DE602004011244T2 - Verwendung von flüssigkristallen zum nachweis von affinitätsmikrokontakt-gedruckten biomolekülen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit biologischer Substanzen und chemischer Verbindungen in Proben stellen ein Teilgebiet kontinuierlicher Weiterentwicklungen auf dem Gebiet der analytischen Chemie und der Biochemie dar. Es sind verschiedene Verfahren entwickelt worden, die den Nachweis verschiedener Zielspezies in Proben ermöglichen, die zum Beispiel aus der Umwelt oder aus einem lebenden Organismus entnommen worden sind. Ein Nachweis von Zielspezies ist häufig in klinischen Situationen notwendig, bevor eine Krankheit diagnostiziert werden kann und eine verschriebene Behandlungsmethode angewandt werden kann.
  • Es gibt derzeit mehrere Assaymethoden zum Nachweis der Anwesenheit von Zielspezies in Proben. Eine herkömmliche Assaymethode ist der Radioimmunassay (RIA). Der RIA ist ein hochempfindliches Verfahren, mit dem man sehr geringe Konzentrationen von Antigen oder Antikörper in einer Probe nachweisen kann. Ein RIA beinhaltet die kompetitive Bindung von radioaktiv markiertem Antigen und nicht markiertem Antigen an einen Antikörper mit hoher Affinität. Üblicherweise wird das markierte Antigen mit dem Antikörper in einer Konzentration gemischt, welche die Antigen-Bindungsstellen des Antikörpermoleküls gerade sättigt. Dann werden steigende Mengen von nicht markiertem Antigen einer unbekannten Konzentration hinzugegeben. Da der Antikörper nicht zwischen dem markierten und dem nicht markierten Antigen unterscheidet, konkurrieren die zwei Antigenarten um die verfügbaren Bindungsstellen auf dem Antikörper. Durch Messen der Menge des markierten Antigens, das frei in Lösung ist, ist es möglich, die Konzentration des nicht markierten Antigens zu bestimmen. Kuby, J., Immunology, W. H. Freeman and Company, New York, NY (1991), S. 147–150.
  • Eine andere Assaymethode, die in zunehmendem Maß für den Nachweis der Anwesenheit von pathogenen Organismen Verbreitung gefunden hat, ist der enzymverbundene Immunadsorptionsassay oder ELISA. Diese Assaymethode ermöglicht es, pathogene Organismen nachzuweisen, indem man biologische Spezies verwendet, die in der Lage sind, Epitope zu erkennen, die mit Proteinen, Viren und Bakterien assoziiert sind. Im Allgemeinen reagiert in einem ELISA-Assay ein Enzym, das mit einem Antikörper konjugiert ist, mit einem farblosen Substrat, um ein farbiges Reaktionsprodukt zu erzeugen, wenn eine Zielspezies in der Probe vorliegt. Kuby, J., Immunology, W. H. Freeman and Company, New York, New York (1991), S. 147–150. Man hat in verschiedenen solchen Assays physikalisch adsorbiertes Rinderserumalbumin als eine blockierende Schicht eingesetzt, weil man festgestellt hat, dass es die nicht-spezifische Adsorption von biologischen Spezies verhindert, welche die Ergebnisse des Assays stören oder verfälschen könnten.
  • Obwohl der ELISA und andere Immunadsorptionsassays einfache und weit verbreitete Verfahren sind, weisen sie mehrere Nachteile auf. Tizard, I. R., Veterinary Immunology: An Introduction, W. B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania (1996); Harlow, Hrsg.; Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, New York (1988); van Oss, C. J., van Regenmortel, M. H. V. Immunochemistry, Dekker, New York, New York (1994). Markierte Antikörper können teuer sein, besonders für Assays, die radioaktive Markierungen erfordern. Darüber hinaus erfordern radioaktive Markierungen eine besondere Handhabung, da radioaktive Materialien auch gefährlich sind. Die Markierung einer Verbindung, welche den größten Nachteil dieser Verfahren darstellt, kann die Bindungsaffinität des Antikörpers an den Analyten verändern. Enzyme sind große Moleküle, welche die Aktivität des Antikörpers sterisch behindern können, oder diese können nach der Konjugation an Antikörper enzymatische Aktivität verlieren. Ein anderer Bedenkpunkt bei Immunadsorptionsassays ist die nicht-spezifische Bindung von Proteinen an das Trägermaterial, das Antigen und an Antikörper-Komplexe. Dies kann zu einem Anstieg des Hintergrundrauschens, zu einem Verlust an Sensitivität und möglicherweise zu einem falsch-positiven Testergebnis führen. Darüber hinaus kann die Immobilisierung von Proteinen an das Trägermaterial die Konformation der Bindungsstellen beeinflussen, was zu einer Verringerung der Sensitivität führt sowie zu einem möglichen Anstieg der nicht-spezifischen Bindung. So tritt beispielsweise auf Grund der hydrophoben Interaktionen zwischen dem Protein und dem Trägermaterial eine physikalische Adsorption von Proteinen an Polystyrol-Vertiefungen auf. Diese Interaktionen können auch die Auffaltung der Aminosäureketten begünstigen, so dass die Polystyrol-Oberfläche bedeckt wird. Dies kann zu einer möglichen Inaktivierung der Bindungsstellen führen.
  • Man kann auch qualitative diagnostische Assays zum Nachweis von Proteinen und Viren einsetzen, die auf der Aggregation von Protein-beschichteten Kügelchen basieren. Tizard, I. R., Veterinary Immunology: An Introduction, W. B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania (1996); Cocchi, J. M., Trabaud, M. A., Grange, J., Serres, P. F., Desgranges, C. J. Immunological Meth., 160, (1993), S. 1; Starkey, C. A., Yen-Lieberman, B., Proffitt, M. R., J. Clin. Microbiol., 28, (1990), S. 819; van Oss, C. J., van Regenmortel, M. H. V. Immunochemistry, Dekker, New York, New York (1994). Für den direkten Nachweis von Antikörpern wird Antigen nicht-spezifisch an die Oberfläche von Latex-Kügelchen adsorbiert, die einen Durchmesser von mehreren Mikrometern aufweisen. Die Protein-beschichteten Kügelchen besitzen eine schwache Ladung, welche die Aggregation verhindert. Das Zusetzen eines Antikörpers, der für das adsorbierte Protein spezifisch ist, kann die Kügelchen vernetzen, was zu Agglutination führt. Die Agglutination kann durch Sichtkontrolle nachgewiesen werden oder durch andere Verfahren wie z. B. der quasi-elastischen Lichtstreuung. Visuelle Agglutinations-Assays sind jedoch nicht sensitiv, und die Messung durch quasi-elastische Lichtstreuung erfordert ein kompliziertes Gerät und ist nicht zur Verwendung an Orten geeignet, die weit ab von einem Zentrallabor liegen. Darüber hinaus ist es auf Grund der Vorgehensweise mit Bulklösungen dieses Assaytyps nicht möglich, Hochmultiplex-Agglutinations-Assays mit Mikroarrays durchzuführen.
  • Um die Erfordernis für markierte Proteine zu umgehen, hat man Prinzipien untersucht, die auf dem direkten Nachweis der Bindung von Proteinen und Liganden basieren. Schmitt, F.–J., Haussling, L., Ringsdorf, H., Knoll, W. Thin Solid Films, 210/211, (1992), S. 815; Haussling, L., Ringsdorf, H., Langmuir 7, (1991), S. 1837. Oberflächen-Plasmon-Reflektometrie (SPR) ist ein solches Verfahren. SPR ist sensitiv gegenüber Veränderungen des Refraktionsindex einer Flüssigkeit in der Nähe einer dünnen Metalloberfläche, die durch evaneszente elektromagnetische Wellen angeregt worden ist. Die Bindung von Proteinen an Liganden kann dadurch nachgewiesen werden, dass man einen Anstieg in dem Resonanzwinkel oder der Signalintensität untersucht. Die typische Winkelauflösung bei der Verwendung dieses Verfahrens ist 0,005°, was mit SPR einen Nachweis von Veränderungen an der Dicke des adsorbierten Films im Sub-Angström-Bereich erlaubt. Man muss jedoch darauf achten, dass sichergestellt ist, dass die Veränderung im Resonanzwinkel auf die Bindung zurückzuführen ist und nicht auf eine Veränderung des Refraktionsindex der Bulklösung. Auf Grund der Abhängigkeit des Resonanzwinkels vom Refraktionsindex der Flüssigkeit ist eine thermisch stabile Umgebung erforderlich. Ein Temperaturanstieg von 25°C auf 26°C in Wasser macht eine Veränderung im Refraktionsindex um 0,0001 aus. Dieser Anstieg würde zu einer Veränderung des Resonanzwinkels von ungefähr 0,015° oder von etwa 0,2 nm in der beobachteten Höhe einer Proteinschicht führen. Dieses Erfordernis der Temperaturstabilität macht SPR ungeeignet für die meisten Freilandanwendungen. Darüber hinaus kann die nicht-spezifische Adsorption von Molekülen an der oder in der Nähe der Sensoroberflache zu falschen Signalveränderungen führen, was eine Oberfläche erfordert, die nicht-spezifische Interaktionen minimiert. Daher ist die Oberflächen-Plasmon-Reflektivität komplexer als ein ELISA und erfordert Geräte, die in einem Labor stehen, sowie die Herstellung einer gut definierten Oberfläche.
  • Man hat über die Verwendung von Ionenkanal-Schaltern zum Nachweis von biospezifischen Interaktionen berichtet. Cornell, B. A., Braach-Maksvytis, V. L. B., King, L. G.; Osman, P. D. J., Raguse, B., Wieczorek, L., Pace, R. J. Nature, 387, (1997), S. 580. In einer Vorrichtung, in der Ionenkanal-Schalter verwendet werden, wird eine fixierte Lipidmembran, in die bewegliche Ionenkanäle eingebettet sind, durch ein Ionenreservoir von einer Goldelektroden-Oberfläche getrennt. Die Goldoberfläche dient als ein Anker für die Membran und fungiert als eine Elektrode. Innerhalb der Membran gibt es obere und untere Ionenkanäle. Um leitend zu werden, müssen sich die äußeren und inneren Ionenkanäle ausrichten und ein Dimer bilden. Membranüberspannende Lipide, die dazu beitragen, die Lipidmembran zu stabilisieren, sind an einem Ende an der Elektrodenoberfläche befestigt und schließen mit Liganden ab, die sich von der Membran weg erstrecken. Die Ionenkanäle der äußeren Schicht besitzen Liganden. In ungebundenem Zustand bewegen sich die äußeren Ionenkanäle frei, wobei sie gelegentlich Dimere mit den inneren Kanälen bilden, was eine Leitung ermöglicht. Die Bindung eines bivalenten Moleküls an sowohl den Ionenkanal als auch das Membran-überspannende Lipid schränkt die Mobilität des äußeren Ionenkanals ein, was zu einer messbaren Verringerung der Konduktivität führt. Wenn jedoch eine große Proteinmenge an die äußere Schicht adsorbiert, würde die Mobilität des Ionenkanals vermutlich eingeschränkt und man könnte eine falsche Verringerung der Leitfähigkeit auf Grund nicht-spezifischer Interaktionen beobachten. Außerdem erfordert dieses Verfahren empfindliche Vorrichtungen zum Nachweis der Veränderung der Leitfähigkeit. Die Prozedur für die Herstellung der Membranen dauert mehrere Stunden und die Stabilität der Membran ist begrenzt (sie muss in Lösung eingetaucht werden). Was noch wichtiger ist, es müssen spezifische Antikörper an den Membranen/den Kanälen befestigt werden, was eine unterschiedliche Proteinchemie für jeden nachzuweisenden Analyten erfordert.
  • Man hat von einem auf einem porösen Siliziumträger basierenden Verfahren berichtet, das einen optischen Nachweis der Bindung spezifischer Proteine an Liganden erlaubt. Lin, V., Motesharei, K., Dancil, K. S., Sailor, M. J., Ghadiri, M. R. Science 278 (1997), S. 840; Dancil, K. S., Greiner, D. P., Sailor, M. J. J. Am. Chem. Soc. 121 (1999), S. 7925. Die porösen Flächen sind üblicherweise 1 bis 5 m dick und haben eine Fläche von einigen Quadratmikrometern bis -millimetern. Typische Bindungszeiten liegen in der Größenordnung von 30 Minuten, gefolgt von Spülen der Oberfläche. Anfängliche Arbeiten auf diesem Gebiet berichteten fälschlicherweise über den Nachweis extrem geringer Konzentrationen von Analyten. Anfänglich stellte man fest, dass die Bindung von Streptavidin an biotinylierte Oberflächen den Refraktionsindex des porösen Trägermaterials verringert, dies führte man später jedoch richtigerweise auf eine Oxidation der Oberfläche zurück. Darüber hinaus beobachtete man Berichten zufolge eine Veränderung der effektiven optischen Dicke des Films nach Zusetzen von Streptavidin; diese Autoren konnten jedoch nicht zwischen spezifischen Interaktionen und nicht-spezifischer Adsorption unterscheiden. Dieses Verfahren erfordert keine markierten Moleküle, die poröse Siliziumoberfläche ist jedoch anfällig gegenüber Oxidation und nicht-spezifischer Adsorption.
  • Die Verwendung von polymerisierten Mehrschichten-Anordnungen zum Nachweis von Rezeptor-Liganden-Interaktionen ist ebenfalls berichtet worden. Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Science 261, (1993), S. 585; Pan, J. J., Charych, D. Langmuir 13, (1997), S. 1365. Mehrschichtige Filme aus Polydiacetylen, bei denen die Abscheidung mit Hilfe der Langmuir-Blodgett-Methode durchgeführt worden sind, verändern auf Grund einer Konformationsänderung im Polymergerüst ihre Farbe von Blau nach Rot. Veränderungen in der Temperatur oder im pH-Wert können zum Beispiel eine Farbverschiebung verursachen. Diese Reaktion lässt sich kontrollieren und kann zum Nachweis von Proteinen verwendet werden, indem man Liganden an der Mehrfachschicht befestigt. Auf die Bindung eines multivalenten Makromoleküls an Liganden hin wird eine Spannung in die Mehrschichten-Anordnung eingeführt. In dem System ist eine Farbveränderung zu sehen, falls genügend Protein gebunden ist, wobei die Bindungszeiten typischerweise in der Größenordnung von 30 Minuten liegen. Dieses System erlaubt den direkten Nachweis von Rezeptor-Liganden-Interaktionen und überführt die Ereignisse in ein optisches Signal, das leicht gemessen und quantifiziert werden kann. Das optische Signal kann per Augenschein interpretiert werden oder für quantitative Schlussfolgerungen mit einem Spektrophotometer analysiert werden. Die Verwendung von polymerisierten Mehrschichten-Anordnungen zum Nachweis von Influenzavirus ist gezeigt worden. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens besteht jedoch darin, dass es einen multivalenten Analyten benötigt. Es müssen mehrere Liganden, die mit der polymerisierten Mehrfachschicht verbunden sind, an dasselbe Makromolekül angehängt werden. Dies verhindert die Verwendung dieses Verfahrens für monovalente Moleküle (sogar auf Kügelchen basierende Verfahren können kompetitiv durchgeführt werden und benötigen keine multivalenten Moleküle). Die Bindung bivalenter Moleküle wie z. B. von IgGs ist nicht gezeigt worden. Darüber hinaus ist die Langmuir-Blodgett-Abscheidung ein Prozess, der sich schwer vom Labormaßstab in einen kommerziellen Maßstab übertragen lässt. Als einem alternativen Verfahren zur Langmuir-Blodgett-Abscheidung sind diese Prinzipien auch mit Vesikeln gezeigt worden. Auf Vesikeln basierende Forschung hat jedoch gezeigt, dass Nützlichkeit des Systems begrenzt ist, da es bei Konzentrationen unter 0,1 mg/ml gegenüber dem Analyten unempfindlich ist.
  • Kürzlich sind Assay-Vorrichtungen offenbart worden, bei denen Flüssigkristalle eingesetzt werden. Zum Beispiel hat man kürzlich über eine Flüssigkristall-Assay-Vorrichtung berichtet, bei der gemischte selbstangeordnete Einzelschichten (SAMS) verwendet werden, die Octanthiol und Biotin enthalten, die auf einem anisotropen Goldfilm gelagert sind, der schief auf Glas aufgetragen worden ist. Gupta, V. K., Skaife, J. J., Dubrovsky, T. B., Abbott, N. L. Science 279, 27. März 1998, S. 2077–2079. Darüber hinaus offenbart die PCT-Veröffentlichung WO 99/63329 , die am 9. Dezember 1999 veröffentlicht worden ist, Assay-Vorrichtungen, bei denen SAMs verwendet werden, die an ein Substrat und an eine Flüssigkristall-Schicht gebunden sind, die mit Hilfe der SAM verankert ist. Obwohl die offenbarten Flüssigkristallbasierten Assay-Vorrichtungen, bei denen anisotrope Goldfilme verwendet werden, für die Verwendung geeignet sind, um zu bestimmen, ob ein Zielprotein in einer Probe vorhanden ist, ist die Herstellung des anisotropen Goldfilms durch schiefe Auftragung schwierig. Zum Beispiel erfordert die Herstellung des schief aufgetragenen Goldfilms komplizierte Reinigungsschritte und eine Hochvakuumabscheidung. Ferner wird bei solchen Assay-Vorrichtungen dieselbe Oberfläche für sowohl den Einfang als auch den Nachweis des Ziels verwendet. Da eine einzige Oberfläche für sowohl den Einfang als auch den Nachweis benutzt wird, lässt sich die Oberfläche nicht optimieren, um beide Funktionen zu erfüllen.
  • Frühere Studien haben gezeigt, dass Mikrokontakt-Drucken ein weit verwendbares Verfahren ist, um Oberflächen mit organisierten Einzelschichten von Alkanthiolen zu strukturieren („pattern"). Mikrokontakt-Drucken und andere eng verwandte „weiche lithographische" Verfahren3 sind auf die Strukturierung von Kolloiden, Metallkomplexen, Polymeren, Proteinen und Metallionen ausgedehnt worden. In seiner einfachsten Form umfasst Mikrokontakt-Drucken das „Einfärben” der Oberfläche aus Polydimethylsiloxan (PDMS) mit einer Lösung der zu strukturierenden Spezies und einen conformen Kontakt des eingefärbten PDMS mit einer zweiten Oberfläche. Eine geeignete Abstimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Oberfläche des PDMS-Stempels und der zweiten Oberfläche führt zur Übertragung der eingefärbten Spezies von dem PDMS auf die zweite Oberfläche.
  • So werden Proteine, die auf der Oberfläche eines PDMS-Stempels adsorbiert sind, beispielsweise auf eine zweite Oberfläche übertragen, wenn die zweite Oberfläche eine Oberflächenenergie aufweist, die höher ist als die von PDMS. Dieses Verfahren ermöglicht die Strukturierung von Proteinen auf Oberflächen und ist ausgenutzt worden, um Oberflächen für biomolekulare Assays und für strukturierte Zellkultur herzustellen.
  • Obwohl viele der vorstehend beschriebenen, konventionellen Assay-Methoden sehr gut funktionieren, um die Anwesenheit von Zielspezies nachzuweisen, sind viele herkömmliche Assay-Methoden teuer und erfordern oft Instrumente und gut trainierte Anwender, was es schwierig macht, diese routinemäßig im Freiland einzusetzen. Es besteht somit ein Bedarf an Assay-Vorrichtungen und Systemen, die einfacher zu verwenden sind und die eine Untersuchung von Proben an abgelegenen Orten ermöglichen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden bereit, umfassend (a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Liganden hat oder von der vermutet wird, dass sie einen Liganden hat, mit einem Affinitätssubstrat (Einfärben), wobei das Affinitätssubstrat einen Rezeptor umfasst, der fähig ist, spezifisch an den Liganden zu binden; (b) Inkontaktbringen des Affinitätssubstrats mit einer Nachweisoberfläche (Stempeln), wobei mindestens ein Teil des Liganden, der an den Rezeptor gebunden ist, auf die Nachweisoberfläche transferiert wird; und (c) Nachweisen der Anwesenheit des Liganden auf der Nachweisoberfläche, wobei die Nachweisoberfläche ferner einen Flüssigkristall umfasst. Dieses Verfahren umfasst ferner Schritt (d) zum Waschen des Affinitätssubstrats nach Schritt (a); Schritt (e) zum Waschen des Nachweissubstrats nach Schritt (b) oder sowohl Schritt (d) als auch (e).
  • In diesem Verfahren kann der Rezeptor oder Ligand ein Biomolekül, ein Biomolekül-erkennendes Agens, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein, ein Kohlenhydrat, ein Toxin, ein Metall, ein Schwermetall, einen Chelator, ein Pathogen, ein Virus, ein Bakterium, ein Säugerzelle oder einen Teil einer Säugerzelle, eine Nucleinsäure, ein Nucleinsäure-Analog oder -Imitat, einen Zucker, Antikörper oder funktionelle Fragmente davon, ein organisches Molekül, ein Lipid, ein Phospholipid, einen Arzneistoff, ein chemisches Agens, ein Pestizid, ein Herbizid oder ein Fragment davon umfassen.
  • In den beschriebenen Verfahren umfasst das Affinitätssubstrat ein Polymer, ein Silicamaterial, ein Metall oder ein Metalloxid. Bevorzugt umfasst das Affinitätssubstrat Polydimethylsiloxan (PDMS). In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der PDMS-Stempel ferner mit einem Peptid ab. Der mit einem Peptid abschließende PDMS-Stempel ist fähig, ein phosphoryliertes Peptid nachzuweisen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform schließt der PDMS-Stempel ferner mit einem Antikörper ab. Der mit einem Antikörper abschließende PDMS-Stempel ist fähig, ein Protein nachzuweisen.
  • In dem Verfahren ist der Rezeptor über eine oder mehrere verbindende Einheiten an das Affinitätssubstrat gebunden. Ferner stellt das Verfahren auch eine Quantifizierung der in der Probe vorhandenen Menge an Ligand bereit.
  • In einer anderen Ausführungsform stellt das Verfahren ein Affinitätssubstrat bereit, das einen Array von Rezeptoren umfasst, die an verschiedenen Plätzen lokalisiert sind. Im Allgemeinen haben die Rezeptoren in dem Array Spezifitäten für mehr als einen Liganden, so dass der Flüssigkristall fähig ist, die Anwesenheit von mehr als einem Liganden nachzuweisen. Bevorzugt sind die Rezeptoren in dem Array fähig, die Anwesenheit von Proteinphosphorylierung an verschiedenen Resten des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) nachzuweisen.
  • Ferner umfasst die Nachweisoberfläche in dem Verfahren eine selbstangeordnete Einzelschicht. Bevorzugt umfasst die selbst-angeordnete Einzelschicht ein Amin, Alkanthiol intradermal eine organische Schwefelverbindung. Die selbstangeordnete Einzelschicht wird auch bevorzugt vor dem Schritt (b) mit einer Säure vorbehandelt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Inkontaktbringen des Affinitätssubstrats mit einer Nachweisoberfläche auf mindestens einem teilweise gekrümmten Affinitätssubstrat durchgeführt. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform verursacht die Nachweisoberfläche in Abwesenheit eines eingefangenen Liganden ein homöotropes Verankern.
  • In dem vorliegenden Verfahren umfasst der Flüssigkristall einen nematischen Flüssigkristall, einen smektischen Flüssigkristall, einen polymeren Flüssigkristall, einen lyotropen Flüssigkristall, einen chromonischen Flüssigkristall, verhinderte (frustrierte) Flüssigkristalle, einen thermotropen Flüssigkristall, einen säulenartigen Flüssigkristall, einen nematischen diskotischen Flüssigkristall, einen kalamitischen nematischen Flüssigkristall, einen ferroelektrischen Flüssigkristall, einen diskoidalen Flüssigkristall oder einen cholesterischen Flüssigkristall. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Flüssigkristall durch Belichtung mit UV-Licht vorbehandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Flüssigkristall 4-Cyano-4'-pentylbiphenyl (5CB) oder ein dotiertes Salz davon. Ferner kann die Ausrichtung des Flüssigkristalls optisch oder elektrisch nachgewiesen werden.
  • Es wird eine Nachweisoberfläche bereitgestellt, die einen Träger, eine erste Schicht auf dem Träger und eine selbst-angeordnete Einzelschicht auf der ersten Schicht umfasst. Im Allgemeinen umfasst die selbst-angeordnete Einzelschicht ein Amin, Alkanthiol oder eine organische Schwefelverbindung. Ferner umfasst die erste Schicht eine Metallschicht, eine Polymerschicht oder eine Silanschicht. Bevorzugt umfasst die Metallschicht Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Chrom oder Titan oder Oxide davon. Die Nachweisoberfläche enthält auch einen Flüssigkristall. Der Flüssigkristall kann thermisch an das Nachweissubstrat angelagert sein.
  • In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Kit zum Nachweisen eines Liganden bereitgestellt, umfassend: (a) ein Affinitätssubstrat; (b) ein Nachweissubstrat, das von dem Affinitätssubstrat getrennt ist; und (c) einen Flüssigkristall. Der Kit umfasst ferner einen oder mehrere Rezeptoren, die spezifisch für einen Liganden sind. Der Kit umfasst auch eine chemische Verbindung, die fähig ist, die Nachweisoberfläche chemisch zu modifizieren. Bevorzugt umfasst die chemische Modifikation ein Amin. In dem Kit umfasst das Affinitätssubstrat einen oder mehrere Liganden.
  • Andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der ausführlichen Beschreibung, den Zeichnungen und den die Beschreibung begleitenden Ansprüchen hervor.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Die 1.1 und 1.2 zeigen die experimentellen Schritte für den Nachweis der Affinitätsmikrokontakt-gedruckten Proteine mit Flüssigkristallen. Der biotinylierte BSA-Affinitätsstempel wird in einer Lösung von Anti-Biotin-IgG eingefärbt. Der eingefärbte Stempel wird auf eine SAM auf schief aufgetragenem Gold Affinitätsmikrokontakt-gedruckt. Unterschiede in der Ausrichtung des Flüssigkristalls zeigen die Anwesenheit von gestempeltem Protein an.
  • 2. Optische Aufnahmen von 5CB, das zwischen eine mit Amin abschließende SAM und OTS-behandelten Glasobjektträgern angeordnet ist. A) mit einem Amin abschließende SAM, 1 Stunde in einem 36°C-Ofen. B) mit einem Amin abschließende SAM, 18 Stunden bei 36°C. C) mit einem Amin abschließende SAM, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden ist, 1 Stunde bei 36°C. D) mit einem Amin abschließende SAM, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden ist, 18 Stunden bei 36°C.
  • 3.1. Zeitverlauf von Flüssigkristall-Aufnahmen von Anti-Biotin-IgG, das auf eine mit einem Amin abschließende SAM gestempelt worden ist, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden ist. Zwischen den Aufnahmen wurde die Probe bei 36°C erhitzt.
  • 3.2. Die Wirkung von Zeit/Erhitzen auf die Gleichmäßigkeit der Ausrichtung des Flüssigkristalls. A) Optische Aufnahme 1 Stunde nach Herstellen der Flüssigkristall-Zelle. B) Optische Aufnahme derselben Flüssigkristall-Zelle nach Erhitzen der Probe für 10 Stunden bei 37°C.
  • 4. Optische Aufnahmen der Reaktion von Flüssigkristallen auf Affinitätsmikrokontakt-gedruckte IgGs mit biotinylierten BSA-Affinitätsstempeln. Der Affinitätsstempel ist ein Array von 300 μm2 großen Stiften. A) Anti-Biotin-IgG, 1 Stunde kalt. B) Probe von A, für 8 Stunden bei 36°C erhitzt. In den Bereichen ohne gestempeltes Protein wechselt der Flüssigkristall von einer planaren zu einer homöotropen Ausrichtung. C) Anti-Ziege-IgG (Kontrolle), 1 Stunde kalt. D) Probe von C, für 8 Stunden bei 36°C erhitzt. Der Flüssigkristall wechselt von einer planaren zu einer homöotropen Ausrichtung.
  • 4.1. Optische Aufnahmen der Flüssigkristall-Reaktion auf Mikrokontaktgedrucktes Anti-Biotin-IgG. A) Mikrokontakt-Drucken auf mit Amin abschließende SAM auf Gold, das bei 0° abgeschieden wurde (isotrop). B) Mikrokontakt-Drucken auf Glas, das mit Aminopropyltriethoxysilan funktionalisiert worden ist.
  • 4.2. Diese Figur zeigt die Flüssigkristall-Aufnahmen, wenn Anti-Biotin-IgG und Anti-Ziege-IgG (Kontrolle) auf einen biotinylierten BSA-Affinitätsstempel geladen werden. In der 4.2A zeigt der Flüssigkristall die Bindung von Anti-Biotin-IgG an den biotinylierten BSA-Affinitätsstempel und den anschließenden Transfer von Protein auf das Amin-SAM-Substrat. Indem man 4.2A mit dem Kontrollexperiment vergleicht, das in 4.2B gezeigt ist, kann man daraus schließen, dass der Affinitätsstempel das Anti-Biotin-IgG spezifisch einfängt und auf die Oberfläche transferiert, was mit Hilfe von Flüssigkristallen nachgewiesen werden kann.
  • 5. Vergleich der Flüssigkristall-Reaktion auf Affinitätsmikrokontaktgedruckte und Mikrokontakt-gedruckte IgGs. A) Affinitätsmikrokontakt-Drucken von Anti-Biotin-IgG. B) Mikrokontakt-Drucken von Anti-Biotin-IgG.
  • 5.2. Vergleich der Gleichmäßigkeit der Flüssigkristalle in den gestempelten Bereichen für Affinitätskontakt-Drucken und Mikrokontakt-Drucken von IgGs. A) Affinitätskontakt-Drucken von Anti-Biotin-IgG. B) Mikrokontakt-Drucken von Anti-Streptavidin-IgG.
  • 6.1. Optische Aufnahmen, die man erhält, wenn man einen biotinylierten BSA-Affinitätsstempel wieder verwendet, um Anti-Biotin-IgG zu drucken. A) Erste Verwendung des Stempels. B) Zweite Verwendung des Stempels. C) Dritte Verwendung des Stempels.
  • 6.2. Direkt-Vergleich der in 6.1 diskutierten optischen Aufnahmen.
  • 7: A) Die optischen Aufnahmen des Affinitätskontakt-gedruckten Anti-Biotin-IgG nach der 3. Verwendung des Stempels. Diese Aufnahmen wurden 1 Stunde nach der Herstellung der Flüssigkristall-Zelle gemacht. B) Diese optischen Aufnahmen wurden von derselben Probe nach Erhitzen der Flüssigkristall-Zelle für 32 Stunden bei 37°C gemacht. Die Bereiche auf der Amin-SAM, die mit 0,1 M HCl ohne Protein behandelt worden waren, sind nun homöotrop.
  • 8: Optische Aufnahmen (gekreuzte Polarisatoren) von 5CB in Kontakt mit mit Amin abschließenden SAMs, auf die Anti-Biotin-IgG auf Flächen, die eine Größe von 300 μm × 300 μm aufwiesen, Affinitätsmikrokontakt-gedruckt (A) und Mikrokontakt-gedruckt (B) wurde. Die Helligkeit innerhalb und außerhalb der quadratischen Strukturen, gemessen als eine Funktion der Ausrichtung der Probe auf dem Mikroskop-Objekttisch, ist für Affinitätsmikrokontakt-Drucken (C) und Mikrokontakt-Drucken (D) graphisch dargestellt.
  • 9: Schematische Darstellung des Mikrokontakt-Druckens von Proteinen mit einem PDMS-Stempel, der auf einem zylindrischen Träger montiert ist. (R1 = 14 mm, t1 = 4 mm).
  • 10: Optische Aufnahmen (gekreuzte Polarisatoren) von 5CB in Kontakt mit mit Amin abschließenden SAMs, auf die IgGs Mikrokontakt-gedruckt worden waren, wobei man einen PDMS-Stempel verwendet hatte, der auf einem zylindrischen Träger montiert war. A) 0° Probenausrichtung. B) 45° Probenausrichtung. C) Graph der Leuchtdichte von Flüssigkristall in Bereichen der Oberfläche, die Mikrokontakt-gedrucktes IgG präsentierten, und Bereichen der Oberfläche, die frei von gedrucktem IgG waren.
  • 11: Optische Aufnahmen (gekreuzte Polarisatoren) von 5CB in Kontakt mit mit Amin abschließenden SAMs, auf die IgGs Mikrokontakt-gedruckt worden waren, wobei man einen PDMS-Stempel verwendet hatte, der auf einem zylindrischen Träger montiert war. Die mit Amin abschließende SAM wurde auf einem Goldfilm gelagert, der mit normalem Einfall aufgetragen worden war. A) 0° Probenausrichtung. B) Graph der Leuchtdichte von Flüssigkristall in Bereichen der Oberfläche, die Mikrokontakt-gedrucktes IgG präsentierten, und Bereichen der Oberfläche, die frei von gedrucktem IgG waren.
  • 12A–C: Schematische Darstellungen der Reaktionsabläufe für eine kovalente Immobilisierung von Biomolekülen auf einen PDMS-Stempel.
  • 13: Aufnahmen und schematische Darstellungen von nematischem 5CB, das von einer mit Amin abschließenden SAM getragen wird, die gedruckten EGFR (epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor) präsentiert, der aus Zellmembran-Extrakten Affinitäts-eingefangen worden ist, die entweder EGFR enthielten (B82L-WT) oder frei von EGFR waren (B82L-parental).
  • 14: Repräsentative Ergebnisse, die die Quantifizierung der gestempelten Proteine zeigen. WT- und parentale Proben waren, wie in der Beschreibung der 13 beschrieben.
  • 15: Optische Aufnahmen von nematischem 5CB, das von einer mit Amin abschließenden SAM getragen wird, die gedruckten EGFR präsentiert, der aus 4 verschiedenen Zellmembran-Extrakten Affinitäts-eingefangen worden ist: 1. B82L-WT mit EGF-Behandlung (5 Minuten) 2. B82L-WT ohne EGF-Behandlung 3. B82L-parental mit EGF-Behandlung (5 Minuten) 4. B82L-parental ohne EGF-Behandlung.
  • 16: Quantitative Analyse der mittleren optischen Reaktion von 5CB in dem Bereich mit gedrucktem EGFR.
  • 17: Optische Aufnahmen von nematischem 5CB, das von einer mit Amin abschließenden SAM getragen wird, die gedruckten EGFR präsentiert, der aus 8 verschiedenen Zellmembran-Extrakten Affinitäts-eingefangen worden ist, wobei Phosphor-spezifischer Anti-EGFR-1068Ab verwendet wurde.
  • 18: Schema für Peptid-Modifikation von BSA-beschichteten PDMS-Stempeln.
  • 19: Schema für spezifisches Einfangen von Antikörper.
  • 20: A. Schematische Darstellung, die den Transfer von markiertem Protein zeigt. B. Optische Aufnahme von Rollen-gedruckten Oberflächen, die den Proteintransfer veranschaulichen.
  • 21: Schematische Darstellung des Verfahrens der Herstellung eines Affinitätsstempels.
  • 22: Optische Aufnahmen von Flüssigkristall (5CB), der zwischen einem mit Octyltrichlorsilan (OTS) behandelten Glas-Objektträger und halbtransparentem Gold (Einfallswinkel 30 Grad) angeordnet ist, das mit einer mit Amin abschließenden SAM funktionalisiert worden ist, die mit 1 N HCL vorbehandelt worden ist. A) 5CB. B) 5CB, für 4 Stunden mit UV-Licht vorbehandelt. C) 5CB, für 24 Stunden mit UV-Licht vorbehandelt. Die Ausrichtung des für 24 Stunden mit UV-Licht vorbehandelten 5CB war 10 Minuten nach der Bildung der Flüssigkristall-Zelle homöotrop (siehe 22C).
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden oder Analyten von Interesse bereit, wobei Affinitätsmikrokontakt-Drucken des Liganden und Visualisieren der Anwesenheit oder Abwesenheit des Liganden mit einem Flüssigkristall eingesetzt werden. Affinitätsmikrokontakt-Drucken wird dazu verwendet, spezifisch einen Liganden aus einer Probe einzufangen und dann den Liganden auf eine Nachweisoberfläche zu „stempeln". Die vorliegenden Verfahren umfassen Inkontaktbringen einer Probe, die einen Liganden hat oder von der vermutet wird, dass sie einen Liganden hat, mit einem Affinitätssubstrat. Das Affinitätssubstrat umfasst einen Rezeptor, der spezifisch für den Liganden ist, oder ein Affinitätsmolekül, das spezifisch für den Analyten von Interesse ist. Wenn der Ligand in der Probe vorhanden ist, kann ein Teil des Liganden an den Rezeptor binden, so dass er zur Isolierung oder zum Nachweis aus der Probe entfernt werden kann. Dieser Schritt wird auch als „Einfärben" des Stempels bezeichnet. Üblicherweise wird das Affinitätssubstrat für eine gewünschte Zeitdauer mit der Probe inkubiert, wie z. B. für mehrere Stunden. Diese Inkubationsdauer kann sich je nach der Art der getesteten Probe unterscheiden. Nachdem der Ligand mit Hilfe des Rezeptors aus der Probe eingefangen worden ist, wird das Affinitätssubstrat mit einer Nachweisoberfläche in Kontakt gebracht, die auf einem getrennten Substrat vorliegt, das es ermöglicht, dass ein Teil des gebundenen Liganden auf die Nachweisoberfläche transferiert wird. Dieser Schritt wird auch als „Stempeln" oder „Drucken" des Liganden bezeichnet. Wie es einem Fachmann ersichtlich ist, kann das Inkontaktbringen des Affinitätssubstrats mit der Nachweisoberfläche manuell oder auf eine automatisierte Weise durchgeführt werden. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von jeglichem Liganden, der auf die Nachweisoberfläche transferiert worden ist, kann dann mit einem Flüssigkristall visualisiert werden. Üblicherweise wird der Flüssigkristall auf die Nachweisoberfläche aufgetragen, nachdem diese mit dem Affinitätssubstrat in Kontakt gebracht worden ist, und der Flüssigkristall wird visualisiert. Wenn der Flüssigkristall während dieses Schritts in eine isotrope Phase erhitzt wird, sollte die isotrope Phase abgekühlt werden, um vor der Abbildung die flüssigkristalline Phase zu bilden. Der Flüssigkristall kann auch in der flüssigkristallinen Phase aufgetragen werden. Ein Inunordnungbringen oder eine Störung des Flüssigkristalls zeigt typischerweise an, dass Ligand auf der Nachweisoberfläche vorliegt. Es ist jedoch auch möglich, die Anwesenheit eines Liganden in einer Probe durch Ordnen des Flüssigkristalls durch den Liganden auf der Oberfläche nachzuweisen. Falls die gleichmäßige Verankerung des Flüssigkristalls zerstört worden ist, dann liegt der Ligand in der Probe vor. Das Bestimmen, ob die gleichmäßige Verankerung des Flüssigkristalls zerstört worden ist, kann mit verschiedenen Methoden bewerkstelligt werden. Eine solche Methode umfasst Anschauen des Substrats durch Polarisatoren. Dies kann auf einer automatisierten Vorrichtung wie z. B. einem Plattenlesegerät durchgeführt werden. Man kann auch elektrische Methoden verwenden (z. B. Messung der elektrischen Impedanz des Dünnfilms). In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird die Anwesenheit von Ligand auf der Einfangoberfläche durch den Flüssigkristall angezeigt, wobei man eine gut charakterisierte Ausrichtung annimmt, die von der Ausrichtung unterscheidbar ist, die der Flüssigkristall in Abwesenheit des Liganden annimmt. Zum Beispiel könnte die Ausrichtung des Flüssigkristalls in Anwesenheit des Liganden parallel zu der Oberfläche sein und senkrecht zu der Oberfläche in Abwesenheit des Liganden auf der Oberfläche. In anderen Ausführungsformen kann sich die Ausrichtung des Flüssigkristalls in der Schichtebene verändern, wenn Ligand auf der Oberfläche vorliegt.
  • Eine Darstellung dieses Prozesses ist in der 1.1 veranschaulicht. Wie man in dieser Figur sehen kann, wird der Affinitätsstempel in einer Ligandenlösung eingefärbt. Der eingefärbte Stempel wird auf eine SAM auf schief abgelagertem Gold Affinitätsmikrokontakt-gedruckt. Unterschiede in der Ausrichtung des Flüssigkristalls zeigen die Anwesenheit von gestempeltem Protein an. Eine spezifischere Prozedur, die verwendet wird, um Affinitätskontakt-gedruckte Proteine mit Flüssigkristallen abzubilden, ist in 1.2 gezeigt. In dieser Figur wird die Amin-SAM (selbstangeordnete Einzelschicht) auf dem Goldsubstrat für 10 Sekunden vor dem Drucken mit 0,1 M HCl behandelt (dieses stellt ein bevorzugtes Substrat dar). Um das Goldsubstrat herzustellen, hat man Gold in einem Winkel von 45° auf einen sauberen Glas-Objektträger aufgetragen. Der Affinitätsstempel wird für 30 Sekunden mit der Amin-SAM auf dem Goldsubstrat in Kontakt gebracht und dann abgezogen. Der PDMS-Stempel wurde aus einer Silizium-Vorlage geformt, so dass sich Stifte ergaben, die 256 μm2 groß waren. Die Flüssigkristall-Zelle wird dann aufgebaut, indem man Flüssigkristall zwischen zwei Substrate einbringt. Das erste Substrat ist das Gold, das mit Protein bedruckt worden ist. Das zweite Substrat ist ein mit OTS (Octadecyltrichlorsilan) funktionalisierter Glas-Objektträger. Dieses Substrat ergibt eine homöotrope Verankerung des Flüssigkristalls. Die Probe wird langsam für > 40 Minuten von 37°C auf Raumtemperatur abgekühlt.
  • Wie man aus der 1.1 sehen kann, kann die Nachweisoberfläche, um die Visualisierung der Nachweisoberfläche zu erleichtern, Teil einer Flüssigkristall-Assayzelle sein, in welcher der Flüssigkristall zwischen zwei Substrate eingebettet ist. Üblicherweise ist das erste Substrat der Zelle die Nachweisoberfläche und das zweite Substrat besteht aus einem optisch klaren Material, bevorzugt aus einem, das eine homöotrope Verankerung von Flüssigkristall ergeben kann. Ein geeignetes Beispiel eines zweiten Substrats ist OTS (Octyltrichlorsilan). In anderen Ausführungsformen der Erfindung ist die zweite Oberfläche eine Grenzfläche zwischen dem Flüssigkristall und Luft. Das heißt, ein dünner Film von Flüssigkristall wird über die Einfang-Oberfläche ausgebreitet, um das eingefangene Protein abzubilden.
  • Wie es einem Fachmann ersichtlich ist, sollte die molekulare Interaktion zwischen der Nachweisoberfläche und dem gebundenen Liganden stark genug sein, so dass eine nachweisbare Menge des Liganden trotz jeglicher Ligand-Rezeptor-Interaktionen, die auf dem Affinitätssubstrat auftreten können, auf die Nachweisoberfläche transferiert werden kann. Typischerweise beinhaltet ein Transfer von Ligand von dem Affinitätssubstrat auf die Nachweisoberfläche gewöhnlich einfach das Inkontaktbringen der Oberfläche der zwei unterschiedlichen Substrate. Man kann auch Druck auf eines der beiden oder auf beide Substrate ausüben, um den Transfer von Ligand zu erleichtern. Wie der Fachmann verstehen wird, erfolgt die Ablösung von Ligand von dem Affinitätssubstrat, indem die Interaktion zwischen dem Liganden und dem Rezeptor zerstört oder beeinträchtigt wird, wodurch der Ligand isoliert wird. Da der Transfer von Ligand von der Beschaffenheit des Liganden, des Rezeptors und der Nachweisoberfläche abhängt, kann der Transfer durch Erhitzen, Abkühlen, wiederholtem Kontakt zwischen dem Affinitätssubstrat und der Nachweisoberfläche, Spülen oder dergleichen verstärkt oder erleichtert werden. Transfer kann auch durch Vorbehandlung des Affinitätssubstrats oder der Nachweisoberfläche mit einem Transfermittel verstärkt werden. Ein Beispiel für ein Transfermittel ist eine Säure. Die vorliegenden Verfahren können auch Waschen des Affinitätssubstrats beinhalten, nachdem es mit der Probe in Kontakt gebracht worden ist, um die Entfernung von jeglichen nicht-spezifisch gebundenen Kontaminanten zu erleichtern, was die Ausbeute oder die Aufreinigung des isolierten Liganden erhöhen kann.
  • Im Allgemeinen ist (sind) der (die) Ligand(en), der (die) auf die Nachweisoberfläche transferiert wird (werden), nicht-spezifisch mit der Nachweisoberfläche assoziiert. Die Nachweisoberfläche als solche kann behandelt werden, so dass sie einen beliebigen Liganden auf eine nicht-spezifische Weise binden kann und dass ihr jegliche Strukturen oder Moleküle fehlen, die spezifisch an einen Liganden binden. Die Nachweisoberfläche ist im eigentlichen Sinn nicht Liganden-spezifisch, im Gegensatz zum Affinitätssubstrat, der für einen bestimmten Liganden oder bestimmte Liganden spezifisch ist.
  • Indem man ein Affinitätssubstrat verwendet, das von der Nachweisoberfläche getrennt ist, kann man den Liganden-Einfangschritt von dem Nachweisschritt entkoppeln. Diese Entkopplung ermöglicht zahlreiche Vorteile gegenüber Systemen, bei denen eine einzige Oberfläche verwendet wird, um sowohl den Liganden einzufangen als auch die Anwesenheit von Ligand nachzuweisen. Zum Beispiel kann man das Affinitätssubstrat und die Nachweisoberfläche unabhängig voneinander optimieren, um so eine erhöhte Sensitivität und/oder Selektivität zu gewährleisten. Das Affinitätssubstrat und die Nachweisoberfläche können auch aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, die besonders für ihre vorgesehenen Umgebungen geeignet sind. Zum Beispiel kann in Fällen, in denen der Ligand oder Analyt von Interesse üblicherweise in extremen Umgebungen vorliegt, wie z. B. sehr säurehaltigen, sehr basischen, bei hohen oder tiefen Temperaturen oder dergleichen vorliegt, das Affinitätssubstrat dann aus einem Material hergestellt werden, welches dem physikalischen und chemischen Abbau in dieser Umgebung widersteht. In einigen Ausführungsformen kann eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden, um die Rezeptoren auf der Oberfläche des Stempels zu immobilisieren, um die Menge an Ligand zu maximieren, die auf dem Stempel eingefangen wird. Diese Verfahren können die Verwendung von polymeren Bürsten, Hydrogelen, Protein-Mehrfachschichten, Polyelektrolyt-Filmen, Protein A-, Streptavidin- und anderen molekularen Schichten umfassen, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Immobilisierung von Rezeptoren auf Oberflächen bekannt sind. Im Gegensatz dazu kann die Nachweisoberfläche aus einem vergleichsweise empfindlicheren Material hergestellt werden, das den Nachweis des Liganden verstärkt, aber nicht unbedingt die Bedingungen überleben würde, unter denen der Ligand gefunden wird. Man kann eine Vielzahl von Substraten verwenden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf durch Reiben behandelte Polymerfilme, Oberflächen mit Topographie, Oberflächen, die durch Nanostrukturierung und Mikrostrukturierung hergestellt worden sind, Oberflächen, die durch Behandlung mit UV-Licht präpariert worden sind, um Flüssigkristalle auszurichten (Photo-Alignment-Schichten), Oberflächen, die mit polymeren Bürsten behandelt worden sind, Oberflächen, die gedehnt worden sind, um Flüssigkristalle anzuordnen, durch Reiben behandelte Proteinfilme, schief aufgetragene organische und anorganische Materialien, mechanisch polierte Oberflächen, anorganische Filme, die organische Einzel- und Mehrfachschichten tragen, Oberflächen, auf denen Polymere und Polyelektrolyte adsorbiert worden sind, Glasoberflächen, Glasoberflächen, die mit Silan-basierten Einzelschichten behandelt worden sind, Gold- und Silberfilme auf organischen Schwefelverbindungen. Fachleute werden erkennen, dass Oberflächen zur Verwendung in dieser Erfindung nicht auf die vorstehend aufgeführten beschränkt sind. Außerdem können sowohl das Affinitätssubstrat als auch die Nachweisoberfläche wiederverwendet werden, was verringerte Kosten mit sich bringt. Affinitätssubstrate, die mit Probe in Kontakt gebracht worden sind, können auch einmal oder mehrere Male mit der Nachweisoberfläche in Kontakt gebracht werden, um Ligand auf der Nachweisoberfläche zu konzentrieren, was einen Nachweis von geringeren Mengen von Liganden ermöglicht. Das behandelte Affinitätssubstrat kann auch mit mehreren Nachweisoberflächen in Kontakt gebracht werden, was es ermöglicht, dass von einer einzigen Probennahme mehrere Nachweise durchgeführt werden können. Es ist auch möglich, räumliche Information im Hinblick auf die Lage eines Zielmoleküls in einer Probe zu erhalten, was sich als sehr nützlich erweisen könnte, wenn man Proteine aus histologischen Schnitten nachweist (Bildgebung) oder Spezies aus einem räumlich aufgelösten Muster von Molekülen nachweist.
  • Ligand oder Analyt und Rezeptor oder Affinitätsmolekül
  • Wie es einem Fachmann ersichtlich ist, kann das Affinitätssubstrat an Stelle eines Rezeptors ein Affinitätsmolekül umfassen, das für einen Analyten von Interesse spezifisch ist. Einige Rezeptoren fangen eine Reihe von Molekülen ein, die zu einer Klasse von Interesse gehören. Die Identität des Liganden oder des Analyten von Interesse ist im eigentlichen Sinn nicht besonders beschränkt, solange es einen Rezeptor oder ein Affinitätsmolekül gibt, der (das) fähig ist, den Liganden oder Analyten spezifisch einzufangen. Die Rezeptoren können verschiedene geeignete Biomoleküle und Biomolekül-erkennende Agenzien umfassen, einschließlich Peptide und Polypeptide, Kohlenhydrate, Toxine, Metalle wie z. B. Schwermetalle, Chelatoren, Pathogene, einschließlich Viren und Bakterien, Nucleinsäuren wie z. B. RNA und DNA, deren Analoga und Imitate, Biotin, Avidin, Zucker, Antikörper, Fab und Fab' oder andere aktive Fragmente von Antikörpern wie z. B., aber nicht beschränkt auf Immunglobuline wie z. B., aber nicht beschränkt auf IgG, kleine organische Moleküle, z. B. Arzneistoffe, chemische Agenzien, Pestizide, Herbizide und dergleichen. Immunglobuline, die IgG, IgA, IgM, IgG und IgE einschließen und Fragmente von Immunglobulinen, sind bevorzugte Rezeptoren, und IgG und Fragmente von IgG sind besonders bevorzugte Rezeptoren. Beispiele für Biomoleküle und Liganden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind auch in den US-Patenten Nr. 6,171,802 und 6,284,197 diskutiert.
  • Der Rezeptor kann gleichmäßig über die Oberfläche des Affinitätssubstrats verteilt sein. In einigen Ausführungsformen kann so gut wie der gesamte Rezeptor an der Spitze der topographischen Strukturen lokalisiert sein. Dies lässt sich erreichen, indem man das Affinitätssubstrat mit einer blockierenden Verbindung wie z. B. mit BSA beschichtet und dann die blockierende Verbindung von der Spitze der topographischen Strukturen entfernt, wie z. B. durch Wischen oder Kratzen, und die Oberfläche mit Rezeptor behandelt wird.
  • Wie bei dem Liganden ist der Rezeptorteil des Affinitätssubstrats ebenfalls nicht besonders beschränkt. Jeder der vorstehend beschriebenen Liganden kann auch an Stelle der Rezeptoren eingesetzt werden, so dass aus dem Rezeptor der Ligand wird und umgekehrt.
  • Affinitätssubstrat
  • Wie vorstehend diskutiert, wird das Affinitätssubstrat dazu verwendet, den Liganden oder den Analyten von Interesse einzufangen und den eingefangenen Liganden auf die Nachweisoberfläche zu transferieren. Um diese Funktionen auszuführen, umfasst das Affinitätssubstrat einen Liganden oder ein Affinitätsmolekül, das mit einem Träger verbunden ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Affinitätsmolekül kovalent an den Träger gebunden, entweder direkt oder via eine oder mehrere verbindende Untereinheiten, obgleich es nicht erforderlich ist, dass diese kovalent gebunden sind, solange das Affinitätssubstrat Liganden wirksam einfangen und transferieren kann. In Fällen, in denen das Affinitätsmolekül nicht kovalent befestigt ist, können das Affinitätsmolekül und der Ligand zum Nachweis der Anwesenheit des Liganden auf die Nachweisoberfläche transferiert werden. Man kann eine Vielzahl von Materialien als Träger für das Affinitätssubstrat verwenden, und diese sind nicht besonders eingeschränkt, solange der ausgewählte Rezeptor oder das ausgewählte Affinitätsmolekül mit dem Substrat verbunden werden kann. Bevorzugte Träger umfassen Polymere und Silica-enthaltende Materialien mit Oberflächen für eine Reaktion mit Oberflächen-modifizierenden Verbindungen oder Agenzien.
  • Das Affinitätssubstrat kann aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, wozu jedes Polymer gehört, das unter den Bedingungen der Probennahme stabil ist, zum Beispiel in wässrigen Medien. Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Polydimethylsiloxan, Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Polycarbonat, Polycyanacrylat, Polyurethan, Polyolefine und Polyimide. Eine bevorzugte Gruppe von Substraten wird aus Polyurethan, Polycyanacrylat oder Polystyrol geformt. Polystyrol ist ein besonders bevorzugtes Substrat zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Eine Alternative ist ein Spin-on-Glas, z. B. Silicamaterial, das durch nasschemische Sol-Gel-Methoden wie z. B. Tetraethoxysilan (TEOS) gebildet wird. Dieses anorganische Material kann formgepresst werden. Weil es ein Glas ist, das Hydroxylgruppen bietet, könnte man die Oberfläche mit Silanchemie behandeln (z. B. 3-Aminopropyltriethoxysilan (APES)). Weil es steif ist, könnte es weniger anfällig gegenüber dem „Verrunden" von Rillen etc. sein als ein Elastomer. Silikon-Elastomere können ebenfalls verwendet werden. Beispiele für Silikon-Elastomere, die für eine Verwendung als Stempel geeignet sind, umfassen solche, die aus Vorläufern gebildet sind, wozu die Chlorsilane wie z. B. Methylchlorsilane, Ethylchlorsilane und Phenylchlorsilane und dergleichen gehören. Ein bevorzugtes Silikon-Elastomer ist Polydimethylsiloxan (PDMS).
  • Obwohl die hierin beschriebenen Affinitätssubstrate aus einem flachen Materialstück ohne besondere Merkmale hergestellt werden können, weist das Affinitätssubstrat bevorzugt topologische Strukturen wie z. B. Erhebungen oder Plateaus auf. Die topologischen Strukturen können verschiedene Geometrien aufweisen, z. B. je nach Wunsch quadratisch, rechteckig, dreieckig, kreisförmig, halbkreisförmig oder Kombinationen davon, und werden typischerweise in Nanodimensionen etwas abgerundet oder keilförmig geformt sein. Die topographischen Strukturen können jede beliebige gewünschte Dimension haben und können in einer Größe hergestellt werden, dass sie leicht durch Mikroskopie beobachtbar sind. Typische Strukturen haben eine Größe im Mikrometer-Bereich und können in einem Bereich von 1 bis 100 μm liegen. Die topographischen Strukturen sind zum Beispiel quadratische Formen, die auf einer Seite 10 bis 20 μm groß sind. Affinitätssubstrate, die mehr als eine Fläche verwenden, können dazu verwendet werden, einer Probe einen Array von Rezeptoren zu präsentieren, welche dieselbe oder verschiedene Spezifitäten aufweisen können. Wenn die Rezeptoren unterschiedliche Spezifitäten haben, wird jede topographische Struktur Rezeptoren haben, die für einen einzigen Liganden spezifisch sind, und die topographischen Strukturen können unterschiedliche Formen haben, um die Identifizierung des Liganden zu erleichtern. Zum Beispiel kann ein Rezeptor für einen spezifischen DNA-Liganden mit einer kreisförmigen topographischen Struktur assoziiert sein und ein Rezeptor für einen Protein-Liganden kann auf einer quadratischen Struktur vorliegen, so dass eine kreisförmige Störung des Flüssigkristalls auf der Nachweisoberfläche die Anwesenheit des DNA-Liganden anzeigen würde und das Vorliegen einer quadratischen Störung die Anwesenheit des Proteins anzeigen würde.
  • Die Topographie des Substrats und des Nachweisbereichs der Nachweisvorrichtung kann modifiziert werden, indem man mindestens einen Teil des Affinitätssubstrats mit einem anorganischen Material beschichtet, wie z. B., aber nicht beschränkt auf ein Siliziumoxid, ein Metalloxid, ein Metall, Kombinationen von diesen. Dies wird bevorzugt mit Hilfe von Vakuumabscheideverfahren erreicht. Silber und Gold sind besonders bevorzugte anorganische Materialien zur Verwendung für solche topographischen Modifikationen, und Gold ist besonders bevorzugt. Wenn mindestens ein Teil des Nachweisbereichs mit Gold oder Silber beschichtet ist, können sie mit einer organischen Schwefelverbindung wie z. B. Mercaptan oder Disulfid behandelt werden, die an die Metalloberfläche bindet.
  • Das Substrat mit den ausgebildeten Mikrostrukturen kann durch verschiedene Herstellungsprozesse erzeugt werden. In einem geeigneten Prozess wird eine Form mit Hilfe von herkömmlichen Mikrobearbeitungsprozessen erzeugt, z. B. in einem Silizium-Werkstück, auf das dann ein flüssiges Polymer aufgetragen wird, das dann fest wird. Mechanische Prägung eines Polymers ähnlich dem, das bei der Herstellung von Kompactscheiben und holographischen Gittern eingesetzt wird, kann ebenfalls verwendet werden. Eine heiße harte Vorlage wird in eine Polymerfolie gepresst, die etwa in den Bereich ihrer Glastransitionstemperatur erhitzt wird, was das Relief in der Vorlage auf das Polymer transferiert, und das Polymer wird dann vor dem Ablösen der Vorlage unter seine Glastransitionstemperatur abgekühlt. Substrate können auch durch Photopolymerisierungsmethoden, Lithographie oder dergleichen hergestellt werden.
  • In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines Substrats wird eine Silizium- oder eine andere Vorlage dazu verwendet, einen Abdruck aus Polydimethylsiloxan (PDMS) oder aus einem anderen Elastomer zu formen. Bevorzugt wird eine Fluor-haltige Verbindung auf die Oberfläche der Silizium-Vorlage aufgetragen, bevor man den Elastomer-Abdruck macht, so dass die Ablösung des Elastomer-Abdrucks einfacher ist. Der Elastomer-Abdruck wird dann bevorzugt als eine Vorlage verwendet, um einen Abdruck aus einem thermisch aushärtenden Material wie z. B., aber nicht beschränkt auf Epoxid oder stärker bevorzugt aus einem UV-aushärtenden Material wie z. B., aber nicht beschränkt auf Polyurethan, Poly cyanacrylat oder Polystyrol zu formen. Polystyrol ist ein besonders bevorzugtes Material zur Verwendung beim Formen solcher Polymer-Abdrücke.
  • Nachstehend ist ein Reaktionsschema diskutiert, das die Schritte veranschaulicht, die bevorzugt in einem Prozess verwendet werden, um eine biochemische Blockierungsschicht für die Verwendung in einer Flüssigkristall-Assay-Vorrichtung chemisch auf der Oberfläche eines Trägers zu immobilisieren. Im Allgemeinen wird ein Träger gewöhnlich zuerst mit einem Oberflächen-modifizierenden Agens behandelt, das ein Ende hat, das eine reaktive Gruppe trägt, die in der Lage ist, mit einer funktionellen Gruppe auf der Oberfläche des Trägers zu reagieren, und ein anderes Ende, das eine reaktive Gruppe hat, die in der Lage ist, mit einer reaktiven Gruppe an dem einen Ende der bifunktionellen Spacer-Verbindung zu reagieren. Bei bevorzugten Oberflächen-modifizierenden Verbindungen schließt die reaktive Gruppe, die in der Lage ist, mit der funktionellen Gruppe des Trägers zu reagieren, Funktionalitäten ein, wie z. B., aber nicht beschränkt auf eine Halogen-Silizium-Bindung oder eine Alkoxy-Silizium-Bindung. Diese Funktionalitäten reagieren mit den chemischen Gruppen auf Trägern wie z. B. Silika-Wafern oder Glas, um eine kovalente Bindung auszubilden, die die Siliziumverbindung an die Oberfläche des Trägers anhängt. Bevorzugte Oberflächen-modifizierende Verbindungen schließen auch ein Ende mit einer reaktiven Gruppe ein, die in der Lage ist, mit einer reaktiven Gruppe an einem Ende der bifunktionellen Spacer-Verbindung zu reagieren. Bevorzugte derartige reaktive Gruppen auf der Oberflächen-modifizierenden Verbindung umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Alkylamine. Demnach sind bevorzugte Oberflächenmodifizierende Agenzien Siliziumverbindungen, umfassend ein Siliziumatom; mindestens eine Alkoxygruppe, die über eine Sauerstoff-Silizium-Bindung an das Siliziumatom gebunden ist; und eine Aminoalkylgruppe, die über eine Kohlenstoff-Silzium-Bindung an die Siliziumatome gebunden ist. Stärker bevorzugte Oberflächen-modifizierende Verbindungen umfassen Aminoalkyltrialkoxysilane wie z. B. jene, die Aminoalkylgruppen von 2 bis 8 Kohlenstoffatomen haben. Eine besonders bevorzugte derartige Verbindung ist Aminopropyltriethoxysilan (APTS).
  • Fachleute werden erkennen, dass Alkoxygruppen wie z. B. Methoxy-, Propoxy-, Butoxy- und Pentoxy-Gruppen an Stelle der Ethoxygruppen verwendet werden können. Außerdem werden Fachleute erkennen, dass andere Silane wie z. B., aber nicht beschränkt auf Aminoalkyldialkylchlorsilane, mit Sulfhydrylgruppen abschließende Silane wie z. B. 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan und Silane mit Doppelbindungen wie z. B. Allyltrichlorsilan und Allyltrialkoxysilane ebenfalls als Oberflächen-modifizierende Verbindung eingesetzt werden können. Fachleute werden erkennen, dass Silane mit Sulfhydrylgruppen wie z. B. 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan sowohl mit den chemischen Gruppen an der Oberfläche des Trägers als auch mit der biochemischen Blockierungsverbindung über Bildung einer Disulfidbindung zwischen der Sulfhydrylgruppe auf dem Silan und einer Sulfhydrylgruppe auf dem Protein reagieren würden. Demnach wäre eine bifunktionelle Spacerverbindung vielleicht nicht erforderlich, falls eine derartige Oberflächen-modifizierende Verbindung verwendet werden würde. Falls gewünscht könnte jedoch ein heterobifunktionelles Vernetzungsmittel wie z. B. n-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) oder Succinimidyloxycarbonylmethyl-(2-pyridylthio)toluol (SMPT) oder Succinimidyl-4-(N-Maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) oder Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid-ester (MBS) mit einer einen solchen Sulfhydrylrest enthaltenden Oberflächen-modifizierende Siliziumverbindung verwendet werden.
  • Eine Reaktion zwischen der Oberflächen-modifizierenden Verbindung und dem Träger erzeugt einen Träger mit einer modifizierten Oberfläche, die durch Reaktion mit der bifunktionellen Spacerverbindung aktiviert werden kann. Da Wasser in dem Reaktionsgemisch eine unerwünschte Reaktion mit der Oberflächenmodifizierenden Verbindung zur Folge haben kann, wird die Reaktion zwischen der Oberflächen-modifizierenden Verbindung und dem Träger bevorzugt mit wasserfreien Lösungsmitteln und Bedingungen durchgeführt, obwohl Fachleute erkennen werden, dass die Anwesenheit von etwas Wasser toleriert werden wird.
  • In dem Prozess der chemischen Immobilisierung eines Rezeptors auf der Oberfläche eines Trägers lässt man eine reaktive Gruppe am einen Ende einer bifunktionellen Spacerverbindung oder eines bifunktionellen Aktivators üblicherweise mit der modifizierten Oberfläche reagieren, um die Oberfläche, die eine aktivierte modifizierte Oberfläche auf dem Träger bildet, zu aktivieren. Bevorzugte bifunktionelle Spacerverbindungen weisen zwei Enden auf, die ähnliche oder unterschiedliche funktionelle Gruppen haben können. Bevorzugt haben solche bifunktionellen Spacerverbindungen Abgangsgruppen an jedem der beiden Enden, so dass ein Ende mit einer Gruppe wie z. B. einem Amin auf der biochemischen Blockierungsverbindung reagiert und das andere Ende mit einer Gruppe wie einem Amin auf der angebundenen Oberflächen-modifizierenden Verbindung reagiert. Bevorzugte bifunktionelle Spacerverbindungen oder Aktivatoren umfassen Strukturen, die die folgende Formel haben:
    Figure 00270001
    wobei n eine Ganzzahl ist, die einen Wert im Bereich zwischen 1 bis 20 hat, stärker bevorzugt einen Wert im Bereich zwischen 2 bis 10 oder noch stärker bevorzugt einen Wert im Bereich zwischen 5 und 8. Am meisten bevorzugt handelt es sich bei der bifunktionellen Spacerverbindung oder dem aktivierenden Agens um Disuccinimidylsuberat, wobei n den Wert 6 hat.
  • Fachleute werden erkennen, dass man eine Vielzahl von bifunktionellen Spacerverbindungen an Stelle der vorstehenden Disuccinimidyl-Spezies verwenden kann und dass diese sich als wirksam bei der Immobilisierung der biochemischen Blockierungsverbindungen auf den Oberflächen von Trägern erweisen. Beispiele für homobifunktionelle Spacerverbindungen, die mit einem Amin auf der Oberflächenmodifizierenden Verbindung und einem Amin auf der biochemischen Verbindung der biochemischen Blockierungsschicht reagieren würden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Disuccinimidylsuberat; bis(Sulfosuccinimdyl)-suberat; Disuccinimidylglutarat; Dimethyladipimidat; Dimethylsuberimidat; Dimethylpimelimidat; Dimethyl-3,3-dithio-bis-propionimidat; Methyl-N-succinimidyl-adipat; und 1,5-Difluor-2,4-nitrobenzol. Beispiele für homobifunktionelle Spacerverbindungen, die mit einer Sulfhydrylgruppe auf der Oberflächen-modifizierenden Verbindung und einer Sulfhydrylgruppe auf der biochemischen Verbindung der biochemischen Blockierungsschicht reagieren würden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: 1,11-bis-Maleimidotetraethylenglykol; bis-Maleimidohexan; 1,6-Hexan-bis-vinylsulfon; 1,8-bis-Maleimidotriethylenglykol; 1,4-bis-Maleimidobutan; und bis-Maleimidoethan.
  • Zusätzlich zu den vorstehend vorgestellten homobifunktionellen Spacerverbindungen ist es möglich, heterobifunktionelle Spacerverbindungen in der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Beispiele für bifunktionelle Spacerverbindungen mit einem Ende, das in der Lage ist, mit einem Amin zu reagieren, und mit einem Ende, das in der Lage ist, mit einer Sulfhydrylgruppe zu reagieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: N-(-Maleimidounudecanoyloxy)-sulfosuccinimidester; Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxy-(6-amidocaproat); N-(-Maleimidoundecansäure); Succinimidyl-4-[p-maleimidophenyl]butyrat; Succinimidyl-6-[(-maleimidopropionamido)hexanat]; Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat; N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat; N-[-Maleimidobutyryloxy]succinimidester; m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester; N-Maleimidocapronsäure; N-[-Maleimidocaproyloxy]-succinimidester; N-Succinimidyl-[4-vinylsulfonyl]-benzoat; N-[-Maleimidopropyloxy]-succinimidester; Succinimidyl-3-[bromacetamido]-propionat; N-Maleimidopropionsäure; N-[-Maleimidoacetoxy]-succinimidester; N-Succinimidyl-S-acetylthiopropionat; und N-Succinimidyliodacetat. Eine bifunktionelle Spacerverbindung mit einem Ende, das in der Lage ist, mit einem Amin zu reagieren, und einem Ende, das in der Lage ist, mit einer Carboxylgruppe zu reagieren, umfasst 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid. Ein Beispiel für eine heterobifunktionelle Spacerverbindung mit einem Ende, das in der Lage ist, mit einer Sulfhydrylgruppe zu reagieren, und einem Ende, das in der Lage ist, mit einer Hydroxylgruppe zu reagieren, umfasst N-[p-Maleimidophenyl]isocyanat.
  • Die Rezeptorverbindung wird bevorzugt mit der aktivierten modifizierten Oberfläche des Trägers umgesetzt, die durch die Reaktion mit der bifunktionellen Spacerverbindung erzeugt worden ist. Zum Beispiel wird eine der Amingruppen, vorzugsweise ein Amin wie z. B. eine Aminogruppe auf einem Lysinrest, mit dem unreagierten Ende der bifunktionellen Spacerverbindung umgesetzt, um eine kovalente Amidbindung zu bilden, welche die biochemische Blockierungsverbindung auf der Oberfläche des Trägers immobilisiert.
  • In einer Ausführungsform kann das Affinitätssubstrat dadurch hergestellt werden, dass man ein Makromolekül (Einfangprotein) kovalent auf einen PDMS-Stempel bindet, wobei man herkömmliche Vernetzungsverfahren für Glas verwendet, so dass die primären Amine auf dem Makromolekül (dem Einfang-Protein) mit den Sulfo-NHS-Estern auf der Oberfläche reagieren, so dass diese kovalent an den Affinitätsstempel gebunden werden. So wird zum Beispiel, wie in 21 gezeigt, ein PDMS-Träger funktionalisiert, indem man zuerst die Oberfläche mit einem O2-Plasma oxidiert (Schritt 1). Die oxidierte Oberfläche wird dann mit Aminopropyltriethoxysilan (APTS) umgesetzt, um eine Oberfläche herzustellen, die primäre Amine präsentiert (Schritt 2). Man verwendet dann ein bifunktionelles Vernetzungsmittel (BS3), um das primäre Amin auf der Oberfläche mit dem primären Amin auf dem Makromolekül (dem Einfang-Molekül) zu vernetzen (Schritte 3 und 4).
  • Das Affinitätssubstrat wird auch als der „Affinitätsstempel" bezeichnet. Beispiele für Affinitätssubstrate, deren Konfigurationen sowie Verfahren zur Herstellung von Affinitätssubstraten sind auch in den US-Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern US 2002/0028451, US 2001/0013294 und US 2002/0098364 und in den US-Patenten Nr. 6,096,386 , 6,537,499 und 6,596,346 erörtert.
  • Alternativen zu PDMS für die Herstellung von Stempeln umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hydrogel (siehe Langmuir 2000, 16, 9944–9946; Langmuir 1998, 14 (15), 3971–3975), Elastomere (Siloxan (PDMS), Silikon, Polyolefin, Kohlenwasserstoff-Gummi, chlorsulfoniertes Polyethylen, Polychloropren, chloriertes Polyethylen) (siehe www.dupont-dow.com), Gummi, andere Polymere (Polyanilin, Polypyrrol) (siehe Synthetic Metals 1997, 84 (1–3), 27–34).
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein zylindrischer Stempel verwendet, um Biomoleküle wie z. B. Proteine, Peptide, Antikörper und andere Mikrokontakt-gedruckte Spezies auf die Nachweisoberfläche zu drucken. Ein beispielhafter Träger für einen zylindrischen Stempel ist ein 20 ml-Szintillationsgefäß, obwohl Fachleute erkennen werden, dass es viele geeignete alternative Träger gibt. Man hat zylindrische Stempel in der Vergangenheit verwendet, um eine kontinuier liche Bearbeitung und ein kontinuierliches Stempeln über große Bereiche zu ermöglichen (siehe 21, 26). Affinitätsmikrokontakt-Drucken ist eine Variante des Mikrokontakt-Druckens, bei der die Oberfläche des PDMS-Stempels chemisch funktionalisiert ist, so dass ein Rezeptor präsentiert wird, der ein spezifisches Biomolekül (z. B. ein Protein) bindet. Kräfte, die während der Adhäsion und der Entfernung des Stempels in der Nähe von dessen Berührungslinie wirken, können zur Abscheidung von Proteinen (und anderen Mikrokontakt-gedruckten Spezies) mit einer bevorzugt azimuthalen Ausrichtung führen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die azimuthale Symmetrie der gedruckten Proteine mit Hilfe von Flüssigkristallen bestimmt. Es ist Fachleuten bekannt, dass Flüssigkristalle als empfindliche Sonden für die Struktur in Schichtebene der Oberflächen dienen können, die mit synthetischen Polymeren und biologischen Makromolekülen wie z. B. Proteinen bedeckt sind. In manchen Ausführungsformen richten Proteine, die sowohl durch Mikrokontakt-Drucken als auch durch Affinitätsmikrokontakt-Drucken gedruckt worden sind, Flüssigkristalle mit bevorzugt azimuthalen Ausrichtungen aus, und die Ausrichtungen lassen sich festlegen, indem man die azimuthale Ausrichtung des Kontakts zwischen einem zylindrischen Stempel und einer Oberfläche steuert. In manchen besonders bevorzugten Ausführungsformen stellen die Verfahren der vorliegenden Erfindung Methoden bereit, Biomoleküle an Grenzflächen zu organisieren, wozu Grenzflächen gehören, die biomolekulare Ereignisse an Ausrichtungsübergänge in Flüssigkristallen koppeln.
  • Nachweisoberfläche
  • Die in den vorliegenden Verfahren verwendete Nachweisoberfläche stellt eine Oberfläche bereit, auf die ein Ligand oder ein Analyt von dem Affinitätssubstrat transferiert wird, und die eine Visualisierung und den Nachweis des Liganden über einen Flüssigkristall ermöglicht. Die Nachweisoberfläche im eigentlichen Sinn kann eine beliebige Oberfläche sein, die Flüssigkristall in der Abwesenheit von Ligand verankert. Bevorzugt ist die Nachweisoberfläche eine selbst-angeordnete Einzelschicht, die auf einem Träger wie z. B. einem Metallfilm abgeschieden wird, zum Beispiel auf schief abgeschiedenem Gold. Typischerweise wird der Metallfilm auf einen Träger abgeschieden. Alternativ kann die Nachweisoberfläche ein Glas-Objektträger sein, der mit Aminopropyltriethoxysilan beschichtet ist. Ähnlich wie das Affinitätssubstrat kann die Nachweisoberfläche auch strukturiert sein. Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung von anderen Oberflächen als selbst-angeordneten Einzelschichten vor, die ebenfalls in der Lage sind, Flüssigkristall gleichmäßig zu verankern. Beispiele für solche Oberflächen umfassen durch Reiben behandelte Substrate und sie sind in der US-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer US 2002/0055093 erörtert; ihnen können jegliche Bindemittel fehlen, wenn sie in den vorliegenden Verfahren zum Einsatz kommen. Andere Verfahren, die man verwenden kann, um die Nachweisoberfläche herzustellen, umfassen Photopolymerisierung, mechanisches Polieren, schiefe Abscheidung von organischen und anorganischen Materialien, Dehnen deformierbarer Substrate sowie Mikroformung und Nanoformung. Oberflächen, die eine homöotrope oder eine azimuthal degenerierte Anordnung von Flüssigkristallen ergeben, können ebenfalls verwendet werden.
  • Alternative Materialien für die Einfangoberfläche. Zusätzlich zu Gold umfassen andere alternative Oberflächenbeschichtungen Silber, Kupfer, Edel- und Münzmetalle, Metalloxide, einschließlich Titanoxide, Polymere, Silizium und eine Vielzahl von Glassorten, sind aber nicht darauf beschränkt. Man kann eine Vielzahl von Substraten verwenden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf durch Reiben behandelte Polymerfilme einschließlich Polyimide, Oberflächen mit Topographie, Oberflächen, die durch Nanoformung und Mikroformung hergestellt worden sind, Oberflächen, die durch Behandlung mit UV-Licht präpariert worden sind, um Flüssigkristalle auszurichten (Photo-Alignment-Schichten), Oberflächen, die mit polymeren Bürsten behandelt worden sind, Oberflächen, die gedehnt worden sind, um Flüssigkristalle anzuordnen, durch Reiben behandelte Proteinfilme, schief aufgeschiedene organische und anorganische Materialien, mechanisch polierte Oberflächen, anorganische Filme, die organische Einzel- und Mehrfachschichten tragen, Oberflächen, auf denen Polymere und Polyelektrolyte adsorbiert worden sind, Glasoberflächen, Glasoberflächen, die mit Silan-basierten Einzelschichten behandelt worden sind, Gold- und Silberfilme auf organischen Schwefelverbindungen. Man kann organische Schwefelverbindungen verwenden, die zur Bildung von Einzelschichten führen, die Carbonsäuregruppen, Metallcarboxylate, Ethylenglykol, Nitrilgruppen, Ferrocenium, quaternäre Ammonium-, Sulfonat- und Amingruppen präsentieren. Der Träger für die Nachweisoberfläche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht sonderlich beschränkt, solange der Träger Flüssigkristall gleichmäßig verankern kann oder behandelt werden kann, so dass er einen Flüssigkristall gleichmäßig verankern kann. Bevorzugte Träger schließen Polymere und Silica-haltige Materialien ein, die Hydroxylgruppen zur Reaktion mit Oberflächen-modifizierenden Verbindungen oder Agenzien enthalten. Beispiele für polymere Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Polystyrol, Polycarbonate und Polymethylmethacrylat, die bevorzugt Plasma-behandelt werden, um Hydroxyl- oder Carbonsäure-Funktionalitäten zu präsentieren. Silikon-Elastomere können ebenfalls verwendet werden. Andere Materialien, die für eine Verwendung als Träger geeignet sind, umfassen Metalloxide wie z. B., aber nicht beschränkt auf Indiumoxid, Zinnoxid und Magnesiumoxid und Metalle wie z. B., aber nicht beschränkt auf Gold, Silber und Platin, die man bevorzugt mit einer Schwefel-haltigen Verbindung umsetzt, die eine reaktive Funktionalität wie z. B. eine Hydroxyl- oder eine Carbonsäuregruppe enthält. Noch andere Materialien, die als Träger verwendet werden können, umfassen Cellulose-haltige Materialien wie z. B. Nitrocellulose, Holz, Papier sowie Karton und Sol-Gel-Materialien. Besonders bevorzugte Träger umfassen Glas, Quarz und Silica und die am meisten bevorzugten Träger umfassen Glas-Objektträger und Silica-Wafer. Bevorzugt werden solche Träger vor der Verwendung gereinigt. Fachleute werden erkennen, dass Oberflächen zur Verwendung in dieser Erfindung nicht auf die vorstehend aufgeführten beschränkt sind. Wenn man eine selbstangeordnete Einzelschicht als Nachweisoberfläche verwendet, kann die SAM eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweisen:
    • (1) hydrophil;
    • (2) ordnet Flüssigkristalle gleichmäßig an: und
    • (3) Ligand löst sich nicht von der SAM ab, insbesondere wenn er mit einem Flüssigkristall oder einem wässrigen Puffer in Kontakt gebracht wird.
  • Erstens kann eine hydrophile SAM verwendet werden, um den Transfer von Protein von dem Stempel auf das Substrat zu verbessern. Der Mechanismus für die Immobilisierung von Protein für das Mikrokontakt-Drucken unterscheidet sich von dem Mechanismus der Immobilisierung von Protein mittels Physisorption. Man nimmt an, dass der erhöhte Transfer von Protein auf hydrophile Oberflächen die Folge der hohen Oberflächenenergie von der Luft ausgesetzten hydrophilen Oberflächen ist. Zweitens kann für einen besseren Nachweis von gebundenem Protein eine SAM verwendet werden, die Flüssigkristalle gleichmäßig auf schief abgeschiedenem Gold anordnet. Dritttens kann eine SAM verwendet werden, die es unmöglich macht, dass sich Protein ablöst, wenn es mit Flüssigkristall oder einem wässrigen Puffer in Kontakt gebracht wird, da eine fehlende Ablösung bei Flüssigkristall wichtig für den Nachweis ist. Eine fehlende Ablösung in einem wässrigen Puffer ist erwünscht, damit ein Testen der Aktivität des gestempelten Proteins durch Bindung eines zweiten Proteins aus der Lösung möglich wäre. Eine bevorzugte SAM ist eine mit Amin abschließende SAM, die alle der vorstehend genannten Kriterien erfüllt. Obwohl die beispielhaft genannten SAMs hydrophil sind, weil der Ligand hydrophil ist, können auch hydrophobe Moleküle in der SAM verwendet werden, insbesondere wenn der Ligand hydrophob ist.
  • Es kann auch eine Vielzahl von Materialien als Träger für die Nachweisoberfläche verwendet werden. Der Träger für die Nachweisoberfläche der vorliegenden Offenbarung ist nicht besonders beschränkt, solange der Träger Flüssigkristall gleichmäßig verankern kann oder behandelt werden kann, so dass er einen Flüssigkristall gleichmäßig verankert. Bevorzugte Träger umfassen Polymere und Silica-haltige Materialien, die Hydroxylgruppen für eine Reaktion mit Oberflächenmodifizierenden Verbindungen oder Agenzien enthalten. Beispiele für polymere Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Polystyrol, Polycarbonate und Polymethylmethacrylat, die bevorzugt Plasma-behandelt werden, um Hydroxyl- oder Carbonsäure-Funktionalitäten zu präsentieren. Silikon-Elastomere können ebenfalls verwendet werden. Andere Materialien, die für eine Verwendung als Träger geeignet sind, umfassen Metalloxide wie z. B., aber nicht beschränkt auf Indiumoxid, Zinnoxid und Magnesiumoxid und Metalle wie z. B., aber nicht beschränkt auf Gold, Silber und Platin, die man bevorzugt mit einer Schwefel-haltigen Verbindung umsetzt, die eine reaktive Funktionalität wie z. B. eine Hydroxyl- oder eine Carbonsäuregruppe enthält. Noch andere Materialien, die als Träger verwendet werden können, umfassen Cellulose-haltige Materialien wie z. B. Nitrocellulose, Holz, Papier sowie Karton und Sol-Gel-Materialien. Besonders bevorzugte Träger umfassen Glas, Quarz und Silica und die am meisten bevorzugten Träger umfassen Glas-Objektträger und Silica-Wafer. Bevorzugt werden solche Träger vor der Verwendung gereinigt. So werden Glas-Objektträger beispielsweise bevorzugt durch eine einstündige Behandlung in „Piranha-Lösung" (70% H2SO4/30% H2O2) gereinigt und dann mit deionisiertem Wasser gespült, bevor man sie unter einem Stickstoffstrom trocknet. „Piranha-Lösung" erfordert Sorgfalt bei der Handhabung, da sie heftig mit organischen Verbindungen reagiert, und sollte nicht in geschlossenen Behältern gelagert werden.
  • Ein bevorzugter Träger zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthält eine obere Oberfläche mit einer Schicht von schief abgeschiedenem Metall darauf. Metalle, die verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Gold, Silber, Kupfer, Platin und Palladium. Gegebenenfalls wird eine schief aufgeschiedene Metalloberfläche wie z. B. eine Gold- oder Silberoberfläche über einer Oberfläche aus Titan oder einem anderen, Adhäsion-förderndem Material liegen, das bereits auf einer oberen Oberfläche des Trägers abgeschieden worden ist. Die Verwendung von Titan liefert eine bessere Adhäsion des schief abgeschiedenen Metalls wie z. B. Silber oder stärker bevorzugt Gold bei der Herstellung der metallisierten Oberfläche. Chrom und organische Adhäsionsförderer wie z. B., aber nicht beschränkt auf Aminopropyltrialkoxysilane können ebenfalls gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Verwendung von Titan oder einem anderen Adhäsions-förderndem Material ist nicht notwendig, da geeignete Nachweisoberflächen ohne die Verwendung solcher Materialien hergestellt werden können. Sofern ein Adhäsions-förderndes Material verwendet wird, kann man eine Schicht von unterschiedlicher Dicke auf den darunter liegenden Träger aufbringen. In manchen Ausführungsformen werden ungefähr 10 Å Ti auf einen Träger wie z. B. einen Glas-Objektträger oder eine Glasplatte abgeschieden. In anderen Ausführungsformen liegt die Menge des Adhäsions-fördernden Materials in einem Bereich von 5 Å (0,5 nm) oder ungefähr 5 Å (0,5 nm) bis 20 Å (2,0 nm) oder ungefähr 20 Å (2,0 nm), während die Dicke in anderen Ausführungsformen in einem Bereich von 8 Å (0,8 nm) oder ungefähr 8 Å (0,8 nm) bis 15 Å (1,5 nm) oder ungefähr 15 Å (1,5 nm) liegt. In manchen Ausführungsformen werden ungefähr 10 Å (1,0 nm) von Aminopropyltrimethoxysilan als einem Adhäsions-förderndem Material abgeschieden. In anderen Ausführungsformen liegt die Dicke der Schicht des Adhä sions-fördernden Materials in einem Bereich von 5 Å (0,5 nm) oder ungefähr 5 Å (0,5 nm) bis 50 Å (5,0 nm) oder ungefähr 50 Å (5,0 nm). Die Menge an Adhäsionsförderndem Material kann dicker sein, so dass in manchen Ausführungsformen die Dicke der Schicht eines Adhäsions-fördernden Materials wie z. B. Titan in einem Bereich von 5 Å (0,5 nm) oder ungefähr 5 Å (0,5 nm) bis 100 Å (10 nm) oder ungefähr 100 Å (10 nm) liegt.
  • In manchen Ausführungsformen wird eine Schicht von schief abgeschiedenem Metall, vorzugsweise Gold, auf eine gereinigte Oberfläche des Trägers abgeschieden, indem man es bei einer Rate von etwa 0,2 Å/s (0,02 nm/s) bei einem Druck von weniger als oder etwa 5 × 10–6 Torr ohne Rotation der Probe relativ zu dem auftreffenden Gold-Fluss aufdampft. Siehe Gupta, V. K. et al., Chemistry of Materials, 8, (1996), S. 1366. In anderen Ausführungsformen wird ein Metall wie z. B. Gold, wie vorstehend beschrieben auf einer oberen Oberfläche eines Trägers aufgetragen, der ein Adhäsions-förderndes Material wie z. B. Titan enthält. Die Schicht eines Metalls wie z. B. Gold auf der metallisierten Oberfläche des Trägers liegt typischerweise in einem Dickebereich von 50 Å (5 nm) oder ungefähr 50 Å (5 nm) bis 300 Å (30 nm) oder ungefähr 300 Å (30 nm). In anderen Ausführungsformen liegt die Schicht eines Metalls wie z. B. Gold, das auf die Oberfläche des Trägers abgeschieden wird, in einem Dickebereich von 80 Å (8 nm) oder ungefähr 80 Å (8 nm) bis 250 Å (25 nm) oder ungefähr 250 Å (25 nm) oder von 90 Å (9 nm) oder ungefähr 90 Å (9 nm) bis 200 Å (20 nm) oder ungefähr 200 Å (20 nm). In noch anderen Ausführungsformen liegt die Schicht eines Metalls wie z. B. Gold, das auf die Oberfläche des Trägers abgeschieden wird, in einem Bereich von 100 Å (10 nm) oder ungefähr 100 Å (10 nm) bis 200 Å (20 nm) oder ungefähr 200 Å (20 nm). In manchen Ausführungsformen wird ein Metall wie z. B. Gold in einem Winkel von 30° oder ungefähr 30° bis 60° oder ungefähr 60° abgeschieden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird ein Metall wie z. B. Gold in einem Winkel von 50° oder ungefähr 50° abgeschieden. Man hat festgestellt, dass der Winkel, bei dem das Gold auf einen darunter liegenden Träger abgeschieden wird, die Empfindlichkeit der Nachweisoberfläche beeinflusst. Daher können je nach der jeweiligen Anwendung unterschiedliche Winkel der Metallabscheidung bevorzugt werden, wie es Fachleuten ersichtlich ist. Die metallisierte Oberfläche, die man nach der Abscheidung des Metalls erhält, ist im Allgemeinen eine anisotrop raue und halbdurchsichtige Oberfläche.
  • Die Nachweisoberfläche wird dann üblicherweise hergestellt, indem man eine selbst-angeordnete Einzelschicht auf den Träger abscheidet. Im Allgemeinen besteht die SAM aus Alkanthiolmolekülen oder aus organischen Schwefelverbindungen, die sich spontan selbst auf dem Träger anordnen. Das Alkanthiol kann aus einer Lösung, die das Alkanthiol enthält, leicht an die Oberfläche des Trägers adsorbiert werden. In manchen Ausführungsformen liegt das Alkanthiol in einem Alkohol wie z. B. Ethanol oder Methanol vor, obwohl gemäß der Erfindung auch andere Flüssigkeiten benutzt werden können.
  • Man kann verschiedene Alkanthiole verwenden, um die SAM herzustellen. Geeignete Alkanthiole umfassen, sind aber nicht beschränkt auf C4- bis C20-Alkanthiole wie z. B. Butanthiol, Pentanthiol, Hexanthiol, Heptanthiol, Octanthiol, Nonanthiol, Decanthiol, Undecanthiol, Dodecanthiol, Tridecanthiol, Tetradecanthiol, Pentadecanthiol, Hexadecanthiol, Heptadecanthiol, Octadecanthiol, Nonadecanthiol und Eicosanthiol. In verschiedenen Ausführungsformen umfassen die Alkanthiole C5- bis C12-Alkanthiole, C5- bis C10-Alkanthiole, C5- bis C8-Alkanthiole oder Hexanthiol. Fachleute werden erkennen, dass auch Dialkyldisulfide, R-S-S-R, dazu verwendet werden können, um Nachweisoberflächen herzustellen. Funktionalisierte Alkanthiole wie z. B. mit einem Amin abschließende Alkanthiole können ebenfalls verwendet werden und sind in der Gruppe von Verbindungen eingeschlossen, die als „Alkanthiole" bezeichnet werden. Zum Beispiel können in einer Ausführungsform der Erfindung Aminoalkanthiole wie 1-Aminoethanthiol an Stelle von oder mit Ethanthiol verwendet werden, um selbst-angeordnete Einzelschichten zu erzeugen.
  • Die Konzentration des Alkanthiols in der Lösung, die für die Alkanthiol-Adsorption verwendet wird, liegt im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 1 mikromolar bis 1 millimolar. Wenn man 1 mikromolare Lösungen verwendet, liegen die bevorzugten Eintauchzeiten in einem Bereich von 10 Sekunden bis 24 Stunden. Besonders bevorzugte Eintauchzeiten liegen in einem Bereich von 1 Minute bis 6 Stunden. Andere bevorzugte Eintauchzeiten liegen in einem Bereich von 30 Minuten bis 2 Stunden. üblicherweise wurden die Nachweisoberflächen hergestellt, indem man metallisierte Oberflächen eines Trägers für einen Zeitraum von mindestens etwa 1 Stunde mit einer Lösung eines Alkanthiols in Ethanol bei einer Konzentration von 1 mM in Kontakt brachte. Man kann längere oder kürzere Kontaktzeiten verwenden, solange man eine dicht gepackte Einzelschicht erhält, wie es Fachleuten ersichtlich sein wird. Im Allgemeinen gilt, je geringer die Konzentration des Alkanthiols in der Alkanthiol-Lösung ist, desto länger wird die metallisierte Oberfläche mit der Alkanthiol-Lösung in Kontakt gebracht. Umgekehrt, je höher die Konzentration des Alkanthiols in der Alkanthiol-Lösung ist, desto kürzer wird die metallisierte Oberfläche mit dem Alkanthiol in Kontakt gebracht.
  • Die Alkanthiole werden typischerweise bei Temperaturen in einem Bereich von etwa 15°C bis etwa 60°C, von etwa 20°C bis etwa 40°C, von etwa 22°C bis etwa 40°C oder von etwa 25°C bis etwa 37°C an der metallisierten Oberfläche des Trägers adsorbiert. In manchen Ausführungsformen liegt der Temperaturbereich von etwa 22°C bis etwa 28°C, und in anderen Ausführungsformen ist liegt die Temperatur bei etwa 25°C. Eine gleich bleibende Temperatur ist nicht notwendig, und die Temperatur kann während der Alkanthiol-Adsorption erhöht oder erniedrigt werden. Im Allgemeinen ist die Temperatur der Alkanthiol-Lösung nicht entscheidend für die Herstellung der Nachweisoberfläche. Sofern das DNA-Erkennungsfragment vorher an der metallisierten Oberfläche des Trägers adsorbiert worden ist, liegt die Temperatur der Alkanthiol-Adsorption dann typischerweise in einem Bereich von etwa 20°C bis etwa 60°C, von etwa 22°C bis etwa 38°C, von etwa 22°C bis etwa 28°C oder von etwa 22°C bis etwa 26°C. Eine Temperatur von 25°C oder etwa 25°C ist besonders geeignet für die Alkanthiol-Adsorption.
  • Nachdem das Alkanthiol an der metallisierten Oberfläche des Trägers adsorbiert worden ist, wird die Oberfläche des Trägers üblicherweise mit Ethanol gespült. Der Ethanol wird dann gewöhnlich durch Blasen mit einem Strom von N2 oder einem anderen Inertgas über die gespülte Oberfläche entfernt.
  • In manchen Ausführungsformen umfasst die Nachweisoberfläche eine mit einem Amin abschließende selbst-angeordnete Einzelschicht (SAM), zum Beispiel 1- Aminoethanthiol, das auf schief abgeschiedenem Gold abgeschieden wird, obwohl SAMs auf einer beliebigen geeigneten Oberfläche abgeschieden werden können. In manchen Ausführungsformen ist die Amin-SAM Säure-behandelt wie z. B. mit 0,1 M HCl für 10 Sekunden, um den Proteintransfer und die Flüssigkristall-Bildgebung zu verbessern. Man kann mit Amin abschließende SAMs verwenden, weil diese drei Eigenschaften besitzen, die für manche Ausführungsformen wichtig sein können, nämlich dass die SAM (i) hydrophil ist, (ii) sie Flüssigkristalle gleichmäßig anordnet und (iii) dass Protein sich nicht von der SAM ablöst, wenn es mit Flüssigkristall oder mit einem wässrigen Puffer in Kontakt gebracht wird. Man kann auch andere Nachweisoberflächen verwenden, die einige oder alle dieser Eigenschaften aufweisen.
  • Man kann verschiedene Arten von Flüssigkristallen in Verbindung mit den Strukturen von durch Reiben behandelten Substraten verwenden. Beispiele für diese umfassen sowohl nematische als auch smektische Flüssigkristalle. Andere Klassen von Flüssigkristallen, die man gemäß der Erfindung verwenden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf polymere Flüssigkristalle, lyotrope Flüssigkristalle, chromonische Flüssigkristalle, einschließlich Dinatriumchromglycat, verhinderte (frustrierte) Flüssigkristalle, thermotrope Flüssigkristalle, säulenartige Flüssigkristalle, nematische diskotische Flüssigkristalle, kalamitische nematische Flüssigkristalle, ferroelektrische Flüssigkristalle, diskoidale Flüssigkristalle und cholesterische Flüssigkristalle. Beispiele für nur ein paar der Flüssigkristalle, die man verwenden kann, sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1. Molekularstruktur von Mesogenen, die für eine Verwendung in Flüssigkristall-Assay-Vorrichtungen geeignet sind
    Figure 00390001
  • Flüssigkristalle werden in der vorliegenden Erfindung wegen ihrer charakteristischen Eigenschaften verwendet. Die vorliegenden Nachweissysteme nutzen speziell vier wichtige Eigenschaften von Flüssigkristallen. Erstens können Moleküle innerhalb von Flüssigkristallen (Mesogene) ihre Ausrichtung an Bereiche der großen Masse des Flüssigkristalls kommunizieren, in manchen Fällen bis zu 100 μm entfernt. Diese Fernkommunikation zwischen Mesogenen ermöglicht es, dass Verände rungen in der Oberfläche in Veränderungen der Ausrichtung von dünnen Filmen von Flüssigkristallen amplifiziert werden können, die auf der Oberfläche verankert sind. Zweitens kann, weil Flüssigkristalle fließfähig sind, die Information über die Bindung von Proteinen an Oberflächen schnell an die Masse des Flüssigkristalls weitergeleitet werden (Amplifikation und Weiterleitung können in ein paar Sekunden stattfinden). Drittens können die Ausrichtungen der Masse des Flüssigkristalls wegen der durch die bevorzugte Ausrichtung von Mesogenen innerhalb des Flüssigkristalls verursachten optischen Anisotropie leicht mittels Polarisationslichtmikroskopie abgebildet werden. Viertens können die Oberflächen, da Flüssigkristalle gegenüber der Oberflächenstruktur auf der molekularen Ebene und der Mesoskala empfindlich sind, so konstruiert werden, dass sie die Bindung von Makromolekülen und kleinen Molekülen anzeigen. Somit stellen die derzeitigen Nachweissysteme ein allgemeines und einfaches Hilfsmittel zum Nachweis spezifischer Liganden-Rezeptor-Interaktionen bereit.
  • Ein bevorzugter Flüssigkristall kann einen Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung auf der Nachweisoberfläche durchlaufen, was durch die Bildung einer elektrischen Doppelschicht in dem Flüssigkristall verursacht werden kann. Ein Beispiel für einen Flüssigkristall, der diesen Übergang durchlaufen kann, ist 4-Cyano-4'-pentylbiphenyl (5CB). Durch Ausnutzen dieses Übergangs ist der Nachweis auf Oberflächen mit Flüssigkristallen nicht auf schief abgeschiedenes Gold beschränkt, sondern kann auf andere Oberflächen ausgedehnt werden, wie z. B. isotropes Gold und Glas. Eine besonders bevorzugte Flüssigkristall-Zusammensetzung ist 5CB, das mit einem Salz wie z. B. Tetrabutylammonium-tetrafluorborat (TRAF) dotiert ist. In manchen bevorzugten Ausführungsformen kann das 5CB vor der Platzierung auf der Nachweisoberfläche mit UV-Licht bestrahlt werden. In der Vergangenheit haben Studien gezeigt, dass Bestrahlung mit UV-Licht zu einer Erhöhung des Ionengehalts der Flüssigkristalle führen kann.
  • Wie in den Beispielen gezeigt ist, ermöglichte die Nachweisoberfläche mit diesen Eigenschaften ein spezifisches Einfangen eines Antikörpers aus einer Lösung, das Drucken des Antikörpers auf eine mit einem Amin abschließende SAM und Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers mit Hilfe von Flüssigkristallen.
  • Indem man Affinitätsmikrokontakt-Drucken mit dem Nachweis mittels Flüssigkristallen kombiniert, kann der Einfangschritt von dem Nachweisschritt entkoppelt werden. Darüber hinaus lieferten Oberflächen, die mit mit einem Amin abschließenden SAMs bedeckt waren, einen Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung des Flüssigkristalls. Ohne den Geltungsbereich dieser Erfindung zu beschränken, nimmt man an, dass dieser Übergang durch die Bildung einer elektrischen Doppelschicht in dem Flüssigkristall 5CB verursacht wird. Durch Ausnutzen dieses Übergangs ist der Nachweis von Proteinen auf Oberflächen mittels Flüssigkristallen nicht auf schief abgeschiedenes Gold beschränkt, sondern kann auf andere Oberflächen ausgedehnt werden, wie z. B. auf Goldoberflächen, die nicht in einem schiefen Einfallwinkel abgeschieden wurden, und auf Glas. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung der Nachweisoberflächen oder Substrate für die hierin beschriebenen Verfahren. Speziell wird eine Nachweisoberfläche abgedeckt, die eine mit einem Amin abschließende SAM aufweist. Die Nachweisoberflächen können auch mit einem Flüssigkristall bedeckt werden, der typischerweise zwischen 1 Mikrometer und 100 Mikrometern dick ist, der auf die Nachweisoberfläche abgeschieden werden kann und ohne die Verwendung eines zweiten Substrats verwendet werden kann. in manchen Ausführungsformen kann der Flüssigkristall nach Kontakt mit dem Nachweissubstrat thermisch angelagert werden, um die Reaktion des Flüssigkristalls auf die Anwesenheit des Liganden auf dem Substrat zu maximieren.
  • Beispiele für Nachweisoberflächen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in den US-Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern US 2002/0004216, US 2002/0055093 und US 2003/0099993 offenbart.
  • Kits
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, insbesondere um die hierin beschriebenen Nachweismethoden durchzuführen. Kits zur Verwendung in einem Flüssigkristall-Assay können einen oder mehrere Rezeptoren, Affinitätssubstrate, Nachweisoberflächen, Spacermaterialien, bevorzugt einen Film, und eine Flüssigkristallverbindung beinhalten. In einem bevorzugten Kit zur Verwendung in einem Flüssigkristall-Assay ist die Oberfläche, auf der der Flüssigkristall gleichmäßig verankert ist, eine andere Struktur eines durch Reiben behandelten Substrats. Solche Kits können Anweisungen für den Nachweis eines Liganden enthalten. Solche Anweisungen enthalten üblicherweise Anleitungen für die Inkubation des Affinitätssubstrats mit einer Probe, die möglicherweise einen nachzuweisenden Zielliganden enthält, und für das Inkontaktbringen des Affinitätssubstrats mit der Nachweisoberfläche, um den eingefangenen Liganden zu transferieren. Er wird bevorzugt auch Anweisungen enthalten, in denen erklärt wird, wie man die Anwesenheit der Zielspezies identifiziert, und kann auch Schritte enthalten, die man verwenden kann, um die Konzentration der Zielspezies in einer Probe zu bestimmen. Beispielhafte Kitkomponenten sind hierin diskutiert, insbesondere in den Beispielen, wie sie nachstehend gezeigt sind.
  • Bevorzugte Kits für die Verwendung zum Nachweisen von Ligand auf einer Oberfläche umfassen typischerweise eine metallisierte Oberfläche; einen Flüssigkristall; eine Oberfläche, auf der gleichmäßig Flüssigkristalle verankert sind; sowie ein Spacermaterial wie z. B. einen angepassten Film. Jegliche Kits der vorliegenden Erfindung stellen bevorzugt entweder eine organische Schwefelverbindung oder eine metallisierte Oberfläche bereit, an die eine geeignete organische Schwefelverbindung bereits adsorbiert worden ist. Sofer das Alkanthiol getrennt bereitgestellt wird, kann es in Form einer Lösung wie z. B. einer Lösung in Ethanol vorliegen oder in einer Form zur Zugabe zu einer Flüssigkeit, um eine Alkanthiol-Lösung zur Adsorption an die metallisierte Oberfläche herzustellen. Die Oberfläche, an der der in den bevorzugten Kits bereitgestellte Flüssigkristall gleichmäßig verankert ist, kann eine beliebige der vorstehend beschriebenen umfassen. Geeignete Kits der Erfindung können auch eine oder mehrere Spüllösungen zur Verwendung nach Adsorption eines Alkanthiols und nach der Inkubation mit einer Probenlösung enthalten. Solche Kits können Anweisungen für den Nachweis und/oder Anweisungen für den Aufbau der Nachweisoberfläche oder einer optischen Zelle enthalten.
  • Die folgenden Beispiele stellen Verfahren, Methoden und Apparate bereit, die in den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Beispiele sind nützlich zu Zwecken der Veranschaulichung und sollten nicht als den Geltungsbereich der Erfindung beschränkend angesehen werden.
  • BEISPIELE
  • Material und Methoden
  • Materialien. Titan (99,999%) und Gold (99,999%) wurden von International Advanced Materials (New York, NY) bezogen. Die Glas-Objektträger waren Fisher's Finest, höchste Qualitätsstufe, bezogen von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Der nematische Flüssigkristall 4-Cyano-4'-Pentylbiphenyl (5CB), hergestellt von BDH, wurde von EM Indusrties (Hawthorne, NY) bezogen. Octyltrichlorsilan (OTS) und 3-Aminopropyltriethoxysilan (APES) sowie der Flüssigkristall N-(4-Methoxybenzyliden)-4-butylanilin (MBBA) wurden von Aldrich (Milwaukee, WI) bezogen. Alle wässrigen Lösungen wurden mit deionisiertem Wasser von hoher Reinheit (18 MΩ cm) hergestellt, wobei ein Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Millipore, Redford, MA) eingesetzt wurde. Alle Proteinllösungen wurden aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 (Sigma) hergestellt. Das 2-Mercaptoethylamin und das Anti-Biotin-IgG waren ebenfalls von Sigma (St. Louis, MO). PDMS-Stempel wurden aus Sylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI) hergestellt. Die Flüssigkristall-Zellen wurden durch Minibindeklammern (Acco, Lincolnshire, IL) zusammengehalten. BS3 (bis[Sulfosuccinimidyl] suberat) und biotinyliertes BSA waren von Pierce (Rockford, IL).
  • Reinigung von Substraten. Objektträger wurden nacheinander in Piranha (70% H2SO4, 30% H2O2) und Laugen (70% KOH, 30% H2O2) gereinigt, wobei man Stickstoff verwendete, um für Umwälzung zu sorgen (1 St bei ~80°C). Warnung: Piranha-Lösung sollte mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden; in einigen Fällen, sehr wahrscheinlich als sie mit signifikanten Mengen eines oxidierbaren organischen Materials gemischt worden ist, ist sie unerwartet explodiert. Die Objektträger wurden dann gründlich in deionisiertem Wasser (18,2 MΩ cm), Ethanol und Methanol gespült und unter einem Strom von Stickstoff getrocknet. Die sauberen Objektträger wurden in einem Vakuumofen bei 110°C gelagert.
  • Herstellung von Octyltrichlorsilan (OTS)-behandelten Glasobjektträgern. OTS(Octadecyltrichlorsilan)-behandelte Objektträger. OTS-Objektträger wurden nach einer Prozedur hergestellt, die in Brake, J. M., Abbott, N. L. Langmuir 2002, 18, 6101–6109 beschrieben ist. In Kürze, man ließ eine Lösung von 10 mM OTS in n-Heptan durch eine Säule von Aluminiumoxid fließen, um sämtliches Restwasser zu entfernen. Mit Piranha gereinigte Glasobjektträger wurden dann für 30 Minuten in die OTS/n-Heptan-Lösung getaucht. Die Objektträger wurden mit Methylenchlorid gespült und unter einem Strom von gasförmigem N2 getrocknet. Die OTS-Objektträger wurden dann auf homöotrope Anordnung getestet, indem man die Ausrichtung von 5CB beobachtete, das zwischen zwei OTS-Objektträgern eingepackt war. Jeder Objektträger, bei dem keine homöotrope Anordnung induziert war, wurde verworfen.
  • Alternative Materialien für die Einfangoberfläche. Neben Gold umfassen andere alternative Oberflächenbeschichtungen Silber, Metall, Metalloxid, Polymer, Silizium, Glasoberfläche, sind aber nicht beschränkt darauf. Neben Gold schließen andere alternative Oberflächenbeschichtungen Silber, Kupfer, Edel- und Münzmetalle, Metalloxide einschließlich Titanoxiden, Polymere, Silizium, und eine Vielzahl von Glassorten ein, sind aber nicht beschränkt darauf. Man kann eine Vielzahl von Substraten verwenden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf durch Reiben behandelte Polymerfilme einschließlich Polyimiden, Oberflächen mit Topographie, Oberflächen, die durch Nanoformung und Mikroformung hergestellt worden sind, Oberflächen, die durch Behandlung mit UV-Licht präpariert worden sind, um Flüssigkristalle auszurichten (Photo-Alignment-Schichten), Oberflächen, die mit polymeren Bürsten behandelt worden sind, Oberflächen, die gedehnt worden sind, um Flüssigkristalle anzuordnen, durch Reiben behandelte Proteinfilme, schief abgeschiedene organische und anorganische Materialien, mechanisch polierte Oberflächen, anorganische Filme, die organische Einzel- und Mehrfachschichten tragen, Oberflächen, auf denen Polymere und Polyelektrolyte adsorbiert worden sind, Glasoberflächen, Glasoberflächen, die mit Silan-basierten Einzelschichten behandelt worden sind, Gold- und Silberfilme auf organischen Schwefelverbindungen. Der Träger für die Nachweisoberfläche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht sonderlich beschränkt, solange der Träger Flüssigkristall gleichmäßig verankern kann oder behandelt werden kann, so dass er einen Flüssigkristall gleichmäßig verankern kann. Bevorzugte Träger schließen Polymere und Silicahaltige Materialien ein, die Hydroxylgruppen zur Reaktion mit Oberflächenmodifizierenden Verbindungen oder Agenzien enthalten. Beispiele für polymere Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Polystyrol, Polycarbonate und Polymethylmethacrylat, die bevorzugt Plasma-behandelt werden, um Hydroxyl- oder Carbonsäure-Funktionalitäten zu präsentieren. Silikon-Elastomere können ebenfalls verwendet werden. Andere Materialien, die für eine Verwendung als als Träger geeignet sind, umfassen Metalloxide wie z. B., aber nicht beschränkt auf Indiumoxid, Zinnoxid und Magnesiumoxid und Metalle wie z. B., aber nicht beschränkt auf Gold, Silber und Platin, die man bevorzugt mit einer Schwefel-haltigen Verbindung umsetzt, die eine reaktive Funktionalität wie z. B. eine Hydroxyl- oder eine Carbonsäuregruppe enthält. Noch andere Materialien, die als Träger verwendet werden können, umfassen Cellulose-haltige Materialien wie z. B. Nitrocellulose, Holz, Papier sowie Karton und Sol-Gel-Materialien. Besonders bevorzugte Träger umfassen Glas, Quarz und Silica und die am meisten bevorzugten Träger umfassen Glas-Objektträger und Silica-Wafer. Bevorzugt werden solche Träger vor der Verwendung gereinigt. Fachleute werden erkennen, dass Oberflächen zur Verwendung in dieser Erfindung nicht auf die vorstehend aufgeführten beschränkt sind.
  • Chemische Funktionalisierung der Einfangoberfläche
  • Alternativen zur Funktionalisierung einer Gold- oder Silberoberfläche umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Thiole oder Disulfide, die mit einem Amin, Alkohol, Aldehyd, Methyl, Allyl, Carbonyl, Carboxyl, Nitril, Nitro, Thiol, Ethylenglykol, Aminoethylenglykol oder Ferrocenyl abschließen. In manchen Ausführungsformen ist es wünschenswert, die vorherigen funktionellen Gruppen mit einer reaktiven Einheit wie NHS, SPDP oder Maleimid zu aktivieren (www.dojindo.com).
  • Ähnlich gibt es einige Alternativen, die für die Funktionalisierung von Silizium-basierten oder glasartigen Substraten zur Verfügung stehen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Silane, die mit Amin, Alkohol, Aldehyd, Methyl, Allyl, Carbonyl, Carboxyl, Nitril, Nitro, Thiol, Ethylenglykol oder Aminoethylenglykol abschließen. In manchen Ausführungsformen ist es wünschenswert, die vorherigen funktionellen Gruppen mit einer reaktiven Einheit wie NHS, SPDP oder Maleimid zu aktivieren (www.dojindo.com).
  • In manchen bevorzugten Ausführungsformen hängt die Auswahl der Chemie zur Funktionalisierung der Oberflächen von der Art des Liganden ab, der an die Oberfläche angeheftet werden soll. In der folgenden Tabelle werden einige beispielhafte funktionelle Gruppen zur Verwendung bei der Anheftung verschiedener Biomoleküle oder Verbindungen mit speziellen funktionellen Gruppen, die für die Anheftung an die funktionalisierte Oberfläche zur Verfügung stehen, dargestellt.
    Biomoleküle Amin Thiol Aldehyd Streptavidin-Biotin
    Saure Peptide/Proteine – + – (#)
    Neutrale Peptide/Proteine ÷ (+) (#) (#)
    Basische Peptide/Proteine ÷ (+) (#) (#)
    Nucleinsäuren – – – #
    Polysaccharide – – – #
    + empfohlen (+) akzeptabel – ungeeignet # erfordert Modifikation des Liganden
    Funktionelle Gruppen Amin Thiol Aldehyd Streptavidin-Biotin
    Peptide/Proteine
    -NH2 + (#) – (#)
    -SH – + – (#)
    -COOH – (#) – (#)
    -CHO – – # (#)
    Polysaccharide
    -CHO – – (#) #
    -COOH – (#)
    + empfohlen (+) akzeptabel – ungeeignet # erfordert Modifikation des Liganden
  • Die Auswahl der Thiolkopplung hängt von der Verfügbarkeit von Thiolgruppen auf dem Liganden ab. Thiolkopplung kann für stark reduzierende Bedingungen ungeeignet sein, da die Disulfidbindung unter solchen Bedingungen nicht stabil ist. Polysaccharide und Glycokonjugate haben cis-Diol- und Sialinsäuren, die leicht zu Aldehyden oxidiert werden. Daher kann in manchen Ausführungsformen für diese Fälle eine Aldehydkopplung verwendet werden. In anderen Ausführungsformen, speziell wenn weder eine Amin- noch eine Thiolkopplung geeignet ist, ist Streptavidin-Biotin ein bevorzugtes Kopplungspaar.
  • Typische NHS-EDC-Prozedur
    • (1) Es werden Lösungen von NHS (0,1 M) und EDC (0,4 M) in destilliertem deionisiertem Wasser hergestellt.
    • (2) Die Immobilisierungsoberfläche mit terminalen Carbonsäuregruppen wird mit PBS äquilibriert.
    • (3) Die Carbonsäuregruppen an der Oberfläche werden zu NHS-Estern umgewandelt, indem man ein Gemisch von 0,05 M NHS und 0,20 M EDC in H2O für 7 Min. über die Oberfläche leitet.
    • (4) Die Oberfläche wird für 2 Min. mit PBS gespült.
    • (5) Die Lösung des zu immobilisierenden Proteins oder Liganden wurde für 7 Min. über die Oberfläche gespritzt, was zur Bildung einer Amidbindung durch Verdrängung der NHS-Ester führte.
    • (6) Die Oberfläche wird mit PBS gespült und überschüssige NHS-Ester werden durch Waschen (5–20 Min.) mit Natriumphosphat-Puffer, pH 8,6, (25 mM) inaktiviert.
  • Immobilisierung von Proteinen auf PDMS mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan
  • Nachstehend werden Reaktionsschemata diskutiert, die die Schritte veranschaulichen, die man bevorzugt in dem Prozess zur kovalenten Immobilisierung eines mit einem Amin abschließenden Rezeptors auf einem PDMS-Stempel über eine durch das Amin eingeleitete nucleophile Ringöffnungsreaktion verwendet. Die Oberfläche eines PDMS-Stempels wird zuerst mit O2-Plasma oxidiert. Die oxidierte Oberfläche wird dann mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPS) durch Eintauchen in eine Lösung von GPS (0,1% Vol./Vol. in wasserfreiem Toluol) für 30 Min. bei 40°C umgesetzt. Die Oberfläche wird dann mehrere Male in wasserfreiem Toluol gewaschen und in einem Ofen für 20 Min. bei 110°C ausgehärtet. Proteine werden dann kovalent an die Epoxygruppe der Oberfläche gebunden, indem man einen Tropfen von in PBS aufgelöstem Protein daraufsetzt. Die Oberfläche wird für 1–2 Stunden in einer zugedeckten Petrischale inkubiert, die mit Wasser getränkte Baumwolle enthält, um eine gleichbleibende befeuchtete Umgebung aufrechtzuerhalten.
  • Immobilisierung von Proteinen auf PDMS mit 3-(Triethoxvsilyl)propylisocyanat
  • Die Oberfläche eines PDMS-Stempels wird zuerst mit O2-Plasma oxidiert. Die oxidierte Oberfläche wird für 2 Stunden bei 40°C in einer Toluollösung inkubiert, die 3% Gew./Vol. 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat enthält. Die Oberfläche wird dann mit Toluol, Hexan und Ether gespült und gründlich mit einem Strom von Stickstoff getrocknet. Ein kleiner Tropfen von in PBS aufgelöstem Protein wird auf eine mit Isocyanat derivatisierte Oberfläche gesetzt. Die Oberfläche wird 1–2 Stunden in einer zugedeckten Petrischale inkubiert, die mit Wasser getränkte Baumwolle enthält, um eine gleichbleibende befeuchtete Umgebung aufrecht zu erhalten.
  • Immobilisierung von Proteinen auf mit Thionylchlorid aktiviertem Glas oder auf PDMS
    • (1) Bereiten Sie einen sauberen Glasobjektträger durch Reinigen mit Piranha-Lösung oder konzentrierter Salpetersäure vor. Oder es wird ein PDMS mit einer dünnen Siliziumoxid-Schicht hergestellt, indem man die Oberfläche mit O2-Plasma oxidiert.
    • (2) Man erzeugt eine Oberfläche mit primärem Amin, indem man entweder Glas oder oxidiertes PDMS für 1 Stunde bei 80°C in eine wässrige Lösung von 10% 3-Aminopropyltriethoxysilan taucht.
    • (3) Spülen Sie die Oberfläche mit Wasser, trocknen Sie sie in einem Ofen und spülen Sie sie mit Aceton.
    • (4) Tauchen Sie die Oberfläche in eine Lösung, die 1% (Vol/Vol.) Triethylamin und 10% (Vol./Vol.) Bernsteinsäureanhydrid in Aceton enthält.
    • (5) Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist (10–20 Min. bei Raumtemperatur), spülen Sie das Succinamidopropyl-Glas oder das PDMS gründlich mit Aceton und Methylenchlorid.
    • (6) Tauchen Sie die Oberfläche in Thionylchlorid und lassen Sie sie auf einem Heizmantel für 1 Stunde bei 60°C reagieren.
    • (7) Spülen Sie die aktivierte Oberfläche nach der Reaktion mit Methylenchlorid, Aceton und Wasser.
    • (8) Trocknen Sie die Oberfläche bei 110°C und lagern Sie sie getrocknet bei Raumtemperatur, bis sie für die Immobilisierung benötigt wird.
    • (9) Äquilibrieren Sie die mit Thionylchlorid aktivierte Oberfläche in PBS.
    • (10) Setzen Sie darauf einen Tropfen des Antikörpers über Nacht bei 4°C.
    • (11) Tauchen Sie die Oberfläche nach der Immobilisierung für 2 Stunden in 1,0 M Glycinmethylester in PBS, um unreagierte, mit Thionylchlorid aktivierte Stellen zu blockieren.
    • (12) Waschen Sie die Oberfläche mit PBS und lagern Sie sie in PBS bis zur Verwendung.
  • Immobilisierung von Proteinen mit Histidin-Markern auf einer mit Nitrilotriessigsäure (NTA) abschließenden Oberfläche
  • In manchen Ausführungsformen werden SAMs auf einer Goldoberfläche gebildet, indem man die Oberfläche für mehr als 12 Stunden in Ethanol-Lösungen taucht, die 1 mM gemischte Alkanthiole enthalten (mit NTA abschließende Alkanthiole und mit Ethylenglykol abschließendes Alkanthiol).
    • (1) Nachdem sie in Ethanol gespült und unter Stickstoff getrocknet worden sind, werden die SAMs für 1 Stunde in eine 40 mM Lösung von NiSO4 in Wasser (pH 7,2) getaucht.
    • (2) Die SAMs werden dann für 10 s mit einer PBS-Lösung (pH 8,2) gespült und mit einem Strom von Stickstoff getrocknet.
    • (3) Die Proteinbindung wird durch Inkubation der SAMs in PBS durchgeführt, das 0,1 μM des Proteins mit dem Histidin-Marker enthält.
    • (4) Die Substrate werden dann mit PBS (pH 8,2) gespült und entweder unter einem Stickstoffstrom getrocknet oder bis zur Verwendung in PBS (pH 7,4) gelagert.
  • Immobilisierung von Proteinen durch Einführung von reaktiven Maleimidgruppen
    • (1) Die carboxymethylierte Matrix wird mit 10 mM Hepes, pH 7,4, 150 mM NaCl und 3,4 mM EDTA (HBS) äquilibriert.
    • (2) Die Oberfläche wird durch Aufspritzen eines Gemisches von 0,05 M NHS/0,2 M EDC in Milli-Q-Wasser für 7 Min. bei einer Flussrate von 5 μl/min aktiviert.
    • (3) Nach Aktivierung der Oberfläche mit NHS/EDC wurden durch Aufspritzen von 1,0 M Ethylendiamin (pH 6,0) für 10 Min. bei 5 μl/min Aminogruppen erzeugt.
    • (4) Um Maleimidgruppen einzuführen, wird die Oberfläche für 30 Min. bei 5 μl/min 15 mM N-(4-Maleimidobutyryloxy)succinimid in HBS/Ethanol (1:1) ausgesetzt.
    • (5) Nach dem Ersetzen des Puffers auf der Flusszelle mit 10 mM Na-Acetat, pH 6,0 und 0,15 M NaCl (ABS) wird das Protein in ABS für 25 Min. bei 2 μl/min aufgespritzt.
    • (6) Unreagierte Maleimidgruppen werden durch Aufspritzen von 10 mM Dithiothreit für 2 Min. bei 5 μl/min blockiert.
    • (7) Am Ende der Immobilisierung wurden 40 μl 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M KCl, 1 mM EDTA und 1 mM DTT bei 5 μl/min aufgespritzt, um die Oberfläche zu waschen.
  • Gleichmäßige Abscheidung von Goldfilmen. Zur Verwendung in Kombination mit Ellipsometrie wurden Goldfilme mit einer Dicke von ~500 Å auf Silizium-Wafer (Silicon Sense, Nashua, NH) abgeschieden, die auf Planetenrotoren montiert waren (keine bevorzugte Richtung oder kein bevorzugter Einfallswinkel), indem man einen Elektronenstrahlverdampfer (VES-3000-C, hergestellt von Tek-Vac industries, Brentwood, NY) verwendete. Die Rotation der Substrate auf den Planetenrotoren stellte sicher, dass das Gold ohne eine bevorzugte Einfallsrichtung abgeschieden wurde. Man verwendete eine Schicht Titan (Dicke ~100 Å), um die Adhäsion zwischen dem Glas-Objektträger und dem Goldfilm zu fördern. Die Abscheideraten von Gold und Titan waren 0,2 Å/s. Der Druck in dem Verdampfer während jeder Abscheidung war weniger als 5 × 10–7 Torr.
  • Halbdurchsichtiges Gold. Zur Verwendung in Kombination mit Flüssigkristallen wurden halbdurchsichtige Goldfilme mit einer Dicke von ~140 Å auf saubere Glas-Objektträger aufgetragen, die auf stationären Haltern montiert waren, indem man den vorstehend beschriebenen Elektronenstrahlverdampfer verwendete. Anisotropes Gold (schief abgeschiedenes Gold) wurde aus einem festen Einfallswinkel von 0° (gemessen von der Normalen zur Oberfläche) abgeschieden. Man verwendete eine Titanschicht (Dicke ~55 Å), um die Adhäsion zwischen dem Glas und dem Goldfilm zu fördern.
  • Amin-SAMs. Auf den Oberflächen der Goldfilme wurden selbst-angeordnete Einzelschichten durch Eintauchen in Ethanol-Lösungen, die 1 mM 2-Mercaptoethylamin (NH2(CH2)2SH, Sigma) enthielten, gebildet. Nach 6 Stunden Eintauchen bei Raumtemperatur wurden die Objektträger herausgenommen, mit Ethanol gespült und dann unter einem Strom von gasförmigem N2 getrocknet. Einige der mit Amin abschließenden SAMs wurden mit HCl vorbehandelt, indem das Substrat für 15 Sekunden in 0,1 oder 1 N HCl-Lösungen getaucht, dann herausgenommen und unter einem Strom von gasförmigem N2 getrocknet wurde.
  • Herstellung von Affinitätsstempeln. PDMS-Stempel wurden hergestellt, indem man Sylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI) auf eine mittels Photolithographie hergestellte Silizium-Vorlage goss. Die Vorlage wurde über Nacht unter Vakuum mit (Tridecafluor-1,1,2,2,-terahydrooctyl)-1-trichlorsilan-Dampf silanisiert, um die Ablösung des PDMS zu unterstützen. Das PDMS wurde über Nacht bei 80°C ausgehärtet. Der Elastomer-Stempel wurde abgezogen, was das Negativmuster der Silizium-Vorlage ergab. Das PDMS wurde in 1 cm × 1 cm große Stempel geschnitten und dann mit PlasmaTherm 1441 RIE (8 sccm, 20 Sekunden, 100 W) oxidiert, um eine dünne Schicht aus Siliziumoxid auf der Oberfläche zu bilden. Das oxidierte PDMS wurde mit einem primären Amin funktionalisiert, indem man es für 1 Stunde bei 80°C in 10% 3-Aminopropyltriethoxysilan (APES; Aldrich) in Wasser eintauchte. Die Oberfläche wurde durch 15-minütige Exposition gegenüber 1 mM BS3 (Bis[sulfosuccinimidyl]-suberat, Pierce) mit einem NHS-Ester aktiviert. Biotinyliertes BSA (Pierce) wurde kovalent an den Affinitätsstempel immobilisiert, indem man den aktivierten Stempel für 2–8 Stunden mit 2 mg/ml biotinyliertem BSA in PBS bedeckte.
  • Alternativen zu PDMS zur Herstellung von Stempeln umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hydrogel (Ref. Langmuir 2000, 16, 9944–9946, Langmuir, 1998, 14 (15), 3971–3975), Elastomere (Siloxan (PDMS), Silikon, Polyolefin, Kohlenwasserstoffgummi, chlorsulfoniertes Polyethylen, Polychloropren, chloriertes Polyethylen) (Ref. www.dupont-dow.com), Gummi, andere Polymere (Polyanilin, Polypyrrol) (Ref. Synthetic Metals, 1997, 84 (1–3), 27–34).
  • Stempelprozedur. Der Stempel wurde eingefärbt, indem der ganze Stempel mit Antikörper-Lösung (1 mg/ml in PBS, 5 Std.) bedeckt wurde. Der eingefärbte Stempel wurde für 15 s mit Wasser gespült, dann mit N2 getrocknet. Der Stempel wurde mit der mit Amin abschließenden SAM in Kontakt gebracht, die für 30 Sekunden mit HCl vorbehandelt worden war, wobei für die ersten 3 Sekunden ein leichter Druck ausgeübt wurde. Der Stempel wurde dann abgelöst. Wenn man von einem Stempel druckte, der auf einem zylindrischen Träger montiert war, wurde der eingefärbte Stempel mit Klebeband an einem 20 ml-Szintillationsgefäß befestigt und dann langsam für einen Zeitraum von ungefähr 30 Sekunden über das Substrat gerollt.
  • Direkte Adsorption. Gleichmäßig abgeschiedene Goldfilme wurden mit mit Amin abschließenden SAMs bedeckt, dann mit 0,1 M HCl vorbehandelt. Diese Goldoberflächen wurden dann mit Anti-Biotin-IgG-Lösung (1 mg/ml in PBS, 5 Std. oder 24 Std.) bedeckt.
  • Optische Zellen. Optische Zellen wurden hergestellt, indem man einen Objektträger, der mit Protein bestempelt war, mit einem mit OTS behandelten Glas-Objektträger zusammenbrachte. Die Objektträger wurden so angeordnet, dass sie einander gegenüberlagen. Die Objektträger wurden durch Einfügen eines dünnen Films von Saran-Wrap (~12 μm) oder Mylar (mit einer Dicke von ~13 μm) am Rand der Glas-Objektträger auseinandergehalten. Die Zellen wurden durch Bulldogklemmen zusammengehalten. Die Zellen wurden durch Legen auf eine Heizplatte auf ~40°C aufgeheizt. Das 5CB, das in einer Glasspritze in seine isotrope Phase (> 35°C) aufgeheizt worden war, wurde auf den Rand jeder Zelle auf der Heizplatte verteilt. Die Dicke des IC-Films (13 μm ± 2 μm) wurde, wie in (**Ref. 37) beschrieben, gemessen. Das 5CB wurde durch Kapillarkräfte in den Raum zwischen den zwei Oberflächen gezogen. Die Zelle wurde dann langsam über 1 Stunde in einem Ofen von 36°C auf 33°C abgekühlt. Beim Abkühlen ging das 5CB von der isotropen in die nematische Phase über.
  • Bilderfassung. Bilder der Flüssigkristalle wurden mit einer CCD-Kamera (DXC-151A, Sony, Park Ridge, NJ) oder einer Digitalkamera (Olympus C-2020-Zoom) und einer Framegrabber-Software (Mediagrabber, Rasterops Inc., Santa Clara, Ka.) aufgenommen, die an ein Polarisationslichtmikroskop (BX60, Olympus, Tokio, Japan) angeschlossen waren. Durchgängige Einstellungen der Lichtquelle des Mikroskops (50% Maximalintensität, 50% offene Blende, 4X oder 10X Vergrößerung und kein Kondensor) und der CCD-Kamera oder Digitalkamera (f-Stop 11) (keine automatische Farbkorrektur, Verschlusszeit 1/100 Sek. für 10X).
  • Ellipsometrie. Ellipsometrische Messungen wurden durchgeführt, um die optischen Dicken von SAMs und von Proteinfilmen zu bestimmen. Die optische Dicke, die für jede Probe angegeben ist, ist der Mittelwert von 3 Substraten, wobei jedes Substrat dreimal an verschiedenen Stellen gemessen wurde. Die Messungen wurden mit einem Rudolph Auto EL-Ellipsometer (Flanders, NJ) bei einer Wellenlänge von 6320 Å und einem Einfallswinkel von 70° durchgeführt. Die Goldsubstrate, die für die ellipsometrischen Messungen verwendet wurden, waren gleichmäßig abgeschiedene Goldfilme. Die ellipsometrischen Dicken von SAMs und immobilisierten Proteinen wurden unter Verwendung eines Dreischichten-Modells und unter der Annahme eines Refraktionsindex von 1,45 für sowohl die Einzelschicht als auch das Protein geschätzt.
  • Experimentelle Ergebnisse
  • Beispiel 1. Design von Oberflächen für Affinitätsmikrokontakt-Drucken. Im vorliegenden Beispiel wurde eine Nachweisoberfläche verwendet, die eine SAM aufwies, die die folgenden Eigenschaften besaß: (I) hydrophil, (II) ordnet Flüssigkristalle gleichmäßig an, (III) Protein löst sich nicht von der SAM ab, wenn es mit Flüssigkristall oder einem wässrigen Puffer in Kontakt gebracht wird. Mit einem Amin abschließende SAMs sind hydrophil. Harnett et al., App/Phys Lett 2000, 76, 2466–2468, Dulcey et al., Science, 1991, 252, 551–554. Vorarbeiten haben auch gezeigt, dass Oberflächen, die mit primären Aminen beschichtet sind, biologische Materialien aus Lösung unspezifisch adsorbieren. Demzufolge wurden in dem vorliegenden Beispiel mit Amin abschließende SAMs eingesetzt. Die endgültige Eigenschaft, die für die Nachweisoberfläche angestrebt wurde, war eine gleichmäßige Anordnung von Flüssigkristall. Um zu bestimmen, ob die mit einem Amin abschließende SAM den Flüssigkristall 5CB gleichmäßig anordnen würde, wurde eine Sandwich-Zelle erzeugt, in der der Flüssigkristall 5CB zwischen zwei Substrate eingelegt war (Dicke des Flüssigkristalls: ~12 μm). Das untere Substrat war eine mit einem Amin abschließende SAM auf schief abgeschiedenem Gold. Das obere Substrat war ein Glas-Objektträger, der mit OTS funktionalisiert war.
  • Ein mit OTS behandelter Objektträger wurde als oberes Substrat verwendet, da berichtet worden ist, dass OTS eine homöotrope Anordnung von Biphenyl-Lcs verursacht, insbesondere von 5CB. Cognard, J. Molecular Crystals and Liquid Crystals, 1982, 1–77 und Yang et al., Microchemistry Proceedings, 1994, 441–454. Bei homöotroper Anordnung ist die mittlere Ausrichtung der Längsachse von 5CB normal zur Oberfläche. Polarisiertes Licht, das durch den Flüssigkristall hindurch geleitet wird, sieht keine Anisotropie im Refraktionsindex. Daher beeinflusst die OTS-Oberfläche die optischen Abbildungen nicht und demnach werden in den optischen Abbildungen des Flüssigkristalls nur die Oberflächeninteraktionen an dem Goldsubstrat angezeigt.
  • 2A zeigt die optische Abbildung einer Sandwich-Zelle mit einer mit einem Amin abschließenden SAM auf einem Substrat und OTS auf dem anderen nach 1 Stunde in einem 36°C-Ofen. Bei einer Probenausrichtung von 0° auf dem Objekttisch wurde die geringste Menge Licht beobachtet, das durch die gekreuzten Polarisatoren hindurch kam. Die Ausrichtung der Probe auf dem Objekttisch ist der Winkel zwischen der Einfallsrichtung des schief abgeschiedenen Golds (maximale Rauheit der Goldoberfläche) und dem unteren Polarisator auf dem Polarisationslichtmikroskop. Dies zeigt an, dass die mittlere Ausrichtung von 5CB in derselben Richtung liegt wie einer der Polarisatoren bei einer Ausrichtung der Probe von 0°, weil das polarisierte Licht keine Doppelbrechung erfährt und daher durch die gekreuzten Polarisatoren ausgelöscht wird. Bei einer Ausrichtung der Probe von 45° erfährt das polarisierte Licht das größte Ausmaß an Doppelbrechung, was dazu führt, dass die größte Lichtmenge durch die gekreuzten Polarisatoren hindurchgeht. Aus dieser Beobachtung hat man geschlussfolgert, dass der Flüssigkristall durch die Oberfläche der Amin-SAM gleichmäßig angeordnet wird.
  • Indem man mit mit einem Amin abschließenden SAMs an beiden Oberflächen eine keilförmige Zelle herstellte (Spacer an dem einen Ende, aber nicht an dem anderen) und die Veränderung in den Interferenzfarben nach Einschieben einer Viertelwellenlängeplatte beobachtete, stellte man fest, dass die azimuthale Ausrichtung des Flüssigkristalls auf der mit einem Amin abschließenden SAM in der Richtung der minimalen Rauheit der Goldoberfläche lag (rechtwinklig zur Richtung der maximalen Rauheit). Eine ausführlichere Beschreibung der Bestimmung der azimuthalen Ausrichtung des Flüssigkristalls wird in Luk et al., Langmuir 2003, 19, 1671–1680 gegeben.
  • In 2A waren auch viele Liniendefekte in der Anordnung des Flüssigkristalls zu sehen, die Domänen des Flüssigkristalls darstellen, die keine bevorzugte Ausrichtung (isotrop) besitzen. Die Zelle wurde erhitzt, um zu bestimmen, ob es möglich war, die Defekte zu entfernen. Nach Erhitzen der Probe in 2A für 18 Stunden in einem Ofen auf 36°C und Zurückkühlen auf Raumtemperatur wurde die Ausrichtung des Flüssigkristalls auf beiden Oberflächen homöotrop (2B). 36°C ist über der Clearing-Temperatur für 5CB (~35°C). Die Clearing-Temperatur ist die Temperatur, an der die Mesogene von einer flüssigkristallinen in eine isotrope Phase übergehen. Die homöotrope Anordnung wurde mittels Konoskopie nachgewiesen. Eine ausführlichere Beschreibung der Bestimmung der homöotropen Anordnung durch Konoskopie wird in Brake, J. M., Abbott, N. L., Langmuir 2002, 18, 6101–6109 gegeben. Bei den meisten Proben, die auf 36°C erhitzt werden, erfolgt der Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung nach ~8 Stunden Erhitzen. Bei Proben, die man bei Raumtemperatur stehen lässt, erfolgt der Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung nach ~6 Tagen. Demzufolge zog man daraus die Schlussfolgerung, dass Erhitzen des Flüssigkristalls über die Clearing-Temperatur die Zeit für den Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung verkürzt.
  • Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bildung einer elektrischen Doppelschicht an einer Oberfläche, die mit einem Flüssigkristall in Kontakt ist, homöotrope Anordnung induzieren kann. Zum Beispiel führt der Kontakt von 5CB mit Oberflächen, die Natriumcarboxylat präsentieren, zum Übergang von 5CB von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung. Die ionischen Spezies in 5CB, welche die elektrische Doppelschicht bilden, sind am Ende ihrer Synthese vorhanden und werden durch den chemischen Abbau der Moleküle innerhalb des Flüssigkristalls oder durch lonisierung von mitgeführtem Wasser (H+ und OH–) gebildet. Shah, R. R., Abbott, N. L. J Phys Chem B 2001, 105, 4936–4950. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass das elektrische Feld, das durch die elektrische Doppelschicht induziert wird, in der Lage ist, 5CB auf Grund seiner positiven dielektrischen Anisotropie (Unterschied in der dielektrischen Konstante zwischen der Längsachse und der Kurzachse) in einer homöotropen Anordnung anzuordnen. Diese Schlussfolgerung wurde durch die Beobachtung unterstützt, dass ein Flüssigkristall, der eine negative dielektrische Anisotropie aufweist (MBBA), keinen Übergang zu einer homöotropen Anordnung zeigt. MBBA-Flüssigkristall-Zellen wurden mit mit einem Amin abschließenden SAMs und OTS gebildet. Selbst nach 21 Tagen Erhitzen der Proben über die Clearingtemperatur und nachfolgender Abkühlung auf Raumtemperatur zeigte der MBBA-Flüssigkristall eine planare Verankerung. Dies ist in Übereinstimmung mit der Hypothese, dass der Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung durch die Bildung einer elektrischen Doppelschicht verursacht wird.
  • Man hatte die Hypothese aufgestellt, dass die Bildung der elektrischen Doppelschicht mit dem Vorliegen einer Ammoniumspezies auf der Oberfläche zusammenhängt. Dementsprechend untersuchte man die mögliche Rolle von Ammoniumgruppen, indem man die Oberfläche mit einer Säure behandelte. Eine Vergrößerung der Zahl der NH3 +-Gruppen auf der Oberfläche verringert die Verankerungsenergie des Flüssigkristalls. 2C zeigt die optische Abbildung des Flüssigkristalls, wenn die mit einem Amin abschließende SAM mit 0,1 N HCl vor behandelt worden war. Durch Vergleich der 2A und 2C beobachtete man, dass die Vorbehandlung der mit einem Amin abschließenden SAM mit 0,1 N HCl die Zahl von Defekten in dem Flüssigkristall verringert. Die Abnahme in der Zahl der Defekte, die man bei einer Vorbehandlung der mit einem Amin abschließenden SAM mit 0,1 N HCl sieht, steht im Einklang mit einer Verringerung in der planaren Verankerungsenergie des Flüssigkristalls, was zu weniger festgestellten Defektlinien führt. Die Verringerung der planaren Verankerungsenergie vorbehandelter Oberflächen im Vergleich zu nicht vorbehandelten Oberflächen steht im Einklang mit dem Vorliegen einer höher geladenen Oberfläche. Daraus folgt, dass Vorbehandeln der mit einem Amin abschließenden SAM mit einer Säure die gleichmäßige Anordnung des Flüssigkristalls verbessert. In 2D wurde ein ähnlicher Übergang von einer planaren Anordnung zu einer homöotropen Anordnung bei der mit einem Amin abschließenden SAM gesehen, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt war, gegenüber der mit einem Amin abschließenden SAM, die nicht vorbehandelt war (2B).
  • Die Dicke der mit einem Amin abschließenden SAMs, die mit HCl behandelt worden waren, wurde auch vor dem Affinitätsmikrokontakt-Drucken gemessen. Bei mit einem Amin abschließenden SAMs, die mit 0, 0,1 und 1 N HCl behandelt worden waren, betrug die gemessene ellipsometrische Dicke 1,3, 1,3 bzw. 1,0 ± 0,2 nm. Da HCl bei Raumtemperatur ein Gas ist und die ellipsometrische Dicke der mit einem Amin abschließenden SAM sich nicht bei verschiedenen Konzentrationen der Säurebehandlung verändert, folgt daraus, dass es keine signifikante Anreicherung von Salzen auf den Oberflächen in Folge der Säurebehandlung gibt.
  • Beispiel 2 Verwenden von Ellipsometrie, um das Affinitätsmikrokontakt-Drucken von Proteinen zu bestätigen. Der Transfer von Proteinen von dem Affinitätsstempel auf die mit einem Amin abschließenden SAM, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden ist, wurde durch Ellipsometrie bestätigt. Für die Ellipsometrie wurden flache PDMS-Stempel verwendet. Der Stempel wurde zuerst mit einem O2-Plasma oxidiert und dann mit einem primären Amin funktionalisiert, indem man Silanchemie (Aminopropyltriethoxysilan) verwendete. Biotinyliertes BSA wurde dann kovalent über Bis[sulfosuccinimidyl]suberat (BS3) an dem Stempel befestigt. Der Stempel wurde eingefärbt, indem ein Tropfen Anti-Biotin-IgG (1 mg/ml in PBS) für 5 Stunden auf die Oberfläche des Stempels gesetzt, dann für 15 Sekunden mit Wasser gespült wurde. Der Stempel wurde dann für 30 Sekunden mit der mit einem Amin abschließenden SAM in Kontakt gebracht. Es wurde eine Veränderung in der ellipsometrischen Dicke von 10,8 ± 0,4 nm beim Stempeln des eingefärbten Anti-Biotin-IgG von dem Affinitätsstempel gemessen. In früheren Arbeiten ist von einer ähnlichen Veränderung in der ellipsometrischen Dicke (10 nm) für die Bindung von Anti-Biotin-IgG an immobilisiertes biotinyliertes BSA berichtet worden. Kim, S, R., Abbott, N. L. Langmuir 2002, 18, 5269–5276. In dem Kontrollexperiment wurde ein Affinitätsstempel mit biotinyliertem BSA eingefärbt, indem ein Tropfen von nicht-spezifischem Antikörper (Anti-Ziege-IgG, 1 mg/ml in PBS) für 5 Stunden auf die Oberfläche des Stempels gesetzt wurde. Der mit Anti-Ziege-IgG eingefärbte Stempel wurde dann auf dieselbe Weise gedruckt wie der mit Anti-Biotin-IgG eingefärbte Stempel. Die Veränderung in der ellipsometrischen Dicke bei dem Kontrollexperiment war 2,3 ± 0,2 nm. Diese Ergebnisse bestätigen den spezifischen Einfang und Transfer von Protein von dem Affinitätsstempel auf die mit einem Amin abschließende SAM, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden war.
  • Indem man dieselbe Konzentration und Einwirkzeit verwendete (1 mg/ml, 5 Std.), verglich man die Menge an Protein, die durch Affinitätsmikrokontakt transferiert wurde, mit dem Drucken über direkte Adsorption. Die Veränderung in der ellipsometrischen Dicke durch direkte Adsorption aus Lösung für Anti-Biotin-IgG ist 6,7 ± 0,2 nm. Selbst bei Proben, die für 24 Stunden eingetaucht wurden, war die Veränderung in der ellipsometrischen Dicke nicht größer als 6,7 nm. Ohne den Geltungsbereich der Erfindung einzuschränken, nimmt man an, dass die größere Zunahme der ellipsometrischen Dicke bei Verwendung des Affinitätsmikrokontakt-Druckens wahrscheinlich die Folge einer höheren Packungsdichte des Anti-Biotin-IgG auf dem Affinitätsstempel im Vergleich zu der direkten Adsorption von Anti-Biotin-IgG ist.
  • Um die Wirkung von Säurebehandlung auf den Transfer von Proteinen von dem Affinitätsstempel zu testen, variierte man die Konzentration der Säurebehandlung und maß die ellipsometrische Dicke. Die Veränderung in der ellipsometrischen Dicke für Affinitätsmikrokontakt-Drucken von Anti-Biotin-IgG auf mit einem Amin abschließende SAMs, die mit 0, 0,1 und 1 N HCl vorbehandelt worden waren, war 7,4, 10,8 bzw. 13,4 ± 0,4 nm. Daraus wurde geschlussfolgert, dass eine Erhöhung der Konzentration der Säurevorbehandlung der mit einem Amin abschließenden SAMs die Menge an Protein erhöht, die auf das Substrat transferiert wird.
  • Beispiel 3 Ausrichtungen von Flüssigkristallen auf Affinitätsmikrokontaktgedruckte Proteine. Als nächstes wurden die Ausrichtungen von Flüssigkristallen auf Proteinen untersucht, die auf mit einem Amin abschließenden SAMs durch Affinitätsmikrokontakt-Drucken abgeschieden worden waren. Der PDMS-Stempel, der für die Flüssigkristall-Experimente verwendet wurde, besaß einen Array von 300 × 300 μm großen quadratischen Stiften. Unter Verwendung derselben Prozedur, die vorstehend beschrieben ist, wurde der Stempel oxidiert und dann mit einem primären Amin funktionalisiert. Biotinyliertes BSA wurde kovalent an dem Stempel befestigt. Der Stempel wurde dann eingefärbt, indem man einen Tropfen Anti-Biotin-IgG (1 mg/ml in PBS) für 5 Stunden auf die Oberfläche des Stempels setzte, dann für 15 Sekunden mit Waser spülte. Der Stempel wurde dann für 30 Sekunden mit der mit einem Amin abschließenden SAM in Kontakt gebracht. Der Flüssigkristall 5CB wurde dann zum Nachweis des Proteins zwischen die beiden Oberflächen eingebettet. Die untere Oberfläche der Flüssigkristall-Zelle war die mit einem Amin abschließende SAM, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden war und die mit Antikörper Affinitätsmikrokontakt-bedruckt worden war. Die obere Oberfläche war OTS, das eine homöotrope Anordnung von 5CB ergibt.
  • 4.1A ist eine optische Aufnahme von Flüssigkristall, der von einer Oberfläche getragen wird, die mit Anti-Biotin-IgG gestempelt und langsam über 1 Stunde von 36°C auf 33°C abgekühlt worden ist. Die Probe wurde langsam abgekühlt, da eine schnelle Abkühlung auf Raumtemperatur zu mehr Defektlinien führt. Bei einer Ausrichtung der Probe auf dem Objekttisch von 0° sah man einen Array aus grünen Quadraten. Die Ausrichtung der Probe auf dem Objekttisch ist der Winkel zwischen der Einfallsrichtung von schief abgeschienem Gold (maximale Rauheit der Goldoberfläche) und dem unteren Polarisator an dem Polarisationslichtmikroskop. Der Hintergrund bei einer Ausrichtung der Probe von 0° ist schwarz. Bei einer Ausrichtung der Probe von 45° weist der Array der grünen Quadrate einige dunkle Bereiche auf und der Hintergrund ist insgesamt grün. Da die Quadrate dieselbe Größe haben wie die Stifte auf dem Affinitätsstempel nimmt man an, dass diese Bereiche Anti-Biotin-IgG immobilisiert haben. Die dunklen Bereiche werden so interpretiert, dass sie gleichmäßige Anordnung des Flüssigkristalls auf der mit einem Amin abschließenden SAM in derselben Richtung anzeigen wie einer der Polarisatoren. Unter Verwendung eines Michel-Levy-Diagramms kann man die effektive Doppelbrechung (Δneff) des Flüssigkristalls aus der grünen Farbe bestimmen. Die Dicke der Probe ist ~12 μm, demzufolge wurde die effektive Doppelbrechung dieser Probe aus dem Michel-Levy-Diagramm mit ~0,065 bestimmt. Der Neigungswinkel des 5CB auf der mit einem Amin abschließenden SAM wurde berechnet, indem man mit einer Beschreibung der effektiven Doppelbrechung, Δneff, eines geneigten doppelbrechenden Materials begann (Van Doorn et al., Influence of the Device Parameters an the Performance of Twisted-Nematic Liquid-Crystal Matrix Displays in The Physics and Chemistry of Liquid Crystal Devices; Plenum Press, New York, 1980),
    Figure 00600001
    Gleichung 1 wobei n|| = 1,7110 und n⏊ = 1,5296 die Refraktionsindices parallel bzw. senkrecht zur optischen Achse von 5CB bei 23°C sind. θ ist der Neigungswinkel von 5CB, gemessen relativ zur Normalen der Oberfläche.
  • Gleichung 2 folgt aus der Annahme, dass der Neigungswinkel von 5CB linear von der OTS-Oberfläche (θ1 = 0) zu der Goldoberfläche variiert, die mit einer mit einem Amin abschließenden SAM (θ2) bedeckt ist. In Gleichung 2 ist d die Dicke des Films von 5CB (~12 μm) und z die Position innerhalb des 5CB, wobei z = 0 die OTS-5CB-Grenzfläche repräsentiert.
  • Figure 00610001
    Gleichung 2
  • Indem man Gleichung 2 in Gleichung 1 einsetzt, gefolgt von Integration von Gleichung 1 über den Film, kann die effektive Doppelbrechung von
    Figure 00610002
    Gleichung 3 des 5CB-Films mit Hilfe von Gleichung 3 abgeschätzt werden.
  • Für eine effektive Doppelbrechung von ~0,065, berechnet sich der Neigungswinkel von 5CB auf der mit einem Amin abschließenden SAM mit ~70° von der Normalen der Oberfläche.
  • 4.1B zeigt die optische Aufnahme der Probe in 4.1A nach Erhitzen für 8 Stunden in einem 36°C warmen Ofen. In 4.1B wurde einer Veränderung in der Ausrichtung des Flüssigkristalls auf der mit einem Amin abschließenden SAM, die nicht mir Protein bedeckt war, von einer fast planaren (~70°) zu einer homöotropen Anordnung (~0°) beobachtet. Der durchgehend schwarze Hintergrund bei allen Ausrichtungen der Probe auf dem Objekttisch ist ein Hinweis auf eine homöotrope Anordnung. Die homöotrope Anordnung wurde auch durch Konoskopie bestätigt.
  • In diesem Beispiel wird auch untersucht, wie sich die Verankerung des Flüssigkristalls über die Zeit verändert. 3 zeigt die zeitliche Entwicklung einer Probe mit Anti-Biotin-IgG, das mittels Affinitätsmikrokontakt-Drucken gedruckt worden ist. Mit zunehmender Zeit im Ofen (5 und 7 Stunden) war eine Veränderung der Farbe des Hintergrunds (mit einem Amin abschließende SAM, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden war) von grün zu gelb zu sehen. Die Veränderung von grün zu gelb entspricht einer Veränderung hin zu Farben niedrigerer Ordnung auf dem Michel-Levy-Diagramm. Da sich die Dicke der Probe nicht verändert (~12 μm dicke Spacer), wurde diese Farbveränderung einer Veränderung in der effektiven Doppelbrechung von ~0,065 auf ~0,02 zugeschrieben. Dies entspricht einer Veränderung in dem Neigungswinkel relativ zur Normalen der Oberfläche von ~70° auf ~35° auf der mit einem Amin abschließenden SAM. Für Zeiten von mehr als 10 Stunden bei 36°C ist die Anordnung des Flüssigkristalls in den Breichen, die kein Protein aufweisen, homöotrop (0° Neigungswinkel). 3.2 ist ein direkter Vergleich, der die Wirkung von Erhitzen der Flüssigkristall-Zelle für 10 Stunden bei 37°C auf die Gleichmäßigkeit der Ausrichtung des Flüssigkristalls zeigt. In A) wurde die optische Aufnahme 1 Stunde nach der Herstellung der Flüssigkristall-Zelle gemacht. B) zeigt die optische Aufnahme derselben Flüssigkristall-Zelle nach Erhitzen der Probe für 10 Stunden bei 37°C. Wie vorstehend diskutiert, nimmt man an, dass dieser Übergang von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung auf der mit einem Amin abschließenden SAM durch die Bildung einer elektrischen Doppelschicht verursacht wird.
  • Um zu bestätigen, dass der in 3 zu sehende optische Kontrast auf die spezifische Bindung von Anti-Biotin-IgG an biotinyliertes BSA und Transfer auf das Goldsubstrat zurückzuführen war, wurde ein Kontrollexperiment durchgeführt. In dem Kontrollexperiment wurde ein Affinitätsstempel mit biotinyliertem BSA eingefärbt, indem ein Tropfen von nicht-spezifischem Antikörper (Anti-Ziege-IgG, 1 mg/ml in PBS) für 5 Std. auf die Oberfläche des Stempels aufgebracht wurde. Der mit Anti-Ziege-IgG eingefärbte Stempel wurde dann auf dieselbe Weise gedruckt wie der mit Anti-Biotin-IgG eingefärbte Stempel. 4.1C zeigt die optische Aufnahme des Kontrollexperiments. Bei einer Probenausrichtung von 0° ist die gesamte Aufnahme schwarz. Bei einer Probenausrichtung von 45° ist die gesamte Aufnahme grün. Die Bereiche, die mit dem Stempel in Kontakt gewesen sind, zeigen dieselbe Anordnung des Flüssigkristalls wie jene Regionen, die nicht mit dem Affinitätsstempel in Kontakt gewesen sind. Dieses Ergebnis stützt die Schlussfolgerung, dass der in 3 zu sehende Kontrast auf Anti-Biotin-IgG zurückzuführen ist, das auf die Oberfläche gedruckt wurde.
  • 4.1D zeigt die optische Aufnahme der Probe in 4.1C nach Erhitzen für 8 Stunden bei 36°C. Wieder wurde ein Übergang einer planaren zu einer homöotropen Anordnung beobachtet, die mittels Konoskopie bestätigt wurde.
  • Aus den Ergebnissen in 4 schlussfolgerte man, dass Antikörper spezifisch eingefangen und auf Goldsubstrate gedruckt werden können, die mit mit einem Amin abschließenden SAMs bedeckt sind, die mit 0,1 N HCl vorbehandelt worden sind, und dass die Anwesenheit von spezifischem Antikörper mit Flüssigkristallen nachgewiesen werden kann. 4.2 zeigt einen direkten Vergleich des spezifischen Einfangs gegenüber der Kontrolle.
  • Beispiel 4 Reaktion der Ausrichtung des Flüssigkristalls auf Mikrokontaktgedruckte Proteine. Eine genaue Beobachtung der 3 und 4 weist auf eine gewisse Gleichmäßigkeit der Reaktion des Flüssigkristalls innerhalb der Bereiche Mikrokontakt-gedruckter Proteine hin. Man stellte die Hypothese auf, dass Affinitätsmikrokontakt-Drucken eine Ausrichtung des Proteins bereitstellen könnte. Um die Möglichkeit einer Ausrichtung des Proteins zu untersuchen, wurde die Reaktion des Flüssigkristalls auf Affinitätsmikrokontakt-gedruckte Proteine und Mikrokontaktgedruckte Proteine verglichen. Man nahm an, dass die Reaktion des Flüssigkristalls auf Mikrokontakt-gedruckte Proteine auf Grund einer geringeren Ausrichtung der Proteine weniger gleichmäßig wäre. Aus 5.1 kann man sehen, dass die Reaktion des Flüssigkristalls für sowohl Affinitätsmikrokontakt-Drucken als auch Mikrokontakt-Drucken sehr ähnlich ist. Bei einer Probenausrichtung von 0° und 90° ist der Hintergrund schwarz und die Quadrate sind grün. Bei einer Rotation der Probe auf dem Objekttisch beobachtete man, dass die grünen Quadrate dunkler wurden, wobei ein Maximum der Dunkelheit bei einer Probenausrichtung von ~60° auftrat. Der Hintergrund ist am hellsten bei einer Probenausrichtung von ~45°. Daraus folgt, dass das gestempelte Protein (Affinitätsmikrokontakt-gedruckt oder Mikrokontaktgedruckt) dem Flüssigkristall eine gewisse Ausrichtung gibt und dass die Reaktion des Flüssigkristalls auf Affinitätsmikrokontakt-gedruckte und Mikrokontakt-gedruckte Proteine sehr ähnlich ist. 5.2 ist ein Vergleich der Flüssigkristall-Aufnahmen für IgGs, die mittels Affinitätskontakt-Drucken und mittels Mikrokontakt-Drucken gestempelt worden sind. In 5.2A sind die Bereiche mit Proteinen, die Affinitätskontakt-gedruckt wurden, ziemlich gleichmäßig in ihrer azimuthalen Ausrichtung. In 5.2B sind die Bereiche mit Proteinen, die Mikrokontakt-gedruckt wurden, ungeordnet in ihrer azimuthalen Ausrichtung.
  • Beispiel 5 Affinitätsmikrokontakt-Drucken von Proteinen auf isotropes Gold und Glas. Man stellte die Hypothese auf, dass das anisotrope Gold die gleichmäßige Ausrichtung des Flüssigkristalls beeinflussen könnte. Um den Einfluss des anisotropen Goldes auf die Ausrichtung des Flüssigkristalls in den Bereichen mit gestempelten Protein auszuschließen und dadurch zu untersuchen, ob das gestempelte Protein den Flüssigkristall ausrichten kann, führte man Mikrokontakt-Drucken auf isotropes Gold und Glas durch. Das isotrope Gold wird mit einem Einfallswinkel von 0° von der Normalen abgeschieden, was keine Anisotropie ergibt und daher keine gleichmäßige Ausrichtung zu dem Flüssigkristall. Das isotrope Gold wurde mit derselben mit einem Amin abschließenden SAM funktionalisiert, dann mit 0,1 N HCl vorbehandelt. Anti-Biotin-IgG wurde auf diese Oberfläche Mikrokontaktgedruckt und mit Flüssigkristallen abgebildet. Die Reaktion des Flüssigkristalls war sehr ähnlich zu der Reaktion, die in den 3, 4A und 5 gezeigt ist. Anti-Biotin-IgG wurde auch auf Glas Mikrokontakt-gedruckt, das mit Aminopropyltriethoxysilan funktionalisiert war. Bei kurzen Zeiten (< 20 Stunden) war die Reaktion des Flüssigkristalls in Bereichen mit gestempeltem Protein ähnlich wie in den Bereichen ohne gestempeltes Protein (nicht gleichmäßige, planare Anordnung). Bei längeren Zeiten (> 20 Stunden) wurden die Bereiche mit gestempeltem Protein deutlicher sichtbar, weil der Hintergrund zu einer homöotropen Anordnung überging (wie 3). Der vollständige Übergang zu einer homöotropen Anordnung war für das Glas viel langsamer als für das Gold (~8 Stunden gegenüber ~8 Tagen). Demnach gibt es keinen Hinweis darauf, dass das gestempelte Protein dem Flüssigkristall eine gewisse Ausrichtung gibt. Es folgt jedoch die Schlussfolgerung, dass der Proteinnachweis mit Flüssigkristallen durch Ausnutzen des Übergangs zu einer homöotropen Anordnung auf mit einem Amin abschließenden Einzelschichten nicht auf schief abgeschiedenes Gold beschränkt ist, sondern auch auf isotropem Gold und Glas durchgeführt werden kann, das mit primären Aminen funktionalisiert ist.
  • Beispiel 6 Wiederverwendung von Affinitätsstempeln. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Affinitätsstempel wiederverwendbar sind. Bernard et al., Nat Biotechnol 2001, 19, 866–869. Um die Wiederverwendbarkeit der Affinitätsstempel mit biotinyliertem BSA zu testen, wurde der Stempel zwei weitere Male mit Anti-Biotin-IgG wiederbeladen (wiedereingefärbt). 6 zeigt die Reaktion des Flüssigkristalls auf die erste, zweite und dritte Verwendung eines Affinitätsstempels. Abgesehen von den unterschiedlichen Farben sind die Aufnahmen für die erste, zweite und dritte Verwendung sehr ähnlich. Man stellte mehrere Hypothesen bezüglich möglicher Gründe für die unterschiedlichen Farben auf. Die unterschiedlichen Farben könnten die Folge von Unterschieden in der Dicke der Zelle, von Unterschieden in der Säurevorbehandlung oder von Unterschieden in der Menge von Protein auf der Oberfläche sein. Es wurde beobachtet, dass die Hintergrundfarbe bei Aufnahmen, die nach 1 Stunde gemacht wurden (nicht > 10 Stunden, wie in 6 gezeigt) für eine gegebene Probe dieselbe ist wie die Farbe in den Quadraten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die Farbveränderung unabhängig davon ist, ob der Bereich Protein aufweist oder nicht. Es ist auch möglich, dass das Protein die Amin-SAM vor dem Flüssigkristall maskiert und dass diese Maskierung der Grund dafür ist, warum in den Bereichen, die Proteine aufweisen, keine Veränderung von einer planaren zu einer homöotropen Anordnung auftritt. Man nimmt daher an, dass die unterschiedlichen Farben die Folge von kleinen Unterschieden in der Zelldicke sind. Unter Annahme einer konstanten effektiven Doppelbrechung von 0,065 wurden die Unterschiede in der Zelldicke aus dem Michel-Levy-Diagramm mit 12 ± 1 μm berrechnet. Demzufolge zeigt 6, dass die Affinitätsstempel mit dem biotinylierten BSA wiederverwendbar sind.
  • Die Wiederverwendbarkeit der Affinitätsstempel mit biotinyliertem BSA wurde auch durch Ellipsometrie bestätigt. Die Veränderung in der ellipsometrischen Dicke wurde für die erste, zweite und dritte Verwendung des Stempels mit 10,8, 8,5 bzw. 8,3 ± 0,4 nm gemessen. Ein direkter Vergleich ist in 6B gezeigt. Für das Kontrollexperiment des Stempelns von Anti-Ziege-IgG war die Veränderung in der ellipsometrischen Dicke für die erste, zweite und dritte Verwendung des Stempels 2,3, 1,5 bzw. 1,2 ± 0,2 nm. Diese Ergebnisse bestätigen die Wiederverwendbarkeit der Affinitätsstempel. Die Ellipsometrie-Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass die Menge von nicht-spezifisch transferiertem Protein nach der ersten Verwendung des Stempels verringert ist, was früher beobachtet worden ist.
  • In 7 ist der Übergang des Flüssigkristalls von planar zu homöotrop für die Bereiche der mit 0,1 M HCl behandelten Amin-SAM zu sehen, die nicht mit Protein bedeckt sind. Der Übergang erfolgt gewöhnlich ~2 Tage nach Herstellung der Flüssigkristall-Zelle.
  • Beispiel 7 Untersuchung von herkömmlichen Prozeduren, die verwendet werden, um Proteine durch Affinitätsmikrokontakt-Drucken zu strukturieren.
  • Affinitätsstempel wurden durch kovalente Bindung von biotinyliertem Rinderserumalbumin an die Oberfläche eines PDMS-Stempels hergestellt (siehe Material und Methoden). Nach Inkubation einer wässrigen Lösung von Anti-Biotin-IgG auf der Oberfläche des Stempels wurde die Oberfläche des Stempels mit wässrigem Puffer gespült und dann mit einem Goldfilm in Kontakt gebracht, der mit NH2(CH2)2SH funktionalisiert war. Die Goldfilme wurden mittels physikalischer Aufdampfung bei einem schiefen Einfallswinkel hergestellt. Die schiefe Abscheidung von Goldfilmen führt zur Einführung einer Struktur in dem Goldfilm in Schichtebene, was eine gleichmäßige azimuthale Anordnung des Flüssigkristalls verursacht, wie früher beschrieben. Der Stempel wurde mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, indem man einen Rand des Stempels mit der Oberfläche in Kontakt brachte und den Rest des Stempels bis zum Kontakt herabließ. Nach dem Kontakt löste man den Stempel von der Oberfläche in einer Richtung ab, die entgegengesetzt zu der war, die verwendet worden war, um den Stempel mit der Oberfläche in Kontakt zu bringen. Nach dem Transfer des Proteins wurde die bestempelte Oberfläche mit einem Abstandshalter (ein dünner Streifen von Mylar mit einer Dicke von ~13 μm) auf einen Glas-Objektträger montiert, der mit Octyltrichlorsilan behandelt worden war (um eine senkrechte oder homöotrope Verankerung des Flüssigkristalls zu bewirken) und der nematische Flüssigkristall 5CB wurde in den Hohlraum eingebettet, der von den zwei Oberflächen begrenzt war.
  • 8A zeigt eine Serie von mikroskopischen Aufnahmen mit polarisiertem Licht (Transmissionsmodus) des nematischen Flüssigkristalls (LC) 4-Cyano-4'-pentylbiphenyl (5CB) in Kontakt mit dem Affinitätsmikrokontakt-gedruckten Anti-Bi-IgG als eine Funktion der Ausrichtung der Probe relativ zu den gekreuzten Polarisatoren. Die ellipsometrische Dicke des Anti-Bi-IgG, der auf die mit einem Amin abschließende Oberfläche transferiert worden war, war ~10 nm. Eine genaue Untersuchung der 8A zeigt, dass die optischen Eigenschaften des LC in Bereichen der Oberfläche, die frei von Antikörper sind, schwarz sind, und grün in den quadratischen Bereichen der Oberfläche, die strukturierten Antikörper tragen, wenn die azimuthale Ausrichtung der Probe relativ zu den gekreuzten Polarisatoren entweder 0° oder 90° ist (entsprechend der Anordnung der azimuthalen Richtung der Goldabscheidung zu entweder dem Analysator oder dem Polarisator der gekreuzten Polarisatoren). Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass die azimuthale Ausrichtung des Flüssigkristalls auf den Bereichen der Oberfläche, die mit Antikörper bedruckt sind, verschieden von der azimuthalen Ausrichtung auf den Bereichen der Oberfläche ist, die frei von Antikörper sind. 8A zeigt auch, dass eine Rotation der Probe weg von 0° und 90° zu einer Abdunklung der optischen Eigenschaften des LC auf dem gedruckten Antikörper führt, wobei ein Maximum der Dunkelheit bei einer Probenausrichtung von ~45° auftritt. Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass die azimuthale Ausrichtung des LC auf dem gedruckten Antikörper nicht zufällig ist, sondern um einen azimuthalen Winkel von ~45° in Bezug auf die Richtung der Goldausscheidung verteilt ist. Diese Schlussfolgerung wird durch Messungen der Intensität des Lichts unterstützt, das durch den Flüssigkristall in Bereiche der Oberfläche, die Affinitätsmikrokontakt-gedruckten Antikörper tragen, und in Bereiche, die frei von Antikörper sind, durchgeleitet wird (8C). Die Erfinder bestimmten, dass die bevorzugte azimuthale Ausrichtung des Flüssigkristalls innerhalb von ±20° von der Richtung des Kontakts des Stempels mit der Oberfläche liegt. Die Erfinder stellten auch fest, dass Mikrokontakt-Drucken von Antikörper von einem PDMS-Stempel zu einer bevorzugten Ausrichtung von LC in Kontakt mit dem gedruckten Antikörper führt (8B und 8D). Die Erfinder schließen daraus, dass das gedruckte Protein (mittels Affinitätsmikrokontakt-Drucken oder mittels Mikrokontakt-Drucken) auf dem schief abgeschiedenen Gold dem Flüssigkristall eine lokal bevorzugte azimuthale Ausrichtung gibt und dass die Reaktion des Flüssigkristalls auf Affinitätsmikrokontakt-gedrucktes Protein und auf Mikrokontakt-gedrucktes Protein ähnlich ist.
  • Beispiel 8 Verwendung von zylindrischen Stempeln zur Kontrolle der Richtung des Kontakts zwischen dem Stempel und der Oberfläche
  • Während die Ergebnisse von Beispiel 7 den Schluss nahelegen, dass sowohl Affinitätsmikrokontakt-Drucken als auch Mikrokontakt-Drucken zu Proteinen führen, die mit bevorzugten azimuthalen Ausrichtungen abgeschieden werden, haben die Erfinder Unterschiede von ±20° zwischen der scheinbaren Richtung des Kontakts des Stempels mit der Oberfläche und der azimuthalen Ausrichtung des LC beobachtet. Um die Richtung des Kontakts des Stempels mit der Oberfläche besser zu steuern und somit dessen Rolle bei der Vorgabe der beobachteten azimuthalen Anordnung des LC zu testen, haben die Erfinder die Verwendung eines zylindrischen Stempels eingeführt (9). Man hat zylindrische Stempel in der Vergangenheit verwendet, um eine kontinuierliche Bearbeitung und ein kontinuierliches Stempeln über große Flächen zu ermöglichen. In diesem Beispiel wurden zylindrische Stempel ausgenutzt, um die azimuthale Organisation der strukturierten Spezies auf der molekularen Ebene zu definieren.
  • 10 zeigt optische Aufnahmen von nematischem 5CB, das von einem mit Amin funktionalisierten Goldfilm (schief abgeschieden) getragen wird, auf den mit einem zylindrischen Stempel IgG Mikrokontakt-gedruckt war. Eine genaue Untersuchung von 10A und 10B zeigt, dass die azimuthale Ausrichtung des Flüssigkristalls während des Transfers des Antikörpers auf die Oberfläche eng der azimuthalen Richtung der Bewegung des zylindrischen Stempels folgt. In Abwesenheit eines strukturierten Antikörpers folgt die azimuthale Ausrichtung des LC derjenigen, die durch die Struktur des schief abgeschiedenen Goldfilms vorgegeben ist. Eine Messung der Intensitäts des Lichts, das durch den LC in Anwesenheit und in Abwesenheit des gedruckten Proteins hindurchgeleitet wird, bestätigt diese Schlussfolgerungen (3C). Ein Vergleich der 10C mit den 8C und 8D zeigt auch, dass die Gleichmäßigkeit der Anordnung des LC, wie sie durch das Ausmaß der Modulation der Intensität des Lichts charakterisiert ist, das durch den LC während der Rotation der Probe hindurchgeleitet wird, im Vergleich zu den herkömmlichen Prozeduren (8C und 8D) wesentlich besser ist, wenn das Protein von dem zylindrischen Stempel an die Oberfläche abgegeben wird (10C). Wenn man sie, kombiniert, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die azimuthale Ausrichtung der Antikörper gesteuert werden kann, indem man zylindrische Stempel verwendet, um den Antikörper an die Oberfläche abzugeben.
  • Obwohl die in den vorstehend beschriebenen Experimenten verwendeten Goldfilme unter Verwendung von schiefer Abscheidung von Gold hergestellt waren, stellten die Erfinder die Hypothese auf, dass Mikrokontakt-Drucken von IgG eine bevorzugte azimuthale Ausrichtung von IgG auf Oberflächen induzieren sollte, die keine zugrundeliegende Anisotropie besitzen. Die Erfinder testeten diese Behauptung, indem sie Antikörper auf Goldfilme Mikrokontakt-druckten, die unter einem normalen Einfallswinkel auf das Silica-Substrat abgeschieden worden waren. Eine genaue Untersuchung der 11A und B bestätigt, dass der LC auf diesen Oberflächen in Bereichen, die frei von Antikörper sind, eine zufällige azimuthale Ausrichtung annimmt. Im Gegensatz dazu richtet sich der LC, der auf dem gedruckten IgG gelagert ist, in einer bevorzugten Richtung aus, die durch die Richtung des Kontakts des zylindrischen Stempels mit dem Goldfilm definiert ist. Quantitative Messungen der Transmission von polarisiertem Licht durch den LC bestätigen, dass in Abwesenheit von gedrucktem IgG keine bevorzugte Ausrichtung des LC auf den Goldfilmen vorliegt, aber dass es eine bevorzugte Ausrichtung auf den Bereichen der Oberfläche gibt, die mit gedrucktem IgG bedeckt sind (11B). Diese Messungen zeigen auch, dass die Gleichmäßigkeit der Anordnung des LC auf Antikörper, der auf Goldfilme gedruckt ist, die in einem normalen Einfallswinkel (11B) und in einem schiefen Einfallswinkel (10C) abgeschieden worden sind, ähnlich ist. Schließlich merken die Erfinder an, dass sie auch die bevorzugte azimuthale Ausrichtung von LCs auf anderen Mikrokontakt-gedruckten Proteinen als IgGs beobachtet haben. Zum Beispiel bewirkt Mikrokontakt-gedrucktes BSA, dass nematische Phasen von 5CB eine gleichmäßige azimuthale Ausrichtung annehmen.
  • Beispiel 9 Im Multiplexverfahren durchgeführter und quantitativer Proteinnachweis mit Affinitätsmikrokontakt-gedruckten Mikroarrays
  • Um einen Mikroarray für Affinitätsmikrokontakt-Drucken zu erzeugen, werden PDMS-Stempel hergestellt, indem man Sylgard 184 auf eine flache Siliziumvorlage gießt, die mit (Tridecafluor-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan silanisiert ist.
  • Nach Aushärten über Nacht bei 80°C wird das PDMS mit einem Sauerstoffplasma (Plasma Etch PE-200, 8 sccm, 20 Sekunden, 100 W) oxidiert. Das oxidierte PDMS wird durch Eintauchen für 1 Stunde bei 80°C in eine wässrige Lösung, die 10% APES enthält, mit einem primären Amin funktionalisiert. Die Oberfläche wird mit einer Carbonsäure funktionalisiert, indem man sie in 0,1 M Bernsteinsäureanhydrid in DMF inkubiert (12 Min.), dann mit DMF spült und in PBS lagert. Der Stempel wird mit NHS/EDC aktiviert und mit PBS gespült. Der Stempel wird auf einen Glas-Objektträger geklebt, um ihn an dem GeneMachines OmniGrid Mikroarrayer zu befestigen. Der Mikroarrayer wird dazu verwendet, um vier Arrays von 25 Punkten (5 Punkte pro Antikörper) zu erzeugen. Um zum Beispiel Proteine nachzuweisen, die an verschiedenen Resten phosphoryliert sind, könnten die folgenden Antikörper in einem Array aufgebracht werden: pan-reaktiver 111.6 Ab (Lab Vision) und phosphospezifische Antikörper Anti-pY1068 (Biosource), Anti-pY1086 (Biosource), Anti-pY1148 (Biosource) und Anti-pY1173 (Upstate). Glycerin (40%) wird zu den Antikörperlösungen hinzugegeben, um die Verdunstung in dem Tröpfchen zu verringern. Das PDMS wird für 10 Min. mit 1% BSA in PBS inaktiviert. Kleine Tropfen von WT (+ und – Behandlung mit EGF)- und PAR (+ und – Behandlung mit EGF)-Membranextrakten werden auf die vier Antikörper-Arrays gegeben, die durch eine Silikondichtung oder einen hydrophoben Stift getrennt sind, und werden für 6 Stunden bei 4°C inkubiert. Der Stempel wird mit PBS mit 0,01% Triton X-100, mit PBS und mit Wasser gespült. Der Stempel wird mit einer Walze auf 30° schief abgeschiedenes Gold gedruckt, das, wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben, mit einer mit einem Amin abschließenden Einzelschicht funktionalisiert ist. Das gestempelte Protein wird abgebildet, indem man 5CB zwischen das schief abgeschiedene Goldsubstrat und einen mit OTS behandelten Glas-Objektträger einbringt. Aufnahmen werden mit einer Digitalkamera gemacht, die auf einem Polarisationslichtmikroskop montiert ist. Die Helligkeit der 5 Punkte wird gemittelt, um eine quantitative Charakterisierung des Gesamt-EGFR und des phosphorylierten EGFR von jedem der Membranextrakte zu ergeben.
  • Beispiel 10 Bildgebung des Epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors mittels Affinitätsmikrokontakt-Drucken und Flüssigkristall-Signalamplifikation.
  • Prozedur: Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist ein Transmembran-Glycoprotein, das EGF-stimulierte Proteintyrosinkinase-Aktivität besitzt. Seine Überexpression und Mutation sind mit vielen Krebsformen in Verbindung gebracht worden. Das nachstehende Experiment zeigt eine Markierungs-freie Analysemethode, die auf Affinitätsmikrokontakt-Drucken (αCP) und Flüssigkristallen (LCs) basiert und mit der man EGFR aus Membranextrakten oder Zelllysaten nachweisen kann, wobei geringe Probenmengen verwendet werden. Die Funktionalisierung des PDMS-Stempels beginnt mit der Oxidation der strukturierten Stempeloberfläche mittels Plasma-Ätzen (8 sccm, 20 s, 100 W), um eine dünne Schicht Siliziumoxid zu bilden. Dann wurde eine Oberfläche mit primärem Amin erzeugt, indem man das oxidierte PDMS für 1 Stunde bei 80°C in eine wässrige Lösung tauchte, die 10% 3-Aminopropyltriethoxysilan enthielt. Eine nucleophile Ringöffnungsreaktion zwischen dem Amin auf der Oberfläche und 0,1 M Bernsteinsäureanhydrid in N.N-Dimethylformamid für 10 Min. bei Raumtemperatur erzeugt eine mit Carbonsäure abschließende Oberfläche. Pan-reaktiver Anti-EGFR 111.6 (1 mg/ml, LabVision) wurde dann mit einem NHS-EDC-Standardprotokoll auf der Carbonsäure-Oberfläche immobilisiert. Der EGFR wurde dann Affinitätseingefangen, indem man einen kleinen Tropfen (~1 μl) Zellmembranextrakt, der entweder von menschlichen epidermalen Karzinomzellen (A431), Mausfibroblasten, in denen kein EGFR vorhanden war (B82L-parental), oder Mausfibroblasten aufgereinigt worden war, die stabil menschlichen Wildtyp-EGFR exprimierten (B82L-WT), auf die mit Antikörper modifizierte Oberfläche setzte und 3–5 Stunden bei Raumtemperatur inkubierte. A431 und BL82-WT enthalten etwa 1 Million EGFR-Moleküle/Zelle bzw. 100.000 EGFR-Moleküle/Zelle. Die Oberfläche des Stempels wird gründlich mit einer Lösung mit einem grenzflächenaktiven Mittel (0,01% Triton X-100 in PBS), PBS und MilliQ-Wasser gespült und unter einem Strom von N2 getrocknet. Der Affinitäts-eingefangene EGFR wird dann durch Kontakt-Drucken des Stempels auf das Substrat auf die Oberfläche transferiert, die eine mit einem Amin abschließende Einzelschicht präsentiert. Mit einem Amin abschließende selbstangeordnete Einzelschichten (SAMs) werden unmittelbar vor dem Stempeln durch Eintauchen der Substrate für 15 s in 1 N wässrige HCl mit HCl behandelt und dann unter einem Strom von N2 getrocknet. Die bestempelte Oberfläche wird mit einem Mikroskop mit gekreuzten Polarisatoren durch eine optische Zelle beobachtet, die durch Einbringen von LC zwischen eine mit Protein bestempelte Amin-SAM-Oberfläche und einen mit Octyltrichlorsilan (OTS) behandelten Glas-Objektträger hergestellt wurde. Eine schematische Darstellung dieser Prozedur ist in 12A dargestellt.
  • Alternatives Verfahren: Nachstehend sind Reaktionsschemata diskutiert, die die Schritte veranschaulichen, die bevorzugt in dem Prozess für kovalente Immobilisierung eines mit einem Amin abschließenden Rezeptors auf einem PDMS-Stempel über eine durch Amin eingeleitete nucleophile Ringöffnungsreaktion verwendet werden. Die Oberfläche eines PDMS-Stempels wird zuerst mit O2-Plasma oxidiert. Die oxidierte Oberfläche wird dann mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPS) durch Eintauchen für 30 Mm. bei 40°C in eine Lösung von GPS (0,1% Vol./Vol. in wasserfreiem Toluol) umgesetzt. Die Oberfläche wird dann mehrere Male in wasserfreiem Toluol gewaschen und für 20 Min. in einem Ofen bei 110°C ausgehärtet. Anti-EGFR wird dann kovalent an die Epoxy-Gruppe an der Oberfläche gebunden, indem man einen Tropfen von in PBS gelöstem Protein aufträgt. Die Oberfläche wird 1–2 Stunden in einer zugedeckten Petrischale inkubiert, die mit Wasser getränkte Baumwolle enthält, um eine gleichbleibende befeuchtete Umgebung aufrechtzuerhalten. Der EGFR wird dann Affinitäts-eingefangen, indem ein kleiner Tropfen (~1 μl) von Zellmembranextrakt aufgebracht wird. Eine schematische Darstellung dieser Prozedur ist in 12B dargestellt.
  • Weiteres alternatives Verfahren: Die Oberfläche eines PDMS-Stempels wird zuerst mit O2-Plasma oxidiert. Die oxidierte Oberfläche wird für 2 Stunden bei 40°C in Toluol-Lösung inkubiert, die 3% Gew./Vol. 3-(Triethoxysilyl)propylisocyanat enthält. Die Oberfläche wird dann mit Toluol, Hexan und Ether gespült und gründlich unter einem Strom von Stickstoff getrocknet. Ein Tröpfchen von in PBS gelöstem Rezeptorprotein wird auf eine mit Isocyanat derivatisierte Oberfläche aufgetragen.
  • Die Oberfläche wird 1–2 Stunden in einer zugedeckten Petrischale inkubiert, die mit Wasser getränkte Baumwolle enthält um eine gleichbleibende befeuchtete Umgebung aufrechtzuerhalten. Der EGFR wird dann Affinitäts-eingefangen, indem ein kleiner Tropfen (~1 μl) Zellmembranextrakt aufgebracht wird. Eine schematische Darstellung dieser Prozedur ist in 12C dargestellt.
  • LC-Ergebnisse von pan-reaktivem Anti-EGFR (111.6 Ab): 13 zeigt die optische Aufnahmen (mit gekreuzten Polarisatoren) von nematischem 5CB, das von einer mit einem Amin abschließenden SAM getragen wurde, die gedruckten EGFR präsentierte, der aus Zellmembranextrakten (EGFR enthaltend (B82L-WT) und EGFR-frei (B82L-parental)) Affinitäts-eingefangen war. Die mit einem Amin abschließende SAM wurde von einem schief abgeschiedenen Goldfilm getragen (untere Oberfläche) und die zweite Oberfläche war ein mit OTS behandelter Glas-Objektträger (obere Oberfläche). Nach dem Drucken wurden die Substrate vor der Abbildung bei Raumtemperatur bei 36°C einem Annealing unterworfen („annealed"). Unmittelbar nach dem Drucken zeigten A431-Proben eine Störung der LC-Anordnung in bedruckten Bereichen, wohingegen Kontrollproben (B82L-parental) dies nicht taten. Nach einem Tag Annealing („annealing") bei 36°C wurde die Anordnung von LC nur in dem Hintergrundbereich der Oberfläche der A431-Probe homöotrop. Die LC-Strukturierung blieb für mehr als eine Woche stabil. Für die Kontrollprobe wurde die gesamte Oberfläche allmählich homöotrop, was bedeutete, dass vernachlässigbare Mengen von Protein durch Stempeln auf die Oberfläche transferiert worden waren. Die homöotrope Anordnung von LC auf den B82L-Parentalproben wurde durch Konoskopie bestätigt.
  • Ellipsometrie: Der Transfer von EGFR von dem Affinitätsstempel auf die mit einem Amin abschließende SAM wurde mittels Ellipsometrie bestätigt. Die ellipsometrische Dicke der Schicht des Affinitäts-eingefangenen Proteins von A431 war ~3 nm dicker als von B82L-parental. Um zu bestätigen, dass die LC-Strukturierungen durch an der Oberfläche gebundenen EGFR erzeugt wurden, wurde ein Sandwich-Assay mit einem zweiten Antikörper (Clon 199.12, LabVision) durchgeführt. 199.12 Ab und 111.6 Ab binden an unterschiedliche Liganden-Bindungsstellen von EGFR. Die Dicke der Schicht von 199.12 Ab, der von dem an die Oberfläche gebundenen EGFR von A431 eingefangen worden war, war ~1,1 nm. Das Kontrollexperiment mit B82L-parental zeigte keine Zunahme der Dicke nach Behandlung mit 199.12 Ab. Die ellipsometrische Dicke der gedruckten Proteinschichten auf der von flachen Goldsubstraten getragenen Amin-SAM wurde ebenfalls gemessen. Die Dicken der gedruckten Proteinschichten von Wildtyp-Proben mit einer Gesamt-Proteinkonzentration von 1 μg/ml waren ~1 nm höher als die parentalen Proben.
  • Quantifizierung von gestempelten Proteinen: Die durch Stempeln auf die Amin-Oberfläche transferierten Proteine wurden quantifiziert, indem die mittleren optischen Eigenschaften des IC innerhalb der strukturierten Bereiche für jeden Fall gemessen wurden, wobei man die Adobe Photoshop-Software verwendete. 14 zeigt, dass die Wildtyp-Proben eine hohe optische Leistung zeigten, aber die Leuchtkraft in den gedruckten Bereichen der parentalen Probe vernachlässigbar war. Sie zeigt auch, dass das IC-Signal allmählich mit der Verringerung der Gesamtkonzentration der Zellproteine abnahm. Das Verschwinden des IC-Signals stützt die Hypothese, dass die LC-Strukturierung auf Affinitäts-eingefangenen EGFR zurückzuführen ist, der auf die Oberfläche gedruckt worden ist.
  • Ergebnisse vom phosphospezifischen Anti-EGFR (1068 Ab): Die Tyrosinphosphorylierung von EGFR läuft genau parallel zur Rezeptoraktivierung. Die Stimulation mit EGF führt zur Autophosphorylierung des Rezeptors auf der Tyrosinkinase-Domäne. Die Verfügbarkeit von Antikörpern, die ausschließlich mit verschiedenen Tyrosin-phosphorylierten Formen des Rezeptors reagieren, ermöglicht den Nachweis des aktivierten Rezeptors. 15 zeigt die optischen Aufnahmen von nematischem 5CB, das auf einer mit einem Amin abschließenden SAM gelagert ist, die gedruckten EGFR präsentiert, der von 4 verschiedenen Zellmembranextrakten Affinitäts-eingefangen wurde: 1. B82L-WT mit EGF-Behandlung (5 Minuten) 2. B82L-WT ohne EGF-Behandlung 3. B82L-parental mit EGF-Behandlung (5 Minuten) 4. B82L-parental ohne EGF-Behandlung. Pan-reaktiver Anti-EGFR (111.6 Ab) zeigt die Störung der LC-Anordnung für beide Wildtyp-Proben, da er den Unterschied zwischen dem phosphorylierten und nicht-phosphorylierten EGFR nicht nachweisen kann. Der phosphospezifische Anti-EGFR (1068 Ab) zeigt jedoch die Störung der LC-Anordnung nur für die phosphorylierte Wildtyp-Probe. 16 zeigt für jeden Fall die mittlere optische Reaktion von 5CB in dem Druckbereich.
  • Hemmung der Phosphorylierung: Biologische Signalprozesse werden häufig untersucht, indem man das Netzwerk selektiv mit spezifischen Hemmstoffen stört. Derzeit verfolgte Ansätze in der Arzneistoffforschung für mit EGFR assoziierte Krebsarten konzentrieren sich zumeist auf die Hemmung der Tyrosinkinase-Aktivität. Diese Ansätze sind jedoch durch die Unzulänglichkeiten der existierenden Screeningverfahren behindert worden. Um zu untersuchen, ob diese Analysemethode in Kombination mit Inhibitoren für diesen Zweck eingesetzt werden könnte, stellte man eine Reihe von Zellmembranextrakten her und behandelte diese unterschiedlich mit Tyrosinkinaseinhibitor (AG1478) und EGF (Tabelle 1). Tabelle 1. Wildtyp- und parentale Zellmembranextrakte mit unterschiedlichen Behandlungen für eine Studie zum Nachweis von CP-LC.
    Gesamtprotein (μg/ml) Hemmung mit AG1478 (Minuten) EGF-Behandlung (Minuten)
    WT (1) 2529 X X
    WT (2) 1641 X 5
    WT (3) 1442 30 X
    WT (4) 1923 30 5
    Parental (1) 2005 X X
    Parental (2) 2274 X 5
    Parental (3) 2086 30 X
    Parental (4) 1987 30 5
  • IC-Ergebnisse von dem Inhibitor: 17 zeigt die optischen Aufnahmen von nematischem 5CB, das von einer mit einem Amin abschließenden SAM getragen wurde, die gedruckten EGFR präsentierte, der von 8 verschiedenen Zellmembranextrakten Affinitäts-eingefangen wurde, wobei der phosphospezifische Anti-EGFR-1068Ab verwendet wurde. Nur die Wildtyp-Probe (+EGF) zeigt die Störung der LC-Anordnung, was bedeutet, dass die Behandlung mit dem Inhibitor AG1478 die Bindung von EGF an den EGFR erfolgreich blockiert. Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial dieses Verfahrens auf, für die Charakterisierung der Fähigkeit von (gegen Tyrosinkinase gerichteten) Anti-Krebs-Mitteln, spezifisch die EGFR-Funktion abzuschwächen, eingesetzt zu werden.
  • Beispiel 11. Verfahren zur Funktionalisierung von PDMS-Stempeln mit mit Cystein abschließenden Peptiden
  • Bis heute ist über keine Verfahren zur Funktionalisierung von PDMS-Stempeln mit Peptidmaterialien berichtet worden. Diese Stempel können beim Einfangen von Proteinen eingesetzt werden, die eine Affinität für bekannte Peptidsequenzen aus komplexen Gemischen (z. B. Zelllysaten) haben. Die hergestellten Stempel müssen auch Oberflächeneigenschaften aufweisen, so dass ein effizienter Proteintransfer von dem Stempel auf eine gewünschte Oberfläche erfolgen kann. Das vorliegende Beispiel stellt eine Beschreibung einer geeigneten Chemie bereit, um Peptide kovalent an Stempeloberflächen zu befestigen. Die Reihenfolge der chemischen Schritte ist in 18 schematisch dargestellt.
  • PDMS-Stempel wurden unter Verwendung des Sylgard 184 Silicone Elastomen-Kit hergestellt und für mindestens 12 Stunden bei 60°C ausgehärtet. Diese Stempel wurden für 20 Sekunden in einer Sauerstoffplasmakammer oxidiert und dann sofort in eine 10%-ige Lösung von Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in verdünnter Essigsäure, pH 6,0, eingetaucht. Diese wurde für eine Stunde auf 80°C erwärmt. Die Stempel wurden mit Wasser gespült und unter einem Strom von Stickstoffgas getrocknet. Als nächstes wurde die Stempeloberfläche nacheinander für 15 Minuten mit einer 1 mM Lösung von BS3 in Wasser und dann für 30 Minuten mit einer 2 mg/ml-Lösung von BSA in PBS-Puffer behandelt.
  • Das kovalent gebundene BSA besitzt freie Amingruppen von Lysinresten, die nicht in Kontakt mit dem Stempel sind. Demzufolge könnten diese freien Amine dazu benutzt werden, Peptidmoleküle über einen heterobifunktionellen Linker zu befestigen. Die Stempel wurden für 45 Minuten mit einer 2 mM Lösung von SSMCC in TEA-Puffer, pH 7,0, behandelt. Die Stempel wurden mit Wasser gespült und man führte für 3 Stunden eine 250 μM Lösung von Cystein-enthaltenden Peptiden in TEA- Puffer, pH 7,0, zu. Diese Stempel wurden mit Wasser gespült und dann für nachfolgende Proteineinfangschritte eingesetzt.
  • Beispiel 12. Einfangen und Freisetzung Anti-pY-Zielantikörper mittels mit Peptiden modifizierter Stempel
  • Um das Vorliegen eines phosphorylierten Peptids an der Oberfläche des Stempels anzuzeigen, wurden phosphospezifische Antikörper eingesetzt, die eine Affinität nur für Peptide aufweisen, die einen phosphorylierten Tyrosinrest enthalten, wie z. B. das p-Src-tide, das die Aminosäuresequenz IYGEFKKKC (SEQ ID NO: 1) umfasst und bei dem es sich um ein bekanntes Substrat für die Src-Proteinkinase handelt. Siehe Houseman, B. T. et al., Langmuir 19: 1522–1531 (2003). Posttranslationell modifiziertes Peptid II, das als (p)-Src-tide bezeichnet wird, ist ein synthetisches Molekül (IpYGEFKKKC (SEQ ID NO: 2)), das einen Phosphotyrosinrest (pY) umfasst, der die Modifikation der Src-Proteinkinase nachahmt. Die Sequenzen dieser Moleküle wurden mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie bestätigt. Eine C18-Umkehrphasen-HPLC-Analyse zeigte, dass jedes Molekül zu mehr als 98% rein war.
  • Das vorliegende Beispiel zeigt die selektive Bindung dieses Antikörperproteins an Stempel, die mit dem p-Src-tide modifiziert worden sind. Es wird nicht beobachtet, dass Stempel, die mit dem Src-tide modifiziert worden sind, irgendeinen Antikörper einfangen.
  • Um dieses Bindungsereignis zu verfolgen, wurde mit einem Fluorescein-Marker versehener monoclonaler Antikörper gegen Phosphotyrosin (Sigma) verwendet. Wie in 19 dargestellt, wurden sowohl mit Src-tide als auch mit p-Src-tide modifizierte Stempel (wie nach den vorstehenden Prozeduren hergestellt) für 3 Stunden mit verdünnten Lösungen von FITC-Anti-pY (10 μg/ml in PBS-Puffer + 0,1% Triton X-100) in Kontakt gebracht. Diese Stempel wurden dann für 10 Sekunden mit PBS-Puffer + 0,1% Triton X-100, dann für 1 Sekunde mit Wasser gespült und unter einem Strom von Stickstoffgas getrocknet.
  • Es wurden Experimente geplant um zu testen, ob der gebundene Antikörper für einen schlussendlichen Flüssigkristall-basierten Nachweis auf SAM-Oberflächen transferiert werden konnte. Es wurden mit einem Amin abschließende Einzelschichten hergestellt, indem man schief abgeschiedene Goldoberflächen für 4 Stunden in eine 2 mM Lösung von 2-Mercaptoamin in Ethanol eintauchte. Diese Goldoberflächen wurden mit reichlichen Mengen an Ethanol und Wasser gespült, dann getrocknet. Dann wurden diese SAM-Oberflächen für 15 Sekunden in 1N HCl eingetaucht und mit Stickstoffgas trocken geblasen.
  • Man brachte die getrockneten Stempel nach Behandlung mit dem FITC-Anti-pY für 30 Sekunden mit den SAM-Oberflächen in Kontakt. Die Intensität der Fluoreszenz auf der Oberfläche des Stempels wurde analysiert, um sowohl 1) die Menge an Protein, die ursprünglich von dem Stempel eingefangen worden war, und 2) die Menge an Protein zu bestimmen, die auf die SAM-Oberfläche transferiert worden war, wie in 20A schematisch dargestellt.
  • 20B stellt zwei wichtige Ergebnisse dar, wenn mit Peptid modifizierte Stempel eingesetzt werden. Erstens ist die Menge an Protein (ein phosphospezifischer Antikörper), die ursprünglich an das p-Src-tide gebunden ist, wesentlich höher als die Menge an Protein, die an die Oberfläche des mit Src-tide modifizierten Stempels adsorbiert ist (Flächen, auf die Pfeile gerichtet sind). Zweitens wird gezeigt, dass es möglich ist, die Menge des Proteins zu verfolgen, die nach dem Kontakt des Stempels mit der Nachweisoberfläche von dem Stempel auf die Nachweisoberfläche transferiert worden ist. Die Größe der Gold-SAM war etwa 1/3 der Größe des Stempels; dunkel gewordene Flecken, auf die das mit einem Fluoreszenz-Marker versehene Protein transferiert worden ist.
  • Beispiel 13. Erzeugung von homöotropen Ausrichtungen auf mit einem Amin abschließenden SAMs durch UV-Vorbehandlung des Flüssigkristalls
  • Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob es möglich war, eine Flüssigkristall-Praparation vorzubehandeln, um homöotrope Ausrichtungen auf mit einem Amin abschließenden SAMs zu erzeugen.
  • Als frische Chargen des 5CB zwischen einen mit OTS behandelten Glas-Objektträger und eine mit einem Amin abschließende SAM auf einer Goldoberfläche eingebettet, wie in vorherigen Beispielen beschrieben, wurden, wurde kein Übergang zu einer homöotropen Ausrichtung beobachtet, wie es bei weniger frischen Chargen der Fall gewesen war (eine frische Charge war beispielsweise ungefähr 5 Monate vor dem Verfallsdatum, wohingegen die weniger frische Charge weniger als einen Monat von ihrem Verfallsdatum entfernt war). Im Allgemeinen liefert eine Vorbehandlung des Flüssigkristalls ein gleichmäßiges Verhalten des Kristalls für eine längere Zeit. Demzufolge behält der Kristall seine homöotrope Ausrichtung für eine längere Zeit nach einer Vorbehandlung bei. Man kann daher eine Vorbehandlung der Kristalle durchführen, wenn eine homöotrope Ausrichtung für eine längere Zeit erwünscht ist.
  • 22A zeigt die gleichmäßige planare Ausrichtung des frischen 5CB, das selbst nach 2 Wochen nich homöotrop wird. Das frische 5CB wurde zwischen einem mit OTS behandelten Glas-Objektträger und einer mit einem Amin abschließenden SAM auf Gold (Einfallswinkel 30 Grad) eingebettet, die mit 1 M HCl vorbehandelt worden war.
  • Das frische 5CB wurde für 4 Stunden in einem Glasgefäß mit UV-Licht vorbehandelt, wobei eine Spectroline-Lampe der E-Serie mit Filter (Modell EN280L, Westbury, NY) eingesetzt wurde. Die Lampe strahlt bei 1,09 mW/cm2 in einem Wellenlängebereich von 300–450 nm mit einem Peak bei 365 nm. Das UV-vorbehandelte 5CB wurde dann zwischen OTS und der mit einem Amin abschließenden SAM auf Gold eingebettet, die mit 1 M HCl vorbehandelt worden war. Die Ausrichtung des UV-vorbehandelten 5CB wird nach 2 Tagen teilweise homöotrop (siehe 22B).
  • Der frische 5CB wurde auch für 24 Stunden in einem Glasgefäß mit UV-Licht vorbehandelt, wobei die Spectroline-Lampe der E-Serie mit Filter eingesetzt wurde. Das 5CB (24 Stunden UV-Vorbehandlung) wurde ebenfalls zwischen OTS und der mit einem Amin abschließenden SAM auf Gold eingebettet, die mit 1 M HCl vorbehandelt worden war. Die Ausrichtung des 24 Std. UV-vorbehandelten 5CB war 10 Minuten nach Bildung der Flüssigzelle homöotrop (siehe 22C).
  • Die vorliegenden Zusammensetzungen und Kits können beliebige oder alle der hierin beschriebenen Bestandteile aufweisen. Ebenso können die vorliegenden Verfahren ausgeführt werden, indem man beliebige der hierin beschriebenen Schritte durchführt, entweder allein oder in verschiedenen Kombinationen. Ein Fachmann wird erkennen, dass man sämtliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit allen anderen, geeigneten hierin beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung verwenden kann. Darüber hinaus wird ein Fachmann erkennen, dass die vorliegende Erfindung auch Variationen der vorliegenden Zusammensetzungen, Kits und Verfahren umfasst, die spezifisch einen oder mehrere der Bestandteile oder Schritte ausschließen, die hierin beschrieben sind.
  • Wie es einem Fachmann ersichtlich ist, umfassen alle hierin offenbarten Bereiche für beliebige Zwecke, insbesondere im Hinblick auf die Bereitstellung einer schriftlichen Beschreibung, alle möglichen Unterbereiche und Kombinationen von Unterbereichen davon. Es ist leicht zu erkennen, dass jeder aufgeführte Bereich denselben Bereich ausreichend beschreibt und befähigt, der mindestens in gleiche Hälften, Drittel, Viertel, Fünftel, Zehntel etc. unterteilt ist. Als ein nicht beschränkendes Beispiel kann jeder hierin diskutierte Bereich leicht in ein unteres Drittel, ein mittleres Drittel und ein oberes Drittel etc. unterteilt werden. Wie es einem Fachmann auf dem Gebiet ebenfalls ersichtlich sein wird, umfasst jeder Ausdruck wie „bis zu", „mindestens", „größer als", „weniger/geringer als", „mehr als" und dergleichen die angegebene Zahl und bezieht sich auf Bereiche, die anschließend, wie vorstehend beschrieben, in Unterbereiche unterteilt werden können. Auf dieselbe Weise umfassen alle hierin offenbarten Verhältnisse auch alle Unterverhältnisse, die in das breiter gefasste Verhältnis fallen.
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet wird auch leicht erkennen, dass in Fällen, in denen Mitglieder auf eine übliche Weise in einer Gruppe wie z. B. einer Markush-Gruppe zusammengefasst werden, die vorliegende Erfindung nicht nur die gesamte Gruppe umfasst, die als Ganzes aufgeführt ist, sondern jedes einzelne Mitglied der Gruppe und alle möglichen Untergruppen der Hauptgruppe. Demzufolge umfasst für alle Zwecke die vorliegende Erfindung nicht nur die Hauptgruppe, sondern auch die Hauptgruppe, in der eines oder mehrere der Gruppenmitglieder nicht vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung sieht auch den expliziten Ausschluss von einem oder von mehreren der Gruppenmitglieder in der Erfindung vor.
  • Sofern nichts Anderweitiges angegeben ist, bedeutet „ein/eine oder „mindestens ein/eine „ein/eine/eines oder mehrere".
  • Obwohl bevorzugte Ausführungsformen veranschaulicht und beschrieben worden sind, sollte es selbstverständlich sein, dass Veränderungen und Modifikationen daran gemäß üblicher Fachkenntnis vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung in ihren weiter gefassten Aspekten, wie hierin beschrieben, abzuweichen.
  • Weiterhin wird auf Folgendes Bezug genommen:
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  • PCT US 2004031498 .txt Sequenzprotokoll
    Figure 00850001

Claims (28)

  1. Verfahren zum Nachweisen eines Liganden umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Probe, die einen Liganden hat oder von der vermutet wird, dass sie einen Liganden hat, mit einem Affinitätsstempel, wobei der Affinitätsstempel einen Rezeptor umfasst, der fähig ist, spezifisch an den Liganden zu binden; (b) Inkontaktbringen des Affinitätsstempels mit einer Nachweisoberfläche, wobei mindestens ein Teil des Liganden, der an den Rezeptor gebunden ist, auf die Nachweisoberfläche transferiert wird; und (c) Nachweisen der Anwesenheit des Liganden auf der Nachweisoberfläche, wobei die Nachweisoberfläche ferner einen Flüssigkristall umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend: (d) Waschen des Affinitätsstempels nach (a); (e) Waschen der Nachweisoberfläche nach (b); oder (f) sowohl (d) als auch (e).
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor oder Ligand ein Biomolekül, ein Biomolekül-erkennendes Agens, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein, ein Kohlenhydrat, ein Toxin, ein Metall, ein Schwermetall, einen Chelator, ein Pathogen, ein Virus, ein Bakterium, eine Säugerzelle oder einen Teil einer Säugerzelle, eine Nucleinsäure, ein Nucleinsäureanalog oder Imitat, einen Zucker, Antikörper oder funktionelle Fragmente davon, ein organisches Molekül, ein Lipid, ein Phospholipid, einen Arzneistoff, ein chemisches Agens, ein Pestizid, ein Herbizid oder ein Fragment davon umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Affinitätsstempel ein Polymer, ein Silicamaterial, ein Metall oder ein Metalloxid umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Affinitätsstempel PDMS (Polydimethylsiloxan) umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei PDMS ferner mit einem Peptid abschließt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mit einem Peptid abschließende PDMS fähig ist, ein phosphoryliertes Peptid nachzuweisen.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei PDMS ferner mit einem Antikörper abschließt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das mit einem Antikörper abschließende PDMS fähig ist, ein Protein nachzuweisen.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor an den Affinitätsstempel über eine oder mehrere verbindende Einheiten gebunden ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in der Probe vorhandene Menge an Ligand quantifiziert wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Affinitätsstempel einen Array von Rezeptoren umfasst, die an verschiedenen Plätzen lokalisiert sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Rezeptoren in dem Array Spezifitäten für mehr als einen Liganden haben, wobei ferner der Flüssigkristall fähig ist, die Anwesenheit von mehr als einem Liganden nachzuweisen.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Rezeptoren in dem Array fähig sind, die Anwesenheit von Proteinphosphorylierung an verschiedenen Resten des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors nachzuweisen.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nachweisoberfläche eine selbstangeordnete Einzelschicht umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die selbstangeordnete Einzelschicht ein Amin, Alkanthiol oder eine organische Schwefelverbindung umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die selbstangeordnete Einzelschicht vor (b) mit einer Säure vorbehandelt wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kontaktieren des Affinitätssstempels mit einer Nachweisoberfläche auf mindestens einem teilweise gekrümmten Affinitätsstempel durchgeführt wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nachweisoberfläche in Abwesenheit eines eingefangenen Liganden ein homöotropes Verankern verursacht.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Flüssigkristall einen nematischen Flüssigkristall, smektischen Flüssigkristall, polymeren Flüssigkristall, lyotrophen Flüssigkristall, chromonischen Flüssigkristall, verhinderten (frustrierten) Flüssigkristall, thermotropen Flüssigkristall, säulenartigen Flüssigkristall, nematischen diskotischen Flüssigkristall, kalamitischen nematischen Flüssigkristall, ferroelektrischen Flüssigkristall, diskoidalen Flüssigkristall oder cholesterischen Flüssigkristall umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Flüssigkristall durch Belichtung mit UV-Licht vorbehandelt wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Flüssigkristall 4-Cyano-4'-pentylbiphenyl oder ein dotiertes Salz davon umfasst.
  23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Orientierung des Flüssigkristalls optisch oder elektrisch nachgewiesen wird.
  24. Kit zum Nachweisen eines Liganden umfassend: (a) einen Affinitätsstempel; (b) eine Nachweisoberfläche, die vom Affinitätsstempel getrennt ist; und (c) einen Flüssigkristall.
  25. Kit nach Anspruch 24, ferner umfassend einen oder mehrere Rezeptoren, die spezifisch für einen Liganden sind.
  26. Kit nach Anspruch 24, ferner umfassend eine chemische Verbindung, die fähig ist die Nachweisoberfläche chemisch zu modifizieren.
  27. Kit nach Anspruch 26, wobei die chemische Modifizierung ein Amin umfasst.
  28. Kit nach Anspruch 24, wobei der Affinitätsstempel einen oder mehrere Liganden umfasst.
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