DE60206736T2

DE60206736T2 - 3-(4-amidopyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinon-derivative als protein-kinase inhibitoren

Info

Publication number: DE60206736T2
Application number: DE60206736T
Authority: DE
Inventors: Huiping Guan; Congxin Liang; Li Sun; Cho Peng Tang; Chen Chung Wei; A. Michael MAURAGIS; Tomas Vojkovsky; Qingwu Jin; Matthew Paul HERRINTON
Original assignee: Sugen LLC; Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Sugen LLC; Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2001-02-15
Filing date: 2002-02-15
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2022-02-16
Also published as: CA2438314C; RS51026B; CN100338059C; HRP20030657A2; ATE307128T1; NZ527572A; DK1370554T3; AP2003002836A0; GEP20053600B; ZA200306335B; AU2002247133B2; US20040102510A1; TNSN03055A1; IL157418A; US7582756B2; HK1059621A1; US20030092917A1; SI1370554T1; MA26997A1; HUP0303146A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte 3-(4-Amidopyrrol-2-ylmethyliden)-2-indolinonderivate, die die Aktivität von Proteinkinasen („PK's") modulieren. Die Verbindungen dieser Erfindung sind daher bei der Behandlung von Störungen, die mit einer abnormalen PK-Aktivität in Zusammenhang stehen, verwendbar. Pharmazeutische Zusammensetzung, die diese Verbindungen umfassen, die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Verbindungen für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung und zum Verhindern von Erkrankungen umfassen, und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sind ebenfalls offenbart.
Stand der Technik
PK's sind Enzyme, die die Phosphorylierung von Hydroxy-Gruppen an Tyrosin-, Serin- und Threoninresten von Proteinen katalysieren. Die Konsequenzen dieser scheinbar einfachen Aktivität sind erstaunlich; Zellwachstum, Differenzierung und Proliferation, d.h., nahezu alle Aspekte des Zelllebens hängen auf die eine oder die andere Art von der PK-Aktivität ab. Die PK-Aktivität ist mit einer Menge von Erkrankungen, die sich von relativ nicht lebensbedrohlichen Erkrankungen, wie zum Beispiel Psoriasis, bis zu extrem virulenten Erkrankungen, wie zum Beispiel Glioblastom (Gehirnkrebs), erstrecken, in Zusammenhang gebracht worden.
Die PK's können auf geeignete Weise auf zwei Klassen reduziert werden, die Protein-Tyrosinkinasen (PTK's) und die Serin-Threoninkinasen (STK's).
Einer der Hauptaspekte der PTK-Aktivität ist ihr Verhältnis zu Wachstumsfaktorrezeptoren. Wachstumsfaktorrezeptoren sind Zelloberflächenproteine. Wenn sie durch einen Wachstumfaktorliganden gebunden werden, werden Wachstumsfaktorrezeptoren in eine aktive Form umgewandelt, die mit Proteinen auf der Innenseite der Zellmembran wechselwirkt. Dies führt zur Phosphorylierung von Tyrosin-Resten des Rezeptors und anderer Proteine und zur Bildung von Komplexen innerhalb der Zelle mit einer Vielfalt von cytoplasmatischen Signalmolekülen die wiederum zahlreiche zelluläre Reaktionen auslösen, wie zum Beispiel die Zellteilung (Proliferation), Zelldifferenzierung, Zellwachstum, Expression von metabolischen Effekten auf die extrazelluläre Mikroumgebung, etc. Für eine vollständigere Diskussion siehe Schlessinger und Ullrich, Neuron, 9: 303–391 (1992), der hierin einschließlich aller Zeichnungen aufgenommen wird, als ob er hier vollständig dargestellt würde.
Wachstumsfaktorrezeptoren mit PTK-Aktivität sind als Rezeptor-Tyrosinkinasen („RTK's") bekannt. Sie umfassen eine große Familie von Transmembranrezeptoren mit verschiedenartiger biologischer Aktivität. Derzeit sind wenigstens neunzehn (19) verschiedene RTK-Subfamilien identifiziert worden. Ein Beispiel für sie ist die Subfamilie, die als „HER"-RTK's bezeichnet wird, und die EGFR (epithelialer Wachstumsfaktorrezeptor) HER2, HER3 und HER4 einschließt. Diese RTK's bestehen aus einer extrazellulären, glycosylierten ligandenbindenden Domäne, einer Transmembrandomäne und einer intrazellulären cytoplasmatischen, katalytischen Domäne, die Tyrosin-Reste an Proteinen phosphorylieren kann.
Eine andere RTK-Unterfamilie besteht aus dem Insulinrezeptor (IR), dem insulinähnlichen Wachstumsfaktor I Rezeptor (IGF-1R) und dem Insulinrezeptor verwandten Rezeptor (IRR). IR und IGF-1R interagieren mit Insulin, IGF-I und IGF-II, um ein Heterotetramer aus zwei vollständig extrazellulären, glycosylierten α-Untereinheiten und zwei β-Untereinheiten, die die Zellmembran überwinden, und die die Tyrosinkinasedomäne enthalten, auszubilden.
Eine dritte RTK-Unterfamilie wird als Plättchenwachstumsfaktorrezeptor (Platelet Derived Growth Factor Receptor) („PDGFR")-Gruppe bezeichnet, die PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, c-kit und c-fms einschließt. Diese Rezeptoren bestehen aus glycosilierten extrazellulären Domänen, die aus einer variablen Anzahl von immunoglobulinähnlichen Schleifen zusammengesetzt sind, und einer intrazellulären Domäne, wobei die Tyrosinkinasedomäne durch nichtverwandte Aminosäuresequenzen unterbrochen wird.
Eine andere Gruppe, die aufgrund ihrer Ähnlichkeit zur PDGFR-Unterfamilie manchmal in die spätere Gruppe subsumiert wird, ist die Fetus-Leberkinase (fetus liver kinase) („flk")-Rezeptorunterfamilie. Man glaubt, dass diese Gruppe aus der Kinase Insert Domain-Receptor Fetal Liver Kinase-1 (KDR/FLK-1, VEGF-R2), flk-1R, flk-4 und der fms-ähnlichen Tyrosinkinase 1 (flt-1) zusammengesetzt ist.
Ein weiteres Mitglied der Tyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptorfamilie ist die Fibroblastenwachstumsfaktor („FGF)-Rezeptoruntergruppe. Diese Gruppe besteht aus vier Rezeptoren, FGFR1-4, und sieben Liganden, FGF1-7. Obwohl sie zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht genau definiert sind, scheint es, dass die Rezeptoren aus einer glycosilierten extrazellulären Domäne, die eine variable Anzahl von Immunoglobulin ähnlichen Schleifen enthält, und eine intrazellulären Domäne, in der die Tyrosinkinasesequenz durch Bereiche mit nichtverwandten Aminosäuresequenzen unterbrochen ist, bestehen.
Ein noch anderes Mitglied der Tyrosinkinasewachstumsfaktor-Rezeptorfamilie ist die vaskuläre Endothel-Wachstumsfaktor („VEGF")-Rezeptor-Untergruppe. VEGF ist ein dem PDGF ähnliches dimeres Glycoprotein, das jedoch unterschiedliche biologische Funktionen und Zielzellspezifität in vivo aufweist. Man glaubt besonders, dass VEGF eine wichtige Rolle bei der Vaskulogenese und Angiogenese spielt.
Eine vollständigere Auflistung der bekannten RTK-Unterfamilien wird von Plowman et al., DN&P, 7 (6): 334–339 (1994) beschrieben, der hiermit einschließlich aller Zeichnungen hierin aufgenommen wird, als ob er hier vollständig dargestellt würde.
Zusätzlich zu den RTK's gibt es auch eine Familie aus vollständig intrazellulären PTK's, genannt „Nichtrezeptor-Tyrosinkinasen" oder "zelluläre Tyrosinkinasen". Die letztere Bezeichnung, abgekürzt „CTK", wird im Folgenden verwendet. CTK's enthalten keine extrazellulären und Transmembrandomänen. Derzeit sind über 24 CTK's in 11 Unterfamilien (Scr, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak und Ack) identifiziert worden. Die Scr-Unterfamilie scheint bisher die größte Gruppe an CTK's zu sein und schließt Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk ein. Für eine detailliertere Diskussion der CTK's, siehe Bolen, Oncogene, 8: 2025–2031 (1993), der hiermit hierin einschließlich aller Zeichnungen aufgenommen wird, als ob er vollständig hier dargestellt würde.
Die Serin/Threonin-Kinasen, STK's, wie die CTK's, sind vornehmlich intrazellulär, obwohl es einige Rezeptorkinasen des STK-Typs gibt. STK's sind die gebräuchlichsten der cytosolischen Kinasen; d.h., Kinasen die ihre Funktion in einem anderen Teil des Cytoplasmas als dem cytoplasmatischen Organellen und dem Cytoskelett ausführen. Das Cytosol ist der Bereich innerhalb der Zelle, in dem ein Großteil der intermediären metabolischen und biosynthetischen Aktivität der Zelle zu finden ist; z.B. werden die Proteine an Ribosomen im Cytosol synthetisiert.
RTK's, CTK's und STK's stehen alle mit pathogenischen Zuständen in einer Zelle, einschließlich, besonders bedeutsam, Krebs, im Zusammenhang. Andere pathogenische Zustände, die mit PTK's im Zusammenhang stehen, schließen, ohne Begrenzung, Psoriasis, Leberzirrhose, Diabetes, Angiogenese, Restenose, Augenerkrankungen, rheumatoide Arthritis und andere entzündliche Störungen, immunologische Störungen, wie zum Beispiel eine Autoimmunerkrankung, eine Herz-Kreislauf-Erkrankung, wie zum Beispiel Atherosklerose und eine Vielzahl von Nierenerkrankungen ein.
In Bezug auf Krebs beziehen sich zwei der Haupthypothesen, die zur Erklärung der exzessiven zellulären Proliferation, die die Tumorentwicklung antreibt, aufgestellt wurden, auf Funktionen, die bekanntermaßen durch PK reguliert werden. Zumindest ist vorgeschlagen worden, dass sich das maligne Zellwachstum aus einem Zusammenbruch des Mechanismus ergibt, der die Zellteilung und/oder Differenzierung kontrolliert. Es ist gezeigt worden, dass die Proteinprodukte mehrerer Proto-Onkogene in den Signaltransduktionswegen, die das Zellwachstum und die Differenzierung regulieren, involviert sind. Diese Proteinprodukte der Proto-Onkogene schließen die extrazellulären Wachstumsfaktoren, die transmembranen Wachstumsfaktor-PTK-Rezeptoren (RTK's), cytoplasmatische PTK's (CTK's) und cytosolische STK's, wie weiter oben diskutiert, ein.
Im Hinblick auf die offensichtliche Verbindung zwischen PK-verwandten zellulären Aktivitäten und einer großen Vielzahl von humanen Störungen, überrascht es nicht, dass große Anstrengungen in einem Ansatz unternommen wurden, um Wege zu identifizieren, um die PK-Aktivität zu modulieren. Einige dieser Bemühungen involvieren biomimetische Ansätze, die große Moleküle verwenden, die nach dem Vorbild derer gestaltet sind, die in den tatsächlichen zellulären Prozessen involviert sind (z.B. mutante Liganden (U.S. Anm. Nr. 4,966,849); lösliche Rezeptoren und Antikörper (Anm. Nr. WO 94/10202, Kendall und Thomas, Proc. Nat'l Acad. Sci., 90: 10705–09 (1994), Kim, et al., Nature, 362: 841–844 (1993)); RNA-Liganden (Jelinek, et al., Biochemistry, 33: 10450–56); Takano, et al., Mol. Bio. Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199: 56–62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 448–57) und Tyrosinkinaseinhibitoren (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; U.S. Pat. Nr. 5,330,992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).
Zusätzlich zum oben genannten, sind Versuche vorgenommen worden, um kleine Moleküle zu identifizieren, die als PK-Inhibitoren agieren. Zum Beispiel sind bis-monocyclische, bicyclische und heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylenazaindolderivate (PCT WO 94/14808) und 1-Cyclopropyl-4-Pyridylchinolone (U.S. Pat. Nr. 5,330,992) als Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben worden. Styrylverbindungen (U.S. Pat. Nr. 5,217,999), Styrylsubstituierte Pyridyl-Verbindungen (U.S. Pat. Nr. 5,302,606), Chinazolinderivate (EP Anm. Nr. 0 566 266 A1), Selenaindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyclische polyhydroxyle Verbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495) alle als PTK-Inhibitoren, die für die Behandlung von Krebs verwendbar sind, beschrieben worden.
Darüber hinaus sind tricyclische 4,5-Azolooxindole als Inhibitoren der Cyclin-abhängigen Kinasen (PCT WO 00/035920) beschrieben worden.
3' substituierte Indolin-2-one wurden als neue Klasse von Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben, die sich sehr selektiv gegen verschiedene Rezeptor-Tyrosinkinasen zeigen, und es wurde vermutet, dass sie eine spezifische chemische Hauptrolle bei der Entwicklung von RTK-spezifischen Arzneimitteln mit breiter Anwendung für die Behandlung von humanen Erkrankungen spielen würden (Sun et al., J. Med. Chem. 41 (14): 2588–2603 (1998)).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte 3-(4-Amidopyrrol-2-ylmethyliden)-2-Indolinonderivate, die eine PK-modulierende Fähigkeit zeigen und daher für die Behandlung von Erkrankungen, die mit einer abnormalen PK-Aktivität in Verbindung stehen, verwendbar sind.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung ist eine Verbindung der Formel (I):
wobei
R¹ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halo, C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₄ Haloalkoxy, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, -C(O)-R⁸, -NR⁹R¹⁰ und -C(O)NR¹²R¹³ besteht, ausgewählt wird;
R² aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halo, C₁-C₁₀ Alkyl, Trihalomethyl, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, Cyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R¹⁰, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰ und -SO₂R¹⁴ (wobei R¹⁴ C₁-C₁₀ Alkyl, C₆-C₁₂ Aryl, C₁-C₄ Alkyl, das mit C₆-C₁₂ Aryl substituiert ist, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, und C₁-C₄ Alkyl, das mit einem 5–12 gliedrigem Heteroaryl, der 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt sind, substituiert ist, ist) besteht, ausgewählt wird;
R³, R⁴ und R⁵ unabhängig Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl sind;
Z C₆-C₁₂ Aryl, 5–12 gliedriges Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome ausgewählt aus N, O oder S besitzt, 3–8 gliedriges gesättigtes Heterocyclyl, das 1 oder 2 Ringheteroatome ausgewählt aus N, O oder S(O)_n, wobei n = 0–2 ist, besitzt, -NR¹⁵R¹⁶, wobei R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl sind; oder R¹⁵ und R¹⁶ zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, ist;
R⁶ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl besteht, ausgewählt wird;
R⁷ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl, C₆-C₁₂ Aryl, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besitzt, und -C(O)R¹⁷ wie unten definiert besteht, ausgewählt wird;
R⁸ aus der Gruppe, die aus Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, C₆-C₁₂ Aryloxy, und einem 5–12 gliedrigem Heteroaryloxy, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besteht, ausgewählt wird;
R⁹ und R¹⁰ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₁₀ Cyanoalkyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, C₆-C₁₂ Aryl und einem 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besteht, ausgewählt werden; oder R⁹ und R¹⁰ zusammengenommen eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n, wobei n = 0–2 ist ausgewählt werden;
R¹² und R¹³ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₁₀ Hydroxyalkyl und C₆-C₁₂ Aryl besteht, ausgewählt werden; oder R¹² und R¹³ zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, besteht, ausgewählt werden;
R¹⁷ aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, C₆-C₁₂ Aryl, Hydroxy und 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besteht, ausgewählt wird;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon;
vorausgesetzt dass die Verbindung nicht
ist und wobei
C₁-C₁₀ Alkyl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) aus Halo, Hydroxy, C₁-C₄ Alkoxy, C₆-C₁₂ Aryl, C₆-C₁₂ Aryloxy, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ und -C(O)NR⁹R¹⁰ ausgewählt wird;
C₃-C₈ monocyclisches Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertes bicyclisches Cycloalkyl und Adamantyl substituiert oder unsubstituiert sein können, und falls sie substituiert sind die Substituentengruppe(n) eine oder zwei Gruppen ist, die unabhängig aus C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Trihaloalkyl, Halo, Hydroxy, C₁-C₄ Alkoxy, C₆-C₁₂ Aryl, C₆-C₁₂ Aryloxy, 6-gliedrigem Heteroaryl, das 1–3 Stickstoffringatome besitzt, 5-gliedrigem Heteroaryl, das 1–3 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, eine 5 oder 6-gliedrige heteroalicyclische Gruppe, die 1–3 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, Mercapto, C₁-C₄ S-Alkyl, C₆-C₁₂ S-Aryl, Cyano, -C(O)R'', -C(S)-R'', -OC(O)NR¹²R¹³, R⁹OC(O)NR¹⁰-, -OC(S)NR¹²R¹³, R⁹OC(S)NR¹⁰-, -C(O)NR⁹R¹⁰, R⁹C(O)NR¹⁰-, Nitro, NR⁹S(O)₂R¹⁰, -S(O)₂NR⁹R¹⁰, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- und -NR⁹R¹⁰ ausgewählt werden;
C₆-C₁₂ Aryl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) eine oder zwei Gruppen ist, die unabhängig aus Halo, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Trihaloalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, Carboxy, NR⁹S(O)₂R¹⁰, R⁹C(O)NR¹⁰-, -NHR oder -NRR, wobei R C₁-C₄ Alkyl, C₃-C₈ monocyclisches Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertes bicyclisches Cycloalkyl oder Adamantyl ist, ausgewählt werden;
5–12 gliedriges Heteroaryl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) wie oben für C₆-C₁₂ Aryl definiert ist;
5–9 gliedriger Heteroalicyclus substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls er substituiert ist, die Substituentengruppe wie oben für C₆-C₁₂ Aryl definiert ist;
3–8 gliedriges gesättigtes Heterocyclyl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) eine oder zwei Gruppen ist, die unabhängig aus =O (als ein C-Substituent, um so eine Carbonylgruppe zu bilden), Halo, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Alkyl substituiert mit Carboxy oder -C(O)O-R''- mit R'' wie hierin definiert, außer das R'' nicht Wasserstoff sein kann, Hydroxy, und -NHR oder -NRR, wobei R C₁-C₄ Alkyl oder C₃-C₈ monocyclisches Cycloalkyl ist, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, oder Adamantyl ausgewählt werden;
3–8 gliedrige Heterocycloamino substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist, die Substituentengruppe(n) wie oben für 3–8 gliedriges gesättigtes Heterocyclyl definiert ist;
C₁-C₁₀ Alkoxy substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert die Substituentengruppe wie oben für C₁-C₁₀ Alkyl definiert ist;
C₆-C₁₂ Aryloxy und 5–12 gliedriges Heteroaryloxy substituiert oder unsubstituiert sein können, und falls sie substituiert sind, die Substituentengruppe(n) wie oben für C₆-C₁₂ Aryl definiert ist;
R'' aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl, Trihalomethyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, C₆-C₁₂ Aryl, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, und einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, besteht, ausgewählt wird.
Eine andere Ausführungsform ist eine Verbindung der Formel I, wobei
R¹ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halo, C₁-C₁₀ Alkyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, -C(O)-R⁸, -NR⁹R¹⁰ und -C(O)NR¹²R¹³ besteht, ausgewählt wird;
R², R¹⁴, R³, R⁴, R⁵, Z, R¹⁵, R¹⁶, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ wie für Anspruch 1 definiert sind;
R¹² und R¹³ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und C₆-C₁₂ Aryl besteht, ausgewählt werden; oder R¹² und R¹³ zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist;
R¹⁷ wie für Anspruch 1 definiert ist;
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Eine andere Ausführungsform ist eine Verbindung der Formel (Ia):
wobei:
R¹, R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind;
R² Fluor ist und an der 5-Position des Indolinonrings platziert ist; und
Z Morpholin-4-yl ist;
R⁶ und R⁷ Methyl sind.
Die Stereochemie am *C ist bevorzugt (S).
Eine andere Ausführungsform ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz der Formeln I oder Ia und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff umfasst.
Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Modulieren der katalytischen Aktivität einer Proteinkinase in vitro, dass das in Kontakt bringen der Proteinkinase mit einer Verbindung oder einem Salz der Formel I oder Ia umfasst. Die Proteinkinase für dieses Verfahren kann eine Rezeptor-Tyrosinkinase, eine Nichtrezeptor-Tyrosinkinase und eine Serin-Threoninkinase sein.
Eine andere Ausführungsform ist die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz der Formel I oder Ia und einen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Hilfsstoff für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder zum Verhindern einer mit einer Proteinkinase zusammenhängenden Störung in einem Organismus umfasst. Die mit einer Proteinkinase zusammenhängende Störung kann eine mit einer Rezeptor-Tyrosinkinase zusammenhängende Störung, eine mit einer Nichtrezeptor-Tyrosinkinase zusammenhängende Störung und eine mit einer Serin-Threoninkinase zusammenhängende Störung sein. Die mit einer Proteinkinase im Zusammenhang stehende Störung kann eine mit EGFR zusammenhängende Störung, eine mit PDGFR zusammenhängende Störung, eine mit IGFR zusammenhängende Störung und eine mit flk zusammenhängende Störung sein. Die Proteinkinasestörung kann auch ein Plattenepithelzellkarzinom, ein Astrozytom, ein Kaposi's Sarkom, ein Glioblastom, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Halskrebs, ein Melanom, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Brustkrebs, kleinzelliger Lungenkrebs, ein Gliom, colorektaler Krebs, urogenitaler Krebs und gastrointestinaler Krebs sein. Darüber hinaus kann die Proteinkinasestörung auch Diabetes, eine Autoimmunstörung, eine Hyperproliferationsstörung, Restenose, Fibrose, Psoriasis, die von Heppel-Lindau-Krankheit, Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, Angiogenese, eine entzündliche Störung, eine immunologische Störung und eine kardiovaskuläre Störung sein. In einer Ausführungsform ist der oben genannte Organismus ein Mensch.
In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung Verfahren zum Herstellen von Verbindungen der Formel (I).
Zu guter Letzt betrifft diese Erfindung auch das Identifizieren einer chemischen Verbindung, die die katalytische Aktivität einer Proteinkinase moduliert, durch in Kontakt bringen der Zellen, die die Proteinkinase exprimieren, mit einer Verbindung oder einem Salz der vorliegenden Erfindung, und dann das Überwachen der Zellen auf eine Wirkung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Soweit nicht anderweitig etwas anderes gesagt wird, haben die folgenden in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Begriffe die unten angegebene Bedeutung:
„Alkyl" betrifft ein gesättigtes, aliphatisches Kohlenwasserstoffradikal, das gerade Ketten- und verzweigte Kettengruppen von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (wann immer ein numerischer Bereich, z.B. „1–20", hierin beschrieben wird, bedeutet das, dass die Gruppe, in diesem Fall die Alkylgruppe, ein Kohlenstoffatom, zwei Kohlenstoffatome, drei Kohlenstoffatome, etc. bis zu und einschließlich 20 Kohlenstoffatome enthalten kann) einschließt. Noch bevorzugter ist es ein mittelgroßes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, n-Butyl, Iso-butyl, Tert-butyl, Pentyl und ähnliche. Am meisten bevorzugt ist es ein niederes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methyl, Ethyl, Propyl, 2-Propyl, n-Butyl, Iso-butyl, oder Tert-butyl und ähnliche. Das Alkyl kann substituiert oder unsubstituiert sein, und wenn es substituiert ist, ist/sind die substituierende(n) Gruppe(en) bevorzugt Halo, Hydroxy, niederes Alkyl, Aryl, Aryloxy, Heteroaryl, heteroalicyclisch, C(O)R⁸, NR⁹R¹⁰ und C(O)NR⁹R¹⁰.
„Cycloalkyl" betrifft einen 3 bis 8 gliedrigen monocyclischen Vollkohlenstoff-Ring, einen Vollkohlenstoff 5 gliedrigen/6 gliedrigen oder 6 gliedrigen/6 gliedrigen fusionierten bicyclischen Ring oder einen multicyclische fusionierte Ring(ein „fusioniertes" Ringsystem bedeutet, dass jeder Ring in dem System ein benachbartes Paar von Kohlenstoffatomen mit jedem anderen Ring im System teilt)-Gruppe, wobei einer oder mehrere der Ringe eine oder mehrere Doppelbindungen enthalten können, jedoch keiner der Ringe ein vollständig konjugiertes Pi-Elektronensystem hat. Beispiele, ohne Begrenzung, von Cycloalkyl-Gruppen sind Cyclopropan, Cyclobutan, Cyclopentan, Cyclopenten, Cyclohexan, Cyclohexadien, Adamantan, Cycloheptan, Cycloheptatrien und ähnliche. Eine Cycloalkyl-Gruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn sie substituiert ist, besteht(en) die Substituentengruppe(n) bevorzugt aus einem oder mehreren, noch bevorzugter einem oder zwei Substituenten, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem niederen Alkyl, Trihaloalkyl, Halo, Hydroxy, niederem Alkoxy, Aryl, das ggf. mit einer oder mehreren, bevorzugt einer oder zwei Gruppen unabhängig voneinander Halo, Hydroxy, niederen Alkyl- oder niederen Alkoxy-Gruppen substituiert ist, Aryloxy, das ggf. mit einer oder mehreren, bevorzugt einer oder zwei Gruppen unabhängig voneinander Halo, Hydroxy, niederem Alkyl oder niederen Alkoxy-Gruppen substituiert ist, einem 6 gliedrigen Heteroaryl mit von 1 bis 3 Stickstoffatomen im Ring, wobei die Kohlenstoffe im Ring ggf. mit einer oder mehreren, bevorzugt einer oder zwei Gruppen unabhängig voneinander Halo, Hydroxy, niederem Alkyl oder niederen Alkoxy-Gruppen substituiert sind, einem 5 gliedrigen Heteroaryl mit von 1 bis 3 Heteroatomen, die aus der Gruppe aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt werden, wobei die Kohlenstoff- und Stickstoffatome der Gruppe ggf. mit einer oder mehreren, bevorzugt einer oder zwei Gruppen unabhängig voneinander Halo, Hydroxy, niederen Alkyl- oder niederen Alkoxy-Gruppen substituiert sind, einer 5 oder 6 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe mit von 1 bis 3 Heteroatomen, die aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt werden, wobei die Kohlenstoff- und Stickstoff (falls vorhanden)-Atome in der Gruppe ggf. mit einer oder mehreren, bevorzugt einer oder zwei Gruppen unabhängig voneinander Halo, Hydroxy, niederem Alkyl oder niederen Alkoxy-Gruppen substituiert sind, Mercapto, (niederem Alkyl)thio, Arylthio, das ggf. mit einer oder mehreren, bevorzugt einer oder zwei Gruppen unabhängig voneinander Halo, Hydroxy, niederem Alkyl oder niederen Alkoxy-Gruppen substituiert ist, Cyano, Acyl, Thioacyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Nitro, N-Sulfonamido, S-Sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- und -NR⁹R¹⁰ sind wie weiter oben definiert, besteht.
„Alkenyl" betrifft eine Alkyl-Gruppe, wie hierin definiert, die aus wenigstens zwei Kohlenstoffatomen und wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung besteht. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Ethenyl, 1-Propenyl, 2-Propenyl, 1-, 2-, oder 3-Butenyl und ähnliche.
„Alkynyl" betrifft eine Alkyl-Gruppe, wie hierin definiert, die aus wenigstens zwei Kohlenstoffatomen und wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung besteht. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Ethynyl, 1-Propynyl, 2-Propynyl, 1-, 2-, oder 3-Butynyl und ähnliche.
„Aryl" betrifft einen monocyclischen Vollkohlenstoff- oder fusionierten Ring polycyclischer (d.h., Ringe, die benachbarte Paare von Kohlenstoffatomen teilen) Gruppen von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen mit einem vollständig konjugierten Pi-Elektronensystem. Beispiele, ohne Begrenzung, für Aryl-Gruppen sind Phenyl, Naphthalenyl und Anthracenyl. Die Arylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn sie substituiert ist, ist/sind die substituierte(n) Gruppe(n) bevorzugt eine oder mehrere, noch bevorzugter eine, zwei oder drei, am meisten bevorzugt eine oder zwei, die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt wird/werden, die aus einem niederem Alkyl, Trihaloalkyl, Halo, Hydroxy, niederem Alkoxy, Mercapto, (niederem Alkyl)thio, Cyano, Acyl, Thioacyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Nitro, N-Sulfonamido, S-Sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- und -NR⁹R¹⁰, mit R⁹ und R¹⁰ wie weiter oben definiert, besteht. Die Aryl-Gruppe wird bevorzugt ggf. mit einem oder zwei Substituenten substituiert, die unabhängig voneinander aus Halo, niederem Alkyl, Trihaloalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Dialkylamino, Carboxy oder N-Sulfonamido ausgewählt werden.
„Heteroaryl" betrifft eine monocyclische- oder fusionierte Ring (d.h., Ringe die ein benachbartes Paar von Atomen teilen)-Gruppe von 5 bis 12 Ringatomen, die ein, zwei, drei oder vier Ring-Heteroatome enthalten, die ausgewählt werden aus N, O oder S, wobei die verbleibenden Ringatome C sind und zusätzlich ein vollständig konjugiertes Pi-Elektroniksystem aufweisen. Beispiele, ohne Begrenzung, für unsubstituierte Heteroaryl-Gruppen sind Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrimidin, Chinolin, Isochinolin, Purin, Tetrazol, Triazin und Carbazol. Die Heteroarylgruppe kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn sie substituiert sind, ist/sind die substituierte(n) Gruppe(n) bevorzugt eine oder mehrere, noch bevorzugter eine, zwei oder drei, am meisten bevorzugt eine oder zwei, die unabhängig voneinander aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem niederem Alkyl, Trihaloalkyl, Halo, Hydroxy, niederem Alkoxy, Mercapto, (niederem Alkyl)thio, Cyano, Acyl, Thioacyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Nitro, N-Sulfonamido, S-Sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- und -NR⁹R¹⁰, mit R⁹ und R¹⁰ wie weiter oben definiert, besteht. Bevorzugt ist die Heteroarylgruppe ggf. mit einem oder zwei Substituenten substituiert, die unabhängig voneinander aus Halo, niederem Alkyl, Trihaloalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Dialkylamino, Carboxy oder N-Sulfonamido ausgewählt werden.
„Heteroalicyclisch" betrifft eine monocyclische oder fusionierte Ring-Gruppe, die im/in den Ring(en) 5 bis 9 Ringatome aufweist, in dem/denen ein oder zwei Ringatome Heteroatome sind, die aus N, O oder S(O)_n (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist) ausgewählt werden, wobei die verbleibenden Ringatome C sind. Die Ringe können auch eine oder mehrere Doppelbindungen aufweisen. Jedoch weisen die Ringe kein vollständig konjugiertes Pi-Elektronensystem auf. Beispiele, ohne Begrenzung, für unsubstituierte heteroalicyclische Gruppen sind 2-Pyrrolidon, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Thiomorpholin, Homopiperazin und ähnliche. Der heteroalicyclische Ring kann substituiert oder unsubstituiert sein. Wenn er substituiert ist, ist/sind die substituierte(n) Gruppe(n) bevorzugt eine oder mehrere, noch bevorzugter eine, zwei oder drei, am meisten bevorzugt eine oder zwei, die unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus niederem Alkyl, Trihaloalkyl, Halo, Hydroxy, niederem Alkoxy, Mercapto, (niederem Alkyl)thio, Cyano, Acyl, Thioacyl, O-Carbamyl, N-Carbamyl, O-Thiocarbamyl, N-Thiocarbamyl, C-Amido, N-Amido, Nitro, N-Sulfonamido, S-Sulfonamido, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, -C(O)OR⁹, R⁹C(O)O-, und -NR⁹R¹⁰, mit R⁹ und R¹⁰ wie weiter oben definiert, besteht. Bevorzugt ist die heteroalicyclische Gruppe ggf. mit einem oder zwei Substituenten substituiert, die unabhängig voneinander ausgewählt werden aus Halo, niederem Alkyl, Trihaloalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, N-Amido, Mono- oder Dialkylamino, Carboxy, oder N-Sulfonamido.
„Heterocyclisch" bedeutet ein gesättigtes cyclisches Radikal aus 3 bis 8 Ringatomen, in dem ein oder zwei Ringatome Heteroatome sind, die ausgewählt werden aus N, O oder S(O)_n (wobei N eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), wobei die verbleibenden Ringatome C sind, wobei ein oder zwei C-Atome ggf. durch eine Carbonyl-Gruppe ersetzt werden können. Der Heterocyclyl-Ring kann ggf. unabhängig mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert werden, die ausgewählt werden aus niederem Alkyl, das ggf. mit einem oder zwei Substituenten substituiert ist, die unabhängig ausgewählt werden aus einer Carboxy- oder Ester-Gruppe, Haloalkyl, Cyanoalkyl, Halo, Nitro, Cyano, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Aralkyl, Heteroaralkyl und -COR (wobei R ein Alkyl ist). Der Begriff Heterocyclyl schließt ganz besonders ein, ist jedoch nicht begrenzt auf Tetrahydropyranyl, 2,2-Dimethyl-1,3-Dioxolan, Piperidin, N-Methylpiperidin-3-yl, Piperazin, N-Methylpyrrolidin-3-yl, 2-Pyrrolidon, Morpholin, Thiomorpholin, Thiomorpholin-1-oxid, Thiomorpholin-1,1-dioxid, 4-Ethyloxycarbonylpiperazin, 3-Oxopiperazin, 2-Imidazolidon, 2-Pyrrolidon, 2-Oxohomopiperazin, Tetrahydropyrimidin-2-on und den Derivaten davon. Die heterocyclische Gruppe ist bevorzugt ggf. mit einem oder mehreren Substituenten substituiert, die unabhängig ausgewählt werden aus Halo, niederem Alkyl, niederem Alkyl, das mit Carboxy, Esterhydroxy, oder Mono- oder Dialkylamino substituiert ist.
„Heterocycloamino" bedeutet ein gesättigtes cyclisches Radikal aus 3 bis 8 Ringatomen, in dem wenigstens eines der Ringatome Stickstoff ist, und wobei ggf. ein oder zwei zusätzliche Ringatome Heteroatome sind, die ausgewählt werden aus N, O oder S(O)_n (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist), wobei die verbleibenden Ringatome C sind, wobei ein oder zwei C-Atome ggf. durch eine Carbonyl-Gruppe ersetzt werden können. Der Heterocycloamino-Ring kann ggf. unabhängig mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert werden, die ausgewählt werden aus niederem Alkyl, das gegebenenfalls mit einem oder zwei Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander ausgewählt werden aus einer Carboxy- oder Estergruppe, Haloalkyl, Cyanoalkyl, Halo, Nitro, Cyano, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Monoalkylamino, Dialkylamino, Aralkyl, Heteroaralkyl und -COR (wobei R ein Alkyl ist). Der Begriff Heterocycloamino schließt noch spezifischer ein, ist jedoch nicht begrenzt auf Piperidin-1-yl, Piperazin-1-yl, Pyrrolidin-1-yl, Morpholin-4-yl, Thiomorpholin-4-yl, Thiomorpholin-1-oxid, Thiomorpholin-1,1-dioxid, 4-Ethyloxycarbonylpiperazin-1-yl, 3-Oxopiperazin-1-yl, 2-Imidazolidon-1-yl, 2-Pyrrolidon-1-yl, 2-Oxohomopiperazin, Tetrahydropyrimidin-2-on und die Derivate davon. Bevorzugt ist die heterocyclische Gruppe ggf. mit einem oder zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt werden aus Halo, niederem Alkyl, niederem Alkyl, das mit Carboxy oder einem Ester substituiert ist, Hydroxy, oder Mono- oder Dialkylamino, substituiert. Die Heterocycloamino-Gruppe ist eine Teilmenge der weiter oben definierten heterocyclischen Gruppe.
„Hydroxy" betrifft eine -OH-Gruppe.
„Alkoxy" betrifft sowohl eine -O-(Alkyl) als auch eine -O-(unsubstituiertes Cycloalkyl)Gruppe. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, z.B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Cyclopropyloxy, Cyclobutyloxy, Cyclopentyloxy, Cyclohexyloxy und ähnliche.
„Haloalkoxy" betrifft eine -O-(Haloalkyl)Gruppe. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, z.B. Trifluormethoxy, Tribrommethoxy und ähnliche.
„Arlyoxy" betrifft sowohl eine -O-Aryl- als auch eine -O-Heteroaryl-Gruppe, wie hierin definiert. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Phenoxy, Pyridinyloxy, Furanyloxy, Thienyloxy, Pyrimidinyloxy, Pyrazinyloxy, und ähnliche und Derivate davon.
„Mercapto" betrifft eine -SH-Gruppe.
„Alkylthio" betrifft sowohl eine -S-(Alkyl)- als auch eine -S-(unsubstituierte Cycloalkyl-)Gruppe. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, z.B. Methylthio, Ethylthio, Propylthio, Butylthio, Cyclopropylthio, Cyclobutylthio, Cyclopentylthio, Cyclohexylthio und ähnliche.
„Arylthio" betrifft sowohl eine -S-Aryl- als auch eine -S-Heteroaryl-Gruppe, wie hierin definiert. Repräsentative Beispiele schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Phenylthio, Pyridinylthio, Furanylthio, Thienylthio, Pyrimidinylthio, und ähnliche und Derivate davon.
„Acyl" betrifft eine -C(O)-R''-Gruppe, wobei R'' aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, niederem Alkyl, Trihalomethyl, unsubstituiertem Cycloalkyl, Aryl, das ggf. mit einem oder mehreren, bevorzugt einem, zwei oder drei Substituenten substituiert wird, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus niederem Alkyl, Trihalomethyl, niederem Alkoxy, Halo und -NR⁹R¹⁰-Gruppen besteht, Heteroaryl (das durch einen Kohlenstoffring gebunden ist), das ggf. mit einem oder mehreren, bevorzugt einem, zwei oder drei Substituenten substituiert ist, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus einem niederem Alkyl, Trihaloalkyl, niederem Alkoxy, Halo und -NR⁹R¹⁰-Gruppen besteht, und Heteroalicyclen (das durch einen Kohlenstoffring gebunden ist), die ggf. mit einem oder mehreren, bevorzugt einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sind, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus niederem Alkyl, Trihaloalkyl, niederem Alkoxy, Halo und -NR⁹R¹⁰-Gruppen besteht. Repräsentative Acyl-Gruppen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Acetyl, Trifluoracetyl, Benzoyl und ähnliche.
„Aldehyd" betrifft eine Acyl-Gruppe, in der R'' Wasserstoff ist.
„Thioacyl" betrifft eine -C(S)-R''-Gruppe, mit R'' wie hierin definiert.
„Ester" betrifft eine -C(O)O-R''-Gruppe, mit R'' wie hierin definiert, mit der Ausnahme, dass R'' nicht Wasserstoff sein kann.
„Acetyl"-Gruppe betrifft eine -C(O)CH₃-Gruppe.
„Halo"-Gruppe betrifft Fluor, Chlor, Brom oder Iod, bevorzugt Fluor oder Chlor.
„Trihalomethyl"-Gruppe betrifft eine -CX₃-Gruppe, wobei X ein Halo ist, wie weiter oben definiert.
„Trihalomethansulfonyl"-Gruppe betrifft X₃CS(=O)₂-Gruppen mit X wie weiter oben definiert.
„Cyano" betrifft eine -C≡N-Gruppe.
„S-Sulfonamido" betrifft eine -S(O)₂NR⁹R¹⁰-Gruppe, mit R⁹ und R¹⁰ wie hierin definiert.
„N-Sulfonamido" betrifft eine -NR⁹S(O)₂R¹⁰-Gruppe, mit R⁹ und R¹⁰ wie hierin definiert.
„O-Carbamyl"-Gruppe betrifft eine -OC(O)NR¹²R¹³-Gruppe, mit R¹² und R¹³ wie hierin definiert.
„N-Carbamyl" betrifft eine R⁹OC(O)NR¹⁰-Gruppe, mit R⁹ und R¹⁰ wie hierin definiert.
„O-Thiocarbamyl" betrifft eine -OC(S)NR¹²R¹³-Gruppe, mit R¹² und R¹³ wie hierin definiert.
„N-Thiocarbamyl" betrifft eine R⁹OC(S)NR¹⁰-Gruppe, mit R⁹ und R¹⁰ wie hierin definiert.
„Amino" betrifft eine -NR⁹R¹⁰-Gruppe, wobei R⁹ und R¹⁰ beide Wasserstoffe sind.
„C-Amido" betrifft eine -C(O)NR⁹R¹⁰-Gruppe, mit R⁹ und R¹⁰ wie hierin definiert.
„N-Amido" betrifft eine R⁹C(O)NR¹⁰-Gruppe, mit R⁹ und R¹⁰ wie hierin definiert.
„Nitro" betrifft eine -NO₂-Gruppe.
„Haloalkyl" bedeutet ein Alkyl, bevorzugt ein niederes Alkyl, wie weiter oben definiert, das mit einem oder mehreren gleichen oder unterschiedlichen Halo-Atomen, z.B. -CH₂Cl, -CF₃, -CH₂CF₃, -CH₂CCl₃ und ähnlichem, substituiert ist.
„Hydroxyalkyl" bedeutet ein Alkyl, bevorzugt ein niederes Alkyl, wie weiter oben definiert, das mit einer, zwei oder drei Hydroxy-Gruppen, z.B. Hydroxymethyl, 1- oder 2-Hydroxyethyl, 1,2-, 1,3-, oder 2,3-Dihydroxypropyl und ähnlichem substituiert ist.
„Aralkyl" bedeutet Alkyl, bevorzugt ein niederes Alkyl, wie weiter oben definiert, das mit einer Aryl-Gruppe, wie oben definiert, z.B. -CH₂Phenyl, -(CH₂)₂Phenyl, -(CH₂)₃Phenyl, CH₃CH(CH₃)CH₂Phenyl, und ähnlichen und Derivaten davon, substituiert ist.
„Heteroaralkyl"-Gruppe bedeutet ein Alkyl, bevorzugt ein niederes Alkyl, wie weiter oben definiert, das mit einer Heteroaryl-Gruppe, z.B. -CH₂Pyridinyl, -(CH₂)₂Pyrimidinyl, -(CH₂)₃Imidazolyl, und ähnlichen und Derivaten davon, substituiert ist.
„Monoalkylamino" bedeutet ein Radikal -NHR, wobei R ein Alkyl oder eine unsubstituierte Cycloalkyl-Gruppe, wie weiter oben definiert, ist, z.B. Methylamino, (1-Methylethyl)amino, Cyclohexylamino und ähnliche.
„Dialkylamino" bedeutet ein Radikal -NRR, wobei jedes R unabhängig ein Alkyl oder eine unsubstituierte Cycloalkyl-Gruppe, wie weiter oben definiert, ist, z.B. Dimethylamino, Diethylamino, (1-Methylethyl)-Ethylamino, Cyclohexylmethylamino, Cyclopentylmethylamino und ähnliche.
„Wahlweise" oder „gegebenenfalls (ggf.)" bedeutet, dass das nachfolgend beschriebene Ereignis oder Umstand auftreten kann aber nicht muss, und dass die Beschreibung Beispiele enthält, in denen das Ereignis oder der Umstand auftritt und Beispiele in denen es das nicht tut. Zum Beispiel bedeutet „heterocyclische Gruppe, die ggf. mit einer Alkyl-Gruppe substituiert ist", dass das Alkyl vorliegen kann, jedoch nicht vorliegen muss, und die Beschreibung Situationen einschließt, in denen die heterocyclische Gruppe mit einer Alkylgruppe substituiert ist und Situationen, in denen die Heterocyclo-Gruppe nicht mit einer Alkyl-Gruppe substituiert ist.
Die Begriffe „2-Indolinon", „Indolin-2-on" und „2-Oxindol" werden hierin miteinander austauschbar verwendet, um ein Molekül mit der chemischen Struktur zu bezeichnen:
Der Begriff „Pyrrol" betrifft ein Molekül mit der chemischen Struktur:
Verbindungen, die die gleiche Molekularformel aufweisen, jedoch in der Natur oder Sequenz der Bindung ihrer Atome oder der Anordnung ihrer Atome im Raum verschieden sind, werden „Isomere" genannt. Isomere, die sich in der Anordnung ihrer Atome im Raum unterscheiden, werden „Stereoisomer" genannt. Stereoisomere, die nicht Spiegelbilder voneinander sind, werden „Diastereomere" genannt und solche, die nicht miteinander in Deckung bringende Spiegelbilder voneinander sind, werden „Enantiomer" genannt. Wenn eine Verbindung ein asymmetrisches Zentrum aufweist, zum Beispiel ist es an vier verschiedene Gruppen gebunden, ist ein Paar von Enantiomeren möglich. Ein Enantiomer kann durch die absolute Konfiguration seines asymmetrischen Zentrums charakterisiert sein und wird durch R- und S-Sequenzregeln von Cahn und Prelog oder durch die Art und Weise wie das Molekül die Ebene des polarisierten Lichtes dreht, beschrieben, und als rechtsdrehend oder linksdrehend (d.h. als (+) bzw. (–)-Isomere) gekennzeichnet. Eine chirale Verbindung kann entweder als individuelles Enantiomer oder als eine Mischung davon existieren. Eine Mischung, die gleiche Anteile der Enantiomere enthält, wird eine „razemische Mischung" genannt.
Die Verbindungen dieser Erfindung können ein oder mehrere asymmetrische Zentren besitzen; diese Verbindungen können daher als individuelle (R)- oder (S)-Stereoisomere oder als Mischungen davon hergestellt werden. Zum Beispiel ist das Kohlenstoffatom, das die Hydroxy-Gruppe in -CONHCHR³-CR⁴(OH)CR⁵ ₂ in einer Verbindung der Formel (I) trägt, ein asymmetrisches Zentrum und daher kann die Verbindung der Formel (I) als ein (R)- oder (S)-Stereoisomer existieren. So lange nichts Gegenteiliges angegeben wird, soll die Beschreibung oder Benennung einer bestimmten Verbindung im beschreibenden Teil und den Ansprüchen sowohl die individuellen Enantiomere als auch die Mischungen, razemisch oder anders, davon einschließen. Die Verfahren zur Bestimmung der Stereochemie und der Auftrennung von Stereoisomeren sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe die Erörterung im Kapitel 4 von „Advanced Organic Chemistry", 4. Ausgabe, J. March, John Wiley and Sons, New York, 1992).
Die Verbindungen der Formel (I) können das Phänomen der Tautomerie und der strukturellen Isomerie zeigen. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Verbindungen eine E- oder eine Z-Konfiguration bzgl. der Doppelbindung, die den 2-Indolinon-Rest mit dem Pyrrol-Rest verbindet, annehmen, oder sie können eine Mischung aus E und Z sein. Diese Erfindung umfasst jede tautomere oder strukturell isomere Form und Mischungen davon, die die Fähigkeit besitzen, die RTK, CTK und/oder STK-Atkivität zu modulieren, und ist nicht auf eine tautomere oder strukturell isomere Form beschränkt.
Eine „pharmazeutische Zusammensetzung" betrifft eine Mischung aus einer oder mehreren der hierin beschriebenen Verbindungen, oder physiologisch/pharmazeutisch annehmbaren Salzen oder Arzneimittelvorstufen davon mit anderen chemischen Komponenten, wie zum Beispiel physiologisch/pharmazeutisch annehmbaren Trägern und Hilfsstoffen. Der Zweck einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist es, das Verabreichen einer Verbindung an einen Organismus zu erleichtern.
Die Verbindung der Formel (I) kann auch als eine Arzneimittelvorstufe wirken. Eine „Arzneimittelvorstufe" betrifft ein Agens, dass in vivo in die Arzneimittelendstufe umgewandelt wird. Arzneimittelvorstufen sind häufig nützlich, da sie in einigen Situationen einfacher verabreicht werden können als die Arzneimittelendstufe. Sie können zum Beispiel durch orale Verabreichung biologisch verfügbar sein, während es die Arzneimittelendstufe nicht ist. Die Arzneimittelvorstufe kann auch eine bessere Löslichkeit in pharmazeutischen Zusammensetzungen gegenüber der Arzneimittelendstufe aufweisen. Eine ohne zur Begrenzung dienendes Beispiel einer Arzneimittelvorstufe wäre eine Verbindung der vorliegenden Erfindung, die als ein Ester (die „Arzneimittelvorstufe") verabreicht wird, um die Übertragung über eine Zellmembran zu erleichtern, bei der die Wasserlöslichkeit nachteilig für die Mobilität ist, dann jedoch metabolisch zur Carboxylsäure, der aktiven Einheit, hydrolisiert wird, sobald sie in der Zelle ist, in der die Wasserlöslichkeit besser ist.
Ein weiteres Beispiel einer Arzneimittelvorstufe kann ein kurzes Polypeptid sein, zum Beispiel, ohne Begrenzung, ein 2–10 Aminosäurepolypeptid, das durch eine terminale Amino-Gruppe an eine Carboxy-Gruppe einer Verbindung dieser Erfindung gebunden ist, wobei das Polypeptid in vivo hydrolisiert oder metabolisiert wird, um das aktive Molekül freizusetzen. Die Arzneimittelvorstufen einer Verwendung der Formel (I) liegen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung.
Zusätzlich wird in Erwägung gezogen, dass eine Verbindung der Formeln (I) durch Enzyme im Körper des Organismus, wie zum Beispiel eines Menschen, metabolisiert wird, um einen Metaboliten zu erzeugen, der die Aktivität der Proteinkinase modulieren kann. Solche Metabolite liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Wie hierin verwendet, betrifft ein „physiologisch/pharmazeutisch annehmbarer Träger" einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, der keine wesentliche Reizung eines Organismus verursacht und die biologische Aktivität und die Eigenschaften der verabreichten Verbindung nicht aufhebt.
Ein „pharmazeutisch geeignetes Hilfsmittel" betrifft eine inerte Substanz, die zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegeben wird, um das Verabreichen einer Verbindung weiter zu erleichtern. Beispiele, ohne Begrenzung, für Hilfsmittel schließen Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker und Stärketypen, Zellulosederivate, Gelatine, Pflanzenöle und Polyethylenglycole ein.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „pharmazeutisch annehmbares Salz" solche Salze, die die biologische Wirksamkeit und die Eigenschaften der Verbindungsendstufe beibehalten. Solche Salze schließen ein:

(i) Säureadditionssalz, dass durch Reaktion der freien Base der Verbindungsendstufe mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Perchlorsäure und ähnliche, oder mit organischen Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure, Oxalsäure, (D) oder (L) Apfelsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Salicylsäure, Tartarsäure, Zitronensäure, Succinsäure oder Malonsäure und ähnliche, bevorzugt Salzsäure oder (L)-Apfelsäure, erhalten wird; oder
(2) Salze, die gebildet werden, wenn ein Säureproton vorhanden ist, das in der Verbindungsendstufe entweder durch ein Metallion, z.B. ein Alkalimetallion, ein Erdalkaliion oder ein Aluminiumion, ersetzt wird; oder sich an eine organische Base, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Tromethanmin, N-Methylglucamin und ähnliche anlagert.

„PK" betrifft die Rezeptorprotein-Tyrosinkinase (RTK's), die Nichtrezeptor- oder „zelluläre" Tyrosinkinase (CTK's) und die Serin-Threoninkinasen (STK's).
„Verfahren" betrifft die Art und Weise, die Mittel, die Techniken und Prozeduren zum Ausführen einer vorgegebenen Aufgabe, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf eine solche Art und Weise, Mittel, Techniken und Prozeduren, die entweder bekannt sind, oder bereits aus einer bekannten Art und Weise, Mitteln, Techniken und Prozeduren von Praktikern der chemischen, pharmazeutischen, biologischen, biochemischen und medizinischen Techniken entwickelt worden sind.
Die „Modulation" oder „das Modulieren" betrifft das Verändern der katalytischen Aktivität von RTK's, CTK's und STK's. Das Modulieren betrifft besonders die Aktivierung der katalytischen Aktivität von RTK's, CTK's und STK's, bevorzugt die Aktivierung oder Inhibierung der katalytischen Aktivität von RTK's, CTK's und STK's, abhängig von der Konzentration der Verbindung oder des Salzes dem gegenüber die RTK, CTK oder STK ausgesetzt wird, oder noch bevorzugter die Inhibierung der katalytischen Aktivität der RTK's, CTK's und STK's.
Die „katalytische Aktivität" betrifft die Phosphorylierungsrate des Tyrosins unter dem Einfluss, direkt oder indirekt, von RTK's und/oder CTK's, oder die Phosphorylierung von Serin und Threonin unter dem Einfluss, direkt oder indirekt, von STK's.
Das „in Kontakt bringen" betrifft das Zusammenbringen einer Verbindung dieser Erfindung und einer Ziel-PK auf eine Art und Weise, bei der die Verbindung die katalytische Aktivität der PK, entweder direkt, d.h. durch Interagieren mit der Kinase selber, oder indirekt, d.h. durch Interagieren mit einem anderen Molekülen von dem die katalytische Aktivität der Kinase abhängt, beeinflussen kann. Ein solches „in Kontakt bringen" kann „in vitro", d.h. in einem Teströhrchen, einer Petrischale oder ähnlichem, durchgeführt werden. In einem Teströhrchen kann das in Kontakt bringen nur eine Verbindung und eine entsprechende PK involvieren, oder es kann ganze Zellen involvieren. Zellen können auch in Zellkulturschalen beibehalten, oder herangezogen werden und in dieser Umgebung mit einer Verbindung in Kontakt gebracht werden. In diesem Zusammenhang kann die Fähigkeit einer bestimmten Erfindung eine mit PK zusammenhängende Störung zu beeinflussen, d.h. den IC₅₀ der Verbindung, der weiter unten definiert wird, vor der Verwendung der Verbindungen in vivo bestimmt werden, wobei dies mit komplexeren lebenden Organismen versucht wird. Für Zellen außerhalb des Organismus gibt es vielfältige Verfahren und diese sind dem Fachmann gut bekannt, um die PK's in Kontakt mit den Verbindungen zu bringen, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf direkte Zell-Mikroinjektion und zahlreiche Transmembran-Träger-Techniken.
„In vitro" betrifft Prozeduren, die in einer künstlichen Umgebung, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, in einem Teströhrchen oder im Kulturmedium, durchgeführt werden.
„In vivo" betrifft Prozeduren, die innerhalb eines lebenden Organismus, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, einer Maus, Ratte oder einem Hasen, durchgeführt werden.
„Mit PK zusammenhängende Störung", „PK getriebene Störung" und „abnormale PK-Aktivität" betreffen alle einen Zustand, der durch eine ungeeignete, d.h. unter oder, gebräuchlicher über, PK katalytische Aktivität gekennzeichnet ist, wobei die bestimmte PK eine RTK, eine CTK oder eine STK sein kann. Eine ungeeignete katalytische Aktivität kann sich als ein Ergebnis ergeben, entweder: (1) der PK-Expression in Zellen, die normalerweise keine PK's exprimieren, (2) der erhöhten PK-Expression, die zur ungewollten Zellproliferation, Differenzierung und/oder Wachstum führt, oder (3) der verringerten PK-Expression, die zu ungewollten Verringerungen der Zellproliferation, Differenzierung und/oder Wachstum führt. Die Überaktivität einer PK betrifft entweder die Amplifikation des Gens, dass für eine bestimmte PK kodiert, oder das Erzeugen eines PK-Aktivitätsniveaus, das mit einer Zellproliferations-, Differenzierungs- und/oder Wachstumsstörung (dass heißt, wenn das PK-Niveau zunimmt, nimmt der Schweregrad eines oder mehrerer der Symptome der zellulären Störung zu) korreliert. Die zu geringe Aktivität ist selbstverständlich das Gegenteil, wobei der Schweregrad eines oder mehrerer Symptome einer zellulären Störung zunimmt, wenn das PK-Aktivitätsniveau sich verringert.
Das „Behandeln" und die „Behandlung" betreffen ein Verfahren zum Lindern oder Aufheben einer durch PK vermittelten zellulären Störung und/oder ihrer begleitenden Symptome. Besonders in Bezug auf Krebs bedeuten diese Begriffe einfach, dass die Lebenserwartung eines Individuums, das vom Krebs betroffen ist, zunehmen wird, oder dass eines oder mehrere der Symptome der Erkrankung verringert werden.
Ein „Organismus" betrifft jede lebende Entität, die aus wenigstens einer Zelle besteht. Ein lebender Organismus kann etwas so einfach sein, wie zum Beispiel eine einzelne eukaryotische Zelle, oder so Komplex wie ein Säugetier, einschließlich eines Menschen.
Die „therapeutisch wirksame Menge" betrifft die zu verabreichende Menge der Verbindung, die bis zu einem gewissen Umfang ein oder mehrere der Symptome der zu behandelnden Erkrankung lindert. In Bezug auf die Behandlung von Krebs betrifft eine therapeutisch wirksame Menge die Menge, die die Wirkung hat:

(1) Verringern der Größe des Tumors;
(2) Inhibieren (das heißt, zumindest in einem gewissen Umfang verlangsamen, bevorzugt stoppen) der Tumormetastase;
(3) Inhibieren, bis zu einem gewissen Ausmaß (das heißt, zumindest in einem gewissen Umfang verlangsamen, bevorzugt stoppen), des Tumorwachstums und/oder
(4) Lindern, bis zu einem gewissen Ausmaß (oder bevorzugt eliminieren), eines oder mehrerer Symptome, die mit dem Krebs im Zusammenhang stehen.

„Überwachen" bedeutet, Beobachten oder Detektieren der Wirkung beim in Kontakt bringen einer Verbindung mit einer Zelle, die eine bestimmte PK exprimiert. Die beobachtete oder detektierte Wirkung kann eine Veränderung des Zellphänotyps, der katalytische Aktivität einer PK, oder eine Veränderung der Wechselwirkung einer PK mit einem natürlichen Bindungspartner sein. Techniken zum Beobachten oder Detektieren solcher Wirkungen sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die oben beschriebene Wirkung wird ausgewählt aus einer Veränderung oder einer Abwesenheit einer Veränderung in einem Zellphänotyp, eine Veränderung oder Abwesenheit einer Veränderung in der katalytischen Aktivität der Proteinkinase oder eine Veränderung oder Abwesenheit einer Veränderung bei der Wechselwirkung der Proteinkinase mit einem natürlichen Bindungspartner in einem letzten Aspekt dieser Erfindung.
Der „Zellphänotyp" betrifft die äußere Erscheinung einer Zelle oder eines Gewebes, oder die biologische Funktion der Zelle oder des Gewebes. Beispiele, ohne Begrenzung, eines Zellphänotyps sind die Zellgröße, das Zellwachstum, die Zellproliferation, die Zelldifferenzierung, das Zellüberleben, die Apoptose, die Nährstoffaufnahme und die die Verwendbarkeit. Solche phänotypischen Charakteristika sind durch im Stand der Technik gut bekannte Techniken messbar.
Der „natürliche Bindungspartner" betrifft ein Polypeptid, das an eine bestimmte PK in einer Zelle bindet. Natürliche Bindungspartner können eine Rolle beim Verbreiten eines Signals in einem PK-vermittelten Signaltransduktionsprozess spielen. Eine Veränderung der Wechselwirkung des natürlichen Bindungspartners mit der PK kann sich selbst als eine erhöhte oder verringerte Konzentration des PK/natürlichen Bindungspartner-Komplexes manifestieren und, als eine Folge davon, in einer beobachtbaren Veränderung der Fähigkeit der PK, die Signaltransduktion zu vermitteln.
Repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden unten in Tabelle 1a gezeigt.
TABELLE 1a
Andere repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden weiter unten in Tabelle 1b gezeigt.
Tabelle 1b
Die in den Tabellen 1a–1b dargestellten Verbindungen sind nur exemplarisch und sollen nicht dazu dienen den Schutzumfang dieser Erfindung in irgendeiner Art und Weise zu begrenzen.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Während die breiteste Definition in der Zusammenfassung der Erfindung gegeben wird, werden bestimmte Verbindungen der Formel (I), die weiter unten dargestellt werden, bevorzugt.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, in der:
R⁶ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und Alkyl, bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl oder n-Butyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl besteht; und
R⁷ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁷ besteht, wobei R¹⁷ Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl oder Heteroaryl ist, und noch bevorzugter ist R⁷ Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, Benzoyl, Acetyl oder Carboxy, am meisten bevorzugt Methyl, Wasserstoff oder Phenyl.
2. Eine andere bevorzugte Gruppe der Verbindungen der Formel (I) ist die, in der:
R⁶ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und Alkyl, bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl oder n-Butyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl, am meisten bevorzugt Methyl besteht;
R⁷ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁷ besteht, wobei R¹⁷ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist, und R⁷ noch bevorzugter Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, Benzoyl, Acetyl oder Carboxy, am meisten bevorzugt Methyl, Wasserstoff oder Phenyl ist; und R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind; und
Z Aryl ist.
3. Eine andere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, in der:
R⁶ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und Alkyl, bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl oder n-Butyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl, am meisten bevorzugt Methyl besteht;
R⁷ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁷ besteht, wobei R¹⁷ Hydroxy, Alkyl oder Aryl ist und R⁷ noch bevorzugter Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, Benzoyl, Acetyl oder Carboxy, am meisten bevorzugt Methyl, Wasserstoff oder Phenyl, am allermeisten bevorzugt Methyl ist; und
R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind; und
Z ein Heteroaryl, bevorzugt Triazinyl, Tetrazolyl, Imidazolyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl oder Pyrazinyl ist.
4. Eine andere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, in der:
R⁶ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und Alkyl, bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl oder n-Butyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl, am meisten bevorzugt Methyl besteht;
R⁷ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁷ besteht, wobei R¹⁷ Hydroxy, Alkyl oder Aryl ist, und R⁷ noch bevorzugter Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, Benzoyl, Acetyl oder Carboxy, am meisten bevorzugt Methyl, Wasserstoff oder Phenyl ist; und
R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind; und
Z heterocyclisch ist.
5. Eine andere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, in der:
R⁶ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und Alkyl, bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Isobutyl, oder n-Butyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl, am meisten bevorzugt Methyl besteht;
R⁷ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁷ besteht, wobei R¹⁷ Hydroxy, Alkyl oder Aryl ist, und R⁷ noch bevorzugter Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, Benzoyl, Acetyl oder Carboxy, noch bevorzugter Methyl, Wasserstoff oder Phenyl, am meisten bevorzugt Methyl ist; und
R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind; und
Z -NR¹⁵R¹⁶ ist, wobei R¹⁵ und R¹⁶ kombiniert werden, um Heterocycloamino, bevorzugt Piperidin-1-yl, N-Methylpiperidin-1-yl, Piperazin-1-yl, N-Methylpyrrolidin-1-yl, Pyrrolidin-1-yl, Morpholin-4-yl, Thiomorpholin-4-yl, Thiomorpholin-1-oxid, Thiomorpholin-1,1-dioxid, 4-Ethyloxycarbonylmethylpiperazin-1-yl, 3-Oxopiperazin-1-yl, Imidazolidin-1-yl-2-on, Pyrrolidin-1-yl-2-on, Oxohomopiperazin-1-yl oder Tetrahydropyrimidin-1-yl-2-on, noch bevorzugter Morpholin-4-yl zu bilden.
5. Eine andere bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) ist die, in der:
R⁶ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff und Alkyl, bevorzugt Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert-Butyl, Iso-butyl oder n-Butyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl besteht;
R⁷ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Heteroaryl und -C(O)R¹⁷ besteht, wobei R¹⁷ Hydroxy, Alkyl oder Aryl ist und R⁷ noch bevorzugter Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-, Iso- oder tert-Butyl, Phenyl, Benzoyl, Acetyl oder Carboxy, am meisten bevorzugt Methyl, Wasserstoff oder Phenyl ist; und
R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind; und
Z -NR¹⁵R¹⁶ ist, wobei R¹⁵ und R¹⁶ Alkyl, bevorzugt Diethylamino, Dimethylamino oder Ethylamino sind.
7. Innerhalb der oben bevorzugten und noch bevorzugteren Gruppen (1)–(6) ist eine sogar noch bevorzugtere Gruppe von Verbindungen die, in der:
R¹ Wasserstoff, Alkyl, -C(O)NR¹²R¹³, unsubstituiertes Cycloalkyl, bevorzugt Wasserstoff, 3,4-Dimethoxyphenylaminocarbonyl, 4-Methoxy-3-chlorphenylaminocarbonyl, noch bevorzugter Wasserstoff oder Methyl, am meisten bevorzugt Wasserstoff ist; und
R² Wasserstoff, Cyano, Halo, ein niederes Alkoxy oder -S(O)₂NR⁹R¹⁰ ist, wobei R⁹ Wasserstoff ist und R¹⁰ Wasserstoff, Aryl oder Alkyl ist und in der 5-Position des Oxindolrings liegt, R² bevorzugt Wasserstoff, Chlor, Brom, Fluor, Methoxy, Ethoxy, Phenyl, Dimethylaminosulfonyl, 3-Chlorphenylaminosulfonyl, Carboxy, Methoxy, Aminosulfonyl, Methylaminosulfonyl, Phenylaminosulfonyl, Pyridin-3-yl-aminosulfonyl, Dimethylaminosulfonyl, Isopropylaminosulfonyl, noch bevorzugter Wasserstoff, Fluor oder Brom ist. Am meisten bevorzugt ist R² Fluor und ist in der 5-Position des Indolinonrings angeordnet. In den oben bevorzugten, noch bevorzugteren und am meisten bevorzugten Verbindungen ist die Stereochemie am Kohlenstoffatom, dass die Hydroxy-Gruppe in der -CONHCH(R³)*CR⁴(OH)CR⁵Z-Kette trägt und durch ein * angezeigt wird, entweder RS, R, oder S, noch bevorzugter S.
Anwendbarkeit
Die PK's, dessen katalytische Aktivität durch die Verbindungen dieser Erfindung moduliert werden, schließen Protein-Tryosinkinasen ein, von denen es zwei Typen gibt, die Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK's) und die zellulären Tyrosinkinasen (CTK's) und die Serin-Threoninkinasen (STK's). Die RTK vermittelte Signaltransduktion wird durch die extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand), gefolgt durch eine Rezeptordimerisierung, transiente Stimulation der intrinsischen Protein-Tyrosinkinaseaktivität und einer Phosphorylierung initiiert. Dadurch werden Bindungsstellen für die intrazellulären Signaltransduktionsmoleküle erzeugt und führen zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalmolekülen, die die geeignete zelluläre Antwort (z.B. Zellteilung, metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung, etc.) erleichtern. Siehe, Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 303–391.
Es ist gezeigt worden, dass Tyrosin-Phosphorylierungsstellen an Wachstumsfaktorrezeptoren als hochaffine Bindungsstellen für SH2 (src Homolog)-Domäne von Signalmolekülen funktionieren. Fantl et al., 1992, Cell 69: 413–423, Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777–2785), Songyang et al., 1993, Cell 72: 767–778, und Koch et al., 1991, Science 252: 668–678. Mehrere intrazelluläre Substratproteine, die mit RTK's im Zusammenhang stehen, sind identifiziert worden. Sie können zwei Hauptgruppen aufgeteilt werden: (1) Substrate, die eine katalytische Domäne haben, und (2) Substrate, denen eine solche Domäne fehlt, die jedoch als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen im Zusammenhang stehen. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767–778. Die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren und den SH2-Domänen ihrer Substrate, wird durch die Aminosäurereste bestimmt, die den phosphorylierten Tyrosinrest sofort umgeben. Unterschiede bei den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und den Aminosäuresequenzen, die die Phosphotyrosinreste an bestimmten Rezeptoren umgeben, stimmen mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen überein. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767–778. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Funktion jeder RTK nicht nur durch die Expressionsmuster und die Ligandenverfügbarkeit bestimmt wird, sondern auch durch das Array von stromabwärts liegenden Signaltransduktionswegen, die durch einen bestimmten Rezeptor aktiviert werden. Demnach stellt die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt bereit, der die Selektivität von Signalwegen, die sowohl durch spezifische Wachstumsfaktorrezeptoren als auch durch Differenzierungsfaktorrezeptoren rekrutiert werden, bestimmt.
STK's, die primär cytosolisch sind, beeinflussen die interne Biochemie der Zelle häufig als Down-Line-Reaktion auf ein PTK-Ereignis. STK's sind mit dem Signalprozess, der die DNA-Synthese und die nachfolgende Mitose, die zur Zellproliferation führt, initiiert, in Verbindung gebracht wurden.
Demnach führt die PK-Signaltransduktion, neben anderen Reaktionen, zur Zellproliferation, Differenzierung, Wachstum und zum Metabolismus. Die abnormale Zellproliferation kann zu einer großen Breite von Störungen und Erkrankungen führen, die die Entwicklung einer Neoplasie, wie zum Beispiel Krebs, Sarkom, Glioblastom und Hämangiom, Erkrankung, wie zum Beispiel Leukämie, Psoriasis, Atherosklerose, Arthritis und diabetische Retinopathie und andere Störungen, die mit einer unkontrollierten Angiogenese und/oder Vaskulogenese zusammenhängen, einschließen.
Ein genaues Verständnis des Mechanismus, durch den die Verbindungen dieser Erfindung PK's inhibieren, ist nicht erforderlich, um die folgende Erfindung auszuführen. Obwohl man hierdurch jedoch nicht an irgendeinen bestimmten Mechanismus oder eine Theorie gebunden ist, glaubt man, dass die Verbindungen mit den Aminosäuren in der katalytischen Region der PK's interagieren. PK's besitzen üblicherweise eine bilobäre Struktur, wobei es scheint, dass ATP in der Spalte zwischen den beiden Loben in einen Bereich bindet, in dem die Aminosäuren unter den PK's konserviert sind. Man glaubt, dass Inhibitoren von PK's durch nichtkovalente Wechselwirkung, wie zum Beispiel einer Wasserstoffbrückenbindung, Van-der-Waals-Kräften und ionischen Wechselwirkungen im gleichen allgemeinen Bereich, in dem das vorgenannte ATP an die PK's bindet, binden. Es wird insbesondere angenommen, dass die 2-Indolinon-Komponente der Verbindungen dieser Erfindung im allgemeinen Raum, der normalerweise durch den Adeninring des ATP besetzt wird, bindet. Die Spezifität eines bestimmten Moleküls für eine bestimmte PK kann sich dann als ein Ergebnis aus der zusätzlichen Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Substituenten am 2-Indolinonkern und den Aminosäuredomänen, die für bestimmte PK's spezifisch sind, ergeben. Demnach können verschiedene Indolinonsubstituenten zur bevorzugten Bindung bestimmter PK's beitragen. Die Fähigkeit, Verbindungen aktiv an verschiedenen ATP (oder anderen Nukleotid)-Bindungsstellen auszuwählen, macht die Verbindungen dieser Erfindung für das Ansteuern irgendeines Proteins mit solch einer Stelle verwendbar. Die hierin offenbarten Verbindungen weisen daher eine Verwendbarkeit in in vitro Assays für solche Proteine auf und zeigen auch in vivo therapeutische Wirkungen durch die Wechselwirkung mit solchen Proteinen.
Zusätzlich stellen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung vieler Arten von festen Tumoren bereit, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf Karzinome, Sarkome, einschließlich Kaposi's Sarkom, Erythroblastom, Glioblastom, Meningioma, Astrocytom, Melanom und Myoblastom. Die Verwendung dieser Verbindungen in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder zum Verhindern von nicht festen Tumorkrebsen, wie zum Beispiel Leukämie, wird ebenso von dieser Erfindung umfasst. Indikationen können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf Gehirnkrebs, Blasenkrebs, Ovarialkrebs, Magenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Dickdarmkrebs, Blutkrebs, Lungenkrebs und Knochenkrebs.
Weitere Beispiele, ohne Begrenzung, der Typen von Störungen die mit einer unpassenden PK-Aktivität im Zusammenhang stehen, für die die hierin beschriebenen Verbindungen beim Verhindern, Behandeln und Studieren verwendet werden könnten, sind proliferative Störungen der Zelle, fibrotische Störungen und metabolische Störungen.
Proliferative Störungen der Zelle, die man durch die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels, das gegen diese Störungen gerichtet ist, verhindern, behandeln oder weiter studieren kann, schließen Krebs, Störungen der Blutgefäßproliferation und mesangiale proliferative Störungen der Zelle ein.
Störungen der Blutgefäßproliferation betreffen Störungen, die mit einer abnormalen Vaskulogenese (Blutgefäßbildung) und Angiogenese (Ausbreitung von Blutgefäßen) im Zusammenhang stehen. Während die Vaskulogenese und die Angiogenese wichtige Rollen bei einer Vielzahl von normalen physiologischen Prozessen, wie zum Beispiel der embryonalen Entwicklung, der Corpus Luteum-Bildung, der Wundheilung und der Organregeneration, spielen, spielen sie auch eine entscheidende Rolle bei der Krebsentwicklung, bei der sie die Bildung von neuen Kapillaren, die für das Überleben des Tumors erforderlich sind, zur Folge haben. Andere Beispiele für Störungen der Blutgefäßproliferation schließen die Arthritis, bei der neue kapillare Blutgefäße in das Gelenk eindringen und den Knorpel zerstören, und Augenerkrankungen, wie die diabetische Retinopathie, bei der neue Kapillaren in der Retina in den Glaskörper eindringen, ausbluten und Blindheit verursachen, ein.
Man hat zwei strukturell miteinander im Zusammenhang stehende RTK's identifiziert, die VEGF mit hoher Affinität binden: der fms-ähnliche Tyrosin 1 (flt-1)-Rezeptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5: 519–524; De Vries et al., 1992, Science, 255: 989–991) und der KDR/FLK-1-Rezeptor, auch als VEGF-R2 bekannt. Es wurde berichtet, dass der vaskuläre Endothelwachstumsfaktor (VEGF) ein Endothelzellenspezifisches Mitogen mit einer Endothelzellenwachstumsfördernden Aktivität in vitro ist. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851–858; Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 19461–19566. Die Informationen, die in den U.S. Anmeldungen mit der Ser. Nr. 08/193,829, 08/038,596 und 07/975,750 dargestellt werden, liegen deutlich nahe, dass VEGF nicht nur für die Endothelzellenproliferation verantwortlich ist, sondern auch der Hauptregulator für die normale und pathologische Angiogenese ist. Siehe im Allgemeinen, Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10) 699–702; Houck, et al., 1992, J. Biol. Chem., 267: 26031–26037.
Die normale Vaskulogenese und Angiogenese spielen wichtige Rollen in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, wie zum Beispiel der embryonalen Entwicklung, der Wundheilung, der Organregeneration und den weiblichen reproduktiven Prozessen, wie zum Beispiel der Follikelentwicklung im Corpus Luteum während des Eisprungs und des plazentalen Wachstums nach der Schwangerschaft. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16): 10931–34. Die unkontrollierte Vaskulogenese und/oder Angiogenese ist mit Erkrankungen, wie zum Beispiel Diabetes als auch mit malignen festen Tumoren, die für das Wachstum von der Vaskularisierung abhängen, in Zusammenhang gebracht worden. Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10): 699–702; Folkham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82: 4–6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324: 1–5.
Die vermutete Rolle des VEGF bei der Endothelzellenproliferation und Migration während der Angiogenese und Vaskulogenese, deuten eine wichtige Rolle für den KDR/FLK-1-Rezeptor in diesen Prozessen an. Erkrankungen wie zum Beispiel Diabetes Mellitus (Folkman, 198, in XI^th Congress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, et al., Hrsg.), S. 583–596, Leuven University Press, Leuven) und Arthritis als auch das maligne Tumorwachstum können sich aus einer unkontrollierten Angiogenese ergeben. Siehe z.B., Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182–1186. Die Rezeptoren, an die VEGF spezifisch bindet, sind ein wichtiges und starkes therapeutisches Ziel für die Regulation und Modulation der Vaskulogenese und/oder Angiogenese und einer Vielzahl von ernsten Erkrankungen, die ein abnormales zelluläres Wachstum, dass durch solche Prozesse verursacht wird, einschließen. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6): 334–339. Insbesondere die hochspezifische Rolle des KDR/FLK-1-Rezeptors bei der Gefäßneubildung machen ihn zu einem Wahlziel für therapeutische Ansätze zur Behandlung von Krebs und anderen Erkrankungen, die die unkontrollierte Bildung von Blutgefäßen einschließen.
Daher stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die die Tyrosinkinase-Signaltransduktion, die die KDR/FLK-1-Rezeptor Signaltransduktion einschließt, regulieren und/oder modulieren können, um die Angiogenese und/oder Vaskulogenese, das heißt Verbindungen, die mit dem durch KDR/FLK-1 transduzierten Signal interferieren, wenn sie durch Liganden, wie zum Beispiel VEGF, aktiviert werden, zu inhibieren oder zu fördern. Obwohl man glaubt, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf einen Rezeptor oder eine andere Komponente entlang des Tyrosinkinase-Signaltransduktionsweges wirken, so können sie auch direkt auf die Tumorzellen, die sich aus einer unkontrollierten Angiogenese ergeben, wirken.
Obwohl sich die Nomenklatur der menschlichen und murinen Gegenstücke des generischen „flk-I"-Rezeptors unterscheiden, sind sie in vielen Beziehungen austauschbar. Der murine Rezeptor, Flk-1, und sein menschliches Gegenstück, KDR, teilen eine Sequenzhomologie von 93,4% innerhalb der intrazellulären Domäne. Das murine FLK-I bindet menschliches VEGF ebenfalls mit der gleichen Affinität wie das Mäuse VEGF, und wird entsprechend durch den Liganden, der von beiden Spezies abstammt, aktiviert. Millauer et al., 1993, Cell, 72: 835–846; Quinn et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7533–7537. FLK-1 verbindet sich auch mit und phosphoryliert anschließend Tyrosin von menschlichen RTK-Substraten (z.B., PLC-γ oder p85), wenn es in 293 Zellen (humane embryonale Nierenfibroblasten) coexprimiert wird.
Modelle, die vom FLK-1-Rezeptor abhängen, sind daher direkt für das Verständnis des KDR-Rezeptors maßgeblich. Zum Beispiel sind die Verwendung des murinen FLK-1-Rezeptors in Verfahren, die Verbindungen identifizieren, die den murinen Signaltransduktionsweg regulieren, direkt bei der Identifikation von Verbindungen, die verwendet werden können, um den menschlichen Signaltransduktionsweg zu regulieren, d.h., die die Aktivität regulieren, die mit dem KDR-Rezeptor zusammenhängt, anwendbar. Daher können chemische Verbindungen, die als Inhibitoren für KDR/FLK-1 in vitro identifiziert worden sind, in geeigneten in vivo-Modellen bestätigt werden. Sowohl in vivo Mäuse- als auch Rattentiermodelle haben gezeigt, dass sie einen außerordentlichen Wert für die Untersuchung des klinischen Potenzials von Agenzien, die auf den KDR/FLK-1 induzierten Signaltransduktionsweg wirken, haben.
Demnach stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen bereit, die die Vaskulogenese und/oder Angiogenese durch Beeinflussen der enzymatischen Aktivität des KDR/FLK-1-Rezeptors und interferieren mit dem Signal, dass durch KDR/FLK-1 transduziert wird, regulieren, modulieren und/oder inhibieren. Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Zusammensetzungen bereit, die die Verbindungen der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von vielen Arten an festen Tumoren, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf ein Glioblastom, Melanom und Kaposi's Sarkom, und ein Ovarial-, Lungen-, Brust-, Prostata-, Pankreas-, Dickdarm- und Epidermoidkarzinom. Zusätzlich legen die Daten die Verwendung von Verbindungen, die den KDR/Flk-1-vermittelten Signaltransduktionsweg inhibieren, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hämangiom, Restenose und diabetische Retinopathie nahe.
Darüber hinaus betrifft diese Erfindung die Inhibierung der Vaskulogenese und Angiogenese durch andere Rezeptorvermittelte Wege, einschließlich des Weges, der den flt-1-Rezeptor umfasst.
Die Rezeptor-Tyrosinkinase vermittelte Signaltransduktion wird durch eine extrazelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) gefolgt von einer Rezeptordimerisierung, transienten Stimulation der intrinsischen Protein-Tyrosinkinaseaktivität und Autophosphorylierung initiiert. Dadurch werden Bindungsstellen für intrazellulären Signaltransduktionsmoleküle erzeugt, die zur Bildung von Komplexen mit einem Spektrum an cytoplasmatischen Signalmolekülen führen, die die geeignete zelluläre Reaktion, z.B. Zellteilung und metabolische Wirkungen auf die extrazelluläre Mikroumgebung, erleichtern. Siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron, 9: 1–20.
Die enge Homologie der intrazellulären Bereiche des KDR/FLK-1 mit denen des PDGF-β-Rezeptors (50,3% Homologie) und/oder dem verwandten flt-1-Rezeptor lassen die Induktion der überlappenden Signaltransduktionswege erkennen. Zum Beispiel ist für den PDGF-β-Rezeptor, Mitgliedern der src-Familie (Twamley et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7696–7700), der Phosphatidylinositol-3'-Kinase (Hu et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12: 981–990), der Phospholipase cγ (Kashishian & Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol., 4: 49–51), dem ras-GTPase-aktivierendem Protein (Kashishian et al., 1992, EMBO J., 11: 1373–1382), dem PTP-ID/syp (Kazlauskas et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 10 90: 6939–6943), dem Grb2 (Arvidsson et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 6715–6726), und den Adaptermolekülen Shc und Nck (Nishimura et al., 1993, Mol. Cell. Biol., 13: 6889–6896) gezeigt worden, dass sie an Bereiche binden, die unterschiedliche Autophosphorylierungsstellen betreffen. Allgemein siehe Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5: 37–54. Daher ist es wahrscheinlich, dass die Signaltransduktionswege, die durch KDR/FLK-1 aktiviert werden, den ras-Weg (Rozakis et al., 1992, Nature, 360: 689–692), den PI-3'-Kinase-, den src vermittelten und den plcγ vermittelten Weg einschließen. Jeder dieser Wege kann eine kritische Rolle bei der angiogenen und/oder vaskulogenen Wirkung von KDR/FLK-1 in Endothelzellen spielen. Folglich betrifft ein noch weiterer Aspekt dieser Erfindung die Verwendung der hierin beschriebenen organischen Verbindungen für die Herstellung eines Arzneimittels, das die Angiogenese und Vaskulogenese moduliert, da diese Prozesse durch diese Wege kontrolliert werden.
Umgekehrt sind Störungen, die mit dem Zurückziehen, der Kontraktion oder dem Verschließen von Blutgefäßen zusammenhängen, wie zum Beispiel der Restenose, ebenfalls eingeschlossen und können durch die Verwendung der Verbindungen dieser Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels daraus behandelt oder verhindert werden.
Fibrotische Störungen betreffen die abnormale Bildung von extrazellulären Matrizes. Beispiele für fibrotische Störungen schließen die Leberzirrhose und proliferative Störungen mesangialer Zellen ein. Die Leberzirrhose ist durch die Zunahme an extrazellulären Matrixbestandteilen gekennzeichnet, die zur Bildung einer Lebernarbe führen. Eine gesteigerte extrazelluläre Matrix, die zu einer Lebernarbe führt, kann auch durch eine virale Infektion, wie zum Beispiel Hepatitis, verursacht werden. Lipocyten scheinen eine Hauptrolle bei der Leberzirrhose zu spielen. Andere fibrotische Störungen, die eingeschlossen sind, schließen Atherosklerose ein.
Proliferative Störungen mesangialer Zellen betreffen Störungen, die durch eine abnormale Proliferation von Mesangialzellen bewirkt werden. Proliferative Störungen mesangialer Zellen schließen verschiedene humane Nierenerkrankungen, wie zum Beispiel Glomerulonephritis, diabetische Nephropathie und maligne Nephrosklerose als auch solche Störungen, wie das thrombotische Mikroangiopathie-Syndrom, die Transplantatabstoßung und Glomerulopathien, ein. Die RTK PDGFR ist mit der Beibehaltung der Proliferation mesangialer Zellen in Verbindung gebracht worden. Floege et al., 1993, Kidney International 43: 47S–54S.
Viele Krebsarten sind proliferative Störungen mesangialer Zellen und, wie bereits vorher angemerkt, sind PK's mit proliferativen Störungen mesangialer Zellen in Verbindung gebracht worden. Daher ist es nicht verwunderlich, dass PK's, wie zum Beispiel Mitglieder der RTK-Familie, mit der Entwicklung von Krebs in Verbindung gebracht worden sind. Einige dieser Rezeptoren, wie zum Beispiel EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227–233, Torp et al., 1992, APMIS 100: 713–719), HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707–712) und PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7: 627–633) sind in vielen Tumoren überexprimiert und/oder durch autokrine Schleifen beharrlich aktiviert worden. Tatsächlich sind bei den üblichsten und schwerwiegendsten Krebsarten diese Rezeptorüberexpressionen (Akbasak und Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111: 119–133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249–273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352–1360) und autokrinen Schleifen (Lee und Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 118: 1057–1070, Korc et al., siehe oben, Akbasak und Suner-Akbasak et al., siehe oben) gezeigt worden. Zum Beispiel hat man EGFR mit dem glatten Epithelzellkarzinom, Astrocytom, Glioblastom, Kopf- und Halskrebs, Lungenkrebs und Blasenkrebs in Verbindung gebracht. HER2 ist mit Brust-, Ovarial-, Lungen-, Pankreas- und Blasenkrebs in Verbindung gebracht wurden. PDGFR ist mit Glioblastom und Melanom als auch Lungen-, Ovarial- und Prostatakrebs in Verbindung gebracht wurden. Die RTK c-met ist auch mit der malignen Tumorbildung in Verbindung gebracht worden. Zum Beispiel ist c-met mit, neben anderen Krebsarten, colorektalen, Thyroid-, Pankreas-, Magen- und hepatozellulären Karzinomen und Lymphomen in Verbindung gebracht worden. Zusätzlich steht c-met im direkten Zusammenhang mit Leukämie. Die Überexpression des c-met-Gens ist auch in Patienten mit der Hodgkin-Erkrankung und der Burkitt-Erkrankung detektiert worden.
IGF-IR ist, zusätzlich dazu, dass es mit der Nahrungsunterstützung und mit Typ II-Diabetes in Verbindung steht, auch mit zahlreichen Krebstypen in Zusammenhang gebracht worden. Zum Beispiel hat man IGF-I als einen autokrinen Wachstumsstimulator mit zahlreichen Tumortypen in Verbindung gebracht, z.B. menschliche Brustkrebskarzinomzellen (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418–1423) und kleinen Lungentumorzellen (Macauley et al., 1990, Cancer Res., 50: 2511–2517). Zusätzlich scheint IGF-I, obwohl wesentlich in das normale Wachstum und die Differenzierung des Nervensystems involviert, auch ein autokriner Stimulator menschlicher Gliome zu sein. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475–2478. Die Wichtigkeit von IGF-IR und seiner Liganden bei der Zellproliferation wird weiterhin durch die Tatsache unterstützt, dass viele Zelltypen in Kultur (Fibroblasten, Epithelzellen, glatte Muskelzellen, T-Lymphozyten, Myeloidzellen, Chondrocyten und Osteoblasten (die Stammzellen des Knochenmarks)) durch IGF-I zum Wachstum stimuliert werden. Goldring und Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1: 301–326. Baserga und Coppola behaupten, dass IGF-IR eine zentrale Rolle im Transformationsmechanismus spielt und als solcher ein bevorzugtes Ziel für therapeutische Interventionen für ein breites Spektrum an bösartigen Tumoren sein könnte. Baserga, 1995, Cancer Res., 55: 249–252, Baserga, 1994, Cell 79: 927–930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14: 4588–4595.
STK's sind mit vielen Krebstypen, einschließlich und im besonderen Maße mit Brustkrebs (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54: 571–77 (1993)) in Verbindung gebracht wurden.
Der Zusammenhang zwischen der abnormalen PK-Aktivität und einer Erkrankung ist nicht auf Krebs beschränkt. Zum Beispiel stehen RTK's mit Erkrankungen, wie zum Beispiel Psoriasis, Diabetes Mellitus, Endometriosis, Angiogenese, atheromatöser Beet-Entwicklung, der Alzheimer-Erkrankung, Restenose, von Hippel-Lindau-Erkrankung, epidermaler Hyperproliferation, neurodegenerativen Erkrankungen, beschleunigter Makuladegeneration und Hämangiomen in Verbindung. Zum Beispiel EGFR bei der kornealen und dermalen Wundheilung aufgeführt worden. Defekte beim Insulin-R und IGF-1R weisen auf den Typ II Diabetes Mellitus hin. Eine vollständigere Zuordnung zwischen spezifischen RTK's und ihren therapeutischen Indikationen ist von Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334–339 dargestellt worden.
Wie zuvor bereits erwähnt, sind nicht nur RTK's sondern auch CTK's, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr und yrk (zusammengefasst von Bolen et al., 1992, FASEB J., 6: 3403–3409) bei der Proliferation und in metabolischen Signaltransduktionsweg involviert, und man kann daher erwarten und es ist gezeigt worden, dass sie in vielen PTK vermittelten Störungen, auf die die vorliegende Erfindung gerichtet ist, involviert sind. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass mutiertes src (v-src) ein Onkoprotein (pp60^v-src) in Hühnern ist. Darüber hinaus überträgt sein zelluläres Homolog, das Proto-Onkogen pp60^c-src, onkogene Signale von vielen Rezeptoren. Die Überexpression von EGFR oder HER2/neu in Tumoren führt zur konstitutiven Aktivierung von pp60^c-src, das für maligne Zellen charakteristisch ist, jedoch in normalen Zellen nicht vorhanden ist. Auf der anderen Seite zeigen Mäuse, die keine Expression von c-src zeigen, einen osteopetrotischen Phänotyp, was auf eine wichtige Teilnahme von c-src bei der Osteoklastenfunktion und eine mögliche Beteilung an verwandten Störungen hindeutet.
Auf die gleiche Weise wird Zap70 mit der T-Zell-Signalgebung, die mit Autoimmunstörungen in Verbindung stehen könnte, in Verbindung gebracht.
STK's sind mit Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Immunantworten und hyperproliferativen Störungen, wie zum Beispiel Restenose, Fibrose, Psoriasis, Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis in Verbindung gebracht worden.
PK's werden auch mit der Embryoimplantation in Verbindung gebracht. Daher können die Verbindungen dieser Erfindung ein wirksames Verfahren für das Verhindern einer solchen Embryoimplantation bereitstellen und dadurch als Geburtskontrollagenzien nützlich sein. Zusätzliche Störungen, die mittels der Verbindungen dieser Erfindung behandelt oder verhindert werden können, sind immunologische Störungen, wie zum Beispiel eine Autoimmunerkrankung, AIDS und kardiovaskuläre Störungen, wie zum Beispiel Atherosklerose.
Zu guter Letzt vermutet man derzeit sowohl bei RTK's als auch bei CTK's, dass sie in Hyperimmunstörungen involviert sind.
Verabreichung und pharmazeutische Zusammensetzung
Eine Verbindung der vorliegenden Erfindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon kann als solches an einen menschlichen Patienten verabreicht werden oder kann in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in die die vorgenannten Materialien mit geeigneten Trägern oder einem Hilfsstoff(en) eingemischt werden, verabreicht werden. Techniken zur Formulierung und Verabreichung von Arzneimittel können bei „Remington's Pharmacological Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA., letzte Ausgabe, gefunden werden.
Wie hierin verwendet, betrifft „verabreichen" oder „Verabreichung" die Abgabe einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch geeigneten Salzes davon oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz davon enthält, diese Erfindung an einen Organismus zum Zwecke des Verhinderns oder Behandelns einer mit PK im Zusammenhang stehende Störung.
Geeignete Verabreichungswege, können, ohne Begrenzung, die orale, rektale, transmukosale, oder intestinale Verabreichung, oder die intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, direkt intraventrikuläre, intravenöse, intravitreale, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektion einschließen. Die bevorzugten Verabreichungswege sind der orale und der parenterale.
Alternativ dazu kann man die Verbindung eher noch auf lokale als auf systemische Art und Weise, zum Beispiel durch direkte Injektion der Verbindung in einen festen Tumor, häufig in einem Depot oder in einer Formulierung zur langsamen Freisetzung, verabreichen.
Darüber hinaus kann man das Arzneimittel in einem gezielten Arzneimittelabgabesystem, zum Beispiel in einem mit einem tumorspezifischen Antikörper beschichtetem Liposom, verabreichen. Die Liposomen werden auf den Tumor gerichtet sein und vom Tumor selektiv aufgenommen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren, z.B. mittels konventioneller Misch-, Auflösungs-, Granulations-, Drageeherstellungs-, Verreibungs-, Emulsifikations-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren, hergestellt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können auf konventionelle Art und Weise mittels eines oder mehrerer physiologisch geeigneter Träger, die Hilfsstoffe und Zusatzstoffe umfassen, die das Verarbeiten der aktiven Verbindungen in Zusammensetzungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern, formuliert werden. Die geeignete Formulierung hängt vom gewählten Verabreichungsweg ab.
Für die Injektion können die Verbindungen der Erfindung in wässrigen Lösungen, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffern, wie zum Beispiel Hanks'-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung formuliert werden. Für die transmukosale Verabreichung können für die zu durchdringende Barriere geeignete Eindringmittel in der Formulierung verwendet werden. Solche Eindringmittel sind im Stand der Technik normalerweise gut bekannt.
Für die orale Verabreichung können die Verbindungen durch das Kombinieren der aktiven Verbindungen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, die im Stand der Technik gut bekannt sind, formuliert werden. Solche Träger erlauben es, die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Pastillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirup, Brei, Suspensionen und ähnliches für die orale Nahrungsaufnahme durch einen Patienten zu formulieren. Pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung können mittels eines festen Hilfsstoffs, ggf. Zermahlen der sich ergebenen Mischung und Verarbeiten der Granulamischung nachdem andere geeignete Zusatzstoffe, falls gewünscht, zugegeben wurden, hergestellt werden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Verwendbare Hilfsstoffe sind besonders Füllmittel, wie zum Beispiel Zucker, einschließlich Lactose, Sucrose, Manitol oder Sorbitol, Zellulose-Zubereitungen, wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke und Kartoffelstärke, und andere Materialien, wie zum Beispiel Gelatine, Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht können sich auflösende Agenzien zugegeben werden, wie zum Beispiel quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar oder Alginsäure. Ein Salz, wie zum Beispiel Natriumalginat, kann ebenfalls verwendet werden.
Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die ggf. Gummiarabikum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol, und/oder Titandioxid, Lacklösungen, und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Färbemittel oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifikation oder zum Adressieren verschiedener Kombinationen von aktiven Verbindungsdosen zugegeben werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die oral verwendet werden können, schließen Push-fit-Kapseln, die aus Gelatine hergestellt werden, als auch weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie zum Beispiel Glycerol oder Sorbitol, gemacht werden, ein. Die Push-fit-Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffe als Zusatz zu einem Füllmittel, wie zum Beispiel Lactose, einem Bindemittel, wie zum Beispiel Stärke, und/oder einem Gleitmittel, wie zum Beispiel Talk oder Magnesiumstearat und ggf. Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel fettigen Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen gelöst oder suspendiert werden. Stabilisatoren können diesen Formulierungen ebenfalls zugegeben werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die ebenfalls verwendet werden können, schließen harte Gelatinekapseln ein. Als nicht begrenzendes Beispiel kann die aktive Verbindungskapsel als orale Arzneimittelproduktformulierung eine Dosisstärke von 50 und 200 mg aufweisen. Die beiden Dosisstärken werden aus den gleichen Granula durch Einführen in unterschiedlich große harte Gelatinekapseln der Größe 3 für die 50 mg Kapsel und der Größe 0 für die 200 mg Kapsel hergestellt. Die Zusammensetzung der Formulierung könnte zum Beispiel so aussehen, wie in Tabelle 2 dargestellt.
TABELLE 2
Die Kapseln können in braunem Glas oder in Kunststoffflaschen verpackt sein, um die aktive Verbindung vor dem Licht zu schützen. Die Behälter, die die Kapsel mit der aktiven Verbindungsformulierung enthalten, müssen bei geregelter Raumtemperatur (15–30°C) gelagert werden.
Für die Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung auf geeignete Weise in Form eines Aerosol-Sprays mittels eines unter Druck stehenden Behälters oder eines Zerstäubers und eines geeigneten Treibmittels, z.B., ohne Begrenzung, Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan oder Kohlendioxid, zugeführt. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosiseinheit durch das Bereitstellen eines Ventils zur Abgabe einer abgemessenen Menge geregelt werden. Kapseln und Patronen aus, zum Beispiel, Gelatine für die Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert werden, dass sie eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis, wie zum Beispiel Lactose oder Stärke, enthalten.
Die Verbindungen können auch für die parenterale Verabreichung, z.B. durch Bolus-Injektion oder fortwährende Infusion, formuliert werden. Formulierungen für die Injektion können in Dosiseinheitsform, zum Beispiel in Ampullen oder in Multi-Dosis-Behältern, mit einem zusätzlichen Konservierungsmittel dargeboten werden. Die Zusammensetzungen können solche Formeln als Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern aufnehmen und können Formulierungsmaterialien, wie zum Beispiel Suspensions-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsagenzien, enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässrige Lösung in einer wasserlöslichen Form, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, ein Salz, der aktiven Verbindung ein. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen in einem lipophilen Vehikel hergestellt werden. Geeignete lipophile Vehikel schließen fettige Öle, wie zum Beispiel Sesamöl, synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat und Triglyceride, oder Materialien, wie zum Beispiel Liposomen, ein. Wässrige Suspensionen für die Injektion können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylzellulose, Sorbitol oder Dextran. Wahlweise kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren und/oder Agenzien enthalten, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von stark konzentrierten Lösungen zu ermöglichen.
Alternativ dazu kann der aktive Inhaltsstoff für die Anordnung mit einem geeigneten Vehikel, z.B. steriles, pyrogenfreies Wasser, vor der Verwendung in Pulverform vorliegen.
Die Verbindungen können auch als rektale Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Suppositorien oder Retentionseinläufe, mittels, z.B., konventioneller Suppositoriumbasen, wie zum Beispiel Kakaobutter oder andere Glyceride, formuliert werden.
Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotzubereitungen formuliert werden. Solche lang wirkenden Formulierungen können durch Implantation (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Eine Verbindung dieser Erfindung kann für diesen Verabreichungsweg mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien (zum Beispiel in einer Emulsion mit einem pharmakologisch geeigneten Öl), mit Ionenaustauschharzen oder als schwer lösliches Derivat, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, ein schwer lösliches Salz, formuliert werden.
Ein nicht zur Begrenzung gedachtes Beispiel eines pharmazeutischen Trägers für die hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Verschnittmittelsystem (cosolvent system), das Benzylalkohol, einen unpolaren oberflächenaktiven Stoff, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase, wie zum Beispiel das VPD Co-Solvent-System, umfasst. VPD ist eine Lösung aus 3% w/v Benzylalkohol, 8% w/v des unpolaren oberflächenaktiven Stoffes Polysorbat 80 und 65% w/v Polyethylenglycol 300, das mit absoluten Ethanol auf das Endvolumen aufgefüllt wird. Das VPD Co-Solvent-System (VPD:D5W) besteht aus VPD, das mit einer 5% Dextrose in Wasser-Lösung auf 1:1 verdünnt wird. Dieses Co-Solvent-System löst hydrophobe Verbindungen gut auf und entwickelt selber nach der systemischen Verabreichung eine geringe Toxizität. Natürlich können die Verhältnisse eines solchen Co-Solvent-Systems beträchtlich variiert werden, ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätscharakteristika zu zerstören. Darüber hinaus kann die Identität der Co-Solvent-Komponenten variiert werden: Zum Beispiel können andere gering toxische, unpolare oberflächenaktive Stoffe anstelle von Polysorbat 80 verwendet werden, die Fraktionsgröße des Polyethylenglycols kann variiert werden, andere biokompatible Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, z.B. Polyvinylpyrrolidon, und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
Alternativ dazu können andere Abgabesystem für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele für Abgabevehikel oder Träger von hydrophoben Arzneimitteln. Zusätzlich können auch bestimmte organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid, verwendet werden, obwohl häufig auf Kosten einer höheren Toxizität.
Zusätzlich können die Verbindungen mittels eines verzögerten Freisetzungs-Systems, wie zum Beispiel semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die das therapeutische Agens enthalten, zugeführt werden. Verschiedene Materialien zur verzögerten Freisetzung sind etabliert worden und sind dem Fachmann gut bekannt. Kapseln zur verzögerten Freisetzung können, abhängig von ihrer chemischen Natur die Verbindungen für ein paar Wochen bis zu über 100 Tagen freisetzen. Abhängig von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagenzes, können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung angewendet werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen hierin können auch geeignete Feste oder Gelphasenträger oder Hilfsstoffe umfassen. Beispiele für solche Träger oder Hilfsstoffe schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Zellulosederivate, Gelatine und Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglycole.
Viele der PK-modulierenden Verbindungen der Erfindung können als physiologisch annehmbare Salze bereitgestellt werden, wobei die beanspruchte Verbindung die negativ oder positiv geladenen Spezies bilden kann. Beispiele für Salze, in denen die Verbindung den positiv geladenen Rest bildet, schließen, ohne Begrenzung, quaternäres Ammonium (an anderer Stelle hierin definiert), Salze, wie zum Beispiel das Hydrochlorid, Sulfat, Carbonat, Lactat, Tartart, Malat, Maleat, Succinat, ein, wobei das Stickstoffatom der quaternären Ammonium-Gruppe ein Stickstoff der ausgewählten Verbindung dieser Erfindung ist, die mit der geeigneten Säure reagiert hat. Salze, in denen eine Verbindung dieser Erfindung die negativ geladene Spezies bildet, schließen, ohne Begrenzung, die Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze ein, die durch die Reaktion einer Carbonsäure-Gruppe in der Verbindung mit einer geeigneten Base (z.B. Natriumhydroxid (NaOH), Kaliumhydroxid (KOH), Calciumhydroxid (Ca(OH)₂), etc.) gebildet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Zusammensetzungen ein, in denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer Menge enthalten sind, die ausreichend ist, um den beabsichtigten Zweck, z.B. die Modulation der PK- Aktivität oder der Behandlung oder das Verhindern einer mit PK zusammenhängenden Störung, enthalten sind.
Eine therapeutisch wirksame Menge bedeutet ganz besonders eine Menge einer Verbindung, die die Symptome einer Erkrankung verhindern, sie lindern oder besser werden lässt, oder das Überleben des zu behandelnden Subjektes verlängert.
Das Bestimmen einer therapeutisch wirksamen Menge liegt im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns, besonders im Hinblick auf die hierin bereitgestellte detaillierte Offenbarung.
Für jede Verbindung, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Menge oder Dosis am Anfang aus Zellkulturassays abgeschätzt werden. Dann kann die Dosis für die Verwendung in Tiermodellen formuliert werden, um einen Konzentrationsbereich im Kreislauf zu erhalten, der den in Zellkultur bestimmten IC₅₀ einschließt (d.h. die Konzentration der Testverbindung, die die Hälfte der maximalen Inhibierung der PK-Aktivität erzielt). Solche Informationen können dann verwendet werden, um eine verwendbare Dosierung in Menschen genauer bestimmen zu können.
Die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit der hierin beschriebenen Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren, z.B., durch Bestimmen des IC₅₀ und des LD₅₀ (beide werden an anderer Stelle hierin diskutiert) für eine betreffende Verbindung bestimmt werden. Die Daten, die von diesen Zellkulturassays und Tierstudien erhalten werden, können zur Formulierung eines Dosisbereiches für die Verwendung in Menschen verwendet werden. Die Dosierung kann abhängig von der angewandten Dosierung und dem verwendeten Verabreichungsweg variiert werden. Die genaue Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosis kann durch den einzelnen Arzt in Hinblick auf den Zustand des Patienten ausgewählt werden. (Siehe z.B., Fingl, et al., 1975, in „The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kap. 1, S. 1).
Die Dosierungsmenge und das Intervall können individuell angepasst werden, um die Plasmaniveaus der aktiven Spezies bereitzustellen, die ausreichend sind, um die Kinasemodulierenden Wirkungen zu erhalten. Diese Plasmaniveaus werden als minimal wirksame Konzentrationen (MEC's) bezeichnet. Die MEC werden für jede Verbindung variieren, können jedoch aus in vitro Daten abgeschätzt werden, z.B. kann die Konzentration, die erforderlich ist, um 50–90% Inhibierung bei einer Kinase zu erzielen mittels des hierin beschriebenen Assays bestimmt werden. Dosierungen, die für das Erzielen der MEC notwendig sind, werden von individuellen Charakteristika und dem Verabreichungsweg abhängen. HPLC-Assays oder Bioassays können verwendet werden, um die Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
Dosierungsintervalle können ebenfalls mittels des MEC-Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung eines Systems verabreicht werden, dass die Plasmaniveaus für 10–90% der Zeit, bevorzugt zwischen 30–90% und am meisten bevorzugt zwischen 50–90% über dem MEC hält.
Zurzeit können die therapeutisch wirksamen Mengen der Verbindungen der Formel I, Ia oder II von etwa 25 mg/m² bis 1500 mg/m² pro Tag, bevorzugt etwa 3 mg/m²/Tag variieren. Noch bevorzugter von 50 mg/qm qd bis 400 mg/qd.
Im Falle der lokalen Verabreichung oder der selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale Konzentration des Arzneimittels nicht mit der Plasmakonzentration in Verbindung gebracht werden und andere im Stand der Technik bekannte Verfahren können angewendet werden, um die korrekte Dosierungsmenge und das Intervall zu bestimmen.
Die Menge einer verabreichten Zusammensetzung wird natürlich vom zu behandelnden Subjekt, der Schwere der Krankheit, der Art und Weise der Verabreichung, des Urteils des verschreibenden Arztes, etc. abhängen.
Die Zusammensetzungen können, falls erwünscht, in einem Paket oder einer Dispenservorrichtung, wie zum Beispiel einem durch das FDA anerkannten Kit, das eine oder mehrere Dosiseinheitsformen, die den aktiven Inhaltsstoff enthalten, enthalten können, dargeboten werden. Das Paket kann zum Beispiel eine Metall- oder Kunststofffolie, wie zum Beispiel eine Blisterpackung, umfassen. Dem Paket oder der Dispenservorrichtung können Instruktionen zur Verabreichung beiliegen.
Dem Paket oder dem Dispenser kann auch eine Notiz beiliegen, die mit dem Behälter in einer Form zusammenliegt, die durch eine Regierungsorganisation, die die Herstellung, Verwendung oder den Verkauf von Arzneimitteln reguliert, vorgeschrieben wird, wobei die Notiz die Zulassung durch die Organisation, die Form der Zusammensetzungen, oder ob zur menschlichen oder veterinären Verabreichung widerspiegelt. Eine solche Notiz kann zum Beispiel ein Schild sein, genehmigt durch die U.S. Food and Drug Administration für verschreibungspflichtige Arzneimittel oder eines genehmigten Produktinserts. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung umfassen, die in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger formuliert wurden, können ebenfalls hergestellt werden, in einem geeigneten Behälter angeordnet werden und für die Behandlung eines angegebenen Zustandes ausgezeichnet werden. Geeignete Zustände auf die auf dem Schild hingewiesen wird, können die Behandlung eines Tumors, die Inhibition der Angiogenese, die Behandlung der Fibrose, Diabetes und ähnliches einschließen.
Die vorliegende Erfindung kann mit einem CMC-Suspensionsvehikel verabreicht werden. Eine beispielhafte CMC-Suspension ist unten in Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3

* abhängig von der erforderlichen Konzentration (Datum)

Ein Protokoll für 1,0 l des CMC-Suspensionsvehikels sieht wie folgt aus. Man berechne die geeignete Menge an Hilfsstoffen, die für das Herstellen der Vehikelformulierung erforderlich sind, unter Verwendung der Tabelle, die die Zusammensetzung der Vehikelformulierung und der Batch-Größe zeigt. Man wiege einen geeigneten leeren Behälter, wie zum Beispiel eine saubere weithalsige Glasflasche oder eine Polyethylenflasche, ab. Man gebe etwa 600 ml Wasser in den Behälter. Man wiege Carboxymethylzellulose-Natrium (5 g) ab und übertrage sie in den Behälter. Man rühre mittels eines magnetischen Rührfisches oder eines Laborrührers mit Propeller bis zur Homogenität (etwa 2–3 Stunden). Man wiege NaCl ab und gebe in den Behälter. Man setze das Mischen fort bis es aufgelöst ist (etwa 10 min). Man gebe Polysorbat-80 zu. Mische bis die Lösung homogen ist (etwa 20 min). Man gebe Benzylalkohol zu. Mische bis die Lösung homogen ist (etwa 10 min). Man gebe das verbleibende Wasser zu, um das Gewicht der Lösung auf die erforderliche Batch-Größe zu bringen, entweder nach Gewicht oder Volumen (1010 g oder 1000 ml, Dichte bei 22°C ist 1,01). Man lagere sie bei 2–8°C (unter Kühlung).
Die Suspensionsformulierung kann wie folgt hergestellt werden. Man zerreibe die API mittels eines Mörsers und eines Pistills, um ein homogen aussehendes Pulver mit kleiner Teilchengröße (keine großen Stücke oder große Teilchen – idealer weise sollte es durch ein US-Standardsieb > 80, d.h. < 180 μm Größe passen) zu erhalten. Man wiege die berechnete Menge an API in den Behälter. Man gebe etwa 90% der insgesamt erforderlichen Menge an (CMC-Suspensionsvehikel) in den Behälter. Man suspendiere die Verbindungen mittels eines Laborrührers mit Propeller oder einem Äquivalent in das Vehikel. Der Durchmesser der Propellerblätter sollte dem Durchmesser des Bodens des Behälters entsprechen, um ein effizientes Vermischen sicherzustellen. Man rühre bei 50 rpm für 30 min oder bis das Arzneimittel gut suspendiert ist. Man gebe die Vehikelformulierung bis „qs" zu (mit Wasser auffüllen) (Qualität ausreichend (quality sufficient)), bis zum geeigneten Gewicht entsprechend der Batch-Größe. Man rühre bei 50 rpm für zusätzliche 30 min und aliquotiere die Suspension sofort in Bernsteinfarben gefärbtes Glas oder in Polypropylenbehälter. Die Behälter sollten vor dem Licht geschützt werden. Man rühre bei 2–8°C (unter Kühlung, nicht einfrieren).
Es ist auch ein Aspekt dieser Erfindung, dass eine hierin beschriebene Verbindung oder ihr Salz oder Arzneimittelvorstufe mit anderen chemotherapeutischen Agenzien für die Behandlung von weiter oben diskutierten Erkrankungen und Störungen kombiniert werden kann. Zum Beispiel kann eine Verbindung, ein Salz oder eine Arzneimittelvorstufe dieser Erfindung mit alkylierenden Agenzien, wie zum Beispiel Fluoruracil (5-FU) alleine oder in weiterer Kombination mit Leukovorin, oder anderen alkylierenden Agenzien, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, andere Pyrimidinanaloga, wie zum Beispiel UFT, Capecitabin, Gemcitabin und Cytarabin, den Alkylsulfonaten, z.B. Busulfan (wird bei der Behandlung von chronischer granulocytärer Leukämie verwendet), Improsulfan und Piposulfan; Aziridine, z.B. Benzodepa, Carboquone, Meturedepa und Uredepa; Ethyleniminen and Methylmelaminen, z.B. Altretamin, Triethylenmelamin, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid und Trimethylolmelamin; und den Stickstoff-Lost, z.B., Chlorambucil (wird zur Behandlung von chronischer lymphocytischer Leukämie, primärer Makroglobulinämie und Non-Hodgkin-Lymphom verwendet), Cyclophosphamid (wird zur Behandlung der Hodgkin-Erkrankung, eines multiplen Myeloms, eines Neuroblastom, von Brustkrebs, Ovarialkrebs, Lungenkrebs, Wilm's-Tumor und Rhabdomyosarkom verwendet), Estramustin, Ifosfamid, Novembrichin, Prednimustin und Uracil-Lost (wird zur Behandlung von primärer Thrombocytose, Non-Hodgkin-Lymphom, Hodgkin-Erkrankung und Ovarialkrebs verwendet), und Triazine, z.B. Dacarbazin (wird bei der Behandlung eines Weichgewebesarkoms verwendet), kombiniert werden.
Eine Verbindung, ein Salz oder eine Arzneimittelvorstufe dieser Erfindung kann auch in Kombination mit anderen antimetabolischen chemotherapeutischen Agenzien, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, Folsäureanaloga, z.B. Methotrexat (wird bei der Behandlung von akuter lymphocytischer Leukämie, Choriokarzinom, Mykose-Brustkrebs, Kopf- und Halskrebs und osteogenem Sarkom verwendet) und Pteropterin; und den Purinanaloga, wie zum Beispiel Mercaptopurin und Thioguanin, die eine Verwendung bei der Behandlung von akuter granulocytärer, akuter lymphocytischer und chronisch granulocytärer Leukämie finden, verwendet werden.
Es wird in Erwägung gezogen, dass eine Verbindung, ein Salz oder eine Arzneimittelvorstufe dieser Erfindung auch in Kombination mit auf natürlichen Produkten basierenden chemotherapeutischen Agenzien, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, Vinca-rosea-Alkaloide, z.B. Vinblastin (wird bei der Behandlung von Brust- und Hodenkrebs verwendet), Vincristin und Videsin; den Epipodophylotoxinen, z.B. Etoposid und Teniposid, beide sind bei der Behandlung von Hodenkrebs und Kaposi-Sarkom verwendbar; die antibiotischen, chemotherapeutischen Agenzien, z.B. Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Mitomycin (wird zum Behandeln von Magen-, Cervix-, Dickdarm-, Brust-, Blasen- und Pankreaskrebs verwendet), Dactinomycin, Temozolomid, Plicamycin, Bleomycin (wird bei der Behandlung von Haut-, Speiseröhren- und Urugenitaltraktkrebs verwendet); und den enzymatischen, chemotherapeutischen Agenzien, wie zum Beispiel L-Asparaginase, verwendet werden kann.
Zusätzlich zum oben genannten, könnte eine Verbindung, ein Salz oder eine Arzneimittelvorstufe dieser Erfindung auch in Kombination mit Platin koordinierten Komplexen (Cisplatin, etc.), substituierten Harnstoffe, wie zum Beispiel Hydroxyharnstoff; Methylhydrazinderivaten, z.B., Procarbazin; Adrenokortikal-Suppressoren, z.B., Mitotan, Aminoglutethimid; und einem Hormon und Hormonantagonisten, wie zum Beispiel dem Adrenocorticosteriod (z.B., Prednison), Progestine (z.B. Hydroxyprogesteroncaproat), Östrogene (z.B. Diethylstilbesterol), Antiöstrogene, wie zum Beispiel Tamoxifen; Androgene, z.B. Testosteronpropionat; und Aromataseinhibitoren, wie zum Beispiel Anastrozol, verwendet werden.
Es wird letztlich auch in Erwägung gezogen, dass die Kombination einer Verbindung dieser Erfindung mit Mitoxantron, Paclitaxel, Cyclooxygenase-2-Inhibitoren, die im Stand der Technik bekannt sind, besonders Celebrex^®, Paracoxib^®, Vioxx^®, Abbott's Cox-189, das in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/11605 offenbart ist, Topoiosmeraseinhibitoren, wie zum Beispiel Camptosar^®, einem Her-2-Rezeptorantagonisten, wie zum Beispiel Herceptin^®, Endostatin, Gleevac^®, einem ImClone VEGF-Rezeptorantagonisten IMC C225^® für die Behandlung von festen Tumoren oder Leukämien, wie zum Beispiel, ohne Begrenzung, akuter myelogener (nicht-lymphocytischer) Leukämie, wirksam sein wird.
Allgemeines Syntheseverfahren
Die folgende allgemeine Methodik kann angewendet werden, um die Verbindungen dieser Erfindung herzustellen:
Das entsprechend substituierte 2-Oxindol (1 Äquiv.), das entsprechend substituierte 3-Carboxy-5-formylpyrrol (1,2 Äquiv.) und eine Base (0,1 Äquiv.) werden in einem Lösungsmittel (1–2 ml/mmol 2-Oxindol) zusammengemischt, und die Mischung wird dann von etwa 2 bis etwa 12 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Präzipitat, das sich bildet, gefiltert, mit kaltem Ethanol oder Ether gewaschen und vakuumgetrocknet, um das entsprechende 5-(2-Oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl)-1-H-pyrrol-3-carbonsäure zu bekommen. Wenn sich kein Präzipitat bildet, wird die Reaktionsmischung auf konzentriert und der Rest wird mit Dichlormethan/Ether zerrieben, der sich daraus ergebende Feststoff wird durch Filtration gesammelt und dann getrocknet. Das Produkt kann wahlweise durch Chromatographie weiter gereinigt werden.
Die Base kann eine organische oder anorganische Base sein. Wenn eine organische Base verwendet wird, ist es bevorzugt eine Stickstoffbase. Beispiele für organische Stickstoffbasen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Diisopropylamin, Trimethylamin, Triethylamin, Anilin, Pyridine, 1,8-Diazabicyclo[5.4.1]undec-7-en, Pyrrolidin und Piperidin.
Beispiele für anorganische Basen sind, ohne Begrenzung, Ammoniak, Alkalimetall oder Erdalkalihydroxide, Phosphate, Carbonate, Bicarbonate, Bisulfate und Amide. Die Alkalimetalle schließen Lithium, Natrium und Kalium ein, während die Erdalkalien, Calcium, Magnesium und Barium einschließen.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist, wenn das Lösungsmittel ein protisches Lösungsmittel ist, wie zum Beispiel Wasser oder Alkohol, die Base ein Alkalimetall oder eine anorganische Erdalkalibase, bevorzugt ein Alkalimetall oder ein Erdalkalihydroxid.
Für den Fachmann wird deutlich sein, welche Base, basierend sowohl auf den bekannten allgemeinen Prinzipien der organischen Synthese als auch den Offenbarungen hierin, für die eingehend betrachtete Reaktion die geeignetste sein würde.
Das Lösungsmittel, in dem die Reaktion durchgeführt wird, kann ein protisches oder ein aprotisches Lösungsmittel sein, bevorzugt ist es ein protisches Lösungsmittel. Ein „protisches Lösungsmittel" ist ein Lösungsmittel, das ein Wasserstoffatom(e) aufweist, das/die kovalent an Sauerstoff- oder Stickstoffatome gebunden ist/sind, die die Wasserstoffatome zusehends sauer machen und daher in die Lage versetzen, mit einer gelösten Substanz durch Wasserstoffbrückenbindung „geteilt zu werden". Beispiele für protische Lösungsmittel schließen, ohne Begrenzung, Wasser und Alkohol ein.
Ein „aprotisches Lösungsmittel" kann polar oder nichtpolar sein, enthält jedoch in beiden Fällen keine sauren Wasserstoffe und kann daher keine Wasserstoffbrückenbindung mit gelösten Substanzen eingehen. Beispiele, ohne Begrenzung, von nichtpolaren aprotischen Lösungsmitteln sind Pentan, Hexan, Benzen, Toluen, Methylenchlorid und Kohlenstofftetrachlorid. Beispiele für polare aprotische Lösungsmittel sind Chloroform, Tetrahydrofuran, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid.
In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Lösungsmittel ein protisches Lösungsmittel, bevorzugt Wasser oder ein Alkohol, wie zum Beispiel Ethanol.
Die Reaktion wird bei einer Temperatur von größer als Raumtemperatur durchgeführt. Die Temperatur liegt im Allgemeinen bei etwa 30°C bis etwa 150°C, bevorzugt bei etwa 80°C bis etwa 100°C, am meisten bevorzugt etwa 60°C bis etwa 85°C, was über dem Siedepunkt von Ethanol liegt. Mit „etwa" ist gemeint, dass der Temperaturbereich bevorzugt innerhalb von 10 Grad Celsius zur angegebenen Temperatur, noch bevorzugter innerhalb von 5 Grad Celsius zur angegebenen Temperatur und am meisten bevorzugt innerhalb von 2 Grad Celsius zur angegebenen Temperatur liegt. Daher ist zum Beispiel mit „etwa 75°C" 75°C ± 10°C, bevorzugt 75°C ± 5°C und am meisten bevorzugt 75°C ± 2°C gemeint.
2-Oxindole und 3-Carboxy-5-formylpyrrol kann einfach mittels im Stand der chemischen Technik gut bekannter Verfahren unter Verwendung von einfach erhältlichen Ausgangsmaterialien synthetisiert werden.
Das Verkuppeln einer 5-(2-Oxo-1,2-dihydroindol-(3Z)-ylidenmethyl)-1-H-pyrrol-3-carbonsäure mit einem Amin der Formel ZCH(R⁵)-CR⁴(OH)-CHR³NH₂ in einem organischen Lösungsmittel, wie zum Beispiel Dimethylformamid, Tetrahydrofuran und ähnlichen und in Gegenwart eines geeigneten Verkopplungsagens, wie zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid, DEAD, EDC und HOBt, stellt dann eine Verbindung der Formel (I) bereit. Amine der Formel ZCH(R⁵)- CR⁴(OH)-CHR³NH₂ sind kommerziell erhältlich oder sie können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Einige solcher Prozeduren werden hierin weiter unten beschrieben.
Der Fachmann wird erkennen, dass andere synthetische Wege zum Bilden der Verbindungen der Erfindung verfügbar sind und dass das nachfolgende als Beispiel und nicht zur Begrenzung dargeboten wird.
BEISPIELE
Die folgenden Zubereitungen und Beispiele werden dargelegt, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, die vorliegende Erfindung einfacher zu verstehen und auszuführen. Sie sollten. nicht zur Begrenzung der Erfindung angesehen werden, sondern lediglich zur Illustration und Darstellung davon.
Synthesebeispiele
Beispiel 1
Synthese von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure
Schritt 1
Dimethylformamid (25 ml, 3 Äq.) wurde unter Rühren in einem Eisbad abgekühlt. Dazu wurde POCl₃ (1,1 Äq., 10,8 ml) gegeben. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung aus 3,5-Dimethyl-4-ethylesterpyrrol (17,7 g, 105,8 mmol) in DMF (2 M, 40 ml) zum Reaktionsansatz gegeben und das Rühren fortgesetzt. Nach 2 Stunden wurde der Reaktionsansatz mit Wasser (250 ml) verdünnt und mit 1 N wässriger NaOH auf pH = 11 basisch eingestellt. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration entfernt, mit Wasser und dann Hexanen gewaschen und getrocknet, um 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3- carbonsäureethylester (19,75 g, 95%) als einen gelbbraunen Feststoff hervorzubringen. ¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,11 (br s, 1H, NH), 9,59 (s, 1H, CHO), 4,17 (q, J = 6,7 Hz, 2H, OCH ₂CH₃), 2,44 (s, 3H, CH ₃), 2,40 (s, 3H, CH ₃), 1,26 (d, J = 6,7 Hz, 3H, OCH₂CH ₃).
Schritt 2
5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester (2 g, 10 mmol) wurde zu einer Lösung aus Kaliumhydroxyd (3 g, 53 mmol), die in Methanol (3 ml) und Wasser (10 ml) aufgelöst wurde, gegeben. Man ließ die Mischung für 3 Stunden refluxieren, auf Raumtemperatur abkühlen und säuerte sie mit 6 N Salzsäure auf pH 3 an. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet, um 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (1,6 g, 93%) zu erhalten. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).
Schritt 3
5-Fluorisatin (8,2 g, 49,7 mmol) wurde in 50 ml Hydrazinhydrat gelöst und für 1 Stunde refluxiert. Die Reaktionsmischungen wurden dann in Eiswasser gegossen. Das Präzipitat wurde dann gefiltert, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, um 5-Fluor-2-oxindol (7,5 g) zu erhalten.
Schritt 4
Die Reaktionsmischung aus 5-Fluoroxindol (100 mg, 0,66 mmol), 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (133 mg, 0,79 mmol) und 10 Tropfen Piperidin in Ethanol (3 ml) wurde bei 60°C über Nacht gerührt und gefiltert. Der Feststoff wurde mit 1 M wässriger Hydrochloridlösung und Wasser gewaschen und getrocknet, um 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (201 mg, quantitativ) als einen gelben Feststoff, zu erhalten. MS m/z (relative Intensität, %) 299 ([M – 1]⁺, 100).
Beispiel 2
Synthese von 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-Diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amid
Schritt 1
Zu 2-Chlormethyloxiran (95 g, 1,03 mol) wurde bei 30°C eine Mischung aus Wasser (3,08 g, 0,17 mol) und Diethylamin (106,2 ml, 1,03 mol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann bei 28–35°C für 6 Stunden gerührt und auf 20–25°C abgekühlt, um 1-Chlor-3-diethylamino-propan-2-ol zu erhalten.
Schritt 2
Zu einer Lösung aus Natriumhydroxid (47,9 g, 1,2 mol) in 78 ml Wasser wurde 1-Chlor-3-diethylamino-propan-2-ol gegeben. Das Endprodukt daraus wurde bei 20–25°C für 1 Stunde gerührt, mit 178 ml Wasser verdünnt und zweimal mit Ether extrahiert. Die kombinierte Etherlösung wurde mit festem Kaliumhydroxid getrocknet und verdampft, um 135 g des Rohproduktes zu erhalten, das durch fraktionierte Destillation gereinigt wurde, um reines Glycidyldiethylamin (98 g, 76%) als Öl zu erhalten.
Schritt 3
Zur eiskalten Lösung aus Ammoniumhydroxid (25 ml, 159 mmol) aus 25% (w/w) wurde Glycidyldiethylamin tropfenweise (3,2 g, 24,8 mmol) über 10 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 0–5°C für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 14 Stunden gerührt. Die sich daraus ergebende Reaktionsmischung wurde verdampft und destilliert (84–90°C bei 500–600 mT), um 1-Amino-3-diethylamino-propan-2-ol (3,3 g, 92%) zu erhalten. MS m/z 147 ([M + 1]⁺).
Schritt 4
Zur Lösung aus 5-Formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (100 mg, 0,43 mmol), EDC (122,7 mg, 0,64 mmol) und HOBt (86,5 mg, 0,64 mmol) in 1,0 ml DMF wurden 1-Amino-3-diethylamino-propan-2-ol (93,2 mg, 0,64 mmol) gegeben. Die sich daraus ergebende Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und verdampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Wasser suspendiert und filtriert. Der Feststoff wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen Übernacht getrocknet, um das Rohprodukt zu erhalten, das mittels Säulenchromatographie, wobei es mit 6% Methanol-Dichlormethan, das Triethylamin (2 Tropfen/100 ml an 6% Methanol-Dichlormethan) enthält, eluiert wurde, gereinigt wurde, um 5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amid (62 mg, 34%) als einen gelben Feststoff zu erhalten. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13,70 (s, 1H, NH-1'), 10,90 (s, 1H, NH-1), 7,76 (dd, J = 2,38, 9,33 Hz, 1H, H-4), 7,72 (s, 1H, vinyl-H), 7,60 (m, br., 1H, CONHCH₂CH(OH)CH₂N(C₂H₅)₂-4'), 6,93 (dt, J = 2,38, 8,99 Hz, 1H, H-5), 6,85 (dd, J = 4,55, 8,99 Hz, 1H, H-6), 3,83 (m, br, 1H, OH), 3,33 (m, 4H), 2,67 (m, br, 5H), 2,46 (s, 3H, CH₃), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,04 (m, br, 6H, CH₃ × 2). MS m/z (relative Intensität, %) 427 ([M + 1]⁺, 100).
Beispiel 3
Synthese von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid
Schritt 1
Eine Mischung aus Morpholin (2,6 ml, 30 mmol) und Epichlorhydrin (2,35 ml, 30 mmol) in Ethanol (50 ml) wurde Übernacht bei 70°C gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rückstand mit Methylenchlorid (50 ml) verdünnt. Der klare präzipitierte Feststoff wurde durch Vakuumfiltration gesammelt, um 1-Chlor-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 37%) zu erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 3,49 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,60 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 3,75 (m, 4H, 2 × CH₂), 4,20 (dd, J = 5,2, 12 Hz, 2H), 4,54 (m, 2H), 4,62 (m, 1H, CH), 6,64 (d, J = 6,4 Hz, 1H, OH). MS (m/z) 180,2 (M + 1).
Schritt 2
1-Chlor-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 11 mmol) wurde mit der Lösung aus NH₃ in Methanol (25 Gew.-%, 20 ml) bei Raumtemperatur behandelt. Stickstoff wurde in die Reaktionsmischung bombiert, um den Ammoniak zu entfernen. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab das Hydrogenchloridsalz 1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (2,0 g, 91%). ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,30 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 2,36 (m, 4H, NCH₂), 2,65 (dd, J = 8,4, 12,8 Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 3,6, 12,8 Hz, 1H), 3,52 (m, 4H, OCH₂), 3,87 (m, 1H, CH), 5,32 (s, 1H, OH), 8,02 (brs., 3H, NH₃ ⁺). MS (m/z) 161,1 (M + 1).
Schritt 3
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (120 mg, 0,4 mmol) wurde mit 1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (74 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid (65 mg, 36%) zu präzipitieren. Die Ursprungsflüssigkeit wurde bis zur Trockne verdampft und der Rückstand wurde durch Schnellchromatographie gereinigt, um zusätzliche 2 N (70 mg, 39%) zu erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,28 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,15 (s, 1H), 3,31 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,78 (m, 1H), 4,73 (brs, 1H, OH), 6,82 (dd, J = 4,5, 8,4 Hz, 1H), 6,90 (td, ²J = 2,8, ³J = 10,0 Hz, 1H), 7,53 (m, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,74 (dd, J = 2,0, 9,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,87 (s, 1H, CONH), 13,66 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 441,4 (M – 1).
Synthese von 2-Hydroxy-7-oxa-4-azoniaspiro[3,5]nonanchlorid
In einen 1 l 3-halsigen, rundbödigen Kolben, dem ein Thermoelement, ein Stickstoffeinlass und ein zusätzlicher 250 ml Trichter eingesetzt wurde, wurde Morpholin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 Äq.) und 100 ml Ethanol eingebracht. Die Lösung wurde schnell gerührt, während Epichlorhydrin (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 Äq.) über den zusätzlichen Trichter für über 30 Minuten zugegeben wurde. Die Temperatur wurde überwacht und wenn die Gefäßtemperatur 27°C erreichte, wurde die Reaktion in einem Eiswasserbad gekühlt. Die klare Lösung wurde für 18 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch GC (verdünne 5 Tropfen der Reaktionsmischung in 1 ml Ethanol und injiziere es auf eine 15 m DB-5 GC-Kapillarsäule mit den folgenden Laufparametern, Injektor 250°C, Detektor 250°C, anfängliche Ofentemperatur 28°C, Erwärmen auf 250°C bei 10°C pro Minute) untersucht. Der Reaktionsansatz wurde mit weniger als 3% verbleibendem Morpholin komplettiert. Der Reaktionsansatz wurde durch Rotationsverdampfen bei 50°C unter einem Vollvakuum konzentriert, bis kein Destillat mehr kondensiert werden konnte. Das verbleibende Öl wurde bei Raumtemperatur für 24–48 Stunden oder bis eine signifikante Masse an Kristallen beobachtet wurde (Animpfen wird den Prozess beschleunigen) gelagert. Der Brei wurde mit 250 ml Aceton verdünnt und gefiltert. Die Feststoffe wurden im Vakuumofen bei 60°C für 18–24 Stunden getrocknet. Dies ergab 84 g des kristallinen Produktes. Die ursprüngliche wässrige Lösung könnte konzentriert werden und der Kristallisationsprozess mit zunehmender Rückgewinnung wiederholt werden. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 6,55 (d, 1H), 4,64 (m, 1H), 4,53 (m, 2H), 4,18 (m, 2H), 3,74 (m, 4H), 3,60 (m, 2H), 3,48 (m, 2H). ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 70,9, 61,39, 61,04, 60,25, 58,54, 57,80.
Synthese von 1-Amino-3-(4-morpholinyl)-2-propanol (racemisch)
In einen 3 l 1-halsigen rundbödigen Kolben mit einem Magnetrührstab wurden 2-Hydroxy-7-oxa-4-azoniaspiro[3,5]nonanchlorid (150 g, 835 mmol), gefolgt von 23 Gew.-% wasserfreiem Ammoniak in Methanol (2120 ml) eingebracht. Der Kolben wurde zugestöpselt und die sich ergebende klare Lösung wurde bei 20–23°C für 18 Stunden gerührt. Eine GC unter den oben dargestellten Bedingungen zeigte kein verbleibendes Ausgangsmaterial. Der Stopfen wurde entfernt und man ließ den Ammoniak für 30 Minuten aus der Lösung ausgasen. Der Kolben wurde dann in einen Rotationsverdampfer übertragen und in einem 45°C Bad und Vollvakuum zu einem weißen Feststoff konzentriert. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,57 (dd, 2H), 3,3–3,5 (m, 6H), 2,59 (m, 2H), 2,2–2,4 (m, 6H); ¹³C NMR (100 MHz DMSO-d₆) δ 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.
Dem oben in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren folgend, jedoch 2-(RS)-1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol durch 2-(S)-1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol ersetzend, dass wie weiter unter beschrieben hergestellt wurde, wurde die gewünschte Verbindung 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-(S)-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid erhalten.
Synthese von 1-Amino-3-(4-morpholinyl)-2-propanol (nicht-razemisch)
In einen 1 l 3-halsigen, rundbödigen Kolben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Thermoelement und einem zusätzlichen Trichter ausgerüstet wurde, wurden Morpholin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 Äq.) und 45 ml t-Butanol eingebracht. Die Lösung wurde schnell gerührt, während R-Epichlorhydrin (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 Äq.) über den zusätzlichen Trichter über etwa 30 Minuten zugegeben wurde. Die Temperatur wurde überwacht und wenn die Gefäßtemperatur 27°C erreichte, wurde die Reaktion in einem Eiswasserbad abgekühlt. Die klare Lösung wurde für 18 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mittels GC (verdünne 5 Tropfen der Reaktionsmischung in 1 ml Ethanol und injiziere es auf eine 15 m DB-5 GC-Kapillarsäule mit den folgenden Laufparametern, Injektor 250°C, Detektor 250°C, anfängliche Ofentemperatur 28°C, Aufwärmen auf 250°C bei 10°C pro Minute) untersucht. Der Reaktionsansatz wurde mit weniger als 3% verbleibendem Morpholin komplettiert. Die Lösung wurde auf 10°C abgekühlt und eine 20 Gew.-% Lösung aus Kalium-t-butoxid in THF (576 g) wurde tropfenweise zugegeben, wobei die Temperatur bei weniger als 15°C gehalten wurde. Der sich daraus ergebende weiße Brei wurde bei 10–15°C für 2 Stunden gerührt und durch GC unter Verwendung der oben angegebenen Bedingungen überprüft. Es konnte kein Chlorhydrin beobachtet werden. Die Mischung wurde auf dem Rotationsverdampfer mit einem 50°C Bad und Vollvakuum auf konzentriert. Die sich daraus ergebende Mischung wurde mit Wasser (500 ml) und Methylenchlorid verdünnt. Die Phasen wurden aufgetrennt und die wässrigen Phasen mit Methylenchlorid (500 ml) gewaschen. Die kombinierten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und zu einem klaren, farblosen Öl auf konzentriert. Dies ergab 145 g, bei 97% Ausbeute für das Epoxid. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,3 (dd, 4H), 3,1 (m, 1H), 2,6 (dd, 1H), 2,5 (dd, 1H), 2,4 (m, 4H), 2,2 (dd, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 65,4, 60,1, 53,1, 48,9, 43,4.
Das obige Rohepoxid wurde in einen 3 l 1-halsigen rundbödigen Kolben mit einem magnetischen Rührstab eingebracht. Wasserfreies Ammoniak in Methanol (24% w/w 2,5 l) wurden zugegeben, der Kolben wurde zugestöpselt und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Unter den obigen Bedingungen zeigte die GC kein zurückgebliebenes Ausgangsmaterial. Der Stopfen wurde entfernt und man ließ den Ammoniak für 30 Minuten aus der Lösung ausdampfen. Der Kolben wurde dann auf einen Rotationsverdampfer übertragen und in einem 45°C Wasserbad und Vollvakuum zu einer klaren, farblosen Öl auf konzentriert. Dies ergab 124 g des Produktes. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,57 (dd, 2H), 3,3–3,5 (m, 6H), 2,59 (m, 2H), 2,2–2,4 (m, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.
Synthese von 1-Amino-3-(4-morpholinyl)-2-(S)-propanol
In einen 1 l 3-halsigen rundbödigen Kolben, der mit einem mechanischen Rührer, einem Thermoelement und einem zusätzlichen Trichter ausgerüstet wurde, wurden Morpholin (91,5 g, 91,5 ml, 1,05 mol, 1,0 Äq.) und 200 ml Methanol eingebracht. Die Lösung wurde schnell gerührt, während R-Epichlorhydrin (100 g, 84,5 ml, 1,08 mol, 1,03 Äq.) über den zusätzlichen Trichter über etwa 30 Minuten zugegeben wurde. Die Temperatur wurde überwacht und wenn die Gefäßtemperatur 27°C erreichte, wurde der Reaktionsansatz mit einem Eiswasserbad abgekühlt. Die klare Lösung wurde für 18 Stunden gerührt. Der Reaktionsansatz wurde mittels GC (verdünne 5 Tropfen der Reaktionsmischung in 1 ml Ethanol und injiziere es auf eine 15 m DB-5 GC-Kapillarsäule, mit den folgenden Laufparametern, Injektor 250°C, Detektor 250°C, anfängliche Ofentemperatur 28°C, Aufwärmen auf 250°C bei 10°C pro Minute) untersucht. Der Reaktionsansatz wurde mit weniger als 3% verbleibendem Morpholin komplettiert. Die Lösung wurde auf 10°C abgekühlt und 25 Gew.-% einer Lösung aus Natriummethoxid in Methanol (233 g, 1,08 mol, 247 ml) wurden tropfenweise zugegeben, wobei die Temperatur bei weniger als 15°C gehalten wurde. Der sich daraus ergebende weiße Brei wurde bei 10–15°C für 2 Stunden gerührt und durch GC unter den oben angegebenen Bedingungen überprüft. Es konnte kein Chlorhydrin beobachtet werden. Die Mischung wurde in einem Rotationsverdampfer mit einem 50°C Bad und Vollvakuum auf konzentriert. Die sich daraus ergebende Mischung wurde mit Wasser (500 ml) und Methylenchlorid verdünnt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit Methylenchlorid (500 ml) gewaschen. Die kombinierten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und zu einem klaren, farblosen Öl auf konzentriert. Dies ergab 145 g, bei 97% Ausbeute an 1,2-Epoxy-3-morpholin-4-ylpropan. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,3 (dd, 4H), 3,1 (m, 1H), 2,6 (dd, 1H), 2,5 (dd, 1H), 2,4 (m, 4H), 2,2 (dd, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 65,4, 60,1, 53,1, 48,9, 43,4.
Das obige Rohprodukt 1,2-Epoxy-3-morpholin-4-ylpropan wurde in einen 3 l 1-halsigen rundbödigen Kolben mit einem magnetischen Rührstab eingebracht. Wasserfreier Ammoniak in Methanol (24% w/w 2,5 l) wurden zugegeben, der Kolben wurde zugestöpselt und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Eine GC unter den obigen Bedingungen zeigte kein zurückgebliebenes Ausgangsmaterial. Der Stopfen wurde entfernt und man lies den Ammoniak für 30 Minuten aus der Lösung ausdampfen. Der Kolben wurde dann auf einen Rotationsverdampfer übertragen und zu einem klaren, farblosen Öl in einem 45°C Wasserbad und Vollvakuum auf konzentriert. Dies ergab 124 g an 1-Amino-3-(4-morpholinyl)-2-(S)-propanol. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 3,57 (dd, 2H), 3,3–3,5 (m, 6H), 2,59 (m, 2H), 2,2–2,4 (m, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ 70,8, 67,1, 60,1, 53,8, 48,1.
Imidazolamid (7,0 g, 32,3 mmol), Amin (15,0 g, 64,6 mmol), 5-Fluoroxindol (4,93 g, 32,6 mmol), Triethylamin (9,79 g, 96,9 mmol) und THF (88 ml) wurden vermischt und auf 60°C erhitzt. Es bildete sich eine braune Lösung. Nach dem Rühren für 24 h bei 60°C wurde der gelbe Brei auf RT (Raumtemperatur) abgekühlt und gefiltert. Der Filterrückstand wurde mit 80 ml THF gewaschen und Übernacht bei 50°C unter Vollvakuum getrocknet. Ein brauner Feststoff (23,2 g) wurde erhalten. Der Feststoff wurde in 350 ml Wasser für 5 h bei RT aufgeschlemmt und gefiltert. Der Filterrückstand wurde mit 100 ml Wasser gewaschen und bei 50°C unter Vollvakuum Übernacht getrocknet. 8,31 g wurden mit einer chemischen Ausbeute von 56% erhalten.
In einen 0,25 l Kolben, der mit einem Thermometer, einem Kondensator, einem magnetischen Rührer und einem Stickstoffeinlass ausgerüstet wurde, wurden 4,92 g 5-Fluoroxindol, 7,0 g Imidazolamid, 15,5 g (R)-1-Amino-3-(4-morpholinyl)-2-propanol, 9,78 g Triethylamin und 88 ml Tetrahydrofuran eingebracht. Die Mischung wurde für 16,5 Stunden auf 60°C erhitzt. Der Reaktionsansatz wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und gefiltert. Die erhaltenen Feststoffe werden (3) drei aufeinander folgende Male in Acetonitril bei 11 ml/g aufgeschlemmt, in Vakuum für 3,6 g (25,25%) getrocknet. [HPLC, Hypersil BDS, C-18, 5μ, (6:4), Acetonitril: 0,1 M Ammoniumchlorid, PHA-571437 = 4,05 min] H¹ NMR (DMSO): δ 10,86 (1H, bs); 7,75 (1H, d); 7,70 (1H, s); 7,50 (1H, m); 6,88 (2H, m); 4,72 (1H, bs); 3,78 (1H, bs); 3,56 (4H, m); 3,32 (6H, m); 3,15 (1H, m); 2,43 (8H, bm).
Beispiel 4
Synthese von 2,4-Dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid
5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (113 mg, 0,4 mmol) wurde mit 1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (74 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 2,4-Dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid (77 mg, 45,3%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,40 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,15 (s, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J = 4,8 Hz, 1H, OH), 6,86 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,96 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 7,10 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,49 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,77 (d, J = 8,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 425,4 (M + 1).
Beispiel 5
Synthese von 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (126,6 mg, 0,4 mmol) wurde mit 1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (74 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid (107 mg, 58%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,29 (m, 1H), 2,33 (m, 1H), 2,39 (m, 4H), 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,15 (s, 1H), 3,37 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J = 4,8 Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 457,4 (M – 1).
Die R- und S-Stereoisomere können wie folgt hergestellt werden.
Imidazolamid (7,0 g, 32,3 mmol), Amin (15,5 g, 96,9 mmol), 5-Chloroxindol (5,48 g, 32,6 mmol), Triethylamin (14 ml) und THF (88 ml) wurden vermischt und auf 60°C erhitzt. Es bildete sich eine rote Lösung. Nach dem Rühren für 16 h bei 60°C wurde der gelbe Brei auf RT abgekühlt und gefiltert. Der Filterrückstand wurde mit 2 × 50 ml THF gewaschen und Übernacht bei 50°C unter Vakuum getrocknet. 4,36 g wurden mit einer chemischen Ausbeute von 29% erhalten.
Imidazolamid (6,8 g, 31,3 mmol), Amin (10,0 g, 62,5 mmol), 5-Chloroxindol (5,3 g, 31,6 mmol) und THF (100 ml) wurden vermischt und auf 60°C erhitzt. Es bildete sich eine rote Lösung. Nach dem Rühren für 68 h bei 60°C wurde Triethylamin (14 ml) zugegeben und für 5 h bei 60°C gerührt. Die Reaktion war nicht vollständig. Man gebe 4,6 g der Amin-Seitenkette zu und rühre für 20 h bei 60°C. Der gelbe Brei wurde auf RT abgekühlt und gefiltert. Der Filterrückstand wurde mit 2 × 50 ml THF gewaschen und Übernacht bei 50°C unter Vollvakuum getrocknet. 5,48 g wurden mit einer chemischen Ausbeute von 38% erhalten.
Beispiel 6
Synthese von 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (72,2 mg, 0,2 mmol) wurde mit 1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol (38 mg, 0,24 mmol) kondensiert, um 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-amid (55 mg, 55%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,27 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 2,39 (m, 4H), 2,41, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,13 (s, 1H), 3,35 (m, 1H), 3,55 (m, 4H), 3,77 (m, 1H), 4,74 (d, J = 4,4 Hz, 1H, OH), 6,80 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 503,4 (M – 1).
Beispiel 7
Synthese von 2,4-Dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-yliden-methyl]-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid
Schritt 1
Eine Mischung aus 3-[1,2,3]triazol (2,0 g, 29 mmol), Epichlorhydrin (3,4 ml, 43,5 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (2,6 ml, 15 mmol) in Ethanol (50 ml) wurde bei Raumtemperatur Übernacht gerührt. Nach dem Entfernen der Lösungsmittel wurde der Rest durch Schnellchromatographie (CH₂Cl₂/CH₃OH = 100/1–100/2–100/4) gereinigt, um 1-Chlor-3-(1,2,3)-triazol-2-ylpropan-2-ol (2,1 g, 45%) zu erhalten. ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,52 (m, 2H, OH und CH₂), 3,60 (dd, J = 5,2, 11,2 Hz, 1H), 4,36 (m, 1H, CH), 4,68 (m, 2H), 7,67 (s, 2H). MS (m/z) 162,1 (M + 1) und 1-Chlor-3-(1,2,3)triazol-1-ylpropan-2-ol (2,3 g, 49%). ¹H NMR (CDCl₃) δ 3,56 (s, 1H), 3,57 (s, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,53 (dd, J = 7,2, 14 Hz, 1H), 4,67 (dd, J = 3,8, 14 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,71 (s, 1H). MS (m/z) 162,1 (M + 1).
Schritt 2
1-Chlor-3(1,2,3)triazol-1-ylpropan-2-ol (2,3 g, 13 mmol) wurde mit der Lösung aus NH₃ in Methanol (25 Gew.-%, 20 ml) bei 60°C Übernacht in einem versiegelten Druckbehälter behandelt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Stickstoff in die Reaktionsmischung bombiert, um den Ammoniak zu entfernen. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab das Hydrogenchloridsalz von 1-Amino-3-(1,2,3)triazol-1-ylpropan-2-ol (2,57 g, 100%). ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,68 (dd, J = 8,8, 12,8 Hz, 1H), 2,97 (dd, J = 3,6, 12,8 Hz, 1H), 4,15 (m, 1H), 4,44 (dd, J = 6,4, 14 Hz, 1H), 4,57 (dd, J = 4,6, 14 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 5,2 Hz, 1H, OH), 7,77 (s, 1H), 8,01 (brs., 3H, NH₃ ⁺), 8,12 (s, 1H). MS (m/z) 143,1 (M + 1).
Schritt 3
5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (113 mg, 0,4 mmol) wurde mit 1-Amino-3(1,2,3)triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 2,4-dimethyl-5-[2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3- [1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid (70 mg, 41%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,45, 2,48 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,35 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 4,32 (dd, J = 7,6, 14 Hz, 1H), 4,53 (dd, J = 3,4, 14 Hz, 1H), 5,43 (d, J = 5,6 Hz, 1H, OH), 6,91 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,12 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,77 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,68 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 405,4 (M – 1).
Beispiel 8
Synthese von 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid
5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (120 mg, 0,4 mmol) wurden mit 1-Amino-3(1,2,3)triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 5-[5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid (100 mg, 62%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,42, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,27 (m, 2H), 3,98 (m, 1H), 4,27 (dd, J = 7,6, 14 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 3,4, 13,6 Hz, 1H), 5,38 (d, J = 5,6 Hz, 1H, OH), 6,82 (dd, J = 4,4, 8,4 Hz, 1H), 6,91 (td, ²J = 2,4, ³J = 9,0 Hz, 1H), 7,70 (m, 3H), 7,75 (dd, J = 2,4, 9,2 Hz, 1H), 8,11 (s. 1H), 10,93 (s, 1H, CONH), 13,73 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 423,4 (M – 1).
Beispiel 9
Synthese von 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid
5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (126,6 mg, 0,4 mmol) wurde mit 1-Amino-3(1,2,3)triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 5-[5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid (48 mg, 27%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,42, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 4,28 (dd, J = 7,8, 14 Hz, 1H), 4,51 (dd, J = 3,2, 14 Hz, 1H), 5,39 (d, J = 6,0 Hz, 1H, OH), 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 2,0, 8,2 Hz, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,74 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 10,99 (s, 1H, CONH), 13,65 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 439,4 (M – 1).
Beispiel 10
Synthese von 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid
5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (144,4 mg, 0,4 mmol) wurden mit 1-Amino-3(1,2,3)triazol-1-yl-propan-2-ol (85 mg, 0,48 mmol) kondensiert, um 5-[5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-(3Z)-ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-[1,2,3]triazol-1-yl-propyl)-amid (130 mg, 67%) zu präzipitieren. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,41, 2,44 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 3,27 (m, 2H), 3,99 (m, 1H), 4,28 (dd, J = 7,6, 14 Hz, 1H), 4,50 (dd, J = 3,6, 14 Hz, 1H), 5,40 (d, J = 5,6 Hz, 1H, OH), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 2,0, 8,0 Hz, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,77 (s, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,10 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 11,0 (s, 1H, CONH), 13,64 (s, 1H, NH). LC-MS (m/z) 485,4 (M – 1).
Die Synthese von 5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, 5-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure, 5-(2-Oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure wurde in der vom Anmelder gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung am 14. Februar 2001 unter dem Titel "PYRROLE SUBSTITUTED 2-INDOLINONE – PROTEIN KINASE INHIBITORS", Seriennr. 09/783,264, angemeldeten Anmeldung, beschrieben, wobei deren Offenbarung hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird.
Beispiel 11 Synthese von 1-Amino-3-(1,1-dioxo-λ⁶-thiomorpholin-4-yl)-propan-2-ol
Zur Lösung aus Thiomorpholin (5,0 g, 48,7 mmol) in HOCH₃ (200 ml) wurde die Lösung aus Oxon (36,0 g, 58,5 mmol) in H₂O (100 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei 40°C für 48 h gut gerührt und dann bei 0°C gekühlt. Wässriges NaOH wurde tropfenweise zugegeben, um auf pH = 12 einzustellen. Der Feststoff wurde herausgefiltert und mit HOCH₃ (3 × 40 ml) gewaschen. Die kombinierte Flüssigkeit wurde kondensiert und durch Schnellchromatographie auf Silicagel (CHCl₃/CH₃OH/NH₃·H₂O = 3/1/0,1–2/1/0,1) gereinigt, um Thiomorpholin-1,1-dioxid (6,2 g) mit einer Ausbeute von 93% zu erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,97 (m, 4H), 3,07 (m, 4H), 3,42 (brs, 1H), MS (m/z) 136 (M + 1).
Zur Mischung aus Thiomorpholin-1,1-dioxid (2,5 g, 18,5 mmol) und (R)-(–)Epichlorhydrin (1,55 ml, 20 mmol) wurde das Lösungsmittel Ethanol (50 ml) und H₂O (5 ml) zugegeben und dann bei 25°C für 24 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Rest durch Schnellchromatographie gereinigt, um (R)-1-Chlor-3-(1,1-dioxo-λ^6–-thiomorpholin-4-yl)-propan-2-ol (4,0 g, 96%) zu erhalten. ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,50 (m, 2H), 2,94 (m, 4H), 305 (m; 4H), 3,54 (dd, J = 5,8, 11,2, Hz, 1H), 3,63 (dd, J = 4,4, 11,2 Hz, 1H), 3,78 (m, 'H, CH), 5,10 (d, J = 5,2 Hz, 1H, OH), MS (m/z) 228,2 (M + 1).
(R)-1-Chlor-3-(1,1-dioxo-λ⁶-thiomorpholin-4-yl)-propan-2-ol (2,27 g, 10 mmol) wurde mit der Lösung aus NH₃ in Methanol (25 Gew.-%, 20 ml) bei 50°C für 12 h behandelt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel wurde der Rest mit einem anionischen Austauschharz (AG1x8, OH-Form) in Wasser behandelt, um das Rohprodukt (S)-1-Amino-3-(1,1-dioxo-λ⁶-thiomorpholin-4-yl)-propan-2-ol (2,0 g) zu erhalten. Es war zu etwa 30% mit seinem Dimer kontaminiert und konnte durch Säulenchromatographie kaum gereinigt werden. MS (m/z) 209,2 (M + 1). Die Kondensation von (S)-1-Amino-3-(1,1-dioxo-λ⁶-thiomorpholin-4-yl)-propan-2-ol mit Oxindolen ergab die gewünschten Indolinone (Ausbeute 50–80% nach der Reinigung). (R)-5-(2-Oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[3-(1,1-dioxo-λ⁶-thiomorpholin-4-yl)-2-hydroxy-propyl]-amid

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,39, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,49 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,07 (m, 4H), 3,16 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J = 4,8 Hz, IH, OH), 6,86 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,97 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,50 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,6 Hz, 1H) (aromatisch und Vinyl), 10,88 (s, 1H, CONH), 13,62 (s, 1H, NH), LC-MS (m/z) 473,4 (M + 1).

₆

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,47 (m, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,17 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 6,82 (t, J = 4,0 Hz, 1H), 6,91 (td, ²J = 2,8, ³J = 9,0 Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,8 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,75 (dd, J = 2,4, 9,2 Hz, 1H), 10,88 (s, 1H), 13,67 (s, 1H). LC-MS (m/z) 491,4 (M + 1).

⁶

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,40, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,45 (m, 1H), 2,53 (m, 1H), 2,96 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,17 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,75 (m, 1H), 4,83 (d, J = 4,4 Hz, 1H, OH), 6,85 (t, J = 8,4 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 2,2, 8,2 Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,97 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 10,98 (s, 1H), 13,62 (s, 1H), LC-MS (m/z) 507,2 (M + 1). (R)-5-(5-Brom-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl), 2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure[3-(1,1-dioxo-λ⁶-thiomorpholin-4-yl)-2-hydroxy-propyl]-amid
- ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,41, 2,42 (2 × s, 6H, 2 × CH₃), 2,47 (m, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,97 (m, 4H), 3,06 (m, 4H), 3,18 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,83 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,24 (dd, J = 1,8, 8,2 Hz, 1H), 7,53 (t, J = 5,8, 1H), 7,76 (s, 1H), 8,09 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 10,98 (s, 1H) 13,62 (s, 1H), LC-MS (m/z) 553,6 (M + 1).

Beispiel 12 Synthese von (S)- oder (R)-1-methylamino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol
Die Mischung aus Morpholin (1,74 ml, 20 mmol) und (R)-Epichlorhydrin (1,56 ml, 20 mmol) in Ethanol (10 ml) wurde bei R. T. für 48 h gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde der Reststoff mit der Lösung aus CH₃NH₂ in Wasser (40 Gew.-%, 20 ml) bei R. T. für 14 h behandelt. Das Entfernen der Lösungsmittel ergab das Rohprodukt (S)-1-Methylamino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol, das durch Vakuumdestillation oder Säulenchromatographie gereinigt werden konnte (2,4 g, 70%). (R)-1-Methylamino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol wurde aus (S)-Epichlorhydrin mit einer Ausbeute von 76% hergestellt. ¹H NMR (CDCl₃) δ 2,33 (dd, J = 3,6, 12,4 Hz, 1H), 2,42 (m, 1H), 2,44 (dd, J = 2,8, 9,8 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,53 (dd, J = 7,6, 11,8 Hz, 1H), 2,62 (m, 2H), 2,65 (dd, J = 3,6, 12,0 Hz, 1H), 3,71 (m, 4H), 3,85 (m, 1H), ¹³CNMR (CDCl₃) δ 67,06, 65,58, 62,80, 55,87, 53,94, 36,72, MS (m/z) 175 (M + 1).
(S)-1-Methylamino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol wurde mit 5-Fluoroxindol, dass mit (R)-5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-methyl-amid versehen ist, kondensiert.
¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,0 (s, 3H), 2,15 (m, 1H), 2,25 (m, 6H), 2,28 (m, 2H), 2,42 (s, 1H), 2,95 (s, 1H), 3,0 (s, 3H), 3,25 (m, 2H), 3,57 (m, 2H), 3,97 & 3,68 (2 × brs, 1H), 4,80 & 4,74 (2 × brs, 1H), 6,82 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz, 1H), 6,90 (td, ²J = 2,3, ³J = 8,7 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H), 7,71 (dd, J = 2,2, 9,0 Hz, 1H), 10,86 (s, 1H), 13,57 (s, 1H), LC-MS (m/z) 457,2 (M + 1).
(R)-1-Amino-3-morpholin-4-yl-propan-2-ol versehen mit (S)-5-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(2-hydroxy-3-morpholin-4-yl-propyl)-methyl-amid

¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,0 (m, 3H), 2,10 (m, 1H), 2,22 (m, 6H), 2,25 (m, 2H), 2,38 (m, 1H), 2,90 (s, 1H), 2,96 (s, 3H), 3,27 (m, 2H), 3,52 (m, 2H), 3,93 & 3,64 (2 × brs, 1H), 4,75 & 4,70 (2 × brs, 1H), 6,77 (dd, J = 4,6, 8,2 Hz, 1H), 6,85 (td, ²J = 2,5, ³J = 8,8 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 767 (dd, J = 2,0, 9,6 Hz, 1H), 10,81 (s, 1H), 13,52 (s, 1H), LC-MS (m/z) 457,2 (M + 1).

Beispiel 13
Amin-Seitenkettenherstellung
3-(1-H-Tetrazol-1-yl)]-2-hydroxy-1-chlorpropan und 3-(2-H-Tetrazol-2-yl)-2-hydroxy-1-chlorpropan
6,905 g Tetrazol (100 mmol), und 1,75 ml Diisopropylethylamin (10 mmol) und 11,73 Epichlorhydrin (150 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (30 ml) wurden bei 60°C für 4 Stunden gerührt. Die erhaltene Lösung wurde verdampft, unter einem Hochvakuum getrocknet und auf einer Säule aus Silica in Chloroform-Methanol 100:8 gereinigt. Die erste Fraktion stellte reines 3-(2-H-Tetrazol-2-yl)-2-hydroxy-1-chlorpropan, 6,215 g (farbloses Öl, 38% A. (A., Ausbeute: engl. Y, yield)) bereit, die zweite Fraktion ergab 9,208 g reines 3-(1-H-Tetrazol-1-yl)]-2-hydroxyl-1-chlorpropan (klebriges Gummi; 57% A.).
3-(1-H-Tetrazol-1-yl)]-2-hydroxy-1-aminopropan
9,110 g an 3-(1-H-Tetrazol-1-yl)]-2-hydroxy-1-chlorpropan, 15 g Kaliumcarbonat und 130 ml an gesättigtem methanolischem Ammoniak wurden für 21 Stunden gerührt, dann gefiltert und verdampft. Der auf einer Säule aus Silica in Chloroform-Methanol-wässrigem Ammoniak 80:35:4 gereinigte Reststoff ergab A. = 7,326 g eines weißen klebrigen Gummis (91,5% th).
3-(2-H-Tetrazol-2-yl)]-2-hydroxy-1-aminopropan
6,105 g an 3-(2-H-Tetrazol-2-yl)]-2-hydroxy-1-chlorpropan, 10 g Kaliumcarbonat und 95 ml an gesättigtem methanolischen Ammoniak wurden für 21 Stunden gerührt, dann gefiltert und verdampft. Der auf einer Säule aus Silica in Chloroform-Methanol-wässrigem Ammoniak 60:25:2 gereinigte Reststoff ergab A. = 3,726 g eines weißen kristallinen Feststoffes (69,5% th).
3-[(2R,6S)-2,6-Dimethylmorpholin-4-yl]-2-hydroxy-1-aminopropan
4,7 ml Epichlorhydrin (60 mmol) wurden zu einer eisgekühlten Lösung aus cis-2,6-Dimethylmorpholin (4,607 g, 40 mmol) in Trifluorethanol (5 ml) gegeben. Die Lösung wurde bei 0–5°C für 1 h gerührt, dann wurde das Bad zum Abkühlen entfernt und es wurde für zusätzliche 5 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde unter Hochvakuum verdampft, der erhaltene ölige Reststoff wurde in wasserfreiem Ethanol (50 ml) aufgelöst, die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, festes Natriummethoxid (2,27 g) wurde in zwei Portionen zugegeben und die Mischung wurde bei 0–5°C für 2 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann gefiltert, die Salze mit Ethanol (30 ml) gewaschen und die kombinierten Filtrate zu eisgekühltem konzentrierten flüssigen Ammoniak (200 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei RT für 12 h gerührt und dann unter einem Hochvakuum verdampft. Der Rest wurde auf einer Säule aus Silica in einer Mischung aus Chloroform-Methanol-7 M methanolischem Ammoniak 80:15:3 gereinigt. A. = 5,75 g eines weißen, kristallinen, hygroskopischen Feststoffes (76,3% th).
(2S)-3-(3-Methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-hydroxy-1-chlorpropan und (2S)-3-(3-Methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)-2-hydroxy-1-aminopropan
3,423 g an 3-Methyl-2,5-dioxoimidazolidin (3,423 g), und 3,60 ml R-Epichlorphydrin (–) (99% ee) und 0,30 ml der Barton-Base (1,5 mmol) in wasserfreiem Acetonitril wurden bei 60°C für 20 h gerührt. Die erhaltene Lösung wurde unter einem Hochvakuum verdampft und auf einer Säule aus Silica in einer Mischung aus Chloroform-Methanol (einem Gradienten von 5 bis 20% Methanol) gereinigt, um 5,572 g der Chlorverbindung als weißen, amorphen Feststoff (90% A.) zu erhalten. Das Chlorid wurde wie folgt in ein Amin umgewandelt. Das erhaltene Hydroxy-Chlor-Zwischenprodukt wurde in methanolischem Ammoniak (gesättigt mit Ammoniakgas) gelöst, Kaliumcarbonat wurde zugegeben und die Mischung wurde in einem geschlossenen Kolben für 2 ½ Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gefiltert und die Filtrate verdampft. Der Reststoff wurde auf einer Silicasäule in einer Mischung aus Chloroform-Methanolkonzentriertem, wässrigen Ammoniak 80:15:1,5 gereinigt.
Beispiel 14
5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(2H-tetraazol-2-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 22) (allgemeines Verfahren)
72 mg an 3-(2-H-Tetrazol-2-yl)]-2-hydroxy-1-aminopropan wurden zum Brei aus 105 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-1-oxy-7-azabenztriazolester [hergestellt durch Aktivieren von (3Z)-3-({3,3-Dimethyl-4-carboxy-1-H-pyrrol-2-yl}methylen)-5-fluor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (480 mg; 1,6 mmol) mit dem HATU-Reagenz (570 mg; 1,5 mmol) in Gegenwart der Hunig-Base (3,0 mol; 0,525 ml) in DMF (5 ml), und isolieren durch Präzipitation mit Chloroform (5 ml) und trocknen unter einem Hochvakuum mit einer Ausbeute von 92% (579 mg) in reiner Form] in wasserfreiem Dimethylacetamid (1,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und im Hochvakuum verdampft. Der Reststoff wurde in einer Mischung aus Methanol-Diethylamin 20:1 (3 ml) suspendiert, man ließ es im Kühlschrank (5°C) für 1 h kristallisieren, es wurde gefiltert und das Präzipitat wurde mit eiskaltem Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. A. = 106 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 15
5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(2H-tetraazol-2-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 23) (allgemeines Verfahren)
72 mg an 3-(2-H-tetrazol-2-yl)]-2-hydroxy-1-aminopropan wurden zum Brei aus 109 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-1-oxy-7-azabenztriazolester [hergestellt durch Aktivieren von (3Z)-3-([3,3-dimethyl-4-carboxy-1-H-pyrrol-2-yl)methylen)-5-chlor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,520 g; 4,8 mmol) mit dem HATU-Reagenz (1,768 g; 4,65 mmol) in Gegenwart der Hunig-Base (9,0 mmol; 1,58 ml) in DMF (20 ml), und isolieren durch Präzipitation mit Chloroform (20 ml) und trocknen unter einem Hochvakuum mit einer Ausbeute von 94% (1,907 g) in reiner Form] in wasserfreiem Dimethylacetamid (1,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und im Hochvakuum verdampft. Der Reststoff wurde in einer Mischung aus Methanol-Diethylamin 20:1 (3 ml) suspendiert, man ließ es im Kühlschrank (5°C) für 1 h kristallisieren, es wurde gefiltert und das Präzipitat wurde in eiskaltem Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. A. = 109 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 16
N-[2-hydroxy-3-(2H-tetraazol-2-yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-[(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]methyl)-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 24) (allgemeines Verfahren)
72 mg an 3-(2-H-Tetraazol-2-yl)]-2-hydroxy-1-aminopropan wurden zum Brei aus 121,5 mg (0,25 mmol) 5-[(Z)-(5-Trifluormethoxy-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-1-oxy-7-azabenztriazolester [hergestellt durch Aktivieren von (3Z)-3- ((3,3-dimethyl-4-carboxy-1-H-pyrrol-2-yl)methylen)-5-trifluormethoxy-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,768 g; 4,8 mmol) mit dem HATU-Reagenz (1,758 g; 4,8 mmol) in Gegenwart der Hunig-Base (9,0 mmol; 1,58 ml) in DMF (25 ml) und isolieren durch Verdampfung und Präzipitation mit wasserfreiem Acetonitril und Trocknen unter einem Hochvakuum mit einer Ausbeute von 85,5% (1,929 g) in reiner Form] in wasserfreiem Dimethylacetamid (1,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und im Hochvakuum verdampft. Der Reststoff wurde in einer Mischung aus Methanol-Diethylamin 20:1 (3 ml) suspendiert, man ließ im Kühlschrank (5°C) für 1 h kristallisieren, es wurde gefiltert und das Präzipitat wurde in eiskaltem Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. A. = 113 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 17
5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(1H-tetraazol-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 25)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 14 aus 72 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 113 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 18
5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(1H-tetraazol-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 26)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 15 aus 72 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 122 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 19
N-[2-hydroxy-3-(1H-tetraazol-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-[(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]methyl]-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 27)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 16 aus 72 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 118 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 20
N-[3-[(2R,6S)-2,6-Dimethylmorpholin-4-yl]-2-hydroxypropyl)-5-[(Z)-(5-fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 28)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 14 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 99 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 21
5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]-2-hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 29)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 15 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 101 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 22
N-[3-[(2R,6S)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]-2-hydroxypropyl]-2,4-dimethyl-5-[(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]methyl]-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 30)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 16 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 89 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 23
5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[(2S)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)]2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 34)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 14 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 109 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 24
5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[(2S)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 36)
Dies wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 15 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 107 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 25
N-[(2S)-2-Hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]methyl}-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 35)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 16 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 123 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 26
5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[(2R)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 31)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 14 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 110 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 27
5[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[(2R)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 32)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 15 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 103 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 28
N-[(2R)-2-hydroxy-3-(3-methyl-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-5-{(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-ylidenmethyl}-1H-pyrrol-3-carboxamid (Verbindung 33)
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 16 aus 95 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 120 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 29 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester
DMF (4 ml, 3 Äq.) wurde unter Rühren in einem Eisbad gekühlt. Dazu wurde POCl₃ (1,1 Äq., 1,8 ml) gegeben. Nach 30 Minuten wurde eine Lösung des 3,5-Dimethyl-4- Ethylesterpyrrols (4 g, 17,4 mmol) in DMF (2 M, 9 ml) zum Reaktionsansatz gegeben und das Rühren fortgesetzt. Nach 10 min verfestigte sich die Reaktionsmischung. Diese wurde mit 5 ml DMF verdünnt und in einem 90°C Ölbad erhitzt. Nach 1 h wurde die Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt, und mit Wasser (100 ml) verdünnt und mit 1 N NaOH auf pH = 11 basisch eingestellt. Das Produkt wurde in Methylenchlorid (3 × 200 ml) extrahiert und die organischen Schichten wurden mit einer Salzlösung (200 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und auf konzentriert, um 4,3 g (95%) an 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester als einen brauen Feststoff zu erhalten. ¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,5 (br s, 1H, NH), 9,11 (s, 1H, CHO), 7,35 (s, 5H, ArH), 3,98 (q, J = 6,8 und 7,2 Hz, 2H, OCH ₂CH₃), 2,48 (s, 3H, CH ₃), 0,98 (t, J = 7 Hz, 3H, OCH₂CH ₃)
5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure
5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäureethylester wurde in Wasser (100 ml) und Methanol (45 ml) unter Rühren gelöst. Es wurden KOH (2 Äq., 1,9 g) zugegeben und bei 100°C erhitzt. Nach 2,5 h wurde sie auf Raumtemperatur abgekühlt und der verbleibende Ester wurde durch Extrahieren in Ethylacetat (200 ml) entfernt, getrocknet und konzentriert. Die wässrige Schicht wurde unter Verwendung von 2 N HCl auf pH = 3 sauer eingestellt. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration und Waschen mit Wasser entfernt. Der Feststoff wurde aus Toluen rekonzentriert, mit Hexan zermahlen und getrocknet, um 2 g (52%) eines cremefarbenen Feststoffes zu erhalten. ¹H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 12,46 (br s, 1H, CO₂H), 11,95 (s, 1H, NH), 9,08 (s, 1H, CHO), 7,36 (s, 5H, ArH), 2,49 (s, 3H, CH ₃). MS m/z (relative Intensität %, Ion) gemessen 229 (100, M⁺); berechnet 229,2.
5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amid
Eine Mischung aus 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure (1,0 mg, 4,36 mmol), 1-Amino-3-diethylamino-2-propanol (950 mg, 6,54 mmol), DDC (900 mg, 4,36 mmol) und HOBt (884 mg, 6,54 mmol) in Chloroform (60 ml) wurde bei RT für 12 h gerührt. Der Reaktionsansatz wurde in gesättigtes Natriumbicarbonat (60 ml) gerührt, und dazu wurden 1 N NaOH (8 ml) gegeben. Er wurde dann mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert, mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert, um 400 mg an 5-Formyl-2-methyl-4-phenyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure(3-diethylamino-2-hydroxy-propyl)-amid zu erhalten.
Beispiel 30
Verfahren zur Synthese der Verbindungen 11–21
Es wurde eine 0,36 M Lösung jedes Oxindols in DMSO als auch eine 0,576 M Lösung jedes Aldehyds hergestellt. 300 μl des passenden Oxindols wurden mit 300 μl des passenden Aldehyds in Gegenwart von 200 μl DMSO vermischt. Dann werden 40 mg des Diethylentriamin-Radikalfängerharzes zugegeben. Die Mischung wird in einem Robbins-Block angeordnet und der Block wird versiegelt und in einem 60°C-Ofen angeordnet, in dem er für 18 Stunden geschüttelt wird.
Nach 18 Stunden wird der Robbins-Block aus dem Ofen entfernt. Das obere Siegel des Blocks wird entfernt und 800 μl DMSO werden zur Mischung gegeben. Dann wird der Block wieder versiegelt und abermals im 60°C-Ofen angeordnet, in dem er sich fortwährend für eine Stunde dreht.
Nachdem die 1 Stunde abgelaufen ist, wird der Robbins-Block aus dem Ofen entfernt, und dann lässt man ihn abkühlen. Das untere Siegel des Robbins-Block wird vorsichtig entfernt und der gesamte Block wird in die Filtrationsvorrichtung eingesetzt, wodurch die neu synthetisierten Verbindungen vom Harz abgefiltert werden können.
Beispiel 31
3-[1-H-(7-Azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-aminopropan
4,083 g 1-Hydroxy-7-azabenztriazol (30 mmol) und 0,53 ml Diisopropylamin (3 mmol) und 4,70 ml Epichlorhydrin in wasserfreiem Chloroform wurden bei 60°C für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Säule aus Silica gegossen und mit einer Mischung aus Chloroform-Methanol 100:3 eluiert. Das dabei erhaltene Hydroxy-Chlor-Zwischenprodukt (4,83 g, blassgelbes Öl, 70% A.) wurde in methanolischem Ammoniak (100 ml, gesättigt mit Ammoniakgas) gelöst, 8,3 g Kaliumcarbonat wurde zugegeben und die Mischung wurde in einem geschlossenen Kolben für 2 ½ Tagen gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gefiltert und die Filtrate verdampft. Der Rest wurde auf einer Silicasäule in einer Mischung aus Chloroform-Methanol-konz. wässrigen Ammoniak 80:15:1,5 gereinigt. A. = 2,793 g eines weißen kristallinen Feststoffes (63% d. Th. des Chlorids).
3-[1-H-(Benztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-chlorpropan und 3-[1-H-(Benztriazolyl-3-N-oxido)]-2-hydroxy-1-chlorpropan
12,162 g Hydroxyazabenztriazol (90 mmol), 1,59 ml Diisopropylethylamin (9 mmol) und 14,1 ml Epichlorhydrin (180 mmol) in wasserfreiem Chloroform wurden bei 55°C für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde verdampft, der Rest wurde im Hochvakuum getrocknet, dann auf einer Silicasäule in einer Mischung aus Chloroform-Methanol 100:5 gereinigt. Die ersten Fraktionen ergaben 3-[1-H-(Benztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-chlorpropan 10,570 g (blassgelber Honig; 51,5% A.), gefolgt von einer Fraktion an 3-[1-H-(Benztriazolyl-3-N-oxido)]-2-hydroxy-1-chlorpropan 9,990 g (weißer, kristalliner Feststoff, 48,5% A.).
3-[1-H-(Benztriazolyl-3-N-oxido)]-2-hydroxy-1-aminopropan
Wurde durch Aminolyse von 3-[1-H-(Benztriazolyl-3-N-oxido)]-2-hydroxy-1-chlorpropan in Analogie zur Synthese von 3-[1-H-(7-Azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-aminopropan hergestellt.
Beispiel 32
5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)propyl]-2,4-dimenthyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (allgemeines Verfahren)
105 mg an 3-[1-H-(7-Azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-aminopropan wurden zum Brei aus 105 mg (0,25 mmol) an 5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4- dimenthyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-1-oxy-7-azabenztriazolester [hergestellt durch Aktivieren von (3Z)-3-({3,3-dimethyl-4-carboxy-1-H-pyrrol-2-yl}methylen)-5-fluor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (480 mg; 1,6 mmol) mmol; 0,525 ml) in DMF (5 ml) und Isolieren durch Präzipitation mit Chloroform (5 ml) und Trocknen im Hochvakuum mit einer Ausbeute von 92% (579 mg) in reiner Form] in wasserfreiem Dimethylacetamid (1,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 30 min gerührt und im Hochvakuum verdampft. Der Reststoff wurde in einer Mischung aus Methanol-Diethylamin 20:1 (3 ml) suspendiert, man ließ ihn im Kühlschrank (5°C) für 1 h kristallisieren, filterte ihn und das Präzipitat wurde im eisgekühlten Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. A. = 121 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 33
5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridin-3-yloxy)propyl-2,4-dimenthyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (allgemeines Verfahren)
105 mg an 3-[1-H-(7-Azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-aminopropan wurden zum Brei aus 109 mg (0,25 mmol) an 5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-1-oxy-7-azabenztriazolester [hergestellt durch Aktivieren von (3Z)-3-({3,3-dimethyl-4-carboxy-1-H-pyrrol-2-yl}methylen)-5-chlor-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,520 g; 4,8 mmol) mit dem HATU-Reagenz (1,768 g; 4,65 mmol) in Gegenwart der Hunig-Base (9,0 mmol; 1,58 ml) in DMF (20 ml) und isolieren durch Präzipitation mit Chloroform (20 ml) und Trocknen im Hochvakuum mit einer Ausbeute von 94% (1,907 g) in reiner Form] in wasserfreiem Dimethylacetamid (1,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 30 Minuten gerührt und im Hochvakuum verdampft. Der Reststoff wurde in einer Mischung aus Methanol-Diethylamin 20:1 (3 ml) suspendiert, man ließ ihn im Kühlschrank (5°C) für 1 h kristallisieren, er wurde gefiltert und das Präzipitat wurde im eiskalten Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. A. = 130 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 34
5-[(Z)-(5-Trifluormethoxy-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(3H-[1,2,3]triazol[4,5-b]pyridin-3-yloxy)propyl]-2,4-dimenthyl-1H-pyrrol-3-carboxamid (allgemeines Verfahren)
105 mg 3-[1-H-(7-Azabenztriazolyl)-oxy]-2-hydroxy-1-aminopropan wurden zum Brei aus 121,5 mg (0,25 mmol) an 5-[(Z)-(5-Trifluormethoxy-2-oxol-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carbonsäure-1-oxy-7-azabenztriazolester [hergestellt durch Aktivieren von (3Z)-3-({3,3-Dimethyl-4-carboxy-1-H-pyrrol-2-yl}methylen)-5-trifluormethoxy-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (1,768 g; 4,8 mmol) mit dem HATU-Reagenz (1,758 g; 4,8 mmol) in Gegenwart der Hunig-Base (9,0 mmol; 1,58 ml) in DMF (25 ml) und isolieren durch Verdampfen und Präzipitieren mit wasserfreiem Acetonitril und Trocknen im Hochvakuum bis zu einer Ausbeute von 85,5% (1,929 g) in reiner Form] in wasserfreiem Dimethylacetamid (1,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 30 min gerührt und im Hochvakuum verdampft. Der Reststoff wurde in einer Mischung aus Methanol-Diethylamin 20:1 (3 ml) suspendiert, man ließ ihn im Kühlschrank (5°C) für 1 h kristallisieren, er wurde gefiltert und das Präzipitat wurde in eiskaltem Methanol gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. A. = 142 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 35
5-[(Z)-(5-Fluor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(3-oxido-1H-1,2,3-benzotriazol-1-yl)propyl]-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 32 aus 105 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 120 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 36
5-[(Z)-(5-Chlor-2-oxo-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden)methyl]-N-[2-hydroxy-3-(3-oxido-1H-1,2,3-benzotriazol-1-yl)propyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-carboxamid
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 33 aus 105 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 127 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Beispiel 37
N-[2-Hydroxy-3-(3-oxido-1H-1,2,3-benzotriazol-1-yl)propyl-2,4-dimethyl-5-[(Z)-[2-oxo-5-(trifluormethoxy)-1,2-dihydro-3H-indol-3-yliden]methyl)-1H-pyrrol-3-carboxamid
Sie wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 34 aus 105 mg des entsprechenden Amins hergestellt. A. = 141 mg eines orangenen, kristallinen Feststoffes.
Biologische Beispiele
Die folgenden Assays werden angewendet, um solche Verbindungen zu finden, welche den gewünschten, optimalen Aktivitätsgrad zeigen.
A. Assay-Verfahren.
Die folgenden Assays können verwendet werden, um das Aktivitätsniveau und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf eine oder mehrere PK's zu bestimmen. Vergleichbare Assays können auf gleiche Art und Weise für jede PK mittels im Stand der Technik gut bekannter Verfahren entworfen werden.
Mehrere der hierin beschriebenen Assays werden in einem ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Sandwich Assay, Festphasen-Enzymimmunoassay)-Format durchgeführt (Voller, et al., 1980, „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay," Manual of Clinical Immunology, 2. Ausgabe, Rose und Friedman, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D. C., S. 359–371). Das allgemeine Verfahren sieht wie folgt aus: Eine Verbindung wird in Zellen eingeführt, die die Testkinase entweder auf natürliche Weise oder rekombinant für einen ausgewählten Zeitraum exprimieren, wonach, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand zugegeben wird, der bekanntermaßen den Rezeptor aktiviert. Die Zellen werden lysiert und das Lysat wird in die Kammern einer ELISA-Platte, die zuvor mit einem spezifischen Antikörper, der das Substrat der enzymatischen Phosphorylierungsreaktion erkennt, beschichtet wurde, übertragen. Nichtsubstratkomponenten des Zelllysats werden weggewaschen und die Phosphorylierungsmenge am Substrat wird mit einem Antikörper, der Phosphotyrosin im Vergleich zu Kontrollzellen, die mit keiner Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, spezifisch erkennt, detektiert.
Die derzeit bevorzugten Protokolle zum Durchführen der ELISA-Experimente für spezifische PK's werden weiter unten bereitgestellt. Jedoch liegt die Anpassung dieser Protokolle zum Bestimmen der Aktivität der Verbindungen gegen andere RTK's als auch CTK's und STK's innerhalb des Wissensumfangs des Fachmanns. Andere hierin beschriebene Assays messen die Menge an DNA, die als Antwort auf die Aktivierung der Testkinase hergestellt wird, was ein allgemeiner Maßstab für eine proliferative Antwort ist. Das allgemeine Verfahren für dieses Assay sieht wie folgt aus: Eine Verbindung wird in Zellen eingeführt, die die Testkinase entweder auf natürliche Weise oder rekombinant für einen ausgewählten Zeitraum exprimieren, wonach, wenn die Testkinase ein Rezeptor ist, ein Ligand zugegeben wird, der bekanntermaßen den Rezeptor aktiviert. Nach zumindest einer Inkubation übernacht wird ein DNA-markierendes Reagenz, wie zum Beispiel 5-Bromdesoxyuridin (BrdU) oder H³-Thymidin zugegeben. Die Menge der markierten DNA wird entweder mit einem Anti-BrdU-Antikörper oder durch Messen der Radioaktivität detektiert und wird mit Kontrollzellen, die nicht mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wurden, verglichen.
GST-FLK-1 BIOASSAY
Dieses Assay analysiert die Tyrosinkinaseaktivität von GST-Flk1 auf Poly(Glu-Tyr)-Peptide.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten (Corning Katalog Nr. 5805-96).
2. Poly(Glu-Tyr) 4:1, Lyophilisat (Sigma Katalog # P0275).
3. Herstellung von Poly(Glu,Tyr)(pEY) beschichteten Assay-Platten: Beschichte mit 2 μg/Kammer an Poly(Glu,Tyr)(pEY) in 100 μl PBS, lagere für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder bei 4°C übernacht. Man decke die Platten gut ab, um ein Verdampfen zu verhindern.
4. PBS-Puffer: für 1 l, mische 0,2 g KH₂PO₄, 1,15 g Na₂HPO₄, 0,2 g KCl und 8 g NaCl in etwa 900 ml dH₂O. Wenn sich alle Reagenzien aufgelöst haben, stelle den pH mit HCl auf 7,2 ein. Man stelle das Gesamtvolumen mit dH₂O auf 1 l ein.
5. PBST-Puffer: zu 1 l des PBS-Puffers, gebe man 1,0 ml Tween-20.
6. TBB-Blockierpuffer: für 1 l, mische man 1,21 g TRIS, 8,77 g NaCl und 1 ml Tween-20 in etwa 900 ml dH₂O. Man stelle den pH mit HCl auf 7,2 ein. Man gebe 10 g BSA zu und rühre es zum Auflösen. Man stelle das Gesamtvolumen mit dH₂O auf 1 l ein. Man filtere, um fein verteiltes Material zu entfernen.
7. 1% BSA in PBS: um eine 1× Arbeitslösung herzustellen, gebe man 10 g BSA zu etwa 990 ml PBS-Puffer und rühre es um es aufzulösen. Man stelle das Gesamtvolumen mit PBS-Puffer auf 1 l ein, und filtere es, um fein verteiltes Material zu entfernen.
8. 50 mM Hepes, pH 7,5.
9. GST-Flk1cd, aus einer sf9 rekombinanten Baculovirustransformation (SUGEN, Inc.) gereinigt.
10. 4% DMSO in dH₂O.
11. 10 mM ATP in dH₂O.
12. 40 mM MnCl₂
13. Kinaseverdünnungspuffer (KDB): Man mische 10 ml Hepes (pH 7,5), 1 ml 5 M NaCl, 40 μl 100 mM Natriumorthovanadat und 0,4 ml an 5% BSA in dH₂O mit 88,56 ml dH₂O.
14. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten, Applied Scientific Katalog # AS-72092
15. EDTA: man mische 14,12 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit etwa 70 ml dH₂O. Man gebe 10 N NaOH zu, bis sich das EDTA auflöst. Man stelle den pH auf 8,0 ein. Man stelle das Gesamtvolumen mit dH₂O auf 100 ml ein.
16. 1⁰ Antikörperverdünnungspuffer: man mische 10 ml 5% BSA in PBS-Puffer mit 89,5 ml TBST.
17. monoklonaler Antiphosphotyrosinantikörper, der mit einer Meerrettichperoxidase (PY99 HRP, Santa Cruz Biotech) konjugiert ist.
18. 2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzthiazolin-6-Sulfonsäure (ABTS, Moss, Kat. Nr. ABST).
19. 10% SDS.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit 2 μg des polyEY-Peptids in sterilem PBS, wie in Schritt 3 von Materialien und Reagenzien beschrieben.
2. Man entferne die ungebundene Flüssigkeit durch Umdrehen der Platte aus den Kammern. Man wasche sie einmal mit TBST. Man klopfe die Platte auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Man gebe 100 μl 1% BSA in PBS in jede Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Man wiederhole Schritt 2.
5. Man tränke die Kammern mit 50 mmol HEPES (pH 7,5) (150 μl/Kammer).
6. Man verdünne die Testverbindung mit dH₂O/4% DMSO auf das 4-fache der gewünschten Assay-Endkonzentration in 96-Kammer-Polypropylenplatten.
7. Man gebe 25 μl der verdünnten Testverbindung zur ELISA-Platte. Man gebe 25 μl an dH₂O/4% DMSO in die Kammern mit der Kontrolle.
8. Man gebe 25 μl an 40 mM MnCl₂ mit 4× ATP (2 μM) zu jeder Kammer.
9. Man gebe 25 μl an 0,5 M EDTA zu den Kammern mit den Negativkontrollen.
10. Man verdünne GST-Flk1 auf 0,005 μg (5 ng)/Kammer mit KDB.
11. Man gebe 50 μl des verdünnten Enzyms zu jeder Kammer.
12. Man inkubiere unter Schütteln für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Man stoppe die Reaktion durch Zugabe von 50 μl an 250 mM EDTA (pH 8,0).
14. Man wasche 3× mit TBST und klopfe die Platte auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
15. Man gebe 100 μl pro Kammer des Antiphosphotyrosin-HRP-Konjugates zu, 1:5000 Verdünnung im Antikörperverdünnungspuffer. Man inkubiere unter Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur.
16. Man wasche wie unter Schritt 14.
17. Man gebe 100 μl der auf Raumtemperatur temperierten ABTS-Lösung zu jeder Kammer.
18. Man inkubiere unter Schütteln für 10 bis 15 Minuten. Man entferne alle Blasen.
19. Man stoppe die Reaktion durch Zugeben von 20 μl 10% SDS zu jeder Kammer.
20. Man lese die Ergebnisse auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät mit einem Testfilter bei 410 nM und einem Referenzfilter bei 630 nM aus.

PKY2-BIOASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die in vitro-Kinaseaktivität von mit HA-Epitop markierten Volllängen pyk2 (FL.pyk2-HA) in einem ELISA-Assay zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten.
2. 12CA5 monoklonaler Anti-HA-Antikörper (SUGEN, Inc.)
3. PBS (Dulbecco's Phosphat gepufferte Salzlösung (Gibco Katalog # 450-1300EB)
4. TBST-Puffer: für 1 l mische man 8,766 g NaCl, 6,057 g TRIS und 1 ml 0,1% Triton X-100 in etwa 900 ml dH₂O. Man stelle den pH auf 7,2 ein und stelle das Volumen auf 1 l ein.
5. Blockierpuffer: für 1 l mische man 100 g 10% BSA, 12,1 g 100 mM TRIS, 58,44 g 1 M NaCl und 10 ml 1% TWEEN-20.
6. FL.pyk2-HA aus den sf9-Zelllysaten (SUGEN, Inc.).
7. 4% DMSO in MilliQue H₂O.
8. 10 mM ATP in dH₂O.
9. 1 M MnCl₂.
10. 1 M MgCl₂.
11. 1 M Dithiothreitol (DTT).
12. 10× Kinasepufferphosphorylierung: Man mische 5,0 ml 1 M Hepes (pH 7,5), 0,2 ml 1 M MnCl₂, 1,0 ml 1 M MgCl₂, 1,0 ml 10% Triton X-100 in 2,8 ml dH₂O. Man füge kurz vom Verwenden 0,1 ml 1 M DTT zu.
13. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten.
14. 500 mM EDTA in dH₂O.
15. Antikörperverdünnungspuffer: für 100 ml, 1 ml 5% BSA/PBS und 1 ml 10% Tween-20 in 88 ml TBS.
16. HRP-konjugiertes Anti-Ptyr PY99, Santa Cruz Biotech Kat. Nr. SC-7020.
17. ABTS, Moss, Kat. Nr. ABST-2000.
18. 10% SDS.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit 0,5 μg pro Kammer an 12CA5 Anti-HA-Antikörper in 100 μl PBS. Man lagere sie Übernacht bei 4°C.
2. Man entferne ungebundene HA-Antikörper durch Umdrehen der Platte aus den Kammern. Man wasche die Platte mit dH₂O. Man klopfe die Platte auf ein Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Man gebe 150 μl Blockierpuffer zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Man wasche die Platten 4× mit TBS-T.
5. Man verdünne das Lysat in PBS (1,5 μg Lysat/100 μl PBS).
6. Man gebe 100 μl des verdünnten Lysats zu jeder Kammer. Schüttle sie bei Raumtemperatur für 1 h.
7. Man wasche wie unter Schritt 4.
8. Man gebe 50 μl des 2× Kinase-Puffers zur ELISA-Platte, die das Eingefangene pyk2-HA enthält.
9. Man gebe 25 μl der 400 μM Testverbindung in 4% DMSO zu jeder Kammer. Für Kammern mit Kontrollen werden nur 4% DMSO verwendet.
10. Man gebe 25 μl an 0,5 M EDTA zu den Kammern mit den Negativkontrollen.
11. Man gebe 25 μl an 20 μM ATP zu allen Kammern. Man inkubiere unter Schütteln für 10 Minuten.
12. Man stoppe die Reaktion durch Zugabe von 25 μl an 500 mM EDTA (pH 8,0) zu allen Kammern.
13. Man wasche wie unter Schritt 4.
14. Man gebe 100 μl mit HRP konjugiertes Anti-Ptyr, das auf 1:6000 verdünnt ist, in Antikörperverdünnungspuffer zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
15. Man wasche die Platte 3× mit TBST und 1× mit PBS.
16. Man gebe 100 μl an ABST-Lösung zu jeder Kammer.
17. Falls erforderlich, stoppe man die Entwicklungsreaktion durch Zugabe von 20 μl an 10% SDS zu jeder Kammer.
18. Man lese die Platte auf einem ELISA-Lesegerät mit einem Testfilter bei 410 nM und einem Referenzfilter bei 630 nM aus.

FGFR1 BIOASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die in vitro Kinaseaktivität für FGF1-R in einem ELISA-Assay zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Costar 96-Kammer-ELISA-Platten (Corning Katalog # 3369.
2. Poly(Glu-Tyr) (Sigma Katalog # P0275).
3. PBS (Gibco Katalog # 450-1300EB)
4. 50 mM Hepes Pufferlösung.
5. Blockierpuffer (5% BSA/PBS).
6. Gereinigtes GST-FGFR1 (SUGEN, Inc.)
7. Kinaseverdünnungspuffer. Man mische 500 μl 1 M Hepes (GIBCO), 20 μl 5% BSA/PBS, 10 μl 100 mM Natriumorthovanadat und 50 μl 5 M NaCl.
8. 10 mM ATP.
9. ATP/MnCl₂ Phosphorylierungsmischung: Man mische 20 μl ATP, 400 μl 1 M MnCl₂ und 9,56 ml dH₂O.
10. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten (Applied Scientific Katalog # AS-72092).
11. 0,5 M EDTA.
12. 0,05% TBST. Man gebe 500 μl TWEEN zu einem Liter TBS.
13. Polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen (SUGEN, Inc.).
14. Anti-Hasen IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (Biosource, Katalog # ALI0404).
15. ABTS-Lösung.
16. ABTS/H₂O₂-Lösung.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte die Costar 96-Kammer-ELISA-Platten mit 1 μg pro Kammer Poly(Glu,Tyr) in 100 μl PBS. Man lagere sie über Nacht bei 4°C.
2. Man wasche beschichtete Platten einmal mit PBS.
3. Man gebe 150 μl an 5% BSA/PBS-Blockierpuffer zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
4. Man wasche die Platte 2× mit PBS und dann einmal mit 50 mM Hepes. Man klopfe die Platten auf einen Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Man gebe 25 μl an 0,4 mM Testverbindung in 4% DMSO oder 4% DMSO alleine (Kontrolle) zur Platte.
6. Man verdünne gereinigtes GST-FGFR1 im Kinaseverdünnungspuffer (5 ng Kinase/50 μl KDB/Kammer).
7. Man gebe 50 μl der verdünnten Kinase zu jeder Kammer.
8. Man starte die Kinasereaktion durch Zugabe von 25 μl/Kammer an frisch hergestelltem ATP/Mn++ (0,4 ml 1 M MnCl₂, 40 μl 10 mM ATP, 9,56 ml dH₂O), frisch hergestellt).
9. Dies ist eine schnelle Kinasereaktion, die man mit 25 μl an 0,5 M EDTA in einer Art und Weise ähnlich der Zugabe von ATP stoppen muss.
10. Man wasche die Platte 4× mit frischem TBST.
11. Herstellen des Antikörperverdünnungspuffers: pro 50 ml: Man mische 5 ml an 5% BSA, 250 μl an 5% Milch und 50 μl an 100 mM Natriumvanadat und stelle es mit 0,05% TBST auf das Endvolumen ein.
12. Man gebe 100 μl pro Kammer an Anti-Phosphotyrosin (1:10000 Verdünnung in ADB) zu. Man inkubiere unter Rühren für 1 h bei Raumtemperatur.
13. Man wasche wie unter Schritt 10.
14. Man gebe 100 μl pro Kammer an Biosource Anti-Hasen IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (1:6000 Verdünnung in ADB) zu. Man inkubiere unter Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur.
15. Man wasche wie unter Schritt 10 und dann mit PBS, um Blasen und überschüssiges TWEEN zu entfernen.
16. Man gebe 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jeder Kammer.
17. Man inkubiere unter Schütteln für 10 bis 20 Minuten. Man entferne alle Blasen.
18. Man lese das Assay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät aus: Testfilter bei 410 nM, Referenzfilter 630 nM.

EGFR BIOASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die in vitro Kinaseaktivität von FGF1-R in einem ELISA-Assay zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten.
2. SUMO1 monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.)
3. PBS.
4. TBST-Puffer.
5. Blockierpuffer: für 100 ml, mische man 5,0 g rosarote (Carnation) lösliche, fettfreie Milch^® mit 100 ml PBS.
6. A431 Zelllysat (SUGEN, Inc.).
7. TBS-Puffer.
8. TBS + 10% DMSO: für 1 l, mische man 1,514 g TRIS, 2,192 g NaCl und 25 ml DMSO; man stelle das Gesamtvolumen mit dH₂O auf 1 Liter ein.
9. ATP (Adenosin-5'-Triphosphat vom Pferdemuskel, Sigma Kat. Nr. A-5394), 1,0 mM Lösung in dH₂O. Dieses Reagenz sollte man kurz vor der Verwendung herstellen und auf Eis lagern.
10. 1,0 mM MnCl₂.
11. ATP/MnCl₂-Phosphorylierungsmischung: um 10 ml herzustellen, mische man 300 μl an 1 mM ATP, 500 μl MnCl₂ und 9,2 ml dH₂O. Man stelle es kurz vor der Verwendung her und lagere es auf Eis.
12. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten.
13. EDTA.
14. Polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen (SUGEN, Inc.).
15. Anti-Hasen IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (Biosource Kat. Nr. ALI0404).
16. ABTS.
17. 30% Wasserstoffperoxid.
18. ABTS/H₂O₂.
19. 0,2 M HCl.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit 0,5 μg SUMO1 in 100 μl PBS pro Kammer und lagere sie bei 4°C über Nacht.
2. Man entferne ungebundenes SUMO1 durch Umdrehen der Platte, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, aus den Kammern. Man wasche 1× mit dH₂O. Man klopfe die Platte auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Man gebe 150 μl des Blockierpuffers zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Man wasche die Platte 3× mit deionisiertem Wasser und dann einmal mit TBST. Man klopfe die Platte auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Man verdünne das Lysat in PBS (7 μg Lysat/100 μl PBS).
6. Man gebe 100 μl des verdünnten Lysats zu jeder Kammer. Man schüttle bei Raumtemperatur für 1 h.
7. Man wasche die Platten wie weiter oben unter 4.
8. Man gebe 120 μl TBS zur ELISA-Platte, die das eingefangene EGFR enthält.
9. Man verdünne die Testverbindung 1:10 in TBS und gebe sie in die Kammer.
10. Man gebe 13,5 μl der verdünnten Testverbindung zur ELISA-Platte. Man gebe 13,5 μl TBS in 10% DMSO zu den Kammern mit den Kontrollen.
11. Man inkubiere unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
12. Man gebe 15 μl Phosphorylierungsmischung zu allen Kammern, mit Ausnahme der Kammer mit der Negativkontrolle. Das Kammerendvolumen sollte bei etwa 150 μl mit 3 μM ATP/5 mM MnCl₂ Endkonzentration in jeder Kammer liegen. Man inkubiere unter Schütteln für 5 Minuten.
13. Man stoppe die Reaktion durch Zugabe von 16,5 μl EDTA-Lösung, während geschüttelt wird. Man schüttle für eine zusätzliche Minute.
14. Man wasche 4× mit deionisiertem Wasser, 2× mit TBST.
15. Man gebe 100 μl Anti-Phosphotyrosin (1:3000 Verdünnung in TBST) pro Kammer zu. Man inkubiere unter Schütteln für 30–45 min bei Raumtemperatur.
16. Man wasche wie weiter oben unter 4.
17. Man gebe 100 μl Biosource Anti-Hasen IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (1:2000 Verdünnung in TBST) zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
18. Man wasche wie weiter oben unter 4.
19. Man gebe 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jeder Kammer.
20. Man inkubiere 5 bis 10 Minuten unter Schütteln. Man entferne alle Blasen.
21. Falls erforderlich, stoppe man die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Kammer.
22. Man lese das Assay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät aus: Testfilter bei 410 nM, Referenzfilter bei 630 nM.

PDGFR BIOASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die in vitro Kinaseaktivität von FGF1-R in einem ELISA-Assay zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten.
2. 28D4C10 monoklonaler Anti-PDGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.)
3. PBS.
4. TBST-Puffer.
5. Blockierpuffer (der gleiche wie für das EGFR-Bioassay).
6. PDGFR-β exprimierendes NIH 3T3-Zelllysat (SUGEN, Inc.).
7. TBS-Puffer.
8. TBS + 10% DMSO.
9. ATP.
10. MnCl₂.
11. Kinasepufferphosphorylierungsmischung: für 10 ml, mische man 250 μl 1 M TRIS, 200 μl 5 M NaCl, 100 μl 1 M MnCl₂ und 50 μl 100 mM Triton X-100 in genügend dH₂O, um 10 ml herzustellen.
12. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten.
13. EDTA.
14. Polyklonales Anti-Phosphotyrosinserum vom Hasen (SUGEN, Inc.).
15. Anti-Hasen IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (Biosource Kat. Nr. ALI0404).
16. ABTS.
17. Wasserstoffperoxid, 30%-Lösung.
18. ABTS/H₂O₂.
19. 0,2 M HCl.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit 0,5 μg 28D4C10 in 100 μl PBS pro Kammer und lagere sie über Nacht bei 4°C.
2. Man entferne ungebundenes 28D4C10 durch Umdrehen der Platten, um Flüssigkeit zu entfernen, aus den Kammern. Man wasche 1× mit dH₂O. Man klopfe die Platten auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
3. Man gebe 150 μl des Blockierpuffers zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
4. Man wasche die Platte 3× mit deionisiertem Wasser und dann einmal mit TBST. Man klopfe die Platte auf einem Papiertuch aus, um überschüssige Flüssigkeit und Blasen zu entfernen.
5. Man verdünne das Lysat in HNTG (10 μg Lysat/100 μl HNTG).
6. Man gebe 100 μl des verdünnten Lysats zu jeder Kammer. Man schüttle sie bei Raumtemperatur für 60 min.
7. Man wasche die Platten wie unter Schritt 4 beschrieben.
8. Man gebe 80 μl der Kinasepufferarbeitsmischung zur ELISA-Platte, die das eingefangene PDGFR enthält.
9. Man verdünne die Testverbindung 1:10 in TBS in 96-Kammer Polypropylenplatten.
10. Man gebe 10 μl der verdünnten Testverbindung zur ELISA-Platte. Zu den Kammern mit den Kontrollen gebe man 10 μl TBS + 10% DMSO. Man inkubiere unter Schütteln für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Man gebe 10 μl ATP direkt zu allen Kammern, mit Ausnahme der Kammer mit der Negativkontrolle (das Kammerendvolumen sollte bei etwa 100 μl mit 20 μM ATP in jeder Kammer liegen). Man inkubiere 30 Minuten unter Schütteln.
12. Man stoppe die Reaktion durch Zugabe von 10 μl EDTA-Lösung zu jeder Kammer.
13. Man wasche 4× mit deionisiertem Wasser und zweimal mit TBST.
14. Man gebe 100 μl Anti-Phosphotyrosin (1:3000 Verdünnung in TBST) pro Kammer zu. Man inkubiere unter Schütteln für 30–45 min bei Raumtemperatur.
15. Man wasche wie unter Schritt 4.
16. Man gebe 100 μl Biosource Anti-Hasen IgG-Peroxidasekonjugat von der Ziege (1:2000 Verdünnung in TBST) zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur.
17. Man wasche wie unter Schritt 4.
18. Man gebe 100 μl der ABTS/H₂O₂-Lösung zu jeder Kammer.
19. Man inkubiere für 10 bis 30 Minuten unter Schütteln. Man entferne alle Blasen.
20. Falls erforderlich, stoppe man die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Kammer.
21. Man lesen das Assay auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät mit einem Testfilter bei 410 nM und einem Referenzfilter bei 630 nM aus.

ZELLULÄRES HER-2 KINASE-ASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die HER-2 Kinaseaktivität in ganzen Zellen in einem ELISA-Format zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. DMEM (GIBCO Katalog #11965-092).
2. Fötales Rinderserum (FBS, GIBCO Katalog #16000-044), hitzeinaktiviert für 30 Minuten bei 56°C in einem Wasserbad
3. Trypsin (GIBCO Katalog #25200-056).
4. L-Glutamin (GIBCO Katalog #25030-081)
5. HEPES (GIBCO Katalog #15630-080).
6. Wachstumsmedium Man mische 500 ml DMEM, 55 ml hitzeinaktiviertes FBS, 10 ml HEPES und 5,5 ml L-Glutamin.
7. Hungermedium Man mische 500 ml DMEM, 2,5 ml hitzeinaktiviertes FBS, 10 ml HEPES und 5,5 ml L-Glutamin.
8. PBS.
9. Flachbödige 96-Kammer Gewebekultur-Mikrotiter-Platten (Corning Katalog #25860).
10. 15 cm Gewebekulturschalen (Corning Katalog #08757148).
11. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten.
12. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten.
13. Costar Patronen zum Übertragen für den Transtar 96 (Costar Katalog #7610).
14. SUMO1: Monoklonaler Anti-EGFR-Antikörper (SUGEN, Inc.).
15. TBST-Puffer.
16. Blockierpuffer: 5% Carnation lösliche Milch^® in PBS.
17. EGF-Ligand: EGF-201, Shinko American, Japan. Man suspendiere Pulver in 100 μl an 10 mM HCl. Man gebe 100 μl 10 mM NaOH zu. Man gebe 800 μl PBS zu und übertrage es in ein Eppendorfgefäß und lagere es bis zum Gebrauch bei –20°C.
18. HNTG-Lysepuffer Für die Stammlösung 5× HNTG, mische man 23,83 g Hepes, 43,83 g NaCl, 500 ml Glycerol und 100 ml Triton X-100 und genügend dH₂O, um 1 l der Gesamtlösung herzustellen. Für 1× HNTG*, mische man 2 ml HNTG, 100 μl 0,1 M Na₃VO₄, 250 μl 0,2 M Na₄P₂O₇ und 100 μl EDTA.
19. EDTA.
20. Na₃VO₄. Um eine Stammlösung herzustellen, mische man 1,84 g Na₃VO₄ mit 90 ml dH₂O. Man stelle den pH auf 10 ein. Man koche sie erst für 1 Minute in der Mikrowelle (die Lösung wird klar). Kühle sie auf Raumtemperatur ab. Man stelle den pH auf 10 ein. Man wiederhole den Erhitzungs/Abkühlungs-Zyklus, bis der pH bei 10 bleibt.
21. 200 mM Na₄P₂O₇.
22. Polyklonales Antiserum vom Hasen, das für Phosphotyrosin spezifisch ist (Anti-Ptyr-Antikörper, SUGEN, Inc.).
23. Affinitätsgereinigtes Antiserum, Anti-Hasen IgG-Antikörper von der Ziege, Peroxidasekonjugat (Biosource Kat. # ALI0404).
24. ABTS-Lösung.
25. 30% Wasserstoffperoxidlösung.
26. ABTS/H₂O₂.
27. 0,2 M HCl.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte Corning 96-Kammer-ELISA-Platten mit SUMO1 bei 1,0 μg pro Kammer in PBS, 100 μl Endvolumen/Kammer. Man lagere sie Übernacht bei 4°C.
2. Am Tag des Gebrauchs, entferne man den Beschichtungspuffer und wasche die Platte 3 mal mit dH₂O und einmal mit TBST-Puffer. Alle Waschungen in diesem Assay sollte man auf diese Weise durchführen, soweit nichts anderes angegeben wird.
3. Man gebe 100 μl des Blockierpuffers zu jeder Kammer. Man inkubiere die Platte unter Schütteln für 30 min bei Raumtemperatur. Kurz vorm Gebrauch, wasche man die Platte.
4. Man verwende die EGFr/HER-2 chimäre/3T3-C7-Zelllinie für dieses Assay.
5. Man wähle Schalen mit 80–90% Konfluenz. Man sammle die Zellen durch Trypsinierung und zentrifugiere sie für 5 min bei 1000 rpm bei Raumtemperatur.
6. Man resuspendiere die Zellen in Hungermedium und zähle sie mit Trypanblau. Es ist eine Lebensfähigkeit von 90% erforderlich. Man impfe die Zellen in Hungermedium bei einer Dichte von 2500 Zellen pro Kammer an, 90 μl pro Kammer, in einer 96-Kammer Mikrotiterplatte. Man inkubiere die angeimpften Zellen Übernacht bei 37° bei 5% CO₂.
7. Man starte das Assay zwei Tage nach dem Animpfen.
8. Man löse die Testverbindungen in 4% DMSO auf. Man verdünnt die Proben dann direkt weiter auf Platten mit Hunger-DMEM. Üblicherweise wird diese Verdünnung 1:10 oder größer sein. Man überträgt dann alle Kammern mit einer weiteren 1:10-Verdünnung (10 μl Probe und Medium in 90 μl Hungermedium) auf die Zellplatte. Die DMSO-Endkonzentration sollte 1% oder niedriger sein. Eine Standardserienverdünnung kann ebenfalls verwendet werden.
9. Man inkubiere bei 5% CO₂, bei 37°C für 2 Stunden.
10. Man stelle den EGF-Liganden durch Verdünnen der Stamm-EGF-Lösung (16,5 μM) in warmem DMEM auf 150 nM her.
11. Man stelle frisches HNTG* her, dass für 100 μl pro Kammer ausreichend ist; man stelle es auf Eis.
12. Nach 2 Stunden Inkubation mit der Testverbindung, gebe man hergestellten EGF-Liganden zu den Zellen, 50 μl pro Kammer, für eine Endkonzentration von 50 nM. Die Kammern mit der Positivkontrolle erhalten die gleiche Menge an EGF. Die Negativkontrollen erhalten kein EGF. Man inkubiere bei 37°C für 10 min.
13. Man entferne die Testverbindung, EGF und DMEM. Man wasche die Zellen einmal mit PBS.
14. Man gebe HNTG* zu den Zellen, 100 μl pro Kammer. Man stelle es für 5 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entferne man den Blockierpuffer von der ELISA-Platte und wasche sie.
15. Man schabe die Zellen mit einem Mikropipettor von der Platte und homogenisiere das Zellmaterial durch wiederholtes Aspirieren und Dispensieren des HNTG*- Lysepuffers. Man übertrage das Lysat auf eine beschichtete, blockierte, gewaschene ELISA-Platte oder man verwendet eine Costar-Patrone zum Übertragen des Lysats auf die Platte.
16. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 1 h.
17. Man entferne das Lysat und wasche. Man gebe frisch verdünnten Anti-Ptyr-Antikörper (1:3000 in TBST) zur ELISA-Platte, 100 μl pro Kammer.
18. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min.
19. Man entferne den Anit-Ptyr-Antikörper und wasche. Man gebe frisch verdünnten BIOSOURCE-Antikörper zur ELISA-Platte (1:8000 in TBST, 100 μl pro Kammer).
20. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min.
21. Man entferne den BIOSOURCE-Antikörper und wasche. Man gebe frisch hergestellte ABTS/H₂O₂-Lösung zur ELISA-Platte, 100 μl pro Kammer.
22. Man inkubiere unter Schütteln für 5–10 Minuten. Man entferne alle Blasen.
23. Man stoppe die Reaktion durch Zugabe von 100 μl an 0,2 M HCl pro Kammer.
24. Man lese das Assay auf einen Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät mit einem Testfiltersatz bei 410 nM und einem Referenzfilter bei 630 nM aus.

CDK2/CYCLIN A ASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die in vitro Serin/Threoninkinaseaktivität des humanen cdk2/Cyclin A in einem Scintillation Proximity Assay (SPA) zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Wallac 96-Kammer Polyethylenterephthalat (flexi)-Platten (Wallac Katalog # 1450-401).
2. Amersham Redivue [γ³³P] ATP (Amersham Katalog #AH 9968).
3. Amersham Streptavidin beschichtete Polyvinyltoluen SPA-Kügelchen (Amersham Katalog #RPNQ0007). Man sollte die Kügelchen in PBS ohne Magnesium oder Calcium bei 20 mg/ml rekonstituieren.
4. Aktivierter cdk2/Cyclin A-Enzymkomplex, der aus Sf9-Zellen (SUGEN, Inc.) aufgereinigt wurde.
5. Biotinyliertes Peptid-Substrat (Debtide). Das Peptid Biotin-X-PKTPKKAKKL wird in dH₂O bei einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst.
6. Peptid/ATP-Mischung: für 10 ml, mische man 9,979 ml dH₂O, 0,00125 ml „kaltes" ATP, 0,010 ml Debtide und 0,010 ml γ³³P ATP. Die endgültige Konzentration pro Kammer wird bei 0,5 μM „kaltem" ATP, 0,1 μg Debtide und 0,2 μCi γ³³P ATP liegen.
7. Kinasepuffer: für 10 ml, mische man 8,85 ml dH₂O, 0,625 ml TRIS (pH 7,4), 0,25 ml 1 M MgCl₂, 0,25 ml 10% NP40 und 0,025 ml 1 M DTT und gebe dies kurz vor der Verarbeitung zu.
8. 10 mM ATP in dH₂O.
9. 1 M TRIS, pH wird mit HCl auf 7,4 eingestellt.
10. 1 M MgCl₂.
11. 1 M DTT.
12. PBS (Gibco Katalog # 14190-144).
13. 0,5 M EDTR.
14. Stopplösung: für 10 ml, mische man 9,25 ml PBS, 0,005 ml 100 mM ATP, 0,1 ml 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Triton X-100 und 1,25 ml an 20 mg/ml SPA Kügelchen.

Verfahrensablauf:

1. Man stelle die Lösungen mit den Testverbindungen bei 5× der gewünschten Endkonzentration in 5% DMSO her. Man gebe 10 μl zu jeder Kammer. Man verwende 10 μl 5% DMSO alleine in Kammern mit den Negativkontrollen.
2. Man verdünne 5 μl der cdk2/Cyclin A-Lösung mit 2,1 ml 2× Kinasepuffer.
3. Man gebe 20 μl Enzym zu jeder Kammer.
4. Man gebe 10 μl an 0,5 M EDTA zu den Kammern mit der Negativkontrolle.
5. Um die Kinasereaktion zu starten, gebe man 20 μl der Peptid/ATP-Mischung zu jeder Kammer. Man inkubiere ohne zu schütteln für 1 h.
6. Man gebe 200 μl Stopplösung zu jeder Kammer.
7. Man behalte alles für wenigstens 10 min bei.
8. Man zentrifugiere die Platte bei etwa 2300 rpm für 3–5 min.
9. Man zähle die Platte mittels Trilux oder einem ähnlichen Lesegerät aus.

MET TRANSPHOSPHORYLIERUNGSASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um die Phosphotyrosinniveaus auf einem Poly(Glutaminsäure:Tyrosin (4:1))-Substrat als Mittel zum Identifizieren von Agonisten/Antagonisten der met Transphosphorylierung des Substrates zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten, Corning Katalog # 25805-96.
2. Poly(Glu,Tyr) 4:1, Sigma, Kat. Nr. P 0275.
3. PBS, Gibco Katalog # 450-1300EB
4. 50 mM HEPES
5. Blockierpuffer: Man löse 25 g Rinderserumalbumin, Sigma Kat. Nr. A-7888, in 500 ml PBS auf und filtere es durch einen 4 μm Filter.
6. Gereinigtes GST-Fusionsprotein, das die Met-Kinasedomäne enthält, Sugen, Inc.
7. TBST-Puffer.
8. 10% wasserhaltiges (MilliQue H₂O) DMSO.
9. 10 ml wasserhaltiges (dH₂O) Adenosin-5'-Triphosphat, Sigma Kat. Nr. A-5394.
10. 2× Kinaseverdünnungspuffer: für 100 ml, mische man 10 ml 1 M HEPES bei pH 7,5 mit 0,4 ml 5% BSA/PBS, 0,2 ml 0,1 M Natriumorthovanadat und 1 ml 5 M Natriumchlorid in 88,4 ml dH₂O.
11. 4× ATP-Reaktionsmischung: für 10 ml, mische man 0,4 ml 1 M Manganchlorid und 0,02 ml 0,1 M ATP in 9,56 ml dH₂O.
12. 4× Mischung für Negativkontroll: für 10 ml, mische man 0,4 ml 1 M Manganchlorid in 9,6 ml dH₂O.
13. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten, Applied Scientific Catalog # S-72092.
14. 500 mM EDTA.
15. Antikörperverdünnungspuffer: für 100 ml, mische man 10 ml 5% BSA/PBS, 0,5 ml 5% Carnation lösliche Milch^® in PBS und 0,1 ml 0,1 M Natriumorthovanadat in 88,4 ml TBST.
16. Polyklonaler Anti-Phosphotyrosinantikörper vom Hasen, Sugen, Inc.
17. Anti-Hasen Meerrettichperoxidase konjugierter Antikörper von der Ziege, Biosource, Inc.
18. ABTS-Lösung: für 1 l, mische man 19,21 g Zitronensäure, 35,49 g Na₂HPO₄ und 500 mg ABTS mit ausreichend dH₂O um 1 l herzustellen.
19. ABTS/H₂O₂: Man mische 15 ml ABST-Lösung mit 2 μl H₂O₂ fünf Minuten vor der Verwendung.
20. 0,2 M HCl.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte ELISA-Platten mit 2 μg Poly(Glu-Tyr) in 100 μl PBS und lagere sie Übernacht bei 4°C.
2. Man blockiere die Platte mit 150 μl an 5% BSA/PBS für 60 min.
3. Man wasche die Platte zweimal mit PBS und einmal mit 50 mM Hepespuffer pH 7,4.
4. Man gebe 50 μl der verdünnten Kinase zu allen Kammern. (Die gereinigte Kinase wird mit dem Kinaseverdünnungspuffer verdünnt. Die Endkonzentration sollte bei 10 ng/Kammer liegen.)
5. Man gebe 25 μl der Testverbindung (in 4% DMSO) oder DMSO alleine (4% in dH₂O) für Kontrollen zur Platte.
6. Man inkubiere die Kinase/Verbindungsmischung für 15 Minuten.
7. Man gebe 25 μl an 40 mM MnCl₂ zu den Kammern mit der Negativkontrolle.
8. Man gebe 25 μl der ATP/MnCl₂-Mischung zu allen anderen Kammern (mit Ausnahme der Negativkontrollen). Man inkubiere für 5 min.
9. Man gebe 25 μl 500 mM EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
10. Man wasche die Platte 3× mit TBST.
11. Man gebe 100 μl des polyklonalen Anti-Ptyr vom Hasen, der auf 1:10000 im Antikörperverdünnungspuffer verdünnt wurde, zu jeder Kammer. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für eine Stunde.
12. Man wasche die Platte 3× mit TBST.
13. Man verdünne den Biosource HRP konjugierten Anti-Hasen-Antikörper 1:6000 im Antikörperverdünnungspuffer. Man gebe 100 μl pro Kammer zu und inkubiere bei Raumtemperatur unter Schütteln für eine Stunde.
14. Man wasche die Platte 1× mit PBS.
15. Man gebe 100 μl ABTS/H₂O₂-Lösung zu jeder Kammer.
16. Falls erforderlich, stoppe man die Entwicklungsreaktion durch Zugabe von 100 μl 0,2 M HCl pro Kammer.
17. Man lese die Platte auf einem Dynatech MR7000 ELISA-Lesegerät mit dem Testfilter bei 410 nM und dem Referenzfilter bei 630 nM aus.

IGF-1 TRANSPHOSPHORYLIERUNGSASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um das Phosphotyrosinniveau in Poly(Glutaminsäure:Tyrosin) (4:1) zur Identifikation von Agonisten/Antagonisten der gst-IGF-Transphosphorylierung eines Substrates zu messen.
Materialien und Reagenzien:

1. Corning 96-Kammer-ELISA-Platten.
2. Poly(Glu-Tyr) (4:1), Sigma Kat. Nr. P 0275.
3. PBS, Gibco Katalog # 450-1300EB.
4. 50 mM HEPES.
5. TBB-Blockierpuffer: für 1 l, mische man 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g Natriumchlorid und 10 ml 1% TWEEN-20.
6. Gereinigtes GST-Fusionsprotein, das die IGF-1-Kinasedomäne (Sugen, Inc.) enthält.
7. TBST-Puffer: für 1 l, mische man 6,057 g Tris, 8,766 g Natriumchlorid und 0,5 ml TWEEN-20 mit genügend dH₂O, um 1 Liter herzustellen.
8. 4% DMSO in Milli-Q H₂O.
9. 10 mM ATP in dH₂O.
10. 2× Kinaseverdünnungspuffer: für 100 ml, mische man 10 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 5% BSA in dH₂O, 0,2 ml 0,1 M Natriumorthovanadat und 1 ml 5 M Natriumchlorid mit genügend dH₂O, um 100 ml herzustellen.
11. 4× ATP-Reaktionsmischung: für 10 ml, mische man 0,4 ml 1 M MnCl₂ und 0,008 ml 0,01 M ATP und 9,56 ml dH₂O.
12. 4× Mischung für Negativkontrollen: Man mische 0,4 ml 1 M Manganchlorid in 9,60 ml dH₂O.
13. NUNC 96-Kammer V-bödige Polypropylenplatten.
14. 500 mM EDTA in dH₂O.
15. Antikörperverdünnungspuffer: für 100 ml, mische man 10 ml 5% BSA in PBS, 0,5 ml 5% Carnation lösliche Milch ohne Fett^® in PBS und 0,1 ml 0,1 M Natriumorthovanadat in 88,4 ml TBST.
16. Polyklonaler Antiphosphotyrosin-Antikörper vom Hasen, Sugen, Inc.
17. Anti-Hasen HRP konjugierter Antikörper von der Ziege, Biosource.
18. ABTS-Lösung.
20. ABTS/H₂O₂: Man mische 15 ml ABTS mit 2 μl H₂O₂ 5 Minuten vor der Verwendung.
21. 0,2 M HCl in dH₂O.

Verfahrensablauf:

1. Man beschichte eine ELISA-Platte mit 2,0 μg/Kammer Poly(Glu,Tyr) 4:1 (Sigma P0275) in 100 μl PBS. Man lagere die Platte Übernacht bei 4°C.
2. Man wasche die Platte einmal mit PBS.
3. Man gebe 100 μl des TBB-Blockierpuffers zu jeder Kammer. Man inkubiere die Platte für 1 Stunde unter Schütteln bei Raumtemperatur.
4. Man wasche die Platte einmal mit PBS und dann zweimal mit 50 mM Hepes-Puffer pH 7,5.
5. Man gebe 25 μl der Testverbindung in 4% DMSO (erhältlich durch Verdünnen einer Stammlösung aus 10 mM der Testverbindung in 100 DMSO mit dH₂O) zur Platte.
6. Man gebe 10,0 ng der gst-IGF-1-Kinase in 50 μl Kinaseverdünnungspuffer zu allen Kammern.
7. Man starte die Kinasereaktion durch Zugabe von 25 μl 4× ATP-Reaktionsmischung zu allen Testkammern und den Kammern mit der Positivkontrolle. Man gebe 25 μl 4× der Mischung für die Negativkontrollen zu allen Kammern mit der Negativkontrolle. Man inkubiere für 10 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur.
8. Man gebe 25 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) zu allen Kammern.
9. Man wasche die Platte 4× mit TBST-Puffer.
10. Man gebe polyklonales Anti-Phosphotyrosinantiserum vom Hasen mit einer Verdünnung von 1:10000 in 100 μl Antikörperverdünnungspuffer zu allen Kammern. Man inkubiere unter schütteln bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
11. Man wasche die Platte wie unter Schritt 9.
12. Man gebe 100 μl Biosource Anti-Hasen HRP mit einer Verdünnung von 1:10000 im Antikörperverdünnungspuffer zu allen Kammern. Man inkubiere unter Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Stunde.
13. Man wasche die Platte wie unter Schritt 9 und folge mit einer Waschung mit PBS, um die Blasen und überschüssiges Tween-20 zu verringern.
14. Man entwickle durch Zugabe von 100 μl/Kammer ABTS/H₂O₂ zu jeder Kammer.
15. Nach etwa 5 Minuten, liest man auf einem ELISA-Lesegerät mit dem Testfilter bei 410 nm und dem Referenzfilter bei 630 nm aus.

ASSAYS ZUM EINBAUEN VON BRDU
Die folgenden Assays verwenden Zellen, die verändert worden sind, um einen ausgewählten Rezeptor zu exprimieren und dann die Wirkung einer entsprechenden Verbindung auf die Aktivität der Liganden-induzierten DNA-Synthese durch Bestimmen des BrdU-Einbaus in die DNA zu evaluieren.
Die folgenden Materialien, Reagenzien und Verfahren sind allgemeingültig für alle folgenden Assays zum Einbauen von BrdU. Unterschiede bei den spezifischen Assays werden angemerkt.
Materialien und Reagenzien:

1. Den passenden Liganden.
2. Die passenden veränderten Zellen.
3. BrdU-Markierungsreagenz: 10 mM in PBS (pH 7,4) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
4. FixDenat: Fixierungslösung (gebrauchsfertig) (Boehringer Mannheim, Deutschland).
5. Anti-BrdU-POD: Monoklonaler Antikörper der Maus, der mit einer Peroxidase konjugiert ist (Boehringer Mannheim, Deutschland).
6. TMB-Substratlösung: Tetramethylbenzidin (TMB, Boehringer Mannheim, Deutschland).
7. PBS-Waschlösung: 1× PBS, pH 7,4.
8. Albumin vom Rind (BSA), Fraktion-V-Pulver (Sigma Chemical Co., USA).

Allgemeiner Verfahrensablauf:

1. Die Zellen werden mit 8000 Zellen/Kammer in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM, in einer 96-Kammer/Platte angeimpft. Die Zellen werden Übernacht bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert.
2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und werden dann in einem serumfreien Medium (0% CS DMEM mit 0,1% BSA) für 24 Stunden ausgehungert ("serum starved").
3. Am dritten Tag werden der passende Ligand und die Testverbindung gleichzeitig zu den Zellen gegeben. Die Kammern mit den Negativkontrolle erhalten nur serumfreies DMEM mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrolle erhalten den Liganden jedoch nicht die Testverbindungen. Die Testverbindungen werden in serumfreiem DMEM mit dem Liganden in einer 96-Kammer-Platte hergestellt und für 7 Testkonzentrationen fortlaufend verdünnt.
4. Nach 18 Stunden der Ligandenaktivierung, wird verdünntes BrdU-Markierungsreagenz (1:100 in DMEM, 0,1% BSA) zugegeben, und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration = 10 μM) für 1,5 Stunden inkubiert.
5. Nach der Inkubation mit dem Markierungsreagenz wird das Medium durch Dekantieren und ausklopfen der umgedrehten Platte auf einem Papiertuch entfernt. Man gibt FixDenat-Lösung zu (50 μl/Kammer), und die Platten werden bei Raumtemperatur für 45 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubiert.
6. Die FixDenat-Lösung wird durch Dekantieren und Ausklopfen der umgedrehten Platte auf einem Papiertuch gründlich entfernt. Milch wird (5% dehydrierte Milch in PBS, 200 μl/Kammer) als Blockierlösung zugegeben, und die Platte wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
7. Die Blockierlösung wird durch Dekantieren entfernt und die Kammern werden einmal mit PBS gewaschen. Man gibt die Anti-BrdU-POD-Lösung (1:200 Verdünnung in PBS, 1% BSA) zu (50 μl/Kammer), und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert.
8. Das Antikörperkonjugat wird durch Dekantieren und fünfmaliges Ausspülen der Kammern mit PBS entfernt, und die Platte wird durch Umdrehen und Ausklopfen auf einem Papiertuch getrocknet.
9. Die TMB-Substratlösung wird zugegeben (100 μl/Kammer) und für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubiert, bis die Farbentwicklung für die photometrische Detektion ausreichend ist.
10. Das Absorbtionsvermögen der Proben wird bei 410 nm (im „dualen Wellenlängen"-Modus mit einem Filter, der bei 490 nm, als Referenzwellenlänge, ausliest) auf einem Dynatech ELISA-Platten-Lesegerät gemessen.

EGF-induziertes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. EGF von der Maus, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFRc7.

EGF-induziertes Her-2 getriebenes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. EGF von der Maus, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr mit einer Her-2-Kinasedomäne).

EGF-induziertes Her-4 getriebenes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. EGF von der Maus, 201 (Toyobo Co., Ltd., Japan).
2. 3T3/EGFr/Her4/EGFr (EGFr mit einer Her-4-Kinasedomäne)

PDGF-induziertes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. Humanes PDGF B/B (Boehringer Mannheim, Deutschland).
2. 3T3/EGFRc7.

FGF-induziertes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. Humanes FGF2/bFGF (Gibco BRL, USA).
2. 3T3c7/EGFr

IGF1-induziertes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. Humane Rekombinante (G511, Promega Corp., USA)
2. 3T3/IGF1r.

Insulin-induziertes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. Insulin, kristallines, Rinder, Zink (13007, Gibco BRL, USA).
2. 3T3/H25.

HGF-induziertes Assay zum Einbau von BrdU
Materialien und Reagenzien:

1. Rekombinantes, humans HGF (Kat. Nr. 249-HG, R&D-Systems, Inc. USA).
2. BxPC-3-Zellen (ATCC CRL-1687).

Verfahrensablauf:

1. Die Zellen werden mit 9000 Zellen/Kammer in RPMI 10% FBS in einer 96-Kammer-Platte angeimpft. Die Zellen werden Übernacht bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert.
2. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit PBS gewaschen und dann werden sie in 100 μl serumfreiem Medium (RPMI mit 0,1% BSA) für 24 Stunden ausgehungert ("serum starved").
3. Am 3. Tag werden 25 μl, die dem Liganden (hergestellt mit 1 μg/ml in RPMI mit 0,1% BSA; HGF-Endkonzentration liegt bei 200 ng/ml) und die Testverbindungen enthalten, zu den Zellen zugegeben. Die Kammern mit der Negativkontrolle erhalten nur 25 μl serumfreies RPMI mit 0,1% BSA; die Zellen der Positivkontrolle erhalten den Liganden (HGF), jedoch keine Testverbindung. Die Testverbindungen werden mit 5-mal ihrer Endkonzentration in serumfreiem RPMI mit den Liganden in einer 96-Kammer-Platte hergestellt und fortlaufend verdünnt, um 7 Testkonzentrationen zu erhalten. Üblicherweise liegt die höchste Endkonzentration der Testverbindung bei 100 μM, und es werden 1:3 Verdünnungen verwendet (d.h. Endkonzentrationsbereich der Testverbindung liegt bei 0,137–100 μM).
4. Nach 18 Stunden der Ligandenaktivierung werden 12,5 μl des verdünnten BrdU-Markierungsreagenzes (1:100 in RPMI, 0,1% BSA) zu jeder Kammer gegeben, und die Zellen werden mit BrdU (Endkonzentration ist 10 μM) für 1 Stunde inkubiert.
5. Genauso wie beim allgemeinen Verfahren.
6. Genauso wie beim allgemeinen Verfahren.
7. Die Blockierlösung wird durch Dekantieren entfernt und die Kammern werden einmal PBS gewaschen. Die Anti-BrdU-POD-Lösung (1:100 Verdünnung in PBS, 1% BSA) wird zugegeben (100 μl/Kammer), und die Platte wird für 90 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Plattenschüttler inkubiert.
8. Genauso wie beim allgemeinen Verfahren.
9. Genauso wie beim allgemeinen Verfahren.
10. Genauso wie beim allgemeinen Verfahren.

HUV-EC-C-Assay
Dieses Assay wird verwendet, um die Aktivität einer Verbindung gegenüber PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF oder Flk-1/KDR, wobei alle natürlicherweise von HUV-EC-Zellen exprimiert werden, zu messen.
TAG 0

1. Man wasche und trypsiniere die HUV-EC-C-Zellen humane Nabelschnurvenenendothelzellen, American Type Culture Collection, Katalog Nr. 1730 CRL). Man wasche sie mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS, erhältlich bei Gibco BRL, Katalog Nr. 14190-029) 2 mal bei etwa 1 ml/10 cm² der Gewebekulturschale. Trypsiniere sie mit 0,05% Trypsin-EDTA in einer nichtenzymatischen Zelldissoziationslösung (Sigma Chemical Company, Katalog Nr. C-1544). Das 0,05% Trypsin wird durch Verdünnen von 0,25% Trypsin/1 mM EDTA (Gibco, Katalog Nr. 25200-049) in der Zelldissoziationslösung hergestellt. Trypsinisiere mit etwa 1 ml/25–30 cm² der Gewebekulturschale für etwa 5 Minuten bei 37°C. Nachdem sich die Zellen von der Schale abgelöst haben, gebe man das gleiche Volumen an Assay-Medium hinzu und übertrage sie in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen (Fisher Scientific, Katalog Nr. 05-539-6).
2. Man wasche die Zellen mit etwa 35 ml Assaymedium in einem 50 ml sterilen Zentrifugenröhrchen durch Zugabe des Assaymediums, man zentrifugiere für 10 Minuten bei etwa 200 × g, man verwerfe den Überstand und resuspendiere mit 35 ml D-PBS. Man wiederhole die Waschung zweimal mit D-PBS und resuspendiere die Zellen in etwa 1 ml Assaymedium/15 cm² der Gewebekulturschale. Das Assaymedium besteht aus F12K-Medium (Gibco BRL, Katalog Nr. 21127-014) und 0,5% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum. Man zähle die Zellen mit einem Coulter Counter^® (Coulter Electronics, Inc.) und gebe das Assaymedium zu den Zellen, um eine Konzentration von 0,8–1,0 × 10⁵ Zellen/ml zu erhalten.
3. Man gebe Zellen zu den 96-Kammer flachbödigen Platten bei 100 μl/Kammer oder 0,8–1,0 × 10⁴ Zellen/Kammer und inkubiere ~24 h bei 37°C, 5% CO₂.

TAG 1

1. Man stelle zweifach Testverbindungstitrationen in separaten 96-Kammer-Platten her, im allgemeinen von 50 μM herunter bis auf 0 μM. Man verwende das gleiche Assaymedium wie am Tag 0, Schritt 2 weiter oben, erwähnt. Die Titrationen werden durch Zugabe von 90 μl/Kammer der Testverbindung bei 200 μM (4× der Kammer Endkonzentration) zur oberen Kammer einer bestimmten Plattenspalte durchgeführt. Da die Stamm-Testverbindung im Allgemeinen bei 20 mM in DMSO vorliegt, enthalten die 200 μM Arzneimittelkonzentration 2% DMSO. Ein Verdünnungsmittel, hergestellt aus 2% DMSO im Assaymedium (F12K + 0,5% fötales Rinderserum) wird als Verdünnungsmittel für die Testverbindungstitrationen verwendet, um die Testverbindung zu verdünnen, die DMSO-Konzentration jedoch konstant zu halten. Man gebe dieses Verdünnungsmittel mit 60 μl/Kammer zu den verbleibenden Kammern in der Spalte. Man entnehme 60 μl aus den 120 μl der 200 μM Testverbindungsverdünnung in der oberen Kammer der Spalte und mische sie mit den 60 μl in der zweiten Kammer der Spalte. Man entnehme 60 μl aus dieser Kammer und mische sie mit den 60 μl in der dritten Kammer der Spalte usw., bis die zweifach Titrationen vollständig sind. Wenn die vorletzte Kammer zusammengemischt wird, nimmt man 60 μl aus den 120 μl in dieser Kammer und verwirft sie. Man behält die letzte Kammer mit 60 μl der DMSO/Mediumverdünnung als eine die Testverbindung nicht enthaltende Kontrolle bei. Man erstelle 9 Spalten mit titrierter Testverbindung, genügend für dreimal so viele Kammern, jede für: (1) VEGF (erhalten bei Pepro Tech Inc.), Katalog Nr. 100–200, (2) den endothelen Zellwachstumsfaktor (ECGF) (auch bekannt als saurer Fibroblastenwachstumsfaktor oder aFGF) (erhalten bei Boehringer Mannheim Biochemica, Katalog Nr. 1439 600), oder (3) humanes PDGF B/B (1276-956, Boehringer Mannheim, Deutschland) und eine Assaymediumkontrolle. ECGF kommt als Zubereitung mit Natriumheparin.
2. Man gebe 50 μl/Kammer der Testverbindungsverdünnungen zu den 96-Kammer-Assayplatten, die 0,8–1,0 × 10⁹ Zellen/100 μl/Kammer der HUV-EC-C-Zellen vom Tag 0 enthalten und inkubiere sie ~2 h bei 37°C, 5% CO₂.
3. Man gebe 50 μl/Kammer an 80 μg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF oder Mediumkontrolle dreifach zu jeder Testverbindungskondition. Wie bei den Testverbindungen entsprechen die Wachstumsfaktorkonzentrationen 4× der gewünschten Endkonzentration. Man verwende das Assaymedium vom Tag 0, Schritt 2, um die Konzentrationen für die Wachstumsfaktoren zu erstellen. Man inkubiere für etwa 24 Stunden bei 37°C, 5% CO₂. Jede Kammer wird 50 μl der Testverbindungsverdünnung, 50 μl des Wachstumsfaktors oder des Mediums und 100 μl Zellen enthalten, was insgesamt 200 μl/Kammer ergibt. Demnach werden die 4× Konzentrationen der Testverbindungen und der Wachstumsfaktoren zu 1×, sobald einmal alles zu den Kammern zugegeben worden ist.

TAG 2

1. Man gebe ³H-Thymidin (Amersham, Katalog Nr. TRK-686) bei 1 μCi/Kammer (10 μl/Kammer an 100 μCi/ml Lösung, hergestellt in RPMI-Medium + 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum) hinzu und inkubiere ~24 h bei 37°C, 5% CO₂. RPMI wird bei Gibco BRL, Katalog Nr. 11875-051 erhalten.

TAG 3

1. Man friere die Platten Übernacht bei –20°C ein.

TAG 4
Man taue die Platten auf und ernte mit einem 96-Kammer Plattenerntegerät (Tomtec Harvester 96^®) auf Filtermatten (Wallac, Katalog Nr. 1205-401) ab, man lese die Treffer auf einem Wallac Betaplate^TM-Liquid-Scintillationszähler aus.
Bioassays, die verwendet worden sind oder verwendet werden können, um die Verbindungen zu evaluieren, werden im Detail weiter unten beschrieben. Die Verbindungen 1–9 wurden getestet und waren in den flkGST-, FGFR1- und PDGF-Assays aktiv.
IN VIVO TIERMODELLE
XENOTRANSPLANTAT TIERMODELLE
Die Fähigkeit humaner Tumoren als Xenotransplantate in athymischen Mäusen (z.B., Balb/c, nu/nu) zu wachsen, stellt ein nützliches in vivo Modell zum Studieren der biologischen Reaktion auf Therapien für humane Tumoren dar. Seit der ersten erfolgreichen Xenotransplantation humaner Tumoren in athymischen Mäusen (Rygaard und Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77: 758–760) sind viele verschiedene humane Tumorzelllinien (z.B., Brust, Lungen, urogenital-, gastrointestinal-, Kopf- und Hals-, Glioblastom, Knochen und maligne Melanome) transplantiert worden und wuchsen erfolgreich in Nacktmäusen. Die folgenden Assays können verwendet werden, um das Aktivitätsniveau, die Spezifität und die Wirkung der verschiedenen Verbindungen der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Drei allgemeine Assaytypen sind für die Evaluierung der Verbindungen verwendbar: zellulär/katalytisch, zellulär/biologisch und in vivo. Das Ziel der zellulären/katalytischen Assays ist es, die Wirkung einer Verbindung auf die Fähigkeit einer TK Tyrosin an einem bekannten Substrat in einer Zelle zu phosphorylieren, zu bestimmen. Das Ziel der zellulären/biologischen-Assays ist es, die Wirkung einer Verbindung auf die biologische Reaktion, die durch eine TK in einer Zelle stimuliert wird, zu bestimmen. Das Ziel der in vivo-Assays ist es, die Wirkung einer Verbindung in einem Tiermodell einer bestimmten Störung, wie zum Beispiel Krebs, zu bestimmen.
Geeignete Zelllinien für subkutane Xenotransplantatexperimente schließen C6-Zellen (Gliom, ATCC # CCL 107), A375-Zellen (Melanom, ATCC # CRL 1619), A431-Zellen (Plattenepithelkarzinom, ATCC # CRL 1555), Calu-6-Zellen (Lunge, ATCC # HTB 56), PC3-Zellen (Prostata, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5-Zellen und NIH 3T3-Fibroblasten, die genetisch verändert wurden, um EGFR, PDGFR, IGF-1R oder jede andere Testkinase überzuexprimieren, ein. Das folgende Protokoll kann verwendet werden, um Xenotransplantatexperimente durchzuführen.
Weibliche athymische Mäuse (BALB/c, nu/nu) werden bei den Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) erhalten. Alle Tiere werden unter Reinraumbedingungen in Mikroisolatorkäfigen mit Alpha-dri-Ausbettung gehalten. Sie erhalten steriles Nagetierfutter und Wasser ad libitum.
Die Zelllinien werden in geeignetem Medium (zum Beispiel, MEM, DMEM, Ham's F10 oder Ham's F12 plus 5%–10% fötalem Rinderserum (FBS) und 2 mM Glutamin (GLN)) herangezogen. Alle Zellkulturmedien, Glutamin und fötales Rinderserum werden bei Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) bezogen, soweit nichts anderes angegeben wird. Alle Zellen werden in einer feuchten Atmosphäre von 90–95% Luft und 5–10% CO₂ bei 37°C herangezogen. Alle Zelllinien werden routinemäßig zweimal pro Woche subkultiviert und sind Mycoplasma negativ, was durch das Mycotect-Verfahren (Gibco) bestätigt wird.
Die Zellen werden bei oder bei fast Konfluenz mit 0,05 Trypsin-EDTA abgeerntet und bei 450 × g für 10 min pelletiert. Die Pellets werden in sterilem PBS oder Medium (ohne FBS) bis auf eine bestimmte Konzentration resuspendiert und die Zellen werden dann in die Hinterflanke der Mäuse (8–10 Mäuse pro Gruppe, 2–10 × 10⁶ Zellen/Tier) implantiert. Das Tumorwachstum wird über 3 bis 6 Wochen mittels eines Tastzirkels gemessen. Die Tumorvolumen werden als Produkt der Länge × Breite × Höhe berechnet, soweit nichts anderes angegeben wird. Die P-Werte werden mittels des Students t-Test berechnet. Die Testverbindungen in 50–100 μl Hilfsstoff (DMSO oder VPD:D5W) können durch IP Injektion in unterschiedlichen Konzentrationen, allgemein am ersten Tag nach der Implantation startend, verabreicht werden.
TUMORINVASIONSMODELL
Das folgende Tumorinvasionsmodell ist entwickelt worden und kann für die Evaluierung des therapeutischen Werts und der Wirksamkeit der Verbindungen, die als den KDR/FLK-1-Rezeptor selektiv inhibierend identifiziert worden sind, verwendet werden.
Verfahrensablauf
8 Wochen alte Nacktmäuse (weiblich) (Simonsen Inc.) werden als Versuchstiere verwendet. Die Implantation der Tumorzellen kann in einem laminaren Flow-Hood durchgeführt werden. Für die Anästhesie wird ein Xylazin/Ketamin-Cocktail (100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin) intraperitoneal verabreicht. Ein Medianschnitt wird durchgeführt, um die abdominale Höhlung (etwa 1,5 cm in der Länge) freizulegen, um 10⁷ Tumorzellen in einem Volumen von 100 μl Medium zu injizieren. Die Zellen werden entweder in den duodenalen Lappen des Pankreas oder unter die Serosa des Dickdarms injiziert. Das Peritoneum und die Muskeln werden mit einer 6-0 fortlaufenden Seitennaht verschlossen und die Haut wird mittels einer Wundklammer verschlossen. Die Tiere werden täglich beobachtet.
Analyse
Nach 2–6 Wochen, abhängig von den allgemeinen Beobachtungen der Tiere, werden die Mäuse getötet und die lokalen Tumormetastasen verschiedener Organe (Lunge, Lebe, Gehirn, Magen, Milz, Herz, Muskel) werden entnommen und analysiert (Messung der Tumorgröße, Invasionsgrad, Immunochemie, in situ Hybridisationsbestimmung, etc.).
C-KIT ASSAY
Dieses Assay wird verwendet, um das Niveau der C-Kit-Tyrosin-Phosphorylierung zu detektieren.
MO7E (humane akute granulozitäre Leukämie)-Zellen werden Übernacht in 0,1% Serum ausgehungert. Die Zellen werden mit der Verbindung vor der Ligandenstimulation vorbehandelt (gleichzeitig zum Aushungern ("serum starved")). Die Zellen werden mit 250 ng/ml rh-SCF für 15 Minuten stimuliert. Nach der Stimulation werden die Zellen lysiert und mit einem Anti-C-Kit-Antikörper immunopräzipitiert. Phosphotyrosin- und Proteinniveaus werden durch Western-Blot bestimmt.
MTT PROLIFERATIONSASSAY
MO7E-Zellen werden ausgehungert ("serum starved") und mit einer Verbindung, wie sie bei den Phosphorylierungsexperimenten beschrieben wurde, vorbehandelt. Die Zellen werden mit 4 × 10⁵ Zellen/Kammer in einer 96-Kammer-Kulturschale in 100 μl RPMI + 10% Serum ausplattiert. Man gibt rh-SCF (100 ng/ml) zu und die Platte wird für 48 Stunden inkubiert. Nach 48 Stunden werden 10 μl an 5 mg/ml MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) zugegeben und man lässt sie für 4 Stunden inkubieren. Saures Isopropanol (100 μl an 0,04 N HCl in Isopropanol) wird hinzugegeben und die optische Dichte wird bei einer Wellenlänge von 550 nm gemessen.
APOPTOSEASSAY
MO7E-Zellen werden +/–SCF und +/–Verbindung in 10% FBS mit rh-GM-CSF (10 ng/ml) und rh-IL-3 (10 ng/ml) inkubiert. Die Proben werden nach 24 und 48 Stunden untersucht. Um die aktivierte Caspase-3 zu messen, werden die Proben mit PBS gewaschen und mit eiskaltem 70% Ethanol permeabilisiert. Die Zellen werden dann mit PE-konjugiertem, polyklonalem anti-aktivem Caspase-3 vom Hasen gefärbt und durch FACS analysiert. Um abgespaltenes PARP zu messen, werden die Proben lysiert und durch Western-Blot mit einem Anti-PARP-Antikörper analysiert.
Zusätzliche Assays
Zusätzliche Assays, die verwendet werden können, um die Verbindungen dieser Erfindung zu evaluieren, schließen, ohne Begrenzung, ein bio-flk-1-Assay, ein EGF-Rezeptor-HER2-chimeräres Rezeptorassay in ganzen Zellen, ein bio-src-Assay, ein bio-lck-Assay und ein Assay, das wie Phosphorylierungsfunktion von raf mißt, ein. Die Protokolle für jedes dieser Assays können in der U.S. Anmeldung mit der Ser. Nr. 09/099,842, die hierin, einschließlich aller Zeichnungen, aufgenommen wird, gefunden werden.
Messung der Zelltoxizität
Therapeutische Verbindungen sollten beim Inhibieren der Rezeptor-Tyrosinkinaseaktivität potenter sein, als beim Ausüben einer cytotoxischen Wirkung. Eine Messung der Wirksamkeit und der Zelltoxizität einer Verbindung kann durch Bestimmen des therapeutischen Indexs, d.h., IC₅₀/LD₅₀, erhalten werden. IC₅₀, die Dosis, die erforderlich ist, um eine 50% Inhibition zu erzielen, kann mit Standardtechniken, zum Beispiel den hierin beschrieben, gemessen werden. LD₅₀, die Dosis, die zu einer 50% Toxizität führt, kann ebenfalls durch Standardtechniken als auch (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55–63) durch Messen der Menge an freigesetzter LDH (Korzeniewski und Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313, Decker und Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115: 61) oder durch Messen der letalen Dosis in Tiermodellen gemessen werden. Verbindungen mit einem hohen therapeutischen Index werden bevorzugt. Der therapeutische Index sollte größer sein als 2, bevorzugt wenigstens 10, am meisten bevorzugt wenigstens 50.

Claims

Eine Verbindung der Formel (I):
wobei R¹ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halo, C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₄ Haloalkoxy, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, -C(O)-R⁸, -NR⁹R¹⁰ und -C(O)NR¹²R¹³ besteht, ausgewählt wird; R² aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halo, C₁-C₁₀ Alkyl, Trihalomethyl, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, Cyano, -NR⁹R¹⁰, -NR⁹C(O)R10, -C(O)R⁸, -S(O)₂NR⁹R¹⁰ und -SO₂R¹⁴ (wobei R¹⁴ C₁-C₁₀ Alkyl, C₆-C₁₂ Aryl, C₁-C₄ Alkyl, das mit C₆-C₁₂ Aryl substituiert ist, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, und C₁-C₄ Alkyl, das mit einem 5–12 gliedrigem Heteroaryl, der 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt sind, substituiert ist, ist) besteht, ausgewählt wird; R³, R⁴ und R⁵ unabhängig Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl sind; Z C₆-C₁₂ Aryl, 5–12 gliedriges Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome ausgewählt aus N, O oder S besitzt, 3–8 gliedriges gesättigtes Heterocyclyl, das 1 oder 2 Ringheteroatome ausgewählt aus N, O oder S(O)_n, wobei n = 0–2 ist, besitzt, -NR¹⁵R¹⁶, wobei R¹⁵ und R¹⁶ unabhängig Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl sind; oder R¹⁵ und R¹⁶ zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, ist; R⁶ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff oder C₁-C₁₀ Alkyl besteht, ausgewählt wird; R⁷ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl, C₆-C₁₂ Aryl, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besitzt, und -C(O)R¹⁷ wie unten definiert besteht, ausgewählt wird; R⁸ aus der Gruppe, die aus Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, C₆-C₁₂ Aryloxy, und einem 5–12 gliedrigem Heteroaryloxy, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besteht, ausgewählt wird; R⁹ und R¹⁰ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₁₀ Cyanoalkyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, C₆-C₁₂ Aryl und einem 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besteht, ausgewählt werden; oder R⁹ und R¹⁰ zusammengenommen eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n, wobei n = 0–2 ist ausgewählt werden; R¹² und R¹³ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl, C₁-C₁₀ Hydroxyalkyl und C₆-C₁₂ Aryl besteht, ausgewählt werden; oder R¹² und R¹³ zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind, eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, besteht, ausgewählt werden; R¹⁷ aus der Gruppe, die aus C₁-C₁₀ Alkyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, C₆-C₁₂ Aryl, Hydroxy und 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, besteht, ausgewählt wird; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon; vorausgesetzt dass die Verbindung nicht
ist und wobei C₁-C₁₀ Alkyl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) aus Halo, Hydroxy, C₁-C₄ Alkoxy, C₆-C₁₂ Aryl, C₆-C₁₂ Aryloxy, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, -C(O)R⁸, -NR⁹R¹⁰ und -C(O)NR⁹R¹⁰ ausgewählt wird; C₃-C₈ monocyclisches Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertes bicyclisches Cycloalkyl und Adamantyl substituiert oder unsubstituiert sein können, und falls sie substituiert sind die Substituentengruppe(n) eine oder zwei Gruppen ist, die unabhängig aus C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Trihaloalkyl, Halo, Hydroxy, C₁-C₄ Alkoxy, C₆-C₁₂ Aryl, C₆-C₁₂ Aryloxy, 6-gliedrigem Heteroaryl, das 1–3 Stickstoffringatome besitzt, 5-gliedrigem Heteroaryl, das 1–3 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, eine 5 oder 6-gliedrige heteroalicyclische Gruppe, die 1–3 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, Mercapto, C₁-C₄ S-Alkyl, C₆-C₁₂ S-Aryl, Cyano, -C(O)R'', -C(S)-R'', -OC(O)NR¹²R¹³, R⁹OC(O)NR¹⁰-, -OC(S)NR¹²R¹³, R⁹OC(S)NR¹⁰-, -C(O)NR⁹R¹⁰, R⁹C(O)NR¹⁰-, Nitro, NR⁹S(O)₂R¹⁰, -S(O)₂NR⁹R¹⁰, R⁹S(O)-, R⁹S(O)₂-, C(O)OR⁹, R⁹C(O)O- und -NR⁹R¹⁰ ausgewählt werden; C₆-C₁₂ Aryl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) eine oder zwei Gruppen ist, die unabhängig aus Halo, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Trihaloalkyl, Hydroxy, Mercapto, Cyano, Carboxy, NR⁹S(O)₂R¹⁰, R⁹C(O)NR¹⁰-, -NHR oder -NRR, wobei R C₁-C₄ Alkyl, C₃-C₈ monocyclisches Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertes bicyclisches Cycloalkyl oder Adamantyl ist, ausgewählt werden; 5–12 gliedriges Heteroaryl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) wie oben für C₆-C₁₂ Aryl definiert ist; 5–9 gliedriger Heteroalicyclus substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls er substituiert ist, die Substituentengruppe wie oben für C₆-C₁₂ Aryl definiert ist; 3–8 gliedriges gesättigtes Heterocyclyl substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist die Substituentengruppe(n) eine oder zwei Gruppen ist, die unabhängig aus =O (als ein C-Substituent, um so eine Carbonylgruppe zu bilden), Halo, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₄ Alkyl substituiert mit Carboxy oder -C(O)O-R''- mit R'' wie hierin definiert, außer das R'' nicht Wasserstoff sein kann, Hydroxy, und -NHR oder -NRR, wobei R C₁-C₄ Alkyl oder C₃-C₈ monocyclisches Cycloalkyl ist, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, oder Adamantyl ausgewählt werden; 3–8 gliedrige Heterocycloamino substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert ist, die Substituentengruppe(n) wie oben für 3–8 gliedriges gesättigtes Heterocyclyl definiert ist; C₁-C₁₀ Alkoxy substituiert oder unsubstituiert sein kann, und falls es substituiert die Substituentengruppe wie oben für C₁-C₁₀ Alkyl definiert ist; C₆-C₁₂ Aryloxy und 5–12 gliedriges Heteroaryloxy substituiert oder unsubstituiert sein können, und falls sie substituiert sind, die Substituentengruppe(n) wie oben für C₆-C₁₂ Aryl definiert ist; R'' aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl, Trihalomethyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, C₆-C₁₂ Aryl, 5–12 gliedrigem Heteroaryl, das 1–4 Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S ausgewählt werden, und einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, besteht, ausgewählt wird.
Die Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei: R¹ aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, Halo, C₁-C₁₀ Alkyl, C₃-C₈ monocyclischem Cycloalkyl, [5,6]- oder [6,6]-fusioniertem bicyclischem Cycloalkyl, Adamantyl, einer 5–9 gliedrigen heteroalicyclischen Gruppe, die 1 oder 2 Heteroatome besitzt, die aus N, O oder -S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist, Hydroxy, C₁-C₁₀ Alkoxy, unsubstituiertem C₃-C₈ Cycloalkoxy, -C(O)-R⁸, -NR⁹R¹⁰ und -C(O)NR¹²R¹³ besteht, ausgewählt wird; R², R¹⁴, R³, R⁴, R⁵, Z, R¹⁵, R¹⁶, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ wie für Anspruch 1 definiert sind; R¹² und R¹³ unabhängig aus der Gruppe, die aus Wasserstoff, C₁-C₁₀ Alkyl und C₆-C₁₂ Aryl besteht, ausgewählt werden; oder R¹² und R¹³ zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, eine 3–8 gliedrige Heterocycloaminogruppe bilden, die optional 1 oder 2 zusätzliche Ringheteroatome besitzt, die aus N, O oder S(O)_n ausgewählt werden, wobei n = 0–2 ist; R¹⁷ wie für Anspruch 1 definiert ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Die Verbindung oder das Salz gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Die Verbindung oder das Salz gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Die Verbindung oder das Salz gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Verbindung die Formel (Ia) besitzt:
wobei: R¹, R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff sind; R² Fluor ist und an der 5-Positon des Indolinonrings platziert ist; und Z Morpholin-4-yl ist; R⁶ und R⁷ Methyl sind; und die Stereochemie an dem *C (S) ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff umfasst.
Ein Verfahren für die Modulierung der katalytischen Aktivität einer Proteinkinase in vitro, das das in Kontakt bringen besagter Proteinkinase mit einer Verbindung oder einem Salz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei besagte Proteinkinase aus der Gruppe, die aus einer Rezeptor-Tyrosinkinase, einer Nichtrezeptor-Tyrosinkinase und einer Serin-Threoninkinase besteht, ausgewählt wird.
Die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Verbindung oder ein Salz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Hilfsstoff umfasst, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Vorbeugung einer mit einer Proteinkinase zusammenhängenden Störung in einem Organismus.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei besagte mit einer Proteinkinase zusammenhängende Störung aus der Gruppe, die aus einer mit einer Rezeptor-Tyrosinkinase zusammenhängenden Störung, einer mit einer Nichtrezeptor-Tyrosinkinase zusammenhängenden Störung und einer mit einer Serin-Threoninkinase zusammenhängenden Störung besteht, ausgewählt wird.
Die Verwendung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei besagte mit einer Proteinkinase zusammenhängende Störung aus der Gruppe, die aus einer mit EGFR zusammenhängenden Störung, einer mit PDGFR zusammenhängenden Störung, einer mit IGFR zusammenhängenden Störung und einer mit flk zusammenhängenden Störung besteht, ausgewählt wird.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei besagte mit einer Proteinkinase zusammenhängende Störung ein Krebs ist, der aus der Gruppe, die aus einem Plattenepitelzellkarzinom, einem Astrozytom, einem Kaposi's Sarkom, einem Glioblastom, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Kopf- und Halskrebs, einem Melanom, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Brustkrebs, kleinzelligem Lungenkrebs, einem Gliom, colorektalem Krebs, urogenitalem Krebs und gastrointestinalem Krebs besteht, ausgewählt wird.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei besagte mit einer Proteinkinase zusammenhängende Störung aus der Gruppe, die aus Diabetes, einer Autoimmunstörung, einer Hyperproliferationsstörung, Restenose, Fibrose, Psoriasis, von Heppel-Lindau Krankheit, Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, Angiogenese, einer entzündlichen Störung, einer immunologischen Störung und einer kardiovaskulären Störung besteht, ausgewählt wird.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei besagter Organismus ein Mensch ist.