DE602004013372T2 - Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHER BEREICH
  • Die Erfindung betrifft Interleukin-7-(IL-7-)Fusionsproteine, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung. Die Fusionsproteine enthalten einen Immunglobulinteil, der direkt oder indirekt mit IL-7 fusioniert ist, das verglichen mit dem Wildtpy-IL-7 an spezifischen Positionen modifiziert wurde, um die biologischen und pharmazeutischen Eigenschaften zu verbessern. Die erfindungsgemäßen Proteine sind insbesondere für die Behandlung von Störungen, die mit Immundefekten einhergehen und insbesondere von Erkrankungen, an denen ein T-Zell-Mangel beteiligt ist, von Nutzen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • An einer Vielzahl von Störungen und Therapien ist ein Mangel an Immunzellen beteiligt. Zum Beispiel führt eine HIV-Infektion zu einem Verlust an CD4+-T-Zellen, während Therapien wie eine Chemotherapie und Strahlungstherapie im Allgemeinen zu einem Verlust einer breiten Vielzahl an verschiedenen Blutzellen führen. Es wurden Versuche unternommen, spezifische Proteinwirkstoffe bereitzustellen, die spezifische Arten von als Folge einer Erkrankung oder Therapie verloren gegangenen Immunzellen zu ergänzen. Zum Beispiel wird in der Krebschemotherapie Erythropoetin verwendet, um die roten Blutkörperchen zu ergänzen, der Granulozytenkolonie stimulierende Faktor (G-CSF) wird verwendet, um Neutrophile zu ergänzen, und der Granulozyten-Makrophagenkolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) wird verwendet, um Granulozyten und Makrophagen zu ergänzen. Diese Proteinwirkstoffe haben, obwohl von großem Nutzen, eine recht kurze Halbwertszeit im Serum, sodass die Ergänzung von Immunzellen oftmals unzureichend ist. Darüber hinaus ist derzeit keinerlei spezifische Behandlung in klinischer Anwendung, um spezifisch die Entwicklung von T- oder B-Zellen zu stimulieren, obwohl der Verlust dieser Zellen als Folge einer Erkrankung oder nach bestimmten myeloablativen Behandlungen bekanntermaßen schädlich für die Gesundheit eines Patienten ist. Daher besteht auf dem Gebiet ein Bedarf, für das Immunsystem Stimulatoren und Stärkungsmittel zu entwickeln, insbesondere für Lymphozyten, die eine verlängerte Halbwertszeit im Serum aufweisen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Interleukin-7-(IL-7-)Fusionsproteine, die verglichen mit den korrespondierenden Wildtyp-IL-7-Proteinen verbesserte biologische Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus beruht die vorliegende Erfindung, teilweise, auf der Erkenntnis, dass IL-7-Fusionsproteine mit bestimmten strukturellen Merkmalen verglichen mit dem rekombinanten Wildtyp-IL-7 verbesserte biologische Eigenschaften aufweisen.
  • Alternative IL-7-Fusionsproteine wurden in WO 02/079232 (Lexigen) und in WO 04/018681 (Cytheris) beschrieben.
  • WO 04/018681 , das früher eingereicht, aber später veröffentlicht wurde als die vorliegende Erfindung, beschreibt Konstrukte, in denen IL-7-Konformere, die Modifizierungen der aus den drei Disulifdbrücken Cys: 1–4 (Cys2–Cys92), 2–5 (Cys34–Cys129) und 3–6 (Cys47–Cys141) bestehenden Aminosäuresequenz von IL-7 enthalten, durch eine Peptid-Gelenk-Region funktional an Fc-Teile der schweren IgG-Kette gebunden sind, wobei dieses IgG ein humanes IgG1 oder IgG4 ist. Diese spezifischen Konstrukte sind, sofern sie unter den Vorbehalt von Anspruch 1 fallen, ausdrücklich in der folgenden Beschreibung der Erfindung ausgeschlossen.
  • Demzufolge bietet die Erfindung in einem Aspekt ein Fusionsprotein, das einen ersten, eine Immunglobulin-(Ig-)Kette enthaltenden Teil und einen zweiten, Interleukin-7 (IL-7) enthaltenden Teil umfasst, wobei das IL-7-Fusionsprotein verglichen mit dem Wildtyp-IL-7 eine erhöhte biologische Aktivität wie z. B. eine verlängerte Halbwertszeit im Serum oder bei der Förderung des Überlebens oder der Vermehrung von Immunzellen aufweist.
  • In einer Ausführungsform bietet die Erfindung ein Fusionsprotein, das einen ersten, eine Ig-Kette umfassenden Teil und einen zweiten, IL-7 enthaltenden Teil umfasst, wobei die Aminosäurereste an den Positionen 70 und 91 von IL-7 glykosyliert sind und der Aminosäurerest an Position 116 von IL-7 nicht glykosyliert ist. Durch dieses Dokument hindurch beziehen sich die Aminosäure-Positionen von IL-7 auf die entsprechenden Positionen in der reifen, humanen IL-7-Sequenz. In einer Ausführungsform ist der Aminosäurerest an Position 116 von IL-7 Asparagin. In einer weiteren Ausführungsform ist der Aminosäurerest an Position 116 von IL-7 verändert, sodass er nicht mehr als eine Glykosylierungsstelle dienen kann. In einer Ausführungsform enthält die IL-7-Einheit Disulfidbindungen zwischen Cys2 und Cys92, Cys34 und Cys129, sowie Cys47 und Cys141 von IL-7, unter dem Vorbehalt wie in Anspruch 1 angegeben.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Fusionsprotein, das einen ersten, eine Ig-Kette enthaltenden Teil und einen zweiten, IL-7 enthaltenden Teil umfasst, wobei das IL-7 Disulfidbindungen zwischen Cys2 und Cys92, Cys34 und Cys129, sowie Cys47 und Cys141 von IL-7 enthält, unter dem Vorbehalt wie in Anspruch 1 angegeben. In einer Ausführungsform ist der Aminosäurerest an Position 116 von IL-7 nicht glykosyliert. In einer weiteren Ausführungsform ist der Aminosäurerest an Position 116 von IL-7 Asparagin oder ist verändert, sodass er nicht mehr als eine Glykosylierungsstelle dient. In einer weiteren Ausführungsform sind die Aminosäurereste an Positionen 70 und 91 von IL-7 glykosyliert.
  • Die Ig-Kette ist im Allgemeinen ein intakter Antikörper oder ein Teil davon, wie z. B. eine Fc-Region. Die Ig-Kette des IL-7-Fusionsproteins kann von jedem bekannten Ig-Isotyp stammen und kann mindestens einen Teil von einer oder mehreren konstanten Domänen umfassen. Zum Beispiel kann die konstante Domäne aus der Gruppe bestehend aus einer CH1-Region, einer Gelenk-Region, einer CH2-Region und einer CH3-Region ausgewählt werden. In einer Ausführungsform umfasst die Ig-Einheit eine Gelenk-Region, eine CH2-Region und eine CH3-Region. Die Ig-Kette wird gegebenenfalls durch einen Linker mit dem IL-7-Teil verbunden.
  • In der vorliegenden Erfindung sind Ig-Einheiten eines einzelnen Antikörper-Isotyps wie z. B. IgG1 oder IgG2, sowie hybride Ig-Einheiten erlaubt. Zum Beispiel umfasst in einer Ausführungsform die Ig-Einheit eine von einem Isotyp (d. h. IgG2) stammende Gelenk-Region und eine von einem weiteren Isotyp (d. h. IgG1) stammende CH-Region. Eine Ig-Kette, die einen Fc-Teil von IgG1 umfasst, kann vorteilhafterweise modifiziert werden, sodass sie die Mutationen Asn297Gln und Tyr296Ala enthält. Darüber hinaus kann eine Ig-Kette, die einen Fc-Teil von IgG2 umfasst, vorteilhafterweise modifiziert werden, so dass sie die Mutationen Asn297Gln und Phe296Ala enthält.
  • Der IL-7-Teil des oben beschriebenen IL-7-Fusionsproteins kann den reifen Teil des IL-7-Teils enthalten. In einer Ausführungsform kann der IL-7-Teil weiterhin eine Deletion umfassen, wie z. B. eine innere Deletion. In einem Beispiel kann IL-7 eine Deletion von achtzehn Aminosäuren, nämlich der Aminosäuren 96 bis 114 von SEQ ID NO: 1 enthalten.
  • In weiteren Ausführungsformen umfasst die Erfindung gereinigte Nucleinsäuren, die für die oben beschriebenen IL-7-Fusionsproteine kodieren, sowie kultivierte Wirtszellen, die diese Nucleinsäuren enthalten.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines IL-7-Fusionsproteins, umfassend die Expression der oben beschriebenen Nucleinsäure in einer Wirtszelle und Ernten des Fusionsproteins.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung eine Zusammensetzung wie z. B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das oben beschriebene Fusionsprotein umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen zur Behandlung eines Patienten durch Verabreichen von Fc-IL-7-Fusionsproteinen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER
  • 1 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem IL-7 (SEQ ID NO: 1). Die Signalsequenz ist fett gedruckt. Ebenfalls fett und kursiv gedruckt ist eine Reihe von achtzehn Aminosäuren, die aus der IL-7-Sequenz deletiert werden können.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz des IL-7 der Kuh (SEQ ID NO: 2). Die Signalsequenz ist fett gedruckt.
  • 3 zeigt die Aminosäuresequenz des IL-7 des Schafs (SEQ ID NO: 3). Die Signalsequenz ist fett gedruckt.
  • 4 zeigt die Aminosäuresequenz von reifem humanem Fcγ1-IL-7 (SEQ ID NO: 4).
  • 5 zeigt die Aminosäuresequenz von reifem, humanem Fcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 (SEQ ID NO: 5).
  • 6 zeigt die Aminosäuresequenz von reifem, humanem Fcγ1(Linker 1)-IL-7 (SEQ ID NO: 6).
  • 7 zeigt die Aminosäuresequenz von reifem, humanem Fcγ1(YN > AQ)(Linker 2)-IL-7 (SEQ ID NO: 7).
  • 8 zeigt die Aminosäuresequenz von reifem humanem Fcγ1(YN > AQ, d)(Linker 2)-IL-7 (SEQ ID NO: 8).
  • 9 zeigt die Nucleinsäuresequenz für die Fc-Region von humanem Fcγ1-IL-7 (SEQ ID NO: 22).
  • 10 zeigt die Nucleinsäuresequenz für die Fc-Region von humanem Fcγ1(YN > AQ)-IL-7 (SEQ ID NO: 21).
  • 11 zeigt die Nucleinsäuresequenz für die Fc-Region von humanem Fcγ2(h)-IL-7 (SEQ ID NO: 20).
  • 12 zeigt die Nucleinsäuresequenz für die Fc-Region von humanem Fcγ2(h)(FN < AQ)-IL-7 (SEQ ID NO: 19).
  • 13 ist eine graphische Darstellung des pharmakokinetischen Profils von rekombinantem, humanem IL-7 (offene Quadrate) und dem Fusionsprotein Fcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 (offene Rauten) aus Beispiel 7. Die Serumkonzentration der verabreichten IL-7-Fusionsproteine (in ng/ml) wurde über die Zeit (in Stunden) gemessen.
  • 14 ist eine graphische Darstellung der B-Zellrekonstitution in bestrahlten Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit rekombinantem, humanem IL-7 (offene Symbole), humanem Fc-IL-7 (gefüllte Symbole) oder PBS (X) behandelt wurden. Die Proteine wurden alle zwei Tage (Quadrate) oder einmal pro Woche (Dreiecke) verabreicht. Die gestrichelte Linie stellt die B-Zellkonzentration in Spendermäusen dar.
  • 15 ist eine graphische Darstellung der T-Zellrekonstitution in bestrahlten Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit rekombinantem, humanem IL-7 (offene Symbole), humanem Fc-IL-7 (gerillte Symbole) oder PBS (X) behandelt wurden. Die Proteine wurden alle zwei Tage (Quadrate) oder einmal pro Woche (Dreiecke) verabreicht. Die gestrichelte Linie stellt die T-Zellkonzentration in Spendermäusen dar.
  • 16 ist ein Dot Blot, das Lymphozytenpopulationen von Blut-(obere Reihe) und Milzproben (untere Reihe) von bestrahlten Mäusen mit transplantiertem Knochenmark, die mit Fcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 (die ersten beiden Spalten) behandelt wurden, sowie unbehandelte Kontrollen (letzte Spalte) darstellt. Die erste Spalte stellt rekonstituierte endogene Lymphozyten (CD45.2+) dar und die zweite Spalte stellt rekonstituierte Spenderlymphozyten dar (CD45.1+). T-Lymphozyten wurden als CD3-positive Zellen nachgewiesen, die im unteren rechten Quadranten gezeigt sind. B-Lymphozyten wurden als B220-positive Zellen nachgewiesen, die im unteren linken Quadranten gezeigt sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt IL-7-Fusionsproteine bereit, die verglichen mit dem Wildtyp-IL-7-Proteinen verstärkte biologische Aktivität aufweisen. Insbesondere stellt die Erfindung IL-7-Fusionsproteine bereit, die einen Immunglobulin-(Ig-)teil umfassen. Diese Ig-IL-7-Fusionsproteine haben verglichen mit den Wildtyp-IL-7-Proteinen eine verstärkte biologische Aktivität wie z. B. eine verlängerte Halbwertszeit im Serum, was sie zur Verwendung bei der Behandlung von Zuständen, die von Immunzelldefekten wie z. B. Lymphozytenmangel begleitet werden, geeignet macht.
  • Die Erfindung beruht des Weiteren auf der Erkenntnis, dass IL-7-Fusionsproteine, die bestimmte strukturelle Eigenschaften aufweisen, auch verstärkte biologische Eigenschaften aufweisen. Während die Aminosäuresequenz von Säugetier-IL-7 wohlbekannt ist, bleiben Informationen über die Struktur der von Eukaryoten stammenden IL-7-Proteine, einschließlich zum Beispiel der Frage, wie die Proteine falten und welche Wirkung die vorausgesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen auf ihre biologische Aktivität haben, schlecht definiert. Zum Beispiel besitzt das humane IL-7-Protein ein Cystein in den Positionen 2, 34, 47, 92, 129 und 141 des reifen Proteins und drei potenzielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen an den Positionen Asparagin (Asn)70, Asn91 und Asn116. Die exakte Struktur von IL-7, das unter eukaryotischen Bedingungen hergestellt wird, ist jedoch unbekannt.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst IL-7-Fusionsproteine mit bestimmten strukturellen Formen und erhöhter biologischer Aktivität. Zum Beispiel sind IL-7-Fusionsproteine mit einem Disulfidbindungsmuster von Cys2–Cys92, Cys34–Cys129 und Cys47–141 mit dem Vorbehalt von Anspruch 1 in vivo aktiver als ein rekombinantes Wildtyp-IL-7-Protein.
  • Darüber hinaus stellt die Erfindung eine Form eines IL-7-Fusionsproteins bereit, bei dem nur zwei der drei potenziellen N-verknüpften Glykosylierungsstellen von IL-7 glykosyliert sind. Insbesondere sind Asn70 und Asn91 des reifen Proteins glykosyliert, während die vorausgesagte N-verknüpfte Glykosylierungsstelle am IL-7 Asn116 nicht glykosyliert ist. Ein solches IL-7-Fusionsprotein ist in vivo aktiver als ein rekombinantes Wildtyp-IL-7.
  • Die Erfindung umfasst auch IL-7-Fusionsproteine, bei denen die IL-7-Einheit eine Deletion enthält und die verglichen mit den entsprechenden unmodifizierten IL-7-Fusionsproteinen eine vergleichbare Aktivität beibehalten. Z. B. stellt die Erfindung eine Form von Ig-IL-7 bereit, bei der die IL-7-Einheit eine innere Deletion von achtzehn Aminosäuren, die der Sequenz VKGRKPAALGEAQPTKSL (SEQ ID NO: 9) entsprechen, enthält.
  • Interleukin-7-Fusionsproteine
  • Typischerweise ist der IL-7-Proteinteil an ein Trägerprotein gebunden. In einer Ausführungsform befindet sich das Trägerprotein in Richtung des N-Terminus des Fusionsproteins und das IL-7-Protein befindet sich in Richtung des C-Terminus. In einer weitere Ausführungsform befindet sich das IL-7-Fusionsprotein in Richtung des N-Terminus des Fusionsproteins und das Trägerprotein befindet sich in Richtung des C-Terminus.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff „Interleukin-7" oder „IL-7" IL-7-Polypeptide und Derivate und Analoga davon, die eine wesentliche Aminosäuresequenz-Identität mit dem reifen Wildtyp-Säugetier-IL-7s und eine im Wesentlichen äquivalente biologische Aktivität aufweisen, z. B. in Standardbioassays oder Assays zur IL-7-Rezeptorbindungsaffinität. Zum Beispiel bezieht sich IL-7 auf eine Aminosäuresequenz eines rekombinanten oder nicht rekombinanten Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von: i) einer nativen oder natürlich vorkommenden Allelvariante eines IL-7-Polypeptids, ii) einem biologisch aktiven Fragment eines IL-7-Polypeptids, iii) einem biologisch aktiven Polypeptidanalogon eines IL-7-Polypeptids oder iv) einer biologisch aktiven Variante eines IL-7-Polypeptids. Erfindungsgemäße IL-7-Polypeptide können von beliebigen Spezies erhalten werden, z. B. Mensch, Kuh oder Schaf. Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen von IL-7 sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Zum Beispiel hat die humane IL-7-Aminosäuresequenz eine Genbank-Zugangsnummer NM 000880 (SEQ ID NO: 1) und ist in 1 dargestellt, die IL-7-Aminosäuresequenz der Maus hat eine Genbank-Zugangsnummer NM 008371; die IL-7-Aminosäuresequenz der Ratte hat eine Genbank-Zugangsnummer AF 367210; die IL-7-Aminosäuresequenz der Kuh hat eine Genbank-Zugangsnummer NM 173924 (SEQ ID NO: 2) und ist in 2 dargestellt, und die IL-7-Aminosäuresequenz des Schafs hat eine Genbank-Zugangsnummer U10089 (SEQ ID NO: 3) und ist in 3 dargestellt. Die Signalsequenz für jede der dargestellten Polypeptidspezies ist in jeder der Figuren fett gedruckt und ist typischerweise nicht enthalten, wenn der IL-7-Teil C-terminal an das Trägerprotein fusioniert wird.
  • Eine „Variante" eines IL-7-Proteins ist definiert als eine Aminosäuresequenz, die durch eine oder mehrere Aminosäuren verändert wurde. Die Variante kann „konservative" Veränderungen enthalten, bei denen eine substituierte Aminosäure eine ähnliche Struktur oder ähnliche chemische Eigenschaften aufweist, z. B. Austausch von Leucin durch Isoleucin. Seltener kann eine Variante „nicht konservative" Veränderungen enthalten, z. B. Austausch eines Glycins durch Tryptophan. Ähnliche kleinere Veränderungen können auch Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder beides umfassen. Eine Leitlinie zur Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische Aktivität aufzuheben, kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Computerprogrammen, zum Beispiel Software für Molecular Modelling oder zur Erzeugung von Alignments, gefunden werden. Die innerhalb der Erfindung eingeschlossenen IL-7-Proteinvarianten umfassen IL-7-Proteine, die IL-7-Aktivität beibehalten. IL-7-Polypeptide, die auch Additionen, Substitutionen oder Deletionen umfassen, sind ebenfalls in die Erfindung eingeschlossen, solange die Proteine eine im Wesentlichen äquivalente biologische IL-7-Aktivität beibehalten. Zum Beispiel sind Verkürzungen von IL-7, welche eine zur Volllängenform des IL-7-Proteins vergleichbare biologische Aktivität beibehalten, in der Erfindung eingeschlossen. Die Aktivität des IL-7-Proteins kann unter Verwendung von zellulären in vitro-Proliferationsassays wie im unten folgenden Beispiel 6 beschrieben gemessen werden. Die Aktivität der erfindungsgemäßen IL-7-Varianten behält verglichen mit dem Wildtyp-IL-7 eine biologische Aktivität von mindestens 10%, 20%, 40%, 60%, aber mehr bevorzugt 80%, 90%, 95% und noch mehr bevorzugt 99% bei.
  • IL-7-Proteinvarianten umfassen auch Polypeptide mit mindestens etwa 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit dem Wildtyp-IL-7. Um die Prozentidentität zweier Aminosäuresequenzen oder zweier Nucleinsäuresequenzen zu bestimmen, wird mit den Sequenzen für einen optimalen Vergleich ein Alignment durchgeführt (z. B. können für ein optimales Alignment mit einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz Lücken in eine erste Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz eingeführt werden). Die Prozentidentität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen, welche die Sequenzen teilen (d. h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtanzahl an Positionen × 100). Die Bestimmung der Prozent Homologie zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264–68, modifiziert wie bei Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–77. Ein solcher Algorithmus ist in den NBLAST- und XBLAST-Programmen von Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10 eingefügt. BLAST-Nucleotidsuchen können mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12 durchgeführt werden. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3 durchgeführt werden. Um Alignments mit Lücken für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17): 3389–3402 beschrieben. Bei Verwendung der BLAST- und Gapped BLAST-Programme können die vorgegebenen Parameter der jeweiligen Programme (z. B., XBLAST und NBLAST) verwendet werden.
  • Potenzielle T-Zell- oder B-Zell-Epitope in der IL-7-Einheit können in den erfindungsgemäßen Fc-IL-7-Fusionsproteinen entfernt oder modifiziert werden. Beispielhaft werden deimmunisierte IL-7-Einheiten in der vorläufigen US-Patentanmeldung mit dem Titel „IL-7 Variants with Reduced Immunogenicity" (Anwalt-Eintragungsnr. LEX-035PR) beschrieben, die beim U.S.-Patentamt am 9. Dezember 2004 eingereicht wurde.
  • Trägerprotein
  • Das Trägerprotein kann eine beliebige Einheit sein, die kovalent an das IL-7-Protein fusioniert wird. In einer Ausführungsform ist das Trägerprotein Albumin, zum Beispiel humanes Serumalbumin. In einer weiteren Ausführungsform ist das Trägerprotein eine Immunglobulin-(Ig-)enheit wie z. B. eine schwere Ig-Kette. Die Ig-Kette kann von IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM abstammen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Ig-Einheit einen intakten Antikörper bilden und kann das IL-7-Fusionsprotein zu spezifischen Zielstellen im Körper dirigieren. Fusionsproteine, die eine Antikörperlenkung einsetzen, sind Fachleuten bekannt. In einer weiteren Ausführungsform enthält die Ig-Trägereinheit des Weiteren eine leichte Ig-Kette.
  • In einer Ausführungsform enthält die Ig-Einheit eine Fc-Region. Wie hierin verwendet, umfasst „Fc-Teil" Domänen, die von der konstanten Region eines Immunglobulins, vorzugsweise eines humanen Immunglobulins, einschließlich eines Fragments, Analogons, einer Variante, Mutante oder einem Derivat der konstanten Region abstammen. Geeignete Immunglobuline umfassen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 und andere Klassen. Die konstante Region eines Immunglobulins ist definiert als ein natürlich vorkommendes oder synthetisch hergestelltes Polypeptid, das zur C-terminalen Immunglobulinregion homolog ist und kann eine CH1-Domäne, eine Gelenk-Region, eine CH2-Domäne, eine CH3-Domäne oder eine CH4-Domäne, einzeln oder in einer beliebigen Kombination umfassen. In der vorliegenden Erfindung umfasst der Fc-Teil typischerweise mindestens eine CH2-Domäne. Zum Beispiel kann der Fc-Teil Gelenk-Region-CH2-CH3 umfassen.
  • Alternativ kann der Fc-Teil den gesamten oder einen Teil der Gelenk-Region, der CH2-Domäne und/oder der CH3-Domäne und/oder der CH4-Domäne umfassen.
  • Die konstante Region eines Immunglobulins ist für viele wichtige Antikörperfunktionen, einschließlich der Fc-Rezeptor-(FcR-)Bindung und Komplementfixierung, verantwortlich. Es gibt fünf Hauptklassen von konstanten Regionen der schweren Kette, die als IgA, IgG, IgD, IgE und IgM klassifiziert sind. Zum Beispiel ist IgG in vier Unterklassen unterteilt: 1, 2, 3, and 4, die auch als IgG1, IgG2, IgG3 bzw. IgG4 bekannt sind.
  • IgG-Moleküle Wechselwirken mit einer Vielzahl an Klassen von zellulären Rezeptoren, einschließlich der drei Klassen Fcγ-Rezeptoren (FcγR), die für die IgG-Antikörperklasse spezifisch sind, nämlich FcγRI, FcγRII und FcγRIII. Es wurde berichtet, dass die wichtigen Sequenzen für die Bindung von IgG an den FcγR-Rezeptor in den CH2- und CH3-Domänen lokalisiert sind. Die Halbwertszeit eines Antikörpers im Serum wird durch die Fähigkeit dieses Antikörpers beeinflusst, an einen Fc-Rezeptor (FcR) zu binden. Ebenso wird auch die Halbwertszeit der Immunglobulinfusionsproteine im Serum durch die Fähigkeit beeinflusst, an derartige Rezeptoren zu binden (Gillies et al., (1999) Cancer Res. 59: 2159–66). Verglichen mit solchen IgG1, weisen CH2- und CH3-Domänen von IgG2 und IgG4 eine biochemisch nicht nachweisbare oder eine verminderte Bindungsaffinität für Fc-Rezeptoren auf. Es wurde berichtet, dass Immunglobulinfusionsproteine, die CH2- und CH3-Domänen von IgG2 oder IgG4 enthalten, verglichen mit den entsprechenden Fusionsproteinen, die CH2- und CH3-Domänen von IgG1 enthalten, eine längere Halbwertszeit im Serum aufwiesen ( U.S. Patent Nr. 5,541,087 ; Lo et al, (1998) Protein Engineering, 11: 495–500). Demzufolge stammen in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung bevorzugte CH2- und CH3-Domänen von einem Antikörperisotop mit verminderter Rezeptorbindungsaffinität und verminderten Effektorfunktionen ab, wie zum Beispiel IgG2 oder IgG4. Mehr bevorzugt stammen die CH2- und CH3-Domänen von IgG2 ab.
  • Die Gelenk-Region befindet sich normalerweise C-terminal zur CH1-Domäne der konstanten Region der schweren Kette. In den IgG-Isotopen treten typischerweise innerhalb dieser Gelenk-Regionen Disulfidbindungen auf, welche die Bildung des endgültigen tetrameren Antikörpermoleküls ermöglichen. Diese Region wird von Prolin-, Serin- und Threoninresten dominiert. Wenn in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, ist die Gelenk-Region typischerweise mindestens homolog zu der natürlich vorkommenden Immunglobulinregion, die die Cysteinreste umfasst, um Disulfid bindungen zur Verknüpfung von zwei Fc-Einheiten zu bilden. Repräsentative Sequenzen von Gelenk-Regionen von humanen und Maus-Immunglobulinen sind auf dem Fachgebiet bekannt und können bei Borrebaeck, Hg., (1992) Antibody Engineering. A Practical Guide. W. H. Freeman and Co. gefunden werden. Geeignete Gelenk-Regionen für die vorliegende Erfindung können von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 und anderen Immunglobulinklassen abstammen.
  • Die IgG1-Gelenk-Region besitzt drei Cysteinreste, wobei der zweite und dritte Rest an den Disulfidbindungen zwischen den beiden schweren Ketten des Immunglobulins beteiligt sind. Genau diese beiden Cysteinreste ermöglichen eine wirksame und beständige Disulfidbindung eines Fc-Teils. Daher stammt eine bevorzugte Gelenk-Region der vorliegenden Erfindung von IgG1 ab, mehr bevorzugt von humanem IgG1, wobei das erste Cystein vorzugsweise zu einer anderen Aminosäure, vorzugsweise Serin, mutiert ist.
  • Die Gelenk-Region des IgG2-Isotyps besitzt vier Disulfidbindungen, die eine Neigung zur Förderung der Oligomerisierung und möglicherweise falschen Disulfidbindung während der Sekretion in rekombinanten Systemen haben. Eine geeignete Gelenk-Region kann von einer IgG2-Gelenkregion abstammen; die ersten beiden Cysteinreste werden jeweils vorzugsweise zu einer anderen Aminosäure mutiert.
  • Von der Gelenk-Region von IgG4 ist bekannt, dass die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten ineffizient ist. Jedoch kann eine geeignete Gelenk-Region der vorliegenden Erfindung von der IgG4-Gelenk-Region abstammen, die vorzugsweise eine Mutation enthält, die eine korrekte Bildung der Disulfidbindungen zwischen den von der schweren Kette stammenden Einheiten verstärkt (Angal et al. (1993) Mol. Immunol.. 30: 105–8).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Fc-Teil CH2- und/oder CH3- und/oder CH4-Domänen und eine Gelenk-Region enthalten, die von verschiedenen Antikörperisotypen abstammen, d. h. ein hybrider Fc-Teil. Zum Beispiel enthält in einer Ausführungsform der Fc-Teil von IgG2 oder IgG4 abstammende CH2- und/oder CH3-Domänen sowie eine mutierte, von IgG1 abstammende Gelenk-Region. Wie in dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich Fcγ2(h) auf eine Ausführungsform, in der die Gelenk-Region von IgG1 abstammt und der Rest der konstanten Domänen von IgG2 abstammen. Alternativ wird eine mutierte Gelenk-Region von einer anderen IgG-Unterklasse in einem hybriden Fc-Teil verwendet. Zum Beispiel kann eine mutierte Form der IgG4-Gelenk-Region verwendet werden, die eine wirksame Disulfidbindung zwischen zwei schweren Ketten ermöglicht. Eine mutierte Gelenk-Region kann auch von einer IgG2-Gelenk-Region abstammen, in der die ersten beiden Cysteinreste jeweils zu einer anderen Aminosäure mutiert sind. Solche hybriden Fc-Teile erleichtern eine Expression in hohen Spiegeln und verbessern die korrekten Anordnung der Fc-IL-7-Fusionsproteine. Die Anordnung von solchen hybriden Fc-Teilen ist auf dem Fachgebiet bekannt und wurde in der veröffentlichten U.S. Patentanmeldung Nr. 2003-0044423 beschrieben.
  • In einigen Ausführungsformen enthält der Fc-Teil Aminosäuremodifizierungen, die im Allgemeinen die Halbwertszeit eines Fc-Fusionsproteins im Serum verlängern. Solche Aminosäuremodifizierungen umfassen Mutationen, die im Wesentlichen die Fc-Rezeptorbindungs- oder Komplementfixierungsaktivität vermindern oder eliminieren. Zum Beispiel kann die Glykosylierungsstelle innerhalb des Fc-Teils einer schweren Immunoglobulinkette entfernt werden. Im IgG1 befindet sich die Glykosylierungsstelle Asn297 innerhalb der Aminosäuresequenz Gln-Tyr-Asn-Ser (SEQ ID NO: 30). In anderen Immunglobulinisotypen entspricht die Glykosylierungsstelle dem Asn297 von IgG1. Zum Beispiel ist in IgG2 und IgG4 die Glykosylierungsstelle das Asparagin innerhalb der Aminosäuresequenz Gin-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 29). Demzufolge entfernt eine Mutation von Asn297 von IgG1 die Glykosylierungsstelle in einem von IgG1 stammenden Fc-Teil. In einer Ausführungsform wird Asn297 durch Gln ersetzt. In weiteren Ausführungsformen wird weiterhin Tyrosin innerhalb der Aminosäuresequenz Gln-Tyr-Asn-Ser (SEQ ID NO: 30) mutiert, um ein mögliches, aus der Asparaginmutation resultierendes, „Non-Self"-T-Zell-Epitop zu eliminieren. Wie hierin verwendet, ist ein T-Zell-Epitop eine Polypeptidsequenz in einem Protein, die mit einem MHC-Klasse-II-Molekül wechselwirkt oder an dieses bindet. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz Gln-Tyr-Asn-Ser (SEQ ID NO: 30) innerhalb einer schweren IgG1-Kette durch eine Aminosäuresequenz Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 28) ersetzt werden. Ebenso entfernt eine Mutation von Asparagin innerhalb der Aminosäuresequenz Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 29) in IgG2 oder IgG4 die Glykosylierungsstelle in einem von der schweren IgG2- oder IgG4-Kette stammenden Fc-Teil. In einer Ausführungsform wird Asparagin durch ein Glutamin ersetzt. In weiteren Ausführungsformen wird weiterhin Phenylalanin innerhalb der Aminosäuresequenz Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 29) mutiert, um ein mögliches, aus der Asparaginmutation resultierendes, „Non-Self"-T-Zell-Epitop zu eliminieren. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz Gln-Phe-Asn-Ser (SEQ ID NO: 29) innerhalb einer schweren IgG2- oder IgG4-Kette durch eine Aminosäuresequenz Gln-Ala-Gln-Ser (SEQ ID NO: 28) ersetzt werden.
  • Es wurde auch beobachtet, dass die Veränderung von Aminosäuren nahe der Verbindung des Fc-Teils und des Nicht-Fc-Teils die Halbwertszeit des Fc-Fusionsproteins im Serum drastisch erhöhen kann. (Veröffentlichte U.S. Patentanmeldung Nr. 2002-0147311). Demzufolge kann die Verbindungsregion eines Fc-IL-7- oder IL-7-Fc-Fusionsproteins der vorliegenden Erfindung Veränderungen enthalten, die in Bezug auf die natürlich vorkommenden Sequenzen einer schweren Immunglobulinkette und IL-7 vorzugsweise innerhalb von 10 Aminosäuren des Verbindungspunkts liegen. Diese Aminosäureveränderungen können eine Erhöhung der Hydrophobizität, zum Beispiel durch Austausch des C-terminalen Lysins des Fc-Teils zu einer hydrophoben Aminosäure wie z. B. Alanin oder Leucin verursachen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das C-terminale Lysin und das vorhergehende Glycin des Fc-Teils deletiert.
  • In weiteren Ausführungsformen enthält der Fc-Teil Aminosäureveränderungen des Leu-Ser-Leu-Ser-Segments nach dem C-Terminus des Fc-Teils einer schweren Immunglobulinkette. Die Aminosäuresubstitutionen des Leu-Ser-Leu-Ser-Segments (SEQ ID NO: 27) eliminieren potenzielle junktionale T-Zell-Epitope. In einer Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz Leu-Ser-Leu-Ser (SEQ ID NO: 27) nahe dem C-Terminus des Fc-Teils durch eine Aminosäuresequenz Ala-Thr-Ala-Thr (SEQ ID NO: 26) ersetzt. In weiteren Ausführungsformen werden die Aminosäuren innerhalb des Leu-Ser-Leu-Ser-Segments (SEQ ID NO: 27) durch andere Aminosäuren wie z. B. Glycin oder Prolin ersetzt. Detaillierte Verfahren zur Erzeugung von Aminosäuresubstitutionen am Leu-Ser-Leu-Ser-Segment (SEQ ID NO: 27) nahe am C-Terminus von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder Molekülen von anderen Immunglobulinklassen, sowie weitere beispielhafte Modifizierungen für die Veränderung von junktionalen T-Zell-Epitopen wurden in der veröffentlichten U.S. Patentanmeldung Nr. 2003-0166877 beschrieben.
  • Spacer
  • In einer Ausführungsform wird ein Spacer- oder Linkerpeptid zwischen das Trägerprotein und das IL-7-Fusionsprotein eingeschoben. Zum Beispiel wird der Spacer direkt C-terminal zur letzten Aminosäure einer konstanten Ig-Region platziert. Das Spacer- oder Linkerpeptid ist vorzugsweise nicht geladen und mehr bevorzugt unpolar oder hydrophob. Die Länge eines Spacer- oder Linkerpeptids beträgt vorzugsweise zwischen 1 und etwa 100 Aminosäuren, mehr bevorzugt zwischen 1 und etwa 50 Aminosäuren oder zwischen 1 und etwa 25 Aminosäuren, und noch mehr bevorzugt zwischen 1 und etwa 15 Aminosäuren und am meisten bevorzugt weniger als 10 Aminosäuren. In einer Ausführungsform enthält der Spacer eine Sequenz (G4S)n, in der n kleiner als 5 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Spacer die Sequenz G4SG4 (SEQ ID NO: 25). In noch einer weiteren Ausführungsform enthält der Spacer eine Einheit, die als eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle erkannt wird. In noch einer weiteren Ausführungsform enthält der Spacer eine Einheit, die durch ein ortsspezifisches Spaltungsmittel erkannt wird. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden das Trägerprotein und das IL-7-Fusionsprotein durch einen synthetischen Spacer, zum Beispiel einen PNA-Spacer getrennt, der vorzugsweise ungeladen und mehr bevorzugt unpolar oder hydrophob ist.
  • Herstellung von IL-7-Fusionsproteinen
  • In den Beispielen hierin werden nicht einschränkende Verfahren zum Herstellen von nützlichen, erfindungsgemäßen Ausführungsformen sowie Assays beschrieben, die für die Untersuchung von in vitro-Eigenschaften und pharmakokinetischen und in vivo-Aktivitäten in Tiermodellen von Nutzen sind.
  • Die erfindungsgemäßen IL-7-Fusionsproteine können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten rekombinanten Expressionsvektoren hergestellt werden. Der Begriff „Expressionsvektor" bezieht sich auf ein replizierbares DNA-Konstrukt, das zur Expression von das gewünschte IL-7-Fusionsprotein kodierender DNA verwendet wird, und das eine Trankriptionseinheit umfasst, die eine Anordnung von (1) einem oder mehreren genetischen Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, zum Beispiel Promotoren, Operatoren oder Enhancer, die funktionell verbunden sind mit (2) einer für das gewünschte IL-7-Fusionsprotein kodierenden DNA-Sequenz, die in mRNA transkribiert und in das Protein translatiert wird, und (3) geeigneten Transkriptions- sowie Translationsstart- und Translationsstoppsequenzen umfasst. Die Wahl des Promotors und anderer regulatorischer Elemente variiert im Allgemeinen je nach der beabsichtigten Wirtszelle. Ein bevorzugter Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ist ein Fc-Expressionsvektor, der vom PdCs-huFc-Expressionsvektor abstammt, der in Lo et al., Protein Engineering (1998) 11: 495 beschrieben wird.
  • In einem bevorzugten Beispiel wird die für das IL-7-Fusionsprotein kodierende Nucleinsäure unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken in eine Wirtszelle transfiziert. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst die Fremd-DNA eine Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodiert. Geeignete Wirtszellen umfassen prokaryotische, Hefe- oder höhere eukaryotische Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind eukaryotische Zellen.
  • Die rekombinanten IL-7-Fusionsproteine können in Hefewirten exprimiert werden, vorzugsweise von Saccharomyces-Spezies wie z. B. S. cerevisiae. Andere Hefe-Gattungen wie beispielsweise Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls eingesetzt werden. Hefe-Vektoren werden im Allgemeinen eine Replikationsstartpunkt-Sequenz von einem Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, für das IL-7-Fusionsprotein kodierende DNA, Sequenzen für Polyadenylierung und Transkriptionsstopp sowie ein Selektionsgen enthalten. Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratekinase oder andere glykolytische Enzyme wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-4-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Zellkultursysteme von verschiedenen Säugetieren oder Insekten können ebenfalls eingesetzt werden, um rekombinante Proteine zu exprimieren. Auf dem Fachgebiet sind Baculovirussysteme für die Herstellung von Proteinen in Insektenzellen wohlbekannt. Beispiele für geeignete Säugetierwirtszelllinien umfassen NS/0-Zellen, L-Zellen, C127-, 3T3-, Chinese-hamster-ovary-(CHO-), HeLa- und BHK-Zelllinien. Weitere geeignete Säugetierwirtszellen umfassen CV-1-Zellen (ATCC CCL70) und COS-7-Zellen, die beide aus Affennieren stammen. Eine weitere geeignete Affenierenzelllinie, CV-1/EBNA, wurde durch Transfektion der CV-1-Zelllinie mit einem für das nukleare Antigen 1 des Epstein-Barr-Virus (EBNA-1) kodierenden Gen sowie mit einem CMV-regulatorische Sequenzen enthaltenden Vektor erhalten (McMahan et al., (1991) EMBO J. 10: 2821). Das EBNA-1-Gen ermöglicht eine episomale Replikation der Expressionsvektoren wie z. B. HAV-EO oder pDC406, die den EBV-Replikationsstartpunkt enthalten.
  • Säugetierexpressionsvektoren können nicht-transkribierte Elemente wie z. B. einen Replikationsstartpunkt, einen geeigneten Promotor und Enhancer, die an das zu exprimierende Gen geknüpft sind, und weiter 5'- oder 3'-flankierende nicht-transkribierte Sequenzen sowie 5'- oder 3'-nichttranslatierte Sequenzen, wie z. B. notwendige Ribosombindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleißdonor- und -akzeptorstellen und Transkriptionsstoppsequenzen enthalten. Üblicherweise verwendete Promotoren und Enhancer stammen vom Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalovirus. Vom viralen Genom SV40 abgeleitete DNA-Sequenzen, zum Beispiel, die SV40-Startstelle, der frühe und späte Promoter, Enhancer, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um weitere genetische Elemente für die Expression einer heterologen DNA-Sequenz bereitzustellen.
  • Für die Sekretion des IL-7-Fusionsproteins aus der Wirtszelle enthält der Expressionsvektor für ein Signal- oder Leaderpeptid kodierende DNA. In der vorliegenden Erfindung kann für die native Signalsequenz von IL-7 kodierende DNA oder alternativ für eine heterologe Signalsequenz kodierende DNA verwendet werden, wie z. B. die Signalsequenz aus einem anderen Interleukin oder aus einem sezernierten Ig-Molekül.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen der vorliegenden Erfindung bereit, die das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem die für das IL-7-Fusionsprotein kodierende DNA-Sequenz enthaltenden Expressionsvektor transformiert wurde, unter die Expression begünstigenden Bedingungen umfasst. Das gewünschte Protein wird dann aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten gereinigt. Zum Beispiel können Überstände von Expressionssystemen, die rekombinantes Protein in das Kulturmedium sezernieren, zunächst unter Verwendung von kommerziell verfügbaren Proteinkonzentrationsfiltern, zum Beispiel einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit aufkonzentriert werden. Im Anschluss an den Konzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine geeignete Reinigungsmatrix, wie auf dem Fachgebiet bekannt, aufgebracht werden. Zum Beispiel werden Fc-IL-7-Fusionsproteine auf geeignete Weise unter Verwendung einer an Protein A gekoppelten Matrix gefangen.
  • Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" IL-7-Fusionsprotein oder ein biologisch aktiver Teil davon ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen kontaminierenden Proteinen aus der Zell- oder Gewebequelle, aus der das IL-7-Fusionsprotein stammt, oder ist im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde. Der Begriff „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Präparate von IL-7-Fusionsprotein, in denen das Protein von den zellulären Bestandteilen der Zellen, aus denen es isoliert oder rekombinant hergestellt wurde, getrennt ist. In einer Ausführungsform umfasst der Begriff „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparate von IL-7-Fusionsprotein mit weniger als etwa 30% (nach Trockengewicht) Nicht-IL-7-Fusionsprotein (hierin auch als „kontaminierendes Protein" bezeichnet), mehr bevorzugt weniger als etwa 20% Nicht-IL-7-Fusionsprotein, noch mehr bevorzugt weniger als etwa 10% Nicht-IL-7-Fusionsprotein und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% Nicht-IL-7-Fusionsprotein. Wenn das IL-7-Fusionsprotein oder ein biologisch aktiver Teil davon von einer rekombinanten Quelle gereinigt wird, ist es ebenfalls vorzugsweise im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h., dass Kulturmedium macht weniger als etwa 20%, mehr bevorzugt weniger als etwa 10% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens des Proteinpräparats aus.
  • Der Begriff „im Wesentlichen reines IL-7-Fusionsprotein" bezieht sich auf ein Präparat, in dem das Ig-IL-7-Fusionsprotein mindestens 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder 99% der Proteine in dem Präparat ausmacht. In einer Ausführungsform umfasst die Erfindung im Wesentlichen reine Präparate von Ig-IL-7-Fusionsproteinen mit einem Disulfidbindungsmuster zwischen Cys2 und Cys92, Cys34 und Cys129, sowie Cys47 und Cys141 mit dem Vorbehalt von Anspruch 1. In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung im Wesentlichen reine Präparate von Ig-IL-7-Fusionsproteinen, bei denen Asn116 nicht glykosyliert ist, Asn70 und Asn91 hingegen glykosyliert sind.
  • Behandlungsverfahren unter Verwendung von Fc-IL-7-Proteinen
  • Die erfindungsgemäßen IL-7-Fusionsproteine sind bei der Behandlung von Immundefekten und bei der Beschleunigung der natürlichen Rekonstitution des Immunsystems von Nutzen, die zum Beispiel nach Erkrankungen oder Behandlungen von immunsuppressiver Art auftreten. Zum Beispiel können IL-7-Fusionsproteine verwendet werden, um infektiöse Pathogene oder Immunstörungen zu behandeln sowie um das Wachstum (einschließlich der Proliferation) von spezifischen Immunzellarten zu verstärken. Darüber hinaus können IL-7-Fusionsproteine bei der Behandlung von Krebsarten wie z. B. Blasenkrebs, Lungenkrebs, Hirnkrebs, Brustkrebs, Hautkrebs und Prostatakrebs verwendet werden. In einem Beispiel ist es von Nutzen, Patienten, die einem oder mehreren Zyklen Chemotherapie unterzogen wurden, mit IL-7-Fusionsproteinen wie oben beschrieben zu behandeln, um die Ergänzung ihrer Immunzellen zu unterstützen. Alternativ sind IL-7-Fusionsproteine bei adoptiven T-Zell-Transplantationen von Nutzen. Zum Beispiel können IL-7-Fusionsproteine verabreicht werden, um das Wachstum und das Überleben von transplantierten T-Zellen zu begünstigen oder isolierte T-Zell-Populationen ex vivo zum Wachsen zu bringen. Alternativ ist es auch von Nutzen, IL-7-Fusionsproteine wie oben beschrieben Patienten mit HIV, älteren Patienten, die ein Transplantat erhalten haben, oder anderen Patienten mit unterdrückter Immunsystemfunktion zu verabreichen.
  • Verabreichung
  • Die erfindungsgemäßen IL-7-Fusionsproteine können in eine für eine Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzung integriert werden. Solche Zusammensetzungen enthalten typischerweise das IL-7-Fusionsprotein und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „pharmazeutisch unbedenklicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Überzüge, antibakterielle Mittel und Mittel gegen Pilze, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen umfassen, die mit der pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Verbindungen ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt.
  • Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird so formuliert, dass sie mit dem beabsichtigten Verabreichungsweg kompatibel ist. Beispiele für Verabreichungswege umfassen parenterale, z. B., intravenöse, intradermale, subkutane, orale (z. B., Inhalation), transdermale (topische), transmukosale und rektale Verabreichung. Für parenterale, intradermale oder subkutane Anwendung verwendete Lösungen oder Suspensionen, können die folgenden Bestandteile umfassen: ein steriles Verdünnungsmittel wie z. B. Wasser für Injektionszwecke, Kochsalzlösung, fette Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel wie z. B. Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidantien wie z. B. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; chelatisierende Mittel wie z. B. Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer wie z. B. Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Einstellung der Tonizität wie z. B. Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH-Wert kann mit Säuren oder Basen wie z. B. Salzsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Das parenterale Präparat kann in Ampulen, Einwegspritzen oder aus Glas oder Kunststoff hergestellten Mehrdosenampullen eingeschlossen werden.
  • Arzneimittel, die die erfindungsgemäßen IL-7-Fusionsproteine enthalten, können eine Konzentration von 0,01 bis 100 Gew.-% aufweisen, obwohl die Menge je nach der Dosierungsform der Arzneimittel variiert.
  • Die Verabreichungsdosis hängt vom Körpergewicht des Patienten, der Schwere der Erkrankung und der Meinung des Arztes ab. Jedoch ist es im Allgemeinen ratsam, etwa 0,01 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise etwa 0,02 bis etwa 2 mg/kg und mehr bevorzugt etwa 0,5 mg/kg im Falle einer Injektion zu verabreichen. Die Dosis kann einmal oder mehrmals am Tag verabreicht werden, je nach der Schwere der Erkrankung und der Meinung des Arztes.
  • Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind von Nutzen, wenn sie gemeinsam mit einem oder mehreren anderen therapeutischen Mitteln, zum Beispiel einem Molekül, von dem ebenfalls bekannt ist, dass es bei der Ergänzung von Blutzellen von Nutzen ist, verabreicht werden. Zum Beispiel kann das Molekül Erythropoetin, von dem bekannt ist, dass es Thrombozyten ergänzt, G-CSF, das zur Ergänzung von Neutrophilen verwendet wird, oder GM-CSF sein, das zur Ergänzung von Granulozyten und Makrophagen verwendet wird.
  • BEISPIEL 1.
  • Klonierung von humanem (hu) Fc-IL-7 und huFc-IL-7-Varianten.
  • Die für die reife Form des humanen IL-7 kodierende Nucleinsäure (d. h., der die N-terminale Signalsequenz fehlt) wird mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines Vorwärts- und eines Rückwärts-Primers amplifiziert, die jeweils die Restriktionsstellen für SmaI und XhoI eingebaut haben. Das amplifizierte PCR-Produkt wird in einen pCRII-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert und die Sequenz verifiziert. Die Aminosäuresequenz des reifen IL-7 ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Das SmaI/XhoI-verdaute IL-7-Fragment wird in einen ebenso behandelten von pdCs-huFc abstammenden Expressionsvektor transferiert, was zu einer chimären Sequenz zwischen huFc und IL-7 führt, wobei IL-7 in-frame direkt stromabwärts der für eine CH3-Einheit von Fc kodierenden Sequenz platziert ist (siehe Lo et al., Protein Engineering (1998) 11: 495).
  • Eine Reihe von Expressionsvektoren werden von dem pdCs-huFc-Vektor abgeleitet, der für ein Fc-Fragment, das im Allgemeinen eine Gelenk-Region, eine CH2-Domäne und eine CH3-Domäne von Ig umfasst, kodiert und der so entworfen wurde, um spezifische Veränderungen der Fc-Region einzubauen. So wurden durch Verschieben des IL-7-Fragment zwischen diesen Vektoren eine Reihe von huFc-IL-7-Fusionsproteine erzeugt, die sich in ihrem Fc-Grundgerüst unterscheiden. Um die verschiedenen Grundgerüste zu erzeugen, können die geeigneten Mutationen zunächst mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren in die Fc-Sequenz eingeführt werden. Da die Fc-Region des von pdCs-huFc abgeleiteten Vektors einer AfIII-Restriktionsstelle und SmaI-Restriktionsstelle benachbart sind, kann, indem die Nucleinsäure des auf geeignete Weise modifizierten Grundgerüsts einer PCR unter Verwendung von jeweils die Restriktionsstellen für AfIII und SmaI einbauenden Primern unterzogen wird, das resultierende, für Fc kodierende Nucleinsäurefragment in den von pdCs-huFc abgeleiteten Vektor als ein AfIII- bis SmaI-Fragment eingebaut werden. Die AfIII-Sequenz CTTAAGC (SEQ ID NO: 24) befindet sich stromaufwärts der Fc-Sequenz, die mit GAGCCCAAA (SEQ ID NO: 23) beginnt und den Anfang der Gelenk-Region darstellt, wie in 20 gezeigt. Die SmaI-Stelle CCGGGT (SEQ ID NO: 17) befindet sich in Richtung des Endes der CH3-Region, wie durch die unterstrichenen Nucleinsäuren in 12 gezeigt und kodiert für die Pro-Gly-Aminosäuren, die dem Alaninrest aus der Lysin zu Alaninmutation am Ende der CH3-Region vorangehen.
  • Zum Beispiel wird huFcγ1-IL-7 mit der Gelenk-Region, der CH2- und der CH3-Domäne konstruiert, die von der IgG1-Unterklasse abstammen. Im Rahmen eines Fc-Fusionsproteins enthält die IgGγ1-Gelenk-Region zusätzlich eine Mutation, die das erste Cystein durch Serin substituiert. Die Sequenz des ersten kodierten Fusionsproteins ist in 4 (SEQ ID NO: 4) dargestellt, während die Sequenz in SEQ ID NO: 22 für das reife huFcγ1-Grundgerüst des Vektors kodiert.
  • Des Weiteren wurden Fcγ1-IL-7-Fusionsproteine erzeugt, die die Dipeptidmutation YN zu AQ zur Eliminierung der Glykosylierungsstelle an Fc (entspricht N297 in IgGγ1) sowie ein potenziell immunogenes T-Zell-Epitop gemäß den oben beschriebenen Verfahren umfasst. Die reife Fc-Grundgerüst-Sequenz für huFcγ1(YN > AQ) wird in SEQ ID NO: 21 beschrieben. Die Substitution von Alanin und Glycin anstelle von Tyrosin und Asparagin wurde erreicht, indem zunächst Mutationen am Fc-Grundgerüst durch einen Überlappungs-PCR-Ansatz eingeführt wurden. Zwei überlappende, komplementäre, mutagene Primer wurden verwendet, um zwei PCR-Fragmente zu erzeugen, die als Matrize in einer zweiten Amplifizierungsrunde verwendet wurden, um ein einzelnes Fragment, das die geeigneten Codon-Substitutionen enthält, herzustellen. Die mutagenen Primer in der Sense-Richtung war 5'-AGCAGGCCCAGAGCACGTACCGTGTGGT-3' (Mutation unterstrichen) (SEQ ID NO: 36). Der komplementäre Strang war 5'-GTACGTGCTCTGGGCCTGCTCCTCCCGC-3' (SEQ ID NO: 37). Der benachbarte Vorwärts-Primer war 5'-CTCTCTGCAGAGCCCAAA TCT-3' (SEQ ID NO: 38), der auch eine PstI-Stelle enthält. In der Antisense-Richtung war der benachbarte Primer 5'-CAGGGTGTACACCTGTGGTTC-3' (SEQ ID NO: 33), der auch eine BsrGI-Stelle enthielt. Nach der Amplifizierung wurde die Sequenz mittels Standardverfahren verifiziert und einer Restriktion mittels BsrGI und PstI unterzogen. Das resultierende Fragment wurde dann durch das nichtmutierte Fragment der Fc-Region ersetzt.
  • Das huFcγ2(h)(FN > AQ) wurde auch unter Verwendung der vorher beschriebenen Techniken konstruiert. Dieses Fusionsprotein umfasst eine veränderte Gelenk-Region, die von der IgGγ1-Unterklasse abstammte, während die CH2- und CH3-Domänen von der IgGγ2-Unterklasse abstammten. Außerdem wurde die Dipeptidmutation FN zu AQ eingeschlossen, um die Glykosylierungsstelle an Fc (entsprechend N297 in IgGγ1) sowie ein potenziell immunogenes T-Zell-Epitop zu eliminieren. Die Sequenz des kodierten Fusionsproteins ist in 5 (SEQ ID NO: 5) dargestellt. Die Sequenz des reifen Fc-Grundgerüsts huFcγ2(h)(FN > AQ) ist in (SEQ ID NO: 19) gezeigt.
  • Des Weiteren wurden Fc-IL-7-Fusionsproteine erzeugt, die eine flexible Linkersequenz zwischen der Fc-Einheit und der IL-7-Einheit umfassten. Zum Beispiel wurde ein Linkerpolypeptid mit der Sequenz GGGGSGGGGSGGGGS (Linker1, SEQ ID NO: 34) insertiert. Um huFcγ1(Linker1)-IL-7 zu erzeugen, wurde ein synthetischer Oligonucleotid-Doppelstrang der Sequenz 5'-G GGT GCA GGG GGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGA TCC GGC GGG GGC TC-3' (SEQ ID NO: 18) mittels „Blunt-End-Ligation" an der einzigen SmaI-Stelle des Expressionsvektors pdCs-huFc-IL-7 insertiert und die Orientierung des Doppelstrangs wurde verifziert. Der Vorwärts-Primer wurde so entworfen, dass die Aminosäurereste Pro-Gly, die durch die die SmaI-Stelle überspannenden Codons kodiert werden (C CCG GGT) (SEQ ID NO: 17), und der darauf folgende Ala-Rest (der aus der kodierten Lysin zu Alanin-Substitution resultiert) der CH3-Region erhalten blieben. Die Aminosäuresequenz des kodierten Fusionsproteins ist in 6 (SEQ ID NO: 6) dargestellt.
  • Des Weiteren wurden Fc-IL-7-Fusionsproteine konstruiert, die ein kürzeres Linkerpolypeptid mit der Sequenz GGGGSGGGG (Linker2, SEQ ID NO: 25) umfassten. Um huFcγ1(YN > AQ)(Linker2)-IL-7 zu erzeugen, wurde ein amplifiziertes PCR- Produkt, das von dem Primerpaar 5'-CCCGGGCGCCGGCGGTGGAGGATCAGGTGGTGGCGGTGAT TGTGATATTGAAGGTAAAGATG-3' (der die kodierte Linkersequenz enthielt, SEQ ID NO: 15) und 5'-ATCATGTCTGGATCCCTCGA-3' (SEQ ID NO: 14) an einem geeigneten pdCs-Fc-IL-7-Matrizenplasmid erhalten wurde, in einen pCRII-Vektor einkloniert (Invitrogen, Carlsbad, CA) und seine Sequenz verifiziert. Ein XmaI/XhoI-verdautes Fragment, das für Linker2/IL-7 kodiert, wurde dann in einen ebenso behandelten, von pdCs-huFc abstammenden Expressionsvektor transferiert. Der Vektor wurde so modifiziert, das er das reife Fc-Grundgerüst huFcγ1(YN > AQ) von SEQ ID NO: 21 enthält. Die Aminosäuresequenz des kodierten Fusionsproteins ist in 7 (SEQ ID NO: 7) dargestellt.
  • Ebenso wurde huFcγ1(YN > AQ, d)(Linker2)-IL-7 unter Verwendung des Primerpaars 5'-CCCGGGCGGTGGAGGATCAGGTGGTGGCGGTGATTGTGATATTGAAGGTAAA GATG-3' (SEQ ID NO: 16) und 5'-ATCATGTCTGGATCCCTCGA-3' (SEQ ID NO: 12) erzeugt. huFc1(YN > AQ, d)(Linker2)-IL-7 unterscheidet sich vom vorhergehenden Fusionsprotein huFcγ1(YN > AQ)(Linker2)-IL-7 darin, dass ihm die terminalen beiden Aminosäurereste des Fc-Teils des Fusionsproteins fehlen. Genauer gesagt endet der Fc-Teil nicht mit der Sequenz ...ATATPGA (SEQ ID NO: 11) sondern mit der Sequenz ...ATATP (SEQ ID NO: 10). Die Aminosäuresequenz des kodierten Fusionsproteins ist in 8 (SEQ ID NO: 8) dargestellt.
  • BEISPIEL 2.
  • Transfektion und Expression von Fc-IL-7-Fusionsproteinen.
  • Es wurde eine Elektroporation zur Einführung von für die oben beschriebenen IL-7-Fusionsproteine kodierender DNA in eine Myelom-NS/0-Zelllinie der Maus verwendet. Zur Durchführung der Elektroporation wurden die NS/0-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem, fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und Penicillin/Streptomycin, gezüchtet. Es wurden etwa 5 × 106 Zellen einmal mit PBS gewaschen und in 0,5 ml PBS resuspendiert. 10 μg linearisierter Plasmid-DNA für huFcγ1-IL-7 wurden dann mit den Zellen in einer Gene Pulser Küvette (0,4 cm Elektrodenlücke, BioRad) auf Eis 10 min lang inkubiert. Elektroporation wurde unter Verwendung eines Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) mit Einstellungen bei 0,25 V und 500 μF ausgeführt. Die Zellen durften sich 10 min auf Eis erholen, dann wurden sie im Wachstumsmedium resuspendiert und auf zwei 96-Loch-Platten ausplattiert.
  • Stabil transfizierte Klone wurden mittels ihres Wachstums in der Gegenwart von zwei Tage nach der Transfektion zu dem Wachstumsmedium gegebenen 100 nM Methotrexat (MTX) selektiert. Die Zellen wurden alle 3 Tage zwei oder drei weitere Male gefüttert und die MTX-resistenten Klone erschienen nach 2 bis 3 Wochen. Überstände von Klonen wurden mittels anti-Fc-ELISA untersucht, um Klone zu identifizieren, die hohe Mengen an IL-7-Fusionsproteinen produzierten. Stark produzierende Klone wurden isoliert und in 100 nM MTX enthaltendem Wachstumsmedium vermehrt. Typischerweise wurde serumfreies Wachstumsmedium wie z. B. H-SFM oder CD-Medium (Life Technologies) verwendet.
  • BEISPIEL 3.
  • Biochemische Analyse von huFc-IL-7-Fusionsproteinen.
  • Es wurde routinemäßig eine SDS-PAGE-Charakterisierung verwendet, um die Integrität der Fusionsproteine zu untersuchen. Unterschiede zwischen den huFc-IL-7-Varianten huFcγ1-IL-7, huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7, huFcγ1(Linker1)-IL-7, huFcγ1(YN > AQ)(Linker2)-IL-7 und huFcγ1(YN > AQ, d)-IL-7 wurden untersucht. Die von NS/0-Zellen exprimierten huFc-IL-7-Fusionsproteine wurden auf Protein A-Sepharose-Perlen (Repligen, Needham, MA) aus dem Gewebekulturmedium, in das sie sezerniert wurden, gefangen und dann mittels Kochen in Proteinprobenpuffer mit oder ohne ein Reduktionsmittel wie z. B. β-Mercaptoethanol eluiert. Die Proben wurde mittels SDS-PAGE getrennt und die Proteinbanden wurden mittels Coomassie-Färbung visualisiert. Mittels SDS-PAGE wurden die untersuchten huFc-IL-7-Fusionsproteine im Allgemeinen gut exprimiert, da sie im Wesentlichen als eine einzelne Bande auf dem Gel vorhanden waren; es wurde gefunden, das in den Proben von huFc-IL-7-Varianten, die einen Linker enthielten, sekundäre Banden, die gespaltenes Material bedeuten könnten, merklich vermindert waren.
  • Gereinigte huFc-IL-7-Fusionsproteine wurden auch mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) analysiert, um das Maß zu bestimmen, mit dem die huFc-IL-7-Varianten aggregiert waren. Kurz gesagt wurde der Zellkulturüberstand auf eine vorher äquilibrierte Fast-Flow-Protein-A-Sepharose-Säule geladen, die Säule wurde ausgiebig in einem physiologischen Puffer (wie z. B. 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl bei neutralem pH-Wert) gewaschen und gebundenes Protein wurde bei etwa pH 2,5 bis 3 in dem gleichen Salzpuffer wie oben eluiert. Die Fraktionen wurden direkt neutralisiert.
  • Es wurde gefunden, dass bei jedem der untersuchten Fusionsproteine mindestens 50% des Produkts und im Allgemeinen mehr als 65% monomer vorlag. „Monomer" wie hier verwendet, bezieht sich auf nicht-aggregierte Proteine. Es ist bekannt, dass Proteine mit einem Fc-Teil normalerweise einen Disulfid-gebundenen Komplex bilden, der normalerweise zwei Polypeptidketten umfasst (es sei denn, es befinden sich zwei Fc-Teile im gleichen Polypeptid) und als ein „Einheitsdimer" betrachtet werden können. „Monomer" soll derartige Disulfid-gebundenen Spezies nicht ausschließen, sondern bezeichnet nur, dass die Proteine nicht aggregiert sind. Um ein nahezu monomeres huFc-IL-7-Fusionsproteinpräparat (etwa 98%) zu erhalten, wurde das Eluat aus der Sepharose-Protein-A-Reinigung auf eine präparative SEC-Säule (Superdex) geladen und die Fraktion des Monomeren-Peaks wurde aufgefangen. Typischerweise betrug die Konzentration an gewonnenem Protein etwa 1 mg/ml. Falls erforderlich wurde die Probe aufkonzentriert, z. B. mittels Spindialyse (e. g. VivaSpin) mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 10–30 kDa.
  • Disulfid-Bindung
  • IL-7 enthält an den Positionen Cys2, Cys34, Cys47, Cys92, Cys129 und Cys141 der reifen IL-7-Proteinsequenz sechs Cys-Reste, die Disulfidbindungen eingehen könnten. Die Faltung von huFcγ1-IL-7 wurde untersucht, indem das Muster der in der IL-7-Einheit des Fusionsproteins vorkommenden Disulfidbindungen bestimmt wurde. Kurz gesagt, wurden Peptidkarten von huFcγ1-IL-7 aus trypsiniertem Material erstellt und auf die Gegenwart von Signaturpeptidfragmenten analysiert. huFcγ1-IL-7-Protein wurde entweder in einer nativen Form oder nach Reduktion und Alkylierung trypsiniert. Um Peptidfragmente, die vielleicht glykosyliert waren, zu berücksichtigen, wurden Proben von nativen und denaturierten Proteinen zusätzlich mit PNGaseF behandelt, um Glykosylketten vor dem tryptischen Verdau zu entfernen. Die Peptidfragmente wurde mittels HPLC fraktioniert und ihre Masse wurde mittels Massenspektrometrie bestimmt.
  • Im Zusammenhang mit Fcγ1-IL-7 sollte voraussagegemäß ein die Disulfidbindung Cys47–Cys141 („3–6") enthaltendes Peptidfragment eine Masse von 1447,6 aufweisen, während ein die Disulfidbindung Cys2–Cys141 („1–6") enthaltendes Peptidfragment voraussagegemäß eine Masse von 1426,6 aufweisen sollte. Ebenso würde ein die Disulfidbindung Cys34–Cys129 („2–5") enthaltendes Peptidfragment voraussagegemäß eine Masse von 2738,3 aufweisen. Tatsächlich wurden Peptidfragmente mit einer Masse von 1447,6 („3–6") und von 2738,3 („2–5") in von dem nativen Fc-IL-7-Protein abstammenden Proben identifziert, ungeachtet dessen, ob die Proben mit PNGaseF behandelt wurden oder nicht, nicht aber in Proben von reduziertem Fc-IL-7. Umgekehrt wurde das Peptidfragment der Masse 1426,6 („1–6") in keiner der Proben gefunden. Also enthielt Fcγ1-IL-7 die Disulfidbindungen Cys47–Cys141 und Cys34–Cys129, aber nicht Cys2–Cys141. Es wurde festgestellt, dass ein Peptidfragment mit der vorausgesagten Masse von 2439,2, entsprechend einem Cys2–Cys92 („1–4") enthaltendem Fragment, nur in der Probe aus dem mit PNGaseF behandelten, nativen Fusionsprotein identifiziert wurde. Tatsächlich liegt Cys92 innerhalb der Tripeptideinheit Asn91Cys92Thr93, was darauf hindeutet, dass Asn91 in huFcγ1-IL-7 glykosyliert wurde. Also stimmte in huFcγ1-IL-7 das Disulfidbindungsmuster mit Cys2–Cys92, Cys34–Cys129 und Cys47–Cys141 überein. Diese experimentell bestimmte Konfiguration der Disulfidbindungen von Fc-IL-7 steht im Gegensatz zur experimentell bestimmten Konfiguration, die für das in Bakterien produzierte und rückgefaltete IL-7 berichtet wurde (Cosenza et al. (1997) JBC 272: 32995).
  • N-verknüpfte Glykosylierungsstellen
  • Humanes IL-7 enthält drei potenzielle Glykosylierungsstellen an den Positionen Asn70, Asn91 und Asn116 der reifen IL-7-Proteinsequenz. Peptidkarten von huFcγ1-IL-7 (reduziert/alkyliert) wurden auf die Gegenwart von Signaturpeptidfragmenten untersucht. Sind sie glykosyliert, würden diese Signaturfragmente sich nur in mit PNGaseF behandelten Proben zeigen. Für tryptische Peptidfragmente, die die unmodifizierten Reste von Asn70, Asn91 bzw. Asn116 enthalten, wurden Massen von 1489,7, 1719,9 und 718,3 vorausgesagt.
  • Tatsächlich wurden Peptidfragmente mit einer Masse von 1489,7 und von 1719,9 in mit PNGaseF behandelten Proben identifiziert, waren aber in der unbehandelten Probe nicht vorhanden, was darauf hindeutet, dass Asn70 (das in der Sequenz ...MNSTG... enthalten ist) (SEQ ID NO: 31) und Asn91 das in der Sequenz ...LNCTG... enthalten ist} (SEQ ID NO: 32) tatsächlich glykosyliert waren. Überraschenderweise wurde ein tryptisches Fragment mit einer Masse von 718,3, das SLEENK (SEQ ID NO: 35) entsprach, sowohl in den mit PNGaseF behandelten Proben als auch in der unbehandelten Proben identifiziert, was darauf hindeutet, dass Asn116 nicht glykosyliert war. Dies war nicht zu erwarten, da Asn116 in der humanen IL-7-Sequenz ...PTKSLEENKSLKE... (SEQ ID NO: 13) (siehe SEQ ID NO: 1) eine N-verknüpfte Glykosylierungsstelle sein sollte. Die putative NKS-Glykosylierungsstelle ist in Schafen und Kühen sowie auch bei Menschen konserviert.
  • Die Analyse der Disulfidbindungsmuster und N-verknüpften Glykosylierungsstellen, die mit den Proben von Fcγ1(Linker1)-IL-7 und von Fcγ2h(FN > AQ)-IL-7 wiederholt wurden, ergaben ähnliche Ergebnisse.
  • BEISPIEL 4.
  • ELISA-Verfahren.
  • Die Konzentrationen an Proteinprodukten in den Überständen der MTX-resistenten Klone und anderen Testproben wurde mittels anti-huFc-ELISA wie im Detail unten beschrieben bestimmt. ELISA-Platten wurden mit AffiniPure Ziegen-Anti-Human-IgG (H + L) (Jackson Immuno Research Laborstories, West Grove, PA) bei 5 μg/ml in PBS and 100 μl/Loch in 96-Lochplatten beschichtet. Beschichtete Platten wurden bedeckt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Platten wurden 4 Mal mit 0,05% Tween (Tween 20) in PBS gewaschen und mit 1% BSA/1% Ziegenserum in PBS, 200 μl/Loch blockiert. Nach Inkubation mit dem Blockierungspuffer bei 37°C für 2 Std. wurden die Platten 4 Mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen und trocken getupft. Testproben wurden soweit erforderlich in Probenpuffer (1% BSA/1% Ziegenserum/0,05% Tween in PBS) verdünnt. Es wurde eine Standardkurve unter Verwendung eines chimären Antikörpers (mit einem humanen Fc) hergestellt, dessen Konzentration bekannt war. Für die Erstellung einer Standardkurve wurden im Probenpuffer Reihenverdünnungen gemacht, um eine Standardkurve im Bereich von 125 ng/ml bis 3,9 ng/ml zu ergeben. Die verdünnten Proben und Standards wurden zu der Platte gegeben, 100 μl/Well, und die Platte wurde bei 37°C für 2 h inkubiert. Nach Inkubation wurde die Platte 8 Mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen. Zu jedem Well wurden dann 100 μl des sekundären Antikörpers, nämlich das mit Meerrettichperoxidase konjugierte Anti-humane IgG verdünnt auf etwa 1:120.000 in Probenpuffer, gegeben. Die genaue Verdünnung des sekundären Antikörpers wurde für jede Charge des HPR-konjugierten anti-humanen IgG bestimmt. Nach Inkubation bei 37°C für 2 h wurde die Platte 8 Mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen.
  • Die Substratlösung wurde mit 100 μl/Loch zu der Platte gegeben. Die Farbe durfte sich 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln entwickeln. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4N Schwefelsäure, 100 μl/Loch gestoppt. Die Platte wurde durch einen Plattenleser ausgelesen, der sowohl auf 490 als auch auf 650 nm eingestellt und darauf programmiert war, die Hintergrund-OD bei 650 nm von der OD bei 490 nm zu subtrahieren.
  • Die Konzentration von humanem IL-7 in Serumproben von mit huFc-IL-7-Fusionsproteinen oder rekombinantem humanem IL-7 behandelten Tieren wurde, im Wesentlichen wie oben beschrieben, mittels ELISA bestimmt. Humanes IL-7 wurde mittels eines anti-humanen IL-7-Antikörpers der Maus (R & D Systems, Minneapolis, MN) abgefangen und mittels eines antihumanen IL-7-Biotinantikörpers der Ziege (R & D Systems, Minneapolis, MN) nachgewiesen.
  • BEISPIEL 5.
  • Reinigung von huFc-IL-7-Proteinen.
  • Eine standardmäßige Reinigung von Fc-haltigen Fusionsproteinen wurde auf der Grundlage der Affinität der Fc-Proteineinheit für Protein A durchgeführt. Kurz gesagt, wurden geeignetes Fusionsprotein exprimierende NS/0-Zellen in Gewebekulturmedium gezogen und der das exprimierte Protein enthaltende Überstand wurde aufgefangen und auf eine voräquilibrierte Past Flow Protein A Sepharose-Säule geladen. Die Säule wurde anschließend ausgiebig mit Puffer (wie z. B. 100 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl bei neutralem pH-Wert) gewaschen. Gebundenes Protein wurde bei einem niedrigen pH-Wert (pH 2,5–3) im gleichen Puffer wie oben eluiert und die Fraktionen wurden direkt neutralisiert.
  • Um ein nahezu nicht aggregiertes huFc-IL-7-Fusionsproteinpräparat (etwa 98%) zu erhalten, wurde das Eluat auf eine präparative SEC-Säule (Superdex) geladen und die Fraktion des Monomeren-Peaks wurde aufgefangen. Typischerweise betrug die Konzentration an gewonnenem Protein etwa 0,5 mg/ml bis 2 mg/ml, und falls erforderlich wurden die Probe mittels Spindialyse (z. B. Viva Spin mit einem Molekulargewicht-Cut-off von 30 kDa) aufkonzentriert.
  • BEISPIEL 6
  • In vitro-Aktivität von huFc-IL-7-Proteinen.
  • Die Cytokinaktivität der gereinigten huFc-IL-7-Fusionsproteine wurde in vitro in einem zellulären Proliferationsbioassay bestimmt. Humane PBMCs (Periphere mononukleäre Blutzellen) wurden mittels PHA-P aktiviert, um auf IL-7 reaktionsfähige Zellen herzustellen. Die Proliferation wurde in einem standardmäßigen Thymidineinbauassay gemessen. Kurz gesagt, wurden PBMCs zunächst fünf Tage lang mit 10 μg/ml PHA-P inkubiert, die Zellen wurden gewaschen und anschließend in einem mit den huFc-IL-7-Fusionsproteinen ergänzten Medium in einer Verdünnungsreihe insgesamt 48 Stunden lang inkubiert. Während der letzten 12 Stunden wurden die Proben mit 0,3 μCi [Methyl-3H]Thymidin (Dupont-NEN-027) gepulst. Die Zellen wurden anschließend ausgiebig gewaschen, geerntet und auf Glasfilter lysiert. In DNA eingebautes 3H-Thymidin wurde in einem Szintillationszähler gemessen. Als Standard wurde Wildtyp-huIL-7-Protein, das von R & D Systems (Minneapolis, MN) oder vom National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) erhalten wurde, untersucht.
  • Ein ED50-Wert der Zellproliferation für huFc-IL-7-Fusionsproteine wurde durch die Auftragung einer Dosis-Wirkungs-Kurve gemäß Standardtechniken und Bestimmung der Proteinkonzentraion, die zu einer halbmaximalen Reaktion führt, erhalten. Die Fusionsproteine huFcγ1-IL-7, huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 und huFcγ1(Linker1)-IL-7 wurden untersucht. Die ED50-Werte der Fusionsproteine waren einander ziemlich ähnlich und befanden sich innerhalb eines 3fachen Bereichs voneinander. Demzufolge wurde gefunden, dass diese Veränderungen in der Fc-Einheit nur geringen Einfluss auf die IL-7-Aktivität des Fusionsproteins haben.
  • Weiterhin wurde gefunden, dass die ED50-Werte für diese Fusionsproteine um etwa das 3- bis 10fache höher waren als die ED50-Werte, die für kommerziell von R & D Systems erhältlichem huIL-7 erhalten wurden. Da dieses kommerzielle Präparat in Bakterien produziert wird und nicht glykosyliert ist, wurde enzymatisch deglykosyliertes, durch Behandlung mit PNGaseF, huFcγ1-IL-7-Protein untersucht. Es wurde gefunden, dass es eine ähnliche Aktivität wie die unbehandelte Form aufweist. Ohne uns auf eine Theorie festlegen zu wollen, könnte die etwas verminderte Aktivität der Fusionsproteine ihren Grund nicht in der Glykosylierung der IL-7-Einheit, sondern stattdessen in einem sterischen Effekt als Folge eines gehinderten N-Terminus der IL-7-Einheit haben.
  • BEISPIEL 7.
  • Pharmakokinetische Eigenschaften der huFc-IL-7-Proteine.
  • Die pharmakokinetischen (PK) Profile eines huFc-IL-7-Fusionsproteins und von rekombinantem humanem IL-7 (Peprotech, Rocky Hill, NJ) wurden untersucht und die Ergebnisse sind in 13 wiedergegeben. Eine einzelne subkutane Injektion einer äquimolaren Menge an huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 oder von rekombinantem humanem IL-7 (50 μg) wurden Gruppen von C57BL6/J-Mäusen verabreicht. Blutproben wurden mittels retro-orbitalem Aderlass zum Zeitpunkt der Injektion (d. h. bei t = 0 min), und 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24, 48, 72, 96, 120 und 144 h nach der Injektion entnommen. Die Proben wurden in Heparinröhrchen gesammelt, um eine Gerinnung zu vermeiden, und die Zellen wurden mittels 4-minütigem Zentrifugieren in einer Hochgeschwindigkeitsmikrozentrifuge von Eppendorf mit 12.500 g entfernt. PK-Werte wurden mittels des PK-Solutions 2.0TM Softwarepakets (Summit Research Services, Montrose, CO) berechnet.
  • Die Konzentration von verabreichtem IL-7 wurde in vierfachen Plasmaproben von jedem Zeitpunkt mittels eines für humanes IL-7 spezifischen ELISAs bestimmt. Es wurde gefunden, dass das pharmakokinetische Verhalten von huFc-IL-7 und rekombinantem IL-7 sich grundlegend unterschied. Bei rekombinantem humanem IL-7 betrug die maximale Konzentration (Cmax) 23,5 ng/ml 2 Stunden nach der Injektion (Tmax), während bei huFc-IL-7 Cmax 1588,7 ng/ml 24 Stunden nach der Injektion betrug. Des Weiteren wurde, während rekombinantes humanes IL-7 schneller absorbiert wurde als huFc-IL-7 (β-Phasenhalbwertszeit 0,9 Stunden gegen 12,4 Stunden), huFc-IL-7 während der β-Phase um etwa das 9fache langsamer aus dem Kreislauf eliminiert. Daher hatten Mäuse, die huFc-IL-7 erhielten, in Form der AUC (Fläche unter der Kurve) als Maß für die Gesamtwirkstoffexposition eine 572fach höhere Exposition gegenüber dem verabreichtem Protein als Mäuse, die rekombinantes humanes IL-7 erhielten. Diese Daten zeigen eine deutliche Verbesserung der huFc-IL-7-Fusionsproteine in Bezug auf freies rekombinantes humanes IL-7 hinsichtlich ihrer PK. Es wurde weiterhin gefunden, dass die PK-Profile von huFc-IL-7-Fusionsproteinen wie z. B. huFcγ1-IL-7 und huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7, huFc1(YN > AQ)(Linker2)-IL-7 und huFcγ1(YN > AQ, d)(Linker2)-IL-7, die Mäusen mittels intravenöser Injektion verabreicht wurden, einander ähnlich waren.
  • BEISPIEL 8.
  • Wirksamkeit von huFc-IL-7 in lymphopenen Mäusen nach einer Knochenmarkstransplantation (KM).
  • Die Wirksamkeit von huFc-IL-7-Fusionsproteinen verglichen mit rekombinantem humanem IL-7 wurde in vivo untersucht. Zum Beispiel wurde huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 oder rekombinantes humanes IL-7 (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) lymphopenen Mäusen nach Transplantation von T-Zell-depletiertem Knochenmark (KM) verabreicht und die Erholung der Immunzellpopulationen wurde bewertet.
  • Im Wesentlichen wurden die Empfängermäuse vor der KM-Transplantion mit zwei Dosen 600 cGy Gesamtkörperbestrahlung in einem 4 h-Intervall letal bestrahlt und in PBS resuspendierte BM-Zellen wurden in die Schwanzvene der Empfängermäuse injiziert. In regelmäßigen Abständen von Tag 5 an wurde den Empfängermäusen subkutan eine äquimolare Menge huFc-IL-7 (7 μg) oder rekombinantes humanes IL-7 (2,5 μg) (Peprotech, Rocky Hill, NJ) verabreicht. Im Verlauf des Experiments wurden Blutproben der Empfängermäuse genommen und die Lymphozytenzellkonzentrationen in den Proben wurden gemessen.
  • Für die KM-Zelltransplantationen wurden KM-Zellen aseptisch aus Femur und Tibia von BL/6.SJL-Mäusen (H2b, CD45.1) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) erhalten und durch Entfernen von magnetisch markierten T-Zellen über MACS®-Säulen (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) an T-Zellen depletiert. Das Maß an T-Zelldepletion wurde mittels FACS-Analyse mit fluorszierend markierten Antikörpern gegen CD45, αβ-TCR (T-Zellen) und 7-Amino-actinomycin D (7-AAD, apoptotische Zellen) (Calbiochem, X) überwacht. Pro Empfängermaus wurden 10 × 106 lebende (7-AAD-negative) KM-Zellen (die weniger als 1% T-Zellen enthalten) verwendet. In kongenerischen KM-Transplantationen wurden B6-Mäuse (H2b, CD45.2) als Empfängermausstamm verwendet und bei allogenen KM-Transplantationen wurden B6C3F1-Mäuse (H2b/k CD45.2) gewählt.
  • Die Lymphozytenzellkonzentrationen (wie in Tabelle 1 angegeben) wurden im Wesentlichen wie von Brocklebank und Sparrow (Brocklebank and Sparrow (2001) Cytometry 46: 254) beschrieben gemessen. Kurz gesagt, wurden fluoreszierende Perlen (TruCOUNTTM Tubes, BD Biosciences, San Jose, CA) in 40 μl PBS, das eine Mischung aus lymphozytenspezfischen Antikörpern enthielt, gelöst. Anschließend wurden 10 μl antikoaguliertes Blut zugegeben, gemischt und 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die roten Blutzellen wurden in 450 μl Red-Blood-Cell-Lysis- Lösung (BD Biosciences, San Jose, CA) lysiert und Proben wurden mittels Durchflußcytometrie analysiert (BD FACSCaliburTM, BD Biosciences, San Jose, CA). Die Konzentration einer bestimmten Lymphozytenpopulation (z. B. B-Zellen, T-Zellen oder gesamte Leukozyten) wurde bestimmt, indem um die Lymphozyten und fluoreszierenden Perlen getrennte Auswertfenster (Gates) geschaffen wurden und die Anzahl an Ereignissen pro Auswertfenster ausgelesen wurde. Die Anzahl an Lymphozyten im Auswertfenster pro Mikroliter wurde durch Teilen der Anzahl an Ereignissen im Lymphozytenregion-Auswertfenster durch die Anzahl an Ereignissen im Perlenregion-Auswertfenster berechnet. Diese Anzahl wurde mit dem Anteil an Anzahl von Perlen pro TruCOUNT-Röhrchen (vom Lieferanten angegeben) über das Probenvolumen multipliziert und schließlich mit dem Probenverdünnungsfaktor multipliziert.
  • In einem Experiment wurde die Lymphozytenrekonstitution in einer kongenerischen KM-Transplantationsumgebung unter Verwendung der oben spezifizierten Materialien und Verfahren bewertet. Empfängermäusen wurde huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 in einer Dosis von 7 μg (125 mg IL-7/kg Körpergewicht) injiziert, und die Lymphozytenzellen wurden wie beschrieben gemessen. Spenderlymphozyten wurden als CD45.1-positive Zellen nachgewiesen, während die endogenen Lymphozyten der Empfängermäuse als CD45.2-positive Zellen nachgewiesen wurden. Lymphozyten-B- und T-Zellen wurden unter Verwendung von B220- bzw. CD3-Lymphozytenmarkern identifiziert. Es wurde gefunden, dass bis Tag 49 Spenderlymphozyten (CD45.1-positive Zellen) die Empfängermäuse bis auf Spiegel repopuliert hatten, die mit nichtbestrahlten Kontrollmäusen vergleichbar waren, während die endogenen Lymphozyten (CD45.2-positive Zellen) sich nicht merklich vermehrt hatten. Außerdem verursachte die Behandlung mit dem huFc-IL-7-Fusionsprotein keine signifikante Toxizität. Diese Ergebnisse haben die Wirksamkeit des Fusionsproteins bei der Vermehrung von adoptiv transferierten Lymphozytenpopulationen nachgewiesen. Diese Ergebnisse sind in 16 dargestellt.
  • In einem weiteren Experiment wurde ein allogenes KM-Transplantationsmodell, das eine klinische Transplantationsumgebung besser simulieren kann, verwendet, um ein huFc-IL-7-Fusionsprotein mit rekombinantem humanem IL-7 zu vergleichen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Es wurden wiederum die Verfahren und Materialien wie oben beschrieben verwendet. Es wurde huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 und humanes IL-7 (äquivalent zu 125 μg IL-7/kg Körpergewicht) von Tag 5 bis Tag 56 nach der Transplantation entweder jeden zweiten Tag (q2d) oder einmal pro Woche (q7d) verabreicht. Mit PBS-behandelte Spendermäuse und bestrahlte, Knochenmark empfangende, mit PBS behandelte Mäuse dienten als Kontrollen.
  • In mit dem Fusionsprotein behandelten Empfängermäusen erreichten vom Spender stammende B-Zellen (CD45.1+, B220+, CD19+) 14 oder 16 Tage nach der Transplantation bei Verabreichung nach q2d bzw. q7d Grundlinienspiegel (wie durch die Blutkonzentration von B-Zellen in Spenderkontrollmäusen definiert). Im Gegensatz dazu hatte bei mit rekombinantem humanem IL-7 behandelten Mäusen keine der beiden Dosierungspläne eine Wirkung; die Anzahl an B-Zellen in mit PBS-behandelten und mit humanem IL-7 behandelten Empfängermäusen benötigte etwa die gleiche Zeit zum Erreichen des Grundlinienspiegels, etwa 28 Tage. Zusätzlich zu einer beschleunigten B-Zellrekonstitution förderte die Behandlung mit huFc-IL-7 die anhaltende Vermehrung von B-Zellen bis Tag 33: nach q2d verabreichtes huFc-IL-7 führte zu einem 7fachen Anstieg, während die Verabreichung nach q7d zu einem 2,5fachen Anstieg der Anzahl an B-Zellen verglichen mit Kontrollmäusen führte. Nach Tag 33 nahm die Anzahl an B-Zellen ab, war aber noch immer ungefähr um das 2fache höher als in Kontrollmäusen. Nach Tag 33 nahmen auch die Spiegel von verabreichten IL-7-Proteinen im Blut ab, was möglicherweise zum Teil an der Bildung von neutralisierenden Antikörpern auf das humane Fusionsprotein lag. 14 stellt diese Ergebnisse der B-Zellrekonstitution in bestrahlten, mit rekombinantem humanem IL-7 und huFc-IL-7 behandelten Mäusen mit Knochenmarkstransplantation dar.
  • Mit Bezug auf von Spender abstammenden T-Zellen (CD45.1+, CD3+, TCRotB+) wurde ein ähnliches Ergebnis beobachtet. Behandlung mit dem huFc-IL-7-Fusionsprotein führte zu einer beschleunigten T-Zellrekonstitution, während die Behandlung mit rekombinantem humanem IL-7 nicht dazu führte. Maximale T-Zellspiegel wurden etwa an Tag 49 erreicht. Die Anzahl an T-Zellen über der Grundlinie (d. h. der Blutkonzentration von T-Zellen in Spendermäusen) wurde jedoch nur mit dem q2d-Dosierungsschema des huFc-IL-7-Fusionsproteins erreicht; es wurde eine 1,5fache Anzahl an T-Zellen bezogen auf Kontrollmäuse erreicht. 15 stellt diese Ergebnisse der T-Zellrekonstitution in bestrahlten, mit rekombinantem humanem IL-7 und huFc-IL-7 behandelten Mäusen mit Knochenmarkstransplantation dar.
  • Trotz den transient hohen Anzahlen an Spender-B-Zellen und -T-Zellen in den Empfängermäusen unter bestimmten Bedingungen, zeigte im Verlauf des Experiments keine der Experiment-Mäuse Anzeichen für Morbidität. Die Analyse von inneren Organen an Tag 55 ergab keine pathologischen Anormalitäten an Leber, Nieren, Lunge, Milz, Thymus, Lymphknoten, Magen, Dünn- und Dickdarm. Daher zeigte dieses allogene Transplantationsexpriment, dass das huFc-IL-7-Fusionsprotein in vivo gegenüber rekombinantem humanem IL-7 bei der Rekonstitution von Lymphozyten nach myelo-ablativer Konditionierung deutlich überlegen war. Tabelle 1: Wirkung von huFc-IL-7-Fuisonsprotein auf die Immunzellrekonstitution.
    Anzahl an Zellen pro μl Blut
    Behandlung Tag
    1. Vom Spender stammende Leukozyten (CD45.1*) 7 13 19 27 33 41 47 55
    a.) Allogeneische KMT in B6C3-Mäuse PBS AVG SEM 580,8 324,5 3576,8 1717,0 4384,0 1474,2 16805,6 8367,6 20732,8 10065,3 16395,2 7997,3 21462,4 11230,2 20329,6 9693,2
    huFc-IL-7, q2d AVG SEM 248,8 89,3 26597,0 4786,2 130253,6 25106,8 148048,0 18786,3 194266,4 17131,1 168794,0 25949,9 127848,0 981,0 79175,2 10740,2
    huFc-IL-7, q7d AVG SEM 278,4 106,3 5848,8 762,9 32308,0 2786,3 64256,0 6081,4 74103,2 8345,9 69042,4 14497,4 55989,6 5989,8 58519,2 6583,8
    humanes IL-7, q7d AVG SEM 270,7 84,9 6020,0 1229,2 6922,7 1089,7 24278,7 5235,3 37353,3 2697,0 42166,7 4691,4 33570,7 764,5 38138,7 3273,6
    humanes IL-7, q7d AVG SEM 229,0 31,9 4603,0 435,6 4963,0 654,1 27443,0 2513,8 27027,0 1813,4 27797,0 4084,6 32675,0 6307,8 33205,0 4894,7
    b.) B6.SJL Kontrollmäuse PBS AVG SEM 30744,5 3018,6
    Anzahl an Zellen pro μl Blut
    Behandlung Tag
    II. Vom Spender stammende B-Zellen (CD45.1* CD19* 8220*) 7 13 19 27 33 41 47 55
    a.) Allogeneische KMT in B6C3-Mäuse PBS AVG SEM 32,0 5,7 1013,3 25,7 4257,3 661,1 19294,7 2858,5 22549,3 2625,4 17842,7 1691,6 23841,3 3783,7 22296,0 1474,5
    huFc-IL-7, q2d AVG SEM 16,0 5,7 17830,0 3755,4 122122,4 24028,4 131862,4 16974,5 169745,6 15413,6 142972,0 22834,6 98571,0 2599,1 58661,6 9352,9
    huFc-IL-7, q7d AVG SEM 14,4 6,5 2559,0 408,9 28124,0 2464,1 53573,6 4911,5 59999,2 6337,2 52932,8 10998,2 41489,6 4821,1 42899,2 5013,0
    humanes IL-7, q7d AVG SEM 5,3 3,5 1550,7 403,5 4316,0 542,7 17802,7 3689,5 28061,3 1484,5 30177,3 2861,6 24720,0 633,8 26104,0 2085,3
    humanes IL-7, q7d AVG SEM 4,0 1,6 748,0 56,1 3179,0 443,3 19303,0 1666,1 19203,0 1429,5 17930,0 2511,6 22460,0 4458,6 21473,0 3199,5
    b.) B6.SJL Kontrollmäuse PBS AVG SEM 15572,6 1631,4
    Anzahl an Zellen pro μl Blut
    Behandlung Tag
    III. Vom Spender stammende T-Zellen (CD45.1* CD3* abTC R*) 7 13 19 27 33 41 47 55
    a.) Allogeneische KMT in B6C3-Mäuse PBS AVG SEM 0,0 0,0 206,7 121,6 192,0 46,2 1808,0 245,0 3928,0 546,7 4453,3 533,0 6178,7 538,1 5622,7 210,0
    huFc-IL-7, q2d AVG SEM 0,0 0,0 124,0 24,9 839,0 155,5 5260,8 1183,1 12252,8 1734,8 15204,8 1641,2 16628,0 1524,5 13365,6 1423,9
    huFc-IL-7, q7d AVG SEM 0,0 0,0 38,4 6,1 228,0 38,5 2428,0 326,2 5492,0 918,1 9988,0 2475,8 9252,8 2748,6 8598,4 1185,9
    humanes IL-7, q7d AVG SEM 0,0 0,0 56,0 3,3 144,0 42,5 1057,3 160,1 3068,0 154,0 5368,0 645,5 5081,3 113,7 7112,0 409,9
    humanes IL-7, q7d AVG SEM 0,0 0,0 41,0 2,5 88,0 20,2 1493,0 187,5 2579,0 238,0 3918,0 694,6 5021,0 724,2 6043,0 1013,1
    b.) B6.SJL Kontrollmäuse PBS AVG SEM 10832,0 1500,4
  • BEISPIEL 9.
  • Wirksamkeit von huFc-IL-7 auf die T-Zell-Transplantationen in lvmphopenen Mäusen.
  • Die Wirksamkeit von huFc-IL-7-Fusionsproteinen wurde ebenfalls in einem T-Zell-Transplantationsmodell untersucht. Im Wesentlichen wurde eine homogene (klonierte) T-Zell-Population in immundefiziente, bestrahlte Mäuse überführt, wobei den Empfängermäusen das huFc-IL-7-Fusionsprotein verabreicht wurde, und das Ausmaß der T-Zell-Rekonstitution und letztendlich der T-Zell-Funktion wurde bewertet.
  • Um eine homogene T-Zell-Population zu erhalten, wurden Splenozyten von P14-TCR-tg/RAG-Mäusen (Charles.River Laborstories, Wilmington, MA) genommen, die frei von B-Zellen sind. Weiterhin exprimieren alle T-Zellen dieser Mäuse den transgenen T-Zell-Rezeptor (TCR), P14, der für ein virales Epitop (gp33 of LCMV) spezifisch ist.
  • Einzelzell-Suspensionen von Splenozyten wurden intravenös in die Schwänze von RAG Cy+ immunodefizienten Mäusen (Qiarles River Laborstories) injiziert, die 4 Stunden vor der Transplantation eimal mit 650 Rad (subletale Dosis) bestrahlt wurden. An jedem zweiten Tag beginnend an Tag 2 wurde den Empfängermäusen 7 mg des Fusionsproteins huFcγ2(h)(FN > AQ)-IL-7 verabreicht. Einer Kontrollgruppe von Empfängermäusen wurde PBS verabreicht. Das Ausmaß der T-Zell-Rekonstitution als Reak tion auf das huFc-IL-7-Fusionsprotein oder PBS wurde mittels Messung des Vorhandenseins von P14 T-Zellen (CD8+VBS.1+Va2+-Zellen) im Blut mittels Durchflusszytometrie bestimmt.
  • Es wurde gefunden, dass an Tag 35 Mäuse, denen das huFc-IL-7-Fusionsprotein verabreicht wurde, eine 17fache Erhöhung der T-Zell-Anzahl (35.000 Zellen/μl) verglichen mit Kontrollmäusen (2.000 Zellen/μl) aufwiesen. Tatsächlich überstiegen die Spiegel an T-Zell-Rekonstitution die in unbehandelten P14 TCR-Mäusen gefundenen (23.000 Zellen/μl). Weiterhin war in diesen mit huFc-IL-7 behandelten Mäusen bei einem signifikanten Anteil der rekonstituierten T-Zellen die IL-2Rα-Rezeptoruntereinheit, CD25, auf der Zelloberfläche hochreguliert. Also war das huFc-IL-7-Fusionsprotein nicht nur bei der Vermehrung von transplantierten T-Zellen von Nutzen, sondern könnte zusätzlich die transferierten T-Zellen so vorkonditioniert haben, dass sie gegenüber Cytokinen wie z. B. IL-2 reaktiv waren.
  • BEISPIEL 10.
  • Adjuvanstherapie mit huFc-IL-7 für immunkompromittierte Patienten.
  • Es lässt sich eine Vielzahl an klinischen Gegebenheiten denken, in denen Patienten aus einer Adjuvanstherapie mit huFc-IL-7 einen Nutzen ziehen könnten. Zum Beispiel werden neue Behandlungsmodalitäten für kindliche Patienten mit bösartigen Erkrankungen wie z. B. lymphoblastischen oder myeloischen Leukämien entwickelt, die im Anschluss an eine myeloablative Therapie mit einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation behandelt werden, um das Immunsystem wiederherzustellen.
  • Um den potenziellen Spenderpool für diese Patienten deutlich zu erhöhen, wurde gefunden, dass G-CSF-mobilisierte Periphere Blutstammzellen (PBSCs) von passenden, nicht verwandten Spender oder haploidentischen Spender mit 1–3 HLA-Loci Fehlpaarungen eine Zellquelle sein können, unter der Voraussetzung, dass sie von T-Zellen depletiert sind (siehe Handgretinger et al. (2001) Annals NY Acad. Sciences 938: 340–357). Diese Depletion verminderte das Auftreten von akuten Graft-versus-Host-Abstoßungen (GvHD) deutlich; es wird jedoch vermutet, dass es aufgrund der geringen Konzentration an T-Zellen eine deutliche Verzögerung bei der Immunrekonstitution gab. Patienten waren während mindestens der ersten 6 Monate nach der Transplantation einem hohen Risiko von viralen Infektionen ausgesetzt und die T-Zellen kehrten erst nach einem Jahr auf die normalen Spiegel zurück (Handgretinger et al, (2001) Annals NY Acad. Sciences 938: 340–357; Lang et al, (2003) Blood 101: 1630–6). Daher wäre es vorteilhaft, die Repopulationsgeschwindigkeit der T-Zellen und anderer Immunzellen bei diesen Patienten zu erhöhen.
  • Patienten, die einen Nutzen aus einer huFc-IL-7-Therapie ziehen, umfassen Patienten mit Kindheitsleukämie wie z. B. einer lymphoblastischen Leukämie oder einer myeloischen Leukämie. Kinder mit dieser Erkrankung werden zunächst einer myeloablativen Konditionierungstherapie unterzogen, die entweder auf dem chemotherapeutischen Mittel Busulfan oder einer mit Chemotherapie kombinierten Ganzkörperbestrahlung beruht. Zum Beispiel wird, je nach der Diagnose und dem Alter des Patienten, dieser mit einer Ganzkörperbestrahlung (typischerweise 6 Behandlungen mit jeweils 2 Gy), anti-Thymoztenglobulin vom Kaninchen (10 mg/kg täglich, 3 Tage lang), Etoposid (40 mg/kg) und Cyclophosphamid (120 mg/kg) behandelt.
  • Um CD34-positive (pos) Stammzellen als Transplantat zu erhalten, werden Periphere Blutstammzellen (PBSCs) eines histokompatiblen (allogenischen) Spenders mit einer täglichen Dosis von 10 μg/kg G-CSF 6 Tage lang mobilisiert und mittels Leukapharese an Tagen 5 und 6 geerntet. Im Allgemeinen werden etwa 20 × 106/kg CD34-pos-Stammzellen erhalten und transplantiert. CD34-pos-Stammzellen werden von den PBSCs mittels positiver Selektion mit einem antiCD34-Antikörper in einem SuperMACS-System (Magnet-aktiviertes Zellsortieren, Miltenyi Biotec) gereinigt und eluiert. Die T-Zell-Depletion beträgt typischerweise etwa 5 log, bis etwa 10 × 103 Zellen/kg. Aggregate und andere Zellbruchstücke werden mittels FACS-Sortierung aus dem Tranplantat ausgeschlossen. Die Zellsuspension wird mittels eines venösen Zentralkatheters in den Patient infundiert. Optional kann das Transplantat gereinigte Populationen von anderen Immunzellen wie z. B. haploidentischen NK-Zellen, DCs, Monozyten sowie CD34neg-Stammzellen umfassen.
  • Um das Anwachsen zu bewerten, wird eine absolute Neutrophilenzählung durchgeführt. Das Anwachsen wird als erfolgreich betrachtet, sobald der Neutrophilenspiegel über 50 Zellen/μl verbleibt. Rekonstitution von Immunzellen wird mittels FACS-Analyse überwacht, zunächst wöchentlich und sobald die Erhohlung der T-Zellen beginnt, alle 3 Monate.
  • Um die Immunrekonstitution zu erhöhen, wird der Patient mit einem huFc-IL-7-Fusionsprotein wie z. B. huFcγ2h(FN > AQ)-IL-7 oder huFcγ1(YN > AQ)(Linker2)-IL-7 behandelt. Ungefähr 3 Wochen nach der Transplantation (oder nach dem Feststellen des Anwachsens), erhält der Patient über 6–12 Monate eine subkutane Verabreichung von huFcγ2h(FN > AQ)-IL-7 oder huFcγ1(YN > AQ)(Linker2)-IL-7 in einer Dosis von etwa 1,5 mg/m2 (oder eine Dosis im Bereich von 0,15 mg/m2 bis 15 mg/m2), etwa 2 Mal die Woche, bis die T-Zell-Anzahl 50% des normalen Spiegels erreicht. Es wurde gefunden, dass die Prognose des Patienten aufgrund des verringerten Risikos einer viralen Infektion, eine der Hauptkomplikationen nach der Transplantation, verbessert wird. Es wurde weiterhin gefunden, dass diese Behandlung das Risiko einer akuten GvHD nicht deutlich erhöht.
  • Zusätzlich zu der Verabreichung von huFc-IL-7-Protein werden optimalerweise weitere Medikationen prophylaktisch gegeben. Diese umfassen, zum Beispiel, Acyclovir, Metronidazol, Flucanazol und Cotrimoxazol. In den ersten drei Monaten kann der Patient wöchentliche Verabreichungen von Immunglobulinen sowie von G-CSF erhalten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • Figure 00390001
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Claims (28)

  1. IL-7-Fusionsprotein, enthaltend eine Immunglobulinkette und ein im Vergleich zu Wildtyp-IL-7 modifiziertes IL-7-Molekül, die direkt oder über ein Linkermolekül miteinander verknüpft sind, wobei die Modifizierung in IL-7 wie folgt ist: (i) die Aminosäurereste an den Positionen 70 und 91 sind glykosyliert und der Aminosäurerest an Position 116 ist nicht glykosyliert; oder (ii) Disulfidbindungen sind innerhalb der IL-7-Einheit zwischen Cys2 und Cys92, Cys34 und Cys129, und Cys47 und Cys141 vorhanden, unter der Voraussetzung, dass im Falle, dass die Modifizierung in IL-7 gemäß (ii) ist, ein IL-7-Fusionsprotein ausgeschlossen ist, in dem dieses IL-7-Molekül durch eine Peptid-Gelenkregion funktional an einen Fc-Teil einer schweren IgG-Kette geknüpft ist.
  2. IL-7-Fusionsprotein, enthaltend eine Immunglobulinkette und ein im Vergleich zu Wildtyp-IL-7 modifiziertes IL-7-Molekül, die direkt oder über ein Linkermolekül miteinander verknüpft sind, wobei die Modifizierung in IL-7 wie folgt ist: (i) die Aminosäurereste an den Positionen 70 und 91 sind glykosyliert und der Aminosäurerest an Position 116 ist nicht glykosyliert; und (ii) Disulfidbindungen sind innerhalb der IL-7-Einheit zwischen Cys2 und Cys92, Cys34 und Cys129, und Cys47 und Cys141 vorhanden.
  3. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminosäurerest an Position 116 Asparagin ist.
  4. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminosäurerest an Position 116 nicht glykosyliert ist.
  5. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminosäurerest an Position 116 so verändert ist, dass er nicht als eine Glykosylierungsstelle dient.
  6. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das IL-7-Molekül eine Deletion enthält.
  7. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 6, wobei das verkürzte IL-7 eine Deletion von achtzehn Aminosäuren von Aminosäure 96 bis Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 1 enthält.
  8. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das IL-7-Molekül humanes IL-7 ist.
  9. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das IL-7 eine reife IL-7-Einheit ist.
  10. IL-7-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–9, wobei die Immunglobulinkette mindestens einen Teil einer konstanten Domäne enthält.
  11. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 10, wobei die konstante Domäne aus der Gruppe bestehend aus CH1, CH2 und CH3 ausgewählt wird.
  12. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 10 oder 11, wobei die konstante Domäne eine konstante Domäne von IgG1 ist.
  13. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 12, wobei Asn297 der konstanten Domäne von IgG1 modifiziert wird.
  14. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 13, wobei die Asn297-Modifizierung Asn297Gln ist.
  15. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 13, weiterhin enthaltend eine Modifizierung an Tyr296.
  16. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 15, wobei die Tyr296-Modifizierung Tyr296Ala ist.
  17. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 10 oder 11, wobei die konstante Domäne eine konstante Domäne von IgG2 ist.
  18. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 17, wobei die IgG2-Kette ein IgG1-Gelenk enthält.
  19. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 17 oder 18, wobei Asn297 der konstanten Domäne von IgG2 modifiziert wird.
  20. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 19, wobei die Asn297-Modifizierung Asn297Gln ist.
  21. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 19, weiterhin enthaltend eine Modifizierung an Phe296.
  22. IL-7-Fusionsprotein nach Anspruch 21, wobei die Phe296-Modifizierung Phe296Ala ist.
  23. IL-7-Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die IL-7-Einheit des Fusionsproteins verglichen mit dem Wildtyp eine erhöhte biologische Aktivität IL-7 aufweist.
  24. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für ein IL-7-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–23.
  25. Kultivierte Wirtszelle, enthaltend die DNA nach Anspruch 24.
  26. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, umfassend: Transformieren einer Wirtszelle mit der DNA nach Anspruch 24, Kultivieren der Wirtszelle und Exprimieren und Ernten des IL-7-Fusionsproteins.
  27. Pharmazeutische Zusammensetzung, geeignet für die Behandlung von Immun störungen oder Krebs, enthaltend ein IL-7-Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1–23 in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.
  28. Verwendung eines IL-7-Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1–23 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Immundefizienzen und Krebs.
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PCT/EP2004/014555 WO2005063820A2 (en) 2003-12-30 2004-12-21 Il-7 fusion proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE602004013372D1 DE602004013372D1 (de) 2008-06-05
DE602004013372T2 true DE602004013372T2 (de) 2009-07-02

Family

ID=34738862

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE602004013372T Active DE602004013372T2 (de) 2003-12-30 2004-12-21 Il-7-fusionsproteine mit antikörperportionen, deren herstellung und deren verwendung

Country Status (16)

Country Link
US (3) US7323549B2 (de)
EP (1) EP1699822B1 (de)
JP (1) JP2008502317A (de)
KR (1) KR101163424B1 (de)
CN (1) CN100467488C (de)
AT (1) ATE393169T1 (de)
AU (1) AU2004309050B2 (de)
BR (1) BRPI0418286A (de)
CA (1) CA2551915C (de)
DE (1) DE602004013372T2 (de)
DK (1) DK1699822T3 (de)
ES (1) ES2305886T3 (de)
PL (1) PL1699822T3 (de)
PT (1) PT1699822E (de)
RU (1) RU2369616C2 (de)
WO (1) WO2005063820A2 (de)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US7052686B2 (en) 2000-09-29 2006-05-30 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
CA2440221C (en) 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
ES2381025T3 (es) 2001-12-04 2012-05-22 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada
EP1391513A1 (de) * 2002-08-08 2004-02-25 Cytheris IL-7 als Wirkstoff, IL-7-haltige Zusammensetzung, Herstellungsverfahren und Verwendungen
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
WO2005063820A2 (en) 2003-12-30 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Il-7 fusion proteins
KR20060124656A (ko) * 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
DE602005020837D1 (de) * 2004-12-09 2010-06-02 Merck Patent Gmbh Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
CA2635618C (en) * 2005-12-30 2015-10-06 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraekter Haftung Interleukin-12p40 variants with improved stability
PT2270050E (pt) 2005-12-30 2013-09-12 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida
EP2821078B1 (de) 2006-09-28 2016-09-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Pegylieretes il-10 zur verwendung zur behandlung von lymphom
EP3415529B1 (de) * 2007-09-26 2020-11-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modifizierte antikörperkonstantregion
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
AU2010238858A1 (en) * 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
JP6048845B2 (ja) * 2011-06-01 2016-12-21 シャモン ユニヴァーシティー ジフテリア毒素の無毒性突然変異体ｃｒｍ１９７又はその断片を含む融合タンパク質
WO2013017653A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-07 Cytheris Hcv immunotherapy
WO2013074489A1 (en) * 2011-11-14 2013-05-23 Emory University Conjugates of gm-csf and il-7, compositions and methods related thereto
CN104066845A (zh) * 2011-12-15 2014-09-24 皇家学术促进会/麦吉尔大学 可溶性IGF受体Fc融合蛋白和其用途
CN104870477B (zh) 2012-10-23 2018-10-09 爱默蕾大学 Gm-csf和il-4轭合物、组合物以及与其相关的方法
US8718729B1 (en) 2012-10-31 2014-05-06 Timothy Kershenstein Electronic device protection system
IL240561B (en) * 2013-03-15 2020-10-29 Genentech Inc il–22 polypeptides and fc il–22 fusion proteins and methods of use
MX368005B (es) 2013-03-15 2019-09-13 Genentech Inc Polipéptidos de il-22 y proteínas de fusion de il-22 fc y métodos de uso.
CN106913865A (zh) 2013-04-18 2017-07-04 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素‑10治疗疾病和病症的方法
ES2688206T3 (es) 2013-06-17 2018-10-31 Armo Biosciences, Inc. Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas
PT3050896T (pt) 2013-09-27 2021-08-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Processo para a produção de heteromultímeros de polipéptidos
AU2014346537A1 (en) 2013-11-11 2016-05-19 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US10293043B2 (en) 2014-06-02 2019-05-21 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
KR20170084033A (ko) 2014-10-22 2017-07-19 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 질환 및 장애를 치료하기 위해 인터루킨-10을 사용하는 방법
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
EP3279216A4 (de) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Verfahren zur herstellung von polypeptid-hetero-oligomer
CA2986755A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
JP2018518955A (ja) * 2015-06-11 2018-07-19 ジェネクシン・インコーポレイテッドＧｅｎｅｘｉｎｅ， Ｉｎｃ． 改変されたインターロイキン−７タンパク質およびその使用
CN106397571A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 李金松 一种新型羧基末端肽及长效白介素7
MX2018002298A (es) 2015-08-25 2018-07-06 Armo Biosciences Inc Metodos de uso de interleucina 10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos.
KR102386735B1 (ko) 2015-11-06 2022-04-14 주식회사 제넥신 변형된 인터루킨-7 융합 단백질의 제형
TWI774651B (zh) * 2015-12-04 2022-08-21 南韓商吉耐森股份有限公司 包含融合有免疫球蛋白Ｆｃ之介白素-７的用於預防或治療人類乳頭狀瘤病毒相關疾病的藥學組成物
US11357827B2 (en) 2015-12-04 2022-06-14 Genexine, Inc. Method for preventing or treating influenza virus infection using pharmaceutical composition comprising immunoglobulin Fc-fused interleukin-7 fusion protein
EP3398965A4 (de) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Verfahren zur förderung der effizienz der reinigung von polypeptid mit fc-region
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3802619A1 (de) * 2018-06-08 2021-04-14 F. Hoffmann-La Roche AG Peptidischer linker mit reduzierter posttranslationaler modifikation
JP7289158B2 (ja) 2018-08-06 2023-06-09 メディカイン、インコーポレイテッド Ｉｌ－２受容体結合化合物
US20220008515A1 (en) 2018-11-16 2022-01-13 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a tumor with a combination of il-7 protein and an immune checkpoint inhibitor
CN113614109A (zh) 2018-12-21 2021-11-05 Ose免疫疗法公司 双功能抗pd-1/il-7分子
CN114555190A (zh) * 2019-05-16 2022-05-27 安驰肿瘤公司 与白介素蛋白的类似物组合治疗癌症的治疗性组合物和方法
CA3141459A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 Xencor, Inc. Il-7-fc-fusion proteins
EP4025241A4 (de) * 2019-09-04 2023-08-30 Genexine, Inc. Verfahren zur erhöhung der lymphozytenzahl unter verwendung von il-7-fusionsprotein bei tumoren
AU2020380296A1 (en) 2019-11-05 2022-06-16 Medikine Inc. IL-2RβγC binding compounds
JP7427287B2 (ja) * 2019-11-05 2024-02-05 メディカイン、インコーポレイテッド 二重ｉｌ－２ｒおよびｉｌ－７ｒ結合化合物
AU2020383176B2 (en) * 2019-11-15 2023-10-19 Genexine, Inc. Fusion protein including modified interleukin-7 and TGF beta receptor II and use thereof
WO2021122866A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecules comprising an il-7 variant
IL294663A (en) 2020-01-13 2022-09-01 Neoimmunetech Inc A method for tumor treatment with a combination of il-7 protein and a bispecific antibody
MX2022009302A (es) 2020-02-03 2022-11-16 Medikine Inc Compuestos de unión a il-7r¿.
BR112022015002A2 (pt) 2020-02-03 2022-12-06 Medikine Inc Ligante de il-7r-alfa/gama/c, composto, composição farmacêutica, método para tratar uma doença em um paciente e ácido nucleico
US20230210952A1 (en) 2020-02-05 2023-07-06 Washington University Method of treating a solid tumor with a combination of an il-7 protein and car-bearing immune cells
US20210324027A1 (en) * 2020-04-16 2021-10-21 Genexine, Inc. Modified interleukin-7 proteins and uses thereof
EP4232070A1 (de) 2020-10-26 2023-08-30 NeoImmuneTech, Inc. Verfahren zur induktion von stammzellenmobilisierung
US20240101629A1 (en) 2020-11-02 2024-03-28 Neoimmunetech, Inc. Use of interleukin-7 for the treatment of coronavirus
AU2021376396A1 (en) 2020-11-05 2023-06-08 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a tumor with a combination of an il-7 protein and a nucleotide vaccine
US20240092851A1 (en) * 2020-11-25 2024-03-21 Jecho Laboratories, Inc. Il-7 fusion protein and related methods
IL303745A (en) * 2020-12-17 2023-08-01 Ose Immunotherapeutics Bifunctional ANTI-PD1/IL-7 molecules
CA3213917A1 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Nicolas Poirier New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
WO2023130081A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Neoimmunetech, Inc. Method of treating a tumor with a combination of il-7 protein and vegf antagonist
WO2023178357A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Evolveimmune Therapeutics, Inc. Bispecific antibody fusion molecules and methods of use thereof
CN117050178B (zh) * 2023-10-13 2024-01-12 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 特异性检测il-7的抗体及应用

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US5082658A (en) 1984-01-16 1992-01-21 Genentech, Inc. Gamma interferon-interleukin-2 synergism
US5679543A (en) 1985-08-29 1997-10-21 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5359035A (en) 1985-12-21 1994-10-25 Hoechst Aktiengesellschaft Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
EP0307434B2 (de) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Geänderte antikörper
DE3856559T2 (de) 1987-05-21 2004-04-29 Micromet Ag Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE122238T1 (de) 1987-06-10 1995-05-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen.
US5064646A (en) 1988-08-02 1991-11-12 The University Of Maryland Novel infectious bursal disease virus
ES2054753T3 (es) 1987-09-02 1994-08-16 Ciba Geigy Ag Conjugados de citoquinas con inmunoglobulinas.
US5677425A (en) * 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
EP0308936B1 (de) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antikörper-Heterokonjugate zur Töting von HIV-infizierten Zellen
NZ226414A (en) 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
US5714585A (en) * 1987-10-26 1998-02-03 Sterling Winthrop, Inc. Antibodies that are immunoreactive with interleukin-7
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
CA1341588C (en) 1988-01-26 2009-01-06 Michel Revel Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use
US5120525A (en) 1988-03-29 1992-06-09 Immunomedics, Inc. Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer
IE62463B1 (en) 1988-07-07 1995-02-08 Res Dev Foundation Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5242824A (en) 1988-12-22 1993-09-07 Oncogen Monoclonal antibody to human carcinomas
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US6750329B1 (en) * 1989-05-05 2004-06-15 Research Development Foundation Antibody delivery system for biological response modifiers
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
ATE123065T1 (de) 1989-07-07 1995-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Proteine und deren herstellung.
GB8916400D0 (en) * 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
US5194596A (en) * 1989-07-27 1993-03-16 California Biotechnology Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor
US5196320A (en) * 1989-09-20 1993-03-23 Abbott Biotech, Inc. Method of producing engineered binding proteins
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US7253264B1 (en) 1990-06-28 2007-08-07 Sanofi-Arentideutschland GmbH Immunoglobulin fusion proteins, their production and use
US5650150A (en) 1990-11-09 1997-07-22 Gillies; Stephen D. Recombinant antibody cytokine fusion proteins
US5709859A (en) 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
US6072039A (en) 1991-04-19 2000-06-06 Rohm And Haas Company Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest
US6797492B2 (en) * 1991-05-17 2004-09-28 Merck & Co., Inc. Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
ATE173763T1 (de) 1991-08-30 1998-12-15 Hutchinson Fred Cancer Res Hybride cytokine
US20020037558A1 (en) 1991-10-23 2002-03-28 Kin-Ming Lo E.coli produced immunoglobulin constructs
US6627615B1 (en) 1991-12-17 2003-09-30 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for in vivo gene therapy
GB9206422D0 (en) * 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
DK0615451T3 (da) 1992-05-26 2006-04-24 Immunex Corp Hidtil ukendt cytokin der binder til CD30
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5614184A (en) 1992-07-28 1997-03-25 New England Deaconess Hospital Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
DE4228839A1 (de) 1992-08-29 1994-03-03 Behringwerke Ag Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren
US5281010A (en) * 1992-11-19 1994-01-25 Allied-Signal Inc. Pumpback adaptive braking system with slave isolation valve
US5554512A (en) 1993-05-24 1996-09-10 Immunex Corporation Ligands for flt3 receptors
PT659439E (pt) * 1993-12-24 2002-04-29 Merck Patent Gmbh Imunoconjugados
CU22615A1 (es) 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6309636B1 (en) * 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
PT706799E (pt) 1994-09-16 2002-05-31 Merck Patent Gmbh Imunoconjugados ii
US6410008B1 (en) * 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
ES2225874T3 (es) 1995-03-10 2005-03-16 Genentech, Inc. Activacion de receptor mediante gas.
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US6620413B1 (en) * 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
ATE218143T1 (de) 1996-09-03 2002-06-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verwendung bi-und trispezifischer antikörper zur induktion einer tumorimmunität
US6100387A (en) 1997-02-28 2000-08-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric polypeptides containing chemokine domains
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
ATE267215T1 (de) * 1997-12-08 2004-06-15 Lexigen Pharm Corp Heterodimäre fusionsproteine zur verwendung für gezielte immuntherapie und allgemeine immunerregung
US20030105294A1 (en) 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
US6194551B1 (en) * 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PL343462A1 (en) 1998-04-15 2001-08-13 Lexigen Pharm Corp Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with angiogenesis inhibitor
EP1071469A2 (de) 1998-04-17 2001-01-31 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Steigerung der antikörper-zytokin-fusionsproteinmediierten immunantwort durch mitverabreichung mit einem prostaglandininhibitor
WO1999054484A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 The Regents Of The University Of California Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof
WO1999058662A1 (fr) 1998-05-14 1999-11-18 Merck Patent Gmbh Proteine fusionnee
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
CA2339331C (en) 1998-08-25 2011-03-01 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Expression and export of angiogenesis inhibitors as immunofusins
US6646113B1 (en) 1998-09-17 2003-11-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants
US6335176B1 (en) 1998-10-16 2002-01-01 Pharmacopeia, Inc. Incorporation of phosphorylation sites
KR20020007287A (ko) 1999-01-07 2002-01-26 추후보정 Ｆｃ 융합 단백질로서 항-비만 단백질의 발현 및 이출
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
KR100922809B1 (ko) 1999-05-06 2009-10-21 웨이크 포리스트 유니버시티 면역 반응을 유발하는 항원을 동정하기 위한 조성물과 방법
EP1187852B1 (de) 1999-05-19 2007-08-08 EMD Lexigen Research Center Corp. Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
US7067110B1 (en) * 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001010912A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Multiple cytokine-antibody complexes
WO2001036489A2 (en) * 1999-11-12 2001-05-25 Merck Patent Gmbh Erythropoietin forms with improved properties
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
CA2399832C (en) * 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
PT1257297E (pt) 2000-02-24 2006-12-29 Philogen Spa Composições e método para tratamento da angiogénese em lesões patológicas
MXPA02011016A (es) 2000-05-12 2004-03-16 Neose Technologies Inc Glicopeptidos recombinantes de glucolisacion in vitro.
ES2288967T3 (es) 2000-06-29 2008-02-01 Merck Patent Gmbh Reforzamiento de las respuestas inmunes mediadas por la proteina de fusion anticuerpo-citoquina por medio del tratamiento combinado por agentes que mejoran la incorporacion de inmunocitoquina.
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2004525621A (ja) 2001-01-18 2004-08-26 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング グルコセレブロシダーゼ活性を有する二機能性融合タンパク質
JP2004532620A (ja) 2001-02-19 2004-10-28 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 免疫原性の低減された人工タンパク質
WO2002069232A2 (en) 2001-02-19 2002-09-06 Merck Patent Gmbh Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity
CA2440221C (en) * 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) * 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
ES2381025T3 (es) * 2001-12-04 2012-05-22 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada
DE60335276D1 (de) * 2002-07-26 2011-01-20 Obi Aps C O Per Thorgaard Verfahren zur umrechnung von venösen blutwerten in arterielle blutwerte, system zur verwendung der methode
EP1391513A1 (de) * 2002-08-08 2004-02-25 Cytheris IL-7 als Wirkstoff, IL-7-haltige Zusammensetzung, Herstellungsverfahren und Verwendungen
ES2346205T3 (es) * 2002-12-17 2010-10-13 Merck Patent Gmbh Anticuerpo humanizado (h14.18) del anticurpo 14.18 de raton que se enlaza con gd2 y su fusion con la il-2.
US7348004B2 (en) * 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20050025573A1 (en) 2003-07-31 2005-02-03 Waldman John Jeffrey Liquid control structure
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
WO2005063820A2 (en) * 2003-12-30 2005-07-14 Merck Patent Gmbh Il-7 fusion proteins
KR20060124656A (ko) * 2003-12-31 2006-12-05 메르크 파텐트 게엠베하 개선된 약물동태를 가지는 Ｆｃ-에리스로포이에틴 융합단백질
CA2553883C (en) * 2004-01-22 2013-04-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
DE602005020837D1 (de) * 2004-12-09 2010-06-02 Merck Patent Gmbh Il-7-varianten mit reduzierter immunogenität
CN100480953C (zh) * 2005-01-10 2009-04-22 新科实业有限公司 短尾读写头万向架组件测试夹具
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
CA2635618C (en) * 2005-12-30 2015-10-06 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraekter Haftung Interleukin-12p40 variants with improved stability
KR20080090484A (ko) * 2005-12-30 2008-10-08 메르크 파텐트 게엠베하 ＧＰ130 에 대한, ＩＬ-6Ｒα 와 복합체를 형성한 ＩＬ-6의 결합을 방해하는 항-ＩＬ-6 항체
PT2270050E (pt) * 2005-12-30 2013-09-12 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
EP2038417A2 (de) * 2006-07-06 2009-03-25 Merck Patent GmbH Zusammensetzungen und verfahren zur verstärkung der wirksamkeit von il-2-vermittelten immunreaktionen

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