DE60132311T2 - Funktionalisierte eingekapselte fluoreszierende nanokristalle - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf neuartige Zusammensetzungen, die verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassen. Im Besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Vesikels oder Kapsids zur Verkapselung von fluoreszierenden Nanokristallen bei der Bildung wasserlöslicher, fluoreszierender Nanokristalle.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Nicht-isotopische Detektionssysteme sind zu einem bevorzugten Verfahren bei der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Diagnostik zur Detektion von Biomolekülen unter Verwendung verschiedener Assays geworden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt: Durchflusszytometrie, Nukleinsäurehybridisierung, DNA-Sequenzierung, Nukleinsäurenamplifikation, Microarrays, Immunoassays, Histochemie und funktionale Assays mit lebenden Zellen. Im Besonderen gibt es, obwohl fluoreszierende organische Moleküle wie Fluorescein und Phycoerythrin häufig in Detektionssystemen verwendet werden, viele Nachteile bei der Verwendung von Kombinationen dieser Moleküle. So benötigt zum Beispiel jeder Typ an fluoreszierendem Molekül typischerweise Anregung mit Photonen von unterschiedlicher Wellenlänge verglichen zu jener, die für einen anderen Typ an fluoreszierendem Molekül erforderlich ist. Wird allerdings selbst eine einzelne Lichtquelle verwendet, um eine einzelne Anregungs-Wellenlänge zur Verfügung zu stellen (angesichts der spektralen Linienbreite), ist die spektrale Abstandsverteilung zwischen den Emissionsoptima von verschiedenen fluoreszierenden Molekülen zu ungenügend, als dass individuelle und quantitative Detektion ohne Wesentliche spektrale Überlappung möglich wären. Zusätzlich haben herkömmliche fluoreszierende Moleküle begrenzte Fluoreszenzintensität. Des Weiteren sind momentan erhältliche, nicht-isotopische Systeme typischerweise auf Grund der endlichen Anzahl an nicht-isotopischen Molekülen, die zur Markierung eines zu detektierenden Biomoleküls verwendet werden können, begrenzt.
  • Dotierte Metalloxid-(„dMO")-Nanokristalle sind Nanokristalle, die mit einer einzelnen Anregungslichtquelle angeregt werden können, was zu einer detektierbaren Fluoreszenzemission von hoher Quantenausbeute (z. B. ein einzelner Quantenpunkt, der eine Fluoreszenzintensität aufweist, die ein Log. oder größer als die eines Moleküls aus einem herkömmlichen fluoreszierenden Farbstoff sein kann) und mit einem separaten Fluoreszenz-Peak führen kann. Typischerweise haben sie eine im Wesentlichen gleichmäßige Größe von weniger als 200 Angström und vorzugsweise eine im Wesentlichen gleichmäßige Größe im Bereich von Größen von ungefähr 1 nm bis ungefähr 5 nm oder weniger als 1 nm. In diesem Zusammenhang bestehen dMO-Nanokristalle vorzugsweise aus Metalloxiden, die mit einem oder mehr als einem Metall der seltenen Erden dotiert sind, wobei das Dotierungsmittel angeregt werden kann (z. B. mit ultraviolettem Licht) um ein enges Spektrum von Fluoreszenzemission (typischerweise enger als das von einem Halbleiter-Nanokristall gesendete Spektrum der Fluoreszenzemission) zu erzeugen. Solche dMO-Nanokristalle sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Allerdings besteht ein erwünschtes Merkmal von dMO-Nanokristallen, wenn diese für nicht-isotopische Detektionsanwendungen verwendet werden, darin, dass die Nanokristalle wasserlöslich gemacht werden. „Wasserlöslich" bedeutet wie hierin verwendet, dass die Nanokristalle in einer Lösung auf wässriger Basis, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Wasser, Lösungen auf Wasserbasis und Pufferlösungen die in Detektionsverfahren, wie dem Fachmann in der Diagnostik bekannt, ausreichend löslich oder suspendierbar sind.
  • Bei Halbleiter-Nanokristallen handelt es sich um Quantenpunkte, die mittels einer einzelnen Lichtquelle angeregt werden können, was zu einer detektierbaren Fluoreszenzemission von hoher Quantenausbeute (z. B. ein einzelner Quantenpunkt, der eine Fluoreszenzintensität aufweist, die ein Log. oder größer als die eines Moleküls aus einem herkömmlichen fluoreszierenden Farbstoff sein kann) und mit einem separaten Fluoreszenz-Peak führen kann. Typischerweise haben sie eine im Wesentlichen gleichmäßige Größe von weniger als 200 Angström und vorzugsweise eine im Wesentlichen gleichmäßige Größe im Bereich von Größen von ungefähr 1 nm bis ungefähr 5 nm oder weniger als 1 nm. In diesem Zusammenhang bestehen Quantenpunkte vorzugsweise aus einem Halbleitermaterial der Gruppen II-VI (beispielsweise ZnS und CdSe) oder einem Halbleitermaterial der Gruppen III-V (beispielsweise GaAs). Solche Quantenpunkte sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Ein wünschenswertes Merkmal von Quantenpunkten, wenn diese für nicht-isotopische Detektionsanwendungen eingesetzt werden, besteht allerdings darin, dass die Quantenpunkte wasserlöslich gemacht werden. Aktuelle Verfahren, die verwendet werden um Halbleiter-Nanokristallen Wasserlöslichkeit zu verleihen bestehen darin, dem Halbleiter-Nanokristall eine Schicht hinzuzufügen, die Mercaptocarbonsäure oder Silica oder eine oder mehr als eine Schicht an Aminosäuren umfasst. Abhängig davon, welche Schichtzusammensetzung verwendet wird, kann das behandelte Nanokristall eine begrenzte Stabilität in einer wässrigen Lösung aufweisen, insbesondere bei Aussetzung gegenüber Luft (Sauerstoff) und/oder Licht. Genauer gesagt können Sauerstoff und Licht dazu führen, dass die Moleküle, welche die Schicht ausmachen, oxidiert werden, wodurch Disulfide gebildet werden, welche die Bindung der Schichtmoleküle an die Halbleiter-Nanokristalle destabilisieren. Somit kann die Oxidierung dazu führen, dass die Schichtmoleküle sich von der Oberfläche der Quantenpunkte lösen, wodurch die Oberfläche der Quantenpunkte freigelegt wird, was wiederum zu „destabilisierten Quantenpunkten" führen kann. Destabilisierte Quantenpunkte bilden, wenn sie miteinander interagieren, Aggregate, was schließlich zu irreversibler Flockulation der Quantenpunkte führt. Zusätzlich kann abhängig von der Schichtzusammensetzung nicht-spezifisches Binden, vor allem an ein oder mehr als ein Molekül in einer Probe, bei dem es sich nicht um das Zielmolekül handelt, bewirkt werden, was in einem Detektionsassay nicht erwünscht ist.
  • Bruchez M. et al, Science, 1998, Band 281, Seiten 2013 bis 2016, offenbart die Verwendung von halbleitenden Nanokristallen als fluoreszierende Sonden bei biologischer Färbung und Diagnose. Die offenbarten Nanokristalle weisen nur geringe Löslichkeit auf und sind deshalb in eine Siliziumschale verkapselt, um die Wasserlöslichkeit zu verbessern, wobei solche Verkapselungen als Kern-Schalen-Systeme bezeichnet werden. Die Verwendung von Silica wird als besonders vorteilhaft angesehen, da deren Chemie hinreichend charakterisiert ist, wodurch die Steuerung von Interaktionen mit biologischen Proben ermöglicht wird.
  • WO 87/07150 bezieht sich auf das Targeting von Medikamenten an spezifische Stellen im menschlichen Körper. Spezifischer gesagt offenbart das Dokument die Verwendung von Liposomen oder Nanoteilchen als Träger, um einen Wirkstoff an eine spezifische Stelle des Körpers zu leiten.
  • Allen T. et al, Biochimica et Biophysica Acta, 1995, Band 1237, Seiten 99 bis 108, offenbart die Verwendung von sterisch stabilisierten Liposomen als ein Mittel für das Targeting von Antikörper zu Krebszellen.
  • Hui S. et al, Biophysical Journal, 1996, Ausg. 71(2), Seiten 590 bis 599, offenbart die Verwendung von kationischen Liposomen als Vektoren für den Gentransfer und spezifischer die Rolle von Helferlipiden mit Bezug auf die Vereinfachung solcher Prozesse.
  • US-A-5449556 offenbart die Verwendung von Liposomen zur Verkapselung von hoch-löslichen Acridinestern, die als chemilumineszierende Markierungen verwendet werden können.
  • Somit besteht ein Bedarf, alternative Formen von wasserlöslichen, fluoreszierenden Nanokristallen vorzusehen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist ein Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung fluoreszierende Nanokristalle vorzusehen, die durch ein Vesikel oder Kapsid umfassend ein Liposom verkapselt sind.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, fluoreszierende Nanokristalle vorzusehen, die durch ein Vesikel oder Kapsid umfassend ein Liposom verkapselt oder innerhalb derselben eingeschlossen sind, wobei die Oberfläche des Liposoms mit Oberflächengruppen, die eine oder mehr als eine reaktive Funktionalität umfassen, die zur Bildung einer Bindung mit einem oder mehr als einem Molekül oder einem Affinitätsmolekül verwendet werden kann, funktionalisiert ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall vorzusehen, das ein oder mehr als ein fluoreszierendes Nanokristall umfasst, das durch ein durch Hinzufügen von einem oder mehr als einem Affinitätsmolekül funktionalisiertes Liposom verkapselt oder in diesem eingeschlossen ist.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall vorzusehen, das ein oder mehr als ein fluoreszierendes Nanokristall, das durch ein Liposom verkapselt oder in demselben eingeschlossen ist, umfasst, wobei der Liposombereich aufgespalten werden kann, um fluoreszierende Nanokristalle in einem Verfahren freizusetzen, dass der "Löschung" der Fluoreszenz in einer Reaktion dient.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen:
  • Der Begriff „fluoreszierende Nanokristalle" soll sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf fluoreszierende Nanokristalle beziehen, die aus dotierten Metalloxid-Nanokristallen, Halbleiter-Nanokristallen oder einer Kombination von diesen bestehen.
  • Der Begriff „dotierte Metalloxid-Nanokristall-Oxide" oder „dMO-Nanokristalle" soll sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf Nanokristalle beziehen, die aus dem Folgenden bestehen: einem Metalloxid und einem Dotierungsmittel bestehend aus einem oder mehr als einem Metall der seltenen Erden. Geeignete Metalloxide schließen zum Beispiel die Folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Yttriumoxid (Y2O3), Zirkoniumoxid (ZrO2), Zinkoxid (ZnO), Kupferoxid (CuO oder Cu2O), Gadoliniumoxid (Gd2O3), Praseodymoxid (Pr2O3), Lanthanoxid (La2O3) und Legierungen derselben. Das Metall der seltenen Erden umfasst ein Element ausgewählt aus der Reihe der Lanthaniden und schließt die Folgenden ein, ist jedoch nicht auf diese beschränkt: Europium (Eu), Cer (Ce), Neodym (Nd), Samarium (Sm), Terbium (Tb), Gadolinium (Gd), Holmium (Ho), Thulium (Tm), ein Oxid derselben und eine Kombination von diesen. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann ein mit Energie angereichertes dMO-Nanokristall in Abhängigkeit von dem Dotierungsmittel Licht in einer bestimmten Farbe senden. Somit wird der Typ des Metalls/oder der Metalle der seltenen Erden je nach der Farbe ausgewählt, die einem funktionalisierten, verkapselten dMO-Nanokirstall gemäß der vorliegenden Erfindung verliehen (von diesem emittiert) werden soll. Ein gegebenes Metall der seltenen Erden oder eine Kombination aus Metallen der seltenen Erden hat eine bestimmte Farbe, wodurch ermöglicht wird, dass funktionalisierte, verkapselte dMO-Nanokristalle zur Verfügung gestellt werden, von denen ein jedes eine Farbe über einen ganzen Bereich an Farben aussenden kann (mit engem Emissionspeak), indem die Art des Dotierungsmittels, die Konzentration des Dotierungsmittels oder eine Kombination von diesen angepasst wird. Zum Beispiel können die Emissionsfarbe und -helligkeit (z. B. Intensität) eines dMO-Nanokristalls umfassend Y2O3:Eu von der Konzentration von Eu abhängen; z. B. kann die Emmisionsfarbe mit steigender Eu-Konzentration von Gelb zu Rot wechseln. Die repräsentativen Farben, die möglich sind, sind lediglich aus Gründen der Veranschaulichung in Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1
    Farbe der Fluoreszenz Dotierungsmittel
    Blau Thulium
    Blau Cer
    Gelb-Grün Terbium
    Grün Holmium
    Grün Erbium
    Rot Europium
    rötliches Orange Samarium
    Orange Neodym
    Gelb Dysprosium
    Weiß Prasodym
    Orange-Gelb Europium + Terbium
    Orange-Rot Europium + Samarium
  • Es ist bekannt, dass Verfahren für die Herstellung von dMO-Nanokristallen einen Sol-Gel-Prozess und eine organometallische Reaktion einschließen. Wie für den Fachmann klar ersichtlich sein wird, ist das Dotierungsmittel (z. B. ein oder mehr als ein Metall der seltenen Erden) in ausreichender Meng in den dMO-Nanokristall inkorporiert, um zu ermöglichen, dass der dMO-Nanokristall bei der Fluoreszenzdetektion praktische Anwendung findet, wie hierin detaillierter beschrieben. Eine ungenügende Menge umfasst entweder zu wenig Dotierungsmittel, wodurch nicht genügend detektierbare Fluoreszenz emittiert werden könnte oder zu viel Dotierungsmittel, wodurch eine reduzierte Fluoreszenz auf Grund von Konzentrations-Quenching verursacht würde. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge an Dotierungsmittel in einem dMO-Nanokristall eine molare Menge in dem dMO-Nanokristall ausgewählt im Bereich von ungefähr 0,1% bis ungefähr 25%.
  • Der Begriff „Halbleiter-Nanokristalle" soll sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf Quantenpunkte (kristalline Halbleiter) beziehen, die aus einem Kern bestehend aus mindestens einem aus einem Gruppe II-VI-Halbleitermaterial (wie beispielsweise ZnS und CdSE) oder aus einem Gruppe III-V Halbleitermaterial (wie beispielsweise GaAS), einem Gruppe IV Halbleitermaterial oder einer Kombination von diesen bestehen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Kern der Quantenpunkte mit einer Halbleiter-Überschichtung ("Schale") passiviert werden, die gleichmäßig darauf aufgebracht ist. Zum Beispiel kann ein Halbleiterkern der Gruppe II-VI mit einer Gruppe II-VI Halbleiter-Schale der Gruppe II-VI passiviert werden (z. B. ein ZnS oder CdSe Kern kann mit einer aus YZ bestehend Schale passiviert werden, worin Y für Cd oder Zn steht und Z für S oder Se steht). Wie dem Fachmann bekannt ist, entspricht die Größe des Halbleiterkerns dem spektralen Emissionsbereich, wie in Tabelle 1 für CdSe dargestellt. Tabelle 1
    Farbe Größenbereich (nm) Bereich des Emissionspeaks
    Blau 2,5 bis 2,68. 476 bis 486
    Grün 2,8 bis 3,4. 500 bis 530
    Gelb 3,58 bis 4,26. 536 bis 564
    Orange 4,9 bis 6,1. 590 bis 620
    3 Rot 8,6 bis 10,2. 644 bis 654
  • Verfahren für die Herstellung von Halbleiter-Nanokristallen sind im Stand der Technik bekannt. Ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von Halbleiter-Nanokristallen besteht in einem kontinuierlichen Strom.
  • Der Begriff „Affinitätsmolekül" soll sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf ein Molekül beziehen, das mit einem anderen Molekül binden kann; und in einer bevorzugten Ausführungsform eine Bindungsspezifität und Avidität für ein Zielmolekül aufweist. Im Allgemeinen ist dem Fachmann bekannt, dass Affinitätsmoleküle die Folgenden einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein: Lektine oder Fragmente (oder Derivate) derselben, die eine Bindungsfunktion beibehalten; monoklonale Antikörper („mAb", einschließlich chimäre oder genetisch modifizierte monoklonale Antikörper (z. B. „humanisiert")); Peptide; Aptamere; Nukleobasen (synthetische, natürliche oder modifizierte); Nukleinsäuremoleküle (einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, einzelsträngige RNA oder einzelsträngige DNA, oder einzelsträngige Nukleinsäurehybride); Avidin oder Streptavidin oder Avidinderivate; und dergleichen. Die Erfindung kann so umgesetzt werden, dass ein bevorzugtes Affinitätsmolekül verwendet wird und alle anderen Affinitätsmoleküle als das bevorzugte Affinitätsmolekül ausgeschlossen sind. Der Begriff "monoklonaler Antikörper" wird hierin ebenfalls in der Beschreibung und den Ansprüchen so verwendet, dass er immunoreaktive Fragmente oder Derivate die von einem mAb-Molekül stammen einschließt, wobei die Fragmente oder Derivate einen Teil oder die gesamte Bindungsfunktion des gesamten mAb-Moleküls beibehalten. Von solchen immunoreaktiven Fragmenten oder Derivaten ist dem Fachmann bekannt, dass sie F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFV, Fd und Fd-Fragmente einschließen. Verfahren für die Herstellung der verschiedenen Fragmente oder Derivate von monklonalen Antikörpern sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Die Herstellung von chimeren Antikörpern ist mittlerweile ein direktes Verfahren, in dem der chimere Antikörper durch Verbinden der murinen variablen Domäne mit einer humanen konstanten Domäne hergestellt wird. Zusätzlich können "humanisierte” Antikörper durch Verbinden der hypervariablen Bereiche des murinen monoklonalen Antikörpers mit einer konstanten Domäne und Teilen von Sequenzen (leichte Kette und schwere Kette) der variablen Domäne von humanen Immunoglobulinen unter Verwendung von mehreren im Stand der Technik bekannten Techniken hergestellt werden. Aptamere können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Lektine und Fragmente derselben sind kommerziell erhältlich. Lektine sind dem Fachmann bekannt und sind kommerziell erhältlich.
  • Der Begriff „Nukleobasen" soll sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf eine Nukleinsäuregruppe beziehen, die Folgendes einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist: Nukleoside (einschließlich Derivate oder funktionale Äquivalente derselben) und synthetische oder modifizierte Nukleoside und insbesondere ein Nukleosid umfassend eine reaktive Funktionalität (z. B. freie Aminogruppe oder Carboxylgruppe); Nukleotide (einschließlich dNTPs, ddNTPs, Derivate oder funktionale Äquivalente derselben) und insbesondere ein Nukleotid umfassend eine reaktive Funktionalität (z. B. freie Aminogruppe oder Carboxylgruppe); Acyclonukleosidtriphosphate; 3'(2')-aminomodifizierte Nukleoside, 3'(2')-aminomodifizierte Nukleotide, 3'(2')-thiolmodifzierte Nukleoside, 3'(2')-thiolmodifzierte Nukleotide, Alkinylamino-Nukleotide (z. B. als einen Ketten-Terminator); und Nukleosidthiotriphosphate.
  • Der Begriff „reaktive Funktionalität" soll sich in der Beschreibung und den Ansprüchen auf eine freie chemische Gruppe beziehen, die mit einer chemisch-reaktiven Gruppe binden oder mit dieser in Verbindung treten kann (reaktiv mit den freien chemischen Gruppen). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die daraus resultierende Bindung oder Verbindung von ausreichender Stabilität um Bedingungen standzuhalten, die bei einem wie im Stand der Technik bekannten Detektionsverfahren anzutreffen sind. Freie chemische Gruppen schließen die Folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: eine Thiol-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Amino-, Amin-, Sulfo-, Phosphat-Gruppe, oder dergleichen; wohingegen chemisch-reaktive Gruppen die folgenden einschließen, ohne auf diese beschränkt zu sein: thiolreaktive Gruppe, carboxylreaktive Gruppe, hydroxylreaktive Gruppe, aminoreaktive Gruppe, aminreaktive Gruppe, sulforeaktive Gruppe oder dergleichen.
  • Der Begriff „Liposom" soll sich hierin in der Beschreibung und den Ansprüchen auf ein im Allgemeinen kugelförmiges Vesikel oder Kapsid beziehen, das im Allgemeinen aus amphipathischen Molekülen besteht (z. B. solche, die sowohl einen hydrophoben (nicht-polaren) Teil als auch einen hydrophilen (polaren) Teil aufweisen). Typischerweise kann das Liposom als einzelne (unilamellare) geschlossene Doppelschicht oder als geschlossene multikompartiment (multilamellare) Doppelschicht hergestellt werden. Das Liposom kann durch natürliche Lipide, synthetische Lipide oder eine Kombination derselben gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Liposom ein oder mehr als ein Phospholipid. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Liposom mit einem oder mehr als einem herkömmlichen Additiv ("eine Substitutionskomponente") substituiert, wobei das eine oder mehr als eine Additiv ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Membranstabilisator, einem isotonischen Mittel (z. B. Zucker, Natriumchlorid, Polyalkohole wie Mannitol, Sorbitol und dergleichen) einem Mittel zur Einstellung des pH-Werts (z. B. eine Base, eine basische Aminosäure, eine saure Aminosäure, Natriumphosphat, Natriumcarbonat und dergleichen, die in einer Menge vorhanden sind, die das Einstellen des Liposoms auf einen gewünschten pH ermöglicht), ein Mittel zur Minimierung der Aggregation (z. B. ein grenzflächenaktiver Stoff (z. B. Polysorbate, Poloxamere), Polysaccharide, Carboxylgruppen auf der liposomalen Oberfläche und dergleichen), ein Affinitätsmolekül, eine Aminosäure und eine Kombination von diesen. Wie dem Fachmann klar ersichtlich ist und in Abhängigkeit von der Lipidzusammensetzung und der Zusammensetzung der Substitutionskomponenten kann die eine oder mehr als eine Substitutionskomponente während der Bildung des Liposoms hinzugefügt werden, nach der Bildung des Liposoms hinzugefügt werden oder eine Kombination davon kann stattfinden. Eine bevorzugte Substitutionskomponente des Liposoms kann verwendet werden, um andere Komponenten als die bevorzugte Komponente auszuschließen. So wird zum Beispiel ein Membranstabilisator in einer wirksamen Menge hinzugefügt, um die Stabilität eines Liposom zu erhöhen. Stabilität bezieht sich auf ein oder mehr als ein Element aus Unversehrtheit der Membran; Fähigkeit, Wärmebeständigkeit (z. B. bei einer Temperatur überhalb Raumtemperatur und vorzugsweise einer Temperatur im Bereich von ungefähr 35°C bis ungefähr 100°C); Sauerstoffbeständigkeit (z. B. wie bei Exposition unter normalen Verwendungsbedingungen); Lichtbeständigkeit (z. B. wie bei Exposition unter normalen Verwendungsbedingungen), und eine Kombination derselben. Ein Membranstabilisator kann ein oder mehr als ein Sterin (z. B. Cholesterin), eine oder mehr als eine Fettsäure, eine oder mehr als eine Aminosäure und eine Kombination von diesen umfassen. Auch die Stabilität mit Bezug auf die Exposition gegenüber Sauerstoff kann durch Stickstoffgassubstitution unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren erhöht werden. Im Stand der Technik für die Bildung von Liposomen bekannte Lipide schließen die Folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Lecithin (Soja oder Ei; Phosphatidylcholin), Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin, Dicetylphosphat, Phosphatidylglycerin, hydriertes Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Cholesterin, Phosphatidylinositol, ein Glycolipid, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, ein Maleimidylderivatisiertes Phospholipid (z. B. N-[4(p-Maleimidophenyl)butyryl]phosphatidylethanolamin), Dioleylphosphatidylcholin, Dipalmitoyl-Phosphatidylglycerin, Dimyristoyl-Phosphatidsäure und Kombinationen von diesen. Für den Fachmann wird klar ersichtlich sein, dass das Verhältnis zwischen dem einen oder mehr als einen Lipid und der einen oder mehr als einen Substitutionskomponente von Faktoren abhängt, die Folgende einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind: Zusammensetzung der Lipide, gewünschte Funktion jedes Lipids (z. B. Grund für den Einschluss desselben in das Liposom), Zusammensetzung der Substitutionskomponente, gewünschte Funktion jeder Substitutionskomponente (z. B. Grund für deren Einschluss in das Liposom) und die gewünschten Eigenschaften des Liposombereichs eines funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls (z. B. Größe der inneren Fläche oder „Einschlussvolumen" (capture volume), pH-Bereich der Stabilität, Temperaturbereich der Stabilität, gewünschte Oberflächenladung, gewünschte freie chemische Gruppe). In diesem Zusammenhang kann ein bestimmtes Lipid oder eine bestimmte Lipidkombination, wie dem Fachmann bekannt ist, besondere Vorteile bieten, wenn diese zur Bildung eines Liposoms verwendet wird. Zum Beispiel verleiht der Einschluss von Phosphatidylglycerin in Kombination mit anderen Lipiden (z. B. mit Phosphatidylcholin und Cholesterin, Verhältnis von 1:9:8) dem Liposom eine negative Ladung, wodurch die intra-lamellare Beabstandung (capture volume) erhöht, die Aggregation reduziert und die anfängliche Hydrierung des Lipids erleichtert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Liposome, welche die fluoreszierenden Nanokristalle verkapseln, bei einem neutralen pH von ungefähr 6 bis ungefähr 7 stabil; und in einer bevorzugteren Ausführungsform sind sie in einem breiten pH-Bereich von ungefähr 4 bis ungefähr 12 stabil. Ein bevorzugtes Liposom (Inhalt und Zusammensetzung) kann als Teil der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung für den Ausschluss von anderen als den bevorzugten Liposomen gebildet werden.
  • Der Ausdruck „funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall" soll sich hierin in der Beschreibung und den Ansprüchen auf ein oder mehr als ein fluoreszierendes Nanokristall beziehen, das verkapselt wurde (z. B. ohne Ausbildung einer chemischen Verknüpfung oder Verbindung zwischen dem einen oder mehr als einem fluoreszierenden Nanokristall und dem Liposom) durch ein Liposom; wobei die äußere Oberfläche des Liposoms mit Oberflächengruppen funktionalisiert ist, die eine oder mehr als eine reaktive Funktionalität, ein oder mehr als ein Affinitätsmolekül oder eine Kombination davon umfassen; und wobei das funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall wasserlöslich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein einzelnes fluoreszierendes Nanokristall durch das Liposom verkapselt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine Vielzahl an fluoreszierenden Nanokristallen durch ein Liposom verkapselt. Dem Fachmann wird klar ersichtlich sein, dass die Anzahl an fluoreszierenden Nanokristallen, die pro Liposom verkapselt sind, durch Faktoren einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Größe des gebildeten Liposoms, des Verfahrens mittels dessen die fluoreszierenden Nanokristalle verkapselt sind, der Bearbeitung nach Herstellung durch Gelpermeation und dem Verhältnis von fluoreszierenden Nanokristallen zu Lipidgemischen während der Bildung, gesteuert werden kann. Es wird für den Fachmann ebenso klar ersichtlich sein, dass, wenn eine Vielzahl an fluoreszierenden Nanokristallen durch ein Liposom verkapselt ist, die fluoreszierenden Nanokristalle homogen (d. h. in der Lage, im Wesentlichen dieselbe Farbe zu fluoreszieren) oder heterogen sein können (z. B. verschiedene Populationen umfassend, wobei jede Population in der Lage ist, eine unterschiedliche (spektral zu unterscheidende) Farbe als eine andere Population an fluoreszierenden Nanokristallen, die verkapselt ist, zu fluoreszieren).
  • Der Begriff "Strangsynthese" soll sich hierin in der Beschreibung und den Ansprüchen auf die Herstellung von einem oder mehr als einem Strang oder Teile davon beziehen, wie zum Beispiel durch enzymatisches Kopieren durch ein Enzym, das Nukleinsäuren in einer Template-gerichteten Art und Weise repliziert. Es gibt keine besonderen Einschränkungen mit Bezug auf Größe, Länge oder Inhalt des Strangs. Somit umfasst „Strangsynthese" Prozesse einschließlich, aber nicht darauf beschränkt: Nukleinsäureamplifikation, DNA-Sequenzierung, Fill-In-Reaktionen, Reverse Transkription, in vitro Mutagenese, zyklische Ketten-Terminierungssequenz-Reaktionen, zufällige Primer-Extension-Reaktionen, Nick-Translationen, Primer Elongation, Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von und zur Quantifizierung der Anzahl an Di- und Trinukleotidrepeats und DNA Typisierung mit kurzen Tandem-Repeat-Polymorphismen. Die Nukleinsäurezusammensetzung des synthetisierten Strangs kann ausgewählt werden aus Molekülen, die Nukleobasen einschließen; und bevorzugter aus Ribonukleotiden (RNA) oder Desoxyribonukleotiden (DNA).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassen. Vorzugsweise sind die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle wasserlöslich und können ohne signifikanten Verlust (Austreten eines oder mehr als eines fluoreszierenden Nanokristalls aus dem Liposom) über lange Zeiträume gelagert werden. Die äußere Oberfläche des Liposombereichs (z. B. polare Kopfgruppen in Kontakt mit der umliegenden wässrigen Umgebung) wird mit Oberflächengruppen umfassend eine oder mehr als eine reaktive Funktionalität, ein oder mehr als ein Affinitätsmolekül oder eine Kombination von diesen, funktionalisiert. Wie dem Fachmann bekannt ist, sind dMO-Nanokristalle und Halbleiter-Nanokristalle im Allgemeinen in organischen Lösungsmitteln löslich und weisen begrenzte oder keine Löslichkeit in wässrigen Umgebungen auf. Somit umfasst ein Verfahren für das Entfernen von Fluoreszenz aus der wässrigen Umgebung enthaltend funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle das Kontaktieren der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer wirksamen Menge eines „disrupting agent" (lipolytische Substanz) um den Liposombereich des funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls aufzuspalten, wodurch die fluoreszierenden Nanokristalle in die wässrige Umgebung freigesetzt werden, woraufhin sie aus der Lösung ausfällen.
  • Als generelle Richtlinie für die Herstellung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen gemäß der vorliegenden Erfindung gibt es viele Verfahren für die Bildung von Liposomen, die für die Verkapselung von fluoreszierenden Nanokristallen geeignet sein können. In einer Ausführungsform werden die Lipide (z. B. Phospholipide und Sterin) zur Bildung von Liposomen und die fluoreszierenden Nanokristalle, die verkapselt werden sollen, in einer geeigneten Umgebung (z. B. Chloroform) aufgelöst und das Lösungsmittel wird in Vacuo verdampft um einen Film umfassend die Lipide und fluoreszierenden Nanokristalle („getrockneter Film aus einem Lipidgemisch") zu erhalten. Zum Beispiel können die Lipide, fluoreszierenden Nanokristalle und das organische Lösungsmittel in einen Kolben eines Rotationsverdampfers hinzugefügt und darin gemischt werden und unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer getrocknet werden, bis die Inhalte einen dünnen homogenen Film bilden. Alternativ kann ein getrockneter Film aus einem Lipidgemisch durch Bilden eines getrockneten Lipidfilm und Hinzufügen einer getrockneten Zubereitung fluoreszierender Nanokristalle zu diesem getrockneten Lipidfilm hergestellt werden. Eine wässrige Lösung wird dann zu dem getrockneten Film aus einem Lipidgemisch hinzugefügt und man lässt den Film hydrieren (z. B. für einen Zeitraum zwischen 10 und 30 Minuten bei Raumtemperatur), was zu einer spontanen Bildung von Liposomen führt, die fluoreszierende Nanokristalle verkapseln. Die Lipiddispersion kann dann stark verwirbelt werden (z. B. für 45 bis 60 Minuten), um eine kontinuierliche Bildung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen zu vereinfachen. Wenn erwünscht, können die Doppelschichten des Lipids durch Erwärmen der Dispersion auf ungefähr 45 bis 50°C gefolgt von allmählichem Abkühlen auf ungefähr 4°C einem Annealing- Prozess unterzogen werden. Dem Fachmann wird klar ersichtlich sein, dass eine oder mehr als eine Substitutionskomponente des Liposoms in der wässrigen Lösung suspendiert werden kann, bevor das Hinzufügen der wässrigen Lösung zu dem getrockneten Film aus einem Lipidgemisch erfolgt. Alternativ kann der Liposombereich des funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls mit einer oder mehr als einer Substitutionskomponente des Liposombereichs nachbehandelt werden (Behandlung nach der Bildung). Zum Beispiel kann eine wässrige Lösung, die eine oder mehr als eine Substitutionskomponente enthält in verlängertem Kontakt (z. B. Inkubation über Nacht) mit den funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen sein. Als eine weitere alternative Ausführungsform können die wässrige Lösung, welche die eine oder mehr als eine Substitutionskomponente enthält und der getrocknete Film aus einem Lipidgemisch zusammengemischt und stark verwirbelt werden, gefolgt von Filterung der Mischung unter Druck durch einen Membranfilter (z. B. Polycarbonat) mit einer gewünschten Porengröße, um eine Lösung enthaltend funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle zu erhalten. In einer anderen alternativen Ausführungsform wird die eine oder mehr als eine Substitutionskomponente in einer wässrigen Lösung suspendiert und anschließend lyophilisiert. Der lyophilisierte Rückstand wird dann in einem Glycerinpuffer (z. B. eine 2%-ige Glycerinlösung enthaltend 0,5 mM EDTA, pH-Wert 6,0) aufgelöst und durch einen Membranfilter (z. B. Polycarbonat) mit einer gewünschten Porengröße gefiltert. Das daraus resultierende Filtrat wird zu dem getrockneten Film aus einem Lipidgemisch hinzugefügt und die daraus resultierende Mischung wird dann mit einer wässrigen Lösung hydriert und gerührt, um funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle zu bilden. Falls erwünscht, können die gebildeten funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle dann durch einen Membranfilter (z. B. Polycarbonat) mit einer gewünschten Porengröße gefiltert werden. In jeder dieser Ausführungsformen bleiben die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle in der wässrigen Lösung, in der sie gebildet werden löslich, wohingegen unverkapselte, fluoreszierende Nanokristalle am Ende ausfallen können; somit kann eine Reinigung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen von nicht verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen erzielt werden.
  • Wie für den Fachmann klar ersichtlich sein wird, gibt es zahlreichen bekannte Verfahren für die Herstellung von Liposomen, die ebenfalls für die Herstellung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle nützlich sein können. Solche Verfahren schließen ein Verwirbelungsverfahren, ein Ultraschallverfahren, ein Filterverfahren, ein Reverse-Phase Verdampfungsverfahren, ein Verfahren zum Einspritzen von Lösungsmittel, ein Verfahren zum Entfernen von oberflächenaktivem Stoff (z. B. Detergens) ein Annealing-Verfahren und eine herbeigeführte Extrusion nach Frost-Tau-Zyklen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Jedes Verfahren kann vorteilhaft sein, deshalb ist möglicherweise eine Kombination von Verfahren wünschenswert. Zum Beispiel stellt die Behandlung mit Ultraschall ein Verfahren dar, das verwendet wird, um Liposome von im Vergleich zu anderen Verfahren vergleichsweise geringer Größe herzustellen, allerdings ist die Größe dabei weitgehend heterogen. Bei Filterung durch eine Membran von definierter Größe oder einer Reihe von Membranen mit Poren von abnehmendem Durchmesser kann die Größenheterogenität reduziert werden, was zu Liposomen mit einer gut definierten und engen Größenverteilung führt. In einem anderen Beispiel kann die Behandlung mit Ultraschall zu Liposomen führen, die strukturelle Defekte einschließen. Annealing (bei einer Temperatur überhalb von Tc des höchstschmelzenden Lipids in der für die Bildung des Liposoms verwendeten Mischung; z. B. für 30 Minuten) kann jedoch eine stabilisierende Wirkung auf die Liposome haben (allerdings ist anzumerken, dass Annealing im Allgemeinen nicht wirksam ist, wenn das Liposom aus einem äquimolaren Verhältnis aus Phospholipid und Cholesterin besteht). Die obengenannten Prinzipien können auf Verfahren für die Herstellung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen angewandt werden.
  • Die Auswahl und das molare Verhältnis der Kombination von Lipiden, mit oder ohne eine oder mehr als eine Substitutionskomponente für die Verkapselung von fluoreszierenden Nanokristallen kann von Faktoren abhängen, welche die Folgenden einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sind: Anwendung in der die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle verwendet werden sollen; die gewünschten Oberflächengruppen umfassend eine oder mehr als eine reaktive Funktionalität; die gewünschte Größe und/oder Stabilität und/oder Oberflächenladung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle und das eine oder mehr als eine Verfahren, das verwendet wurde, um die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle herzustellen. Obwohl zahlreiche Kombinationen verwendet werden können, kann eine bevorzugte Kombination aus den beiden allgemeinen Gruppierungen an geeigneten Lipidgemischen für die Bildung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. eine Kombination von Phospholipiden mit einem Sterin, wobei ein Phospholipid in der größten Menge der Kombination (im Vergleich zu den Mengen des einem oder mehr als einem verbleibenden Phospholipids der Kombination) in einem annähernd äquimolaren Verhältnis zu dem Sterin vorliegt; und eine Kombination aus Phospholipiden mit einem Sterin, wobei das Sterin nicht in einem annähernd äquimolaren Verhältnis mit dem Phospholipid umfassend die höchste Menge (Konzentration) in der Kombination vorliegt (im Vergleich zu den Mengen des einen oder mehr als einen Phospholipids der Kombination). Beide Kombinationen können des Weiteren eine oder mehr als eine Substitutionskomponente des Liposombereichs der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle wie hierin in größerem Detail beschrieben, umfassen. Die folgenden Beispiele für Kombinationen aus Lipiden (einschließlich von Beispielen für Molverhältnisse), die für die Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, dienen zur Veranschaulichung, ohne dabei einschränkend zu sein und schließen die Folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Phosphatidylcholine ("PC")/Cholesterin ("ch")/Phosphatidylserin ("PS"), 5:4:1; PC/CH/Phosphatidylglycerin ("PG"), 8:2:1,2 oder 9:8:1 oder 9:5:1; PC/CH/Phosphatidylethanolamin, 6:2:2 oder 5:4:1; und DipalmitoylPC/ch/Phosphatidsäure, 7:2:1. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Kombination an Lipiden des Weiteren eine oder mehr als eine Substitutionskomponente umfassen, die zu den Lipiden in Gewichtsanteilen (in Bezug zu dem Lipidgemisch ausgedrückt, wobei das gesamte Lipidgemisch 1 Gewichtsanteil umfasst) in einem Bereich von ungefähr 0,0001 bis ungefähr 0,5 hinzugefügt wird, in Abhängigkeit von dem Typ der einen oder mehr als einen Komponente und der beabsichtigten Funktion. Eine bevorzugte Kombination von Lipiden und einer oder mehr als einer Substitutionskomponente kann verwendet werden, um andere Kombinationen als die bevorzugte Kombination bei der Herstellung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung auszuschließen. Auf gleiche Weise kann ein bevorzugtes fluoreszierendes Nanokristall verwendet werden, um ein anderes fluoreszierendes Nanokristall als das bevorzugte fluoreszierende Nanokristall bei der Herstellung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen gemäß der vorliegenden Erfindung auszuschließen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das eine oder mehr als eine Affinitätsmolekül, dass als Teil eines funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls inkorporiert werden soll, während des Herstellungsprozesses von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen hinzugefügt. In dieser bevorzugten Ausführungsform ist es wünschenswert, dass das Affinitätsmolekül aus einem hydrophoben und einem hydrophilen Bereich besteht, so dass der hydrophobe Bereich die Interaktion mit dem hydrophoben Bereich des Lipids in der Lipidmischung bei der Bildung des Liposombereichs der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle erleichtert; und der hydrophile Bereich reicht von der Oberfläche der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle hinaus. Zum Beispiele werden ein getrocknetes Lipidgemisch, umfassend getrocknete Lipide, eine getrocknete Zubereitung der fluoreszierenden Nanokristalle und eine getrocknete (z. B. lyophilisiertes) Zubereitung des Affinitätsmoleküls umfassend ein Protein (z. B. monoklonale Antikörper oder Peptid oder Glycoprotein oder Lipoprotein, etc.) durch Hinzufügen einer wässrigen Lösung hydriert (alternativ wird das Affinitätsmolekül in der wässrigen Lösung suspendiert); und die daraus resultierende Dispersion wird dann kräftig verwirbelt, um eine Bildung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen, die in dem Liposombereich das eine oder mehr als eine Affinitätsmolekül inkorporiert aufweisen, zu erleichtern. Dem Fachmann wird klar ersichtlich sein, dass, im Vergleich zu neutralen Phospholipiden (z. B. PC), anionische Phospholipide (z. B. PG und PS) das Binden des Affinitätsmoleküls in dem Liposombereich der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle verbessern. Dem Fachmann wird ersichtlich sein, dass die Menge an Affinitätsmolekül, die inkorporiert werden soll und der Inhalt (Verhältnis) und die Zusammensetzung des Lipidgemisches von dem spezifischen Affinitätsmolekül, das eingebaut werden soll und der gewünschten Anwendung zur Verwendung für die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle abhängig sind. In einem veranschaulichenden, nicht-einschränkenden Beispiel kann das Lipidgemisch PC/ch/PG (17:5:2,5) umfassen und das Affinitätsmolekül kann ein Peptid in einer Menge im Bereich von ungefähr 0,001 mg/ml bis ungefähr 1 mg/ml umfassen. Wie hierin in größerem Detail beschrieben, kann eine oder mehr als eine Substitutionskomponente hinzugefügt werden. Zusätzlich können, falls erwünscht, die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle einem Reinigungsprozess wie Gelpermeation oder Trennung nach Funktion oder einem anderen im Stand der Technik bekannten Reinigungsverfahren unterzogen werden.
  • Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um die Erfindung weiter zu beschreiben, stellen jedoch keinerlei Einschränkung der Erfindung dar.
  • BEISPIEL 1
  • Dieses Beispiel ist eine nicht einschränkende Erläuterung eines Verfahrens zur Herstellung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung. dMO-Nanokristalle, die Yttriumoxid dotiert mit Europium umfassen, wurden verkapselt, um funktionalisierte, verkapselte dMO-Nanokristalle zu bilden. Kurz zusammengefasst wurde dies wie folgt durchgeführt. Eine erste Lösung bestand aus Tröpfchen einer Lösung, die ein Metallsalz (Yttriumsalz und Europiumsalz) aufgelöst in Wasser, einen grenzflächenaktiven Stoff (nicht ionisch, kationisch oder ionisch) und ein Öl (z. B. Oktan) umfasste. Bei dem grenzflächenaktiven Stoff kann es sich um ein Lipidgemisch oder ein anderes geeignetes bipolares Molekül (z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid) handeln. Das ungefähre Verhältnis von Metallsalzlösung: grenzflächenaktivem Stoff: Öl betrug 10:15:85. Eine zweite Lösung bestand aus Tröpfchen einer Lösung, die ein Hydroxid (Ammoniumhydroxid) aufgelöst in Wasser, einen grenzflächenaktiven Stoff und ein Öl, in einem ungefähren Verhältnis von 10:15:85 umfasste. Die erste Lösung und die zweite Lösung wurden gemischt (z. B. gerührt), wodurch die Bildung von fluoreszierenden Nanokristallen bestehend aus Yttriumoxid dotiert mit Europium und die Verkapselung der fluoreszierenden Nanokristalle bewirkt wurde. Das Verhältnis von Metallsalz in der ersten Lösung zu Hydroxid in der zweiten Lösung betrug ungefähr 1:2. Die gemischte Lösung wurde dann zentrifugiert, um die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle zu pelletieren. Die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle wurden anschließend gewaschen, um losen grenzflächenaktiven Stoff und Öl (nach dem Pelletieren) zu entfernen und anschließend wurden sie in Wasser resuspendiert.
  • Falls erwünscht, kann die funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassende Suspension weiter gereinigt werden (z. B. durch Trennen von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen von Liposomen, die keine fluoreszierenden Nanokristalle enthalten) oder unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren nach Größe selektiert werden. Zum Beispiel kann eine Lösung mit Dichtegradient (z. B. Saccharose oder Glycerol oder Ficoll) mit einer Suspension überschichtet und dann für einen ausreichenden Zeitraum zentrifugiert werden, um die gewünschte Trennung von Liposomentypen, die in der Suspension vorhanden sein können, zu erzielen. In Fortführung dieses Beispiels hätten funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle eine größere Dichte als Liposome, die keine fluoreszierenden Nanokristalle enthalten. Somit kann der Dichtegradient einem Spektrum an Anregungswellenlängen ausgesetzt sein und die funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassende fluoreszierende Bande kann dann von dem Rest des Dichtegradienten geerntet werden. Alternativ können funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle unter Verwendung von Gel-Permeations-Chromatographie oder durch magnetische Trennung weiter gereinigt werden.
  • BEISPIEL 2
  • Dieses Beispiel ist eine nicht einschränkende Erläuterung eines Verfahrens zur Herstellung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung. Halbleiter-Nanokristalle umfassend CdSe-Kern, ZnS-Schale, von einer Größe von ungefähr 7,6 nm (Kerngröße von ungefähr 5,1 nm) und mit einem Spektrum der Peakemission von ungefähr 606 nm wurden für Verkapselung hergestellt. Die Halbleiter-Nanokristalle (100 μl einer 7 × 10–6 M Pyridinlösung) wurden in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl Hexan ausgefällt. Die Mischung wurde zentrifugiert, um die Halbleiter-Nanokristalle zu pelletieren; der Überstand aus Hexanen/Pyridin wurde entsorgt und das Pellet wurde dann in 100 μl DMSO (Dimethylsulfoxid) resuspendiert. Die DMSO-Lösung, welche die Halbleiter-Nanokristalle enthielt, wurde mit 0,9 ml Chloroform gemischt. Die Lösung wurde dann zweimal mit 500 μl Wasser extrahiert, um das DMSO zu entfernen. Die Lösung wurde dann zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen und der gelöste Halbleiter-Nanokristalle enthaltende Überstand wurde anschließend abgegossen und bis zur Verwendung gelagert (4°C). Zur Verkapselung der Halbleiter-Nanokristalle wurde ein Lipidgemisch verwendet, das Phosphatidylcholin (PC) und Cholesterin (ch) in einem Verhältnis von 5:2 umfasste. In einen Kolben, der 1 ml Chloroform enthielt, wurden 100 μl der die gelösten Halbleiter-Nanokristalle umfassenden Lösung hinzugefügt. Unter Rühren wurde PC (15 mg) zu der Mischung hinzugefügt und abschließend wurde ch (6 mg) zu der Mischung hinzugefügt. Ein Schlenkadapter wurde an dem Kolben befestigt und das darin enthaltende Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, um einen getrockneten Film aus einem Lipidgemisch mit Halbleiter-Nanokristallen herzustellen. Zu dem Film wurden 3 ml destilliertes Wasser hinzugefügt und die Lösung wurde dann in einem Wasserbad für 20 Minuten mit Ultraschall behandelt. Die daraus resultierende Suspension, die funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle enthielt, wurde durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter gefiltert. Die Untersuchung durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigte die Bildung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle mit enger Größenverteilung.
  • Falls erwünscht, kann die funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassende Suspension weiter gereinigt werden (z. B. durch Trennen von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen von Liposomen, die keine fluoreszierenden Nanokristalle enthalten) oder unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren nach Größe selektiert werden, wie hierin in Beispiel 1 detaillierter beschrieben. Für den Fachmann wird aus den hierin gegebenen Beschreibungen klar ersichtlich sein, dass ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall eine Kombination von einem oder mehr als einem dMO-Nanokristall und einem oder mehr als einem Halbleiter-Nanokristall umfassen kann (wobei vorzugsweise jede Population von Nanokristallen spektral von anderen Populationen von Nanokristallen in der Kombination von Nanokristallen unterschieden werden kann). Somit kann beispielsweise eine organische Lösung, die dMO-Nanokristalle (z. B. umfassend Yttriumoxid dotiert mit Europium und mit einem Spektrum der Peakemission das spektral von den CdSe/ZnS-Nanokristallen, die Spektra der Peakemission von ungefähr 606 nm aufweisen, unterscheidbar ist) und Halbleiter-Nanokristallen (z. B. CdSe/ZnS-Nanokristalle, die Spektra der Peakemission von ungefähr 606 nm aufweisen) umfasst, mit den Phospholipiden wie hierin beschrieben gemischt werden, wobei ein getrockneter Film aus einem Lipidgemisch entsteht. Der getrocknete Lipidfilm kann dann, wie in diesem Beispiel 2 beschrieben, behandelt werden, um funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle herzustellen.
  • BEISPIEL 3
  • Dieses Beispiel veranschaulicht funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie hierin in größerem Detail beschrieben, können verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle durch Einschließen von Oberflächengruppen umfassend eine oder mehr als eine reaktive Funktionalität, die mit einer reaktiven Funktionalität eines Affinitätsmoleküls bindet und verwendet werden kann, um den Liposombereich an ein Affinitätsmolekül zu binden, funktionalisiert werden. Somit kann eine Kombination von reaktiven Funktionalitäten verwendet werden, um ein Affinitätsmolekül mit einem funktionalisierten, verkapselten und fluoreszierenden Nanokristall zu markieren. Falls erwünscht, können als separater Schritt in der Reaktion freie reaktive Funktionalitäten, die möglicherweise nach dem Markierungsprozess vorhanden sind, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren blockiert oder deaktiviert werden (z. B. durch Hinzufügen eines Moleküls, das an die freie reaktive Funktionalität bindet). Nach der Reaktion, in der die Kombination reaktiver Funktionalitäten zur Durchführung der Markierung verwendet wird, kann ein mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall markiertes Affinitätsmolekül durch ein oder mehr als ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Chromatographie und Größenselektion, von ungebundenem Affinitätsmolekül und ungebundenem (nicht an Affinitätsmolekül gebundenem), funktionalisiertem, verkapseltem und fluoreszierendem Nanokristall getrennt werden. Eine bevorzugte Kombination reaktiver Funktionalitäten kann verwendet werden, um eine andere Kombination reaktiver Funktionalitäten als die bevorzugte Kombination reaktiver Funktionalität auszuschließen.
  • 3.1 Kombination reaktiver Funktionalitäten, die Aminogruppen und aminoreaktive Gruppen umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle Oberflächengruppen, die freie, durch ein Lipid erhaltene Aminogruppen, eine Substitutionskomponente oder eine Kombination von diesen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die freien Aminogruppen durch Einfügen eines Aminolipids in das Lipidgemisch, das den Liposombereich der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle bildet, bereitgestellt. So stellen beispielsweise Moleküle von Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin („PE") oder Dioleoyl-PE bei Inkorporieren in den Liposombereich primäre Aminogruppen bereit, die frei reagieren und chemisch mit einem oder mehr als einem Affinitätsmolekül, das eine oder mehr als eine aminoreaktive Gruppe aufweist, binden können. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Affinitätsmolekül, das eine Nukleobase umfasst, die eine reaktive Funktionalität umfassend eine freie aminoreaktive Gruppe (z. B. eine Carboxylgruppe) aufweist, chemisch unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren an eine Oberflächengruppe gebunden werden, die eine freie Aminogruppe umfasst. Kurz gesagt wird die Nukleobase durch Behandlung mit EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl]carbodiimid) gefolgt von der Behandlung mit Sulfo-NHS bei Umgebungstemperatur in einer gepufferten wässrigen Lösung (bei einem pH-Wert von ungefähr 7,4; z. B. für einen Zeitraum von 30 Minuten) verestert. 2-Mercaptoethanol wird zu der Lösung hinzugefügt (z. B. mit einer Konzentration von 20 mM) und die Mischung wird gerührt (z. B. für einen Zeitraum von 15 Minuten), um das gesamte nicht-umgesetzte EDC zu löschen. Die aktivierte Nukleobase wird dann mit einer Mol-Konzentration der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle (in Abhängigkeit von Größe und gewünschter Anzahl) zur Kopplung einer geeigneten und gewünschten Anzahl an Nukleobasen-Molekülen (z. B. eines, oder, falls erwünscht, mehr als eines) an ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall kontaktiert und die Reaktionsmischung wird gerührt (z. B. für 2 Stunden oder unter anderen, zur Bildung einer Amidbindung zwischen den EDC-aktivierten Carboxylaten der Nukleobasenmoleküle und der Amingruppen der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle geeigneten Bedingungen umgesetzt). Anschließend wird Ethanolamin hinzugefügt (z. B. mit einer Konzentration von 30 mM) um die Kopplungsreaktion zu quenchen (z. B. durch Rühren für einen Zeitraum von 30 Minuten). Die daraus resultierende Lösung wird dann gefiltert und/oder dialysiert, um überschüssige Reagenzien zu entfernen. Das Ergebnis dessen ist die Herstellung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen, die eine Nukleobase aufweisen, die kovalent an diese gekoppelt ist (z. B. eine mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall markierte Nukleobase).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind Nukleobasen mit freien Aminogruppen kovalent an Oberflächengruppen umfassend die freien Aminogruppen von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gekoppelt, und zwar durch die Verwendung einer Substitutionskomponente, die einen Spacerarm umfasst, der an jedem Ende mit einer aminoreaktiven Gruppe endet. Von Spacerarmen ist im Stand der Technik bekannt, dass sie eine Chemikalie (Glutaraldehyd), eine Kohlenwasserstoffkette und ein Peptid einschließen. Die Oberflächengruppen, welche die freien Aminogruppen umfassen, können beispielsweise durch Inkubieren der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer Glutaraldehyd enthaltenden Lösung aktiviert werden (z. B. 25%, bei 20°C für 10 Minuten), woraufhin eine Dialyse zur Entfernung von überschüssigem Glutaraldehyd folgt. Die aktivierten, funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle werden dann mit einer die freien aminoreaktiven Gruppen in einer Mol-Konzentration enthaltenden Lösung der Nukleobase kontaktiert, um die gewünschte Anzahl an Nukleobase-Molekülen an ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall zu koppeln. Falls erwünscht, kann jede freie reaktive Funktionalität blockiert werden (z. B. durch Hinzufügen von Ethanolamin). Die daraus resultierende Lösung wird dann gefiltert und/oder dialysiert, um überschüssige Reagenzien zu entfernen. Das Ergebnis dessen ist die Herstellung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen, die eine Nukleobase aufweisen, die kovalent an diese gekoppelt ist (z. B. eine mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall markierte Nukleobase).
  • 3.2 Kombination reaktiver Funktionalitäten, die Thiolgruppen und thiolreaktive Gruppen umfassen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleobase mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall gemäß der vorliegenden Erfindung markiert (an dieses gebunden oder gekoppelt), und zwar unter Verwendung von reaktiven Funktionalitäten, die Thiolgruppen und thiolreaktive Gruppen umfassen.
    • 3.2(a) Zum Beispiel können, wie hierin bereits zuvor beschrieben, die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle Oberflächengruppen aufweisen, die freie Aminogruppen umfassen. Diese Oberflächengruppen können weiter durch Hinzufügen (entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von EDC) eines Maleimidderivats, das mit Aminogruppen reagiert, funktionalisiert werden. Ein solches Maleimidderivat kann 3-Maleimidopropionsäure-N-Hydroxysuccinimidester, 3-Maleimidopropionsäure, 3-Maleimidobenzoesäure-N-Hydroxysuccinimidester, 4-(Maleimid-methyl)-1-cyclo-hexancarbonsäure-N-Hydroxysuccinimidester einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Die daraus resultierenden funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle, die eine thiolreaktive Gruppe aufweisen, können mit einer Nukleobase interagieren und an eine Nukleobase binden, die zuvor mit einer oder mehr als einer Thiolgruppe derivatisiert wurde.
    • 3.2 (b) Als eine Alternative werden die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle, die freie Aminogruppen umfassende Oberflächengruppen aufweisen und Moleküle der Nukleobase, die Thiolgruppen aufweisen in Anwesenheit einer ein quervernetzendes Reagens umfassenden Substitutionskomponente gemischt. Das quervernetzende Reagens weist an einem Ende eine aminoreaktive Gruppe und am anderen Ende eine thiolreaktive Gruppe auf. Es ist dem Fachmann bekannt, dass solche quervenetzenden Reagenzien Sulfosuccinimidyl 6-[3'-(2-pyridyldithio)-propionamido]hexonat, N-Succinimidyl-[4-vinylsulfonyl]benzoat, Sulfosuccinimidyl-[4-iodoacetyl]aminobenzoat, N-Succinimidyl-[4-iodoacetyl]aminobenzoat und N-Succinimidyl-iodacetat, Succinimidyl 3-[bromacetamido]propionat einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • In beiden der unter 3.2(a) oder (b) dargestellten Ausführungsformen können die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle, die reaktive Funktionalitäten umfassend eine thiolreaktive Gruppe (z. B. als Teil eines Lipids oder als Ergebnis eines quervernetzenden Reagens) aufweisen, unter für die Bindung an eine zuvor mit einer oder mehr als einer Thiolgruppe derivatisierten Nukleobase geeigneten Bedingungen mit dieser kontaktiert werden. Die geeigneten Bedingungen sind abhängig von Faktoren einschließlich der Frage, ob ein quervernetzendes Reagens verwendet wird, der Frage, welcher Typ an quervernetzendem Reagens verwendet wird und der gewünschten Anzahl an Molekülen von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen, die mit dem Affinitätsmolekül markiert werden sollen. Wenn ein im Handel erhältliches quervernetzendes Reagens verwendet wird, werden die geeigneten Bedingungen häufig vom Hersteller spezifiziert. Nukleobasen können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren derivatisiert werden, damit sie Thiolgruppen enthalten. Zum Beispiel kann die sich in der 3'- und/oder 2'-Position einer Nukleobase befindende OH-Gruppe zu einer Thiolgruppe derivatisiert werden, wodurch die Interaktion mit der thiolreaktiven Gruppe eines funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls ermöglicht wird, wobei wiederum Thioether-Bindungen gebildet werden, welche die Nukleobase an das funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall binden. In einem weiteren Beispiel können die 3'-O-Position und/oder die 2'-O-Position einer Nukleobase so derivatisiert werden, dass sie alkylthiolchemische Funktionalität einschließen, die dann unter Bedingungen, die zur Entfernung der Thiol-schützenden Gruppe führen, mit Säure behandelt werden kann. Somit kann die Nukleobase so derivatisiert werden, dass sie eine Thiolgruppe enthält, wobei durch die Bildung von Thioetherbindungen, die die Nukleobase an das funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall (z. B. eine mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall markierte Nukleobase) koppeln, Interaktion zwischen den thiolreaktiven Gruppen eines funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls ermöglicht wird.
    • 3.2(c) Als noch eine weitere Alternative kann eine relativ kleine Menge (mit Bezug auf die Mol-Konzentration von einem oder mehr als einem anderen Lipid, das in dem Lipidgemisch verwendet wird; z. B. 20:10:1; PC/CH/DPET) eines Thiolgruppenenthaltenden Lipids bei der Herstellung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen in dem Lipidgemisch vorhanden sein. Ein solches Lipid umfasst Distearolylphosphatidyl-Ethanolamidomethyl-Thioacetat („DPET"). Die Oberflächengruppen des Lipidbereichs können bei der Entschützung der Thiolgruppen mit Hydroxylamin modifiziert werden, wodurch freie Thiolgruppen erhalten werden. Ein quervernetzendes Reagens, das eine thiolreaktive Gruppe an einem Ende und eine aminoreaktive Gruppe am anderen Ende aufweist (siehe z. B. 3.2. (b) hierin), kann verwendet werden. Somit werden die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle, die freie Thiolgruppen aufweisen, ein quervernetzendes Reagens und eine Nukleobase, die freie Aminogruppen aufweist unter für die Markierung der Nukleobase mit den funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen geeigneten Bedingungen gemischt. Nukleobasen können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren mit Aminogruppen derivatisiert werden. Zum Beispiel kann die sich in der 3'- und/oder 2'-Position einer Nukleobase befindende OH-Gruppe so derivatisiert werden, dass sie eine Aminogruppe enthält. Alternativ kann ein Propargylethoxyamino-Nukleosid als Nukleobase für den Kettenabbruch verwendet werden, wobei die reaktive Funktionalität dieser Nukleobase für den Kettenabbruch den primären Aminorest oder den sekundären Aminorest umfasst. Wie dem Fachmann durch die hierin gegebenen Beschreibungen klar ersichtlich sein wird, können auch andere Kombinationen reaktiver Funktionalitäten verwendet werden, um ein Affinitätsmolekül mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall zu markieren. Zum Beispiel kann ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall, das ein Thiolgruppen enthaltendes Lipid umfasst (wie hierin in 3.2. (c) beschrieben), an ein thiol-derivatisiertes Affinitätsmolekül umfassend eine Nukleobase (wie hierin in 3.2.(b) beschrieben) gekoppelt werden, und zwar unter Verwendung eines quervernetzenden Reagens, das eine thiolreaktive Gruppe (z. B 1,4-Bis-maleimidobutan; 1,4-Bis-maleimidyl-2,3-dihydroxybutan) an einem der Enden aufweist.
  • BEISPIEL 4
  • Dieses Beispiel dient der weiteren Erläuterung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie hierin in Beispiel 3 in größerem Detail beschrieben, können verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle durch Einschließen von Oberflächengruppen, die eine oder mehr als eine reaktive Funktionalität umfassen, die mit einer reaktiven Funktionalität eines Affinitätsmoleküls bindet, und die verwendet werden kann, um den Liposombereich an ein Affinitätsmolekül zu binden, funktionalisiert werden. Somit kann eine Kombination von reaktiven Funktionalitäten verwendet werden, um ein Affinitätsmolekül mit einem funktionalisierten, verkapselten und fluoreszierenden Nanokristall zu markieren. In Beispiel 3 wurde ein Affinitätsmolekül dargestellt, das eine Nukleobase umfasst. Wie dem Fachmann jedoch aus den hierin gegebenen Beschreibungen ersichtlich ist, können andere Typen an Affinitätsmolekülen gleichermaßen an funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung gekoppelt werden.
  • Das Affinitätsmolekül kann zum Beispiel und unter Berücksichtigung der Lehren aus Beispiel 3 ein Protein umfassen (z. B. ein Glycoprotein, Peptid, Lipoprotein, einen monoklonalen Antikörper, ein Antikörperfragment mit Bindungsspezifität, ein Lectin, Avidin und dergleichen), das eine reaktive Funktionalität umfassend eine Amingruppe aufweist, die unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Kopplung an die reaktive Funktionalität von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen verwendet werden kann. Alternativ kann das Protein eine reaktive Funktionalität umfassend eine oder mehr als eine freie Thiolgruppe umfassen. Um diese Erläuterung fortzuführen: Sulfhydrylgruppen (Thiolgruppen) eines Antikörpers können durch Reduktion mit einem Thiol-Reagens hergestellt werden. Zum Beispiel kann der Antikörper (z. B. 20 mg/ml in Puffer, pH-Wert 8,7) mit 2-Mercaptoethanol (z. B. abschließende Konzentration von 25 mM) unter geeigneten Bedingungen (z. B. 4°C für 10 Minuten) behandelt werden, um das Protein so zu reduzieren, dass es freie Thiolgruppen enthält. Der behandelte Antikörper kann gereinigt werden (z. B. durch Gelpermeation) und die Anzahl an Sulfhydrylgruppen pro Mol Antikörper kann bestimmt werden (z. B. Ellmanreaktion) und somit wird anschließend vorzugsweise ein Antikörper mit 2 bis 3 freien Thiolgruppen in einer Kopplungsreaktion mit den funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen (z. B. mit oder ohne Kopplungsreagens in Abhängigkeit von den reaktiven Funktionalitäten und der verwendeten Kopplungsreaktion) umgesetzt. Andere Reduktionsmittel wie Dithiothreitol können verwendet werden, um eine Disulfidgruppe eines Antikörpers oder Fab-Fragments zu einer eine freie Sulfhydrylgruppe umfassenden, reaktiven Funktionalität zu reduzieren. Als eine weitere Alternative kann das Protein eine reaktive Funktionalität umfassend eine oder mehr als eine freie Carboxylgruppe umfassen. In einer Erläuterung und unter Verwendung der hierin in Beispiel 3 in größerem Detail beschriebenen Methodologie kann eine freie Carboxylgruppe des Proteins verestert werden, was dann in einer Kopplungsreaktion ein Koppeln mit einer freien Aminogruppe der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle ermöglicht.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das mit funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen markierte Affinitätsmolekül ein Nukleinsäuremolekül (z. B. Oligonukleotid, Primer, Sonde, Aptamer, Vektor, molekulare Sonde und dergleichen). So kann beispielsweise durch Anpassen von Faktoren, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Anzahl an freien reaktiven Funktionalitäten pro Molekül, des Verhältnisses und/oder der Anzahl an verschiedenen pro Kopplungsreaktion zu koppelnden Molekülen und einer Kombination von diesen ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall hergestellt werden, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Nukleinsäuremolekül markiert mit einer Vielzahl an funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen, einem Nukleinsäuremolekül markiert mit einem einzelnen funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall, einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall markiert mit einer Vielzahl an Nukleinsäuremolekülen und einer Kombination von diesen. Als veranschaulichendes Beispiel kann das Nukleinsäuremolekül eine reaktive Funktionalität umfassend eine oder mehr als eine freie Amingruppe umfassen. Zum Beispiel werden unter Verwendung von hierin in Beispiel 3 beschriebener Methodologie reaktive Funktionalitäten von freie Aminogruppen umfassenden Nukleinsäuremolekülen und funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle, die freie Thiolgruppen umfassende Oberflächengruppen aufweisen, in Anwesenheit einer ein quervernetzendes Reagens umfassenden Substitutionskomponente gemischt. Das quervernetzende Reagens weist an einem Ende eine aminoreaktive Gruppe und am anderen Ende eine thiolreaktive Gruppe auf. In einer alternativen Ausführungsform können Nukleinsäuremoleküle, die reaktive Funktionalitäten umfassend freie aminoreaktive Gruppen (z. B. Carboxylgruppen) umfassen, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren an freie Aminogruppen umfassende Oberflächengruppen von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen gekoppelt werden. in noch einer weiteren Ausführungsform umfassen die Nukleinsäuremoleküle freie Thiolgruppen umfassende reaktive Funktionalitäten, die unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren an Oberflächengruppen umfassend eine reaktive Funktionalität funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle (z. B. thiolreaktive Gruppen oder unter Verwendung eines quervernetzenden Reagens an freie Aminogruppen) gekoppelt werden können.
  • BEISPIEL 5
  • Dieses Beispiel erläutert verschiedene Ausführungsformen für ein Verfahren der Strangsynthese unter Verwendung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle, die markierte Nukleobasen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Andere als die hierin zur Erläuterung beschriebenen Ausführungsformen zur Verwendung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung bei einem Verfahren zur Strangsynthese sind dem Fachmann aus den hierin gegebenen Beschreibungen ersichtlich. In einer Ausführungsform ist ein einzelnes Set bestehend aus mindestens vier Spezies an funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen vorgesehen, die (a) durch eine einzelne Lichtquelle wirksam angeregt werden, (b) eng beieinander liegende Emissionsspektra aufweisen, die durch Wellenlängen der Peakemission spektral auflösbar (unterscheidbar) sind (und so z. B. die gleichzeitige Detektion von jedem einzelnen Peak ermöglichen), (c) Emissionen von relativ hoher Quanteneffizienz aufweisen; (d) in ihrer Größe ausreichend klein sind, um mögliche sterische Störungen, die mit dem Inkorporieren während der Strangsynthese und/oder deren Fortschreiten verbunden sind, zu minimieren. Zum Beispiel werden in einem Verfahren der Strangsynthese, das ein modifiziertes DNA-Sequenzierungsprotokoll wie nach Sanger umfasst, mindestens vier Spezies funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle verwendet, die separate Fluoreszenzemissionsspektra aufweisen (z. B. eine Spezies kann rot fluoreszieren, eine Spezies kann grün fluoreszieren, eine Spezies kann gelb fluoreszieren, eine Spezies kann orange fluoreszieren) und die verschiedene Nukleobasen für den Kettenabbruch umfassen (z. B. eine Spezies umfasst ddATP; eine Spezies umfasst ddTTP, eine Spezies umfasst ddCTP, eine Spezies umfasst ddGTP), die in einen synthetisierten Strang inkorporiert sein können. Die Spezies an markierten Nukleobasen für den Kettenabbruch werden in einer oder mehr als einer Sequenzierungsreaktion verwendet, gefolgt vom Auflösen der resultierenden differenzial markierten, synthetisierten Stränge (z. B. wie nach Größe, Länge oder Zeit), wobei die synthetisierten Stränge mit einer Anregungslichtquelle angeregt und dann für die Detektion mittels eines Fluorimeters oder einem anderen geeigneten Detektionsmittel gescannt werden, das in der Lage ist, die separaten Fluoreszenzspektra der angeregten, funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle spektral aufzulösen. Somit können die einzelnen Nukleobasen für den Kettenabbruch identifiziert werden und die Sequenz des synthetisierten Strangs kann bestimmt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Strangsynthese die Verwendung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle in einem Sequenzierungsprotokoll, das auf Primer-Extension gefolgt von einer basenspezifischen Spaltung von Produkten der Primer-Extension beruht. In einem Beispiel für diese Ausführungsform wird ein Set an vier verschiedenen Spezies funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle (z. B. eine Spezies kann rot fluoreszieren, eine Spezies kann grün fluoreszieren, eine Spezies kann gelb fluoreszieren, eine Spezies kann orange fluoreszieren), die verschiedene Nukleobasen umfassen (z. B. eine Spezies umfasst dATP; eine Spezies umfasst dTTP, eine Spezies umfasst dCTP, eine Spezies umfasst dGTP), während der Strangsynthese inkorporiert und der synthetisierte Strang wird in einem sich bewegenden Strom aus Flüssigkeit suspendiert; eine Exonuklease wird verwendet, um eine einzelne Nukleobase (markiert mit einem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall) von dem Ende des suspendierten, synthetisierten Strang sequentiell zu spalten und jede gespaltene, markierte Nukleobase wird in der Reihenfolge der Spaltung für die anschließende Detektion, spektrale Auflösung und Identifizierung unter Verwendung eines geeigneten Detektionssystems zur Bestimmung der Sequenz eines synthetisierten Strangs beibehalten. Wie für den Fachmann klar ersichtlich sein wird, beinhaltet eine weitere Variation dieser Ausführungsform Koppeln eines funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls an die Nukleobase, nachdem diese gespalten wurde (nach der Replikation, nach der Spaltung). Ein bevorzugtes Mittel zu Detektion kann einen Scanner oder ein Lesegerät oder ein anderes analytisches Instrument umfassen, das separate Fluoreszenz-Peaks, die in den spektralen Bereich von ungefähr 400 nm bis ungefähr 900 nm fallen, detektieren kann, und optional (wenn mehr als eine Farbe in dem Detektionssystem verwendet wird) zwischen spektral auflösbaren Fluoreszenz-Peaks innerhalb dieses Bereichs unterscheiden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform sind die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle, die markierte Nukleobasen umfassen, in einen (Nukleinsäure)-Strang, der in einer Template-gesteuerten Art und Weise synthetisiert wurde, inkorporiert. Eine Template-gesteuerte Art und Weise wird generell durch Kopieren eines Templates und Einfügen von Nukleobasen in den synthetisierten Strang durch ein Enzym, das Nukleinsäuren unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren repliziert, erreicht. Bei der Strangsynthese kann es sich um einen Prozess ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäureamplifikation, Fill-In-Reaktionen, Reverse Transkription, in vitro Mutagenese, zyklische Kettenabbruchssequenz-Reaktionen, zufällige Primer-Extension-Reaktionen, Nick-Translationen, Primer-Elongation, Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von und zur Quantifizierung der Anzahl an Di- und Trinukleotidrepeats und DNA Typisierung mit kurzen Tandem-Repeat-Polymorphismen handeln.
  • BEISPIEL 6
  • Dieses Beispiel erläutert verschiedene Ausführungsformen für die Verwendung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle, die markierte Affinitätsmoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Andere als die hierin zur Erläuterung beschriebenen Ausführungsformen zur Verwendung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung bei einem Verfahren zur Fluoreszenzdetektion sind dem Fachmann aus den hierin gegebenen Beschreibungen ersichtlich. In einem Verfahren zur Detektion eines Zielsubstrats unter Verwendung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung werden die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer Probe kontaktiert, die auf Anwesenheit oder Abwesenheit eines Substrats („Zielsubstrat"), für welches das Affinitätsmolekül der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle Bindungsspezifität aufweist, analysiert wird. In Fällen, in denen der Bereich des Affinitätsmoleküls der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle ein Nukleinsäuremolekül umfasst, umfasst das Verfahren zur Detektion eines Zielsubstrats Hybridisierung (wenn es sich bei dem Zielsubstrat um ein Nukleinsäuremolekül handelt) oder Binden (wenn es sich bei dem Zielsubstrat um ein Protein handelt). Mit Bezug auf die Hybridisierung ist im Stand der Technik bekannt, dass auf einen Prozess zurückgegriffen wird, durch den sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang durch Nukleotidbasenpaarung verbindet. Eine ausreichende Anzahl an komplementären Basenpaaren wird für die Hybridisierung benötigt und die Selektivität der Hybridisierung ist abhängig von dem Grad der Komplementarität, der Rigorosität der Bedingungen während des Hybridisierungsprozesses und der Länge der hybridisierenden Stränge. Somit wird in einem geeigneten Detektionssystem eine funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassende molekulare Sonde in einer diagnostisch wirksamen Menge zu einer Probe, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielsubstrats in geeigneten Bedingungen für die molekulare Sonde untersucht wird, hinzugefügt, um das Zielmolekül zu kontaktieren und, wenn dieses in der Probe vorhanden ist, an dieses zu binden. Typischerweise kann ein Waschschritt durchgeführt werden, um jede ungebundene oder nicht-spezifisch gebundene molekulare Sonde zu entfernen und anschließend wird die Probe einer geeigneten Anregungslichtquelle ausgesetzt (z. B. abhängig von dem Typ der verwendeten fluoreszierenden Nanokristalle) und jedes resultierende Fluoreszenzemissionsspektrum wird detektiert (und kann Quantifizierung einschließen). Die Quantifizierung der Menge an vorhandenem Zielsubstrat steht direkt in Bezug zu der Intensität des emittierten Fluoreszenz-Peaks. Wie dem Fachmann im Gebiet der fluoreszierenden Nanokristalle bekannt ist, sind der Peak der Absorption und die Peakemissionen der Fluoreszenz von Faktoren abhängig, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der chemischen Natur, der Größe des Halbleiter-Nanokristalls und der Menge des dMO-Nanokristalle umfassenden Dotierungsmittels. Es gibt zahlreiche Formate von Assaysystemen, in denen solche funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle verwendet werden können, die Folgende einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind: Northern Blot, Southern Blot, Microarrays (z. B. Genchips, Proteinchips), in-situ Hybridisierung („FISH"), Screening von Nukleinsäuremolekülbibliotheken, Effizienzassays genetischer Einschleusung (z. B. Transfektion, Infektion, Elektroporation), molekulare Amplifikationsassays und Assays für Genexpression.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, worin ein funktionalisiertes, verkapseltes, fluoreszierendes Nanokristall ein oder mehr als ein Nukleinsäuremolekül umfasst, umfasst das Nukleinsäuremolekül einen Expressionsvektor für die Expression von einer erwünschten Nukleinsäuresequenz, oder ein Nukleinsäuremolekül (z. B. Gen), das in eine lebende Zelle eingeschleust (z. B. Infektion, Transfektion, Elektroporation) werden soll. Zum Beispiel umfasst das Lipidgemisch, das verwendet wird, um die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle zu bilden, ein oder mehr als ein kationisches Lipid und ein oder mehr als ein „Helferlipid", wobei ein Lipidgemisch, das den resultierenden funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen Transfektionseffizienz verleiht oder diese erleichtert, gebildet wird. Es ist dem Fachmann bekannt, dass solche Helferlipide Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Cholesterin (ch), Monooleoylglycerin, Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) und eine Kombination von diesen einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind. Es ist dem Fachmann bekannt, das kationische Lipide 3(beta)(N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl)cholesterin (DC-ch), N-(1-(2,3-dioleoyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammoniumchiorid (DOTMA), Dymyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammonium (DMRIE), 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropanchlorid (DOTAP) und eine Kombination von diesen einschließen, aber nicht auf diese beschränkt sind. Es wird dem Fachmann klar ersichtlich sein, dass das Lipidgemisch in Abhängigkeit von der gewünschten Durchführung und den gewünschten Eigenschaften ein oder mehr als ein kationisches Lipid, oder ein oder mehr als ein kationisches Lipid in Kombination mit einem oder mehr als einem Helferlipid umfassen kann. Zum Beispiel kann das eine oder mehr als eine kationische Lipid von ungefähr 10% bis ungefähr 90% oder mehr des Lipidgemisches umfassen. Bevorzugte Lipidgemische umfassen: DMRIE und DOPE; MMCE und DOPE (1:1); DOTMA und ch (1:1); DOTAP und DC-ch; DMRIE und DC-ch; oder DOPE und DC-ch. Wie dem Fachmann klar ersichtlich ist, kann die Transfektionseffizienz eines funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls von einem oder mehr als einem Faktor einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Struktur der bei dieser Bildung verwendeten kationischen Lipide, Verhältnis von kationischem Lipid zu Nukleinsäuremolekül, Größe des funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls und Inhalt des Lipidgemisches abhängig sein.
  • In einer Ausführungsform werden die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit Nukleinsäuremolekül (einschließlich einem Plasmid oder einem anderen DNA-Molekül, jedoch nicht darauf beschränkt) in geeigneten Verhältnissen und Mengen gemischt, wobei Komplexe für die Förderung der Einschleusung in die Zellen, die transfiziert werden sollen, gebildet werden. Zum Beispiel kann mit Bezug auf Zelltypen und/oder Transfektionsbedingungen, in denen ein negativ geladener Komplex erwünscht ist, ein vergleichsweise höheres Verhältnis von Nukleinsäure zu funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen verwendet werden. Gleichermaßen kann für Zelltypen und/oder Transfektionsbedingungen, in denen ein positiv geladener Komplex erwünscht ist, ein vergleichsweise höheres Verhältnis von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen zu Nukleinsäuremolekül verwendet werden. Zum Beispiel können in Abhängigkeit von dem Zelltyp die verschiedenen Verhältnisse von Nukleinsäuremolekül: funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen verwendet werden, um die Komplexe zur Transfektion zu bilden. Im Allgemeinen werden diese Verhältnisse in Mikrogramm Nukleinsäuremolekül: Nanomol kationisches Lipid ausgedrückt. Zur Erläuterung: Im Allgemeinen ist bekannt, dass das Verhältnis im Bereich von ungefähr 15:1 bis ungefähr 1:20 (Nukleinsäuremolekül: kationisches Lipid) liegt. Somit werden zum Beispiel das Nukleinsäuremolekül und die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle zusammengemischt, um eine Mischung zu bilden (z. B. durch Mischen und Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur). Alternativ kann das Nukleinsäuremolekül in die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle verkapselt werden, indem das Nukleinsäuremolekül (z. B. in dem angemessenen Verhältnis) während der Liposombildung, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, in den getrockneten Film aus einem Lipidgemisch oder in die Lösung für das Hydrieren des getrockneten Film aus einem Lipidgemisch inkorporiert wird. In beiden Ausführungsformen können die resultierenden Komplexe dann in im Stand der Technik bekannten Transfektionsprotokollen verwendet werden (z. B. können sie zu Medium hinzugefügt werden und das Medium wird mit Zellen unter für die Transfektion geeigneten Bedingungen inkubiert, beispielsweise für 5–6 Stunden in einem Gewebskulturinkubator bei 37°C mit CO2). Nach diesem Prozess kann die Effizienz des Einschleusens der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle in die Zellen evaluiert werden, indem die Zellen einer Fluoreszenzanalyse mittels eines Verfahrens, das Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenzscanner einschließen kann, aber nicht darauf beschränkt ist, unterzogen wird. Zum Beispiel werden die Zellen einer geeigneten Anregungslichtquelle ausgesetzt (z. B. in Abhängigkeit von dem Typ des verwendeten fluoreszierenden Nanokristalls) und jedes resultierende, von dem funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall emittierte Fluoreszenzemissionsspektrum wird detektiert. Die Quantifizierung der Menge an in den Zellen vorhandenen, funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen steht direkt in Bezug zu der Intensität des emittierten Fluoreszenz-Peaks.
  • BEISPIEL 7
  • Dieses Beispiel veranschaulicht verschiedene Ausführungsformen für ein Verfahren zur Verwendung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle, die markierte Affinitätsmoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Andere als die hierin zur Erläuterung beschriebenen Ausführungsformen zur Verwendung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung bei einem Verfahren zur Fluoreszenzdetektion sind dem Fachmann aus den hierin gegebenen Beschreibungen ersichtlich. In einem Verfahren zur Detektion eines Zielsubstrats unter Verwendung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung werden die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer Probe kontaktiert, die auf Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielsubstrats, für welches das Affinitätsmolekül der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle Bindungsspezifität aufweist, analysiert wird. In dieser Ausführungsform umfasst der Bereich des Affinitätsmoleküls der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle ein Protein mit Bindungsspezifität (z. B. monoklonaler Antikörper, Peptid, Lectin) oder ein Aptamer mit Bindungsspezifität. Die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle werden mit der Probe, die auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielsubstrats analysiert wird, kontaktiert. Das darauf folgende Binden zwischen dem Bereich des Affinitätsmoleküls des funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls und dem Zielsubstrat, wenn es in der Probe vorhanden ist, führt in einem Detektionssystem zu Komplexen, welche die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle und Zielsubstrat umfassen, und die ein zu detektierendes Signal für die Quantifizierung, Visualisierung oder eine andere Form der Detektion emittieren können. Nach der Bildung des die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle und Substrat umfassenden Komplexes, kann das davon emittierte detektierbare Signal detektiert werden, indem zunächst die in dem Detektionssystem gebildeten Komplexe einem Anregungsspektrum von Licht ausgesetzt werden (UV oder eine andere geeignete Lichtquelle; in Abhängigkeit des Typs des verwendeten fluoreszierenden Nanokristalls), das für die Anregung der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle geeignet ist, damit ein Fluoreszenzspektrum emittiert werden kann. Der Peak wird dann durch geeignete Detektionsmittel (z. B. Photodetektor, Filter, Fluoreszenzmikroskop und dergleichen) detektiert oder detektiert und quantifiziert. Die Quantifizierung der Menge an vorhandenem Zielsubstrat steht direkt in Bezug zu der Intensität des emittierten Fluoreszenz-Peaks. Wie dem Fachmann im Gebiet der fluoreszierenden Nanokristalle bekannt ist, sind der Peak der Absorption und die Peakemissionen der Fluoreszenz von Faktoren abhängig, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der chemischen Natur und der Menge des dMO-Nanokristalle umfassenden Dotierungsmittels und der chemischen Natur und der Größe der Halbleiter-Nanokristalle. Wie für den Fachmann klar ersichtlich sein wird, kann das Detektionssystem Folgendes einschließen, ist jedoch nicht darauf beschränkt: einen Immunoassay auf Fluoreszenzbasis, Detektionssysteme auf Fluoreszenzbasis, Fluoreszenzfärbung (z. B. immunofluoreszierende Färbung auf einem Glasträger), Microarrays, Durchflusszytometrie, molekulares Tracking (z. B. Lokalisierung oder Tracking eines Zielsubstrats), molekulares Sortieren (z. B. Zellsortierung durch Durchflusszytometrie), Fluoreszenz-Imaging (z. B. von lebendem Gewebe oder optische Faser-Fluoreszenz-Imaging-Mikroskopie) und dergleichen.
  • BEISPIEL 8
  • In einer anderen Erläuterung eines Verfahrens zur Verwendung von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen kann es erwünscht sein, dass das Fluoreszenzsignal, das von in einem Detektionssystem (insbesondere einem Detektionssystem, das eine wässrige Lösung verwenden kann, z. B. einem Immunoassay, Microarray und dergleichen) vorhandenen funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen emittiert wird, gelöscht (reduziert oder eliminiert) wird. Um dieses Beispiel zu erläutern, worin die funktionalisierten, fluoreszierenden Nanokristalle in einer Lösung auf Wasserbasis (entweder vor oder nach der Behandlung mit der lipolytischen Substanz) vorhanden sind, kann der Liposombereich des funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls aufgespalten werden, um die fluoreszierenden Nanokristalle zu freizusetzen. Die fluoreszierende Nanokristalle, die in wässrigen Lösungen unlöslich sind, können Aggregate bilden, wenn sie miteinander interagieren, was irreversible Flockulation der fluoreszierenden Nanokristalle hervorrufen kann. Somit umfasst ein Verfahren zur Fluoreszenzlöschung in einem Detektionssystem von einem funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle umfassenden Substrat das Folgende: Kontaktieren der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer lipolytischen Substanz in einer wirksamen Menge, um die Liposombereiche der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalls aufgespalten, wobei fluoreszierende Nanokristalle freigesetzt werden; und Entfernen der freigesetzten fluoreszierenden Nanokristalle aus dem Detektionssystem (z. B. indem ermöglicht wird, dass die freigesetzten fluoreszierenden Nanokristalle in einer Lösung auf Wasserbasis ausfallen und sie damit aus dem Substrat entfernt werden, und/oder durch Waschen der freigesetzten fluoreszierenden Nanokristalle aus dem Detektionssystem), wobei die Fluoreszenz gelöscht wird.
  • Wenn der Bereich des Affinitätsmoleküls der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle in dem System an ein Zielsubstrat gebunden ist, wodurch die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle immobilisiert werden, führt zum Beispiel eine Abspaltung des Liposombereichs zur Aufhebung der Immobilisierung der fluoreszierenden Nanokristalle. Wie dem Fachmann ersichtlich ist, gibt es mehrere Mittel, durch deren Verwendung der Liposombereich von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen aufgespalten werden kann. Zum Beispiel schließt eine lipolytische Substanz zur Abspaltung des Liposombereichs Folgendes ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt: ein lipolytisches Enzym, Komponenten des Komplementsystems, die ausreichen, um durch Komplemente verursachte Lyse auszulösen; ein Detergens (z. B. ein nicht-ionisches Detergens wie TRITON X-100; Saponin und dergleichen); einen Alkohol, der mit Wasser vermischt werden kann, und eine Kombination von diesen. Kurz zusammengefasst werden die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer ausreichenden Menge einer lipolytischen Substanz kontaktiert, um eine Abspaltung (Bruch oder Lyse) der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle zu bewirken. In Abhängigkeit von der lipolytischen Substanz und dem Zeitraum, in dem die gewünschte Abspaltung erfolgen soll, kann eine Menge einer lipolytischen Substanz, die wirksam ist, um eine solche Lyse oder Abspaltung zu verursachen, von ungefähr 10% bis ungefähr 90% des Volumens der die aufzuspaltenden funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle umfassenden Lösung auf Wasserbasis umfassen. Die freigesetzten fluoreszierenden Nanokristalle können dann aus dem Detektionsassay oder -system entfernt oder ausgeschlossen werden.
  • BEISPIEL 9
  • Wie hierin zuvor in größerem Detail beschrieben, umfasst ein Verfahren zur Herstellung funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristalle gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden Schritte: (a) Mischen von fluoreszierenden Nanokristallen mit einer Lipidgemisch, das die Lipide umfasst (z. B. ein oder mehr als ein Phospholipid, oder ein oder mehr als ein Phospholipid und ein oder mehr als ein Sterin), um einen getrockneten Film aus einem Lipidgemisch zu bilden; (b) Kontaktieren des getrockneten Films aus einem Lipidgemisch mit einer wässrigen Lösung; und (c) Mischen des getrockneten Films aus Lipidgemisch mit der wässrigen Lösung, wobei funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle gebildet werden. Der Schritt des Vermischens (c) kann mittels jedem im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, das Verwirbelung, Ultraschallbehandlung, Druckanwendung, Filterung, Injektion und eine Kombination von diesen einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Wie aus den hierin gegebenen Beschreibungen hervorgeht, umfasst der getrocknete Film aus einem Lipidgemisch die Lipide, die den Liposombereich der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle bilden sollen; und in einer alternativen Ausführungsform kann das Lipidgemisch des Weiteren eine oder mehr als eine Substitutionskomponente umfassen. Wie aus den hierin gegebenen Beschreibungen hervorgeht, kann die wässrige Lösung des Weiteren eine oder mehr als eine Substitutionskomponente, ein oder mehr als ein Affinitätsmolekül oder eine Kombination von diesen umfassen. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren Nachbehandeln der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle durch Kontaktieren der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer oder mehr als einer Substitutionskomponente unter geeigneten Bedingungen umfassen, so dass die eine oder mehr als eine Substitutionskomponente Teil des Liposombereichs der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle wird. Wie aus den hierin gegebenen Beschreibungen hervorgeht, umfasst die eine oder mehr als eine Substitutionskomponente ein oder mehr als ein Affinitätsmolekül, das eine reaktive Funktionalität aufweist, die an die reaktive Funktionalität des Liposombereichs der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle gekoppelt ist. Zusätzlich kann das Verfahren des Weiteren einen Reinigungsschritt (z. B. Gelpermeation, Trennung nach Dichte, Trennung auf Basis der Löslichkeit, magnetische Trennung auf Basis der magnetischen Anziehung der verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle an eine Magnetquelle und dergleichen) zur Reinigung der gewünschten Population an funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen umfassen. Wie zuvor hierin in größerem Detail beschrieben, umfasst eine Ausführungsform des Mischens von fluoreszierenden Nanokristallen mit einem Lipidgemisch zur Bildung eines getrockneten Films aus einem Lipidgemisch das Mischen der fluoreszierenden Nanokristalle und des Lipidgemisches in demselben organischen Lösungsmittel und anschließendes Verdampfen des Lösungsmittels, um den getrockneten Film aus einem Lipidgemisch zu bilden. Alternativ können die fluoreszierenden Nanokristalle in einem Lösungsmittel verdampft werden, um eine getrocknete Zubereitung an fluoreszierenden Nanokristallen zu bilden; das Lipidgemisch kann getrocknet werden und anschließend können die getrocknete Zubereitung fluoreszierender Nanokristalle und die getrocknete Zubereitung des Lipidgemisches miteinander vermischt werden, um den getrockneten Film aus einem Lipidgemisch zu bilden.
  • Die vorangehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurde aus Gründen der Veranschaulichung im Detail beschrieben.

Claims (38)

  1. Ein funktionalisierter, verkapselter, fluoreszierender Nanokristall, der folgendes umfasst: (a) ein Liposom; (b) einen oder mehr als einen durch das Liposom verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall; und (c) Oberflächengruppen, wobei eine äußere Fläche des Liposoms die Oberflächengruppen umfasst, und wobei die Oberflächengruppen aus der Gruppe, die aus einer oder mehr als einer reaktiven Funktionalität, einem oder mehr als einem Affinitätsmolekül und einer Kombination aus diesen besteht, ausgewählt sind.
  2. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei ein fluoreszierender Nanokristall aus dem einen oder mehr als einem durch das Liposom verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall einen Halbleiter-Nanokristall umfasst.
  3. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei ein fluoreszierender Nanokristall aus dem einen oder mehr als einem durch das Liposom verkapselten, fluoreszierenden Nanokristall einen dotierten Metalloxid-Nanokristall umfasst.
  4. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei eine Vielzahl von fluoreszierenden Nanokristallen durch das Liposom verkapselt ist, und die Vielzahl von fluoreszierenden Nanokristallen eine Kombination aus einem oder mehr als einem dotierten Metalloxid-Nanokristall und einem oder mehr als einem Halbleiter-Nanokristall umfasst.
  5. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei das Liposom ferner eine Substitutionskomponente umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Membranstabilisator, einem isotonischen Mittel, einem den pH-Wert einstellenden Mittel, einem die Aggregation minimierenden Mittel, einem Affinitätsmolekül, einer Aminosäure und einer Kombination aus diesen besteht.
  6. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 5, wobei das Liposom einen Membranstabilisator umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem oder mehr als einem Sterol, einer oder mehr als einer Fettsäure, einer oder mehr als einer Aminosäure und einer Kombination aus diesen besteht.
  7. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 6, wobei das Liposom ein oder mehr als ein Phospholipid und ein oder mehr als ein Sterol umfasst.
  8. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die freie Aminogruppen umfasst.
  9. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die Thiol-reaktive Gruppen umfasst.
  10. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die freie Thiolgruppen umfasst.
  11. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die freie Carboxylgruppen umfasst.
  12. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen ein Affinitätsmolekül umfassen, das einen monoklonalen Antikörper umfasst.
  13. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die an ein Affinitätsmolekül gekoppelt ist, das einen monoklonalen Antikörper umfasst.
  14. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen ein Affinitätsmolekül umfassen, das eine Nukleobase umfasst.
  15. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die an ein Affinitätsmolekül gekoppelt ist, das eine Nukleobase umfasst.
  16. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen ein Affinitätsmolekül umfassen, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst.
  17. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei die Oberflächengruppen eine reaktive Funktionalität umfassen, die an ein Affinitätsmolekül gekoppelt ist, das ein Nukleinsäuremolekül umfasst.
  18. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei sich das Liposom für das Bilden eines für Transfektion geeigneten Liposoms aus einem oder mehr als einem kationischen Lipid und einem oder mehr als einem Hilfslipid zusammensetzt.
  19. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 1, wobei sich das Liposom für das Bilden eines für Transfektion geeigneten Liposoms aus einem oder mehr als einem kationischen Lipid zusammensetzt.
  20. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 18, der ferner ein Nukleinsäuremolekül umfasst.
  21. Der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristall gemäß Anspruch 18, der ferner ein Nukleinsäuremolekül umfasst.
  22. Ein Komplex, der aus einer Vielzahl von funktionalisierten verkapselten fluoreszierenden Nanokristallen gemäß Anspruch 18 und einem Nukleinsäuremolekül besteht.
  23. Ein Komplex, der aus einer Vielzahl von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen gemäß Anspruch 19 und einem Nukleinsäuremolekül besteht.
  24. Ein Verfahren für das Verwenden von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen gemäß Anspruch 1 in einem Detektionssystem, wobei die Oberflächengruppen ein Affinitätsmolekül umfassen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle mit einer Probe, die in Bezug auf das Vorliegen oder das Nichtvorliegen eines Substrats, für welches das Affinitätsmolekül eine Bindungspezifität aufweist, analysiert wird, wobei, falls das Substrat in der Probe vorliegt, Komplexe gebildet werden, welche die funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden, an das Substrat gebundenen Nanokristalle umfassen; (b) Aussetzen der Komplexe, falls gebildet, in dem Detektionssystem einer anregenden Lichtquelle, die für das Anregen der funktionalisierten verkapselten Nanokristalle geeignet ist, um einen Fluoreszenz-Peak zu emittieren; und (c) Detektieren des von den Komplexen emittierten Fluoreszenz-Peaks, falls vorliegend, über ein Detektionsmittel für das Detektieren des Fluoreszenz-Peaks; wobei die Detektion eines Fluoreszenz-Peaks das Vorliegen des Substrats anzeigt.
  25. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Vorliegen des Substrats detektiert wird und das ferner das Quantifizieren der vorhandenen Substratmenge durch das Messen der Intensität des emittierten Fluoreszenz-Peaks umfasst.
  26. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Affinitätsmolekül ein Nukleinsäuremolekül umfasst, und wobei das Detektionssystem eine Hybridisierung umfasst.
  27. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Detektionssystem aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem fluoreszenzbasierten Immunoassay, einem fluoreszenzbasierten Detektionssystem, Microarrays, Fluoreszenzfärbung, Durchflusszytometrie, Strangsynthese, molekularem Sortieren, molekularem Tracking und einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren besteht.
  28. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Affinitätsmolekül einen monoklonalen Antikörper umfasst.
  29. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Oberfächengruppen eine Nukleobase umfassen und wobei das Detektionssystem eine Strangsynthese umfasst, in der funktionalisierte, verkapselte, fluoreszierende Nanokristalle in den auf eine Templat-gesteuerte Weise synthetisierten Nukleinsäurestrang inkorporiert werden.
  30. Das Verfahren gemäß Anspruch 24, in dem Fluoreszenz detektiert wird, wobei das Verfahren ferner das Kontaktieren der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle in dem Detektionssystem mit einem lipolytischen Mittel in einer Menge umfasst, die wirksam ist, um Liposomenteile der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle beim Freisetzen von fluoreszierenden Nanokristallen zu spalten; und um die freigesetzten fluoreszierenden Nanokristalle aus dem Detektionssystem zu entfernen, um die Fluoreszenz zu löschen.
  31. Ein Verfahren für das Herstellen von funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristallen, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Mischen von fluoreszierenden Nanokristallen mit einer Lipidmischung, um eine Schicht der getrockneten Lipidmischung zu bilden; (b) Kontaktieren der Schicht der getrockneten Lipidmischung mit einer wässrigen Lösung; und (c) Mischen der getrockneten Schicht der Lipidmischung mit der wässrigen Lösung beim Bilden der funktionalisierten, verkapselten, fluoreszierenden Nanokristalle.
  32. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die fluoreszierenden Nanokristalle und die Lipidmischung in einem organischen Lösungsmittel gemischt werden, und das organische Lösungsmittel verdampft wird, um die getrocknete Lipidmischung zu bilden.
  33. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei ein fluoreszierende Nanokristalle enthaltendes organisches Lösungsmittel für das Bilden eines getrockneten Ansatzes von fluoreszierenden Nanokristallen verdampft wird, und ein organisches, die Lipidmischung enthaltendes Lösungsmittel für das Bilden eines getrockneten Ansatzes der Lipidmischung verdampft wird, und der getrocknete Ansatz der fluoreszierenden Nanokristalle und der getrocknete Ansatz der Lipidmischung vermischt werden, um die getrocknete Lipidmischung zu bilden.
  34. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die fluoreszierenden Nanokristalle Halbleiter-Nanokristalle umfassen.
  35. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die fluoreszierenden Nanokristalle dotierte Metalloxid-Nanokristalle umfassen.
  36. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die fluoreszierenden Nanokristalle Halbleiter-Nanokristalle und dotierte Metalloxid-Nanokristalle umfassen.
  37. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die Schicht der getrockneten Lipidmischung ferner eine Substitutionskomponente umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Membranstabilisator, einem isotonischen Mittel, einem den pH-Wert einstellenden Mittel, einem die Aggregation minimierenden Mittel, einem Affinitätsmolekül, einer Aminosäure sowie einer Kombination aus diesen besteht.
  38. Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die wässrige Lösung ferner eine Substitutionskomponente umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Membranstabilisator, einem isotonischen Mittel, einem den pH-Wert einstellenden Mittel, einem die Aggregation minimierenden Mittel, einem Affinitätsmolekül, einer Aminosäure sowie einer Kombination aus diesen besteht.
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