DE60218347T2

DE60218347T2 - Mesoporöse permeationsschichten zur verwendung an elektronischen aktivmatrixbauelementen

Info

Publication number: DE60218347T2
Application number: DE60218347T
Authority: DE
Inventors: Jainamma San Diego KROTZ; Daniel D. Jamul SMOLKO; Howard R. Poway REESE; Thomas J. Poway ONOFREY; Daguang Wang; Theodore M. Winger; John R. Arlington HAVENS
Original assignee: Nanogen Inc
Current assignee: Nanogen Inc
Priority date: 2001-12-10
Filing date: 2002-11-27
Publication date: 2007-10-25
Anticipated expiration: 2022-11-28
Also published as: US20030146145A1; US20080063794A1; CA2469355A1; US7270850B2; US20050164283A1; EP1463576A2; AU2002359542A1; EP1463576B1; DE60218347D1; WO2003049677A2; US7597932B2; KR20040074066A; EP1463576A4; US6960298B2; WO2003049677A3; ATE354412T1; JP2005512069A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel zur Verwendung auf aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen für biologische Assays zur Verfügung. Die Permeationsschichten haben eine definierte poröse Struktur, mit Mesoporen in einem Größenbereich von etwa 100 nm bis etwa 1000 nm, und können ebenso Mikroporen im Mikrometergrößenbereich aufweisen. Die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel zeigen eine verbesserte Signalintensität und Linearität, verglichen mit Permeationsschichten aus nanoporösem synthetischem Hydrogel auf aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung auch Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel bereit, die copolymerisierte Befestigungsstellen für Nucleinsäuresonden oder andere Biomoleküle aufweisen.
HINTERGRUND
Die folgende Beschreibung gibt eine Zusammenfassung der Informationen, die für die vorliegende Erfindung relevant sind. Dies bedeutet nicht, dass irgendeine der Informationen Stand der Technik für die derzeit beanspruchte Erfindung ist oder dass irgendeine der angegebenen Veröffentlichungen ausdrücklich oder implizit Stand der Technik für die Erfindung ist.
Indem eine Vielzahl von Nucleinsäuresonden auf eine Oberfläche aufgebracht werden und die Oberfläche einer Probe ausgesetzt wird, die Zielnucleinsäuren enthält, können mit einer Probe viele Hybridisierungsreaktion gleichzeitig durchgeführt werden, wodurch simultan Hybridisierungsdaten für mehrere Zielnucleinsäuren (Reverse-Dot-Blot-Technik) erzeugt werden. Ähnlich können, indem Nucleinsäuren von verschiedenen Proben auf der Oberfläche immobilisiert werden, verschiedene Proben mit der gleichen Oligonucleotidsonde gleichzeitig untersucht werden (Dot-Blot-Technik). Ursprünglich wurden Dot-Blot-Hybridisierungen und Reverse-Dot-Blot-Hybridisierungen durchgeführt, indem Nucleinsäuresonden unbearbeitet auf eine Nucleinsäure-bindende Membran oder ein Nucleinsäure-bindendes Filter geblottet wurden. In den letzten beiden Jahrzehnten wurden mehrere Werkzeuge entwickelt, um Nucleinsäuresonden auf verschiedenen Typen von Oberflächen (Glas, Polymeren, Siliciumnitrid etc.) an definierten Stellen in hoher Dichte durch Verfahren wie physikalische Abscheidung (z.B. Tintenstrahl, Mikrospray, Pin-Abscheidung, Mikrokanalabscheidung) oder durch in-situ-Polymerisationstechniken (z.B. photochemische Schutzgruppenentfernung) anzuordnen. Derartige DNA-Arrays auf "Mikrochip"-Basis waren in den vergangenen Jahren von großem Interesse wegen ihrer enormen Fähigkeit, die schnelle Analyse von genetischer Information zu vereinfachen. Auch wenn sehr fortschrittliche Techniken verwendet werden, um diese Array-Typen zu erzeugen, verwenden sie immer noch die parallele Hybridisierung von DNA auf die immobilisierten Capture-Sonden in einem passiven Modus. Anders ausgedrückt kommt es in gleichem Ausmaß gleichzeitig zu einer Wechselwirkung zwischen den Nucleinsäuren, die im gesamten Probenvolumen vorhanden sind, und der gesamten Array-Oberfläche.
Im Gegensatz hierzu wird in aktiven elektronischen Matrixarrays ein elektrisches Feld verwendet, um den schnellen Transport und die Hybridisierung von DNA auf Mikrochips zu erleichtern. Im Allgemeinen enthalten aktive Matrixarray-Vorrichtungen eine Array von elektronisch adressierbaren Mikroelektroden auf einem Träger, die für die Steuerung einer Vielzahl biomolekularer Reaktionen einschließlich DNA-Transport, Hybridisierung und Denaturierung durch ein elektrisches Feld sorgen. Durch die Verwendung der Elektroden, mit denen ein elektrisches Feld an eine Lösung angelegt wird, die geladene Moleküle, wie Nucleinsäuren, enthält, können die geladenen Moleküle schnell transportiert werden und an den Elektroden aufkonzentriert werden, die entgegengesetzt zu den Molekülen geladen sind. Dies erlaubt den sehr effizienten und spezifischen Transport von Nucleinsäuresonden oder Amplikons für die Bindung an Befestigungsgruppen an den Mikrostellen (ein Vorgang, der manchmal als "Programmieren" der Stellen bezeichnet wird), was die Erzeugung von Arrays für Dot-Blot-Formate und Reverse-Dot-Blot-Formate ermöglicht. Nach der Immobilisierung der Sonden oder Amplikons an den Mikrostellen kann das elektrische Feld erneut verwendet werden, um die zweite Komponente für den Hybridisierungsassay schnell an die Mikrostelle zu dirigieren. Die durch ein elektrisches Feld regulierte Hybridisierung ist um eine bis drei Größenordnungen schneller als die passive Hybridisierung unter gleichen Bedingungen, wodurch mehrere Einschränkungen der passiven Hybridisierung überwunden werden.
Diese Arrays, die auch als aktive programmierbare elektronische Matrixvorrichtungen (active programmable electronic matrix devices) oder APEX-Vorrichtungen bekannt sind, sind umfassend beschrieben worden, z.B. in den US-Patenten Nr. 6,051,380 und 6,245,508, die durch die Bezugnahme in ihrem vollem Umfang hier eingefügt werden. Im Allgemeinen umfassen die Vorrichtungen ein Array von individuell ansteuerbaren Mikroelektroden auf einem Träger, und sie umfassen optional zusätzliche Gegenelektroden für das Anlegen der entgegengesetzten Spannung. Über den Mikroelektroden liegt eine dünne Permeationsschicht, wodurch die Mikrostellen der Vorrichtung oberhalb der Mikroelektroden festlegt werden. Zusätzlich zur Erleichterung der Befestigung von Biomolekülen durch die Bereitstellung ei ner Matrix für die Befestigung von Befestigungseinheiten (z.B. Streptavidin) trennt die Permeationsschicht die Biomoleküle von der Elektrodenoberfläche, an der eine Hydrolyse und andere potentiell nachteilige elektrochemische Reaktionen stattfinden können. Auch wenn die Permeationsschicht die Bewegung der Biomoleküle in Richtung der Mikroelektrode verzögert oder verhindert, ist die Permeationsschicht ausreichend durchlässig für kleine Moleküle, wodurch der Ionenaustausch zwischen der Elektrodenoberfläche und dem Puffermedium ermöglicht wird, wodurch das Fließen eines elektrischen Stromes ermöglicht wird. Die Chips mit aktiver elektronischer Matrix verwenden üblicherweise Bedingungen hinsichtlich elektrischer Stromstärke und Spannung, unter denen die elektrischen Stromdichten mindestens 0,04 nA/μm² (etwa 200 nA für eine Mikrostelle mit einem Durchmesser von 80 μm) betragen und/oder die Potentiale für die Hydrolyse von Wasser ausreichen. Die elektrische Stromdichte ist als die elektrische Stromstärke dividiert durch die Fläche der Elektrode, die verwendet wird, um sie zu tragen, definiert.
Zusätzlich hängt die Effektivität der Ortsveränderung geladener Biomoleküle, wie von Nucleotid-Oligomeren, innerhalb eines elektronisch angetriebenen Systems, wie eines Chips mit aktiver elektronischer Matrix, von der Erzeugung des geeigneten Gradienten positiv und negativ geladener elektrochemischer Spezies durch die Anode bzw. die Kathode ab. Ein tatsächlicher Transport von Nucleinsäuren (d.h. entweder DNA oder RNA) kann durch die Erzeugung von Protonen und Hydroxyanionen erzielt werden, wenn das Potential an der Anode größer als +1,29 V ist, bezogen auf die "gesättigte Kalomel-Elektrode" (SCE). Die Effizienz des Transports geladener Moleküle nimmt mit zunehmender Stromdichte zu, was den Wunsch nach einem Betrieb bei einem größeren Spannungsabfall und einer höheren Stromdichte fördert und demzufolge den Bedarf an dauerhaft robusten Permeationsschichten antreibt.
Es wurde außerdem festgestellt, dass das Hindurchfließen eines elektrischen Stromes durch die Permeationsschicht beträchtlichen chemischen und mechanischen Stress in der dünnen Permeationsschicht auf der Elektrodenoberfläche hervorruft. Es wurde festgestellt, dass die Permeationsschicht anfällig für ein Ablösen oder "Abblättern" von der Elektrodengrenzfläche ist, wenn derartig dünne Schichten ohne kovalente Befestigung an der Elektrodenoberfläche auf Elektroden aufgebracht werden. Es wird angenommen, dass dieses Abblättern durch eine Veränderung im chemischen Aufbau an der Grenzfläche zwischen der Permeationsschicht und der Elektrode verursacht wird, was aus dem Anlegen einer elektrischen Spannung an die Elektrode und dem physikalischen Zerbrechen geladener Ionen und dem Ausströmen von Gasen, die aus der Elektrode hervortreten, resultiert. Die Permeationsschicht muss eine ausreichende mechanische Festigkeit haben, und sie muss chemisch relativ inert sein, um den Unbilden der Veränderungen an der Elektrodenoberfläche ohne unmäßige Dehnung oder Zersetzung zu widerstehen.
Demnach stellt die Permeationsschicht aktiver elektronischer Matrixvorrichtungen ein wichtiges Element für die Gesamtfunktion der Vorrichtung dar. Sie muss ausreichend durchlässig für kleine wässrige Ionen sein, dennoch Biomoleküle effizient von der Elektrodenoberfläche entfernt halten. Zusätzlich muss sie imstande sein, beträchtlichen chemischen und mechanischen Kräften zu widerstehen und dabei ihre Unversehrtheit und Form zu behalten. Verschiedene Materialien sind verwendet worden, die diese Eigenschaften liefern. Agarose mit Glyoxal-vernetztem Streptavidin (SA) wurde als Permeationsschicht auf kommerziell verfügbaren aktiven elektronischen Matrixchips verwendet, und über die Ergebnisse der elektronischen Hybridisierung von DNA auf diesen Chips wurde in zahlreichen Veröffentlichungen berichtet (z.B. Sosnowski, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 94:1119-1123 (1997), und Radtkey, et al., Nucl. Acids Research, 28(7) e17 (2000.))
Agarose ist ein polymeres Kohlenwasserstoffhydrogel natürlicher Herkunft, das lange Polymerstränge enthält, die durch nicht-kovalente Bindungen vernetzt sind. Derartige Hydrogele werden als "physikalische Hydrogele" bezeichnet, da sie ihre Struktur durch nicht-kovalente Wechselwirkungen erlangen, verglichen mit "chemischen Hydrogelen", die ihre Struktur durch kovalente Bindungen (oder Vernetzungen) erhalten. Agarose-Permeationsschichten liefern gute relative Fluoreszenzintensitätsmessungen in Nucleinsäure-Assays, wie Hybridisierungsassays für SNPs ("single nucleotide polymorphisms") und STRs ("Short tandem repeat sequences") in Amplikon- und Capture-Sandwich-Formaten, und ebenso in Nucleinsäure-Assays vom Primer-Extensionstyp, die für die Genexpressionsanalyse verwendet worden sind.
Man trifft jedoch auf einige Nachteile bei der Verwendung von Agarose als Permeationsschichtmaterial. Sowohl das Herstellungsverfahren als auch die Tatsache, dass Agarose ein Produkt natürlicher Herkunft ist, verursachen einige Schwankungen, die die Leistungsfähigkeit von Charge zu Charge verändern können, was eine striktere Qualitätskontrolle erforderlich macht. Dies ist nicht ideal für eine Herstellung in großem Maßstab. Daher ist ein alternatives Material wünschenswert, das nicht natürlicher Herkunft ist, das leicht zu einer Permeationsschicht auf der Vorrichtung geformt werden kann und das die Betriebsstandards von Agarose erfüllt oder übertrifft.
Polyacrylamidgel und andere synthetische Polymergele stellen eine Alternative zu Permeationsschichten aus einem Agarosehydrogel dar. Diese Materialien sind vollkommen synthetisch und bieten daher eine strikte Qualitätskontrolle der Komponenten. Zusätzlich können sie einfach auf die Oberfläche des Mikroelektrodenarrays geformt werden mit einem hohen Grad an Homogenität über die gesamte Vorrichtung. Permeationsschichten, die im trockenen Zustand 1 bis 2 μm dick sind, können auf diese Weise leicht hergestellt werden, und sind abänderbar für eine Herstellung mit hohem Durchsatz. Nach der Formgebung wird Streptavidin kovalent an die Oberfläche des Hydrogels gebunden, um Befestigungsstellen für biotinylierte Oligonucleotidsonden oder Amplikons zu erhalten. Obwohl in herkömmlicher Weise formulierte Polyacrylamidhydrogele, die durch das Mikroformgebungsverfahren hergestellt werden, homogen sind und eine bessere Produktkontrolle bieten, ist ihre Leistungsfähigkeit in den meisten Nucleinsäure-Assays nicht so gut wie Agarose-Streptavidin-Permeationsschichten. Es gibt daher weiterhin einen Bedarf an hochleistungsfähigen Permeationsschichten aus synthetischem, polymerem Hydrogel zur Verwendung auf aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen.
In dem US-Patent Nr. 6,112,908 werden neue Membranlaminatstrukturen, die für die osmotische Destillation brauchbar sind, und Verfahren für ihre Herstellung präsentiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben die überraschende Feststellung gemacht, dass Permeationsschichten aus synthetischem, polymerem Hydrogel mit definierter Porosität eine hohe Leistungsfähigkeit auf aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen bieten. Speziell synthetische, polymere Hydrogele mit Mesoporen mit einer Größe zwischen Nanoporen mit einer Größe im Nanometerbereich und Mikroporen mit einer Größe im Mikrometerbereich zeigten eine Leistungsfähigkeit, die genauso gut wie oder besser als die Leistungsfähigkeit von Permeationsschichten aus physikalischem Agarosehydrogel in verschiedenen Nuclein säure-Assay-Formaten war. Nach einem ersten Aspekt stellt die Erfindung demnach Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel zur Verwendung auf aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen bereit. In ihrer grundlegendsten Ausführungsform umfasst der Aufbau der Permeationsschicht auf der Vorrichtung eine mesoporöse Permeationsschicht, die auf einer individuell adressierbaren Elektrode auf einem Träger liegt.
Nach einigen bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung weisen die Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel Poren auf, die eine Porengröße im Bereich von 100 bis 1000 nm haben. Bevorzugter weisen die Permeationsschichten Poren auf, die eine Porengröße im Bereich von 100 bis 500 nm haben, und am bevorzugtesten weisen die Permeationsschichten Poren auf, die eine Porengröße im Bereich von 200 bis 500 nm haben. So wie der Begriff hier verwendet wird, um Hydrogelporen zu beschreiben, ist die "Porengröße" die längste lineare Abmessung quer durch die Pore. Bei einigen Anwendungen, wie diejenigen, bei denen relativ lange Nucleinsäuren (mit einer Länge von mehr als etwa 70 Nucleotiden (im Folgenden "nt")) verwendet werden, bei Assays auf Primer-Extensionsbasis oder bei anderen enzymatischen Reaktionen, an denen immobilisierte Nucleinsäuren beteiligt sind, ist es bevorzugt, dass die Permeationsschichten außerdem Mikroporen aufweisen, die eine Porengröße im Bereich von 1,0 μm bis 3,0 μm, vorzugsweise im Bereich von 1,0 μm bis 2,0 μm, haben. Bei Ausführungsformen der Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel, bei denen die Permeationsschicht im trockenen Zustand eine Dicke von weniger als 3 μm hat, haben die Mikroporen vorzugsweise eine Porengröße im Bereich von 1,0 μm bis 1,5 μm, um ein Freiliegen der darunter liegenden Elektrode zu vermeiden.
Nach anderen bevorzugten Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspekts haben die Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel eine Porositätsmesswert θ im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 4,0, wobei θ durch die Gleichung
definiert ist, wobei die Messwerte λ der integrierten Lichtintensität unter Anwendung der Dunkelfeldmikroskopie einer trockenen Hydrogelschicht auf dem Testchip (λ), einer Standardschicht (λ_S) mit einem mittleren Grad der Phasentrennung und einer nicht phasengetrennten, oder festen Schicht (λ₀) in einem Leica-Dunkelfeldmikroskop aufgenommen werden und wobei die Standardschicht ein Polyacrylamidhydrogel mit einer Standardzusammensetzung (Zusammensetzung S) ist:
Acrylamid:Bisacrylamid 19:1 (mol/mol)
Gesamtmonomergehalt 20 Gew.-%
Die Standardschicht und die Testschicht werden auf dem Träger ähnlich hergestellt und geformt (oder wahlweise angeordnet). Für die Messung von θ haben die Standardpermeationsschicht und die Testpermeationsschicht eine Dicke von etwa 1,7 μm. Unter den in den Beispielen verwendeten Beleuchtungsbedingungen hatte λ_S für die Standardzusammensetzung einen Wert von 60 ± 1,5. Noch bevorzugter hatten die Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel einen θ-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 3,8. Bei Anwendungen, bei denen relativ kurze Nucleinsäuren verwendet werden, mit einer Länge von etwa 70 nt oder darunter, sind Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel mit einem θ-Wert von etwa 2,0 bis etwa 3,0 bevorzugter. Bei Anwendungen, bei denen relativ längere Nucleinsäuren mit einer Länge von mehr als etwa 70 nt verwendet werden, wie Assays auf Primer-Extensionsbasis oder andere enzymatische Reaktionen, an denen immobilisierte Nucleinsäuren beteiligt sind, sind Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel mit einem θ-Wert im Bereich von etwa 3,0 bis etwa 3,8 bevorzugt.
Bevorzugte erfindungsgemäße Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel umfassen ein synthetisches, polymeres Hydrogel auf Acryloyl- oder Acrylamidobasis, bevorzugter ein synthetisches polymeres Hydrogel auf Acrylamidbasis, und ebenfalls bevorzugter ein synthetisches, polymeres Hydrogel auf Methacrylamidbasis. Bevorzugte erfindungsgemäße Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel sind außerdem kovalent auf der oder den darunter liegenden Elektroden und/oder dem Träger verankert. Zusätzlich umfassen bevorzugtere erfindungsgemäße Ausführungsformen der Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel copolymerisierte Befestigungsgruppen für die Befestigung von derivatisierten Biomolekülen als spezifische Bindungseinheiten (z.B. Nucleinsäuren, Proteine, etc.). In bevorzugten Ausführungsformen haben diese copolymerisierten Befestigungsgruppen die allgemeine Formel:
worin
P eine polymerisierbare Gruppe ist, die kovalent mit einer oder zwei Gruppen verbunden ist, die ausgewählt werden unter: einer Monomer-Einheit des synthetischen Polymers und einer weiteren Gruppe P-X-R, die wie hier definiert ist, wobei die weitere Gruppe P-X-R der ersten Gruppe P-X-R entsprechen kann oder von dieser verschieden sein kann, wobei weiterhin die gestrichelte Linie eine kovalente Bindung zu der zweiten Gruppe ist, falls P kovalent mit zwei Gruppen verbunden ist;
X eine kovalente Bindung oder eine Verbindungsgruppe ist; und
R eine funktionelle Gruppe für die kovalente oder nicht-kovalente Anbindung eines Biomoleküls ist.
In bevorzugteren Ausführungsformen ist P eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe, noch bevorzugter eine Acrylamidgruppe. Ebenfalls in bevorzugteren Ausführungsformen handelt es sich bei R um Biotin oder eine Biotinbindungsgruppe, wie z.B. Streptavidin oder Avidin. In anderen bevorzugteren Ausführungsformen ist R eine reaktive Gruppe, die bei der chemischen Befestigung über Amin, Hydrazin oder Hydrazid verwendet wird. Einige bevorzugte Gruppen R schließen aktive N-Hydroxylsuccinimidylester (NHS-Ester), sulfonierte NHS-Ester, Aldehyde, Säuren, Acylhalogenide, Thiole, Disulfide, Amine, Ether, Ester, Thioether, Hydrazine oder Hydrazide ein. In einigen noch bevorzugteren Ausführungsformen handelt es sich bei R um einen Succinimidylester. In einer anderen Gruppe bevorzugter Ausführungsformen ist R ein Aldehyd. In einer weiteren Gruppe bevorzugter Ausführungsformen ist R ein Hydrazid. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist R ein Psoralen.
Da sich die Verwendung von copolymerisierten Befestigungsgruppen als vorteilhaft erwiesen hat, um für eine größere Dichte der Befestigungsgruppen für die Befestigung spezifischer Bindungseinheiten (wie Nucleinsäuren oder Proteine) auf Permeationsschichten aus synthetischem, polymerem Hydrogel für aktive elektronische Matrixchipvorrichtungen zu sorgen, stellen die Permeationsschichten aus synthetischem, polymerem Hydrogel mit copolymerisierten Befestigungsgruppen von beliebiger Porosität einen anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Diese Permeationsschicht bedeckt mindestens ei ne Elektrode auf einem Träger, und umfasst copolymerisierte Befestigungsgruppen der wie weiter oben definierten allgemeinen Formel
In bevorzugteren Ausführungsformen ist P eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe, noch bevorzugter eine Acrylamidgruppe. Ebenfalls in einigen bevorzugteren Ausführungsformen handelt es sich bei R um eine reaktive Gruppe, die auf dem chemischen Gebiet der Befestigung über Amin, Hydrazin oder Hydrazid verwendet wird, wie einen aktiven N-Hydroxylsuccinimidylester (NHS-Ester), einen sulfonierten NHS-Ester, ein Aldehyd, eine Säure oder dgl. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist R eine Gruppe, die imstande ist, an einer Biotinbindungspaarreaktion teilzunehmen, d.h. entweder eine Biotingruppe oder eine Biotin-Bindungsgruppe. Demnach binden diese bevorzugten Gruppen R in der vorliegenden Erfindung an derivatisierte Biomoleküle, die so derivatisiert worden sind, dass sie entweder eine Biotingruppe oder eine Biotin-Bindungsgruppe (z.B. Streptavidin) enthalten. Da viele Biomoleküle problemlos mit Biotin oder einem Biotinanalogon derivatisiert werden können, ist in bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen R eine Biotin-Bindungsgruppe, wie zum Beispiel Streptavidin, Avidin, oder ein chemisches Derivat oder ein rekombinant verändertes Derivat davon. Dem Fachmann ist es ersichtlich, dass das Befestigungsmolekül mehr als eine Gruppe P enthalten kann, die an einer Gruppe R befestigt ist, insbesondere im Fall von Proteingruppen R mit mehreren Untereinheiten, wie Streptavidin. In einigen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen hat das Befestigungsmolekül etwa eine Gruppe P für jede Biotin-Bindungsstelle auf R. In anderen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen hat das Befestigungsmolekül etwa eine Gruppe P für jede Gruppe R. Bevorzugte X können eine kovalente Bindung ebenso wie üblicherweise verwendete hydrophile Linker-Moleküle, wie Polyethylenglykole (PEGs), einschließen, die mit R und P durch übliche chemische Verbindungsgruppen, wie Ester, Amid, Ether oder andere übliche chemische Verbindungsgruppen, verbunden sein. Chemische Verbindungsgruppen, die über einen großen pH-Bereich stabiler sind, wie Amidverbindungsgruppen, sind bevorzugt.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen der Permeationsschicht ist die Permeationsschicht durch kovalente Bindungen auf der Elektrode, auf dem Träger, oder auf der Elektrode und dem Träger verankert. In diesen Ausführungsformen werden Linker auf Silanbasis, die eine copolymerisierbare Gruppe enthalten, bevorzugt verwendet, um die Permeationsschicht kovalent zu verankern.
Ganz allgemein haben in bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen der Permeationsschichten die Permeationsschichten eine Dicke im Bereich von etwa 0,5 μm bis etwa 10 μm im trockenen Zustand, noch bevorzugter eine Dicke im Bereich von etwa 1,0 μm bis etwa 5,0 μm im trockenen Zustand, und am bevorzugtesten eine Dicke von etwa 1,0 μm bis etwa 2,0 μm im trockenen Zustand [oder mindestens eine Dicke von etwa 8-9 μm, wenn im Gleichgewicht mit wässrigem Puffer]. Weiterhin variiert in bevorzugten Ausführungsformen die Dicke quer über das Elektrodenarray der aktiven elektronischen Matrixchip-Vorrichtung um weniger als 0,5 μm, noch bevorzugter um weniger als 0,2 μm und am bevorzugtesten um weniger als 0,1 μm bei einer Messung im trockenen Zustand.
Nach einem weiteren Aspekt gibt die vorliegende Erfindung Verfahren für die Herstellung von Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel auf aktiven elektronischen Matrixchip-Vorrichtungen durch in-situ-Polymerisation an. Diese Methoden umfassen allgemein
Einbringen eines geeigneten Volumens eines Polymerisationsgemischs, das polymerisierbare Monomere, ein Vernetzungsmittel und ein Porogen enthält, in einen Formhohlraum einer Mikroform, wobei der Formhohlraum einen Boden und mindestens eine Seite aufweist;
Inkontaktbringen eines Trägers, der eine Vielzahl von Elektroden auf dem Träger aufweist, mit der Form, um ein geschlossenes Volumen des Polymerisationsgemischs zu erzeugen, wobei sich das geschlossene Volumen mit mindestens einer der Elektroden auf dem Träger im Kontakt befindet;
Polymerisieren des Polymerisationsgemischs; und
Entfernen der Mikroform, um
die Permeationsschicht aus polymerisiertem, mesostrukturiertem, synthetischem Hydrogel, die über mindestens einer Elektrode auf dem Träger liegt, freizulegen. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Porogen ein als Templat wirkendes Porogen, wie z.B. ein micellbildendes Porogen, ein festes als Templat wirkendes Porogen, oder ein flüssiges als Templat wirkendes Porogen. Noch bevorzugter ist das als Templat wirkende Porogen ein micellbildender grenzflächenaktiver Stoff, am bevorzugtesten ein nichtionischer oder zwitterionischer grenzflächenaktiver Stoff, der eine aliphatische Kohlenstoffkette und einen Polyether umfasst, wie z.B. die Brij-Tenside. In Ausführungsformen, in denen eine als Templat wirkendes Porogen verwendet wird, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise einen zusätzlichen Schritt, in dem das als Templat wirkende Porogen selektiv mit einem Lösemittel entfernt wird. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist das als Templat wirkende Porogen ein micellbildender grenzflächenaktiver Stoff, und das Verfahren umfasst weiter hin die selektive Entfernung des grenzflächenaktiven Stoffs mit Wasser.
In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens zur Herstellung von Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogelumfasst das Polymerisationsgemisch Acryloyl- oder Acrylamidomonomere, am bevorzugtesten ein Acrylamid-Monomer, wie Methacrylamid. Zusätzlich enthält nach bevorzugten Ausführungsformen das Polymerisationsgemisch ein polymerisierbares Vernetzungsmittel, (z.B. Methylenbisacrylamid, wenn das Monomer ein Acrylamid ist). In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Polymerisationsgemisch einen freie Radikale bildenden Polymerisationsinitiator. In noch bevorzugteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem freie Radikale bildenden Initiator um einen Photoinitiator, der Boden der Mikroform ist durchlässig für eine Strahlung mit einer Wellenlänge, die den Photoinitiator aktiviert, und der Polymerisationsschritt umfasst die Bestrahlung der Form mit einer Strahlung mit der Wellenlänge, die für die Aktivierung des Photoinitiators geeignet ist.
Nach anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße aktive elektronische Matrixvorrichtung mit der Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel mit derivatisierten Biomolekülen elektronisch adressiert, um eine adressierte Vorrichtung mit Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel mit spezifischen Bindungseinheiten zu produzieren, die an einer oder mehreren Mikrostellen der Vorrichtung befestigt sind. In einigen bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den Biomolekülen um Nucleinsäuren, z.B. Nucleinsäuresonden oder Proben aus Nucleinsäuren. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Biomoleküle Peptide, Polypeptide oder Proteine (wie Antikörper).
Nach anderen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße Vorrichtung mit Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel in einem Assay oder einer Reaktion auf Nucleinsäurebasis verwendet. Beispielhafte Assays und Reaktionen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein: Hybridisierungsassay-Formate (zum Beispiel Dot-Blot-Assay-Formate, Reverse-Dot-Blot-Assay-Formate, Nucleinsäure-Sandwich-Assay-Formate, durch "Base Stacking" stabilisierte Hybridisierungsassay-Formate), mit oder ohne elektronische Stringenz und/oder elektronisches Waschen, "Primer-Extensions-Reporting"-Assays (zum Beispiel Genexpressionsanalyse mit "Primer-Extensions-Reporting"), Amplifikationsreaktionen mit immobilisierter Nucleinsäure (zum Beispiel Strangverschiebungsamplifikation, Amplifikation mit ligationsabhängiger Strangverschiebung, Amplifikation in einer Polymerasekettenreaktion, transkriptionsvermittelte Amplifikation oder Amplifikation auf der Basis der Nucleinsäuresequenz, Amplifikation durch "rolling circle"), Ligationsreaktionen und Nucleinsäurespaltungsreaktionen (zum Beispiel Restriktionsendonucleasereaktionen, Endonucleasereaktionen und Exonucleasereaktionen). Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel in Anwendungen zur Nucleinsäure- oder Polypeptidsynthese verwendet werden, wie dies für APEX-Vorrichtungen beschrieben worden ist.
Nach zusätzlichen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße Vorrichtung mit Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel in einem Assay auf Immunchemiebasis verwendet. Beispielhafte Assay-Formate schließen, ohne hierauf eingeschränkt zu sein, ein: Adressierung der Mikrostellen der Vorrichtung mit Antigenen (z.B. Peptiden, Proteinen, Kohlenwasserstoffen, Lipiden, Proteoglykanen, Glykoproteinen, etc.), um auf Antikörper in einer Körperflüssigkeitsprobe zu untersuchen durch Sandwich- Assay, kompetitiven Assay oder andere Formate; und Adressieren der Mikrostellen der Vorrichtung mit Antikörpern, um Antigene in einer Probe durch Sandwich-Assay, kompetitiven Assay oder andere Assay-Formate nachzuweisen.
Zusammenfassend wird nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Einheit bereitgestellt, die umfasst: eine Elektrode auf einem Träger; und eine Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel, die auf der Elektrode liegt, wobei die Permeationsschicht Mesoporen aufweist, die eine Porengröße im Bereich von etwa 100 nm bis 1000 nm haben.
Nach dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung ein Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel, die auf einer Elektrode auf einem Träger liegt, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst: a) Einbringen eines geeigneten Volumens eines Polymerisationsgemischs, das polymerisierbare Monomere, ein Vernetzungsmittel und ein Porogen enthält, das imstande ist, Mesoporen zu erzeugen, in einen Formhohlraum einer Mikroform, wobei der Formhohlraum einen Boden und mindestens eine Seite aufweist; b) Inkontaktbringen eines Trägers, der eine Vielzahl von Elektroden auf dem Träger aufweist, mit der Form, um ein geschlossenes Volumen des Polymerisationsgemischs zu erzeugen, wobei sich das geschlossene Volumen mit mindestens einer der Elektroden auf dem Träger im Kontakt befindet; c) Polymerisieren des Polymerisationsgemischs unter Ausbildung einer Permeationsschicht aus einem mesostrukturierten, synthetischen, polymeren Hydrogel; und d) Entfernen der Mikroform.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Fotografie der Elektronik einer NanoChip^®-100-Site-Vorrichtung, die Elektroden mit einem Elektrodendurchmesser von 80 μm und einem Mitte-Mitte-Abstand von 200 μm aufweist. Die individuell steuerbaren Elektroden definierten die aktiven Stellen der Vorrichtung.
Die gezeigten Elektroden sind eine Schicht aus Platin (ein nichtreaktives Edelmetall), die auf einer Schicht aus Titan/Wolfram ausgebildet ist, die auf einer Schicht aus einem Siliciumdioxid-Träger ausgebildet ist. Es wird darauf hingewiesen, dass die leitfähige Schicht der Elektroden von einer Schicht aus isolierendem Siliciumdioxid bedeckt ist, die weggeätzt wird, um die aufgebrachten Elektrodenfelder freizulegen. Es wird ferner auf den Ring von Gegenelektroden hingewiesen, der das zentrale 10 × 10-Array umgibt, an den eine entgegengesetzte Spannung angelegt werden kann, so dass alle Mikrostellenelektroden in einem (+)- oder (–)-Spannungszustand verwendet werden können.
2: Eine Stereomikroskop-Dunkelfeld-Fotografie des gleichen Vorrichtungstyps, mit einer mesoporösen Permeationsschicht. Die Permeationsschicht wurde mit Hilfe einer Mikroform auf die Vorrichtung aufgebracht.
3: Ein Reaktionsschema, das die Herstellung von zwei derivatisierten Streptavidin(SA)-Proteinen für die Copolymerisation mit Acrylamidhydrogelen zeigt. Die Umsetzung von SA mit N-Acryloxysuccinimid liefert Acrylamidgruppen, während die Umsetzung von SA mit dem Acryloyl-PEG-N- hydroxysuccinimidylester ein SA mit über PEG-Ester angebundenen Acrylatgruppen liefert. Über Ester angebundene SA-Derivate sind für die Verwendung in Hydrogelformulierungen weniger bevorzugt wegen ihrer geringeren Stabilität über einen größeren pH-Bereich. Ähnlich sind chemische Befestigungsgruppen, die nicht basen- oder säurelabil sind, im Allgemeinen bevorzugter, aber nicht erforderlich für die Verwendung in den synthetischen, polymeren Hydrogelen der Permeationsschichtformulierungen. Beispielsweise kann N-Acryloxysuccinimid als eine Befestigungsgruppe für die Copolymerisation verwendet werden, falls ein Amin, Hydrazid o. dgl. als chemische Gruppe verwendet wird, um z.B. eine Nucleinsäuresonde oder ein Amplikon kovalent an die Permeationsschicht der Vorrichtung zu binden.
4: Ein Reaktionsschema, das die Copolymerisation eines Acryloyl-PEG-SA-Derivats mit Acrylamid in Gegenwart von Brij-Micellen zeigt, um ein mesoporöses, Acrylamid-vernetztes Hydrogel, das mit SA-Befestigungsgruppen imprägniert ist, zu bilden. Es wird darauf hingewiesen, dass, wenn die Polymerisation oberhalb einer aktiven elektronischen Arrayvorrichtung auf einer Oberfläche stattfindet, die mit einem Linker aus einem Silanderivat (wie Bind Silane^TM, auch 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan) aktiviert wurde, die polymere Hydrogelmatrix durch den Einbau der Linkergruppe in das Polymer kovalent mit der Oberfläche der Vorrichtung verbunden wird.
5A und B: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Oberfläche einer geformten, physikalisch homogenen Permeationsschicht aus homogenem nanoporösem Polyac rylamidhydrogel (4012-1) auf einer Vorrichtung. Kein als Templat wirkendes Mittel (Brij-Tensid) wurde in dieser Formulierung verwendet. Die Oberfläche des Gels erscheint relativ glatt im 5000-fach-Scan (5A), Maßstab 5,00 μm. Die Oberfläche zeigt im 45000-fach-Scan (5B), Maßstabsbalken 500 nm, nur Poren im Nanometermaßstab. Dies stimmt mit der geschätzten Porengröße in homogen polymerisierten Acrylamidhydrogelen überein, über die an anderer Stelle berichtet wurde. Diese Poren, Größe unterhalb von 100 nm, werden hier als "Klasse I-Poren" bezeichnet.
6A und B: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Oberfläche einer geformten, physikalisch heterogenen Permeationsschicht aus mesoporösem Polyacrylamidhydrogel (4012-2) auf einer Vorrichtung. 11 mg/ml als Templat wirkendes Mittel (Brij 700 Tensid) wurden in dieser Formulierung verwendet. Die Oberfläche des Gels erscheint im 5000-fach-Scan (6A), Maßstabsbalken 5,00 μm, körnig. Die Oberfläche zeigt im 50000-fach-Scan (6B), Maßstabsbalken 500 nm, Poren im 100-500 nm-Maßstab. Diese Poren mit einer Größe im Bereich von etwa 100 nm bis etwa 500 nm werden hier als "Klasse II-Poren bezeichnet.
7A und B: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Oberfläche einer geformten, physikalisch heterogenen Permeationsschicht aus mesoporösem/mikroporösem Polyacrylamidhydrogel (4012-3) auf einer Vorrichtung. 18 mg/ml als Templat wirkendes Mittel (Brij 700 Tensid) wurden in dieser Formulierung verwendet. Die Oberfläche des Gels erscheint in dem 5000-fach-Scan (7A), Maß stabsbalken 5,00 μm, körnig und zerfurcht. Poren im Mikrometermaßstab sind bei dieser Vergrößerung sichtbar. Diese Poren, von etwa 500 nm bis etwa 2,00 μm, werden hier als "Klasse III-Poren bezeichnet. Die Oberfläche zeigt Klasse II-Poren im 50000-fach-Scan (7B), Maßstabsbalken 500 nm.
8A und B: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Oberfläche einer geformten, physikalisch heterogenen Permeationsschicht aus mesoporösem/mikroporösem Polyacrylamidhydrogel (4006-1) auf einer Vorrichtung. 73 mg/ml als Templat wirkendes Mittel (Brij 700 Tensid) wurden in dieser Formulierung verwendet. Die Oberfläche des Gels erscheint in dem 5000-fach-Scan (8A), Maßstabsbalken 5,00 μm, körnig und zerfurcht und zeigt Klasse III-Poren. Die Oberfläche zeigt Klasse II-Poren im 50000-fach-Scan (8B), Maßstabsbalken 500 nm.
9: Eine Dunkelfeldmikroskopfotografie (Leica iNM 100 mit einer Optromics^TM Videokamera) einer einzelnen Mikrostelle oder eines Feldes einer Vorrichtung, wie derjenigen, die verwendet werden, um die Lichtstreuwerte für die Berechnung von θ zu ermitteln. Der Durchmesser des Feldes beträgt 80 μm.
10: Diagramm, das die θ-Messungen für mehrere Chargen von 4006-1-Permeationsschichten, die auf NanoChip^®-Vorrichtungen ausgebildet sind, zeigt. Die θ-Porositätsmessung ist sehr gleichmäßig über zwanzig verschiedene Chargen (Mittelwert 3,63 θ, Std. ± 0,07 θ). Diese Daten zeigen, dass die Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel gleichmäßig auf aktiven elektro nischen Matrixvorrichtungen geformt werden können. Gleichermaßen wird auch die Konsistenz der Lichtstreumesstechnik bestätigt.
11: Ein Diagramm, das Mittelwerte der Fluoreszenzintensitätsmessung (MFI) für den SNP1-Assay, der in Beispiel 4 beschrieben wird, zeigt, durchgeführt an drei aktiven elektronischen Matrixchip-Vorrichtungen mit 4006-1 Permeationsschichten, und die Ergebnisse des gleichen Assays, durchgeführt mit einem Standard-SA-Agarose-Permeationsschicht-Chip. Es wird darauf hingewiesen, dass die Fluoreszenzintensitätsmesswerte auf den 4006-1-Chips im Allgemeinen bei höheren Werte liegen als diejenigen auf dem SA-Agarose-Chip, und dass beide Allel-Sonden (C-Allel-Cy-3 und T-Allel-Cy-5) gute Messwerte liefern, was die leichte Identifizierung heterozygoter Amplikongemische ermöglicht.
12: Ein Diagramm, das die MFI-Messwerte von zwei Experimenten zur Immobilisierung von Nucleinsäuren zeigt, die in Beispiel 5 beschrieben werden. Die Ergebnisse des 46 nt-Oligomerimmobilisierungsexperiments werden durch Rauten (✦) angegeben, die Ergebnisse des 114 nt-Amplikonimmobilisierungsexperiments werden durch Quadrate (
) angegeben. Es wird darauf hingewiesen, dass die relative Bindungseffizienz der größeren Nucleinsäure signifikant mit vergrößerter Porosität zunimmt, während die Bindungseffizienz der kleinen Nucleinsäure ganz geringfügig mit vergrößerter Porosität abnimmt.
13: Ein Diagramm, das die MFI-Messwerte von Primer-Extensions-Assay-Experimenten zeigt, die in Beispiel 6 be schrieben werden, in denen Probenamplikons mit einer Konzentration von 0,5 nM, 1,0 nM, 2,0 nM, 4,0 nM, 8,0 nM und 16,0 nM auf viele Stellen auf Chips mit Permeationsschichten aus den Formulierungen 4012-1, 4012-2, 4012-3 oder 4006-1 adressiert wurden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Fluoreszenzintensität nicht in linearer Weise mit zunehmender Nucleinsäurekonzentration auf dem Chip mit nanoporöser Permeationsschicht 4012-1 (✦) zunimmt, aber in linearer Weise auf den Chips mit mesoporöser Permeationsschicht 4012-2 (
), 4012-3 (
) und 4006-1 (•) zunimmt.
14: Ein Diagramm, das θ-Messungen an Permeationsschichten aus synthetischem, polymerem Hydrogel zeigt, die unter Verwendung verschiedener Mengen an Brij 700-Tensid als Templat-Porogen hergestellt wurden.
15: Schematische Zeichnung des Mikroformungsprozesses. Mit einer Mikroform startend, die einen Boden aufweist, der durchlässig für eine Lichtwellenlänge (hν) ist, wird in Schritt 1 ein Tropfen eines Polymerisationsgemischs in die Form eingebracht. In Schritt 2 wird der Träger des aktiven elektronischen Matrixchips mit dem Gemisch und der Form in Kontakt gebracht, wodurch ein geschlossenes Volumen des Polymerisationsgemischs gebildet wird. In Schritt 3 wird das Gemisch durch Bestrahlen der Form mit einer Lichtwellenlänge, die für die Initiierung der Polymerisation geeignet ist, polymerisiert. In Schritt 4 wird der Träger entfernt, zusammen mit der gerade erzeugten Permeationsschicht über den Elektroden, was es ermöglicht, den Vorgang erneut mit einem neuen aktiven elektronischen Matrixchipträger in Schritt 5 zu starten.
DETAILLIERTE BESCHICHTUNG DER ERFINDUNG
Wie beschrieben worden ist, hat die ionendurchlässige Permeationsschicht, die auf den Elektroden der Mikrostellen, oder aktiven Stellen, der aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen liegt, eine Schlüsselrolle bei der Funktion dieser Vorrichtungen. Als Teil ihrer Funktion liefert die Permeationsschicht Befestigungsgruppen für die Befestigung und Immobilisierung von Nucleinsäuren (oder anderer spezifischer Bindungseinheiten, wie Antikörper, oder synthetischer Bindungseinheiten, wie Pyranosyl-RNA). Noch wichtiger ist, dass die Permeationsschicht die befestigten oder angebundenen Oligonucleotide und hybridisierten Ziel-DNA-Sequenzen von der hoch reaktiven elektrochemischen Umgebung trennt, die unmittelbar an der Elektrodenoberfläche erzeugt wird. Diese hoch reaktive Elektrodenoberfläche und die an der Elektrodenoberfläche aufkonzentrierten elektrochemischen Produkte können DNA-Sonden und Ziel-DNA-Sequenzen schnell zerstören, die mit der Oberfläche in Kontakt treten oder die ihr zu nahe kommen. Ähnliche nachteilige Effekte können mit anderen makromolekularen Bindungseinheiten, die direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert werden, angetroffen werden. Die Permeationsschicht ermöglicht es Oligonucleotiden und DNA-Fragmenten, oberhalb der Elektrodenoberfläche anstatt auf der Elektrodenoberfläche elektronisch aufkonzentriert zu werden und mit verankerten komplementären Oligonucleotiden zu hybridisieren, während sie dabei vor der reaktiven Elektrodenoberfläche und ihrer unmittelbaren Umgebung geschützt werden. Die Permeationsschicht ermöglicht auch die allmähliche Diffusion der elektrochemischen Reaktionsprodukte (H⁺, OH^–, Gase, etc.) in die Lösung in der Umgebung der Mikrostellen, was es diesen Produkten ermöglicht, die Ladung durch die Permeationsschicht hindurch durch Ionenaustausch auszugleichen und mit Pufferchemikalien zu reagieren. Demnach ermöglicht das Design der Mikroelektrode und der Permeationsschicht, die eine Mikrostellenstruktur bilden, hohe Stromdichten in einem sehr begrenzten Gebiet, während die schädlichen Effekte, die durch die Elektrode selbst hervorgerufen werden, minimiert werden.
Sobald spezifische Bindungseinheiten, wie Nucleinsäuren, auf die Mikrostellen adressiert und dort immobilisiert worden sind, sind die adressierten Vorrichtungen imstande, eine Vielzahl von Assays und Reaktionen zu steuern und aktiv durchzuführen. Analyte oder Reaktanden können durch Elektrophorese in einem freien Feld an jede beliebige Mikrostelle transportiert werden, wo die Analyte oder Reaktanden effizient aufkonzentriert werden und mit der spezifischen Bindungseinheit an der Mikrostelle reagieren. Die Empfindlichkeit, mit der ein spezifischer Analyt oder Reaktand in verdünnten Probelösungen nachgewiesen wird, wird durch dieses Aufkonzentrieren verbessert. Ein zusätzlicher Vorteil, der auch die Spezifität der Assays verbessert, die auf der Vorrichtung durchgeführt werden, besteht darin, das ungebundene Analyte oder Reaktanden entfernt werden können, indem die Polarität einer Mikrostelle gewechselt wird (auch bekannt als "elektronisches Waschen").
Die Fähigkeit, eine genau kontrollierte hohe Stromstärke oder Stromdichte an einzelnen Mikrostellen einzustellen, erlaubt sogar die selektive "Dehybridisierung" von DNA-Fragmenten, womit eine Selektivität der Hybridisierung im Bereich einzelner unpassender Basenpaarungen erzielt wird. Demnach kann die Vorrichtung die Spezifität von Assays und Reaktionen weiter verbessern, indem ein weiterer Parameter zur Verfügung gestellt wird, durch den die Dehybridisierung unpassender Basenpaarungen gefördert wird (zusammen mit den herkömmlicheren Parametern wie Temperatur und chemische Umgebung), was als "elektronische Stringenz" oder "elektronische Stringenz-Kontrolle (ESC)" bekannt ist. Für DNA-Hybridisierungsreak tionen, die unterschiedliche Stringenzbedingungen benötigen, können die inhärenten Grenzen herkömmlicher Arraytechnologien durch ESC überwunden werden, die auf Stringenzbedingungen angewiesen sind, die für alle Stellen auf dem gesamten Array gleich sind. Die erfindungsgemäßen aktiven Vorrichtungen können auf elektronischem Weg verschiedene Stringenzbedingungen an jeder Mikrostelle erzeugen. Hierdurch wird den herkömmlicheren Faktoren, wie Temperatur, Salzkonzentration und Vorhandensein chaotroper Mittel, ein weitere steuerbarer Faktor zur Beeinflussung der Hybridisierung hinzugefügt. Somit können alle Hybridisierungen in der gleichen Volumenlösung optimal durchgeführt werden, und eine Vielzahl von Hybridisierungsreaktionen kann mit minimalen physikalischen Eingriffen von außen durchgeführt werden. Zusätzlich kann es unnötig sein, in einigen Fällen die Temperatur zu ändern, und die Notwendigkeit für mehrfache Waschschritte wird deutlich reduziert.
Die Permeationsschicht der aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen ist demnach mehr als einfach nur ein mechanischer Träger, auf dem Befestigungsstellen für spezifische Bindungseinheiten gehalten werden. Sie ist auch ein wichtiger Faktor für die gesamte Leistungsfähigkeit und Effizienz der Vorrichtungen in ihren aktiven elektronischen Betriebszuständen. Anders als Überzüge oder Gelträger, die für passive Arrayvorrichtungen beschrieben worden sind, z.B. die Gelblock-Arrays, die in dem US-Patent 5,770,721 beschrieben werden, in denen einfach Hydrogelmatrices als Befestigungsgerüst verwendet werden, müssen die Permeationsschichten, die auf den hier beschriebenen aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen verwendet werden, auch den effizienten aktiven elektronischen Transport von Biomolekülen zu den Mikrostellen der Vorrichtung ermöglichen, und sie müssen förderlich für elektronische Hybridisierungs- und/oder Stringenzverfahren sein.
Wie oben angegeben wurde, haben sich Agarosehydrogele, die glyoxalvernetztes Streptavidin enthalten, als effiziente Permeationsschichtmaterialien auf aktiven elektronischen Matrixchip-Vorrichtungen erwiesen. Im Allgemeinen haben diese Permeationsschichtformulierungen gute mittlere Fluoreszenzwerte mit minimalem Untergrund geliefert. SNP-Assays, die auf SA-Agarosechips ausgeführt wurden, haben eine nahezu 100%ige Genauigkeit in mehreren Testläufen mit echten Genomproben gezeigt, zusammen mit einem hohen Unterscheidungsverhältnis bei der Unterscheidung zwischen Allelen sowohl in homozygoten als auch heterozygoten Proben. Außerdem wurden in STR-Assays und Assays zur Genexpressionsanalyse bei der Verwendung von aktiven elektronischen SA-Agarosematrixchips sehr gute Ergebnisse erzielt.
Wie jedoch oben beschrieben wurde, gibt es bei der Verwendung von SA-Agarose als Permeationsschicht verschiedene Nachteile im Zusammenhang mit der Herstellung. Agarose ist ein physikalisches Hydrogel, das seine halbfeste Struktur von nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen langen Polysaccharidketten erhält. Da diese Wechselwirkungen temperaturabhängig sind, ändern Temperaturänderungen die Viskosität der Agarose-Lösung: bei höheren Temperaturen ist die Lösung flüssiger, während sie bei Raumtemperatur ein verfestigtes Geld bildet. Um die Agarose-Permeationsschicht auf das aktive elektronische Matrixchipelektrodenarray aufzubringen, muss die Agaroselösung während des Herstellungsverfahrens bei einer relativ hohen und konstanten Temperatur gehalten werden. Diese Temperatur muss außerdem mit der Erhaltung der Aktivität des Streptavidins, das durch Vernetzung an die Agarose in der Lösung gebunden ist, in ein Gleichgewicht gebracht werden, das denaturieren kann, wenn die Temperatur zu hoch ist. Das gegenwärtig verwendete Herstellungsverfahren besteht darin, die Agarose-Lösung durch Schleuderbeschichtung auf die Oberfläche des aktiven elektronischen Mat rixchips aufzubringen. Die Verfahren zur Herstellung der Agarosepermeationsschicht tragen daher beträchtlich zum Verbrauch der Geldmittel bei der Herstellung der Vorrichtung bei.
Obwohl dieses Verfahren zu einer ziemlich einheitlichen Dicke führt, kommt es oft zu Schwankungen der Dicke im Submikrometerbereich, wenn die Dicke der Permeationsschicht über Mikrostellen an verschiedenen Orten auf dem Chip verglichen wird. Zusätzlich kann dadurch, dass Agarose ein Naturprodukt ist, von Charge zu Charge eine Variabilität hinsichtlich ihrer chemischen Eigenschaften und ihrer Leistungsfähigkeit als Permeationsschicht auftreten. Diese Variabilität sowohl bezüglich des Materials als infolge des Herstellungsverfahrens verringert die Zahl der aktiven elektronischen Matrixchips, die die Normen der Qualitätskontrolle erfüllen, wodurch ebenfalls die finanziellen Mittel erhöht werden, die erforderlich sind, um aktive elektronische Matrixchips hoher Qualität mit Permeationsschichten auf Agarosebasis zu erzeugen.
Im Gegensatz zu den physikalischen Hydrogelen natürlicher Herkunft, wie Agarose, bieten synthetische polymere chemische Hydrogele eine leichter kontrollierbare Qualität und leichter kontrollierbare Herstellungscharakteristika. Synthetische polymere Hydrogele werden aus einzelnen monomeren Bestandteilen hergestellt, die üblicherweise selbst aus organisch-chemischen Grundbestandteilen synthetisiert werden. Die Monomere können bis zum Erhalt einer sehr hohen Qualität gereinigt werden, mit identischen physikalischen und chemischen Eigenschaften von Herstellungscharge zu Herstellungscharge. Die monomeren Bestandteile können in verschiedenen Formulierungen mit Vernetzungsmittelgruppen vermischt werden und durch einen getriggerten Initiator (z.B. indem ein Photoinitiator UV-Strahlung ausgesetzt wird) polymerisiert werden. Chemische Hydrogele bieten demnach eine strenge Kontrolle über die Polymerisations geschwindigkeit und die Eigenschaften des resultierenden Hydrogels, verglichen mit der Kontrolle, die physikalische Hydrogele bieten, die aus präpolymerisierten Ketten erzeugt werden.
Zusätzlich bieten synthetische polymere Hydrogele viele Vorteile für die Massenproduktion. Die können leicht in situ auf der Oberfläche des Mikroelektrodenarrays mit einem hohen Maß an Gleichmäßigkeit über die gesamte Vorrichtung geformt werden. Mikroreaktionsformen und Verfahren, die diese verwenden, um dünne, gleichmäßige synthetische polymere Hydrogelschichten auf der Oberfläche aktiver elektronischer Matrixchips zu erzeugen, wurden in dem Dokument WO 01/43938, Havens et al, beschrieben, das hier durch die Bezugnahme in seinem vollen Umfang aufgenommen wird. Die offenbarten Mikroreaktionsformen umfassen einen Formhohlraum mit mindestens einer Seite, die durchlässig für die Wellenlänge einer elektromagnetischen Strahlung ist. In diese Systeme wird ein kleines Volumen des Polymerisationsgemischs (Monomere, Vernetzungsmittel, und Photoaktivator) in den Formhohlraum eingefüllt. Der Mikroelektrodenarrayträger wird dann gegen die Form gepresst, wodurch ein geschlossenes Volumen des Polymerisationsgemischs auf dem Träger erzeugt wird. Die Polymerisationsreaktion wird durch Bestrahlen des geschlossenes Volumen mit einer für den Photoinitiator geeigneten Lichtwellenlänge (z.B. UV-Licht) gestartet, und man lässt die Polymerisationsreaktion bis zur Beendigung der Polymerisation ablaufen. Nach dem Entfernen der Form ist eine dünne, gleichmäßige Permeationsschicht aus synthetischem polymerem Hydrogel auf dem Mikroelektrodenarray ausgebildet.
Permeationsschichten, die 1 bis 2 μm dick sind, mit Dickeschwankungen im Submikrometerbereich können auf diese Weise problemlos hergestellt werden, und können an eine Herstellung mit einem hohen Durchsatz angepasst werden. Permeationsschichten aus meh reren Schichten (entweder übereinander geschichtet oder durch Pfropfpolymerisation auf die vorherigen Schichten aufgebracht) können ebenfalls auf diese Weise hergestellt werden, indem eine Reihe von Formen mit verschiedenen Tiefen und/oder Breiten verwendet wird. Zusätzlich können die Formen so gestaltet werden, dass individuelle Permeationsschichten über jeder einzelnen Mikroelektrode ausgebildet werden, wodurch individuell geformte Mikrostellen erzeugt werden. Auf diese Weise ist es sogar möglich, die Zusammensetzung der Permeationsschicht von Mikrostelle zu Mikrostelle über dem Array des aktiven elektronischen Matrixchips zu variieren.
In Anbetracht der Vorteile einer Verwendung von Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel wurden verschiedene Formulierungen für synthetische polymere Hydrogele zur Verwendung als Materialien für die Permeationsschicht getestet. Anfänglich wurden Polyacrylamidgele, die an der Oberfläche mit SA derivatisiert waren, getestet. Die nanoporösen Standard-Polyacrylamidformulierungen, die verwendet wurde, ergaben jedoch keine Permeationsschichten, die für Fluoreszenzintensität, Signallinearität und andere Leistungsmerkmale sorgten, die vergleichbar mit den Merkmalen waren, die bei Verwendung von Permeationsschichten aus physikalischem Agarose-SA-Hydrogel erhalten werden. Daher wurden alternative Formulierungen erforscht, die die physikalischen Eigenschaften der chemischen Hydrogelmatrix aus Polyacrylamid ändern könnten.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Polyacrylamid-Hydrogel mit definierten Eigenschaften hinsichtlich der Porosität in allen getesteten Nucleinsäureassayformaten dramatisch besser funktionierten als Permeationsschichten aus synthetischem, polymerem Hydrogel mit einer Porengröße, die kleiner war als der definierte Bereich. Diese Permeationsschichten besitzen Poren mit einer Größe in einem mittleren Größenbereich von etwa 100 nm bis etwa 1000 nm. Daher wurden diese Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel als "mesoporös" bezeichnet, im Gegensatz zum Vorhandensein von Poren im Nanometerbereich ("nanoporös") oder Poren im Mikrometerbereich ("mikroporös"). Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel zeigen auch einen makroskopischen Unterschied gegenüber nanoporösen Permeationsschichten, was in 2 gezeigt wird. Anstelle eines klaren Gels erscheinen Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel milchig oder durchscheinend auf Grund der Streuung von Licht durch die Schicht, was durch die Trennung der Gelphase und der Lösungsphase verursacht wird. Dieser Lichtstreueffekt, den man auch in der Dunkelfeldmikroskop-Fotografie in 9 sieht, bildet die Grundlage für die Porositätsmessung θ, die weiter unten und in Beispiel 3 diskutiert wird.
Die kennzeichnenden Merkmale einer erhöhten Porosität synthetischen polymeren Hydrogelformulierungen wurden weitergehend unter Verwendung eines als Templat wirkenden Porogens charakterisiert, um unterschiedliche Porositäten oder eine Phasentrennung in die synthetischen polymeren Hydrogele einzuführen. Da das Hydrogel in der wässrigen Lösung ein Netzwerk von Polymersträngen aufweist, kann es als ein Zweiphasensystem betrachtet werden: das Netzwerk, oder die feste Phase, und die umgebende Lösungsphase. Wenn das Netzwerk aufgetrennt wird, um Poren zu erzeugen (oder Bereiche, in denen das Netzwerk nicht ist), werden die Phasen stärker voneinander getrennt, wodurch größere und deutlichere Poren/Hohlraum-Bereiche erzeugt werden. Durch die Verwendung eines micellbildenden grenzflächenaktiven Stoffs, Brij 700, konnte das Ausmaß der Phasentrennung gesteuert werden, indem die Konzentration des grenzflächenaktiven Stoffs in der Polymerisationslösung variiert wur de, wodurch die Verbreitung und die mittlere Größe der Micellen variiert wurde.
Wie in Beispiel 1 beschrieben wurden vier Permeationsschichtformulierungen mit verschiedenem Ausmaß der Phasentrennung verwendet, um aktive elektronische Matrixchipvorrichtungen zu produzieren, die der Gegenstand der Mehrzahl der Experimente waren: 4012-1, mit 0 mg/ml Brij 700 [kein Porogen – ein chemisches Acrylamid/Bisacrylamid-Basishydrogel mit copolymerisierten Streptavidin-Befestigungsgruppen]; 4012-2, mit 11 mg/ml Brij 700; 4012-3, mit 18 mg/ml Brij 700; und 4006-1, mit 73 mg/ml Brij 700. 4012-2, 4012-3 und 4006-1 werden alle als Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel angesehen. Die Elektronenmikroskopaufnahmen (5A & B, 6A & B, 7A & B und 8A & B) wurden von den Permeationsschichten aufgenommen, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurden. Wie man deutlich an den 45000-fach und 50000-fach Scans der Permeationsschichten erkennen kann, scheint 4012-1 ziemlich glatt zu sein mit Poren im Nanometerbereich. Im Gegensatz hierzu hatten die anderen drei Formulierungen eine ziemlich gleichmäßige, feine Morphologie bei dieser Vergrößerung, die Mesoporen mit einer Porengröße im Bereich von etwa 100 bis etwa 500 nm zeigt. Zusätzlich zeigen 4012-3 und 4006-1 im 5000-fach Scan auch eine mikroporöse Morphologie mit Poren mit einer Porengröße im Bereich von etwa 1 μm bis etwa 2 μm.
Um die Porositätseigenschaften der Permeationsschichtformulierungen einfacher quantifizieren zu können, wurde die Messung von θ entwickelt, die in Beispiel 3 beschrieben wird, die auf der Lichtstreuungsanalyse im Dunkelfeldmikrosk basiert. Die Standardschicht ist eine Standardzusammensetzung für ein Polyacrylamidhydrogel (Zusammensetzung S):
Acrylamid:Bisacrylamid 19:1 (mol/mol)
Gesamtmonomergehalt 20 Gew.-%
Unter den Beleuchtungsbedingungen, die in den Beispielen verwendet wurden, lag λ_S für die Standardzusammensetzung bei 60 ± 1,5. Durch den Vergleich mit der Standardzusammensetzung S kann die relative Phasentrennung und damit die Porosität der Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel quantifiziert werden. Der θ-Wert von 4012-1 betrug 1,5, während die θ-Werte der mesoporösen Permeationsschichten im Bereich von 3,0 bis 3,5 lagen. Um den Effekt verschiedener Konzentrationen des grenzflächenaktiven Stoffs Brij auf die Porositätsmessung θ sorgfältiger zu charakterisieren, wurden acht Permeationsschichten auf der Basis der 4012-1-Formulierung mit variierenden Konzentrationen des grenzflächenaktiven Stoffs Brij 700 von 3,9 bis 170,4 mg/ml, wie in Beispiel 7 beschrieben, mit der 4012-1-Formulierung verglichen. Die θ-Werte für diese Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel werden in 14 gezeigt. Wie in der Figur gesehen werden kann, ändert sich die Porosität der Permeationsschichten schnell von der 9,3 mg/ml-Formulierung (etwas geringer als bei 4012-2) mit einem θ-Wert von 2 bis zu der 18,6 mg/ml-Formulierung (etwas größer als bei 4012-3) mit einem θ-Wert von etwa 3. Dies deutet auf eine kritische Phasentrennungsänderung bei Verwendung des als Templat wirkenden Porogens aus dem grenzflächenaktiven Stoff Brij bei etwa 10 mg/ml hin: oberhalb dieser Konzentration bewegen sich die θ-Werte im Bereich von 3,0 bis 3,5. Auch wenn die Anmelder durch keine spezielle Theorie gebunden sind, besteht eine Möglichkeit darin, dass es bei den höheren Konzentrationen zu einer Aggregation der Brij-Micellen kommt. Dies könnte das Erscheinen von Mikroporen in den Elektronenmikroskopaufnahmen von 4012-3 erklären. Interessanterweise sorgte die Verwendung einer anderen Streptavidin-Gruppe bei der Copolymerisation für eine erhöhte Porosität, was mit Hilfe des θ-Werts gemessen wurde, was in Beispiel 3 beschrieben wird. Wie in 10 gezeigt führten die Chargen der Permeationsschichten mit der gleichen Formulierung wie 4006-1, mit Ausnahme der Substitution von Amid-verknüpftem Acrylamido-SA durch Ester-PEG-verknüpftes Acryloyl-SA (siehe 3 zum Vergleich) zu Permeationsschichten aus mesoporösem, synthetischem Hydrogel mit θ-Werten mit einem Mittelwert von etwa 3,6. Die Porosität der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel kann demnach durch eine Kombination von Faktoren beeinflusst werden, die das Vorhandensein von Porogenen, den Typ der verwendeten copolymerisierten Befestigungsgruppe und herkömmlichere Parameter wie Mengenanteil des Vernetzungsmittels und Gesamtmonomerkonzentration einschließen.
In zahlreichen Nucleinsäure-Assays, in denen die Techniken der elektronischen Adressierung und der Hybridisierung angewendet werden, zeigten diese Permeationsschichten deutliche Unterschiede hinsichtlich der Funktion. Wie in Beispiel 5 beschrieben und in 12 gezeigt, wurde die Fähigkeit eines relativ großen Polynucleotids (114-mer), durch eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung in den Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel immobilisiert zu werden, im Vergleich zu der Formulierung (4012-1) für die nanoporöse Permationsschicht erhöht. Umgekehrt war die Fähigkeit eines relativ kleinen Oligonucleotids (46-mer), durch eine Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung immobilisiert zu werden, in der nanoporösen Permeationsschicht ausreichend hoch, und sie nahm in der mesoporösen Permeationsschicht leicht ab. Auch wenn die Erfindung an keine spezielle Theorie gebunden ist, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass möglicherweise die erhöhte Wanderungsgeschwindigkeit durch die Schichten mit erhöhter Porosität unter den Bedingungen der elektronischen Adressierung die Möglichkeiten des biotinylierten 46-mers verschlechtern, mit den Streptavidin-Befestigungs gruppen in Wechselwirkung zu treten. Diese Hypothese wurde durch Versuche untermauert, in denen vier Permationsschichten mit dem 46-mer unter passiven Bedingungen inkubiert wurden, unter denen kein Unterschied bei der Immobilisierung gesehen wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Formulierungen mit einem größeren Bereich von Porogenkonzentrationen in den Versuchen gezeigt, die in Beispiel 7 beschrieben und in den 15 und 16 gezeigt werden.
In einem getrennten Satz von Versuchen wurden die vier Permeationsschichten in einem Primer-Extensions-Reporting-Assay-Format verwendet, was in Beispiel 6 beschrieben wird. Diese Versuche zeigen die Fähigkeit der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel, eine linear zunehmende Hybridisierung und den Nachweis durch enzymatisches Primer-Extensions-Reporting unter Verwendung eines Oligonucleotids von mäßiger Größe (etwa 80 nt lang, eine typische Größe für diejenigen, die in Genexpressions-Assays verwendet werden) zu zeigen. Wie in 13 gezeigt wird, verdoppelte sich die Fluoreszenzintensität auf den Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel in etwa für jede zweifache Zunahme der Oligonucleotidkonzentration über einen großen Konzentrationsbereich, während sie auf der nanoporösen Permeationsschicht 4012-1 schnell abflacht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Formulierungen für Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel für eine verbesserte Leistungsfähigkeit bei Anwendungen sorgen, bei denen die quantitative Analyse verwendet wird, wie bei der Überwachung einer Genexpression und der Bestimmung einer Viruslast oder der Konzentration eines Krankheitskeims.
Die Leistungsfähigkeit der Permeationsschichten aus der 4006-1-Formulierung auf aktiven elektronischen Matrixchip-Vorrichtungen wurde mit einem Standard-Agarose-SA-Chip (MSP) in einem SNP- Typ-Base-Staking-Reporting-Assay (SNP1), der in Beispiel 4 beschrieben wird, verglichen. Wie anhand der Daten in 11 gesehen werden kann, ist die mittlere Fluoreszenzintensität auf den 4006-1-Permationsschichten sehr hoch, und sie ist vergleichbar mit den MFI-Messwerten auf dem SA-Agarose-Chip. Zusätzlich zeigen alle Allelsonden ein intensives Signal, was eine deutliche Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Proben ermöglicht. Die Leistungsfähigkeit dieser Permeationsschichtformulierung wurden unter Verwendung von sieben anderen SNPs weiter getestet. Wie durch das Diagramm in Beispiel 4 gezeigt wird, sorgt die Formulierung 4006-1 für die Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel für hervorragende Unterscheidungsquotienten zwischen den Signalen für die Allelsonden und identifizierte alle getesteten SNPs korrekt unter Verwendung von amplifizierten Proben.
Da all diese Versuche auf typischen Typen von Nucleinsäure-Assays, die aktive elektronische Matrixchipvorrichtungen verwenden, basierten, haben sie unmittelbare Auswirkungen auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit einer Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel in ähnlichen Assays auf der Basis einer Nucleinsäurehybridisierung und in Assays auf der Basis von Enzymreaktionen oder DNA-Protein-Wechselwirkungen. Wie die experimentellen Daten zeigen, sorgen die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel für überraschend verbesserte Nachweiseigenschaften und einen verbesserten Dynamikbereich, verglichen mit nanoporösen Formulierungen aus synthetischem polymerem Standardhydrogel, was sie für einen großen Bereich elektronisch unterstützter Nucleinsäureassay-Formate geeignet macht. Da Anwendungen mit synthetischem Bindungssystem, wie die Pyranosyl-RNA-codierende Verwendung, ähnlich große Nucleinsäure-ähnliche Oligomere verwenden, auch wenn sie verschiedene Sekundärstrukturen bilden, weisen die experimentellen Ergebnisse auch darauf hin, dass die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel verbesserte Vorrichtungseigenschaften bei Anwendungen, die synthetische Bindungssysteme verwenden, bieten. Zusätzlich weist die Leistungsfähigkeit der neuen Vorrichtungen mit Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel in Nucleinsäure-Assays, speziell den Assays mit enzymatischer Reaktion, darauf hin, dass sie auch eine verbesserte Leistungsfähigkeit bei Anwendungen auf Proteinbasis, wie Immunoassays, zeigen werden.
STEUERUNG DER POROSITÄT VON PERMEATIONSSCHICHTEN AUS SYNTHETISCHEM POLYMEREM HYDROGEL
Wie weiter oben beschrieben hängen die verbesserten Eigenschaften der erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel vom Vorhandensein von Mesoporen in der Permeationsschicht aus synthetischem polymerem Hydrogel auf den Vorrichtungen ab. Einen Schlüsselschritt bei der Herstellung der Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel stellt daher die Steuerung der Porosität in der polymerisierenden Hydrogelmatrix dar, wenn die Monomere und die Vernetzungsmittel zu einem Polymernetzwerk polymerisiert werden. In der Praxis können unterschiedliche Porositäten auf zwei Wegen erreicht werden: a) Erzeugen einer physikalisch relativ homogenen Hydrogelmatrixstruktur, in der die Zwischenräume in der Polymermatrix von genügendem Abstand sind, um Poren mit der gewünschten Größe zu erzeugen, und b) Erzeugen einer physikalisch relativ homogenen Hydrogelmatrixstruktur, indem die sich entwickelnden Polymerstränge dazu gebracht werden, sich zu dichten Bereichen und leeren Bereichen zusammenzuballen, üblicherweise indem die Matrix um eine entfernbare Templatstruktur mit einer geeigneten Größe gebildet wird. Jede der Strategien kann allein oder in Kombination mit dem anderen Verfahren verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel zu erzeugen.
PHYSIKALISCH HOMOGENE VERFAHREN: POLYMERISATIONSKONTROLLE
Synthetische polymere Hydrogele sind von Natur aus mehr oder weniger porös, da sie primär aus einem Zufallsnetzwerk von vernetzten Polymersträngen und einer wässrigen Lösung, die die Zwischenräume zwischen den Strängen füllen, bestehen. Dieses hydratisierte Netzwerk erzeugt eine halbfeste Struktur, die Porositätseigenschaften aufweist, die primär durch die Polymerisationsbedingungen bestimmt werden, zu denen gehören: Gesamtkonzentration an Monomeren (z.B. individuelle Monomergruppen oder Blockcopolymereinheiten) und beliebige Vernetzungsmittelmoleküle in dem Polymerisationsgemisch, der relative prozentuale Anteil des Vernetzungsmittels (oft ein Molekül mit zwei oder mehr als zwei polymerisierbaren Gruppen) in dem Polymerisationsgemisch, und die Polymerisationsgeschwindigkeit (die durch den Typ, die Konzentration und die Aktivierung eines Initiatormoleküls, die Temperatur der Polymerisationsreaktion und andere bekannte Parameter beeinflusst werden kann).
Der Typ des in den erfindungsgemäßen Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel verwendeten synthetischen polymeren Hydrogels soll nicht auf die chemischen Acrylamid-Hydrogele beschränkt sein, auch wenn Acrylamid/Bisacrylamid-Systeme in den Beispielen als ein beispielhaftes System aus synthetischem polymerem Hydrogel verwendet werden. Im Allgemeinen kann jedes beliebige ausreichend hydrophile und polymerisierbare Molekül bei der Herstellung eines synthetischen polymeren Hydrogels zur Verwendung als Permeationsschicht verwendet werden. Polymerisierbare Gruppen in den Monomeren können einschließen: Al kenylgruppen, eingeschlossen aber nicht darauf eingeschränkt substituierte oder unsubstituierte α,β-ungesättigte Carbonyle, wobei die Doppelbindung unmittelbar an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, das durch eine Doppelbindung mit einem Sauerstoffatom und eine Einfachbindung mit einem anderen Sauerstoff-, einem Stickstoff-, Schwefel-, Halogen- oder Kohlenstoffatom verbunden ist; Vinyl, wobei die Doppelbindung durch eine Einfachbindung an ein Sauerstoff-, Stickstoff-, Halogen-, Phosphor- oder Schwefelatom gebunden ist, Allyl, wobei die Doppelbindung durch eine Einfachbindung mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist, das mit einem Sauerstoff-, Stickstoff-, Halogen- Phosphor- oder Schwefelatom verbunden ist, Homoallyl, wobei die Doppelbindung durch eine Einfachbindung mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist, das durch eine Einfachbindung mit einem weiteren Kohlenstoffatom verbunden ist, das dann durch eine Einfachbindung mit einem Sauerstoff-, Stickstoff, Halogen-, Phosphor- oder Schwefelatom verbunden ist; Alkinylgruppen, in denen es eine Dreifachbindung zwischen zwei Kohlenstoffatomen gibt.
Acryloyl- oder Acrylamidomonomere, wie Acrylate, Methacrylate, Acrylamide, Methacrylamide etc. sind vorteilhaft wegen des großen Wissensumfangs, der sich hinsichtlich der Formulierung von Hydrogelen unter Verwendung dieser Polymere angesammelt hat. Noch bevorzugtere Acrylamidomonomer schließen Acrylamide, N-substituierte Acrylamide, N-substituierte Methacrylamide und Methacrylamid ein. Andere Polymere sind jedoch auch brauchbar, wie Polymere auf Epoxidbasis, Polymere auf Vinylbasis, Polymere auf Allylbasis, Polymere auf Homoallylbasis, Polymere auf der Basis cyclischer Anhydride, Polymere auf Esterbasis, Polymere auf Etherbasis, Polymere auf Alkylenglycolbasis (z.B. Polypropylenglycol), und dergleichen. Die erfindungsgemäßen Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel umfassen demnach zahlreiche synthetische polymere Hydrogelzusammensetzungen, die vom Fachmann auf dem Gebiet der Polymere problemlos ausgewählt werden können. Die ersten Überlegungen bei der Auswahl eines synthetischen polymeren Hydrogels sind ausreichende mechanische Festigkeit für die Verwendung als Permeationsschicht, ausreichende Hydrophilie, um ausreichendes Lösungsvolumen in dem Gel zu gewährleisten, sehr geringe nicht-spezifische Bindung von Biomolekülen, wie Nucleinsäuren, an das polymere Hydrogel, und die Anpassbarkeit des synthetischen polymeren Hydrogels an verschiedene Verfahren für die Herstellung von mesoporösen Strukturen in der Hydrogelmatrix.
Bei der Herstellung des Polymerisationsgemischs ist es möglich, Substanzen in die Permeationsschicht einzuführen, die nachteilige physikalische und chemische Effekte der Elektrolysereaktionen reduzieren, eingeschlossen, aber nicht darauf beschränkt, Substanzen, die die Produkte von Redox-Reaktionen einfangen (z.B. Palladium für H₂, und Eisenkomplexe für O₂ und Peroxide). Eine Subschicht in der Permeationsschicht kann für diesen Zweck vorgesehen werden. Zusätzlich kann die Permeationsschicht Verbindungen oder Materialien enthalten, die dabei helfen, die Stabilität der DNA-Hybride zu erhalten; diese können Histidin, Histidinpeptide, Polyhistidine, Lysin, Lysinpeptide und andere kationische Verbindungen oder Substanzen einschließen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
Für Hydrogele auf Polyacrylamidbasis ist das Verhältnis zwischen den Faktoren der Monomerkonzentration, des prozentualen Anteils an Vernetzungsmittel, den Polymerisationsbedingungen und der Porosität bei der Formulierung von Gelen für die elektrophoretische Trennung durch die Gelmatrix untersucht worden, und der Fachmann schätzt die Möglichkeit, die relative Porosität eines Polyacrylamid-Hydrogels unter Verwendung dieser Parameter zu beeinflussen. Im Allgemeinen führt die Verringerung der Konzentration der Gesamtmonomerkonzentration in dem Polymerisationsgemisch zu einer Erhöhung der Porosität des resultierenden Hydrogels. Die Verringerung der Konzentration erzeugt jedoch ein weniger festes Polyacrylamid-Hydrogel, dem es an einem ausreichenden mechanischen Zusammenhalt fehlt, und die durch dieses Verfahren erzielbare maximale Porengröße scheint etwa 100 nm zu betragen. Alternativ kann der prozentuale Anteil des Vernetzungsmittels erhöht werden, um die Porosität des resultierenden Gels zu vergrößern. Die Erhöhung der Vernetzungsmittelkonzentration führt jedoch zu einem weniger hydrophilen Polymernetzwerk, das gegebenenfalls zusammenbricht und die wässrige Lösung bei höheren Vernetzungsmittelkonzentrationen ausschließt (z.B. etwa 30 % für Methylenbisacrylamid und etwa 50 % für DHEBA). Selbst bei diesen maximalen funktionsfähigen Zusammensetzungen kann die Porengröße nur auf etwa 200-300 nm erhöht werden. Zusätzlich werden hoch vernetzte Polyacrylamidgele zunehmend brüchig, was ebenfalls die mechanische Robustheit dieser synthetischen polymeren Hydrogelformulierungen zur Verwendung als Permeationsschicht verringert. Für die Verwendung verschiedener Lösemittelsysteme wurde ebenfalls gezeigt, dass hierdurch die Porositätseigenschaften der synthetischen polymeren Hydrogele verändert werden. Beispielsweise kann die Zugabe eines weniger polaren Co-Lösemittels, wie DMSO, verwendet werden, um porösere Netzwerke von vernetzten Polymerketten in Polyacrylamidmatrices zu erzeugen.
Zusätzlich haben die Anmelder festgestellt, dass die Verwendung verschiedener copolymerisierbarer Befestigungsgruppen (die weiter unten detaillierter diskutiert werden) einen beträchtlichen Einfluss auf die Gesamtporosität des resultierenden synthetischen polymeren Hydrogels haben kann. Beispielsweise führt in Beispiel 3 der Wechsel von einem SA-PEG-Acryloyl-Molekül zu einem SA-N-Acrylamid-Molekül zu einer Zunahme der Porosität der 4006-1-Formulierung von einem θ von etwa 3,0 zu einem θ von etwa 3,6. Der Austausch im Be reich des copolymerisierten Befestigungsmoleküls in dem Polymerisationsgemisch können demnach auch verwendet werden, um die Porosität des resultierenden synthetischen polymeren Hydrogels zu erhöhen.
Demnach wurden mehrere Techniken entwickelt, die die Basisformulierung des Polymerisationsgemischs betreffen, um die Porosität des Polyacrylamid-Hydrogels zu erhöhen. Es sind jedoch selbst Kombinationen dieser Techniken nur dazu imstande, Poren in Polyacrylamid-Hydrogelen zu erzeugen, die sich am unteren Ende des Mesoporengrößenbereichs befinden. Zusätzlich neigen niedrig konzentrierte Polyacrylamid-Hydrogele mit hohen Konzentrationen an Vernetzungsmittel dazu, mechanisch schwach und brüchig zu sein, und sie können unerwünschte hydrophobe Eigenschaften haben. Diese Materialien können immer noch als Zusammensetzungen für Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel verwendet werden. Aber für die Verwendung als Permeationsschichten ist es bevorzugt, dass ein physikalisch heterogenes Polyacrylamid-Hydrogel verwendet wird, das durch die weiter unten beschriebenen Verfahren erzeugt werden kann.
Der Durchschnittsfachmann ist sich jedoch darüber im klaren, dass diese mechanischen Einschränkungen primär auf Polyacrylamid-Hydrogele zutreffen. Die allgemeinen Prinzipien der Erhöhung der Porosität durch Senkung der Monomerkonzentration und Erhöhung der Vernetzungsmittelkonzentration können auch verwendet werden, um die Porositätseigenschaften anderer polymerer Hydrogele mit weniger nachteiligen Auswirkungen auf die mechanische Festigkeit zu verändern. Wenn also ein Nichtacrylamidpolymer mit einer größeren inneren Festigkeit verwendet wird, kann man eine Zusammensetzung für eine Permeationsschicht aus einem physikalisch homogenen mesopo rösen Hydrogel entwickeln, die dann die gewünschte mechanische Festigkeit hat.
PHYSIKALISCH HETEROGENE VERFAHREN: TEMPLAT-VERWENDUNG UND ANDERE STRATEGIEN
Wegen der Schwierigkeiten beim Erhalt einer Formulierung für eine Permeationsschicht aus mechanisch festem, mesoporösem synthetischem Hydrogel unter Verwendung physikalisch homogener Verfahren mit synthetischem polymerem Hydrogel auf Acrylamidbasis ist es bevorzugt, dass eine physikalisch heterogene Strukturstrategie mit diesem Polymermaterial verwendet wird. Zusätzlich sind diese Strategien im Allgemeinen bevorzugt, um Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, weil sie eine zusätzliche Kontrolle über die Porengröße und die Porenverteilungscharakteristika bieten. Verschiedene Werkzeuge zur Erzeugung der Hohlräume in synthetischen polymeren Hydrogelmatrices sind im Zusammenhang mit elektrophoretischen Trennmaterialien und Gelchromatographiematerialien beschrieben worden, die umfassen: Die Verwendung eines als Templat wirkenden Porogens (z.B. micellbildende Stoffe, feste Mesobeads, flüssige Emulsionen); die Verwendung der seitlichen Aggregation des Polymers, und andere Verfahren, wie zweiphasige copolymerisierbare Systeme.
Im Allgemeinen hat die Verwendung von als Templat wirkenden Porogenen die größte Flexibilität bei der Herstellung synthetischer polymerer Hydrogele mit definierten Porengrößen ermöglicht. Das grundlegende Verfahren ist einfach: 1) ein Templat mit der gewünschten Größe wird in das Polymerisationsgemisch gemischt; 2) Das Gemisch wird dann polymerisiert, wobei das Netzwerk polymerisierter, vernetzter Monomere um das Templat herum entsteht; 3) nach der Polymeri sation wir das Templat selektiv mit einer Lösemittellösung entfernt, wobei das synthetische polymere Hydrogel mit der gewünschten mesoporösen Struktur zurückbleibt. Die ersten Erwägungen bei der Auswahl eines als Templat wirkenden Porogens betrifft demnach die Möglichkeit, das Mittel selektiv in einem Lösemittel zu lösen, das das synthetische polymere Hydrogel während des Auswaschvorgangs nicht wesentlich verändert.
Zahlreiche micellbildende Moleküle sind ideal für die Verwendung als Templat-Porogene, weil sie kugelförmige Strukturen mit einer ziemlich engen Größenverteilung bilden, und sie können üblicherweise unter relativ milden Lösemittelbedingungen extrahiert werden. Die Polymerisationslösung bildet ein Zweiphasensystem mit dem micellbildenden, als Templat wirkenden Mittel: eine "äußere" Phase, die die polymerisierbaren Monomere und Vernetzungsmittel enthält, und eine "innere" Phase, die üblicherweise primär aus den micellbildenden Materialien besteht. Verglichen mit einem einfachen unmischbaren Ernulsionssystem, in dem die Größe der nichtpolymerisierenden Phase weniger kontrolliert ist oder von der Konzentration des grenzflächenaktiven Stoffs abhängt, stellen Micellen eine geordnete flüssige Struktur mit stärker festgelegten Größenparametern dar. Grenzflächenaktive Stoffe sind als micellbildende Templat-Porogene für die Verwendung zur Herstellung von Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel zur Verwendung in der Erfindung besonders bevorzugt. Durch die Auswahl des geeigneten grenzflächenaktiven Stoffs oder Tensids kann der gewünschte Micellengrößenbereich erzeugt werden. Beispielsweise werden Micellen von Nanometergröße leicht durch die Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) erzeugt, während Micellen mit einer Mesogröße unter Verwendung der im Handel erhältlichen nichtionischen grenzflächenaktiven Stoffe auf Polymerbasis, wie den Brij-Reihen, erzeugt werden können. Grenzflächenaktive Brij-Stoffe enthalten eine aliphatische Kohlen stoffkette und eine Polyetherkette. Diese sind vielseitig brauchbare nichtionische grenzflächenaktive Stoffe, die verwendet werden können, um Micellen unterschiedlicher Größen und Größenverteilungen zu erzeugen. Brij 700 wird hier als ein beispielhaftes grenzflächenaktives, als Templat wirkendes Porogen verwendet, aber der Durchschnittsfachmann ist ohne Weiteres imstande, alternative micellbildende, als Templat wirkende Porogene in einer ähnlichen Weise zu verwenden.
Als Templat wirkende Porogene auf der Basis eines grenzflächenaktiven Stoffs haben zwei weitere Vorteile, die von großem Nutzen für die Herstellung der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel auf aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen sind. Erstens können die Größe und die Zahl der erzeugten Poren und damit die Porositätseigenschaften des synthetischen polymeren Hydrogels verändert werden, indem die Konzentration des als Templat wirkenden Porogens aus einem grenzflächenaktiven Stoff in dem Polymerisationsgemisch geändert wird. Wie in 14 gezeigt wird, kann die Porosität eines synthetischen polymeren Polyacrylamid-Hydrogels um ungefähr 1,5 θ verändert werden, indem die Mengen des grenzflächenaktiven Stoffs leicht erhöht werden. Diese Möglichkeit zur Veränderung des θ-Wertes des synthetischen polymeren Hydrogels über einen beträchtlichen Bereich ist nützlich für das Einbringen von Mikroporen in die mesoporöse Struktur, die in Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel bevorzugt sind, die in großen (über 100 nt) Amplikon-Hybridisierungsanwendungen oder in Anwendungen auf der Basis einer Enzymreaktion verwendet werden.
Zweitens sind als Templat wirkende Porogene auf der Basis von grenzflächenaktiven Stoffen in Wasser in gutem Ausmaß löslich, was die Verwendung von einfachem destilliertem Wasser oder von wässrigen Pufferlösungen beim Auswaschen des Templats nach der Polyme risation ermöglicht, wie in den beispielhaften Permeationsschichten. Durch die Vermeidung der Verwendung organischer Lösemittel oder chemisch reaktiverer Zusammensetzungen können die mechanische Festigkeit und die mesostrukturellen Eigenschaften des synthetischen Polymerhydrogels bewahrt werden. Im Gegensatz hierzu erfordert ein nicht wasserlösliches, als Templat wirkendes Porogen üblicherweise härtere Auswaschbedingungen, die die strukturelle Integrität der als Endprodukt erhaltenen Permeationsschicht verändern können.
Anstelle von grenzflächenaktiven Stoffen oder anderen micellbildenden, als Templat wirkenden Porogenen kann ein als Templat wirkendes Porogen vom Typ der festen Kügelchen verwendet werden. Glaskügelchen ("Mesobeads") mit einer Submikron-Mesogröße sind beschrieben worden, die geeignete Porogentemplate darstellen würden. Diese Typen von als Templat wirkenden Porogenen haben den Vorteil einer strikten Kontrolle über die Templat-Größe und die Größenverteilung, da dies einen stabilen physikalischen Parameter der festen Kügelchen darstellt, und die Kügelchen können größensortiert werden, bevor sie in das Polymerisationsgemisch eingebracht werden. Glaskügelchen erfordern jedoch ein Auswaschen aus der synthetischen Polymerhydrogel-Mesostruktur durch Auflösen mit Fluorwasserstoffsäure. In Polyacrylamidgelen hat dieses Verfahren keinen beobachtbaren nachteiligen Effekt auf die Gelstruktur gezeigt. Gegenwärtig werden jedoch Siliciumdioxidschichten in den Trägermaterialien aktiver elektronischer Matrixchipvorrichtungen verwendet, und das Elektrodenarray könnte nachteilig verändert werden, wenn diese Komponenten Fluorwasserstoffsäure ausgesetzt werden. Die Verwendung von Mesobeads aus Glas ist daher gegenwärtig kein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von Vorrichtungen mit einer Permeationsschicht aus einem mesoporösen synthetischen polymeren Hydrogel der vorliegenden Erfindung. Wenn jedoch alternativ nicht ätzbare Materialien (wie Siliciumnitrid) für die Isolierschicht verwendet werden, oder wenn ein Träger auf der Basis eines siliciumfreien Materials für das aktive elektronische Matrixelektrodenarray verwendet wird, würden die Nachteile, die mit dem Auswaschverfahren mit Fluorwasserstoff zusammenhängen, für keine Besorgnis sorgen.
Eine andere Strategie für ein als Templat wirkendes Porogen ist die Verwendung von nicht mischbaren Flüssigkeiten zur Erzeugung von stabilen (oder halbstabilen) Emulsionen mit dem Polymerisationsgemisch. Da viele der Polymerisationsbestandteile (Monomere, Vernetzungsmittel, copolymerisierbare Befestigungsmoleküle) in einer wässrigen Phase löslich sind, ist es weit verbreitet, ein Zweiphasensystem aus einer hydrophoben und einer hydrophilen Phase zu verwenden, in dem die hydrophobe Phase Tröpfchen der gewünschten Porengröße in der hydrophilen Phase bildet. Üblicherweise werden diese Emulsionen mit grenzflächenaktiven Stoffen stabilisiert, um die Aggregation und die Trennung der hydrophoben Phase von der hydrophilen Phase zu vermeiden. Obwohl dieses Verfahren für die Verwendung bei der Herstellung von Permeationsschichten aus einem mesoporösen synthetischen polymeren Hydrogel geeignet ist, ist es nicht so bevorzugt wie das Verfahren mit einem micellbildenden, als Templat wirkenden Porogen, da die Tröpfchen der Mikroemulsion nicht so geordnet und gut definiert sind wie die Struktur von Tensidmicellen.
Eine ähnliche Strategie ist die Verwendung von als Templat wirkenden Gasphasenporogenen. Mehrere Porogene sind auf dem Gebiet der Polymertechnik bekannt, die für die Herstellung von Gasblasen in einer gut verteilten und kontrollierten Weise während der Polymerisationsreaktion nützlich sind. Die Verwendung eines gaserzeugenden Porogens kann für speziell viskose Polymerisationsgemische geeignet sein, in denen die gebildeten Gasblasen nicht in einem merklichen Ausmaß in der sich verfestigenden synthetischen polymeren Hydro gelmatrix aggregieren. Dieses Verfahren ist jedoch für eine Verwendung mit Polyacrylamid-Hydrogelen nicht bevorzugt, da sie zu flüssig sind.
Strategien ohne einen als Templat wirkenden Stoff können ebenfalls verwendet werden, um Hohlräume in die fertige synthetische polymere Hydrogelmatrix einzuführen, um eine physikalisch heterogene Mesostruktur zu erzeugen. Es ist beispielsweise ein als laterale oder seitliche Aggregation bezeichnetes Phänomen beschrieben worden, bei dem, wenn Polyethylenglycole mit bestimmten Molekulargewichten in Acrylamid-Polymerisationsgemische eingebracht werden, die wachsenden Polymerketten zwischen den Polyethylenglycol-Molekülen aggregieren. Wenn beispielsweise PEGs im MG-Bereich von 10000 bis 20000 in Konzentrationen von etwa 2,0 bis 2,5 % (Gewicht/Volumen) zu dem Polymerisationsgemisch gegeben werden, können Poren mit einer mittleren Größe von 500 nm erzeugt werden (siehe z.B. Righetti et al., J. Chromatography, 638:165-178 (1993), das durch die Bezugnahme hier in vollem Umfang eingefügt wird). Die Zugabe von PEGs mit einem hohen Molekulargewicht kann demnach auch verwendet werden, um Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel zu erzeugen, insbesondere diejenigen auf der Basis von Polyacrylamidhydrogelen.
Zusätzlich ist auch eine Technik des kontrollierten Abbaus von Polymernetzwerken beschrieben worden. Bei dieser Technik wurde eine Polyacrylamidmatrix durch Periodatoxidation kontrolliert abgebaut, um in dem Gel Mikroporen zu öffnen. Dieses Verfahren würde jedoch wahrscheinlich für die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen nicht bevorzugt sein, da die scharfen chemischen Bedingungen für die Elektronik der Vorrichtung oder die chemischen Befestigungsgruppen schädlich sein könnten.
Wie aus der obigen Diskussion offensichtlich ist, gibt es zahlreiche Verfahren, um synthetische polymere Hydrogelmatrices mit den gewünschten meoporösen (und wahlweise mikroporösen) Eigenschaften zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Permeationsschichten zu erzeugen. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Polymertechnik kann daher richtig einschätzen, dass die erfindungsgemäßen Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel nicht notwendigerweise auf Schichten begrenzt sind, die durch ein spezielles Verfahren (z.B. die Verwendung von als Templat wirkenden Porogenen) erzeugt werden, sondern dass sie viel mehr eine breite Klasse von Permeationsschichten aus mesostrukturiertem synthetischem polymerem Hydrogel umfassen, die aus einer Vielzahl synthetischer polymerer Hydrogelmaterialien durch eine Vielzahl von Verfahren hergestellt werden können.
FORMULIERUNGEN FÜR SYNTHETISCHE POLYMERE HYDROGELE, MIT COPOLYMERISATION VON BEFESTIGUNGSGRUPPEN
Bevorzugte synthetische polymere Hydrogele zur erfindungsgemäßen Verwendung enthalten copolymerisierte Befestigungsgruppen für die Befestigung spezifischer Moleküle als Bindungseinheiten (z. B. Nucleinsäuren, Proteine, Polypeptide, synthetische Bindungssystemkomponenten, wie Pyranosyl-RNA). Derartige copolymerisierte Befestigungsgruppen können allgemein durch die allgemeine Formel Struktur der allgemeinen Formel
beschrieben werden, worin
P mindestens eine polymerisierbare Gruppe ist, die kovalent mit einer oder zwei Gruppen verbunden ist, die ausgewählt werden unter: einer Monomer-Einheit des synthetischen polymeren Hydrogels und einer weiteren Gruppe P-X-R, die wie hier definiert ist, wobei die weitere Gruppe P-X-R der ersten Gruppe P-X-R entsprechen kann oder von dieser verschieden sein kann, wobei weiterhin die gestrichelte Linie eine kovalente Bindung zu der zweiten Gruppe ist, falls P kovalent mit zwei Gruppen verbunden ist;
X eine kovalente Bindung oder eine Verbindungsgruppe ist; und
R eine funktionelle Gruppe für die kovalente oder nicht-kovalente Anbindung eines Biomoleküls ist.
Die polymerisierbaren Befestigungsmoleküle, die als 'P-X-R' bezeichnet werden, werden durch Copolymerisation während der Herstellung der Permeationsschicht oder der Herstellung eines Teils der Permeationsschicht in die Permeationsschicht eingebracht, um eine Permeationsschicht herzustellen, die copolymerisierte Befestigungsgruppen enthält.
Die X-Bindung oder Verbindungsgruppe ist typischerweise eine kovalente Bindung oder Standardabstandshalter- oder Linker-Gruppe. Wenn X keine kovalente Bindung ist, wird X vorzugsweise unter Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, Alkylestern, Ketonen, Amiden, Thioestern, Alkylethern, Amidogruppen, Carbonylgruppen und/oder beliebigen Kombinationen davon ausgewählt. In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst X eine Polyethylenglycolgruppe, während in anderen bevorzugten erfndungsgemäßen Ausführungsformen X eine kovalente Bindung darstellt.
So wie der Begriff hier verwendet wird, bezeichnet Alkyl geradkettige und verzweigte Kohlenwasserstoffgruppen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, tert.-Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, Neopentyl, tert.-Pentyl und dergleichen. Derartige Alkyle können mit einer Vielzahl von Substituenten substituiert sein, darin eingeschlossen, aber nicht darauf eingeschränkt, Hydroxy, Oxo, Amino, Thio, Cyano, Nitro, Sulfo und dergleichen. Alkenyl bezeichnet einen Kohlenwasserstoff, in dem eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen Doppelbindungen sind, und die nicht doppelt gebunden Kohlenstoffe sind Alkyl oder substituiertes Alkyl. Alkenylkohlenwasserstoffgruppen können geradkettig sein oder eine oder mehrere Verzweigungen enthalten. Amino bezeichnet Gruppen, die ein Stickstoffatom enthalten, das mit zwei Wasserstoffatomen, Alkylgruppen und Kombinationen davon verbunden ist. Amido bezeichnet Gruppen, die ein Kohlenstoffatom enthalten, das über eine Doppelbindung mit einem Stickstoffatom und eine Einfachbindung mit einer Aminogruppe verbunden ist.
Die Gruppen R des Befestigungsmoleküls sind vorzugsweise Gruppen, die imstande sind, an einer Biotin-Bindungspaarreaktion teilzunehmen, d.h. entweder eine Biotin-Gruppe oder eine Biotin-Bindungsgruppe. Biotin-Bindungsgruppen schließen Anti-Biotin-Antikörper; Abkömmlinge von Avidin oder Streptavidin, die gentechnisch verändert, enzymatisch gespalten oder chemisch modifiziert worden sind; und andere synthetische Biotin-Bindungsstrukturen, die mit einer Dissoziationskonstante an Biotin binden, die funktionell äquivalent zu Avidin oder Streptavidin ist, ein. Die Gruppen R in bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen binden an derivatisierte Biomoleküle, die so derivatisiert worden sind, dass sie entweder eine Biotin-Gruppe oder eine Biotin-Bindungsgruppe (z.B. Streptavidin) enthalten. Da viele Biomoleküle leicht mit Biotin oder einem Biotinanalogon derivatisiert werden können, ist R in bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen eine Biotin-Bindungsgruppe, wie zum Beispiel Streptavidin, Avidin, oder chemisch oder rekombinant gentechnisch veränderte Derivate davon. Der Fachmann vermag einzuschätzen, dass das Befestigungsmolekül mehr als eine Gruppe P, die an eine Gruppe R gebunden ist, enthalten kann, insbesondere in dem Fall einer Gruppe R auf Proteinbasis, wie Streptavidin, das eine homotetramere Quartärstruktur hat. In einigen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen hat das Befestigungsmolekül etwa eine Gruppe P für jede Biotin-Bindungsstelle auf R, während in anderen bevorzugten Ausführungsformen das Befestigungsmolekül weniger als eine Gruppe P für jede Biotin-Bindungsstelle auf R hat.
Die Gruppe R wird verwendet, um Biomoleküle oder andere Bindungseinheiten an die Permeationsschicht an der Mikrostelle zu binden. Verschiedene chemische Gruppen zur Befestigung (sowohl nicht kovalente chemische Affinitätsgruppen als auch kovalente reaktive chemische Gruppen) sind entwickelt worden um Biomoleküle spezifisch zu derivatisieren, wie Nucleinsäuren, Proteine und Polypeptide, und andere Moleküle, um die spezifische Befestigung an einer anderen Gruppe unter Beibehaltung der Aktivität des derivatisierten Moleküls zu ermöglichen. Ganz allgemein schließen diese kovalent gebundene chemische Gruppen für die nicht-kovalente Befestigung, wie Streptavidin, Biotin, Phenylborsäure, Salicylhydroxamidsäure oder sogar synthetische Bindungseinheiten, wie spezielle Pyranosyl-RNA-Sequenzen (oder "pRNAs", die in der ebenfalls anhängigen Anmeldung 09/374,338, eingereicht am 13. August 1999, beschrieben werden, die hier vollständig durch die Bezugnahme aufgenommen wird), oder reaktive Gruppen für die kovalente Befestigung, wie N-Hydroxysuccinimidyl-aktive Ester, Amine, Aldehyde, Acylchloride, Hydrazine, Hydrazide, und dergleichen ein. Derivatisierungen für die Befestigung an R schließen auch Oligonucleotide, die oxidierte Ribose enthalten, Aminendgruppen, oder beliebige der wohlbekannten Biokonjugat-Paare ein, wie sie von Hermanson (Hermanson, G. T. Bioconjugate Technique Copyright 1996, Academic Press, San Diego, CA) dargestellt werden, das hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Befestigung der chemischen Gruppen für die Befestigung des Biomoleküls an R oder eine andere spezifische Bindungseinheit umfasst vorzugsweise eine kovalente Bindung. Die Befestigung der derivatisierten Biomoleküle an einer copolymerisierten Befestigungsgruppe in der Permeationsschicht des Mikroarrays kann jedoch entweder durch eine kovalente oder eine nicht-kovalente Bindung erfolgen.
Demnach ist nach alternativen bevorzugten Ausführungsformen R eine reaktive Gruppe für die kovalente Befestigung eines derivatisierten Biomoleküls durch chemische Amin-, Hydrazin- oder Hydrazidbefestigungsgruppen, wie ein aktiver N-Hydroxysuccinimidylester (NHS), ein sulfonierter NHS-Ester, ein Aldehyd, eine Säure, ein Acylhalogenid oder dergleichen, oder ein Hydrazid, Hydrazin, Amin. Chemische Hydrazid-Befestigungsgruppen werden detailliert in PCT/US01/41663 (mit Benennung USA) dargestellt, die brauchbar für die Befestigung von Bindungseinheiten an die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel der erfindungsgemäßen Vorrichtungen sind. Zusätzlich können andere reaktive Gruppen, die in üblichen chemischen Systemen zur Biomolekülbefestigung verwendet werden, eingesetzt werden, wie diejenige, die für Disulfidverbindungen oder Thioesterverbindungen (z.B. Thiole) brauchbar sind, Phosphorthiolatmonoester, Acetale, Ketone, Aldehyde, Dialdehyde, Brom- oder Iodacetamide, und Ester. Zusätzlich können in verschiedenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen Psoralene als R brauchbar sein. Bevorzugt verwendbare Psoralene sind photoaktiverbar bei einer Wellenlänge von etwa 365 nm.
In anderen alternativen erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann R eine synthetische Paarbildungssystemeinheit sein, wie ein Pyranosyl-RNA-Oligomer, für die Immobilisierung der spezifischen Bindungseinheit an speziellen Mikrostellen auf der aktiven elektronischen Matrixvorrichtung. In diesen Ausführungsformen kann die pRNA mit einer polymerisierbaren Gruppe derivatisiert werden und in die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel copolymerisiert werden, wie dies allgemein für P-X-R-Moleküle beschrieben wird. Wie jedoch weiter unten für copolymerisierte spezifische Bindungseinheiten beschrieben wird, ist die Verwendung einer Form, die Permeationsschichten produziert, die nur eine Mikrostellenelektrode oder eine Untergruppe von Mikrostellenelektroden anstelle eines gesamtes Array von Mikrostellenelektroden bedecken, bevorzugt.
Wie für Biotin-Bindungsgruppen, wie Streptavidin, beschrieben, wird R üblicherweise in einem aktiven Zustand copolymerisiert. Speziell wenn reaktive Gruppen als R verwendet werden, kann R jedoch verändert sein und die Entfernung einer Schutzgruppe oder eine Aktivierung erfordern, damit R als Befestigungsgruppe funktioniert. Beispielsweise kann tert.-Butyl oder eine andere sperrige Gruppe verwendet werden, um ein reaktives R während der Polymerisation abzuschirmen, das/die dann vor der Befestigung der spezifischen Bindungseinheiten an den Mikrostellen der aktiven elektronischen Matrixvorrichtung abgespalten wird. Alternativ kann R als ein Vorläufer einer reaktiven Gruppe in dem copolymerisierten Molekül bereitgestellt werden und dann (z.B. durch eine Oxidations- oder Reduktionsreaktion) in die reaktive Gruppe umgewandelt werden.
Die Gruppe P kann mit Monomeren der umgebenden Permeationsschicht oder mit Gruppen P eines zweiten Befestigungsmoleküls usw. reagieren. Demnach können die zuzugebenden Befestigungsmoleküle auch bereits teilweise polymerisiert sein, bevor sie in die Basispermeationsschicht eingebracht werden (z. B. in der Form eines Blockcopolymers oder einer anderen additiven Einheit). Die Polymerisationsreaktion kann in einer Lösung, einer Aufschlämmung oder einer sonstigen akzeptablen Aufbereitung durchgeführt werden, wo die Gruppe P mit einer Monomergruppe des wachsenden Permeations schichtpolymers (die die gleiche wie 'P' sein kann) und/oder einer Gruppe P eines anderen Befestigungsmoleküls reagieren kann. Die Polymerisation von P in die Permeationsschicht kann unspezifisch gestartet werden, indem ein Polymerisationsinitiatormolekül, wie ein freie Radikale erzeugender Polymerisationsinitiator, verwendet wird, das empfindlich gegenüber Hitze und/oder speziellen Wellenlängen elektromagnetischer Strahlung ist. Die Verwendung eines derartigen aktivierbaren Initiators erlaubt die Initiierung der Polymerisation durch eine äußere Energiequelle (Hitze oder eine Lichtwellenlänge), die über das gesamte Mikroelektrodenarray oder in spezifischen Bereichen des Mikroelektrodenarrays einwirken kann.
P umfasst eine chemische Gruppe, die ein reaktives Zentrum einschließt, das in einer Polymerisationsreaktion an der Verbindung mit einem reaktiven Zentrum einer anderen Gruppe P beteiligt sein kann und/oder das an ein reaktives Zentrum der Polymermatrix der Permeationsschicht binden kann. Zusätzlich kann P an eine Gruppe R einer anderen funktionellen Gruppe binden. P wird vorzugsweise ausgewählt unter: Alkenylgruppen, die die folgenden Gruppen einschließen, ohne jedoch auf sie eingeschränkt zu sein: substituierte oder unsubstituierte α,β-Carbonyle, worin die Doppelbindung direkt mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist, das über eine Doppelbindung mit einem Sauerstoffatom und eine Einfachbindung mit einem weiteren Sauerstoff-, Stickstoff-, Schwefel- Halogen- oder Kohlenstoffatom verbunden ist; Vinyl, worin die Doppelbindung durch eine Einfachbindung mit einem Sauerstoff-, Stickstoff-, Halogen-, Phosphor- oder Schwefelatom verbunden ist; Allyl, worin die Doppelbindung durch eine Einfachbindung mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist, das mit einem Sauerstoff-, Stickstoff-, Halogen-, Phosphor- oder Schwefelatom verbunden ist; Homoallyl, worin die Doppelbindung durch eine Einfachbindung mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist, das durch eine Einfachbindung mit einem weiteren Kohlen stoff verbunden ist, das dann durch eine Einfachbindung mit einem Sauerstoff-, Stickstoff-, Halogen-, Phosphor- oder Schwefelatom verbunden ist; Alkinylgruppen, worin die Dreifachbindung zwischen zwei Kohlenstoffatomen existiert. Noch bevorzugtere Gruppen P schließen substituierte oder nicht substituierte α,β-ungesättigte Carbonyle, Vinyl-, Allyl- und Homoallylgruppen und Alkine ein. P kann auch unter Acetal, Epoxid, Ester, Carbonsäure, Amid, Halogenacetamid, Thiol, Phosphorthiolatmonoester, Thioester, Disulfid, Aldehyd, Keton, Hydrazid, Hydrazin und Aminen ausgewählt werden. In bevorzugteren Ausführungsformen ist P eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist P eine Acrylamidogruppe und am bevorzugtesten eine Methacrylamidgruppe.
Der Fachmann auf dem Gebiet der Polymertechnik vermag einzuschätzen, dass eine geeignete Gruppe P ausgewählt werden sollte, die leicht mit den Monomeren der synthetischen polymeren Hydrogelmatrix copolymerisiert, um die gleichmäßige Verteilung und den guten Einbau der Befestigungsgruppen in der gesamten Permeationsschicht aus synthetischem polymerem Hydrogel zu gewährleisten. Ganz allgemein führt die Verwendung einer Gruppe P, die dem Monomer des Polymerisationsgemischs entspricht oder ihm ähnelt, zur Erzeugung einer besseren Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel, die copolymerisierte Befestigungsgruppen enthält. In den Beispielen weiter unten wird daher eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe als Gruppe P für die Copolymerisation in ein Acrylamidhydrogel verwendet.
Copolymerisierte spezifische Bindungseinheiten
Nach alternativen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem polymerem Hydrogel copolymerisierte spezifische Bindungseinheiten.
In diesen Ausführungsformen hat die copolymerisierte spezifische Bindungseinheit die gleiche allgemeine Formel
wie sie weiter oben definiert ist, mit der Änderung, dass R eine spezifische Bindungseinheit ist. Wie diskutiert schließen spezifische Bindungseinheiten, die brauchbar für Assays sind, die auf den erfindungsgemäßen aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen durchgeführt werden, Nucleinsäuren, Proteine, Polypeptide, Proteoglycane, Glycoproteine, Antigenepitope und andere in biochemischen oder chemischen Assays brauchbare Moleküle ein, ohne auf diese Moleküle eingeschränkt zu sein. Bevorzugte spezifische Bindungseinheiten schließen Nucleinsäuren (z.B. DNA, RNA, chemisch derivatisierte DNA oder RNA, oder Nucleinsäureanaloga, die mit natürlich vorkommenden Nucleinsäuren hybridisieren), Proteine, Antikörper und Antigene ein. Wie durch die Copolymerisation von Streptavidin in den Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Polyacrylamid-Hydrogel der Beispiele gezeigt wird, können Proteine und Polypeptide leicht mit Acryloyl- oder Acrylamidogruppen (oder anderen polymerisierbaren Gruppen) derivatisiert und mit minimalem Verlust der Proteinaktivität copolymerisiert werden. Zusätzlich sind verschiedene Phosphoramidit-Reagenzien erhältlich, um eine copolymerisierbare Gruppe, wie eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe, problemlos an ein beliebiges Ende von Nucleinsäuren anzubinden (z.B. Acrydite^TM von Mosaic Technologies, Boston, MA). Demnach können spezifische Bindungseinheiten direkt durch Copolymerisation in die Permeationsschicht eingeführt werden.
Da es üblicherweise nicht erwünscht ist, die selbe spezifische Bindungseinheit an jeder Mikrostelle einer aktiven elektronischen Matrixvorrichtung zu haben, ist es vorteilhaft, Formen für die Polymeri sation der Permeationsschicht auf die aktiven elektronischen Matrixmikroelektrodenarrays zu verwenden, die so zugeschnitten sind, dass eine Permeationsschicht über einer Mikrostelle oder einer Untergruppe von Mikrostellen auf der aktiven elektronischen Matrixvorrichtung erzeugt wird. Derartige Formen können leicht für ein Array von Elektroden, wie in 1 dargestellt, entworfen werden, bei denen eine Vielzahl von Formhohlräumen in der Form vorgesehen wird, die bestimmte Mikroelektroden auf der Vorrichtung erfassen. Derartige Formen können beispielsweise ein Array von Formhohlräumen mit einer geeigneten Form aufweisen, die mindestens die einzelnen Mikrostellenelektroden der aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtung abdecken (zum Beispiel 100 runde, quadratische oder hexagonale Hohlräume, die mindestens einen Durchmesser von 80 μm für die Elektroden in 1 aufweisen). Oder es können Formen erzeugt werden, die Hohlräume aufweisen, die eine Untergruppe der Mikrostellenelektroden abdecken (z. B. eine vollständige Reihe oder ein Quadrat von 4 Elektroden, etc.). Das Polymerisationsgemisch, das eine besondere copolymerisierbare spezifische Bindungseinheit enthält, kann dann in die Formhohlräume pipettiert werden, die den Mikroelektroden des Arrays entsprechen, die mit einer Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel bedeckt werden sollen, die die besondere spezifische Bindungseinheit enthält. Derartige Formen können aus Quarz, Glas oder anderen Materialien unter Anwendung von mikrolithographischen Standardtechniken hergestellt werden, oder sie können aus Kunststoff von einer Vorlage geformt werden, die unter Verwendung derartiger Techniken erzeugt wurde.
Die Verwendung copolymerisierter spezifischer Bindungseinheiten ist besonders attraktiv für die Herstellung aktiver elektronischer Matrixchipvorrichtungen für die klinische Anwendung, in denen mehrere vorab aufgebrachte spezifische Bindungseinheiten bereitgestellt wer den können, um auf ein Panel spezieller Nucleinsäuresequenzen, Antikörper oder Antigene in einer Probe zu testen. Da klinische Anwender ein Interesse an bequemen und zeitsparenden Testvorrichtungen haben, bieten derartige vorher beladene Aktive elektronische Matrixchip-Vorrichtungen beträchtliche Vorteile gegenüber gattungsgemäßen Vorrichtungen, die vom Verbraucher mit spezifischen Bindungseinheiten beladen werden müssen. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit copolymerisierten spezifischen Bindungseinheiten auch in Forschungszusammenhängen brauchbar, in denen mehrere Proben zum Vergleich auf die gleichen Nucleinsäuresequenzen, Antikörper oder Antigene in mehreren Proben getestet werden. Durch das Copolymerisieren der spezifischen Bindungseinheit in die Permeationsschicht über einem Satz von Mikroelektroden wird die Konzentration der spezifischen Bindungseinheit für diesen Satz von Mikroelektroden standardisiert, was einen exakteren Vergleich des Anbindens des Analyts zwischen Proben erlaubt. Weil der Mikroformungsprozess sich einfach für automatisierte Schritte eignet, in denen Polymerisationsgemische, die die speziellen copolymerisierbaren spezifischen Bindungseinheiten enthalten (z. B. spezielle Nucleinsäuresonden, die kovalent an eine Acryloylgruppe gebunden sind), gegeneinander ausgetauscht werden können, kann die Herstellung von für Kunden vorab beladenen Chips für spezielle Forschungsexperimente einfach durchgeführt werden.
BASISAUFBAU EINES ELEKTRONISCHEN MATRIXCHIPS
Damit eine aktive elektronische Matrixchipvorrichtung Multischritt- und Multiplexreaktionen durchführen kann, müssen ihre elektronischen Komponenten imstande sein, in wässrigen Lösungen ihren aktiven Betrieb aufrechtzuerhalten. Um dieses Erfordernis zu erfüllen, hat jede Mikrostelle eine darunter liegende kontrollierbare und funktionierende Gleichstrom-Mikroelektrode. Für die Leistungsfähigkeit der Vorrichtung, vor allem die Empfindlichkeit (Signal-Rausch-Verhältnis) ist es jedoch wichtig, dass die Bindungs- und Affinitätsreaktionen nicht durch die Elektrolysereaktionen verhindert werden, die auf den aktiven Oberflächen von Gleichstromelektroden stattfinden. Zusätzlich zu den Beschädigungen, die alle empfindlichen Reagenzien und Analyte (DNA, RNA, Proteine etc.) erleiden, die die Elektrodenoberfläche direkt kontaktieren, erzeugen die Elektroden Elektrolyseprodukte, die Säure (H⁺), Base (OH^–), Wasserstoff, Sauerstoff und verschiedene freie Radikale einschließen, die ebenfalls die empfindlichen Komponenten schädigen können. Andere Erwägungen für den Aufbau und die Herstellung einer Vorrichtung schließen die Verträglichkeit von Materialien (einschließlich die Verträglichkeit mit der Permeationsschicht und ihrer Herstellung, und mit Lösungsbestandteilen, die in verschiedenen chemischen oder biochemischen Assays auf der Vorrichtung verwendet werden), die Beschaffenheit der spezifischen Bindungseinheiten und der nachfolgenden Reaktanden und Analyte und die Zahl der Mikrostellen ein, sind hierauf aber nicht beschränkt.
Unter "einer kontrollierbaren und funktionierenden Gleichstrom-Mikroelektrode" wird eine Mikroelektrode verstanden, die entweder eine positive oder negative Vorspannung aufweist, die in einem Gleichstrombetrieb betrieben wird (entweder kontinuierlich oder gepulst oder Gleichstrom/Wechselstrom), die in einer kontrollierbaren Weise den elektrophoretischen Transport im freien Feld von geladenen spezifischen Bindungseinheiten, Reaktanden oder Analyten an eine beliebige Stelle oder von einer beliebigen Stelle auf der Vorrichtung oder aus der Probelösung beeinflussen oder hervorrufen kann.
Wie hier beschrieben hängt der elektrophoretische "Transport" von Molekülen im freien Feld nicht von der Begrenzung oder Einschränkung des elektrischen Feldes, die durch ein isolierendes Material er zeugt wird, ab. Herkömmliche elektrophoretische Trenntechnologien erfordern die Einschränkung oder Einschließung der elektrischen Feldlinien durch isolierende (nichtleitende) Materialien (z. B. die Wände eines Glaskapillarrohrs bei der Kapillargelelektrophorese). Im Fall des elektrophoretischen Transports im freien Feld auf den aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen werden geladene Moleküle von einer Mikrostelle durch das freie Lösungsvolumen zu einer beliebigen anderen Mikrostelle oder aus der freien Lösung an spezifische Mikrostellen bewegt. Daher sind spezielle Anordnungen oder Einschränkungen durch isolierende Materialien nicht erforderlich für diesen Aspekt der Erfindung. Die relativ kleine Fläche der Mikrostellenteststelle erlaubt jedoch die Erzeugung hoher Stromdichten. Diese hohen Stromdichten über einer begrenzten Fläche des Chips erlauben die schnelle Aufkonzentrierung der geladenen Nucleinsäuren oder anderer Biomoleküle aus der Lösung und die elektronische Stringenz für die Dehybridisierung.
Eine aktive elektronische Matrixchipvorrichtung kann so gestaltet werden, dass sie nur zwei adressierbare Mikrostellen oder auch Hunderte oder Tausende Mikrostellen aufweisen. Im Allgemeinen wird eine komplexe Vorrichtung mit einer großen Zahl von Mikrostellen unter Verwendung von Mikrolithographietechniken oder einer Kombination aus Mikroherstellung und Mikrobearbeitung erzeugt. Die Herstellung wird auf Silicium oder anderen geeigneten Trägermaterialien, wie Glas, Siliciumdioxid, Kunststoff, isolierten metallischen oder keramischen Materialien, durchgeführt.
1 zeigt das Elektrodenarray einer 100-Site-NanoChip^®-Vorrichtung, die unter Verwendung von Photolithographietechniken hergestellt wurde. Die Mikrostellen sind die Flächen in und auf der Permeationsschicht oberhalb der exponierten Metallelektrodenfelder, die auf einem Isolatorschicht/Basismaterial abgeschieden worden sind.
Die Metallfelder dienen als die darunter liegenden Mikroelektrodenstrukturen. Die Elektrodenmaterialien können Aluminium, Kupfer, Kohlenstoff, Eisen, Silber, Gold, Palladium, Platin, Titan, Wolfram, Polysilicium und Indiumzinnoxid sowie Silicidmaterialien, wie Platinsilicid, Titansilicid, Goldsilicid oder Wolframsilicid, einschließen, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Spezielle Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, um die richtige Haftung auf den isolierenden Trägermaterialien (SiO₂) zu gewährleisten, werden mit verschiedenen Metallen angewendet. Verschiedene Metalle und andere Materialien können für verschiedene leitfähige Komponenten der Vorrichtung verwendet werden, beispielsweise kann Aluminium für die am Umfang vorhandenen Kontaktfelder, Titan für die Verbindungsschaltung und ein Edelmetall (Gold oder Platin) für die Mikroelektroden verwendet werden. Zusätzlich kann es vorteilhaft sein, eine geschichtete Elektrodenstruktur zu verwenden, in der eine Oberflächenschicht aus einem weniger reaktiven Edelmetall oder einer Edelmetalllegierung über eine andere Metallschicht geschichtet wird. In den Elektroden, die in 1 gezeigt werden, ist beispielsweise die Elektrode aus Platin, das auf einer Trägerschicht aus Titan/Wolfram-Legierung (für verbesserte Haftung) abgeschieden ist. Alternativ können leitfähige Polymere, wie Polyaniline oder Polypyrrolidone, als Elektrodenmaterialien verwendet werden. Zusätzlich zu den Elektroden, die unter den Mikrostellen der aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen liegen, können andere Elektroden vorgesehen werden, die nicht unter den Mikrostellen auf den Chipvorrichtungen liegen. Diese schließen beispielsweise Gegenelektroden ein, die einfach als Elektroden mit einer entgegengesetzten Spannung während des elektrophoretischen Transports der Biomoleküle in der Lösung verwendet werden. Da sie nicht als Mikrostellenelektroden verwendet werden, werden sie üblicherweise nicht durch die Permeationsschicht abgedeckt. Ein Beispiel für diese Elektroden wird in 2 gezeigt, in der die Gegenelektroden in einem Kreis positioniert sind, der das zentrale Array von Mikroelektrodenfeldern umgibt, die unter den Mikrostellen der Chipvorrichtung liegen. Zusätzlich zu den Gegenelektroden können andere Elektroden, wie Referenzelektroden oder Pseudoreferenzelektroden (z.B. Silberpastenelektroden etc.) zur Verwendung bei der Messung und der Aufrechterhaltung eines konstanten Stroms oder einer konstanten Spannung, die den Elektroden geliefert wird, in die Chipvorrichtung eingefügt werden.
Auf der Oberfläche der fertigen Chipvorrichtung trennt ein Isolatormaterial die Metallelektrodenfelder voneinander in der Ebene der Chipvorrichtung. Diese Trennung der Elektroden durch das Isoliermaterial verhindert den "Kurzschluss" des Elektronenstroms durch die Oberfläche der Chipvorrichtung und die Leitung durch die Lösung über der Chipoberfläche. Ganz allgemein ist das Isoliermaterial (z. B. Siliciumdioxid) eine Schicht, die über und zwischen der Metallschicht, die auf dem Träger abgeschieden ist, oder einer Sandwich-Typ-Elektrode und einer Verbindungsdrahtstruktur abgeschieden ist, wie in 1 gezeigt. Bei dieser Herstellungsstrategie wird die Isolierschicht, die über den Elektrodenfeldern abgeschieden ist, entfernt, um die funktionierenden Mikroelektroden freizulegen. Dies kann einfacher in 2 gesehen werden, in der die freigelegten Elektrodenabschnitte als dunklere Kreise über dem leitfähigen Elektrodenmaterial erscheinen. Das dunklere Aussehen wird durch die vergrößerte Tiefe der Permeationsschicht in den geätzten "Löchern" in der isolierenden Siliciumdioxidschicht verursacht. Den Fachleuten auf den Fachgebieten der Mikroelektronik sind jedoch andere Herstellungsstrategien ohne weiteres ersichtlich. Isoliermaterialien schließen Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Glas, Lacke, Polyimid, Kautschuk, Kunststoff oder Keramikmaterialien ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Mikroelektroden auf der gezeigten NanoChip^®-Vorrichtung sind durch eine Siliciumdioxidschicht voneinander getrennt, die auch die Mikroverdrahtung, die die Elektrodenfelder mit elektrischen Verbindungen auf dem Umfang auf dem Chip verbinden, bedeckt und isoliert (Äußerer Bereich von 1).
Die grundlegenden Merkmale einer einzelnen Mikrostelle, die durch Mikrolithographietechniken erzeugt wird, sind demnach: das Metallfeld, das die Stelle der adressierbaren Mikrostelle definiert und das eine Schicht für die kovalente Befestigung der Permeationsschicht enthalten kann; eine Permeationsschicht, die über der Mikroelektrode liegt; eine Befestigungsschicht, die flächengleich mit der Permeationsschicht sein kann, oder eine weitere Schicht einer Befestigungsgruppe aus dem Permeationsschichtmaterial, die über einer Basispermeationsschicht liegt.
Die Dicke der Permeationsschicht für mikrolithographisch erzeugte Vorrichtungen kann im Bereich von etwa 1 Nanometer (nm) bis 100 Mikrometer (μm) liegen, wobei 2 nm bis 10 μm am bevorzugtesten sind. Allgemein haben die Permeationsschichten in bevorzugten Ausführungsformen der Permeationsschichten der Erfindung ein Dicke im Bereich von etwa 0,5 μm bis etwa 10 μm im trockenen Zustand, noch bevorzugter eine Dicke im Bereich von etwa 1,0 μm bis etwa 5,0 μm im trockenen Zustand, und am bevorzugtesten eine Dicke im Bereich von etwa 1,0 μm bis etwa 2,0 μm im trockenen Zustand (oder mindestens eine Dicke von etwa 8-9 μm, wenn im Gleichgewicht mit wässrigem Puffer). Ebenfalls in bevorzugten Ausführungsformen variiert die Dicke der Permeationsschichten über das Elektrodenarray der aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtung um weniger als 0,5 μm, bevorzugter um weniger als 0,2 μm und am bevorzugtesten um weniger als 0,1 μm, gemessen im trockenen Zustand.
Wie weiter oben erwähnt, können die Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel in Form einer einzigen Schicht oder als eine Vielzahl von Schichten auf das aktive elektronische Matrix mikroelektrodenarray geformt werden. In einigen Fällen können die Permeationsschicht und die Befestigungsschicht aus dem gleichen Material geformt werden, was in den Beispielen gezeigt wird. Alternativ kann eine Basispermeationsschicht auf das Mikroelektrodenarray geformt werden, auf die eine Permeationsschicht folgt, die copolymerisierte Befestigungsgruppen oder copolymerisierte spezifische Bindungseinheiten enthält. Wenn mehr als eine Schicht die Permeationsschicht bildet, ist es bevorzugt, dass die aufeinanderfolgenden Schichten jeweils kovalent auf der vorherigen Schicht befestigt werden (oder darauf gepfropft werden). Die Verwendung von Multischicht-Permeationsschichten ist besonders bevorzugt, wenn teurere Reagenzien oder Spezialreagenzien, wie copolymerisierbare spezifische Bindungseinheiten, verwendet werden.
Optimal enthält die Befestigungsschicht 10⁵ bis 10⁷ Befestigungsgruppen (oder spezifische Bindungsgruppen, nach der Befestigung) pro Quadratmikrometer (μm²) für die Befestigung spezifischer Bindungseinheiten. Wenn copolymerisierte Befestigungsgruppen in der Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen werden, sollten sie demnach in einer ausreichenden Konzentration in dem Polymerisationsgemisch vorhanden sein, um für eine Dichte der Befestigungsstellen in diesem Bereich zu sorgen. Die Befestigung der spezifischen Bindungseinheiten sollte die Oberfläche nicht so vollständig überziehen oder isolieren, dass die darunter liegende Mikroelektrode an ihrer Funktionstüchtigkeit gehindert wird. Eine funktionierende Vorrichtung erfordert, dass ein gewisser Bruchteil (~5 % bis 25 %) der effektiven metallischen Mikrolektrodenoberfläche für Lösemittelmoleküle (H₂O) durch die Permeationsschicht zugänglich bleibt und dass die Diffusion der Gegenionen (z.B. Na⁺ und Cl^–) und der Elektrolysegase (z. B. O₂ und H₂) stattfinden kann. Die dazwischenliegende Permeationsschicht ist auch so ausgebildet, dass die Diffusion stattfinden kann. Zusätzlich sollte die Permeationsschicht Eigenschaften hinsichtlich der Porengrenze haben, die größere Bindungseinheiten, Reaktanten und Analyte daran hindern oder darin einschränken, in physikalischen Kontakt mit der Mikroelektrodenoberfläche zu geraten. Demnach hält die Permeationsschicht die Oberfläche der aktiven Mikroelektrode physikalisch getrennt von der Schicht mit den Bindungseinheiten der Mikrostelle.
Adressierbare Mikrostellen können eine beliebige Form haben (z. B. eine runde, quadratische oder rechteckige Form). Die Größe einer adressierbaren Mikrostelle kann beliebig sein und vorzugsweise vom Submikrometerbereich (~0,5 μm) bis zu einigen Zentimetern (cm) reichen, wobei 5 μm bis 100 μm der bevorzugteste Größenbereich für Vorrichtungen ist, die unter Anwendung mikrolithographischer Techniken hergestellt werden. Die Größe der Mikrostelle für die in 1 gezeigte Vorrichtung beträgt 80 μm. Der Abstand zwischen Mikrostellen wird durch die Einfachheit der Herstellung, das Erfordernis der Detektorauflösung zwischen Mikrostellen und die Zahl der Mikrostellen, die auf einer Vorrichtung erwünscht ist, bestimmt. Beispielsweise beträgt der Abstand zwischen Mikrostellen der in 2 gezeigten Chipvorrichtung 120 μm Kante zu Kante oder 200 μm Mitte zu Mitte. Besondere Abstände zwischen Mikrostellen oder räumliche Anordnungen oder Geometrien der Mikrostellen sind jedoch für die Funktionstüchtigkeit der Vorrichtung nicht erforderlich, da jede beliebige Kombination von Mikrostellen (d. h. darunter liegende Mikroelektroden) über die vollständige Vorrichtungsfläche arbeiten kann. Wenn die Zahl der Mikrostellen über einige Hundert ansteigt, nimmt die Komplexität der darunter liegenden Schaltung der Mikrostellen zu. In diesem Fall müssen die Gruppierungsmuster der Mikrostellen verändert werden und die Größen der Zwischenräume proportional erhöht werden, oder Multischichtschaltungen können in die Grundvorrichtung eingefügt werden, d.h. Transistoren und Halbleitersteue rungselemente, die direkt in das Silicium eingebaut werden. Wie oben angegeben läuft für jede einzelne darunter liegende Mikroelektrode eine verbindende Schaltung vorzugsweise bis zu einem äußeren Umfang von metallischen Kontaktfeldern. Wenn diese Kontaktfelder in einer Standardkonfiguration erzeugt werden, kann die Chipvorrichtung in ein quadratisches Standardgehäuse eingesetzt werden, wo die Chipkontaktfelder mit den Anschlussstiften des quadratischen Standardgehäuses verdrahtet werden.
Es ist nicht erforderlich, die Vorrichtung zu umhüllen oder die Mikrostellen vollständig mit dielektrischen oder isolierenden Barrieren einzugrenzen, weil komplexe elektrische Feldmuster oder dielektrische Grenzen nicht erforderlich sind, um in dem Raum oder dem Medium zwischen beliebigen Elektroden spezifische Moleküle selektiv zu bewegen, zu trennen, zu halten oder zu orientieren. Die aktive elektronische Matrix erreicht die räumliche Trennung durch die Befestigung der spezifischen Bindungsmoleküle und anschließend der Analyte und Reaktanden auf der Oberfläche einer adressierbaren Mikrostelle. Es ist jedoch bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen in einer Fließzelle enthalten oder verpackt sind, um die kontrollierte Zufuhr von Proben und Reagenzien auf die Oberfläche der Vorrichtungen zu ermöglichen. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, das derartige Fließzellen ein geschlossenes Volumen über der aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtung mit mindestens einer Einlassöffnung und mindestens einer Auslassöffnung aufweisen. Auf diese Weise können die Funktionen der Probenzufuhr, des Spülens und der Zufuhr der Reagenzien problemlos auf den aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen unter Verwendung von Standardströmungstechniken durchgeführt werden.
Systeme, die mehr als einen Chip und zusätzliche Verpackungs- und Peripheriekomponenten enthalten, können entwickelt werden, um Aufgaben zu behandeln, die sich auf die klinische Diagnostik (d. h. Zugabe von Probematerialien, Flüssigkeitstransfer und Einkapselung von biologisch gefährlichen Materialien, und Nachweis von Markergruppen, wie zum Beispiel fluoreszierenden, chemilumineszierenden, kolorimetrischen oder radioaktiven Gruppen) beziehen. Der verpackte Chip kann dann in eine mikroprozessorgesteuerte Gleichstrom-Stromversorgung und ein Vielfachmessgerät eingesteckt werden, das die Vorrichtung steuern und betätigen kann. Es wird von dieser Erfindung in Erwägung gezogen, dass die Herstellung der Vorrichtung (vor der Adressierung) den Einbau verschiedener Basiskomponenten in eine Einwegvorrichtung einschließt, die im Wesentlichen in einer Einheit zusammengesetzt würden, wie: der Basischipvorrichtung, an die die Bindungseinheiten angebunden sind, einer Komponente für die Einkapselung einer Fließzellenflüssigkeit; und wahlweise integrierte aktive elektronische Matrixkontrollkomponenten. Mit dieser Strategie wird eine Zahl von Problemen gelöst, die mit den Herstellungstechniken und den Materialverträglichkeiten zusammenhängen.
CHEMISCHE VERANKERUNGSGRUPPEN FÜR DIE PERMEATIONSSCHICHT
Obwohl synthetische polymere Hydrogelmaterialien wie die oben genannten Materialien die gewünschten funktionellen Qualitäten haben, sind Permeationsschichten aus einem Hydrogel dafür anfällig, sich von der Elektrodenfläche zu lösen oder davon "abzublättern". Obwohl die Anmelder an keine spezielle Theorie gebunden sind, wird angenommen, dass dieses Abblättern durch eine Änderung der chemischen Zusammensetzung an der Grenzfläche zwischen der Permeationsschicht und der Elektrode verursacht wird, die aus dem Anlegen eines elektrischen Potentials an die Elektrode und dem physikalischen Abtrennen geladener Ionen und von Gasen, die aus der Elektrode ausströmen, resultiert. Ein derartiges Abblättern kann vom Standpunkt des "Mikroabblätterns" und des "Makroabblätterns" gesehen werden.
Das Mikroabblättern hängt mit dem elektrochemischen Abbau der chemischen Grenzfläche zwischen der Permeationsschicht und der Elektrode zusammen. Es ist erkennbar an der Bildung erhöhter Beulen in der Permeationsschicht oder an Locken, die durch die Brechung von Licht an der abgeblätterten Schicht sichtbar werden, wenn durch ein konfokales Mikroskop beobachtet wird, und führt zu einem Verlust der Gleichheit der Leistungsfähigkeit der Permeationsschicht (möglicherweise verursacht durch den Verlust der Kontrolle über die Homogenität des elektrischen Feldes). Andererseits wird das Makroabblättern durch eine Unausgeglichenheit der Oberflächenenergien zwischen der Permeationsschicht und dem Chipträger verursacht, was zu einem Abschälen (Abheben) der Permeationsschicht führt, das sich über die gesamte Mikrochipoberfläche erstrecken kann. Da die Permeationsschicht ein Mittel für die Befestigung spezifischer Bindungseinheiten für Analyte, die in der darüber liegenden Flüssigkeit vorhanden sind, bereitstellt, ist das Mikroabblättern nachteilig für Assays, die typischerweise auf den aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen ausgeführt werden. In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen mit synthetischem polymerem Hydrogel kann das Problem des Mikro- und Makroabblätterns verringert werden, indem eine kovalente chemische Verbindung zwischen dem aktiven elektronischen Matrixelektrodenarray und der Permeationsschichthydrogelmatrix verwendet wird. Diese chemische Verbindung ist bei einer Vielzahl von Zusammensetzungen für Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel anwendbar, eingeschlossen Polyacrylamide, und sie widersteht Stromdichten von mindestens 0,04 nA/μm² und/oder Spannungsabfällen zwischen 1 und 3 V.
Im Fall von Metallen wie Aluminium oder Silicium/Edelmetall-Gemischen bildet die Metalloxidschicht eine Basis für die kovalente Kupplung der Permeationsschicht. Metalloxid und Hydroxygruppen (entweder allein oder in Kombination) und andere ähnliche Grenzflächenoberflächen, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Oberflächenbeschichtungschemie bekannt sind, stellen kovalente Stellen bereit, von denen aus die Permeationsschicht konstruiert wird oder die die Permeationsschicht halten. Bevorzugte Metall/Silicid-Elektroden schließen Platinsilicid (PtSi), Wolframsilicid (WSi), Titansilicid (TiSi) und Goldsilicid (AuSi) ein, da sie Stellen bereitstellen, die leicht für die Silankupplung unter Verwendung der weiter unten angegebenen Reagenzien verwendet werden können.
Es ist jedoch nicht essentiell, dass die Permeationsschicht kovalent auf der Metallelektrodenoberfläche verankert wird. Eine beträchtliche zusätzliche Beständigkeit gegen das Mikro- und Makroabblättern kann erzielt werden, indem die Permeationsschicht einfach auf dem Träger oder dem isolierenden Material, der/das die betreffende Mikroelektrode der Mikrostelle umgibt, befestigt wird. Das Aufbringen der permeablen Materialien durch physikalische Kräfte stellt ein alternatives Verfahren dar, das auch zum Gegenstand dieser Erfindung gehört. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind demnach die Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel der erfindungsgemäßen Vorrichtungen kovalent auf dem Träger der aktiven elektronischen Matrixvorrichtung, der die Mikroelektrode umgibt, verankert. So wie der Begriff für die Beschreibung dieses Verfahrens verwendet wird, wird der "Träger" so betrachtet, dass er nicht nur eine Schicht aus dem Trägermaterial, auf dem die Mikroelektrode ausgebildet wird, sondern auch beliebige Schichten aus isolierendem Material (z. B. Siliciumdioxid) einschließt, die über dem Metall der Elektrode liegen können und somit die Grenze der Mikrostelle definieren. Beispielsweise kann im Fall von Metallen wie Platin und Gold ei ne Permeationsschicht physikalisch darüber gelegt sein, die dann auf der Siliciumdioxidschicht verankert wird, die die Elektrode umgibt. Dieser als "Zeltbildung" bezeichnete Ansatz, der in Beispiel 1 beschrieben wird, hat sich als sehr brauchbar gegen das Makroabblättern der Permeationsschicht erwiesen. Die Verwendung von Vernetzungsmitteln für die Verankerung einer Permeationsschicht auf einer Elektrode einer aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtung wird allgemein in dem US-Patent Nr. 6,303,082 beschrieben, das hier durch die Bezugnahme in seinem vollen Umfang aufgenommen wird.
In einem Beispiel dieser bevorzugten Ausführungsformen umfasst die kovalente Befestigung eine Verbindungsgruppe, die eine Gruppe für die Bindung des Linkers an die Silanolgruppe einer siliciumhaltigen Oberfläche (z. B. einer Metall/Si-Elektrode oder einer siliciumhaltigen Oberfläche des Trägers) und eine davon getrennte Gruppe für die Bindung des Linkers an die Permeationsschicht bereitstellt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Verbindungsgrupe durch die Formel
definiert, in der bedeuten:
X = Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, Allyl, Vinyl, Acetyl, Amin (substituiert oder nicht substituiert), Epoxy oder Thiol;
ABSTANDSHALTER = Alkyl, Aryl, Mono- oder Polyalkoxy (wie Ethylenglycol oder Polyethylenglycol), Mono- oder Polyalkylamin, Mono- oder Polyamid, Thioesterderivate oder Mono- oder Polydisulfide;
A und B = beliebige Kombinationen von Sauerstoff-R, worin R = H, Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl oder ein anderer geradket tiger oder verzweigter Kohlenwasserstoff, Cl, Br oder eine Gruppe mit einer Funktionalität ähnlich der von X-ABSTANDSHALTER; und
C = Sauerstoff-R, worin R = H, Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl oder ein anderer geradkettiger oder verzweigter Kohlenwasserstoff, Cl, Br, oder eine beliebige andere hydrolysierbare Gruppe.
In Ausführungsformen, in denen Metall/Si-Mikrostellenelektroden verwendet werden, kann die Silanolgruppe mit Hydroxygruppen reagieren, die an ein Siliciumatom auf der Elektrodenfläche gebunden sind. In Ausführungsformen, in denen eine siliciumhaltige Gruppe nicht auf der Elektrode, sondern auf dem Träger vorhanden ist, kann die Silanolgruppe mit Hydroxygruppen reagieren, die an ein Siliciumatom auf der Trägeroberfläche gebunden sind. Am anderen Ende des Linkers umfasst die Gruppe X chemische Gruppen, die für die kovalente Reaktion mit reaktiven Zentren auf dem Permeationsschichtpolymer zur Verfügung stehen.
Wie in 4 gezeigt wird, kann die Permeationsschicht durch eine Verbindungsgruppe, die mindestens ein copolymerisierbares reaktives Zentrum aufweist, mit der Elektrode verbunden werden. Linker, die geeignete Eigenschaften haben, werden in der folgenden Tabelle angegeben:
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform verwenden die aktiven elektronischen Matrixchips, die kovalente chemische Befestigungsgruppen aufweisen, einen Linker, der unter APS, AEAPS, AHAPS, MOTS und AMPTS ausgewählt wird.
Beispiel 1 veranschaulicht die Verwendung eines Silanol-Linkers für die Verankerung der Permeationsschicht auf dem Träger, der eine Platinmikrostellenelektrode umgibt. Alternativ, falls eine Edelmetall/Silicid-Elektrode verwendet wird, kann das Elektrodenarray des Chips zunächst 5 min bei 250 mTorr und 250 Watt mit einem Argonplasma behandelt werden. Der Chip kann dann mit dem Linker durch Vakuumabscheidung über 15 min bei Raumtemperatur behandelt werden, wonach das Ganze durch zweistündiges Erhitzen bei 90 °C auf den Chip gehärtet wird. Dies führt dazu, dass der Linker kovalent an die Hydroxygruppen des Silicidanteils in der Elektrode gebunden wird. Sobald der Linker an den Mikrochip gebunden ist, kann eine UV-initiierte freie radikalische Polymerisationsreaktion zwischen den Monomeren, die die Permeationsschicht bilden, und den Vinylgruppen, die auf der Oberfläche der mit dem Linker derivatisierten Elektroden vorhanden sind, durchgeführt werden, wodurch in einem einzigen Schritt die Permeationsschicht synthetisiert und kovalent auf der Elektrode verankert wird.
ANWENDUNGEN, DIE AKTIVE ELEKTRONISCHE MATRIXVORRICHTUNGEN MIT PERMEATIONSSCHICHTEN AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM HYDROGEL VERWENDEN
Ganz allgemein können die erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel in sehr ähnlicher Weise wie früher offenbarte aktive elektronische Matrixchipvorrichtungen adressiert und verwendet werden. Eine Beschreibung des Verfahrens der elektronischen Adressierung kann in dem US-Patent 6,051,380 gefunden werden. Kurz gesagt können die Vorrichtungen adressiert werden, indem eine Lösung zugeführt wird, die ein mit einer Befestigungsgruppe derivatisiertes Molekül enthält, die auf die aktive elektronische Matrixchipvorrichtung (üblicherweise in einer Fließzellenabteilung) adressiert wird, indem eine Vorspannung an die Elektroden unter den Mikrostellen angelegt wird, an die die Molekülspezies adressiert werden soll, so dass die Elektrode eine Vorspannung aufweist, die der Ladung der Moleküle entgegengesetzt ist (z. B. positiv, falls das Molekül eine Nucleinsäure ist). Das Molekül wandert dann durch die Lösung zu der Mikrostelle und wird durch die die Befestigung erleichternde Gruppe an die Befestigungsgruppe in der Permeationsschicht gebunden (z. B. durch eine Biotiin-Streptavidin-Wechselwirkung). Wie in US-Patent 5,051,380 beschrieben, sind bevorzugte verwendbare Lösungen Puffer mit niedriger Leitfähigkeit mit beträchtlicher Pufferungskapazität, wie Histidin (vorzugsweise etwa 50 mM) oder andere zwitterionische Puffer. Auf diese Weise können Nucleinsäuresonden, Nucleinsäureproben, Amplikons von Proben, Antigene, Antikörper oder jedes sonstige geladene Molekül an spezifische Mikrostellen der Vorrichtung adressiert und für die Verwendung in verschiedenen Assayformaten befestigt werden.
Nach der Adressierung können die Vorrichtungen mit einer Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel in einer Vielzahl von Assayformaten verwendet werden. Beispielsweise können Vorrichtungen, die mit Nucleinsäuresonden oder Amplikons adressiert werden, in Dot-Blot- oder Reverse-Dot-Blot-Analysen, wie im US-Patent 5,051,380 beschrieben, Base-Stacking-Single-Nucleotid-Polymorphismus-Analysen (SNP), wie in der US-Anmeldung 09/291,129 beschrieben, SNP-Analysen mit elektronischer Stringenz, wie in der US-Anmeldung 09/727,030 beschrieben, oder in STR-Analysen, wie in dem US-Patent 6,207,373 beschrieben, verwendet werden. Zusätzlich können derartige adressierte Vorrichtungen in Formaten für die enzymatische Nucleinsäuremodifizierung, oder Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkung, wie z.B. Genexpressionsanalysen mit enzymatischem Reporting, wie in der US-Anmeldung 09/710,200 beschrieben, der Amplifikation einer verankerten Nucleinsäure, wie in dem US-Patent 6,238,868 beschrieben, oder anderen Nucleinsäuremodifizierungen, die für Festphasen-Formate geeignet sind, eingeschlossen Restriktionsendonuclease-Spaltung, Endo- oder Exonuclease-Spaltung, "Minor groove binding"-Proteinassays, Terminale-Transferase-Reaktionen, Polynucleotidkinase-Reaktionen oder Phosphatase-Reaktionen, Ligase-Reaktionen, Topoisomerase-Reaktionen und anderen nucleinsäurebindenden oder proteinmodifizierenden Reaktionen verwendet werden.
Zusätzlich sind die Vorrichtungen mit Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel ganz allgemein in Immunoassay-Formaten brauchbar. Beispielsweise können die Mikrostellen der Vorrichtungen mit Antigenen (z. B. Peptiden, Proteinen, Kohlenwasserstoffen, Lipiden, Proteoglycanen, Glycoproteinen etc.) adressiert werden, um auf Antikörper in einer Körperflüssigkeitsprobe durch Sandwich-Assays, kompetitive Assays oder andere Formate zu prü fen. Alternativ können die Mikrostellen der Vorrichtung mit Antikörpern adressiert werden, um Antigene in einer Probe durch einen Sandwich-Assay, einen kompetitiven Assay oder ein sonstiges Assayformat nachzuweisen. Da der isoelektrische Punkt von Antikörpern und Proteinen ziemlich leicht durch Experimente oder pH/Ladungsberechnungen ermittelt werden kann, können die Vorteile der elektronischen Adressierung und elektronischen Aufkonzentrierung der Vorrichtungen verwendet werden, indem einfach der pH-Wert des Puffers eingestellt wird, so dass das adressierte Molekül oder der adressierte Analyt geladen wird.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen einfachen aktiven elektronischen Matrixassayformaten sind auch Formate, die spezifische Paarbildungskomponenten als Derivatisierungsgruppen für die Befestigung von Biomolekülen für aktive elektronische Matrixchipvorrichtungen verwenden, beschrieben worden. Diese Formate erlauben die gleichzeitige elektronische Adressierung mehrerer Molekülsorten auf einen Satz von Mikrostellen unter Verwendung einer komplementären spezifischen Paarbildungskomponente (z. B. eines Pyranosyl-RNA-Oligomers), um spezifisch an eine komplementäre spezifische Paarbildungskomponente zu binden, die zuvor an der Permeationsschicht der Mikrostelle befestigt worden ist. Diese Formate können die erforderliche Zeit, um Arrays von duzenden von verschiedenen Bindungseinheitszusammensetzungen auf einem aktiven elektronischen Matrixarray zu erzeugen, dramatisch senken. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen mit Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel sind auch in diesen Formaten brauchbar, die für Arrays vom Immunoassay-Typ (siehe US-Anmeldung 09/783,763) und Nucleinsäurearrays (siehe US-Anmeldung 09/910,469) beschrieben worden sind.
Alle Patente, Patentanmeldungen und veröffentlichte Patentanmeldungen und andere Veröffentlichungen, auf die hier Bezug genommen wurde, werden durch die Bezugnahme mit ihrem vollständigen Inhalt hier eingeführt und aufgenommen, und zwar so als wären sie hier vollständig wiedergegeben worden.
BEISPIELE
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Beispiele, die die Herstellung und Verwendung von Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel auf aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen betreffen, beschrieben.
Die Rezepturen für die Puffer, die Lösungen und Medien in den folgenden Beispielen werden in J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 beschrieben.
BEISPIEL 1: BEISPIELHAFTE PERMEATIONSSCHICHTEN AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM HYDROGEL
A. Acryloyl- oder Acrylamido-Streptavidin-Herstellung
Für das Einbringen in die Formulierungen für eine Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel wurden funktionalisierte Streptavidin-Derivate mit seitenständigen Acrylgruppen für den Einbau in das Polymerrückgrat hergestellt. Streptavidin wurde entweder mit einer Acrylamidogruppe oder mit einer amidverbunden PEG-3400-Esteracryloylgruppe gemäß dem Reaktionsschema in 3 derivatisiert. Ein N-Acryloxysuccinimid stammte von Polyscien ces, Inc. und wurde so verwendet wie es geliefert wurde. α-Acryloyl, ω-N-Hydroxysuccinimidylester von Poly(ethylenglycol)-Propionsäure, (MG 3400) (PEG-NHS) wurde von Shearwater Polymers, Inc. geliefert. Streptavidin (SA) wurde von Roche Molecular Biochemicals erworben.
Natives SA (165 mg) und ein Überschuss an NHS-Reagens (2,4 mg) wurden in ein wegwerfbares Zellkulturröhrchen aus Polypropylen abgewogen. Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH 9, 12 ml) wurde zugegeben, und das Rohr wurde kurz kräftig gerührt, bis alle Feststoff vollständig aufgelöst waren. Dann ließ man die Reaktion 30 min im Dunklen weiterlaufen. Die Produkte der Streptavidin-Derivatisierungsreaktionen wurden unter Verwendung einer Gelpermeationssäule (HiPrep 26/10 GPC-Entsalzungssäule, Amersham Pharmacia Biotech) auf einem Äkta^TM-Explorer-HPLC-System (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt. Die Elution wurde mit Natriumphosphat (50 mM, pH 7) mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min durchgeführt. Der erste Peak eluierte zwischen 10 und 24 ml, und der zweite Peak eluierte nach 30 ml. Der zweite Peak enthielt das freie NHS und die überschüssige Acrylsäure, die bei der SA-Derivatisierungsreaktion und der Hydrolyse entsteht. Alle Fraktionen unter dem ersten Peak wurden gesammelt und in einem Rotationsverdampfer (SpeedVac) bei 35 °C während sechs bis sieben Stunden aufkonzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde auf Raumtemperatur gebracht, und die Proteinkonzentration wurde durch UV-Spektralphotometrie bei 280 nm gemessen. Die Konzentration wurde mit entionisiertem Wasser auf 35 mg/ml eingestellt.
Die relativen Bindungsaktivitäten von unmodifiziertem SA, N-Acryl-SA und PEG-Acryloyl-SA wurde durch einen Standard-HABA-Assay bestimmt. Unmodifiziertes SA hatte eine HABA-Aktivität von 4,0, während N-Acryl-SA eine Aktivität von 3,8 hatte. Die PEG-Acryloyl-SA hatte eine relativ niedrige Aktivität von 3,0, möglicherweise wegen der sterischen Hinderung durch die sperrige PEG-Gruppe. Wegen seiner hohen beibehaltenen Bindungsaktivität wurde das N-Acyl-SA in den Testformulierungen in einem viele Chargen umfassenden Produktionsrunde verwendet, deren Herstellung in Beispiel 3 beschrieben wird und die in 10 charakterisiert werden.
B. Aktivierung der Oberfläche der Aktiven Elektronischen Matrix für die Kovalente Verankerung der Permeationsschicht
Zur Verbesserung der Haftung der Permeationsschicht auf der Oberfläche des aktiven elektronischen Matrixchips wurde die Oberfläche mit einer Acryloylgruppe (Bind-Silane^TM (3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan), Produkt von Pharmacia Biotech) silaniert. Die aktiven elektronischen Matrixträger wurden durch Ätzen mit einem Argonplasma (100 W, 30 min) gereinigt und anschließend und Gasphasenbedingungen mit Bind-Silane^TM umgesetzt. Die Gasphasensilanierung wurde in einer Petrischale aus Polystyrol (150 × 15 mm) durchgeführt. Fünf Träger wurden zentrosymmetrisch in der Schale angeordnet. Wasser (200 μl) wurde an 5 verschiedenen Stellen des Umfangs in die Schale gegeben. Bind-Silane^TM (200 μl) wurde in eine kleine Petrischale (35 × 10 mm) gegeben, die in der Mitte der großen Schale angeordnet wurde. Die große Petrischale wurde geschlossen, und man ließ die Reaktion 15 min bei Raumtemperatur weiter stattfinden. Die Träger wurden entnommen und für das anschließende zweistündige Erhitzen in einem Ofen bei 90 °C in Petrischalen aus Glas angeordnet.
Ein Weg zur Verbesserung der effektiven Funktion eines Hydrogels als Permeationsschicht auf einem aktiven elektronischen Matrixchip besteht darin, eine starke Haftung zwischen dem Hydrogel und dem Chip zu erhalten. Durch die Vorbehandlung des Chips mit einem Silan, das polymerisierbare Gruppen aufweist, die anschließend mit ei nem Hydrogel durch Copolymerisation verbunden werden können, kann die kovalente Verbindung des Hydrogels mit der Trägeroberfläche erreicht werden. Bind-Silane^TM (3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan) wird leicht auf der plasmagereinigten aktiven elektronischen Matrix adsorbiert. Das adsorbierte Silan reagiert dann mit den Oberflächenhydroxygruppen, die durch das Plasmaätzen auf der Fläche um die Mikroelektroden auf dem Chip erzeugt worden sind, was zur Ausbildung einer stabilen silanierten Oberfläche führt. Um die vollständige Oberflächenbefestigung zu gewährleisten, wurden die Träger nach der Silanadsorption 2 h in einem Luftofen auf 90 °C erhitzt: Dieses Verfahren führt zur Abscheidung und Immobilisierung einer Oligoschicht (10-100 Schichten) des Silans. Ähnliche Studien zur Gasphasensilanierung von Oberflächen mit (3-Aminopropyl)-triethoxysilan (APS) haben gezeigt, dass die Adsorption von sauberen APS-Dämpfen zu einer stabilen chemisorbierten Schicht sowie einer weniger stabilen physisorbierten Phase führt, die durch Verdampfung entfernt werden kann.
C. Beispielhafte Formulierungen von Polymerisationsgemischen
Die Anmelder haben verschiedenen Formulierungen für Permeationsschichten auf Polyacrylamid-Basis zur Verwendung auf aktiven elektronischen Matrixchips entwickelt, von denen ein repräsentativer Satz hier gezeigt wird. Obwohl eine einzige Basispolymerrezeptur verwendet wird, können vom Fachmann alternative Rezepturen entwickelt werden, die ebenso als die synthetische Polymerkomponente der Permeationsschicht funktionieren würden. In ähnliche Weise, obwohl derivatisiertes SA mit den Permeationsschichten copolymerisiert wird, die in diesen Beispielen beschrieben werden, könnten andere geeignete Befestigungsgruppen mit der Permeationsschicht copolymerisiert werden, falls eine Nicht-Biotin-Befestigung (z. B. kovalente chemische Befestigungsgrupen oder chemische Salicylhydoxamid säure/Phenylborsäure-Gruppen) verwendet wird, um die Mikrostellen zu adressieren. Gleichermaßen könnten die Befestigungsgruppen auch vollständig weggelassen werden, falls die Permeationsschicht später an der Oberfläche derivatisiert werden soll oder eine Befestigungsschicht über eine Basispermeationsschicht gelegt werden soll. Aus den weiter oben beschriebenen Gründen hat es sich jedoch als bevorzugt herausgestellt, die Befestigungsgruppen in die Permeationsschicht in einer einzigen Schicht zu copolymerisieren.
Die Herstellung der Arylderivate von SA wird weiter oben beschrieben. Polyoxyethylen-100-stearylether (Brij 700) wurde von Sigma im Handel erworben). DMSO war ein Produkt von Aldrich. Darocur^® 4265 wurde von Ciba geliefert. Die Monomerlösungen wurden hergestellt, indem die Komponenten einfach miteinander vermischt und kräftig gerührt wurden, mit der Ausnahme, dass Darocur zunächst in DMSO gelöst wurde, bevor es zu den anderen Komponenten gegeben wurde. Die Basisrezeptur, die für die hier beschriebenen beispielhaften Permeationsschichten verwendet wurde, war eine wässrige Lösung von:
Acrylamid/Methylenbisacrylamid insgesamt 18 % G/V, 10 Mol-% Bisacrylamid
Acryloyl-PEG-SA 14 mg/ml
Darocur (zugegeben als 1,9%-ige Lösung (G/V) in DMSO), 0,2 % G/V
Brij 700:
Rezeptur 4012-1: 0 mg/l
Rezeptur 4012-2: 11 mg/ml
Rezeptur 4012-3: 18 mg/ml
Rezeptur 4006-1: 73 mg/ml
Die Rezeptur 4012-1 dient in den Anwendungsexperimenten als Kontrollzusammensetzung für ein synthetisches polymeres Hydrogel, während die Rezepturen 4012-2, 4012-3 und 4006-1 den Effekt zunehmender Mengen des als Templat wirkenden Porogens zeigen.
D. Mikroformung der Permeationsschichten aus Synthetischem Polymerem Hydrogel auf die Oberfläche des Aktiven Elektronischen Matrixchips
Ein speziell entworfenes Formgebungssystem wurde für die genaue Kontrolle sowohl der Dicke der Hydrogelschicht als auch die gleichmäßige Verteilung der UV-Strahlungsintensität entwickelt. Das System besteht aus einer Quarzmikroreaktionsform mit einer präzisionsgeformten Vertiefung, die durch mikrolithographische Standardtechniken erzeugt wird, und einer UV-Lichtquellenanordnung. Eine Lösung des Polymerisationsgemischs (0,35 μl) wurde auf die Formoberfläche gegeben, und der Mikroelektrodenarrayträger wurde mit einem Druck von etwa 1 N gegen die Form gedrückt. Die Polymerisation wurde in zwei Schritten durchgeführt, bei einer anfänglichen Intensität von 700 μW/cm² über 15 s, worauf eine höhere Intensität von 70 mW/cm² über zusätzliche 15 s folgte. Der Chip wurde von der Formoberfläche abgenommen, 5 s in einem Strom von destilliertem Wasser gewaschen und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Diese Verfahren wurde dann für den nächsten Chip wiederholt.
Die in situ-Polymerisation und Abscheidung des Hydrogels auf der Chipoberfläche wird durch das Reaktionsschema in 4 veranschaulicht. Die Reaktionsformung ist ein kontrolliertes Verfahren, das für eine exzellente Kontrolle der Dicke der geformten Schichten sorgt. Zusätzlich ist das System so konzipiert, dass die UV-Intensität kontrolliert wird, was außerdem die Kontrolle der Polymerisationsgeschwindigkeit und des Ausmaßes der Phasentrennung des Hydrogels ermöglicht. Eine Stereomikroskop-Dunkelfeld-Fotografie eines geformten Hydrogels auf einem 10 × 10-Arrayträger wird in 2 gezeigt. Die Kontrolle der Dicke über eine Charge von 136 geformten Permeationsschichten wurde getestet. Die mittlere Dicke war ziemlich einheitlich und lag bei 1,8 ± 0,3 μm. Die Polymerisationsbedingungen (UV-Intensität und Belichtungszeit) wurde unter Verwendung einer Photo-DSC optimiert. Eine optimale Phasentrennung zwischen dem entstehenden Polymer und dem als Templat wirkenden grenzflächenaktiven Stoff während der Polymerisation wurde erreicht, indem ein Zwei-Schritt-UV-Härtungsverfahren verwendet wurde: eine anfängliche Belichtung bei niedriger Intensität (700 μW/cm² über 15 s), worauf eine Belichtung bei hoher Intensität (70 mW/cm² über 15 s) folgte. Das Starten der Polymerisation bei einer geringeren Lichtintensität hat sich auch als ein Weg herausgestellt, die Bildung von Gasblasen auf Grund der exothermen Polymerisationsreaktion zu minimieren.
Dem Durchschnittsfachmann ist ersichtlich, dass dieses Verfahren leicht automatisiert werden kann, mit einer Robotertechnik, die so konzipiert ist, dass die Monomerlösung in die Form gegeben wird, der Chip über der Form positioniert wird, der Chip gegen die Form gedrückt wird, die Form bestrahlt wird usw. Dieser Verfahrenstyp kann demnach einfach an die Produktion mit hohem Durchsatz von aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen angepasst werden.
Um die vollständige Entfernung des grenzflächenaktiven Stoffs zu erreichen, wurden die Träger ausgiebig mit Wasser gewaschen. Sie wurden dann in destilliertem Wasser in einer Petrischale angeordnet, die über Nacht geschüttelt wurde, wonach sorgfältig mit fließendem destilliertem Wasser gewaschen wurde. Dies erwies sich als ausreichend, um das Brij-Tensid zu entfernen, danach erhält man die Per meationsschicht aus mesostrukturiertem synthetischem polymerem Hydrogel.
BEISPIEL 2: RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE DER STRUKTUR DER PERMEATIONSSCHICHT AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM POLYMEREM HYDROGEL
Die Morphologie der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel wurde unter Anwendung der Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Proben für die REM wurden durch den allmählichen Austausch des Wassers gegen Ethanol in einem Gradientenmodus und anschließendes Trocknen unter Anwendung der Technik der kritischen Punkt-Trocknung hergestellt. Über dieses Verfahren wurde berichtet, dass es die Gelstruktur des Polymers mit sehr geringen Veränderungen aufrechterhält. Die Rasterelektronenaufnahmen werden in den 5A & B (4012-1), 6A & B (4012-2, 7A & B (4012-3) und 8A & B (4006-1) gezeigt. Diese Mikroskopaufnahmen zeigen deutlich die Mikrostruktur des Gels in dem 5000-fach Scan und zeigen die Mesostruktur des Gels in dem 45000-fach Scan. Aus diesen Bildern ist die physikalisch heterogene Beschaffenheit der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel offensichtlich, insbesondere wenn mit der physikalisch relativ homogenen Beschaffenheit von 4012-1 verglichen wird:
Bei der Untersuchung mit 5000-facher Vergrößerung schien 4012-1 (kein Porentemplat) eine relativ gleichmäßige, nichtporöse Morphologie zu haben im Vergleich zu den andere Permeationsschichten. 4012-3 und 4006-1 zeigten eine sehr poröse Struktur mit einer breiten Verteilung größerer Poren. Die Poren in den Gelstrukturen können grob in drei Klassen eingeteilt werden:
Klasse I – Poren mit einer Größe unter 100 nm (nanoporös)
Klasse II – Poren in der Größenordnung von 100-1000 nm, hauptsächlich im Bereich von 100-500 nm (mesoporös)
Klasse III – Poren in der Größenordnung von 1-2 μm.
Die großen Poren der Klasse III (Größenordnung im Mikrometerbereich) waren nicht deutlich bei Formulierung #4012-2, obwohl Poren der Klasse II bei dieser Vergrößerung vorhanden zu sein schienen.
Die Aufnahmen mit der stärkeren Vergrößerung (45000-fach) dieser Permeationsschichten zeigten, dass die feinen Porenstrukturen der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel sehr ähnlich sind, wobei 4012-2, 4012-3 und 4006-1 eine mesoporöse Struktur zeigen. Die Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel 4012-3 und 4006-1 mit einer höheren Templat-Konzentration zeigten außerdem Mikroporen, die Bereiche aus mesoporösem Permeationsschichtmaterial voneinander trennen. Derartige Mikroporen weisen wahrscheinlich auf die Aggregation von Micellen aus grenzflächenaktivem Stoff oberhalb einer bestimmten Konzentration im Polymerisationsgemisch hin, was den scharfen Unterschied in der Morphologie zwischen 4012-2 und 4012-3 und die hingegen relativ unveränderte Morphologie zwischen 4012-3 und 4006-1 erklären könnte.
Die Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel können in drei Gruppen klassifiziert werden: 4012-1 ist nanoporös (Klasse I), 4012-2 ist mesoporös (Klasse II), während 4012-3 und 4006-1 mesoporös und mikroporös sind (Klasse II und III).
BEISPIEL 3: VERWENDUNG DES θ-WERTES FÜR DIE QUANTIFIZIERUNG DER POROSITÄT DER PERMEATIONSSCHICHTEN AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM POLYMEREM HYDROGEL
Wie durch die Rasterelektronenmikroskopaufnahmen gezeigt wird, kann die Porosität der synthetischen polymeren Hydrogele variiert werden, indem die Menge an Templat-Porogen, wie dem Brij-Tensid, das in dem Polymerisationsgemisch verwendet wird, verändert wird. Obwohl die REM-Aufnahmen brauchbar sind, um die Morphologie der Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel qualitativ und quantitativ zu bewerten, war eine weniger arbeitsintensive quantitative Porositätsmessung erwünscht. Hierfür wurde die Dunkelfeldmikroskopie verwendet, um die morphologischen Veränderungen auf Grund der Phasentrennung zu quantifzieren.
Ein dimensionsloser Parameter θ (theta) wurde verwendet, um das Ausmaß der Phasentrennung oder die Porosität auszudrücken, dessen Grundlage die Messung der Lichtstreuung unter dem Dunkelfeldmikroskop ist. Das dimensionslose Ausmaß der Phasentrennung (θ) wurden durch die Integration der Messwerte der im Dunkelfeld gemessenen Lichtintensität einer trockenen Hydrogelschicht auf dem Testchip (λ), einer Standardschicht (λ_S) mit einem mittleren Ausmaß der Phasentrennung und einer nicht phasengetrennten oder festen Schicht (λ₀) in einem Leica INM 100 Dunkelfeldmikroskop bestimmt und mit der folgenden Formel berechnet. Wenn λ₀ << 1, kann die Gleichung vereinfacht werden:
Ein Beispiel einer Oberfläche, die eine Annäherung an die ideale nicht phasengetrennte Schicht darstellen würde, wäre eine sehr glat te Oberfläche, wie aus der Gasphase abgeschiedenes Platin auf einem Siliciumwafer mit elektronischer Qualität. Die Änderung von θ von Polymerschichten als Funktion der Porosität wurde für 4012-1, 4012-2, 4012-3 und 4006-1 gemessen. Die Standardschicht war ein Polyacrylamidhydrogel mit der folgenden Zusammensetzung (Zusammensetzung S):
Acrylamid:Bisacrylamid 19:1 (mol/mol)
Gesamtmonomergehalt: 20 Gew.-%
Unter den Beleuchtungsbedingungen, die in den Beispielen verwendet wurden, war λ_S 60 ± 1,5, was für diese Experimente verwendet wurde. Der θ-Wert für 4012-1, polymerisiert ohne als Templat wirkende Porogene, betrug 1,35. Die Zugabe von Brij zu der Formulierung erhöht die Phasentrennung oder Porosität und erhöht somit den θ-Wert. Die Formulierung 4012-2 hatte ein θ von 3,06, 4012-3 hatte ein θ von 3,27 und 4006-1 hatte ein theta von 3,00. Somit hatten alle beispielhaften Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel θ-Werte im Bereich von 3,0 bis 3,5.
Mehrere mikrogeformte Permeationsschichten, die aus verschiedenen Chargen der Polymerisationsgemische hergestellt wurden, wurden unter Verwendung der obigen Technik getestet. Die Formulierung für die Permeationsschicht entsprach 4006-1, mit dem Unterschied, dass N-Acryl-SA anstelle von Acryloyl-PEG-SA verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in dem Diagramm in 10 gezeigt. Die Messung der θ-Porosität ist sehr einheitlich über zwanzig verschiedene Chargen (mittleres θ von 3,63 ± 0,07). Interessanterweise erhöhte die Verwendung von N-Acryl-SA die relative Phasentrennung oder Porosität der Permeationsschicht, verglichen mit Acyloyl-PEG-SA. Dies zeigt den Einfluss, den kleine Änderungen in der Polymerisationsrezeptur auf die Porosität haben können. Diese Daten zeigen weiterhin, dass Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem Hydrogel in einer gleichmäßigen Weise auf aktiven elektronischen Matrixvorrichtungen geformt werden können. Gleichermaßen wird so auch die Konsistenz der Lichtstreuungsmesstechnik bestätigt.
BEISPIEL 4: VERGLEICH EINER PERMEATIONSSCHICHT AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM POLYMEREM HYDROGEL MIT EINER SA-AGAROSE-PERMEATIONSSCHICHT
Um die Leistungsfähigkeit einer Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel mit Nanogen's gegenwärtiger SA-Agarose-Permeationsschicht (MSP) zu vergleichen, wurde ein SNP-Assay (SNP = "Single Nucleotide Polymorphism" = Einzelnucleotidpolymorphismus) durchgeführt unter Verwendung von aktiven elektronischen Matrixchips mit den beiden Schichten. In dem SNP1-Assay wurden ein 120 nt biotinyliertes Amplikon, 5 nM in 50 mM Histidin, elektronisch an Mikrostellen auf beiden Chips bei einem konstanten Potential von 2,1 V über 2 min adressiert. Cy-3-markierte Reporter-Oligonucleotide für das C-Allel und Cy-5-markierte Reporter-Oligonucleotide für das T-Allel, beide mit einer Länge von 12 nt, wurden dann passiv auf dem Chip hybridisiert, bei einer Konzentration von 500 nM in einem hoch konzentrierten Salzpuffer (50 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid).
Die Ergebnisse werden in 11 gezeigt. Die mittleren Fluoreszenzintensitätsmesswerte für einen SNP1-Assay, der auf drei aktiven elektronischen Matrixchipvorrichtungen mit 4006-1-Permeationsschichten durchgeführt wurde, lagen im Allgemeinen oberhalb von 2000 für alle drei getesteten Chips. Beide Allel-Sonden (C-Allel-Cy-3, und T-Allei-Cy-5) wurden gut nachgewiesen, was die leichte Identifizierung von heterozygoten Amplikon-Proben ermöglicht. Verglichen mit den Ergebnissen des gleichen Assays, der auf einem Standard- SA-Agarose-Permeationsschichtchip durchgeführt wurde, zeigte die die Formulierung 4006-1 für eine Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel eine verbesserte Signalintensität in dem SNP-Assay. Die Fluoreszenzintensitätsmesswerte auf den 4006-1-Chips waren im Allgemeinen höher als diejenigen, die unter Verwendung des SA-Agarose-Chips erhalten wurden.
Ähnliche SNP-Assays von klinischem Interesse wurden auf zwanzig 4006-1 N-Acryl-SA-Chips unter Verwendung von Amplikons von Probennucleinsäuren mit einer Länge von etwa 150 bis etwa 250 und von "Base-Stacking"-Format-Reportersonden durchgeführt. Im Allgemeinen wurden biotinylierte Amplikons in relativ niedrigen Konzentrationen elektronisch an Mikrostellen auf den aktiven elektronischen Matrixchips in 50 mM Histidin-Puffer adressiert. Stabilisiersonden und Base-Stacking-stabilisierbare Allel-spezifische Reportersonden (Cy-3- und Cy-5-markiert) wurden dann passiv an die adressierten Amplikons unter höheren Konzentrations- und hohen Salzgehaltbedingungen hybridisiert. Die Messungen der mittleren Fluoreszenzintensität wurden dann durchgeführt, nachdem eine thermische Stringenzbedingung angelegt wurde. Die die Leistungsfähigkeit betreffenden Ergebnisse der Assays werden in der folgenden Tabelle gezeigt:
Wie aus den Ergebnissen in der obigen Tabelle entnommen werden kann, zeigte der aktive elektronische Matrixchip 4006-1 eine sehr gute Leistungsfähigkeit in den getesteten SNP-Assays mit einem exzellenten Unterscheidungsverhältnis zwischen Allelen (Cy-3- und Cy-5-markierte Reporteroligos). SNP2 und SNP3 wurden in einem Multiplex-Assay-Format getestet, in dem beide Amplikons individuell von einer Nucleinsäureprobe amplifiziert und dann gleichzeitig an die gleiche Mikrostelle adressiert und durch die sequentielle Hybridisierung mit den Reporter-Oligomeren getestet wurden. Die Fluoreszenz ergebnisse wurden sequentiell abgelesen, nachdem die thermische Stringenzbedingung angelegt wurde, um einen Satz von Reporteroligomeren zu entfernen. Die beiden Versuche ohne Signal für SNP2 erwiesen sich später als ein Versagen der Amplifikation in der speziellen Nucleinsäureprobe.
BEISPIEL 5: VERGLEICH DES ANBINDENS VON KURZEN UND MITTELLANGEN NUCLEINSÄUREN IN PERMEATIONSSCHICHTEN AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM POLYMEREM HYDROGEL
Das im Handel erhältliche "Nanogen NanoChip^® Molecular Biology Workstation"-Chipadressierungsmodul (Nanogen, Inc.) ist imstande, vier Chips unter im Wesentlichen den gleichen Bedingungen zur gleichen Zeit zu adressieren. Daher wurden für die Vergleichsexperimente zu den Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel vier Chips mit vier verschiedenen Acryloyl-PEG-SA-Hydrogel-Formulierungen (4012-1, 4012-2, 4012-3 und 4006-1) in das Adressierungsmodul eingesetzt und Seite an Seite gemäß den folgenden Verfahren adressiert.
Die Fähigkeit von relativen kleinen Nucleinsäuren (Länge unter 50 nt), an copolymerisierte SA-Bindungsgruppen in den Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel zu binden, verglichen mit Permeationsschichten aus nanoporösem synthetischem polymerem Hydrogel (wie normalen vernetzten Acrylamidhydrogelen), wurde durch einen Direktbindungsassay ermittelt. Dies ist eine direkte Messung des Ausmaßes der Bindung von relativ kleinen Nucleinsäuren, wie sie für Capture-Sonden verwendet würde, auf die Chips mit einer Permeationsschicht aus synthetischem polymerem Hydrogel. Eine Fluorophor-markierte 46-nt-DNA, die am 5'-Ende biotinyliert war, 5 nM, wurde elektronisch auf den Chip adressiert (2,0 V, 60 s). Da die Nucleinsäuren direkt mit dem Fluorophor mar kiert wurden, war die Fluoreszenzintensität auf dem Chip ein direktes Maß für das Ausmaß der DNA-Anbindung. Die Ergebnisse des Assays werden in der mit der Raute markierten Linie in 12 gezeigt.
Zur Messung der Fähigkeit von mittelgroßen Nucleinsäuren (Länge von etwa 60-150 Nucleotiden), an copolymerisierte SA-Befestigungsgruppen in den Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel, verglichen mit Permeationsschichten aus nanoporösem synthetischem polymerem Hydrogel, wurde ein Dot-Blot-Assay verwendet. Ein 114-nt-Einzelstrang-DNA-Amplikon, das am 5'-Ende biotinyliert war, 5 nM, wurde elektronisch unter den gleichen elektronischen Bedingungen an die Chips adressiert. Ein Fluorophor-markiertes Reporter-Oligonucleotid (12 bp) wurde dann passiv an die Amplikons hybridisiert, die an den Chip gebunden waren. Die Fluoreszenzintensitätsergebnisse für die verschiedenen Formulierungen für Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel sind durch die mit Quadraten markierte Linie in 12 angegeben.
Demnach scheinen nanoporöse Hydrogele, wie # 4012-1, die Bindungswechselwirkungen mit kürzeren Oligonucleotiden zu fördern. Die MFI-Messwerte für das 114-mer waren beinahe 3-mal geringer als die Messwerte eines 46-mers. Die Anbindung der längeren DNA (114-mer) nahm drastisch zu (~4-fach), wenn eine mesoporöse Permeationsschicht (4012-2, 4012-3 und 4006-1) verwendet wurde. Die erhöhte Signalintensität korreliert direkter mit der erhöhten Porosität (θ) bis zu einem θ größer als etwa 3,0 (d.h. Zusammensetzung 4006-1). Diese Daten schlagen vor, dass die maximale Leistungsfähigkeit für diesen Typ von Assay erhalten werden kann, wenn eine Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem Hydrogel mit einer Porosität in einem θ-Bereich von etwa 2 bis etwa 3 verwendet wird. In die sen Daten zeigten die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel einen deutlichen Vorteil gegenüber der Permeationsschicht aus nanoporösem synthetischem polymerem Hydrogel wenn Amplikons adressiert wurden, die eine Größe haben, die häufig für SNP, STR oder die Genexpressionsanalyse verwendet wird. Dies kann das Ergebnis einer erhöhten Zugänglichkeit des immobilisierten Streptavidins für die lange DNA durch die größeren Poren sein.
Die kürzere DNA (46-bp) zeigte jedoch eine leichte Abnahme der Bindung mit erhöhter Porosität. Die Ergebnisse zusätzlicher Experimente schlagen vor, dass unter den Bedingungen der elektronischen Adressierung kürzere DNA durch die Permeationsschicht aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel hindurchdringen kann, ohne dabei genügend Zeit zu haben, die Streptavidin-Biotin-Komplexierung zu erreichen. Dies wurde weiterhin bestätigt durch passive DNA-Bindungsexperimente (d. h. das Fehlen eines angelegten elektrischen Feldes), bei denen die kurze DNA gleich gut an mesoporöse Schichten wie an nichtporöse Schichten band.
BEISPIEL 6: VERGLEICH DER LINEARITÄT DES PRIMER-EXTENSIONS-REPORTINGS IN PERMEATIONSSCHICHTEN AUS MESOPORÖSEM SYNTHETISCHEM POLYMEREM HYDROGEL
In Multiplex-Assays, in denen das Vorhandensein und/oder die Menge einer großen Zahl von Amplikons nachgewiesen werden soll, ist der Primerextensions-Nachweis der Amplikons wünschenswert, um die Reporter/Stabilisator-Sonden-Dimerisierung zu vermeiden. Demnach wurde, um die vier Formulierungen für synthetische polymere Hydrogele zu testen, die elektronische Hybridisierung einer Ziel-Desoxyribonucleinsäure (78 nt) durchgeführt, auf die das enzymatische Reporting auf den Chips folgte. Anfänglich wurde ein Capture- Oligonucleotid (500 nM), das komplementär zu der Ziel-DNA-Sequenz ist, auf den Chip geladen und anschließend elektronisch mit verschiedenen Konzentrationen (0,5 nM, 1,0 nM, 2,0 nM, 4,0 nM, 8,0 nM und 16,0 nM) der Zielsequenz (Target) hybridisiert. Die enzymatische Primerextension unter Verwendung von dNTPs, die dCTP-Cy5 enthalten, wurde verwendet, um das Ausmaß der Zielsequenzhybridisierung zu quantifizieren.
In diesen Assays wird die Fluoreszenzintensität, die auf dem Chip gemessen wird, hauptsächlich von zwei Faktoren beeinflusst: der Effizienz der Anbindung der DNA auf dem Chip, und die Effizienz der Capture-Primerextension durch das Polymerase-Enzym. Die Extensionsreaktion hängt von der Porosität der Polymeroberfläche und der nachfolgenden Zugänglichkeit zu der DNA in der Matrix ab. Die Ergebnisse werden in 13 gezeigt.
Wie in 13 gezeigt wird, zeigte die Permeationsschicht aus nanoporösem synthetischem polymerem Hydrogel, 4012-1, eine relativ lineare Zunahme der MFI für eine Zielsequenz-Konzentration von bis zu ~2 nM. Eine weitere Erhöhung der Konzentration führte zu keiner Zunahme der Signalintensität. Dieses Phänomen kann durch einen kombinierten Effekt aus 1) einer Abnahme der Zielsequenzhybridisierung und/oder 2) einer Abnahme des Zugangs des Polymeraseenzyms zu der hybridisierten Nucleinsäure verursacht werden. Im Gegensatz hierzu zeigten die Permeationsschichten aus mesoporösem synthetischem polymerem Hydrogel (4012-2, 4012-3 und 4006-1) eine gut lineare Zunahme der Signalintensität mit zunehmender Konzentration der Zielsequenz über den gesamten Konzentrationsbereich, der zwei Größenordnungen überspannte. Dieser Typ einer linearen Antwortkurve ist wünschenswert für Anwendungen, in denen quantitative Zusammenhänge zwischen den Zielnucleinsäuren untersucht werden, wie in der Genexpressionsanalyse, oder in Viruslast/Populations-Studien.
BEISPIEL 7: VERGLEICH VERSCHIEDENER FORMULIERUNGEN FÜR PERMEATIONSSCHICHTEN AUS SYNTHETISCHEM HYDROGEL UNTER VERWENDUNG DER LICHT-STREUUNGS-θ-TECHNIK UND DES REVERSE-DOT-BLOT-NUCLEINSÄURE-ASSAYS
Um den Effekt verschiedener Mengen des als Templat wirkenden Porogens auf die Porosität der Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel, gemessen mit Hilfe des θ-Wertes, zu untersuchen, wurden wie weiter oben beschrieben Permeationsschichten auf aktiven elektronischen Matixchipträgern ausgebildet, indem die Basispolymerisationsgemische mit verschiedenen zugegebenen Mengen an Brij-700-Tensid verwendet wurden. Folgende Konzentrationen wurden verwendet (mg/ml): 0,0, 3,9, 9,3, 18,6, 55,8, 71,3, 80,6, 102,3 und 170,4. Da die kritische Micellkonzentration für die meisten Brij-Tenside 1 mg/ml beträgt, war 3,9 die niedrigste verwendete Konzentration. Der Standard-λ-Wert, der für die θ-Messung verwendet wurde, betrug 60 ± 1,5. Wie in 14 gesehen wird, zeigten die Permeationsschichten aus synthetischem polymerem Hydrogel eine ziemlich merkliche Zunahme der Phasentrennung, oder Porosität, im Bereich der niedrigeren Konzentrationen an Templat-Tensid. Dies schwächte sich oberhalb von 80 mg/ml Brij-700-Tensid auf einen maximalen θ-Bereich von etwa 3,5 ab. Dies stimmt mit den Beobachtungen zur Porosität durch die REM-Untersuchung der Permeationsschichten überein, die in Beispiel 2 beschrieben wird.
Obwohl die obige Erfindung in einigen Details durch Veranschaulichung und Beispiele mit dem Ziel der Klarheit und des Verständnisses beschrieben worden ist, ist es dem Durchschnittsfachmann im Lichte der Lehre dieser Erfindung ohne weiteres offensichtlich, dass bestimmte Änderungen und Modifizierungen durchgeführt werden können, ohne dass man sich dadurch vom Gegenstand der beigefügten Ansprüche entfernt.

Claims

Aufbau, der umfasst: eine Elektrode auf einem Träger; und eine Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel, die auf der Elektrode liegt, wobei die Permeationsschicht Mesoporen aufweist, die eine Porengröße im Bereich von 100 nm bis 1000 nm haben.
Aufbau nach Anspruch 1, wobei die Permeationsschicht außerdem Mikroporen aufweist, die eine Porengröße im Bereich von 1,0 μm bis 3,0 μm haben.
Aufbau nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Permeationsschicht einen θ-Wert im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 4,0 hat, verglichen mit einer Standardzusammensetzung einer Permeationsschicht, die ein Acrylamid:Bisacrylamid-Verhältnis von 19:1 mol/mol und einen Gesamtmonomergehalt von 20 Gew.-% aufweist.
Aufbau nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die Permeationsschicht im trockenen Zustand eine Dicke im Bereich von 0, 5 μm bis 10 μm aufweist.
Aufbau nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei das Polymer ein polymerisiertes Acryloyl- oder Acrylamidomonomer umfasst.
Aufbau nach Anspruch 5, wobei das Acryloyl- oder Acrylamidomonomer unter Acrylamiden, N-substituierten Acrylamiden, N-substituierten Methacrylamiden und Methacrylamid ausgewählt wird.
Aufbau nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die Permeationsschicht kovalent auf der Elektrode verankert ist.
Aufbau nach Anspruch 7, wobei die Elektrode ein siliciumhaltiges leitfähiges Material umfasst.
Aufbau nach Anspruch 8, wobei die Elektrode ein Material umfasst, das unter Platinsilicid, Titansilicid, Goldsilicid und Wolframsilicid ausgewählt wird.
Aufbau nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die Permeationsschicht um die Elektrode herum kovalent auf dem Träger verankert ist.
Aufbau nach Anspruch 10, wobei die Permeationsschicht außerdem kovalent auf der Elektrode verankert ist.
Aufbau nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, wobei die Permeationsschicht eine copolymerisierte Befestigungsgruppe für die Befestigung spezifischer Bindungseinheiten umfasst.
Aufbau nach Anspruch 12, wobei die spezifische Bindungseinheit mit dem synthetischen polymeren Hydrogel durch eine Struktur der allgemeinen Formel
copolymerisiert ist, worin P eine polymerisierbare Gruppe ist, die kovalent mit einer oder zwei Gruppen verbunden ist, die ausgewählt werden unter: einer Monomer-Einheit des synthetischen Polymers und einer weiteren Gruppe P-X-R, die wie hier definiert ist, wobei die weitere Gruppe P-X-R der ersten Gruppe P-X-R entsprechen kann oder von dieser verschieden sein kann, wobei weiterhin die gestrichelte Linie eine kovalente Bindung zu der zweiten Gruppe ist, falls P kovalent mit zwei Gruppen verbunden ist; X eine kovalente Bindung oder eine Verbindungsgruppe ist; und R eine funktionelle Gruppe für die kovalente oder nicht-kovalente Anbindung eines Biomoleküls ist.
Aufbau nach Anspruch 13, wobei R mit einem Biomolekül verbunden ist.
Aufbau nach Anspruch 14, wobei das Biomolekül unter Nucleinsäuren und Proteinen ausgewählt wird.
Aufbau nach Anspruch 13, wobei R ausgewählt wird unter: Biotin, Avidin, Streptavidin, sonstigen Biotinbindungsgruppen, Aldehyd-, Carbonsäure-, Acylhalogenid-, Succinimidyl-, Maleimidyl-, Thiol-, Hydrazid-, Hydrazin-, Amin-, Ester-, Thioester-, Ketal-, Disulfidgruppen, Hydrazidgruppen, Succinimidylestergruppen, Aldehydgruppen und Psoralengruppen.
Aufbau nach Anspruch 13, wobei P unter Acrylamid-, Acrylat-, Methacrylat-, Methacrylamid-, Allyl-, Amino-, Epoxygruppen, Acryloyl- und Acrylamidogruppen ausgewählt wird.
Aufbau nach Anspruch 13, wobei X unter einer kovalenten Bindung und einem Polyalkylenglykol-Linker ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung ein Permeationsschicht aus mesoporösem, synthetischem, polymerem Hydrogel, die auf einer Elektrode auf einem Träger liegt, wobei das Verfahren umfasst: a) Einbringen eines geeigneten Volumens eines Polymerisationsgemischs, das polymerisierbare Monomere, ein Vernetzungsmittel und ein Porogen enthält, das imstande ist, Mesoporen zu erzeugen, in einen Formhohlraum einer Mikroform, wobei der Formhohlraum einen Boden und mindestens eine Seite aufweist; b) Inkontaktbringen eines Trägers, der eine Vielzahl von Elektroden auf dem Träger aufweist, mit der Form, um ein geschlossenes Volumen des Polymerisationsgemischs zu erzeugen, wobei sich das geschlossene Volumen mit mindestens einer der Elektroden auf dem Träger im Kontakt befindet; c) Polymerisieren des Polymerisationsgemischs unter Ausbildung einer Permeationsschicht aus einem mesostrukturierten, synthetischen, polymeren Hydrogel; und d) Entfernen der Mikroform.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Porogen ein als Templat wirkendes Porogen ist, wobei das Verfahren weiterhin nach Schritt (c) die selektive Entfernung des als Templat wirkenden Porogens aus der Permeationsschicht aus dem mesostrukturierten, synthetischen, polymeren Hydrogel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das als Templat wirkende Porogen ein micellbildender grenzflächenaktiver Stoff ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der micellbildende grenzflächenaktive Stoff ein nichtionischer grenzflächenaktiver Stoff ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der micellbildende grenzflächenaktive Stoff einen Polyether und eine aliphatische Kohlenstoffkette umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der micellbildende grenzflächenaktive Stoff ein Brij-Tensid mit einem Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 10000 ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der micellbildende grenzflächenaktive Stoff ein Brij-Tensid mit einem Molekulargewicht im Bereich von 4500 bis 5000 ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die selektive Entfernung des als Templat wirkenden Porogens das Spülen der Permeationsschicht mit einem wässrigen Lösemittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Polymerisationsgemisch einen mit Hitze aktivierbaren Polymerisationsinitiator enthält, wobei das Verfahren weiterhin das Erhitzen des geschlossenen Volumens des Polymerisationsgemischs zur Initiierung der Polymerisation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Polymerisationsgemisch einen mit Licht aktivierbaren Polymerisationsinitiator enthält, wobei das Verfahren weiterhin die Bestrahlung des geschlossenen Volumens des Polymerisationsgemischs mit einer geeigneten Lichtwellenlänge zur Initiierung der Polymerisation umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Polymerisationsgemisch einen redoxaktivierbaren Polymerisationsinitiator enthält.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei mindestens ein Teil des Formhohlraums der Mikroform durchlässig für die geeignete Lichtwellenlänge ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Oberfläche der mindestens einen Elektrode, die mit dem geschlossenen Volumen in Kontakt steht, mit einer Verankerungsgruppe derivatisiert worden ist, die eine copolymerisierbare Gruppe enthält.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die copolymerisierbare Gruppe eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei sich eine Oberfläche des Trägers mit dem geschlossenen Volumen im Kontakt befindet, wobei weiterhin die Oberfläche des Trägers mit einer Verankerungsgruppe derivatisiert worden ist, die eine copolymerisierbare Gruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die copolymerisierbare Gruppe eine Acryloyl- oder Acrylamidogruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Polymerisationsgemisch weiterhin eine copolymerisierbare Befestigungsgruppe für die Befestigung spezifischer Bindungseinheiten aufweist.