DE60208299T2

DE60208299T2 - Detektion von amplifizierten Genprodukten zur Gendetektion und Reagenzkit

Info

Publication number: DE60208299T2
Application number: DE60208299T
Authority: DE
Inventors: Kayo Kobe-shi Hiyama; Koichi Kobe-shi Yamagata; Makoto Kakogawa-shi Ueda; Kadzuki Kobe-shi Nakabayashi
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2001-10-09
Filing date: 2002-10-09
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2022-10-10
Also published as: EP1586661A1; EP1586661B1; DE60216827T2; EP1306448A2; DE60216827D1; EP1306448B1; DE60208299D1; EP1306448A3; US20030096284A1; US6919182B2; ATE348193T1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt durch Genamplifikation und ein Reagenzkit für das Verfahren, genauer gesagt ein Verfahren zum genauen Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt oder ein Nebenprodukt durch Reduzieren der Turbidität, welche generiert wird in einer Genamplifikationslösung und welche den genauen Nachweis des Gens oder des Nebenprodukts stören könnte und ein Reagenzkit für das Verfahren.
2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik
Eine Vielzahl von Genamplifikationsverfahren werden in wirksamer Weise in der Identifikation von genetischen Krankheiten, Krebs, Mikroorganismen oder dergleichen in einem medizinischen oder anderen Settings verwendet, auf Grund ihrer Einfachheit und Geschwindigkeit. Unter solchen Verfahren wird die PCR (Polymerasekettenreaktion) oft verwendet, insbesondere im medizinischen Bereich, da das Verfahren eine gute Empfindlichkeit aufweist (Japanische Patentveröffentlichung HEI 4(1992)-67957). Aufmerksamkeit wird auch dem LAMP(Loop-vermittelte isothermische Amplifikation)-Verfahren zu Teil, da dieses Verfahren eine spezifische Reaktion zur Verfügung stellt und große Mengen an amplifiziertem Produkt amplifizieren kann (Japanisches Patent 3313358).
Desweiteren wurde in den letzten Jahren eine quantitative PCR-Methode entwickelt, welche sowohl die Bestimmung der Menge eines existierenden Zielgens wie auch die Amplifikation von Zielgenen ermöglicht. Gemäß dieses Verfahrens kann der Grad der Amplifikation der Zielgene in Echtzeit nachgewiesen werden und die Menge der Zielgene kann im Bezug auf die Zeit, zu der die Amplifikation nachgewiesen wird, bestimmt werden.
Der Echtzeitnachweis von Genamplifikation wird grob in zwei Arten eingeteilt, d.h. ein Fluoreszenzverfahren und ein turbidimetrisches Verfahren. Insbesondere kann gemäß des turbidimetrischen Verfahrens eine quantitative Genamplifikation durchgeführt werden durch Nachweis von amplifizierten Produkten in Echtzeit unter Verwendung von Präzipitation als Turbiditätsindex. Die Präzipitation wird in einer Lösung hervorgerufen durch Reaktion von Magnesium mit Pyrophosphorsäure, welche durch die Genamplifikation gebildet wird. Desweiteren ist der für das turbidimetrische Verfahren verwendete Detektor simpel. In diesen Aspekten ist das turbidimetrische Verfahren überlegen.
Jedoch enthält eine Lösung zur Genamplifikation üblicherweise nicht nur Enzyme wie Polymerase, reverse Transkriptase und dergleichen, sondern auch Tenside zur Verbesserung der Stabilität und Reaktivität der Enzyme. Wenn die Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer solchen Lösung durchgeführt wird unter Erhitzen auf etwa 65°C, wird die Lösung in Folge der Tenside trüb. Aus diesem Grund steigt der Hintergrund der Lösung an, wenn im medizinischen Bereich oder dergleichen die Amplifikation von Zielgenen durch das turbidimetrische Verfahren durchgeführt wird und deshalb ist es unmöglich, die Genamplifikation mit hoher Sensitivität und Genauigkeit nachzuweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die oben genannten Probleme gemacht und ein Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweise von Genen zur Verfügung zu stellen, welches die Trübheit in Folge des Erhitzens der Lösung unterdrückt und ein Reagenzkit für das Verfahren zur Verfügung zu stellen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Gens als ein amplifiziertes Produkt zur Verfügung, d.h. Nachweis eines amplifizerten Produkts umfassend Durchführen einer Genamplifikationsreaktion an einer Lösung, enthaltend das Gen bei einer vorbestimmten Reaktionstemperatur in der Gegenwart eines Tensids mit einem höheren Trübungspunkt als die vorherbestimmte Reaktionstemperatur, und Nachweis des Gens als das resultierende amplifizierte Produkt.
Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Gens als ein amplifiziertes Produkt zur Verfügung, umfassend Hinzufügen eines zweiten Tensids zu einer Lösung enthaltend das Gen und eines erstes Tensids mit einem Trübungspunkt, der niedriger ist, als die vorherbestimmte Reaktionstemperatur einer Genamplifikationsreaktion, um den Trübungspunkt der Lösung höher als die vorherbestimmte Reaktionstemperatur zu machen, Durchführen der Genamplifikationsreaktion bei der vorherbestimmten Reaktionstemperatur und dem optischen Nachweis des Gens als das resultierende amplifizierte Produkt.
Desweiteren wird ein Reagenzkit für das Verfahren zum Nachweis eines Gens als ein amplifiziertes Produkt unter Verwendung von Genamplifikation beschrieben, wobei das Kit einer Primer umfasst, der notwendig ist zur Amplifikation des Gens, ein Enzym zum Amplifizieren des Gens und ein Tensid mit einem Trübungspunkt, der höher ist als die Genamplifikationsreaktionstemperatur, worin der Primer separat von dem Enzym verpackt ist und das Tensid mit dem Primer oder dem Enzym verpackt ist oder getrennt davon.
Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden noch leichter ersichtlich aus der folgenden detaillierten Beschreibung.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt das Prinzip eines Trübungsdetektors verwendet im Verfahren zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine graphische Darstellung, die Ausgabewerte im Bezug auf Zeit zeigt in einem Beispiel des Verfahren zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung und
3(a) bis 3(d) sind graphische Darstellungen, die Ausgabewerte im Bezug auf die Zeit in anderen Beispielen des Verfahrens zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Das Verfahren zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt der vorliegenden Erfindung wird verwendet zum Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens eines Genprodukts, welches synthetisiert wird unter Verwendung von Genamplifikation, und ist anwendbar auf jegliches Analyseverfahren, Messen oder Nachweisen des Vorhandenseins oder Fehlens eines synthetisierten Genprodukts unter Verwendung eines optischen Verfahrens. Genauer gesagt kann die Erfindung auf verschiedene Verfahren angewendet werden wie ein Verfahren zum Nachweis der Trübheit, ein Verfahren zum Nachweis der Absorption, ein Verfahren zum Nachweis von Intensität gestreuten Lichts, ein Verfahren zum Nachweis der Fluoreszenzintensität und dergleichen. Unter diesen Verfahren kann die Erfindung vorzugsweise angewandt werden auf Verfahren zum Nachweis von Turbidität und Intensität gestreuten Lichts.
Das amplifizierte Produkt kann nachgewiesen werden unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von etwa 310 nm bis etwa 1285 nm, genauer gesagt Licht mit einer Wellenlänge von 400 nm, 405 nm, 575 nm, 800 nm oder dergleichen. Die Turbidität und das gestreute Licht können z.B. nachgewiesen werden wie in 1 gezeigt, durch Herausfiltern von Licht mit der gewünschten Wellenlänge aus von der Lichtquelle 1 ausgestrahltem Licht durch ein Filter 2, Anwenden des herausgefilterten Lichts auf ein Objekt 3, welches nachzuweisen ist, Nachweisen von hindurchgetretenem oder von dem Objekt 3 gestreutem Licht unter Verwendung eines Photorezeptors 4 und wahlweise Umwandeln des detektierten Lichts in ein elektrisches Signal.
Beispiele von Genamplifikationsverfahren umfassen eine Vielzahl von Verfahren wie LAMP (Notomi T, et al.; Nucleic acid Res. 28:e63, 2000), LCR, SDA, NASBA, RCA, ICAN, TMA, quantitative PCR, sowie Abwandlungen dieser Verfahren. Unter diesen Verfahren kann vorzugsweise das LAMP-Verfahren verwendet werden, wenn die Trübheit oder das gestreute Licht nachgewiesen werden soll.
In Genamplifikationsverfahren findet üblicherweise eine enzymatische Reaktion in einer Lösung zum Amplifizieren des Gens statt. Die Lösung kann üblicherweise einen Puffer zum Bereitstellen eines geeigneten pHs für die enzymatische Reaktion enthalten, ein Salz, das nötig ist zum Beibehalten der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, ein Tensid (ein erstes Tensid) zum Schützen und Stabilisieren des Enzyms, ein Verdünnungsmittel, eine Substanz zum Unterdrücken von nicht spezifischer Reaktion und ein Sensitivierungsmittel und dergleichen. Darüber hinaus werden das zu amplifizierende Gen, ein Primer, ein Enzym und dergleichen in die Lösung gemischt. So wird die Lösung auf gewöhnliche Art und Weise zubereitet.
Gemäß dem Verfahren zum Nachweis eines Gens der vorliegenden Erfindung wird ein Tensid (ein zweites Tensid), das anders ist, als das Tensid (das erste Tensid), welches notwendigerweise in der Lösung enthalten ist, zu der Lösung hinzugefügt, um den Trübungspunkt der Lösung zu erhöhen. Es sollte angemerkt werden, dass die Reihenfolge des Mischens dieser Komponenten der Lösung nicht besonders limitiert ist. Die Art und Konzentration des Puffers, Salzes, Tensids und dergleichen in der Lösung können in Abhängigkeit der Art des zu amplifizierenden Gens, des Primers und des Enzymes geeignet ausgewählt werden. Darüber hinaus können auch das zu amplifizierende Gen, der Primer, das Enzym und dergleichen ausgewählt werden, wie es geeignet ist in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Genamplifikationsverfahren, der Art und Menge des Gens, des Primers und des Enzyms und anderer.
Z.B. können als Puffer jene mit einer Pufferwirkung von neutral bis leicht alkalisch, wie Tris-HCl erwähnt werden. Als Salze können KCl, NaCl, (NH₄)₂SO₄ und dergleichen erwähnt werden. Das Tensid (das erste Tensid) darf das Enzym nicht beschädigen und muss in der Lage sein, die sterische Struktur des Enzyms beizubehalten und das Enzym stabil zu halten. Ein wie unten genanntes nichtionisches Tensid, üblicherweise Alkylarylpolyethylenglycol (Triton X-100) kann als das Tensid verwendet werden, jedoch kann jedes andere nichtionische Tensid anstelle von Triton X-100 verwendet werden. Da es einen Trübungspunkt hat, der niedriger ist, als die Reaktionstemperatur der später beschriebenen Genamplifikationsreaktion, verursacht Triton X-100 eine Trübung während der Genamplifikationsreaktion.
Das weiter zu der Lösung hinzugefügte Tensid, d.h. das zweite Tensid, muss in der Lage sein, den Trübungspunkt der Lösung zu erhöhen (der Trübungspunkt ist hauptsächlich verursacht durch das notwendigerweise in der Lösung enthaltene Tensid), höher als die Reaktionstemperatur der Genamplifikationsreaktion, die später beschrieben wird. Desweiteren darf das zweite Tensid auch das Enzym nicht beschädigen und muss in der Lage sein, das Enzym stabil zu halten. Das zweite Tensid kann ausgewählt werden wie in Abhängigkeit von der Art und Menge des notwendigerweise in der Lösung enthaltenen Tensids und der Art und Menge des Gens, dem Primer und dem Enzym, welche verwendet werden, geeignet. Im allgemeinen hat das zweite Tensid vorteilhafterweise einen Trübungspunkt, der höher ist, als die Reaktionstemperatur. Z.B. kann als zweites Tensid eines erwähnt werden, das einen Trübungspunkt von 70°C oder höher hat. Als solche Tenside können EMULGEN 220 (hergestellt von Kao Corporation), mit einem Trübungspunkt von 98°C, und TERGITOL NP-40 (hergestellt von Sigma), EMULGEN 123P (hergestellt von Kao Corporation) EMULGEN 147 (hergestellt von Kao Corporation) und NISSAN NONION E-230 (hergestellt von Nippon Yushi KK), welche einen Trübungspunkt von 100°C oder höher haben, erwähnt werden.
Unter verschiedenen Arten von Tensiden kann das zweite Tensid vorzugsweise ein nichtionisches Tensid sein. Genauer gesagt können Beispiele des zweiten Tensids umfassen:

(1) Fettsäureester von Polyoxyverbindungen wie
– Glycerinester höherer Fettsäuren (z.B. Gylcerid Monostearat, Glycerid Monooleat, etc.);
– Glycolester von Fettsäuren (z.B. Polyglycolstearat, Diethylenglycollaureat, Propylenglycolmonolaureat, Propylenglycolmonooleat, Propylenglycolmonostearat, Polyethylenglycolalkylether, Polyethylenglycolalkenylether, etc.);
– Pentaerythritolfettsäureester (z.B. Pentaerythritolmonostearat, Pentaerythritolmonocaprylat, Pentaerythritolsojabohnenfettsäureester, Pentaerythritolmonolaurat etc.);
– Sucrosefettsäureester (z.B. Sucroselaureat, Sucrosemyristat, Sucrosepalmitat, etc.);
– Sorbitan- und Mannitanfettsäureester (z.B. Sorbitansesquioleat, Sorbitanmonolaurat, ein Kondensationsprodukt von Sorbitanmonolaurat mit Polyethylenoxid, Mannitanmonooleat, ein Kondensationsprodukt von Mannitanmonopalmitat mit Polyethylenoxid, etc.);
(2) Polyethylenoxidkondensationsprodukte wie
– Kondensationsprodukte höherer Alkohole (Polyoxyethylenalkylether (z.B. Hexadecynol, Dodecanolpolyethylenoxid etc.), Polyoxyethylenalkenylether (z.B. Oleinolpolyethylenoxid, etc.), Fettsäurealkoholpolyethylenglycolether, Polyethylenglycolalkylphenylether etc.),
– Kondensationsprodukte höherer Fettsäuren (z.B. ein Kondensationsprodukt eines Monolaurats mit Polyethylenoxid, ein Kondensationsprodukt eines Ricinoleats mit Polyethylenoxid, etc.);
– Kondensationsprodukte von höheren Fettsäuren mit Amiden;
– Kondensationsprodukte von höheren Alkylen mit Aminen;
– Kondensationsprodukte von höheren Alkylen mit Mercaptanen;
– Kondensationsprodukte von Alkylphenol (ein Polyoxyethylenalkylphenylether, Nonylphenolpolyoxyethylenether, ein Kondensationsprodukt von Alkylalylethern mit Polyethylenoxid, ein Kondensationsprodukt von Diaminophenolether mit Polyethylenoxid, ein Kondensationsprodukt eines Alkylphenolethers mit Polyethylenoxid etc.);
– Kondensationsprodukte von Polypropylenoxid (z.B. Polyoxypropylenglycol etc.).

Unter diesen Tensiden sind Polyoxyethylen-basierte Tenside bevorzugt. Die zusätzliche molare Zahl von Ethylenoxid kann zwischen 10 und 100 sein. Spezifische Beispiele solcher Tenside werden dargestellt durch die folgende Formel: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H
Worin R₁ C_8-22-Alkyl oder Alkenyl ist, R₂ -O-, -(C₆H₄)-O- oder -COO- ist und n eine ganze Zahl von 10 bis 100 ist.
Das C_8-22-Alkyl kann geradkettig oder verzweigt-kettig sein, umfassend Octyl, Nonyl, Dodecyl (Lauryl), Hexadecyl und dergleichen, zum Beispiel. Das C_8-22-Alkenyl kann geradkettig oder verzweigt-kettig sein, umfassend Octenyl, Oleyl, Hexadecenyl und dergleichen, zum Beispiel. C₆H₄ ist ein aromatischer Ring.
Vorzugsweise wird das zweite Tensid in einer solchen Menge verwendet, dass der Trübungspunkt der Lösung über die Reaktionstemperatur erhöht wird, Trübung unterdrückt wird und die spezifische Genamplifikationsreaktion nicht beeinflusst wird. Die Menge kann wie geeignet ausgewählt werden in Abhängigkeit von der Art und der Menge des in der Lösung notwendigerweise enthaltenen Tensids und der Art der Menge des Gens, des Primers und des Enzyms, welche verwendet werden. Z.B. kann die Menge des zweiten Tensids etwa 0,1 bis 20-fach, vorzugsweise etwa 0,1 bis 10-fach, am bevorzugtesten zwischen 0,5 und 2-fach größer im Gewicht sein als die Menge des in der Lösung notwendigerweise enthaltenen Tensids. Insbesondere wenn Triton-X und TERGITOL NP-40 zusammen in der Lösung verwendet werden, kann das Verhältnis von Triton-X zu TERGITOL NP-40 vorzugsweise 0,1 Gew.-%: 0,01 bis 2,0 Gew.-% sein. Von einem anderen Standpunkt aus kann das zweite Tensid in einem Verhältnis von vorzugsweise etwa 0,05 bis 10 Gew.-%, noch bevorzugter etwa 0,1 bis 1,0 Gew.-% in Bezug auf die Lösung hinzugefügt werden.
Die Genamplifikationsreaktion kann entweder durch eine isothermische Reaktion oder durch eine Temperaturcyclingreaktion durchgeführt werden. Die Genamplifikationsreaktionstemperatur ist vorzugsweise in dem Bereich der Reaktionstemperatur eines TMA-Verfahrens, d.h. 40°C, welches die geringste unter den Genamplifikationsverfahren ist, bis zur Reaktionstemperatur von PCR-Verfahren, d.h. 95°C, welches das höchste darunter ist, d.h. von 40 bis 95°C.
Z.B. wird in der isothermischen Reaktion die Lösung auf eine geeignete Temperatur erwärmt, welche für eine geeignete Zeitdauer beibehalten wird. Die Reaktion wird üblicherweise durchgeführt durch Erwärmen der Lösung auf etwa 40 bis 70°C und Beibehalten von etwa 10 Minuten bis etwa 3 Stunden. Jedoch kann eine Reaktion bei einer anderen Temperatur vor oder nach der isothermischen Reaktion hinzugefügt werden.
In der Temperaturcyclingreaktion wird die Genamplifikation durchgeführt durch Wiederholen des Zyklus von Erhitzen der Lösung z.B. auf 95°C für eine Minute auf 55°C für 1 Minute und auf 72°C für 1 Minute 15–40 mal. Jedoch kann eine Reaktion bei einer anderen Temperatur vor oder nach der Temperaturcyclingreaktion hinzugefügt werden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet die Genamplifikationsreaktionstemperatur nicht nur die Temperatur der tatsächlichen Amplifikationsreaktion, sondern auch die Temperatur des Nachweisens des Produkts der Genamplifikationsreaktion. Es ist bevorzugt, dass die Temperatur der Genamplifikationsreaktion gleich ist zu der Temperatur des Nachweises des Produkts der Genamplifikation, aber diese Temperaturen sind nicht notwendigerweise dieselben.
In der isothermischen Reaktion oder der Temperaturcyclingreaktion kann die Gegenwart des Produkts der Genamplifikation z.B. nachgewiesen werden durch Anwenden eines optischen Verfahrens. Solche optischen Verfahren umfassen die oben genannten.
Verschiedene Reagenzkomponenten, die für das Verfahren zum Nachweis des Genprodukts durch die Genamplifikation der vorliegenden Erfindung benötigt werden, können in ein Kit verpackt werden. Genauer gesagt wird ein Reagenzkit zur Verfügung gestellt, umfassend einen Primer, der nötig ist zur Amplifizierung eines Gens, ein Enzym zum Amplifizieren des Gens und ein Tensid mit einem Trübungspunkt, der höher ist als die Genamplifikationsreaktionstemperatur und des weiteren, falls nötig, ein Salz, das notwendig ist für das Annealing, ein Verdünnungsmittel und ein Puffer zum Bereitstellen eines geeigneten pHs für eine enzymatische Reaktion und wahlweise eine Substanz zum Unterdrücken einer nicht spezifischen Reaktion und ein Sensitivierungsmittel. Der Primer ist vorzugsweise separat von dem Enzym verpackt. Das Tensid ist mit dem Primer oder dem Enzym oder separat davon verpackt. Das Tensid ist auch mit einer oder mehreren weiteren Komponenten oder separat davon verpackt. Die anderen Komponenten als der Primer, das Enzym und das Tensid können mit dem Primer oder dem Enzym oder separat davon verpackt sein.
Das Verfahren zum Nachweis eines Genprodukts der vorliegenden Erfindung wird im Detail nachstehend beschrieben.
Beispiel 1

Zunächst wurde ein CA-6000-Reaktionsröhrchen (hergestellt von Sysmex Corporation) auf Eis gestellt und eine Lösung wurde hergestellt. • Lösung

Wasser	52,0 μL
10 × Thermopolpuffer (hergestellt von NEB (New England Biolab))	20,0 μL
10 mM dNTPs (hergestellt von GIBCO)	8,0 μL
100 mM MgSO4 (hergestellt von NEB)	4,0 μL
5 M Betain (hergestellt von Sigma)	32,0 μL
FA Primer (40 pmol/μL)	8,0 μL
RA Primer (40 pmol/μL)	8,0 μL
F3 Primer (5 pmol/μL)	8,0 μL
R3 Primer (5 pmol/μL)	8,0 μL

Der 10-fach-Thermopolpuffer war zusammengesetzt aus (durchgestrichen:20 mM) 200 mM Tris-HCl pH 8,8, (durchgestrichen:10 mM) 100 mM KCl, (durchgestrichen:10 mM) 100 mM (NH₄)₂SO₄, (durchgestrichen:2 mM) 20 mM MgSO₄ und (durchgestrichen:0,1%) 1,0% Triton X-100 (Trübungspunkt: 63 bis 69°C).
Die Primer waren Einzelstrang-DNAs mit den folgenden Nukleotidsequenzen:
Zu dieser Reaktionslösung wurde 20 μL von 1,0% TERGITOL NP-40 (Nonylphenolpolyoxyethylenether, die Anzahl von Oxyethylen: 40, Trübungspunkt: mehr als 100°C, hergestellt von Sigma) hinzugefügt, gefolgt von Rühren.
Anschließend wurden 16,0 μL vom großen Fragment von Bst DNA-Polymerase (hergestellt von NEB) und 16,0 μL von M13mp18DNA (hergestellt von Takara) als Vorlage hinzugefügt, gefolgt von Rühren.
Dann wurde das Reaktionsröhrchen in eine Vorrichtung überführt (eine verbesserte Version von CA-1500), ausgestattet mit einer Nachweiseinheit, welche Licht mit 400 nm Wellenlänge verwendet wie in 1 gezeigt. Das Reaktionsröhrchen wurde in einen Heizblock bei 65°C eingeführt, welcher es ermöglichte, die Lösung auf 65°C zu halten. Unmittelbar nachdem das Reaktionsröhrchen in den Heizblock eingefügt worden war nach dem Mischen der Lösung wurde die Turbidität der Lösung in Echtzeit gemessen und die Amplifikation des Gens wurde auf der Basis der Veränderungen des transmittierten Lichts nachgewiesen.
Als ein Vergleichsbeispiel wurde die oben beschriebene Lösung in derselben Weise wie oben beschrieben reagieren gelassen, außer dass 1,0% TERGITOL NP-40 nicht hinzugefügt wurde, und die Turbidität der Lösung wurde gemessen. Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt.
Gemäß 2 erhöht das Hinzufügen von 1,0% TERGITOL NP-40 den Trübungspunkt der Lösung (hauptsächlich den Trübungspunkt, der auf das von vorneherein in der Lösung enthaltene Tensid zurückzuführen ist) auf 70°C oder höher, und dadurch wurde die Trübung der Lösung unterdrückt. Dementsprechend konnte der Hintergrund in der Messung der Intensität des transmittierten Lichts (ein Ausgabewert (Volt) von der Auffangeinheit für transmittiertes Licht) stabil gehalten werden. Die Intensität des transmittierten Lichts konnte auch nach Beginn der Reaktion, angezeigt durch einen Pfeil, stabil gehalten werden. Desweiteren wurde der Anfangspunkt der Reaktion, angezeigt durch den Pfeil, eindeutig erkannt, was den genauen Nachweis der Gegenwart des Produkts der Genamplifikation ermöglicht. Auf der anderen Seite wurden in dem Fall, wo 1,0% TERGITOL NP-40 nicht hinzugefügt wurde, Veränderungen im Hintergrund beobachtet, in der Messung der Intensität des transmittierten Lichts. Veränderungen in der Intensität des transmittierten Lichts wurden auch nach dem Beginn der Reaktion beobachtet.
Beispiele 2–5

Zunächst wurde ein CA-6000-Reaktionsröhrchen (hergestellt von Sysmex Corporation) auf Eis gestellt und eine Lösung wurde zubereitet. Zu der Lösung wurden 20 μL mRNA von Cytokeratin 20 als Vorlage hinzugefügt, gefolgt von Rühren. Das Reaktionsröhrchen wurde in eine Detektionseinheit einer Detektionsvorrichtung bei 65°C gestellt, um die Genamplifikationsreaktion zu beginnen. Die Intensität des transmittierten Lichts wurde in Echtzeit detektiert und die Turbidität wurde überprüft. Als ein Vergleichsbeispiel wurde die Lösung hergestellt ohne Hinzufügen des Tensids und derselben Reaktion unterworfen. Die Turbidität der Lösung wurde geprüft. • Lösung

Wasser	7,5 μL
422 mM Tris-HCl pH 8,0 (hergestellt von KK Nippon Gene)	14,2 μL
10 × Thermopolpuffer (hergestellt von NEB)	10,0 μL
10 mM dNTPs (hergestellt von Invitrogen)	4,0 μL
100 mM MgSO₄ (hergestellt von Sigma)	4,0 μL
0,1 M DTT (Wako Junyaku Kogyo KK)	5,0 μL
5 M Betain (hergestellt von Sigma)	12,8 μL
FA Primer (40 pmol/μL)	4,0 μL

RA Primer (40 pmol/μL)	4,0 μL
F3 Primer (5 pmol/μL)	4,0 μL
R3 Primer (5 pmol/μL)	4,0 μL
Loop Primer Forward (20 pmol/μL)	4,0 μL
Loop Primer Reverse (20 pmol/μL)	4,0 μL
10% Tensid	10,0 μL
10 U/μL AMV reverse Transkriptase (hergestellt von Promega Co.)	0,5 μL
8000 U/mL großes Fragment Bst DNA-Polymerase (hergestellt von NEB)	8,0 μL

Die Primer waren einzelsträngige DNAs mit den folgenden Nukleotidbasensequenzen:
Die folgenden vier Arten von Tensiden wurden verwendet.
Emulgen 123P (Polyoxyethylenlaurylether, Oxyethylenanzahl: 23, hergestellt von Kao Corporation)
Emulgen 147 (Polyoxyethylenlaurylether, Oxyethylenanzahl: 19, hergestellt von Kao Corporation)
Emulgen 220 (Polyoxyethylenecetylether, Oxyethylenanzahl: 13, hergestellt von Kao Corporation)
Nissan nonion E-230 (Polyoxyethylenoleylether, Oxyethylenanzahl: 30, hergestellt von Nippon Yushi KK).
Eine Vorrichtung (MU001, Sysmex Corporation), ausgestattet mit einer Nachweiseinheit, welche Licht mit einer Wellenlänge von 400 nm verwendet und dasselbe Prinzip hat wie die Vorrichtung, die in 1 gezeigt wird, wurde als Nachweisvorrichtung verwendet. Diese Vorrichtung kann die Intensität von transmittiertem Licht in Echtzeit messen, unmittelbar nachdem das Reaktionsröhrchen in den Nachweisteil eines Heizblocks bei 65°C eingeführt wurde.
Intensität von transmittiertem Licht wird erhalten durch A/D-Umwandeln eines elektrischen Ausgangssignals durch ein Licht auffangendes Element 4 wie in 1 gezeigt in Antwort auf das Auffangen von transmittiertem Licht.
Die erhaltenen Ergebnisse werden in 3(a) bis 3(d) gezeigt. Gemäß diesen Abbildungen erhöhte das Hinzufügen des Tensids den Trübungspunkt der Lösung auf 70°C oder höher. Dadurch wurde die Trübung der Lösung unterdrückt, der Hintergrund konnte bei der Messung der Intensität des transmittierten Lichts stabil gehalten werden. Die Intensität des transmittierten Lichts konnte auch stabil gehalten werden nach dem Anfang der Reaktion, angezeigt durch einen Pfeil. Desweiteren wurde der Anfangspunkt der Reaktion, angezeigt durch einen Pfeil, eindeutig erkannt, was den genauen Nachweis des Vorliegens des Produkts der Genamplifikation ermöglicht. Auf der anderen Seite wurde in dem Fall, wo die Tenside nicht hinzugefügt wurden, Veränderungen im Hintergrund beobachtet bei der Messung der Intensität von transmittiertem Licht. Veränderungen wurden auch beobachtet in der Intensität des transmittierten Lichts nach Beginn der Reaktion.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Hinzufügen des Tensids zu der Lösung das Auftreten von Trübung verhindern, welche verursacht ist durch das in der Lösung notwendigerweise enthaltene Tensid. Daher kann der Hintergrund reduziert und stabilisiert werden in dem optischen Nachweis des amplifizierten Gens, ohne dass die spezifische Amplifikationsreaktion beeinträchtigt würde. So kann die Gegenwart des amplifizierten Genprodukts mit verbesserter Genauigkeit nachgewiesen werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt, umfassend: Durchführen einer Genamplifizierungsreaktion an der genhaltigen Lösung bei einer vorherbestimmten Reaktionstemperatur in Gegenwart eines Tensids mit einem höheren Trübungspunkt als die vorherbestimmte Reaktionstemperatur; und Nachweisen des Gens als amplifiziertes Produkt durch Nachweisen von zumindest einem von Turbidität, Absorption, Intensität von gestreutem Licht und Intensität von Fluoreszenz in einer Genamplifikationslösung.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Tensid einen Trübungspunkt von 70°C oder höher hat.
Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Tensid ein nicht-ionisches Polyoxyethylentensid ist.
Verfahren gemäss Anspruch 3, worin das nicht-ionische Polyoxyethylentensid durch die folgende Formel dargestellt wird: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H worin R₁ C_8-22-Alkyl oder -Alkenyl ist, R₂ -O-, -(C₆H₄)-O- oder -COO- ist und n eine ganze Zahl von 10 bis 100 ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die vorherbestimmte Reaktionstemperatur 40 bis 95°C ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Gen als das amplifizierte Produkt durch die Turbidität der Lösung nachgewiesen wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Nachweis des Gens als amplifiziertes Produkt in Echtzeit durchgeführt wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Tensid zu der Lösung in einem Verhältnis von 0,05 bis 10 Gew.-%, in bezug auf die Lösung, hinzugefügt wird.
Verfahren zum Nachweis eines Gens als amplifiziertes Produkt, umfassend: Hinzufügen eines zweiten Tensids zu einer Lösung, enthaltend das Gen und ein erstes Tensid mit einem Trübungspunkt, niedriger als eine vorherbestimmte Reaktionstemperatur einer Genamplifikationsreaktion, um den Trübungspunkt der Lösung höher als die vorherbestimmte Reaktionstemperatur zu machen; Durchführen der Genamplifikationsreaktion an der Lösung bei der vorherbestimmten Reaktionstemperatur; und Nachweisen des Gens als amplifiziertes Produkt durch Nachweis von zumindest einem von Turbidität, Absorption, Intensität des gestreuten Lichts und Intensität der Fluoreszenz in einer Genamplifikationslösung.
Verfahren gemäss Anspruch 9, worin das zweite Tensid einen Trübungspunkt von 70°C oder höher hat.
Verfahren gemäss Anspruch 9, worin das Tensid ein nicht-ionisches Polyoxyethylentensid ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das zweite Tensid zu der Lösung in einem Verhältnis von 0,05 bis 10 Gew.-%, in bezug auf die Lösung, hinzugefügt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 11 oder 12, worin das nicht-ionische Polyoxyethylentensid durch die folgende Formel dargestellt wird: R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H worin R₁ C_8-22-Alkyl oder -Alkenyl ist, R₂ -O-, -(C₆H₄)-O- oder -COO- ist und n eine ganze Zahl von 10 bis 100 ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 13, worin die vorherbestimmte Reaktionstemperatur 40 bis 95°C ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 14, worin das Gen als das amplifizierte Produkt durch die Turbidität der Lösung nachgewiesen wird.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 15, worin der Nachweis des Gens als amplifiziertes Produkt in Echtzeit durchgeführt wird.