-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine entsprechende Vorrichtung
zum Analysieren eines Probenstoffgemisches. Ein solches Verfahren
kann angewendet werden zum Identifizieren chemischer oder biochemischer
Stoffe in einem Gemisch und zum Ermitteln der Konzentration dieser
Stoffe. Das Verfahren kann zum Beispiel zum Analysieren von Proteinen
verwendet werden.
-
ALLGEMEINER
STAND DER TECHNIK
-
Das
Gebiet der analytischen Chemie und Biochemie befasst sich mit der
Messung der Zusammensetzung, der Mengen und der Eigenschaften von Stoffen
wie Lösungen
von Chemikalien, biochemischen Stoffen oder anderen Analyten. Ein
wichtiges biochemisches Projekt, welches in den letzten Jahren durchgeführt worden
ist, ist das Projekt der Erforschung des menschlichen Genoms. Dieses
Projekt hat ein neues Geschäftsfeld
entstehen lassen, die Pharmakogenomik, welche es zum Ziel hat, die
biologischen Funktionen zu verstehen und solche Funktionen durch
spezifische Eingriffe mit pharmazeutischen Substanzen zu beeinflussen.
Durch Vergleichen der Proteinexpression nach der Arzneimittelbehandlung
mit der Proteinexpression in unbehandeltem Zustand ist es möglich, die
beobachteten Veränderung
mit den Wirkungen oder der Funktion des Arzneimittels in Beziehung
zu setzen. Neue Arbeiten haben gezeigt, dass es eine mangelnde Korrelation zwischen
den Transkriptionsprofilen und den tatsächlichen Proteinspiegeln in
Zellen gibt. Die Proteinanalyse ist daher unentbehrlich und eine
Ergänzung
der Genomanalyse geworden, um ein genaues Bild der Zellfunktion
und des Zellstoffwechsels zu erhalten.
-
Es
sind Verfahren und Vorrichtungen entwickelt worden, um den Nachweis
oder die Identifizierung von Analyten in immer geringeren Mengen
oder unter zweckmäßigeren
Bedingungen zu ermöglichen.
Insbesondere erfordert die Proteinanalyse eine schnelle Ausführung und
eine hohe Trennwirksamkeit, wenn sie als Prüfverfahren (screening method) für verschiedene
Zell- und Gewebearten angewendet wird. Das etablierte Verfahren
für die Überwachung der
Proteinexpression ist die Gelelektrophorese auf Polyacrylamid (PAGE).
Obwohl diese als präparatives
Verfahren leistungsfähig
ist, ist sie bei weitem zu langsam für Prüfanwendungen (screening applications).
Sie erfordert einen großen
Zeitaufwand für
einen Laboranten, und häufig
müssen
die getrennten Flecken aus diesen Präparaten per Hand ausgeschnitten
werden, damit sie in der Folge in einem Maldi-TOF-MS-System [Maldi: Matrixunterstützte Laser-Desorption/Ionisation
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization); TOF: Laufzeit (Time-of-Flight); MS:
Massenspektrometrie] analysiert werden können.
-
Häufig ist
es schwierig, eine genügende Trennung
oder Peak-Kapazität
zu erreichen, um jedes einzelne Fragment einer Probe in nur einem Durchlauf
nachzuweisen und zu identifizieren. Diese Beschränkung ist gewöhnlich ein
Grund dafür,
zweidimensionale Trenneinheiten zu verwenden, wobei eine Mischung
aus zwei Trennmechanismen gebildet wird. Beispiele für solche
zweidimensionalen Trennungen sind: Ionenaustausch/Flüssigchromatographie
mit umgekehrten Phasen oder isoelektrische Fokussierung (IEF)/SDS-PAGE,
was als zweidimensionale Gelelektrophorese (2D-GE) bezeichnet wird. Hinsichtlich
des Standes der Technik wird Bezug genommen auf den Artikel: „The dynamic
range of protein expression: A challenge for proteomic research", G.L. Corthals u.a.,
Electrophoresis 2000, 21/6, Seite 1104–1115; und „Proteomic tools for biomedicine", V.C. Wasinger u.a.,
Journal of Chromatography B, 771 (2002), Seite 33 bis 48.
-
In
der pharmazeutischen Industrie wird häufig ein Prüflauf mit hohem Durchsatz benötigt. Um
auf statistisch relevante Parameter abzuprüfen (to screen), wird eine
große
Zahl von Analyseschritten parallel durchgeführt. Ein Prüflauf mit hohem Durchsatz erfordert
Automatisierung, Geschwindigkeit und zuverlässige Bedienung. In dieser
Hinsicht können häufig alle
2D-GE-Plattformen die Anforderungen nicht erfüllen.
-
Es
sind verschiedene Versuche unternommen worden, eine automatisierte
zweidimensionale Trennanordnung zu erschaffen. In einem Ansatz wird die
Flüssigchromatographie
mit der Kapillarelektrophorese verbunden. In einem anderen Ansatz,
offenbart in EP-A-977030, wird eine zweidimensionale Elektrophorese-Trenneinheit auf
einem Mikrochip verwirklicht.
-
Die
erwähnten
Einheiten und Verfahren haben ihre Hauptanwendungen auf dem Gebiet
der Proteomik. Es gibt eine derart breite Vielfalt von Proteinen,
dass eine einfache eindimensionale Trennung schnell an ihre Grenzen
stößt. Außerdem liegen die
interessanten Proteine in einer Probe, welche bestimmte Störungen oder
Krankheiten anzeigen, häufig
nur in kleinen Mengen vor, während
es einen wesentlich größeren Teil
der Proteine in der Probe gibt, welche nicht von speziellem Interesse
sind. Dies hat zur Folge, dass kleine, aber interessante Peaks in den
Messergebnissen unter großen
Peaks, welche für
die aktuelle Analyse nicht von speziellem Interesse sind, verborgen
sind, was dann wieder eine noch höhere Peak-Kapazität erforderlich macht, um klarere,
schärfere
Messergebnisse zu erhalten.
-
Zuverlässige Ergebnisse
auf dem Gebiet der Proteomik sind derart wichtig, dass man sogar
die Unannehmlichkeit von mehrtägigen
Messungen hinnehmen muss, um ein klares scharfes zweidimensionales
Muster zu erzeugen. Es ist üblich
gewesen, eine zweidimensionale Gelelektrophorese durchzuführen, die
entsprechenden Flecken auszuschneiden, um eine reine Fraktion zu
extrahieren, und sie dann in ein Maldi-MS oder sogar einem Sequenzierungsautomaten
zu geben, siehe auch Man F. Lopez: „Better approaches to finding
the needle in a haystack: Optimizing proteome analysis through automation", Electrophoresis,
Bd. 21, Ausgabe 6 (2000), Seite 1082 bis 1093.
-
Ein über Elektromobilitätsfokussierung
gesteuertes Kanal-Elektrophoresesystem ist aus WO 01/71330 A1 bekannt.
Eine Proteintrennung und Anzeigevorrichtung ist auch in US 2002/0098595
A1 beschrieben.
-
KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
-
Es
ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine entsprechende
Vorrichtung zum Analysieren eines Probenstoffgemisches bereitzustellen,
welches) es ermöglicht, ähnliche
oder bessere Trennergebnisse zu erzielen als die zweidimensionalen
Verfahren des Standes der Technik, und welches leicht zu automatisieren
ist und welches besser für
einen Betrieb mit hohem Durchsatz geeignet ist.
-
Erfindungsgemäß werden
diese Aufgaben durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte
Ausführungsformen
werden in den abhängigen
Ansprüchen
vorgestellt.
-
Es
ist eine der Erfindung zugrunde liegende Idee, verschiedene Trennarten
in einer Weise zu kombinieren, dass die letzte physische Trennung nicht
wirklich perfekt sein muss, aber dass mit einer hoch entwickelten
Erfassung mehrerer Parameter zusätzliche
Daten hergeleitet werden können,
welche die Berechnung sauberer Banden der Probenstoffe ermöglichen.
Auf diese Weise ist eine zuverlässige
Identifizierung der Probenstoffe selbst dann möglich, wenn die Probenstoffe
an den Stellen, wo sie nachgewiesen worden sind, nicht vollständig getrennt
worden sind.
-
Ausführungsformen
der Erfindung können den
zusätzlichen
Vorteil aufweisen, dass alle Probenkomponenten sich in Richtung
auf einen einzigen physischen Ausgang bewegen, was ideal dafür ist, ein
Massenspektrometer oder eine NMR-Vorrichtung anzuschließen. In
den zweidimensionalen Anordnungen des Standes der Technik sind die
Probenstoffe über
mehrere Achsen verteilt, was ein Nachweisverfahren über die
gesamte Fläche
erfordert, während es
die Erfindung ermöglicht,
die Konzentration an einer bestimmten Stelle aufzuzeichnen. In dem
Fall, dass ein Massenspektrometer mit einer Vorrichtung der Erfindung
verbunden ist, kann diese Stelle die Atmosphärendruck-Ionisationsquelle
(API-Quelle) sein.
-
In
der Erfindung wird eine Zeitverlaufs- oder Geschwindigkeitsmessung
durchgeführt,
um zusätzliche
Daten herzuleiten. Entweder wird die Zeitdifferenz zwischen dem
Auftreten an verschiedenen Nachweisstellen hergeleitet, oder es
kann ein komplexerer Ansatz mit Fouriernachweis angewendet werden.
Es kann auch ein Fotodiodenfeld benutzt werden, welches entlang
der fluidleitenden Struktur angeordnet ist, um die Bewegung der
Banden zu überwachen.
Ein Fotodiodenfeld als solches ist in einem anderen Zusammenhang
bekannt aus EP-A 840 113 mit dem Titel „Microchip Electrophoretic
Method and Apparatus".
Auf der Grundlage der geometrischen Gestaltung des Aufbaus ist der
Weg der Bewegung der Probe bekannt. Aus der tatsächlichen Geschwindigkeit und
der Gesamtzeit ist es möglich, die
spezifischen Parameter für
jede Dimension zu berechnen.
-
Die
Erfindung stellt somit eine mechanisch einfache Vorrichtung bereit,
die in einer Dimension arbeitet, welche aber ermöglicht, Trenndaten herzuleiten,
die ansonsten nur durch eine zweidimensionale Trennung erhältlich wären.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Im
Folgenden werden Ausführungsformen der
Erfindung mit Bezug auf die Zeichnungen erläutert.
-
1 ist
eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Erfindung.
-
2 zeigt
die Detektor-Ausgabesignale als Funktion der Zeit in der Ausführungsform
der 1.
-
3 ist
eine grafische Darstellung der Konzentration als Funktion der Mobilität und dem
Retentionsfaktor, hergeleitet in der Ausführungsform der 1.
-
4 ist
eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
-
In
der in 1 dargestellten Ausführungsform der Erfindung ist
eine Kapillare mit Packungsmaterial 2 gepackt, und die
Enden der Kapillare sind mit Hochspannungsquelle 3 verbunden.
Das Packungsmaterial 2, mit welchem der linke Abschnitt der
Kapillare 1 gefüllt
ist, ist von der Art, wie es bei der Kapillarelektrochromatographie
(CEC) benutzt wird. Die Probenstoffe wie z.B. Proteine, welche in die
Kapillare eingegeben worden sind, werden mittels des elektrischen
Feldes, welches die Spannungsquelle 3 liefert, durch die
Kapillare bewegt. Die Bewegung aufgrund des elektrischen Feldes
hängt von
der Mobilität
der jeweiligen Probenstoffe ab. Da es eine Wechselwirkung zwischen
den Probenstoffen und dem Packungsmaterial 2 gibt, gibt
es auch eine Retention in der Kapillare, welche von der speziellen Probensubstanz
abhängt.
Daher liegen in der Kapillare kombinierte Trennarten vor, nämlich Retention und
Elektromigration.
-
Ein
erster Detektor 11 ist nahe dem Ende der Packung 2 angeordnet,
und ein zweiter Detektor 12 ist nahe dem Ende der Kapillare 1 angeordnet.
Die Detektoren können
von beliebigem Typ sein, zum Beispiel können für die Proteinanalyse Absorptionsdetektoren
benutzt werden, für
die DNA-Analyse können
Fluoreszenzdetektoren benutzt werden. Für bestimmte Anwendungen können auch
andere Detektoren wie z.B. Leitfähigkeitsdetektoren
benutzt werden. In der dargestellten Ausführungsform sind die zwei Detektoren
von gleicher Art, es ist aber auch möglich, verschiedenartige Detektoren
zu benutzen.
-
In 1 sind
die Detektoren nur schematisch dargestellt. Die Linien 11a und 12a bezeichnen die
Stellen in der Kapillare, wo Probenstoffe nachgewiesen werden. Die
Ausgangssignale der Detektoren 11 und 12 werden
einer Datenverarbeitungseinheit 13 zugeführt, welche
in einer Weise, welche im Folgenden beschrieben wird, aus den beiden
Eingabesignalen verfeinerte Messergebnisse herleitet.
-
1 zeigt
als ein Beispiel zwei getrennte Probenstoffe 8 und 9.
Diese beiden Probenstoffe passieren den ersten Detektor 11 zu
verschiedenen Zeiten t1 bzw. t2. Dies ist in 2 veranschaulicht, wo
das Detektor-Ausgangssignal des Detektors 11 als eine Funktion
der Zeit als Kurve Nr. 1 und das Detektor-Ausgabesignal
des Detektors 12 als Kurve Nr. 2 dargestellt ist.
Die Fläche
der Peaks ist ein Maß für die Probenkonzentration.
Nachdem die Stoffe 8 und 9 von dem Detektor 11 nachgewiesen
worden sind, bewegen sie sich unter dem Einfluss des elektrischen Feldes
in der Kapillare zum Detektor 12, ohne dass eine Retention
stattfindet. Die Stoffe 8 und 9 werden dann von
dem Detektor 12 zu den Zeiten t3 und t4 gemessen. Aus den
Zeitdifferenzen t3–t1
und t4–t2
werden die Mobilitäten
der Stoffe 8 bzw. 9 durch die Datenverarbeitungseinheit 13 auf
der Grundlage der bekannten elektrischen Feldstärke in der Kapillare und der
bekannten Entfernung zwischen den beiden Detektoren ermittelt.
-
Aus
den ermittelten Mobilitätswerten
der Probenstoffe 8, 9 und aus den Messungen durch
Detektor 11 können
die Retentionsfaktoren der Probensubstanzen ermittelt werden. Das
Endergebnis ist in 3 dargestellt, welche eine grafische
Darstellung der Mobilitäten
und Retentionsfaktoren für
die verschiedenen Probenstoffe und der entsprechenden Konzentrationen
ist. Auf der Grundlage des ermittelten Retentionsfaktors und der
Mobilität
eines bestimmten Probenstoffs ist eine genaue Identifizierung dieses
Probenstoffs möglich,
zum Beispiel durch Verwendung von Datenbanken bekannter Mobilitäten und
Retentionsfaktoren.
-
Bei
der Kapillarelektrophorese tritt typischerweise ein Phänomen auf,
welches als elektroosmotischer Fluss (EOF) bezeichnet wird, welcher
abhängig
von Faktoren wie dem Material der inneren Kapillarwand usw. mehr
oder weniger betont ist. Wenn in einer Vorrichtung der Erfindung
(1, Bezugsziffer 7) EOF auftritt, trägt er nicht
zur Trennung der Probenstoffe bei, aber er hat noch einen Einfluss
auf die Zeiten, wann die Peaks am Nachweispunkt ankommen. Der EOF
kann jedoch gemessen und berücksichtigt
werden, wenn die Mobilitäten
der Probenstoffe ermittelt werden, zum Beispiel durch Bereitstellen bekannter
Markierungssubstanzen in der Flüssigkeit, welche
durch die Kapillare befördert
wird, siehe zum Beispiel US-Patentschrift 5 316 630 mit dem Titel „Methods
for Chromatography Analysis".
In einer Ausführungsform
der Erfindung kann man auch einen prozessentkoppelten Ansatz der
Art verwenden, wie er in der US-Patentschrift 5 009 760 mit dem
Titel „Measuring
Electrokinetic Properties" beschrieben ist,
oder einen prozessgekoppelten Ansatz der Art, wie er in der US-Patentschrift
4 456 513 mit dem Titel „Measuring
Electrophoretic Mobility" oder
in US-5,441,613 mit dem Titel „Realtime
Monitoring, Measurement and Control of EOF" beschrieben ist.
-
Eine
zweite komplexere Ausführungsform der
Erfindung ist in 4 dargestellt. Diese Ausführungsform
ist in einer Technologie des „Labors
auf einem Chip" (Iab-on-a-Ihip-technology)
verwirklicht, wobei kleine Kanäle,
durch welche Flüssigkeiten
befördert
werden können,
auf einem Mikrofluid-Chip angeordnet sind. Der Chip kann zum Beispiel
aus Glas oder Kunststoffmaterial hergestellt sein. 4 zeigt einen
Hauptkanal 20 und zwei Seitenkanäle 21, 22 auf
einem Mikrofluid-Chip. Die Anordnung ist so gestaltet, dass sie
zwei Abschnitte aufweist, namentlich einen Abschnitt 23 zur
Ausführung
der isoelektrischen Fokussierung (IEF) und einen gelgefüllten Sortierungsabschnitt 24.
-
Mit
Hilfe einer Hochspannungsquelle 25 werden die Probenstoffe
durch den Seitenkanal 21 in den Hauptkanal 20 eingeführt und
dann fokussiert. Verschiedene Probenstoffe in dem Kanal sind mit den
Bezugsziffern 26 und 27 bezeichnet. Nach dem Einführen der
Probe und dem Fokussieren wird mit einer zweiten Hochspannungsquelle 28 eine
Hochspannung entlang des Kanals 20 angelegt. Diese Hochspannung
setzt die Banden in Richtung auf den Abschnitt 24 in Bewegung,
wo das Gel eine weitere Trennung gemäß der Größe der Probenstoffe bewirkt.
-
Eine
Nachweisanordnung 29 wird benutzt, um die Absorption innerhalb
des Gels zu überwachen,
um Daten über
die Konzentration und die Geschwindigkeit der Bewegung der Probenstoffe
herzuleiten. Die Nachweisanordnung umfasst zwei oder mehr Nachweisstellen 29a, 29b, 29c usw.
Die Nachweisanordnung kann zum Beispiel von der Art sein, wie sie
in der US-Patentschrift 5 699 157 beschrieben ist, wobei ein Kanal
durch eine optische Maske bestrahlt wird, während sich die Stoffe durch
den Kanal bewegen, und wobei das Licht, welches mit einem Fotodetektor
erfasst wird, z.B. durch Fourieranalyse analysiert wird. Alternativ
könnten
mehrere Lichtquellen und mehrere Fotodetektoren, welche gegenüber den
Lichtquellen angeordnet sind, verwendet werden, um die Konzentration
und die Geschwindigkeit der Probenstoffe zu ermitteln. Eine solche
Anordnung ist in einem anderen Zusammenhang in der US-Patentschrift
5 303 021 mit dem Titel „Optical
Detection for Capillary Chromatography" offenbart. Die Ausgangssignale der
Nachweisanordnung 29 in 4 werden
einer Signalverarbeitungseinheit 33 zugeführt, wo
sie weiterverarbeitet werden, um verbesserte Trennungsdaten herzuleiten.
-
Zwei
Banden, die im IEF-Abschnitt 23 getrennt worden sind, können immer
noch zur selben Zeit am Detektor ankommen. Aber mit der Kenntnis der
Geschwindigkeit am Nachweispunkt ist es möglich zu berechnen, an welchen
Positionen diese Banden jeweils gestartet sind, d.h. die speziellen
Positionen im ursprünglichen
pH-Gradienten. Das
Messen der Geschwindigkeit allgemein kann Daten über die Größe der Probenstoffe bereitstellen,
aber das Messen der Geschwindigkeit zu speziellen Zeitpunkten ermöglicht es,
Daten über
den pI-Wert (isoelektrischen Punkt) herzuleiten. Der pH-Wert einer
Lösung, in
welcher eine bestimmte Aminosäure
unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes nicht migriert, wird als
isoelektrischer Punkt dieser bestimmten Aminosäure bezeichnet. An seinem pI-Wert
verliert ein Protein seine Nettoladung aufgrund einer pH-induzierten Veränderung
der Dissoziationsstufe.
-
Es
versteht sich, dass andere Nachweisanordnungen als jene in Zusammenhang
mit 1 und 4 beschriebenen benutzt werden
können.
Zum Beispiel könnte
man eine Anordnung von Fotodioden, wie z.B. ein Fotodiodenfeld,
entlang der Trennkapillare benutzen, um die Bewegung der Probenstoffe
zu überwachen.