DE60217066T2

DE60217066T2 - Kristallisierung von igf-1

Info

Publication number: DE60217066T2
Application number: DE60217066T
Authority: DE
Inventors: Michelle Waterville SCHAFFER; Mark Mill Valley ULTSCH; Felix Lebyard VAJDOS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2022-02-02
Also published as: US20060276397A1; CN100439397C; HK1060138A1; DE60233359D1; EP1772464A2; US7354769B2; US7433788B2; DK1358209T3; ZA200304900B; CN1703425A; EP1772464B1; NZ526672A; BR0207422A; DE60217066T4; US7297763B2; IL156435A0; HUP0500733A3; MXPA03007042A; NZ548359A; WO2002064627A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine kristalline Form des humanen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors-1 (IGF-1) und insbesondere kristallines humanes IGF-1, ein Verfahren zu dessen Kristallisation und seine Struktur, die durch Röntgenstrahldiffraktion erhalten wird. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Identifizieren von neuen IGF-1-Agonistenmolekülen, basierend auf biophysikalischen und biochemischen Daten, die ein einzelnes Detergenzmolekül nahe legen, das mit Resten in Kontakt tritt, von denen bekannt ist, dass die für IGS-1-Bindungsprotein(IGFBF)-Interaktion wichtig sind, an IGF-1 spezifisch binden und das Binden von IGFBP-1 und IGFBP-3 blockieren.
Beschreibung des Standes der Technik
Es gibt eine große Menge an Literatur über die Wirkungen und Aktivitäten von IGF (IGF-1, IGF-2 und IGF-Varianten). Humanes IGF-1 ist ein Serumprotein von 70 Aminosäuren und 7649 Dalton mit einem pI von 8,4 (Rinderknecht und Humbel, Prov. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 2365 (1976); Rinderknecht und Humbel, J. Biol. Chem, 253: 2769 (1978)), das zur Familie der Somatomedine mit Insulin-ähnlichen und mitogenen biologischen Aktivitäten gehört, das die Wirkung eines Wachstumshormons (GH) moduliert (Van Wyk et al. Recent Prog. Horm Res, 30: 259 (1974); Binous, Ann. Endocrinol., 41: 157 (1980); Clemmons und Van Wyk, Handbool Exp. Pharmacol., 57: 161 (1981); Baxter, Adv. Clin. Chem, 25: 49)1986); US-Patent Nr. 4,988,675; WO 91/03253; Wo93/23071). IGFs teilen eine hohe Sequenzidentität mit Insulin, wobei sie zu etwa 49 % damit identisch sind. Anders als Insulin jedoch, das als Vorläuferprotein mit einem 33-Aminosäurensegment synthetisiert wird, das als C-Peptid bekannt ist (das abgeschnitten wird, um ein kovalent verbundenes Dimer der verbleibenden A- und B-Ketten zu ergeben), sind IGFs einzelne Polypeptide (vgl. 1).
Bei der Entwicklung eines Embryos führt das Fehlen von IGF-1 zu einer ernsthaften Wachstumsverzögerung, das sich postnatal fortsetzt (Baker et al. Cell, 75: 73-82; Powell-Braxton et al., Genes & Development, 7: 2609.2617 (1993); Liu et al., Cell, 75: 59-72 (1993), Liu et al., Molecular Endocrinol., 12: 1452-1462 (1998)). Während das meiste (mehr als 75 des Serum-IGF-1 von der Leber als Antwort auf ein Wachstumshormon produziert wird, wurde von diesem aus der Leber-stammenden IGF-1 gezeigt, dass es für das post-natale Körperwachstum von Mäusen nicht notwendig ist (Sjogren et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 7088-7092 (1999). Vielmehr ist es das lokal produzierte nicht-hepatische IGF-1, das in einer paracrinen/autocrinen Art wirkt, die für die meisten post-natalen Wachstumseffkte von IGF-1 verantwortlich ist (Schlechter et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 83: 7932-7934 (1986); Isaksson et al., Science, 216: 1237-1239 (1982). Konsistent mit diesen wachstumsfördernden Effekten ist IGF-1 ein leistungsstarkes Mitogen, das diverse zelluläre Funktionen, wie die Zellzyklusprogression, Apoptose und zelluläre Differenzierung, reguliert (LeRoith, Endocrinology, 141: 1287-1288 (2000)).
IGFs sind bei einer Vielzahl zellulärer Funktionen und Krankheitsprozesse beteiligt, einschließlich Zellzyklusprogression, Proliferation, Differenzierung und Insulin-ähnliche Effekte bei der Insulin-resistenten Diabetes. Somit wurde IGF als therapeutisches Werkzeug für eine Vielzahl von Erkrankungen und Verletzungen vorgeschlagen (Übersicht bei Lowe, Scientific American (März/April 1996), Seite 62). Wegen des Aktivitätsbereichs wurde IGF-1 bei Säugern für solche weit auseinander liegenden Krankheiten wie Wundheilung, Behandlung von Nierenerkrankungen, Behandlung von Diabetes, Umdrehen des catabolen Status des Gesamtkörpers, wie AIDS-bedingte Schwächung, Behandlung von Herzerkrankungen wie congestives Herzversagen, und die Behandlung neurologischer erkrankungen getestet (Guler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4889-4893 (1988); Schalch et al., J. clin. Metab., 77: 1563-1568 (1993), Froesch et al., Horm. Res., 42: 66-71 (1994) Vlachopapadopoulou et al., J. Clin. Endo. Metab., 12: 3715-3723 (1995); Saad et al., Diabetologia, 37: Abstract 40 (1994), Schoenle et al., Diabetologica, 34: 675-679 (1991); Morrow et al., Diabetes 42 (suppl.): 269 (1993) (abstract); Kuzuya et al., Diabetes, 42: 696- 705 (1993); Schalch et al., « Short-term metabolic effects of recombinant insulin-like growth factor I (rhIGF-1) in type II diabetes mellitus » in Spencer EM, Hrsgb. Modern Concepts of Insulin-like Growth Factors (New York elsevier: 1991) Seiten 705-715; Zenobi et al., J. Clin. Invest., 90: 2234-2241 (1993); elahi et al., "Hemodynamic and metabolic responses to human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in men" in Modern concept of Insulin-Like Growth Factors, Spencer, EM, Hrsgb. (Elsevier, New York, 1991), Seiten 219-224; Quinn et al., New england J. Med., 323: 1425-1426 (1990); schalch et al., "Short-term metabolic effects of recombinant human insulin-like growth factor 1 (rhIGF-1) in type Ii diabete mellitus", in Modern Concept of Insulin-like Growth Factors, Spencer, EM, Hrsg. (Elsevier, New york, 1991). Seiten 705-714; Schoenle et al., Diabetologia, 34: 675-679 (1991); Usala eet al., N. Eng. J. Med, 327: 853-857 (1992); Liebermann et al., J. Clin. Endo. Metab., 75: 30-36 (1992), Zenobi et al., J. Clin. Invest., 90: 2234-2241 (1992); Zenobi et al., J. Clin. Invest, 89: 1908-1913 (1992); Kerr et al., J. Clin. Invest. 91: 141-147 (1993); Jabri et al., Diabetes, 43: 369-374 (1994); Duerr et al., J. Clin. Invest., 95: 619-627 (1995); Bondy, Ann. Intern. Med., 12o: 593-601 (1994); Hammermann und Miller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14 (1993); Hammermann und Miller, J. Am. Soc. Nephrol., 5: 1-11 (1994) und Barinaga et al., Science, 264: 772-774 (1994)).
Die Patentliteratur ist ebenfalls voll mit Beschreibungen verschiedener Verwendungen von IGF-1 oder Verbindungen, die die aktive IGF-1-Konzentration erhöhen, um Säuger, insbesondere menschliche Patienten, zu behandeln, z.B. US-Patente 5,714,460, 5,273,961, 5,466,670, 5,126,324, 5,187,151, 5,202,119, 5,374,620, 5,106,832, 4,988,675, 5,106,832, 5,068,224, 5,093,317, 5,569,648 und 4,876,242; WO 96/01124, WO 91/03253, WO 93/25219, WO 93/08826 und WO 94/16722.
Das IGF-System ist auch zusammengesetzt aus Membran-gebundenen Rezeptoren für IGF-1, IFG-2 und Insulin. Der Typ I-IGF-Rezeptor (IGF-1R) ist eng bezogen auf den Insulinrezeptor bezüglich Struktur und teilt einige Signalwege (Jones und Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995)). Der IGF-Rezeptor ist ein Clearance-Rezeptor, der scheinbar kein intracelluläres Signal übermittelt (Jones und Clemmons, supra). Da IGF-1 und IGF-2 an IGF-1R mit einer viel höheren Affinität binden als an den Insulinrezeptor, ist es am wahrscheinlichsten, dass die meisten der Effekte von IGF-1 und IGF-2 über IFG-1R vermittelt werden (Humbel, Eur. J. Biochem. 190: 445-462 (1990), Ballard et al., „Dose IGF-1 ever act through insulin receptor?" in Baxter et al., The Insulin-Like Growth Factor and Their Regulatory Proteins, (Amsterdam: elsevier, 1994) Seiten 131-138).
IGF-1R ist ein _α2_β2-Heterotetramer von Disulfid-verbundenen α- und β-Untereinheiten. _αßDimere sind selbst auf der Zelloberfläche Disulfid-verbunden, wodurch ein kovalentes Heterotetramer gebildet wird. Wie beim Insulin/Insulinrezeptor-Komplex bindet IGF-1 an IGF-1R mit einer 1 : 2-Stöchiometrie (De Meyts, Diabetologia, 37: 5135-5148 (1994) mit einer Stelle mit hoher Affinität (K_d etwa 0,4 nM) und einer Stelle mit niedriger Affinität (K_d etwa 6 nM) (Tollefsen und Thompson, J. Biol. Chem., 263: 16267-16273 (1988)). Die Röntgenkristallstruktur der ersten drei Domänen von IGF-1R wurde bestimmt (Garrett et al., Nature, 394 395-399 (1998)). Sie enthält drei distinkte Domänen (L1, Cys-reich, L2). Mutationen, die das IGF-1-Binden beeinflussen, erfasst die konkave Oberfläche des Rezeptors.
IGF-1R ist ein Schlüsselfaktor beim normalen Zellwachstum und der Entwicklung (Isaksson et al., Endocrin. Reviews, 8: 426-438 (1987); Daughaday und Rotwein, Endocrine Rev., 10: 68-91 (1989)). Zunehmende Hinweise legen jedoch nahe, dass der IGF-1R-Signalweg („signaling") auch beim Wachstum von Tumorzellen, der Zelltransformation und der Tumorgenese eine Rolle spielt (Baserga, Cancer Res. 55: 249-251 (1995)). Schlüsselbeispiele umfassen der Verlust des metastatisierenden Phänotyps der Murinkarzinomzellen durch die Behandlung mit Antisens-RNA gegen IGF-1R (Long et al., Cancer Res. 55: 1006-1009 (1995)) und die in vitro Inhibierung der Beweglichkeit humaner Melanomzellen (Strack et al., J. Biol. Chem. 264: 21554-21559 (1989) und des Wachstums von humanen Brustkrebszellen durch Zugabe von IGF-1-Antikörpern (Rohlik et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149: 276-281 (1987)).
Die IGFs sind potente Brustkrebszellmitogene, basierend auf der Beobachtung, dass IGF-1 die Brustkrebszellproliferation in vitro erhöht (Cullen et al., Cancer Res. 50: 48-53 (1990)). Brustkrebs exprimiert IGF-2 und IGF-1R, was all die erforderlichen Effektoren für ein autocrines Loop-basierendes Proliferationsparadigma bereitstellt (Quinn et al., J. Biol. Chem. 271: 11477-11483 (1996); Steller et al., Cancer Res. 56: 1761-1765 (1996)). Da der Brustkrebs eine häufige Malignität ist, die etwa 1 von acht Frauen befällt, und die häufigste Todesursache von Krebs bei Frauen aus Nordamerika ist (LeRoith et al., Ann. Int. Med. 122: 54-59 (1995)) werden neue rationale Therapien zur Intervention benötigt. IGF-1 kann die Apoptose unterdrücken und somit können Zellen, denen IGF-1Rs fehlen oder die einen beeinträchtigten IGF-1R-Signalweg haben, Tumorzellen entstehen lassen, die selektiv via Apoptose sterben (Long et al., Cancer res., 55: 1006-1009 (1995)). Des weiteren wurde kürzlich evident, dass Änderungen des IGF-Signals im Kontext mit anderen Krankheitszuständen, wie Diabetes, für die Verschlimmerung der Komplikationen der Retinopathie (Smith et al., Science, 276: 1706-1709 (1997)) und Neuropathy (Horney et al., Am. J. Physiol. 274: F1045-F1053 (1998)) verantwortlich ist.
IGF-1 wird in vivo hauptsächlich im Komplex mit einer Familie von mindestens sechs Serumproteinen gefunden, die als IGFBPs bekannt sind (Jones und Clemmons, supra; Bach und Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995)), die den Zugang der IGFs zu IGF-1R modulieren. Sie regulieren auch die Konzentrationen von IGF-1 und IGF-2 in der Zirkulation und die Mengen von Gewebe-IGF-1R (Clemmons et al., Anal NY Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993)). Die IGFBPs binden IGF-1 und IGF-2 mit verschiedenen Affinitäten und Spezifitäten (Jones und Clemmons, supra; Bach und Rechler, supra) Beispielsweise bindet IGFBP-3 IGF-1 und IGF-2 mit einer ähnlichen Affinität, wohingegen IGFBP-2 und IGFBP-6 IGF-2 mit einer viel höheren Affinität binden als sie IGF-1 binden (Bach und Rechler, supra; Oh et al., Endocrinology 132: 1337-1344 (1993)). Das Hauptträgerprotein ist wegen der heterogenen Größe des Komplexes der durch Glycosylierung verursacht wird, IGFBPs. Gegenwärtig ist nichts über die Stöchiometrie der Bindung in diesen Komplexen von IGF-1 und seinen IGFBPs wegen der heterogenen Größe der Komplexe, die durch die Glyksylierung verursacht werden, bekannt.
IGF-1 tritt natürlicherweise in humanen Körperflüssigkeiten auf, beispielsweise Blut und humane Cerebralspinalflüssigkeit. Obwohl IGF-1 in vielen Geweben produziert wird, wird von dem Meisten des zirkulierenden IGF-1 angenommen, dass es in der Leber synthetisiert wird. Von den IGFBPs wird angenommen, dass die biologische Aktivität von IGF-1 (Jones und Clemmons, supra) moduliert wird, wobei IGFBP-1 (Lee et al., Proc. Soc. Exp. Biol & Med. 204: 4-29 (1993) als das Hauptbindungsprotein, das beim Glucosemetabolismus involviert ist, beteiligt ist (Baxter „Physiological roles of IGF binding proteins" in: Spencer (Hrsgb.), Modern Concepts of Insulin-like Growth Factor (Elsevier, New York, 1991), Seiten 371-380)). Die IGF-Produktion durch die Leber wir durch der Ernährungssatus reguliert, wobei Insulin direkt ihre Produktion unterdrückt (Suikkari et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 66: 266-272 (1988)).
Die Funktion von IGFBP-1 in vivo wird wenig verstanden. Die Verabreichung von gereinigtem humanem IGFBP-1 an Ratten hat gezeigt, dass eine akute aber geringe Erhöhung der Blutglucosemenge verursacht wird (Lewitt et al., Endocrinology 129: 2254-2256 (1991)). Die Regulierung von IGFBP-1 wird etwas besser verstanden. Es wurde vorgeschlagen (Lewitt und Baxter, Mol. Cell Endocrinology, 79: 147-152 (1991), dass, wenn die Blutglucose erhöht wird und Insulin sezerniert wird, IGFBP-1 unterdrückt wird, was eine langsame Erhöhung der Menge an „freier" IGF-1 erlaubt, die der Insulinwirkung auf dem Glucosetransport assistiert. Ein solches Szenario stellt die Funktion von IGFBP als direkten Regulator der Blutglucose dar.
In den meisten fällen schneidet die Zugabe von IGFBP die Effekte von IGF-1 ab. Beispielsweise ist der wachstumsstimulierende Effekt von Estradiol auf die humanen MCF-7-Brustkrebszellen mit einer verminderten IGFBP-3 mRNA und Proteinakkumulation assoziiert, wohingegen das Anti-Östrogen ICI 182780 die Wachstumsinhibition und Erhöhte IGFBP-3 mRNA und Protein-Mengen verursacht (Huyn et al., J. Biol. Chem., 271: 1016-1021 (1996); Oh et al., Prog Growth Factor Res., 6: 503-512 (1995)). Es wurde auch berichtet, dass die in vitro Inhibierung der Proliferation von Brustkrebszellen durch Retinolsäure („retinoic acid") eine geänderte IGFBP-Sekretion durch Tumorzellen oder verminderte zirkulierende IGF-1-Mengen in vivo involvieren kann (LeRoith et al., Ann. Int. Med. 122: 54-59 (1995); Oh et al., (1995) supra). Im Gegensatz zu diesen Befunden vermindert die Behandlung von MCF-7-Zellen mit dem Anti-Östrogen Tamoxifen das IGF-1R-Signal in einer Art, die auf die verminderte IGFBP-Produktion nicht bezogen ist (Lee et al., J-Endocrinol., 152: 39 (1997)). Zusätzliche Stütze für die allgemeinen anti-proliferativen Effekte von IGFBPs ist der schlagende Befund, dass IGFBP-3 ein Zielgen für den Tumorsuppressor p53 ist (Buckbinder et al., Nature, 377: 646-649 (1995). Dies legt nahe, dass die Suppressoraktivität von p53 teilweise durch die IGFBP-3-Produktion und die folgende Blockade der IGF-Wirkung vermittelt wird (Buckbinder et al., supra). Diese Ergebnisse zeigen, dass die IGFBPs die Zellproliferation blockieren können, indem sie paracrine/autocrine Prozesse modulieren, die durch IGF-1/IGF-2 reguliert werden. Eine selbstverständliche Folge dieser Beobachtungen ist der Befund, dass die Prostata-spezifischen Antigene (PSA) eine IGFBP-3-Protease ist, die nach Aktivierung die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber der Wirkung von IGF-1/IGF-2 wegen der proteolytischen Inaktivierung von IGFBP-3 erhöht (Cohen et al., J. Endocr., 142: 407-415 (1994)). Die IGFBPs komplexieren mit IGF-1/IGF-2 und interferieren mit dem Zugang von IGF-1/IGF-2 zu IGF-1Rs (Clemmons et al., Anal. NY Acad. Sci. USA, 692: 10-21 (1993)). IGFBP-1, -2, und -3 inhibieren das Zellwachstum nach der Addition zu Zellen in vitro (Lee et al., J. Endocrinol., 152: 39 (1997); Feyen et al., J. Biol. Chem. 266: 19469-19474 (1991)). Ferner wurde von IGFBP-1 (McGuire et al., J. Natl. Cancer Inst., 84: 1335-1341 (1992); Fugueroa et al., J. Cell Physiol., 157: 229-236 (1993)), IGFBP-3 (Oh et al., (1995) supra; Pratt und Pollak, Biophys. Res Commun., 198: 292-297 (1994)) und IGFBP-2 gezeigt, dass sie IGF oder Östrogen-induzierte Brustkrebszellproliferation in nanomolarer Konzentration in vitro inhibieren. Diese Befunde stützen die Idee, dass die IGFBPs potente Antagonisten der IGF-Wirkung sind. Es gibt auch Belege für einen direkten Effekt von IGFBP-3 auf Zellen durch ihren eigenen Zelloberflächenrezeptor, unabhängig von den IGF-Interaktionen (Oh et al., J. Biol. Chem., 268: 14964-14971 (1993); Valentinis et al., Mol. Endocrinol. 9: 361-367 (1995)). Zusammengenomme unterstreichen diese Befunde die Wichtigkeit von IGF und IGF-1R als Targets für die therapeutische Verwendung.
IGFs besitzen mitogene und anti-apoptotische Einflüsse auf normale und transformierte Prostataepithelzellen (Hsing et al., Cancer. Research, 56: 5146 (1996), Culig et al., Cancer Research 54: 5474 (1994); Cohen et al., Hormon and Metabolic Research, 26: 18 (1994); Iwamura et al., Prostate, 22: 243 (1993); Cohen et al., J. Clin. Endocrin & Metabol., 73: 401 (1991); Rajah et al., J. Biol. Chem., 272: 12181 (1997)). Das Meiste von zirkulierendem IGF-1 entstammt der Leber, aber die IGF-Bioaktivität im Gewebe ist nicht nur auf die Mengen von zirkulierendem IGF und IGFBP bezogen, sondern auch auf die lokale Produktion von IGFs, IGFBPs und IGFBP-Proteasen (Jones und Clemmons, Endocrine Reviews, 16: 3 (1995)). Die Variabilität von Person zu Person in den Mengen an zirkulierendem IGF-1 und IGFBP-3 (das zirkulierende Haupt-IGFBP (Jones und Clemmons, supra)) ist bemerkenswert (juul et al., J. Clin. Endocrinol. & Metabol. 78: 744 (1994); Juul et al., J. Clin. Endocrinol. & Metabol., 80: 2534 (1995)), und die Heterogenität in den IGF-1-Mengen im Serum scheinen die Heterogenität der Gewebe-IGF-Bioactivität wieder zu spiegeln. Marker, die der IGF-Achsenkomponenten entsprechen, können als Risikomarker für Prostatakrebs verwendet werden, wie PSA in ähnlicher Weise verwendet wird (WO 99/38011).
Anders als die meisten anderen Wachstumsfaktoren, liegen die IGFs in hohen Konzentrationen in der Zirkulation vor, aber nur ein kleiner Anteil der IGFs ist nicht an ein Protein gebunden. Beispielsweise ist allgemein bekannt, dass bei Menschen und Nagern weniger als 1 % des IGF im Blut „frei" oder ungebunden vorliegt (Juu et al., Clin. Endocrinol., 44: 515-523 (1996); Hizuka et al., Growth Regulation, 1: 51-55 (1991), Hasegawa et al., J. Clin Endocrinol. Metabol., 80: 3284-3286 (1995)). Der überwiegende Hauptteil der IGFs im Blut zirkuliert als Teil eines nicht-kovalent assoziierten ternären Komplexes, der aus IGF-1 oder IGF-2, IGFBP-3 und einem großen Protein, das als säurelabile Untereinheit (ALS) bezeichnet wird, zusammengesetzt ist. Der ternäre Komplex von IGF, IGFBP-3 und ALS besitzt ein Molekulargewicht von etwa 150 000 Dalton, und es wurde vorgeschlagen, dass die Funktion dieses Komplexes in der Zirkulation darin besteht, dass er als Reservoir und Puffer für IGF-1 und IGF-2 dient, was schnelle Änderungen in der freien IGF-1 oder IGF-2 verhindert.
Es gibt viele Arbeiten, die die Regionen von IGF-1 und IGF-2 identifizieren, die an die IGFBPs binden (Bayne et al., J. Biol. Chem., 265: 15648-15652 (1990); Dubaquie und Lowman, Biochemistry, 38: 6386-6396 (1999); und US-Patente 5,077,276, 5,164,370 und 5,470,828). Beispielsweise wurde entdeckt, dass die N-terminale Region von IGF-1 und IGF-2 für die Bindung an die IGFBPs kritisch ist (US-Patente Nr. 5,077,276; 5,164,370 und 5,470,828). Somit bindet die natürliche Variante von IGF-1, die als des(1-3)IGF-1 bezeichnet wird, schwach an IGFBPs.
Eine ähnliche Menge an Forschung wurde der Identifizierung der Regionen von IGF-1 und IGF-2 gewidmet, die an IGF-1R binden (Bayne et al., supra; Oh et al., Endocrinology (1993) supra). Es wurde gefunden, dass die Tyrosin-Reste von IGF-1 an den Positionen 24, 31 und 60 für das Binden von IGF-1 an IGF-1R entscheidend sind (Bayne et al., supra). Mutierte IGF-1-Moleküle, in denen einer oder mehrere der Tyrosin-Reste substituiert sind, zeigten eine progressiv verminderte Bindung an IGF-1R. Bayne et al., untersuchten auch, ob solche Mutanten von IGF-1 an IGF-1R und die IGFBPs binden könnten. Sie fanden, dass ziemlich verschiedene Reste von IGF-1 und IGF-2 verwendet werden, um an die IGFBPs zu binden, von denen, die verwendet werden, um an IGF-1R zu binden. Es ist somit möglich, IGF-Varianten herzustellen, die eine vermindertes Binden an die IGFBPs zeigen, aber, da sie gut an IGF-1R binden, eine aufrechterhaltene Aktivität bei in vitro Aktivitätsassays zeigen.
Es wurde auch von einer IGF-Variante berichtet, die an IGFBPs aber nicht an IGF-Rezeptoren binden und somit eine verminderte Aktivität in in vitro-Tests zeigen (Bar et al., Endocrinology, 127: 3243-3245 (1990). Bei dieser Variante, die als (1-27, g1y⁴, 38-70)-hIGF-1 bezeichnet wird, sind die Reste 28-37 des C-Region des humanen IGF durch eine Glycin-Brücke aus 4 Resten ersetzt.
Andere abgeschnittene IGF-1-Varianten sind offenbart. Beispielsweise wird in der Patentliteratur WO 96/33216 eine abgeschnittene Variante beschrieben, die die Reste 1-69 des authentischen IGF-1 aufweist. Die EP 742,228 offenbart Zweiketten-IGF-1-Superangonisten, die Derivate des natürlich vorkommenden, einkettigen IGF-1 mit einer abgekürzten C-Region sind. Die IGF-1-Analoga haben die Formel BCⁿ,A, wobei B die B- Region von IGF-1 oder ein funktionelles Analogon davon, C die C-Region von IGF-1 oder ein funktionelles Analogon davon, n die Anzahl der Aminosäuren in der C-Region darstellt und von etwa 6 bis etwa 12 beträgt und A für die A-Region von IGF-1 oder ein funktionelles Analogon davon steht.
Zusätzlich offenbart Cascieri et al., Biochemistry, 27: 3229-3233 (1988) vier mutierte IGF-1, wobei drei davon eine verminderte Affinität zu IGF-1R besitzen. Diese Mutanten sind (Phe²³, Phe²⁴, Tyr²⁵)IGF-1 (das mit humanem IGF-1 äquipotent in der Affinität zu den Typen 1 und 2 IGF und den Insulinrezeptoren ist), (Leu²⁴)IGF-1 und (Ser²⁴)IGF-1 (das eine niedrigere Affinität als IGF-1 gegenüber humaner Placenta-IGF-1R, dem Placentainsulinrezeptor und dem IGF-1R aus Ratten- und Mäusezellen aufweist) und das Desoctapeptid (Leu²⁴)IGF-1 (in dem der Verlust der Aromatizität in Position 24 mit der Deletion der Carboxyl-terminalen D-Region von hIGF-1 kombiniert ist, die eine niedrigere Affinität als (Leu²⁴)IGF-1 für IGF-1R und eine höhere Affinität für den Insulinrezeptor aufweist). Diese vier Mutanten besitzen eine normale Affinität für humane Serum-bindende Proteine.
Bayne et al., J. Biol. Chem., 263: 6233-6239 (1988) offenbaren vier strukturelle Analoga von humanem IGF-1: eine B-Ketten-Mutante, in der die ersten 16 Aminosäuren von IGF-1 durch die ersten 17 Aminosäuren der B-Kette des Insulins ersetzt sind, (Gln³, Ala⁴)IGF-1, (Tyr¹⁵, Leu¹⁶)IGF-1 und (Gln³,Ala⁴,Tyr¹⁵,Leu¹⁶)IGF-1. Diese Studien identifizieren einige der Regionen von IGF-1, die für die Aufrechterhaltung der Hochaffinitätsbindung mit dem Serumbindungsprotein und den Typ-2-IGF-Rezeptor verantwortlich ist.
In einer anderen Studie offenbaren Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004-11008 (1988) drei strukturelle Analoga von IGF-1: (1-62)IGF-1, dem die Carboxyl-terminale 8-Aminosäure-D-Region von IGF-1 fehlt, (1-27, Gly²⁴, 38-70)IGF-1, in dem die Reste 28-37 der C-Region von IGF-1 durch ein Glycin-Brücke aus 4 Resten ersetzt ist und (1-27), Gly⁴, 38-62)IGF-1, mit einem C-Region-Austausch und einer D-Region-Deletion. Peterkofsky et al., Endocrinology, 128: 1769-1779 (1991) offenbart Daten, die die Gly⁴-Mutante von Bayne et al, supra, verwendet.
Cascieri et al., J. Biol. Chem., 264: 2199-2202 (1989) offenbaren drei IGF-1-Analoga, in denen spezifische Reste in der A-Region von IGF-1 durch die entsprechenden Reste in der A-Kette des Insulins ersetzt sind. Diese Analoga sind:
(Ile⁴¹, Glu⁴⁵, Gln⁴⁶, Thr⁴⁹, Ser⁵⁰, Ile⁵¹, Ser⁵³, Tyr⁵⁵, Gln⁵⁶)IGF-1 eine A-Kettenmutante bei der der Rest 41 von Threonin in Isoleucin geändert wurde und die Reste 42-56 der A-Region sind ersetzt; (Thr⁴⁹, Ser⁵⁰, Ile⁵¹,)IGF-1 und (Tyr⁵⁵, Gln⁵⁶)IGF-1.
Clemmons et al., J. Biol. Chem. 265: 12210-12216 (1990) offenbart die Verwendung von IGF-1-Analoga, die eine vermindert Bindungsaffinität für entweder IGF-1R oder Bindungsproteinen haben, um die Ligandenspezifität von IGFBP-1 und die Rolle von IGFBP-1 bei der Modulierung der biologischen Aktivität von IGF-1 zu untersuchen.
WO 94/04569 offenbart ein spezifisches Bindungsmolekül, das anders als die natürlichen IGFBP ist, das Fähig ist, an IGF-1 zu binden und die biologische Aktivität von IGF-1 erhöhen kann.
Peptide, die an IGFBP-1 binden, blockieren die IGF-1-Bindung an dieses Bindungsprotein und setzten dadurch Aktivität von „freiem IGF" aus Gemischen von IGF 1 und IGFBP frei, wurden kürzlich beschrieben (Lowman et al., Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998); WO 98/45427, veröffentlicht am 15. Oktober 1998, Lowman et al., International Pediatric Nephrology Association, Fifth Symposium on Growth and Development in Children with Renal Failure (New York, March 13, 1999)). Auch beschrieben ist das natürliche Molekül des(1-3)IGF-1, das eine selektiv verminderte Affinität für einige der IGF-Bindungsproteine zeigt, jedoch eine beibehaltene Affinität für den IGF-Rezeptor (US-Patente Nr. 5,077,276, 5,164,370, 5,470,828.
Die Nutzbarmachung der Interaktion zwischen IGF und IGFBP beim Screenen, Verhindern oder Behandeln einer Erkrankung wurde jedoch beschränkt, da spezifische Antagonisten fehlen. Bis heute ist nur eine Publikation bekannt, dass sie existiert, die die Anwendung eines IGF-1/IGF-2-Antagonists als potentes Zusatztherapeutikum bei der Behandlung von Krebs beschreibt (Pietrzkowski et al., Cancer Res., 52: 6447-6451 (1992)). In diesem Bericht wurde ein Peptid, das der D-Region von IGF-1 entspricht, zur Verwendung als IGF-1/2-Antagonist synthetisiert. Dieses Peptid zeigte eine fragwürdige inhibitorische Aktivität gegen IGF-1. Die Basis für die beobachtete Inhibition ist unklar, da die D-Region keine signifikante Rolle bei der IGF-1R-Bindung sondern bei der IGF-1-Bindung an den Insulinrezeptor spielt (Cook et al., Biochem., 30: 5484-5491 (1991); Bayne et al., supra (Vol. 264), Yee et al., Cell Growth and Different., 5: 73-77 (1994).
WO 00/23469 offenbart die Teile der IGFBP- und IGF-Peptide die für die IGF-IGFBP-Bindung zählen, d.h. eine isolierte IGF-Bindungsdomäne eines IGFBP oder Modifikation davon, die mit mindestens der gleichen Bindungsaffinität wie das IGFBP in voller Länge bindet. Die Patentveröffentlichung offenbart auch einen IGF-Antagonisten, der das Binden von IGF an einen IGF-Rezeptor vermindert und/oder an eine Bindungsdomäne von IGFBP bindet.
Zusätzlich offenbart EP 639981 pharmazeutische Zusammensetzungen, die kurze Peptide umfassen, die als IGF-1-Rezeptorantagonisten wirken. Die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Peptide bestehen aus weniger als 25 Aminosäuren, umfassen mindestens einen Teil der C- oder D-Region von IGF-1 und Inhibieren die IGF-1-induzierte Autophosphorylierung des IGF-1-Rezeptors.
Polypeptide, einschließlich IGF-Moleküle, besitzen eine dreidimensionale Struktur, die durch die primäre Aminosäuresequenz und die Umgebung der umgebenden Polypeptide bestimmt ist. Diese dreidimensionale Struktur begründet die Aktivität, Stabilität, Bindungsaffinität, Bindungsspezifität und andere biochemische Eigenschaften der Polypeptide. Somit kann die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur eines Proteins eine große Anleitung bei der Konstruktion von Mitteln sein, die ihre biologische Aktivität in löslichen oder Membran-gebundenen Formen nachahmen, inhibieren oder verbessern.
Die dreidimensionale Struktur eines Polypeptides kann auf vielen Wegen bestimmt werden. Viele der meisten präzisen Verfahren verwenden die Röntgenkristallgraphie (Van Holde, Physical Biochemistry (Prentice Hall: N.J., 1971), Seiten 221-239). Diese Technik beruht auf der Fähigkeit kristalliner Gitter, Röntgenstrahlen oder andere Strahlungsformen zu beugen. Beugungsexperimente, die zur Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Makromoleküls geeignet sind, erfordern typischerweise Kristalle mit hoher Qualität. Leider stehen solche Kristalle für IGF-1 und viele andere interessierende Proteine nicht zur Verfügung. Kristalle wurden für M-CSF ( EP 668,914 B1 ), CD40-Ligand (WO 97/00895) und ein BC2 Fab-Fragment (WO 99/01476) beispielsweise beschrieben.
Die Kristallisation von Insulin ist in ein intensives Forschungsgebiet, sowohl im Hinblick auf die Arbeit zu Strukturanalyse (Adams et al., Nature 224: 491 (1969)) als auch die pharmazeutischen Anwendungen. Beispiele von Insulinkristallsuspensionen, die therapeutische eingesetzt werden, umfassen rombohedrale Zink-Insulin-Kristalle, die in Gegenwart von 0,8 bis 2,5 % Zink (basierend auf das gewicht des Insulins) bei einem neutralen pH-Wert stabil sind und eine verspätete Wirkung zeigen, und Isophan-Insulin-Protamin-Kristalle, die zur verspäteten Wirkungsprodukten in Form kleiner Stäbchen eingesetzt werden. Ferner sind einige wenige andere Kristallmodifikationen des Insulins bekannt, die aber bisher nur für die Röntgenstrukturanalyse interessant waren. Somit wurden Zink-freie orthorombische und monokline Kristalle unter sauren pH-Bedingungen erhalten (Einstein und Low, Acta Crystallorg., 15: 32-34 (1962)). Kleinere rhombische Dodecahedra, die in die kubische Raumklasse eingeordnet werden, wurden am isoelektrischen Punkt ebenfalls in Abwesenheit von Zink erhalten. Schließlich wurde eine monokline Kristallform von Insulin über dem isoelektrischen Punkt in Gegenwart von Zink und in Gegenwart von Phenol oder Phenol-Derivaten erhalten. Diese Kristalle wachsen zu einer beachtlichen Größe (bis zu 3 mm) innerhalb weniger Tage und sie besitzen scharfe Kanten. Interessanterweise wurden diese Kristalle nur an Glassoberflächen und nicht auf der freien Oberfläche der Lösung gefunden. Kristallsuspensionen und andere Kristallformen von Insulinpräperationen und Insulinanaloga werden beispielsweise in solchen repräsentativen US-Patenten beschrieben, wie 4,959,351; 5,840,680; 5,834,422; 6,127,334; 5,952,297; 5,650,486; 5,898,028; 5,898,067; 5,948,,751; 5,747,642; 5,597,893; 5,547,930; 5,534,488; 5,504,188; 5,461,031; und 5,,028,587.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung kristalliner Proteine und Polypeptide sind auf diesem Gebiet bekannt (McPherson et al., „Preparation and Analysis of Protein Crystals, McPherson (Robert E. Krieger Publishing Company, Malabar, FL, 1989); Weber, Advances in Protein Chemistry, 41: 1-36 (1991); US-Patente Nr.: 4,672,108 und 4,833,233). Obwohl es mehrfache Zugänge zum Kristallisieren von Polypeptiden gibt, stellt kein einzelner Satz von Bedingungen eine vernünftige Erfolgserwartung bereit, insbesondere wenn die Kristalle für Röntgenbeugungsuntersuchungen geeignet sein sollen. Eine bedeutsame Anstrengung ist erforderlich, um Kristalle von ausreichender Größe und Auflösung zu erhalten, um genaue Informationen bezüglich der Struktur bereit zu stellen. Wenn beispielsweise ein Protein mit ausreichender Reinheit erhalten wird, muss es in einer Größe und Klarheit kristallisiert werden, die für die Röntgenbeugung und nachfolgende Strukturauflösung geeignet ist. Ferner, obwohl die Aminosäuresequenz eines Zielproteins bekannt sein kann, erlaubt diese Sequenzinformation keine genaue Voraussage der Kristallstruktur des Proteins. Und auch bietet die Sequenzinformation kein Verständnis der strukturellen, konformationalen und chemischen Interaktionen zwischen einem Liganden, wie IGFBP, und seinem Zielprotein. Somit, obwohl Kristallstrukturen einen Reichtum an wertvollen Informationen auf dem Gebiet der Arzneimittelwirkstoffdesigns und -entdeckung bereitstellen können, stehen Kristalle bestimmter biologisch relevanter Verbindungen, wie IGF-1, nicht leicht dem Fachmann zur Verfügung. Beugende IGF-1-Kristalle mit hoher Qualität würden die Bestimmung ihrer dreidimensionalen Struktur unterstützen.
Eine Generation von spezifischen IGF-1-Antagonisten wurde zumindest teilweise wegen der Schwierigkeit beim Untersuchen der Struktur von IGF und IGFBPs eingeschränkt. Wegen der Unfähigkeit, IGF-1-Kristalle zu erhalten, die für die Beugungsuntersuchungen geeignet sind, war beispielsweise die Extrapolation der IGF-1-Struktur, die auf der Kristallstrukur von Schweineinsulin basiert, der wichtigste strukturelle Wegweiser für verfügbares IGF-1 (Blundell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 180-184 (1978)); vergleiche auch Blundell et al., Fed. Proc, 42: 2592-2597 (1983), der tertiäre Strukturen, Rezeptorbindungen und Antigenizitäten von IGFs beschreibt. Basierend auf Studien von chemisch modifiziertem und mutiertem IGF-1, wurden eine Vielzahl von gemeinsamen Resten zwischen IGF-1 und Insulin identifiziert, die Teil der IGF-1R-Insulinrezeptor-Kontaktstelle sind, insbesondere die aromatischen Reste an den Positionen 23-25.
Unter Verwendung von NMR und eingeschränkter molekularer Dynamiken wurde die Lösungsstruktur von IGF-1 kürzlich beschrieben (Cooke et al., supra). Von der resultierenden minimierten Struktur wurde gezeigt, dass sie besser zu den experimentellen Befunden über modifiziertes IGF-1 sowie den Extrapolationen von den Struktur-Aktivitäts-Studien von Insulin passt. Ferner offenbart De Wolf et al., Protein Sci., 5: 2193-2202 (1996) die Lösungsstruktur eines mini-IGF-1. Sato et al., Int. J. Protein Res., 41: 433-440 (1993) offenbart die dreidimensionale Struktur von IGF-1, die durch ¹H-NMR und Distanzgeometrie („distance geometry") bestimmt wurde. Laajoki et al., J. Biol. Chem., 275: 10009-10015 (2000) offenbart die Lösungsstruktur und die Hauptkettendynamiken von lang-[Arg(3)]IGF-1, vgl. auch Laajoki et al., FEBS Lett., 420: 97-102 (1997). Die kleine Anzahl von NMR-Modellen, die für IGF-1 verfügbar ist, ist nicht besonders gut definiert, da es zwischen den Hauptketten-Atomen und den helikalen Segmenten große RMSD gibt. Das beste NMR-Modell gibt es von IGF-2, in dem 3 alpha-Helices gezeigt sind, vgl. Torres et al., J. Mol. Biol., 248: 385-401 (1995), die die Lösungsstruktur von humanem IGF-2 und seine Beziehung zur Rezeptor- und Bindungsproteininteraktion offenbart. In allen Strukturen sind die C- und D-Regionen sehr wenig definiert.
Zusätzlich zur Bereitstellung der strukturellen Informationen, stellen kristalline Polypeptide andere Vorteile bereit. Beispielsweise reinigt der Kristallisationsprozess selbst weiter das Polypeptid und befriedigt eines der klassischen Kriterien für die Homogenität. Tatsächlich stellt die Kristallisation häufig eine nicht parallelisierte Reinigungsqualität bereit, die Verunreinigungen entfernt, die nicht durch andere Reinigungsmethoden, wie HPLC, Dialyse, herkömmliche Säulenchromatographie etc. entfernt werden. Ferner sind kristalline Polypeptide oft bei Umgebungstemperaturen stabil und frei von Proteaseverunreinigungen und anderem Abbau, der mit der Lösungslagerung verbunden ist. Kristalline Polypeptide können auch für pharmazeutische Präparationen nützlich sein. Schließlich sind Kristallisationstechniken im Allgemeinen weitestgehend frei von Problemen wie Denaturierung, die mit anderen Stabilisierungsverfahren (z.B. Lyophilisierung) verbunden sind. Es gibt somit ein wichtiges Bedürfnis zur Herstellung von IGF-1-Zusammensetzungen in kristalliner Form und dem Bestimmen ihrer dreidimensionalen Struktur. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse. Wenn einmal eine Kristallisation ausgeführt wurde, stellen die kristallographischen Daten nützliche strukturelle Informationen bereit, die das Design von Peptiden unterstützen können, die als Agonisten oder Antagonisten dienen können. Zusätzlich stellt die Kristallstruktur Informationen bereit, die nützlich sind, um die Rezeptorbindungsdomäne kartographisch zu erfassen, die dann durch kleine Nicht-Peptidmoleküle nachgeahmt werden kann, die als Antagonist oder Agonist dienen kann. Auch Befunde über die Detergenzinhibierung der Bindung von IGFBP an IGF-1 kann verwendet werden, um neue IGF-1-Agonisten zu identifizieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend wird die Erfindung beansprucht. IGF-1 wurde kristallisiert und seine Struktur wurde unter Verwendung einer anormalen Multiwellenlängenbeugung („multiwavelength anomalous diffraction" (MAD)) bei 1,8 Å Auflösung durch Ausnutzen der anormalen Streuung eines einzelnen Bromid-Ions und sechs von sieben Schwefelatomen von IGF-1 bestimmt. Die C-Region von IGF-1, die in der Kristalllstruktur geordnet ist, bildet eine beta-Umkehrung („turn") vom Typ II und vermittelt die Kristallpackungsinteraktion über die kristallographische Dyade. Der Lösungszustand von IGF-1 wurde durch analytische Ultrazentrifugation charakterisiert, und die Ergebnisse zeigen, das IGF-1 bei neutralem pH hauptsächlich als Monomer vorliegt, mit nur einer geringen Tendenz, bei Millimolaren Konzentrationen zu dimerisieren. Ein Moleküldetergenz, N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin (deoxy big CHAPS) vermittelt einen Kristallpackungskontakt zwischen Symmetrie-bezogenen Molekülen. Die Lösungsexperimente bestätigen, dass der IGF-1:N,N-bis(D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin-Komplex eine Lösung bildet, und dass das Detergenzbinden messbar das IGFBP-Binden blockiert.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein aus IGF-1 gebildeten Kristall bereit, der Röntgenstrahlen beugt, um ein Beugunsgmuster zu ergeben, das die dreidimensionale Struktur von IGF repräsentiert. Vorzugsweise besitzt dieser Kristall in etwa die folgenden Zellkonstanten a = 31,831 Å, β = 71,055 Å, c = 65,995 Å und eine C222-Raumgruppe. Ebenfalls bevorzugt enthält das IGF-1 eine A-, B-, C,- und D-Region und bildet ein Dimer in dem Kristall, und weiter bevorzugt umfasst das Kristall eine Rezeptorbindungsstelle an dem Dimerinterface.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die das vorstehende Kristall und einen Träger umfasst. Vorzugsweise ist in dieser Zusammensetzung das IGF-1 biologisch aktiv, wenn es wieder gelöst wird. Die Erfindung stellt ferner die Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Säugers bereit, der an einer Agonistenerkrankung leidet, vorzugsweise einen humanen Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge der vorstehenden wieder aufgelösten Zusammensetzung an den Säuger umfasst.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kristallisieren von IGF-1 der SEQ ID Nr. 1, wie es in den Ansprüchen definiert ist, bereit.
Die Erfindung stellt auch kristallines IGF-1 bereit, das durch das vorstehende Verfahren hergestellt wurde.
Zusätzlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der drei-dimensionalen Struktur von IGF-1 bereit, wie es in den Ansprüchen definiert ist.
Ferner ist ein maschinenlesbares Datenspeichermedium beschrieben, das ein Datenspeichermaterial umfasst, das mit maschinenlesbaren Daten kodiert ist, die, wenn es von einer geeigneten Maschine gelesen wird, die dreisimensionale Darstellung eines Kristalls aus einem Molekül, das IGF-1 umfasst, zeigt.
Ein IGF-1-Kristall mit den in Anhang 1 dargestellten Strukturkoordinaten ist beschrieben.
Zusätzlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung einer dreidimensionalen Struktur von IGF-1 bereit, die von einem IGF-1-Kristall stammt, in dem die dreidimensionale Struktur von IGF-1 eine IGF-1-Rezeptorbindungsregion umfasst, wobei das Verfahren das Identifizieren der Verbindungen mit Strukturen umfasst, die mit der Rezeptorbindungsregion der dreidimensionalen Struktur von IGF-1 interagiert und als IGF-1-Agonist oder Antagonist funktioniert. Vorzugsweise umfasst in einem solchen Verfahren die dreidimensionale Struktur von IGF-1 alpha-Kohlenstoffkoordinaten, die im Wesentlichen die gleichen wie die der in Anhang 1 dargestellten Strukturinformationen sind.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von IGF-1-Agonisten oder -Antagonisten bereit, das die Schritte umfasst:

a) Kristallisieren von IGF-1, um die beanspruchten IGF-1-Kristalle zu bilden, die eine Gruppe von Aminosäureresten enthalten, die eine IGF-1-Rezeptorbindungsregion definieren;
b) Bestrahlen der IGF-1-Kristalle aus Schritt a), um das Beugungsmuster der IGF-1-Kristalle zu erhalten;
c) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von IGF-1 aus dem Beugungsmuster, wobei die Struktur eine IGF-1-Rezeptorbindungsregion umfasst, und
d) Identifizieren eines IGF-1-Agonisten oder -Antagonisten, der die dreidimensionale Struktur aufweist, die im wesentlichen die IGF-Rezeptorbindung, Lösunsmittelzugängliche Reste, die die dreidimensionale Struktur der IGF-1-Rezeptorbindungsregion darstellt, funktionell dupliziert, wobei der IGF-1-Agonist oder -Antagonist eine geänderte Signalübermittlungskapazität für auf IGF-ansprechende Zellen verglichen mit IGF-1 aufweist.

Vorzugsweise nehmen die Lösungsmittel-zugänglichen Reste nicht an der Bildung der IGF-Grenzfläche teil.
Entsprechend bestimmten weiteren Aspekten umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Konstruieren einer Verbindung, wie ein Peptidomimetikum, die die dreidimensionale Oberflächenstruktur von IGF-1 nachahmt, das die Schritte umfasst:

a) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von IGF-1 aus dem beanspruchten Kristall und
b) Konstruieren einer Verbindung, die die dreidimensionale Struktur von IGF-1 nachahmt.

Nach einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Peptidomimetikums bereit, das IGF-1 bindet und das Binden von IGFBP blockiert, oder einen Rezeptor, der an IGF-1 bindet, umfassend die Schritte:

a) Suchen in einer Molekularstrukturdatenbank mit den Strukturparametern oder Strukturkoordinaten, die in Anhang 1 bereitgestellt sind und
b) Auswählen eines Moleküls aus der Datenbank, die die Strukturparameter oder Strukturkoordinaten von IGF-1 nachahmt.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Bestimmung mindestens eines Teils einer dreidimensionalen Struktur eines molekularen Komplexes bereit, wobei der Komplex IGF-1 umfasst und das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Bestimmen der Strukturkoordinaten des beanspruchten IGF-1-Kristalls;
b) Berechnen von Phasen aus den Strukturkoordinaten;
c) Berechnen der Elektronendichteabbildung aus den in Schritt b) erhaltenen Phasen, und
d) Bestimmen der Struktur mindestens eines Teils des Komplexes, basierend auf der Elektronendichteabbildung.

Vorzugsweise sind die in Schritt a) verwendeten Strukturkoordinaten im Wesentlichen die gleichen wie die in Anhang 1 beschriebenen oder beschreiben im Wesentlichen die gleichen Kristalle wie die Koordinaten in Anhang 1.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Beurteilung der Fähigkeit einer chemischen Entität bereit, mit IGF-1 oder einem Komplex davon zu assoziieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Anwenden von rechnerischen oder experimentellen Mitteln, um eine Anpassungsorperation zwischen der chemischen Entität und IGF-1, das die in Anhang 1 beschriebenen Strukturkoordinaten aufweist, oder eines Komplexes davon, durchzuführen, wodurch auf die Assozierung bezogene Daten erhalten werden, und
b) Analysieren der in Schritt a) erhaltenen Daten, um die Charakteristiken der Assoziierung zwischen der chemischen Entität und dem IGF-1 oder Komplex davon zu bestimmen.

Eine durch das vorstehende Verfahren bestimmte chemische Entität, die mit der in vivo oder in vitro Assoziation zwischen IGF-1 und seinem Rezeptor oder zwischen IGF-1 und mindestens einem von seinen Bindungsproteinen interferiert oder mit der Bindungsstelle an IGF-1 assoziiert ist auch beschrieben.
Ferner werden Schweratomderivate einer kristallisierten Form von IGF-1 bereitgestellt.
Auch beschrieben wird ein Verfahren zur rechnerischen oder experimentellen Bestimmung einer chemischen Entität, um Informationen über ihre Assoziierung mit einer oder mehreren Bindungsstellen von IGF-1 unter Verwendung eines IGF-1-Kristalls zu erhalten, der die in Anhang 1 beschriebenen Strukturkoordinaten aufweist.
Jedes Peptidanaloga und jede andere chemische Entität, die unter Verwendung der obigen Verfahren der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, sind für therapeutische Verfahren, die hier beschrieben werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen nützlich.
Ein Verfahren zum Identifizieren eines indirekten Agonisten von IGF-1 wird ins Auge gefasst, umfassend die Schritte:

a) Vergleichen der Fähigkeit von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin, das Binden von IGFBP-1 oder IGFBP-3 an IGF-1 zu inhibieren, mit der Fähigkeit eines Kandidaten eines indirekten Agonisten von IGF-1, um das Binden ebenso zu inhibieren, und
b) Bestimmen, ob der Kandidatenagonist ein solches Binden mindestens so gut wie N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin inhibiert.

Der Vergleich kann durch einen Kompetitionsassay zwischen N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin und dem Kandidatenagonisten durchgeführt werden. Zusätzlich wird die Inhibition der Bindung durch Vorinkubieren von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin oder dem Kandidatenagonisten mit IGF-1, das auf Bakteriophagenpartikeln expremiert wird, und Messen des restlichen Bindens von IGF-1 and IGFBP-1 oder IGFBP-3 in einem Platten-basierenden ELIS-Assay gemessen.
Ein Verfahren zum Identifizieren eines indirekten Agoisten von IGF-1 wird beschrieben, umfassen das Cokristallisieren eines indirekten Kandidatenagonisten von IGF-1 mit IGF-1, um eine Cokristalline Struktur zu bilden, und Bestimmen, ob der Kandidatenagonist an ein oder mehr Flecken („patches") von IGF-1 bindet, wobei ein Fleck die Aminosäurereste Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 und Leu 57 und der zweit Patch die Aminosäurereste Val 11, Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49 und Arg 55 aufweist und wobei das Binden auftritt, wenn es mindestens einen Kontakt zwischen jedem aufgeführten Aminosäurerest eines aufgeführten Flecken auftritt und der Kandidatenagonisten weniger als oder gleich 6 Ångstroms in der Kristallisationsstruktur beträgt. Der Kandidatenagonist kann das Binden von IGFBP-1 oder -3 an IGF mindestens so gut wie N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin inhibieren. Ein anderes Verfahren ist ein Verfahren, wo die Inhibierung des Bindens unter Verwendung eines Kompetitionsassays zwischen N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin und dem Kandidatenagonisten gemessen wird, oder das Verfahren, indem die Inhibierung des Bindens durch Vorinkubation von N,N-bis(3-D-Gluconamidoprpyl)-deoxycholamin oder dem Kandidatenagonisten mit IGF-1, das auf Bakteriophagenpartikeln exprimiert wird, und Messen der restlichen Bindung von IFG-1 an IGFBP-1 oder IGFBP-3 in einem Platten-basierten ELISA-Assay, gemessen wird.
Ferner wird hier ein Verfahren zur Behandlung einer IGF-1-Agonistenerkrankung in einem Säuger beschrieben, umfassend das Verabreichen einer effektiven Menge von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin an einen Säuger.
Weiterhin wird ein Co-Kristallinisationskomplex von IGF-1 und N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ordnet die Sequenzen von IGF-1 (SEQ ID Nr. 1), IGF-2 (SEQ ID Nr. 2) und Insulin (SEQ ID Nr. 3) an. Die A-, B- und C-Ketten des Insulins (und die dazu korrespondierenden Sequenzen von IGF-1 und IGF-2) sind in fettem, unterstrichenem bzw. kursivem Text dargestellt. Die drei aromatischen Reste sind durch Konturtext dargestellt. Von den mit einem (!) markierten Buchstaben wurde gezeigt, dass sie für das Binden an den IGF-Rezeptor wichtig sind. Von den mit einem „*" markierten Resten wurde gezeigt, dass sei für das Binden an IGFBP-1 und IGFBP-3 wichtig sind. Die Carboxyl-terminalen Reste, die die D-Region von IGF-1 und IGF-2 umfassen, sind in regulären Buchstabentypen veranschaulicht.
2 ist eine Banddarstellung von IGF-1, die die Hauptkettenfaltung zeigt. Im Ramachandran-Plot ist 97,7 % am meisten begünstigt und 2,3 % erlaubt.
3 ist eine Banddarstellung von sowohl IGF-1 (linke Struktur) und Insulin (rechte Struktur).
4 ist eine Banddarstellung von IGF-1, die das in der Reservoirlösung verwendete Detergenz (N,N-bis(3-D-Glucanamidopropyl)-deoxycholamin) zeigt, das in einer kleinen hydrophilen Spalte an der Base der B-Helix bindet. Das wird durch schwächer graue Strukturen als die der IGF-1-Strukturen dargestellt.
5 ist eine Banddarstellung von IGF-1 als Dimer, wobei das Detergenz in schwächerem Grau dargestellt ist.
6 ist eine Banddarstellung von IGF als Dimer, das zeigt, dass die für die Rezeptorbindung wichtigen Reste (die durch eine Ringstruktur in Mittelteil der Figur dargestellt sind) sich an der Dimergrenzfläche zusammenlagern. Das Detergenz ist in schwächerem Grau an den äußeren Teilen der Figur dargestellt.
7A und 7A sind Banddarstellungen von IGF-1, die, wie 4, zeigen, das das in der Reservoirlösung verwendete Detergenz (N,N-bis(3-D-Gluconamidopropoyl-) deoxycholamin), das in Stabform dargestellt ist, in eine kleine hydrophile Spalte an der Basis der B-Helix bindet. In 7A wird die Detergenzgruppe in die Spalte eingeführt, die durch die Reste Leu 5, Phe 16, Val 17, Leu 54 und Leu 57 eingefasst ist. Die verschiedenen Schattierungen an Grau sind in Übereinstimmung der Alanin-Scanning-Mutagenese-Ergebnisse von Dubaquie und Lowman, supra, wobei die Phe 16-, Val 17- und Leu 5-Regionen eine 5 bis 10 fache Reduktion, die Glu 3-Region eine 10 bis 100-fache Reduktion und die Pro 63- und Pro 63'-Region eine > 100-fache Reduktion in der Affinität von IGFBP-1 anzeigt. Der schwarze Teil ganz rechts entspricht dem Symmetrie-bezogenen IGF-1-Molekül, das das kristallographische Dimer bildet. Der Kreis nahe beim Leu 54 zeigt das C10-Atom des Detergenzmittels, das sich von einem anderen Detergenz (3-((3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propan-sulfonat oder CHAPS) durch eine Hydroxyl-Gruppe an dieser Position unterscheidet. 7B zeigt die Sicht von der gegenüberliegenden Oberfläche des Detergenz und veranschaulicht die Interaktion des Detergenzmoleküls mit einem Symmetrie-bezogenen IGF-1-Molekül. Wie in 7A entsprechen die verschiedenen Grauschattierungen die Alanin-Scanning-Mutagenese-Ergebnisse von Dubaquie und Lowman, supra, wobei die Gruppe nahe Gln 15 eine 5 bis 10-fache Reduktion anzeigen, die mittelgrauen Moleküle ganz links, die Leu 10-Regionmoleküle und die ganz rechte mittelgraue Region eine 10 bis 100-fache Reduktion und die schwarzen Regionen bei Phe 49 und Gly 7 ein > 100-fache Reduktion der Affinität von IGFBP-1 anzeigen. Die schwarzen Regionen rechts des Detergenzmoleküls entsprechen dem Symmetrie-bezogenen IGF-1-Molekül, das das kristallographische Dimer bildet. Der Kreis nahe Gln 15 zeigt das C10-Atom der Detergenzes, wie vorstehend für 7A angegeben. Diese Figur wurde unter Verwendung von INSIGHT (MSI, San Diego, CA) hergestellt.
8 zeigt einen Graphen, der von einer kompetetiven Detergenz/IGFBP-Bindungsstudie resultiert. In diesem Experiment wurde N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin als kompetetiver Inhibitor der IFG-1-Bindung an immobilisiertem IGFBP-1 (geschlossene Quadrate) oder IGFBP-3 (offene Kreise) verwendet. Als positive Kontrolle wurde lösliches IGFBP-1 als kompetetiver Inhibitor der IGF-1-Bindung an immobilisiertes IGFBP-1 (geschlossene Dreiecke) verwendet. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von zwei unabhängigen Experimenten dar.
9A zeigt eine nicht lineare Analyse der kleinsten Quadrate der Sedimentationsgleichgewichts für IGF-1 in Lösung. Die bei Rotorgeschwindigkeiten von 30 000 U/min (offenen Dreiecke) und 35 000 U/min offene Quadrate) wurden als ideales Monomer-Dimer-Selbstassoziierungsmodel angepasst. Die durchgehenden Linien sind die Einstellungen der Daten. 9B zeigt die Reste, die für beide Rotorgeschwingikeiten nach dem Zählen der Daten durch die Einstellungsprozedur aufgezeichnet wurden. Sie sind zufällig um Null verteilt, was zeigt, dass das Monomer-Dimer-Model richtig für diese Interaktion ist.
10A zeigt eine Banddarstellung, die durch NMR eines Komplexes aus IGF-1 und N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin) bestimmt wurde, und 10B zeigt eine Banddarstellung, die durch NMR eines Komplexes aus IGF-1 bestimmt wurde, das an ein von einem Phagen stammendes IGF-1-Antagonisten-Peptid gebunden ist, das als IGF-F1-1 bezeichnet wird.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
A. Definitionen
„IGF-1", wie er hier verwendet wird, bezeichnet den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1, soweit nichts anderes bezeichnet ist, und besitzt die humane native reife IGF-1-Sequenz ohne N-terminalem Methionin, wie beispielsweise in EP 230,869 , veröffentlicht am 5. August 1987, EP 128,733 , veröffentlicht am 19. Dezember 1984 oder EP 288,451 , veröffentlicht am 26. Oktober 1988 beschrieben.
Ein „IGFBP" oder ein „IGF-Bindungsprotein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das normalerweise assoziiert ist mit, gebunden oder komplexiert ist an IFG-1, ob es zirkuliert oder nicht (d.h. im Serum oder Gewebe). Diese Definition umfasst IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac 25 (IGFBP-7 und den Prostacyklinstimulierenden Faktor (PSF) oder das Endothelzellen-spezifische Molekül (ESM-1) sowie andere Proteine mit hoher Homologie zu IGFBPs. Mac 25 ist beispielesweise in Swisshelm et al., Proc. Natl., Acad., Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995) und Oh et al., J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (1996) beschrieben. PSF ist bei Yamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994 beschrieben. ESM-list bei Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996) beschrieben. Hinsichtlich der identifizierten IGFBPs vgl. z.B. EP 375,438 , veröffentlicht am 27. Juni 1990, EP 369,943 , veröffentlicht am 23 Mai 1990, US-Patent Nr. 5,258,287, WO 89/09268, veröffentlicht am 5. Oktober 1989, Wood et al. Molecular Endocrinology, 2: 404-411 (1988), Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988), EP 294,021 , veröffentlicht am 7. Dezember 1988, Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1987), Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987), Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986), baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988), WO 89/08667, veröffentlicht am 21. September 1989, WO 89/09792, veröffentlicht am 19. Oktober 1989 und Binker et al., EMBO J., 8: 2497-2502 (1989). IGFBP-1 und IGFBP-3 binden an verschiedene Reste von IGF-1.
„Humaner IGF-1-Rezeptor" oder nur „IGF-1-Rezeptor", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jeden Rezeptor für IGF-1, der in Menschen gefunden wird und umfasst die IGF-Rezeptoren vom Typ 1 und Typ 2 in Menschen, an die humanes IGF-1 bindet, wie z.B. IGF-1 aus der Plazenta etc.
Ein „indirekter Agonist von IGF-1" ist ein Molekül, das IGF-1 in situ aus IGFBP-3 oder IGFBP-1 freisetzt, so dass das freigesetzte IGF-1 aktiv ist und mit seinem Rezeptor interagiert.
„Peptide" sind Moleküle mit mindestens zwei Aminosäuren und umfassen Polypeptide mit mindestens etwa 60 Aminosäuren. Vorzugsweise besitzen die Peptide etwa 10 bis etwa 60 Aminosäuren, bevorzugter etwa 10 bis 25 und am bevorzugtesten etwa 12 bis 25 Aminosäuren. Die Definition umfasst lineare und zyklische Peptide, Peptidderivate, ihre Salze und optische Isomere.
„Säuger" zur Behandlung, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf jedes als Säuger klassifizierte Tier, einschließlich Menschen, Haus- und Hoftieren, Zoo-, Sport- oder Stubentier, wie Hunde, Pferde, Katzen, Schafe, Schweine, Kühe etc. Der hier bevorzugte Säuger ist der Mensch. Der Ausdruck „nicht erwachsen" bezieht sich auf Säuger, die ein perinatales Alter (wie Niedriggeburtsgewichtskinder) bis zum Alter der Pubertät haben, wobei Letztere die sind, die das volle Wachstumspotential noch nicht erreicht haben.
Der Ausdruck „Behandeln", wie er hier verwendet, wird bezieht sich auf eine therapeutische Behandlung und prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Die eine Behandlung benötigen umfassen diejenigen die bereits die Erkrankung haben sowie diejenigen, die anfällig für die Krankheit sind oder bei denen die Krankheit diagnostiziert wurde oder diejenigen, in denen die Krankheit verhindert werden soll.
Eine „Erkrankung" ist jeder Zustand, der von einer Behandlung mit IGF-1-Agonist („Agonistenerkrankugn) oder Antagonist („Antagonistenerkrankung) profitieren würde. Diese umfassen chronische und akute Erkrankungen oder Erkrankungen, die solche pathologische Erkrankungen umfassen, die den Säuger für die in Rede stehende Erkrankung prädispositioniert. Die Erkrankung, die behandelt werden soll, kann eine Kombination von zwei oder mehreren der nachstehend aufgeführten Agonisten- oder Antagonistenerkrankungen sein.
Nicht beschränkende Beispiele der Antagonistenerkrankungen umfassen gutartige und bösartige Tumore, Leukämien und lymphoide bösartige Erkrankungen, neuronale, gliale, astrocytale, hypothalmatische und andere glanduläre, makrophagische epitheliale, stromale und blastocoelische Erkrankungen und Entzündungen, angiogene und immunologische Erkrankungen, diabetische Komplikationen, wie diabetische Retinopathien, Alters-bezogene Makuladegeneration, opthalmische chirurgische Eingriffe, wie Kataraktextraktion, ein Koronatransplant, Glaukomfiltrationschirurgie und keratoplastische Chirurgie, um eine Refraktion zu korrigieren, d.h. Radialkeratotomie, auch in den Skleramakulalöchern und – degeneration, Retinatränen, Vitreoretinopathie gemischet Erkrankungen, Katarakterkrankungen der Cornea, wie die Sequelae der Radialkeratomie, trockenes Auge, virale Conjunktivitis, ulcerative Conjunctivitis, Wunden, wie korneal-epitheliale Wunden, Sjogren's Syndrom, Retinalerkrankungen, wie Makula- und Retinaödem, Gesichtsfeldbeschränkende Vernarbungen, Retinaischämie und proliferative Glaskörperretinopathie.
Bevorzugter umfassen solche Antagonistenerkrankungen diabetische Komplikationen, die durch IGF-1 verschlimmert werden, ischämische Verletzungen und Erkrankungen, die mit unerwünschter Zellproliferation assoziiert sind, wie Krebs, Retenose und Asthma. Wenn die Erkrankung eine durch IGF-1 verschlimmerte diabetische Komplikation ist, können solche Komplikationen diabetische Retinopathie oder diabetische Nephropathie umfassen. Die Effizienz der Behandlung kann durch eine Reduktion der klinischen Manifestationen oder Symptome nachgewiesen werden, einschließlich beispielsweise einer verbesserten renalen Clearance, einer verbesserten Sicht oder eine Reduktion der Menge an IGF-1, die zum Binden an IGF-1-Rezeptor zur Verfügung steht. Wenn die Erkrankung eine ischämische Verletzung ist, kann sie Schlaganfälle, myokardiale Ischämie und eine ischämische Verletzung der Niere umfassen.
Beispiele der Agonistenerkrankung zum Zweck hier umfassen jede Erkrankung, die von der Behandlung mit IGF-1 profitieren würde, einschließlich, aber nicht beschränkt auf z.B. Lungenerkrankungen, hyperglykämische Erkrankungen, wie sie nachfolgend dargestellt werden, renale Erkrankungen, wie akute oder chronische Niereninsuffizienz, chronisches Nierenversagen im Endstadium, Glomerulonephritis, insterstitiale Nephritis, pyelonephritis, Glomerulosclerosis, z.B. Kimmelstiel-Wilson bei Diabetispatienten und Nierenversagen nach Nierentransplantation, Fettsucht, GH-Insuffizienz, Turner's Syndrom, Larons's Syndrom, kleiner Wuchs, unerwünschte Symptome, die mit dem altern assoziiert sind, wie Fettsucht und erhöhte Fettmasse-Schlank-Verhältnisse („fat mass-to-lean ratios"), immunologische Erkrankungen, wie Immundefizienzen, einschließlich verminderte CD4-Zahl und verminderte Immuntoleranz oder Chemotherapie-induzierter Gewebeschädigung, Knochenmarkstransplantation, Erkrankungen oder Insuffizienzen der Herzstruktur oder – funktion, wie Herzdysfunktionen und kongestives Herzversagen, neuronale, neurologische oder neuromuskuläre Erkrankungen, z.B. periphere Neuropathie, multiple Sklerose, Muskeldystrophie oder myotone Dystrophie und katabole Zustände, die mit einer Schwächung assoziiert ist, die durch jeden Zustand verursacht wird, einschließlich z.B. Trauma oder Wunden oder Infektion wie mit einem Bakterium oder Humanvirus, wie HIV, wunden Hauterkrankungen, Eingeweidestrukturen und Funktion, die eine Wiederherstellung bedürfen und so weiter. Die bevorzugten Agonistenerkrankungen, die hier zur Behandlung ausgesucht werden, sind Diabetes, Adipositas, Herzfunktionsstörung, AIDS-bedingte Schwächung, Nierenerkrankungen, neurologische Erkrankungen, Gesamtkörperwachstumserkrankungen oder immunologische Erkrankungen.
Der Ausdruck „hyperglykämische Erkrankung", wie er hier verwendet wird, bezeichnet alle Formen von Diabetes und Erkrankungen, die aus einer Insulinresistent resultieren, wie Typ I und Typ II Diabetes, sowie ernste Insulinresistenz, Hyperinsulinämie und Hyperlipidämie, z.B. übergewichtige Personen, Insulin-resistente Diabetes, wie Mendenhall's Syndrom, Werner-Syndrom, Leprechaunismus, lipoatrophe Diabetes und andere Lipoatrophie. Die bevorzugte Hyperglykämische Erkrankung ist Diabetes, insbesondere Typ I und Typ II Diabetes. „Diabetes" selbst bezieht sich auf eine progressive Erkrankung des Kohlenhydratstoffwechsels, die eine ungeeignete Produktion oder Ausnützung von Insulin beteiligt und durch Hyperglykämie und Glycosuria gekennzeichnet ist.
„Biologisch aktives" IGF-1 bezeichnet IGF-1, dass eine biologische Eigenschaft zeigt, die üblicherweise mit einem IGF-1-Agonist oder -Antagonist assoziiert ist, wie z.B. eine Eigenschaft, die die Behandlung von einer oder mehren der obigen Krankheiten ermöglicht.
Der Ausdruck „wirksame Menge" bezeichnet eine Menge von IGF-1 oder einem Peptidomimetikum oder einer anderen Verbindung, einschließlich einer chemischen Entität, die wirksam zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung in einem Säuger ist. Im Fall von Krebs beispielsweise kann die effektive Menge die Anzahl der Krebszellen reduzieren, die Tumorgröße vermindern, die Krebszelleninfiltration in periphere Organe inhibieren (d.h. in gewissem Ausmaß verlangsamen und vorzugsweise stoppen), die Tumormetastatisierung verlangsamen (d.h. in gewissem Ausmaß verlangsamen und vorzugsweise stoppen), in gewissem Ausmaß das Tumorwachstum inhibieren, Apoptose fördern und/oder in gewissem Ausmaß ein oder mehrere der Symptome erleichtern, die mit der Erkrankung assoziiert sind.
Ein „Ausfällmittel" ist ein Mittel in einer Reservoirlösung, das IGF-1 präzipitiert, wenn es mit einer wässrigen IGF-1-Lösung gemischt wird und äquilibirieren lässt, um IGF-1-Kristalle zu bilden. Beispiele umfassen chaotrope Mittel, wie Ammoniumsulfat, Polyethylenglycole (mit einer großen Variablität der Molekulargewichte, die z.B. von etwa 2 000 bis 20 000 reicht), Natriumcitrat, Natriumcacodylat oder ein Gemisch davon.
Eine „Reservoirlösung" ist eine Lösung eines Ausfällmittels und irgendeinem anderen Bestandteil, der benötigt wird, um IGF-1-Kristalle zu ergeben, z.B. ein Detergenz, wie C₁₂E₉ (Nonaethylenglycol-monododecyl ether, Nonaethylenglycol-monolauryl-ether, Polyoxyethylen (9)-ether), C₁₂E₈ (Octaethylenglycol-monodecyl-ether, Octaethylenglycolmonolauryl-ether, Polyoxyethylen (8)-lauryl-ether), Dodecyl-beta-D-maltopyranosid, Laurinsäuresucroseester, Cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosid, Nonaethylenglycoloctylphenolether, Cetyltrimethylammoniumbromid, Decyl-beta-D-maltopyranosid, lauryldimethylaminoxid, Cyclohexyl-pentyl-beta-D-maltosid, n-Dodecylsulfobetain, 3-(Dodecyldimethylammonium)propan-1-sulfonat, Nonyl-beta-D-glycopyranosid, Octyl-beta-D-thiolucopyranosid, OSG, N,N-dimethyldecylamin-beta-oxid, Methyl-6-O-(N-heptylcarbomyl)-alpha-D-glycopyranosid, Sucrosemonocaprylat, Heptyl-beta-D- thioglucopyranosid, Octyl-beta-D-glucopyranosid, Cyclohexyl-propyl-beta-D-maltosid, Cyclohexylbutanoyl-N-hydroxyethylglucamid, n-Decylsulfobetain, 3-(Decyldimethylammonium)propan-1-sulfonat, Octanoyl-N-methylglucamid, Hexyl-beta-D-glucopyranosid und N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin. Vorzugsweise ist das Detergenz N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin.
„Umkristallisierung" bezeichnet das Verfahren, bei den, nachdem die anfänglichen Kristalle gewachsen sind und als nicht sehr groß oder nützlich bestimmt wurden, eine Substanz zu den Kristallen zugegeben wird, wie Methylpentandiol, das den Effekt hat, die Kristalle aufzulösen, aber nicht irgendetwas anderes in dem Kristallisationsgemisch sehr zu verdünnen. Dann wachsen über den Verlauf mehrere Tage, sowie die Kristallisationtropfen in ihrer Reservoirlösung wieder äquilibrieren, die Kristalle, diesmal aber viel größer und besser geordnet.
Der Ausdruck "assoziieren mit" bezieht sich auf einen Zustand der Nähe zwischen IGF-1 und einer chemischen Entität oder Teilen davon. Die Assoziierung kann kovalent oder nicht kovalent sein, wobei die Aneinanderlagerung durch Wasserstoff-Bindung, Van der Waals-Wechselwirkung oder elektrostatische Interaktionen energetisch bevorzugt ist, oder sie kann eine kovalente Assoziierung sein.
Der Ausdruck „Bindungsstelle" bezeichnet jede oder alle Stellen, an die eine chemische Entität mit IGF-1 bindet oder assoziiert.
Der Ausdruck „Strukturkoordinaten" bezeichnet die Koordinaten, die von mathematischen Gleichungen stammen, die sich auf die Muster beziehen, die durch Diffraktion eines monochromatischen Strahls von Röntgenstrahlen durch die Atome (Streuzentren) eines Moleküls in einer Kristallform erhalten werden. Die Beugungsdaten können verwendet werden, um eine Elektronendichteabbildung („elektron density map") der wiederholenden Einheiten des Kristalls zu berechnen. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird verstehen, dass die erhaltenen Daten von dem besonderen verwendeten System abhängen und somit können verschiedene Koordinaten in der Wirklichkeit den gleichen Kristall beschreiben, wenn solche Koordinaten im wesentlichen die gleiche Beziehung wie die hier beschriebene definieren. Eine Elektronendichteabbildung kann verwendet werden, um die Positionen der einzelnen Atome in der Einheitszelle des Kristalls zu untersuchen.
Der Fachmann auf diesem Gebiet versteht, dass es einen Satz von Strukturkoordinaten, der durch Röntgenstrahlkristallographie bestimmt wurde, nicht ohne Standardabweichung gibt. Anhang 1 zeigt die Atomkoordinaten von IGF-1. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung soll jedes Set von Strukturkoordinaten von IGF-1, das eine mittlere quadratische Abweichung der äquivalenten Proteinhauptkettenatome von weniger als etwa 2 Å aufweist, wenn es – unter Verwendung der Hauptkettenatome – mit den Strukturkoordinaten von Anhang 1 überlagert wird, als identisch angesehen werden. Vorzugsweise beträgt die Abweichung weniger als etwa 1 Å und am bevorzugtesten weniger als etwa 0,5 Å.
Der Ausdruck „Schweratomderivatisierung" bezieht sich auf ein Verfahren zu Herstellung einer chemisch modifizierten Form eines kristallinen IGF-1. In der Praxis wird ein Kristall mit einer Lösung getränkt, die ein Schwermetallatomsalz oder eine Metallorganische Verbindung, z.B. Bleichlorid, Goldthiomalat, Thimerosal oder Uranylacetat, enthält, das durch den Kristall diffundieren und an die Oberfläche des Proteins binden kann. Die Lokalisation des/der gebundenen Schwermetallatom/e kann durch Röntgendiffraktionsanalyse des getränkten Kristalls bestimmt werden. Die Information kann verwendet werden, um Phaseninformationen zu erzeugen, die verwendet werden, die dreidimensionale Struktur des Moleküls zu generieren.
Der Ausdruck „Einheitszelle" bezeichnet einen geformten Grundblock. Das gesamte Volumen des Kristalls kann durch einen gleichmäßigen Zusammenbau von solchen Blöcken konstruiert werden. Jede Einheitszelle umfasst die vollständige Repräsentation der Einheit des Musters, wobei dessen Wiederholung den Kristall aufbaut.
Der Ausdruck „Raumgruppe" bezeichnet eine Anordnung der Symmetrieelemente des Kristalls.
Der Ausdruck „molekularer Austausch" bezeichnet ein Verfahren, das das Erzeugen eines vorläufigen Strukturmodels eines Kristalls involviert, dessen Strukturkoordinaten unbekannt sind, in dem ein Molekül, dessen Strukturkoordinaten bekannt sind, z.B. die IGF-1-Koordinaten in Anhang 1, innerhalb der Einheitszelle des unbekannten Kristalls orientiert und positioniert werden, um so am besten den beobachteten Diffraktionsmustern des unbekannten Kristalls Rechnung zu tragen. Phasen können dann von diesem Modell berechnet und mit den beobachteten Amplituden kombiniert werden, um eine angenäherte Fourier-Synthese der Struktur zu ergeben, deren Koordinaten unbekannt sind. Das wiederum kann Gegenstand jeder der mehreren Formen der Verfeinerung sein, um eine endgültige genaue Struktur des unbekannten Kristalls zu ergeben (siehe z.B. Lattman, E., „Use of the Rotation and Translation Function", Methods in Enzymology, 115: 55-77 (1985); Rossman, Hrsg., „The Molecular Replacement Method, „Int. Sci. Rev. Ser. Nr. 13 (Gordon and Breach: New York, 1972)). Unter Verwendung der Strukturkoordinaten von IGF-1, die durch diese Erfindung bereitgestellt werden, kann der molekulare Austausch verwendet werden, um die Strukturkoordinaten eines kristallinen Co-Komplexes, unbekannter Liganden, Mutanten oder Homologe oder einer verschiedenen kristallinen Form von IGF-1 zu bestimmen. Zusätzlich können die beanspruchten Kristalle und ihre Koordinaten verwendet werden, um die Strukturkoordinaten einer chemischen Entität zu bestimmen, die mit IGF-1 assoziiert ist.
Der Ausdruck „chemische Entität" oder „Verbindung", wie er hier verwendet wird, bedeutet jedes Molekül, jeden molekularen Komplex, jede Verbindung, jedes Peptidomimetikum oder Fragment davon, das nicht IGF-1 ist. Vorzugsweise ist es ein Molekül mit hoher oraler Bioverfügbarkeit, wie ein organisches chemisches Molekül oder ein Peptid.
B. Arten der Durchführung der Erfindug
Die folgende genaue Beschreibung der Erfindung umfasst die Kristallstruktur von IGF-1, Verfahren zur Herstellung der IGF-1-Kristalle und Verfahren zur Verwendung eines IGF-1-Kristalls und seine Strukturkoordinaten.
a. Kristallstruktur von IGF-1
Die beanspruchte Erfindung stellt IGF-1-Kristalle sowie die Struktur von IGF-1 bereit, die davon bestimmt wird. Im speziellen stellt die beanspruchte Erfindung Kristalle von IGF-1 bereit, die in etwa die folgenden Dimensionen aufweisen: a = 31,831 Å, b = 71,055 Å, c = 65,995 Å, α = β = γ = 90,000°. Es hat eine Symmetrie- oder Raumgruppe von C222₁. Die Bandstruktur davon ist in 2 gezeigt, sie hat drei Helices, wobei die N-terminale B-Region den Resten 3-28, die C-Region den Resten 29-34, eine Streckung von schwach geordneten Resten den Resten 35-40 und die A-Region den Resten 42-62 entspricht. Die D-Region (Reste 63-70) ist im wesentliche ungeordnet. Die 4 und 7 zeigen, dass das zur Kristallisation verwendete Detergenz in eine kleine hydrophobe Spalte an der Basis der B- Helixstruktur bindet. Das IGF-1 kann ein Dimer im Kristall bilden, wie in 5 dargestellt, wobei die zwei Schwänze an der Dimergrenzfläche positioniert sind. Die verborgene Oberflächenfläche beträgt 689 Å²/Monomer, was insgesamt 1 378 Å² ausmacht. Die für die IGF-1R-Bindung wichtigen Reste lagern sich an der Dimergrenzfläche zusammen, wie in 6 gezeigt.
Die Charakteristiken der beanspruchten IGF-1-Kristalle werden in den Beispielen hier weitern beschrieben, und die Strukturkoordinaten davon sind in Anhang 1 bereitgestellt.
b. Verfahren zur Herstellung von IGF-1-Kristallen
In verschiedenen Ausführungsformen betrifft die beanspruchte Erfindung Verfahren zur Herstellung kristalliner Formen von IGF-1, in dem zuerst eine wässrige Lösung, die IGF-1 umfasst, bereitgestellt wird. Eine Reservoirlösung, das ein Ausfällmittel enthält, wird dann mit einem Volumen der IGF-1-Lösung gemischt, und das resultierende gemischte Volumen wird dann kristallisiert. In einem bevorzugten Schritt werden die Kristalle wieder aufgelöst und rekristallisiert. Ein Beispiel eines Reagenzes, das für die Rekristallisation verwendet werden kann, ist Methylpentandiol, das bevorzugt ist. Die Kristalle werden typischerweise in diesem Reagenz in einer kleinen Menge aufgelöst, um den Verdünnungseffekt der anderen Reagenzien zu minimieren, und für das Wiederwachsen für eine Zeitspanne stehen gelassen. In einem optionalen Schritt, wird das kristalline IGF-1 aus dem gemischten Volumen isoliert. Vorzugsweise wird das IGF-1 aus prokaryontischen Zellen, bevorzugter Bakterienzellen und am bevorzugtesten E.coli gewonnen. Vorzugsweise wird es in das Periplasma sekretiert und, wie in dem US-Patent Nr. 5,723,310 beschrieben, hergestellt.
Die Konzentration von IGF-1 in der wässrigen Lösung kann variieren, aber sie beträgt vorzugsweise etwa 1 bis 50 mg/ml, und bevorzugter 5 bis 15 mg/ml. In ähnlicherweise können die Ausfällmittel in der Erfindung variieren und können unter jedem auf diesem Gebiet bekanntem Ausfällmittel ausgewählt werden. Vorzugsweise ist das Ausfällmittel aus der Gruppe bestehend aus Natriumcitrat, Ammoniumsulfat, Polyethylenglycol, Natriumcacodylat oder einem Gemisch davon ausgewählt. Bevorzugter ist das Ausfällmittel Polyethylenglycol, das mit Natriumcitrat oder Natriumcacodylat gepuffert ist. Jede Konzentration des Ausfällmittels kann in der Reservoirlösung verwendet werden, allerdings ist es bevorzugt, dass die Konzentration etwa 20 bis 25 % bei Polyethylenglycol und etwa 1 bis 10 M bei Natriumcitrat, Ammoniumsulfat oder Natriumcacodylat beträgt. Vorzugsweise umfasst die Reservoirlösung weiterhin ein Detergenz. Vorzugsweise liegt das Detergenz in einer Menge von 10 bis 50 mM vor. Ebenso bevorzugt ist das Detergenz N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin. Der pH der Reservoirlösung kann auch variiert werden, vorzugsweise zwischen etwa 4 und etwa 10, am bevorzugtesten etwa 6,5.
Ein Fachmann wird verstehen, dass jeder dieser Parameter ohne übermäßige Experimente variiert werden kann, und immer noch akzeptable Kristalle erhalten werden. In der Praxis kann, wenn einmal die geeigneten Ausfällmittel, Puffer oder andere experimentelle Variablen für ein gegebenes Wachstumsverfahren bestimmt sind, jedes dieser Verfahren oder jedes andere Verfahren verwendet werden, um die beanspruchten Kristalle wachsen zu lassen. Ein Fachmann kann die Variablen bestimmen, abhängig von den besonderen Bedürfnissen von Jemanden.
Verschiedene Kristallisationsverfahren können in der beanspruchten Erfindung verwendet werden, einschließlich Dampfdiffusion, diskontinuierlicher Kristallisation, Flüssigkeitsbrückenkristallisation oder Dialysekristallisation. Die Dampfdiffusionskristallisation ist bevorzugt, vgl. z.B. McPherson et al., Preparation and Analysis of Protein Crystals, Glick, Hrsg. (John Wiley & Co., 1982), Seiten 82-159; Jancarik et al., J. Appl. Crystallgr., 24: 409-411 (1991).
Bei der Dampfdiffusionskristallisation wird ein kleines Volumen (d.h. einige wenige Milliliter) der Proteinlösung mit einer Lösung gemischt, die das Ausfällmittel enthält. Dieses gemischte Volumen wird über einer Vertiefung suspendiert, die eine kleine Menge, d.h. etwa 1 ml, Ausfällmittel enthält. Dampfdiffusion aus dem Tropfen in die Vertiefung ergibt eine Kristallbildung in dem Tropfen.
Das Dialyseverfahren der Kristallisation benützt eine semipermeable Größenausschluss-Membran, die das Protein zurück hält aber es kleinen Molekülen (d.h. Puffer und Ausfällmittel) erlaubt, hinein und hinaus zu diffundieren. Bei der Dialyse lässt man das Ausfällmittel, eher als beim Konzentrieren des Proteins und des Ausfällmittel durch Verdampfen, langsam durch die Membran diffundieren und die Löslichkeit des Proteins vermindern, während die Proteinkonzentration fix gehalten wird.
Das diskontinuierliche Verfahren umfasst im Allgemeinen die langsame Zugabe eines Ausfällmittels zu einer wässrigen Lösung eines Proteins bis die Lösung gerade trüb wird; an diesem Punkt kann der Behälter verschlossen werden und man lässt ihn für eine Zeitspanne ungestört, bis Kristallisation auftritt.
Somit beabsichtigt der Anmelder, dass die beanspruchte Erfindung jede und alle Kristallisationsverfahren umfasst. Ein Fachmann kann unter jedem dieser Verfahren auswählen und die Parameter variieren, so dass das gewählte Verfahren die gewünschten Kristalle ergibt.
Das am meisten bevorzugte Kristallisationsverfahren umfasst die Verfahren, bei denen das IGF-1, nach der Isolation aus der Zelle und der Formulierung, z.B. in Acetat-, Citrat oder Succinat-Puffer, wie z.B. in dem US-Patent Nr. 5,681,814 oder der WO 99/51272 beschrieben, optional entsalzt wird, wenn nötig, auf einen pH von 4 bis 5, vorzugsweise etwa 4,5, um eine wässrige Lösung zu bilden. Dann wird ein Tropfen der wässrigen Lösung mit etwa 24 % Polyethylenglycol, das mit entweder 0,1 M Natriumcitrat oder etwa 0,1 M Natriumcacodylat auf etwa pH 6,5 gepuffert ist, und mit etwa 1 μl etwa 1,4 mM N,N-,bis(3-D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin als Detergenz gemischt. Diese Lösung wird dann durch Dampfdiffusionskristallisation mit etwa 1 ml etwa 24 % Polyethylenglycol, das auf etwa pH 6,5 mit entweder 0,1 M Natriumcitrat oder etwa 0,1 m Natriumcacodylat gepuffert ist, äquilibriert, bis Kristallisationstropfen gebildet werden, üblicherweise in etwa 4 bis 5 Tagen. Dann werden etwa 2 μl etwa 100 % Methylpentandiol zu den Kristallisationstropfen zugegeben, um die Kristalle über Nacht aufzulösen und dabei neue Kristalle zu bilden, üblicherweise innerhalb einer Zeit von einer Woche.
Die Kristallstruktur wurde mittels einer kombinierten anomalen Streuung von einem intrinsischen Schwefelion und einem zufälligen Bromidion bestimmt, wie es in den Beispielen nachfolgend detailliert diskutiert wird.
c. Verfahren zur Verwendung von IGF-1-Kristallen und seine Koordinaten
Das kristalline IGF-1 kann hier für verschiedene Zwecke verwendet werden. Beispielsweise reinigt der Kristallisationsprozess das IGF-1 selbst weiter bis zur Homogenität. Somit ist ein solcher Zweck, ein hoch gereinigtes IGF-1 bereitzustellen, das als Standard oder Kontrolle bei Diagnoseeinstellungen verwendet werden kann, z.B. als Molekulargewichtsmarker oder als ELISA-, Radioassay- oder Radiorezeptorassay-Kontrolle. Weiterhin ist kristallines IGF-1 bei Raumtemperatur stabil, kann leicht lyophilisiert werden und neigt weniger zum Abbau als weniger reine Zusammensetzungen.
Bei einer anderen Verwendung der Erfindung hier erlauben IGF-1-Kristalle von einer Größe und Qualität, die die Durchführung von Röntenbeugungsuntersuchungen ermöglicht, dem Fachmann Studien durchzuführen, die auf die Bindungseigenschaften von IGF-1 sowie die Bindungseigenschaften von IGFBPs, IGF-1-Rezeptoren und ALS, die mit IGF-1 assoziieren bezogen sind.
Weiterhin können Strukturinformationen, die von einer Peptidkristallstruktur abgeleitet sind, zur Identifizierung chemischer Entitäten, beispielsweise kleine organische oder bioorganische Moleküle, wie Peptidomimetika und synthetische organische Moleküle, die IGF-1 binden und vorzugsweise einen IGF-1-vermittelten oder -asszoziierten Prozess oder Ereignis blockieren oder verhindern, oder die als IGF-1-Agonisten wirken, verwendet werden. Ein beispielhafter Zugang an ein solches Struktur-basierende Verbindungsdesign ist in „Struktur Based Drug Design", Pandi Veerapandian Hrsg. (Marcell Dekker: New York 1997) beschrieben.
Beispielsweise konstruiert der Fachmann, wenn er die dreidimensionale Struktur von IGF-1 bestimmt hat, ein IGF-1-Modell, wie die in den 2 und 5 veranschaulichten. Da jedes Atom eines Peptides oder Polypeptides als Kugel des geeigneten Van der Waals-Radius veranschaulicht werden kann, kann eine genaue Oberflächendarstellung des gefalteten IGF-1 konstruiert werden. Die Oberfläche, die resultiert, ist als die Van der Waals-Oberfläche bekannt. Die „Lösungsmittel-zugängliche Oberfläche" ist die Oberfläche, die für eine chemische Sonde, ein Wassermolekül hier, zugänglich ist, und wird durch rundbiegen eines Wassermoleküls von geeigneter Größe auf die Außenseite des Peptides konstruiert, das den Kontakt mit der Van der Waals-Oberfläche aufrecht erhält. Die Teile der Van der Waals-Oberfläche, die in Kontakt mit der Wasseroberfläche steht, definiert eine kontinuierliche Oberfläche, die als „Lösungsmittel-zugängliche Oberfläche" bekannt ist (Creighton, Thoma E., Protein: sturctur and molecular properties, 2. Auflage (W. H. Freeman und Company, 1984), Seiten 227-229).
Solche chemischen Entitäten, die eine Lösungsmittel-zugängliche Oberfläche darstellen, die die Lösungsmittel-zugängliche Oberfläche von IGF-1 nachahmt, kann vom Fachmann konstruiert werden. Beispielsweise kann der Fachmann dreidimensionale Struktrudatenbanken von Verbindungen durchsuchen, um die Verbindungen zu identifizieren, die geeignete funktionelle Gruppen in einer ähnlichen dreidimensionalen Strukturanordnung positionieren, dann kann er eine kombinatorische chemische Bibliothek um diese chemischen Identitäten aufbauen, um die mit einer hohen Affinität zu identifizieren.
Ein Zugang, der durch die Erfindung ermöglicht wird, ist die Verwendung von Strukturkoordinaten von IGF-1, um chemische Entitäten zu konstruieren, die an IGF-1 binden oder damit assoziieren und die physikalische Eigenschaften der chemischen Entitäten auf verschiedene Weise ändern. Somit können Eigenschaften wie beispielsweise Löslichkeit, Affinität, Spezifität, Potenz, on/off-Raten („on/off rates") oder andere Bindungscharakteristiken alle geändert und/oder maximiert werden.
Man kann erwünschte chemische Entitäten durch Untersuchen eines IGF-1-Kristalls mit eine Bibliothek von verschiedenen Entitäten konstruieren, um die optimale Größe für die Wechselwirkung zwischen chemische Entitäten als Kandidaten und IGF-1 zu bestimmen. Beispielsweise erlauben hoch aufgelöste Röntegenbeugungsdaten, die von Kristallen gesammelt sind, die mit einem Lösungsmittel gesättigt sind, die Bestimmung, wo jeder Typ von Lösungsmitttelmolekül anhaftet. Kleine Moleküle, die eng an diese Stellen binden, können dann konstruiert und synthetisiert und hinsichtlich der gewünschten Aktivität getestet werden. Wenn einmal die gewünschte Aktivität erhalten wurde, können die Moleküle weiter geändert werden, um die erwünschten Eigenschaften zu maximieren.
Die Erfindung fasst auch das Screenen einer Datenbank mit kleinen Molekülen mit einem Computer oder das Konstruieren chemischer Entitäten, die insgesamt oder teilweise anIGF-1 binden können. Sie können auch verwendet werden, die Kristallstruktur von Mutanten, Co-Komplexen oder der kristallinen Form von irgendeinem anderen Molekül zu lösen, das homolog ist zu oder fähig ist zu assoziieren mit mindestens einem Teil von IGF-1.
Ein Verfahren, dass für diesen Zweck eingesetzt werden kann, ist der Molekülaustausch. Eine unbekannte Kristallstruktur, die jede unbekannte Struktur haben kann, wie z.B. eine andere Kristallform von IGF-1, eine IGF-1-Mutante oder -Peptid oder ein Co-Komplex mit IGF-1 oder jedes andere unbekannte Kristall einer chemischen Entität, die mit IGF-1 assoziiert, die von Interesse sind, kann unter Verwendung der Strukturkoordinaten, die in Anhang 1 dargestellt sind, bestimmt werden. Co-Komplexe mit IGF-1 können umfassen, wobei sie aber darauf nicht beschränkt sind, IGF-1-IGFBP-3, IGF-1-IGFBP-3-ALS, IGF-1-Rezeptor, IGF-1-Peptid oder ein kleines IGF-1-Molekül. Dieses Verfahren wird eine genaue Strukturform des unbekannten Kristalls viel schneller und effizienter ergeben, als zu versuchen, diese Informationen ohne die Erfindung hier zu bestimmen.
Die erhaltene Information kann somit verwendet werden, um maximal wirksame Inhibitoren oder Agonisten von IGF-1 zu erhalten. Das Design der chemischen Entitäten, die IGF-1 inhibieren oder agonisieren, beinhaltet die Betrachtung von mindestens zwei Faktoren. Erstens soll die chemische Entität fähig sein, physikalisch oder strukturell mit IGF-1 zu assoziieren. Die Assoziation kann jede physikalische, strukturelle oder chemische Assoziation sein, wie z.B. kovalent oder nicht kovalent Bindung, oder Van der Waals-, hydrophobe oder elektrostatische Interaktionen.
Zweitens soll die chemische Entität fähig sein, die Konformation anzunehmen, die ihr erlaubt, mit IGF-1 zu assoziieren. Obwohl nicht alle Teile der chemischen Entität notwendigerweise bei der Assoziierung mit IGF-1 Teil haben, können die nicht teilhabenden Teile noch die Gesamtkonformation des Moleküls beeinflussen. Das kann wiederum einen signifikanten Einfluss auf die Erwünschtheit der chemischen Entität haben. Solche konformatorischen Erfordernisse umfassen die gesamte dreidimensionale Struktur und Orientierung der chemischen Entität in Bezug auf alle oder einen Teil der Bindungsstelle.
Der potentielle inhibitorische oder Bindungseffekt einer chemischen Entität an IGF-1 kann vor ihrer tatsächlichen Synthese analysiert und unter Verwendung einer Computermodellierungstechnik getestet werden. Wenn die theoretische Struktur einer gegebenen chemischen Entität eine ungenügende Interaktion und Assoziation zwischen ihr und IGF-1, erübrigt sich die Notwendigkeit der Synthese oder des Testens der chemischen Entität. Wenn jedoch das Computermodellieren eine starke Wechselwirkung anzeigt, kann das Molekül synthetisiert und hinsichtlich seiner Fähigkeit, an IGF-1 zu binden, getestet werden. Somit kann die teurere und zeitaufwändige Synthese von unwirksamen Verbindungen vermieden werden.
Eine inhibitorische oder eine andere bindende Verbindung kann rechnerisch beurteilt werden und mittels einer Serie von Schritten konstruiert werden, in denen die chemische Entität oder Fragmente davon gescreent und hinsichtlich ihrer Fähigkeit ausgewählt werden, mit den individuellen Bindungsstellen von IGF-1 zu assoziieren.
Somit kann ein Fachmann eines von verschiedenen Verfahren verwenden, um die chemische Entität oder Fragmente davon hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu screenen, mit IGF-1 zu assoziieren. Dieser Prozess kann mit einer visuellen Inspektion von z.B. der Bindungsstelle auf einem Computerbildschirm beginnen, basierend auf den IGF-1-Koordinaten in Anhang 1. Ausgewählte Fragmente oder chemische Entitäten können dann in einer Vielzahl von Orientierungen positioniert oder in einer individuellen Tasche von IGF-1 angedockt werden. Das Andocken kann unter Verwendung einer Software, wie Quanta und Sybyl, erfolgen, gefolgt von einer Energieminimierung und Moleküldynamik mit Standardmolekülmechanikkraftfeldern („standard molecular mechanics force fields"), wie CHARMM und AMBER.
Spezialisierte Computerprogramme können für das Auswählen von interessierenden Fragmenten oder chemischen Entitäten nützlich sein. Diese Programme umfassen z.B. GRID, das von der Oxford University, Oxford, UK erhältlich sind, MCSS oder CATALYST, die von Molecular Simulations, Burlington, MA erhältlich ist, AUTODOCK, das vom Scripps Research Institut, La Jolla, CA erhältlich ist, DOCK, das von der University of California, San Francisco, CA erhältlich ist, und XSITE, das vom University College of London erhältlich ist.
Wenn einmal geeignete chemische Entitäten oder Fragmente ausgewählt wurden, können sie zu einem Inhibitor oder Agonisten zusammengebaut werden. Das Zusammenbauen kann durch visuelle Inspektion der Beziehung der Fragmente zu jedem anderen dreidimensionalen Bild, das auf einem Computerbildschirm gezeigt ist, in Relation zu den hier offenbarten Strukturkoordinaten erfolgen.
Alternativ kann man die gewünschte chemische Entität de novo experimentell unter Verwendung entweder einer leeren Bindungsstelle oder optional einschließlich eines Teils eines Molekül mit der gewünschten Aktivität konstruieren. Somit kann man z.B. die Festphasen-Screening-Technik verwenden, wo entweder IGF-1 oder ein Fragment davon oder eine chemische Kandidatenentität, die beurteilt werden soll, an eine Festphase gebunden werden, wodurch potentielle Binder für weitere Untersuchungen identifiziert werden.
Grundsätzlich kann jede molekulare Modellierungstechnik in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden; diese Techniken sind bekannt oder für den Fachmann leicht verfügbar. Es soll verstanden werden, dass die hier beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, um nicht nur Entitäten, die an IGF-1 assoziieren oder binden, zu identifizieren, zu konstruieren oder zu charakterisieren, sondern alternativ Entitäten, die ähnlich wie IGF-1 an den Rezeptor binden, wodurch die IGF-1-Rezeptor-Interaktion gestört wird, identifiziert, konstruiert oder charakterisiert werden. Die beanspruchte Erfindung ist dazu gedacht, diese Verfahren und Zusammensetzungen breit zu erfassen.
Wenn einmal eine Verbindung durch die obigen Verfahren konstruiert oder ausgewählt wurde, kann die Effizienz, mit der die Verbindung an IGF-1 binden, kann hinsichtlich der maximalen gewünschten Charakteristiken unter Verwendung rechnerischer oder experimenteller Beurteilung getestet und modifiziert werden. Verschiedene Parameter können maximiert werden, abhängig vom gewünschten Ergebnis. Diese umfassen, wobei sie nicht darauf beschränkt sind, die Spezifität, Affinität, die on/off-Raten, Hydrophobizität, Löslichkeit und andere Charakteristiken, die vom Fachmann leicht identifiziert werden können.
Zusätzlich ist die Erfindung zur Herstellung von nieder molekularen Wirkstoffkandidaten nützlich. Somit können die beanspruchten Kristallstrukturen auch verwendet werden, um Informationen über die Kristallstrukturen von Komplexen von IGF-1 und nieder molekularen Inhibitoren zu erhalten. Beispielsweise kann, wenn der nieder molekulare Inhibitor mit IGF-1 co-kristalllisiert wird, die Kristallstruktur des Komplexes durch einen molekularen Austausch unter Verwendung der bekannten Koordinaten von IGF-1 für die Berechnung der Phasen gelöst werden. Solche Informationen sind beispielsweise zur Bestimmung der Natur der Interaktion zwischen IGF-1 und dem nieder molekularen Inhibitor nützlich, und sie könne somit Modifikationen nahe legen, die die Bindungscharakteristiken, wie Affinität, Spezifität und Kinetiken, verbessern.
d. Andere Verfahren
Die Erfindung hier ist auch nützlich, ein Verfahren zum Identifizieren eines indirekten Agonisten von IGF-1, basierend auf den inhibitorischen Eigenschaften von N,N-bis(3-D- Gluconamidopropyl)-deoxycholamin im Hinblick auf IGFBPs bereitzustellen. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: Vergleichen der Fähigkeit von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin, das Binden von IGFBP-1 oder -3 an IGF-1 zu inhibieren, mit der Fähigkeit eines indirekten Kandidaten-IGF-1-Agonisten, ein solches Binden zu inhibieren, und Bestimmen, ob der indirekte Kandidaten-IGF-1-Agonist eine solche Bindung mitdestens so gut wie N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin die Bindung inhibieren kann.
Vorzugsweise wird der Vergleich durch einen Kompetitionsassay zwischen N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin und dem indirekten Kandidaten-IGF-1-Agonisten unter Verwendung von IC₅₀ durchgeführt, um die Fähigkeit zu messen, das IGFBP-Binden zu inhibieren. In einer bevorzugteren Ausführungsform wird die Bindungsinhibierung gemessen durch das Pre-Inkubieren von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin oder des Kandidatenagonistenmoleküls mit IGF-1, das auf Bakteriophagenpartikeln exprimiert wird, und Messen der verbleibenden Bindung von IGF-1 an IGFBP-1 oder IGFBP-1 in einem Platten-basierenden Assay, wie einem ELISA.
Ein Verfahren zum Identifizieren eines indirekten Agonisten von IGF-1 wird beschrieben, das die Co-Kristallisation des Kandidatenagonisten mit IGF-1 umfasst, um eine co-kristalline Struktur zu bilden und zu bestimmen, wenn das Kandidatenagonistenmolekül an eine oder beide von zwei Flecken von IGF-1 bindet. Der erste Flecken enthält die Aminosäurereste Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 und Leu 57, und der zweite Fleck enthält die Aminosäurereste Val 11, Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49 und Arg 55. Für den Zweck hier bedeutet Binden, dass mindestens ein Kontakt zwischen jeder der aufgeführten Aminosäureresten eines gegebenen Fleckens und dem Kandidatenagonistenmolekül, das weniger als oder gleich 6 Ångstoms in der co-kristallinen Struktur. Ein solches Kandidatenagonistenmolekül wird die Eigenschaften besitzen, das Binden von IGFBP-1 oder IGFBP-3 an IGF-1 zu inhibieren. Das bevorzugteste Kandidatenagonistenmolekül wird das Binden von IGFBP-1 oder -3 an IGF-1 mindestens so gut wie N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin inhibieren. Bevorzugter ist das Verfahren, in dem die Inhibierung der Bindung unter Verwendung eines Kompetitionsassays zwischen N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin und dem Kandidatenagonistenmolekül gemessen wird. Am bevorzugtesten ist das Verfahren, in dem die Inhibierung der Bindung durch Pre-Inkubation von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl) deoxycholamin oder dem Kandidatenagonistenmolekül mit IGF-1 gemessen wird, das auf Bakterienphagenmolekülen exprimiert ist, und Messen der verbleibenden Bindung von IGF-1 an IGFBP-1 oder IGFBP-3 in einem Platten-basierten ELISA-Assay.
Das N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin-Detergenz hier kann als Matrize verwendet werden, um die Konstruktion eines niedrig molekularen Wirkstoffs durch zu führen, der den gleichen Effekt wie das Detergenz hervorbringt (Konkurrenz mit IGF-1 um die IGFBP-Bindung und nachfolgende Störung der Interaktion von IGFBP mit IGF-1, um IGF-1 in situ frei zu setzen, so dass es aktiv ist und mit dem Rezeptor interagieren wird). Im Gegensatz zu anderen in den nachfolgenden Beispielen getesteten Detergenzien fehlt N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin ein Sauerstoffatom an der Position C10. Diese Region des Detergenz ist in nahem Kontakt mit den Seitenkettenatomen der Reste Leu 5, Leu 54 und Leu 57 von IGF-1. Moleküle mit der gleichen Art von Konformation würden als indirekte IGF-1-Agonisten wirken.
Der so identifizierte indirekte Agonist kann in einem Verfahren zur Behandlung einer Agonistenerkrankung verwendet werden, wobei eine wirksame Menge des indirekten Agonisten von IGF-1 einem Säuger verabreicht wird, der eine solche Erkrankung aufweist. Somit kann ein solcher Agonist therapeutisch in einer pharmazeutischen Präparation verwendet werden, z.B. in klinischen Versuchen oder kommerzialisiert für die hier definierten Agonistenerkrankungen. Somit kann die Formulierung des Agonisten verwendet werden, um jede Erkrankung zu Behandeln, die von der Behandlung mit IGF-1 profitiert, einschließlich z.B. Diabetes, chronische oder akute Nierenerkrankung, wie chronische Niereninsuffizienz, Nekrose etc. Adipositas, Hyperinsulinämie, GH-Insuffizienz, Turner's Syndrom, Kleinwüchsigkeit, unerwünschte mit dem Altern verbundene Symptome, wie ein erhöhtes Schlankmasse-zu-Fett-Verhältnis („lean-mass-to-fat-ratio"), Immundefizienzen, einschließlich erhöhte CD4-Zahl und erhöhte Immuntoleranz, katobole Zustände die mit einer Schwächung verbunden sind etc., Laron-Dwarfism („Laron dwarfism"), Insulinresistenz usw.
Zur therapeutischen Verwendung kann die indirekte Agonistenzusammensetzung direkt dem Säüger durch jede geeignete Technik verabreicht werden, einschließlich oral, parenteral intranasal oder intrapulmonar, und kann lokal oder systemische verabreicht werden. Der spezifische Weg der Verabreichung wird abhängen z.B. von der Anamnese des Patienten, einschließlich der wahrgenommenen oder antizipierten Stelle oder der verminderten Effekte bei der Verwendung von IGF-1, und der zu behandelnden Erkrankung. Beispiele der parenteralen Verabreichung umfasst die subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarteriele und intraperitoneale Verbreichung. Am bevorzugtesten erfolgt die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion (unter Verwendung z.B. einer Minipumpe, wie einer osmotischen Pumpe) oder durch Injektion (unter Verwendung z.B. intravenöser oder subkutaner Mittel). Die Verabreichung kann auch ein einzelner Bolus oder eine langsam freisetzende Depotformulierung sein. Am Bevorzugtesten wird der direkte Agonist oral oder durch Infusion oder Injektion in einer Frequenz von vorzugsweise ein halb mal, einmal, zweimal oder dreimal täglich, am bevorzugtesten täglich verabreicht.
Die Agonistenzusammensetzung, die in der Therapie verwendet wird, wird in einer Art formuliert und dosiert, die mit einer guten medizinischen Praxis übereinstimmt, wobei der klinische Zustand des Patienten (insbesondere die Nebenwirkungen der Behandlung mit dem Agonisten), die Stelle der Abgabe der Agonistenzusammensetzung, das Verfahren der Verabreichung, der Plan der Verabreichung und andere dem klinischen Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt werden. Die „wirksame Menge" des Agonisten für den Zweck hier wird somit durch solche Überlegungen bestimmt und soll eine Menge sein, die die in Rede stehende Erkrankung behandelt.
Als allgemeine Proposition wird die gesamte pharmazeutisch effektive Menge des Agonisten, die parenteral pro Dosis verabreicht wird, in Bereich von etwa 1 μg/kg/Tag bis etwa 100 mg/kg/Tag, vorzugsweise 10 μg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag betragen. Wenn es kontinuierlich gegeben wird, wird der Agonist im Allgemeinen in Dosen von etwa 1 μg/kg/Stunde bis etwa 100 μg/kg/Stunde entweder durch 1 bis 4 Injektionen pro Tag oder durch subkutane Infusionen, beispielsweise unter Verwendung einer Minipumpe oder einer tragbaren Infusionspumpe verbareicht. Eine intravenöse Beutellösung kann auch verwendet werden. Der Schlüsselfaktor bei der Auswahl einer geeigneten Dosis ist das erhaltene Ergebnis, das durch Kriterien gemessen wird, wie sie vom Praktiker für geeignet angesehen werden. Wenn der Agonist zusammen mit Insulin verabreicht wird, wird letzteres in niedrigeren Mengen verwendet, als wenn es allein verwendet wird, bis herunter zu Mengen, die bei sich selbst wenig Effekt auf die Blutglukose aufweisen, d.h. in Mengen von zwischen etwa 0,1 IU/kg/24 Stunden bis etwa 0,5 IU/kg/24 Stunden.
Für die parenterale Verabreichung wird in einer Ausführungsform der Agonist im Algemeinen durch Mischen in dem gewünschten Reinheitsgrad in einer injezierbaren Dosiseinheitsform (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger formuliert, d.h. einer, der für den Empfänger nicht toxisch in den eingesetzten Dosen und Konzentrationen ist, und mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist. Beispielsweise umfasst die Formulierung vorzugsweise keine oxidierenden Mittel und andere Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie für Polypeptide schädlich sind.
Im Allgemeinen wird die Formulierung durch gleichmäßiges und inniges Kontaktieren des Agonisten mit einem flüssigen Träger oder eines fein verteilten festen Trägers oder beidem hergestellt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Empfängers isoton ist. Beispiele von solchen Trägervehikeln schließen Wasser, Salzlösung, Ringer's Lösung und Dextrose-Lösung ein. Nicht wässrige Vehikel, wie fixierte („fixed") Öle und Ethyloleat sind hier auch nützlich, sowie Liposome.
Der Träger enthält geeigneterweise geringe Mengen von Additiven, wie Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen. Solche Materialien sind nicht toxisch für den Empfänger in der eingesetzten Dosis und Konzentration und umfasst Puffer, wie Phosphate, Citrate, Succinate, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze; Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), z.B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, wie Serumalbumin, Gelatin oder Immunglobuline, hydrophile Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon; Glycin; Aminosäuren, wie Glutaminsäure, Aspartinsäure oder Argini, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate, einschließlich Cellulose oder seine Derivate, Glucose, Mannose oder Dextrine, Chelatbildner, wie EDTA; Zuckeralkohole, wie Mannitol oder Sorbitol, Gegenionen, wie Natrium; nicht ionische Surfaktanten, wie Polysorbate, Poloxamere oder PEG; und/oder Neutralsalze, z.B. NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂ etc.
Der Agonist wird typischerweise individuell in solche Vehikel in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 10 mg/ml bei einem pH von etwa 4,5 bis 8 formuliert. Die Endformulierung, wenn es eine Flüssigkeit ist, wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 2 bis 8°C für bis zu etwa vier Wochen gelagert. Alternativ kann die Formulierung lyophilisiert und als Pulver zur Rekonstitution mit Wasser zur Injektion bereitgestellt werden, das wie bei der flüssigen Formulierung beschrieben gelagert wird.
Der Agonist, der zur therapeutischen Verabreichung verwendet werden soll, sollte steril sein. Sterilität wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (z.B. 0,1 Micron Membranen) erreicht. Therapeutische Agonistenzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter platziert, der einen sterilen Zugang aufweist, z.B. ein intravenöser Lösungsbeutel oder ein Vial, das einen mit einer hypodermen Injektionsnadel durchstechbaren Verschluss aufweist.
Der Agonist wird üblicherweise in einem Einheits- oder Multi-Dosis-Behälter gelagert, z.B. abgedichtete Ampullen oder Vials als wässrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele vollständig verstanden werden. Sie sollten aber nicht so konstruiert werden, dass sie den Schutzgegenstand der Erfindung beschränken. Die Offenbarung der gesamten Literatur und der Patentzitate, die hier erwähnt sind, werden ausdrücklich unter Bezugnahme aufgenommen.
BEISPIEL 1
Kristallisation und Charakterisierung von IGF-1-Kristallen
Kristallisation von IGF-1 und Datensammlung
Rekombinantes humanes IGF-1 (rhIGF-1) wurde, wie in den Beispielen des US-Patentes Nr. 5,723,310 beschrieben, erhalten, wobei eine Polymer/Salz-Kombination für die Phasen-bildende Spezies verwendet wurde und, wie in den Beispielen des US-Patentes Nr. 5,681,814 beschrieben (Acetat, NaCl, Polysorbat 20 und Benzylalkohol), formuliert, und in ein Vial mit 7 ml 10 mg/ml rhIGF-1 gegeben. Es wurde in 0,15 M NaCl, 20 mM NaOAc, pH 4,5 entsalzt und zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml verdünnt. Ein 4 μl Tropfen der IGF-1-Lösung wurde mit 5 μl Reservoirlösung (24 % Polyethylenglycol 3350, gepuffert auf pH 6,5 mit 0,1 M Natriumcacodylat) und 1 μl 14 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin gemischt, das in einem CRYSTAL SCREEN^TM-Reagenzkit erhalten wird, der für Kristallisationsbedingungsscreenen verwendet wird und von Hampton Research, Laguna Nigel, CA erhältlich ist. Die Lösung lässt man über Dampfdiffusion (Jancarik et al., supra) mit 1 ml Reservoirlösung äqulibrieren. Somit wurde ein Tropfen der Mischung unter einer Plastikabdeckungsschlitz über der Reservoirlösung suspendiert. Kleine Kristalle mit einer dünnen, Plättchen-ähnlichen Morphologie erschienen nach 4 bis 5 Tagen. An diesem Punkt wurden 2 μl von 100 % Methylpentandiol (MPD) (zu einer Endkonzentration von 20 %) zu dem Kristallisationtropfen gegeben, und die Kristalle lösten sich über Nacht auf. Innerhalb 1 Woche erschienen die Kristalle wieder und wuchsen zu den Enddimensionen von 0,2 mm × 0,1 mm × 0,05 mm mit bemerkenswert scharfen Ecken. Diese Kristalle wurden für alle nachfolgenden Experimente verwendet.
Der Fachmann wird erkennen, dass die vorstehenden Kristallisationsbedingungen variiert werden können. Durch Variation der Kristallisationsbedingungen können andere Kristallformen von IGF-1 erhalten werden. Solche Variationen können alleine oder in Kombination verwendet werden und umfassen z.B. das Variieren der Endproteinkonzentrationen zwischen etwa 5 und 35 mg/ml, dem Variieren des Verhältnisses von IGF-1 zu Ausfällmittel, dem Variieren der Ausfällmittelkonzentrationen zwischen etwa 20 und 30 % für Polyethylenglycol, dem Variieren des pH-Bereichs zwischen 5,5 und 7,5, dem Variieren der Konzentration oder der Art des Detergenz, dem Variieren der Temperatur zwischen etwa –5 und 30°C und dem Kristallisieren von IGF-1 chargenweise, mit einer Flüssigkeitsbrücke oder durch Dialyseverfahren unter Verwendung der obigen Bedingungen oder Variationen davon, vgl. McPherson et al (1982) supra.
Charakterisierung der IGF-1-Kristalle
Ein einzelner Kristall wurde von der Mutterflüssigkeit in eine Kryo-Schutzlösung übertragen, bestehend aus 25 % (W/V) Polyethylenglycol 3350, 30 % MPD, 0,2 M Natriumcacodylat pH 6,5, 2,8 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin und 1 M NaBr. Die Diffraktion betrug 1,8 Å. Nach 30 Sekunden in dieser Lösung, wurden die Kristalle blitzgekühlt, in dem die Lösung in flüssigen Stickstoff eingetaucht wurde. Die Technik des Gefrierens von Kristallen immortalisiert sie im Wesentlichen und ergibt ein Datenset mit viel höherer Qualität. Alle nachfolgenden Manipulationen und Röntgenstrahldatensammlungen wurden bei 100°C Kelvin durchgeführt.
Ein 4-Wellenlängen-MAD-Datensatz wurde mit einer Strahlenlinie 9-2 mit einem Stanford Synchrotron Radiation Laboratory gesammelt, wobei die Reihenfolge der Datensätze wie folgt ist: Br-Peak (λ1), Niedrigenergieentfernung (λ2), Br-Beugung (λ3) und Hochenergieentfernung (λ4). Der Br-Peak und die Beugungspunkte wurden aus den Fluoreszenzscans des Kristalls abgeschätzt, und die Niedrigernergieentfernung wurde so gewählt, dass sie 1,54 Å betrug, um die kleinen anomalen Schwefel-Signale bei dieser Wellenlänge zu maximieren, während die Absorptionseffekte minimiert werden. Es wurde keine inverse Strahlgeometrie verwendet. Die Datenreduktion erfolgte unter Verwendung von Denzo und Scalepack (Otwinowski und Minor, Methods in Enzymology, 276: 307-326 (1997)). Um die genaueste Skala und mögliche B-Faktoren zu bestimmen, wurden Daten für alle vier Wellenlängen anfänglich zusammen skaliert, wobei keine anormalen Signale angenommen wurden. Die Skalen und B-Faktoren, die von diesem Skalierungslauf bestimmt wurden, wurden dann auf jedes dieser vier Datensätze angewendet.
Die Kristalle gehören zur Raumgruppe C222₁ mit Einheitszellkonstanten a = 31,83 Å, b = 71,06 Å, c = 66,00 Å und α = β = γ = 90,000°. Die Assymetrieeinheit dieser Kristalle enthielt ein Monomer von IGF-1, das an ein einzelnes Detergenzmolekül gebunden war, was einen Matthew's Koeffizienten von 2,4 Å³/Da oder 48,1 % Lösungsmittel ergab. Der Lösungsmittelgehalt des Kristalls betrug 55 %.
Strukturbestimmung
Anfängliche Versuche zur Bestimmung der Struktur von IGF-1 durch Molekülaustausch, wobei entweder die verfügbaren NMR-Modelle von IGF-1 oder die Kristallstruktur von Insulin verwendet wurden, waren nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurde die Struktur de novo durch Br-Multiwellenlänge-Anomalie-Dispersion (MAD) (Dauter et al., Acta Crystallogr., D56: 232-237 (2000) bestimmt.
Die Koordinaten des einzelnen gebundenen Bromids wurden durch manuelle Inspektion der anomalen und dispersiven Differenz-Patterson-Abbildung bestimmt. Die Handmehrdeutigkeit („hand ambiguity") wurde durch Phasenfeineinstellung aufgelöst, wobei das Programm SHARP (De La Fortelle und Bricogne, Methods in Enzymology, 276: 472-494 (1997) von Global Phasing Limited, 43 Newton Road, Cambridge CB2 2AL, England, verwendet wurde, gefolgt von der Untersuchung der anomalie-Differenz-Fourier-Abbildung, die unter Verwendung der λ2-Bijvoet-Differenz berechnet wurden. Ein Cluster von sechs Peaks für eine Hand der Br-Koordinaten war konsistent mit der Disulfid-Struktur des Insulins (PDB-Code: 1ZNI). Diese sechs Peaks entsprechen den Sechs Cys-Sy-Atomen im IGF-1; ein siebtes Schwefel (Met 59 Sδ) wurde niemals in den Anomalie-Differenz-Fourier-Abbildungen nachgewiesen, vermutlich wegen seines höheren Temperaturfaktors (36,7 Å²). An diesem Punkt wurden die sechs Cys-Sy-Positionen in die Phasenfeineinstellung involviert, wobei der λ1-Datensatz als Referenz verwendet wurde. Durch die Phasenfeineinstellung wurde Br f'' für den λ1-Datensatz fein eingestellt, f' und f'' wurden für λ3 fein eingestellt und beide wurden für die Datensätze λ2 und λ4 fixiert gehalten; die f''- und f'-Werte für Schwefel wurden bei den theoretischen Werten jeder Wellenlänge fixiert gehalten. Das kleine anomale Signal von den Schwefelatomen hatte einen bescheidenen Effekt auf die Phasierungsstatistik, aber die resultierende Elektronendichteabbildung zeigte eine verbesserte Verbindung, insbesondere in den weniger gut geordneten Regionen von IGF-1.
Dichtemodifikationen (Lösungsmittelabflachung und Histogrammapping) wurden unter Verwendung von DM (Collaborativ Computational Project Number 4, Acta Crystallogr., 50: 760-763 (1994); Cowtan, Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein Crystallography, 31: 34-38 (1994)) durchgeführt und die resultierende Elektronendichteabbildung war von hoher Qualität. Etwa 50 % der Struktur, die den drei helikalen Regionen von IGF-1 entspricht, wurde direkt in der Elektronendichteabbildung aufgebaut, wobei die Programme O (Jones et al., Acta Crystallogr., A47: 110-119 (1991)) und QUANTA (Version 97.0, MSI, San Diego, CA) verwendet wurden. Mehrere Runden der Phasenkombination unter Verwendung von Sigma (Collaborative Computational Project Number 4, supra; Read, Acta Crystallogr., A42: 140-149 (1986) erlaubt es, den Rest des Moleküls zu modelieren. Atom-positionales und gehinderte B-Faktor-Feineinstellung benutzt die maximal-wahrscheinliche Targetfunktion von CNX (Brünger et al., Acta Crystallogra., D54. 905-921 (1998) und MSI, San Diego, CA), gekoppelt mit einer Bulklösungsmittelkorrektion vom „mask"-Typ und eine anisotrope Gesamt-B-Faktor-Scalierung.
Das Endmodell enthält die Reste 3-34 und 41-64 von IGF-1, ein N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin-Molekül, ein Br und 50 Wassermoleküle. Das Modell wurde gegen den λ3-Datensatz fein eingestellt, da die Datenstatistik zeigt, dass dieser Datensatz von höherer Qualität ist, als die anderen. Alle Daten von der 20- bis 1,8 Ångstrom Auflösung wurden in die Feineinstellung aufgenommen, wobei das Sigma-cutoff nicht angewendet wurde. Die Zuordnungen der Sekundärstruktur wurden mit dem Programm PROMOTIF (Hutchinson und Thornton, Protein Science, 5: 212-220 (1996)) durchgeführt.
Während die gut geordneten Positionen von IGF-1 im Wesentlichen unter Verwendung der zwei Sätzen von Phasen identisch waren, zeigten die flexibleren Regionen des Moleküls eine dramatisch verbesserte Verbindbarkeit nach Einschluss der Schwefel in das Phasieren. Experimentelle Elektronendichteabbildungen zeigten die Umkehrregion von IGF-1 unmittelbar nach der ersten Helix (Reste 19, 20 und 21), was anzeigt, dass die Verwendung der kombinierten Br- und S-Phasen ein viel besser verbundene Abbildung ergibt, als nur die Br-Phase alleine. An diesem Punkt bei der Verwendung der Br + S-Phasen konnten etwa 50 % der Moleküle direkt in den experimentellen Abbildungen nachgewiesen werden.
Beschreibung der Struktur
Nach mehreren Zyklen der Modellbildung und Phasenkombination, enthielt das in 2 dargestellte Endmodell die Reste 3-34 und 41-64 von IGF-1, ein einzelnes gebundenes Detergenzmolekül und 46 Wassermoleküle. Der R-Faktor zu 1,8 Å beträgt 23,7 %, und der freie R-Faktor beträgt 26, % mit guter Stereochemie. Die N-terminale B-Region entspricht den Resten 3-28, die C-Region von 29-34 und eine Streckung von wenig geordneten Resten von 35-40 und die A-Region von 42-62. Die D-Region (63-70) ist im Wesentlichen ungeordnet.
Die Struktur von IGF-1 ist dem Insulin ähnlich (siehe 3), mit einer mittleren quadratischen Abweichung (RMSD) von 3 Å über die Hauptkettenatome, die zwischen den zwei Molekülen konserviert sind. Die Meisten dieser Abweichungen treten in den flexiblen Regionen auf, und wenn nur die helikalen Regionen betrachtet werden, beträgt der RMSD zwischen den alpha-Kohlenstoffatomen etwa 0,47 Å. Der Hauptunterschied ist die Extension der C-Region, für die es im reifen Insulin kein Gegenstück gibt, weg vom Körper des Moleküls. Diese Schleife enthält viele der Reste, von denen bekannt ist, dass sie für die Rezeptorbindung wichtig sind.
Eine extensive Alanin-Scan-Mutagenese-Untersuchung für IGF-1 hat gezeigt, welche Reste für die Bindung von IGFBP-1 und IGFBP-3 (Dubqui und Lowman, supra) wichtig sind. Die Reste, die an IGFBP-3 binden sind ähnlich zu denen, die an IGFBP-1 binden, obwohl von IGFBP-3 angenommen wird, dass es mehr von der Hauptketten-Interaktion abhängt und weniger ernst durch die Alaninmutationen beeinflusst wird. Es gibt keinen dramatischen Spot, wo die Reste, die für die IGFBP-1- und IGFBP-3-Bindung wichtig sind, zusammengehäuft werden, und Mutationen, die das Binden behindern, sind über das gesamte Molekül verstreut. Es scheint ein schwaches Zusammenhäufen von Stellen am N-Terminus zu geben, wobei viele dieser Stellen intrinsisch hydrophob sind.
Wie in den 4 und 7 gezeigt ist, bindet das Detergenzmolekül in eine kleine hydrophobe Spalte an der Basis der B-Helix. Es gibt mehrere Seitenkettenkontakte an das Detergenz von den Resten 5, 7 und 10. Trotz der Überlappung der Detergenzbindungsstelle mit einem Teil des IGFBP-1/IGFBP-3-Bindungsepitops legen die vorläufigen Ergebnisse nahe, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, dass das Detergenz die Bindung dieser Proteine an IGF-1 nicht hemmt. Die gegenüberliegende Seite des Detergenz stellt einen Symmetriekontakt an die gegenüberliegende Seite von IGF-1 her.
Wie in der 5 gezeigt ist, gibt es nur einen großen Kristallpackungskontakt zwischen den Symmetrie-bezogenen IGF-1-Molekülen, was in einem symmetrischen Homodimer resultiert. Die verborgene Oberflächenfläche beträgt 1378 Å², was im Bereich der physiologisch relevanten Protein-Protein-Grenzflächen liegt.
6 zeigt, dass die Reste, von denen bekannt ist, dass sie für die Rezeptorbindung wichtig sind, sich an dieser Dimergrenzfläche anhäufen. Gezeigt sind Tyr 24, Thr 31 und Tyr 60. Mutationen dieser Reste ergeben irgendwo von 6-20X einen Verlust der Affinität für den Rezeptor für individuelle Mutationen oder einen 240 → 1200X-Verlust in der Affinität für Doppelmutationen. Auch gezeigt sind Phe 23 und Phe 25, die mit Phe 24 und Tyr 26 des Insulins ohne Verlust der Affinität austauschbar sind.
Weitere Beschreibung der Struktur
IGF-1 ist hauptsächlich aus 3 helikalen Segmenten zusammengesetzt, die der B-Helix (IGF-1-Reste 7-18) und zwei A-Helices (IGF-1-Reste 43-47 und 54-58) des Insulins entsprechen. Der hydrophobe Kern ist im Wesentlichen identisch mit dem, der für die NMR-Struktur von IGF-1 beschrieben ist, einschließlich der Disulfidbindungen zwischen Cys 6 und Cys 48, Cys 18 und Cys 61 und Cys 47 und Cys 52, wie in den vorstehenden Publikationen bemerkt wurde. Die Reste 3 bis 6 bilden keine reguläre Sekundärstruktur und die hier beschriebene Struktur kann als am ähnlichsten mit der T-Form von Insulin klassifiziert werden (Derewenda et al., Nature, 338: 594-596 (1989); wenn tatsächlich IGF-1 und die T-Form des Insulins an den Cα-Positionen ihrer entsprechenden helikalen Segmenten (IGF-Reste 8-19, 42-49 und 54-61; Insulinreste B9-B20, A1-A8 und A13-A20) übereinander gelegt werden, beträgt der RMSD nur 0,93 Å. Wie im Insulin bilden die Reste 18-21 am Ende der B-Helix eine β-Umkehrung vom Typ II', der die Hauptkette von der B-Helix in eine verlängerte Region umlenkt. Die Reste 24-27 bilden einen β-Umkehung vom Typ VIII, um sich der C-Region anzupassen, die sich vom Kern von IGF-1 weg erstreckt und mit einem Symmetrie-bezogenen Molekül ineragiert. Die Reste 30-33 bilden eine gut definierte beta-Umkehrung vom Typ II, die hauptsächlich das Tyr 31 an der i + 1-Position zeigt. Die Reste 35-40 wurden nicht modelliert, da die Elektronendicht in dieser Region schwach und unverbunden ist. Nur die ersten zwei Reste der D-Region (Reste 63 und 64) sind in der Struktur geordnet.
Die C-Region von IGF-1 vermittelt eine zweifache symmetrische Kristallpackungsinteraktion quer über die a-Achse der Einheitszelle. Diese Interaktion verbirg 689 Å² der Lösungsmittelzugänglichen Oberflächenfläche jedes IGF-1-Moleküls oder insgesamt 1378 Å², und ist die größte Grenzfläche im Kristall. Insgesamt 28 intermolekulare Kontakte mit der Entfernung von 3,6 Å oder weniger sind über diese Grenzfläche gebildet, wobei die nächste extensivste Kristallpackungsinteraktion nur neun Kontakte bildet. Der Kern der Grenzfläche wird von Tyr 24 und Pro 28 von jedem Monomer gebildet, das 39 Å² bzw. 57 Å² der Lösungsmittelzugänglichen Oberflächenfläche verbirgt. Der aromatische Ring von Tyr 31, der an der Spitze der Schleife am weitesten Punkt vom Kern von IGF-1 liegt, packt gegen den phenolischen Ring von Phe 23 und Phe 25 des Symmetrie-bezogenen Moleküls. Zusätzlich zu diesen hydrophoben Interaktionen liegen zwei Hauptketten mit Wasserstoffbindungen (Tyr 31 N-Phe 23 O; Ser 34 N-Asp 20 O) in der Dimergrenzfläche vor. Die Reste von der D-Region (62-64) werden auch partiell durch die Dimerbildung sequestriert. Wegen diesen Interaktionen ist das Meiste der C-Region im Kristall gut geordnet, wobei die erste Hochauflösungansicht der Konformation dieser biologisch wichtigen Schleife bereitgestellt wird.
Obwohl 72 Detergenzberbindungen, einschließlich dem ähnlichen 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-Propan-sulfonat (CHAPS)- und 3-((Cholamidopropyl)dimethylammonio)-2-hydroxypropan-sulfonsäure (CHAPSO)-Detergenz, in den Kristallisationversuchen gescreent wurden, ergab nur N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin Kristalle. Ein einzelnes Molekül N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin interagiert mit den Resten, wobei eine kleine hydrophobe Spalte an einer Oberfläche des IGF-1 gebildet wird (Leu 5, Phe 16, Val 17, Leu 54 und Leu 57) (7A). Die Präferenz für N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)- deoxycholamin wird, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, durch die Abwesenheit eines Sauerstoffatoms an der Position C10 im Detergenzmolekül erklärt. Diese Region des Detergenzes ist in einem nahen Kontakt mit den Seitenkettenatomen der Reste Leu 5, Leu 54 und Leu 57 in IGF-1. Die gegenüber liegende Fläche des Detergenzes vermittelt einen Symmetriekontakt mit den Resten Val 11, Leu 14 und Gln 15 eines Symmetrie-bezogenen IGF-1-Moleküls. Faszinierenderweise steht diese Seite von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin auch mit den Kanten der Dimergrenzfläche in Kontakt, wobei enge Kontakte mit Phe 23 und Phe 25 des gleichen IGF-1-Moleküls bestehen sowie mit Tyr 31 und Gly 32 des dimeren Partners (7B). Eine detailliertere Analyse zeigt, dass das Detergenz an zwei Flecken der Bindungstaschen von IGF-1 bindet. Ein Fleck hat die Aminosäurereste Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 und Leu 57, und der zweite Fleck hat die Aminosäurereste Val 11, Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49 und Arg 55. Binden wird dadurch definiert, das mindestens ein Kontakt zwischen jedem aufgeführten Aminosäure-Rest und dem Kandidatenagonistenmolekül vorliegt, das kleiner oder gleich 6 Ångstrom ist.
Diskussion
Die C-Region im IGF-1-Kristall erstreckt sich vom Kern des Moleküls, wobei die Reste 30-33 eine kanonische beta-Umkehrung vom Typ II bilden, und die Restlichen der C-Region bilden ein kristallographisches Dimere mit einem Symmetrie-bezogenen Molekül. Tyr 31 wurde als kritische Determinante für die IGF-1-Bindung verwickelt, und sein Ort an der Spitze dieses Extensions platziert es an einem idealen Ort, um mit einem Rezeptormolekül zu interagieren. Während diese IGF-1-Region nicht gut durch NMR-Daten definiert ist spiegelt die Konformation der C-Region in dem Kristall wahrscheinlich die Lösungskonformation wieder. Es gibt Hinweise einer reversen Umkehrung an der Spitze der Schleife und eine Gelenkbindung an den Schleifentermini von IGF-2 (Torres et al., supra). Während somit die Kristallpackungskräfte unzweifelhaft helfen, die Orientierung dieser Schleife zu stabilisieren, ist ihre Konfirmation mit der Lösungsstruktur des eng verwandten IGF-2 konsistent.
Die Größe der Grenzfläche, die durch das kristallographische Dimer gebildet wird, liegt gut im Bereich der verborgenen Oberflächenflächen in bekannten biologischen Komplexen. (Janin und Chothia, J. Biol. Chem., 264: 16027-16030 (1990)). Zusätzlich schließt diese Interaktion partiell vom Lösungsmittel einige der Reste aus, die für das Binden an IGF-1R bekannt sind, einschließlich Phe 23 (69 % verborgen), Tyr 24 (64 %), Phe 25 (29 %) und Tyr 31 (38 %). Von anderen Gruppen wurde ebenfalls eine homodimere Interaktion von IGF-1 und IGF-1 berichtet. Laajoki et al., (2000), supra berichtet, dass in einer Konzentration von 1 mM eine konstruierte Form von IGF-1 (Long-[Arg³]IGF-1) in 20 % Dimer und 80 % Monomer teilt, ein Verhältnis, das in guter Übereinstimmung mit der Abschätzung von 3,6 mM K_d steht. In ihren NMR-Untersuchungen von IGF-2 berichteten Torres et al, supra, dass die Amidprotonen der Reste in der C-Region langsam mit dem Lösungsmittel austauschen, was nahe legt, dass IGF-2 ein Homodimer in Lösung bildet. Trotz der signifikanten Menge der Oberflächenfläche, die verborgen ist durch die Dimerbildung im Kristall, ist die Affinität von IGF-1 für sich selbst sehr schwach. Zusätzlich mach es die bekannte Bindungsstöchiometrie von einem IGF-1-Molekül pro Rezeptordimer (De Meyts, supra) schwierig, die biologische Bedeutung der IGF-1-Dimerisierung zu rationalisieren. Zur Schlussfolgerung resultiert das IGF-1-Dimer in dieser Kristallform aus der hohen Konzentration von IGF-1 in den Kristallisationsexperimenten und repräsentiert nicht eine physiologisch relevante Form des Moleküls.
Die sehr schlechte Qualität der NMR-spektroskopischen Daten, die von IGF-1 bei nahezu neutralem pH erhalten wurden, wurde der Kombination einer Selbstassoziierung und einer internen Mobilität zugeschrieben, die zu einer großen Variation in der Resonanzlinienbreite (Cook et al., supra) führt. Als Ergebnis erhalten die NOESY-Spektren, die von IGF-1 erhalten wurden, viele breite überlappende Peaks und wenige scharfe gut aufgelöste Korrelationen. NOESY-Spektren, die von IGF-1 in Gegenwart eines Überschusses von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin gesammelt wurden, haben ein ähnliches Aussehen. Somit ist das Detergenzbinden nicht ausreichend, um die Aggregation oder inhärente Flexibilität von IGF-1 zu eliminieren und erleichtert nicht die Charakterisierung der Lösungskonformation des Proteins. Dies steht im Gegensatz zu den Beobachtungen in kristallinem Zustand, in dem die Zugabe eines Detergenz zu einem gut gepackten kristallographischen Dimer führt, das zu hoher Auflösung beugt. Jansson et al., J. Biol. Chem., 273: 24701-24707 (1998) bemerkte, dass das Fehlen der NMR-Zuordnung in dem Bereich, der Cys 6 unmittelbar umgibt, der Leu 5 und Gly 7 umfasst, ein Cys 6 – Cys 48 – Disulfid anzeigt, das einen intermediären Austausch zwischen einer cis- und eine trans-Konfiguration eingeht. Die Tatsache, dass das Detergenz an eine Seite der B-Helix unmittelbar gegenüber dieses Disulfides bindet, legt nahe, ohne an eine Theorie gebunden zu sein, dass es dienen kann, diese Region des Moleküls durch eine vollständigeres Packen der hydrophoben Spalte zu stabilisieren. Tatsächlich sind in der Kristallstruktur hier die Cys 6 – Cys 46 eindeutig in der trans-Konformation, und es gibt keinen Hinweis von multiplen Konformationen.
Schlussfolgerung
Die Kristallstruktur von IGF-1 wurde bestimmt, wobei eine anomale Streuung von intrinsischen Schwefelatomen und einem Br-Ion, das an einer zufälligen Halogenbindungsstelle gebunden ist, verwendet wurde. Die Struktur ist dem Insulin sehr ähnlich, wobei der einzige Hauptunterschied in der C-Region besteht, die aus dem Körper des Proteins vorsteht und eine homodimere Interaktion vermittelt. Die Menge der verborgenen Oberflächenfläche ist mit der Tatsache konsistent, dass bei neutralem pH das IGF-1 eine Selbstassoziierung in einer konzentrationsabhängigen Art eingeht. Zusätzlich werden mehrere Reste an dieser Dimergrenzfläche gefunden, die für die Rezeptorbindung wichtig sind, was ohne an eine Theorie gebunden zu sein nahe legt, dass die Effekte über die Rezeptorbindung durch Mutation dieser Reste das Ergebnis einer Störung des Dimers ist, vielmehr als ein direkter Kontakt mit der Rezeptoroberfläche.
BEISPIEL 2
Diffusions-basierende Messung der Detergenzbindung
Von NMR-abgeleitete Diffusionsmessungen wurden verwendet, um K_d für die Interaktion zwischen IGF-1 und N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin abzuschätzen. Proben wurden in 50 ml Phosphatpuffer in D₂O, pH 6,5 (unkorrigierte Messablesung) hergestellt, die enthielten: 1,0 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin + 0,5 mM IGF-1; 0,5 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin + 0,25 mM IGF-1, 0,25 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin + 0,125 mM IGF-1; oder nur N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin (1,0, 0,5, oder 0,25 mM). Alle Spektren wurden an einem Bruker AVANCE 500^TM-Spektrometer (Bruker Analytik GmbH) bei 40°C erhalten, das mit einem 5 mm Trippelachsengradienten, Tripelresonanzsonde ausgestattet war. Die Diffusionsmessungen wurden mit einem bipolaren Pulspaarverfahren mit δ = 5 ms, τ = 2 ms und Δ = 25 oder 40 ms für N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin alleine bzw. N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin + IGF-1 (Wu et al., J. Magn. Reson., Ser A. 115: 260-264 (1995)) durchgeführt. Spektren wurden mit 128 bis 1024 Transienten gesammelt sowie die z-Gradientenfestigkeit wurde von 0,009 auf 0,45 T._m ^–1 in 18 gleichen Inkrementen erhöht wurde; Messungen wurden mindestens zweimal mit einer Probe ausgeführt. Die Spektren wurden verarbeitet und die Peakhöhen mit dem Programm FELIX (v98,0, MSI, San Diego) extrahiert. Die Diffusionskonstanten, der Anteil des gebundenen Detergenz und die resultierende K_d wurden wie bei Fejzo et al., Chemistry & Biology, 6: 755-769 (1999) beschrieben extrahiert. Spektren wurden auch mit Proben gesammelt, die 1,0 mM 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat, einem zwitterionischen Detergenz, das für die Membransolubilisierung verwendet wird, und 1,0 mM 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat + 0,5 mM IGF-1 enthielten. Zweidimensionale NOESY-Spektren (Jeener et al, J. Chem. Phys., 71: 4546-4553 (1979)) wurden an einer 0,5 mM Probe von IGF-1 in Gegenwart oder Abwesenheit von 1,0 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin mit einer Mischzeit von 100 ms gesammelt.
IGF-1-PhagenELISA
E.coli-Zellen (XL1-Blue, Stratagene), die mit dem Phagenvektor pIGF-g3, der humanes IGF-1 zeigt, wie in Dubaqui und Lowman supra beschrieben, frisch transformiert wurden, wurden über Nacht in 5 ml 2YT-Medium (Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Handbook (Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) wachsen gelassen. Die Phagenpartikel, die IGF-1 zeigen, wurden gegen IGFBP-1 und IGFBP-3 titriert, um eine 500-1 000 fache Verdünnung zur Preinkubation mit der seriellen Verdünnung der Detergenzes und den Bindungsproteinstandards über 35 Minuten zu erhalten. Mikrowellenklare Polystyrolimmunplatten mit MAXISORP^TM-Oberfläche (Nune, Dänemark) wurden mit IGFBP-1- oder IGFBP-3-Protein über Nacht bei 4°C (50 μl bei 3 μg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6) überzogen, mit 0,5 % TWEEN^® 20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat (Atlas Chemical Co.) und PBS blockiert und acht mal mit PBS, 0,05 % TWEEN^® 20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat gewaschen. Die Proben wurden zu den Platten während 30 Minuten zugegeben. Die Platten wurden acht mal mit PBS, TWEEN^® 20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat gewaschen, mit 50 μl eines 1 : 10 000 Meerettichperoxidase/anti-M13-Antikörperkonjugates (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) in PBS, 0,5 % BSA während 30 Minuten inkubiert und dann acht mal mit PBS, 0.05 % TWEEN^® 20 Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat und zweimal mit PBS gewaschen. Die Platten wurden unte Verwendung von Tetramethylbenzidin-Substrat (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) entwickelt, mit 1,0 H₃PO₄ gestoppt und spektrometrisch bei 450 nm ausgelesen.
Sedimentationsgleichgewichtsanalyse
Die Selbstassoziierung von IGF-1 wurde durch eine Sedimentationsgleichgewichtsanalyse bestimmt. Die Experimente wurden bei 20°C in eine OPTIMA^TMXL-A/XL-I analytischen Ultrazentrifuge (Beckma Coulter, Inc.) durchgeführt. Die Proben wurden in 0,1 M Citratpuffer, pH 6,5, 75 mM NaCl mit einer Beladungskonzentration von 1 mM bis 0,01 mM hergestellt. Die Konzentrationsgradienten wurden bei Rotorgeschwindigkeiten von 25 000 und 30 000 U/min. bei 280 nm oder 285 nm unter Verwendung eines Abtast-Absorptions-Optiksystems gemessen. Das Erreichen eines Gleichgewichtszustandes wurde dadurch verifiziert, dass die sukzessiven Scans nach etwa 16 Stunden verglichen wurden. Das partielle spezifische Volumen von IGF-1 wurde von seiner Aminosäurezusammensetzung berechnet. Die Daten wurden zu einer einzelnen idealen Spezies oder den idealen Dimer-Selbstassoziierungsmodellen unter Verwendung eines nicht linearen Anpassungsprogramms der kleinsten Quadrate NONLIN (Johnson et al., Biophys. J. 36: 578-588 (1981)) angepasst. Die Assoziierungskonstanten wurden von den am besten passenden Werten des Models bestimmt, das durch eine nicht lineare Regression der kleinsten Quadrate zurückgeführt wird.
Ergebnisse:
N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin bindet an IGF-1 in Lösung
Die Affinität von IGF-1 für 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat und N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin wurden bestimmt unter Verwendung von Lösungs-NMR-Verfahren. Die chemische Verschiebungen, die während einer Titration von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin in 0,5 mM IGF-1-Lösung beobachtet wurden, legten nahe, dass die Affinität submillimolar war und von solchen Daten nicht leicht messbar war. Stattdessen wurden Diffusionsmessungen an Proben bei variierenden IGF-1-Konzentrationen gemacht, die 2 molare Äquivalente des Detergenz enthielten, und ebenfalls mehreren Proben des Detergenz alleine (aber die Detergenzkonzentration war immer geringer als die kritische Mizellenkonzentration von 1,4 mM für N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)deoxycholamin und 14 mM für 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propansulfonat). Die Abnahme in der Diffusionskonstante des Detergenz in Gegenwart des Proteins kann verwendet werden, um die Proportion des Detergenzes zu bestimmen, das an das Protein gebunden ist (Fejzo ea al., supra). Da die Gesamtkonzentration des Detergenz und des Proteins bekannt ist, kann ein Wert für die Dissoziationskonstante bestimmt werden. Bei den drei untersuchten Proteinkonzentrationen (0,5 mM, 0,25 mM und 0,125 mM) wurden K_d-Werte von 220, 440 bzw. 430 erhalten. Diese Technik wurde routinemäßig für kleine Moleküle (mehrere hundert Dalton Molekulargewicht oder weniger) angewendet, die an große Proteine binden. In diesem besonderen Fall ist der Ligand relativ groß (862 Dalton) und das Protein ist relativ klein (7648 Da); somit ist die differentielle Abnahme in der Diffusionskonstante an der Bindungsstelle gering. Dies erhöht die Unsicherheit mit der die Dissoziationskonstante gemessen werden kann. Unter diesen Umständen beschreiben die obigen Daten, dass der K_d für die Interaktion zwischen N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin und IGF 300 ± 150 μM beträgt. Eine ähnliche Analyse von (3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat-Diffusionsdaten legt nahe, dass der K_d in diesem Fall größer als 3 mM ist.
N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin blockiert IGFBP-1- und IGFBP-3-Bindung
Um die Bindungsepitope von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin an IGF-1 zu untersuchen, wurde das Detergenz mit IGF-1 vor inkubiert, das auf Baktriophagen exprimiert wird, und die Menge der restlichen Bindung an IGFBP-1 und IGFBP-3 wurde in einem Platten-basierenden Assay (ELISA) gemessen. Als Kontrolle wurde das 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)1-propansulfonat-Molekül ebenfalls getestet. Wie in 8 dargestellt ist, inhibiert das N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin vollständig IGF-1 an Phagen vom Binden an IGFBP-1 und IGFBP-3 mit IC₅₀-Werten von 740 ± 260 mM bzw. 231 ± 29 μM. Diese Zahlen müssen konservativ interpretiert werden, da jedoch die kritische Mizellenkonzentration von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin (1,4 mM) ein oberes Limit auf der Kurve in 8 darstellt. Im Gegensatz zu dem Effekt von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin zeigte das eng verwandte Detergenz 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat keine Inhibierung der Bindung bei irgendeiner getesteten Konzentration bis 1 mM. Trotz dieser Beschränkung des Experiments stehen die für N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin erhaltenen IC₅₀-Werte in guter Übereinstimmung mit der obigen Abschätzung für K_d für die N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin-IGF-1-Interaktion.
Selbstassoziierung von IGF-1
Die Sedimentationsgleichgewichtsdaten zeigen, dass IGF-1 eine Selbstassoziierung in Lösung eingeht. Das durchschnittliche Molekulargewicht nahm mit der zunehmenden Proteinkonzentration von 0,01 mM bis 1 mM zu. Das durchschnittliche Molekulargewicht bei der höchsten untersuchten Konzentration (1 mM) ist etwa 37 % höher als das Monomere Molekulargewicht (10,4 kDa bei 1 mM versus 7,6 kDa Monomermolekulargewicht). Bei Konzentrationen unter 0,05 mM wurde keine Selbstassoziierung beobachtet, und IGF-1 existierte nur als Monomer in Lösung bei neutralem pH. Es wird angenommen, dass die Spezies mit höherem Molekulargewicht IGF-1-Dimere sind, die Sedimentationsdaten können zu einem Monomer-Dimer-Modell mit einem K_d von 3,6 ± 1,0 mM (9) passen.
Mehrere Studien haben Reste im IGF-1 identifiziert, die für die IGFBP-Bindung wichtig sind (Clemmons et al., Endocrinology, 131: 890-895 (1992); Dubaquie und Lowman, supra, Jansson et al., supra, Oh et al., (1993), supra; Lowman et al., (1998), supra und Dubaquie et al., Endocrinology, 142: 165-173 (2001)). Dubaquie und Lowman, supra, identifizierten zwei unterschiedliche Flecken an IGF-1, die mit IGFBP-1 und IGFBP-3 interagieren. Fleck 1 besteht aus Glu 7, Leu 10, Val 11, Leu 14, Phe 25, Ile 43 und Val 44, während Fleck 2 aus Glu 3, Thr 4, Leu 5, Phe 16, Val 17 und Leu 54 besteht. In der Kristallstruktur von IGF-1 sind diese beiden Flecken an den Detergenz-vermittelten Kristallpackungskontakten beteiligt (speziell Fleck 1 der Kristallstruktur von IGF-1 besteht aus den Aminosäureresten Glu 3, Thr 4, Leu 5, Asp 12, Ala 13, Phe 16, Val 17, Cys 47, Ser 51, Cys 52, Asp 53, Leu 54 und Leu 57, und Fleck 2 der Kristallstruktur von IGF-1 besteht aus den Aminosäureresten Val 11, Gln 15, Phe 23, Phe 25, Asn 26, Val 44, Phe 49 und Arg 55, wobei ein Binden auftritt, wenn mindestens ein Kontakt zwischen jedem aufgeführten Aminosäure-Rest vorliegt und das Kandidatenagonistmolekül weniger als oder gleich 6 Ångstrom beträgt.
Das überlappen der Detergenzbindungsstelle mit der IGFBP-Interaktionsoberfläche ist insgesamt konsistent mit der Beobachtung, dass N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin das IGFBP-1- und IGFBP-2-Binden blockiert. Im Gegensatz dazu inhibiert N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin nicht das IGF-1R-vermittelte Signal in einem auf Zellen basierenden Rezeptoraktivitätsassay. Diese Ergebnisse sind mit früheren Studien konsistent, die verschiedene Bindungsepitope an IGF-1 für Rezeptor- und IGFBP-Interaktion zeigen (Bayne et al., supra, (Vol. 264); Bayne et al., supra, (Vol 265); Cascieri et al.., supra). Die Identifikation von N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin als Inhibitor der IGFBP-Interaktionen erlaubt die Möglichkeit, niedermolekulare Wirkstoffe oder Peptidomimetika zu entwickeln, die den IGF-1/IGFBP-Komplex in vivo stören, wobei Rezeptor-aktives IGF-1 aus dem systemischen, inaktiven Pool freigesetzt wird. Solche Wirkstoffe umfassen die oral bioverfügbare Therapie für metabole Erkrankungen, wie Diabetes.
Kürzlich veröffentlichten Zeslawski et al (EMBO J. 20: 3638-3644 (2001)) die Kristallstruktur von IGF-1 im Komplex mit der N-terminalen Domäne von IGFBP-5. Die Struktur des Komplexes ist vollständig mit dem Modell der Detergenzinhibierung der IGFBP-Bindung, die hier präsentiert wurde und auch bei Vajdo et al., Biochemistry, 40: 11022-11029 (2001) veröffentlicht wurde, konsistent. Die NMR-Bestimmung eines Komplexes von IGF-1, der an ein von einem Phagen stammendes IGF-1-Antagonistenpeptid gebunden ist, das als IGF-F1-1 (RNCFESVAALRRCMYG (SEQ ID NO: 4)) bezeichnet wird, im Vergleich zu anderen IGF-1-Kristallstrukturen zeigt, dass ohne an eine Theorie gebunden zu sein ein Teil der A-Kette (Helix III) in Lösung mobil ist und eine leicht unterschiedliche Konformation annimmt, wenn es an verschiedene Liganden (Detergenz, Peptid, Bindungsprotein) gebunden wird.
Der Komplex zwischen den Peptiden IGF-F1 und IGF-1 wurde aus NMR-Spektroskopiedaten bestimmt, die bei 600 und 800 MHz gewonnen wurden. IGF-1, das gleichförmig mit ¹³C und ¹⁵N markiert wurde, wurde unter Verwendung des bei Reilly und Fairbrother, J. Biomol. NMR, 4: 459-462 (1994) veröffentlichten Schemas hergestellt und nach dem Verfahren von Vajdos et al., supra, gereinigt. Ein geringer molarer Überschuss von unmarkiertem IGF-F1-1 wurde mit einer 1,5 mM-Lösung von ¹³C/¹⁵N-IGF-1 gemischt, und ¹H-, ¹³C- und ¹⁵N-NMR-Resonanz von Doppel und Trippel-Resonanz-NMR-Experimenten, wie sie bei Cavanagh et al., in Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice (Academic Press, New York, 1996) beschrieben sind, wurden zugeordnet. Entfernungsbeschränkungen im IGF-1 wurden aus den ¹³C editierten NOESY HSQC-Spektren und ¹⁵N-editierten NOESY HSQC-Spektren (Cavanagh et al., supra) identifiziert.
Intramolekulare Randbedingungen zwischen IGF-1 und dem Peptid wurden aus einem _ω1 gefiltertem, _ω2-editiertem ¹³C-HSQC-NOESY-Spektrum erhalten (Lee et al., FEBS Lett., 350: 87-90 (1994)). Intrapeptidrandbedingungen wurden von einem 2-D ¹³C-gefiltertem NOESY-Spektrum erhalten. Zusätzlich wurden _φdihedrale Winkelrandbedingungen aus einem HNHA-Spektrum erhalten (Cavanagh et al., supra) und _x1-Randbedingungen wurden aus HNHB und TOCSY-Spektren mit kurzer Mischzeit (Clore et al., J. Biomolec. NMR, 1: 13-22 (1991)) erhalten. Zusätzlich wurden _φψ Randbedingungen von einer Analyse der chemischen Verschiebungen von H^α, N, C^α, C^β und CO unter Verwendung des Programms TALOS (Cornilescu et al., J. Biomol. NMR, 13: 289-302 (1992)) erhalten.
Insgesamt wurden 899 Distanzrandbedingungen (779 intra-IGF-1; 33 intra-Peptid; 87 Intramolekular), 16 Wasserstoffbindungsrandbedingungen in der Helix 1 und 138 dihedrale Winkelrandbedingungen (71 φ, 44 ψ, 23 X1) verwendet, um einen Gesamteindruck von Strukturen zu erzeugen, wobei ein dynamisches Torsionswinkelprotokoll mit dem Computerprogramm CNX (Accelrys inc., San Diego) verwendet wurde. Die IGF-1-Struktur war für die B-Region (Reste 2-25) und die A-Region (Reste 41-63) mit einem mittleren RMSD von der Hauptstruktur der schweren Atome der Hauptkette von 0,32 ± 0,06 Å gut definiert. Die C-Region (26-40) und die D-Region (62-70) war durch die zur Verfügung stehenden Daten nicht gut definiert. Die 20 Strukturen der niedrigsten Beschränkungsbruchenergie hatte eine gute Hauptkettenstereochemie (80 % der Reste in der begünstigten Region des φ/ψ-Raums mit Keinen in nicht erlaubten Regionen) und enthielt wenig Übertretungen der experimentellen Randbedingungen (mittlere maximale Distanzrandbedingungsübertretung 0,09 ± 0,02 Å). IGF-F1-1 nimmt eine sehr ähnliche Konformation an wie die, die für das Peptid selbst in Lösung bestimmt wurde. Die Konformation von IGF-1 enthält drei Helices (Reste 7-18, 43-49 und 54-60) und ist der ähnlich, die bei niedrigerer Auflösung in früheren NMR-Studien des unkomplexierten IGF-1 beobachtet wurde (vgl. z.B. Cooke et al., supra, Sato et al., supra und Laajoki et al., supra).
10 zeigt den Vergleich für das Detergenz und ein Phagenpeptidkomplex. Insbesondere zeigt 10A eine Bandabbildung eines Komplexes aus IGF-1 und N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin und 10B zeigt einen Komplex aus IGF-1, das an das von einem Phagen-abgeleitete Peptid IGF-F1-1 gebunden ist. Die B-Region (Helix) nimmt eine sehr ähnliche Konformation in beiden Komplexen an. Die C-Schleife ist im Detergenzkomplex nur partiell geordnet und schlecht in dem Peptidkomplex definiert. Liganden-induzierte Unterschiede werden für die A-Region von IGF-1-beobachtet (Helix III), sowohl am Hauptketten (Reste 52-60)- als auch dem Nebenkette (Leucin 54 und 57)-Level. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird von der Maleability („maleability") in dieser A-Region angenommen, dass sie das ist, was es IGF-1 erlaubt, so viele Proteine (sechs IGFBPs und drei Rezeptoren) zu binden.
Die vorliegende Erfindung wurde erforderlicherweise unter Bezugnahme auf bestimmte Methoden und Materialien hier diskutiert. Es soll verstanden werden, dass die Diskussion dieser speziellen Verfahren und Materialien in keiner Weise irgendeine Beschränkung des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung dar stellt, die sich auf jede und alle alternativen Materialien und Verfahren erstreckt, die zur Erreichung der Ziele der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
ANHANG 1

Claims

IGF-1-Kristall mit in etwa den folgenden Zellkonstanten a = 31,831 Å, b = 71,055 Å, c = 65,995 Å und einer C222₁-Raumgruppe, um die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von IGF-1 durch Röntgendiffraktionsuntersuchungen zu ermöglichen.
Kristall nach Anspruch 1, wobei das IGF-1 eine A-, B-, C- und D-Region enthält und in dem Kristall ein Dimer bildet und wobei der Kristall eine Rezeptorbindungsstelle an dem Dimerinterface umfasst.
Zusammensetzung, die das Kristall nach Anspruch 1 und einen Träger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das IGF-1 biologisch aktiv ist, wenn es wieder gelöst wird.
Zusammensetzung nach Anspruch 4 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Säugers, der an einer Agonistenerkrankung leidet, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 4 an den Säuger umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Erkrankung Diabetes, Adipositas, eine Herzfunktionsstörung, eine AIDS-bedingte Schwächung, eine Nierenerkrankung, eine neurologische Erkrankung, eine Gesamtkörperwachstumserkrankung oder eine immunologische Erkrankung ist.
Verfahren zum Kristallisieren des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors 1 (IGF-1) der SEQ ID Nr. 1, umfassend die Schritte: (a) Mischen einer wässrigen Lösung, die das IGF-1 in einer Konzentration von etwa 1 bis 50 mg/ml beinhaltet, mit einer Reservoirlösung, die ein Ausfällmittel umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglycol, Natriumcitrat, Ammoniumsulfat, Natriumcacodylat und Mischungen davon, um ein gemischtes Volumen zu bilden, und (b) Kristallisieren des gemischten Volumens, um IGF-1-Kristalle zu erhalten, die eine Röntgenbestrahlung auslenken, um ein Beugunsgmuster zu ergeben, das die dreidimensionale Struktur des IGF-1 darstellt und in etwa die folgenden Zellkonstanten a = 31,831 Å, b = 71,055 Å, c = 65,995 Å und eine C222₁-Raumgruppe und α = β = γ aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das IGF-1 aus einer prokaryontischen Zelle erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die wässrige Lösung aus Schritt (a) etwa 5 bis 15 mg pro ml IGF-1 enthält.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Ausfällmittel Polyethylenglycol ist, das mit Natriumcitrat oder Natriumcacodylat gepuffert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Ausfällmittel in der Reservoirlösung in einer Menge von etwa 20 bis 25 %, wenn es Polyethylenglycol ist, und von etwa 1 bis 10 M vorliegt, wenn es Natriumcitrat, Ammoniumsulfat oder Natriumcacodylat ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Reservoirlösung weiterhin ein Detergenz umfasst, insbesondere wobei das Detergenz in einer Menge von etwa 10 bis 50 mM vorliegt, insbesondere wobei das Detergenz N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der pH der Reservoirlösung etwa 4 bis 10 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der pH etwa 6,5 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei Schritt (b) mittels Dampfdiffusionskristallisation, diskontinuierlicher Kristallisation, Flüssigkeitsbrückenkristallisation oder Dialysekristallisation ausgeführt wird, insbesondere wobei Schritt (b) mittels Dampfdiffusionskristallisation ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, das weiterhin das Umkristallisieren des IGF-1 nach Schritt (b) umfasst, insbesondere wobei das Umkristallisieren unter Verwendung von Methylpentandiol stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 8, das weiterhin das Isolieren des kristallinen IGF-1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die wässrige Lösung mit etwa 24 % Polyethylenglycol, das auf etwa pH 6,5 mit entweder etwa 0,1 M Natriumcitrat oder etwa 0,1 M Natriumcacodylat gepuffert ist, und etwa 1 μl von etwa 1,4 mM N,N-bis(3-D-Gluconamidopropyl)-deoxycholamin-Detergenz gemischt wird, diese Lösung mittels Dampfdiffusionskristallisation mit etwa 1 ml etwa 24 % Polyethylenglycol, das auf pH 6,5 mit entweder etwa 0,1 M Natriumcitrat oder etwa 0,1 M Natriumcacodylat gepuffert ist, äquilibriert wird, bis Kristallisationströpfchen gebildet werden, und etwa 2 μl von etwa 100 % Methylpentandiol zu den Kristallisationströpfchen zugegeben werden, um die Kristalle über Nacht zu lösen und dadurch neue Kristalle zu bilden.
Kristallines IGF-1, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8.
Verfahren zum Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von IGF-1, umfassend (a) Kristallisieren des IGF-1 nach dem Verfahren gemäß Anspruch 8, (b) Bestrahlen des kristallinen IGF-1, das in etwa die folgenden Zellkonstanten a = 31,831 Å, b = 71,055 Å, c = 65,995 Å und eine C222₁-Raumgruppe aufweist, um ein Beugungsmuster zu erhalten, das für kristallines IGF-1 charakteristisch ist, und (c) Umwandeln des Beugungsmusters in die dreidimensionale Struktur von IGF-1.
Verfahren zum Verwenden einer dreidimensionalen Struktur von IGF-1, das von einem IGF-1-Kristall nach Anspruch 1 stammt, wobei die dreidimensionale Struktur von IGF-1 eine IGF-t-Rezeptorbindungsregion umfasst, wobei das Verfahren das Identifizieren von Verbindungen mit Strukturen umfasst, die mit der Rezeptorbindungsregion der dreidimensionalen Struktur von IGF-1 interagieren und als IGF-1-Agonist oder -Antagonist wirken.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die dreidimensionale Struktur von IGF-1 die alpha-Kohlenstoff-Koordinaten umfasst, die im wesentlichen die gleichen wie die der strukturellen Informationen sind, die in Anhang 1 dargestellt sind.
Verfahren zum Identifizieren von IGF-1-Agonisten oder -Antagonisten, umfassend die Schritte: (a) Kristallisieren von IGF-1, um einen IGF-1-Kristall gemäß Anspruch 1 zu bilden, wobei die IGF-1-Kristalle eine Gruppe von Aminosäure-Resten enthalten, die eine IGF-1-Bindungsrezeptor-Region definieren, (b) Bestrahlen der 1GF-1-Kristalle aus Schritt (a), um ein Beugungsmuster der IGF-1-Kristalle zu erhalten, (c) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des IGF-1 aus dem Beugungsmuster, wobei die Struktur eine IGF-1-Rezeptorbindungs-Region umfasst, und (d) Identifizieren eines IGF-1-Agonisten oder -Antagonisten mit einer dreidimensionalen Struktur, die funktionell im wesentlichen die IGF-Rezeptorbindungs-Reste und Lösungsungsmittel-zugänglichen Reste dupliziert, die die dreidimensionale Struktur der IGF-1-Rezeptorbindungs-Region repräsentiert, wobei der IGF-1-Agonist oder -Antagonist eine geänderte Signalübermittlungskapazität für auf IGF-1 ansprechende Zellen, verglichen mit IGF-1, aufweist.
Verfahren nach Ansprach 24, wobei die Lösungsmittel-zugänglichen Reste nicht an der Bildung des IGF-1-Interfaces Teil nimmt.
Verfahren zum Konstruieren einer Verbindung, die die dreidimensionale Oberflächenstruktur von IGF-1 nachbildet, umfassend die Schritte: (a) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von IGF-1 von einem IGF-1-Kristall nach Anspruch 1, (b) Konstruieren einer Verbindung, die die dreidimensionale Oberflächenstruktur von IGF-1 nachahmt.
Verfahren zum Identifizieren eines Peptidmimetikums, das IGF-1 bindet und das Binden von IGFBP oder eines Rezeptors, der an IGF bindet, blockiert, umfassend die Schritte: (a) Suchen in einer Molekularstrukturdatenbank mit den Strukturparametern oder Strukturkoordinaten, die in Anhang 1 bereitgestellt sind, und (b) Auswählen eines Moleküls aus der Datenbank, das die Strukturparameter oder Strukturkoordinaten von IGF-1 nachahmt.
Verfahren zum Bestimmen mindestens eines Teils einer dreidimensionalen Struktur eines molekularen Komplexes, wobei der Komplex IGF-1 umfasst und wobei das Verfahren die Schritte umfasst. (a) Bestimmen der Strukturkoordinaten eines IGF-1-Kristalls nach Anspruch 1, (b) Berechnen der Phasen von den Strukturkoordinaten, (c) Berechnen der Elektronendichteabbildung von den in Schritt (b) erhaltenen Phasen und (d) Bestimmen der Struktur mindestens eines Teils des Komplexes, basierend auf der Elektronendichteabbildung.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die in Schritt (a) verwendeten Strukturkoordinaten im wesentlichen die gleichen wie die in Anhang 1 beschriebenen sind, oder im wesentlichen das gleiche Kristall beschreiben, wie die Koordinaten in Anhang 1.
Verfahren zur Beurteilung der Fähigkeit einer chemischen Entität mit IGF-1 oder einem Komplex davon zu assoziieren, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Anwenden von rechnerischen oder experimentellen Mitteln, um eine Anpassungsoperation zwischen der chemischen Entität und dem IGF-1, das die in Anhang 1 beschriebenen Strukturkoordinaten aufweist, oder eines Komplexes davon durchzuführen, wodurch auf die Assoziierung bezogene Daten erhalten werden, und (b) Analysieren der in Schritt (a) erhaltenen Daten, um die Charakteristiken der Assoziierung zwischen der chemischen Entität und dem IGF-1 oder Komplex davon zu bestimmen.
Schweratomderivat einer kristallisierten Form von IGF-1 nach Ansprüchen 1 oder 8.