DE60131439T2

DE60131439T2 - Verfahren zur ex-vivo- und in-vitro-reparation und regeneration von knorpel und kollagen

Info

Publication number: DE60131439T2
Application number: DE60131439T
Authority: DE
Inventors: R. Lane Palo Alto SMITH; Dennis R. Stanford CARTER; David J. Stanford SCHURMAN
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2008-09-04
Anticipated expiration: 2021-09-29
Also published as: US20080075751A1; KR20040007397A; US6528052B1; DK1330176T3; ATE377999T1; AU2001296928B2; CN1503840A; AU9692801A; US10655104B2; ES2296813T3; US20090176304A1; US20150079048A1; EP1330176A2; WO2002026116A2; WO2002026116A3; EP1330176A4; JP2004512031A; US20030133915A1; WO2002026116A9; EP1330176B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die ex vivo und in vitro Reparatur, Regeneration, de novo Bildung und Remodeling von erkrankten und normalen mesenchymalen oder mesenchymal abgeleiteten Zellen, Knorpel, Kollagen und erkranktem oder normalem Knochen, und Medikamente für solche Zwecke. Insbesondere betrifft diese Erfindung die ex vivo und in vitro Regeneration von artikulärem Knorpel und Kollagen und das Knochenremodeling durch intermittierend angelegtem hydrostatischem Druck. Das Verfahren umfasst das Anlegen einer äußeren Intervallbelastung bestehend aus sich wiederholenden Zeitspannen von angelegtem hydrostatischem Druck, gefolgt von und unterbrochen durch Erholungszeitspannen. Das Verfahren umfasst insbesondere das Anlegen des intermittierenden, hydrostatischen Drucks im Bereich von 0,5–30 MPa für ein Intervall von 1–8 Stunden, gefolgt von einer Erholungszeitspanne bis zu etwa 16–23 Stunden, wobei der Druck angelegt wird an Knorpel- und Knochenzellen in vitro, Knorpelexplantaten und Knochentransplantaten ex vivo, an Knorpel, der innerhalb des Gelenkspalts von diarthrotischen Gelenken intakt bleibt. Die Intervallbelastung führt zu einer signifikanten Erhöhung der Expression von Proteinen, welche die besonderen phänotypischen Eigenschaften von Knorpel und Knochen bereitstellen, und zur selektiven Inhibierung von matrixabbauenden Enzymen, proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, die inflammatorische Zellen in die Gelenkhöhle locken, und zu einer selektiven Verringerung der Genexpression von Wachstumsfaktoren, welche die extrazelluläre Matrixreparatur und -regeneration hemmen.
Die Erfindung betrifft auch ex vivo und in vitro Verfahren zur Behandlung von artikulärem Knorpel und für die Kollagenregeneration, -Wiederherstellung und -transplantation.
Hintergrund und verwandte Offenbarungen
Arthritische Erkrankungen, insbesondere Osteoarthritis, betreffen mehr Menschen als irgendein anderes Leiden. Osteoarthritis umfasst den Funktionsverlust von Knorpel, der in vielen Gelenken einer langsam fortschreitenden Degeneration unterliegt. Obwohl Osteoarthritis als eine nicht-inflammatorische Erkrankung angesehen wird, tritt ein bestimmtes Maß an Entzündung auf. Osteoarthritis unterscheidet sich von der rheumatoiden Arthritis, die eine chronische entzündliche Gelenkerkrankung ist.
Osteoarthritis betrifft viele Menschen im späteren mittleren Lebensalter. Osteoarthritis bezogene Zustände verringern die persönliche Leistungsfähigkeit und Lebensqualität, und erhöhen in einer alternden Gesellschaft die Morbidität und Mortalität für Männer und Frauen durch Erhöhen der Inzidenz von anderen chronischen Zuständen, wie beispielsweise Osteoporose. Zurzeit erfordert die einzige erfolgreiche Behandlung für eine Gelenkerkrankung im Endstadium eine größere Operation, die einen Austausch des gesamten Gelenks umfasst, was nicht ohne damit verbundene Komplikationen, wie einer Infektion, einer aseptischen Lockerung und Schmerz, erfolgt. Diese Komplikationen können dazu führen, dass die Arthoplastie korrigiert werden muss. Das Beseitigen einer in einem frühen Zeitpunkt auftretenden Osteoarthritis durch neue Operationstechniken, welche die Notwendigkeit für einen Austausch des Gelenks entfallen lassen würde, ist gerade im Versuchsstadium.
Intraartikuläre chirurgische Methoden werden entwickelt, die den Transfer von Knorpelzellen von gesunden Bereichen des Gelenks auf erkrankte Oberflächen einschließen, um die Gelenkfunktion wiederherzustellen. Dazu werden Knorpelzellen oder kleine Knorpelbereiche in partiellen oder durchgehenden Defekten innerhalb der Gelenkoberfläche unter Verwendung eines offenen chirurgischen Verfahrens platziert. Das Zellkonstrukt wird dann durch periostales Gewebe, welches an Ort und Stelle genäht wird, fixiert. In vielen Fällen unterliegen diese Transplantate schnell einer Fibrillation und bauen sich ab. Gemäß einem alternativen Verfahren umfasst die Mosaikplastik das Bewegen vieler kleiner Knorpeltransplantate von einem Bereich der Gelenkoberfläche zu einem anderen, um eine Wiederbelastung zu erleichtern. Bei jeder Art von Knorpelaustausch wird die Reparatureffizienz nach Wiederherstellung einer extrazellulären Matrixstruktur von normalem Knorpel vor der Verwendung in hohem Maße erleichtert.
Knorpel-, Kollagen- und Knochenerkrankungen stellen deshalb ein vorrangiges medizinisches Problem dar, insbesondere bei einer immer älter werdenden Bevölkerung, die anfälliger gegenüber Osteoarthritis und anderen degenerativen Gelenkerkrankungen ist, und es wäre daher wichtig, ein Mittel zur Regeneration von artikulärem Knorpel und Kollagen und zum Knochenremodeling zur Verfügung zu haben.
Artikulärer Knorpel bedeckt die Enden von langen Knochen und ist ein Belastungsgewebe, das Kräfte entlang von Gelenkoberflächen verteilt und dadurch den darunter liegenden starreren Knochen schützt. Er sorgt auch für eine problemlose Gelenkverbindung und Biegung der Gelenke während den normalen Aktivitäten des täglichen Lebens.
Es wird fortwährend versucht artikulären Knorpel zu regenerieren. Das U.S.-Patent 6,080,194 beschreibt beispielsweise eine Kollagenmatrize, die durch Vereinigen eines porösen Kollagenschwamms mit einer Kollagenmembran gebildet wurde. Das Patent 5,786,217 beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zur Reparatur von artikulären Knorpeldefekten. Das Patent 5,206,023 offenbart Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung und Reparatur von Defekten oder Läsionen von Knorpel. Das Patent 5,041,138 betrifft die Neomorphogenese von Knorpel in vivo aus einer Zellkultur für die Entwicklung und Implantation von knorpelartigen Strukturen. Keines dieser Patente offenbart jedoch ein Verfahren, welches den erkrankten Knorpel bis zu einem funktionsfähigen Zustand regeneriert, und ein solches Verfahren gibt es nach wie vor nicht.
Die klinische Erfahrung mit Menschen und experimentelle Studien mit Tiermodellen bestätigen, dass mechanische Belastungen einen unerlässlichen Reiz zur Aufrechterhaltung einer Homöostase von normalem artikulärem Knorpel darstellen (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 190: 275 (1989)).
Veränderungen der Gelenkbelastung durch Ruhigstellung (Clin. Orthop. Rel. Res., 219: 28 (1987)), Bandlockerung (Ibid, 213: 69 (1986)), übermäßige Einwirkungen (J. Biomechanics, 6: 51 (1973)) oder erhöhte subchondrale Knochensteifigkeit (J. Biomechanics, 28: 357 (1995)) führen zu pathologischen Veränderungen der Knorpeleigenschaften bei Osteoarthritis.
Die Fähigkeit von Knorpel zur schnellen und reversiblen Gestaltsveränderung ist zurückzuführen auf eine nachgiebige und elastische Matrix mit einem hohen Gehalt von gut löslichen Proteoglykanen, welche in Kollagen, einem unlöslichen Fasernetzwerk, eingeschlossen sind. Proteoglykane, Kollagen und andere Moleküle, die in Knorpelgewebe vorkommen, werden durch mesenchymal abgeleitete Knorpelzellen, den Chondrozyten, erzeugt.
In vitro Studien bestätigen, dass die Knorpelzellen, artikuläre Chondrozyten, auf bestimmte Belastungsbedingungen mit einer anabolen oder katabolen Reaktion antworten, die auf die Belastung und den Druck zurückzuführen ist, welche durch den physikalischen Reiz auf die Zelle ausgeübt werden (Biochem. Biophys. Res. Commun., 240: 216 (1997); Spine, 22: 1085 (1997) und J. Orthop. Res., 15: 189 (1997)).
Die Rolle, welche die mechanische Belastung bei der Regulation des Metabolismus von artikulären Chondrozyten spielt, wurde zum Teil durch eine mathematische Analyse der Verteilung der Kräfte über die Gelenkoberflächen beschrieben (J. Biomech., 22: 853 (1989)).
In J. Exp. Physiol., 81: 535 (1996) beschriebene biochemische Analysen bestätigen, dass Chondrozyten in dem Knorpel eines diarthrotischen Gelenks hydrostatische Druckwerte in der Größenordnung von 7 bis 10 MPa, die sich aus normalen Aktivitäten des täglichen Lebens ergeben, durchmachen. Studien, welche den Einfluss mechanischer Kräften auf die Gewebedifferenzierung untersuchten, zeigten, dass eine erhöhte Knorpeldicke in den Bereichen des diarthrotischen Gelenks vorhanden sind, welche einer hohen intermittierenden, hydrostatischen Druckbeanspruchung ausgesetzt sind. Ein dünner Knorpel fällt mit Bereichen zusammen, die sich einem verringerten hydrostatischen Druck ausgesetzt sehen und tangential zu der Gelenkoberfläche auftretende Zugkräfte aufweisen (Bone, 11: 127 (1990)).
In J. Orthop. Res., 9: 1–10 (1991) beschriebene experimentelle Studien bestätigen, dass ein in vitro angelegter hydrostatischer Druck den Metabolismus einer artikulären Knorpelmatrix beeinflusst und stellten fest, dass ein hydrostatischer Druck im Bereich von 5–15 MPa die Inkorporationsraten von ³⁵SO₄ und ³H-Prolin in adultem, artikulärem Rinderknorpel in vitro moduliert.
In J. Biol. Chem., 262: 15490 (1987) beschriebene Organkulturexperimente zeigten, dass Stellen der Proteoglykan-Erzeugung mit Bereichen von reinem hydrostatischem Druck zusammenfallen. Physiologische Werte von hydrostatischem Druck erhöhen, wie in J. Orthop. Res., 14: 53 (1996) beschrieben, die mRNA-Signalspiegel für Aggrecan und Typ II-Kollagen bei der Messung unmittelbar nach der Belastung. In einer Studie zur belastungsgesteuerten Kompression hinsichtlich der Expression der Aggrecan-mRNA in Rinderknorpelexplantaten wurde nach 1 Stunde Belastung eine vorübergehende Up-Regulation beobachtet.
Obwohl die obigen Untersuchungen die Wichtigkeit von hydrostatischem Druck bezüglich der normalen Funktion von Knorpel und Typ II-Kollagen beschreiben und erkennen, war es dennoch nicht möglich, dieses Wissen klinisch anzuwenden, da das kontinuierliche Anlegen eines hydrostatischen Drucks zu einer Erschöpfung des metabolischen Potentials von Knorpel und zu einer Schädigung desselben führt, wäh rend die kurze (< 1 Stunde) Belastung mit hydrostatischem Druck zu einer veränderten zellulären Antwort führt, die den Metabolismus und die Homöostase von Chondrozyten durcheinander bringt. Eine kurze Zeitspanne einer hydrostatischen Druckbelastung führt beispielsweise zu einer erhöhten Expression der Typ II-Kollagen-mRNA, während die kontinuierlich angelegte Belastung keine solche erhöhte Expression erhält. Andererseits erhöhte sich die Aggrecan-Signalexpression während der gesamten Zeitdauer der Belastung stetig. Es ist klar, dass diese Ergebnisse das zelluläre Gleichgewicht zwischen Aggrecan und Typ II-Kollagen stört. Knorpelzellen antworten auf mehrere Reize auf nicht vorhersehbare Art und Weise und die Variabilität der Antwort hängt von der Dauer, der Stärke und der Häufigkeit der Belastung ab. Diese Unberechenbarkeit steht der Verwendung der kontinuierlichen langen oder kurzen Zeitspannen von willkürlichen hydrostatischer Druckbelastungen für die Behandlung von Osteoarthritis oder für die Regeneration von beschädigtem Knorpel entgegen (3. Rehab. Res. Dev., 37: 153–161 (2000)).
Die WO 96/39992 betrifft einen Apparat und ein Verfahren zum Sterilisieren, Animpfen, Kultivieren, Lagern, Transportieren und Testen von Austauschknorpelgewebekonstrukten. US 5,746,704 betrifft einen Therapieapparat mit einer passiven Bewegungsvorrichtung zum Biegen eines Körperteils. US 5,752,925 betrifft das Erhöhen der Knochenbruchfestigkeit durch wiederholtes Anlegen von Traumakräften gleichenden Kräften mit geringer Stärke.
Angesichts der Schwere und des Behinderungseffekts von Osteoarthritis und anderen Knorpel-, Kollagen- oder Knochenerkrankungen wäre es wichtig, ein Verfahren bereitzustellen, das eine Knorpel- oder Kollagenregeneration und ein Knochenremodeling bereitstellt.
Bis vor kurzem glaubte man, dass artikulärer Knorpel sich nicht mehr selbst reparieren kann, sobald die Anordnung der Stützfasern zerstört war (Articular Cartilage and Osteoarthritis, Workshop Conference Hoechst und Werk, Kalle-Albert, Wiesbaden, 12.–16. Mai 1991, Herausgeber Kuettner et al., Rosen Press, New York).
Es wurde nunmehr gefunden, dass eine Regeneration möglich ist mit einem bestimmten Schema von intermittierendem, hydrostatischem Druck, angelegt an mesenchymale oder mesenchymal abgeleitete Zellen, wie Fibroblasten, Fibrochondrozyten oder Chondrozyten, und es ist deshalb eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ex vivo und in vitro Verfahren zur Behandlung von Osteoarthritis und anderen Knorpel- und Kollagenerkrankungen bereitzustellen, in dem deren Regeneration, de novo Bildung und das Knochenremodeling stimuliert wird, wobei die Verfahren eine definierte mechanische Belastungsumgebung bereitstellen, die adulte Knorpel- und Knochenzellen regeneriert und repariert.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein ex vivo oder in vitro Verfahren zur Wiederherstellung der Funktion eines degenerierten, erkranktem oder beschädigten Gelenks bereit, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Aussetzen von degeneriertem, erkranktem oder beschädigtem Knorpel oder eines Knorpeltransplantats, das aus dem Gelenk entfernt wurde, oder Chondrozyten, ex vivo oder in vitro gegenüber einem intermittierend angelegten hydrostatischen Druck (IHP) zwischen etwa 0,5 und etwa 30 MPa für etwa 1 bis etwa 8 Stunden täglich;
(b) Entfernen des IHP für eine etwa 16- bis 22-ständige Erholungszeitspanne; und
(c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) über eine Zeitspanne von etwa 4 bis etwa 100 Tagen oder je nach Bedarf.

Die Erfindung betrifft zusätzlich die Verwendung von Knorpel, Kollagen, Bändern, Sehnen, Knochen, Chondrozyten oder eines Knorpeltransplantats, erhalten durch ein erfindungsgemäßes Verfahren, zur Herstellung eines Medikaments für die Wiederherstellung der Funktion eines degenerierten, erkrankten oder beschädigten Gelenks.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein in vitro oder ex vivo Verfahren zur Reparatur, Regeneration und de novo Bildung von Knorpel, Wiederauffüllung von Chondrozyten oder Ablagerung von Typ II-Kollagen und die Stimulation und das Knochenremodeling.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein in vitro oder ex vivo Verfahren zur Behandlung von Knorpel-, Kollagen- oder Knochen-Erkrankungen durch Stimulieren der Knorpel- und Kollagenregeneration und des Knochenremodelings unter Verwendung eines Intervallbelastungsschemas, das aus sich wiederholenden Zeitspannen von intermittierend angelegtem hydrostatischem Druck innerhalb eines bestimmten Belastungsintervalls, an das sich eine Erholungszeitspanne anschließt, besteht.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein ex vivo oder in vitro Verfahren zur Reparatur, Regeneration und de novo Bildung von Knorpel, wobei die Regeneration erreicht wird durch Anwenden eines Intervallbelastungsschemas, das aus sich wiederholenden Zeitspannen von angelegtem hydrostatischem Druck, gefolgt von Erholungszeitspannen, besteht, auf ex situ Knorpel oder -Knorpelzellen oder auf Knorpel oder Knorpelzellen in vitro.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein ex vivo Knorpelreparatur-, Regenerations- und de novo Bildungsverfahren, welches das Anlegen von hydrostatischem Druck an das Knorpelgewebe, das eine Regeneration benötigt und in situ entfernt wurde, oder an Chondrozyten, Fibroblasten oder Fibrochondrozyten, adhäriert an eine Matrix und dem Schema unterzogen, umfassend das intermittierende Anlegen des hydrostatischen Drucks für etwa 1–8 Stunden, gefolgt von einer etwa 16–23-ständigen Erholungszeitspanne, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Knorpeltransplantaten zur Herstellung eines Medikaments für die Regeneration eines er krankten Gelenks, um die normale Funktion des Gelenks wiederherzustellen, wobei die Transplantate der erfindungsgemäßen intermittierenden, hydrostatischen Druckbelastung zur Wiederherstellung einer gesunden lasttragende Matrix ausgesetzt wurden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isolierter, regenerierter, funktioneller, gesunder, lasttragender Knorpel aus dem erkrankten Knorpel, wobei der erkrankte Knorpel einem intermittierenden, hydrostatischen Druck ausgesetzt wird, gefolgt von Erholungszeitspannen, bis die normalen mechanischen und biochemischen Eigenschaften wiederhergestellt sind.
Das erfindungsgemäße ex vivo oder in vitro Verfahren kann ferner den Nachweis der Funktionalität des Knorpels umfassen durch Bestimmen des relativen in vitro Spiegels von, oder Expressionsspiegel von, Knorpel- oder Knochen-abbauenden Enzymen, Zytokinen und deren Inhibitoren oder wachstumsfördernden Substanzen, Wachstumsfaktoren und Hormonen nach dem Aussetzen des erkrankten Knorpels oder Knochens gegenüber einem intermittierenden, hydrostatischen Druck, gefolgt von Erholungszeitspannen.
Insbesondere kann das Verfahren ferner das Bestimmen der Funktionalität oder des Ausmaßes der Beschädigung von Knorpel oder Kollagen nach der erfindungsgemäßen IHP-Behandung durch Bestimmen des Expressionsspiegels der mRNA von Kollagen, Aggrecan, TGF, MMP-1, MMP-2 oder IL-6 umfassen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung eines servo-hydraulischen Belastungsgeräts, das zum Anlegen eines intermittierenden, hydrostatischen Drucks an artikuläre Chondrozyten geeignet ist.
2 ist ein Diagramm, das die Wirkungen auf die Intervallbelastung mit unterschiedlichen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Aggrecan-(2A) und Typ II-Kollagen (2B)-Expression in normalen, humanen, artikulären Chondrozyten darstellt.
3 ist ein Diagramm, das die Wirkungen einer Intervallbelastung für 4 Stunden für 4 Tage mit 10 MPa eines intermittierenden, hydrostatischen Drucks auf die Expression des Aggrecan- und Typ II-Kollagen-mRNA-Signals in humanen, osteoarthritischen, artikulären Chondrozyten darstellt.
4 ist ein Diagramm, das die Wirkungen der Intervallbelastung mit unterschiedlichen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung von Matrixmetalloproteinase-2 aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten unter Verwendung eines ELISA (4A) und die enzymatische Aktivität unter Verwendung von Zymographie für aktivierte (+APMA) und inaktivierte Präparationen (4B) zeigt.
5 ist ein Diagramm, das die Wirkungen der Intervallbelastung mit unterschiedlichen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung von transformierendem Wachstumsfaktor-β (TGF-β) aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten zeigt.
6 ist ein Diagramm, das die Wirkungen der Intervallbelastung mit unterschiedlichen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung des Makrophagen-Chemoattraktant-Protein-1 (MCP-1) aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten zeigt.
7 ist ein Diagramm, welches das Fehlen einer Wirkung der Intervallbelastung mit unterschiedlichen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1) aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten zeigt.
8 ist ein Diagramm, das den RT-PCR-Signalspiegel der Expression von Typ II- und Typ I-Kollagen und Beta-Aktin in nicht-belasteten Kontrollzellen zeigt.
9 zeigt die Signalspiegel der Expression von Beta-Aktin in Zellen, die einem IHP ausgesetzt wurden, und in nicht-belasteten Kontrollzellen.
10 zeigt den RT-PCR-Signalspiegel für Aggrecan nach dem Aussetzen von hochdichten Monolayerkulturen gegenüber IHP.
11 zeigt die RT-PCR-Signalspiegel für Typ II-Kollagen nach dem Aussetzen von hochdichten Monolayerkulturen gegenüber IHP.
12 zeigt die Zeitverlaufsanalyse der Freisetzung von TGF-β1 aus MG-63-Zellen, die einem intermittierenden, hydrostatischen Druck (10 MPa) ausgesetzt wurden.
13 stellt die Dosis-Wirkungs-Effekte von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung von TGF-β1 aus MG-63-Zellen dar.
14 zeigt die Zeitverlaufsanalyse der Freisetzung von MMP-2 aus einem IHP ausgesetzten MG-63-Zellen.
DEFINTIONEN
Wie hierin verwendet:

"Spongiös" bezeichnet einen Knochen, der eine gitterförmige oder schwammartige Struktur aufweist.
"Mesenchymal", "mesenchymale Stammzellen" oder "mesenchymal abgeleitete Zelle" bezeichnet die Zellen, welche sich in der extrazellulären Matrix von Knorpel (Chon drozyten), Bindegewebe (Fibroblasten), Faserknorpel (Fibrochondrozyten), Sehne (Tenozyten) und Knochen (Osteoblasten und Osteozyten) befinden und selbige erzeugen.
"Belastung" oder "Belastungsintervall" bezeichnet eine Zeitdauer einer angelegten IHP-Belastung, oder Reiz in einem Gewebe, welcher eine Erholungszeitspanne folgt, in der kein äußerer Druck angelegt wird und in welcher der Druck zur Umgebungsbedingung zurückkehrt.
"Intervall" bezeichnet eine Kombination einer Belastungs- und Erholungszeitspanne, so oft wie erforderlich wiederholt.
"De novo Bildung" bezeichnet die Erzeugung von Knorpelbindegewebe, Faserknorpel, Sehne und Knochen als Ergebnis der Anhaftung von Chondrozyten, Fibroblasten, Fibrochondrozyten, Tenozyten und Osteoblasten in einer Stützstruktur (Gerüst- oder Kollagenmatrix) nach Aussetzen gegenüber einem Belastungsintervall.
"Osteoblast" bezeichnet eine vom Mesenchym abgeleitete knochenbildende Zelle (Fibroblast) und bildet eine Knochenmatrix, in welcher sie als Osteozyt eingeschlossen wird.
"Fibroblast" oder "Fibrozyt" bezeichnet eine stern- oder spindelförmige Zelle mit cytoplasmatischen Prozessen, welche in Bindegewebe vorkommt und Kollagenfasern bilden kann.
"Aggrecan" bezeichnet ein großes aggregiertes Proteoglykan, das eine Rolle dabei spielt, dem artikulären Knorpel eine Druckelastizität zu verleihen, und das Lasttragen ermöglicht. Aggrecan ist ein häufig vorhandenes Proteoglykan, das etwa 85% der gesamten Proteoglykane darstellt.
"Typ II-Kollagen" bezeichnet ein homopolymeres Molekül von α1 (11) Ketten, welches das Produkt eines einzelnen Gens COL2A1 ist. Typ II-Kollagen ist das häufigste aller anderen Kollagenarten und stellt etwa 95% des gesamten Kollagens dar.
"Matrixmetalloproteinase" oder "MMP" bezeichnet eine Protease, welche die Knorpeldegeneration in einem erkrankten Gelenk verursacht und damit assoziiert ist. MMP kann weiter als MMP-1, MMP-2, MMP-9, etc., unterschieden werden.
"Makrophagen-Chemoattraktant-Protein-1" oder "MCP-1" bezeichnet einen proinflammatorischen Mediator, der den Immunzustand von Gewebe beeinflusst. Dessen erhöhter Spiegel ist mit dem Beginn oder der Zunahme einer Gewebezerstörung assoziiert, sein verringerter Spiegel ist mit einer Verringerung eines Gewebeschadens oder einer Heilung assoziiert.
"Transformierender Wachstumsfaktor-β" oder "TFG-β" bezeichnet einen Faktor, der durch Zellen nach Anlegen eines intermittierenden, hydrostatischen Drucks freigesetzt wird und eine Veränderung des Zellmetabolismus anzeigt.
"Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1" oder "FGF-1" bezeichnet einen Wachstumsfaktor, von dem nicht bekannt ist, dass dieser bei der Proliferation von Chondrozyten- oder Osteoblasten-ähnlichen Zellen beteiligt ist.
"MPa" bezeichnet Megapascal. Ein MPa entspricht 145 psi.
"GAG" bezeichnet Glycosaminoglykane.
"IHP" bezeichnet intermittierenden, hydrostatischen Druck.
"GAPDH" bezeichnet Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase.
"APMA" bezeichnet 4-Aminophenylquecksilberacetat, einen Aktivator des latenten Proenzyms zum aktiven Enzym.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die hierin beschriebene Erfindung betrifft die Entdeckung, dass ein intermittierend und wiederholt angelegter hydrostatischer Druck während Intervallbelastungszeitspannen die Genexpression von artikulären Chondrozyten beeinflusst, die belastungsabhängige Expression von Kollagen vom Typ II auslöst, eine Matrixmetalloproteinase verringert, die de novo Bildung von mesenchymalen oder mesenchymal abgeleiteten Zellen in einer Matrix ermöglicht und das Knochenremodeling verändert. Die Entdeckung ist geeignet für die Reparatur und Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen, wie Osteoarthritis, Arthrose, Beschädigungen des Gelenkknorpels, degenerative Gelenkerkrankungen, Gelenkaustausch, Knochenrestrukturierung und anderen Erkrankungen von Knorpel, Kollagen und Knochen.
I. Verfahren zur Knorpel- und Kollagenregeneration und für das Knochenremodeling
Das Verfahren für die Knorpel- und Kollagenregeneration und für das Knochenremodeling zur Behandlung der oben aufgeführten Erkrankungen umfasst, im breiteren Umfang, das Anwenden eines erfindungsgemäßen Intervallbelastungsschemas auf transplantierbare, durchgehende Transplantate von humanem osteoarthritischem oder erkranktem Knorpel oder Knochen ex vivo oder an die Zellen, die aus dem gesunden oder erkrankten Knorpel, Kollagen und Knochen isoliert wurden, in vitro.
A. Therapeutisches Schema für die Knorpelregeneration Allgemeine Bedingungen
Das therapeutische Schema besteht aus der Stimulation von behandeltem Gewebe oder isolierten Zellen mit sich wiederholenden Zeitspannen von angelegtem, hydro statischem Druck, gefolgt von Erholungszeitspannen (Belastungsintervall). Der Druck wird vorzugsweise innerhalb jedes Belastungsintervalls intermittierend angelegt. Die Verfahrensparameter, wie Druck, Frequenz, Länge der Intervalle, Intermittenz- und Erholungszeitspanne, werden anhand des gewählten Verfahrens zur Regeneration ausgewählt, das heißt, ex vivo oder in vitro, sowie der Erkrankung und der Schwere der Knorpeldegeneration.
1. Hydrostatischer Druck
Das Belastungsschema, das geeignet ist für die Reparatur, Regeneration oder de novo Bildung von intaktem Knorpel, intaktem Knochen, Knorpel- und Knochentransplantaten oder -zellen, umfasst im Allgemeinen das Anlegen von hydrostatischem Druck zwischen 0,5 MPa und 30 MPa, vorzugsweise zwischen 1 MPa und 20 MPa, und am meisten bevorzugt zwischen 5 MPa und 10 MPa in intermittierenden Intervallen mit einer Frequenz von 1 Hz.
Üblicherweise werden Drücke, die höher als etwa 30 MPa sind, nicht verwendet oder empfohlen, da diese zu einer Zellschädigung führen können, während Drücke, die niedriger sind als 0,1 MPa, für die Regeneration von Zellen oder Gewebe nicht wirksam sein können. Drücke von ungefähr 5–10 MPa entsprechen normalen physiologischen Werten, welche sich der artikuläre Knorpel in vivo ausgesetzt sieht.
2. Dauer von IHP- und Erholungszeitspannen
Die Dauer der Hochdruckintervalle liegen im Allgemeinen im Bereich von Minuten bis etwa 8 Stunden und sind vorzugsweise zwischen etwa 1 und 8 Stunden, am meisten bevorzugt etwa 4 Stunden.
Während der Erholungszeitspanne werden das Gewebe/die Zellen von Interesse Atmosphärendruck oder einem ausreichend niedrigen konstanten Druck ausgesetzt. Die Erholungszeitspannen können im Allgemeinen im Bereich von Minuten bis mehre re zehn Stunden liegen, und sind vorzugsweise zwischen etwa 16 bis etwa 23 Stunden, vorzugsweise etwa 20 Stunden.
3. Frequenz
Innerhalb jedes intermittierenden, hydrostatischen Druckintervalls wird der Druck intermittierend mit einer Frequenz zwischen 0,1 Hz und 10 Hz, vorzugsweise in der Größenordnung von 1 Hz, angelegt. In der bevorzugten Ausführungsform für Knorpelzellen wird das Intervallbelastungsschema für wenigstens 4 aufeinanderfolgende Tage, üblicherweise für etwa 4 Stunden Belastung bei mit 1 Hz angelegten 10 MPa, angelegt, gefolgt von etwa 20 Stunden Erholung bei konstantem Atmosphärendruck.
4. Länge der Behandlung
Die Länge der Behandlung von Knorpel hängt ganz vom Grad und Schwere der Knorpeldegeneration, des Ausmaßes an Kollagenverlust, der Schwere der Knochenerkrankung oder des Grades und der Schwere der Gelenkbeschädigung ab. Üblicherweise wird eine Verbesserung der Knorpelfunktionalität und dessen Regeneration nach etwa vier Behandlungen mit einer IHP-Belastung beobachtet, das heißt, üblicherweise nach 4 Behandlungstagen. Bei stärker degeneriertem, erkranktem oder beschädigtem Knorpel wird eine solche Behandlung für nicht weniger als 100 Tage ohne irgendwelche nachteiligen Auswirkungen fortgeführt und kann immer weiter fortgeführt werden, wenn die Knorpel- und/oder Kollagenfunktion chronisch beeinträchtigt ist. Eine bevorzugte Behandlung wird zwischen 7 und 30 Tage dauern und dabei erfolgreich sein.
Für die de novo Bildung wird die Kollagenmatrix mit gesunden oder erkrankten zu behandelnden Zellen beladen und die Behandlung fortgesetzt, bis das neue Gewebe gebildet ist.
5. Untersuchung der Funktionalität
Die Behandlungslänge hängt von der Schnelligkeit der funktionellen Erholung ab. Die Funktionalität von Knorpel hängt von der Erholung und/oder dem Umbauen und/oder der Bildung einer lasttragenden Matrix ab. Die Degeneration von Knorpel beruht auf der Deformation von Zellen, auf ungenügenden Stärken von Scherspannungsbelastung auf die Matrix, und auf der Degeneration aufgrund von metabolischen Veränderungen.
Diese metabolischen Veränderungen beeinflussen die genetische Expression einer Knorpelzelle in Bezug auf Aggrecan und Kollagen, insbesondere auf Typ II-Kollagen, und gewisse Wachstumsfaktoren, wie TGF-β. Die Veränderungen und der Metabolismus von Chondrozyten führen auch zur Expression oder Überexpression von Proteinen, die in gesunden funktionellen Chondrozyten normalerweise nicht oder nur schwach exprimiert werden, wie die Metalloproteinasen MMP-1, MMP-2, MMP-9, und proinflammatorische Zytokine, wie IL-1 und IL-6.

Folglich werden während und insbesondere nach der IHP-Belastungsbehandlung einige oder alle der obigen Faktoren untersucht und deren Vorhandensein wird im Hinblick auf eine erhöhte Aktivität ausgewertet. Fehlende oder verringerte Aktivitäten korrelieren mit der Regeneration der Knorpelintegrität und der lasttragenden Funktion. Untersuchen der Funktionalität Tabelle 1

	Aggrecan	Typ II-Kollagen	MMP-2	MMP-1	MMP-9	IL-6	IL-1	MCP-1
Physiologische Spiegel	4–7% Nass-Gew.	10–29 % Nass-Gew.	niedrig	niedrig	nd	niedrig	nd	niedrig
Pathologische Spiegel	0,1–1% Nass-Gew.	1–10% Nass-Gew.	hoch	hoch	erhöht oder hoch	hoch	erhöht	hoch
Regenerierte Siegel	4–7%	10–20	niedrig	niedrig	nd	niedrig	nd	niedrig

nd = nicht nachweisbar oder Spuren

Das hierin offenbarte Untersuchen der Funktionalität umfasst das Bestimmen der relativen Werte von extrazellulären Matrixkomponenten, wie Aggrecan und Typ II-Kollagen, Proteasen, wie MMP-1, MMP-2, MMP-9, und Zytokinen, wie IL-6, IL-1 und MCP1. Diese Werte unterscheiden sich in Abhängigkeit von der Gewebeherstellung und des verwendeten Verfahrens, der Trend bleibt jedoch der gleiche, nämlich, dass sich die Spiegel von extrazellulären Matrixproteinen verringern und dass sich die Spiegel von Proteasen und Zytokinen in beschädigtem oder degeneriertem Knorpel und Kollagen erhöhen. Während der Regeneration kehren die Spiegel in ihre normalen physiologischen Bereiche zurück.
Es wurde gefunden, dass das angewendete erfindungsgemäße Belastungsschema die Regeneration von artikulärem Knorpelgewebe, Kollagengewebe, Knochengewebe und/oder deren jeweiligen isolierten Zellen stimuliert. Es wurde auch gefunden, dass das Intervallbelastungsschema die Genexpression für Proteine erhöht, welche die funktionelle, extrazelluläre Matrix von artikulärem Knorpel bilden. Nach dem Anwenden des erfindungsgemäßen Intervallbelastungsschemas bestätigte das Anfärben der Matrix mit kationischen Farbstoffen das erhöhte Vorhandensein einer extrazellulären Matrix.
Zusätzlich wurde gefunden, dass das Intervallbelastungsschema zu einer selektiven Inhibierung von Matrix-abbauenden Enzymen, proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, welche inflammatorische Zellen in die Gelenkhöhle locken, führt. Des Weiteren wurde gefunden, dass das Intervallbelastungsschema die Expression von transformierendem Wachstumsfaktor-β1 (TGF-β1), einer Matrixmetalloproteinase, wie beispielsweise MMP-1, MMP-2, MMP-9, und des Gewebeinhibitors von Metallopro teinase (TIMP) in humanen, Osteoblasten-artigen Zellen beeinflusst. Diese und andere Faktoren können, wie in Tabelle 1 gezeigt, geeigneterweise zur Beurteilung der Knorpel- und Knochenfunktionalität verwendet werden.
Die Verfahren, die für den Nachweis der Parameter zur Bestimmung der Funktionalität verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, RT-PCR, Zymographie, Biochemie, Färbung, ELISA, Gen-Array-Techniken und Proteomimiks.
B. In vitro Behandlung
Für die in vitro Behandlung wird beschädigtes Knorpelgewebe durch chirurgische Mittel aus einem Patienten entfernt. Das Intervallbelastungsschema kann für eine ex vivo Behandlung auf das intakte Gewebe, wie ein Osteochrondroknorpeltransplantat, angewendet werden. Für eine in vitro Behandlung wird die normale oder erkrankte Knorpelmatrix abgebaut und das Intervallbelastungsschema wird auf die resultierenden Knorpelzellen angewendet, die in Suspension innerhalb eines Gerüsts/Trägers oder als Monolager kultiviert werden. Nach der Anwendung des Belastungsschemas wird das resultierende de novo gebildete Gewebe oder die Ansammlung von Zellen in einen Patienten reimplantiert. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, ist das Transplantat autolog.
Das Operationsverfahren folgt im Allgemeinen der Technik, die für einen arthroskopischen Eingriff unter Verwendung des osteochondralen Graftings entwickelt und verwendet wurde. In diesem Verfahren wird eine durchgehende Knorpelprobe aus Randbereichen der Gelenkoberfläche entfernt und dann in einen kreisförmigen Defekt überführt. Die Wirtsstelle weist üblicherweise einen Umfang auf, der geringer ist als das einzusetzende Material, so dass die Vereinigung zwischen der Wirtsstelle und dem Austauschgewebe ein Widerstandssitz ist. In dem Material, das in Antwort auf die Intervallbelastung erzeugt werden soll, wird die Größe des wiederhergestellte Knorpelmaterial eingestellt, um auf die Oberflächenumrisse des Gelenks zu passen. Dies ist verschieden von dem üblichen Verfahren des osteochondralen Graftens, bei dem das übergroße Transplantat 2–3 mm über der Oberfläche des umgebenden Knorpels belassen wird. Die Bildung einer Typ II-Kollagen-basierten, extrazellulären Matrix, die normalen Gelenkbelastungen standhalten kann, ermöglicht es den Presssitz-Transplantaten mit der Oberflächendicke eines normalen Gelenks, die mit der natürlichen Dicke übereinstimmt, welche der örtlichen Variation des normalen Gelenks entspricht, übereinzustimmen.
Die in vitro Behandlung von Zellen, Zellmonolayer oder Zellkulturen ist im Wesentlichen so wie in Abschnitt II beschrieben.
C. Ex vivo Behandlung
Für die ex vivo Behandlung, die besonders geeignet ist für die Behandlung einer Gelenkknorpelbeschädigung, wie ein zerfetzter oder gerissener Meniskus, bei der nur ein Teil des Knorpels beschädigt sein kann und der Rest des Knorpels gesund und funktionsfähig ist, wird der gerissene oder zerfetzte Knorpel als Knorpeltransplantat chirurgisch entfernt und dem IHP-Belastungsschema unterzogen. Die Funktionalität des Knorpeltransplantats wird regelmäßig geprüft, bis die Kriterien die in Tabelle 1 gezeigten Spiegel von normalem, gesundem Knorpel erreichen. Anschließend wird das Transplantat, das seine ursprüngliche Form und Größe beibehält, in das Gelenk reimplantiert. Die ex vivo IHP-Behandlung, das Prüfen, die chirurgische Entnahme und die Reimplantation werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Der Vorteil der ex vivo Behandlung besteht darin, dass das Gewebe autolog ist, nur das beschädigte Gewebe einer Behandlung unterzogen wird und die Form und Größe des Explantats gleich bleibt, so dass nicht weniger oder mehr Knorpelgewebe hinzugefügt wird. Zusätzlich wird das Gewebe nur retransplantiert, falls und wenn es vollständig regeneriert ist. Der Nachteil dieses Vorgehens ist eine doppelte Operation. Bei einer umfangreichen artikulären Gelenkbeschädigung ist dieses Vorgehen jedoch nach wie vor bevorzugt verglichen mit einem Gelenkaustausch oder dem Belassen des Gelenks ohne Knorpel oder eines Teils des Knorpels zusammen.
D. Apparat für die intermittierende, hydrostatische Druckbelastung
Geräte und Apparate für die Regeneration von artikulärer. Knorpelmatrix und/oder Zellen bei ex vivo und in vitro Behandlungen umfassen im Wesentlichen einen hydrostatischen Druckerzeuger, einen Frequenzzähler, einen Zeitnehmer und eine Temperaturüberwachungsvorrichtung.
Ein geeigneter in vitro Apparat umfasst eine Druckkammer zum Aufnehmen des Gewebes, Zellen von Interesse oder Zellkulturen, ein hydraulisches Belastungsgerät (Druckvorrichtung) in Fluidverbindung mit der Druckkammer zum Druckbeaufschlagen der Druckkammer auf vorbestimmte Drücke von Interesse, und eine Steuerelektronik zur Frequenzsteuerung in elektrischer Verbindung mit dem Belastungsgerät zum Steuern des Belastungsgeräts, so dass dieses ein vorbestimmtes Intervallbelastungsschema auf das Gewebe oder die Zellen von Interesse angewendet.
Ein geeignetes Gerät zum Anlegen eines intermittierenden, hydrostatischen Drucks auf isolierte, artikuläre Chondrozyten für eine in vitro Behandlung ist in 1 zu sehen. Das in 1 erkennbare besondere Gerät ist ein handelsüblich erhältliches Druckgefäß aus Edelstahl, das an ein servo-hydraulisches Belastungsgerät angeschlossen ist. Diese Bauweise sorgt für die vollständige Evakuierung von Luft aus dem System, was zur Folge hat, dass ein rein hydrostatischer Druck angelegt wird.
Der in 1 zu sehende Apparat ist nur beispielhaft und man beachte, dass irgendein Gerät oder Apparat, unabhängig davon, wie diese abgeändert sind, und die ähnliche Bauteile umfassen und zu ähnlichen Ergebnissen führen, im Umfang dieser Erfindung liegen soll. Es wird auch Bezug genommen auf ein in vivo Gerät, das eine Haltevorrichtung zum Halten eines Gelenks oder einer Extremität eines Patienten oder Mittel zum Anbringen am Gewebe eines Patienten, einen mit der Haltevorrichtung verbundenen Motor zum Bewegen der Haltevorrichtung entlang einer vorbestimmten Bahn, und eine elektrisch mit dem Motor verbundene Steuerelektronik zum Steuern des Motors, um eine Extremität des Patienten zu bewegen, umfasst, um ein Intervallbelastungsschema auf das Knorpelgewebe von Interesse anzuwenden.
Die in vivo Belastung des Gelenks erfolgt durch eine Vorrichtung, welche das betreffende diarthrotische Gelenk überspannt. Für das Knie überspannt das Gerät beispielsweise den Abstand von der Hüfte bis zur Fußsohle mit entsprechenden Einschränkungen, das Bein gestreckt zu halten. Die Vorrichtung umfasst einen Zusammenziehmechanismus, durch welchen der condyläre Oberschenkelknorpel nebeneinander gesetzt werden kann auf dem Schienbeinkopfknorpel auf der anderen Seite des Meniskus bei einer Frequenz zwischen 0,1 und 10 Hz, und wird Drücke im Bereich von 1 bis 20 MPa für vorgeschriebene Intervalle zwischen 1 und 8 Stunden, was näher an 4 Stunden pro Tag normaler täglichen Aktivität herankommt, erzeugen.
II. Intervallbelastung von humanen, normalen und osteoarthritischen Chondrozyten
Die Hauptkomponente von mechanischen Belastungen, welchen artikuläre Chondrozyten innerhalb der extrazellulären Matrix von Gelenkknorpel ausgesetzt sind, ist der hydrostatische Druck. Die normale Belastung von Gelenken während den täglichen Aktivitäten bewirkt, dass der artikuläre Knorpel hohen Werten von intermittierendem, hydrostatischem Druck ausgesetzt wird. Die in diesem Abschnitt beschriebene Studien zeigen, dass in vitro gehaltene osteoarthritische Chondrozyten auf einen angelegten hydrostatischen Druck durch Erhöhen der positiven metabolischen Aktivität und Verringern der Expression von zerstörerischen Enzymen ansprechen.
Die Wirkung von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Proteinsynthese von Knorpelmatrix in isolierten, adulten, humanen, artikulären Chondrozyten konzentrierte sich auf die Expression der mRNA von Typ II-Kollagen, Aggrecan und anderen abbauenden und wachstumsfördernden Proteinen, wie MMP-2, TGF-β, MCP-1 und FGF-1. Die Ergebnisse dieser Studien sind in den 2–7 zu sehen.
In dieser Reihe von Studien wurde die Expression von mRNA von Aggrecan, Typ II-Kollagen, MMP-2, TFG-β, MCP-1 und FGF-1 von normalen, gesunden und osteoarthritischen humanen Chondrozyten, die mit 1 MPa oder 10 MPa hydrostatischem Druck für 5 Minuten oder 4 Stunden für 4 Tage stimuliert worden waren, mit der Expression von mRNA in Kontrollen verglichen. Wenn die Belastung in der Art und Weise einer Dosis-Wirkung im Bereich von 1, 5 und 10 MPa gegenüber dem hydrostatischen Druck, begrenzt entweder auf intermittierende 5 Minuten oder intermittierende 4 Stunden pro Tag bei 1 MPa und 10 MPa Druck, durchgeführt wurde, wurde beobachtet, dass sich das Aggrecan-mRNA-Signal, wie aus 2 ersichtlich, bei Belastungen von 1 MPa und 10 MPa erhöhte.
Wie in 2 zu sehen, bestätigen die Ergebnisse eindeutig, dass das vorliegende Intervallbelastungsschema zu einer erhöhten genetischen Expression von Aggrecan und Typ II-Kollagen führt. Aggrecan, ein großes und das am häufigste vorkommende aggregierte Proteoglykan, das eine grundlegende Rolle beim Verleihen einer Druckelastizität für den artikulären Knorpel spielt, und es ermöglicht, dass die Belastbarkeit bleibt. Kollagen vom Typ II versieht das Gewebe mit Zugfestigkeit. Die erfindungsgemäße Behandlung führt folglich zu einer erhöhten Elastizität von Knorpel und der Fähigkeit, größere Belastungen auszuhalten.
3 zeigt die Wirkungen einer 4-ständigen Intervallbelastung für 4 Tage mit 10 MPa intermittierendem, hydrostatischem Druck (IHP) auf die Expression des Aggrecan- und Typ II-Kollagen-mRNA-Signals, ausgedrückt als Verhältnis von Aggrecan oder Typ II-Kollagen zu dem intrazellulären Referenzprotein β-Aktiv in humanen, osteoarthritischen, artikulären Chondrozyten.
Diese Ergebnisse bestätigen eindeutig, dass sowohl die Expression von Aggrecan als auch von Typ II-Kollagen, den makromolekularen Hauptproteinen in der extrazellulären Knorpelmatrix, in erkrankten, humanen, osteoarthritischen Knorpelzellen nach einer IHP-Behandlung erhöht war.
Wie in den 3A und 3B zu sehen, führte das Anlegen von intermittierendem, hydrostatischem Druck zu einem erhöhten Verhältnis der Erzeugung des Aggrecanzu-β-Aktin-Signals von etwa 0,1 auf etwa 0,5, das heißt, zu einer etwa 5-fachen Erhöhung. Das Verhältnis von Typ II-Kollagen-zu-β-Aktin-Signal erhöhte sich, wie in 3B zu sehen, noch mehr von etwa 0,1 auf etwa 0,12.
Es wurde auch eine immunhistochemische Analyse der Wirkung von hydrostatischem Druck auf Chondrozyten vorgenommen. Die Immunhistochemie stellt einen Index der Antwort der extrazellulären Matrix auf mechanische Belastungen bereit. Mit den oben beschriebenen Belastungsbedingungen zeigte die immunhistochemische Analyse, dass das Anlegen von hydrostatischem Druck das Ablagern von Proteoglykan und Kollagen in der extrazellulären Matrix erhöhte (Daten nicht gezeigt).
Um zu untersuchen, ob IHP auch Wirkungen auf die Expression von Molekülen Deletionen in Knorpel zeigt, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Freisetzung und wirksame Intervallbelastung von Proteasen und Wachstumsfaktoren zu untersuchen.
Der Wirkung der Intervallbelastung mit intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Inhibierung der Expression von mRNA von Matrixmetalloproteinase wurde durch Untersuchen der Wirkungen von hydrostatischem Druck unter den gleichen Bedingungen wie in der 2 beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 4 zu sehen, welche die Wirkungen der Intervallbelastung mit verschiedenen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung von Matrixmetalloproteinase-2 aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten zeigt.
Matrixmetalloproteinase-2 (MMP-2) ist eines von mehreren Enzymen, die dafür bekannt sind, mit der Knorpeldegeneration in einem erkrankten Gelenk assoziiert zu sein. Die Verringerung der Spiegel dieses Enzyms nach Anlegung von IHP bei 10 MPa für vier Stunden für 4 Tage zeigt, dass die Reparatur und die Regeneration der extrazellulären Matrix im Gange ist. Eine zymographische Analyse, wie in 4B zu sehen, der Expression von neutraler Metalloproteinase zeigte, dass APMA, ausgesetzt gegenüber einem intermittierenden, hydrostatischen Druck für 4 Stunden, gefolgt von 20 Stunden Erholung für 4 Tage, die gelatinolytischen Aktivitätsspiegel verringerte.
Der transformierende Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) ist dafür bekannt, bei metabolischen Veränderungen beteiligt zu sein, die mit der beschleunigten Matrixresorption assoziiert sind, die beispielsweise bei der Osteoarthritis auftritt, bei der sowohl anabole als auch katabole Wege des Aggrecan-Metabolismus aktiviert sind. TGF-β1 beeinflusst folglich die Homöostase von Knorpel.
Die Rolle von TGF-β1 ist am ausgeprägtesten in Bezug auf Vorläuferzellen, wie beispielsweise den umgebenden periostalen Bereich von Knochen. Die direkten Wirkungen von TGF-β1 auf isolierte Knorpelzellen variieren in Abhängigkeit des Spiegels von erzeugtem Protein, da dieser pleiotrope Wirkungen auf verschiedene Zellen ausübt. Die Zugabe von TGF-β1 zu artikulären Knorpelzellen in Kultur verringert die Expression von Kollagen vom Typ II, was für die Erzeugung der Matrix kontraproduktiv ist.
5 zeigt die Wirkungen der Intervallbelastung mit verschiedenen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung von TGF-β1 aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten.
Die Wirkung von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die in 5 zu sehende Freisetzung von TGF-β bedeutet, dass der Zellmetabolismus durch den mechanischen Reiz moduliert wird. Die verringerte Erzeugung dieses Wachstumsfaktors ist eindeutig mit anderen Veränderungen des Zellmetabolismus verknüpft.
Wie in 5 zu sehen, führt die Anlegung von IHP für 4 Stunden bei 10 MPa zu einer Verringerung der Freisetzung von TGF-beta aus normalen Chondrozyten, was zeigt, dass die Proteinsynthese sich bei höherem Druck (10 MPa), der intermittierend für längere Zeitspannen angelegt wird, verringert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die IHP-Stimulation den metabolischen Zustand von Chondrozyten auf eine zeit- und dosisabhängige Art und Weise unterschiedlich beeinflusst. Wie unten gezeigt, wurden ähnliche Ergebnisse nach IHP-Stimulation von Osteoblasten-artigen Zellen beobachtet.
6 zeigt die Wirkungen der Intervallbelastung mit verschiedenen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Freisetzung von Makrophagen-Chemoattraktant-Protein-1 (MCP-1) aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten.
MCP-1 stellt einen Mediator aus einer Vielzahl von proinflammatorischen Mediatoren dar, welche den Immunstatus von Geweben beeinflussen. Eine Verringerung von MCP-1 in Chondrozyten ist aussagekräftig als Marker für eine Veränderung des Zellmetabolismus und die Beendigung von inflammatorischen Prozessen, welche die Knorpeldegeneration oder -schädigung begleiten. Die Freisetzung von MCP-1 ist üblicherweise mit der Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen, den Zellen des Immunsystems, die eine Rolle bei der Zerstörung von Gewebe spielen, assoziiert. Dessen verringerte Expression signalisiert eine Besserung der Knorpelschädigung.
Wie in 6 zu sehen, ist die Freisetzung von MCP-1 aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten nach dem Anlegen von IHP bei 10 MPa für 4 Stunden signifikant, ungefähr 8-fach, verringert.
Die beobachtete Verringerung der Freisetzung von MCP-1 zeigt eindeutig, dass ein anti-inflammatorischer Mechanismus oder ein Antiverletzungsmechanismen des Knorpels weniger aktiviert ist, was folglich zu einem geringeren Maß an Knorpeldegeneration und -zerstörung führt.
Um zu bestimmen, ob die Verringerung der Freisetzung von MMP-1, MMP-2 oder TGF-β nach IHP für diejenigen Proteine, die bei der Knorpeldegeneration beteiligt sind, selektiv ist, wurden Studien mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 durchgeführt, der bei solchen Prozessen nicht beteiligt ist und folglich nicht auf die IHP reagieren sollte. Die Ergebnisse sind in der 7 zu sehen.
7 zeigt das Fehlen einer Wirkung der Intervallbelastung mit verschiedenen Stärken von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf den Fibroblasten-Wachstumsfaktor-1 (FGF-1) aus normalen, humanen, artikulären Chondrozyten.
Die 7 zeigt, dass nicht alle Wachstumsfaktoren auf intermittierenden, hydrostatischen Druck ansprechen, sondern nur diejenigen Faktoren, welche bei der Knorpeldegeneration oder -regeneration beteiligt sind. Die 7 zeigt auch, dass die Chondrozyten nicht durch die IHP beschädigt wurden und dass die verringerte Freisetzung von MMP-2, TGF-β und MMP-1 auf den beschädigten Knorpel zurückzuführen ist.
Der Zielsetzung der in den 2–7 beschriebenen Studien bestand darin, zu untersuchen, ob das Anlegen von intermittierendem, hydrostatischem Druck an Knorpel zu Veränderungen der Synthese von Matrixproteinen in isolierten, adulten, humanen, artikulären Chondrozyten führt.
Die 2–7 zeigen zusammengenommen, dass eine übermäßige oder ungenügende (5 Minuten bei 10 MPa oder 4 Stunden bei 1 MPa) Belastung von Gelenkknorpel keinen ausreichenden Reiz für die Knorpelreparatur und -regeneration bereitstellt und in einigen Fällen sogar zu einer erhöhten Degeneration und zu einem Funktionsverlust führen kann. Die in den 2–7 zu sehenden Ergebnisse bestätigen, dass eine Korrelation zwischen dem IHP und dem Auftreten von vorteilhaften Veränderungen der metabolischen Prozesse, die zu einer Knorpelregeneration führen, besteht.
Die Rehabilitation der Gelenkfunktion hängt von der Reparatur und der Regeneration von erkranktem Knorpel ab. Eine Vielzahl der oben beschriebenen experimentellen Methoden bestätigen, dass die mechanische Belastung die Synthese von extrazellulären Matrixkomponenten von artikulären Chondrozyten, d. h. Aggrecan und Typ II-Kollagen, beeinflusst. Bis heute wurde jedoch nicht gezeigt, dass eine eindeutige Beziehung für die mechanisch induzierte Modulation der Genexpression der Knorpelmatrix besteht, was zeigt, dass die mechanische IHP-Stimulierung als Impetus für die Reparatur und Regeneration von Knorpel dient. Die oben beschriebenen Ergebnisse ermöglichen die in vitro und ex vivo therapeutische Intervention.
III. Zeitabhängige Wirkungen von IHP auf die mRNA-Expression von Typ II-Kollagen und Aggrecan
Anfängliche Studien, die zu dieser Erfindung führten, haben gezeigt, dass ein kontinuierlich angelegter hydrostatischer Druck nicht zu einer Knorpelreparatur und -regeneration, gemessen durch die Erhöhung oder Verringerung der metabolischen Aktivitäten der relevanten Proteinsynthese, führt. Ein solcher Druck, der für eine kurze Zeitspanne angelegt wurde, führte zu einer erhöhten Expression der mRNA für Typ II-Kollagen, während die kontinuierlich angelegte Belastung eine solche erhöhte Expression nicht erhielt. Andererseits erhöhte sich die Aggrecan-SignalExpression während der Dauer der Belastung stetig.
Die im Abschnitt II dokumentierten Studien haben gezeigt, dass eine Korrelation zwischen IHP und metabolischen Prozessen von Chondrozyten besteht.
Die in diesem Abschnitt beschriebenen Studien untersuchten die zeitabhängigen Wirkungen von IHP auf die Expression der mRNA von Typ II-Kollagen und Aggrecan in normalen, adulten, artikulären Rinder-Chondrozyten in vitro.
Der Zweck dieser Studie bestand darin, zu prüfen, ob der auf Chondrozyten angelegte intermittierende Druck die mRNA-Spiegel von Typ II-Kollagen und Aggrecan ohne Stimulierung der mRNA von Typ I-Kollagen erhöht. Die experimentelle Methode beruhte auf der Verwendung von RT-PCR für die relative Quantifizierung der mRNA-Spiegel von Kollagen und Aggrecan in Bezug auf die mRNA von Beta-Aktin als internes Referenzsignal.
Diese Studie untersuchte insbesondere die Wirkungen von zwei Arten von Belastungsschemen von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Expression der mRNA von Typ II-Kollagen und Aggrecan in normalen, adulten, artikulären Chondrozyten. Die Chondrozyten wurden gemäß Beispiel 1 isoliert. Ein System zum quantitativen Belasten von adulten, artikulären Chondrozyten verwendete eine hochdichte Monolayerkultur (1,75 × 10⁵ Zellen/cm²) oder aggregierte Zellcluster.
Die Belastung der Zellen mit intermittierendem, hydrostatischem Druck wurde entweder nach einem kontinuierlichen Schema über eine Zeitspanne von 24 Stunden oder als Intervallbelastung durchgeführt, wobei die Belastung für vier Stunden pro Tag gemäß Beispiel 3 angelegt wurde. Die metabolische Antwort der artikulären Chondrozyten wurde unter Verwendung eines semi-quantitativen reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion(RT-PCR)-Assays für Typ II-Kollagen-, Aggrecan- und Beta-Aktin-mRNA-Signal bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 8–12 zu sehen.
8 ist ein Diagramm, das die RT-PCR-Signalspiegel für die Expression von Kollagen vom Typ II und Typ I und Beta-Aktin in nicht-belasteten hochaktiven Chondrozytenkulturen zeigt, beibehalten während den bezeichneten Testzeitspannen von 2–24 Stunden.
9 zeigt die Signalspiegel für die Expression von β-Aktin gegenüber IHP ausgesetzten Zellen und in nicht-belasteten Kontrollzellen.
8 zeigt die durch RT-PCR bestimmten Signalspiegel für die Expression von Typ II-Kollagen und β-Aktin in Kontrollzellen, die ohne Stimulierung bei 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden gemäß Beispiel 3 erhalten wurden. Die RT-PCR-Bedingungen waren wie in Beispiel 4 beschrieben.
Die 8 zeigt, dass die RT-PCR-Signalspiegel für die Expression von Kollagen vom Typ II und Typ I und von β-Aktiv in nicht-belasteten Kontrollzellen eindeutig nachweisbar sind und sich nicht verändern.
Artikuläre Chondrozyten, die plattiert und als hochdichte Monolayerkulturen bei Atmosphärendruck gehalten wurden (nicht-belastete Kontrollkulturen), zeigten keine signifikanten Schwankungen bezüglich der Signalspiegel für die mRNA von Typ II-Kollagen oder die mRNA von β-Aktirr. Diese Beobachtungen blieben, wie in 8 zu sehen, über einen Zeitverlauf von 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden zutreffend.
Um ein mRNA-Referenzsignal zu bestimmen, das sich in Antwort auf einen angelegten IHP nicht verändern würde und folglich einen Richtwert für einen Vergleich darstellen würde, wurde β-Aktiv aufgrund dessen relativen Häufigkeit von mRNA und aufgrund dessen Lokalisierung ausgewählt.
9 zeigt die RT-PCR-Signalspiegel für die Expression von β-Aktiv in Zellen, die einem intermittierenden, hydrostatischen Druck ausgesetzt wurden, und in nicht-belasteten Kontrollzellen.
Wie in 9 zu sehen, veränderte das Aussetzen von Chondrozyten gegenüber einem intermittierenden, hydrostatischen Druck die Signalspiegel von β-Aktin-mRNA über einen Zeitverlauf von 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden, verglichen mit den nicht-belasteten Kontrollzellen, nicht.
Im Gegensatz dazu zeigte das Anlegen von IHP an normale Chondrozyten in einer Monolayerkultur oder einer Aggregatkultur, dass das mRNA-Signal von Typ II-Kollagen nicht deutlich zeigte bei Belastungszeitspannen von 4 und 8 Stunden und sich danach verringerte. Andererseits zeigte die Aggrecan-mRNA unter denselben Bedingungen ein unterschiedliches Profil und stieg während 24 Stunden stetig an.
Die Ergebnisse, die sich auf die Expression von Typ II-Kollagen bezogen, veranlassten die Untersuchung einer Intervallbelastung, bei der IHP für eine Zeitspanne von 4 Stunden angelegt wurde, gefolgt von einer Erholungszeitspanne.
Die Chondrozyten-Kulturaggregate wurden einem intermittierenden, hydrostatischen Druck unter Verwendung einer kontinuierlichen Belastung während einer 24-stündigen Zeitspanne ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in den 10 und 11 zu sehen.
10 zeigt die RT-PCR-Signalspiegel für Aggrecan nach dem Aussetzen von hochdichten Monolayerkulturen gegenüber einem intermittierenden, hydrostatischen Druck unter Verwendung einer Intervallbelastung für 4 Stunden pro Tag, gefolgt von einer 20-stündigen Erholung für 4 Tage.
11 zeigt die RT-PCR-Signalspiegel für Typ II-Kollagen nach dem Aussetzen von hochdichten Monolayerkulturen gegenüber einem intermittierenden, hydrostatischen Druck unter Verwendung einer Intervallbelastung für 4 Stunden pro Tag, gefolgt von einer 20-stündigen Erholung für 4 Tage.
Unter diesen Belastungsbedingungen erhöhte sich der Signalspiegel der AggrecanmRNA ungefähr viermal im Vergleich zu den nicht-belasteten Kontrollen (10). Die Veränderung des Belastungsprotokolls führte zu einer ungefähr siebenfachen Erhöhung des mRNA-Signals von Typ II-Kollagen im Vergleich zu den nicht-belasteten Kontrollen (11).
Die Ergebnisse der oben beschriebenen und in den 8–11 dargestellten Studien zeigten, dass die Chondrozyten auf ein verändertes Belastungsprotokoll hin zu einem Schema, welches das Aussetzen gegenüber einem intermittierenden, hydro statischen Druck für vier Stunden, gefolgt von einer 20-ständigen Erholungszeitspanne, umfasste, dahingehend antworteten, dass das RT-PCR-Signal, das der Typ IImRNA zuzurechnen ist, in Bezug auf das Signal, das die β-Aktin-mRNA darstellt, signifikant erhöht war. Das Aggrecan-mRNA-Signal war auch erhöht.
Diese Daten zeigen, dass die mechanische IHP-Belastung mit einem geeigneten Reiztyp der Modulation der Expression von Makromolekülen der artikulären Chondrozyten-Matrix dient. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen, dass die Anwendung bestimmter Belastungsschemen die Reparatur und Regeneration von artikulärem Knorpel fördert und zur erfolgreichen Erzeugung von transplantierbaren Knorpelverbundtransplantaten beiträgt.
Die belegten Wirkungen von hydrostatischem Druck auf Chondrozyten zeigen, dass die bestimmten Belastungsschemen einen wirksamen Reiz bereitstellen, um die Synthese von Makromolekülen der extrazellulären Knorpelmatrix zu modulieren und Reaktionen einzuleiten, die mit der Reparatur und Regeneration von beschädigtem Knorpel und Typ II-Kollagen verbunden sind.
IV. Wirkungen von intermittierendem, hydrostatischem Druck auf die Expression von TGF-β1 und MMP-2 in Osteoblasten-ähnlichen Zellen
Die mechanische Beanspruchung, die während normalen Belastungsaktivitäten erzeugt werden, tragen zur Knochenstruktur und -funktion durch einen besonderen Kreislauf bei, der die osteoblastische Bildung und die osteoklastische Resorption beinhaltet. Die Aufrechterhaltung einer normalen Knochenhomöostase in Antwort auf den Belastungsverlauf umfasst eine Anzahl von Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren.
Nach den oben beschriebenen Ergebnissen untersuchte diese Studie, ob ein intermittierender, hydrostatischer Druck (IHP) die Expression des pleiotropen Wachstumsfaktors, nämlich des transformierenden Wachstumsfaktors beta-1 (TGF-β1) in MG-63-, und HOS TE85-Zellen, moduliert und ob dieser als mechanisches Signal zur Modulation des Knochenzellmetabolismus fungiert. Zu diesem Zweck wurde die Wirkung von IHP auf die Osteoblasten-Expression von TGF-β1, der dafür bekannt ist, die Proliferation von Osteoblasten zu beeinflussen, und die phänotypische Expression von knochenspezifischen Proteinen untersucht. Zusätzlich wurde die Expression der Matrixmetalloproteinase MMP-2 untersucht.
Die Ergebnisse sind in den 12–14 zu sehen. Die 12–14 veranschaulichen die Wirkung von IHP auf die Erzeugung des TGF-β-Proteins oder die Expression von MMP-2 in den Osteoblasten-ähnlichen Zellen MG-63.
12 zeigt die Zeitverlaufsanalyse der Freisetzung von TGF-β1 aus MG-63-Zellen, die bei 10 MPa einem IHP ausgesetzt wurden. Die 13 zeigt Dosis-Wirkung-Effekte von IHP auf die Freisetzung von TGF-B1 aus MG-63-Zellen. Der Querstrich und die vertikale Linie in der 12 bzw. 13 stellen die Mittelwerte ± SD, bzw. (n = 3), p < 0,05, verglichen mit der Kontrolle dar.
Die Konzentration des TGF-β1-Proteins in dem konditionieren Medium von MG-63 wurde mittels ELISA untersucht. Mit den MG-63-Zellen wurde, wie in 12 gezeigt, keine signifikante Veränderung der Freisetzung von TGF-β1 nach einer 12-stündigen Aussetzung gegenüber IHP beobachtet. Das Anlegen von IHP für 24 und 48 Stunden verringerte jedoch, wie ebenfalls in der 12 zu sehen, die Freisetzung von TGF-β1 aus den MG-63-Zellen um 65% (p < 0,05) bzw. 53% (p < 0,05), bezogen auf die nicht-belasteten Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden für HOS TE85-Zellen beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Eine zweite Reihe von den in der 13 zu sehenden Studien untersuchte den Dosis-Wirkungs-Effekt von IHP auf die Expression von TGF-β1 mit MG-63-Zellen. Eine 12-ständige Aussetzung gegenüber IHP bei Werten von 1 und 10 MPa veränderte die Freisetzung von TGF-β1 nicht. Nach einer 24-ständigen Anlegung von IHP bei entweder 1 MPa oder 10 MPa war die Freisetzung von TGF-β1 in das Medium, wie in der
13 zu sehen, um 23% bzw. 31%, verglichen mit der nicht-belasteten Zellen, inhibiert.
14 stellt eine Zeitverlaufsanalyse der Freisetzung von MMP-2 (pg/ml) aus gegenüber IHP ausgesetzten MG-63-Zellen, quantifiziert mittels ELISA, dar.
20 zeigt die Quantifizierung der Freisetzung von MMP-2 in dem konditionierten Medium unter Verwendung von ELISA. Ein ähnliches Muster wurde in der zymographischen Analyse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wie in 20 zu sehen, war die Freisetzung von MMP-2 nach einem Aussetzen gegenüber einem IHP für 24 und 48 Stunden, bezogen auf die Kontrollen, signifikant um 46% bzw. 28% inhibiert. Das Anlegen von IHP unter den gleichen Bedingungen verringerte auch die Freisetzung von TIMP-1 in dem konditionierten Medium der Osteoblasten-ähnlichen Zellen. Nach 24- und 48-ständigem Aussetzen gegenüber IHP war die Freisetzung von TIMP-1 signifikant um 63% bzw. 29%, bezogen auf die nicht-belasteten Zellen, inhibiert. MMP-1 und MMP-9 wurden in Mediumproben von Zellen, die einem IHP ausgesetzt worden waren, oder nicht-belasteten Zellen zu keiner Zeitdauer nachgewiesen (Daten nicht gezeigt).
Die dargestellte zymographische Analyse zeigte, dass MMP-2 die prominente Matrixmetalloproteinase war, die durch die MG-63 freigesetzt wurde. In Gegenwart von IHP zeigte die Zymographie eine Inhibierung der Freisetzung der latenten 72 kD-Form von MMP-2 und beiden aktivierten Formen, 68 kD und 62 kD, in Mediumproben von Zellen, die gegenüber einem IHP für 24 und 48 Stunden ausgesetzt worden waren, verglichen mit Proben aus nicht-belasteten Zellen.
VI. Therapeutischer Nutzen
Das erfindungsgemäße therapeutische Verfahren ist in den Bereichen der orthopädischen Chirurgie, der Rheumatologie und der Sport- und Rehabilitationsmedizin verwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die de novo Bildung und Regeneration von erkranktem oder beschädigtem Knorpel, insbesondere von artikulärem Knorpel. Das Verfahren ermöglicht auch die ex vivo Regeneration von Knorpel oder verwendbaren Knorpeltransplantaten, die dem erkrankten oder beschädigten Gelenk entnommen wurden, das Regenerieren eines solchen Knorpels oder Transplantats bis zu einem Grad, bei dem sowohl die mechanischen als auch die biochemischen Eigenschaften des Knorpels auf normale Niveaus wiederhergestellt sind, und das Wiedereinsetzen des Transplantats in das Gelenk, nachdem die Knorpelkollagenmatrix wiederhergestellt wurde. Zusätzlich ermöglicht das Verfahren die in vitro Aufbereitung von Knorpel und Knochenzellen und Zellkulturen in funktionelles Gewebe, das für eine Transplantation geeignet ist, und die de novo Bildung und Erzeugung von gesunden, normal funktionierenden Knorpelzellen und anderen mesenchymal abgeleiteten Zellen.
BEISPIEL 1
Isolierung von Chondrozyten
Dieses Beispiel beschreibt das für die Isolierung von Chondrozyten verwendete Verfahren.
Adulte, artikuläre Rinder-Chondrozyten wurden aus durchgehendem Knorpel isoliert, der aus frisch vom örtlichen Schlachthof erhaltenen Radiocarpal-Gelenken herausgeschnitten wurde.
Die Knorpelzellen wurden aus der Matrix freigesetzt durch Inkubieren in 15 ml Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), enthaltend Gentamicin (50 μg/ml), und eine Mischung von bakteriellen Kollagenasen, Typ II und Typ IV (Worthington, Freehold, NJ) in einer Endkonzentration von 0,6 mg/ml in jeweils 15 ml Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium/Ham-Medium F12 (DMEM/F12, Gibco BRL, Grand Island, NY), enthaltend 25 μg/ml Gentamicin (Sigma, St. Louis, MO). Die Knorpelproben wurden für insgesamt 18 Stunden bei 37°C in 7,5% CO₂ und 100% Feuchtigkeit inkubiert, um einen vollständigen Aufschluss sicherzustellen. Die aus der Matrix freigesetzten Chondrozyten wurden durch ein Nylon-Maschenfilter filtriert, um einzelne Zellen zu isolieren. Die Zellen wurden nachfolgend durch wiederholte Zentrifugation bei 600 × g gesammelt, wobei die Zellen in Dulbecco's Phosphat-gepufferter Salzlösung resuspendiert und gesammelt wurden (3 × 50 ml).
Ein Zellendpellet wurde in dem serumfreien DMEM/F12-Medium suspendiert und die Zellen in einem Hämozytometer gezählt, wobei die Viabilität durch Trypan-Blau-Ausschluss bestimmt wurde. Die für Chondrozyten unter diesen Bedingungen erhaltene normale Viabilität war größer als 95%.
Die Chondrozyten wurden dann auf 60 mM Gewebeplatten plattiert und die Kulturen bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 7,5% CO₂ in Luft gehalten. Für die Bindung unter serumfreien Bedingungen wurden die einzelnen Platten über Nacht mit Poly-D-Lysin (Sigma, 0,1 mg/ml) vorbehandelt und zweimal mit PBS ohne Calcium oder Magnesium gewaschen. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/cm² plattiert.
BEISPIEL 2
Serumhaltiges oder serumfreies Medium
Dieses Beispiel beschreibt eine Zusammensetzung von serumhaltigem oder serumfreiem Medium.
Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthaltendes Serum enthielt dialysiertes hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum in einer Konzentration von 10% (v/v). Das serumfreie Medium bestand aus einer 1:1-Mischung von Ham F12/DMEM, supplementiert mit Selen und Liposomen. Die Liposomen wurden hergestellt durch Lösen von Lecithin, Cholesterin, Sphingomyelin, und Vitamin E-Acetat in 1 ml 2:1 Chloroform/Methanol (v/v), welches unter N₂ getrocknet wurde. Ein ml DMEM/F12 wurde zugegeben und die Lipidmischung wurde anschließend 3 x für Intervalle von jeweils 3 Minuten unter Verwendung einer Mikrospitze mit einem Duty-Cycle von 70% mit Ultraschall behandelt. Dieses Liposom-Ausgangsmaterial wurde mit einer 1000-fachen Endkonzentration hergestellt, unter N₂ aufbewahrt und bei 4°C gelagert. In einigen Experimenten wurde Ascorbat mit einer Konzentration von 50 μg/ml zu dem Medium gegeben.
BEISPIEL 3
Mechanische Belastung mit intermittierenden, hydrostatischen Drücken
Dieses Beispiel beschreibt das Belastungsprotokoll und die Bedingungen zum Anlegen von intermittierendem, hydrostatischem Druck.
Der hydrostatische Druck wurde periodisch mit einer Belastungsdosis von 10 MPa und bei einer Frequenz von 1 Hz angelegt. Der intermittierende, hydrostatische Druck wurde auf Zellen, die nach Zeitspannen von 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden entfernt wurden, oder durch ein Intervallbelastungsprotokoll angelegt, bei dem die Zellen nach einer 4-tägigen Zeitspanne entfernt wurden, während der ein intermittierender, hydrostatischer Druck für und beschränkt auf 4 Stunden pro Tag angelegt wurde, gefolgt von einer 20-ständigen Erholung. Dies wurde täglich für 4 Tage oder mehr wiederholt. Jeder Versuchszeitpunkt wurde dreifach getestet und jedes Experiment wurde für eine Mindestanzahl von drei unabhängigen Versuchen durchgeführt.
Der Druck wurde mit einem handelsüblich erhältlichen in 1 zu sehenden Druckgefäß aus Edelstahl durchgeführt, das mit einem servo-hydraulischen Belastungsgerät gekoppelt ist. Die Bauweise sorgte für die vollständige Evakuierung von Luft aus dem System, so dass das Anlegen des Drucks rein hydrostatisch war. Die Kulturplatten wurden innerhalb steriler verschweißter Beutel, die 45 ml Kulturmedium (DMEM/F12 1:1 mit 30 mM HEPES, eingestellt auf pH 7,4 für die pH-Stabilität in Abwesenheit von Kohlendioxid) enthielten, belastet.
Die Temperaturkontrolle wurde erreicht durch das teilweise Eintauchen des hydrostatischen Belastungsgefäßes in ein bei 37°C gehaltenes Umwälzwasserbad. Während der Belastungszeitspannen von bis zu 96 Stunden trat keine messbare Veränderung der Temperatur auf. Die Kontrollkulturen wurden unter identischen Bedingungen in verschweißten Beuteln gehalten und in einem identischen Gefäß platziert, das in demselben temperaturkontrollierten Wasserbad platziert wurde, wie die belasteten Kulturen.
BEISPIEL 4
Analyse des mRNA-Signalspiegels von Aggrecan und Typ II-Kollagen (RT-PCR) Dieses Beispiel beschreibt das für die Analyse der mRNA-Signalspiegel von Aggrecan und Typ II-Kollagen durch RT-PCR verwendete Verfahren.
Um das Testen von mehreren Proben für jede Belastungsbedingung zu ermöglichen, wurde eine in J. Orthop. Res., 15: 94 beschriebene experimentelle Methode unter Verwendung von semi-quantitativer RT-PCR für die Analyse der mRNA-Signalspiegel von Aggrecan und Typ II-Kollagen verwendet. Die Gesamt-RNA aus den gegenüber einem intermittierenden, hydrostatischen Druck ausgesetzten Zellen und aus den nicht-belasteten Zellen wurde aus den Zellen mittels des Quanidiniumisothiocyanat-Verfahrens, das in Biochemistry, 18: 5296 (1979) beschrieben ist, mit einem handelsüblich erhältlichen Tri-Reagens (Sigma, St. Louis, MO) extrahiert. Eine typische Ausbeute für zelluläre RNA pro 60 mm-Platte betrug 5 Mikrogramm.
Alle RNA-Präparationen wurden routinemäßig auf Agarose-Gelen hinsichtlich der Integrität von ribosomaler RNA gescreent. Die RNA-Gesamtkonzentrationen wurden spektrophotometrisch bestimmt und auf 200 ng/μl für die reverse Transkription unter Verwendung von Random-Hexamer-Priming eingestellt. Die mRNA-Probe wurde unter Verwendung von m-MLV-reverser Transkriptase (Gibco-BRL) in Gegenwart von RNase-Inhibitor (5-Prime, 3-Prime, Inc., Boulder, Co.) und in Gegenwart von 500 μM dNTPs (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in einzelsträngige cDNA überführt. Die Reaktion wurde bei 37°C für 15 Minuten, 42°C für 10 Minuten, 47°C für 10 Minuten durchgeführt und schließlich auf 99°C erhöht, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die Reaktionsmischung wurde 10 x verdünnt und für die PCR verwendet.
Die Zielsequenzen in den revers transkribierten cDNA-Proben wurden mittels PCR durch Verwendung von sequenzspezifischen Oligonucleotid-Primern amplifiziert, welche so gestaltet sind, dass ungefähr 200-bp-Sequenzen erhalten werden, welche sich über verschiedene Exone innerhalb des Aggrecan- (Anal. Biochem., 225: 356 (1995)) und des Typ II-Kollagen- (Arch. Biochem. Biophys., 314: 90 (1994)) -Gens erstrecken. Die Primersätze für Aggrecan und Typ II-Kollagen beruhten auf den für diese Gene publizierten Sequenzdaten.
Eine DNA-Größenanalyse und DNA-Sequenzierung der bestimmten Produkte stellte die Validität der unter Verwendung der Primer-Sätze erzeugten Produkte fest.
Die PCR wurde mit 1,0 μl cDNA in einem 0,5 ml Reaktionsröhrchen, das 1,5 μl PCR-Mater-Mix enthielt, durchgeführt; die Reaktion wurde bei 65°C eingeleitet, um ein nicht-spezifisches Annealing zu verhindern. Der PCR-Master-Mix enthielt 125 mM Tris-HCl, 50 mM Ammonium, jeweils Downstream- und Upstream-Primer, und 0,625 U/ml Tfl-DNA-Polymerase (Epicentre Technologies, Madison, WI). ³²P-α-dCTP mit 3000 Ci/mmol (Amersham NEN-Corp.) wurde zu dem Master-Mix gegeben, um eine Endkonzentration von 0,1 mCi/ml für das statistische Radiomarkieren von amplifizierten Produkten herzustellen. Das gesamte Reaktionsvolumen zu Beginn der PCR betrug 2,5 ml.
Zum Vergleich der relativen Expression wurden 0,5 ml einer Primerlösung, die 900 nM eines Oligonucleotid-Primersatzes zur Amplifikation der 3' nicht-translatierten Region von β-Aktin, 50 mM Tris-HCl, 20 mM Ammoniumsulfat, 1,5 mM Magnesiumchlorid enthielt, beim zehnten Zyklus zugegeben und in demselben Reaktionsröhrchen amplifiziert. Das β-Aktin-mRNA-Signal diente als interne Kontrolle zur Verfolgung von Röhrchen-zu-Röhrchen-Schwankungen in den Amplifikationsbedingungen und Unterschieden in der Anfangskonzentration oder -beladung von cDNA. Das Thermozyklus-Programm umfasste einen Zyklus bei 95°C für 3 Minuten zum anfänglichen Erhitzen, gefolgt von sich wiederholenden Zyklen von 95°C für 1 Minute und 65°C für 1 Minute. Die letzte Verlängerung erfolgte bei 72°C für 5 Minuten. Die gesamte Zyklusanzahl, die in dieser Studie verwendet wurde, betrug 30 Zyklen für Aggrecan und Typ II-Kollagen und 26 Zyklen für β-Aktin.
Die amplifizierten Produkte aus der PCR wurden auf 5% Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt und die Gele wurden direkt unter Verwendung des PhosphoImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) analysiert. Die relative Expression der mRNA wurde als bestimmte Signalspiegel und als Verhältnis des Signals von Aggrecan und Typ II zu dem β-Aktin-Signal ausgedrückt.
BEISPIEL 5
Statistische Verfahren
Dieses Beispiel beschreibt die Einzelheiten der statistischen Verfahren, die für die Auswertung der in den Beispielen 3 und 4 erhaltenen Ergebnisse verwendet wurden.
Die Signifikanz von Unterschieden zwischen belasteten und nicht-belasteten Proben wurde unter Verwendung des allgemeinen linearen Verfahrens für die "one-correction" für multiples Vergleichstesten (SAS, Gary, NC) verwendet.
Die Bestimmung der mRNA-Signalspiegel durch semi-quantitative RT-PCR-Verfahren stellte ausreichende Unterschiede zwischen behandelten und nicht behandelten Proben bereit, so dass ein „power level" erreicht wurde, um die Signifikanz bei p < 0,05 mit fünf unabhängigen Versuchen zu bestimmen. Im Falle der mRNA-Quantifizierung war die zu überprüfende Hypothese, dass eine Veränderung der Matrix-Gen-Expression relativ zur Expression von β-Aktin auftrat. Es wurde festgestellt, dass die Expression von β-Aktin sich in Antwort auf intermittierenden, hydrostatischen Druck nicht verändert. Dies erlaubte es, den gepaarten t-Test zu verwenden, um die Signifikanz aus den verschiedenen Kulturproben zu testen.
BEISPIEL 6
Humane Osteoblasten-Zellkultur
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, das zur Herstellung einer humanen Osteoblasten-Zellkultur verwendet wurde.
Humane Osteoblasten-artige Zellen, MG-63 und HOS TE85, wurden von der American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) bezogen.
Die Zellen wurden in 60 mM-Schalen mit „alpha minimal essential"-Medium (alpha-MEM) (Gibco, Grand Island, NY), enthaltend 10% fötales Rinderserum (Gibco) und Antibiotikum, Antimykotikum (Gibco; 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B), bei 37°C in einer Atmosphäre aus 5% CO₂ enthaltender Luft kultiviert.
Konfluente Kulturen wurden für weitere 24 Stunden in Abwesenheit von Serum inkubiert, um eine Wachstumsarretierung herbeizuführen. Das Kulturmedium wurde entfernt und jede Kulturplatte wurde in einen verschweißten Beutel platziert, der 40 ml serumfreies alpha-MEM, das mit 0,1% BSA, 15 mM HEPES, Ascorbinsäure (50 μg/ml) und Na-β-Glycerolphosphat (10 mM) supplementiert war, enthielt. Die ver schweißten Beutel wurden in ein Hochdruckgefäß, das mit Wasser gefüllt war, eingetaucht und IHP (1 oder 10 MPa bei einer Frequenz von 1 Hz) wurde angelegt.
Die Kontrollkulturen wurden bei Atmosphärendruck gehalten. Sowohl die Druckgefäßkulturen als auch die nicht-belasteten Kontrollkulturen wurden bei Atmosphärendruck gehalten. Sowohl die Druckgefäßkulturen als auch die nicht-belasteten Kontrollkulturen wurden während der Testzeitspanne in dem Wasserbad gehalten, um die Temperatur bei 37°C zu halten. Kulturmediumproben wurden zu den in den Figurlegenden der 13–18 angegebenen Zeitspannen gesammelt und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Um die mRNA-Stabilität zu untersuchen, wurde Actinomycin D (2,5 mg/ml) in Methanol gelöst und zu Kulturen mit einer Endkonzentration von 5 μm gegeben.
Humane Chondrozyten wurden auf dieselbe Art und Weise erhalten, wurden jedoch mit 0,1 mg/ml Trypsin vorbehandelt, um Protease- und Kollageninhibitoren zu entfernen.
BEISPIEL 7
Messung des TGF-(3-Proteinspiegels in dem konditionierten Medium
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, das zur Messung des TGF-β-Proteinspiegels in dem Medium verwendet wurde.
Zusammenpassende Paare von Antikörpern gegen TGF-β1 wurden von R & D Systems (Minneapolis, MN) gekauft. Latentes TGF-β1 in dem konditionierten Medium wurde durch 1NHCl aktiviert und konditionierte Mediumproben wurden durch Zugabe von 1,2 M NaOH/0,5 M HEPES-Puffer neutralisiert. Die Gesamtmenge von TGF-β1 wurde unter Verwendung des Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) gemessen. Alle Proben wurden dreifach analysiert. Die optischen Dichten wurden mit tels eines ELISA-Lesegeräts bei 450 nm mit einer Background-Korrektur bei 595 nm bestimmt.
BEISPIEL 8
Northern Blot-Analyse für TGF-β
Dieses Beispiel beschreibt die für die Northern Blot-Analyse von TGF-β verwendeten Bedingungen.
Gesamt-RNA wurde aus den Zellen extrahiert.
Für eine Northern Blot-Analyse wurden 10 μg von Gesamt-RNA denaturiert und auf einem 1% Agarose/1,1 M Formaldehyd-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt, um die Integrität der 28S- und 18S-Banden zu bestimmen. Der Transfer auf eine Nylon-Membran erfolgte mittels Standardverfahren. Die Membranen wurden mit ³²P-markierten cDNA-Sonden für TGF-β1 (ATCC) und GAPDH (ATCC) hybridisiert.
Die Radioaktivität jeder hybridisierten Sonde wurde unter Verwendung eines PhosphorImagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) analysiert.
BEISPIEL 9
Verfahren zur statistischen Analyse
Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren für die statistische Analyse der in den Beispielen 7 und 8 beschriebenen Studien.
Die Signifikanz zwischen behandelten Gruppen und Kontrollgruppen wurde unter Verwendung von ANOVA und des ungepaarten Zwei-Proben-Student's t-Tests (zweiseitig) unter Verwendung der Bonferroni-Approximation für multiple Vergleiche be stimmt. Alle Werte sind als Mittelwerte ± SD angegeben. Die Northern Blotting-Ergebnisse wurden als Verhältnis des Ziel-mRNA-Signals (TGF-β1) zu dem Housekeeping-mRNA-Signal (GAPDH) ausgedrückt. Die Unterschiede der mRNA-Verhältnisse, die mit und ohne die IHP-Behandlung beobachtet wurden, wurden unter Verwendung des Mann-Whitney U-Tests ausgewertet mit einem Signifikanz darstellenden p < 0,05.
BEISPIEL 10
Zymographie
Dieses Beispiel beschreibt die für die Zymographie verwendeten Bedingungen.
Die Mediumproben wurden aktiviert durch Inkubieren in 1,0 mM 4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) für eine Stunde bei 37°C. Die Proben wurden anschließend mit Probenpuffer gemischt und in 10% SDS-Polyacrylamid-Gelen, die mit 1 mg/ml Gelatine imprägniert waren, laufengelassen. Die Gele wurden mit Wasser gewaschen und für eine Stunde in 2,5% Triton X-100 in Wasser imprägniert. Nach 16-ständigem Aussetzen gegenüber Substratpuffer (0,05 Tris-HCl, pH 8, 0,5 mM CaCl₂) bei 37°C wurden die Gele mit Commassie-Blau R-250 in 30% Ethanol und 10 Essigsäure angefärbt und anschließend in Wasser entfärbt, um die gelatinolytische Aktivität sichtbar zu machen.
BEISPIEL 11
Messung von MMP- und TIMP-1-Peiltiden in dem konditionierten Medium
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, das zur Bestimmung des Vorhandenseins von MMP-1-, MMP-2-, MMP-9- und TIMP-1-Proteinen im Medium verwendet wurde.
Nach Beendigung der Belastung wurden die Mediumproben aus jedem Beutel gesammelt und die Konzentrationen von MMP-1-, MMP-2-, MMP-9- und TIMP-1-Proteinen wurden unter Verwendung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Kits (Oncogene, Cambridge, MA) gemäß den Herstelleranweisungen gemessen.
BEISPIEL 12
Northern Blot-Analyse für MMP-2 und TIMP-1
Dieses Beispiel beschreibt die Bedingungen der Northern Blot-Analyse für MMP-2 und TIMP-1.
Gesamt-RNA wurde aus den Zellen durch dasselbe wie in Beispiel 8 beschriebene Verfahren extrahiert. Für eine Northern Blot-Analyse wurden 10 μg Gesamt-RNA denaturiert und auf einem 1% Agarose/1,1 M Formaldehyd-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt, um die Integrität der 28S- und 18S-Banden zu bestimmen. Der Transfer auf eine Nylon-Membran erfolgte mittels Standardverfahren.
Die Membranen wurden mit ³²P-markierten cDNA-Sonden für MMP-2 und TIMP-1 (ATCC, Manassas, VA) hybridisiert. Die Radioaktivität jeder hybridisierten Sonde wurde unter Verwendung eines PhosphorImagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) analysiert.
BEISPIEL 13
Bestimmung der mRNA-Stabilität
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, das für die Bestimmung der mRNA-Stabilität verwendet wurde.
Die Stabilität der mRNA nach der mechanischen Belastungstestzeitspanne von 24 Stunden wurde durch Zugabe von Actinomycin D zu den Zellen gemäß Beispiel 6 bestimmt.
Actinomycin D wurde in vier Milliliter serumfreies Kulturmedium zugegeben. Die Zellen wurden für Testzeitspannen von 0, 1, 2 und 4 Stunden gehalten, bevor die zelluläre Gesamt-RNA isoliert wurde. Die Analyse des mRNA-Signalspiegels erfolgte wie in Beispiel 11 für das Northern-Blotting beschrieben. Die Stabilität der mRNA in den Kontrollkulturen wurde wie für die Zellen, die keinem IHP ausgesetzt wurden, bestimmt.
BEISPIEL 14
Statistische Analyse
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur statistischen Analyse von Ergebnissen, die in den in den Beispielen 10–12 beschriebenen Studien erhalten wurden.
Die Signifikanz zwischen behandelten Gruppen und Kontrollgruppen wurde unter Verwendung von ANOVA und des ungepaarten Zwei-Proben Student's t-Tests (zweiseitig) unter Verwendung der Bonferroni-Approximation für multiple Vergleiche bestimmt. Alle Werte sind als Mittelwerte ± SD angegeben.

Claims

Ex vivo oder in vitro Verfahren zur Wiederherstellung der Funktion von degeneriertem, erkranktem oder beschädigtem Knorpel, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Aussetzen von degeneriertem, erkranktem oder beschädigtem Knorpel oder eines Knorpeltransplantats, das aus einem Gelenk entfernt wurde, oder Chondrozyten ex vivo oder in vitro gegenüber einem intermittierend angelegten hydrostatischen Druck (IHP) zwischen etwa 0,5 und etwa 30 MPa für etwa 1 bis etwa 8 Stunden täglich; (b) Entfernen des IHP für eine etwa 16 bis 22-ständige Erholungszeitspanne; und (c) Wiederholen der Schritte (a) und (b) über eine Zeitspanne von etwa 4 bis etwa 100 Tagen oder je nach Bedarf.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Druck mit einer Frequenz von etwa 0,1–10 Hz angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Druck zwischen etwa 1 MPa und etwa 10 MPa beträgt, der Druck intermittierend für etwa 4 Stunden angelegt wird und die Erholungszeitspanne etwa 20 Stunden beträgt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Druck etwa 5 MPa –10 MPa beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Knorpel ex vivo dem IHP ausgesetzt wird und im Anschluss an die Regeneration in ein Medikament zur Rückführung in ein behandeltes Gelenk formuliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren ferner das Formulieren einer Matrix, umfassend regenerierte Chondrozyten, in ein Medikament zum Implantieren in das Gelenk umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Knorpel in vitro regeneriert wird, indem Chondrozyten einem IHP ausgesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Verfahren ein de novo Verfahren ist und das Aussetzen einer Matrix mit einer Suspension von mesenchymalen oder mesenchymal abgeleiteten Zellen gegenüber dem IHP umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend das Bestimmen der Funktionalität oder des Ausmaßes der Beschädigung von Knorpel oder Kollagen nach der ex vivo oder in vitro IHP-Behandlung durch Bestimmen des in vitro Expressionsspiegels der mRNA von Kollagen, Aggrecan, TGF, MMP-1, MMP-2 oder IL-6.
Verwendung von Knorpel, Kollagen, Bändern, Sehnen, Knochen, Chondrozyten oder Knorpeltransplantaten, erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, zur Herstellung eines Medikaments für die Wiederherstellung der Funktion eines degenerierten, erkrankten oder beschädigten Gelenks.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder die Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Erkrankung Osteoarthritis und/oder Osteoarthrose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder die Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Degeneration eine degenerative Gelenkerkrankung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder die Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Erkrankung ein Kollagenmangel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder die Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Gelenkbeschädigung ein belasteter oder beschädigter Knorpel ist.