DE602004006282T2

DE602004006282T2 - Verfahren und vorrichtung zur adhäsiven steuerung interner zellorganisation

Info

Publication number: DE602004006282T2
Application number: DE602004006282T
Authority: DE
Inventors: Michel Bornens; Manuel Thery; Matthieu Piel
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Curie
Priority date: 2003-09-12
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2024-09-11
Also published as: US20070042483A1; JP2007504818A; ATE361357T1; CA2538440A1; EP1664266B1; DE602004006282D1; CA2538440C; EP1664266A1; US7955838B2; EP1514920A1; WO2005026313A1; JP4689609B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Anhaften von Zellen in einer spezifischen und vorher bestimmten Position mit einer Anhaftsteuerung der inneren Zellorganisation, sowie Verfahren zum Herstellen solcher Vorrichtungen, Verfahren zum Überprüfen von Modifikationen von Zellform und globaler innerer Zellorganisation wie z.B. die Verteilung von zellulären Kompartimenten, Centrosom-Zentrierung, Spindelorientierung, innere Kompartimentbildung und innere Transporte, Verfahren zum Screenen von Verbindungen von Interesse, welche spezifische Zellfunktionen verstärken oder inhibieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das High throughput zellbasierte Phenotyp-Screenen wird notwendig, um Vorteile von der Flut von Daten, erhalten aus systematischem Genomsequenzieren zu ziehen. Genomweites gene silencing durch siRNA ist nun möglich für kultivierte Zellen. Alternativ würde man gerne schnell geologisch aktive Verbindungen aus Wirksubstanzbibliotheken identifizieren, die in der Lage sind spezifische Zellfunktionen zu verstärken oder zu inhibieren. Das Ziel ist es folglich Phenotypen-Analysen mit kultivierten Zellen mit einem automatischen Werkzeug durchzuführen.
High throughput-Verfahren werden bereits lange verwendet um quantitative Dosierungen mit bekannten molekularen Pfaden durchzuführen. Diese Verfahren können nicht verwendet werden wenn man neue Gene identifizieren will, welche in komplexe Zelleigenschaften wie z.B. Proteintransport, Adhäsion, Migration, Teilung oder Apoptose identifizieren will oder die Fähigkeit einer neuen Substanz überprüfen will, mit diesen Mechanismen wechselzuwirken.
Die Herausforderung besteht heutzutage darin, die Genauigkeit der modernen Zellbiologie-Analyse mit einer kleinen Anzahl von Zellen auf das Potenzial von high throughputautomatisierten Verfahren mit einer großen Anzahl von Zellen zu korrelieren. Antworten auf diese Herausforderungen sind nicht zahlreich, da es verschiedene Schwierigkeiten gibt:

– Zunächst kann eine Zellpopulation auf dem Boden von Wells eine Verteilung aufweisen, die nicht vorhergesagt werden kann. Dies macht die Verwendung von Objektiven mit kleiner Vergrößerung oder eine automatisierte, jedoch langwierige Scann-Einrichtung notwendig.
– Zum Zweiten ist die Zellform für jede Zelle zur nächsten unterschiedlich und dieser Parameter kann nicht ignoriert werden, egal welcher Phenotyp analysiert wird oder welche Quantifikation auf einer Zellbasis durchgeführt wird (intrazelluläre Lokalisation, Anzahl und Größe von partikulären Organellen, Molekülsignale).
– Zum Dritten sind die intrazelluläre Verteilung von Zellkompartimenten und die globale Zellorganisation auch variabel wenn man eine Zelle zur nächsten betrachtet. Dies ist besonders erschwerend. Es verhindert jegliche Art einer präzisen Analyse der einheitlichen Verteilung von intrazellulären Kompartimenten oder der Etablierung und Aufrechterhaltung von Zellpolarität während der Zellteilung oder Zellwanderung.
– Die Verteilung der Zellpopulation wie auch die Größe und die innere Organisation von individuellen Zellen hängen alle von der Zellmigrations-Aktivität ab. Die Beweglichkeit kann stark variieren, abhängend vom Zelltyp, ist jedoch stets ein signifikanter Parameter.

Um diese Schwierigkeiten überkommen zu können, wäre es notwendig, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches verhindert, dass Zellen wandern und jede Zelle in der gleichen Art und Weise mit Blick auf einen externen Standard orientiert. Eine Antwort wurde bereitgestellt durch Mikro-Mustergeben, welches eine präzise Steuerung von Zellform und Zellposition durch Beeinflussung der Actin-Antwort ermöglicht. Viele Möglichkeiten des Mikro-Musterns wurden untersucht (Whitesides und Ingber; US 6,368,838 ; WO 01/70389 ; WO 02/86452 ; WO 02/22787 ), jedoch keine davon beeinflusst die gesamte funktionelle und strukturelle Polarität in einer reproduzierbaren Art und Weise, welche kompatibel ist mit einem präzisen Screening von inneren Zelleigenschaften.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung präsentieren die Erfinder ein effizientes und billiges Verfahren, welches das Screenen von Genen ermöglicht oder von Verbindungs-Aktivitäten auf Zellfunktionen, die Polarität, Beweglichkeit und Teilung wie auch innere Kompartimentierung und Transport einschließen. Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht in einer präzisen Steuerung der fokalen Anhaftverteilung. Diese Transmembran-Komplexe Wechselwirken mit dem Cytoskelett, was stark die Zellkompartimentierung steuert. Die akute Steuerung der inneren Verteilung einer jeden Organelle wird möglich durch die Verwendung eines anisotropen Klebemusters, wie z.B. eines konkaven Klebemusters, welches eine Nichtklebefläche einschließt. Diese Steuerung kann auch möglich werden durch die Verwendung eines Klebemusters, was zu einer Längsstreckung der Zelle führt.
Folglich betrifft die Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zum Anheften von tierischen oder menschlichen Zellen in einer spezifischen und vorbestimmten Position mit einer gesteuerten Polarisation der inneren Zellorganisation, wodurch die Polarisation der Zellmaschinerie induziert wird. Die Vorrichtung umfasst eine Platte, welche eine Oberfläche definiert und zumindest ein anisotropes Klebemuster auf besagter Zelloberfläche, wie z.B. ein konkaves Anhaftmuster für eine individuelle Zelle, insbesondere für nur eine einzelne Zelle, welche isoliert wird durch cytophobe Regionen, an welche die Zellen nicht anhaften, benachbart zu besagtem Klebemuster.
Solche Vorrichtungen sind bedeutsam einem breiten Array von zellulär biologischen Anwendungen, einschließend Zellkultivierung, Cytometrie, Toxikologie, Wirksubstanzscreening, Diagnose sowie Immobilisierung von Zellen. Sie ermöglichen High- oder Medium throughput-Screening-Assays und/oder zugleich individuelle Assays.
Folglich betrifft die Erfindung Verfahren zum Herstellen solcher Vorrichtungen, Verfahren zum Kultivieren von Zellen, Verfahren zum Immobilisieren von Zellen auf einer Oberfläche, Verfahren zum Steuern der Zellform sowie der globalen inneren Zellorganisation, Verfahren zum Überprüfen der Zellform und der globalen inneren Zellorganisation, wie z.B. die Verteilung von zellulären Kompartimenten, Centrosom-Zentrierung, Spindelorientierung, innere Kompartimentierung sowie inneren Transport, Verfahren zum Screenen von Verbindungen von Interesse, welche die Zellform, die globale Organisation und/oder Funktion modifizieren, beispielsweise verstärken oder inhibieren.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 Automatisierte numerische Detektion der Anaphase und Spindelorientierung für eine Zelle, plattiert auf einem L-förmigen Klebemuster.
1A Rahmen von einer 3 Minuten-Zeitverzögerung in Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fach Objektiv. Die Zahlen korrespondieren mit den jenigen auf der Zeitkurve in 1C. Das mitotische Zellzentrum angegeben im Rahmen 4 und die Anaphasen-Spindelorientierung, gezeigt im Rahmen 5 werden aus der Analyse b dargestellt.
1B Wavelet-Segmentierung der Bilder von a. Ellipsoidale Fits sind schwarz dargestellt. Schwarz unterbrochene Linien korrespondieren mit der Haupt- und der Nebenachse der Ellipse. Das mitotische Zellzentrum wird im Rahmen 4 gemessen, sechs Minuten vor der Anaphase im Rahmen 5. Die Anaphasen-Orientierung ist diejenige der Ellipsen-Hauptachse im Rahmen 5 mit Blick auf die vertikale Referenz des Musters, orientiert wie in 2 gezeigt.
1C Formfaktor versus Zeit. Der Formfaktor ist das Verhältnis der kurzen zur langen Achse, definiert in b. Anaphasen-Elongation im Rahmen 5 wird automatisch nachgewiesen durch die Formfaktor-Verschiebung von über 0,9 bis weniger als 0,6. Der Balken = 20 μm.
2 Verteilung der mitotischen Zellpositionen und der Spindelorientierungen von lebenden Zellen, plattiert auf verschiedenen Klebemustern. Erste und zweite Spalten: mitotische Zellpositionen und Spindelorientierungen, gemessen wie in 1 beschrieben. Koordinaten der runden Zellzentrumpositionen werden in Mikrometer dargestellt und jeder Balken für die mitotische Spindelorientierung repräsentiert 10 Grad. Dritte Spalte: Beispiele von Zellen fixiert in der Metaphase. HeLa-Zellen, welche Centrin-1 GFP exprimieren, platziert auf Fibronectin-Mikro-Mustern, fixiert in Metaphase und angefärbt für Actin (Mitte der z-Ausdehnung) mit Phaloidin-FITC und für DNA mit DAPI. Vierte Spalte: gleiche Zellen, beobachtet nach Actin-Färbung mit Phaloidin-FITC am Boden der z-Ausdehnung. Man beachte die Korrelation zwischen den Spindelpolpositionierungen und den zurückziehenden Fasern, welche auf dem runden Zellkörper ankern.
2A–2C Vollständig klebende Mikro-Muster von Fibronectin;
2D–2H Periphere Klebe-Mikro-Muster;
2I [Kreuz]Mikro-Muster mit den gleichen Symmetrien wie in 2F. Skala: Zellbilder und Zelipositionsdarstellungen liegen auf der gleichen Skala: die Gitterweite ist 4 Mikrometer.
3 Fibronectin-Mikro-Muster modulieren die Größe und Orientierung des Actin-Cytoskeletts und der fokalen Anhaftungen. HeLa-Zellen, welche Centrin-1 GFP exprimieren wurden fixiert und angefärbt in G3 (1 Stunde vor dem Runden der Zelle). Immunolabelling von Vinculin, und Phaloidin-FITC färben von filamentösem Actin auf Zellen, plattiert auf den korrespondierenden Mustern. Als eine Regel sind die Actin-Bündel entlang nicht klebenden Grenzen und die korrespondierenden fokalen Anhaftunqgen dicker und größer als diejenigen entlang der Klebegrenzen. Eine 4x-Vergrößerung der rechten unteren Ecke des untergetauchten Bildes wird in der rechten Spalte dargestellt. Man beachte die Anhaftmuster und die fokale Anhaftverteilung sowie die Actin-Organisation teilen die gleichen Symmetrien und Balancen. 3A–I gleiche Anhaftbedingungen wie in 4 beschrieben. Balken = 5 μm.
4 Centrosom-Trennung während der mitotischen Spindelausbildung.
4A–B Hervorstehende Zellfläche (schwarz) und hervorstehende Intercentrosom-Abstand (grau) gegen die Zeit für Zellen, plattiert auf mit homogenem Fibronectin überzogenem Glas-Deckgläschen (4A, n = 24) oder auf L-förmigen Mikro-Mustern (4B, n = 14). Die Zellfläche wird normalisiert hinsichtlich der ursprünglichen Fläche. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Die Zeit 0 korrespondiert mit dem Anfang der Zellreaktion. Die Centrosom-Abtrennung war eher unprognostizierbar geht jedoch häufig der Retraktion der Zelle auf unbegrenztem Substrat voran, wohingegen sie synchron mit der Retraktion der Zelle auf Mikro-Mustern war.
4C Ein Beispiel von Zeitverlaufsaufnahmen von Centrin-1 GFP während der Mitose auf L-Form.
4D Ein Beispiel von Centrosom-Abtrennung nach NZ-Mitose-Arrest. Die weißen Kreuze korrespondieren mit den Centrosomen.
4E Verteilung von Spindelorientierungen nach NZ-Freisetzung. Jeder Balken repräsentiert 30°. Es sollte festgehalten werden, dass die Spindeln immer noch in der Lage sind, sich in erster Linie in runden Zellkörperchen zu orientieren wie in den Kontrollzellen. Balken = 10 μm.
5 Beispiele von Anhaftmustern. Die schwarzen Flächen sind indikativ für die Klebefläche, wohingegen die weißen indikativ für die Nichtklebefläche sind.
5A Symmetrische L-Formmuster, die gut geeignet sind, um die Spindelachsenorientierung zu steuern.
5B Nichtsymmetrische Formen, geeignet, um die Centrosom-Golgi-Apparat-Organelle auf einer Seite des Kerns zu platzieren.
6 L929-n auf unterschiedlichen L-förmigen Mikro-Mustern.
6A Vinculin-Verteilung auf L-förmigen Mikro-Mustern.
6C Actin-Verteilung auf L-förmigen Mikro-Mustern.
6E Fibronectin mikrogemustert.
6B und 6D Vinculin- und Actin-Verteilung jeweils von Kontrollzellen, kultiviert auf einer unbegrenzten Anhaftoberfläche.
7 MDCK-Zellen auf verschiedenen L-förmigen Mikro-Mustern.
7A Vinculin-Verteilung auf L-förmigen Mikro-Mustern.
7C Actin-Verteilung auf L-förmigen Mikro-Mustern.
7E Fibronectin mikrogemustert.
7B und 7D Vinculin- und Actin-Verteilung, jeweils von Kontrollzellen, kultiviert auf einer unbegrenzten Klebeoberfläche.
8 HeLa-Zellen auf unterschiedlichen L-förmigen Mikro-Mustern.
8A Vinculin-Verteilung auf L-förmigen Mikro-Muster.
8C Filament-Actin-Verteilung auf L-förmigen Mikro-Mustern.
8E Fibronectin mikrogemustert.
8B und 8D Vinculin- und Filament-Actin-Verteilung, jeweils von Kontrollzellen, kultiviert auf einer unbegrenzten Klebeoberfläche.
9 Mikrotubulus-Netzwerk, welches vom Centrosom in Richtung der L-Form-Extremitäten reicht.
9A EB1-Labeling in einer HeLa-Zelle, begrenzt auf einem L-förmigen KlebeMikro-Muster.
9B Centrin-GFP- und Tubulin-Labelling von der begrenzten HeLa-Zelle.
10 Mikrotubulus- + Enden-Trajektorien von dem Centrosom in Richtung der L-Form-Extremitäten. EB1-Dynamiken, gemessen durch Videoaufzeichnung in HeLa-Zellen, transfiziert mit EB1-GFP. Überlagerung von Zeitverbrauchsaufnahmen pro 2 Sekunden über 2 Minuten hinweg.
11 Centrosom-Position: HeLa-Zellen, welche stabil Centrin1-GFP exprimierten wurden videoaufgezeichnet über 4 min hinweg. Überlagerung von Zeitverlaufsaufnahmen pro 4 s. Fibronectin in grau, Centrin in weiß.
12A, B, C, D: Die konzentrische Golgi-Struktur um das Centrosom einer HeLa-Zelle auf L-förmigen Mikro-Mustern.
12A Immunolabelln für TGN (Trans Golgi-Netzwerk);
12B Immunolabelln für CGN (Cis Golgi-Netzwerk);
12C Centrin GFP; und
12D Immunolabelln für mikrogemustertes Fibronectin.
12E, F: Golgi-Struktur für eine Zelle, kultiviert auf einer unbegrenzten Klebefläche.
12E Immunolabelin für TGN (Trans Golgi-Netzwerk);
12F Immunolabelln für CGN (Cis Golgi-Netzwerk).
13 HeLa-Zellen, fixiert auf L-Form-Mikro-Muster, welche drei unterschiedliche Stadien der Mitose zeigen: Interphase, Metaphase und post-Telophase.
13A Mikro-Muster von Fibronectin;
13B Immunolabelln für Tubulin;
13C Centrin GFP.
14 Unterschiedliche L-förmige KlebeMikro-Muster: In jeder Zone bleibt die gesamte Klebeoberfläche konstant, die Äste werden dünner und länger. Von S1 oder D1 nach S3 oder D3 nehmen die Klebeoberflächen ab.
15 Verteilungskurven des Winkels zwischen der Metaphasenebene und der normalen (senkrechten) zur L-Hypotenuse. Anzahl von Messungen pro Kurve ≈ 50.
16 Verteilungskurven des Winkels zwischen der Zellunterteilungsachse während der Telophase und der L-Hypotenuse. Anzahl von Messungen pro Kurve ≈ 50.
17 Verteilungskurven des Winkels zwischen der Metaphasenebene und der Normalen (Senkrechten) zu dem L oder der korrespondierenden vollständigen Dreiecks-Hypotenuse.
17A Verteilungskurve auf einer L-Form (S13 in 16);
17B Verteilungskurve des korrespondierenden vollen Dreiecks.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Ansatz entsprechend der Erfindung baut auf die Eigenschaften von Zellen der meisten tierischen Gewebe auf, dass sie konvex sind und eine stereotype Verteilung von intrazellulären Kompartimenten zeigen mit Blick auf spezialisierte Kontakte mit Nachbarzellen, welche ihre Wanderung verhindern.
Tatsächlich induzieren Zell-Zell oder Zell-ECM-Wechselwirkung im Gewebe die Segregation und die räumliche Organisation von membran-adhäsiven Proteinen. Die innere Zellstruktur und die Organisation sind mit diesen Randbedingungen verknüpft. Signalkaskaden steuern die Zellaktivität von peripheren Rezeptoren, aber auch von mechanischen Stimuli an den Anhaftstellen. Zu jeder Zeit ist das Anhaftmuster einer Zelle das Ergebnis einer Wechselwirkung zwischen der Zellaktivität, welche die Plasmamembranstruktur steuert sowie die Zusammensetzung und der zelldynamischen Antwort auf die Begrenzung der Umgebung.
In klassischen Kulturbedingungen auf unbegrenzte Klebeebenen sind Zellklebestrukturen wie fokale Adhäsionen (FA) oder fokale Komplexe über die "ventrale" Zellkontaktfläche verteilt auf dem Substrat, obwohl dies in einer unhomogenen Art und Weise geschieht. Die Fähigkeit von Zellen, Spannung zwischen den Anhaftkomplexen zu entwikkeln ist ein wichtiger Parameter ihrer Geometrie: Zu jedem Moment korrespondiert die Zellform grundlegend mit der konvexen Ummantelung der am entferntest gelegenen Anhaftkontakte. Diese Eigenschaft kann verwendet werden um die Zellform zu steuern: Die Steuerung der Verteilung der Anhaftkomplexe genügt, um die Form von Zellen zu gewährleisten nicht nur auf einer nicht-unbegrenzten Klebeoberfläche, sondern sogar auf nicht-verknüpften Oberflächen.
Diese Eigenschaft kann sogar ex vivo bei Epithelzellen beobachtet werden, beispielsweise bei Enterocyten oder Nierenzellen, wenn ihre Polarität normalisiert ist durch die Kulturbedingungen (zwei Kompartimentkammern). Die Verwendung solcher Kulturbedingungen für High throughput-Analyse ist jedoch begrenzt.
Ein physiologischerer Ansatz für Fibroblasten-Zellen ist es, Zellen in 3D-Kollagen-Gel-Fasern zu kultivieren. Die Verwendung solcher Kulturbedingungen für High throughput-Analyse ist jedoch begrenzt.
Ein alternativer Ansatz, kompatibel mit High throughput-Analyse ist es, ein begrenztes Muster von möglichen Kontakten auf einer 2D-Oberfläche anzubieten: Auf diese Art und Weise kann man Zellen dazu zwingen, ein Verhalten einzunehmen ähnlich zu demjenigen von Zellen in Gewebe als Antwort auf begrenzte Kontakte mit Nachbarzellen.
Da Deckgläschen unbegrenzte Klebeflächen sind, welche eine einheitliche und nicht physiologische Umgebung darstellen, sind mikrogemusterte zelldimensionierte oberflächenartige Vierecke und andere reguläre Polygone ein erster Schritt in Richtung des Nachahmens einer mechanischen Begrenzung der Umgebung auf die Zellmigration und die Zellorganisation. Diese Oberflächen begrenzen jedoch nur das Ausmaß der Zellabflachung. Sie können noch immer sehr große verbundene Klebeoberflächen erzeugen mit Blick auf die Zellgröße, was der Zellplasmamembran "dorsale" und "Ventrale" Domänen verleiht, und recht unterschiedlich ist zu der limitierten Anzahl von Kontakten, welche Zellen mit benachbarten Zellen in Geweben etablieren.
Die Erfinder demonstrieren erstmals, dass Zellen die Topologie des Anhaftmusters interpretieren durch Anordnen eines Actin-Netzwerks, welches ein nicht isotropes Feld der Traktionskräfte auf Anhaftkontakte ausübt. Dies steuert die Orientierung der bipolaren Spindel zu Beginn der Mitose. Daher ist es nicht die Zellform sondern die Zelladhäsion, welche die Schnittebene bestimmen kann.
Die Erfinder demonstrieren des Weiteren, dass Zellen präzise Regeln als Antwort auf ihre adhäsiven Kontakte erfüllen, was wiederum die Orientierung der Zellteilung beeinflusst. Diese Anhaftkontakte geben auch einen Positionsspeicher an die Tocherzellen weiter. Es wird berichtet, dass die erste Vorrichtung welche Anhaft-Mikro-Muster einsetzt, verlässlich die Unterteilungsachse von Tierzellen in Kultur steuert. Bevorzugt gekoppelt an automatisierte Überwachung sollte es von merklichem Wert für die Analyse von Zell-Mitose-Prozessen und ihren Störungen beim High throughput-Screening sein.
Das Prinzip der vorliegenden Erfindung, welches hier als Anhaftsteuerung der inneren Zellorganisation (ACICO) bezeichnet wird, ist es, ein Netzwerk zu erzeugen (ein Array oder ein Gitter) von Klebe(Anker)-Oberflächen für individuelle Zellen, welche verhindern, dass sie wandern und eine reproduzierbare Polarisation der Zellmaschinerie ermöglichen, in welcher die Position der unterschiedlichen Organelle, wie des Centrosoms oder dem Golgi-Apparat vorhergesagt werden kann.
Das Einheitsmotiv oder – muster des Netzwerkes ist eine anisotrope Klebeoberfläche. Diese anisotrope Klebeoberfläche induziert ein Ungleichgewicht an den Anhaftstellen, welches zu einer Zellpolarisierung führt. Genauer gesagt ist die bevorzugte anisotrope Klebeoberfläche so, dass zumindest eine Seite der anhaftenden Zelle keinen Kontakt mit der Anhaftoberfläche aufweisen sollte. Das Ungleichgewicht an den Anhaftstellen kann beispielsweise beobachtet werden durch die Actin-Filamente, welche inhomogen an der Zellumrandung verteilt sind. Dieses Ungleichgewicht kann auch beobachtet werden durch die Anzahl von zurückziehenden Faseranhaftungen (RF). Beispielsweise führt das Vorliegen von nur zwei RF-Anbindungen zu einer exzellenten Zellpolarisierung. Eine anisotrope Anhaftoberfläche kann entstehen durch Begrenzen der Anzahl von Symmetrieelementen des Musters und durch Polen ihrer entsprechenden Gewichte. Vorzugsweise weist das Anhaftmuster entsprechend der vorliegenden Erfindung eine oder zwei Symmetrieachsen auf, mehr bevorzugt nur eine Symmetrieachse.
Eine bevorzugte anisotrope Anhaftoberflächen entsprechend der vorliegenden Erfindung ist eine konkave oder hohle Klebefläche: Ihre konvexe Ummantelung wird die Gussoberfläche einer individuellen Zelle erzwingen trotz einer großen Nichtklebefläche. Sobald die Zellen auf diese Muster stabilisiert sind, induzieren die begrenzte Anzahl von Klebekontakten einer individuellen Zelle mit dem Substrat und die Verteilung dieser Kontakte entsprechend einem konkaven oder hohlen Motiv die reproduzierbare Polarisation der Zellmaschinerie. In der vorliegenden Anmeldung bezieht sich der Begriff "konkaves Anhaftmuster" auf ein Anhaftmuster, welches eine konvexe Ummantelung präsentiert, wobei besagte Ummantelung zumindest 5 % einer Nichtanhaftfläche einschließt, vorzugsweise 10 %, 20 % oder 30 %. Durch "konvexe Ummantelung" soll ein minimal konvexes Polygon beabsichtigt sein, welches das Anhaftmuster einschließt.
In einer alternativen und wenig bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Anhaftmuster ein Muster, welches zu einer Verlängerung der Zelle führt. Tatsächlich kann die Verlängerung der Zelle die Zelle polarisieren. Dieses Muster führt zu einem Umrissformfaktor (SF) oder stellt einen Formfaktor dar, welcher weniger als 0,6 ist, vorzugsweise weniger als 0,5, mehr bevorzugt weniger als 0,4. In einer bevorzugten Ausführungsform ist besagtes Anhaftmuster eine lange und dünne Anhaftfläche beispielsweise eine rechtwinklige Fläche oder dergleichen. Der Formfaktor ist das Verhältnis zwischen der kleinen Achse und der großen Achse einer Ellipse, gefittet auf dem Zellumriss oder auf die Ummantelung der Anhaftfläche. Die lange und dünne Anhaftfläche entsprechend dieser Ausführungsform kann verschiedene Formen aufweisen wie z.B. ein Rechteck, eine Raute oder ein Kreuz.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Anhaften von zumindest einer Zelle, vorzugsweise in einem spezifischen und vorbestimmten Templat, mit einer gesteuerten Polarisation der inneren Zellorganisation umfassend:

– eine Platte, welche eine Oberfläche definiert und
– zumindest ein anisotropes Klebemuster auf besagter Oberfläche, wobei die Größe von besagtem Muster so ist, dass nur eine individuelle tierische oder menschliche Zelle in besagtem Muster anhaften kann mit einer gesteuerten Polarisierung der inneren Zellorganisation; und wobei das anisotrope Klebemuster entweder ein konkaves Klebemuster (Anhaftmuster) oder eine lange und dünne Klebefläche ist mit einem Formfaktor von weniger als 0,6.

Vorzugsweise umfasst besagte Vorrichtung eine Vielzahl von Klebemustern isoliert voneinander durch cytophobe Regionen, an welche die Zellen nicht anhaften. Genauer gesagt umfasst besagte Vorrichtung zumindest 2 Klebemuster, vorzugsweise zumindest 5, 10, 100, 1000, 10000 oder 100000 Klebemuster. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst besagte Vorrichtung zwischen 10 und 50000 Klebemuster/cm², mehr bevorzugt zwischen 5000 und 15000 Klebemuster/cm² und noch mehr bevorzugt ungefähr 10000 Klebemuster/cm².
Entsprechend der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Form des Klebemusters die reproduzierbare Polarisation der Zellmaschinerie. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist besagtes anisotrope Klebemuster ein konkaves Klebemuster. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform ist besagtes Klebemuster ein langes und dünnes Klebemuster welches das In-Die-Lange-Dehnen der Zelle induziert mit einem Umrissformfaktor (SF, shape factor) welcher weniger als 0,6 ist, vorzugsweise weniger als 0,5 mehr bevorzugt weniger als 0,4.
Die cytophile Insel umfasst vorzugsweise ein konkaves Klebemuster, welches eine nicht klebende Fläche involviert. Beispielsweise kann die Klebefläche die Form der folgenden Buchstaben aufweisen: C, L, U, V. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform weist das konkave Klebemuster die [L] Form auf.
Die inskribierte Oberfläche des konkaven Klebemusters umfasst klebende und nicht klebende Flächen und die konkave Ummantelung von besagtem konkaven Klebemuster umfasst vorzugsweise eine oder mehrere Klebeflächen, mehr bevorzugt eine oder mehrere Klebelinien oder Kurven. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die konvexe Ummantelung der konkaven Klebefläche ein Polygon. Vorzugsweise umfasst besagtes Polygon zumindest eine Klebekante. Besagtes Polygon kann ein gleichseitiges Dreieck, ein Quadrat, ein Pentagon, ein Hexagon, ein Heptagon, ein Octogon, ein Nonagon, ein Decagon, ein Hendecagon, ein Dodecagon, ein Pentadecagon oder ein Icosagon sein.
Beispielsweise besteht das Polygon aus einer oder mehreren Klebekante(n) und optional einer oder mehreren Klebekante(n). Beispiele von Klebemustern sind auch in den 2D, 2E, 2G, 2H und 5 illustriert.
Falls das Polygon ein Dreieck ist kann das Polygon beispielsweise entweder eine Klebekante und eine Klebefläche aufweisen (d.h. [Balken + Punkt] Form) oder zwei Klebekanten (beispielsweise [L] Form).
Falls das Polygon ein Viereck ist kann das Polygon beispielsweise wie folgt aussehen:

– eine Klebekante und zwei Klebeecken (d.h. [Balken + 2 Punkt] Form);
– zwei nicht konsekutive Klebekanten (beispielsweise [Zwillingsbalken] Form);
– zwei konsekutive Klebekanten und eine Klebeecke (beispielsweise [L + Punkt] Form; und
– drei zusammenhängende Klebekanten.

Besagtes Viereck kann ein regelmäßiges oder unregelmäßiges Viereck sein. Es kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus einem Quadrat, einem Rechteck, einer Raute und einem Trapez.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist besagtes Polygon ein Dreieck. Mehr bevorzugt weist besagtes Dreieck zwei Klebekanten auf. Bevorzugt ist der Winkel zwischen den beiden Klebekanten zwischen 30 und 150°, mehr bevorzugt zwischen 60 und 120°, noch mehr bevorzugt ungefähr 90°. Bevorzugt ist das Längenverhältnis der zwei Kanten zwischen 0,1 und 1, mehr bevorzugt zwischen 0,3 und 1, noch mehr bevorzugt zwischen 0,5 und 1. Für die Analyse der Zellen in der Mitose ist das Längenverhältnis der beiden Kanten bevorzugt ungefähr 1. Für die Analyse von Zellen in der Interphase ist das Längenverhältnis der beiden Kanten weniger als 1, mehr bevorzugt zwischen 0,3 und 0,8.
Das Klebemuster kann aus einzelnen verknüpften Klebeflächen ausgebildet sein und/oder aus nicht verknüpften Klebeflächen. In einer speziellen Ausführungsform kann das Klebemuster entweder aus einer einzelnen verknüpften Klebefläche ausgebildet sein oder aus mehreren nicht verknüpften Klebeflächen. Durch "einzelne verknüpfte Klebefläche" soll bevorzugt eine durchgezogene Linie oder Kurve gemeint sein. Durch "nicht verknüpfte Klebefläche" ist vorzugsweise eine gepunktete oder gestrichelte Linie oder Kurve gemeint oder ein diskreter Punkt oder eine diskrete Fläche. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Klebemuster aus einer Kombination von Klebeelementen ausgewählt aus einer Linie, einer Kurve und einem Punkt.
Die Breite des Klebepunktes, der Klebelinien, der Klebekurven oder Klebekanten liegt vorzugsweise zwischen 0,1 bis 10 μm, mehr bevorzugt zwischen 1 und 5 μm und noch mehr bevorzugt bei ungefähr 4 μm.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die durch das Klebemuster inskribierte Oberfläche hauptsächlich nicht klebend, vorzugsweise essentiell nicht klebend. Mehr bevorzugt ist die durch das Klebemuster inskribierte Oberfläche vollständig nicht klebend. Optional sind 75 % der durch das Klebemuster inskribierten Oberfläche nicht klebend, vorzugsweise 90 %, mehr bevorzugt 95 % und immer noch mehr bevorzugt 99 %.
Vorzugsweise ist das Verhältnis zwischen der Klebefläche und der Nichtklebefläche der konvexen Ummantelung der Klebefläche am wenigstens konsistent mit der Zellabflachung.
Beispielsweise ist das Verhältnis zwischen 10 und 90 %, vorzugsweise zwischen 20 und 80 % und noch mehr bevorzugt zwischen 30 und 70 %.
Die Größe des Klebemusters ist so, dass eine individuelle tierische oder menschliche Zelle in der Lage ist daran anzuhaften. Vorzugsweise ist die Größe des Klebemusters so, dass eine einzelne Zelle sich ausbreiten und teilen kann, sie jedoch gegen Zellbeweglichkeit eingeschränkt ist. Vorzugsweise ist die Fläche der konvexen Ummantelung des Klebemusters zwischen 1 und 2500 μm², mehr bevorzugt 1 und 1000 μm², noch mehr bevorzugt zwischen 1 und 500 μm² oder 500 bis 900 μm². Die Große des Klebemusters hängt vom Zelltyp ab.
Die Oberfläche einer Platte umfasst eine Vielzahl von diskreten Klebemustern, wobei ein jedes davon das Anhaften einer individuellen Zelle fördert, angeordnet in einem vorbestimmten geometrischen Templat, wobei die Klebemuster voneinander durch cytophobe Regionen isoliert sind, welche das Anhaften der Zellen nicht fördern. Die cytophoben Regionen sind hinreichend breit um zu verhindern, dass die Zellen, welche an besagte Klebemuster anhaften miteinander in Kontakt treten können. Vorzugsweise ist das Mesh des Netzwerkes größer als zwei Zelldurchmesser. Vorzugsweise sind die Klebemuster durch zumindest ein 10 μm getrennt, vorzugsweise durch zumindest 20, 30 oder 50 μm.
Das Klebemuster umfasst Moleküle, welche das Zellanhaften vorantreiben. Diese Moleküle sind üblicherweise den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und umfassen Antigene, Antikörper, Zelladhäsionsmoleküle, extrazelluläre Matrixmoleküle wie z.B. Laminin, Fibronectin, synthetische Peptide, Carbihydrate und dergleichen. Bevorzugt umfassen besagte Klebemuster extrazelluläre Matrixmoleküle, mehr bevorzugt Fibronectin.
Die nicht klebende Fläche ist eine inerte Oberfläche. Eine geeignete inerte Oberfläche ist eine Oberfläche welche mit einem Derivat von Oligo- oder Poly(ethylenglycol) bedeckt ist.
Die Platte ist eine Abdeckung, welche hinreichend ist für konfokale, optische und/oder Fluoreszenzmikroskopien. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Platte aus Glas vorzugsweise aus silanisiertem Glas. Beispielsweise ist eine geeignete Platte entsprechend der vorliegenden Erfindung ein Deckgläschen oder ein Objektträger.
Die Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung kann verschiedene Gruppen von Klebemustern umfassen auf der gleichen Platte, getrennt voneinander, so dass jede Gruppe in einem unterschiedlichen Medium inkubiert sein kann. Beispielsweise kann eine Gruppe von Klebemustern mit einer Testverbindung in Kontakt sein und eine andere Gruppe kann mit einem anderen Testverbindung in Kontakt sein oder ohne jegliche Testverbindung. Diese Trennung kann bereitgestellt werden durch eine physikalische Barriere wie z.B. eine Teflonversiegelung. Siehe beispielsweise SPI Teflon^® von SPI Supplies, Teflon^®, Printed Slides of Aname.
Die Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung mit Klebemustern und den cytophoben Regionen werden ausgebildet durch Mikro-Musterung, vorzugsweise durch Mikrokontaktmusterung. Herkömmliche Verfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Für einen Übersichtsartikel siehe Whitesides et al. (Annu. Rev. Biomed. Eng., 2001, S. 335–373, insbesondere S. 341–345).
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst:

– Bereitstellen eines Master-Templats mit zumindest einem Klebemuster;
– Herstellen eines Stempels aus besagtem Master-Templat;
– Tränken von besagtem Stempel mit Molekülen, welche die Zelladhäsion fördern;
– Inkontaktbringen des getränkten Stempels mit der Platte;
– Cytophob-machen der nicht bedruckten Grenzfläche der Platte.

Vorzugsweise wird das Master-Templat hergestellt aus einem Siliconwafer der mit einer Fotolackschicht überzogen ist, durch Bestrahlen mit UV durch eine Maske auf welcher das Klebemuster designed worden ist. Der Stempel ist vorzugsweise aus Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) oder einem anderen Siloxan basierten Polymer. Vorzugsweise werden solchen nicht bedruckten Oberflächen der Platten cytophob gemacht durch eine Inkubation mit einem inerten Material wie z.B. Polyethylenglycol.
Ein spezielles Beispiel für die Herstellung einer Platte entsprechend der vorliegenden Erfindung wird im Detail in dem Beispielabschnitt dargelegt.
Das Mikro-Mustern ermöglicht eine präzise Steuerung des Zellposition auf einem Mikrometermaßstab. Die Verwendung von Glas-Deckgläschen ohne irgendwelche Gold- oder andere Metallüberzüge ist kompatibel mit allen optischen bildgebenden Techniken und insbesondere mit Epifluoreszenz an einem Inversionsmikroskop für Video-Mikroskopie. Die Automatisierung von vielen 4D-Anwendungen (3D im Zeitverlauf) ist sehr einfach: Mit einem motorisierten XY-Tisch muss man nur die XY-Position der ersten Zelle aufnehmen, da alle anderen von der ersten durch eine bekannte iterative Translation reduziert werden können; 100 × Mikroskop auf einer keramischen Piezoelectrik-Vorrichtung erzeugt eine 3D-Stapelaufnahme in sehr schneller Zeit. Glas-Deckgläschen und Mikro-Mustern ermöglichen es, High throughput 3D-Zellscreening mit hoher Auflösung durchzuführen unter Verwendung von Epifluoreszenz wie auch Transmissionslicht. Wenn die Zellen vor dem Aussäen synchronisiert werden, kann man an der Beschreibung einer "durchschnittlichen Zelle" durch Aufsummieren der Beobachtung von so vielen Zellen als notwendig erhalten. Dies liefert eine sehr akkurate Beschreibung der Zellorganisation und des Zellverhaltens, da die Zellen sehr ähnlich sind, wenn nicht sogar identisch. Von einer solchen "durchschnittlichen Zell"-Beschreibung kann man adäquate Schranken zum Screenen von aktiven Verbindungen hinsichtlich einer speziellen Zellfunktion platzieren oder von Genen, deren Inaktivierung die Funktion beeinträchtigt.
Entsprechend umfasst die Erfindung des Weiteren ein automatisiertes Verfahren der Analyse zum Nachweis der Position und der Orientierung von Zellen im Verlauf der Zeit und am speziellen Moment der Zellteilung. Dieses Verfahren umfasst:

a) Identifizieren der Position des Klebemusters auf einer Platte;
b) Aufzeichnen von Zellbildern an verschiedenen Zeiten für verschiedene identifizierte Muster;
c) Fitten einer Ellipse auf den Zellumriss von Zellbildern;
d) Nachweis der Teilungszeit und Bestimmung der Parameter von Interesse.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren in Schritt d) einen Schritt des Berechnens der Umgebung der Zelle (wie unten angegeben). Die Entwicklung der Rundung entsprechend der Zeit ermöglicht die Bestimmung des Moments der Zellteilung und der Spindelorientierung. Vorzugsweise wird die Spindelorientierung bestimmt während der Verlängerungsphase.
Genauer gesagt umfasst dieses Verfahren:

1- Identifizieren der Position des Klebemusters auf der Platte unter Verwendung von Fluoreszenz;
2- Aufzeichnen von Phasenkontrastbildern (Transmissionslicht) zu verschiedenen Zeiten für verschiedene identifizierte Muster;
3- vorzugsweise Segmentierung von Farbenkontrastbildern durch Wavelet-Zerlegung;
4- Fitten einer Ellipse auf die segmentierten Bilder;
5- Nachweis der Teilungszeit und Bestimmen der Parameter von Interesse.

Der Schritt 1 wird durchgeführt mit einem 2D Fluoreszenzbild der Platte. Auf dieser Platte und entsprechend dem Objektiv des Mikroskops kann man verschiedene rechtwinklige Flächen (Felder) beobachten einschließend mehrere Klebemuster. Die Klebemusterdetektion wird vorzugsweise durchgeführt durch Korrelationsanalyse mit einer 2D Fourier Transformation.
In Schritt 2 werden die untersuchten Positionen des Klebemusters verwendet zum Aufzeichnen von zeitlichen Sequenzen (2D Bilder gegen die Zeit) auf den unterschiedlichen Feldern und für jedes Klebemuster. Die Bilder sind Farbenkontrastbilder (Transmissionslicht). Zu diesem Stadium ist es möglich, zu bestimmen, ob eine Zelle auf dem Muster angehaftet ist oder nicht.
In dem Schritt 3 wird die Zelle segmentiert, um die Zelle vom Hintergrund zu separieren. Diese Segmentation kann durchgeführt werden unter Verwendung einer Wavelet-Zerlegungs-Transformation. Die Wavelet-Zerlegungs-Transformation ermöglicht es, nur einen Teil der Details, die in einem ursprünglichen Bild vorliegen, zu behalten. Folglich werden die zu kleinen Details (welche als Hintergrundrauschen betrachtet werden können) oder die zu großen Details, welche als Fluktuation des Hintergrunds betrachtet werden können) entfernt. In dem erhaltenen Bild wird eine Schwelle zum Abtrennen der Pixel, assimiliert mit einer physikalischen Struktur gegen die Pixel assimiliert mit dem Hintergrund, verwendet. Ein Algorithmus der Segmentierung der untersuchten Strukturen wird verwendet, um die verwandte Struktur, welche die Zelle repräsentiert abzutrennen.
In dem Schritt 4 wird eine Ellipse auf jede segmentierte Zelle durch eine prinzipielle Komponentenanalyse gefittet (was den durchschnittlichen quadratischen Fehler minimiert). Die zeitliche Sequenz von Bildern ist so kompatibel mit einem Satz von Ellipsen, welche um das Massezentrum der segmentierten Strukturen zentriert ist, die Form (kleine und große Achse) und die Orientierung der Ellipse reproduzieren die Morphologie der Zelle so gut als möglich. Einer der Formparameter ist die Rundung (SF), welcher das Verhältnis darstellt zwischen der kleinen Achse und der großen Achse der Ellipse. Beispielsweise ist, wenn die Ellipse ein Kreis ist, die Rundung 1 und wenn die Ellipse eine Zigarre ist, ist die Rundung 0. Der Orientierungsparameter ist der Winkel zwischen der großen Achse und der horizontalen oder vertikalen Referenz. Tatsächlich kann angenommen werden, dass die Orientierung der großen Achse der Ellipse während des Verlängerungsschritts die gleiche ist wie die der Spindelorientierung.
In dem Schritt 5 ermöglicht die zeitliche Analyse der Rundung einer Zelle den automatisierten Nachweis des Moments der Zellteilung. Die unterschiedlichen Stadien des zellulären Zyklus induzieren ein spezielles Verhaltensmuster der Formparameter. Während der Mitose werden die Zellen rund (Rundung ungefähr 1). Anschließend in der Anaphase verlängert sich die Zelle plötzlich (die Rundung nimmt schnell ab). Man versucht den Moment zu finden, um exakt die runde Phase von der Phase der Verlängerung zu trennen. Daher wird zu jeder Zeit t ein Test durchgeführt, falls die kurzen letzten Momente (t-6 bis t-1) überall höher sind als der erste Grenzwert (spezifisch für die runde Phase), anschließend ein Test, falls die wenigen nachfolgenden Momente (beispielsweise t+1 mit t+5) überall niedriger sind als eine zweite Schwelle (spezifisch für die Phase der Ver längerung). Falls diese beiden Bedingungen erfüllt sind, betrachtet man, dass der Moment T den Beginn der Anaphase definiert. Für mehr Details siehe 1 und Beispiel 1.
Dieses automatisierte Verfahren ermöglicht es mit höheren Datenvolumina sich zu befassen und folglich eine statistische Analyse durchzuführen. Darüber hinaus ist die Morphologie-Analyse der Zellen mit der Zeit und während der Zellteilung reproduzierbar und führt daher zu verlässlicheren Ergebnissen.
Parameter vom Interesse werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Mitose-Dauer, der Dauer der Phase des Eintritts in die Mitose (G2-Mitoseübergangsphase), der Dauer der Mitose-Endphase (abrupt oder graduell) oder/und der Orientierung der Spindelorientierung. Die Spindelorientierung ist ein sehr interessanter Aspekt unter den bestimmten Parametern.
Die Vorrichtung entsprechend der Erfindung kann bedeutsam sein in einem breiten Array von zellulär biologischen Anwendungen, sowohl auf dem Gebiet der fundamentalen als auch der angewandten Forschung, einschließend Zellkultivierung, Cytometrie, Toxikologie, Wirksubstanzscreening, Immobilisieren von Zellen. Diese Vorrichtung ist gut geeignet um die Form, die globale innere Organisation, den inneren Transport und einige zelluläre Funktionen von Zellen, vorzugsweise Mitose, zu untersuchen.
Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Kultivierung von zumindest einer Zelle auf einer Oberfläche oder in einem Medium auf einer Oberfläche, wobei besagtes Verfahren umfasst:

– Bereitstellen einer Platte, welche eine Oberfläche definiert und zumindest eines Klebemusters entsprechend der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung; und
– Kultivieren der Zellen auf besagtem Klebemuster (besagten Klebemustern) oder in einem Medium auf besagtem Klebemuster (in besagten Klebemustern).

Das Medium kann irgendein Medium sein, welches geeignet ist für die Zellkultur. Beispielsweise kann das Medium Dulbecco Modified Eagle Medium sein mit 10 % Kälberserum, 1 % Penizillin und Streptomycin und 1 % Glutamin.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Immobilisieren von zumindest einer Oberfläche, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst:

– Bereitstellen eine Platte, welche eine Oberfläche definiert und zumindest eines Klebemusters entsprechend der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung; und
– Exponieren der Platte gegen mindestens eine Zelle über einen Zeitraum, der hinreichend ist, um zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an das (die) Klebemuster binden.

Das Verfahren betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Untersuchen der Form, der globalen inneren Zellorganisation und/oder einer Funktion einer Zelle, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst:

– Bereitstellen einer Platte, welche eine Oberfläche definiert und zumindest ein Klebemuster entsprechend der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung;
– Inkontaktbringen von besagtem (besagten) Klebemuster(n) mit zumindest einer Zelle über einen Zeitraum der hinreichend ist, um zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an das (die) Klebemuster anhaftet;
– Kultivieren der Zelle(n) auf dem (den) Klebemuster(n); und
– Beobachten der Form, der globalen inneren Zellorganisation, der Mitose und/oder einer Funktion von besagter Zelle (besagten Zellen).

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die globale Zellorganisation ausgewertet durch, jedoch nicht limitiert auf die Beobachtung der Centrosom-Position, die Golgi-Apparatstruktur (d.h. CGN und TGN), das Netzwerk von Vinculin, Actin (beispielsweise die räumliche Verteilung von Actin-Filamenten) und/oder Tubulin, den inneren Transport des Moleküls oder die Spindelorientierung.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren eine automatisierte Analyse von besagter Zelle (besagten Zellen) unter Verwendung eines Bildanalysators, einschließend eine spezifische Software unter Verwendung eines Algorithmus, konzipiert für solch eine Analyse. Genauer gesagt ermöglicht die spezifische Software, ein automatisiertes Verfahren wie oben beschrieben durchzuführen.
Zellen, welche in der Erfindung verwendet werden können, können von Tieren, Säugetieren oder Menschen sein. Zellen können beispielsweise Fibroblasten und hämatopoetische Zellen sein, Endothel- und Epithel-Zellen. Zellen können abgeleitet sein aus ei nem gesunden oder befallenen Gewebe oder Organismus. Die Zelle kann vom Wildtyp sein oder es kann sich um modifizierte Zellen handeln. In einem speziellen Beispiel kann die Zelle eine Tumorzelle sein. Beispielsweise kann ein Gen inaktiviert sein und diese Verfahren ermöglichen, die Gene zu identifizieren, welche in die Zellform involviert sind, in dem inneren Zelltransport von Molekülen, in die globale innere Organisation, in die Kompartimentation, in die Spindelformation oder Orientierung etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Bestimmen, falls eine Zelle einen transformierten Phenotyp aufweist, assoziiert mit einer Spindelmissorientierung. Es kann ein interessantes Kriterium sein zu bestimmen, ob die Zelle eine Krebszelle ist. Das Verfahren kann folgendes umfassen:

– Bereitstellen einer Platte, welche eine Oberfläche definiert und zumindest eines Klebemusters entsprechend der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung;
– Inkontaktbringen von besagten Klebemustern mit Zellen, um auf einen Zeitraum zu testen, welcher hinreichend ist um zu ermöglichen, dass die Zellen an die Klebemuster haften;
– Kultivieren der Zellen um die Klebemuster zu testen; und
– Bestimmen der Spindelorientierung für jede Zelle und Vergleich der Spindelorientierung der unterschiedlichen Zellen;

Eine große Spindelorientierungsverteilung wird abgeschätzt im Vergleich mit der Spindelorientierungsverteilung für normale Zellen. Vorzugsweise ist eine große Spindelorientierungsverteilung eine Winkelvariation von zumindest 20°, mehr bevorzugt zumindest 30, 40 oder 50°.
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung zum Screenen von Verbindungen von Interesse, welche die Zellform modifiziert, die globale innere Organisation der Zelle, die Mitose oder eine Funktion der Zelle. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung zum Identifizieren von Genen von Interesse, welche in die Zellform involviert sind, die globale innere Organisation der Zelle, die Mitose oder eine Funktion der Zelle. Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung zum Bestimmen, ob eine Zelle ihre Fähigkeit verloren hat eine geeignete Orientierung der Spindel zu steuern.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen von Interesse unter Verwendung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung. Tatsächlich ermöglicht diese Vorrichtung das High throughput-Screenen, da die Form und die globale innere Organisation der Zellen reproduzierbar sind und stabil sind und die Ergebnisaufzeichnungen automatisiert werden können. Diese Vorrichtung ermöglicht es, den Effekt der Testverbindungen auf die Zellform, auf die globale innere Zellorganisation der Zelle oder eine Funktion der Zelle zu beobachten.
Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auswählen von logisch aktiven Verbindungen wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst:

– Bereitstellen einer Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung;
– Inkontaktbringen von besagten Klebemustern mit zumindest einer Zelle über einen Zeitraum, der hinreichend ist, um zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an die Klebemuster anhaftet;
– Inkontaktbringen einer Testverbindung mit besagter Zelle (besagten Zellen);
– Kultivieren der Zelle(n) auf den Klebemustern; und
– Beobachten der Form, der globalen inneren Zellorganisation, der Mitose und/oder eine Funktion von besagter Zelle(n).

In einer alternativen Ausführungsform des Screening-Verfahrens können die Zellen kultiviert werden auf den Klebemustern bevor sie mit der Testverbindung in Kontakt gebracht werden. Folglich kann es möglich sein, den Effekt der Verbindung auf die existierende Form und Organisation der Zelle zu bewerten.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren einen weiteren Schritt des Vergleichens der Form, der globalen inneren Zellorganisation und/oder einer Funktion von besagter Zelle (besagten Zellen) mit Zellen, die nicht durch besagte Testverbindung kontaktiert werden. Optional kann besagte Kontrollzelle in Kontakt gebracht werden mit einer Referenzverbindung mit bekanntem Effekt.
Die Testverbindung kann von verschiedenem Ursprung, verschiedener Natur oder Zusammensetzung sein. Es kann sich um irgendeine organische oder anorganische Substanz handeln beispielsweise ein Lipid, Peptid, Polypeptid, eine Nukleinsäure, ein kleines Molekül etc. in isolierter Form oder als Mischung mit anderen Substanzen. Beispielsweise kann die Testverbindung ein Antikörper sein, ein Antisense-Oligonukleotid oder ein RNAi. Die Verbindungen können alle oder teilweise von einer kombinatorischen Bibliothek für Produkte abgeleitet sein, um ein Beispiel zu nennen.
Beispielsweise können die Verbindungen von Interesse Verbindungen sein, welche die Mitose oder Zellmigration inhibieren oder blockieren oder welche Apoptose induzieren. Diese Verbindungen sind bedeutsam für die Behandlung von Krebs.
In nicht teilenden Zellen oder während der Interphase von teilenden Zellen
Das Vorliegen von einer Nichtklebefläche unter den Zellen induziert eine reproduzierbare zelltypspezifische Verteilung von Klebestrukturen und Actin-Filamenten. Aufgrund der permanenten Wechselwirkung zwischen den unterschiedlichen Komponenten des Cytoskeletts beeinflusst die Lokalisierung von FA (fokaler Adhäsion) die Membranprotrusionen, wo Actin polymerisiert, wie auch die dynamische Organisation des Mikrotubuli-Netzwerks, einschließend die Position des Centrosoms, wo die Mikrotubuli verankert sind. Die gesamte Golgi-Struktur am Zentrum des Proteinverkehrs, welches klassischerweise in der Umgebung des Centrosoms lokalisiert ist, ist polarisiert von CGN (Cis Golgi Network) zu TON (Trans Golgi Network) und zwar nicht nur lokal wie unter klassischen Kulturbedingungen zu beobachten ist, sondern global auf dem Niveau ganzer Organellen. Der Golgi-Apparat wird nicht länger durch das Abflachen der Zelle gestört, sondern zeigt eine konzentrische Organisation der verschiedenen Kompartimente um das Centrosom herum. Dies ermöglicht einen leichten Vergleich der Golgi-Struktur oder Aktivität von einer Zelle zu einer anderen. In ähnlicher Art und Weise ist es sehr leicht, Wirksubstanzen zu untersuchen oder Gene zu untersuchen, welche einen Effekt haben, selbst wenn es nur ein kleiner ist, auf die Position des Centrosoms, wohingegen es sehr schwierig, falls nicht unmöglich ist, dies unter klassischen Kulturbedingungen durchzuführen.
Zellteilung und Mitose-Spindelorientierung
Eine sehr stark gesteuerte Orientierung der Spindelachse kann erhalten werden. Die Orientierung der Metaphasenebene und die Spannung zwischen Tochterzellen während der Cytokinese werden sehr präzise injiziert durch die vorgeschlagenen Klebemuster. Zellteilungen werden folglich in Raum und Zeit gesteuert in einer Art und Weise, welche präzise und quantitative Vergleiche zwischen individuellen Zellen ermöglicht sowie zwischen Zelltypen, entweder von gesteuerten oder transformierten Zellen. Es ist insbesondere angenehm für die Auswertung von Wirksubstanzeffekten kann jedoch auch für die Geninaktivierungsanalyse verwendet werden.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden offenbart in dem folgenden Beispielabschnitt, welcher als illustrativ und nicht limitierend für den Umfang der vorliegenden Erfindung betrachtet werden sollte.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Methoden
Mikro-Musterfabrikation
Mikrokontaktdrucken ist eine vollständig beschriebene Methode (Whitesides et al., Annu. Rev. Biomed. Eng., 2001, S. 335–373). Wir haben Polydimethylsiloxanstempel (Sylgard, Dow Corning) hergestellt unter Verwendung eines Verfahrens beschrieben durch Dr. A. Pépin (Pépin, A., Chef, Y., in Alternative lithography (Hrsg. Sotomayor Torres C.M.) 305–330, Boston/Dordrecht/London, 2003). Die Glas-Deckgläschen-Behandlung, die wir verwendet haben, wurde entwickelt von Dr. P. Nassog (Cuvelier et al., Eur. Biophys. J. 32, 342–354 (2003). Ein Stempel wurde getränkt mit 50 μm/ml Fibronectinlösung, wobei 10 % davon mit Cy3 (Amersham Biosciences) gelabellt waren, für 5 Minuten, getrocknet und platziert in Kontakt mit einem silanisierten Deckgläschen für 5 Minuten. Nach Entfernung des Stempels wurde das bedruckte Deckgläschen untergetaucht in PBS, welche 20 mg/ml Maleimidpoly(ethylenglycol) enthielt, PEG-mal (Nektar Therapeutics) für 1 Stunde Raumtemperatur. Das Deckgläschen wurde anschließend milde in PBS gewaschen und war fertig für die Zellabscheidung.
Zellkultur und Abscheidung
HeLa, menschliche Epithelzellen, stabil exprimierende Centrinl-GFP (fiel et al., J. Cell Biol. 149, 317–329 (2000) wurden kultiviert in Dulbecco Modified Eagle Medium mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 % Penizillin und Streptomycin sowie 1 % Glutamin bei 37°C. Die Zellen wurden synchronisiert unter Verwendung eines Doppel-Thymidinblocks und anschließend entfernt aus ihrem Kolben unter Verwendung von VERSEN, für 10 Minuten bei 37°C. Nach Entfernen des VERSEN durch Zentrifugation wurden die Zellen erneut resuspendiert in DMEM mit 1 % FCS und abgeschieden auf dem bedruckten Deckgläschen in einer Dichte von 10⁴ Zellen/cm².
Fixierung und Färbung
Premitotische Zellen wurden permeabilisiert mit 0,5 % TritonX-100 in Cytoskelettpuffer (CB) (Mitchison. Cell Motil. Cytoskeleton 22, 135–151 (1992) für 2 Minuten und anschließend fixiert in Paraformaldehyd 4 % in CB für 20 Minuten und behandelt mit Ammoniumchlorid 0,1 M für 10 Minuten. Zellen in der Metaphase wurden fixiert unter Verwendung eines Verfahrens, beschrieben von Mitchison (1992), welches zurückziehende Fasern konserviert. Actin und DNA wurden angefärbt unter Verwendung von Phaloidin-FITC und DAPI. Vinculin wurde immunogelabellt mit primären Mausantikörpern bereitgestellt von Dr. M. Glukhova sowie sekundären Cy5-konjugierten Ziege-anti-Maus-Antikörpern (Jackson Immunoresearch)
Videomikroskopie
Die Erfindung haben ein invertiertes Leica DMIRBE-Mikroskop eingesetzt mit einem beheizbaren und motorisierten Probentisch kombiniert mit einer selbstgefertigten Zellkammer aus Plastik um das bedruckte Glas-Deckgläschen zu halten, welches mit einer porösen Membran bedeckt war die CO₂-Pufferung bei pH = 7,4 ermöglichte. Metamorph-Software (Universal Imaging) wurde verwendet für die Bildaufnahme. Verschiedene Zellteilungen wurden verfolgt unter Verwendung eines Zeitablaufphasenkontrastes bei einer Multifeldaufnahme mit einer Frame-Rate von einem Bild pro 3 Minuten mit einem Objekt von 10-facher Vergrößerung. Centrosom-Bewegungen wurden verfolgt während der Mitose mit einer 63-fach Apochromatobjektivlinse (Leica) unter Verwendung von fluoreszierender Z-Aufnahme durch einen grünen Filter und eines Phasenkontrastbildes des Zellbodens alle 5 Minuten.
Videoanalyse und Verarbeitung
Eine Software wurde entwickelt. Diese Software war in der Lage automatisch ein einzelnes fluoreszierendes Mikro-Muster zu erkennen innerhalb eines Feldes, um das Vorliegen einer einzelnen Zelle, daran angebunden, nachzuweisen. Individuelle Zellteilungen wurden extrahiert aus dem 10-fach Phasenkontrast-Zeitverlaufs-Aufzeichnungen und alle Bilder wurden automatisch segmentiert unter Verwendung einer Wavelet-Zerlegung und mit einer Ellipse gefittet (1b). Der Moment der Zellelongation in der Anaphase wurde präzise nachgewiesen als Formfaktor, definiert als das Längenverhältnis der Ellipse, plötzlich aus einem oder mehr als 0,9 bis weniger als 0,6 aufgenommen (1c). Der Winkel zwischen der Hauptachse der Ellipse, korrespondierend mit der Spindelorientierung und der vertikalen Referenz des Musters, orientiert wie in 2 gezeigt, wurde dann aufgenommen. Die Position des Zentrums der runden mitotischen Zelle mit Blick auf das Muster wurde automatisch aufgezeichnet 6 Minuten vor der Anaphase. Nähere Angaben für die gewünschten Abschnitte finden sich innerhalb der Verfahrensabschnitte.
Zellteilungsachse durch kontrolliertes Anhaften
Um dieses Ziel zu erreichen steuerten die Erfinder die Fähigkeit von HeLa-Zellen anzuhaften und auf Klebeformen zu teilen unter Verwendung von Mikrokontaktdrucken, einer herkömmlichen Musterungstechnik. Ein Bereich von Muster bedeckenden Flächen von 600 bis 900 μm² wurde konzipiert, in welchem eine einzelne Zelle eingebracht und geteilt werden konnte, jedoch gegenüber Zellbewegung fixiert war. Folgend auf einen Doppel-Thymidinblock wurden G2-Zellen ausgesät auf Fibronectin-Mikro-Muster und die Zellteilung wurde videoaufgezeichnet. Ein automatisiertes numerisches Tool wurde entwickelt um jedes Mikro-Muster nachzuweisen in dem aufgezeichneten Feld sowie das Vorliegen einer einzelnen Zelle, daran angehaftet (1). Spindelorientierung, genommen als die Orientierung der Zellelongation beim Beginn der Anaphase sowie die Position des runden mitotischen Zellzentrums wurden automatisch aufgezeichnet (siehe Methoden). Diese Verarbeitung ermöglicht die rasche Analyse einer großen Anzahl von Zellteilungen.
Vollständige Klebe-Mikro-Muster
Die Effizienz dieses Ansatzes wurde bestätigt durch auch Beobachten der Korrelation zwischen dem Prä-Mitose-Formfaktor und der Mitose-Spindelorientierung auf Mikro-Mustern einer ähnlichen Fläche. Zellen wurden plattiert auf rechtwinkligen (11,5 μm × 55 μm = 630 μm, Umriss SF = 0,3), scheibenförmigen (Durchmesser = 29 μm, 660 μm², Umriss SF = 1) und rechtwinkligen gleichschenkligen Dreiecken (Kantenlänge = 32 μm, 580 μm², Umriss SF = 0,6)-Klebemustern. Die Mehrzahl der Zellen, kultiviert in dem Rechtecksmuster (2A) zeigt die Mitose-Spindeln angeordnet entlang der längsten Achse, wobei insgesamt 69 % eine Winkel-Abweichung von weniger als 15° zeigen. Die Mitose-Spindelorientierung der Zellen platziert auf Scheiben zeigten eine gleichförmige Verteilung (28). Mit den Zellen kultiviert auf den Dreiecksmustern waren die Spindeln hauptsächlich parallel zur längsten Kante orientiert, obwohl die Verteilung breiter war als bei den Rechtecksmustern (2C).
Die Verteilung der Klebestellen wurde bestimmt durch Untersuchen von Vinculin enthaltenden Strukturen in Prä-Mitose-Zellen. Klebestellen fanden sich in erster Linie entlang der Peripherie der Muster (4a–c), gleichförmig verteilt an der Grenze der kreisförmigen Muster. Jedoch wurden mit den rechtwinkligen Mustern eine hauptsächliche Stelle des Klebens an jedem Ende der beiden längsten Kanten beobachtet. Eine signifikante Akkumulation von Vinculin wurde auch beobachtet an den drei Ecken der Dreiecksformen. Die filamentöse Actin-Konzentration war hoch entlang der beiden langen Kanten von rechtwinklig geformten Zellen und der drei Ecken von dreieckig geformten Zellen, wohingegen eine gleichmäßige Verteilung der Peripherie von scheibenförmigen Zellen auftrat.
Die Mitose-Spindelorientierung erschien daher als Korrelation mit der globalen Orientierung der Vinculin-Actin-Organisation, entwickelt durch die Interphase-G2-Zelle als Antwort auf die Adhäsion. Die Spindelorientierung zeigte sich starker begrenzt, wenn die Vinculin-Actin-Organisation in einer Richtung verlief. Um das zelluläre Klebeprofil vom Zellumriss in dieser Korrelation zu unterscheiden (diskriminieren) wurden unterschiedliche Klebemuster konzipiert und so getestet, dass die Zellumrisse nicht zerstört wurden. Diese Muster-Designs versuchten Gewebsbedingungen nachzuahmen, wo nur begrenzte Abschnitte der Zellmembran in Klebekontakt mit Nachbarzellen involviert sind.
Periphere Klebe-Mikro-Muster
[L] und [Balken + Punkt] Mikro-Muster wurden konzipiert, um komplementäre Kombinationen von klebenden und nicht klebenden Flächen in der gleichen konvexen Umhüllung wie für die rechtwinkligen gleichschenkligen Dreiecke wie oben beschrieben (Kantenlänge = 32 μm, Fläche = 580 μm², Umriss SF = 0,6) zu erhalten. In jedem Fall waren die Mitose-Zellen auf einer Linie zentriert, welche senkrecht die Hypotenuse durchschneidet. Auf den [L] wurden die Mitose-Zellen eng in der Nähe der rechtwinkligen Kante geclustert. Die Spindeln wurden angeordnet in einer Richtung parallel zur Hypotenuse des Dreiecks (2D). Die Winkelverteilung war so begrenzt wie sie sich für die Rechtecke zeigte abgesehen von einem größeren Formfaktor. Interessanterweise war die durchschnittliche Position der Mitose-Zellen auf den [Balken + Punkt] signifikant unterschiedlich von derjenigen auf dem [L], welche näher zur Hypotenuse des Dreiecks lag. Entscheidend ist, dass die Spindelorientierung auch parallel zur Hypotenuse auf dem [Balken + Punkt] war, jedoch mit einer zweifach größeren Winkelverteilung (2E).
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass, anders als für die Zellform, es die Verteilung von Zellanhaftungen an der Zellperipherie ist, welche die Mitose-Spindelorientierung und die Mitose-Zellpositionierung prädestiniert. Obwohl die Dreiecksverteilung von Vinculin und filamentösem Actin in Interphasezellen ähnlich war und die allgemeine Zellform reflektierte, lieferten die [L] und die [Balken + Punkt]-Muster zwei unterschiedliche externe Grenzflächenbedingungen, welche die innere Anordnung des Zelladhäsions-Actin-Systems bestimmte. Daher waren Actin-Bündel entlang von Nichtklebeseiten konsistent dicker und mit größeren Vinculin-positiven fokalen Adhäsionen assoziiert als diejenigen entlang von Klebekanten.
Die Erfinder schließen, dass Zellen auf Klebemustern auf die ungleichförmige Verteilung des Vinculin-Actin-Systems antworten und folglich die Symmetrie und das Gewicht der extern auferlegten Klebeoberflächen replizieren, eine Eigenschaft, welche unten ausgenutzt wird. Sie schlussfolgerten, dass diese starken Actin-Bündel die intrazelluläre Verteilung von Kompartimenten und anderen Cytoskelett-Netzwerken polen könnten wodurch Führungsschienen für die Zellteilung und die Spindelorientierung bereitgestellt würden. Der Mitose-Apparat in den Zellen auf [L] würde durch einzelne hauptsächliche unidirektionale Begrenzungen beeinflusst, wohingegen diejenigen in den Zellen auf [Balken + Punkt] zwei hauptsächliche rechtwinklige Begrenzungen liefern würden was zur gleichen durchschnittlichen Orientierung im Vergleich zu derjenigen auf [L] führen würde, jedoch mit einer größeren Variation. Merklich liegt in beiden Zellen die resultierende Begrenzung senkrecht nur zu der Ebene der Symmetrie, sowohl innerhalb des Mikro-Musters als auch der Zelle; diese Ebene schneidet die Hypotenuse.
Um des Weiteren die entsprechenden Rollen der räumlichen Auflösung und der Symmetrie der Klebegrenzflächen auf das Anleiten der Zellantwort zu analysieren, wurden peripherale Muster mit Formen von mehr als einer Symmetrieebene untersucht. Diese Muster basierten auf einem Quadrattemplat und schlossen folgendes ein: ein [Rahmen] Muster bestehend aus einem unausgefüllten Quadrat mit vier Symmetrieachsen; ein [L + Punkt] Muster bestehend aus zwei senkrechten Klebe- und zwei senkrechten Nichtklebekanten mit nur einer Symmetrieebene; und ein [Zwillingsbalken] Muster besteht aus zwei Paaren von gegenüberliegenden Kanten, wobei eine davon klebte und die andere nicht und zwei Achsen der Symmetrie (3F–3H). Vinculin-Actin-Strukturen zeigten ein Verhalten wie oben beschrieben; Elemente entlang der Nichtklebekanten waren häufiger, woraus folgt, dass innerhalb der Zelle die externe Symmetrie sowie die Balancen der Klebegrenzflächen reflektiert wurden (3F–3H).
Auf dem [Rahmen] Muster (Kantenlänge = 20 μm, Fläche = 900 μm², Umriss SF = 0,4) zeigten G2-Zellen vier äquivalente Vinculin-Actin-Strange entlang der Kanten (2F) und Mitose-Spindeln orientierten sich in erster Linie entlang einer oder der anderen Diagonalen (3F). Diese bevorzugte diagonale Orientierung schlägt anders als parallel zu den Kanten klar einen Prozess vor, durch welchen die Spindel die vier Komponenten des Interphasen-Cytoskeletts aufsummiert um sich selbst zu orientieren. Interessanterweise zeigte ein nicht peripherales Muster wie [Kreuz], welches die gleichen Symmetrieachsen wie der Rahmen aufwies eine ähnliche Balance innerhalb der Vinculin-Actin-Struktur (31) und der Spindelorientierungsverteilung (2I). Durch Reduzieren auf eine Symmetrieebene unter Verwendung des [L + Punkt] ordnete sich die Spindel senkrecht dazu an und die Verteilung der Mitose-Zellpositionen verschob sich in Richtung der Klebebalkenecke (2G).
Interessanterweise waren, dadurch, dass sie zwei Symmetrieebenen aufwiesen, bei Verwendung der [Zwillingsbalken] die Spindeln in erster Linie entlang einer Achse orientiert (2H). Diese Achse war parallel zu den Nichtklebekanten, was zu den beiden stärksten Vinculin-Actin-Strukturen korrespondierte (3H), und 45° zu der langen Zellachse. Die Orientierung, senkrecht zu der zweiten Ebene der Symmetrie war selten. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das Ungleichgewicht innerhalb der Klebeverteilung integriert ist in den Prozess der Spindelorientierung und andere geometrische Parameter übertrumpfen kann.
Als Schlussfolgerung bleibt, dass die Spindelorientierung orientiert werden kann, entweder durch Vermindern der Anzahl der Symmetrieelemente des Klebemusters oder durch Polarisierung ihrer entsprechenden Gewichte. Die lange Achse, definiert durch den Zellumriss, ist nicht kritisch und kann experimentell übertrumpft werden. Zellen interpretieren im Inneren die Symmetrien und Balancen der äußeren Klebebedingungen und dies erscheint als Führung für die Spindelorientierung.
Wie wird die Position des Mitose-Zellzentrums durch das Muster gesteuert ? Mitose-Zellrundung beginnt mit der Zellretraktion (Mitchison, 1992; Cramer und Mitchison. Mol. Biol. Cell 8, 109–119, 1997). Die Erfinder haben beobachtet, dass Zellmargins auf Nichtklebegrenzen, wo Actin-Fasern häufiger auftraten, zunächst zurückgezogen wurden und die ersten RFs an den korrespondierenden Zell-Apizes auftraten. Kontakt mit dem Klebemuster wurde dann progressiv zurückgezogen was dazu führte, dass der Zellkörper das Runden eventuell vervollständigte in der Nähe der Klebefläche. Dieser Mechanismus induzierte eine weite Verteilung von Mitose-Zellpositionen lokalisiert in der Nähe des Zentrums des [Rahmens], wohingegen er mehr konzentriert ist auf dem [Kreuz], verschoben ist in Richtung der Klebeecke auf dem [L + Punkt], und elongiert ist in Richtung der Klebefläche auf den [Zwillingsbalken] (siehe die Verteilungen in 2). Interessanterweise bleiben, unabhängig von der Abschlussposition des runden Zellkörpers die RFs in ihrer Verknüpfung zum Gesamtmuster erhalten (siehe 2 reche Spalte) und erschienen, so die Spindelorientierung zu beeinflussen. Dies führt zur wichtigen Frage der zeitlichen Korrelation zwischen Spindelausbildung und Zellretraktion.
Mitose-Zellrundung, Centrosom-Segregation und Spindelanordnung Die Separation der Tochter-Centrosomen wird häufig als Beginn der Mitose betrachtet. Wie jedoch dieses Event mit der Zellrundung korreliert ist, ist nicht klar bekannt. Es wurde beispielsweise berichtet, dass die Centrosom-Separation häufig in der Prometaphase vor dem Zellrunden stattfindet. Die Erfinder haben diesen Aspekt erneut untersucht in Zellen, welche auf einem unbegrenzten Klebesubstrat wandern, wie auch in Zellen, immobilisiert auf einem [L] Muster. Wie in 4A gezeigt, war die Segregation von Centrosomen merklich unterschiedlich in beiden Fällen. Mit wandernden Zellen schreitet die Centrosom-Separation häufiger dem Zellrunden voran und die Zeit, genommen zwischen diesen Ereignissen, variierte zwischen den Zellen. Bei Zellen, immobilisiert auf den [L], war der Beginn der Centrosom-Abtrennung eng synchronisiert mit der Zellrundung (4B). Die Centrosomen trennten sich, während die Kernhülle immer noch vorlag, und erreichten ihre endgültigen Positionen nur nachdem die Kernhülle zusammengebrochen war (aufgenommen durch die Neuverteilung von cytoplasmischem Centrin-GFP), was während der Zellrundung passierte.
Der Mechanismus, durch welchen das prämitotische Netzwerk remodelliert wurde während der Mitose-Kortikalretraktion und die korrelative Ausbildung von actinreichen Retraktionsfasern sind nicht vollständig verstanden. Um zu adressieren, ob die Spindelan- Ordnung stattfinden muss während des Remodullierens des Actin-Netzwerks um korrekt orientiert zu sein wurde vermieden, dass die Centrosomen sich während der Zellretraktion auf [L] Muster trennten und zwar durch Behandeln der premitotischen Zellen mit 10^-7 M Nocodazol über eine Stunde. Diese Behandlung blockierte die Zellen in der Metaphase mit ungetrennten Centrosomen, blockierte jedoch nicht das Zellrunden. Nach dem Auswaschen von Nocodazol trennten die Centrosomen und bildeten eine bipolare Spindel (4C). Selbst, falls sie viel breiter als die nicht behandelten Zellen war, war die Verteilung der Spindelorientierungen nach dem Nocodazol-Auswaschen immer noch preferenziell parallel zur Hypotenuse des Dreiecks (4D) orientiert. Dies zeigt, dass die Mitose-Zellretraktion in der Abwesenheit von Mikrotubuli zu runden Zellen führt, welche immer noch sensitiv für Klebemuster sind. RFs sind gute Kandidaten, um die Spindelorientierung zu führen, da sie trotz Nocodazol-Behandlung beibehalten werden.
Tatsächlich hängt – wie für andere Ergebnisse der Erfinder – die Verteilung von RFs direkt vom Klebeprofil ab. Sie sind beinahe abwesend in Klebeflächen. Die entsprechenden Orientierungen ihrer Klebezonen auf dem runden Zellkörper korrespondieren systematisch mit den präferenziellen Orientierungen der Spindelpole (2). Rechteck, [L]- und [Zwillingsbalken]-Muster lieferten alle effektive Begrenzung durch die Spindelorientierung und induzierten die Ausbildung von zwei hauptsächlichen gegenüberliegenden kortikalen Anbindungszonen von RFs, während Muster, welche die Ausbildung von mehr als zwei hauptsächlichen RFs-Anbindungszonen auf dem runden Zellkörper ([vollständiges Dreieck], [Balken + Punkt], [Rahmen], [L + Punkt]) induzierten, viel weniger effizient waren beim Steuern der Spindelorientierung. Beispielsweise waren trotz ähnlicher Mitose-Zellpositionierung auf dem [L]- und [L + Punkt]-Muster die zusätzlichen RFs, induziert durch den Punkt, hinreichend, um die Spindelorientierung zu destabilisieren. RFs sind auffällig direkt, was impliziert, dass sie unter Spannung stehen. Sie sind daher scheinbar in der Lage die notwendigen strukturellen und biochemischen Informationen von der Prämitose-Actin-Vinculin-Struktur auf dem Spindelapparat zu übertragen.
Diskussion
Die Erfinder haben demonstriert, dass sowohl die Position der Mitose-Zelle und die Orientierung der Mitose-Spindel innerhalb der Zelle exquisit sensitiv für externe Klebemuster sind. Es ist die Antwort der Zelle gegen das Klebemuster, d.h. die Koanordnung der Adhäsion und der Stressfasern in das nicht isotrope Netzwerk aufgrund der Muster- Topologie, welche die Orientierung der bipolaren Spindel beim Beginn der Mitose steuert. Es wurde gezeigt, dass die Größe und Orientierung der fokalen Adhäsionen direkt korreliert sind mit der Traktion, die eine Zelle auf ein Substrat ausübt. Bei vollständig klebrigen Quadrat-Mikro-Muster sind diese Kräfte effektiv viel starker bei Zelleckpunkten, wo sich Vinculin akkumuliert. Konsequenterweise reflektieren die Symmetrien und Ungleichgewichte innerhalb des Vinculin-Actin-Netzwerks die Richtungen und Intensitäten der Kraftverteilung an der Zellsubstratgrenzfläche. Tatsächlich wurde eine solche präferenzielle Orientierung des Actin-Cytoskeletts in jüngster Zeit mit einem 3d Anisotropie-Kraftfeld innerhalb der klebenden Zellen korreliert. Die vorliegende Beobachtungen legen dann nahe, dass die Spindelachse symmetrisch angeordnet ist entlang des Kraftfelds, entwickelt in der Interphase, was dann partiell aufrechterhalten werden konnte während der Mitose durch die Spannung der zurückziehenden Fasern. Diese Anordnung erzeugt eine stabile Konfiguration geeignet für die Migration von Chromsomen entlang des Traktionsfeldes, für die Ausbildung von Tochterzellen und für selbige um das Zelltraktionsfeld wieder herzustellen, und so die Cytokinese zu vervollständigen. Tatsächlich könnte dies instrumentell sein zum Aufrechterhalten der Gewebeintegrität.
Die Schlussfolgerung ist, dass der vorliegende Ansatz einen unerwarteten Anknüpfungspunkt geliefert hat zwischen der globalen Organisation von Zelltraktionskräften und der Teilungsachse. Er ist reproduzierbar und die Automatisierung sollte wertvoll sein für die Neuerforschung der Signalkaskade involviert in die Spindelwechselwirkungen mit dem Zellkortex.
BEISPIEL 2
Material und Methoden
Chemikalien

PDMS,: Sylgard, Dow Corning, ref: 1673921, 184 Silizium Elastomer Kit.
Mercapto-silane: Roth Sochiel, ref: SIM6476.0,3-Mercaptopropyulrimethoxysilan.
PEG-mal: Shear Water mPEG-MALMW: 5000, ref 2D2MOH01.
Fibronectin: Sigma
Trypsin

Mikrokontaktdrucken μCP
Ein Mastertemplat wurde erstellt unter Verwendung eines fotolithografischen Verfahrens, entwickelt und vollständig beschrieben bei Whitesides et al. (Annu. Rev. Biomed. Eng., 2001, S. 335–373). Kurz gesagt wurde ein Silizium-Wafer überzogen mit einer Fotolackschicht beleuchtet mit UV durch eine Chrommaske, auf welcher das Muster mit einem Elektronenstrahl konzipiert worden war. Ein elastomerer Poly(dimethylsiloxan), PDMA, Stempel wurde gegossen auf dem Master und 3 Stunden bei 60°C ausgehärtet, um die negativen Merkmale des Masters zu reproduzieren. Der Stempel aus PDMS wurde ultraschallbehandelt in Ethanol 70 % für 2 Minuten und mit eingeblasener Luft getrocknet anschließend oxidiert in einem Luftplasma für 10 Sekunden und mit der Proteinlösung getränkt, 50 μg/ml von Fibronectin in Wasser für 30 Minuten. Anschließend wurde die Lösung begast und der Stempel getrocknet mit filtrierter Luft, bevor er in Kontakt mit einem silanisierten Deckgläschen für 15 Minuten gebracht wurde. Das Deckgläschen wurde zuvor oxidiert mit einer "Piranha"-Lösung (30 % H₂O₂ 33 %, 70 % H₂SO₄ 96 %) für 10 Minuten, silanisiert (in 10 ml Methanol, 86 μl Essigsäure, 450 μl deionisiertem Wasser, 212 μl Mercaptosilan) für 3 h beim Raumtemperatur, gewaschen in Methanol und getrocknet 10 Minuten bei 60°C. Nach Entfernen des Stempels wurde das bedruckte Deckgläschen inkubiert in einem Maleimidpoly(ethylenglycol), PEG-mal, Lösung 10 mg/ml in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Des Deckgläschen wurde anschließend milde gewaschen in PBS und war fertig für die Zellabscheidung.
Zellkultur und Abscheidung
Zellen wurden kultiviert in Dulbecco Modified Eagle Medium mit 10 % Kälberserum, 1 % Penizillin und Streptomycin und 1 % Glutamin bei 37°C. Die Zellen wurden gewaschen mit warmer PBS und entfernt aus ihren Kolben mit Trypsin 2 Minuten bei 37°C. Nach Entfernen des Trypsins durch Zentrifugation wurden die Zellen resuspendiert in DMEM mit so wenig Serum als möglich und abgeschieden ab dem bedruckten Deckgläschen bei ungefähr 10⁴ Zellen/cm² Dichte. Nach weniger als 30 Minuten wurden die nicht anhaftenden Zellen entfernt. Eine Stunde später wurden die Zellen in ihrer begrenzten Form ins Gleichgewicht gebracht und waren fertig für die Fixierung oder die Videomikroskopie.
Ergebnisse
Fokale Klebungen und Actin-Netzwerk
In Serummedium von wenig Gehalt wurden fokale Adhäsionen streng begrenzt auf die Klebemuster. Zellformen korrespondierten stets mit der konvexen Umhüllung der Klebe-Mikro-Muster. Auf den L-förmigen Mikro-Muster hatten die Zellen eine rechtwinklig dreieckige Form, entwickeln aber nicht jegliche fokale Klebungen auf den Nichtklebeflächen. Verschiedene Zelltypen zeigten sehr spezifisches und repetitives Klebeverhalten auf L-förmigen Mikro-Muster. Die Actin-Netzwerkstruktur war direkt korreliert mit spezifischen Verteilungen der fokalen Klebungen.
L929
Zellen entwickelten fokale Klebungen über das gesamte Klebe-Mikro-Muster und an dessen Peripherie, außer am konkaven Sektor der Peripherie, welche der Nichtklebefläche gegenüberlag. Actin-Fasern wurden stets verankert auf beiden Seiten des Nichtklebelochs und wurden prinzipiell parallel zu Hypotenuse des L-förmigen Musters orientiert. Die Verteilung von Fibronectin folgte dem L-förmigen Muster (siehe 6).
MDCK
Zellen entwickelten fokale Klebungen nur an der Zellperipherie der Klebeoberfläche, jedoch nicht am konkaven Sektor der Peripherie, welche der Nichtklebefläche gegenüberlag. Es scheint, dass Vinculin sich an den Zellecken (oder Eckpunkten) akkumulierte und dass, falls die Zellecken nahe genug beieinander waren, sie eine lange kontinuierliche Klebekante erzeugen konnten. Actin-Fasern sind nahezu begrenzt auf die Zellperipherie. Ein ähnliches Bild zeigt sich für Kontrollzellen kultiviert auf einer unbegrenzten Klebefläche, wobei die L-förmigen Mikro-Muster einen stark normalisierenden Effekt auf die Verteilung von individualen fokalen Adhäsionen haben. Die Verteilung von Fibronectin zeigte ein L-förmiges Muster (siehe 7).
HeLa
Vinculin lag im Überschluss im Cytoplasma vor, verteilt in einer zufälligen Art und Weise, was die Existenz eines löslichen Pools nahelegt. Zellen entwickeln die meisten ihrer fokalen Komplexe an den Zelleckpunkten und entlang der Peripherie der Klebeoberfläche, jedoch wieder einmal nicht am konkaven Sektor der Peripherie, welcher der Nichtklebefläche gegenüberlag. Actin-Faser war über die vollständige Zelle verteilt. Die Verteilung von Fibronectin folgte dem L-förmigen Muster (siehe 8).
Mikrotubulusdynamik
Das Mikrotubulinetzwerk ist zu dicht, um eine offensichtliche Korrelation zwischen ihrer Struktur und dem Klebemuster zu zeigen. Jedoch einige Proteine, assoziiert mit dem wachsenden Plusenden der Mikrotubuli wie EB1 können Einblick gewähren. Die meisten erwachsenen Enden waren an der Peripherie von rechtwinkligen dreieckigen Zellen lokalisiert und auch eng am kerngebenden Zentrum, dem Centrosom, von wo sie scheinbar radial Richtung Zellkantenpunkte sich erstreckten (siehe 9). EB1-Dynamiken, aufgenommen durch Videoaufzeichnungen bestätigten, dass die Mikrotubuli in erster Linie in Richtung von zwei scharfen Ecken der rechtwinkligen dreieckigen Zelle wuchsen (siehe 10).
Centrosom-Position
Die Klebemuster ermöglichen die Definition einer Fläche mit 90 % Präsenz der hervorstehenden durchschnittlichen Centriol-Position in der Interphase (siehe 11).
Golgi-Struktur
Das Mikrotubulus-Netzwerk fungiert in einer sehr komplexen Art und Weise als ein Scaffold für die Golgi-Apparatstruktur. Zellen auf den Klebe-Mikro-Mustern können nicht wandern. Die gesamte Golgi-Struktur, welche klassischerweise in der Umgebung des Centrosoms lokalisiert ist, wurde von CGN nach TGN polarisiert, nicht nur lokal wie in klassischen Kulturbedingungen zu beobachten ist (12B), sondern global auf der Ebene ganzer Organellen (12A). Der Golgi-Apparat war nicht weiter durch Zellabflachung zerdreht, sondern zeigte eine konzentrische Organisation der verschiedenen Kompartimente um das Centrosom. Siehe auch 13.
Spindelorientierung
Auf L-förmigen Klebe-Mikro-Mustern teilen sich mehr als 80 % der Zellen entlang einer Achse, welche einen Winkel mit der L-Hypotenuse ergibt, der kleiner als 10° ist. Sogar die kleinsten L-förmigen Klebe-Mikro-Muster waren effektiv um die Zellteilung zu orientieren (siehe 14).
Da die Äste der L-förmigen Klebe-Mikro-Muster kürzer wurden und breiter (die nicht klebende Fläche nimmt ab) (siehe 15), wurde die Verteilung des Winkels zwischen der Spindelachse und der Hypotenuse breiter (siehe 16 und 17).

Claims

Eine Vorrichtung zum Anhaften von zumindest einer Zelle in einer spezifischen und vorher bestimmten Position mit einer gesteuerten Polarisierung der inneren Zellorganisation, umfassend: – eine Platte, welche eine Oberfläche definiert; und – zumindest ein anisotropes Klebemuster auf besagter Oberfläche, wobei die Größe von besagtem Muster so ist, dass nur eine individuelle tierische oder menschliche Zelle in besagtem Muster anhaften kann mit einer gesteuerten Polarisierung der inneren Zellorganisation; und wobei das anisotrope Klebemuster entweder ein konkaves Klebemuster ist, oder eine lange und dünne Klebefläche mit einem Formfaktor von weniger als 0,6.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei besagte Klebemuster entweder aus einer einzelnen verbundenen Klebeoberfläche oder aus mehreren nicht verbundenen Klebeflächen ausgebildet ist.
Die Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2, wobei besagtes Klebemuster aus einer Kombination von Klebeelementen besteht, ausgewählt aus einer Linie, einer Krümmung und einem Punkt.
Eine Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei besagtes anisotropes Klebemuster ein konkaves Klebemuster ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 4, wobei die konvexe Hülle von besagtem Klebemuster eine oder mehrere Klebelinien oder Krümmungen umfasst.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 5, wobei besagte konvexe Hülle ein Polygon ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 6, wobei das Polygon ein Dreieck ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 7, wobei besagtes Dreieck zwei Klebekanten aufweist.
Die Vorrichtung gemäß Ansprach 8, wobei der Winkel zwischen den beiden Klebekanten ungefähr 90° ist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 6, wobei besagtes Polygon ein Viereck
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 10, wobei besagtes Viereck zwei nicht aufeinanderfolgende Klebekanten aufweist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 10, wobei besagtes Viereck zwei aufeinanderfolgende Klebekanten und eine Klebeecke aufweist.
Die Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei besagte Vorrichtung eine Vielzahl von Klebemustern aufweist, isoliert voneinander durch cytophobe Regionen, an welche Zellen nicht haften.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 13, wobei besagte Vorrichtung zumindest 100 Klebemuster aufweist.
Die Vorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei besagte Vorrichtung zwischen 5.000 und 15.000 Klebemuster/cm² umfasst.
Die Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die durch das Klebemuster einbeschriebene Oberfläche essentiell nicht adhäsiv ist.
Ein Verfahren zum Immobilisieren einer Zelle auf einer Oberfläche, wobei das Verfahren folgendes umfasst: – Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16; – Exponieren der Platte gegen mindestens eine Zelle über einen Zeitraum, der hinreichend ist, zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an das (die) Klebemuster binden.
Ein Verfahren zum Steuern der Zellform und der globalen inneren Zellorganisation, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst: – Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16; – in Kontakt bringen von besagter Vielzahl von besagten Klebemustern mit zumindest einer Zelle über einen Zeitraum, welcher hinreichend ist, zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an die Klebemuster anhaften; und – Kultivieren der Zelle(n) auf den Klebemustern, wobei gleichzeitig ermöglicht wird, dass die Form des Klebemusters die Form der Zelle beeinflusst und die Polarisierung der Zellmaschinerie.
Ein Verfahren zum Untersuchen der Form, der globalen inneren Zellorganisation und/oder einer Funktion einer Zelle, wobei besagtes Verfahren folgendes umfasst: – Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16; – in Kontakt bringen von besagtem Klebemuster (besagten Klebemustern) mit zumindest einer Zelle über einen Zeitraum, der hinreichend ist, zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an die Klebemuster anhaftet (anhaften); – Kultivieren der Zelle(n) auf dem Klebemuster (den Klebemustern); und – Beobachten der Form, der globalen inneren Zellorganisation, der Mitose und/oder einer Funktion von besagter Zelle(n).
Ein Verfahren zum Auswählen von biologisch aktiven Verbindungen, wobei das Verfahren folgendes umfasst: – Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16; – in Kontakt bringen von besagtem Klebemuster (besagten Klebemustern) mit zumindest einer Zelle über einen Zeitraum, der hinreichend ist, zu ermöglichen, dass die Zelle(n) an die Klebemuster anhaften; – in Kontakt bringen einer Testverbindung mit besagter Zelle (besagten Zellen); – Kultivieren der Zelle(n) auf den Klebemustern; und – Beobachten der Form, der globalen inneren Zellorganisation, der Mitose und/oder einer Funktion von besagter Zelle (besagten Zellen).
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei besagtes Verfahren einen weiteren Schritt des Vergleichens der Form, der globalen inneren Zellorganisation und/oder einer Funktion von besagter Zelle (besagten Zellen) mit Zellen, die nicht mit besagter Verbindung in Kontakt gebracht wurden, umfasst.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die globale innere Zellorganisation bewertet wird durch die Position des Centrosoms und der Position des Golgi-Apparates, die räumliche Verteilung der Actinfilamente und/oder der mitotischen Spindel-Orientierung.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das Verfahren eine automatisierte Analyse von besagter Zelle (besagten Zellen) umfasst unter Verwendung eines Bildanalyseapparates, einschließend eine spezifische Software unter Verwendung eines Algorithmus, konzipiert für solch eine Analyse.
Das Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei eine automatisierte Analyse folgendes umfasst: a) Identifizieren der Position der Klebemuster auf der Platte; b) Aufzeichnen von Zellbildern zu verschiedenen Zeitpunkten für mehrere identifizierte Muster; c) Einpassen einer Ellipse auf der Zellkontur von Zellbildern; d) Nachweisen der Teilungszeit und Bestimmen der Parameter von Interesse unter welchen die Spindelorientierung ist.
Ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine Zelle einen transformierten Phenotyp aufweist, der assoziiert ist mit einer Spindel-Missorientierung, wobei das Verfahren folgendes umfasst: – Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16; – in Kontakt bringen von besagten Klebemustern mit Zellen, um auf einen Zeitraum zu testen, welcher hinreichend ist, zu ermöglichen, dass die Zellen an die Klebemuster anhaften; – Kultivieren der Zellen, um auf Klebemuster zu testen; – Bestimmen der Spindelorientierung für jede Zelle und Vergleich der Spindelorientierung von verschiedenen Zellen; – wobei eine große Spindelorientierungs-Verteilung anzeigt, dass die getestete Zelle einen transformierten Phenotyp aufweist, assoziiert mit einer Spindelmissorientierung.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16 zum Screenen nach einer Verbindung von Interesse.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16 zum Identifizieren eines Gens von Interesse.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16 zum Bestimmen, ob eine Zelle ihre Fähigkeit verloren hat, eine geeignete Orientierung der Spindel zu steuern.