DE602004005477T2

DE602004005477T2 - Injizierbare feste Calciumphosphat-Stäbe zur Abgabe von osteogenen Proteinen

Info

Publication number: DE602004005477T2
Application number: DE602004005477T
Authority: DE
Inventors: Rebecca Bedford LI; Howard Cambridge SEEHERMAN; Hyun Bedford KIM
Original assignee: Wyeth LLC; Etex Corp
Current assignee: Wyeth LLC; Etex Corp
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2024-09-11
Also published as: CY1108012T1; EP1772154A3; AU2004272072A8; EP1675608A2; IL174198A0; EP2374471A1; DK1675608T3; EP1772154A2; ECSP066500A; WO2005025595A2; ZA200602079B; US20050089579A1; WO2005025595B1; CN1878565B; IL174198A; SI1675608T1; RU2006105911A; NO20061547L; EP1675608B1; US8507008B2

Description

Der Gegenstand der Erfindung betrifft das Fachgebiet der osteogenen Proteine und Arzneimittel davon.
Die idiopathische Osteoporose ist eine Erkrankung unbekannter Ätiologie, die durch den progressiven Verlust von Knochenmasse und erhöhter Brüchigkeit gekennzeichnet ist, was zu einem bemerkenswerten Anstieg in der Auffälligkeit für Frakturen führt. Osteoporose ist die häufigste aller Muskel-Skelett-Störungen, die fünfundsechzig Prozent der Frauen über 45 Jahre beeinträchtigt. Praemer et al. „Musculoskeletal Conditions in the United States", Amer. Acad. of Orthopaedic Surgeons, Park Ridge, IL (1992). Da ihre Inzidenz mit dem Alter zunimmt und der prozentuale Anteil der älteren Menschen in der Bevölkerung ansteigt, wird Osteoporose mit der Zeit häufiger werden. Osteoporose ist lokal schwer zu behandeln und es gibt gegenwärtig kein bekanntes Heilverfahren. Schließlich, und das ist am bedeutsamsten, steht Osteoporose mit einer beträchtlichen Morbidität und Mortalität in Zusammenhang. Die schwerste Fraktur, die von Osteoporose herrührt, ist die des proximalen Oberschenkelknochens im Bereich des Hüftgelenks. Mit einer jährlichen Inzidenz von über 300.000 Fällen sind Hüftfrakturen gegenwärtig die häufigsten Frakturen älterer Menschen. Eine von sechs weißen Frauen wird in ihrem Leben eine Hüftfraktur erleiden (Cummings et al., Arch. Intern. Med., Bd. 149, S. 2455–2458 (1989)), und für diejenigen, die das Alter von 90 Jahren erreichen, wird das Zahlenverhältnis eine von dreien betragen.
Zusätzlich zur Behandlung des osteoporotischen Knochens besteht ein Bedarf an Verfahren, die mit Osteoporose in Zusammenhang stehenden Frakturen zu behandeln oder diesen vorzubeugen, zum Beispiel durch lokale Verabreichung von osteogenen Proteinen. Osteogene Proteine sind Proteine, die fähig sind, Knorpelbildung und/oder Knochenbildung auszulösen oder die Induktion derselben zu unterstützen. In den letzten Jahren sind viele derartiger osteogener Proteine isoliert und beschrieben worden, und einige sind durch rekombinante Verfahren hergestellt worden. Zudem sind verschiedene Formulierungen entwickelt worden, die entworfen wurden, um osteogene Proteine an einer Stelle abzugeben, wo die Induktion der Knochenbildung erwünscht ist.
Doch trotz der beträchtlichen Anstrengungen auf diesem Gebiet besteht ein Bedarf für ein wirksames Verfahren des Reparierens und/oder der Behandlung des osteoporotischen und osteopenischen Knochens und zur Minimierung oder Verringerung des Auftretens oder der Schwere von mit Osteoporose in Zusammenhang stehenden Frakturen.
Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen, d. h. osteogene Zusammensetzungen, gerichtet. Die Zusammensetzungen nehmen die Form eines festen Stabs, bevorzugt eines zylindrischen festen Stabs, an. Die Zusammensetzungen umfassen ein osteogenes Protein und ein Calciumphosphat-Material.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das osteogene Protein ein Mitglied der Familie der knochenmorphogenetischen Proteine, stärker bevorzugt eines von BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, am meisten bevorzugt BMP-2. Das osteogene Protein ist bevorzugt in einer Menge vorhanden, die im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% liegt, stärker bevorzugt von etwa 15 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% des festen Stabs der Erfindung.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das Calciumphosphat-Material ein Material, ausgewählt aus einem amorphen apatitischen Calciumphosphat, schwachkristallinem apatitischen Calciumphosphat, Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat, Fluorapatit und Kombinationen davon. Am meisten bevorzugt ist das Calciumphosphat-Material ein schwachkristallines apatitisches Calciumphosphat. Das Calciumphosphat-Material ist bevorzugt in einer Menge im Bereich von etwa 10 Gew.-% bis etwa 99 Gew.-%, stärker bevorzugt von etwa 40 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% der stabförmigen osteogenen Zusammensetzung vorhanden.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf osteogene Zusammensetzungen gerichtet, die auch einen Knochenresorptionshemmer umfassen. Der Knochenresorptionshemmer ist bevorzugt ein Bisphosphonat, ausgewählt aus Alendronat, Cimadronat, Clodronat, EB 1053, Etidronaten, Ibandronat, Neridronat, Olpadronat, Pamidronat, Risedronat, Tiludronat, YH 529, Zoledronat und pharmazeutisch verträglichen Salzen, Estern, Säuren und Gemischen davon.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf osteogene Zusammensetzungen gerichtet, die auch ein Additiv umfassen, ausgewählt aus pharmazeutisch verträglichen Salzen, Polysacchariden, Peptiden, Proteinen, Aminosäuren, synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren, oberflächenaktiven Mitteln und Kombinationen davon, stärker bevorzugt ausgewählt aus Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose, Polylactid, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer, Polyvinylalkohol, Dextransulfat und Kombinationen davon. Das Additiv ist bevorzugt in einer Menge im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-%, stärker bevorzugt von etwa 20 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% der stabförmigen osteogenen Zusammensetzung vorhanden.
Wenn die osteogene Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung die Form eines festen zylindrischen Stabs annimmt, liegt der Durchmesser des zylindrischen Stabs bevorzugt zwischen etwa 0,1 mm und 3,0 mm, stärker bevorzugt etwa 1,0 mm, und die Länge des zylindrischen Stabs liegt bevorzugt zwischen etwa 0,5 cm und 5,0 cm.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung einer stabförmigen Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen gerichtet, wobei die Zusammensetzung ein osteogenes Protein und ein Calciumphosphat-Material umfasst, umfassend die Schritte von (a) Mischen einer trockenen Form des osteogenen Proteins mit einer trockenen Form des Calciumphosphat-Materials, um ein trockenes Gemisch herzustellen; (b) Rekonstituieren des trockenen Gemischs durch Zugeben eines wässrigen Puffers, um eine Paste zu bilden; (c) Formen der Paste, um eine stabförmige Zusammensetzung zu bilden; und (d) Trocknen der stabförmigen Zusammensetzung von Schritt (c), um eine stabförmige Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen zu bilden. In bevorzugten Ausführungsformen ist der wässrige Puffer ausgewählt aus Phophat-gepufferter Salzlösung, Salzlösung, Puffern auf Glycin- und Glutaminsäurebasis und Kombinationen davon. Das Verhältnis Volumen zu Gewicht (ml:g) von wässrigem Puffer zu trockenem Gemisch liegt im Bereich von etwa 0,5:1 bis etwa 2:1. Das Formen wird bevorzugt durch Formen, Extrudieren, Pressen, Bohren oder Kombinationen davon ausgeführt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die stabförmige Zusammensetzung vor oder nach Schritt (d) geschnitten.
Noch weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf Verfahren zum Behandeln von Säugetieren mit einem Knochendefekt gerichtet, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einer hierin beanspruchten Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen an die Stelle des Knochendefekts. Noch weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind auf Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers mit einem Knochendefekt gerichtet, umfassend die Schritte von (a) Verabreichen einer wirksamen Menge einer hierin beanspruchten Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe osteogener Proteine an die Stelle des Knochendefekts und (b) Verabreichen einer wirksamen Menge eines Knochenresorptionshemmers an die Stelle des Knochendefekts. Die Verabreichung eines Knochenresorptionshemmers kann vor Schritt (a), nach Schritt (a) oder gleichzeitig mit Schritt (a) erfolgen.
1 ist eine Graphik, welche die In-vitro-Freisetzungskinetik von rhBSM-2 aus α-BMP-Stäben unter Verwendung von 125I-rhBMP-2 als Indikatorsubstanz zeigt.
2 ist eine Graphik, welche die lokale In-vivo-Retention von rhBMP-2 aus α-BSM-Stäben unter Verwendung von 125I-rhBMP-2 als Indikatorsubstanz zeigt.
Im Allgemeinen beziehen sich die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf die Regeneration von Knochengewebe und die gleichzeitige Zunahme von Knochenmasse, Knochendichte und Knochenfestigkeit. Insbesondere umfasst die Erfindung injizierbare feste Stäbe, umfassend ein osteogenes Protein, einen Calciumphosphatträger und gegebenenfalls Additiva und Wirkstoffe wie einen Knochenresorptionshemmer, ebenso wie Verfahren zur Herstellung derartiger osteogener Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung unter Verwendung derartiger osteogener Zusammensetzungen. Die festen Calciumphosphat-Stäbe der vorliegenden Erfindung sind zur intraossären Abgabe von osteogenen Proteinen geeignet. Durch die Verwendung der vorliegenden erfinderischen Verfahren und Zusammensetzungen kann die Schwere der Osteoporose oder die Häufigkeit von osteoporotischen Läsionen vorteilhaft verringert werden, wobei letzten Endes die Inzidenz von Knochenfrakturen verringert wird. Andere klinische Anwendungen schließen die Reparatur von Frakturen, die Knorpelreparatur, die Reparatur von nicht heilenden Defekten und Wirbelfusion ein. Die injizierbaren festen Stäbe der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um das Knochenwachstum zu fördern, wie es benötigt wird, wenn Gelenkersatzimplantate verwendet werden, wie in der vorläufigen U.S.-Anmeldung Nr. 60/502,526 („Promotion of Bone Ingrowth in Joint Replacement Implants Using Osteogenic Proteins; der Hauptgegenstand dieser vorläufigen Anmeldung ist hiermit in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen) beschrieben.
Eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf eine stabförmige Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen, umfassend ein osteogenes Protein und ein Calciumphosphat-Material, gerichtet. Eine Zusammensetzung gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann gegebenenfalls andere Additiva (Bindemittel, Exzipienten) und/oder Wirkstoffe wie einen Knochenresorptionshemmer einschließen.
Diese feste stabförmige Zusammensetzung ist zur lokalen intraossären Abgabe geeignet und kann deshalb direkt an eine osteoporotische oder osteopenische Stelle injiziert werden, um die Bildung und/oder Aufrechterhaltung des Knochens wirksam auszulösen. Ferner zeigt die injizierbare stabförmige Zusammensetzung ein verlängertes Abgabeprofil im Hinblick auf das osteogene Protein, wenn es auf diese Weise abgegeben wird. Die festen Stäbe der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt zylindrisch und weisen einen Durchmesser im Bereich von etwa 0,1 mm bis etwa 3,0 mm auf, stärker bevorzugt von etwa 1,0 mm, um die Abgabe durch eine Injektionsnadel Nr. 16 zu ermöglichen. Zudem weisen die festen Stäbe bevorzugt eine Länge im Bereich von etwa 1,0 mm bis etwa 5,0 cm auf.
Anders als bestehende injizierbare Formulierungen wird die osteogene Zusammensetzung dieser ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in einer festen Form verabreicht, wodurch die Mängel, die flüssigen oder viskosen Formulierungen inhärent sind, vermieden werden. Zum Beispiel kann unter Verwendung von flüssigen Formulierungen oder Gelformulierungen das osteogene Mittel durch die Körperflüssigkeiten vorzeitig verdünnt werden, bevor die knochenfördernde Wirkung erreicht werden kann. Die vorliegende Erfindung vermeidet den Verdünnungseffekt, indem es einen festen Träger verwendet, der sich in vivo langsam abbaut, wodurch eine verzögerte, verlängerte Freisetzung des Wirkstoffs (der Wirkstoffe) bereitgestellt wird. Darüber hinaus werden die festen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, anders als flüssige oder viskose Formulierungen, die von der Verabreichungsstelle fortwandern können, eingelagert und bleiben an der Stelle des gewünschten Knochenwachstums, um die das Knochenwachstum fördernde Wirksamkeit zu entfalten. Sie ermöglichen auch eine stärker präzise Einbringung eines festen Stabs in Bereiche von geringer Knochenmasse durch Injektion. Typischerweise sollte die Zusammensetzung für einen Zeitraum von etwa 5 Tagen bis etwa 2 Monaten an der Stelle bleiben. Wenn die Zusammensetzung vorzeitig verteilt wird, wird die gewünschte Knochenwachstumsförderungswirkung entweder nicht eintreten oder der gebildete Knochen wird nicht die gewünschte Festigkeit aufweisen. Schließlich ist die osteogene Zusammensetzung dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, auch wenn sie als Feststoff verabreicht wird, bevorzugt als zylindrischer Stab geformt, wodurch sie entweder zur Injektion oder Implantation in den Körper geeignet ist. Natürlich könnten, falls gewünscht, andere Stabformen verwendet werden, z. B. sechseckige, quadratische oder halbrunde Stabformen. Zudem wird auch die bekannte Komplikation eines chirurgischen Eingriffs, dass während eines intraossären Injektionsvorgangs eine Embolie ausgelöst wird, durch die Verwendung von festen Stäben (vs. flüssigen Formen oder Gelformen) beträchtlich abgeschwächt. Die mögliche Verlagerung von intraossären Knochenfragmenten, Fett oder eine Embolie, die durch eine Druckinjektion eines großen Volumens eines flüssigenTrägers/Gelträgers verursacht wird, wird verringert, da das injizierte Volumen des hoch konzentrierten festen Stabes viel geringer ist als das Volumen, das erforderlich ist, wenn eine gleiche Dosis in flüssiger Form oder in Gelform abgegeben wird. Die Zusammensetzung kann an die Stelle des gewünschten Knochenwachstums auf jede geeignete Weise abgegeben werden, einschließlich durch Einführung durch eine übliche hypoderme Nadel oder Spritze.
Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung der festen stabförmigen Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe osteogener Proteine gerichtet. Im ersten Schritt wird eine trockene Form des osteogenen Proteins mit einer trockenen Form des Calciumphosphat-Materials gemischt, um ein trockenes Gemisch herzustellen. Mit anderen Worten, es werden gepulverte oder trockene Formen sowohl des osteogenen Proteins als auch des Calciumphosphat-Materials verwendet, um zunächst ein trockenes Gemisch zu bilden. Wenn Additiva und/oder weitere Wirkstoffe in die Zusammensetzung eingeschlossen werden, können diese Materialien auch in einer trockenen oder gepulverten Form verwendet und in das trockene Gemisch eingeschlossen werden.
Im zweiten Schritt wird das trockene Gemisch durch Zugeben eines wässrigen Puffers rekonstituiert, um eine Paste zu bilden. Geeignete wässrige Puffer schließen ohne Einschränkung phosphatgepufferte Salzlösung, Salzlösung, Puffer auf Glycinbasis und Kombinationen davon ein. Wenn BMP-2 als osteogenes Protein verwendet wird, ist ein Puffer auf Glycinbasis mit einem pH-Wert von etwa 4,5 zur Anwendung bevorzugt; stärker bevorzugt wird ein Puffer auf Glycinbasis mit einer Zusammensetzung von 5 mmol L-Glutaminsäure, 2,5% Glycin, 0,5% Saccharose, 5 mmol NaCl und 0,01% Polysorbat 80 verwendet.
Ein Verhältnis Volumen zu Gewicht (ml:g) eines wässrigen Puffers zu einem trockenen Gemisch liegt im Bereich von etwa 0,5:1 bis etwa 2:1. Jedoch ist die untere Grenze dieses Gewichtsverhältnisses nur dadurch begrenzt, dass dem trockenen Gemisch genug Flüssigkeit zugegeben wird, ausreichend, um die Bildung einer Paste zu ermöglichen, die durch Injektion durch eine Spritze oder durch ein anderes Verfahren geformt werden kann. Zudem wird die obere Grenze dieses Gewichtsverhältnisses nur dadurch begrenzt, dass nicht so viel Flüssigkeit dem trockenen Gemisch zugegeben wird, dass die erreichte Geometrie, d. h. die Stabform, während des anschließenden Trocknens zerstört wird; mit anderen Worten, wenn zuviel Flüssigkeit verwendet wird, dann wird die im dritten Schritt dieses Verfahrens gebildete Stabform während des Trocknens der osteogenen Verbindung gefährdet sein.
Dieser Schritt wird unter Bedingungen durchgeführt, in denen ein im Wesentlichen einheitliches Mischen geschieht. Das Mischen vereinigt die Bestandteile und kann verwendet werden, um das Ausmaß der Umsetzungen zwischen den Bestandteilen zu regulieren. Während alle gewünschten Bestandteile bevorzugt in dem trockenen Gemisch enthalten sind, ist es auch möglich, ein Additiv oder einen weiteren Wirkstoff unmittelbar vor Beginn des Mischens oder vor Abschluss des Mischens zuzugeben. Ein derartiges Additiv oder ein weiterer Wirkstoff liegt bevorzugt in einer trockenen Form vor; jedoch kann auch eine hydratisierte Form des Additivs oder des weiteren Wirkstoffs zur Paste zugegeben werden.
Im dritten Schritt des vorliegenden erfinderischen Verfahrens wird die Paste geformt, um eine stabförmige Zusammensetzung zu bilden. Das Formen oder Gestalten kann unter Verwendung irgendeiner aus einer Anzahl bekannter Techniken wie Formen, Extrudieren, Pressen, Bohren und/oder Schneiden durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Paste in eine Injektionsspritze gepackt und durch das Auslassende extrudiert. In diesem Fall wird der Spritzenkolben eingefügt und eine ausreichende Menge Druck wird angelegt, um eine kontinuierliche Länge der Paste auf eine trockene Oberfläche zu extrudieren. Dann werden unter Verwendung eines Schneidewerkzeugs wie einer Rasierklinge, eines Skalpells, Messers oder dergleichen, Abschnitte abgeschnitten, um injizierbare, stabförmige Zusammensetzungen zu bilden. Das Schneiden kann auch nach dem nachstehend beschriebenen Trocknungsschritt stattfinden. In einer anderen Ausführungsform kann die Paste in eine zylindrische Form, einen Katheter, ein luft- oder gasdurchlässiges Röhrenmaterial (z. B. Silastic oder Teflon^®/FEP) oder ein anderes Gerät vom Extrusionstyp gepackt werden.
Im letzten Schritt wird die stabförmige Zusammensetzung, die in den früheren Schritten erhalten wurde, getrocknet oder gehärtet, um die stabförmige Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen der vorliegenden Erfindung (erste Ausführungsform) zu bilden. Das Trocknen kann über Lufttrocknen oder Inkubation bei erhöhten Temperaturen, d. h. mindestens bei 37°C, durchgeführt werden. Die Trocknungstemperatur ist nur durch den Abbau des osteogenen Proteins eingeschränkt, der typischerweise irgendwo im Bereich von 55°C und 60°C auftritt. Wenn das Trocknen in einem Ofen von 37°C durchgeführt wird, dauert das Trocknen etwa mindestens eine Stunde und das Trocknen wird bevorzugt über Nacht durchgeführt. Die stabförmige Zusammensetzung weist bevorzugt eine Restfeuchte von weniger als 10% auf.
Die Details bezüglich des Wirkstoffs, des Trägers, der Additiva und der Knochenresorptionshemmer, die zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden nachstehend gegeben.
WIRKSTOFF
Der in den osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorhandene Wirkstoff wird bevorzugt aus der Familie von Proteinen ausgewählt, die als Protein-Überfamilie der transformierenden Wachstumsfaktoren beta (TGF-β) bekannt ist. Diese Familie schließt die Aktivine, Inhibine und knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs) ein. Diese BMPs schließen die BMP-Proteine BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 und BMP-7 ein, die zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 5,108,922, 5,013,649, 5,116,738, 5,106,748, 5,187,076 und 5,141,905 offenbart sind, BMP-8, offenbart in PCT WO 91/18098, BMP-9, offenbart in PCT WO 93/00432, BMP-10, offenbart in PCT WO 94/26893, BMP-11, offenbart in PCT WO 94/26892, BMP-12 und BMP-13, offenbart in PCT WO 95/16035, BMP-15, offenbart in U.S. Patent Nr. 5,635,372, und BMP-16, offenbart in U.S. Patent Nr. 6,331,612. Andere TGF-β-Proteine, die als Wirkstoff in der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, schließen Vgr 2, Jones et al., Mol. Endocrinol., Bd. 6, S. 1961–1968 (1992) und einen der Wachstums- und Differenzierungsfaktoren (GDFs), einschließlich der in PCT WO 94/15965, WO 94/15949, WO 95/01801, WO 95/01802, WO 94/21681, WO 94/15966, WO 95/10539, WO 96/01845, WO 96/02559 beschriebenen, und andere ein. In der vorliegenden Erfindung ebenfalls nützlich sein kann BIP, offenbart in WO 94/01557, HP00269, offenbart in JP 7 250688 , und MP52, offenbart in PCT WO 93/16099. Die Offenbarungen all der vorstehenden Patente, Publikationen und veröffentlichten internationalen Anmeldungen sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Bevorzugt schließt der Wirkstoff mindestens ein Protein ein, ausgewählt aus der Unterklasse der Proteine, die im Allgemeinen als BMPs bekannt sind, von denen offenbart wurde, dass sie osteogene Wirksamkeit und andere Wirksamkeiten vom Wachstums- und Differenzierungstyp aufweisen. Eine Untergruppe von BMPs, die gegenwärtig zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, schließt BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 und BMP-13, am meisten bevorzugt BMP-2, ein, dessen Sequenz im U.S.-Patent Nr. 5,013,649 offenbart ist, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Der Wirkstoff kann rekombinant hergestellt werden oder aus einer Proteinzusammensetzung gereinigt werden. Der Wirkstoff kann, wenn er ein TGF-β wie BMP oder ein anderes dimeres Protein ist, homodimer sein oder kann mit anderen BMPs heterodimer (z. B. ein Heterodimer, zusammengesetzt aus einem Monomer von jeweils BMP-2 und BMP-6) oder mit anderen Mitgliedern der TGF-β-Überfamilie wie Activinen, Inhibinen und TGF-β1 heterodimer sein (z. B. ein Heterodimer zusammengesetzt aus einem Monomer von jeweils einem BMP und einem verwandten Mitglied der TGF-β-Überfamilie). Beispiele für derartige heterodimere Proteine werden zum Beispiel in PCT WO 93/09229 beschrieben, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Der Wirkstoff kann DNA, die BMPs codiert, und Zellen, die mit Genen, welche BMP-Proteine codieren, transduziert oder transfiziert wurden, umfassen.
Der Wirkstoff kann ferner zusätzliche Mittel wie Hedgehog-, Frazzled-, Chordin-, Noggin-, Cerberus- und Follistatinproteine umfassen. Diese Proteinfamilien werden im Allgemeinen in Sasai et al., Cell, Bd. 79, S. 779–790 (1994) (Chordin); PCT WO 94/05800 (Noggin); und Fukui et al., Dev. Biol. Bd. 159, S. 131–139 (1993) (Follistatin) beschrieben. Hedgehogproteine werden in PCT WO 96/16668, WO 96/17924 und WO 95/18856 beschrieben. Die Frazzled-Proteinfamilie ist eine vor relativ kurzer Zeit entdeckte Proteinfamilie mit hoher Homologie zur extrazellulären Bindungsdomäne der Rezeptorproteinfamilie, die als Frizzled bekannt ist. Die Frizzledfamilie der Gene und Proteine ist in Wang et al., J. Biol. Chem., Bd. 271, S. 4468–4476 (1996) beschrieben. Der Wirkstoff kann auch andere lösliche Rezeptoren einschließen, wie die trunkierten löslichen Rezeptoren, die in PCT WO 95/07982 offenbart sind. Aus den Lehren von WO 95/07982 wird einem Fachmann ersichtlich, dass trunkierte lösliche Rezeptoren für zahlreiche andere Rezeptorproteine hergestellt werden können. Solche würden auch vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst werden. Die vorstehenden Veröffentlichungen sind hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
Die Menge des hierin nützlichen Wirkstoffs ist die Menge, die wirksam ist, um eine gesteigerte osteogene Aktivität von vorhandenen oder infiltrierenden Progenitorzellen (Osteoblast-Vorläuferzellen) oder anderen Zellen zu stimulieren (hierin nachstehend „wirksame Menge"), und wird von der Größe und der Natur des zu behandelnden Schadens ebenso wie von der Zusammensetzung des verwendeten Calciumphosphatträgers abhängen. Im Allgemeinen liegt die Menge des osteogenen Proteins, das in einer festen, stabförmigen osteogenen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-%, stärker bevorzugt von etwa 15 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% der osteogenen Zusammensetzung.
TRÄGER
Gemäß allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein Calciumphosphat-Material als ein Träger verwendet. Wie hierin verwendet, bedeutet ein „Calciumphosphat-Material" jedes synthetische Knochenersatzmaterial, umfassend Calciumphosphat als primären Bestandteil, d. h. dass es mindestens 90 Gew.-% aufweist, die Calcium und/oder Phosphat zuzuschreiben sind. Das Calciumphosphat-Material der vorliegenden Erfindung kann jedes biokompatible Calciumphosphat-Material, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, sein. Geeignete Calciumphosphat-Materialien können durch eines aus einer Vielzahl von Verfahren unter Verwendung jeglicher geeigneter Ausgangskomponenten hergestellt werden oder können im Handel erhältlich sein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Calciumphosphat-Material in einer Menge vorhanden, die im Bereich von etwa 10 Gew.-% bis etwa 99 Gew.-%, stärker bevorzugt von etwa 40 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% der festen stabförmigen osteogenen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung liegt. Bevorzugt wird das Calciumphosphat-Material oder der Träger in trockener, d. h. gepulverter Form, verwendet.
Die Formen von Calciumphosphat, die zur Anwendung in dieser Erfindung geeignet sind, schließen ohne Einschränkung amorphes apatitisches Calciumphosphat (ACP), schwachkristallines apatitisches Calciumphosphat (PCA), Hydroxyapatit (HA), Tricalciumphosphat und Fluorapatit ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Calciumphosphat-Material ein schwachkristalliner apatitischer Calciumphosphatfeststoff mit einem Calcium-zu-Phosphat-Verhältnis (Ca/P), das natürlich vorkommenden Knochenmineralien vergleichbar ist, stärker bevorzugt einem Calcium-zu-Phosphat-Verhältnis von weniger als etwa 1:1,5, am meisten bevorzugt etwa 1:1,4.
Geeignete PCA-Materialien können durch Vereinigen von PCA-Vorläufern, Hydratisieren mit einer begrenzten Menge an Wasser (so dass eine Paste oder ein Kitt gebildet wird), Formen in die Form eines zylindrischen Stabs und Härtenlassen des geformten Materials in ein PCA-Material, identifiziert werden. Wünschenswerte Vorläufer sind fähig, in einer feuchten Umgebung bei oder um Körpertemperatur in weniger als 5 Stunden und bevorzugt innerhalb von 10–30 Minuten zu härten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Calciumphosphatträger jedes Knochenersatzmaterial umfassen, das eine der vorstehenden Formen von Calciumphosphat als seinen primären Bestandteil enthält, d. h. dass es mindestens 90 Gew.-% aufweist, die Calcium und/oder Phosphat zuzuschreiben sind. Das Knochenersatzmaterial kann nur eine der vorstehenden Calciumphosphat-Formen umfassen, mit oder ohne zusätzliche Bestandteile; der Knochenersatz kann eine Kombination der vorstehenden Calciumphosphat-Formen umfassen, mit oder ohne zusätzliche Bestandteile. Zudem kann eine oder mehrere der vorstehend aufgeführten Calciumphosphat-Formen verwendet werden, um ein Calciumphosphat-Material herzustellen, das zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die Verfahren zur Herstellung derartiger Materialien sind auf dem Fachgebiet bekannt. Jedoch ist jedes Verfahren, das zum Erhalten von einem trockenen, d. h. gepulverten, Calciumphosphat-Material führt, geeignet.
Wie hierin verwendet bedeutet „amorph" ein Material mit signifikant amorphem Charakter. Signifikant amorpher Charakter bedeutet mehr als 75% an amorphem Gehalt, bevorzugt mehr als 90% an amorphem Gehalt, und wird durch ein breites Röntgendiffraktionsmuster ohne besondere Merkmale charakterisiert.
„Schwachkristallines apatitisches Calciumphosphat", „PCA-Calciumphosphat" und „PCA-Material" beschreiben, wie diese Begriffe hierin verwendet werden, ein synthetisches schwachkristallines apatitisches Calciumphosphat. Das schwachkristalline apatitische (PCA) Material ist nicht notwendigerweise auf eine einzige Calciumphosphatphase beschränkt, mit der Maßgabe, dass es das charakteristische Röntgendiffraktionsmuster (XRD) und Fourier-Transformations-Infrarotmuster (FTIR) aufweist. Ein PCA-Calciumphosphat weist ein im Wesentlichen gleiches XRD-Spektrum auf wie Knochen. Das XRD-Spektrum wird im Allgemeinen nur durch zwei breite Peaks im Bereich von 20–35 E charakterisiert, wobei einer bei 26 E zentriert und der andere bei 32 E zentriert ist. Das FTIR-Spektrum ist durch Peaks bei 563 cm^–1, 1034 cm^–1, 1638 cm^–1 und 3432 cm^–1 (±2 cm^–1) charakterisiert; scharfe Bandenschultern wurden bei 603 cm^–1 und 875 cm^–1 beobachtet, mit einem Dublett mit Maxima bei 1422 cm^–1 und 1457 cm^–1. PCA-Materialien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, sind in den U.S.-Patenten Nr. 5,650,176, 5,683,461 und 6,214,368 beschrieben, wobei jedes von diesen hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Geeignete Materialien werden ebenfalls in einer Gruppe von verwandten Anmeldungen beschrieben, die „Delivery Vehicle", „Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Form a Novel Bioceramic", „Orthopedic and Dental Ceramic Implants" und „Bioactive Ceramic Composites" betitelt wurden, wobei jedes von diesen am 16. Oktober 1997 eingereicht worden war und der ETEX-Corporation (Cambridge, MA) zugeschrieben wurde, wobei jedes hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist. Im Licht der Breite der Offenbarung in jedem der vorstehend aufgeführten Patentdokumente werden die Details der Herstellung geeigneter PCA-Materialien hier nicht weiter im Detail ausgeführt werden. Eine Zusammenfassung der PCA-Merkmale wird ausreichen. Das PCA-Material ist durch seine Bioresorptionsfähigkeit und seine minimale Kristallinität charakterisiert. Sein kristalliner Charakter ist im Wesentlichen der gleiche wie von natürlichem Knochen. Das PCA-Material ist auch biokompatibel und für den Wirt nicht nachteilig.
Kristalliner Hydroxyapatit (HA) wird zum Beispiel in den U.S.-Patenten Ref.-Nr. 33,221 und 33,161 beschrieben, welche beide hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Diese Patente lehren die Herstellung von Calciumphosphat-Remineralisations-Zusammensetzungen und von einem fein kristallinen, nicht keramischen, allmählich resorbierbaren Hydroxyapatit-Trägermaterial, das auf derselben Calciumphosphat-Zusammensetzung basiert. Ein ähnliches Calciumphosphatsystem, welches aus Tetracalciumphosphat (TTCP) und Monocalciumphosphat (MCP) oder seiner Monohydrat-Form (MCPM) besteht, wird in den U.S.-Patenten Nr. 5,035,212 und 5,129,905 beschrieben, wobei beide hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Zusätzliche kristalline HA-Materialien (üblicherweise als Dahllite bezeichnet) werden im U.S.-Patent Nr. 5,962,028 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
ADDITIVA
Additiva können in den osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Viele derartige Bindemittel, welche die Kohäsionskraft verbessern, und Exzipienten, welche die Freisetzung der Wirkstoffe stabilisieren und/oder modulieren, sind auf dem Fachgebiet des Formulierens bekannt. Geeignete Additiva schließen ohne Einschränkung pharmazeutisch verträgliche Salze, Polysaccharide, Peptide, Proteine, Aminosäuren, synthetische Polymere, natürliche Polymere und/oder oberflächenaktive Mittel ein. Nützliche Polymere schließen zum Beispiel solche ein, die in U.S.-Patent Nr. 5,171,579 beschrieben sind, dessen gesamte Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Bevorzugte Additiva schließen Cellulosematerialien wie Carboxymethylcellulose (CMC), Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) und Methylcellulose (MC), synthetische Polymere wie Polylactide und Poylethylenglykole, z. B. Polylactid/Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenglykol (PEG), Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer und Polyvinylalkohol (PVA) und Dextransulfat und Kombinationen davon ein. Andere nützliche Additiva schließen ohne Einschränkung Natriumalginat, Chitosan, Collagen, Gelatine, Hyaluronan und verschiedene Peptide, Proteine und Aminosäuren ein. Additiva, welche eine schäumende Wirkung aufweisen, sind gegenwärtig nicht zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Additiv in trockener Form oder in Pulverform verwendet, welches mit dem Wirkstoff (den Wirkstoffen), dem Träger und der wässrigen Flüssigkeit gemischt wird, um die injizierbare Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Additiv (sind die Additiva) in einer Menge vorhanden, die im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-%, stärker bevorzugt von etwa 20 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% der festen osteogenen Stab-Zusammensetzung liegt.
ZUSÄTZLICHE WIRKSTOFFE
Die injizierbaren osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch einen zusätzlichen Wirkstoff oder zusätzliche Wirkstoffe einschließen. Derartige zusätzliche Wirkstoffe können bevorzugt in trockener Form, obwohl hydratisierte Formen ebenso zur Anwendung geeignet sind, mit dem Wirkstoff, dem Träger und der wässrigen Flüssigkeit gemischt werden, um die injizierbaren osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung herzustellen. In einer anderen Ausführungsform können derartige Wirkstoffe auch mit den osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung co-verabreicht werden, entweder auf eine sozusagen sequenzielle Weise oder gleichzeitig (hierin nachstehend „Co-Verabreichungsschema"). Zusätzliche Wirkstoffe können hierin verwendet werden, um zusätzliche erwünschte Wirkungen zu erzielen oder sie können verwendet werden, um potenziellen unerwünschten Wirkungen wie Infektion, Entzündung oder transitorischer Resorption entgegenzuwirken.
Zum Beispiel zeigen jüngere Berichte, dass, obwohl viel über das osteogene Potenzial von TGF-β-Proteinen bekannt ist, die lokale Verabreichung bestimmter osteoinduktiver Mittel wie BMP-2 die transitorische osteoklastische Aktivität (lokale Bereiche der Knochenresorption) an der Stelle der Verabreichung stimuliert. Diese Reaktion, welche BMP-induzierter neuer Knochenbildung gelegentlich vorangeht, ist „transitorisches Resorptionsphänomen" genannt worden. Mittel, die dafür bekannt sind, die Knochenresorption zu hemmen, können deshalb eine wichtige Rolle in der Verzögerung oder Verringerung der anfänglichen Knochenresorption, die mit lokaler BMP-Verabreichung in Zusammenhang steht, spielen, ohne die anschließende Knochenbildung zu hemmen.
Deshalb wird in bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ein Knochenresorptionshemmer als zusätzlicher Wirkstoff verwendet, der in der injizierbaren osteogenen Zusammensetzung vorhanden ist oder der mit der injizierbaren osteogenen Zusammensetzung co-verabreicht wird, um der anfänglichen Knochenresorption, die mit der intraossären Abgabe eines Wirkstoffs wie BMP in Zusammenhang steht, vorzubeugen oder diese zu minimieren. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Hemmung der Knochenresorption" auf die Vorbeugung von Knochenverlust, insbesondere die Hemmung des Entfernens von bestehendem Knochen durch direkte oder indirekte Änderung der Osteoklastenbildung oder der Osteoklastenaktivität. Deshalb bezieht sich der Begriff „Knochenresorptionshemmer" wie hierin verwendet auf Mittel, welche dem Knochenverlust vorbeugen oder diesen durch direkte oder indirekte Änderung der Osteoklastenbildung oder Osteoklastenaktivität hemmen.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Knochenresorptionshemmer ein Biphosphonat. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Bisphosphonat" auf die verwandten Bisphosphonsäuren und Salze und verschiedene kristalline und amorphe Formen des Bisphosphonats. Klinisch wurde von der Bisphosphonat-Therapie gezeigt, dass sie die Indizes des Knochenumsatzes dramatisch verringert, die Knochenmineraldichte erhöht und in osteopenischen Frauen das Risiko einer Hüft- und Wirbelsäulenfraktur verringert (siehe zum Beispiel H. Fleisch, Bisphosphonates in Bone Disease, from the Laboratory to the Patient, 3. Auflage, Parthenon Publishing (1997), welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist).
Zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Biphosphonate schließen ohne Einschränkung Alendronat, Cimadronat, Clodronat, EB 1053, Etidronate, Ibandronat, Neridronat, Olpadronat, Pamidronat, Risedronat, Tiludronat, YH 529, Zoledronat und pharmazeutisch verträgliche Salze, Ester, Säuren und Gemische davon ein. Die Menge an Biphosphonat, und zwar die Menge eines jeden nützlichen Knochenresorptionshemmers, ist die Menge, die wirksam ist, dem transitorischen Knochenverlust, der gelegentlich mit der lokalen Verabreichung eines osteogenen Proteins wie BMP in Zusammenhang steht, durch direkte oder indirekte Änderung der Osteoklastenbildung oder Osteoklastenaktivität vorzubeugen oder diese zu verhindern (hierin nachstehend „wirksame Menge"). Die genaue Dosierung, die notwendig ist, wird von der Größe und der Natur des zu behandelnden Knochendefekts abhängig sein, ebenso wie die Menge des osteogenen Mittels, das abgegeben wird. Im Allgemeinen liegt die Menge des abzugebenden Biphosphonats bevorzugt in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 3000 mg, stärker bevorzugt von etwa 10 bis etwa 1000 mg und am meisten bevorzugt von etwa 10 bis etwa 500 mg pro Kubikzentimeter des Materials.
Wenn das Co-Verabreichungsschema der vorliegenden Erfindung angewendet wird, wird der Knochenresorptionshemmer typischerweise in einem geeigneten Träger abgegeben. Der Träger kann jeder pharmazeutisch verträgliche Träger sein, von denen eine breite Vielzahl bekannt und auf dem Fachgebiet leicht erhältlich ist (siehe zum Beispiel Martin, E. W., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., aktuelle Ausgabe), das hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen ist). Gegenwärtig bevorzugte Träger werden in feste Stäbe oder Pasten geformt, wie hierin an anderer Stelle beschrieben.
Im Co-Verabreichungsschema kann der Knochenresorptionshemmer sequenziell, entweder vor oder nach, oder gleichzeitig mit den injizierbaren festen Stab-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Zudem kann der Knochenresorptionshemmer lokal (intraossär) verabreicht werden, er kann jedoch an anderen parenteralen Stellen wie intramuskulär oder subkutan oder oral aufgenommen oder intravenös injiziert zur systemischen Abgabe angewendet werden. Bevorzugt wird der Knochenresorptionshemmer, z. B. ein Bisphosphonat, systemisch abgegeben, d. h. oral oder intravenös, entweder vor oder gleichzeitig mit der injizierbaren festen Stab-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Ferner kann der Knochenresorptionshemmer an die Stelle implantiert werden, die durch chirurgische Implantierung behandelt werden soll. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Bisphosphonate trotz ihres therapeutischen Nutzens im Gastrointestinaltrakt schlecht absorbiert werden, wenn sie oral aufgenommen werden. Um das Problem der schlechten Bioverfügbarkeit zu überwinden, ist die intravenöse Verabreichung angewendet worden; jedoch wird diese Modalität als teuer und unbequem aufgrund der Dauer und Häufigkeit der Dosierung angesehen. Die vorliegende Erfindung kann daher diese Nachteile überwinden, indem die Bisphosphonate in die injizierbaren osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingebaut werden und sie lokal direkt an der Stelle der gewünschten Wirkung abgegeben werden.
Die vorstehende Beschreibung, die sich auf die Verabreichung eines Knochenresorptionshemmers bezieht, betrifft im Allgemeinen die Verabreichung jedes zusätzlichen Wirkstoffs. Andere geeignete Wirkstoffe schließen ohne Einschränkung andere osteogene Proteine, Antibiotika, entzündungshemmende Mittel, Wachstumsfaktoren, Peptide, Proteine, Cytokine, Oligonucleotide, Antisense-Oligonucleotide, DNA und Polymere ein. Diese Verbindungen können bevorzugt in trockener Form durch Mischen derselben zugegeben werden, um die Paste in den Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung zu bilden.
VERABREICHUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung von Patienten bereitgestellt, die Knochendefekte aufzeigen. Wie hierin verwendet, schließt ein „Knochendefekt" einen osteoporotischen Knochen, einen osteopenischen Knochen, eine Knochenfraktur, einen Knorpeldefekt und jeden anderen mit Knochen oder Knorpel in Zusammenhang stehenden Zustand ein, der durch stimuliertes Knochen- oder Knorpelwachstum verbessert oder beseitigt werden würde. Deshalb ist eine fünfte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf die Verwendung eines osteogenen Proteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen gemäß der ersten, vorstehend beschriebenen Ausführungsform gerichtet, wobei die Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe der osteogenen Proteine zur Behandlung eines Säugetiers mit einem Knochendefekt vorgesehen ist und wobei die Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen an die Stelle des Knochendefekts abgegeben werden soll.
Eine ähnliche sechste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf eine Verwendung eines osteogenen Proteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von ostogenen Proteinen gemäß der ersten, vorstehend beschriebenen Ausführungsform gerichtet, wobei die Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen zur Behandlung eines Säugetiers mit einem Knochendefekt vorgesehen ist und wobei die Behandlung die Schritte umfasst:

(a) Verabreichen einer wirksamen Menge der Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen an die Stelle des Knochendefekts; und
(b) Verabreichen einer wirksamen Menge eines Knochenresorptionshemmers an die Stelle des Knochendefekts.

Der Knochenresorptionshemmer kann auch an die Stelle des Knochendefekts verabreicht werden, er kann jedoch auch über etwas andere Wege, d. h. parenteral, durch chirurgische Implantation, oral oder intravenös verabreicht werden. Zudem kann die Verabreichung des Knochenresorptionshemmers vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung der injizierbaren Stab-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geschehen.
Am häufigsten werden die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Patienten bereitgestellt, die Zeichen von Osteoporose oder osteopenischen Zuständen, einschließlich osteoporotischen Knochenläsionen, aufzeigen. Die Identifizierung von derartigen Patienten kann durch Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Derartige Verfahren stellen dem Krankenhausarzt Informationen über die Lokalisation und Schwere der osteoporotischen oder osteopenischen Knochenläsionen bereit. Zusätzlich zur Lokalisation der Läsion (der Läsionen), der (die) behandelt werden sollen, kann der Krankenhausarzt diese Information verwenden, um das geeignete Verabreichungsverfahren und die Dosis des osteoinduktiven Mittels für den Patienten auszuwählen. Nützliche Diagnoseverfahren schließen das Messen der Knochenmasse/-dichte ein unter Verwendung der Zwei-Spektren-Röntgen-Absorptiometrie (DEXA), Kilgus et al., J. Bone & Joint Surgery, Bd. 75 B, S. 279–287 (1992); Markel et al., Acta Orthop. Scand., Bd. 61, S. 487–498 (1990); und der quantitativen Computertomographie (QCT), Laval Jeantet et al., J. Comput. Assist. Tomogr., Bd. 17, S. 915–921 (1993); Markel, Calcif. Tissue Int., Bd. 49, S. 427–432 (1991); der Single-Photon-Absorptiometrie, Markel et al., Calcif. Tissue Int., Bd. 48, S. 392–399 (1991); der Ultraschalltransmissionsgeschwindigkeit (UTG); Heaney et al., JAMA, Bd. 261, S. 2986–2990 (1989); Langton et al., Clin. Phys. Physiol. Meas. Bd. 11, S. 243–249 (1990); und der Röntgenuntersuchung, Gluer et al., J. Bone Min. Res., Bd. 9, S. 671–677 (1994). Andere Verfahren zur Identifikation von Patienten mit drohender Knochenfraktur schließen die Bewertung altersbedingter Faktoren wie die Kenntnis ebenso wie das frühere Auftreten von mit Osteoporose in Zusammenhang stehenden Frakturen ein. Porter et al., BMJ, Bd. 301, S. 638–641 (1990); Hui et al., J. Clin. Invest., Bd. 81, S. 1804–1809 (1988). Die vorstehenden Veröffentlichungen sind hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Die besonderen Dosierungsregime werden durch die angestrebte klinische Indikation ebenso wie durch verschiedene Patientenvariablen (z. B. Gewicht, Alter, Geschlecht) und die klinische Präsentation (z. B. Umfang der Verletzung, Stelle der Verletzung, etc.) bestimmt.
Die injizierbaren osteogenen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf jede klinisch verträgliche Weise der Injektion verabreicht werden. Eine Anzahl von im Handel erhältlichen Spritzen kann zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung und zur Verabreichung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Derartige Spritzen schließen ohne Einschränkung die Calasept^®-Spritze (JS Dental Manufacturing, Ridgefield CT); die Henke-Ject^® Aspirationsspritze und die Hypo^® Dental-Spritzen/-Nadeln (Smith & Nephew MPL, Franklin Park, IL); intraossäre Nadeln von MPL, Inc., Chicago IL; und Luer-Lok^® Spritzen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ein. Jede Spritze, die fähig ist, einen injizierbaren Stab aufzunehmen und abzugeben und/oder die Extrusion mit einem Obturator zu ermöglicht, ist zur Anwendung geeignet.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden die festen stabförmigen Zusammensetzungen unter Verwendung einer Injektionsnadel von geeigneter Größe und Art, die perkutan oder chirurgisch in den ausgewählten anatomischen Ort eingebracht wurde, intraossär abgegeben. Das perkutane Einbringen der Injektionsnadel kann unter Anwendung manueller Palpation bekannter anatomischer Referenzpunkte mit oder ohne Anwendung von Fluoroskopie zur visuellen Einbringung durchgeführt werden. Fluoroskopie kann auch in Verbindung mit einer chirurgischen Implantierung vor und/oder gleichzeitig mit dem Einbringen der Injektionsnadel angewendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird zuerst ein Führungsdraht (üblicherweise als "k-Draht" bezeichnet) perkutan in den gewünschten anatomischen Ort eingeführt, um als Führung für die Injektionsnadel zu dienen. Die Injektionsnadel wird über den Führungsdraht eingeführt, der anschließend entfernt wird, wobei nur die Injektionsnadel an der Stelle zurückgelassen wird. Die feste stabförmige Zusammensetzung wird dann in das Auslassende der Injektionsnadel eingeführt. Nach dem Beladen der Zusammensetzung wird ein zweiter Führungsdraht in die Nadel eingeführt, der verwendet wird, um die feste Zusammensetzung zur Spitze der Nadel zu befördern. Die Nadel wird dann entfernt, wobei der Führungsdraht zurückgelassen wird, um die Zusammensetzung innerhalb des Knochens am gewünschten Ort zu verankern. Schließlich wird der Führungsdraht entfernt, wobei er die feste Zusammensetzung an Ort und Stelle zurückläßt. In einer anderen Ausführungsform wird die feste stabförmige Zusammensetzung der Erfindung in den Zylinder der Nadel vorher eingebracht. Nach dem Einbringen an den gewünschten anatomischen Ort wird der Kolben der Spritze bis zum Zylinder der Nadel vorgeschoben, während die Vorrichtung zurückgezogen wird, wobei die feste stabförmige Zusammensetzung an dem gewünschten Ort zurückgelassen wird.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen, dass therapeutisch wirksame Mengen von osteogenem Protein an den Ort der Verletzung abgegeben werden, wo die Knorpel- und/oder Knochenbildung erwünscht ist. Die Formulierungen können als Ersatz für ein autologes Knochentransplantat bei frischen und nicht heilenden Frakturen, Wirbelfusionen und der Reparatur von Knochendefekten auf orthopädischem Gebiet, bei cranio-/maxillofacialen Rekonstruktionen, bei Osteomyelitis zur Knochenregeneration und auf dentalem Gebiet zur Erhöhung des Alveolarkamms und Periodontaldefekten und Zahnextraktionshöhlen verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung veranschaulichend und auf keine Weise einschränkend. Modifikationen, Variationen und geringfügige Verbesserungen werden in Betracht gezogen und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
BEISPIELE
Alle in diesen Beispielen verwendeten Materialien sind von pharmazeutischer Qualität. Das Calciumphosphat-Material war das im Handel erhältliche Knochenersatzmaterial (nachstehend "α-BSM"), das unter dem Handelnamen CEREDEX^TM von der Etex Corporation, 38 Sydney Street, Cambridge, MA 02139, verkauft wird und in den U.S.-Patenten Nr. 5,683,461, 6,117,456 und 6,214,368 und in PCT WO 98/16209 im Detail beschrieben ist. Das osteogene Protein, das als ein Wirkstoff verwendet wurde, war rekombinantes humanes knochenmorphogenetisches Protein-2 (rhBMP-2). Die Herstellung und Beschreibung von rhBMP-2 ist gut bekannt. Wang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., Bd. 87, S. 2220–2224 (1990).
Beispiel 1 – Formulierung
Es wurden verschiedene injizierbare feste Stäbe (A–E) aus α-BSM, rhBMP-2 und einem von Carboxymethylcellulose (CMC), Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Dextransulfat hergestellt. Trockene Pulver jedes Bestandteils wurden in einem sterilen Mischkolben vereinigt und zu einem steifen Kitt durch die Zugabe eines wässrigen Puffers auf Glycinbasis mit einem pH-Wert von etwa 4,5 und umfassend 5 mmol L-Glutaminsäure, 2,5% Glycin, 0,5% Saccharose, 5 mmol NaCl und 0,01% Polysorbat 80 in einem bestimmten Flüssigkeit (ml) zu Pulver (g) Verhältnis (L/P) rekonstituiert und für 1 Minute geknetet, um eine Paste zu bilden. Die Mengen eines jeden Bestandteils wurden ebenso wie die besonderen L/P-Verhältnisse, die verwendet wurden, in Tabelle 1 nachstehend dargelegt.
Tabelle 1.
Jede Paste wurde in eine Spritze gegeben und extrudiert, um zylindrische Stäbe mit einem Durchmesser von etwa 1 mm und einer Länge von etwa 5 cm zu bilden. Diese 5-cm-Stäbe wurden dann für das nachstehende Testen in die gewünschten Längen geschnitten.
Nach dem Formen wurden die Stäbe unter simulierten in-vivo-Bedingungen, d. h. einem 37°C Inkubator, über Nacht zu einer festen Masse gehärtet. Der Härtungsprozess könnte um mehrere Stunden verzögert werden, indem man die Stäbe bei einer kühleren Temperatur, d. h. etwa 4°C, lagert.
Die theoretische rhBMP-2-Dosis von jedem der Stäbe A–E betrug 150 Mikrogramm rhBMP-2 pro Milligramm Stab. Alle Stäbe erschienen glatt, dicht, kohäsiv und nicht spröde und waren durch eine Nadel Nr. 16 injizierbar.
Beispiel 2 – In-Vitro-Beschreibung
Es wurde eine Korrelation zwischen Additivgehalt und Teilchenbildung beobachtet. Unter Eintauchen für 14 Tage in den wässrigen Puffer auf Glycinbasis, der in Beispiel 1 beschrieben wurde, dispergierten die Stäbe, die einen höheren prozentualen Additivgehalt enthielten (40% CMC, 40% PVP beziehungsweise 40% Dextransulfat, d. h. die Stäbe C–E), schneller in kleinere Teilchen, d. h. innerhalb 1 Tages, als die mit mittlerem (29% CMC, d. h. Stab B) und geringem (17% CMC, d. h. Stab A) Additivgehalt. Die Stäbe, die geringe Additivgehalte (17% CMC, d. h. Stab A) enthielten, behielten ihre stabförmige Struktur viel länger bei, d. h. in der Größenordnung von Tagen bis Wochen, als ihre Gegenspieler mit höheren CMC.
Zudem wurde die In-vitro-Freisetzungskinetik von rhBMP-2 aus α-BSM-Stäben, die entweder 17% (Stab A), 29% (Stab B) oder 40% (Stab C) CMC enthielten, unter Verwendung von 125I-rhBMP-2 als Indikatorsubstanz durchgeführt. Ähnlich den groben Beobachtungen setzten Stäbe, die einen höheren prozentualen Gehalt an CMC enthielten, rhBMP-2 schneller frei als solche mit geringerem prozentualen CMC-Gehalt, wie in 1 gezeigt.
Beispiel 3 – Biokompatibilitäts- und Wirksamkeitsstudie an der Ratte
Injizierbare stabförmige Zusammensetzungen auf Calciumphosphatbasis (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) wurden an einem Rattenmodell auf Biokompatibilität und Wirksamkeit hin untersucht, sowohl intraossär als auch ektopisch.
Defekte des intraossären Kerns wurden chirurgisch an den distalen Oberschenkelknochen von sechs männlichen CD-Ratten gebildet. Die Ratten wurden in zwei Gruppen (A und B) von drei Tieren geteilt. Eine Extremität jeder Ratte erhielt einen 2-mm-Segment-Teststab (Calciumphosphat/rhBMP-2/Exzipient), während die kontralaterale Extremität einen 2-mm-Segment-Kontrollstab (Calciumphosphat/Exzipient) erhielt. Die Ratten von Gruppe A erhielten Stab A (68/17/15% (Gew./Gew.) ACP/CMC/rhBMP-2) aus Beispiel 1 als Teststab, während die Ratten von Gruppe B Stab B (56/29/15% (Gew./Gew.) ACP/CMC/rhBMP-2) vom Beispiel 1 als Teststab erhielten. Zudem wurde ein 10-mm-Stab subkutan lateral zur Mittellinie der ventralen Thoraxregion implantiert, wobei eine Seite einen Teststab erhielt und die andere Seite einen Kontrollstab erhielt. Hier erhielten die Ratten der Gruppe A wieder Stab A (68/17/15% (Gew./Gew.) ACP/CMC/rhBMP-2) von Beispiel 1 als Teststab, während die Ratten der Gruppe B Stab B (56/29/15% (Gew./Gew.) ACP/CMC/rhBMP-2) von Beispiel 1 als Teststab erhielten.
Die Tiere wurden nach 2 Wochen zu Erfolgsbewertungen bestehend aus Faxitron-Röntgenbildern und Histomorphometrie geopfert. Die Röntgenbilder und Histologie der 2-wöchigen distalen Oberschenkelexplantate zeigten eine insgesamt erhöhte Bildung von Knochenkallus in der mit rhBMP-2 behandelten Seite, verglichen mit dem Placebo. Insbesondere bildeten die einen höheren CMC-Gehalt enthaltenden Stäbe (B) mittlere bis große Knochenkallusse verglichen mit den einen geringeren CMC-Gehalt enthaltenden Stäben (A), die Kallusse von kleiner bis mittlerer Größe bildeten. Die Röntgenbilder und Histologie der subkutanen Implantate zeigten auch Knochenbildung in der mit rhBMP-2 behandelten Seite verglichen mit dem Placebo. Insbesondere bildeten die einen höheren CMC-Gehalt enthaltenden Stäbe (B) eine robustere ektopische Knochenreaktion verglichen mit den geringere CMC-Gehalte enthaltenden Stäben (A). Es wurde eine gute Biokompatibilität in allen Gruppen ohne Entzündungsreaktion auf die Implantate beobachtet.
Beispiel 4 – Intraossäre lokale Biodistributions-Studie am Kaninchen
Die Stäbe A–D aus Beispiel 1 wurden perkutan in die intraossären Räume des distalen Kaninchen-Oberschenkelknochens (n = 4 Stellen pro Gruppe) unter Verwendung eines Katheders Nr. 14 mit einer Nadel Nr. 16 injiziert. Insbesondere wurden 10-mm-Stäbe A–D, die etwa μCi 125I-rhBMP-2 enthielten, verwendet. Die Menge an Radioaktivität in den synthetischen Stäben wurde vor der Injektion unter Verwendung eines Capintec-Dosiskalibrators gemessen. Die lokale rhBMP-2-Retention wurde über 4 Wochen unter Verwendung von Gamma-Zintigraphie aufgezeichnet. Die lokalen in-vivo-Biodistributionsdaten weisen auf eine anhaltende Freisetzung von rhBMP-2 aus den Stäben hin und darauf, dass Stäbe, die einen höheren prozentualen Gehalt an Additiva enthalten, eine schnellere in-vivo-Freisetzung zeigen als ihre einen geringeren prozentualen Gehalt an Additiva enthaltenden Gegenspieler, wie in 2 gezeigt.
Beispiel 5 – Formulierung (Referenzbeispiel)
Es wurden härtbare Pasten, die entweder 1 mg rhBMP-2 pro ml Paste oder 4,5 mg rhBMP-2 pro ml Paste enthielten, durch Zugeben von 2 ml der entsprechend konzentrierten Lösungen von rhBMP-2 in wässrigem Puffer auf Glycinbasis von Beispiel 1 zu 2,5 g α-BSM formuliert. Die Gemische wurden in sterilen Kolben für 1 Minute geknetet, um härtbare Pasten zu bilden.
Beispiel 6 – Javaneraffen – Intraossäre Injektion der Paste (Referenzbeispiel)
Die 1 mg pro ml und 4,5 mg pro ml härtbaren Pasten aus Beispiel 5 wurden aus dem sterilen Kolben unter Verwendung einer 3-ml-Spritze, die mit einer Nadel Nr. 18 versehen worden war, extrahiert und dann unter fluoroskopischer Kontrolle in verschiedene intraossäre Stellen der Javaneraffen injiziert. Die Stellen schlossen den distalen Oberschenkelknochen, den proximalen Oberschenkelknochen, die distale Speiche, die proximale Tibia ein. Nach einem Monat wurde signifikant neuer Knochen an den lokalen Stellen beobachtet, wo das rhBMP-2 injiziert worden war.
Während die Erfindung anhand von bevorzugten Ausführungsformen und speziellen Beispielen beschrieben wurde, wird der Fachmann durch routinemäßiges Experimentieren erkennen, dass verschiedene Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne von Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen. Deshalb sollte die Erfindung als durch die vorstehende detaillierte Beschreibung nicht eingeschränkt verstanden werden, jedoch als durch die anhängenden Ansprüche und ihre Äquivalente definiert.

Claims

Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen, umfassend: ein osteogenes Protein; und ein Calciumphosphat-Material, wobei die Zusammensetzung in der Form eines festen Stabs vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das osteogene Protein aus Mitgliedern der Familie der knochenmorphogenetischen Proteine (BMP) ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das osteogene Protein aus BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13 und MP52 ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das osteogene Protein BMP-2 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das osteogene Protein BMP-12 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das osteogene Protein BMP-13 ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das osteogene Protein MP52 ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das osteogene Protein in einer Menge im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das osteogene Protein in einer Menge im Bereich von etwa 15 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend einen Knochenresorptionshemmer.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei der Knochenresorptionshemmer ein Bisphosphonat ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Bisphosphonat aus Alendronat, Cimadronat, Clodronat, EB 1053, Etidronaten, Ibandronat, Neridronat, Olpadronat, Pamidronat, Risedronat, Tiludronat, YH 529, Zoledronat, und pharmazeutisch verträglichen Salzen, Estern, Säuren, und Gemischen davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Calciumphosphat-Material ein Material umfasst, das aus amorphem apatitischem Calciumphosphat, schwachkristallinem apatitischem Calciumphosphat, Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat, Fluorapatit und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Calciumphosphat-Material schwachkristallines apatitisches Calciumphosphat umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das schwachkristalline apatitische Calciumphosphat ein Verhältnis von Calcium zu Phosphat von weniger als 1:1,5 aufweist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das schwachkristalline apatitische Calciumphosphat ein Verhältnis von Calcium zu Phosphat von etwa 1:1,4 aufweist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Calciumphosphat-Material in einer Menge im Bereich von etwa 10 Gew.-% bis etwa 99 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Calciumphosphat-Material in einer Menge im Bereich von etwa 40 Gew.-% bis etwa 60 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend ein Additiv, das aus pharmazeutisch verträglichen Salzen, Polysacchariden, Peptiden, Proteinen, Aminosäuren, synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren, grenzflächenaktiven Mitteln, und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das Additiv aus Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose, Polylactid, Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Polyoxyethylenoxid, Carboxyvinylpolymer, Polyvinylalkohol, Dextransulfat und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Additiv in einer Menge im Bereich von etwa 1 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Additiv in einer Menge im Bereich von etwa 20 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% der Zusammensetzung vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Stab zylindrisch ist und ein Durchmesser des zylindrischen Stabs zwischen etwa 0,1 mm und 3,0 mm liegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei die Länge des Stabs zwischen etwa 1,0 mm und 5,0 cm liegt.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Mischen einer trockenen Form des osteogenen Proteins mit einer trockenen Form des Calciumphosphat-Materials, um ein trockenes Gemisch herzustellen; (b) Rekonstituieren des trockenen Gemischs durch Zugeben eines wässrigen Puffers, um eine Paste zu bilden; (c) Formen der Paste, um eine stabförmige Zusammensetzung zu bilden; und (d) Trocknen der stabförmigen Zusammensetzung aus Schritt (c), um eine stabförmige Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der wässrige Puffer aus Phosphat-gepufferter Salzlösung, Salzlösung, Puffern auf Glycinbasis und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Verhältnis von wässrigem Puffer zu trockenem Gemisch im Bereich von etwa 0,5:1 bis etwa 2:1 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das Formen unter Verwendung eines Verfahrens durchgeführt wird, das aus Formen, Extrudieren, Pressen, Bohren und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, ferner umfassend einen Schritt des Schneidens der stabförmigen Zusammensetzung vor oder nach Schritt (d).
Verwendung eines osteogenen Proteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen wie in einem der Ansprüche 1 bis 24 definiert, wobei die Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen für die Behandlung eines Säugetiers mit einem Knochendefekt ist, und wobei die Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen an die Stelle des Knochendefekts zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Knochendefekt osteoporöser Knochen ist.
Verwendung eines osteogenen Proteins zur Herstellung einer Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen wie in einem der Ansprüche 1 bis 24 definiert, wobei die Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen für die Behandlung eines Säugetiers mit einem Knochendefekt ist, und wobei die Behandlung die Schritte umfasst: (a) Verabreichen einer wirksamen Menge der Zusammensetzung zur injizierbaren Abgabe von osteogenen Proteinen an die Stelle des Knochendefekts; und (b) Verabreichen einer wirksamen Menge eines Knochenresorptionshemmers an die Stelle des Knochendefekts.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei Schritt (a) vor Schritt (b) durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei Schritt (b) vor Schritt (a) durchgeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei Schritt (a) und Schritt (b) simultan durchgeführt werden.