DE602004011448T2

DE602004011448T2 - Poröse Medien

Info

Publication number: DE602004011448T2
Application number: DE602004011448T
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Longmeadow Pluester; Christian Ziegmann
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2003-11-24
Filing date: 2004-11-23
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: DE602004011448D1; EP1820552B1; EP1533015B1; EP1533015A1; US7846333B2; DE07002457T1; US20050178720A1; ATE512703T1; ATE384568T1; EP1820552A1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung einer Lösung, wobei die Vorrichtung ein Gehäuse mit einer Gehäusewand, die ein internes Volumen definiert, und ein poröses Medium in wenigstens einem Teil des internen Volumens des Gehäuses umfasst, wobei das poröse Medium eine fixierte Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen umfasst und Poren zwischen der Gehäusewand, den Polymerpartikeln und den Sorbenskügelchen oder irgendeiner Kombination von diesen definiert.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Vorrichtung, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen, das Injizieren einer Menge der Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen in das Gehäuse, die ausreicht, wenigstens einen Teil des Gehäuses zu füllen, und das Fixieren der Mischung aus Sorbenskügelchen und Polymerpartikeln im Gehäuse unter Bildung des besagten porösen Mediums umfasst.
Eine Vorrichtung, wie sie oben definiert wurde, und ein Verfahren, wie es oben definiert wurde, kennt man aus US-B1-6200474 . Wie es in dem besagten Dokument offenbart wurde, insbesondere unter Bezugnahme auf das Beispiel 9, wird eine Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen durch das Mischen der Polymerpartikel mit einem Mineralöl, das Erhitzen der Mischung aus den Polymerpartikeln und dem Mineralöl auf eine Temperatur über der Schmelztemperatur der Polymerpartikel, so dass die Polymerpartikel verflüssigt werden, das Zugeben der Sorbenskügelchen zu der Schmelze, sodass eine Mischung aus verflüssigten Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen gebildet wird, und das Aufziehen der Schmelze in eine Pipettenspitze, in der man die Schmelze sich anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lässt, erzeugt. Die Pipette wird zur Extraktion des Mineralöls in ein Methylenchloridbad transferiert. Sie wird dann entnommen, das Methylenchlorid wird ausgetrieben, und man lässt sie an der Luft trocknen.
WO 03/080211 A1 offenbart eine Vorrichtung zur Festphasenextraktion (FPE) und ein Verfahren zur Durchführung einer FPE mittels der Vorrichtung. Die Vorrichtung enthält ein Bett aus Sorbenspartikeln, das so zwischen zwei porösen Filterelementen in einer konischen internen Vertiefung enthalten ist, dass der poröse Filter, der stromabwärts vom Sorbensbett gelegen ist, kleiner als der poröse Filter ist, der stromaufwärts vom Sorbensbett gelegen ist. Die Vorrichtung schließt auch einen Reservoirabschnitt ein, der stromaufwärts vom größeren porösen Filter gelegen ist, und eine Auslasstülle, die stromabwärts vorn kleineren porösen Filter liegt. Die Tülle leitet Flüssigkeiten, die die Vorrichtung verlassen, in einen geeigneten Sammelbehälter. Die porösen Filter können aus gesintertem Polyethylenmaterial bestehen. Die Sorbenspartikel können ein anorganisches Material wie SiO₂ sein, und sie können mit einer organischen funktionellen Gruppe, wie einer funktionellen C₂-C₂₂-Gruppe, vorzugsweise einer funktionellen C₈-C₁₈-Gruppe, behandelt worden sein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Aufreinigung, Aufkonzentrierung und/oder größenbasierte Abtrennung biologischer Zielmoleküle in bzw. von einer Probe ist für verschiedene molekularbiologische und biochemische Techniken von Bedeutung. Zum Beispiel ist das Entsalzen von Peptidlösungen vor einer Spektralanalyse kritisch für die Empfindlichkeit und die Korrektheit der Analyse. Diese Zielsetzungen gelten insbesondere für Biomoleküle enthaltende Proben mit kleineren Volumina, d. h. Probenlösungen im Mikroliterbereich, oder für verdünntere, Biomoleküle enthaltende Proben, d. h. Proben mit weniger als ungefähr 10 μg/ml des Zielbiomoleküls in der Lösung.
Die herkömmlichen Techniken zur Aufreinigung, Aufkonzentrierung und größenbasierten Trennung sind auf verschiedene Filtrationstechniken und chromatografische Techniken ausgerichtet. Zum Beispiel werden Proben auf eine vorgewählte Filtermembran in einem Mikrozentrifugenröhrchen aufgebracht oder gegeben, wobei die Filtermembran Porengrößen definiert, die das Zielbiomolekül darin hindern, durch den Filter gewaschen zu werden. Die Zentrifugation des Mikrozentrifugenröhrchen zwingt kleinere Moleküle in der Probe dazu, durch die Poren des Filters zu treten, während die Moleküle, die größer (als die Poren) sind, auf dem Filter zurückgehalten werden. Dieser Prozess konzentriert und reinigt die Zielbiomoleküle auf und trennt sie letztlich von anderen kleineren Bestandteilen ab. Diese Ultrafiltrationstechniken erfordern allerdings häufig lange Zentrifugations- oder Filtrationsaschritte für den Transport der Probe durch die Filterporen. Weiterhin reagieren Ultrafiltrationsmembranen sehr empfindlich auf die Viskosität, was häufig zu Problemen durch ein Zusetzen führt.
Unlängst ist ein auf einer Polymermatrix basierender Pfropfen zur Abtrennung und Aufkonzentrierung von Zielmolekülen von bzw. in einer Probe entwickelt worden. Der Pfropfen wird durch das Gießen des Polymers und des Materials der Sorbenskügelchen in ein geeignetes Gehäuse, zum Beispiel eine Pipettenspitze, hergestellt. Siehe z. B. das zuvor erwähnte US-Patent Nr. 6 200 474 . Die durch den Gießprozess erzeugte homogene Polymermatrix stellt ein zusammenhängendes Polymermaterial bereit, das in der Lage ist, Partikel vom Sorbenstyp zum umschließen, wobei der gesamte Pfropfen eine Aufkonzentrierung, Aufreinigung und Abtrennung des Zielbiomoleküls bewirkt. Unglücklicherweise erfordern auf einer Polymermatrix basierende Techniken jedoch lösemittelbasierte Gießtechniken, die häufig Zeit, schädliche Lösemittel und eine spezielle Ausrüstung zur Herstellung von Gehäusen mit Pfropfen erfordern.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung, wie sie oben definiert wurde, bereitgestellt, wobei sie dadurch gekennzeichnet ist, dass das poröse Medium im Gehäuse unter Einsatz von Temperaturen gesintert wird, die nicht über der Schmelztemperatur der Polymerpartikel liegen.
Somit umfasst das poröse Medium eine inhomogene Kombination aus Sorbenskügelchen und diskontinuierlichen Polymerpartikeln. Das poröse Medium kann zu ungefähr 30 Gew.-% bis ungefähr 70 Gew.-% aus Sorbenskügelchen bestehen, auch wenn andere Bereiche als im Umfang der Erfindung eingeschlossen betrachtet werden. Bei einer bestimmten Ausführungsform umfasst das poröse Medium ungefähr 50 Gew.-% Sorbenskügelchen und 50 Gew.-% Polymerpartikel. Bei einigen Ausführungsformen umfassen die Polymerpartikel Polyethylenkügelchen, und die Sorbenskügelchen umfassen ein derivatisiertes oder funktionalisiertes Siliciumdioxid.
Bei einigen Ausführungsformen ist die Vorrichtung eine Pipettenspitze, vorzugsweise mit porösem Medium mit einer Tiefe von ungefähr 1 bis 3 mm, auch wenn andere Tiefen als im Umfang der Erfindung eingeschlossen betrachtet werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, wie sie oben definiert wurde, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung durch ihr Sintern im Inneren des Gehäuses unter Einsatz von Temperaturen, die nicht über der Schmelztemperatur der Polymerpartikel liegen, fixiert wird.
KUZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Ablaufschema, das ein Verfahren zur Herstellung eines ein poröses Medium enthaltenden Gehäuses veranschaulicht.
2 ist eine Querschnittsansicht eines Sinterblocks für den Einsatz in Ausführungsformen der Erfindung.
3 ist ein Säulendiagramm, das die Ergebnisse eines Coomassie-Blue-Bindungsassays zeigt, bei dem eine bestimmte Menge GUR X120 und GUR 2122 mit 30, 50, 60 oder 70 Gew.-% C18-Siliciumdioxidpartikeln zusammengegeben wird, um die Bindungskapazität dieser verschiedenen Zusammensetzungen des porösen Mediums zu testen.
4 ist ein Säulendiagramm, das die Ergebnisse eines Coomassie-Blue-Bindungsassays zeigt, bei dem 50 Gew.-% GUR X120 mit 50 Gew.-% an verschiedenen C-18-funktionalisierten Siliciumdioxidpartikeln zusammengegeben werden. Die porösen Medien aus den einzelnen Kombinationen wurden für den Vergleich der Bindungskapazitäten der verschiedenen Siliciumdioxidpartikel miteinander im Kontext der Bindung von Materialien mit niedrigem Molekulargewicht getestet.
5 ist ein silbergefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gel, bei dem die gefärbte Menge an Cyt c, die mittels des erfindungsgemäßen porösen Mediums (GUR X120 mit 50 % RP-18 von ICN) aus einer Probe entfernt wurde, mit der Menge verglichen wird, die im Durchfluss verblieb.
6A-D zeigt eine spektrale Analyse (Maldi-TOF-MS-Spektrum) ungereinigter Proben (A und B) und mittels eines erfindungsgemäßen porösen Mediums gereinigter Proben (C und D). Bei A und B wurde ein ungereinigter Cytochrom-c-Verdau in einer Speed-Vac-Apparatur auf drei Mikroliter eingeengt, auf ein MS-Target gespottet und mit einer Kristallisationsmatrix überschichtet. Bei C und D wurde ein Cytochrom-c-Verdau mit Spitzenprototypen mit 2 mm 50 % GUR X120 Sinterpolymer und 50 % RP-18-Siliciumdioxid von ICN, das C-18-funktionalisiert war, gereinigt und (C) mit 3 Mikrolitern Kristallisationsmatrix direkt auf das MS-Target eluiert oder (D) mit drei Mikrolitern Elutionspuffer aus 50 % Acetonitril und 0,1 % TFA eluiert, auf das MS-Target gespottet und mit Kristallisationsmatrix überschichtet.
7 zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes 1 %-iges Agarosegel, bei dem freier Farbstoff mit porösem Medium aus einem Farbstoff-Inkorporationstest entfernt wurde. Die Spuren 4 – 7 zeigen eine zunehmende Entfernung des freien Farbstoffs durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung des Verständnisses bestimmter, hier häufig verwendeter Begriffe gebracht, und sie sollen den Umfang der vorliegenden Offenbarung nicht einschränken:
Definitionen:

„Gehäuse" bezieht sich auf einen beliebigen Behälter mit wenigstens einem offenen Ende, und vorzugsweise zwei offenen Enden, für die Aufnahme des porösen Mediums. Zu solchen Gehäusen gehören Pipettenspitzen, und sie bestehen typischerweise aus Polymeren, zum Beispiel thermoplastischen Polymeren wie Polypropylen.
„Molekular reines Wasser" bezieht sich auf Wasser mit einer Leitfähigkeit von ungefähr 0,83 μS (< 1,3 μS), einer Gesamtkeimzahl von zehn oder weniger KBE pro 100 ml Wasser, einem Endotoxingehalt von 0,03 EU/ml und einem Wert für den gesamten organischen Kohlenstoff (total organic carbon, TOC) von ungefähr 0,178 ppm.
„Polyethylen" oder „Polyethylen hoher Dichte" bezieht sich auf ein thermoplastisches Polymer hoher Dichte mit der allgemeinen Formel (-H₂C-CH₂-)_n.
„Oberflächenmodifiziertes Polyethylen hoher Dichte" bezieht sich auf ein thermoplastisches Polyethylen hoher Dichte mit einer beliebigen Anzahl funktioneller Oberflächenmodifikationen, zu denen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, -OH, -COOH, -NH₂, -SH, -epoxid und dergleichen gehören. Außerdem können die Oberflächenmodifikationen multiple funktionelle Modifikationen in ein und demselben porösen Medium einschließen und/oder sekundäre Verknüpfungsgruppen oder mit einem Protein modifizierte Partikel aus Polyethylen hoher Dichte, d. h. biotinmarkierte oder antikörpermarkierte Partikel aus Polyethylen hoher Dichte, umfassen.
„Polypropylen" bezieht sich auf ein thermoplastisches Polymer mit der allgemeinen Formel (C₃H₅)_n.

Bei bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung eine Vorrichtung, wie eine Pipettenspitze, bereit, die ein Gehäuse umfasst, das ein definiertes poröses Medium für die Aufkonzentrierung, Aufreinigung und größenbasierte Trennung von Zielanalyten einer Probe enthält. Das poröse Medium umfasst typischerweise Partikel aus einem Polymer, wie Polyethylen, die auf zufällige Weise mit Sorbenskügelchen, zum Beispiel Siliciumdioxidkügelchen, kombiniert sind. Das poröse Medium ist in einem Teil des Gehäuses in einer Tiefe, die für die jeweilige Aufgabe geeignet ist, gesintert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist schnell und effizient, insbesondere im Vergleich zu existierenden herkömmlichen Verfahren, zum Beispiel dem Gießen einer Polymermatrix in ein Zielgehäuse.
Sorbenskügelchen
„Sorbenskügelchen" bezieht sich, so wie der Begriff hier verwendet wird, auf Sorbensoberflächen für das Aufnehmen, Einfangen, Binden oder andere Prozesse in Bezug auf einen Zielanalyten. Typischerweise enthalten geeignete Sorbenskügelchen Siliciumdioxid, derivatisiertes Siliciumdioxid und dergleichen mit einer Schmelztemperatur, die über der Schmelztemperatur der Polymerpartikel des porösen Mediums liegt. Die erfindungsgemäßen Sorbenskügelchen können sich auch aus Styrol/Divinylbenzol-Verknüpfungsgruppen, Methacrylat/Ethylendimethacrylat-Verknüpfungsgruppen, Amberlit XAD 2000 (Tosoh Biosep Inc.), Sephabeads, z. B. SP850-Sephabeads (Tosoh Biosep Inc.), aktiviertem Graphit, Diatomeenerde (Sigma D-5384) sowie Kügelchen auf Siliciumdioxidbasis zusammensetzen. Bei bevorzugteren Ausführungsformen sind die Sorbenskügelchen hydrophobe Partikel und bestehen aus Kügelchen auf Siliciumdioxidbasis, einschließlich von Kügelchen aus derivatisiertem Siliciumdioxid. Die bindenden Partikel, die für die Verwendung geeignet sind, weisen einen Bereich der mittleren Durchmesser auf, der typischerweise bei 100 nm bis 1000 μm liegt, und in einigen Fällen bei 1 μm bis 100 μm. Außerdem können die Sorbenskügelchen Partikel mit oder ohne Poren umfassen. Bezüglich der Poren enthaltenden Kügelchen liegen die Porengrößen, die die Kanäle in den Kügelchen definieren, typischerweise im Bereich von 10 Å bis ungefähr 10 000 Å. Bei bevorzugen Ausführungsformen liegt der mittlere Durchmesser des bindenden Kügelchens bei ungefähr 1 bis ungefähr 100, mit Poren, die Kanäle definieren, die einen mittleren Durchmesser von ungefähr 50 bis ungefähr 1000 Å aufweisen.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen die hydrophoben Partikel Siliciumdioxid, d. h. Partikel, die wenigstens teilweise aus Siliciumdioxid bestehen, einschließlich von derivatisierter Kieselerde, d. h. derivatisiertem Siliciumdioxid. Kügelchen aus derivatisiertem Siliciumdioxid können Kohlenstoffketten aufweisen, die von C-2 bis C-18 reichen, aber typischerweise C-4, C-8 oder C-18 sind. Veranschaulichende Beispiele für Siliciumdioxidpartikel sind C-18-funktionalisiertes Siliciumdioxid mit verschiedenen nützlichen Parametern, zum Beispiel R202 (Degussa AG), ICN-RP-18 (ICN Inc.), CPG-SM (CPG Inc.) und CPG-LG (CPG Inc.). Zu diesen Siliciumdioxidpartikeln gehören Partikel ohne Poren, mit Poren von 100 Å und mit Poren von 500 Å, und sie haben Partikeldurchmesser von mehreren hundert Nanometern bis 150 μm. Zum Beispiel haben die ICN-RP-18-Partikel einen mittleren Durchmesser von 32 bis 63 μm und Poren mit Kanaldurchmessern, die im Mittel bei ungefähr 100 Å liegen.
Bindende Partikel aus Siliciumdioxid sind zum Beispiel für die Sorption vieler verschiedener Analyten, einschließlich der Bindung von Biomolekülen, zu denen DNA, RNA, Polypeptiden und dergleichen gehören, aus einer Lösung nützlich. Zum Beispiel kann ICN-RP-18 zur Aufreinigung/Entsalzung von Peptiden und Proteinen, insbesondere in Chromatografiesäulen, eingesetzt werden.
Polymerpartikel
Zu Polymerpartikein für den Einsatz in den Ausführungsformen der Erfindung gehören Polymere, die niedrigere Schmelztemperaturen als die Polymermaterialien haben, die zur Herstellung des Gehäuses, wie der Pipettenspitze aus Polypropylen, eingesetzt werden. Ein Beispiel für ein Polymer, das als Polymerkomponente des porösen Mediums nützlich ist, ist Polyethylen hoher Dichte. Es können auch andere polyethylenartige Polymere mit hoher Dichte im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden. Im Allgemeinen haben die erfindungsgemäßen Polymerpartikel unterschiedliche Molekulargewichte und Durchmesser von 100 nm bis 1000 μm, und typischerweise von 1 μm bis 500 μm. Beispiele für Polymere sind GUR X120 (Ticona AG, Deutschland), GUR 2122 (Ticona AG, Deutschland), GUR 4120 (Ticona AG, Deutschland) und GUR 4186 (Ticona AG, Deutschland).
Die erfindungsgemäßen Polymerpartikel sind in der Lage, zusammen mit den erfindungsgemäßen Sorbenskügelchen unter Bildung eines porösen Mediums gesintert zu werden. Ideale Polymerpartikel weisen Parameter auf, die es dem porösen Medium ermöglichen, geeignete Kanäle zwischen den einzelnen Kügelchen, die den Fluss von Analyten durch das Medium erleichtern, zu bilden oder zu definieren.
Eine andere nützliche Eigenschaft der erfindungsgemäßen Polymermoleküle besteht darin, dass das Polymer bei Temperaturen zwischen 100 und 180°C, und insbesondere zwischen ungefähr 130 und 160°C, klebrig wird. Bei diesen Temperaturen bilden die Polymerpartikel die Wechselwirkungen aus, die, zusammen mit den Sinterdrucken, erforderlich sind, um die Polymerpartikel an den erfindungsgemäßen bindenden Partikeln und Gehäusewänden zu halten. Weiter sollte der Polymerbestandteil des porösen Mediums bei diesen Temperaturen nicht vollständig schmelzen und eine kontinuierliche Polymermatrix, wie sie nach dem Stande der Technik produziert wird, bilden.
Falls erforderlich können die Partikel aus dem Polyethylen hoher Dichte zur Minimierung einer möglichen unspezifischen Bindung modifiziert werden. Zum Beispiel können die Partikeloberflächen über eine Plasmaentladung angeätzt werden, um die Polymeroberfläche hydrophiler zu machen und dadurch die unspezifische Bindung zu reduzieren.
Das poröse Medium
Die Ausführungsformen der Erfindung schließen eine inhomogene Mischung von bindenden Sorbenskügelchen und Polymerpartikein ein. Das Polymermaterial und die Sorbenskügelchen werden typischerweise in im Voraus festgelegten Verhältnissen auf der Basis ihres Gewichts vereinigt/gemischt. Im Allgemeinen liegt das Verhältnis von Polymerpartikel zu Sorbenskügelchen bei ungefähr 5:95 bis ungefähr 95:5, und typischerweise liegt es bei ungefähr 30:70 bis ungefähr 70:30, bei einigen Ausführungsformen auch bei ungefähr 50:50. Bei alternativen Ausführungsformen kann ein dünner Film von Sorbenskügelchen auf das gemischte poröse Medium geschichtet werden, um die Sorbenskapazität zu erhöhen, ohne die Fähigkeit der Probe, durch das Medium zu fließen, zu beeinflussen.
Im Allgemeinen müssen die Sorbenskügelchen im porösen Medium genügend Bindungsstellen für den Analyten bereitstellen, damit sie die Sorbenswirkungen des porösen Mediums ausüben können. Andererseits stellen die Polymerpartikel die strukturelle Integrität des porösen Mediums bereit, indem sie die Durchmesser der Kanäle durch die Sorbenspartikel und um diese herum aufrechterhalten, wodurch sie die Fähigkeit der Proben, durch das poröse Medium zu fließen, gewährleisten. Als solches stellt das erfindungsgemäße poröse Medium Strukturen bereit, die in der Lage sind, den Durchfluss im Inneren des porösen Mediums aufrecht zu erhalten, aber immer noch eine Vielzahl von Bindungsstellen für den Analyten bereitstellen. Typische Gegendrücke dieser Ausführungsformen sind diejenigen, die beim Pipettieren von Proben in den meisten üblichen Anwendungen zum Einsatz kommen, d. h. dem Entsalzen eines Polypeptidverdaus, der Aufkonzentrierung von DNA in einer wässrigen Lösung und dergleichen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht das poröse Medium zu 50 Gew.-% aus C-18-funktionalisiertem Siliciumdioxid in Kombination mit 50 Gew.-% GUR-X120-Polymer. Bei einigen Ausführungsformen wird das poröse Medium vor dem Einsatz in einem Gehäuse zur Entfernung fehlerhafter Komponenten gesiebt. Zum Beispiel kann das poröse Medium mit einem Sieb von 125 bis 160 μm vorgesiebt werden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des porösen Mediums besteht zu 40 Gew.-% aus C-18-funktionalisiertem Siliciumdioxid in Kombination mit 60 Gew.-% 2122-Polymer.
Die Herstellung des porösen Mediums erfolgt vorzugsweise, indem zunächst die Polymerpartikel und die bindenden Partikel zusammengemischt werden. Das Mischen erfolgt typischerweise für eine Zeit, die ausreicht, die beiden Komponenten gründlich zu mischen, wobei das poröse Medium vorzugsweise eine Viskosität behält, die es dem Medium erlaubt, in ein Dispenserröhrchen oder eine Säule aufgezogen zu werden. Das poröse Medium wird als nächstes mittels bekannter Sintertechniken im Zielgehäuse gesintert. Zu den optimalen Sinterparametern gehören die Zeit, die Temperatur und das Ausmaß der Vollständigkeit, die für das jeweilige poröse Medium erforderlich sind, damit es in ein Zielgehäuse eingebracht werden kann. Zum Beispiel wird, wenn das Polymer Polyethylen ist, eine Sinterung von einer bis zwei Minute(n) bei 140 – 145°C durchgeführt. Im Allgemeinen sollte der Sinterprozess ausreichen, das poröse Medium im Gehäuse zu „fixieren", ohne nennenswerten Schaden hervorzurufen, d. h. ein Schmelzen oder eine Krümmung des Gehäuses.
Im Allgemeinen wird das poröse Medium in ausreichendem Maß zusammengehalten, sodass es seine strukturelle Integrität bewahrt. Die nützlichen Mengen an porösem Medium, zum Beispiel für eine Pipettenspitze, variieren in Abhängigkeit von der Anwendung und der Zusammensetzung des porösen Mediums, d. h. den Mengen der bindenden Partikel. Jedoch sind typischerweise Tiefen von 0,5 bis 5 mm in einer Pipettenspitze und von 0,5 bis 10 mm in einer Säule, mit einem Verhältnis von Polymer zu bindenden Partikeln von ungefähr 50:50, für die meisten Anwendungen nützlich. Man beachte, dass mit dem Ansteigen der Tiefe des porösen Mediums die Fließgeschwindigkeit typischerweise abnimmt, so dass eine gewisse Variation der Zusammensetzung des porösen Mediums durch die Tiefe und den Durchmesser des Gehäuses ausgeglichen werden kann.
Man beachte, dass die Ausführungsformen der Erfindung in Gewichtseinheiten beschrieben werden. Der weite Bereich an prozentualen Zusammensetzungen beruht auf den Auswirkungen der Porosität und der Größe der Kügelchen auf die Dichte der Sorbenskügelchen. Zum Beispiel könnte ein poröses Medium, das 50 % Sorbenskügelchen umfasst, 80 % des porösen Mediums in Volumeneinheiten enthalten, wenn die Dichte signifikant geringer als die des Polyethylens hoher Dichte ist.
Gehäusevorrichtungen
Es kann eine beliebige Zahl unterschiedlicher Gehäusekonfigurationen in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen porösen Medium eingesetzt werden. Zum Beispiel können Gehäuse, die aus unterschiedlichen Typen von Polymeren, Metallen und dergleichen bestehen, zur Aufnahme oder zum Zusammenhalten des porösen Mediums eingesetzt werden. Die Gehäuse können ein offenes Ende oder zwei offene Enden haben, und sie können gegebenenfalls eine Fritte einschließen, um sicherzustellen, dass das poröse Medium nicht aus dem Gehäuse austritt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Pipettenspitze. Typischerweise haben Pipettenspitzen eine konische Form mit zwei offenen Enden, ein Ansaugende und ein Auslassende. Das Ansaugende ist typischerweise von kleinerem Durchmesser als das Auslassende. Zu bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gehört eine Pipettenspitze, die das erfindungsgemäße poröse Medium enthält. Typischerweise enthält nur ein Teil der Pipettenspitze das poröse Medium, und zwar bis zu einer im Voraus festgelegten Tiefe. Die erfindungsgemäßen Pipettenspitzen können Spitzen mit kleinem Volumen einschließen, zum Beispiel 10-μl-Spitzen, oder Spitzen mit größerem Volumen, zum Beispiel 1-ml-Spitzen. Die Pipettenspitze selbst besteht üblicherweise aus Polypropylen. Bei einer Ausführungsform enthält eine 10-μl-Spitze ein an der Stelle des Auslassendes der Spitze gesintertes poröses Medium von 1 – 3 mm Tiefe aus 60 % Polyethylen (GUR X120): 40 % ICN-RP-18-Siliciumdioxidpartikeln. Wie zuvor diskutiert wurde, kann die Tiefe des porösen Mediums in Abhängigkeit von der für die Anwendung erforderlichen Kapazität variiert werden, und sie kann auch bezüglich des in der Kombination des porösen Mediums eingesetzten prozentualen Anteils der bindenden Partikel modifiziert werden.
Vorzugsweise ist das poröse Medium an Ort und Stelle fixiert und verbleibt unter normalen Anwendungsbedingungen im Auslassende der Spitze, d. h. wenige oder gar keine Polymerpartikel oder bindende Partikel werden bei einem Pipettiervorgang aus der Spitze ausgestoßen (siehe Beispiele unten). Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens, und im Gegensatz zum Stande der Technik, erfordert das poröse Medium nicht typischerweise eine Fritte oder eine andere mechanische Vorrichtung für das Zurückhalten des porösen Mediums in der Spitze, auch wenn die Erfindung derartige Ausführungsformen einschließen kann.
Verfahren zur Herstellung von Gehäusen, die ein poröses Medium enthalten
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Gehäuse bereit, die das poröse Medium enthalten. Das bevorzugte Verfahren zur Inkorporation des erfindungsgemäßen porösen Mediums in einen Teil des Gehäuses ist ein Sintern. Zum Zwecke der Veranschaulichung wird die Herstellung einer Pipettenspitze mit einer spezifischen Ausführungsform des porösen Mediums beschrieben.
Die 1 veranschaulicht einen Prozess zur Herstellung multipler Pipettenspitzen, wobei jede Spitze 1 – 3 mm poröses Medium enthält, das in der Nähe des Auslassendes der Spitze oder mit diesem zusammenhängend angeordnet ist. Zunächst wird eine im Voraus festgelegte Menge Polyethylen mit einer im Voraus festgelegten Menge an Siliciumdioxidkügelchen, C-18, unter Bildung einer 50:50-Mischung (in Gewichtseinheiten) 100 gemischt. Die beiden Komponenten werden bei Raumtemperatur unter Bildung einer inhomogenen Mischung 102 gründlich gemischt. Das Medium wird, zum Beispiel unter Einsatz der Schwerkraft, mittels einer Dispensiereinheit, die eine im Voraus festgelegte Menge des porösen Mediums abgibt, in eine Pipettenspitze 104 eingebracht. Ein bevorzugtes Beispiel umfasst Pipettenspitzen, die 1 – 3 mm an porösem Medium am Auslassende der Spitzen enthalten. Im Allgemeinen tritt nur wenig oder gar kein poröses Medium aus dem Auslassende der Spitze aus.
Da das Auslassende der Pipettenspitze ziemlich eng ist, bleibt das poröse Medium typischerweise in der Spitze, bis das Medium in der Spitze gesintert wird. Die Automatisierung des Prozesses ermöglicht es, Sinterblöcke mit der benötigten Zahl an Ziel-Pipettenspitzen zu bestücken. Die Spitzen werden dann ungefähr zwei Minuten bei etwa 140°C gesintert 106.
Die Steuerung der Temperatur in den Sinterblöcken wird vom Typ des Polymers, das für die Gehäuse und im porösen Medium eingesetzt wird, bestimmt. Typischerweise wird das Auslassende der Pipettenspitze für eine im Voraus festgelegte Zeit auf eine im Voraus festgelegte Temperatur erhitzt. Wenn zum Beispiel die Pipettenspitze aus Polypropylen besteht und das poröse Medium ein Polymerelement aufweist, das aus Polyethylen besteht, wird die Spitze ungefähr zwei Minuten auf ungefähr 140 bis 145°C erhitzt. Die Wärme stellt genügend Energie für das Sintern des porösen Mediums im Auslassende der Pipettenspitze bereit. Die Pipettenspitze wird aus dem Sinterblock entnommen, und dann lässt man sie abkühlen 108. Außerdem wird eventuell vorhandenes überschüssiges poröses Medium, das aus der Spitze ausgestoßen wurde, von der Spitze 110 abgewischt. Die Mengen des ausgestoßenen Mediums variieren in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des porösen Mediums und von den Sinterparametern, die bei der Präparation der „beladenen" Gehäusevorrichtung zum Einsatz kommen. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird mittels automatisierter Dispenser- und Sinterblockelemente eine Vielzahl von Spitzen gleichzeitig hergestellt.
Ein Beispiel für einen Sinterblock zur automatisierten Herstellung für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung ist in der 2 gezeigt. Der Sinterblock 112 weist eine Reihe von Hohlräumen 114 für die Aufnahme der Pipettenspitzen 116 auf. Die Hohlräume 114 haben im Wesentlichen die gleiche Kontur wie die Pipettenspitzen 116, und sie haben eine Tiefe, die es ermöglicht, dass das Auslassende 118 der Spitze vom Block bis zu einer Tiefe von wenigstens 4 mm umschlossen wird. Dispensierköpfe 120, die funktionsfähig am Block 112 angebracht sind, dispensieren eine im Voraus festgelegte Menge des porösen Mediums direkt in jede Empfängerspitze. Ein Heizelement ist in der Lage, den Block exakt auf eine bestimmte Temperatur zu erhitzen. Man beachte, dass das poröse Medium vorher gesiebt werden kann, um die Zuführung des porösen Mediums zum Auslass der Pipettenspitze vor dem Erhitzen der Spitzen zu erleichtern. Die Siebvorrichtung ist nicht gezeigt.
Elutionspuffer für das poröse Medium
Die Ausführungsformen der Erfindung schließen hydrophobe Elutionspuffer ein, die für „Reverse-Phase"-Anwendungen nützlich sind, die man über das erfindungsgemäße poröse Medium laufen lässt. Zum Beispiel stiegen die Menge und die Konzentration eines Proteins bei Verwendung einer Kombination aus dem erfindungsgemäßen porösen Medium und einem hydrophoben Elutionspuffer im Vergleich zu den bei Einsatz eines herkömmlichen Elutionspuffers erhaltenen Werten dramatisch an (siehe Beispiel 6).

Die Ausführungsformen der Erfindung schließen Elutionspuffer ein, wie sie in der Tabelle 1 beschrieben werden: Tabelle 1: Ausführungsformen des Elutionspuffers für das poröse Medium

Reagens	Elutionspuffer 1 (μl)	Elutionspuffer 2 (μl)	Elutionspuffer 3 (μl)	Elutionspuffer 4 (μl)
100 % Acetonitril	500	750	250	-
2,5 % TFA	40	40	40	40
n-Propanol	-	-	100	200
Wasser molekularer Reinheit	460	210	610	760
Gesamt	1000	1000	1000	1000

Assays, in denen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen porösen Mediums zum Einsatz kommen
Gehäuse mit dem erfindungsgemäßen porösen Medium können in verschiedenen Assays eingesetzt werden. Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung können in zahlreichen Verfahren eingesetzt werden, zu denen eine Filtration, eine Aufreinigung und Aufkonzentrierung, eine Umschließung von Chemikalien, eine chemische Manipulation und eine Verwendung als Indikator gehören.
Das erfindungsgemäße poröse Medium kann zur Eliminierung von Verunreinigungen in einer Probe, zum Beispiel von Salz, Metallionen, Endotoxinen, eines Farbstoffs und dergleichen, über die kombinierten, mit einem Größenausschluss und der Hydrophobie in Verbindung stehenden Eigenschaften der verschiedenen Ausführungsformen des Mediums eingesetzt werden. Zum Beispiel erhöht die Entfernung von Endotoxinen (Lipopolysacchariden) aus einer Transfektionsreaktion die Transfektionseffizienz dieser Reaktion dramatisch. Hier könnte eine Kombination aus einer Größenausschlusschromatografie und einer hydrophoben Chromatografie eingesetzt werden, zum Beispiel poröse C-4-Kügelchen mit optimierter Porengröße.
Außerdem können die Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung bei der Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung von Zielanalyten in einer Probe, zum Beispiel der Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung von Plasmiden, RNA, gDNA und dergleichen, eingesetzt werden. Hier ist der Anteil der Sorbenskügelchen im Medium von Bedeutung, wobei der Typ und die Menge für die Kapazität des Mediums zur Aufreinigung und/oder Aufkonzentrierung eines Zielanalyten kritisch sind (siehe zum Beispiel Tabelle 2).
Weiterhin können die Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung als Strukturen für die Umschließung von Chemikalien eingesetzt werden, wobei die Sorbenskügelchen so ersetzt oder modifiziert werden, dass sie die interessierende Chemikalie enthalten. Zum Beispiel kann der Polymeranteil des porösen Mediums die interessierende Chemikalie daran hindern, aus dem Gehäuse, zum Beispiel einer Pipettenspitze, auszutreten, bis die interessierende Chemikalie mit einer Probe reagiert. Zum Beispiel kann ein Farbstoff für einen Auftragspuffer in der Pipettenspitze untergebracht werden, wodurch eine definierte Farbstoffmenge zu einer Probe für ein Gel zugefügt wird.
Ferner können die Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung zur Manipulierung von Zellen und anderer, ähnlicher Materialien eingesetzt werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen porösen Mediums so optimiert werden, dass sie einfach als eine undichte Barriere für Zellen und andere ähnliche Materialien wirkt, die durch ein Scheren mit Hilfe des Materials aufgebrochen werden sollen.

Schließlich können die Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung in Verbindung mit einer durchsichtigen Beobachtungskammer als eine Indikatorvorrichtung eingesetzt werden. Zum Beispiel kann ein pH-Indikator-Material gegen die Sorbenskügelchen des porösen Mediums ausgetauscht oder an ihnen angebracht werden. Die Kammern mit den Polymerpartikeln/dem Sorbens/dem pH-Indikator-Material werden dann mit der zu analysierenden Probe in Kontakt gebracht. Der pH-Indikator wird, nachdem er mit der Probe reagiert hat, direkt in den das poröse Medium enthaltenden Kammern betrachtet. Tabelle 2: Potenzielle Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung

Nutzen des porösen Mediums	Erläuterndes Beispiel	Potenzielle Strategie
Filtration: Eliminierung von Verunreinigungen	Salze	Größenausschluss (ähnlich dem Beispiel der Farbstoffentfernung, unten)
	Metallionen	Chelex-Harz in Stopfen
	Debris	entweder Binden, Waschen, Eluieren eines Liganden oder Filtration
	Endotoxin	Hydrophobe Chromatografie (HIC) oder Kombination von HIC/SEC (Größenausschluss) zur Abtrennung von amphipatischem LPS von der größeren DNA
	dNTPs	Größenausschluss oder Kombination von HIC/SEC
	Farbstoff	HIC oder Kombination von HIC/SEC
Modifikationen	Primer	HIC oder Kombination von HIC/SEC
	gDNA	Bindung an chaotropes Siliciumdioxid
	RNA	Siliciumdioxid oder Oligo-dT (für Poly-A)
	Häm	Eisen
	DNase	HIC-Ionenaustausch (IEX)
	Detergens	Hydrophobe Wechselwirkung
	Enzym	HIC, IEX oder Affinitätsreinigung
	Wasserreinigung	Filtration
	PCR-Verunreinigungen	Kombination anderer Techniken zur Entfernung von Verunreinigungen (Chelex, Nucleinsäure etc.)
Molekulargewichtsausschluss	Entfernung von Nucleinsäuren aus Wasser	Siliciumdioxid oder Cu
	Protein	SEC oder Kombination von SEC/HIC
	Nucleinsäure	SEC oder Kombination von Bindung an Siliciumdioxid/SEC
Aufreinigung und Aufkonzentrierung	Plasmid	Binden an Siliciumdioxid, Waschen, Eluieren
	RNA	Siliciumdioxid oder Oligo-dT
	gDNA	(Lysemethodik unter Überschrift Manipulation), Binden an Siliciumdioxid, Waschen, Eluieren
	PCR-Produkte	Binden an Siliciumdioxid, Waschen, Eluieren
	Protein (Säulenchromatografie)	fast jede beliebige Säulenchromatografie-Technik kann in Miniaturform nachgeahmt werden
	Proteinreinigung über SEC	Größenausschluss
	Proteinreinigung über IMAC	Immobilisierte-Metallionen-Chromatografie
	Proteinreinigung über HIC	Hydrophobe Wechselwirkung
	Proteinreinigung über hydrophile Wechselwirkungen	Hydrophile Chromatografie
	Proteinreinigung über IEX	Ionenaustausch
	Proteinreinigung über Affinität	Einsatz von Antikörpern, Liganden, Tags, Farbstoffen oder posttransl.
	His-tagged Protein	Nickel
	verdaute NS	Binden an Siliciumdioxid, Waschen, Eluieren
	Oligonucleotide	HIC oder Kombination von HIC/SEC
	über posttranslationale Modifikation	Trennung aufgrund einer Glycosylierung, Methylierung oder Phosphorylierung
Umschließung von Chemikalien	Lagerung (z. B. von DNA)	Lyophilisation von Material auf Stopfen
	Reaktionsgefäß	inertes Material, das als Gefäß für chemische Reaktionen dienen kann
	Zugabe von Chemikalien zu Reaktionsansatz (z. B. Farbstoff, Ethidiumbromid, Trypsin)	zugegebene Chemikalien können lyophilisiert, in Poren eingeschlossen oder über die Oberflächenspannung zurückgehalten werden
Manipulation	Lysieren von Zellen	Scheren von Zellmembranen durch Pressen durch Poren definierter Größe mit hoher Kraft
	Handhabung von Flüssigkeiten bei HTP-Anwendungen	Einsatz von Spitzen als Verfahren zur Zugabe von Chemikalien oder zur Durchführung von Reaktionen wird HTP-Anwendungen stromlinienförmiger machen
Indikator	Proteinaufkonzentrierung	reaktive Substanz kann an Partikeloberfläche konjugiert werden
	Aufkonzentrierung von NS	reaktive Substanz kann an Partikeloberfläche konjugiert werden (HDPE und/oder Kügelchen)
	pH	Immobilisierung von pH-Indikator-Molekülen an poröse Kügelchen
	Vorliegen anderer Reagenzien	reaktive Substanz kann an Partikeloberfläche konjugiert werden (HDPE und/oder Kügelchen)
	Nachweis über Amplifizierung	Nachweis über Fluoreszenz, potenziell unter Verwendung eines sekundären Indikators zur Amplifizierung des Signals
	Temperatur	Immobilisierung/Inkorporation temperaturempfindlicher Moleküle/Partikel

Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, wird sie durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung gebracht werden und die Erfindung nicht einschränken sollen, besser verständlich werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung eines porösen Mediums auf der Basis von Polyethylen hoher Dichte : Siliciumdioxid
Das folgende Beispiel stellt das Rezept zur Herstellung einer Ausführungsform des porösen Mediums der vorliegenden Erfindung bereit. Ungefähr 1 g Polyethylen hoher Dichte, bezogen von Ticona AG, wurde 5 Minuten mit 1 g C-18-Siliciumdioxid-Partikeln (32 – 63 Mikrometer, 100 Angstrom, ICN-RP18), bezogen von ICN Inc., gemischt. Die Komponenten wurden bei Raumtemperatur mittels eines von IKA hergestellten MS1-Minishakers gemischt. Die Vereinigung führte zu einem Verhältnis der Siliciumdioxidpartikel zu den Polyethylenpartikeln von 1:1. Das poröse Medium kann mit Hilfe der Schwerkraft oder mittels mechanischer Vorrichtungen in ein Zielgehäuse eingeführt werden. Die Sinterparameter für diese Zusammensetzung waren 155°C auf einem Sinterblock für 2 Minuten.
Beispiel 2: Das poröse Medium zeigte unter normalen Einsatzbedingungen nur ein geringes oder kein Austreten der Partikel aus einer Pipettenspitze
Es wurde ein Assay auf das Austreten von Partikeln durchgeführt, um das Ausmaß des „Austretens" von porösem Medium, das in einer Pipettenspitze gesintert wurde, zu bestimmen. Das Ausmaß des Austretens wurde nach normalen Einsatzbedingungen der Pipettenspitze, d. h. bezüglich der Volumina, Temperaturen und Drucke, bestimmt. Pipettenspitzen mit Betten aus 2 mm porösem Medium wurden wie im Beispiel 1 diskutiert hergestellt. Das poröse Medium in den einzelnen Spitzen wurde zunächst angefeuchtet, mit Puffer äquilibriert, und die Probe wurde gebunden, gewaschen und unter Einsatz eines Standardprotokolls zur Entsalzung eluiert. Im Einzelnen wird eine Pipette auf 10 μl eingestellt und fest an einer das poröse Medium enthaltenden Pipettenspitze, wie sie oben beschrieben wurde, befestigt. Der Pipettenkolben wird niedergedrückt, um 10 μl der Lösung zur Vorbefeuchtung aufzusaugen. Die Vorbefeuchtungslösung wird verworfen, und der Prozess wird wiederholt. Ungefähr 10 μl der Äquilibrierungs-/Waschlösung werden durch das poröse Medium aufgesaugt und verworfen, und der Prozess wird wiederholt. Es wurde eine Lösung von Wasser aufgesaugt und durch das poröse Medium ausgestoßen und nach jedem Zyklus auf einen Objektträger aus Glas abgegeben und trocknen gelassen.
Alle Objektträger wurden dann bei einer Vergrößerung von 40x bis 200x in Augenschein genommen, um die Menge des ausgestoßenen porösen Mediums, das im Durchfluss und im Eluat vorhanden war, zu bestimmen.
Die Daten aus einer Testreihe zeigten, dass nur wenig oder gar kein poröses Medium bei diesen Standard-Entsalzungsprotokollen ausgestoßen wurde. Tatsächlich war in einer Serie von mehr als zehn Tests mittels dieser visuellen Techniken kein poröses Medium nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Dieses Beispiel veranschaulicht erneut, dass die das gesinterte poröse Medium enthaltenden Pipettenspitzen für die Aufrechterhaltung der Integrität in der Pipettenspitze keine Klebstoffe, mechanische Hilfsmittel (zum Beispiel Fritten) oder andere Fixierungsverfahren als ein Sintern erfordern.
Beispiel 3: Das poröse Medium hat eine hohe Bindungskapazität für Analyten, wie mittels eines Coomassie-Blue-Bindungsassays bestimmt wurde
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bindungskapazität mehrerer verschiedener Zusammensetzungen des porösen Mediums. Zunächst wurde das Verhältnis der Polymerpartikel zu den bindenden Partikeln variiert, um das Verhältnis zu bestimmen, das eine optimale Bindungskapazität bereitstellt. Als nächstes wurden die Zusammensetzungen der bindenden Partikel des porösen Mediums bezüglich mehrerer verschiedener C-18-Siliciumdioxidpartikel variiert, um ein optimales C-18-Siliciumdioxid zu ermitteln.
Zunächst wurde die Kapazität unterschiedlicher Verhältnisse von Polymer zu bindenden Partikeln mittels eines Coomassie-Blue-Bindungsassays bestimmt. Coomassie Blue ist ein kleines hydrophobes Farbstoffmolekül, das zur Abschätzung der Affinität eines porösen Mediums für Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht eingesetzt werden kann. Generell wurde jede getestete Zusammensetzung des porösen Mediums zunächst angefeuchtet und in einem normalen Entsalzungsprotokoll äquilibriert (siehe Beispiel 1). Der Farbstoff wurde dann zehnmal durch die einzelnen Spitzen geleitet. Das poröse Medium in jeder Spitze wurde dann zweimal mit 0,1 %-iger TFA-Lösung gewaschen, und der gebundene Coomassie-Farbstoff wurde mit 70 % Acetonitril/0,1 % TFA in einem Volumen von 10 μl eluiert. Die Coomassie-Menge im Eluat wurde mittels eines Spektralfotometers gemessen, und der Extinktionswert wurde mit Hilfe einer Standardkurve in Nanogramm Material umgerechnet.
Wie in der 3 gezeigt ist, wurden die Polymere GUR X120 oder GUR 2122 mit 30, 50, 60 oder 70 Gew.-% an C-18-Siliciumdioxid-Partikeln (ICN RP-18) gemischt, um vier verschiedene Zusammensetzungen des porösen Mediums (insgesamt acht) herzustellen. Jede Zusammensetzung des porösen Mediums wurde in einer 10-μl-Pipettenspitze gesintert, und die Bindungskapazität wurde mittels des Tests auf die Kapazität zur Bindung von Coomassie Blue wie oben beschrieben getestet. Das in der 3 gezeigte Säulendiagramm macht deutlich, dass GUR X120 durchweg höhere Bindungskapazitäten für Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht bereitstellte als GUR 2122, auch wenn beide Polymerkomponenten adäquate Ergebnisse lieferten, d. h. solche, die mit den bei Einsatz herkömmlicher Verfahren erzielbaren Kontrollmengen vergleichbar waren. Weiterhin zeigten Zusammensetzungen des porösen Mediums mit 50 bis 70 Gew.-% an C-18-Partikeln höhere Bindungskapazitäten als die Zusammensetzung mit 30 % Siliciumdioxid oder eine als Kontrolle dienende Spitze eines Mitkonkurrenten. Diese Daten zeigen, dass Zusammensetzungen des porösen Mediums mit lediglich 30 Gew.-% an bindenden Partikeln eine beträchtliche Bindungsaffinität für Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht zeigten, und dass beide Typen des Polyethylenpolymers (GUR X120 und GUR 2122) als Polymerbestandteil in den Zusammensetzungen des erfindungsgemäßen porösen Mediums nützlich waren.
Die 4 veranschaulicht, dass verschiedene Typen bindender Partikel aus Siliciumdioxid unterschiedliche Wirkungen auf die Bindungskapazität des porösen Mediums haben. Jeder Typ der getesteten Siliciumdioxidpartikel wurde mit 50 Gew.-% GUR X120-Polymer gemischt und bezüglich der Coomassie-Blue-Bindung getestet (wie oben). (Man beachte, dass in jedem Fall die Siliciumdioxidpartikel 50 Gew.-% des porösen Mediums ausmachten.) Wie aus den Ergebnissen in der 5 hervorgeht, sind verschiedene Typen von Siliciumdioxidpartikeln bezüglich der Bindung von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht effektiver, auch wenn alle getesteten Siliciumdioxidpartikel eine gewisse Bindung zeigten. Bevorzugte Ergebnisse wurden mit RP-18 von ICN, Argonaut Isolute MFC, Argonaut Isolute und Argonaut Isolute end-capped erhalten.
Dieses Beispiel liefert einen Beleg für den Nutzen des porösen Mediums für die Bindung von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, die unter gleichen Bedingungen eindrucksvoller war als die wenigstens einer häufig für die gleichen Zwecke eingesetzten Spitze eines Mitkonkurrenten.
Beispiel 4: Das poröse Medium konzentriert und trennt die Peptide von verdautem Cyt c
Die Bindungskapazität des in Beispiel 1 beschriebenen porösen Mediums wurde mittels eines Assays auf die Kapazität zur Bindung von Cytochrom c mit Hilfe einer SDS-PAGE bestimmt. Cytochrom c, ein Protein von ungefähr 13 000 Dalton, wurde mittels des im Beispiel 2 beschriebenen Entsalzungsprotokolls an poröses Medium in Pipettenspitzen gebunden. Im Einzelnen wurde eine Probe, die 1 μg Cyt c enthielt, zehnmal über das poröse Medium geleitet. Das Protein wurde in fünf Mikrolitern 70 %-igem Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde Seite an Seite mit dem Durchfluss der Reaktion auf ein 15 %-iges SDS-Polyacrylamid-Gel geladen, und das Protein wurde mit Hilfe eines Standardprotokolls der Silberfärbung sichtbar gemacht. Es wurden die Gesamtmengen des Proteins im Eluat und im Durchfluss sichtbar gemacht, wodurch die Wirksamkeit des porösen Mediums bezüglich der Abtrennung eines Proteins von 13 kDa angezeigt wurde. Für die Zwecke dieses Beispiels wurde eine Gesamttiefe von 3 mm eingesetzt.
Wie in der 5 gezeigt ist, war das poröse Medium (GUR X120 + 50 % ICN RP-18) bezüglich der Abtrennung der Peptide des Cyt c von der Probe extrem effektiv, und es war mit den Ergebnissen vergleichbar, die mit einer herkömmlichen Pipettenspitze von MilliPore (Produkt-Nr. ZTC18M096) erhalten wurden. Man beachte, dass der größte Teil des Cyt c in der Spitze zurückgehalten wurde; siehe die Spur des Eluats im Vergleich zur Gesamtmenge des Cyt c im Durchfluss. Dieses Beispiel veranschaulicht erneut den Nutzen der Erfindung bezüglich der Bindungskapazität für Proteine mit einer Größe von 13 kDa.
Beispiel 5: Das poröse Medium bewirkt die Entsalzung eines Proteinverdaus
Die Effektivität des porösen Mediums bezüglich der Entsalzung eines Verdaus aus Peptiden wurde mittels eines MALDI-TOF-Assays bestimmt. Pipettenspitzen mit dem erfindungsgemäßen porösen Medium wurden wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Eine Zusammensetzung des porösen Mediums wurde zur Entsalzung von Proteinverdaus eingesetzt, um zu bestimmen, ob ein MS-Spektrum mit einem starken Signal und niedrigem Hintergrund erzeugt werden würde. Es wurden ungefähr 100 ng eines in einem Röhrchen verdauten Cytochrom c untersucht. Es wurden Elutionen mit einem Puffer aus 75 % Acetonitril und 0,1 % TFA und einer mit der Kristallisationsmatrix α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure gesättigten Lösung aus 50 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure verglichen.
Die 6A und 6B zeigen die Spektren für einen ungereinigten Cytochrom-c-Verdau, der in einer Speed-Vac auf das gleiche Volumen aufkonzentriert wurde, das bei der Aufkonzentrierung mit dem erfindungsgemäßen porösen Medium erhalten wurde (ungefähr 20 Mikroliter bis 3 Mikroliter). Die mittels der Speed-Vac aufkonzentrierte Probe wurde auf ein MS-Target gespottet und mit Kristallisationsmatrix überschichtet.
Zum Vergleich zeigen die 6C und 6D die gleiche, mit einem 2 mm dicken porösen Medium (50 % GUR X120 mit 50 % ICN RP-18) entsalzte und von einem Ausgangsvolumen von 20 Mikroliter auf drei Mikroliter konzentrierte Ausgangsprobe. Die Proben wurden direkt auf das MS-Target eluiert (C) oder mit einem Elutionspuffer aus 75 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert und auf das MS-Target gespottet. Die Proben wurden mit Kristallisationsmatrix überschichtet.
Die Daten in diesem Beispiel veranschaulichen die Effektivität des erfindungsgemäßen porösen Mediums bezüglich der Entsalzung des Verdaus aus Peptiden. Man vergleiche die in den 6A und B gezeigten Signale und Hintergründe mit den in den 6C und 6D gezeigten.
Beispiel 6: Das poröse Medium entfernt nicht-inkorporierten Farbstoff aus Markierungsreaktionen
Eine Pipettenspitze mit einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen porösen Mediums wurde zur Entfernung von nicht inkorporiertem Farbstoff aus einer BSA-Markierungsreaktion eingesetzt. Die Pipettenspitzen wurden mit C-18-Polyethylenkügelchen mit Poren von ungefähr 100 Å im Durchmesser mit einer Tiefe von 2 mm präpariert. Die Farbstoffproben wurden gemäß dem Kit Nummer PA25001 von Amersham in Natriumcarbonat hergestellt. Die Proben wurden mit nicht-markiertem BSA, markiertem BSA ohne Farbstoff und markiertem BSA in Gegenwart von Farbstoff [ungefähr 5 Mikroliter BSA mit einer Konzentration von 1 mg/ml (markiert mit Cy5) wurden mit 5 Mikroliter Farbstoff, der wie oben hergestellt worden war, gemischt] präpariert. Die einzelnen Proben wurden zehnmal in einer Pipettenspitze auf und ab bewegt, und dann ließ man sie auf einem 8 – 16 %-igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengel (Biorad-Criterion-Gel) laufen. Für den Vergleich der erfindungsgemäßen Medienzusammensetzungen mit anderen Technologien zur Farbstoffentfernung wurde eine Probe aus Farbstoff/BSA als Positivkontrolle über eine Sephadex-G50-Säule geleitet (siehe Spur 2).
Wie in der 7 gezeigt ist, kommt es bei jedem Durchlauf einer Probe aus BSA/Farbstoff durch das erfindungsgemäße Medium zur sukzessiven Entfernung von nicht inkorporiertem Farbstoff (vergleiche die Spur 4 mit den Spuren 5 – 7). Die Ergebnisse zeigen, dass die Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Pipettenspitzen Ergebnisse liefern, die den für Sephadex-G-50 gezeigten äquivalent sind.
Das vorliegende Beispiel veranschaulicht, dass das erfindungsgemäße poröse Medium für die Unterscheidung zwischen größeren und kleineren Molekülen nützlich ist. Kleinere Moleküle, wie nicht-inkorporierte Farbstoffe, werden durch eine Kombination aus Größenausschlusschromatografie und hydrophober Chromatografie aus der Probe entfernt, wenn das kleinere Material in die porösen Kügelchen wandert und an die internen Oberflächen der Polymerpartikel bindet. Größere Moleküle, zum Beispiel markiertes BSA, sind zu groß, als dass sie in die Poren eindringen könnten, und treten deshalb aus der Spitze aus.
Beispiel 7: Das poröse Medium kann Metallionen und andere Verunreinigungen biologischer Proben aus biologischen Proben eliminieren
Das erfindungsgemäße poröse Medium kann zur Entfernung von Metallionen aus Nucleinsäurelösungen vor einer PCR oder einer anderen, gegenüber Metallionen empfindlichen Reaktion eingesetzt werden. Wie man weiß, limitieren oder behindern verschiedene Metallionen den Ablauf der PCR. Diese Metallionen liegen häufig in Puffern und wässrigen Lösungen vor, die in Standard-PCR-Protokollen eingesetzt werden. Ausführungsformen des porösen Mediums der Erfindung können wie im Beispiel 1 hergestellt werden, typischerweise mit einer Tiefe von 2 – 5 mm. Die Nucleinsäure-haltigen Proben mit kontaminierenden Metallionen werden durch die das poröse Medium enthaltenden Pipettenspitzen geleitet.
Es wird erwartet, dass ungefähr 1,62 × 10^-2 bis 1,34 × 10^-1 mol/mg Harz eines jeden Ziel-Metallions entfernt werden, wenn sie über die Ausführungsformen des erfindungsgemäßen porösen Mediums geleitet werden, während andere Bestandteile des Reaktionspuffers für den Einsatz in der PCR durchtreten.
Das vorliegende Beispiel dürfte zeigen, dass Ausführungsformen der Erfindung den Chelex-Säulen (BioRad Inc.) vergleichbar sind und aufgrund des anpassungsfähigeren Formats den Chelex-Säulen vorzuziehen sind.

Claims

Vorrichtung zur Reinigung und/oder Konzentrierung einer Lösung, wobei die Vorrichtung umfasst: ein Gehäuse mit einer Gehäusewand, die ein internes Volumen definiert, und ein poröses Medium in wenigstens einem Teil des internen Volumen des Gehäuses, wobei das poröse Medium eine fixierte Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen umfasst und Poren zwischen der Gehäusewand, den Polymerpartikeln und den Sorbenskügelchen oder irgendeiner Kombination von diesen definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse Medium unter Einsatz von Temperaturen, die nicht die Schmelztemperatur der Polymerpartikel überschreiten, in dem Gehäuse gesintert wurde.
Vorrichtung, wie sie im Anspruch 1 beansprucht wird, bei der die Sorbenskügelchen aus der aus C4-, C8- und C18-Siliciumdioxidpartikeln bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Vorrichtung, wie sie im Anspruch 2 beansprucht wird, bei der die Siliciumdioxidpartikel vom C18-Typ sind.
Vorrichtung, wie sie in einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche beansprucht wird, bei der das poröse Medium bis zu 95 Gew.-% an Sorbenskügelchen umfasst.
Vorrichtung, wie sie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, bei der das poröse Medium 30 bis 70 Gew.-% an Sorbenskügelchen umfasst.
Vorrichtung, wie sie in einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche beansprucht wird, bei der die Polymerpartikel alle einen mittleren Durchmesser von ungefähr 1 bis 500 μm haben.
Vorrichtung, wie sie in einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche beansprucht wird, bei der die Polymerpartikel aus Partikeln aus Polyethylen hoher Dichte bestehen.
Vorrichtung, wie sie in einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Vorrichtung eine Pipettenspitze ist.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung, wie sie in einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen, Injizieren einer Menge der Mischung aus Polymerpartikeln und Sorbenskügelchen in das Gehäuse, die ausreicht, wenigstens einen Teil des Gehäuses zu füllen, Fixieren der Mischung aus Sorbenskügelchen und Polymerpartikeln im Gehäuse unter Bildung des besagten porösen Mediums, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung durch ihr Sintern innerhalb des Gehäuses unter Einsatz von Temperaturen, die nicht die Schmelztemperatur der Polymerpartikel überschreiten, fixiert wird.
Verfahren, wie es im Anspruch 9 definiert ist, wobei die Sorbenskügelchen C18-Siliciumdioxidpartikel sind.
Verfahren, wie es im Anspruch 9 oder im Anspruch 10 definiert ist, wobei das Fixieren der Mischung durch das Erhitzen der Mischung aus Sorbenskügelchen und Polymerpartikeln auf eine Temperatur von 160 °C erfolgt.
Verfahren, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 11 definiert ist, wobei die Polymerpartikel alle einen mittleren Durchmesser von ungefähr 1 bis ungefähr 500 μm haben.
Verfahren, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 12 beansprucht wird, wobei das poröse Medium ungefähr 5 bis ungefähr 95 % an Sorbenskügelchen einschließt.
Verfahren, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 12 beansprucht wird, wobei das poröse Medium ungefähr 30 bis ungefähr 70 Gew.-% an Sorbenskügelchen einschließt.
Verfahren, wie es in einem beliebigen der Ansprüche 9 bis 14 beansprucht wird, wobei die besagten Polymerpartikel aus Partikeln aus Polyethylen hoher Dichte bestehen.