwünscht ist, können mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr von einem oder von mehreren Epitopen, die von dem HCV-Polyprotein abgeleitet sind, in dem Fusionsprotein vorkommen.
Beispielsweise können Epitope, die z.B. aus der hypervariablen Region von E2 abgeleitet sind, wie beispielsweise eine Region, welche die Aminosäuren 384-410 oder 390-410 überspannt, in das MEFA-Antigen eingeschlossen werden. Ein besonders wirksames E2-Epitop ist ein solches, das eine Konsensus-Sequenz umfasst, die von dieser Region abgeleitet ist, wie beispielsweise die Konsensus-Sequenz Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, die eine Konsensus-Sequenz für die Aminosäuren 390 bis 410 des Genoms von HCV Typ 1 darstellt. Ein repräsentatives E2-Epitop, das in einem MEFA der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, kann ein Hybridepitop umfassen, das die Aminosäuren 390-444 überspannt. Ein solches E2-Hybridepitop kann eine Konsensus-Sequenz umfassen, welche die Aminosäuren 390-410 darstellt und an die native Aminosäuresequenz der Aminosäuren 411-444 von HCV-E2 fusioniert ist.
Darüber hinaus können die Antigene von verschiedenen HCV-Stämmen abgeleitet sein. Mehrere virale Stämme von HCV sind bekannt, und Epitope, die von einem beliebigen dieser Stämme abgeleitet sind, können in einem Fusionsprotein Verwendung finden. Es ist hinreichend bekannt, dass eine beliebige Spezies eines Organismus von einem individuellen Organismus zum anderen variiert, und dass ein bestimmter Organismus, wie beispielsweise ein Virus, mehrere verschiedene Stämme aufweisen kann. HCV umfasst beispielsweise wie oben beschrieben mindestens sechs Genotypen. Jeder dieser Genotypen umfasst äquivalente antigenische Determinanten. Genauer gesagt umfasst jeder Stamm mehrere antigenische Determinanten, die auf allen Stämmen des Virus vorhanden sind, sich jedoch von einem viralen Stamm zum anderen leicht unterscheiden. Beispielsweise umfasst HCV die antigenische Determinante, die als 5-1-1 bekannt ist (siehe 1). Diese besondere antigenische Determinante scheint in drei verschiedenen Formen auf den drei verschiedenen viralen Stämmen von HCV vorzukommen. Somit kommen in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung alle drei Formen von 5-1-1 in dem Mehr-Epitop-Fusionsantigen vor, das im Rahmen der vorliegenden Immunassays verwendet wird. Gleichermaßen können auch äquivalente antigenische Determinanten aus der Core-Region der verschiedenen HCV-Stämme vorhanden sein. Im allgemeinen haben äquivalente antigenische Determinanten einen hohen Grad an Homologie in Bezug auf die Aminosäuresequenz, wobei dieser Grad an Homologie in einem Alignment im allgemeinen 30% oder mehr beträgt, vorzugsweise 40% oder mehr. Das Mehrkopien-Epitop der vorliegenden Erfindung kann ferner mehrere Kopien umfassen, die exakte Kopien des gleichen Epitops sind.
Die 4 und 6A-6C zeigen repräsentative MEFAs für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die von HCV abgleitet sind. Es sollte jedoch verstanden werden, dass andere Epitope, die aus dem HCV-Genom abgeleitet sind, ebenfalls bei den vorliegenden Assays Anwendung finden können.
Die DNA-Sequenz und die korrespondierende Aminosäuresequenz eines repräsentativen Mehr-Epitop-Fusionsantigens, MEFA 7.1, ist in den 5A bis 5F gezeigt. Die allgemeine Strukturformel für MEFA 7.1 ist in 4 gezeigt und lautet wie folgt: hSOD-E1(Typ 1)-E2 HVR Konsensus(Typ 1a)-E2 HVR Konsensus(Typen 1 und 2)-Helicase(Typ 1)-5-1-1(Typ 1)-5-1-1(Typ 3)-5-1-1(Typ 2)-c100(Typ 1)-NS5 (Typ 1)-NS5(Typ 1)-Core(Typen 1+2)-Core(Typen 1+2). Dieses Mehrkopien-Epitop umfasst die folgende Aminosäuresequenz, wobei die Numerierung relativ zu HCV-1 erfolgt (die Numerierung der unten dargestellten Aminosäuren folgt der Numerierungsbenennung, die von Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455 vorgeschlagen wurde, bei der die Aminosäure #1 das erste Methionin ist, welches von der kodierenden Sequenz der Core-Region kodiert wird): Aminosäuren 1 bis 156 der Superoxiddismutase (SOD, verwendet, um die rekombinante Expression des Proteins zu verstärken); minosäuren 303 bis 320 vom Polyprotein aus der E1-Region; Aminosäuren 390 bis 410 des Polyproteins, die eine Konsensus-Sequenz für die hypervariable Region von HCV-1a E2 darstellen; Aminosäuren 384 bis 414 des Polyproteins aus der Region E2, die eine Konsensus-Sequenz für die E2 hypervariablen Regionen von HCV-1 und HCV-2 darstellen; Aminosäuren 1193 bis 1658 des HCV-Polyproteins, die die Helicase definieren; drei Kopien eines Epitops von 5-1-1; Aminosäuren 1689 bis 1735, eine von HCV-1, eine von HCV-3 und eine von HCV-2, wobei die Kopien äquivalente antigenische Determinanten von den drei verschiedenen viralen Stämmen von HCV sind; HCV-Polypeptid c100 von HCV-1, Aminosäuren 1901 bis 1936 des Polyproteins; zwei exakte Kopien eines Epitops aus der NS5-Region von HCV-1, wobei jede die Aminosäuren 2278 bis 2313 des HCV-Polyproteins aufweist; und zwei Kopien eines Epitops aus der Core-Region, eine aus HCV-1 und eine aus HCV-2, wobei die Kopien äquivalente antigenische Determinanten sind, und durch die Aminosäuren 9-32, 39-42 und 64-88 von HCV-1 und 67-84 von HCV-2 dargestellt werden.

Tabelle 2 zeigt die Aminosäure-Positionen der verschiedenen Epitope in Bezug auf die vorliegenden 5A bis 5F.

Tabelle 2: MEFA 7.1
MEFA aa#	Schnittstelle am 5'-Ende	Epitop	HCV aa#	Stamm
1-156	NcoI	hSOD
159-176	EcoRI	E1	303-320	1
179-199	HindIII	E2 HVR1a Konsensus	390-410	1
200-230		E2 HVR1+2 Konsensus	384-414	1+2
231-696	SalI	Helicase	1193-1658	1
699-745	SphI	5-1-1	1689-1735	1
748-794	NruI	5-1-1	1689-1735	3
797-843	ClaI	5-1-1	1689-1735	2
846-881	AvaI	C100	1901-1936	1
884-919	XbaI	NS5	2278-2313	1
922-957	BglII	NS5	2278-2313	1
958-1028	NcoI	Core Epitope	9-32, 39-42 64-88 67-84	1 1 2
1029-1099	BalI	Core Epitope	9-32, 39-42 64-88 67-84	1 1 2

In einer Ausführungsform der Erfindung, die in 2 dargestellt ist, wird ein "Rapid Capture Ligand"-Immunassay durchgeführt, wobei ein Konformationsepitop von NS3/4a und ein oder mehrere Mehr-Epitop-Fusionsantigene, wie beispielsweise MEFA 7.1, verwendet werden. Die Probe wird mit den Antigenen kombiniert, wobei diese auf einem festen Träger vorhanden sein können, wie nachfolgend genauer beschrieben wird. Wenn die Probe mit HCV infiziert ist, werden HCV-Antikörper gegen solche Epitope, die auf dem festen Träger vorhanden sind, an die Bestandteile des festen Trägers binden. Die Detektion erfolgt durch Anheften eines nachweisbaren Markers (wie beispielsweise Meerrettich-Peroxidase (HRP), wie in 2 gezeigt) an ein Mitglied des Antigen/Antikörperkomplexes. Die Anheftung kann durch kovalente Mittel oder durch anschließende Bindung von nachweisbar markierten Antikörpern erfolgen, wie beispielsweise in einem Standard-Sandwichassay, oder durch eine Enzymreaktion, bei der das Produkt der Reaktion nachgewiesen wird. Der nachweisbare Marker kann ein Chromophor, einen Antikörper, ein Antigen, ein Enzym, eine enzymreaktive Verbindung, dessen Spaltprodukt nachweisbar ist, Rhodamin oder ein Rhodaminderivat, Biotin, Avidin, Strepavidin, eine fluoreszente Verbindung, eine chemilumineszente Verbindung, wie beispielsweise ein Dimethylacridiniumester (DMAE, Ciba Corning Diagnostics Corp.) sowie Derivate und/oder Kombinationen dieser Marker umfassen (ist jedoch nicht auf diese beschränkt). Praktischerweise kann ein nachweisbar markierter Anti-Human-Antikörper, der in der Lage ist, ein vorhandenes humanes IgG-Molekül nachzuweisen, verwendet werden.
Zum weiteren Verständnis der Erfindung wird nachfolgend eine ausführlichere Diskussion in Bezug auf die Herstellung von Polypeptiden zur Verwendung in den Immunassays und in den Verfahren zur Durchführung der Immunassays bereitgestellt.
Herstellung von Antigenen zur Verwendung in den HCV-Immunassays
Wie oben beschrieben ist, werden die Moleküle der vorliegenden Erfindung im allgemeinen rekombinant hergestellt. Folglich können Polynukleotide, die für HCV-Antigene kodieren, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, unter Verwendung von Standardmethoden der Molekularbiologie hergestellt werden. Beispielsweise können Polynukleotidsequenzen, die für die oben beschriebenen Moleküle kodieren, unter Verwendung rekombinanter Verfahren erhalten werden, wie beispielsweise durch Screening von cDNA-Bibliotheken und genomischen Bibliotheken aus Zellen, die das Gen exprimieren, oder durch Ableiten des Gens aus einem Vektor, von dem bekannt ist, dass er dieses enthält. Darüber hinaus kann das gewünschte Gen unmittelbar von viralen Nukleinsäuremolekülen abgeleitet werden, wobei im Stand der Technik beschriebene Methoden verwendet werden, wie sie beispielsweise in Houghton et al., US-Patent Nr. 5,350,671 beschrieben sind. Das Gen von Interesse kann ferner statt durch Klonierung auch synthetisch hergestellt werden. Die Moleküle können mit geeigneten Codons für die jeweilige Sequenz ausgestaltet sein. Die vollständige Sequenz wird dann aus überlappenden Oligonukleotiden, die durch Standardverfahren hergestellt wurden, in eine vollständige kodierende Sequenz zusammengesetzt. Siehe beispielsweise Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; und Jay et al. (1984) J. Bio. Chem. 259:6311.
Somit können bestimmte Nukleotidsequenzen von Vektoren erhalten werden, welche die gewünschten Sequenzen enthalten, oder sie können vollständig oder teilweise unter Verwendung verschiedener Oligonukleotid-Synthesemethoden, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, wie beispielsweise durch zielgerichtete Mutagenese und ggf. Polymerasekettenreaktionen (PCR). Siehe beispielsweise Sambrook, oben ange geben. Ein Verfahren zum Erhalt von Nukleotidsequenzen, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, besteht aus einem Aneinanderlagern von komplementären Gruppen überlappender synthetischer Oligonukleotide, die in einem herkömmlichen automatisierten Polynukleotid-Synthesegerät hergestellt wurden, gefolgt von einer Ligation mit einer geeigneten DNA-Ligase und einer Amplifikation der ligierten Nukleotidsequenz mittels PVR. Siehe beispielsweise Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Darüber hinaus können eine Oligonukleotid-gesteuerte Synthese (Jones et al. (1986) Nature 54:75-82), eine Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese von vorbestehenden Nukleotidregionen (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 und Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), und ein enzymatisches Auffüllen von Lücken zwischen Oligonukleotiden unter Verwendung einer T4-DNA-Polymerase (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) im Rahmen der Erfindung verwendet werden, um Moleküle mit veränderten oder verstärkten Antigen-Bindungsfähigkeiten und/oder verringerter Immunität bereitzustellen.
Sobald kodierende Sequenzen hergestellt oder isoliert wurden, können solche Sequenzen in einen beliebigen geeigneten Vektor oder in ein beliebiges geeignetes Replikon kloniert werden. Zahlreiche Klonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt, und die Auswahl eines geeigneten Klonierungsvektors ist eine Routineangelegenheit. Geeignete Vektoren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Plasmide, Phagen, Transposons, Kosmide, Chromosomen oder Viren, die in der Lage sind, sich zu replizieren, wenn sie mit geeigneten Kontrollelementen assoziiert sind.
Die kodierende Sequenz wird anschließend unter die Kontrolle von geeigneten Kontrollelementen gestellt, wobei diese von dem für die Expression zu verwendenden System abhängen. Somit kann die kodierende Sequenz unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosombindungsstelle (für die bakterielle Expression) und (eventuell) eines Operators gestellt werden, sodass die DNA-Sequenz von Interesse von einer geeigneten Transformante in RNA transkribiert wird. Die kodierende Sequenz kann ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz umfassen, die später in einer post-translationalen Prozessierung vom Wirt entfernt wird, sie muss aber eine solche Sequenz nicht umfassen. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 4,431,739 ; 4,425,437 ; 4,338,397 .
Zusätzlich zu den Kontrollsequenzen kann es erwünscht sein, regulatorische Sequenzen zuzufügen, die eine Regulation der Expression der Sequenzen relativ zum Wachstum der Wirtszelle erlauben. Regulatorische Sequenzen sind dem Fachmann bekannt, und Beispiele für solche Sequenzen umfassen diejenigen, welche die Expression eines Gens in Reaktion auf einen chemischen oder physikalischen Stimulus, einschließlich des Vorhandenseins einer regulatorischen Verbindung, anschalten oder ausschalten. Andere Arten von regulatorischen Elementen können ebenfalls im Vektor vorhanden sein. Beispielsweise können vorliegend Enhancer-Elemente verwendet werden, um die Expressionsmengen des Konstrukts zu erhöhen. Beispiele umfassen den SV40-Early-Gen-Enhancer (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), den Enhancer/Promotor, der vom Long Terminal Repeat (LTR) des Rous-Sarcoma-Virus abgeleitet ist (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777), sowie Elemente, die von dem humanem CMV (Boshart et al. (1985) Cell 41:521) abgeleitet sind, wie beispielsweise Elemente, die in der Sequenz des CMV-Introns A enthalten sind ( US-Patent Nr. 5,688,688 ). Die Expressionskassette kann ferner einen Replikationsursprung für die autonome Replikation in einer geeigneten Wirtszelle, einen oder mehrere nachweisbare Marker, eine oder mehrere Restriktionsschnittstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl sowie einen starken Promotor umfassen.
Ein Expressionsvektor ist so konstruiert, dass die jeweilige kodierende Sequenz in dem Vektor mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen lokalisiert ist, wobei die Positionierung und die Orientierung der kodierenden Sequenz in Bezug auf die Kontrollsequenzen so gestaltet ist, dass die kodierende Sequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert wird (d.h. eine RNA-Polymerase, die an den Kontrollsequenzen an das DNA-Molekül bindet, transkribiert die kodierende Sequenz). Es könnte eine Modifikation der Sequenzen, die für das Molekül von Interesse kodieren, erwünscht sein, um dieses Ziel zu erreichen. Beispielsweise kann es in einigen Fällen notwendig sein, die Sequenz so zu modifizieren, dass diese in geeigneter Orientierung an die Kontrollsequenzen angeheftet wird; d.h. um den Leserahmen zu erhalten. Die Kontrollsequenzen und andere regulatorische Sequenzen können vor Einbringung in einen Vektor an die kodierende Sequenz ligiert werden. Alternativ dazu kann die kodierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden, der bereits die Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsschnittstelle aufweist.
Wie oben beschrieben, kann es darüber hinaus erwünscht sein, Mutanten oder Analoga des Antigens von Interesse herzustellen. Dies trifft insbesondere für NS3/4a zu. Verfahren, um dies zu erreichen, werden beispielsweise in Dasmahapatra et al., US-Patent Nr. 5,843,752 und Zhang et al., US-Patent Nr. 5,990,276 beschrieben. Mutanten oder Analoga davon und von anderen HCV-Proteine können für die Verwendung in den vorliegenden Assays durch Deletion eines Teils der Sequenz, die für das Polypeptid von Interesse kodiert, durch Insertion einer Sequenz und/oder durch Substitution von einem oder von mehreren Nukleotiden innerhalb der Sequenz hergestellt werden. Methoden zur Modifizierung von Nukleotidsequenzen, wie beispielsweise zielgerichtete Mutagenese und ähnliches, sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., oben angegeben; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder et al. (1987) Bio-Techniques 5:786; Zoller und Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409.
Die Moleküle können in einer großen Vielzahl von Systemen exprimiert werden, einschließlich in Insekten-, Säugetier-, Bakterien-, Virus- und Hefeexpressionssystemen, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind.
Beispielsweise sind Expressionssysteme auf Basis von Insektenzellen, wie beispielsweise Baculovirus-Systeme, im Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987) beschrieben. Materialien und Methoden in Bezug auf Baculovirus-/Insektenzellexpressionssysteme sind kommerziell in Form von Kits verfügbar, unter anderem von Invitrogen, San Diego, CA ("MaxBac"-Kit). Gleichermaßen sind bakterielle Expressionssysteme und Expressionssysteme auf Basis von Säugetierzellen im Stand der Technik bekannt, und diese werden beispielsweise in Sambrook et al., oben angegeben, beschrieben. Hefeexpressionssysteme sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise in Yeast Genetic Engineering (Barr et al., Hrsg. 1989) Butterworths, London, beschrieben.
Mehrere geeignete Wirtszellen zur Verwendung in den obigen Systemen sind ebenfalls bekannt. Beispielsweise sind im Stand der Technik Säugetierzelllinien bekannt, und sie umfassen immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) verfügbar sind, wie beispielsweise (jedoch nicht beschränkt auf) Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-Zellen, Nierenzellen des Babyhamsters (BHK), Affen-Nierenzellen (COS), humane embryonische Nierenzellen, humane Zellen des hepatozellulären Karzinoms (z.B. Hep G2), Madin-Darby-Rinder-Nierenzellen ("MDBK") und andere. Gleichermaßen werden bakterielle Wirte, wie beispielsweise E. coli, Bacillus subtilis und Streptococcus spp. mit den vorliegenden Expressionskonstrukten verwendet werden. Hefewirte, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen u.a. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica. Insektenzellen zur Verwendung mit Baculovirus-Expressionsvektoren umfassen u.a. Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni.
Nukleinsäuremoleküle, welche die Nukleotidsequenzen von Interesse umfassen, können stabil in das Genom einer Wirtszelle integriert werden, oder sie können in einer geeigneten Wirtszelle unter Verwendung geeigneter im Stand der Technik bekannter Methoden der Genverabreichung als stabiles episomales Element beibehalten werden. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,399,346 .
Abhängig vom ausgewählten Expressionssystem und vom ausgewählten Wirt werden die Moleküle erzeugt, indem man Wirtszellen, die mit einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformiert sind, unter Bedingungen anzüchtet, bei denen das Protein exprimiert wird. Das exprimierte Protein wird anschließend aus den Wirtszellen isoliert und aufgereinigt. Wenn das Expressionssystem das Protein in das Wachstumsmedium ausscheidet, kann das Produkt unmittelbar aus dem Medium aufgereinigt werden. Wird es nicht ausgeschieden, kann es aus Zelllysaten isoliert werden. Die Auswahl von geeigneten Wachstumsbedingungen und Gewinnungsverfahren sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
Die Herstellung von verschiedenen HCV-Antigenen, einschließlich von Antigenen, die in den oben beschriebenen Mehr-Epitop-Fusionsproteinen verwendet werden, ist beschrieben worden. Siehe beispielsweise Houghton et al., US-Patent Nrn. 5,350,671 und 5,683,864 ; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8:Seiten 33-39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365 ; Chien, D.Y.; Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778 ; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10011-10015; Chien, D.Y.; Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778 und gemeinsame, gewährbare US-Patentanmeldung Serien-Nrn. 08/403,590 und 08/444,818 .
Immundiagnostische Assays
Nach der Herstellung können die HCV-Antigene in nahezu jedem Assayformat verwendet werden, das ein bekanntes Antigen zum Nachweis von Antikörpern verwendet. Ein übliches Merkmal all dieser Assays besteht darin, dass das Antigen mit dem Körperbestandteil in Kontakt gebracht wird, von dem angenommen wird, dass er HCV-Antikörper enthält, wobei Bedingungen angelegt werden, die es erlauben, dass das Antigen an diese in dem Bestandteil vorhandenen Antikörper bindet. Solche Bedingungen werden üblicherweise physiologische Temperatur, physiologischer pH-Wert und physiologische Innenstärke sein, wobei ein Überschuß des Antigens verwendet wird. Der Inkubation des Antigens mit der Probe folgt der Nachweis von Immunkomplexen, die das Antigen umfassen.
Die Gestaltung der Immunassays kann stark variiert werden, und zahlreiche Formate sind im Stand der Technik bekannt. Protokolle können beispielsweise feste Träger oder eine Immunpräzipitation verwenden. Die meisten Assays umfassen die Verwendung eines markierten Antikörpers oder Polypeptids; die Markierungen können beispielsweise enzymatisch, fluoreszent, che miluminineszent oder radioaktiv sein, oder es kann sich um Farbstoffmoleküle handeln, wie nachfolgend erläutert wird. Assays, welche die Signale ausgehend von dem Immunkomplex verstärken, sind ebenfalls bekannt; Beispiele dafür sind Assays, die Biotin und Avidin verwenden, sowie enzymmarkierte und enzymvermittelte Immunassays, wie beispielsweise ELISA-Assays.
Der Immunassay kann (ohne Einschränkung) ein heterogenes oder homogenes Format aufweisen, und er kann dem Standardtyp oder dem kompetitiven Typ entsprechen. In einem heterogenen Format ist das Polypeptid üblicherweise an eine feste Matrix oder an einen festen Träger gebunden, um nach der Inkubation die Trennung der Probe von dem Polypeptid zu ermöglichen. Ein fester Träger kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ein beliebiges Material sein, dass eine unlösliche Matrix ist, und es kann eine feste oder semi-feste Oberfläche aufweisen. Beispielhafte feste Träger umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Substrate, wie beispielsweise Nitrocellulose (z.B. in Form einer Membran oder einer Mikrotiter-Vertiefung); Polyvinylchlorid (z.B. Schichten oder Miktrotiter-Vertiefungen); Polystyrollatex (z.B. Kügelchen oder Mikrotiterplatten); Polyvinylidinfluorid; diazotiertes Papier; Nylonmembranen; aktivierte Kügelchen (beads), magnetisch reagierende Kügelchen und ähnliches. Besondere Träger umfassen Platten, Pellets, Scheiben, Kapillaren, hohle Fasern, Nadeln, Stifte, feste Fasern, Cellulosekügelchen, Kügelchen aus porösem Glas (pore-glass beads), Silicagele; Polystyrolkügelchen, die wahlweise mit Divinylbenzen quervernetzt sind; Grafted-Co-Poly-Kügelchen, Polyacrylamidkügelchen, Latexkügelchen, Dimethylacrylamidkügelchen, die wahlweise mit N-N'-bis-Acryloylethylendiamin quervernetzt sind, und Glaspartikel, die mit einem hydrophoben Polymer beschichtet sind.
Sofern dies gewünscht ist, können die Moleküle, die dem festen Träger zugesetzt werden sollen, problemlos funktionali siert werden, um Styrol- oder Acrylat-Gruppen zu erzeugen, was den Einbau dieser Moleküle in Polystyrol, Polyacrylat oder andere Polymere, wie beispielsweise Polyimid, Polyacrylamid, Polyethylen, Polyvinyl, Polydiacetylen, Polyphenylen-Vinylen, Polypeptid, Polysaccharid, Polysulfon, Polypyrrol, Polyimidazol, Polythiophen, Polyether, Epoxide, Silicaglas, Silicagel, Siloxan, Polyphosphat, Hydrogel, Agarose, Cellulose und ähnliche, ermöglicht.
In einem Aspekt läßt man den festen Träger zunächst mit den HCV-Antigenen (gemeinsam vorliegend als "die Festphasenbestandteile" bezeichnet) unter geeigneten Bindungsbedingungen reagieren, sodass die Moleküle in ausreichendem Maße an den Träger immobilisiert werden. Manchmal kann die Immobilisierung an den Träger durch vorherige Kopplung des Antigens und/oder des Antikörpers an ein Protein mit besseren Festphasen-Bindungseigenschaften verbessert werden. Geeignete Kopplungsproteine umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Makromoleküle, wie beispielsweise Serumalbumine, einschließlich bovines Serumalbumin (BSA), Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Immunglobulinmoleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin und andere Proteine, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind. Andere Reagenzien, die verwendet werden können, um Moleküle an den Träger zu binden, umfassen Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Co-Polymere, und ähnliche. Solche Moleküle und Verfahren zur Kopplung dieser Moleküle an Antigene sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Siehe beispielsweise Brinkley, M.A. (1992) Bioconjugate Chem. 3:2-13; Hashida et al. (1984) J. Appl. Biochem. 6:56-63; und Anjaneyulu und Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30:117-124.
Nach Reaktion des festen Trägers mit den Festphasenbestandteilen werden sämtliche nicht immobilisierten Festphasenbestandteile durch Waschen von dem Träger entfernt, und die an den Träger gebundenen Bestandteile werden anschließend unter geeigneten Bindungsbedingungen mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht, von der angenommen wird, dass sie HCV-Antikörper enthält (zusammenfassend vorliegend als "Liganden-Moleküle" bezeichnet). Wenn HCV-Antikörper in der Probe vorhanden sind, werden diese einen Komplex mit den HCV-Antigenen bilden. Nach Waschen zur Entfernung von sämtlichen nicht gebundenen Ligandenmolekülen werden nachweisbar markierte Antixenogene (z.B. Anti-Human-) Antikörper zugesetzt, die ein Epitop auf den Anti-HCV-Antikörpern erkennen. Diese Antikörper binden aufgrund der Komplexbildung.
In einem homogenen Format wird die Testprobe mit der Kombination von Antigenen in Lösung inkubiert. Dies kann beispielsweise unter Bedingungen durchgeführt werden, bei denen sämtliche Antigen-Antikörper-Komplexe, die sich gebildet haben, präzipitiert werden. Sowohl Standardformate als auch kompetitive Formate sind im Stand der Technik für homogene Assays bekannt.
In einem Standardformat wird die Menge an HCV-Antikörpern, die den Antikörper-Antigen-Komplex bilden, unmittelbar überwacht. Dies kann dadurch erreicht werden, dass man bestimmt, ob markierte Anti-xenogene (z.B. Anti-Human-) Antikörper, die ein Epitop auf Anti-HCV-Antikörper erkennen, aufgrund der Komplexbildung binden werden. In einem kompetitiven Format wird die Menge an HCV-Antikörpern in der Probe ermittelt, indem die kompetitive Wirkung auf die Bindung einer bekannten Menge eines markierten Antikörpers (oder eines anderen kompetitiven Liganden) in dem Komplex verfolgt wird.
Es werden die gebildeten Komplexe, die einen Anti-HCV-Antikörper umfassen (oder im Fall von kompetitiven Assays, die Menge an kompetitiven Antikörpern), nachgewiesen, indem ein beliebiges von mehreren bekannten Verfahren verwendet wird, welches von dem jeweiligen Format abhängig ist. Beispielsweise können unmarkierte HCV-Antikörper in dem Komplex nachgewiesen werden, indem ein Konjugat aus Anti-xenogenem Ig verwendet wird, das mit einer Markierung (z.B. einer Enzymmarkierung) komplexiert ist. In einem Immunpräzipitationsassayformat oder einem Agglutinationsassayformat bildet die Reaktion zwischen den HCV-Antigenen und dem Antikörper ein Netzwerk, das aus der Lösung oder der Suspension präzipitiert und eine sichtbare Schicht oder einen Film des Präzipitats bildet. Wenn kein Anti-HCV-Antikörper in der Testprobe ist, bildet sich kein sichtbares Präzipitat.
Die oben beschriebenen Assayreagenzien, einschließlich des festen Immunassay-Trägers mit den gebundenen Antikörpern und Antigenen sowie der Antikörper und Antigene, die mit der genommenen Probe umgesetzt werden sollen, können in Kits bereitgestellt werden, mit geeigneten Anweisungen und anderen notwendigen Reagenzien, um Immunassays wie oben beschrieben durchzuführen. Das Kit wird normalerweise in getrennten Containern enthalten: die Kombination von Antigenen (entweder bereits an eine feste Matrix gebunden oder in separater Form mit Reagenzien für die Bindung an eine feste Matrix), Antikörperformulierungen zur Kontrolle (positiv und/oder negativ), markierten Antikörper, wenn das Assayformat einen solchen erfordert, und signalerzeugende Reagenzien (z.B. Enzymsubstrat), wenn die Markierung nicht direkt ein Signal erzeugt. Anweisungen (z.B. geschrieben, auf Kassette, VCR, CD-ROM, usw.) zur Ausführung des Assays werden üblicherweise im Kit enthalten sein. Das Kit kann ferner (abhängig von dem jeweils verwendeten Immunassay) andere verpackte Reagenzien und Materialien enthalten (z.B. Waschpuffer und ähnliches). Standardimmunassays, wie sie die oben beschrieben wurden, können unter Verwendung dieser Kits durchgeführt werden.
III. Versuchsteil
Nachstehend werden Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung dargestellt. Die Beispiele werden lediglich zur Veranschaulichung aufgeführt und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
Es wurden sich bemüht, möglichst genaue Zahlenwerte anzugeben (z.B. Mengen, Temperaturen, usw.), wobei jedoch selbstverständlich ein gewisser experimenteller Fehler und eine Abweichung erlaubt sein sollten.
BEISPIEL 1
Konstruktion von MEFA 7 und MEFA 7.1
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer Polyproteinkassette mit mehreren HCV-Epitopen. Das Polyprotein, das von der Mehr-Epitop-Kassette exprimiert wird, wird vorliegend als Mehr-Epitop-Fusionsantigen (MEFA) bezeichnet. Wenn ein Epitop wiederholt wird, ist die zusätzliche Kopie oder sind die zusätzlichen Kopien hintereinander in gleicher Orientierung angeordnet. Es ist verständlich, dass die Region einer viralen kodierenden Sequenz, die als Epitop verwendet wird, geringfügig verändert werden kann und ihre Antigen-Aktivität weiterhin beibehalten kann, und dass sich die Bezeichnung für die Aminosäurenumerierung von Stamm zu Stamm unterscheiden kann. Somit können sich die wiederholten Epitope in der Aminosäuresequenz durch Abweichungen der Stamm-Sequenz und/oder durch die Bezeichnung der Numerierung voneinander unterscheiden. Vorzugsweise sind die Aminosäuresequenzen von wiederholten Epitopen innerhalb eines MEFAs auf der Aminosäureebene mindestens zu 30% homolog, vorzugsweise sind sie auf der Aminosäureebene mindestens zu 40% homolog.
Einzeln vorkommende Restriktionsenzymschnittstellen wurden eingebracht, um die Epitope in der vorgeschriebenen Reihenfolge miteinander zu verbinden und die Nützlichkeit der Erfindung zu erhöhen, indem Modifikationen bei der Erstellung eines chimären Antigens ermöglicht werden. Die Wahl der Restriktionsenzymschnittstellen und der Klonierungsverfahren werden vom Fachmann im Bereich der rekombinanten DNA-Technologie problemlos bestimmt. Vorzugsweise erzeugen die Verbindungsstellen der Epitope (Aminosäuresequenzen, die aufgrund der Klonierung zwischen den Epitopen erzeugt werden) keine unspezifischen Epitope. Unspezifische Epitope sind beispielsweise Nicht-HCV-Sequenzen, die in der Natur nicht angrenzend zu den HCV-Epitopen vorkommen. Unspezifische Epitope können Antikörper in einer Testprobe binden und damit falsch-positive Assayergebnisse verursachen. Vorzugsweise wird das Mehr-Epitop-Fusionsprotein im Hinblick auf falsch-positive Ergebnisse aufgrund solcher an den Verbindungsstellen der Epitope erzeugter Sequenzen getestet. Um unspezifische Interaktionen mit dem MEFA aufgrund von Sequenzen von Verbindungsstellen zu vermeiden, kann die für die Verbindungsstelle kodierende Sequenz beispielsweise mutiert werden, sodass unspezifische Interaktionen mit der mutierten Aminosäuresequenz verringert werden, und die Klonierung der Epitopfragmente möglich ist.
Die HCV-Expressionskassetten MEFA 7 und 7.1 wurden konstruiert, indem man die kodierenden Nukleotidsequenzen klonierte, welche die wesentliche Epitope hintereinander aufwiesen, wie es in 4 gezeigt ist. Ein wesentliches Epitop wurde basierend auf der Frequenz der Antikörperreaktion und der Reaktionsintensität (Titer) gegen das Epitop ausgewählt (Chein, D.Y. et al. (1994) Viral Hepatitis and Liver Disease, Seiten 320-324). Die verschiedenen DNA-Segmente, die für die HCV-Epitope kodierten, wurden durch PCR-Amplifikation oder mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden konstruiert. Die Aminosäuren in jedem Segment sind in Tabelle 2 oben sowie in den
5A bis 5F gezeigt. Die vollständige Aminosäuresequenz von HCV-1 (3011 Aminosäuren) wurde von Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2451-2455 bestimmt. Oligonukleotide, die in der Lage sind, an HCV zu binden, werden in US-Patent Nr. 5,350,671 beschrieben. Die Numerierung der Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Epitopen folgt der Numerierung, die in Choo et al., oben angegeben, verwendet wurde, wobei die Aminosäure Nr. 1 das erste Methionin ist, das von der kodierenden Sequenz der Core-Region kodiert wird, sofern es nicht anders angegeben ist. Beispielsweise wird ein Epitopsegment von NS5 durch die Aminosäuren 2278 bis 2313 des HCV-Polyproteins dargestellt. Ein Epitop der E1-Region wird durch die Aminosäuren 303 bis 320 dargestellt, wobei die Nummerierung relativ zum HCV-1-Polyprotein erfolgt.
MEFA 7 und 7.1 enthalten jeweils Epitope von HCV-1, HCV-2 und HCV-3, was die Detektion von mehreren Arten eines Virus in einem einzelnen Assay ermöglicht. Verfahren zur Bestimmung des HCV-Serotyps werden in WO 96/27153 gefunden. Es wurde beispielsweise herausgefunden, dass Epitope aus der Region 5-1-1 zwischen den HCV-Serotypen variieren. Eine Kopie von jedem der HCV-Typ-spezifischen 5-1-1-Epitope, die in den vorliegend beschriebenen MEFAs vorhanden ist, ermöglicht die Bindung eines beliebigen HCV-Typs, der in der biologischen Testprobe vorhanden ist.
Die Konstrukte MEFA 7 und 7.1 wurden genetisch für die Expression in Saccharomyces cerevisiae hergestellt, wobei der Hefe-Expressionsvektor pBS24.1 verwendet wurde, der 2 μ-Sequenzen für die autonome Replikation in Hefen umfasst sowie die Hefegene leu2-d und URA3 als selektierbare Marker. Das β-Lactamasegen und der ColE1-Replikationsursprung, der für die Replikation eines Plasmids in Bakterien erforderlich ist, waren ebenfalls in diesem Expressionsvektor vorhanden. Der Hefe-Expressionsvektor für MEFA 7, ps.MEFA 7, wurde zuerst konstru iert. Anschließend wurde das Plasmid in der für die HCV-Core-Epitope kodierenden Region modifiziert, um das Plasmid ps.MEFA7.1 zu erzeugen, welches für das MEFA 7.1-Antigen kodiert.
Wie insbesondere in den 7A bis 7D gezeigt ist, wurde ein Hefe-Expressionsplasmid für MEFA 7 wie folgt konstruiert. Zunächst wurde ein BamHI-HindIII-Fragment von 1896 bp, das für den ADH2/GAPDH-Hybridpromotor, hSOD (Aminosäuren 1-156), gefolgt von einem E1-Epitop (Aminosäuren 303-320, HCV1-Stamm) kodiert, aus ps.MEFA 6 isoliert, dem Expressionsplasmid, das für MEFA 6 kodiert und in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 beschrieben ist. Als nächstes wurde ein synthetisches HindIII/SphI-DNA-Fragment von 269 bp erzeugt, das die kodierende Sequenz für das E2-HVR1a-Konsensusepitop (Aminosäuren 390-410, HCV-1), das E2-HVR1+2-Konsensusepitop (Aminosäuren 384-414, HCV1+2) und das 5'-Ende der Helicasedomäne (Aminosäuren 1193-1229, HCV-1) enthielt. Ein SphI/EclXI-Fragment von 1264 bp, das für die übrige Helicasedomäne (Aminosäuren 1230-1651, HCV-1) kodierte, wurde ausgehend von pTac5/HelI-Plasmid-DNA aus einem Gel aufgereinigt. Das synthetische HindIII/SphI-DNA-Fragment und das SphI/EclXI-Fragment von 1264 bp wurden in den Vektor pSP72new.HindIIIEclXI ligiert, wobei pSP72new.HindIIIEclXI/e2.helicase erzeugt wurde. Dieser Vektor wurde ausgehend von pSP72 erhalten, einem E. coli-Vektor, der kommerziell von Promega, Madison, WI, erhältlich ist (siehe, GenBank/EMBL Zugriffsnummer X65332). Um die Subklonierung von einigen MEFA 7-Epitopen zu ermöglichen, wurde über synthetische Oligos ein neuer Multiklonierungsstellen (MCS)-Polylinker zwischen den Schnittstellen SphI und BglII von pSP72 eingebracht. Das neue Plasmid, das als pSP27new bezeichnet wurde, wurde mit HindIII und EclXI (auch als EagI bekannt) verdaut, die einzeln vorkommende Schnittstellen in der MCS aufweisen. Es wurde anschließend dephosphoryliert und aus dem Gel aufgereinigt.
Kompetente E. coli HB101-Zellen wurden mit dem Plasmid transformiert und auf Luria-Agarplatten ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Die gewünschten Klone wurden mittels Miniprep-DNA-Analysen identifiziert. Nach Verifizieren der Sequenz wurden das Plasmid pSP72new.HindIII/EclXI/e2.Helicase Subklon #4 mit HindIII und EclXI(EagI) verdaut, wobei ein Fragment von 1534 bp erzeugt wurde. Das HindIII/EclXI-Fragment wurde aus dem Gel aufgereinigt und mit EclXI/Sphl-Oligonukleotide, welche die letzten Aminosäuren der Helicasedomäne (Aminosäuren 1651-1658, HCV-1) kodieren, in einen pGEM7 HindIII/Sphl-Vektor ligiert. Die kompetenten HB101-Zellen wurden transformiert und auf Luria-Ampicillin (100 μg/ml) ausplattiert. Nach Identifizieren der erwünschten Klone und Bestätigung der Sequenzinformation wurde pGEM7HindIII/SphI-Subklon #9 mit HindIII und SphI verdaut, wobei ein Fragment von 1560 bp erzeugt wurde, das aus dem Gel aufgereinigt wurde (siehe 7A).
Um den Teil am 3'-Ende von MEFA 7 zusammenzusetzen, wurden die folgenden Schritte durchgeführt. Die 5-1-1-Epitope (Aminosäuren 1689-1735) von HCV-1, HCV-3 und HCV-2 wurden (in dieser Reihenfolge) ausgehend von ps.MEFA6, dem Expressionsplasmid, das für MEFA 6 kodiert und in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 beschrieben ist, als ein SphI/AvaI-Fragment von 441 bp aus dem Gel isoliert. Dieses Fragment wurde mit den synthetischen AvaI/XbaI-Oligonukleotiden, die das Epitop c100 (Aminosäuren 1901-1936) kodieren, in einen pSP72new.SphI/XbaI-Vektor ligiert. Nach Transformation in HB101, Identifizieren der Klone und verifizieren der Sequenz wurde pSP72newSXi-Subklon #6 mit XbaI und NotI verdaut, um einen pSP72newXbaI/NotI-Vektor herzustellen. Darüber hinaus wurde ausgehend von ps.MEFA 6 ein XbaI/NcoI-Fragment von 221 bp isoliert, das für eine doppelte Wiederholung eines NS5-Epitops (Aminosäuren 2278-2313, HCV-1) kodierte. Das XbaI/NcoI-Fragment wurde mit NcoI/NotI-Oligonukleotiden, die für die ersten Aminosäuren des Core-Epitops von HCV-1 (Aminosäuren 9-17) kodierten, wobei das Lys an Position 9 in ein Arg geändert war, und das Asn an Position 11 in ein Thr geändert war, wie oben hergestellten pSP72newXbaI/NotI-Vektor ligiert. HB101-Transformanten wurden analysiert, und ihre Plasmid-DNA wurde sequenziert. Ein Subklon, der als pSP72newSX/XNi#3 bezeichnet wurde, wurde mit NotI/SalI verdaut, um einen Vektor für die anschließende Subklonierung herzustellen (siehe 7B).
Um die Zusammensetzung des 3'-Endes von MEFA 7 zu vervollständigen wurden eine doppelte Wiederholung der Sequenz, die für ein Core-Epitop mit den Aminosäuren 9-53 von HCV-1 kodiert, und zwei Genotyp-spezifische Epitope der Core-Region (Aminosäuren 64-88, HCV-1, und Aminosäuren 67-84, HCV-2) wie folgt in pSP72newSX/XNi Subklon #3 subkloniert, der mit NotI/SalI verdaut worden war. Zunächst wurde ein NotI/XmnI-Fragment von 92 bp, das für die Aminosäuren 18-51 eines Core-Epitops kodiert, aus pd.Corel91RT Klon #20 isoliert. Das Plasmid pd.Corel91RT wurde konstruiert, indem ein BamHI-NcoI-Fragment von 1365 bp für den ADH2/GAPDH-Promotor und ein NcoI/SalI-Fragment von 615 bp, das für die ersten 191 Aminosäuren von HCV-1 Core kodiert, wobei Aminosäure 9 von Lys zu Arg mutiert ist und Aminosäure 11 von Asn zu Thr mutiert ist, in den Hefe-Expressionsvektor pBS24.1 BamHI-SalI kloniert wurden. Das NcoI/SalI-Fragment von 615 bp wurde von einem E. coli-Expressionsvektor abgeleitet, in den die Core-Sequenz für die Aminosäuren 1-191 mit den beiden oben beschriebenen Mutationen kloniert worden war.
Das NotI/XmnI-Fragment von 92 bp wurde mit einem pSP72newNot/Kpn-Vektor ligiert sowie mit XmnI/KpnI-Oligonu kleotiden, die für das 3'-Ende des vollständigen Core-Epitops kodieren. Nach Bestätigung der Sequenz der positiven Klone wurde pSP72newNKi-Subklon #4 mit NotI und KpnI verdaut, und ein Fragment von 224 bp wurde aus dem Gel isoliert. Dieses NotI/KpnI-Fragment wurde mit 284 bp von Oligonukleotiden (KpnI-SalI-Enden), die für eine vollständige Wiederholung des oben beschriebenen Core-Epitops kodierten, in den oben beschriebenen pSP72newSX/XniNotI/SalI-Vektor ligiert. Nach Transformation in HB101, Identifizieren des Klons und Verifizieren der Sequenz wurde pSP72newSX/XN/NSi-Subklon #18 mit SphI und SalI verdaut, und ein Fragment von 1317 bp wurde aus dem Gel isoliert (siehe 7C).
Im letzten Schritt wurden die folgenden, oben beschriebenen Fragmente in den Hefe-Expressionsvektor pBS24.1BamHI/SalI ligiert, wobei ps.MEFA7 erzeugt wurde (siehe 7D):
das BamHI/HindIII-Fragment von 1896 bp (7A)
das HindIII/SphI-Fragment von 1560 bp (7A)
das SphI/SalI-Fragment von 1317 bp (7C)
Der S. cerevisiae-Stamm AD3 wurde mit ps.MEFA 7 transformiert, und einzelne Transformanten wurden nach Entreicherung des Mediums von Glucose hinsichtlich einer Expression untersucht. Das rekombinante Protein wurde in der Hefe in hohen Mengen exprimiert, wie durch Coomassie-Blau-Färbung nachgewiesen wurde. Hefezellen wurden insbesondere unter Verwendung eines Lithium-Acetat-Protokolls mit dem MEFA-Expressionsplasmid transformiert. Ura^- Transformaten wurden ausgestrichen, um einzelne Kolonien zu erhalten, und sie wurden auf Leu^-/8 % Glucoseplatten aufgebracht, um die Kopienzahl des Plasmids zu erhöhen. Leu Startkulturen wurden für 24 Stunden bei 30°C angezüchtet und anschließend 1:20 in YEPD (Hefeextrakt, Baktopepton, 2 Glucose)-Medium verdünnt. Die Zellen wurden für 48 Stunden bei 30°C angezüchtet und abgeerntet. Um eine Ex- Pression des rekombinanten MEFA 7-Antigens zu testen, wurde ein Aliquot der Zellen mit Glaskügelchen in Lysepuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 10 mM DTT) lysiert. Das Lysat wurde bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Überstand und das unlösliche Pellet wurden auf SDS-Proteingelen analysiert. MEFA 7 war in der unlöslichen Pellet-Fraktion stark angereichert.
Das MEFA 7-Antigen wurde wie folgt aufgereinigt. S. cerevisiae-Zellen, die MEFA 7 exprimierten, wurden wie oben beschrieben geerntet. Die Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 8,0) suspendiert und in einer Dyno-Mühle (Wab Willy A. Bachofen, Basel, Schweiz) oder in einem äquivalenten Gerät unter Verwendung von Glaskügelchen (glass beads) lysiert. Das Lysat wurde bei geringer Geschwindigkeit (3000 bis 5000 UpM, 15 Minuten) zentrifugiert, und das Pellet, das die unlösliche Proteinfraktion enthielt, wurde mit ansteigenden Konzentrationen von Harnstoff (1 M, 2 M, 3 M) in Lysepuffer gewaschen. Das Protein wurde aus dem Zentrifugationspellet mit 0,1 N NaOH, 4 M Harnstoff in Lysepuffer solubilisiert. Zelttrümmer wurden durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 3000 bis 5000 UpM, 15 Minuten entfernt. Der Überstand wurde mit 6 N HCl auf pH 8,0 angepasst, um unter diesen Bedingungen unlösliche Proteine auszufällen.
Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde auf 2,3 % SDS, 50 mM DTT, pH 8,0 eingestellt und für 3 Minuten gekocht. Die Proteine in der Mischung wurden durch Gelfiltration auf einer Pharmacia-Sephacryl S-400 in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 0,1 % SDS, 1 mM EDTA enthielt und auf pH 7,4 eingestellt war, fraktioniert. Die Eluatfraktionen von der Säule, die MEFA 7 enthielten, wurden gesammelt, vereinigt und mittels einer Amicon-YM-30-Membran aufkonzentriert. Die Gelfiltration wurde mit den vereinigten Frak tionen unter Verwendung derselben Säule und derselben Bedingungen wiederholt.
Während der Analyse von MEFA 7 in einem Testassay wurde entdeckt, dass ein monoklonaler Antikörper, der als Nachweiskonjugat verwendet wurde, mit einer spezifischen Sequenz des Core-Epitops (Aminosäuren 33-38) reagiert. Daher wurde ps.MEFA7.1 so gestaltet, dass die Aminosäuren 33-38 aus der Region des Core-Epitops eliminiert wurden.
Ein Hefe-Expressionsvektor für MEFA 7.1 wurde wie folgt hergestellt. Zunächst wurde die doppelte Wiederholung des Core-Epitops am 3'-Ende von ps.MEFA7 modifiziert. Um diese zu erreichen, wurden ein synthetisches NcoI/KpnI-Fragment von 206 bp, das für die erste Wiederholung des Core-Epitops (Aminosäuren 9-32, 39-42 und 64-88 von HCV-1 und Aminosäuren 67-82 von HCV-2) kodiert, sowie ein synthetisches KpnI/SalI-Fragment von 233 bp, das für die Aminosäuren 83 und 84 von HCV-2 kodiert, gefolgt von der zweiten Wiederholung des Core-Epitops (Aminosäuren 9-32, Aminosäuren 39-42 und Aminosäuren 64-88, HCV-1, Aminosäuren 67-84, HCV-2) in einen pSP72new.NcoI/KpnI-Vektor bzw. in einen pSP72new.KpnI/SalI-Vektor subkloniert. Nach Transformation in HB101, Identifizieren des Klons und Bestätigung der Sequenz wurde pSP72newNKi Klon #21 mit NcoI und KpnI verdaut, um das NcoI/KpnI-Fragment von 206 bp zu isolieren, und pSP72newKSi Klon #32 wurde mit KpnI und SalI verdaut, um das KpnI/SalI-Fragment von 233 bp zu isolieren.
Das Plasmid ps.MEFA7.1 wurde zusammengesetzt, indem die folgenden Fragmente in den Hefe-Expressionsvektor pBS24.1 BamHI/SalI ligiert wurden (siehe 8):
das oben für ps.MEFA7 beschriebene BamHI/HindIII-Fragment von 1896 bp;
das oben für ps.MEFA7 beschriebene HindIII/SphI-Fragment von 1560 bp;
ein SphI/NcoI-Fragment von 776 bp, das ausgehend von ps.MEFA7 isoliert wurde und für die 5-1-1-Epitope, das c100-Epitop und das NS5-Epitop kodiert;
das NcoI/KpnI-Fragment von 206 bp;
und das KpnI/SalI-Fragment von 233 bp.
Der S. cerevisiae-Stamm AD3 wurde mit ps.MEFA7.1 kloniert, und einzelne Transformanten wurden nach Entreicherung des Mediums von Glucose hinsichtlich ihrer Expression untersucht, wie es oben beschrieben ist. Das rekombinante Protein wurde in hohen Mengen in der Hefe exprimiert, wie durch Coomassie-Blau-Färbung nachgewiesen wurde.
Das MEFA 7.1-Antigen wurde wie folgt aufgereinigt. S. cerevisiae-Zellen, die MEFA 7.1 exprimierten, wurden wie oben beschrieben geerntet. Die Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert und in einer Dyno-Mühle (Wab Willy A. Bachofen, Basel, Schweiz) oder in einem ähnlichen Gerät unter Verwendung von Glaskügelchen (glass beads) lysiert. Das Lysat wurde bei 10000 UpM für 30 Minuten in einem JA10-Rotor zentrifugiert, und das Pellet, das die unlösliche Proteinfraktion enthielt, wurde mit ansteigenden Konzentrationen von Harnstoff (1 M, 2 M, 3 M) in Lysepuffer gewaschen. Das Protein wurde ausgehend von dem Zentrifugationspellet mit 0,1 N NaOH, 4 M Harnstoff, 50 mM DTT in Lysepuffer solubilisiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 14000 UpM für 20 Minuten in einem JA14-Rotor entfernt. Der Überstand wurde mit 6 N HCl auf pH 8,0 eingestellt, um unter diesen Bedingungen unlösliche Proteine zu präzipitieren.
Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation bei 14000 UpM für 20 Minuten in einem JA14-Rotor entfernt. Der Überstand wurde auf 2,3 SDS eingestellt, in kochendem Wasser auf 70-75°C erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Proteine in der Mischung wurden durch Gelfiltration auf einer Pharmacia Sephacryl S-400 HR in PBS fraktioniert, das 0,1 SDS, 1 mM EDTA enthielt und auf pH 7,4 eingestellt war. Eluatfraktionen der Säule, die MEFA 7.1 enthielten, wurden gesammelt, vereinigt und mittels einer Amicon-YM-30-Membran aufkonzentriert. Die vereinigten Gelfiltrationsfraktionen wurden auf 2,3 SDS und 50 mM DTT eingestellt und wie oben beschrieben erhitzt/abgekühlt. Diese Vereinigung wurde einem zweiten Gelfiltrationsschritt auf einer Pharmacia Sephacryl S-300 HR-Säule unterworfen, wobei dieselben Bedingungen wie beim ersten Gelfiltrationsschritt angelegt wurden.
BEISPIEL 2
Rekombinante Herstellung eines NS3/4a-Konformationsepitops
Ein Konformationsepitop von NS3/4a wurde wie folgt erhalten. Dieses Epitop weist die in den 3A bis 3D gezeigte Sequenz auf und unterscheidet sich von der nativen Sequenz an Position 403 (Aminosäure 1428 der HCV-1-Sequenz vollständiger Länge) und 404 (Aminosäure 1429 der HCV-1-Sequenz vollständiger Länge). Das Thr, das normalerweise in Position 1428 der nativen Sequenz vorkommt, wurde zu einem Pro mutiert, und das Ser, das an Position 1429 der nativen Sequenz vorkommt, wurde zu Ile mutiert.
Der verwendete Hefe-Expressionsvektor war der oben beschriebene pBS24.1. Das Plasmid pd.hcv1a.ns3ns4aPI, das für eine repräsentatives NS3/4a-Epitop kodierte, welches in den vorliegenden Immunassays verwendet wurde, wurde wie folgt hergestellt. Es wurde ein zweistufiges Verfahren verwendet. Zunächst wurden die folgenden DNA-Stücke aneinander ligiert: (a) synthetische Oligonukleotide, die eine 5'-HindIII-Klonierungs stelle bereitstellen, gefolgt von der Sequenz ACAAAACAAA, dem Start-ATG, und Codons für HCV1a, beginnend mit Aminosäure 1027, wobei sich diese bis zu einer BglI-Schnittstelle bei Aminosäure 1046 fortsetzen; (b) ein Bg1I-ClaI-Restriktionsfragment von 683 bp (kodierend für die Aminosäuren 1046-1274) von pAcHLTns3ns4aPI; und (c) ein pSP72-Vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Zugriffsnummer X65332), der mit HindIII und ClaI verdaut, dephosphoryliert und aus dem Gel aufgereinigt worden war. Das Plasmid pAcHLTns3ns4aPI wurde von pAcHLT abgeleitet, einem Baculovirus-Expressionsvektor, der kommerziell von BD Pharmingen (San Diego, CA) erhältlich ist. Es wurde insbesondere ein pAcHLT EcoRI-PstI-Vektor hergestellt, sowie die folgenden Fragmente: EcoRI-AlwnI, 935 bp, das den Aminosäuren 1027-1336 des Genoms von HCV-1 entspricht; AlwnI-SacII, 247 bp, das den Aminosäuren 1336-1419 des Genoms von HCV-1 entspricht; HinfI-BglI, 175 bp, das den Aminosäuren 1449-1509 des Genoms von HCV-1 entspricht; BglI-PstI, 619 bp, das den Aminosäuren 1510-1711 des Genoms von HCV-1 entspricht, plus dem Transkriptionsterminationscodon. Ein synthetisch hergestelltes SacII-HinfI-Fragment von 91 bp, das den Aminosäuren 1420-1448 des Genoms von HCV-1 entspricht, und das die PI-Mutationen (Thr-1428 mutiert zu Pro, Ser-1429 mutiert zu Ile) enthält, wurde mit dem HinfI-BglI-Fragment von 175 bp und dem BglI-PstI-Fragment von 619 bp, die oben beschrieben wurden, ligiert und in einen pGEM-5Zf(+)-Vektor subkloniert, der mit SacII und PstI verdaut worden war. Der pGEM-5Zf(+)-Vektor ist ein kommerziell erhältlicher E. coli-Vektor (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Zugriffsnummer X65308). Nach Transformation von kompetenten HB101-Zellen, Miniscreen-Analyse von einzelnen Klonen und Verifizieren der Sequenz wurde ein SacII-PstI-Fragment von 885 bp von pGEM5.PI Klon2 aus dem Gel aufgereinigt. Dieses Fragment wurde mit dem EcoRI-AlwnI-Fragment von 935 bp, dem AlwnI-SacII-Fragment von 247 bp und dem oben beschriebenen pAcHLT EcoRI-PstI-Vektor ligiert. Das resultierende Konstrukt wurde als pAcHLTns3ns4aPI bezeichnet.
Die obige Ligationsmischung wurde in kompetente HB101-Zellen transformiert und auf Luria-Agarplatten ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Miniprep-Analysen von einzelnen Klonen führten zur Identifizierung von vermeintlich positiven Klonen, von denen zwei amplifiziert wurden. Die Plasmid-DNA für pSP72 1aHC, Klone #1 und #2, wurde mit einem Qiagen-Maxiprep-Kit präpariert, und sie wurde sequenziert.
Als Nächstes wurden die folgenden Fragmente aneinander ligiert: (a) ein HindIII-ClaI-Fragment von 761 bp aus pSP721aHC #1 (pSP72.1aHC wurde hergestellt, indem nachfolgendes ligiert wurde: pSP72, der mit HindIII und ClaI verdaut worden war, synthetische Oligonukleotide, die eine 5'-HindIII-Klonierungsstelle bereitstellen, gefolgt von der Sequenz ACAAAACAAA, dem Startcodon ATG, sowie Codons für HCV1a, beginnend mit Aminosäure 1027, wobei sich diese bis zu einer BgIII-Schnittstelle bei Aminosäure 1046 fortsetzen, und ein BgIII-ClaI-Restriktionsfragment von 683 bp (das für die Aminosäuren 1046-1274 kodiert) aus pAcHLTns3ns4aPI); (b) ein BamHI-HindIII-Fragment von 1353 bp für den Hefe-Hybrid-Promotor ADH2/GAPDH; (c) ein ClaI-SalI-Fragment von 1320 bp (das für die Aminosäuren 1046-1711 von HCV-1 kodiert, wobei Thr 1428 zu Pro mutiert ist und Ser 1429 zu Ile mutiert ist) aus pAcHLTns3ns4aPI; und (d) der Hefe-Expressionsvektor pBS24.1, der mit BamHI und SalI verdaut, dephosphoryliert und aus dem Gel aufgereinigt worden war. Die Ligationsmischung wurde in kompetente HB101 transformiert und auf Luria-Agarplatten ausplattiert, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Miniprep-Analysen von einzelnen Kolonien führten zur Identifizierung von Klonen mit dem erwarteten BamHI-SalI-Insert von 3446 bp, das aus dem ADH2/GAPDH-Promotor, dem Startcodon ATG und HCV1a NS3/4a aus Aminosäuren 1027-1711 (gezeigt als Aminosäuren 1-686 in den 3A-3D) bestand, wobei Thr 1428 (Aminosäureposition 403 in 3A-3D) zu Pro mutiert war und Ser 1429 (Aminosäureposition 404 in 3A-3D) zu Ile mutiert war. Das Konstrukt wurde als pd.HCV1a.ns3ns4aPI bezeichnet (siehe 9).
S. cerevisiae-Stamm AD3 wurde mit pd.HCV1a.ns3ns4aPI transformiert, und einzelne Transformanten wurden hinsichtlich der Expression nach Entreicherung des Mediums von Glucose überprüft. Das rekombinante Protein wurde in hohen Mengen in der Hefe exprimiert, wie durch Coomassie-Blau-Färbung nachgewiesen wurde, und durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen die Helicasedomäne von NS3 bestätigt wurde.
BEISPIEL 3
Aufreinigung des NS3/4a-Konformationsepitops
Das NS3/4a-Konformationsepitop wurde wie folgt gereinigt. S. cerevisiae-Zellen, die oben beschrieben worden sind, und die das NS3/4a-Epitop exprimierten, wurden wie oben beschrieben geerntet. Die Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin) suspendiert und in einer Dyno-Mühle (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Schweiz) oder in einem äquivalenten Gerät unter Verwendung von Glaskügelchen lysiert, wobei ein Verhältnis von 1:1:1 von Zellen:Puffer:0,5 mm Glaskügelchen verwendet wurde. Das Lysat wurde bei 30100 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert, und das Pellet, das die unlösliche Proteinfraktion enthielt, wurde zu Waschpuffer (6 ml/g Startgewicht des Zellpellets) gegeben und bei Raumtemperatur für 15 Minuten geschüttelt. Der Waschpuffer bestand aus 50 mM NaPO₄, pH 8,0, 0,3 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerol, 0,05 % Octylglucosid, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 30100 × g für 30 Minuten bei 4°C entfernt. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde zurückbehalten.
Das Protein wurde aus dem Pellet wie folgt extrahiert. 6 ml/g Extraktionspuffer wurden zugesetzt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten geschüttelt. Der Extraktionspuffer enthielt 50 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl, 5 mM β-Mercaptoethanol, 10 % Glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 μM Pepstatin, 1 μM Leupeptin. Es wurde bei 30100 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückbehalten, und es wurden bis zu 17,5 % Ammoniumsulfat zugefügt, wobei folgende Formel verwendet wurde: Volumen des Überstands (ml) multipliziert mit x% Ammoniumsulfat/(1 - x% Ammoniumsulfat) = ml von 4,1 M gesättigtem Ammoniumsulfat für die Zugabe zum Überstand. Das Ammoniumsulfat wurde tropfenweise zugefügt, wobei auf Eis gerührt wurde, und die Lösung wurde für 10 Minuten auf Eis gerührt. Die Lösung wurde bei 17700 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert, und das Pellet wurde zurückbehalten und bei 2°C bis 8°C für bis zu 48 Stunden gelagert.
Das Pellet wurde resuspendiert und wie folgt auf eine Poly-U-Säule (Poly-U-Sepharose 43, Amersham Pharmacia) aufgetragen. Das Pellet wurde in 6 ml Poly-U-Äquilibrierungspuffer pro Gramm Pelletgewicht resuspendiert. Der Äquilibrierungspuffer bestand aus 25 mM HEPES, pH 8,0, 200 mM NaCl, 5 mM DTT (frisch zugesetzt), 10 % Glycerol, 1,2-Octylglucosid. Die Lösung wurde bei 4°C für 15 Minuten geschüttelt und bei 31000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Es wurde eine Poly-U-Säule (1 ml Säule pro Gramm Startgewicht des Pellets) hergestellt. Die lineare Flussrate betrug 60 cm/h und die Packungsflussrate betrug 133 % von 60 cm/h. Die Säule wurde mit Äquilibrierungspuffer äquilibriert, und der Überstand des resuspendierten Ammoniumsulfat-Pellets wurde auf die äquilibrierte Säule geladen. Die Säule wurde bis zur Basislinie mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, und Protein wurde mit einer Schritt-Flution in den folgenden Poly-U-Elutionspuffer eluiert: 25 mM HEPES, pH 8,0, 1 M NaCl, 5 mM DTT (frisch zugesetzt), 10 % Glycerol, 1,2-Octylglucosid. Das Eluat von der Säule wurde auf einer SDS-PAGE gefahren (Coomassie-Färbung), und Aliquots wurden eingefroren und bei -80°C gelagert. Das Vorhandensein des NS3/4a-Epitops wurde durch Western-Blot bestätigt, wobei ein polyklonaler Antikörper verwendet wurde, der gegen die NS3-Proteasedomäne gerichtet war, sowie ein monoklonaler Antikörper gegen das 5-1-1-Epitop (HCV 4a).
Darüber hinaus wurde die Protease-Enzymaktivität während der Reinigung wie folgt überwacht. Ein NS4A-Peptid (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK) und die Probe, die das NS3/4a-Konformationsepitop enthielt, wurden in 90 μl Reaktionspuffer (25 mM Tris, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 % Glycerol, 0,05 n-Dodecyl-B-D-Maltosid, 5 mM DTT) verdünnt, und es wurde ihnen erlaubt, sich für 30 Minuten bei Raumtemperatur zu mischen. 90 μl der Mischung wurden in eine Mikrotiterplatte gegeben (Costar, Inc., Corning, NY), und es wurden 10 μl HCV-Substrat (AnaSpec, Inc., San Jose, CA) zugegeben. Die Platte wurde gemischt und mit einem Fluostar-Plattenlesegerät ausgelesen. Die Ergebnisse wurden als relative Fluoreszenzeinheiten (relative fluorescence units, RFU) pro Minute ausgedrückt.
Bei Anwendung dieser Verfahren enthielt das Produkt der Extraktion mit 1 M NaCl 3,7 RFU/Minute Aktivität, das Ammoniumsulfat-Präzipitat wies eine Aktivität von 7,5 RFU/Minute auf, und das Produkt der Poly-U-Rufreinigung zeigte eine Aktivität von 18,5 RFU/Minute.
BEISPIEL 4
Beschichtung des festen Trägers mit HCV-Antigenen
Das HCV NS3/4a-Konformationsepitop und das MEFA 7.1-Antigen wurden wie folgt auf Platten geschichtet. HCV-Beschichtungspuffer (50 mM NaPO₄, pH 7,0, 2 mM EDTA und 0,1 Chloracetamid) wurden durch eine 0,22 μ-Filtereinheit filtriert. Die folgenden Reagenzien wurden anschließend nacheinander zu dem HCV-Beschichtungspuffer gegeben, wobei nach jeder Zugabe gerührt wurde: 2 μg/ml modifiziertes BSA-Sulfhydryl aus einer Lösung von 10 mg/ml (Bayer Corp. Pentex, Kankakee, Illinois); 5 mM DTT aus einer 1 M Lösung (Sigma, St. Louis, MO); 0,45 μg/ml NS3/4a (Proteinkonzentration von 0,3 mg/ml); 0,375 μg/ml MEFA 7.1 (Proteinkonzentration von 1 mg/ml). Die finale Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
200 μl der obigen Lösung wurden in jede Vertiefung einer Costar High Einding-Platte mit flachem Boden gegeben (Corning Inc., Corning, New York), und die Platten wurden über Nacht in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit Waschpuffer (1 × PES, 0,1 TWEEN-20) gewaschen und abgesaugt, und es wurden 285 μl Ortho Post-Beschichtungspuffer (1 × PES, pH 7,4, 1 BSA, 3 Sucrose) zugegeben. Die Platten für mindestens 1 Stunde inkubiert, abgesaugt und über Nacht bei 2 bis 8°C getrocknet. Die Platten wurden für die künftige Verwendung mit Trockenmittel verpackt.
BEISPIEL 5
Untersuchungen zur frühen Serokonversion
Das Verhalten der Antigene NS3/4a und MEFA 7.1 in einem Kombinationsassay (HCV 4.0) wurde mit anderen HCV-Assays verglichen, um die Nachweisgrenzen der Serokonversion zu untersuchen, und diese Grenzen mit denjenigen zu vergleichen, die mit anderen kommerziell verfügbaren Assays erhalten werden. Es wurden Panels aus kommerziell erhältlichen humanen Blutproben verwendet, die mit HCV infiziert waren. Die PHV-Panels, die in den nachfolgenden Tabellen gezeigt sind, wurden von Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA (BBI) erhalten. Die 6212-Panels wurden von Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP) erhalten. Die SC-Panels wurden von North American Biologics, Inc., BocoRatan, FL (NABI) erhalten. Der Tag, an dem die Blutproben erhalten wurden, ist in den Tabellen angegeben.
Der HCV 4.0 Assay wurde wie folgt durchgeführt. 200 μl Probenverdünnungspuffer (1 g/l Casein, 100 mg/l rekombinantes humanes SOD, 1 g/l Chloracetamid, 10 g/l BSA, 500 mg/l Hefeextrakt, 0,366 g/l EDTA, 1,162 g/l KPO₄, 5 ml/l Tween-20, 29,22 g/l NaCl, 1,627 g/l NaPO₄, 1 SDS) wurden zu den beschichteten Platten gegeben. 20 μl der Probe wurden anschließend zugegeben. Diese wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden mit Waschpuffer (1 × PBS, pH 7,4, 0,1 Tween-20) gewaschen. 200 μl Konjugatlösung (ein Maus-Anti-Human-IgG-HRP, wie beispielsweise ein Maus-Anti-Human-IgG-HRP, der 1:22000 in ORTHO HCV 3,0 ELISA-Testsystem mit verstärktem Save-Bulk-Konjugatverdünnungsmittel (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) verdünnt ist, wurde zugesetzt, und es wurde für 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Es wurde wie oben beschrieben gewaschen, und es wurden 200 μl Substratlösung (1 OPD Tablette/10 ml) zugegeben. Die OPD-Tablette enthielt o-Phenylendiamindihydrochlorid und Wasserstoffperoxid für die Farbentwicklung bei einer Meerrettichperoxidasereaktion. Es wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 50 μl 4N H₂SO₄ abgestoppt, und die Platten wurden bei 492 nm relativ zur Absorption bei 690 nm als Kontrolle ausgelesen.
Die weiteren Assays, die im Rahmen dieser Untersuchung verwendet wurden, waren die Folgenden:
Der Abbott-PRISM-Assay (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) ist kommerziell erhältlich, und es handelt sich um einen Antikörper-basierten Nachweisassay. Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Das ORTHO-HCV Version 3.0 ELISA-Testsystem (HCV 3.0) (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) ist ein Antikörperbasierter Nachweisassay. Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Der Pasteur-MONOLISA Anti-HCV-Plus Version 2-Assay (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette, Frankreich) ist ein Antikörper-basierter Nachweisassay. Der Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Das Abschneiden des HCV 4.0-Assays wurde mit dem HCV 3.0-Assay, dem PRISM-Assay und dem Pasteur-Assay verglichen (siehe Tabellen 3 und 4). HCV-Antikörper, die in den Blut-Panels vorhanden waren (Anti-c33c oder Anti-c22), sind in Tabelle 4 gezeigt. Es wurden 17 Serokonversions-Panel aus den drei oben angegebenen kommerziellen Quellen unter Verwendung der obigen Methoden getestet. Für die c33c-Panels ist zu erkennen, dass HCV 4.0 einen früheren Nachweis (um 1-3 Blutentnahmen) als HCV 3.0 in 9 von 9 c33c-Panels zeigte, und einen früheren Nachweis als PRISM in 6 von 9 Panels und einen gleichartigen Nachweis im Vergleich zu PRISM in 3 von 9 Panels. Bei den c22-Panels zeigte HCV 4.0 einen früheren Nachweis als HCV 3.0 in 3 von 8 Panels und einen gleichartigen Nachweis in den anderen 5 Panels. HCV 4.0 zeigte ferner einen früheren Nachweis als PRISM in 2 von 8 Panels und einen gleichartigen Nachweis in 6 von 8 Panels. Der beobachtete Bereich der Verbesserung betrug 2 bis 14 Tage im Vergleich sowohl gegenüber dem HCV 3.0-Assay als auch gegenüber dem PRISM-Assay. Tabelle 3

			HCV 4.0	Ortho HCV 3.0	Abbott Prism
ID	Tag Blutentnahme	s	s/co	s/co	s/co
PHV 904-1	0	0,031	0,05	0,01	0,12
PHV 904-2	2	0,024	0,04	0,01	0,08
PHV 904-3	7	1,391	2,11	0,33	0,51
PHV 904-4	9	2,813	4,28	1,10	1,56
PHV 904-5	14	3,197	4,86	3,27	3,54
PHV 904-6	21	3,176	4,83	3,92	4,45
PHV 904-7	23	3,554	5,40	4,26	4,69

PHV 905-1	0	0,015	0,02	0,02	0,06
PHV 905-2	4	0,019	0,03	0,01	0,07
PHV 905-3	7	0,079	0,12	0,02	0,14
PHV 905-4	11	0,950	1,44	0,42	0,70
PHV 905-5	14	1,586	2,41	0,80 -	1,21
PHV 905-6	18	2,529	3,84	1,32	2,00 -
PHV 905-7	21	3,177	4,83	2,54	3,44
PHV 905-8	25	3,419	5,20	4,45	4,74
PHV 905-9	28	3,408	5,18	4,85	5,04

PHV 907-1	0	0,030	0,05	0,01	0,09
PHV 907-2	4	0,023	0,03	0,01	0,09
PHV 907-3	7	0,021	0,03	0,01	0,11
PHV 907-4	13	0,148	0,22	0,13	0,35
PHV 907-5	18	1,726	2,62	0,83 -	1,68
PHV 907-6	21	2,785	4,23	1,59	3,12
PHV 907-7	164	3,279	4,98	4,85	5,16

PHV 908-1	0	0,029	0,04	0,01	0,07
PHV 908-2	3	0,079	0,12	0,01	0,08
PHV 908-3	5	0,399	0,61	0,01	0,13
PHV 908-4	11	1,780	2,71	0,50	1,27
PHV 908-5	13	2,068	3,14	0,67	1,61
PHV 908-6	19	2,793	4,24	1,16	3,11
PHV 908-7	25	3,390	5,15	3,11	4,29
PHV 908-8	27	3,299	5,01	3,78	4,44
PHV 908-9	32	3,474	5,28	4,85	4,54
PHV 908-10	35	3,707	5,63	4,85	4,92
PHV 908-11	41	3,363	5,11	4,85	6,09
PHV 908-12	45	3,372	5,12	3,80	5,79
PHV 908-13	48	3,278	4,98	4,85	5,56

PHV 913-1	0	0,060	0,09	0,01	0,08
PHV 913-2	2	0,242	0,37	0,02	0,10
PHV 913-3	7	0,893	1,36	0,43 -	0,5 -
PHV 913-4	9	1,141	1,73	0,54 -	0,59 -

PHV 914-1	0	0,033	0,05	0,00	0,06
PHV 914-2	5	0,024	0,04	0,01	0,06
PHV 914-3	9	0,135	0,21	0,01	0,06
PHV 914-4	12	2,653	4,03	0,04	0,09
PHV 914-5	16	3,020	4,59	0,33 -	0,47 -
PHV 914-6	19	2,302	3,60	0,82 -	0,9 -
PHV 90147	24	2,697	4,10	3,10	2,41
PHV 914-8	30	2,744	4,17	4,85	4,09
PHV 914-9	33	2,991	4,55	4,85	4,52

6212-1	16.11.95	0,723	1,10	0,01	0,08
6212-2	28.11.95	2,716	4,13	0,85	1,26
6212-3	30.11.95	3,117	4,74	1,15	1,11
6212-4	09.12.95	3,278	4,98	4,08	2,65
6212-5	12.12.95	3,527	5,36	5,04	3,13
6212-6	18.12.95	3,292	5,00	5,51	3,07
6212-7	23.12.95	3,096	4,71	5,43	2,80
6212-8	08.01.96	3,241	4,93	13,4	3,48
6212-9	10.01.96	3,306	5,02	13,4	4,04

6213-1	16.01.96	0,035	0,05	0,01	0,09
6213-2	18.01.96	0,028	0,04	0,00	0,07
6213-3	24.01.96	0,037	0,06	0,01	0,08
6213-4	27.01.96	0,047	0,07	0,01	0,09
6213-5	31.01.96	0,034	0,05	0,01	0,07
6213-6	03.02.96	0,037	0,06	0,01	0,07
6213-7	13.01.96	0,056	0,09	0,01	0,07
6213-8	15.02.96	0,027	0,04	0,01	0,06
6213-9	20.02.96	0,098	0,15	0,01	0,11
6213-10	22.02.96	1,572	2,39	0,46 -	1,26
6213-11	28.02.96	3,410	5,18	4,18	4,75
6213-12	02.03.96	3,224	4,90	4,67	4,68

62141	13.01.96	0,042	0,06	0,01	0,09
6214-2	15.01.96	0,016	0,02	0,00	0,07
6214-3	21.01.96	0,035	0,05	0,00	0,07
6214-4	23.01.96	0,028	0,04	0,00	0,07
6214-5	29.01.96	0,031	0,05	0,00	0,08
6214-6	31.01.96	0,028	0,04	0,00	0,09
6214-7	05.02.96	0,364	0,55	0,01	0,59
6214-8	07.02.96	0,916	1,39	0,02 -	1,36
6214-9	12.02.96	2,290	3,48	0,94 -	2,31
6214-10	14.02.96	3,669	5,58	2,29	3,05
6214-11	02.03.96	3,523	5,35	3,15	5,32
6214-12	06.03.96	3,125	4,75	4,75	5,38
6214-13	09.03.96	3,246	4,93	4,89	5,17

6222-1	18.07.96	0,023	0,03	0,01	0,08
6222-2	20.08.96	0,151	0,23	0,00	0,06
6222-3	04.09.96	0,053	0,08	0,00	0,06
6222-4	06.09.96	0,016	0,02	0,00	0,06
6222-5	11.09.96	0,015	0,02	0,00	0,07
6222-6	13.09.96	0,009	0,01	0,00	0,06
6222-7	23.09.96	0,817	1,24	0,04	0,36
6222-8	27.09.96	2,862	4,35	1,10	3,74

SC-0030-A SC-0030-B SC-0030-C	1 40 45	0,024 1,658 2,372	0,04 2,52 3,60	0,01 0,94 - 3,07	0,05 0,54 - 3,15

SC-0040-A SC-0040-B SC-0040-C SC-0040-D SC-0040-E	1 3 8 10 15	0,773 1,491 2,400 2,639 3,423	1,17 2,27 3,65 4,01 5,20	0,02 0,12 0,77 - 1,37 3,46	0,09 0,54 2,66 3,23 3,46

Tabelle 4

			Blutproben früherer Nachweis
		Panel	HCV 3.0	Abbott Prism	frühen c33c Panels	frühen c22 Panels
#1	c33c	PHV 904	2	2	PHV 904	PHV 907
#2	c33c	PHV 905	7	3	PHV 905	PHV 909
#3	c22	PHV 907	3	0	PHV 908	PHV 910
#4	c33c	PHV 908	8	0	PHV 914	PHV 911
#5	c22	PHV 909	0	0	6212	PHV 912
#6	c22	PHV 910	0	0	6213	PHV 913
#7	c22	PHV 911	0	0	6214	SC-0010
#8	c22	PHV 912	0	0	6222	SC-0030
#9	c22	PHV 913	2	2	SC-0040
#10	c33c	PHV 914	12	12
#11	c33c	6212	14	12
#12	c33c	6213	6	0
#13	c33c	6214	7	0
#14	c33c	6222	4	4
#15	c22	SC-0010	0	0
#16	c22	SC-0030	5	5
#17	c33c	SC-0040	9	7
Bereich der Verbesserung			2-14 Tage	2-12 Tage

BEISPIEL 6
HCV 4.0 Genotypsensitivität
Die Genotypsensitivität des HCV 4.0-Assays wurde mit dem oben beschriebenen HCV 3.0-Assay und dem Pasteuer-Assay verglichen. Proben von 10 verschiedenen HCV-Genotypen, die in Tabelle 5 erläutert sind, wurden wie in der Tabelle angegeben verdünnt (zweifach oder zehnfach, abhängig von der ursprünglichen Probenverdünnung) und in den 3 Assays verwendet, wobei die oben beschriebenen Vorgehensweisen angewendet wurden. Alle drei Tests wurden gleichzeitig durchgeführt. Die Daten sind als Signal oder unbearbeitete O.D. (raw O.D.) gezeigt. Die Daten verweisen darauf, dass der HCV 4.0-Prototyp beim Nachweis von verdünnten Genotyp-Proben sensitiver ist.
BEISPIEL 7
Kompetitionsuntersuchungen
Die folgende Kompetitionsuntersuchung wurde durchgeführt, um festzustellen, ob das NS3/4a-Konformationsepitop andere Antikörper nachweist als andere HCV-Antigene. Das NS3/4a-Antigen wurde wie folgt mit dem c200-Antigen verglichen.
0,5 μg und 1,0 μg NS3/4a, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, oder c200 (Hepatology (1992) 15:19-25, erhältlich im ORTHO-HCV Version 3.0-ELISA-Testsystem, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) wurden in einem Gesamtvolumen von 220 μl (1 × PBS) mit 20 μl PHV914-5-Probe gemischt (einer Blutprobe einer frühen Serokonversion, die von Blut eines infizierten Individuums erhalten wurde). Die Mischung wurde für 1 Stunde in Mikrovertiefungen bei 37°C inkubiert. Die Mischung wurde anschließend in NS3/4a-beschichtete Platten überführt und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und wie folgt untersucht.
1 μg Antigen c200 wurde in einem Gesamtvolumen von etwa 220 μl zu 10 μl der PHV914-5-Probe gegeben. Die Mischung wurde für 1 Stunde in einer Mikrovertiefung bei 37°C inkubiert und 200 μl davon wurden auf eine mit NS3/4a beschichtete Platte (100 ng/Assay) überführt und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten für fünfmal mit 1 × PBS, 0,1 Tween-20 gewaschen. 200 μl der Konjugatlösung (oben beschrieben) wurden zugesetzt, und die Platten wurden inkubiert und wie in Beispiel 4 für den HCV 4.0-Assay beschrieben untersucht. Kontrollen, die aus PHV914-5 und 1 × PBS (ohne Antigen) bestanden, wurden ebenfalls wie oben beschrieben behandelt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Ergebnisse für die prozentuale Inhibierung, die in Spalte 4 gezeigt sind, werden als Spalte 3 minus (Spalte 2 geteilt durch Spalte 3 mal 100) berechnet. Wie zu erkennen ist, zeigen die Daten, dass NS3/4a durch Antikörper einer frühen Serokonversion neutralisiert wird, wobei dies bei c200 nicht der Fall ist. Ein starkes Signal wurde erhalten, wenn Antikörper bei einem Mitglied des c33c-Panels mit früher Serokonversion PHV914-5 mit dem auf die Platte geschichteten NS3/4a reagierte. Das c200-Antigen wurde durch diese Antikörper nicht neutralisiert. Dies ist im obersten Abschnitt von Tabelle 6 gezeigt. Bei Mischen von NS3/4a mit der PHV914-5-Probe gemischt wurde dieses neutralisiert und aus diesem Grund waren keine Antikörper in der Probe vorhanden, um mit dem NS34a zu reagieren, das auf die Mikroplatte geschichtet war. Diese Daten verweisen darauf, dass NS34a eine unterschiedliche Klasse von Antikörpern nachweisen könnte, als durch c200 nachgewiesen wird. Tabelle 6 Kompetitionsuntersuchung, um nachzuweisen, dass das NS34a-Antigen im Vergleich zum c200-Antigen unterschiedliche Antikörper im c33c-Panel mit früher Serokonversion nachweist

	1	2	3	4
c200	+	PHV914-5	Kontrolle 1 × PBS	% Inhibierung
		S	S
1 μg		1,450	1,645	12
1 μg		1,545	1,687	8
0,5 μg		1,557	1,913	19
0,5 μg		1,719	1,804	5

NS3/4a	+	PHV914-5
		S	S
1 μg		0,054	1,599	97
1 μg		0,037	1,677	98
0,5 μg		0,066	1,672	96
0,5 μg		NA	1,524	NA

BEISPIEL 8
Untersuchungen zur Stabilität des NS3/4a-Konformationsepitops
Um die Rolle der Stabilität des NS3/4a-Epitops auf das Abschneiden des Assays zu untersuchen, wurde die folgende Untersuchung durchgeführt, um die NS3/4a-Immunreaktivität pro Zeit bei Raumtemperatur zu bestimmen. Kleine Aliquots eines Vorrats von NS3/4a wurde es bei Raumtemperatur erlaubt, sich zu setzen, und diese wurden anschließend in den in Tabelle 7 gezeigten Intervallen eingefroren. Alle Fläschchen wurden gleichzeitig beschichtet und gegen zwei frühe NS3-Serokonversions-Panels getestet. Die Assays wurden wie oben in Beispiel 5 für HCV 4.0 beschrieben durchgeführt.
Wie in Tabelle 7 zu erkennen ist, ist der NS3/4a-Vorrat nicht stabil, und die Immunreaktivität nimmt mit der Zeit ab. Darüber hinaus ist die Beibehaltung der NS3/4a-Konformation für die Immunreaktivität notwendig.

Weitere Stabilitätsstudien wurden wie folgt durchgeführt. Zwei monoklonale Konformations-Antikörper, die gemäß Standardverfahren gegen NS3/4a hergestellt worden waren, wurden gegen Anti-HCV-Panels früher Serokonversion ausgetauscht. Vorratsfläschchen mit NS3/4a wurden bei Raumtemperatur in den Zeitintervallen 3, 6 und 24 Stunden gelagert. Das NS3/4a aus den gefrorenen Fläschchen wurde mit 90 ng/ml beschichtet und unter Verwendung der oben beschriebenen Vorgehensweise untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass die zwei monoklonalen Antikörper tatsächlich Konformations-Antikörper waren, und ihre Reaktivität empfindlich auf die Behandlung des NS3/4a-Antigenvorrats bei Raumtemperatur reagierte. Die Reaktivität eines als Positivkontrolle verwendeten monoklonalen Antikörpers änderte sich nicht. Tabelle 7

Zeit (h)	0	6	21,4	29	35,5	46	52	Kontrolle
	A	D	G	H	I	K	N	Referenz
	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co	s/co
PHV 904-1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 904-2	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 904-3	1,5	0,3	0,1	0,0	0,0	0,0	0,0	1,8
PHV 904-4	3,7	1,0	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	4,4
PHV 904-5	4,8	2,0	0,7	0,6	0,3	0,2	0,3	5,5
PHV 904-6	5,4	2,8	1,1	1,0	0,6	0,5	0,6	5,8
PHV 904-7	5,1	3,4	1,5	1,0	1,1	0,5	0,7	5,4

PHV 914-1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-2	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-3	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0
PHV 914-4	0,5	0,1	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	0,7
PHV 914-5	2,1	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	3,0
PHV 914-6	2,3	0,4	0,0	0,0	0,0	0,0	0,0	3,4
PHV 914-7	2,8	0,5	0,1	0,1	0,0	0,0	0,0	4,9
PHV 914-8	2,9	0,7	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	4,9


Enzym
RFU/min	8,75	4,14	3,08	1,88	1,75	1,75	0,75

BEISPIEL 9
Immunreaktivität des NS3/4a-Konformationsepitops im Vergleich mit denaturiertem NS3/4a
Die Immunreaktivität des NS3/4a-Konformationsepitops, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde mit NS3/4a verglichen, das durch Zugabe von SDS zur NS3/4a-Konformationsepitopzubereitung in einer Endkonzentration von 2 denaturiert worden war. Das denaturierte NS3/4a und das Konformations-NS3/4a wurden wie oben beschrieben auf Mikrotiterplatten geschichtet. Das c200-Antigen ((Hepatology (1992) 15:19-25, erhältlich im ORTHO-HCV Version 3.0 ELISA-Testsystem, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, New Jersey) wurde ebenfalls auf Mikrotiterplatten geschichtet. Das c200-Antigen wurde als Vergleich verwendet; es wird angenommen, dass dieses Antigen aufgrund des Vorhandenseins von Reduktionsmittel (DTT) und Tensid (SDS) bei seiner Formulierung kein Konformationsantigen ist.

Die Immunreaktivität wurde gegen zwei Panels einer frühen HCV-Serokonversion, PHV 904 und PHV 914 (kommerziell erhältliche humane Blutproben von Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA), untersucht, wobei die oben beschriebene Vorgehensweise für einen ELISA-Assay verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Die Ergebnisse verweisen darauf, dass die denaturierte oder linearisierte Form von NS3/4a (sowie auch c200) Panels einer frühen Serokonversion nicht so früh nachweist wie das NS3/4a-Konformationalsepitop. TABELLE 8

	NS3/4a versus denaturiertem NS3/4a
	*Spiked 2% SDS zu NS3/4a-Vorrat
		NS3/4a	dNS3/4a*	c200	NS3/4a	dNS3/4a*	c200
		CD	CD	OD	s/co	s/co	s/co
HCV Serokonversionen	PHV 904-1	0,012	0,012	0,009	0,02	0,02	0,01
	PHV 904-2	0,011	0,009	0,008	0 02	0 01	0 01
	PHV 904-3	1,124	0,071	0,045	1,80	0,11	0,07
	PHV 904-4	2,401	0,273	0,129	3,85	0,44	0,21
	PHV 904-5	3,022	0,793	0,347	4,85	1,28	0,57
	PHV 904-6	2,711	1,472	0,774	4,35	2,37	1,28
	PHV 904-7	3,294	1,860	0,943	5,28	2,99	1,55

	PHV 914-1	0,006	0,004	0,001	0,01	0,01	0,00
	PHV 914-2	0,005	0,004	0,002	0,01	0,01	0,00
	PHV 914-3	0,098	0,003	0,001	0,16	0,00	0,00
	PHV 914-4	1,118	0,006	0,004	1,79	0,01	0,01
	PHV 914-5	2,035	0,044	0,022	3,26	0,07	0,04
	PHV 914-6	2,092	0,074	0,025	3,35	0,12	0,04
	PHV 914-7	2,519	0,281	0,132	4,04	0,45	0,22
	PHV 914-8	2,746	0,907	0,500	4,40	1,46	0,82
	PHV 914-9	3,084	1,730	0,931	4,94	2,78	1,53

HCV 3.0 Kontrollen	Negativkontrolle	0,023	0,024	0,008
	Negativkontrolle	0,027	0,024	0,007
	Negativkontrolle	0,021	0,017	0,005
	Durchschnitt	0,024	0,022	0,007
	Schwellenwert	0,624	0,622	0,607

	Positivkontrolle	1,239	0,903	0,575	1,99	1,45	0,95
	Positivkontrolle	1,445	0,916	0,614	2,32	1,47	1,01

Die Immunreaktivität des Konformationsepitops wurde darüber hinaus unter Verwendung von monoklonalen Antikörper gegen NS3/4a untersucht, die unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt worden waren. Diese monoklonalen Antikörper wurden anschließend in dem oben beschriebenen ELISA-Format gegen NS3/4a und denaturiertes NS3/4a sowie gegen das c200-Antigen eingesetzt. Die Daten zeigen, dass monoklonale Anti-NS3/4a- Antikörper mit dem NS3/4a und dem denaturierten NS3/4a in ähnlicher Weise reagieren wie die in Tabelle 9 gezeigten Serokonversions-Panels. Die Ergebnisse stellen einen weiteren Beweis dafür bereit, dass das NS3/4a ein Konformationsepitop ist, da monoklonale Antikörper hergestellt werden können, die eine ähnliche Reaktivität gegenüber den c33c-Panels einer frühen Serokonversion aufweisen. Tabelle 9

		NS3/4a	Platte dNS3/4a	c200
monoklonaler AK		OD	OD	OD
4B9/E3	1:100	1,820	0,616	0,369
	1:1000	1,397	0,380	0,246
	1:10000	0,864	0,173	0,070
	1:20000	0,607	0,116	0,085
5B7/D7	1:100	2,885	0,898	0,436
	1:1000	2,866	0,541	0,267
	1:10000	1,672	0,215	0,086
	1:20000	1,053	0,124	0,059
1A8/H2	1:100	1,020	0,169	0,080
	1:1000	0,921	0,101	0,043
	1:10000	0,653	0,037	0,013
	1:20000	0,337	0,027	0,011

Somit sind neue Assays für den Nachweis von HCV offenbart worden. Aus dem oben Gesagten wird ersichtlich sein, dass die spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung beschrieben worden sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fester Immunassay-Träger, der im Wesentlichen aus mindestens einem NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und einem Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht, die an den Träger gebunden sind, wobei das NS3/4a-Epitop und/oder das Mehr-Epitop-Fusionsantigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagieren, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind, und wobei das Mehr-Epitop-Fusionsantigen die in den 5A-5F dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität zu dieser umfasst, die spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
Fester Immunassay-Träger nach Anspruch 1, bei dem das Mehr-Epitop-Fusionsantigen die in den 5A-5F dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität zu dieser umfasst, die spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
Fester Immunassay-Träger nach Anspruch 1, bei dem das Mehr-Epitop-Fusionsantigen die in den 5A-5F dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 98 % Sequenzidentität zu dieser umfasst, die spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
Fester Immunassay-Träger nach Anspruch 1, bei dem das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A-5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Fester Immunassay-Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das NS3/4a-Epitop die in den 3A-3D dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Sequenzidentität zu dieser umfasst, die Proteaseaktivität aufweist.
Fester Immunassay-Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das NS3/4a-Epitop die in den 3A-3D dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Sequenzidentität zu dieser umfasst, die Proteaseaktivität aufweist.
Fester Immunassay-Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das NS3/4a-Epitop die in den 3A-3D dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 98 % Sequenzidentität zu dieser umfasst, die Proteaseaktivität aufweist.
Fester Immunassay-Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das NS3/4a-Epitop aus der in den 3A-3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Fester Immunassay-Träger, der im Wesentlichen aus mindestens einem NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und einem Mehr-Epitop-Fusionsantigen besteht, die an den Träger gebunden sind, wobei das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A-3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A-5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Immundiagnostisches Testkit, das den festen Immunassay-Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie Hinweise zur Durchführung des immundiagnostischen Tests umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines festen Immunassay-Trägers, bei dem man: (a) einen festen Träger bereitstellt; und (b) mindestens ein NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und ein Mehr-Epitop-Fusionsantigen an den festen Träger bindet, wobei das NS3/4a-Epitop und/oder das Mehr-Epitop-Fusionsantigen spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagieren, die in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind, und wobei das Mehr-Epitop-Fusionsantigen die in den 5A-5F dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 Sequenzidentität zu dieser umfasst, die spezifisch mit Anti-HCV-Antikörpern reagiert, welche in einer biologischen Probe von einem mit HCV infizierten Individuum vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das NS3/4a-Konformationsepitop die in den 3A-3D dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Aminosäuresequenz mit mindestens 80 Sequenzidentität zu dieser umfasst, die eine Proteaseaktivität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A-3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A-5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Verfahren zur Herstellung eines festen Immunassay-Trägers, bei dem man: (a) einen festen Träger bereitstellt; und (b) mindestens ein NS3/4a-Konformationsepitop von HCV und ein Mehr-Epitop-Fusionsantigen an den festen Träger bindet, wobei das NS3/4a-Konformationsepitop aus der in den 3A-3D dargestellten Aminosäuresequenz besteht und das Mehr-Epitop-Fusionsantigen aus der in den 5A-5F dargestellten Aminosäuresequenz besteht.
Verwendung eines festen Immunassay-Trägers nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines diagnostischen Reagenzes zur Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis C Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe.
Verfahren zum Nachweis einer Hepatitis C Virus (HCV)-Infektion in einer biologischen Probe, bei dem man: (a) einen festen Immunassay-Träger nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bereitstellt; (b) eine biologische Probe mit dem festen Träger unter Bedingungen kombiniert, die es HCV-Antikörper - sofern diese in der biologischen Probe vorhanden sind - erlauben, an das NS3/4a-Epitop und/oder an das Mehr-Epitop-Fusionsantigen zu binden, wobei ein erster Immunkomplex gebildet wird; (c) zu dem festen Träger von Schritt (b) unter komplexbildenden Bedingungen einen nachweisbar markierten Antikörper gibt, wobei der markierte Antikörper mit dem Immunkomplex reaktiv ist; und (d) zweite Immunkomplexe, die sich aus dem nachweisbar markierten Antikörper und dem ersten Immunkomplex gebildet haben, sofern diese vorhanden sind, in der biologischen Probe als Hinweis auf eine HCV-Infektion nachweist.