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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Aufnahme von Tierzellkolonien.
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Automatisierte
Vorrichtungen für
verschiedenartige wiederholte Aufgaben in Bezug auf genetische und
proteomische Untersuchungen haben weite Verbreitung gefunden. Beispielsweise
sind seit mehreren Jahren automatisierte Vorrichtungen im Handel
erhältlich,
die zur Mikroanordnung von Proben, zum Aufnehmen von Bakterienkolonien
oder zum Gewinnen von Gel-Kernen dienen. Beispielhaft beschreiben
WO-A-92/1233A [7]
und Johns et al [9] einen frühen
Bakterienkolonie-Aufnahmeroboter unter Verwendung von festen Nadeln.
Uber et al [8] beschreibt eine Bilddarstellung zum Identifizieren
der Koordinaten von Bakterien- oder Hefe-Kolonien, sowie einen separaten
Aufnahmeroboter zum Aufnehmen der Kolonien auf der Basis von mit
der Bildeinrichtung erzeugten Koordinaten, wobei das Aufnehmen durch
Eintauchen einer entsorgbaren Pipettenspitze in die Probenflüssigkeit
ausgeführt
wird. Eine Vorrichtung zum automatischen Aufnehmen von Säugetier-Zellkolonien
stand jedoch bisher nicht zur Verfügung.
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Proben
von Säugetier-Zellkolonien
liegen üblicherweise
in einer von zwei Typen vor. Beim ersten Typ ist die Säugetier-Zellkolonie
in einem halb-festen Medium in Suspension gehalten. Beim zweiten
Typ haftet die Säugetier-Zellkolonie auf einem
Substrat und ist in einem flüssigen
Medium eingetaucht.
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Ein
Problem beim automatischen Aufnehmen von Säugetier-Zellkolonien des ersten
Typs liegt im Lokalisieren, Entnehmen und Abgeben von individuellen
Zell-zielkolonien aus dem halb-festen Medium. Bei anhaftenden Kolonien
besteht das zusätzliche
Problem, dass die Kolonie vom Substrat abgelöst werden muss, bevor sie entnommen
werden kann. Die Standard Praktiken (nicht automatisiert) zum Ablösen von
anhaftenden Kolonien sind ein Abkratzen mit einem Skalpell oder
einer andersartigen mechanischen Klinge, und Aufschluss mit Trypsin.
Keine dieser Praktiken ist für
eine Automatisierung gut geeignet.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Nach
einem ersten Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zur Aufnahme
von Tierzellkolonien zur Verfügung
gestellt, die Folgendes aufweist: ein Vorrichtungsbett zum Anordnen
eines Probenbehälters,
welcher eine Mehrzahl von in einem Medium gehaltenen Tierzellkolonien
umfasst, eine Kamera zum Aufnehmen von Bildern der Tierzellkolonien,
einen Bildprozessor zum Identifizieren von Stellen von Tierzellkolonien
anhand von aufgenommenen Bildern und einen Aufnahmekopf, der unter
Verwendung von Positionierungsmotoren relativ zu dem Vorrichtungsbett
zu Stellen von Tierzellkolonien, die durch den Bildprozessor identifiziert
wurden, bewegt werden kann, wobei der Aufnahmekopf zumindest eine
hohle Nadel aufweist, die durch jeweilige Fluidleitungen mit einer
Drucksteuerung verbunden sind, die so betreibbar ist, dass sie Mengen
des Mediums aus dem Probenbehälter
in die zumindest eine hohle Nadeln einsaugt, das Medium hält und es
ausstößt, wenn
dies erforderlich ist, wodurch eine Aufnahme von Tierzellkolonien
aus dem Medium ermöglicht wird.
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Diese
Vorrichtung ist vorzugsweise zum automatisierten Aufnehmen von Tierzellenkolonien
so ausgebildet, dass der Aufnahmekopf zumindest eine hohle Nadel
aufweist und über
die Vorrichtung unter Verwendung von Positionier-Motoren bewegbar ist, wobei ein Probenbehälter einschließlich einer
Vielzahl von in einem Medium gehaltener Tierzellenkolonien auf der
Vorrichtung vorhanden ist, sowie auch ein Ausgabebehälter. Des
Weiteren ist eine Maschinenbildaufnahmeeinrichtung zur Bildverarbeitung vorgesehen,
um Tierzellenkolonieanordnungen in der Probe zu identifizieren.
Mittels der Vorrichtung ist der Aufnahmekopf bzgl. des Probenbehälters ausrichtbar,
wobei eine Tierzellenkolonie aufnehmbar ist, indem eine der zumindest
einen hohlen Nadel bzgl. einer der Tierzellenkolonieorte ausgerichtet
wird, wobei ein distales Ende dieser hohlen Nadel in das Medium
einführbar
ist und die Tierzellenkolonie an dem Ort in die hohle Nadel einsaugbar
ist. Mittels der Vorrichtung ist die aufgenommene Tierzellenkolonie ausgebbar,
indem der Aufnahmekopf über
den Ausgabebehälter
bewegbar ist und dort die aufgenommene Tierzellenkolonie in den
Ausgabebehälter
ausstoßbar
ist.
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Der
automatisierte Prozess kann zum Sortieren oder Aufnehmen von Tierzellkolonien
verwendet werden, die biologische Moleküle enthalten, ausdrücken oder
absondern, wie etwa ein Protein (Eiweiß) oder einen Kohlenwasserstoff
von Interesse, und die über
eine Zellenabbildung erfasst werden können. Die Tierzellkolonien
können
optisch auf verschiedene Arten erfasst werden, z.B. mit Hilfe von
fluoreszierender Färbung,
nicht-fluoreszierender Färbung
oder ohne jegliche Färbung; über Raman-Streuung,
durch Phasenkontrast oder Verwendung von Nomarski-Interferenzabbildung.
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Die
Kolonien werden hauptsächlich
aus Säugetier-Zellkolonien
bestehen, aber auch andere Tierzellkolonien, wie Insekten-Zellkolonien
können
aufgenommen werden. Die Ziel-Tierzellkolonien können anhand einer Vielzahl
von Eigenschaften unterschieden werden, wie etwa Form, Größe, Farbe
oder molekularer Inhalt der Zelle, der Membran oder deren Ausscheidungen
oder durch eine beliebige Kombination mehrerer Eigenschaften.
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Der
Aufnahmeschritt kann ein Wiederholen der Ausrichtungs- und Ansaugschritte
für mehrere der
hohlen Nadeln umfassen um mehrere der Tierzellkolonien aufzunehmen.
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Der
Abgabebehälter
kann eine Anordnung von Titern (Mulden) umfassen, die in einem charakteristischen
Abstand zueinander angeordnet sind. In diesem Fall wird es bevorzugt,
dass auch die hohlen Nadeln in diesem charakteristischen Abstand
zueinander angeordnet sind, damit der Abgabeschritt parallel für alle hohlen
Nadeln ausgeführt
werden kann. Es ist günstig,
wenn die hohlen Nadeln in einem charakteristischen Abstand angeordnet
sind, der mit einem Standartabstand für Titerplatten übereinstimmt. Dies
vermindert die Bewegung des Aufnahmekopfes und erlaubt es den Prozess
zu Parallelisieren.
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Die
Tierzellkolonien können
mit einem fluoreszierenden Eiweiß/Protein (FP) kontaktiert
sein oder dieses ausdrücken,
z.B. ein grün
fluoreszierendes Protein (GFP), um die Bildverarbeitung zu unterstützen. Das
FP kann in den Zellen vorliegen, auf der Oberfläche der Zellen oder in das
die Zellen umgebende Medium abgesondert sein. Der Prozess kann auf
jedem Molekül
beruhen, das mit einem Antikörper,
einem Liganden oder einem Rezeptor detektierbar ist.
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Der
Aufnahmekopf kann in vorteilhafter Weise einen Antriebsmechanismus
zur Erzeugung von seitlichen Oszillationen der distalen Enden der
hohlen Nadeln umfassen, um das Ablösen von anhaftenden Tierzellkolonien
zu erleichtern.
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Zum
Beispiel kann der Antriebsmechanismus so ausgelegt werden, dass
er eine Drehbewegung der distalen Enden der hohlen Nadeln bewirkt. Andere
Arten der Bewegung, etwa linear, sind auch möglich.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Zum
besseren Verständnis
der Erfindung und um zu zeigen, wie sie ausgeführt werden kann, wird beispielhaft
auf die Zeichnungen verwiesen, die zeigen:
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1 ist
eine perspektivische Ansicht einer Vorrichtung nach der Erfindung
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2 ist
eine perspektivische Ansicht der Vorrichtung
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3 zeigt
Einzelheiten eines Lichttisch-Beleuchtungssystems der Vorrichtung
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4 ist
eine schematisierte Seitenansicht der optischen Anordnung der Vorrichtung
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5 ist
eine perspektivische Ansicht des Aufnahmekopfes der Vorrichtung
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6 ist
perspektivische Ansicht einer hohlen Nadel des Aufnahmekopfes mit
dem zugehörigen Antriebsmechanismus
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7 ist
ein schematisierter Schnitt durch die hohle Nadel und den Antriebsmechanismus
von 6 im Betrieb
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8 stellt
eine Folge von schematischen Darstellungen der Schritte bei der
Aufnahme von anhaftenden Tierzellkolonien
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9 ist
eine schematisierte Zeichnung der Fluid-Bauteile (fluidics) der
Vorrichtung
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10 ist
ein schematisches Blockdiagramm der Steuerung der Vorrichtung
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11 ist
ein Flussdiagramm eines mittels der Vorrichtung durchgeführten beispielhaften
Prozesses
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12 ist
ein Flussdiagramm des Zellkolonieaufnahmeteils des Prozesses von 11.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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1 zeigt
eine perspektivische Ansicht des unteren Teils einer Vorrichtung
nach der Erfindung. Der obere Teil ist nicht dargestellt, um das
Vorrichtungsbett 10 sichtbar zu machen. Eine Lichttischplatte 12 aus
einem durchscheinenden Material, bekannt als Opalacryl, ist bündig mit
dem Vorrichtungsbett 10 montiert. Die Lichttischplatte 12 könnte auch
aus einem anderen durchscheinenden Akryl- oder Glasmaterial bestehen,
z.B. gesandstrahltem Glas oder Perspex (Plexiglas).
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Ein
Satz von Stiften oder Klammern 14 (vier in dieser Figur)
ist um den Umfang der Lichttischplatte 12 vorgesehen. um
Behälter
für biologische
Proben, wie Petrischalen, die Zellkolonien enthalten, auf dem Lichttisch
anzuordnen und zu fixieren. Die Kolonien könnten auch in Q-trays, omni-trays
oder beliebigen anderen geeigneten Behältern bereitgestellt werden.
Die Lichttischplatte 14 wird von unten her von optischen
Einrichtungen beleuchtet, die unter dem Vorrichtungsbett in dem
von dem Hauptbett 16 zur Verfügung gestellten Raum angeordnet
sind.
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Die
Tierzellkolonien können
menschliche Zellkolonien oder andere Säugetier-Zellkolonien oder Insektenzellkolonien
sein. Die Zellen können
z.B. unsterblich, embryonisch oder Stammzellen sein. Typischerweise
würden
die Zellkolonien in Gewebekultur gezogen.
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Die
Vorrichtung hat einen Aufnahmekopf 18 zum Aufnehmen von
Säugetier-Zellkolonien, der über das
Hauptbett der Vorrichtung durch x-y- und z-Positionierungsmotoren 20, 22 und 24 bewegbar ist.
Der gezeigte Aufnahmekopf 18 umfasst eine Anordnung von
hohlen Nadeln 26, von denen jede mit einer Fluidleitung
verbunden ist. In einem Beispiel hat der Aufnahmekopf 18 eine
1 × 8
Anordnung von Nadeln, wobei jede hohle Nadel 26 ihre eigene
Fluidleitung 28 besitzt, zum Ansaugen und Abgeben einer Zellkolonie
um die Zellkolonie aus einem Behälter
zu entnehmen gefolgt von Ablegen der Zellkolonieprobe in einer Titer 29 oder
einen anderen Zielort. Es dürfte klar
sein, dass normalerweise mehrere Titerplatten verwendet werden,
obwohl nur eine aus Gründen
der Einfachheit dargestellt ist. Ein Raster von Titer-Aufnahmemulden
kann auf dem Hauptbett der Vorrichtung zur Verfügung gestellt werden. Es kann
auch eine Automatisierung der Handhabung der Titerplatten vorgesehen
sein, z.B. als „Hotel"-System, oder einen
voll-automatischen Titerplatten Stapler und Zuführer, wie aus dem Stand der
Technik bekannt ist. Der Aufnahmekopf 18 wird von dem z-Positionierer getragen,
der seinerseits vom y-Positionierer
getragen wird und dieser wiederum vom x-Positionierer. Der Aufnahmekopf 18 ist
auf einer Seite mit einer Kamera 19 für eine maschinelle Bildaufnahme
versehen. Die Kamera 19 kann mit einem Zoom-Objektiv oder
mit Wechselobjektiven ausgestattet sein, um verschiedene Vergrößerungen
und damit Auflösungen
zu erzielen. Alternativ kann eine weitere (nicht gezeigte) Kamera
auf dem Aufnahmekopf 18 montiert sein, so dass zwei Kameras
mit verschiedener Objektiv-Vergrößerung vorhanden
sind. Eine für niedrige
Auflösung
und großes
Gesichtfeld und die andere für
ein kleines Gesichtsfeld mit hoher Auflösung. im Gebrauch wird die
Kamera mit niedriger Auflösung
benutzt, um die gesamte Petrischale oder anderen Behälter zu
erfassen (kartieren) um die Orte von Zellkolonien zu identifizieren/ermitteln.
Dann wird die Kamera mit der hohen Auflösung eingesetzt, um jede Kolonie
abzubilden. Selbstverständlich
kann ein ähnliches
Vorgehen auch mit einer einzigen am Aufnahmekopf 18 montierten
Kamera mit veränderlicher
Vergrößerung durchgeführt werden.
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Benachbart
zum Aufnahmekopf 18 kann am z-Positionierer auch ein (nicht
gezeigter) Greifer für Titerplatten
befestigt sein, der es erlaubt Titerplatten auf dem Hauptbett der
Vorrichtung herum zu bewegen.
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Eine
einzelne Titerplatte 29 ist beispielhaft auf dem Hauptbett
der Vorrichtung dargestellt. Das Hauptbett kann mit Stationen für Titerplatten
und Schalen für
Kolonien von verschiedenen Standart Typen versehen sein.
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Nachdem
aufgenommene Zellkolonien in ihre Titer abgegeben wurden, müssen die
hohlen Nadel gereinigt werden, bevor sie benutzt werden können, um
weitere Zellkolonien aufzunehmen, um eine Kreuz-Kontamination zu
vermeiden. Zum Reinigen der Nadeln wird eine Wasch- und Trockenstation 2 verwendet.
Der Waschteil umfasst ein erste und ein zweites Bad 4 und 6.
Der Trockenteil besteht aus einer Kammer zum Geblasen der Nadeln
mit Luft und bevorzugt auch aus Halogen- oder anderen Lampen. Die
Lampen dienen zum Sterilisieren und Trocknen der Nadeln durch Erhitzung.
Das Gebläse
kann das Trocknen unterstützen,
aber wenn Lampen vorhanden sind, dient er hauptsächlich zum Kühlen der
Nadeln nach der Erhitzung.
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Nach
Beendigung eines Durchgangs bewegen die x-, y- und z-Positionierer 20, 22 und 24 den Aufnahmekopf 18 zur
Wasch- und Trockenstation 2. Die Nadeln werden in das erste
Waschbad 4 abgesenkt und eingetaucht, das Wasser oder eine
Wasser/Bleichemischung enthält.
Das erste Waschbad 4 kann mit aufrecht stehenden Bürsten, die
in der Reinigungsflüssigkeit
eingetaucht sind, versehen sein. In diesem Fall werden die x- und
y-Positionierer verwendet um die Nadeln in einer drehenden Bewegung in
der xy-Ebene über
die Bürsten
zu bewegen. Bevorzugt werden die Nadeln auch mit einer sterilisierenden
Lösung,
wie etwa Bleiche, durchspült.
Der Aufnahmekopf 18 wird dann zu dem zweiten Bad 6 bewegt,
das beispielsweise Ethanol zur weiteren Reinigung enthält. Ethanol
wird im letzten Bad im Hinblick auf seine Flüchtig keit verwendet, da dies
das nachfolgende Trocknen der Nadeln unterstützt. Die bestimmten Reinigungsmittel
sind lediglich erwähnt,
um konkrete Beispiele zu geben. Andere Reinigungsmittel werden manchmal
verwendet.
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Der
Aufnahmekopf wird dann über
die Trocknungsstation 8 bewegt. Wenn vorhanden werden die Halogenlampen
zu diesem Zeitpunkt eingeschaltet, um die nadeln zu Erwärmen/Erhitzen.
Ein Luftgebläse
wird dann eingeschaltet, um die Nadeln zu trocknen und/oder um sie
auf Umgebungstemperatur zu Kühlen,
wenn sie durch die Halogenlampe erwärmt wurden.
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Das
Hauptbett kann auch andere Standartausrüstungen umfassen, wie einen
Abfallschacht, eine Vorrichtung zum Entfernen der Deckel von Titerplatten,
einen Titerplatten-Schüttler
oder ein Titerplatten-Hotel. Keine von diesen ist gezeigt. Die Vorrichtung
kann auch mit einem automatischen Titerplatten-Zufuhr- und Stapelmechanismus versehen
sein, desgleichen mit einem automatischen Zufuhr- und Stapelmechanismus
für Schalen,
die Zellkolonien enthalten. Keine von diesen ist gezeigt.
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2 ist
eine perspektivische Ansicht einer Vorrichtung nach der Erfindung.
Im Vergleich zu 1 zeigt die Vorrichtung auch
den oberen Teil der Maschine. Der obere Teil ist hauptsächlich aus
einem licht- und gasdichten Gehäuse/Deckel 30 mit
zwei Seiten 32, einer Rückwand 34 und
einem Abdeckung 36. Eine sogenannte hochleistungs Luftpartikel
(HEPA)-Filtereinheit 35 ist auch auf der Abdeckung 36 montiert.
Das Arbeitsvolumen der Vorrichtung, das vom Hauptbett 10 und
dem Gehäuse 30 umschlossen
ist, kann in einer kontrollierten Umgebung im Wesentlichen frei
von kontaminierenden Partikeln gehalten werden. Dies geschieht durch
die Zufuhr von gefilterter Luft durch die HEPA-Filtereinheit 35 in
das Arbeitsvolumen und durch Halten des Arbeitsvolumens unter einem
geringen Überdruck,
so dass ungefilterte Luft aus der Umgebung daran gehindert ist,
in das Arbeitsvolumen einzudringen.
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Auf
der Vorderseite der Maschine befindet sich eine mit Scharnieren
versehene Tür 38,
um den Zugang zu erlauben. Auf der Abdeckung 36 ist eine Detektoreinheit 40 angeordnet,
die einen Matrix-Detektor, in Form eines CCD-Chips, und zugehörige Abbildungsoptik in Form
eines Objektivs und geeigne ter Filter enthält. Die Abbildungsoptik ist
so konstruiert, dass sie die obere Fläche der Lichttischplatte als
Abbildungsebene besitzt, oder eine geringfügig höhere Ebene, um die übliche Dicke
der Basis einer Schale für
Zellkolonien zu berücksichtigen.
Der CCD-Chip kann mit einem Peltier-Kühler (nicht gezeigt) gekühlt werden
um Rauschen zu reduzieren. Falls eine niedrigere Arbeittemperatur
erwünscht
ist, um das Rauschen noch weiter zu vermindern, könnte ein
kryogenes Kühlmittel,
wie flüssiger
Stickstoff, verwendet werden, beispielsweise mit einem Kryostaten
mit geschlossenem Kreislauf. Der Matrix-Detektor muss kein CCD sein und könnte ein
beliebiger, geeigneter zweidimensionaler Matrix-Detektor sein, wie
eine Vielkanalplatte (multi channel plate MCP). Der Matrix-Detektor
kann gekühlt
sein, z.B. mit einem Peltier-Modul oder mit einem kryogenen Kühlmittel,
wie flüssigem
Stickstoff.
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Die
Detektoreinheit 40 ist in einem zylindrischen Gehäuse enthalten,
das aufrecht auf der Abdeckung der Maschine verschraubt ist, so
dass die optische Hauptachse „O" der Detektoreinheit
senkrecht zu der Ebene des Hauptbetts der Vorrichtung steht. Optischer
Zugang zu dem darunter liegenden Lichttisch wird durch eine Öffnung im
Dach ermöglicht.
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3 zeigt
Einzelheiten eines Lichttisch-Beleuchtungssystems der Vorrichtung
nach der Erfindung. Die Zeichnung ist eine perspektivische Ansicht von
einer Seite der Maschine von einer Position, die nach unten und
durch die Ebene des Hauptbetts der Maschine blickt, jedoch ohne
das Hauptbett zu zeigen. Die Ebene des Hauptbetts (und die Lichttischplatte)
ist mit dem Bezugszeichen
10 markiert. Der Hauptteil des
Beleuchtungssystems ist eine (Licht)Quelleneinheit
50,
mit rechteckigem Grundriss und mit Abmessungen, die in etwa denjenigen
der Lichttisch Beleuchtungsplatte (z.B. 300 × 200 mm) entsprechen und die
eine Dicke von ungefähr
20 mm hat. In der Basis der Lichtquelleneinheit ist eine Mehrzahl
von blauen Licht emittierenden Dioden (LEDs) angeordnet, die Licht
mit einer nominalen mittleren Wellenlänge von 473 nm abstrahlen.
(In anderen Ausführungsformen
könnten
LEDs mit hiervon verschiedener Farbe verwendet werden). Die LEDs sind
in vier Gruppen
52 (gestrichelte Linien) angeordnet, wobei
jede Gruppe eine verpackte Einheit von 100 oberflächenmontierten
LEDs mit integrierter Fresnellinse umfasst. Alternativ könnten einzelne LEDs
verwendet werden, die über
die Fläche
der Lichtquelleneinheit verteilt sind. Über den LEDs und die gesamte
Fläche
der Lichtquelleneinheit überdeckend
befindet sich eine Filterplatte (nicht gezeigt) gefolgt von einem
schichtförmigen,
holographischen Diffusor
54. Der holographische Diffusor
ist eine Platte aus Kunststoffmaterial mit einer mikrostrukturierten
Oberflächenreliefstruktur,
die durch einen Prägeprozess
unter Verwendung eines holographisch erzeugten Prägewerkzeugs
hergestellt wird (vgl. hierzu
US
5,534,386 : Physical Optics Corporation (
6)). Der Diffusor
homogenisiert das Licht der LEDs, so dass die Intensitätsverteilung
des LED-Lichts auf
der Lichttischplatte ausgeglichen ist. Auf beiden Seiten der der
Lichtquelleneinheit sind Lichtstreifeneinheiten
56 angeordnet,
um eine Weißlichtbeleuchtung der
Lichttischplatte für
Kontrastabbildung bereitzustellen.
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4 stellt
eine schematische Seitenansicht dar, welche die optische Auslegung
zeigt. Im oberen Teil der Figur kann man die Detektoreinheit 40 sehen, welche
auf der Abdeckung 36 befestigt ist. Die Detektoreinheit 40 enthält einen
CCD-Chip 42 mit zugeordneter Sammeloptik 44 welche
schematisch als eine einzige Objektivlinse dargestellt ist. Es versteht
sich, dass jegliche geeignete Linsen(oder Spiegel)-Kombination verwendet
werden kann, um die Lichttischplatte auf der aktiven Oberfläche des
CCD-Chip darstellen zu können.
Die optische Achse „U" der Detektoreinheit 40 ist
ebenfalls gezeigt. Die Detektoreinheit 40 weist auch ein
Filter 46 auf. Dies ist ein Bandpassfilter zum Filtern
der LED-Emission. Eine mittlere Wellenlänge von 620 nm mit 35 nm Bandpass
ist für die
zuvor erwähnten
blauen LED's ausgewählt. Es versteht
sich, dass im Allgemeinen eine geeignete Auswahl eines Bandpasses
oder eines Abtrennfilters bzgl. der Emission der LED's getroffen werden
kann und die Erregungs- und Emissionsbänder der fluoreszenten Farbe
zu nutzen. Darüber
hinaus kann bei gewissen Anwendungen z.B. mit Kontrastdarstellung ein
Filter entbehrlich sein. In der Mitte der Figur sind die Lichttischplatte 12 und
Tischklammern 14 dargestellt, wobei die Lichttischplatte 12 im
Allgemeinen in der Ebene des Hauptbettes der Vorrichtung liegt.
Im untern Teil der Figur ist die Lichtquelleneinheit 50 mit ihren
LED's 52,
dem Filter 53 und dem Diffuser 54 gezeigt. Das
Filter 53 ist ein gefärbtes
Bandpasshauptfilter einer solchen Art, welche für elektrisches Leuchten verwendet
wird, welches beim vorliegenden Beispiel blau ist, in welchem blaue
LED's verwendet
werden. Das Filter 53 ist wirksam zum Entfernen unerwünschter
Bestandteile der LED- Emission.
Insbesondere hat sich (im Fall von) bei blauen LED's herausgestellt,
dass ein kleiner Anteil der LED's
durch das Emittieren von Wellenlängenbestandteilen
außerhalb
des blauen in den grünen
und den roten eine Fehlfunktion besitzt. Ein unterschiedliches Farbfilter kann
in Abhängigkeit
von den Ausgangswellenlängen
der verwendeten LED's
gewählt
werden. Die winklig angeordneten Streifenlichteinheiten 56 sind ebenfalls
klar ersichtlich.
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Eine
CCD-Belichtungszeit von etwa 10 Sekunden bis 3 Minuten ist normalerweise
ausreichend, um Zellkolonien darzustellen. Die Belichtungszeit wird
von einer Anzahl von Faktoren abhängig sein, z.B. vom verwendeten
Farbtyp. Eine brauchbare Farbe ist trypan-blau. Die Belichtungszeit
ist proportional der Bestrahlungsintensität, so dass die Belichtungszeit
reduziert werden kann, indem eine intensivere Bestrahlung von weißen Lichtquellen,
Lasern oder in LED's
verwendet wird.
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5 ist
eine perspektivische Ansicht, welche einen Teil des Aufnahmekopfes
18 mit
größerem Detail
zeigt. Die Endabschnitte der hohlen Nadeln
26 sind sichtbar,
indem sie durch den Boden ihrer Gehäuseteile hindurch dringen.
Das hohle Innere der Nadeln erstreckt sich nach oben und dann durch
eine rechtwinklige Biegung, um an Zapfen
27 zum Anschluss
flexibler Fluidleitungen (in
5 nicht
gezeigt, jedoch angedeutet in
1). Es soll
ebenfalls festgestellt werden, dass der Aufnahmekopf
18 mit den
Nadeln als ein einziges Stück
entfernt und in einem Autoklav zur Sterilisation behandelt werden.
Ein automatisierter Kopfaustausch kann ebenfalls vorgesehen sein,
wie z.B. in
US 10/144,763 von
Ruddock beschrieben, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen
ist. Zahlreiche Mehrfachkopfanordnungen werden in Betracht gezogen.
Um z.B. die Geschwindigkeit zu erhöhen, können zwei Köpfe ähnlich dem in
5 gezeigten,
vorgesehen sein. Während
einer dieser Köpfe
angewendet wird, kann der andere in einer automatisierten Wasch-/Trocknungsstation
gereinigt werden, wodurch Totzeit eliminiert wird, welche ansonsten
während
der Kopfsterilisation auftreten würde, wie es in
US 10/298, 948 von Elverd, Haslam
und Ruddock beschrieben ist, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme
eingefügt
wird. Eine weitere Möglichkeit
besteht darin, ein Speziallistenbildkopf zum Tragen der Kamera (oder
Kameras) vorzusehen. Indem ein separater Bildkopf vorgesehen wird,
wird das Gewicht der Köpfe reduziert,
wodurch die Geschwindigkeit erhöht
wird, mit welcher sie gescannt werden können und wodurch Überlastprobleme
verhindert werden. Dies kann besonders nützlich sein, wenn der Bildkopf
weitere Teile enthält wie
z.B. sein eigenes Spektrometer oder mehrere Kameras.
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6 stellt
eine perspektivische Ansicht von einer der Nadeln 26 in
größerem Detail
dar. Sowie die Nadel ist auch ein Elektromotor 60 gezeigt,
welcher längs
der Nadel 26 angebracht ist. Die hohle Nadel 26 weist
sowohl äußere als
auch innere Nadeln 62 und 64 auf, wobei die innere
Nadel 64 koaxial im Innern der äußeren Nadel 62 angeordnet
ist. Beide Nadeln sind aus nicht rostendem Stahl hergestellt. Die innere
Nadel 62 bildet das Ende des Fluidweges, welcher die flexible
Leitung enthält.
Der Elektromotor 60 ist mit der inneren Nadel 64 über einen
Verbindungsstab 66 verbunden, welches mittels einer an dem
Motor 60 montierten Kurbel angetrieben wird. Der Motor
treibt somit die innere Nadel 62 an, sodass sie eine Drehbewegung
ausführt,
wobei die Bewegung durch Biegen der inneren Nadel 64 aufgenommen
wird.
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Bei
dem vorliegenden Ausführungsbeispiel weist
die innere Nadel 64 einen Innendurchmesser von 0,7 mm und
einen Außendurchmesser
von 1,07 mm auf. Die äußere Nadel 62 ist
35 mm lang und hat einen 5 mm Außendurchmesser, wobei sie sich
auf 4,2 mm an ihrem Ende verjüngt,
sowie einen Innendurchmesser von 3,2 mm. Diese Abmessungen sind geeignet
zum Aufnehmen von Zellkolonien einer mittleren Größe von etwa
0,5 mm.
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7 ist
ein schematischer Schnitt der Nadel 26 und des Motors 60,
wobei die Nadel im Gebrauch zum Aufnehmen benachbarter Zellkolonien gezeigt
ist. Die innere und die äußere Nadel 64 und 62 sind
zu sehen, sowie der Motor 60 und der Verbindungsstab 66.
Wie ersichtlich ist das Ende der inneren Nadel 64 axial
im Inneren des Endes der äußeren Nadel 62 um
einen Abstand d1 zurückgesetzt.
Bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel
sind Werte von d1 = 0,25 – 0,5
mm verwendet worden. Weitere Werte im Bereich von 0, 1 bis 2 mm
sind anwendbar, und zwar in Abhängigkeit
von den relevanten Parametern wie z.B. mittlerer Koloniegröße und Flüssigkeitsviskosität. Die Figur
zeigt die Nadel 26 abgesenkt in Position zur Aufnahme einer
benachbarten Zellkolonie 74. Die Nadel 26 ist
derart abgesenkt, dass das distale Ende der äuße ren Nadel 62 in
die Flüssigkeit 72 eingetaucht
und um einen kleinen Betrag d2 von der oberen Oberfläche der
Probenbehälterbasis
(Substrat) 76 versetzt, auf welchen die Zellkolonien wachsen.
Bei vorliegenden Ausführungsbeispiel
ist d2 zwischen etwa 0 (d.h. Antreffen gegen die Platte 76)
und 0,5 mm variiert, obwohl größere Versetze
in Betracht gezogen werden können,
z.B. bis zu 2 mm. Dabei sind Werte von 0 (d.h. Antreffen), 0,1 mm
und 0,2 mm üblich.
Die Nadel 26 ist auch mit der Zellkolonie 74 ausgerichtet,
wie es durch die xy-Koordinaten
der Kolonie bestimmt ist, welche durch das Bild der mit der Kamera 40 aufgenommenen
und der nachfolgenden Bildverarbeitung bestimmt wurde.
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In
der dargestellten Position ist der Motor 60 so betätigt, dass
das Ende der inneren Nadel 64 oszilliert, wodurch eine
Turbolenz in der Flüssigkeit 72 erzeugt
wird. Eine Oszillationsfrequenz von etwa 100 Hz ist erfolgreich
verwendet worden. Andere Frequenzen dürften wahrscheinlich auch funktionieren. Die
durch diese Bewegung erzeugten Kräfte haben sich als ausreichend
herausgestellt, um die Zellkolonie zu entnehmen und ein Einsaugen
der entnommenen Zellkolonie in die hohle Nadel zu ermöglichen, welche,
wie zuvor erwähnt,
das Ende der Kapillare 70 bildet. Die innere Nadel 64 ist
durch einen Flansch 68 gehalten, welcher in die Oberseite
der äußeren Nadel 62 passt
und eine mittige Durchgangsbohrung aufweist, durch welche die innere
Nadel 64 in in einem Schiebegleitsitz hindurchläuft.
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Im
Fall von nicht benachbarten Kolonien, welche in einem halbfesten
Wachstumsmedium sind, versteht es sich, dass die Kolonien nicht
an der Platte haften, sodass keine Notwendigkeit zum Vibrieren der
Nadel gegeben ist.
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8 stellt
eine Reihe von schematischen Darstellungen A-E dar, welche die verschiedenen Schritte
beim Aufnehmen einer ausgewählten
Säugetierzellkolonie
veranschaulicht. In der Darstellung A ist die Nadel 70 über einer
benachbarten Zielkolonie 74 abgesenkt, welche in einer
Flüssigkeit 72 eingetaucht
ist, und zwar nach Ausrichtung der xy-Koordinaten. In der Darstellung
B ist die Nadelspitze direkt über
der Kolonie bereit zum Ausführen
des Aufnahmevorganges eingetaucht. Die Darstellung C zeigt die Situation
nach der vibrationsinduzierten Aufnahme, bei welcher das Einsaugen
stattfindet. Eine Flüssigkeitssäule, in
welcher die Kolonie in Suspension ist, wird nach oben in die Nadel
gezogen, indem der Druck in der Nadel abgesenkt wird. Die Darstellung
D zeigt die Situation, nachdem die Nadel aus dem Probenbehälter angehoben
worden ist. Die Kolonie wird unter einem Druck, welcher geringer
als der Atmosphärendruck
ist, welcher in der Nadel aufrecht erhalten wird, gehalten. Der
Aufnahmekopf kann dann über
eine Titerplatte zum Ausgegeben werden. Die Darstellung E zeigt
die Situation, in welcher das Ende der Nadel in einen Titer einer
Titerplatte abgesenkt worden ist und die Kolonie aus der Nadel durch
Anheben des Druckes in der Nadel ausgestoßen worden ist, wodurch der
Zellaufnahmevorgang beendet wird.
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Die
obige Beschreibung bezieht sich auf ein Beispiel einer benachbarten
Kolonie. Es versteht sich, dass, wenn eine Kolonie in Suspension,
eine vereinfachte Form desselben Prozesses ausgeführt werden
kann, bei welchem die mit der Entnahme einer benachbarten Kolonie
verbundenen Schritte ausgelassen sind. Es versteht sich auch, dass
einige der Teile der Vorrichtung im Fall der Aufnahme von Zellkolonie
aus einer Suspension redundant sind und weggelassen werden können, falls
die Maschine nicht die Fähigkeit
zum Handling benachbarter Kolonien benötigt. Z.B. kann die äußere Nadel
wie auch der Motor und damit verbundene Antriebsteile weggelassen
werden.
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9 ist
eine schematische Zeichnung der für die Flüssigkeit vorgesehene Elemente
der Vorrichtung. Eine der Nadeln 26 ist verbunden mit seiner Flüssigkeitsleitung 28 gezeigt,
welche aus einer flexiblen Leitung hergestellt ist, welche zu einer
an dem Gehäuse
einer für
die Flüssigkeiten
benötigten
Einheit 86 montiert ist. (Die Sammelleitung 81 wird
zum Aufnehmen sämtlicher
Fluidleitung 28 verwendet, obwohl nur eine einzige gezeigt
ist.) Die Sammelleitung 81 nimmt auch eine weitere Fluidleitung 101 von einem
Flüssigkeitszufuhrgefäß 103 über eine
Fluidleitung 101 auf, welche die Flüssigkeit in das Zufuhrgefäß 103 über einen
abgedichteten oberen Flansch 105 einleitet. Die Flüssigkeit
in dem Behälter 103 kann
unter Druck gehalten sein. Im Innern der die Flüssigkeit betreffenden Einheit 86 ist
die Flüssigkeitszufuhr
von der Sammelleitung 81 über eine Fluidleitung 99 zu
einem normalerweise offenen (NO) Anschluss 93 eines Ventils 85 verbunden,
und die andere Seite des Fluidweges, welcher zu der Nadel 26 führt, ist
von der Sammelleitung 81 über eine Fluidleitung 97 zu
einem normalerweise geschlossenen (N.C.) Anschluss 89 des
Ventils 85 verbunden. Die für die Flüssigkeiten vorgesehene Einheit 86 schließt auch
eine Pumpe 83 ein, welche eine hin- und hergehende Kolben/Zylinderpumpe
welche eine Verbindung über
eine Fluidleitung 95 zu einem gemeinsamen Anschluss (COM) 87 des
Ventils 85 herstellt. Das Ventil 85 sowie auch
die Pumpe 83 sind mit einer für die Flüssigkeiten vorgesehenen Steuereinheit 84 mittels
elektrischer Steuerleitungen verbunden. Die für die Flüssigkeiten vorgesehene Steuereinheit 84 ihrerseits
ist mit einem Steuercomputer verbunden und durch diesen angetrieben
(nicht in dieser Figur gezeigt).
-
Im
Gebrauch wird das Ventil 85 wie folgt gesteuert. Wenn das
Ventil 85 in seiner Ruhezustand ohne Inputs ist, ist der
NO-Anschluss 93 offen, und der N.C.-Anschluss 89 ist
geschlossen. Dies verbindet die hin- und hergehende Pumpe mit dem
Fluidgefäß 103,
sodass es Flüssigkeit
aus dem Reservoir mittels einer geeigneten Abwärtsbewegung des Pumpenkolbens
in seinem Zylinder ziehen kann. Andererseits, wenn das Ventil 85 in
seinem betätigten Zustand
mit einem energetisierenden Input-Signal ist, ist der NO-Anschluss 93 geschlossen,
und der N.C.-Anschluss 89 ist offen. Dies verbindet die
hin- und hergehende Pumpe 83 mit der Nadel 26,
was es der Flüssigkeitssäule in dem
Fluidweg, welcher durch die Elemente 26, 28, 97 und 95 erlaubt,
die jeweilige Richtung durch die Bewegung des Pumpenzylinders bewegt
zu werden. Dies gewährleistet
die Feinsteuerung zum Einsaugen und Ausstoßen von Tierzellenkolonien,
was schematisch in 8, wie zuvor beschrieben, gezeigt
ist. Das Anheben des Kolbens ermöglicht
auch ein Durchspülen
des Fluidweges während
des Reinigens. Zum Reinigen können
die Fluidgefäße von Hand
ausgetauscht werden. Alternativ kann ein automatisiertes Schalten
zwischen verschiedenen Fluidbehältern
unter Verwendung zusätzlicher
computergesteuerter Ventile vorgesehnen sein. Gegebenenfalls kann
ein unter Druck stehender Gasbehälter
als ein Fluidgefäß (z.B.
zum Reinigen mit Druckgas) vorgesehen sein, sodass die Fluidgefäße nicht
notwendigerweise Flüssigkeit
enthalten müssen.
Es versteht sich, dass die Gefäße 103 von
einer Vielzahl von Nadeln genutzt werden können und dass nicht für jede Nadel
ein separates Gefäß vorgesehen
sein muss. Individuelle Pumpen können
auch von zwei oder mehr Ventilen genutzt werden, um Kosten zu reduzieren.
-
10 ist
ein schematisches Blockdiagramm, welches das Steuersystem der Vorrichtung zum
Koordinieren der verschiedenen Komponenten zur Ausführung des
zuvor beschriebenen Prozesses zeigt. Ein Computer (PC 90)
wird als eine grundlegende Steuerkomponente verwendet und ist mittels elektronischer
Verbindungen unter Verwendung standardisierter Interface-Protokolle
mit verschiedenen Komponenten verbunden, welche Teil des automatisierten
Steuersystems sind. Die Steuerung wird durch eine Steuersoftware 91 bewirkt,
welche im PC 90 vorliegt. Eine Bildverarbeitungssoftware 92 liegt ebenfalls
im PC 90 vor und ist mit der Steuersoftware 91 verbunden.
Die Bildverarbeitung kann als Software, wie zuvor beschrieben, Hardware
oder Firmware, je nach Wunsch, ausgeführt werden. Die Detektoreinheit 40 in
der Form einer CCD-Kamera ist mit dem PC 90 zum Empfangen
von digitalen Bildern verbunden, welche mit der Kamera aufgenommen
wurden. Eine Beleuchtungs- und
Filtersteuereinrichtung 80 ist mit dem PC 90 verbunden.
Diese Steuereinrichtung wird verwendet, um die LED's 52 und
die Weißlichtquelleneinheit 56 zu
steuern, welche benutzt wird, um die Lichttischplatte 12 zu
beleuchten und auch um einen geeigneten Filter 46 aus einem
motorgetriebenen Filterrad auszuwählen. Eine Steuereinrichtung 82 für einen
Wäscher/Trockner
ist mit dem PC 90 verbunden und wird verwendet, um das
Gebläse und
die Halogenlampen des Trockners zu steuern. Die Positionierer 20, 22, 24 zum
Bewegen des Aufnahmekopfes 18 sind mit dem PC 90 verbunden.
Die kopfmontierte Kamera 19 ist mit dem PC 90 zum Empfangen
der Digitalbilder verbunden, welche durch die kopfmontierte Kamera 19 aufgenommen werden.
Diese werden verwendet zum Ausrichten der Nadeln des Aufnahmekopfes
mit den verschiedenen Teilen der Wasch- und Trocknungsstation 4, 6, 8, der
Titerplatten 29, Kolonien etc. Die Fluidleitungen 70 sind
mit der für
Flüssigkeiten
vorgesehenen Einheit 86 verbunden, welche durch die für die Flüssigkeiten
vorgesehene Steuereinheit 84 gesteuert wird, welche mit
dem PC 90 verbunden ist. Die für Flüssigkeiten vorgesehene Steuereinheit 84 wird
verwendet, um den Druck in den Fluidleitungen zu steuern, um ein
Einsaugen, ein Halten und ein Ausstoßen der Flüssigkeit aus der Probe zu steuern.
Die für
die Flüssigkeiten
vorgesehene Steuereinheit 84 steuert ebenfalls den Waschzyklus
der Nadeln und der Fluidleitungen, wobei ein Reinigungsfluid aus
den Bädern 4, 6 eingesaugt
und von den Enden der Nadeln während
des eingesaugt und von den Enden der Nadeln während des Reinigungszykluses
ausgestoßen
wird.
-
11 ist
ein Flussdiagramm, welches einen beispielhaften Prozess zeigt, welcher
durch die Vorrichtung ausgeführt
wird. Der Prozess hat die folgenden Schritte:
- S1 Plaziere
die Zellschalen in einen Bildbereich, d.h. auf einer Lichttischplatte 12.
- S2 Beleuchte den Bildbereich 12 unter Verwendung von
entweder einer farbigen Lichtquelle 52 (typischerweise
zum Detektieren gefärbter
Zellkolonien unter Verwendung von Fluoreszenz) oder der Weißlichtquelle 56 (typischerweise
für ungefärbte Kolonien)
- S3 Nimm ein Bild/Bilder unter Verwendung einer CCD-Kamera 40 auf
- S4 Führe
eine Software basierte Analyse zum Detektieren der Zellkolonien
aus, um eine „Aufnahmeliste" zu schaffen.
- S5 Zuordnen der Robotervorrichtung zum Auswählen von Zellkolonien aus der
Aufnahmeliste (detaillierter nachfolgend beschrieben)
- S6 Speichern aller Bilder und Daten
- S7 Entfernen der Titerplatten, welche die aufgenommenen Kolonien
enthalten
-
Bzgl.
der Schritte S2 bis S4 werden die Zellkolonien unter Verwendung
von Fluoreszenz sichtbar gemacht. Z.B. kann ein fluoreszenzmarkierter
Antikörper
benutzt werden, welcher sich an ein gewünschtes Protein bindet, das
abgesondert wurde von den Zellkolonien, an der Oberfläche davon
ausgedrückt
oder in dieser enthalten ist. Während
des Darstellens der Fluoreszenz erscheinen die Zellkolonien als
hell emittierende Punkte, wenn sie mit einer geeigneten Anregungswellenlänge (z.B.
mit blauen LEDs) bestrahlt werden. Eine Abreicherung der fluoreszenten
Antikörper
in der unmittelbaren Nähe
der Zellkolonien tritt ebenfalls auf, was den Effekt des Erzeugens
einer „inversen
Halo" hat, d.h.
eines dunkleren Bereiches um jede helle Kolonie, was die Bildverarbeitung
unterstützt.
-
Alternativ
werden, im Falle des Einfärbens, die
Zellkolonien durch Zumischen einer geeigneten Farbe in die Suspension
sichtbar gemacht. Es soll jedoch festgestellt werden, dass es möglich ist,
viele Kolonien ohne Einfärben
oder Fluoreszenz sichtbar zu machen.
-
12 ist
ein Flussdiagramm, das im größeren Detail
Schritt S5 zeigt, den Zellkolonie aufnehmenden Teil des Prozesses.
Schritt S5 des Prozesses hat die folgenden Unterschritte:
- S5.1
Auswählen
eines Elementes aus der Aufnahmeliste zum Aufnehmen
- S5.2 • Bewegen
einer ungenutzten Nadel bis über
die zugeordnete xy-Koordinate der aufzunehmenden Zellkolonie
• „Feuern" (d.h. absenken)
der Nadel in die Kolonieaufnahmeposition, wobei das Ende der Nadeln
in das Medium über
der Zielkolonie um einen Versatz d2 eingeführt ist
• Lediglich
für angesaugte
Kolonien – Bewegen
des Nadelendes zum Entfernen der Zielzellkolonie
• Ansaugen
eines definierten Volumens
• Zurückziehen
der Nadel und Halten der Probe, während andere Nadeln gefeuert
werden.
- S5.3 Sofern nicht alle Nadeln verwendet werden oder alle Kolonien
in der Aufnahmeliste aufgenommen worden sind, Wiederholen von Schritt
S5.2
- S5.4 Bewegen des Aufnahmekopfes über die Titerplatte und Ausrichten
der Nadeln bzgl. der Titer – dann
Ausgeben aller Proben gleichzeitig in die Titerplatte (Mikrotiterplatte)
- S5.5 Reinigen aller Nadeln unter Verwendung der Wasch- und Trocknungsstation 2
- S5.6 Sofern nicht alle Kolonien in der Aufnahmeliste aufgenommen
worden sind, Bewegen des Aufnahmekopfes zurück in den Probenbereich und
zurück zu
Schritt S5.1.
-
Dies vervollständigt Schritt S5.
-
Dies
beendet die Beschreibung des Hauptausführungsbeispiels. Verschiedene
mögliche
Alternativen werden nachfolgend erwähnt.
-
Das
Einsaugen ist beschrieben worden in Form von Hindurchlassen einer
Flüssigkeitssäule durch
die Fluidleitungen und in die Nadeln. Eine Alternative wäre, eine
Flüssigkeitssäule in der
Mehrheit jeder Flüssigkeitsleitung
zu halten, jedoch einen Verschluss mit Luft oder mit Inertgas, wie
z.B. Helium und Stickstoff in der Nadelspitze zu haben. Die Probe könnte eingesaugt
werden durch ein Nach-oben-ziehen von Flüssigkeitssäule und Luftverschluss zusammen,
sodass der Luftverschluss die Probenflüssigkeit oder das halbfeste
Medium vom Hauptkörper der
Flüssigkeitssäule separiert.
Die Verwendung eines Gasverschlusses bietet eine verbesserte Sterilität, da die
Probenflüssigkeit
von der Hauptflüssigkeitssäule durch
den Gasverschluss isoliert ist.
-
Alternative
optische Konfigurationen sind möglich.
So kann z.B. eine Laserquelle verwendet, wie z.B. ein Ionenlaser
anstelle von Licht emittierenden Dioden. Der Laserstrahl kann über die
untere Oberfläche
der Lichtplatte gescannt werden. In diesem Fall kann ein einzelner
Kanaldetektor verwendet werden. Geeignete Ionenlaser schließen Argonionen-
und Kryptonionenquellen ein. Es versteht sich, dass das Strahlscanning
mit geeigneten Scanspiegel-Optiken ausgeführt werden kann. Emissionswellenlängen über einen
weiten Bereich können
verwendet werden, z.B. 200 nm bis 1,6 μm, oder außerhalb dieses Bereiches.
-
Die
Vorrichtung kann mit einer Vielzahl von optisch basierten Verfahren
verwendet werden. Einfache Kontrastbilddarstellung kann verwendet
werden, oder höher
entwickelte spektroskopische Verfahren auf der Basis von optischer
Dichte, Lumineszenz oder Raman-Scattering. Sofern höher entwickelte
Spektralanalyse benötigt
wird, wie z.B. für
Resonanz-Raman-Scattering, die Sammeloptik kann ein Spektrometer
oder kontinuierlich einstellbare Bandpassfilter aufweisen, welche
vor dem Detektor angeordnet sind. Um bedeutende optische Dichteänderungen
zu erhalten, müssen
hohe Farbkonzentrationen verwendet werden, und viele Zellen werden benötigt, um
signifikante Änderungen
in der optischen Dichte zu erzielen. Vorzugsweise verwenden die
optisch basierten Verfahren Fluoreszenz und/oder Lumineszenz, welche
empfindlichere Untersuchungsmethoden sind verglichen mit der optischen
Dichte.
-
Es
wird auch herausgestellt, dass, obwohl das Hauptausführungsbeispiel
eine Illumination eines Lichttisches von unten zeigt, eine Illumination von
oben kann ebenfalls anstelle oder in Kombination mit einer Illumination
von unten verwendet werden.
-
In
einigen Fällen
kann die kopfmontierte Kamera (oder Kameras) ausschließlich verwendet
werden, und die abdeckungsmontierte Kamera wäre dann nicht erforderlich.
-
Lumineszente
Substrate schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
darauf, Luziferase, Luziferin (Anal Biochem (1994) 219, 169-181),
Aequorin (Methods Enzymol. (1978) 57, 271-291), und alkaline Phosphatase
(Clin. Chem (1996) 42, 1542-1546).
-
Fluoreszente
Substrate können
ein sehr helles Signal ergeben, was es ermöglicht, dass sie leicht auf
dem einzigen Zellniveau detektiert werden können. Ein bevorzugtes Fluoreszentprotein
ist grünes Fluoreszenzprotein – wie z.B.
ein modifiziertes (z.B. mutiertes) GFP. Lediglich beispielhaft kann
ein GFP an ein oder mehrere Antikörper zur Detektierung eines
Proteins von Interesse konjugiert sein.
-
Die
GFP der Quallenart Aequorea victoria ist ein Protein mit einem Erregungsmaximum
mit 395 nm und einem Emissionsmaximum bei 510 nm und benötigt keinen
exogenen Faktor. Die Eigenschaften und Anwendungen von GFP für das Studium
von Genausdruck (gene expression) und Proteinlokalisation sind beispielsweise
in Nat Cell Biol (2002) 4, E15-20; Biochemistry (1974) 13, 2656-2662;
Photochem. Photobiol. (1980) 31, 611-615; Science (1994) 263, 12501-12504;
Curr. Biology (1995) 5, 635-642; und
US
5,491,084 , diskutiert worden.
-
Demgemäß kann die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung mit verschieden fluoreszenten
und nicht fluoreszenten Proteinen und Farben verwendet werden.
-
Da
weitere Arten von Licht emittierenden Dioden kommerziell verfügbar werden
(wie z.B. Ultraviolett), können
weitere Gruppen vorgesehen sein, sodass die Vorrichtung so ausgebildet
sein kann, dass ein größerer Bereich
möglicher
Wellenlängenanregung
vorgesehen ist. Die Vorrichtung kann auch als multifunktionelle
Vorrichtung vorgesehen sein, in dem Licht emittierende Dioden unterschiedlicher
Arten wie z.B. eine erste Gruppe zum Ausgeben in einem ersten Wellenlängenband
(z.B. Blau) und eine zweite Gruppe zum Ausgeben in einem zweiten
Wellenlängenband
(z.B. Grün,
Rot) vorgesehen sein.
-
Eine
Vielzahl von fluoreszenten Farben ist verfügbar, welche emittieren über sichtbares
Licht von Ultraviolett bis Blau, Grün, Orange und Rot. Es versteht
sich, dass der vorgeschlagene Entwurf leicht modifiziert werden
kann, um ihn mit jeder Art von gewünschter fluoreszenter Farbe,
Protein mit geeigneter Anpassung an die optischen Quellen, Filter
und Detektoren verwendet werden kann. Insbesondere kann die Erfindung
auf cy3 und cy5 Farben angewendet werden, welche von Amersham Biosciences
verfügbar
sind. Nicht fluoreszente Farben, auf welche die Erfindung angewendet
werden kann, schließen Trypanblau
ein.
-
Es
versteht sich auch, dass, obwohl der Begriff Licht emittierende
Diode im Stand der Technik gewöhnlich
verwendet wird, um lediglich eine Art einer Lichtquelle auf der
Basis von Diodenemission zu beschreiben, dass der Begriff Licht
emittierende Dioden breiter in den Ansprüchen des vorliegenden Dokumentes
anzusehen ist, um jegliche Form von Licht emittierenden Dio denquellen
einschließlich
Diodenlaser, wie z.B. Halbleiter-Diodenlaser und superlumineszente
Dioden abzudecken.
-
Nachfolgend
sind Wege, in welchen eine Kolonie von Interesse identifiziert werden
kann, und zwar unter Verwendung der Vorrichtung, detaillierter beschrieben.
-
Der
automatisierte Prozess welcher hier beschrieben ist kann verwendet
werden, um eine oder mehrere Zellkolonien von Interesse auf der
Basis von Kontrastbilddarstellung zu sortieren, aufzunehmen oder
zu identifizieren.
-
Daher
kann die vorliegende Erfindung zum Identifizieren und Analysieren
biologischer Moleküle verwendet
werden, welche in Zellkolonien vorhanden sind, einschließlich z.B.
Peptiden, Polypeptiden, Nukleinsäuren
und glycosilierte und nicht-glycosilierte Proteine (Oligosaccharide,
Lipide und Ähnliches).
-
Es
versteht sich für
einen Durchschnittsfachmann, dass ein biologisches Molekül, wie z.B.
ein Protein von Interesse, auf eine Vielzahl von Arten detektiert
werden kann. Lediglich beispielhaft kann das biologische Molekül wie folgt
detektiert werden:
- 1. Das Expressierungssystem,
das verwendet wird, um das Protein von Interesse zu Tage treten zu
lassen, kann eines sein, welches bewirkt, dass das Protein von Interesse
aus der Zellkolonie in das umgebende Medium sekretiert wird. Wenn das
expressierte Protein in das Kulturmedium sekretiert wird, dann wird
der Expressionsvektor typischerweise eine geeignete Signalsequenz
enthalten, welche die Sekretion des Proteins in das Kulturmedium
richtet. Ein Fluoreszenz-Antikörper beispielsweise,
welcher spezifisch für
das Protein von Interesse ist, kann dann verwendet werden für die nachfolgende
Identifikation der Zellkolonien, welche das Protein von Interesse
expressieren.
- 2. Das Expressierungssystem, welches verwendet wird, um das
Protein von Interesse in Erscheinung treten zu lassen zu expressieren,
kann eines sein, in dem das Expressieren des Proteins von Interesse
an der Oberfläche
einer Zelle, wie z.B. der Zellmembran, erfolgt. Für den Durchschnittsfachmann
ist es verständlich,
das Vektoren – wie z.B.
Expressionsvektoren – Kodiersequenzen enthalten,
welche mit Signalsequenzen ausgestattet sind, welche die Sekretion
der kodierenden Sequenzen durch eine spezielle Zellmembran richten.
Ein Fluoreszenz-Antikörper
beispielsweise kann dann für
die nachfolgende Identifikation von Zellkolonien verwendet werden,
welche das Protein von Interesse expressieren.
- 3. Die Zellkolonie könnte
permeabel gemacht werden unter Verwendung einer Zellpermeabilisierungssubstanz
der Gestalt, dass beispielsweise ein fluoreszenter Antikörper in
die Zellenkolonie eintreten kann und sich mit dem Protein von Interesse
verbinden kann, während
die Lebensfähigkeit
der Zellkolonie dennoch erhalten bleibt.
- 4. Die Zellkolonie kann einen Expressionsvektor aufweisen, in
welchem ein Protein von Interesse mit einem Reporter oder einem „tag" – wie z.B. GFP verbunden wird.
Auf diese Weise, erfolgt eine Expression des Proteins von Interesse
auch bei der Expression des Reporters, der die Identifikation der
Zellenkolonie schafft. Die einzigartige Tag-Sequenz wird der Nukleotid-Sequenz zugefügt, welche
das Protein durch rekombinante DNA-Techniken kodiert, was ein Protein
schafft, das durch einen Antikörper
erkannt werden kann, welcher spezifisch für beispielsweise das Tag-Peptid
ist. Eine große
Vielfalt von Reportern kann in die Übereinstimmung der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, wobei bevorzugte Reporter zweckmäßigerweise
erkennbare Signale bereitstellen (z.B. durch Fluoreszenz). Beispielsweise
kann ein Reporter-Gen ein Enzym kodieren, welches eine Reaktion
katalysiert, welche die Lichtabsorptionseigenschaften verändert. Beispiele
von Reporter-Molekülen
schließen
ein, sind jedoch nicht auf β-Galactosidase, Invertase,
grünes
fluoreszentes Protein, Luziferase, Chloramphenicol, Acetyltransferase, β-Glucoronidase, Exo-Glucanase
und Glucoamylase. Beispielsweise können fluoreszent gekennzeichnete
Biomoleküle,
welche spezifisch mit speziellen chemischen Eigenschaften des Bindens
oder Andockens synthetisiert wurden, als fluo reszente Reportermoleküle verwendet
werden. Fluoreszenz gekennzeichnete Antikörper sind besonders nützliche Reportermoleküle infolge
ihres hohen Grades an Spezifizität
zum Anhaften an einem einzigen molekularen Ziel in einem Gemisch
von Molekülen als
Komplex als eine Zelle, Gewebe oder einem Extrakt von beiden.
-
Es
gibt eine große
Zahl von Wegen, um Fluoreszenz zu messen. Beispielsweise bewirken
einige fluoreszente Reportermoleküle eine Änderung in Anregungs- oder
Emissionsspektren, einige weisen eine Resonanzenergieübertragung
auf, bei welcher ein fluoreszenter Reporter Fluoreszenz verliert,
während
ein zweiter an Fluoreszenz gewinnt, einige bewirken eine Unterdrückung oder
ein Auftreten von Fluoreszenz, während
andere Rotationsbewegungen veranlassen. Eine multi-spektrale Bildgebung
kann ebenfalls verwendet werden.
-
Anwendungsbeispiele
-
Einige
spezifische Beispiele davon, wie die Vorrichtung gemäß der Erfindung
verwendet werden kann, werden nachfolgend angegeben.
-
Auswahl von Zellen für biopharmzeutische
Herstellung
-
Die
vorliegende Erfindung kann auch geeignet sein für ein automatisches Sortieren
von Zellkolonien, welche erhöhte
Niveaus eines Proteins von Interesse expressieren oder sekretieren.
Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das Protein von Interesse ein biopharmazeutisches Protein wie
z.B. ein Protein, das zweckmäßig bei
der Behandlung oder Diagnose von Krankheiten ist.
-
Derartige
Zellen können
gemäß einem
Beispiel entsprechend der Helligkeit der Fluoreszenz der Zellenkolonie
detektiert werden, welche mit der Menge von Protein korreliert,
welches expressiert wird. Die hellsten Zellkolonien können dann
zur weiteren Analyse/Verarbeitung aufgenommen werden.
-
Wie
zuvor beschrieben, könnte
die vorliegende Erfindung auch für
die Gewinnung von Zellkolonien verwendet werden, welche Membrane
und sekretierte Proteine produzieren.
-
Stammzellen
-
Differentiation
ist ein Prozess, wodurch Strukturen und Funktionen von Zellen progressiv
realisiert werden, um spezialisiertere Zellen zu erhalten. Deshalb,
wenn die Zellen mehr spezifiziert sind, werden sie mehr spezialisiert.
Bei der Mehrzahl der Säugetierzellarten
ist die Zelldifferentiation ein Einwegprozess, welcher ultimativ
zu schließlich
differenzierten Zellen führt.
Obwohl einige Zellarten während
des gesamten Lebens ohne Teilung und ohne, dass sie ersetzt werden,
fortbestehen, setzen jedoch viele Zellarten ein Teilen während der
Lebenszeit des Organismus fort und unterliegen einer Erneuerung. Dies
kann durch einfache Teilung, wie im Falle von Zellen – wie z.B.
blutbildenden Zellen und epidermischen Zellen – durch Teilung von relativ
undifferenzierten Stammzellen geschehen, welchem sich ein Programm
nachfolgender irreversibler Differenzierung von einer der Tochterzellen
anschließt.
-
Da
die vorliegende Erfindung besonders geeignet ist für die Identifikation
von Zellen auf der Basis von Unterschieden in der Zellgröße, der
Form und/oder der Replikationsrate, kann dies verwendet werden,
um eine oder mehrere Stammzellen zu identifizieren und/oder zu isolieren,
sobald sie in einen gegebenen Zelltyp differenziert worden sind.
-
RNAi
-
Post-transskriptionale
Genstilllegung (PTGS) bewirkt durch doppelsträngige RNA (dsRNA) ist ein konservierter
Zellenverteidigungsmechanismus zum Steuern der Expression von Fremdgenen. Man
nimmt an, dass die zufällige
Integration von Elementen, wie z.B. Transposonen oder Viren die
Expression der dsRNA bewirkt, was eine sequenz-spezifische Degradation
von homologen einsträngigen mRNA
oder viralen genomischen RNA bewirkt. Der Stilllegungseffekt ist
bekannt als RNA-Interferenz (RNAi). Der Mechanismus des RNAi schließt das Verarbeiten
von langen dsRNAs in Dopplungen von 21 bis 25 Nukleotiden (nt) RNAs.
Diese Produkte werden als kleininterferierende oder stilllegende RNAs
(siRNAs) genannt, welche die sequenz-spezifischen Mediatoren der
mRNA-Degradation sind.
-
In
differenzierten Säugetierzellen
sind dsRNA > 30bp
gefunden worden, um die Interferonantwort zu aktivieren, welche
zu einer Beendigung der Proteinsynthese und der nicht-spezifischen mRNA-Degradation
führt.
Diese Antwort kann jedoch unter Verwendung von 21 ntsiRNA-Dopplungen
umgangen werden, indem es erlaubt wird, dass eine Genfunktion in
kultivierten Säugetierzellen
analysiert wird.
-
In
Säugetieren
kann RNAi durch das Liefern von entweder kurzen dsRNA-Molekülen (siRNAs)
direkt in die Zelle oder durch Liefern von DNA-Konstrukten ausgelöst werden, welche die dsRNA
innerhalb der Zelle produzieren.
-
Der
Prozess und die Vorrichtung können
verwendet werden, um Zellen zu identifizieren und aufzunehmen, bei
einem geänderten
Phänotyp
zur weiteren Analyse, da die RNAi morphologische Veränderung
in den Zellen induzieren.
-
Zelltransformationsuntersuchungen
-
Unterschiede
zwischen transformierten und nicht-transformierten Zellen können auch
gemäß der vorliegenden
Erfindung detektiert werden.
-
Derartige
Untersuchungen können
verwendet werden, um beispielsweise die Transformationsfähigkeiten
von Viren oder Chemikalien zu untersuchen.
-
Derartige
Untersuchungen stellen ein Verfahren zum Untersuchen von Änderungen
dar, welche in Übereinstimmung
sind mit Tumorigenese ohne die Kenntnis der genetischen Natur der
Beschädigung,
welche die Änderung
veranlasst hat. Nach einem Ausplatieren bei niedriger Dichte, können transformierte
Zellen, welche einen geänderten
Phänotyp haben,
unter Verwendung morphologischer Kriterien identifiziert werden,
wobei die Zellen in einem automatisierten Prozess unter Verwendung
der Bildgebungsfähigkeit
der Vorrichtung gemäß der Erfindung identifizierbar
sind.
-
Zelltransformationsuntersuchungen
testen deshalb nach genetischer Veränderung, welche an einem veränderten
Phänotyp
aufgetreten sind, welche leicht durch das morphologische Erscheinungsbild
der transformierten Zellen identifiziert werden.
-
Gewinnung von Viren
-
Das
Vorhandensein eines Virus gibt oft Anlass für morphologische Veränderungen
in einer Wirt-Zelle. Jegliche detektierbare Veränderungen in der Wirt-Zelle in Folge einer
Infektion sind bekannt als ein zytopatischer Effekt. Zytopatische
Effekte können
bestehen in Form von Zellabrundung, Fehlorientierung, Anschwellen
oder Schrumpfen, Tod, Lösen
von der Oberfläche
etc.
-
Die
zytopatischen Effekte, welche durch verschiedene Viren erzeugt worden
sind, hängen
vom Virus und den Zellen ab, an welchen er gewachsen ist. Das kann
in den klinischen Virologie-Laboratorien verwendet werden, um eine
Identifizierung eines isolierten Virus zu unterstützen.
-
Derartige
zytopatische Effekte können
die Morphologie der Zelle ändern,
welche unter Verwendung des automatisierten Prozesses, welcher hier beschrieben
ist, detektiert werden können.
-
Transfektion von Genen
-
Im
Allgemeinen benötigt
das Einfügen
eines Gens in eine Zelle einen dominanten selektiven Marker, wie
z.B. Neomyzin-Resistenz. Die hohe Wirksamkeit eines automatisierten
Systems, welches hier beschrieben ist, kann einen derartigen Marker überflüssig machen,
da Zellen in begrenzten Lösungen ausplatiert
und Kolonien zur weiteren Analyse aufgenommen werden könnten.
-
Immortalisierung von Zellen
-
Die
Transformation mit Chemikalien oder Viren kann einen immortalen
Phänotyp
induzieren. Die Vorrichtung und das Verfahren, welche hier beschrieben
sind, erlauben es, dass derartige Zellen zu selektieren.
-
Selektion von Zellklonen, welche post-translationale modifizierte
Proteine erzeugen
-
Therapeutische
Proteine wie z.B. ein Erythro-Protein oder Gewebeplasminogen-Aktivator
verdanken ihre Serum-Halbwertzeit Zuckerrückständen am Protein. Klonen von
Zellen welche eine gewünschte
Modifikation erzeugen, können
mit kennzeichnenden Lektin detektiert und dann aufgenommen werden.
-
IN BEZUGGENOMMENE DOKUMENTE
-
- [1] US 6,198,107 :
Clare Chemical Research, Inc
- [2] JP 07-260742 :
Sanyo Electric Co Ltd
- [3] WO 98/23950 :
Oxford Glycoscience (UK) Ltd.
- [4] US 5,587,062 :
Shimadzu Corporation
- [5] WO 99/051977 :
Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung
der Wissenschaften
- [6] US 5,534,386 :
Physical Optics Corporation
- [7] WO 92/12233 :
Medical Research Council
- [8] Uber et al: Bio Techniques, vol. 11, no 4 (1991), pages
642-647
- [9] Jones et al: Nucleic Acids Research, vol. 20, no. 17 (1992),
Pages 4599-4606