-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Konjugate, die ein Enzym umfassen.
Insbesondere betrifft sie Konjugate, welche ein glycosyliertes Enzym
umfassen, wobei das glycosylierte Enzym eine alkalische Phosphatase
ist, die durch Rekombinationsmaßnahmen
in einem eukaryotischen mikrobiellen Wirt erzeugt wurde.
-
Glycoproteine
sind glycosylierte Polypeptide. Die Glycosylierung der Polypeptide
ist gewöhnlich
entweder N- oder O-verknüpft.
N-verknüpft
betrifft die Bindung der Kohlenhydrateinheit an die Seitenkette
eines Asparagin-Restes. Die Tripeptid-Sequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin,
wobei X eine beliebige Aminosäure
außer
Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen zur enzymatischen Bindung
der Kohlenhydrateinheit an die Asparaginseitenkette. Somit erzeugt
die Anwesenheit von einer der Tripeptid-Sequenzen in einem Polypeptid eine potentielle
Glycosylierungsstelle. O-verknüpfte
Glycosylierung betrifft die Bindung von Zuckern, beispielsweise
N-Acetylgalactosamin,
Galactose oder Xylose, an eine Hydroxylaminosäure, meist Serin oder Threonin,
obschon 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin ebenfalls verwendet
werden können. Die
N-verknüpften
Oligosaccharide sind weiter unterteilt in 3 Untergruppen, nämlich den
mannosereichen Typ, den komplexen Typ und den Hybridtyp. N-verknüpfte Oligosaccharide
sind häufig
verzweigt, wobei die Verzweigung gewöhnlich entweder an einem Mannoserest
oder an einem N-Acetylglucosaminrest erfolgt. Diese verzweigten
Strukturen werden biantennarisch genannt, wenn zwei Verzweigungen
vorhanden sind, und triantennarisch, wenn drei Verzweigungen vorhanden
sind.
-
Gängige Verfahren
zur Analyse der Kohlenhydratstruktur beruhen auf komplexen Mehrschritt-Verfahren. Diese
Verfahren beinhalten Techniken, wie Massenspektrometrie, NMR, schnellen
Atombeschuss, komplexe Chromatographie-Techniken (Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie,
Gasphasenchromatographie, Innenaustausch, und Umkehrphasenchromatographie)
und komplexe Reihen chemischer Reaktionen (Methylierungsanalyse,
Periodatoxidation und verschiedene Hydrolysereaktionen), die jeweils
in verschiedenen Kombinationen zur Bestimmung der Sequenz der Oligosaccharide
und der Eigenschaften ihrer glycosidischen Bindung verwendet wurden.
Jedes Verfahren kann bestimmte Stücke von Information über die
Kohlenhydratstruktur bereitstellen, jedoch hat jedes Verfahren Nachteile.
Beispielsweise kann der schnelle Atombeschuss (Dell, A., Adv. Carbohydr.
Chem. Biochem. 45 (1987) 19-72) einige Größen- und Sequenzdaten bereitstellen,
stellt aber keine Information über
Verknüpfungspositionen
oder anomere Konfiguration bereit. NMR ist das leistungsfähigste Werkzeug
zur Analyse von Kohlenhydraten (Vliegenthart et al., Adv. Carbohydr.
Chem. 41 (1983) 209-375), ist aber relativ unempfindlich und erfordert
große
Mengen Analyt. Ein Überblick über diese Verfahren
wurde von Spellman, M.W., Anal. Chem. 62 (1990) 1714-1722; Lee,
K.B. et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 23 (1990) 53-80; und Geisow, M.J.,
Bio/Technology 10 (1992) 277-280 gegeben.
-
Die
Entfernung von Kohlenhydrateinheiten aus einem gereinigten glycosylierten
Protein kann chemisch oder enzymatisch bewerkstelligt werden. Die
chemische Deglycosylierung durch Aussetzen des Polypeptids gegenüber der
Verbindung Trifluormethansulfonsäure
oder einer äquivalenten
Verbindung kann zur Spaltung eines Großteils oder des gesamten Zuckers
außer
dem Verbindungszucker (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin) führen, während das
Polypeptid intakt bleibt. Die chemische Deglycosylierung wurde von
Sojar, H.T. und Bahl, O-P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57
und von Edge, A.S.B. et al., Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137 beschrieben.
Die enzymatische Spaltung der Kohlenhydrateinheiten an den Polypeptiden
kann erzielt werden durch die Verwendung einer Reihe von Endo- und
Exo-Glycosidasen wie beschrieben von Thotakura, N.R. und Bahl, O.P.,
Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.
-
Man
kennt im Stand der Technik glycosylierte Enzyme, bei denen die Kohlenhydrateinheit
zur Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität erforderlich ist. Ein Beispiel
dafür ist
beschrieben von Barbaric, S. et al., Arch. Biochem. Biophys 234
(1984) 567-575. Saure Phosphatase, gereinigt aus der Hefe Saccharomyces
cerevisiae wurde durch Endo-β-N-acetylglucosaminidase
H oder durch HF-Behandlung deglycosyliert. Das 90% deglycosylierte
Enzym zeigte einen ausgeprägten
Verlust der Enzymaktivität,
der von der Unterbrechung der dreidimensionalen Struktur begleitet
war.
-
Houba,
H.J. et al., Bioconjugate Chem. 7 (1996) 606-611, beschreiben die
Modifikation der menschlichen Beta-Glucuronidase mittels NaIO4 und NaBH4 zur Verbesserung
der Retention des Enzyms im Kreislauf. Das modifizierte Enzym wurde
zur Herstellung von Immunkonjugaten verwendet.
-
Die
Expression heterologer Proteine in Hefe führt oft zu schwer glycosylierten
Proteinen mit hohem Mannosegehalt (Tanner, W. und Lehle, L., Biochim.
Biophys. Acta 906 (1987) 81-99). Ein Beispiel dafür ist Alpha-Galactosidase
von der Pflanze Cyamopsis tetragonoloba (Guar), die als heterologes
Protein in der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha erzeugt
wurde (Fellinger, A.J. et al., Yeast 7 (1991) 463-473). In C. tetragonoloba
ist die Alpha-Galactosidase ein Glycoprotein. Die durch H. polymorpha
sezernierte Alpha-Galactosidase wurde ebenfalls glycosyliert und
hatte einen Zuckergehalt von 9,5%. Die spezifische Aktivität der Alpha-Galactosidase,
die durch H. polymorpha erzeugt wurde, betrug 38 U/mg, verglichen
mit 100 U/mg für
die native Alpha-Galactosidase aus Guar. Bemerkenswerterweise stellte
die Deglycosylierung der Alpha-Galactosidase die spezifische Aktivität vollständig wieder
her.
-
Bei
der Reinigung aus nativem Säugetierwirtsgewebe
birgt ein zur Bildung eines Konjugats verwendetes Protein die Gefahr,
dass eine ungewünschte
Verbindung, wie ein Inhibitor oder ein Pathogen gleichzeitig mit
gereinigt wird. Alkalische Phosphatase aus Rind, die aus Rindergewebe
isoliert wird, kann beispielsweise mit pathogenem Rinderprionenprotein
kontaminiert sein. Aus diesem Grund ist die rekombinante Expression des
gewünschten
Proteins in einem mikrobiellen Wirt, wie Hefe, bevorzugt. Sehr stark
bevorzugt ist eine methylotrophe Hefe, als mikrobieller Wirt. Die
Expression eines gewünschten
Proteins kann einen Vorteil der intrazellulären Trafficking-Wege nutzen,
wie dem sekretorischen Weg, der die Modifikation des gewünschten Proteins
durch Glycosylierung umfasst.
-
EP 1 176 205 offenbart sehr
aktive eukaryotische alkalische Phosphatase, die als heterologes
Protein in Pichia pastoris exprimiert wird, die auch durch Hefe
glycosyliert wird, wenn sie auf den sekretorischen Weg zielt. Bemerkenswerterweise ähneln die
Eigenschaften des aus Hefe stammenden Enzyms denjenigen des nativen
glycosylierten Enzyms, das aus Rinderdarm gereinigt wird. Folglich
wird berichtet, dass die spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase,
die als heterologes Protein in Pichia pastoris exprimiert wird,
eine spezifische Aktivität
von 7000 U/mg hat. Somit stört
die hefespezifische Kohlenhydrateinheit die enzymatische Aktivität des freien
Enzyms nicht.
-
Die
alkalische Phosphatase ist ein Beispiel für ein Enzym, das häufig als
Markierung in Analyseverfahren für
die Erfassung chemischer oder biologischer Substanzen verwendet
wird. Die meisten dieser Verfahren beruhen auf dem, was man als "spezifische Bindungs-"Reaktionen kennt,
in der eine zu erfassende Substanz, die als "Zielmolekül" oder "Analyt" bezeichnet wird, spezifisch und vorzugsweise
mit einem entsprechenden "Molekül, das an
ein Zielmolekül" oder einen "Rezeptor" binden kann, reagiert.
Die meisten gut bekannten spezifischen Bindungsreaktionen erfolgen
zwischen den Immunreaktanten, beispielsweise Antikörpern und Antigenen
oder Haptenen. "Hapten" steht für jedes
Molekül,
das als Antigen wirken kann, aber das selbst keine Immunreaktion
hervorrufen kann. Zum Hervorrufen einer geeigneten Antikörperreaktion
kann ein Hapten gewöhnlich über eine
kovalente Bindung an einen immunogenen Träger gebunden werden, so dass
man ein immunogenes Konjugat erhält,
das Antikörper
hervorrufen kann, die für
das Hapten spezifisch sind.
-
Ebenfalls
bekannt sind andere spezifische Bindungsreaktionen, wie Avidin oder
Streptavidin mit Biotin, ein Kohlenhydrat mit einem Lectin, oder
ein Hormon mit einem Hormonrezeptor. Der Begriff spezifische Bindung
umfasst auch die Wechselwirkung der komplementären Nukleinsäuren oder
Analoga davon in einer Hybridisierungsreaktion. Eine spezifische
Bindung erfolgt darüber
hinaus bekanntlich zwischen einem Protein und einer Nukleinsäure oder
einem Nukleinsäure-Analogon. Ein Beispiel
für ein
Nukleinsäure-Analogon
ist ein Phosphorthioat oder eine Peptid-Nukleinsäure ("PNA")
-
Da
die Proben, die analysiert werden sollen, die Zielmoleküle oft in
sehr kleinen Mengen enthalten, werden Verfahren auf der Basis der
Immuntests vorzugsweise für
ihre Erfassung verwendet, womit die Zielmoleküle sehr spezifisch und genau
bestimmt werden können.
Es gibt viele Varianten dieser Verfahren. Die verschiedenen immunologischen
Bestimmungsverfahren können
in homogene und heterogene Verfahren unterteilt werden. Eine Festphasenreaktion
bildet immer einen Teil des "heterogenen" Verfahrens, damit
Komplexe immobilisiert werden, die die zu erfassende Substanz und
eine markierte Komponente enthalten, und somit zu ihrer Trennung
von ungebundenen markierten Komponenten. In der Variante des "homogenen" Verfahren gibt es
keine Trennung von gebundener und ungebundener Markierung, so dass
die gebundene und ungebundene Markierung durch andere Verfahren
differenziert werden müssen.
-
Die "Markierung" ist ein beliebiges
Molekül,
das ein Signal erzeugt, oder so induziert werden kann, dass es ein
solches erzeugt. Man kennt viele verschiedene "markierte Komponenten" für Immuntests.
Ein Teil einer markierten Komponente, die Markierung, ist ein Enzym,
das eine oder mehrere verschiedene zusätzliche Komponenten zur Erzeugung
eines Signals benötigt,
und das signalerzeugende System umfasst alle Komponenten, die zur
Erzeugung eines messbaren Signals erforderlich sind. Somit wird
das Signal durch Erfassen der Enzymaktivität erfasst und/oder gemessen.
Die zusätzlichen
Komponenten können
Substrate, Coenzyme, Enhancer, zusätzliche Enzyme, Substanzen,
die mit den Produkten reagieren, die durch enzymatische Aktivität erzeugt
werden, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Fänger, Metallionen,
und eine spezifische Bindungssubstanz, die für die Bindung der signalerzeugenden
Substanzen erforderlich ist, umfassen. Eine eingehende Diskussion
geeigneter signalerzeugender Systeme findet sich in
US 4,275,149 und
US 5,185,243 . Beispiele für Enzyme
und Substrate umfassen alkalische Phosphatase mit para-Nitrophenylphosphat
als chromogenes Substrat. Der Fachmann kennt jedoch viele andere
Enzym-Substrat-Kombinationen.
-
Ein
weiterer Teil einer markierten Komponente ist ein Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann, das durch einen Antikörper oder ein funktionelles
Fragment eines Antikörpers
veranschaulicht wird. Einzelketten-Antikörper und chimäre, humanisierte
oder primatisierte (CDR-gepfropfte) Antikörper sowie chimäre oder CDR-gepfropfte Einzelketten-Antikörper und
dergleichen mit Abschnitten, die von verschiedenen Arten herstammen,
sind ebenfalls von dem Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet
wird, umfasst. Die verschiedenen Abschnitte dieser Antikörper können chemisch
durch herkömmliche
Techniken verknüpft
werden oder sie können
als durchgehendes Protein hergestellt werden, wobei gentechnische
Verfahren verwendet werden. Zudem können auch funktionelle Fragmente
der Antikörper,
wie u.a. Fragmente von chimären,
humanisierten, primatisierten oder Einzelkettenantikörpern produziert
werden. Funktionelle Fragmente der vorangehenden Antikörper behalten
zumindest eine Bindungsfunktion des Volllängenantikörpers, von dem sie hergeleitet
sind. Bevorzugte funktionelle Fragmente behalten eine Antigenbindungsfunktion
eines entsprechenden Volllängenantikörpers. Andere.
Beispiele für
ein Molekül,
das an ein Zielmolekül
in einer markierten Komponente binden kann, sind Avidin, Streptavidin,
Lectine, Nukleinsäuren
oder Analoga davon.
-
Eine
markierte Komponente, die zwei Abschnitte umfasst, d.h. ein Enzym
und ein Molekül,
das an ein Zielmolekül
binden kann, kann erhalten werden durch Bilden eines "Konjugats", d.h. durch Konjugation
der beiden Abschnitte. Ein Konjugat ist ein Molekül, das aus
zwei oder mehreren Molekülen
besteht, die aneinander gebunden sind, und zwar gegebenenfalls durch
eine Verbindungsgruppe, so dass man eine einzelne Struktur enthält. Die
Bindung kann entweder über
eine direkte Verbindung zwischen den Molekülen oder über eine Verbindungsgruppe
erfolgen. Ein Überblick über die
Bildung von Konjugaten, insbesondere die Konjugation von Enzymen,
findet sich in Hermanson, G.T., In: Bioconjugate Techniques, Kap.
16, Academic Press 1996, S. 630-638. Techniken zum Konjugieren von
Enzymen an Proteine sind in O'Sullivan,
M.J. und Marks, V., Methods Enzymol. 73 (1981) 147-166 beschrieben.
-
In
einem Konjugat kann die Funktion, d.h. die Aktivität eines
Enzyms alkalische Phosphatase, das hier als Markierung vorhanden
ist, aus mehreren Gründen
gestört
werden. In dem Konjugat kann das Enzym beispielsweise eine veränderte und
unteroptimale Konformation haben. Ein weiteres Beispiel ist eine
Wechselwirkung des Enzyms mit einem Molekül, mit dem es ein Konjugat
bildet, beispielsweise ein Antikörper.
In einem solchen Fall kann die gestörte Enzymaktivität in dem
Konjugat von sterischen Effekten herrühren, die beispielsweise den
Zugang eines Substrates zum katalytischen Zentrum des Enzyms reduzieren.
Folglich hat ein Test zur Erfassung der Anwesenheit oder Bestimmung
der Menge eines Zielmoleküls,
wie ein Immuntest (ein Erfassungstest) eine reduzierte Empfindlichkeit,
wenn die markierte Komponente ein Konjugat ist, das ein Enzym alkalische
Phosphatase mit einer gestörten
Aktivität
umfasst. Die Empfindlichkeit eines Nachweistests, wie eines Immuntests,
kann dagegen durch Entfernen jeglicher Hindernisse, die die Aktivität des Enzyms
in dem Konjugat stören,
die in dem Test als markierte Komponente verwendet werden, erhöht werden.
-
Eine
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Enzyms alkalische
Phosphatase zur Herstellung eines Konjugats als markierte Komponente,
die die Empfindlichkeit eines Tests zur Bestimmung der Anwesenheit
oder Bestimmung der Menge eines Zielmoleküls erhöht, wobei das Enzym von einem
eukaryotischen Organismus hergeleitet ist, d.h. es wurde in einem
eukaryotischen Organismus exprimiert und/oder aus diesem gereinigt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines
Enzyms alkalische Phosphatase zur Herstellung eines Konjugats als
markierte Komponente, die die Empfindlichkeit eines Immuntests steigert,
wobei das Enzym rekombinant in Hefe erzeugt wurde, insbesondere
in methylotropher Hefe.
-
Die
Erfinder haben überraschend
gefunden, dass die Empfindlichkeit des Tests zur Bestimmung der Anwesenheit
oder der Menge eines Zielmoleküls,
in dem das Konjugat als markierte Komponenten verwendet wird, erhöht wird,
wenn ein von einem eukaryotischen Organismus hergeleitetes Enzym
alkalische Phosphatase vor der Bildung des Konjugats deglycosyliert
wird, d.h. vor der Bindung des Enzyms an das Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann. Daher ist eine erste Ausführungsform der Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus einem Molekül, das an ein
Zielmolekül
binden kann, und einem Enzym, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen
eines glycosylierten Enzyms alkalische Phosphatase, das die Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1 umfasst, erhalten durch Expression in einer transformierten
Hefe und daraus isoliert, (b) Deglycosylieren des Enzyms aus Schritt
(a) mit der Endo-β-N-acetylglucosaminidase
H, (c) Isolieren des deglycosylierten Enzyms, (d) Binden des deglycosylierten
Enzyms aus Schritt (c) an das Molekül, das an ein Zielmolekül binden
kann. Eine weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Konjugat aus einem Molekül, das an ein Zielmolekül binden
kann, und einem Enzym, das durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhalten werden kann. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist
die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats in einem Test
zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge eines Zielmoleküls. Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Teile-Kit, umfassend ein Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann, das an eine Festphase gebunden ist, ein erfindungsgemäßes Konjugat,
einen Inkubationspuffer und ein Substrat, das durch den Enzymabschnitt
des Konjugats umgewandelt werden kann.
-
Es
gibt viele Anwendungen in der Wissenschaft, in denen die Konjugate
eine Funktion haben. Die Konjugate stammen aus der Kopplung von
Proteinen, wie Enzymen, an andere Moleküle, wie einem zweiten Protein,
oder einer anderen Molekülklasse.
Ein Beispiel für
ein zweites Protein ist ein Antikörper oder Streptavidin. Biotin
ist ein Beispiel für
ein Molekül
einer anderen Klasse. Sehr wichtige Techniken in Gebieten, wie klinische Diagnostik,
Immunologie, und In-vivo-Bildgebung, beruhen auf der Verwendung
dieser gekoppelten Proteinreagenzien. Das Fachgebiet kennt auch
beispielsweise Konjugate, die einen Antikörper und ein Enzym zur Verwendung
in einem Immuntest vom ELISA-Typ umfassen. Bei der Erwägung der
Bildung eines Konjugats aus einem Protein mit einem anderen Molekül können mehrere
Ansätze
in Bezug auf die funktionelle Chemie unternommen werden. Ein breiterer Überblick über Anwendungen
der Konjugate sowie verschiedener chemischer Wege zur Kopplung von
Proteinen an andere Moleküle
wird von Aslam M. und Dent A. (1998) Bioconjugation. Grove's Dictionaries, Inc.,
New York, insbesondere auf den Seiten 50-101, gegeben.
-
Die
Seitenkettenfunktion der proteinbildenden Aminosäuren kann einerseits für Kopplungsreaktionen bei
der Herstellung von Konjugaten verwendet werden. Eine ε-Aminogruppe
eines Lysins ist beispielsweise stark reaktiv und die -(CH2)4-Kette wirkt als
geeigneter Spacer, mit dem die Reaktionsstelle von dem Proteinmolekül auf Abstand
gehalten wird. Die Derivatisierung der terminalen Aminogruppen kann
mit Hilfe der Umsetzung der Amingruppe mit Aryl, Sulfonyl- oder Triazin-Halogeniden,
aktiven Carboxylderivaten, Aldehyden, Iso(thio)cyanaten, Imidaten,
Oxiranen, oder Halogenacetylderivaten erzielt werden. Als weiteres
Beispiel ist die Derivatisierung der Proteinthiolgruppen mit Oxiranen,
Maleimiden, Disulfiden, Halogenacetyl-Verbindungen, Quecksilber-Verbindungen, Vinylsulfonen,
Arylhalogeniden, sowie Aziridinen im Stand der Technik bekannt.
Der Fachmann kennt auch viele andere Derivatisierungsverfahren für proteinbildende
Aminosäuren,
wie solche mit Carboxylat-, Carboxamid- und Hydroxylfunktionen,
und auch Tyrosin-, Tryptophan-, Arginin- und Methioninresten.
-
Glycoproteine
bieten dagegen zudem Kohlenhydratreste zur Verwendung in Kopplungsreaktionen.
In dem vorliegenden Dokument steht der Begriff "Kohlenhydratrest" für
eine monomere Zuckeruntereinheit in einem Glycan. Kohlenhydratreste
können
derivatisiert werden, beispielsweise mit Epoxiden, Benzochinon oder Cyanogenbromid.
Darüber
hinaus wird die Periodatoxidation weithin verwendet. Periodat ist
ein leistungsfähiges
Oxidationsmittel und durchläuft
eine ziemlich spezifische Reaktion mit Zuckermolekülen, die
Hydroxylgruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen (benachbartes
Diol) enthalten, Spalten des Kohlenhydratrings und Erzeugen von
zwei Aldehydgruppen in jedem Fall. Aldehyde durchlaufen eine Dehydratisierungsreaktion mit
Aminen unter Bildung eines Imins, so dass dieses eine Maßnahme zur
Kopplung eines aminhaltigen Moleküls an eine Zuckerkette ist;
für eine
größere Stabilität wird diese
Bindung gewöhnlich
auf eine substituierte Aminbindung reduziert. Mildere Oxidationsreagenzien
sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und umfassen Enzym-Beispiele, wie Galactoseoxidase.
Eine Alternative für
die Aminolyse des oxidierten Materials ist die Umsetzung des Aldehyds
mit Hydraziden.
-
Die
Expression eines Enzyms alkalische Phosphatase, das in seiner nativen
Form als heterologes Enzym in Hefe glycosyliert ist, führt oft
zu einem schwer glycosylierten Produkt. D.h. dass mehr Zuckerreste
an dem in der Hefe produzierten Enzym gebunden sind, als bei der
nativen Form des Enzyms. Zudem kann das Glycosylierungsmuster verglichen
mit der nativen Form des Enzyms verschieden sein.
-
Berücksichtigt
man diese Unterschiede eines glycosylierten Enzyms, das rekombinant
in Hefe exprimiert wird, kann der Kohlenhydratabschnitt des rekombinant
exprimierten Enzyms unter bestimmten Bedingungen eine negative Auswirkung
auf seine Leistung haben, wenn es chemisch an ein anderes Protein
gebunden wird, so dass ein Konjugat erhalten wird. Daher ist ein
erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines
Konjugats aus einem Molekül,
das an ein Zielmolekül
binden kann, und einem Enzym, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen
eines glycosylierten Enzyms alkalische Phosphatase mit der Aminosäuresequenz
der Seq.-ID.-Nr. 1, erhalten durch Expression in einer transformierten
Hefe und daraus isoliert, (b) Deglycosylieren des Enzyms aus Schritt
(a) mittels Endo-β-N-acetylglucosaminidase
H, (c) Isolieren des deglycosylierten Enzyms, (d) Binden des deglycosylierten
Enzyms von Schritt (c) an das Molekül, das an ein Zielmolekül binden
kann. Der Kohlenhydratabschnitt des glycosylierten Enzyms enthält vorzugsweise
mehrere Mannose-Untereinheiten.
-
Erfindungsgemäß enthält die Aminosäuresequenz
des Enzyms eine Glycosylierungsstelle. Das Enzym ist zudem von eukaryotischem
Ursprung, und das Enzym wird durch Expression eines Genkonstruktes, das
das Enzym codiert, in einem Hefe-Wirtsorganismus erhalten. Der Begriff "Exprimieren" umfasst posttranslationale
Modifikation und insbesondere Glycosylierung des Enzyms. Die Expression
eines gewünschten
Enzyms in Hefe kann einen Vorteil der intrazellulären Trafficking-Wege
nutzen, wie dem sekretorischen Weg, der die Modifikation des gewünschten
Enzyms durch Glycosylierung umfasst. Die Expression von Proteinen
in Hefe ist in
US 5,618,676 ,
US 5,854,018 ,
US 5,856,123 und
US 5,919,651 beschrieben. Bei einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist der eukaryotische Wirtsorganismus ein methylotropher Hefestamm.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der eukaryotische
Hefeorganismus ein methylotropher Hefestamm der Gattung ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus Pichia, Hansenula, Candida und Torulopsis.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der eukaryotische
Wirtsorganismus ein methylotropher Hefestamm der Art Pichia pastoris.
Gut eingearbeitete Verfahren zur Expression von Proteinen in der
methylotrophen Hefe Pichia pastoris sind
US 4,683,293 ,
US 4,808,537 ,
US 4,812,405 ,
US 4,818,700 ,
US 4,837,148 ,
US 4,855,231 ,
US 4,857,467 ,
US 4,879,231 ,
US 4,882,279 ,
US 4,885,242 ,
US 4,895,800 ,
US 4,929,555 ,
US 5,002,876 ,
US 5,004,688 ,
US 5,032,516 ,
US 5,122,465 ,
US 5,135,868 ,
US 5,166,329 , und
WO 00/56903 . Die Isolation des gewünschten
Proteins aus dem Wirtsorganismus umfasst die Isolation aus der Biomasse
des Wirtsorganismus sowie aus dem Medium, in dem der Wirtsorganismus
gezüchtet
wurde.
-
Die
Expression von heterologen Proteinen in Hefe führt oft zu schwer glycosylierten
Proteinen mit einem hohen Mannosegehalt (Tanner, W. und Lehle, L.,
Biochim Biophys Acta 906 (1987) 81-99). Somit umfasst ein stark glycosyliertes
Protein einen Kohlenhydratabschnitt, der mehrere Mannose-Untereinheiten
umfasst.
-
Es
gibt bekanntlich mehrere Verfahren, mit denen man ein Glycoprotein
deglycosylieren kann, und zwar chemische und enzymatische Verfahren.
Das Peptid N-Glycosidase
F, auch bekannt als N-Glycosidase F (EC 3.2.218; 3.5.1.52) spaltet
alle Typen asparagingebundener N-Glycane, vorausgesetzt, dass die
Aminogruppe sowie die Carboxylgruppe in einer Peptidbindung zugegen
sind, und dass das Oligosaccharid die minimale Länge der Chitobiose-Kerneinheit
hat (Tarentino, A.L. et al., Biochemistry 24 (1985) 4665-4671; Chu, F.K.,
J. Biol. Chem. 261 (1986) 172-177). Die Reaktionsprodukte sind Ammoniak,
Asparaginsäure
(in der Peptidkette) und das vollständige Oligosaccharid. Der Reaktionsmechanismus
unterscheidet sich von dem der Endoglycosidasen D, H und F. Diese
Enzyme spalten die glycosidische Bindung zwischen den beiden N-Acetylglucosaminresten.
Sie zeigen auch eine stärker
eingeschränkte
Substratspezifität
als N-Glycosidase F. (Haselbeck, A., und Hoesel, W., Topics in Biochemistry
(1988), Nr. 8, Boehringer Mannheim GmbH). Somit ist N-Glycosidase F keine
Glycosidase, sondern eine Amidase, da sie Asparagin in Asparaginsäure umwandelt.
-
Erfindungsgemäß wird die
enzymatische Spaltung der Kohlenhydrateinheiten an den Polypeptiden
der alkalischen Phosphatase mit Endo-β-N-Acetylglucosaminidase H, auch bekannt
als Endoglycosidase H oder Endo H (EC 3.2.1.96) erzielt. Dieses
Enzym hydrolysiert vorzugsweise N-Glycane des mannosereichen Typs (Kobata,
A., Anal. Biochem. 100 (1979) 1-14; Trimble, R.B. und Maley, F.
Anal. Biochem. 141 (1984) 515-522). Endoglycosidase H spaltet zwischen
den beiden N-Acetylglucosaminidase-Resten in dem Diacetylchitobiose-Kern
des Oligosaccharids, so dass ein verkürztes Zuckermolekül mit einem
N-Acetylglucosamin-Rest
erzeugt wird, der auf dem Asparagin verbleibt. Die Peptid-N-Glycosidase
F entfernt dagegen das Oligosaccharid intakt. Die Endo-β- N-acetylglucosaminidase
F, auch bekannt als Endoglycosidase F oder Endo F spaltet innerhalb
des Diacetylchitobiosekerns der N-gebundenen Oligosaccharide, so
dass ein N-Acetylglucosaminrest am Asparagin gebunden bleibt. Die
Endoglycosidase F wirkt vorzugsweise auf mannosereiche N-Glycane.
-
Beispiel
1 beschreibt die Deglycosylierung von alkalischer Phosphatase, die
rekombinant in Pichia pastoris produziert wurde, mittels Endoglycosidase
H. Selbst wenn die Deglycosylierung ausgiebig erfolgt, entfernt
die Endoglycosidase H trotzdem nicht alle Glycanreste vollständig aus
dem glycosylierten Protein, sondern hinterlässt einen Acetylglucosaminrest
gebunden an dem Asparaginrest der Polypeptidkette. Der verbleibende
N-Acetylglucosaminrest kann noch als Ziel für die Kopplungsreaktion dienen,
wenn ein Konjugat gebildet wird. Das Gleiche gilt für O-verknüpfte Glycane,
die sofern vorhanden nicht das bevorzugte Substrat der Endoglycosidase
H sind.
-
Ein
Enzym, das rekombinant in Hefe produziert wird, ist gewöhnlich in
Bezug auf das Molekulargewicht inhomogen. Dies ist der Fall für alkalische
Phosphatase aus Rind mit der Aminosäuresequenz von Seq.-ID.-Nr. 1,
die rekombinant in Pichia pastoris hergestellt wurde. Die 4 zeigt
ein erstes Ergebnis der MALDI-TOF-MS-Analyse, wobei die Peak-Maxima, die
Molekulargewichte von 57503,0 und 65872,48 anzeigen, den glycosylierten
alkalische Phosphatase-Monomeren mit verschiedenen Glycosylierungsgraden
entsprechen. Die 5 zeigt ein zweites Ergebnis
der MALDI-TOF-MS-Analyse, wobei das Peak-Maximum, das das Molekulargewicht
von 55113,64 anzeigt, den deglycosylierten alkalische Phosphatase-Monomeren entspricht. Der
Nachbar-Peak bei 66431,01 entspricht einem internen Standard. Das
zweite Ergebnis wurde unter Bedingungen erhalten, die eine vollständige oder
fast vollständige
Spaltung mit Endoglycosidase H ermöglichen. Somit werden unter
diesen Bedingungen bis zu etwa 80% Glycanreste abgespalten.
-
Somit
ist ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Erfindung ein Verfahren
zum Herstellen eines Konjugats aus einem Molekül, das an ein Zielmolekül binden
kann, und einem Enzym, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen
eines Enzyms alkalische Phosphatase mit der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1, erhalten durch Expression in einer transformierten
Hefe und daraus isoliert, (b) partielles Deglycosylieren des Enzyms von
Schritt (a) mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase
H, (c) Isolieren des partiell deglycosylierten Enzyms, (d) Binden
des partiell deglycosylierten Enzyms von Schritt (c) an das Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann. Der Kohlenhydratanteil des glycosylierten Enzyms enthält vorzugsweise
mehrere Mannose-Untereinheiten.
-
Es
ist zudem bevorzugt, dass in Schritt (b) zwischen 10 und 99% der
Kohlenhydratreste von dem glycosylierten Enzyms abgespalten werden.
Es ist stärker
bevorzugt, dass zwischen 20% und 70% der Kohlenhydratreste von dem
glycosylierten Enzym abgespalten werden. Es ist noch stärker bevorzugt,
dass etwa 60% der Kohlenhydratreste von dem glycosylierten Enzym
abgespalten werden, wobei "etwa" ein Intervall zwischen 50%
und 70% bedeutet. Die partielle Deglycosylierung bietet die Möglichkeit
zur Verwendung von chemischen Reaktionen, die verbleibende Kohlenhydratreste
des Enzyms anzielen, wenn ein Konjugat aus dem Enzym und dem Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann, gebildet wird.
-
Die
Reinigung eines Enyms, das zur Herstellung eines Konjugats verwendet
werden soll, aus nativem Wirtsgewebe, birgt das Risiko, dass eine
ungewünschte
Verbindung, wie ein Inhibitor oder ein Pathogen, gleichzeitig mit
gereinigt werden kann. Beispielsweise kann die aus Rindergewebe
isolierte alkalische Phosphatase mit pathogenem Rinderprionprotein
kontaminiert sein. Aus diesem Grund ist die rekombinante Expression
des gewünschten
Enzyms in einem mikrobiellen Wirt, wie Hefe, bevorzugt. Sehr stark bevorzugt
ist eine methylotrophe Hefe als mikrobieller Wirt. Das gewünschte Enzym,
das durch eine transformierte Hefe als mikrobieller Wirt rekombinant
exprimiert wird und/oder darin sezerniert wird, ist frei von Säugetier-Protein,
und insbesondere frei von Säugetier-Pathogenen.
-
Daher
ist eine weitere Ausführungsform
der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats aus
einem Molekül,
das an ein Zielmolekül
binden kann, und einem Enzym, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen
eines glycosylierten Enzyms alkalische Phosphatase mit der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1, erhalten durch Expression in einer transformierten
Hefe und daraus isoliert, (b) Deglycosylieren des Enzyms von Schritt
(a) mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase
H, (c) Isolieren des deglycosylierten Enzyms, (d) Binden des deglycosylierten
Enzyms von Schritt (c) an das Molekül, das an ein Zielmolekül binden
kann. Der Schritt (b) besteht vorzugsweise aus dem partiellen Deglycosylieren
des Enzyms von Schritt (a). Es ist stärker bevorzugt, dass in Schritt
(b) zwischen 10% und 99% der Kohlenhydratreste von dem glycosylierten
Enzym abgespalten werden. Es ist noch stärker bevorzugt, dass zwischen
20% und 70% der Kohlenhydratreste von dem glycosylierten Enzym abgespalten
werden. Es ist noch stärker
bevorzugt, dass etwa 60% der Kohlenhydratreste von dem glycosylierten
Enzym abgespalten werden.
-
Erfindungsgemäß ist das
Enzym eine alkalische Phosphatase, deren Aminosäuresequenz eine Glycosylierungsstelle
umfasst, die in dem transformierten Wirtsorganismus, die die alkalische
Phosphatase exprimiert, erkannt wird. Der Begriff "alkalische Phosphatase" steht für ein Mitglied
der Familie der alkalischen Phosphatasen. Alkalische Phosphatasen
sind Dimere, zinkhaltige, nichtspezifische Phosphomonoesterasen, die
in prokaryotischen sowie eukaryotischen Organismen, beispielsweise
in E. coli und Säugetieren
vorkommen (McComb et al., Alkaline Phosphatases Plenum Press, New
York, 1979). Der Vergleich der primären Strukturen verschiedener
Mitglieder der Familie der alkalischen Phosphatasen zeigen einen
hohen Grad an Homologie (25 bis 30% Homologie zwischen E. coli und
alkalischen Phosphatasen aus Säugetier;
Millan, J.L., Anticancer Res. 8 (1988) 995-1004; Harris, H., Clin.
Chim. Acta 186 (1990) 133-150). In Menschen und höheren Säugetieren
umfasst die Familie der alkalischen Phosphatasen vier Mitglieder,
die sich in verschiedenen Gen-Loci befinden (Millan, J.L. Anticancer
Res. (1988) 995-1004; Harris, H. Clin. Chim. Acta 186 (1990) 133-150). Die Familie
der alkalischen Phosphatase in Menschen und höheren Tieren umfasst die gewebespezifischen
alkalischen Phosphatasen (alkalische Phosphatase aus Plazenta, alkalische
Phosphatase aus Keimzelle und alkalische Phosphatase aus Darm) und
die nicht-gewebespezifischen alkalischen Phosphatasen, die sich
vorwiegend in der Leber, Niere und Knochen befinden.
-
Der
Begriff "alkalische
Phosphatase" umfasst
zudem Varianten der alkalischen Phosphatasen. Eine Variante einer
alkalische Phosphatase, d.h. eine Variante einer Wildtyp-alkalischen
Phosphatase, bezeichnet ein Protein, das in einer Allelform einer
Wildtypalkalischen Phosphatase vorliegt, die durch Aminosäureinsertion,
Aminosäuredeletion
oder terminale Addition von einer oder mehreren Aminosäuren erzeugt
wird. In einer bevorzugten Variante einer alkalischen Phosphatase
sind bis zu 10% der Aminosäuren
in der Aminosäuresequenz
der Variante der alkalischen Phosphatase gegenüber der Aminosäuresequenz
der Wildtyp-alkalischen Phosphatase, aus der die Variante hergeleitet
ist, verschieden.
-
Noch
stärker
bevorzugt ist eine Variante einer alkalischen Phosphatase, wobei
die Variante glycosyliert werden kann, d.h. die Variante umfasst
eine Glycosylierungsstelle.
-
Es
gibt auch gentechnische Verfahren für Fusionsproteinexpression
in eukaryotischen Wirtsorganismen, dadurch gekennzeichnet, dass
es eine zusätzliche
Sequenz von Aminosäuren
gibt, die an die Aminosäuresequenz
eines gewünschten
Proteins gebunden ist. Beispiele für eine zusätzliche Sequenz von Aminosäuren sind
die Biotinylierungspeptide (beispielsweise
WO 95/04069 ) und Histidin-Tags (Janknecht,
R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8972-8976).
-
Im
Stand der Technik ist auch bekannt, dass bestimmte Aminosäuren an
bestimmten Positionen in der Aminosäuresequenz der alkalischen
Phosphatase einen spezifischen Einfluss auf die Aktivität eines
Enzyms haben.
EP 0 955 369 beschreibt
eine sehr aktive alkalische Phosphatase.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats
aus einem Molekül,
das an ein Zielmolekül
binden kann, und einer alkalischen Phosphatase, umfassend die Schritte (a)
Exprimieren eines Enzyms alkalische Phosphatase mit der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1 in einer methylotrophen Hefe, wobei das Polypeptid
der alkalischen Phosphatase eine Glycosylierungsstelle enthält, und
Isolieren der glycosylierten alkalischen Phosphatase, (b) partielles
Deglycosylieren der alkalischen Phosphatase aus Schritt (a) mit
Endo-β-N-Acetylglucosaminidase
H, (c) Isolieren der partiell deglycosylierten alkalischen Phosphatase,
(d) Binden der partiell deglycosylierten alkalischen Phosphatase
von Schritt (c) an das Molekül,
das an ein Zielmolekül
binden kann. Erfindungsgemäß stammt
die alkalische Phosphatase aus Rind. In einer weiteren sehr stark
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung besteht die alkalische Phosphatase aus einem Dimer
aus zwei Proteinen, wobei die Polypeptidkette jedes Proteins die
Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1 umfasst. In einer weiteren sehr stark bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung besteht die alkalische Phosphatase aus einem Dimer
aus zwei Proteinen, wobei die Polypeptid-Kette jedes Proteins aus der
Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr.
1 besteht.
-
Bei
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Molekül,
das an ein Zielmolekül binden
kann, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem Antikörper oder einem funktionellen
Fragment davon, (b) Avidin, oder einem Polymer von Avidinmolekülen, oder
einem Fragment von Avidin, das Biotin binden kann, oder einem Polymer
von Avidinfragmenten, das Biotin binden kann, (c) Streptavidin oder
einem Polymer von Streptavidinmolekülen oder einem Fragment von
Streptavidin, das Biotin binden kann, oder einem Polymer von Streptavidinfragmenten,
das Biotin binden kann, (d) einem Lectin, oder einem Fragment davon,
das ein Kohlenhydrat binden kann, (e) einem Hapten, (f) einer Nukleinsäure oder
einem Analogon davon.
-
Bei
einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann, an das Enzym über
eine Verbindungsgruppe gebunden.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein isoliertes und partiell deglycosyliertes
Enzym, das aus Säugetier
stammt und das frei von Säugetier-Proteinen
ist, erhältlich
durch ein Verfahren, umfassend die Schritte (a) Bereitstellen eines
glycosylierten Enzyms alkalische Phosphatase mit der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1, erhalten durch Expression in einer transformierten
Hefe und daraus isoliert, wobei der Kohlenhydrat-Anteil des glycosylierten
Enzyms mehrere Mannose-Untereinheiten enthält, (b) partielles Deglycosylieren
des Enzyms von Schritt (a) mit Endo-β-N-acetylglucosaminidase H, (c) Isolieren
des partiell deglycosylierten Enzyms. Das Enzym ist vorzugsweise
eine alkalische Phosphatase. Die alkalische Phosphatase enthält noch
stärker
bevorzugt eine Untereinheit, umfassend die Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1. Eine Untereinheit der alkalischen Phosphatase
besteht noch stärker
bevorzugt aus der Aminosäuresequenz
von Seq.-ID.-Nr. 1. Das Protein der Seq.-ID.-Nr. 1 bildet ein Dimer,
d.h. zwei Monomeruntereinheiten assoziieren. Das Molekulargewicht
einer Untereinheit der alkalischen Phosphatase ist vorzugsweise
zwischen 54 kDa und 58 kDa. Das Molekulargewicht der alkalischen
Phosphatase ist noch stärker
bevorzugt etwa 55 kDa, d.h. zwischen 54,5 kDa und 56 kDa.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Enzyms, erhältlich durch
ein erfindungsgemäßes Verfahren
zur Herstellung eines Konjugats. Die Verwendung eines partiell deglycosylierten
Enzyms, erhältlich
durch ein erfindungsgemäßes Verfahren,
zur Herstellung eines Konjugats, ist bevorzugt.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Konjugat aus einem Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann, und einem Enzym, erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren.
Bevorzugt ist ein Konjugat aus einem Molekül, das an ein Zielmolekül binden
kann, und einem partiell deglycosylierten Enzym, erhältlich durch
ein erfindungsgemäßes Verfahren.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats
in einem Test zum Bestimmen der Anwesenheit oder der Menge eines
Zielmoleküls.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Test ein Enzymimmuntest. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
der Erfindung ist der Enzymimmuntest ein heterogener oder homogener
Enzymimmuntest.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Teile-Kit, umfassend ein Molekül, das an
ein Zielmolekül
binden kann, das an eine Festphase gebunden ist, ein erfindungsgemäßes Konjugat,
einen Inkubationspuffer, und ein Substrat, das durch den Enzymanteil
des Konjugats umgewandelt werden kann.
-
Die
folgenden Beispiele, Literaturstellen, Sequenzprotokoll, und Figuren
unterstützen
das Verständnis der
vorliegenden Erfindung, deren wahrer Schutzbereich in den beiliegenden
Ansprüchen
offenbart ist. Selbstverständlich
können
Modifikationen in den Verfahren vorgenommen werden, ohne dass man
vom Geist der Erfindung abweicht.
-
Beschreibung der Figuren
-
1 Flution
auf einer TSK 3000 Säule
der rekombinant erzeugten alkalischen Phosphatase (recAP) vor (A)
und nach (B) der Endo H Behandlung. Die durchgezogene Linie zeigt
die Proteinabsorption bei 280 nm.
-
2 Profile
der rekombinant produzierten alkalische Phosphatase/anti-hCG-IgG-(Teil
A)- und rekombinant produzierten alkalische Phosphatase (Endo-H-behandelt)/anti-hCG-IgG
(Teil B)-Konjugate nach 2 Std. Reaktionszeit, getrennt auf einer
TSK 4000 Chromatographie-Säule. Die
durchgezogene Linie zeigt die Proteinabsorption bei 280 nm.
-
3 Messungen
von hCG in einem MTP-ELISA mit dem rekombinant produzierten alkalische
Phosphatase/anti-hCG-IgG-Konjugat (Quadrate) und dem rekombinant
produzierten alkalische Phosphatase (Endo-H-behandelt)/anti-hCG-IgG
(Dreiecke). In Teil A wurden 100 mU/ml und in Teil B 42 ng/ml jedes
Konjugats eingesetzt.
-
4 Bestimmung
des Molekulargewichts der alkalischen Phosphatase aus Rind mit der
Seq.-ID.-Nr. 1, rekombinant hergestellt in Pichia pastoris. Ergebnisse
der MALDI-TOF-MS (siehe Beispiel 5).
-
5 Bestimmung
des Molekulargewichts der alkalischen Phosphatase aus Rind mit der
Seq.-ID.-Nr. 1, rekombinant hergestellt in Pichia pastoris, nach
der Endo-H-Behandlung. Ergebnisse der MALDI-TOF-MS (siehe Beispiel
5).
-
Beispiel 1
-
Deglycosylierung der rekombinant produzierten
alkalischen Phosphatase.
-
10
mg rekombinant produzierte und aus Pichia pastoris isolierte alkalische
Phosphatase (in den Figuren auch als "recAP" bezeichnet) wurden mit 200 Millieinheiten
Endoglycosidase H ("endo
H", Roche Kat.Nr. 1643053)
in 1 ml Natriumacetatpuffer 30 mM, pH-Wert 5,5, mit 1 mM MgCl2 und
1,5 M NaCl für
2 Std. inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Lösung ausgiebig in einer Filtrationskammer
mit einer YM 30-Membran mit einem Triethanolamin/HCl-Puffer, pH-Wert
7,6, mit 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 und 0,1
mM ZnCl2, dialysiert, was zu einem Endvolumen
von 1 ml führte.
Die 1 veranschaulicht die Elutionszeiten auf einer
TSK 3000 Säule der
rekombinant produzierten alkalischen Phosphatase vor und nach der
Endo-H-Behandlung. Es lässt
sich ersehen, dass der bei 6,88 min eluierende Peak vor der Behandlung
vollständig
verschwunden ist, und ein neuer Peak erhalten wurde, der bei 7,61
min eluierte, was zeigt, dass die rekombinant produzierte alkalische Phosphatase
Glycanketten verlor, die zu einem kleineren Molekulargewicht und
zu einer späteren
Elutionszeit verglichen mit dem unveränderten Molekül führten.
-
Beispiel 2
-
Messung der AP-Enzymaktivität
-
Die
Enzymaktivität
der alkalischen Phosphatase wurde mit 4-Nitrophenylphosphat als
Substrat gemäß dem beschriebenen
Testprotokoll bestimmt (Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 8 (1970) 658-660;
und Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 10 (1972) 182). Die rekombinant
produzierte alkalische Phosphatase aus Pichia pastoris ergab eine
spezifische Aktivität
von etwa 7000 U/mg, die durch die Endoglycosidase-H-Behandlung nicht
verändert
wurde.
-
Beispiel 3
-
Herstellung von Konjugaten von alkalischer
Phosphatase
-
Aktivierung von AP
-
5
mg des entsprechenden alkalische Phosphatase-Präparates
(rekombinant produzierte alkalische Phosphatase; rekombinant produzierte
alkalische Phosphatase/endo-H-behandelt), gelöst in 0,5 ml Natriumphosphatpuffer
30 mM, pH-Wert 7,1, wurden mit 0,059 mg N-Succinimidyl-S-acetylthiopropionat
(SATP), gelöst
in 12 μl
DMSO, gemischt und für
1 Std. bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 5 μl
1 M Lysin-HCl gestoppt und für
weitere 30 min bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde
dann ausgiebig über
Nacht bei 4°C
gegen 1,5 l 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,1, mit 50 mM NaCl
dialysiert.
-
Aktivierung von anti-Mensch-Choriongonadotropin(hCG)-Immunglobulin
-
20
mg monoklonaler Antikörper
anti-hCG-M-INN22-IgG,
gelöst
in 1 ml 30 mM Natriumphosphat-Puffer pH-Wert 7,1 wurden mit 0,205 mg Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimidester
(MHS), gelöst
in 21 μl
DMSO, gemischt, und 1 Std. bei RT gerührt. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 5 μl
1 M Lysin-HCl gestoppt und für
weitere 30 min bei RT gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann ausgiebig über Nacht bei 4°C gegen 5 l
10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,1, mit 50 mM NaCl, dialysiert.
-
Herstellung der Konjugate
-
3
mg der jeweiligen SATP-aktivierten AP-Präparate (rekombinant produzierten
alkalischen Phosphatase; rekombinant produzierten alkalischen Phosphatase/endo-H-behandelt), gelöst in 324 μl 10 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH-Wert 7,5, mit 50 mM NaCl, wurden mit 8 μl 1 M Hydroxylaminlösung gemischt
und für
1 Std. bei RT gerührt.
Nach dieser Zeit wurden 1,74 mg MHS-aktiviertes anti-hCG-M-INN22-IgG,
gelöst
in 262 μl
von 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5, mit 50 mM NaCl, zugefügt und das
Reaktionsgemisch für
2 Std. bei RT gerührt.
Dann wurden 7 μl
0,2 M Cystein-HCl-Lösung
(eingestellt auf pH-Wert 6,7 durch Zugabe von 1 M Phosphorsäure) zugegeben
und für
30 min bei RT gerührt.
Danach wurden 7 μl
0,5 M N-Methylmaleimid-Lösung
in Wasser zugegeben und für
weitere 30 min bei RT gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann ausgiebig über Nacht bei 4°C gegen 1,5
l 50 mM Triethanolamin-HCl-Puffer, pH-Wert 7,6, mit 150 mM NaCl, 1
mM MgCl2 und 0,1 mM ZnCl2 dialysiert.
Nach der Dialyse wurde die Lösung
auf eine NaCl-Konzentration von 3 M gebracht und bis zum Gebrauch
bei +4°C
aufbewahrt.
-
Die 2 zeigt
die Ergebnisse der Konjugationen nach 2 Std. für rekombinant produzierte alkalische Phosphatase/anti-hCG-IgG
(Teil A) und rekombinant produzierte alkalische Phosphatase (endo-H-behandelt)/anti-hCG-IgG
(Teil B) in Form einer Trennung der Reaktionsgemische auf einer
TSK 4000 Säule.
Es ist ersichtlich, dass der Konjugat-Peak in Teil A (Maximum bei
8,08 min Elutionszeit) nicht so gut von dem nicht konjugierten rekombinant
produzierten alkalische Phosphatase-Peak (Flution bei 9,63 min)
getrennt wird, wie es bei Teil B der Fall ist, wobei der Großteil des
Konjugats (Elutionsmaximum bei 8,52 min) viel besser von der nicht
derivatisierten rekombinant produzierten alkalischen Phosphatase/endo-H-behandelt
(Elutionsmaximum bei 10,13 min) getrennt wird, was zu einer viel
besseren Ausbeute dieses Konjugats verglichen zu dem in Teil A führt. Die
Konjugate wurden wie in der Figur angegeben vereinigt und zur weiteren
Analyse verwendet.
-
Beispiel 4
-
Vergleich der Konjugate durch hCG-ELISA
-
Der
hCG-ELISA wurde als Sandwich-Test durchgeführt, indem streptavidinbeschichtete
Mikrotiterplatten verwendet wurden. Biotinyliertes Mabanti-hCG-M-
1F79-Fab-Derivat wurde als immobilisierter Bindungspartner verwendet
(150 μl
einer 5 μg/ml
Lösung
in Inkubationspuffer pro Vertiefung wurden 30 min bei RT inkubiert).
Nach dreimaligem Waschen wurden 120 μl hCG-Proben in Konzentrationen
von 0, 14,84, 254,8, 2103 bzw. 7801 mU/ml, gelöst in Inkubationspuffer, pro
Vertiefung hinzugefügt
und für
1 Std. bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden 100 μl der vorstehend
beschriebenen entsprechenden alkalischen Phosphatase/Mab-anti-hCG-M-INN22-IgG-Konjugate
zugegeben und für
1 Std. bei RT inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden 100 μl pro Vertiefung
einer 100 mM 4-Nitrophenylphosphatsubstratlösung zugegeben, und nach 20
min Inkubation bei RT wurde die Absorption mit einem ELISA-Lesegerät bei 405
nm mit 490 nm bei einer Korrektur-Wellenlänge gemessen.
Inkubationspuffer:
Kaliumphosphat 50 mM, Natriumchlorid 150 mM, 1% Rinderserumalbumin,
0,05% Tween 20, pH-Wert 7,5.
-
Für den Vergleich
der Konjugate wurden zwei Analysereihen durchgeführt. In der ersten Reihe wurden die
Konjugate bei einer Konzentration von jeweils 100 mU/ml zugefügt, und
in der zweiten wurden 42 ng/ml der entsprechenden Konjugate verwendet,
und 3 veranschaulicht die erhaltenen Ergebnisse. Es
ist ersichtlich, dass das Konjugat mit rekombinant erzeugter alkalischer
Phosphatase (endo-H-behandelt) als Markierung in jedem Fall besser
abschneidet, verglichen mit rekombinant produzierter alkalischer
Phosphatase aus Pichia pastoris mit den noch vorhandenen N-Glycan-Ketten
(Teil A mit 100 mU/ml jedes Konjugats, Teil B mit 42 ng/ml).
-
Beispiel 5
-
Bestimmung des Molekulargewichts von Endo-H-deglycosylierter
recAP durch Matrix-Assisted Laser-Desorption- Ionization-Time-of-Flight-Mass-Spectrometry
(MALDI-TOF-MS)
-
recAP,
hergestellt in Pichia pastoris, wurde durch Endo H wie in Beispiel
1 beschrieben behandelt, und gegen destilliertes Wasser dialysiert.
Die Proteinlösung
wurde mit Sinapinsäurematrixlösung gemischt
und auf dem Ziel kristallisiert. Die Proben wurden auf einer Voyager
Biospectrometry Arbeitsstation, ausgerüstet mit verzögerter Extraktion
im Positiv-Modus, kristallisiert.
-
Die
Peak-Maxima, die einem Molekulargewicht von recAP vor der Deglycosylierung
entsprechen, wurden bei 57503 und 65872,48 Da und nach der Deglycosylierung
bei 55113,64 Da bestimmt (siehe 4 und 5).
-
Literaturliste
-
- Aslam M. und Dent A. (1998) Bioconjugation. Grove's Dictionaries, Inc.,
New York, S. 50-101
- Barbaric, S., et al., Arch. Biochem. Biophys. 234 (1984) 567-575
- Chu, F. K., J. Biol. Chem. 261 (1986) 172-177
- Dell, A., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 45 (1987) 19-72
-
EP 0 955 369
-
EP 1 176 205
- Fellinger, A. J., et al., Yeast 7 (1991) 463-473
- Geisow, M. J., Bio/technology 10 (1992) 277-280
- Harris, H., Clin. Chim. Acta 186 (1990) 133-150
- Haselbeck, A. und Hoesel, W., Topics in Biochemistry (1988),
Nr. 8, Boehringer Mannheim GmbH
- Hermanson, G. T., In: Bioconjugate Techniques, Kap. 16, Academic
Press, 1996, S. 630-638
- Houba, H. J. et al. Bioconjugate Chem. 7 (1996) 606-611
- Janknecht, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991)
8972-8976
- Kobata, A., Anal. Biochem. 100 (1979) 1-14
- Lee, K. B., et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 23 (1990) 53-80
- McComb et al., Alkaline Phosphatases Plenum Press, New York,
1979
- Millan, J. L., Anticancer Res. 8 (1988) 995-1004
- O'Sullivan,
M. J., und Marks, V., Methods Enzymol. 73 (1981) 147-166
- Spellman, M. W., Anal. Chem. 62 (1990) 1714-1722
- Tanner, W. und Lehle, L., Biochim Biophys Acta 906 (1987) 81-99
- Tarentino, A. L., et al., Biochemistry 24 (1985) 4665-4671
- Thotakura, N. R. und Bahl, O. P., Meth. Enzymol. 138 (1987)
350-359
- Trimble, R. B. und Maley, F., Anal. Biochem. 141 (1984) 515-522
-
US 4,275,149
-
US 4,683,293
-
US 4,808,537
-
US 4,812,405
-
US 4,818,700
-
US 4,837,148
-
US 4,855,231
-
US 4,857,467
-
US 4,879,231
-
US 4,882,279
-
US 4,885,242
-
US 4,895,800
-
US 4,929,555
-
US 5,002,876
-
US 5,004,688
-
US 5,032,516
-
US 5,122,465
-
US 5,135,868
-
US 5,166,329
-
US 5,618,676
-
US 5,854,018
-
US 5,856,123
-
US 5,919,651
-
US 5,185,243
- Vliegenthart et al., Adv. Carbohydr. Chem. 41 (1983) 209-375
-
WO 00/56903
-
WO 95/04069
- Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 10 (1972) 182
- Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 8 (1970) 658-660
-
-
-
