DE60219207T2

DE60219207T2 - Diagnostisches testverfahren

Info

Publication number: DE60219207T2
Application number: DE60219207T
Authority: DE
Inventors: Andrew John Balmain SLOANE; Robert Arthur Greenwich COLE; David Ian Balgowlah MARLBOROUGH; William Samuel Hunter
Original assignee: Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd
Current assignee: Proteome Systems Ltd
Priority date: 2001-12-12
Filing date: 2002-12-12
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2022-12-13
Also published as: CN1646909A; CA2469935A1; US7875435B2; WO2003050537A1; US20100323369A1; DE60219207D1; US20050164404A1; CA2469935C; JP4551660B2; CN100510747C; EP1461615B1; US8067246B2; ATE358274T1; EP1461615A4; JP2005512090A; EP1461615A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein diagnostisches Testverfahren und insbesondere eine Vorrichtung für die Verwendung bei der Durchführung eines Untersuchungsvorganges und ein Verfahren zur Durchführung eines Untersuchungsvorganges unter Verwendung dieser Vorrichtung.
Hintergrund der Erfindung
Hintergrundtechnik
Die Lateralfluß- und die Durchflußtechnologie wurden für diagnostische Untersuchungen seit fast 20 Jahren verwendet. Die Lateralflußtechnologie ist derzeit vorherrschend, denn Lateralflußvorrichtungen sind leicht herzustellen, und die Untersuchung kann in einem einfachen Zweistufenvorgang durchgeführt werden, der für die Vollbluttrennung angepaßt werden kann. Dies führt zu einer einfachen Vorrichtung, die auf dem Gebiet als eine schnelle Diagnose an der Behandlungsstelle verwendet werden kann (Cole et al. 1996 Tuberc. Lung. Dis. 77:363-368). Jedoch ist die Mehrfacherkrankungs-Diagnose unter Verwendung der Lateralflußtechnologie sehr schwierig wegen Unterschieden der Querdiffusion zwischen Proben und der Variation der Fließgeschwindigkeiten zwischen Chargen der Partitionsmembran. Dies bedeutet, daß Antigen- oder Antikörpersignalstärken sowohl innerhalb der Versuche als auch zwischen Versuchschargen variieren können, was zu uneinheitlichen Ergebnissen führt.
Vorhandene Durchfluß-Diagnosetests können in weniger als 2 Minuten vollendet werden im Vergleich zu typischen Zeiten von 5 bis 15 Minuten für Lateralflußtests. Dieser Vorteil bei der Geschwindigkeit geht jedoch oft auf Kosten der Empfindlichkeit. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß höhere Probenvolumina erforderlich sind, um dieselbe Empfindlichkeit wie der Lateralfluß zu erreichen. Dies kann bei einigen Situationen problematisch sein. Z. B. erfordert die Diagnose von Analyten (Reagenzien) im Vollblut die Trennung von Plasma aus Vollblutzellen. Die höheren Volumina des Vollblutes, die hierfür erforderlich sind, würden die Membranen in der Durchflußausführung schnell blockieren.
Das Grundprinzip von Durchflußuntersuchungen ist gut festgelegt. Die Versuche sind ausgestaltet, um die Existenz und in einigen Fällen die Menge eines vorbestimmten Analyten/Reagenzes in einer Probe zu bestimmen. Das Reagenz ist oft ein Protein, aber andere Reagenzien können darauf getestet werden. Wenn die Untersuchung vorgesehen ist, auf die Existenz einer besonderen Krankheit in einem Patienten zu prüfen, können die Körperfluide des Patienten auf einen Antikörper oder ein anderes Protein getestet werden, welches von einem Patienten in Reaktion auf die Infektion produziert ist, oder auf ein Protein, welches durch das Bakterium oder das virale Agens oder dergleichen, welches die Krankheit hervorruft, exprimiert wird. Bei einer typischen Durchflußuntersuchung wird eine flüssige Probe, von der man glaubt, daß sie das Reagenz enthält, über eine Membran in eine Absorbensunterlage gesaugt, wobei an der Membran ein Einfanganalyt angelagert ist, von dem man weiß, daß er das Reagenz bindet. Die Membran wird dann in typischer Weise mit einer Pufferlösung gewaschen, und eine einen Nachweisanalyten enthaltende Flüssigkeit, wobei der Analyt sich auch an das Reagenz anlagert und einen Tracer oder einen Marker einschließt, der nachweisbar ist, wird auf die Membran aufgebracht. Der Nachweisanalyt lagert sich an das immobilisierte Reagenz an, welches an der Membran angelagert ist, und kann gesehen oder anderweitig erkannt werden, um die Gegenwart des Reagenzes anzuzeigen.
US 4,246,339 offenbart eine Versuchsvorrichtung für die Untersuchung von flüssigen Proben auf die Gegenwart eines vorbestimmten Reagenzes. Die Vorrichtung weist ineinanderschiebende obere Bodenteile auf, welche zwischen sich einen Flüssigkeitsvorrat bilden, sowie Federmittel für das Vorspannen der Teile in die offene Position. Das obere Teil bildet eine Reihe von Testwannen, deren jede eine Basis hat, die durch eine mikroporöse Membran mit einem Einfanganalyten gebildet wird, der auf der Membranoberfläche immobilisiert ist. Absorbensmittel sind in dem Bodenteil angeordnet, im Abstand von der Membran in der offenen Position, aber in Kontakt mit dieser in der geschlossenen Position. US 4,246,339 beschreibt die Zugabe des Testserums, welches mit einer Pufferlösung verdünnt ist, zu einer Erprobungswanne und das Inkubieren der Vorrichtung bei Raumtemperatur 10 Minuten lang vor dem Niederdrücken der Kassette in die geschlossene Position, um die Probe durch die Membranen in das Absorbensmaterial zu bringen. Wenn die Membranen trocken sind, wird die Membran gewaschen und dann mit einer Lösung abgedeckt, welche einen Nachweisanalyten enthält, der sich an das immobilisierte Reagenz anlagert, gefolgt von einem nachfolgenden Schritt, bei welchem ein Färbemittel angewendet wird.
Man erkennt, daß das in der US 4,246,339 beschriebene Verfahren etwas lang, zeitaufwendig und ein ermüdender Vorgang ist, dem es auch an Empfindlichkeit mangelt.
Eine jüngere Durchflußvorrichtung ist in der US 5,185,127 beschrieben, die eine Untersuchungsvorrichtung zeigt mit einem Filterstapel und einer Einschließung mit einem Basisabschnitt und einem Deckel. Der Filterstapel hat eine hydrophile Membran und einen Einfanganalyten auf dieser, welcher in der US 5,185,127 Binder genannt wird. Eine hydrophobe Membran ist unter der hydrophilen Membran angebracht, und eine Unterlage aus Absorbensmaterial befindet sich unter der hydrophoben Membran. Der Deckel weist eine sich nach oben erstreckende Rippe auf, die eine Ausnehmung bildet, in welcher sich ein Einsatz befindet. Bei der Benutzung wird eine das Reagenz enthaltende (in der US 5,185,127 das Analyt genannte) Probe in der Wanne der Untersuchungsvorrichtung angeordnet, wobei sich zu dieser Zeit das Reagenz/der Analyt an den Einfanganalyt/Binder anlagert. Der Fluß der Untersuchungslösung findet jedoch nicht statt, denn die wässrige Lösung benetzt nicht die hydrophobe Membran, die in dem Filterstapel unter der hydrophilen Membran angeordnet ist. Somit ist so viel Zeit erlaubt wie nötig, um das Anlagern des Nachweisanalyten an das Reagenz zu vollenden. Wenn man entscheidet, daß das Anlagern vollendet ist, kann der Fluß dadurch begonnen werden, daß ein Benetzungsmittel zugegeben wird, welches die hydrophobe Membran befeuchtet. Nach dieser Zeit fließt die wässrige Flüssigkeit in die Unterlage des Absorbensmaterials. Die Membran kann dann gewaschen und mit einem Nachweisanalyten/Tracer behandelt werden, der ein Antikörper sein kann, welcher sich speziell an den Analyten anlagert, wobei der Antikörper eine Markierung hat, welches versteckt mit diesem verbunden ist. Wieder fehlt die Empfindlichkeit der US 5,185,127 und ist nicht äquivalent derjenigen, die man bei Lateralflußausführungsformen oder ELISA-Ausführungsformen erhältlich hat.
Allgemeine Information
Die hier benutzten Begriffe „abgeleitet von" oder „Derivat" sollen andeuten, daß ein spezielles Ganzes aus einer besonderen Quelle, wenngleich nicht notwendigerweise direkt aus dieser Quelle, erhalten werden kann.
Wenn der Kontext nicht etwas anderes erfordert oder speziell das Gegenteil ausdrückt, umfassen ganze Dinge, Schritte oder Elemente der hier erwähnten Erfindung, die als einzelne ganze Teile, Schritte oder Elemente erwähnt sind, klar sowohl einzelne als auch Mehrfachformen der erwähnten ganzen Teile, Schritte oder Elemente.
Die hier beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung bezüglich einer beliebigen einzelnen Ausführungsform und insbesondere bezüglich einer Vorrichtung und eines Verfahrens zum Untersuchen sollen mutatis mutandis auch für andere Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung gelten.
Durchweg verstehen sich in dieser Beschreibung, wenn der Kontext nicht etwas anderes verlangt, die Worte „aufweisen" oder Variationen, wie z. B. „aufweist" oder „aufweisend", so, daß sie das Einschließen eines angegebenen Schrittes oder Elementes oder ganzen Teiles oder einer Gruppe von Schritten oder Elementen oder ganzen Teilen beinhalten, ohne irgendwelche anderen Schritte oder Elemente oder ganze Teile oder Gruppen von Elementen oder ganzen Teilen auszuschließen.
Der Fachmann erkennt, daß die hier beschriebene Erfindung auch auf andere Weise als speziell beschrieben verändert und modifiziert werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist mit ihrem Geltungsbereich nicht durch die speziellen hier beschriebenen Beispiele beschränkt.
Die vorliegende Erfindung wird ohne ungebührliche Versuche durchgeführt, wobei – sofern nicht anders ausgeführt – herkömmliche Techniken der Immuncytochemie verwendet werden, wie z. B. die Immungold-Markierung und die Proteomik. Diese Vorgänge werden z. B. in den folgenden Texten beschrieben:
Colloidal Gold – A New Perspective For Cytochemical Marking, Beesley J. (1989), Royal Microscopical Society Handbook No. 17, Oxford Science Publications. Oxford University Press. (Paperback),
An Introduction to Immunocytochemistry: Current techniques and problems, Polak J. and Van Noorden S. (1984) Royal Microscopical Society Handbook No. 11. Oxford Science Publications. Oxford University Press. (Paperback),
Immunocytochemistry – Modern Methods and Applications, Polak J. and Van Noorden S. (1986) (2. Ausgabe), Butterworth Heinemann, Oxford. (Hardback),
Techniques in Immunocytochemistry, Bullock G. and Petrusz P. (1982-1989) (4 Bände) Academic Press. (Paperback), und
Colloidal Gold – Principles, Methods and Applications, Hayat M., (1989-1990) (3 Bände), Academic Press. (Hardback).
Weil der Stand der Technik mit einer Terminologie nicht einheitlich ist, werden zur Vermeidung von Zweifeln und zwecks Klarheit die folgenden Begriffe, die in der nachfolgenden Beschreibung benutzt werden, wie folgt bestimmt. Der Begriff „Reagenz" oder „Zielanalyt" (Targetanalyt) wird verwendet, um sich auf ein Makromolekül (z. B. Protein oder Enzym) oder sein Fragment oder dergleichen zu beziehen, welches durch eine Untersuchung nachzuweisen ist. Der Begriff „Einfanganalyt" wird verwendet, um sich auf eine „Einfang"-Verbindung zu beziehen, die an einer Membran angelagert ist und an welche sich das Reagenz anlagert. Der Begriff „Nachweisanalyt" wird benutzt, um sich auf einen Analyten zu beziehen, der eine „Nachweis"-Verbindung aufweist, die sich auch an das Reagenz anlagert, und ebenso ein „nachweisbares" Element. Das nachweisbare Element wird in typischer Weise visuell nachgewiesen, entweder unter sichtbarem Licht oder Fluoreszenz.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach einem ersten breiten Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für eine Vorrichtung und ein Verfahren für die Verwendung in einem Untersuchungsvorgang, der gekennzeichnet ist durch Schaffung eines „Vorinkubationsschrittes", bei welchem ein Reagenz und ein Mehrfacherfassungsanalyt sich aneinander anlagern können, was die Wirkung hat, daß sowohl die Empfindlichkeit der Untersuchung verbessert wird als auch das Volumen der Probe reduziert wird, welches für eine Untersuchung vor der Reaktion des Proben-/Analyt-Komplexes mit einer Reaktionsmembran erforderlich ist, an welcher ein oder mehrere Liganden angelagert sind.
Bei einer Ausführungsform ist der Erfassungsanalyt ein Mehrfacherfassungsanalyt mit mehr als einer Erfassungsverbindung, die an einem erfassbaren Element angelagert ist.
Deshalb ist bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Untersuchungsvorgang vorgesehen mit:
einem ersten Teil mit einer ersten, porösen Reaktionsmembran, an welche ein Einfanganalyt angelagert ist für das Anlagern an ein zu erfassendes Reagenz, wobei das Teil eine obere und eine untere Fläche hat;
einem zweiten Teil, welches ein Körper eines absorbierenden Materials ist, wie z. B. Seidenpapier oder dergleichen, welches unter der unteren Fläche des ersten Teils angeordnet ist und diese berührt;
einer Kammer für die Aufnahme einer flüssigen Probe, die im Abstand über dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände und eine Basis hat, die von einer zweiten Membran festgelegt ist; wobei die Kammer in der Lage ist, eine vorbestimmte Inkubationszeit lang eine flüssige Probe zurückzuhalten; und
Mitteln für das Halten der Kammer über dem ersten Teil in zwei Positionen, einer ersten Position, in welcher die Membran in einem ausreichenden Abstand von dem ersten Teil so angeordnet ist, daß sie nicht einen Fluidtransfer von der Kammer zu dem Körper des absorbierenden Materials gestattet, und einer zweiten Position, in welcher sich die Membran mit dem ersten Teil in Berührung befindet, wobei diese Berührung eines Fluidtransfer von der Kammer durch die erste und zweite Membran zu dem Körper von absorbierendem Material gestattet.
Nach einem ähnlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für das Untersuchen auf die Gegenwart eines vorbestimmten Reagenzes in einer flüssigen Probe vorgesehen, wobei eine Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird, mit folgenden Schritten:

a) Anordnen einer flüssigen, zu untersuchenden Probe und eines Erfassungsanalyten in der Kammer, wobei sich die Kammer in der ersten Position befindet;
b) Erlauben des Durchgangs für den Erfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang, um sich an das Reagenz anzulagern, falls es vorhanden ist;
c) Niederdrücken der Kammer zu der zweiten Position, um die Basis der Kammer mit der ersten porösen Membran in Berührung zu bringen;
d) Vorsehen der Möglichkeit, daß die Probe durch die erste und zweite Membran fließt, um es dem Reagenz zu ermöglichen, wenn es vorhanden ist, sich an den Einfanganalyten anzulagern, der auf der ersten Membran getragen wird,

Der hier verwendete „Mehrfacherfassungsanalyt" bezieht sich auf einen Erfassungsanalyten, der mehr als eine Erfassungsverbindung aufweist, die an einem nachweisbaren Element angelagert ist.
Die Erfinder haben in überraschender Weise gefunden, daß ein Mehrfacherfassungsanalyt eine Anzahl von Vorteilen gemäß der Erfindung hat, einschließlich einem beliebigen von den folgenden, z. B.

– Mehrfacherfassungsverbindungen können mit optimaler Bindeeffizienz an nachweisbare Elemente angelagert werden,
– Erfassungsanalyte, die mit Mehrfacherfassungsverbindungen erzeugt sind, haben eine ähnliche Größe und physikalische Eigenschaften für jede der Erfassungsverbindungen,
– das Verhältnis von Erfassungsverbindungen auf dem erfaßbaren Element kann geändert werden, ohne daß relative Bindungsprofile des erfaßbaren Elementes beeinflußt werden,
– quantitative Vergleiche können durchgeführt werden, und
– das erfaßbare Element hat eine reduzierte Kapazität für nichtspezifische Bindungen.

Demgemäß schafft die Erfindung bei einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zum Untersuchen auf die Gegenwart mindestens eines vorbestimmten Reagenzes mit folgenden Schritten:

a) Vorsehen einer ersten porösen Membran, an welcher Einfanganalyte zum Anlagern an das mindestens eine Reagenz angebunden worden;
b) Anordnen einer flüssigen, zu untersuchenden Probe und eines Mehrfacherfassungsanalyten in einer Kammer mit einer Basis, welche durch eine zweite poröse Membran festgelegt ist;
c) Ermöglichen des Durchgangs für den Mehrfacherfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang zum Anlagern an das mindestens eine Reagenz, wenn es vorhanden ist;
d) Inberührungbringen der Basis der Kammer mit der ersten porösen Membran;
e) Veranlassen der Probe, durch die Membranen zu fließen, um für das Reagenz: die Möglichkeit vorzusehen, sich an den auf der ersten Membran getragenen Einfanganalyten anzulagern.

Vorzugsweise ist die Erfassungsverbindung ein Antigen, ein Antikörper oder ein Ligand.
Antikörper, Antigene und Liganden können als Erfassungsverbindungen verwendet werden, da sie Bindestellen haben, die in der Lage sind, sich speziell an die interessierenden Proteine oder ihre Fragmente oder Epitopen anzulagern im Vorzug zu anderen Molekülen.
Antikörper sind aus einer handelsüblichen Quelle erhältlich oder sind alternativ durch herkömmliche Mittel erzeugt. Handelsübliche Quellen sind dem Fachmann in der Technik gut bekannt.
Der hier benutzte Begriff „spezifisch angelagert" unter Bezugnahme auf ein Komplexbildendes Agens, wie z. B. einen Antikörper, bezieht sich auf den Wirkstoff, der vorzugsweise einem Targetanalyten zugeordnet ist (z. B. interessierendes Protein). Bezüglich Antikörpern weiß man speziell, daß ein gewisser Grad an nichtspezifischer Wechselwirkung zwischen einem Molekül und einem Nicht-Targetprotein auftreten kann. Nichts desto weniger kann eine spezielle Anlagerung angesehen werden, als sei sie durch eine spezielle Erkennung des Antigens vermittelt worden.
Bei alternativen Ausführungsformen ist die Erfassungsverbindung bzw. Nachweisverbindung (Antikörper oder Ligand) mit einem Element verknüpft, um einen Targetanalyten in einer Probe durch direktes oder indirektes Markieren des Antikörpers oder Liganden nachzuweisen, z. B. mit radioaktiven, fluoreszierenden oder Enzymmarkierungen, wie z. B. Meerrettichperoxidase), so daß sie unter Verwendung von gut bekannten Techniken erfaßt werden können. Direkt markierte Analyten haben eine Markierung (erfaßbares Element), welches der Erfassungsverbindung zugeordnet ist oder an diese angekoppelt ist. Indirekt markierte Erfassungselemente können in der Lage sein, sich an einer markierten Spezies anzulagern (z. B. ein markierter Antikörper mit der Fähigkeit, sich an das Entwicklungsmittel anzulagern), oder sie können auf eine weitere Spezies einwirken, um ein erfaßbares Ergebnis zu erzeugen.
Erfaßbare Elemente können mit Antikörpern (oder anderen Liganden) verbunden sein und makromolekulare kolloidale Teilchen einschließen (z. B. kolloidale Goldteilchen) oder korpuskulares Material, wie z. B. Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Wirkstoffe, die direkt oder indirekt erfaßbare Signale erzeugen können, die visuell beobachtet werden sollen, elektronisch erfaßt oder anderweitig aufgezeichnet werden sollen. Diese Moleküle können Enzyme sein, welche Reaktionen katalysieren, die Farben entwickeln oder ändern oder z. B. Änderungen elektrischer Eigenschaften hervorrufen. Sie können molekular anregbar sein, so daß elektronische Übergänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie können chemische Gebilde einschließen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Bei einer Ausführungsform ist die Erfassungsverbindung (Antikörper) mit einem kolloidalen Goldteilchen konjugiert. Die Anlagerung des konjugierten Antikörpers an das Probenprotein erzeugt ein visuelles Signal, welches durch das Auge erfaßt werden kann oder elektronisch gelesen werden kann, um ein quantitatives Ergebnis zu liefern. Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin und Nachweissysteme mit alkalischer Phosphatase können auch verwendet werden.
Dem Fachmann sind andere Markierungen bekannt.
Vorzugsweise wird das Erfassungselement aus der Gruppe ausgewählt mit kolloidalem Goldpartikel, Latexperle, gefärbter Farbstoff und kolloidaler Kohlenstoff.
Bei einer Ausführungsform ist das erfaßbare Element kolloidales Gold. Vorzugsweise schafft das kolloidale Gold gleichmäßige Reflektionseigenschaften.
Bei einer anderen Ausführungsform ist das erfaßbare Element eine Latexperle, die mit einem gefärbten Farbstoff verknüpft ist.
Bei einer anderen Ausführungsform ist das erfaßbare Element kolloidaler Kohlenstoff.
Vorzugsweise ist ein positives Ergebnis dort, wo das Signal aus einer „Test"-Probe in der Untersuchung merklich höher oder niedriger ist als eine Probe aus einer Kontrollprobe.
Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Kammer zur Verfügung, die als Vorinkubationskammer dienen kann, in welcher ein Vorinkubationsschritt erfolgen kann, bei welchem die Probe und der Mehrerfassungsanalyt sich vereinen, wodurch die Empfindlichkeit des Tests verbessert und das Volumen der Probe verringert wird, welches für die Untersuchung erforderlich ist. Man hat gefunden, daß die Vorinkubation die Testempfindlichkeit für eine typische vorhandene Durchflußvorrichtung um etwa das Zehnfache gegenüber äquivalenten Empfindlichkeitsniveaus erhöht wird im Vergleich zu der Lateralflußtechnologie, wobei doch für die Untersuchung die Möglichkeit gegeben ist, in etwa 2 Minuten abgeschlossen zu sein im Vergleich zu 10 Minuten für Lateralflußausführungen.
Bei einer Ausführungsform wird die Probe aus der Gruppe ausgewählt oder wird aus dieser abgeleitet, welche aufweist:
landwirtschaftliches Produkt, mikrobielles Produkt und biologisches Produkt.
Bei einer Ausführungsform wird das landwirtschaftliche Produkt aus der Gruppe ausgewählt, welche Saatgut, Getreidekorn oder Pflanzenextrakt aufweist.
Bei einer Ausführungsform enthält die Probe korpuskulare bzw. partikuläre Materialien, die aus der Gruppe ausgewählt sind, welche Getreidekornextrakt, Zellenextrakt und mikrobielles Extrakt enthält. Bei einer anderen Ausführungsform ist die biologische Probe ein körperliches Fluid oder eine Gewebeprobe, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Blut, Serum, Sputum und Lunge aufweist.
Andere Proben sind nicht ausgeschlossen.
Standardmethoden können verwendet werden, um Proben für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung zu erhalten, vorzubereiten und/oder zu speichern. Z. B. kann bei einer Ausführungsform ein Adsorptionsmitteltupfer, der eine Baumwollmatrix oder ein ähnliches Material aufweist, für die Probe bzw. den Meßfühler oder für die Oberfläche oder das Medium verwendet werden, welches einen Zielanalyt enthält. Bei einer Ausführungsform wird der Adsorptionsmitteltupfer gewaschen, um den Zielanalyten zu entfernen. Vorzugsweise wird dann der Zielanalyt und/oder das korpuskulare Material, welches den Zielanalyten enthält, gelöst.
Demgemäß kann bei einer Ausführungsform eine Suspension von zerkleinertem Weizenkopf löslich gemacht werden und dann in der Kammer mit einem Mehrfacherfassungsanalyten, welcher einen primären Antikörper gegen Alpha-Amylase, verknüpft mit einem kolloidalen Goldpartikel, und einen sekundären Kontrollantikörper, ebenfalls verknüpft mit dem kolloidalen Goldpartikel, umfaßt, vermischt und vorinkubiert werden. Die Inhalte der Kammer läßt man dann durch die erste Membran fließen, die einen Einfanganalyten in der Form eines immobilisierten Anti-Amylase-Antikörpers oder eines Anti-Kontrollantikörpers enthält, und die Antikörper/Gold-Komplexe werden an den immobilisierten Antikörper unter Erzeugung eines nachweisbaren Signals gebunden. Das Signal kann erfaßt werden, indem man die Vorinkubationseinheit entfernt und die Reaktionsmembran mit einem Puffer wäscht.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Erfindung auch verwendet werden für den Nachweis von Reagenzien in Vollblut, da vollständige rote Blutkörperchen in der Vorinkubationskammer entfernt werden können und man das Plasma durch die Reaktionsmembran, die einen angelagerten Einfanganalyten enthält, fließen lassen kann. Bei dieser Form wird die Basismembran, die an der Basis der Vorinkubationskammer definiert ist, typischerweise eine Membran sein, die die richtige Porengröße aufweist, um die roten Blutkörperchen zurückzuhalten und um das Plasma beim Kontakt mit der ersten Membran hindurch passieren zu lassen. Gleichsam kön nen bestimmte Proben, die Getreideextrakte, Zell- oder mikrobielle Extrakte enthalten, mit dieser Durchflußform analysiert werden, da bestimmte Materie in der Vorinkubationskammer entfernt werden kann und daher den Reaktionsbereich auf der oberen Oberfläche der Reaktionsmembran nicht blockieren kann.
Die Vorrichtung kann auch verwendet werden, um Analyten in Körperflüssigkeit nachzuweisen, die von Blut verschieden sind, wie z. B. Plasma, Seren, Urin, Speichel und Sputum. In diesem Fall kann die Probe in der Vorinkubationskammer zurückgehalten werden, indem man eine hydrophobe Membran verwendet. Um einen effizienten Fluß durch Kapillarkraft zu dem zweiten Teil zu erreichen, wenn die Vorinkubationskammer abgesenkt wird, wird die Reaktionsmembran mit einem Benetzungsmittel, welches ein Detergens enthält, zuvor angefeuchtet, oder die Reaktionsmembran wird mit einer hygroskopischen Lösung, wie z. B. Saccharose, Trehalose, Fructose oder alternativ Glycerol, blockiert.
Dies verändert die Eigenschaften der Reaktionsmembran von einer nicht-hygroskopischen zu einer hygroskopischen Membran, was es ermöglicht, daß die Probe beim Kontakt der Membran an der Basis der Vorinkubationskammer mit der Reaktionsmembran durch das zweite Teil fließen kann.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann die Vorrichtung, wenn eine hydrophobe Membran als die Basis der Vorinkubationskammer verwendet wird, mit der hydrophoben Membran und der Reaktionsmembran in Kontakt verwendet werden, wobei der Bediener, falls dies gewünscht ist, ein Benetzungsmittel zu der Probe zugeben kann, um den Durchfluß zu verursachen.
Demnach wird bei einem verwandten Aspekt eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Testverfahren bereitgestellt, welche ein Gehäuse umfaßt, das einschließt:
ein erstes Teil mit einer ersten, porösen Membran, an welcher ein Einfanganalyt für die Anlagerung an ein zu erfassenden Reagenz angelagert ist, wobei die Membran eine obere Oberfläche und eine untere Oberfläche aufweist,
ein zweites Teil, welches ein Körper von absorbierendem Material ist, wie z. B. Seidenpapier oder dergleichen, welches unterhalb angeordnet ist und die untere Oberfläche des ersten Teils berührt,
eine Kammer, die über dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände aufweist, sowie eine Basis, die eine zweite, hydrophobe Membran mit einer oberen und einer unteren Oberfläche einschließt, wobei die Vorinkubationskammer über dem ersten Teil gehalten ist, wobei die untere Oberfläche der hydrophoben Membran in Kontakt mit der oberen Oberfläche des ersten Teils steht.
Die Vorinkubationskammer kann auch verwendet werden, um Analyten zu entfernen, die den Test stören können, wie z. B. humane Anti-Maus-Antikörper (HAMAS), wobei dies in Lösung erfolgen kann oder indem Anti-Analyt-Antikörper an die Oberfläche der Kammer angelagert werden. Die Kammer kann auch verwendet werden, um den interessierenden Analyten von einer Adsorbensoberfläche, wie z. B. einem Tupfer, der dem Rachen eines Patienten entnommen worden ist, zu extrahieren, indem man den Tupfer in einer Extraktionslösung in der Kammer herumschwenkt. Die Vorinkubationskammer kann Teil einer Vorfiltereinheit sein, weiche auch so wirkt, daß sie die Probe vor dem Kontakt mit der oberen Oberfläche des ersten Teils vorfiltert.
Die Beispiele für Tests, die nach diesem Verfahren durchgeführt werden können, bei dem zwei Reaktionsstufen erforderlich sind (die Inkubation des Analyten mit dem markierten Anti-Analyten, gefolgt von dem Anlagern dieses Komplexes an einen Anti-Analyten an einer festen Phase), sind:
Direkte Antigenuntersuchung

1. Ag*(Analyt) + Ab*₁(Anti-Ag)-Markierung
2. Feste Phase-Ab₂(Anti-Ag) + Ag/Ab₁(Anti-Ag)-Markierungskomplex

Direkte Antikörperuntersuchung (i)

1. Ab₁(Analyt = Anti-Ag) + Ab₂(Anti-Ab₁)-Markierung
2. Feste Phase-Ag + Ab₁(Anti-Ag)/Ab₂(Anti-Ab₁)-Markierungskomplex

Direkte Antikörperuntersuchung (ii)

1. Ab₁(Analyt = Anti-Ag) + Ab₂(Anti-Ab₁)-Markierung
2. Feste Phase-Ab₃(Anti-Ag)/Ag + Ab₁(Anti-Ag)/Ab₂(Anti-Ab₁)-Markierungskomplex

Indirekte Antigenuntersuchung

1. Ag (Analyt) + Ab₁(Anti-Ag) + Ab₂(Anti-Ab₁)-Markierung
2. Feste Phase-Ab₃(Anti-Ag) + Ag/Ab₁(Anti-Ag)/Ab₂(Anti-Ab₁)-Markierungskomplex

Indirekte Antikörperuntersuchung (i)

1. Ab₁(Analyt = Anti-Ag) + Ab₂(Anti-Ab₁) + Ab₃(Anti-Ab₂)-Markierung
2. Feste Phase Ag + Ab₁(Anti-Ag)/Ab₂(Anti-Ab₁)/Ab₃(Anti-Ab₂)-Markierungskomplex

Indirekte Antikörperuntersuchung (ii)

1. Ab₁(Analyt = Anti-Ag) + Ab₂(Anti-Ab₁) + Ab₃(Anti-Ab₂)-Markierung
2. Feste Phase Abo (Anti-Ag)/Ag + Ab₁(Anti-Ag)/Ab₂(Anti-Ab₁)/Ab₃(Anti-Ab_a)-Markierungskomplex

*Ag bedeutet Antigen
*Ab bedeutet Antikörper

Andere Typen von Untersuchungen sind nicht ausgeschlossen.
Ein piezoelektrisch angetriebener Drucker kann verwendet werden, um genaue Mengen von Mehrfacherkrankungsliganden auszugeben, wie z. B. Antigene oder Antikörper oder einen Analyten als eine Mikroanordnung auf eine Reaktionsmembran für die Verwendung in der Vorrichtung nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die Liganden oder Analyte können in besonderen Mustern ausgegeben werden, z. B. Buchstaben für die leichte Erkennung von Ergebnissen. In typischer Weise werden 100 pl eines Fluidreagenzes (1 Tropfen) oder Mehrfaches davon ausgegeben, dies aber verändert sich in Abhängigkeit von der Anwendung. Die sich ergebende Größe des Fleckes auf der Membran beträgt etwa 55 μm im Durchmesser in Abhängigkeit von der Fluiddiffusion auf der Membran, aber dies variiert wiederum je nach der Anwendung. Es ist möglich, Tröpfchen mit Durchmessern von 5-10 μm auszugeben, und deshalb können kleinere Volumina an Fluidreagenz (z. B. 1-10 pl) angewendet werden. Die Verwendung von exakten quantitativen Aufdrucken von Mikroarrays von Antikörpern, Antigenen oder anderen Analyten bedeutet, daß Tests unter Verwendung von exakten Mengen dieser Reagenzien für die Mehrfachdiagnose von Erkrankungen einer einzelnen Probe hergestellt werden können. Diese Array-Technologie kann auf Tests, auf Arzneistoffe oder andere Marken über alle diagnostischen Gebiete angewendet werden.
Alternativ kann eine Spritzenpumpe 1235 von ATOM Medical Corporation, Japan, die typischerweise verwendet wird, um kleine Mengen an intravenösen Flüssigkeiten über einen Katheter an Krankenhauspatienten zu verabreichen, angepaßt werden, um einzelne oder mehrere Spuren eines Einfanganalyten auf die erste Membran, zum Beispiel Nitrozellulose, aufzubringen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform können Liganden für die Erfassung von Tuberkulose-, HIV-, Hepatitis-, Syphilis- und Malaria-Antikörpern auf einer Reaktionsmembran abgeschieden werden. Dies würde die gleichzeitige Diagnose von Tuberkulose, HIV, Hepatitis, Syphilis und Malaria aus einer einzelnen Blutprobe ermöglichen, ohne daß es notwendig wäre Probenzwischenbehandlungsstufen vorzusehen.
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Testung von kleinen Volumina an Vollblut, und daher stellt die vorliegende Erfindung eine sehr schnelle diagnostische Testvorrichtung dar, die einfach zu verwenden ist und die sowohl im Labor als auch vor Ort bei der Felddiagnose verwendet werden kann. Zum Beispiel wäre die Menge an Blut, die man erhält, wenn man mit einer Nadel in die Fingerspitze sticht, ausreichend, um einen Test durchzuführen. Gleichsam können große Probenvolumina in dieser Vorrichtung verwendet werden, indem die Menge an Adsorbensmaterial (zweites Teil) erhöht wird. Zum Beispiel können 10 ml an verdünnten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Urin, untersucht werden, um selten vorkommende Moleküle zu erfassen.
Die Analyten und/oder Liganden (zum Beispiel Antigene oder Antikörper) können in Titriermengen und/oder Titrierkonzentrationen aufgedruckt werden. Demnach würde dies in einem individuellen Screen ein Mittel zur Quantifizierung der Analyt-Ligand-Niveaus in der Probenlösung bereitstellen.
Kurze Beschreibung der Figuren
Eine spezifische Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nun beispielhaft und unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren beschrieben, von denen:
1 eine schematische Zeichnung einer Vorrichtung ist, in der Aspekte der vorliegenden Erfindung in einer ersten Konfiguration ausgeführt sind,
2 eine schematische Zeichnung der Vorrichtung von 1 in einer zweiten Konfiguration ist,
3 eine perspektivische Ansicht einer Testvorrichtung oder -kassette ist, in der Aspekte der vorliegenden Erfindung ausgeführt sind,
4 eine Explosionsansicht der Komponenten der Kassette, die in 3 dargestellt ist, ist,
die 5a bis 5d verschiedene Stufen bei der Verwendung der Vorrichtung von 3 bei der Durchführung eines Tests darstellen und
6 eine graphische Darstellung ist, in der Testergebnisse von Proben, die mit alpha-Amylase gespiket sind und die keiner Vorinkubation unterzogen wurden, mit Proben, die einer Vorinkubation von einer Minute unterzogen wurden, verglichen wurden.
Kurze Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform
Herstellung des Erfassungsanalyten.
Die Einheiten, die an Goldkolloid angeheftet sind, um das Immunogold-Konjugat (normalerweise Immunglobiline) zu erzeugen, sind passiv gebunden, um einen stabilen Komplex zu ergeben, der die Zielaktivität des Antikörpers zurückhält. Die ursprüngliche Goldkolloid-Dispersion, wie sie bei Proteome Systems Limited (PSL) hergestellt wird, wird mit einem Hydroxylamin-Reduktionsmittel initialisiert. Ausgehend von der Annahme, daß das Oxim teilweise als ein Rest in dem Kolloid zurückbehalten wird, wird das Immunogold-Konjugat durch Zugabe von Glutaraldehyd während der Stufe des Anheftens unter Ausbildung einer Schiff-Base zwischen jedem verbliebenem Oxim in der Kolloidstruktur und in freien Aminen des Immunglobulins stabilisiert.
Das optimale Anheftungsprofil für das Immunglobulin (Konzentration und pH-Wert) wird erhalten durch Titrierung der Antikörperkonzentration gegen fixierte Aliquots von Goldkolloid bei spezifischen pH-Werten und durch Behandlung der Gemische mit Salzlösung. Ein ausreichendes Konzentrationsverhältnis für die Bindung zwischen Kolloid und Antikörper beugt dem Ausflocken oder der Aggregation des Kolloids aus/in der Suspension vor, wenn sie mit der Salzlösung behandelt wird. Demnach führt bei geringen Proteinkonzentrationen die Zugabe der Salzlösung dazu, daß das Kolloid aus der Suspension heraus Aggregate bildet, wenn jedoch das optimale Niveau an Antikörper erreicht wird, bleibt das Kolloid in der Suspension stabil (die Integrität der Kolloid-Suspension wird spektroskopisch im Wellenlängenbereich zwischen 450 nm und 600 nm gemessen). Dieser Wert der Antikörperkonzentration ergibt die minimale schützende Konzentration, die erforderlich ist, um den stabilen Immunogold-Konjugatkomplex zu bilden. Eine Antikörperkonzentration von 0,1 bis 0,2 mg/ml in 5 mM Borat wird bei der Titration verwendet, und für polyklonale Antikörper wird ein pH-Wert von 9 gewählt: dieser pH-Wert ist normalerweise deutlich überhalb des Bereichs der Werte des isoelektrischen Punkts (pl), die zusammentreffen mit dem Bereich der Immunglobuline in einem polyklonalen Serum. Im Fall von monoklonalen Antikörpern aus Hybridom haben die Immunglobuline einen einzigartigen isoelektrischen Punkt, und der pH-Wert des Kolloids wird üblicherweise eingestellt auf 0,5 bis 1 Einheit über dem pl des Antikörpers.
Die Konzentration des Antikörpers, der für die Konjugation verwendet wird, beträgt 110% der minimalen „Schutz"-Konzentration, die aus den hier beschriebenen Titrationsverfahren bestimmt wurde.
Konjugationsprotokoll (für einzelnen Antikörper)
Das erforderliche Volumen an Kolloid wird ausgemessen (unter der Annahme, daß ein 90%-Gehalt des Volumens nahezu äquivalent zu demjenigen des fertigen Konjugats bei der optischen Dichte, die für das Kolloid gemessen wurde, ist).
Es wird ein Volumen einer 5%-Glutaraldehydlösung zu dem schnellen gerührten Kolloid zugegeben, um einer Glutaraldehyd-Endkonzentration von 0,002% zu ergeben.
Fünf Minuten nach der Zugabe des Glutaraldehyds wird die berechnete Menge an Antikörperlösung zu der schnell gerührten Suspension zugegeben. Wenn ein signifikantes Volumen an Antikörper zugegeben werden soll (> 10 ml), wird dies in einem gleichförmigen Fluß von Tröpfchen (vorzugsweise über einen Tropftrichter) zugegeben.
In Abhängigkeit des Volumens des Kolloids (von 200 ml bis 5 l) wird 30 bis 90 Minuten danach der pH-Wert der Suspension von pH 9 auf pH 7 abgesenkt (es sei denn, die Konjugation wird zwischen pH 7,5 und 6 durchgeführt) mit 0,2 M Phosphorsäure. Ein berechnetes Volumen von 10% (m/V) Winterserumalbumin wird zu der Suspension zugegeben, um eine Endkonzentration von Rinderserumalbumin in der Suspension von 0,5% zu ergeben.
Man läßt die Suspension für 3 bis 4 Stunden über Nacht rühren, sobald das Volumen > 1 L beträgt, und dann wird die Suspension bei 10.000 UpM über zwischen 35 Minuten und 60 Minuten (in Abhängigkeit von Volumen und Kolloidgröße) lang zentrifugiert.
Der Überstand wird von der zentrifugierten Suspension entfernt und das konzentrierte flüssige Zentrifugat wird 2 mM Borat bei einem pH-Wert von 7,2 enthaltend 0,2% Rinderserumalbumin und 0,1% Natriumazid (als Konservierungsmittel) aufgenommen.
Konjugationsprotokoll (für mehrere Antikörper)
Für den Fall, daß mehr als ein Antikörper an das Kolloid angeheftet wird, werden die schützenden Konzentrationstitrationen (sondiert mit Salzlösung für die Aggregation) für jeden der Antikörper durchgeführt. Die Volumina der verwendeten Antikörper sind diejenigen, die für die individuellen Antikörper (+10%) anhand der Titrationen gefunden wurden.
Falls äquivalente Anheftungsniveaus der Antikörper bei deren individuellen optimalen Anheftungsniveaus erforderlich sind, werden die Antikörper vorgemischt und gemeinsam dem Kolloid zugegeben (nach der Zugabe von Glutaraldehyd). Die Verarbeitung folgt dem Verfahren, das oben für die Einzelkonjugationen beschrieben wurde. Falls die Antikörper in einem bestimmten Verhältnis vorliegen sollen, wird zunächst jedem der primäre Antikörper zugegeben, und die zweiten Antikörper werden in Intervallen später zugegeben. Der Zeitverlauf der Bindungsniveaus an das Kolloid wurde für einige Kombinationen von Antikörpern bestimmt, und die Niveaus der zweiten und nachfolgenden Antikörper nehmen in einem regelmäßigen Muster mit dem Zeitintervall zwischen der Zugabe des ersten Antikörpers und den nachfolgenden Zugaben ab. Nach dem ersten Intervall vom 30 bis 40 Minuten wird ein konstantes Niveau des zweiten Antikörpers gebunden bei ungefähr 10% des Niveaus des primären Reaktant gefunden. In manchen Fallen findet sich, daß ein Intervall von 5 Minuten zwischen Test-Antikörper und Verfahrenskontroll-Antikörper in den erforderlichen Konzentrationsverhältnissen optimal ist.
Bei einem Beispiel ist der primäre Antikörper eine Maus-Anti-α-Amylase, konjugiert bei pH 8,3, und der sekundäre Antikörper (Kontrolle) ist Ziege-Immunglobulin-G. Bei einem anderen Beispiel können zwei primäre Antikörper (zum Beispiel Anti-Human-IgG1 und Anti-Human-IgG2) gleichzeitig zugegeben werden, und ein Kontroll-Antikörper wird anschließend nach einem geeigneten Intervall zugegeben.
Herstellung von Membran mit Einfang-Analyt
Die Einfang-Analyten in der Form von Liganden, wie zum Beispiel Antigenen oder Antikörpern (zum TB, HIV-1), werden auf eine Proteineinfangmembranmatrix (zum Beispiel eine Nitrozellulosemembran) aufgedruckt in einer angemessen bemessenen Anordnung unter Anwendung piezoelektrisch-chemischer Aufdrucktechnologie. Ein geeignetes chemisches Aufdrucksystem für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfaßt die Anwendung einer piezoelektrischen Tintenstrahldrucktechnologie mit Drop-on-Demand-Funktion für die Mikroverteilung von Fluiden bei der DNA-Diagnostik oder das Syntheseverfahren nach Combion Inc., welches „CHEM-JET" genannt wird. Um die Fluidverteilung für die DNA-Diagnostik mit Drop-on-Demand-Funktion zu erkunden, wurde als ein Teil des Genosensor Technology Development-Projekts (GTD), welches vom Institute of Standards and Technology (USA) gefördert wurde, ein acht-Fluid-Drucker entwickelt. Die Forschung konzentriert sich bis heute auf das Aufdrucken von Oligonukleotid-Mikro-Spots auf feste Träger. Bei der CHEM-JET-Technik, die am California Institute of Technology entwickelt wurde, werden kleine Volumina von Reagenz tragender Flüssigkeit auf spezifische Stellen oder an spezifische Adressen auf einem festen Substrat gespritzt, gerade wie ein Tintenstrahldrucker Tinte auf eine Seite aufspritzt. Durch wiederholte Rückkehr zu jeder Adresse mit einem oder anderen eines kleinen Satzes an Aufbaueinheiten, in diesem Fall für das Verfahren modifizierte Nukleotide, können riesige zwei-dimensionale Bibliotheken von kurzen DNA-Ketten (Oligonukleotide) zusammengestellt werden. Eine solche Vorrichtung, einschließlich eines Bildgebungsmittels, wird beschrieben in der parallel anhängigen internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/AU98/00265 des Anmelders, deren vollständiger Inhalt durch Querverweis darauf hierin eingeschlossen ist. Bei der beschriebenen Ausführungsform wird Antigen auf eine Reaktionsmembran in Tröpfchen von 100 pl oder einem Vielfachen davon (zum Beispiel 10 nl) aufgedruckt, wobei jedes Aliquot einen Abstand von 1 mm aufweist. Diese Volumina und Abstände können jedoch erhöht/abgesenkt werden, je nachdem, welcher Antigentiter und welche Array-Größe gewählt wird. Beispielswiese ist es möglich, Tröpfchen mit Volumina von lediglich 1-10 pl zu verteilen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform können Antigene oder Antikörper in eine Matrix aus Punkten oder Linien oder in der Form von Buchstaben aufgedruckt werden, so daß eine quantitative Mehrfach-Analyten-Analyse einer einzelnen Probe möglich ist.
Nachdem das verteilte Antigen getrocknet ist, werden nichtspezifische Protein-bindende Stellen auf der (Nitrozellulose-)Membran unter Verwendung von 0,5% (V/V) Casein in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) – 0,05% (nN) Natriumazid + 0,1% (V/V) Tween-20 (PBSA-Waschpuffer) blockiert. Es besteht allerdings auch die Option, die Membran im Anschluß an das Aufdrucken des Antigens (oder des Antikörpers) oder anderer Liganden unblockiert zu lassen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Spritzpumpentechnologie, die für die intravenöse Verabreichung von Flüssigkeiten an Patienten verwendet wird, angepaßt werden, um einzelne oder mehrere Reihen auf Nitrozellulosemembranen abzulegen.
Verwendung von Immunkonjugaten im Durchflußformat.
Die optische Dichte der Immunkonjugatsuspension wird üblicherweise bei einer Wellenlange von 520 nm gemessen. Dieser Wert gibt ein relatives Maß für die Konzentration des Kolloids. Auch aus der Kenntnis der Bedingungen der Konjugation ist das Niveau an das Kolloid gebundenem Antikörper bei einer optischer Dichte = 1 bekannt, und dies kann angewendet werden, um das optimale Volumen zu bestimmen, das in dem Durchflußtest zu verwenden ist (Antikörperkonzentration pro ml an Kolloid × Volumen an Konjugat × optische Dichte des Konjugats).
Das Immunkonjugat wird zu der Probe, die in der Filteranordnung vorinkubiert wird, vor dem Kontakt mit der aktiven Membran in dem Gehäuse zugegeben. Dies ermöglicht das maximale Anheftungsniveau des Analyten in der Probe, um an den aktiven, mit dem Kolloid konjugierten Antikörper zu binden. Der Komplex Konjugat:Analyt wird dann durch den immobilisierten Tests-Antikörper auf der Membran eingefangen, wenn das Gemisch durch die aktive Membran, die zu der gleichen Zeit dem Probenfluid ausgesetzt ist, hindurchfiltriert, da das Verfahrenskontroll-Antigen an den sekundären Antikörper, der mit dem Konjugat verknüpft ist, bindet.
Bei Mehrfach-Analyten-Proben würden die mehreren Antikörper auf dem Konjugat (erfaßbares Element) auf dem gleichen Niveau an die Proben-Analyten binden, da sich die Antikörper auf ihren optimalen Bindungsniveaus auf dem Kolloidpartikel befinden würden.
Beschreibung der Figuren
Von den Zeichnungen zeigt 1 eine Untersuchungsvorrichtung 10 mit Durchfluß, welche die oben beschriebene Nitrocellulosemembran verwendet. Die Vorrichtung hat die Form einer Kassette 12 und eines passenden, entfernbaren Filterrahmens 14. In der Kassette befindet sich die Membran (in typischer Weise Nitrocellulose) 16, auf welcher Einfanganalyten in der Form von Liganden in der oben beschriebenen Weise aufgedruckt sind und die oben auf einer Absorbensmatrix 18 angeordnet ist. Die Absorbensmatrix weist vorzugsweise Mehrfachschichten eines Absorbensgewebes oder einer Absorbensunterlage, wie z. B. Fließpapier, auf, bei der speziellen Ausführungsform vierundzwanzig Schichten (Doppellage), von denen man gefunden hat, daß sie eine ideale Porosität besitzen, welche den schnellsten Durchfluß verschiedener Lösungen erlaubt. Dieser schnelle Durchfluß ist wichtig, denn er führt zu niedrigeren Hintergrundwerten bei höherer Spezifität und höherer Signalauflösung.
Wie in 1 gezeigt ist, ist oben auf der Kassette in ihrer oberen Fläche eine Öffnung gebildet sowie ein abgehängter, im allgemeinen kegelstumpfförmiger Raum, dessen Seiten bis zu der Membran 15 herunterreichen, um eine Kammer zu bilden, mit schrägen Seiten und einer Basis, welche von der Membran 16 gebildet ist.
Der Filtereinheitsrahmen 14 ist im Abstand über der oberen Fläche der Kassette 12 angeordnet. Er bildet auch einen abgehängten konischen Raum in der Form einer Kammer 21, die auch als „Vorinkubationskammer" bezeichnet ist mit schrägen Seiten und einer Basis 22, die aus einer 5 μm-Whatman grade 1-Membran oder einem 0,22 μm hydrophilen Durapore-Membranfilter (Millipore, North Ryde, Australien) gebildet ist. Es können jedoch auch andere Arten von Filter/Membran und Porengröße je nach der Anwendung zweckmäßig sein. Die Funktion der Membran ist es, eine Probe, die untersucht werden soll, lange genug in dem Raum oder in der Vorinkubationskammer 21 zurückzuhalten, damit eine „Vorinkubationsstufe" stattfinden kann. Wenn die Membran 22 abgesenkt wird, um mit der Membran 1 in Berührung zu kommen, zieht die Kapillaranziehung die Probe durch die Membranen 22 und 16 aus der Kammer und in das Gewebe 18 hinein.
Zur einfacheren Nutzung sind zwei Stifte 24 vorgesehen, die während der Vorinkubationsstufe den Filterrahmen 14 in einem geeigneten Abstand über der Kassette 12 halten, die es aber dem Filterrahmen erlauben, nach unten gestoßen zu werden, so daß die Membranen 22 und 16 für die zweite Stufe des Vorgangs, der in 2 gezeigt ist, in Berührung kommen. Der Rahmen 14 ist auch wegnehmbar, so daß die Membran 16 betrachtet werden kann, um die Ergebnisse der Untersuchung zu bestimmen.
Die 3 bis 5d veranschaulichen eine handelsübliche Ausführungsform einer Untersuchungsvorrichtung entsprechend den Aspekten der 1 und 2.
In diesen Figuren tragen die Komponenten, die den in den 1 und 2 gezeigten Komponenten äquivalent sind, dieselben Bezugszahlen. Die Kassette 12 weist einen oberen Formling 12a und einen unteren Formling 12b auf. Die poröse Membran 22 wird von der Basis eines kegelstumpfförmigen Pressfilterpapiers 22a gebildet, welches von einer Filterrückhalteeinrichtung 23 gehalten wird. Der Filtereinheitsrahmen 14 bildet zwei Vertiefungen 14a, auf denen ein Bedienungsmann seine Daumen drücken kann, wenn er den Filterrahmen niederdrückt, um die Membranen 22 und 16 in Berührung zu bringen.
Die 5a bis 5d veranschaulichen die Betriebsstufen der Vorrichtung. 5a veranschaulicht den Filterrahmen separat von der Kassette 12. 5b veranschaulicht die Vorinkubation, die so angeordnet ist, daß sich die Basis der Kammer/des Raumes 21 im Abstand von der Membran befindet. Die 5c und 5d veranschaulichen die Vorrichtung, nachdem die Filtereinheit niedergedrückt worden ist, um die Membranen 22 und 16 in Berührung zu bringen und es der Probe zu erlauben, durch das Fließpapier 18 hindurchzufließen.
Wenn die Membran 22 durch eine hydrophobe Membran ersetzt wird, ist es möglich, die Vorrichtung mit einem Vorinkubationsschritt allein in derjenigen Position zu betreiben, die in den 3 und 4 gezeigt ist, wobei die Membranen 22 und 16 immer in Berührung miteinander sind. Die hydrophobe Membran 22 verhindert den Fluß der Probe in der Inkubationskammer 21 zu der Reaktionsmembran 16. Nachdem eine ausreichende Zeit vergangen ist, so daß sich der Erfassungsanalyt in der Kammer 21 an das Reagenz anlagert, wird ein geeignetes Benetzungsmittel der Probe in der Kammer zugegeben, welches es der Probe ermöglicht, durch die Reaktionsmembran 16 und in eine Absorbensmatrix 20 hinein durch die hydrophobe Membran zu fließen.
Beispiel 1
Anwendung der Vorfilterkammer
Eine Whatman-Membran (Papier) oder Reemay-Filter (Polyester, 1 cm²) werden in die Kammer 21 in dem Filterrahmen eingeführt, um einen konischen Rückhaltebehälter (Vorfiltereinheit) zu bilden.
Die Probe wird in die Vorfilterkammer aus Kunststoff (50-100 ul) pipettiert zusammen mit einem Erfassungsanalyten in der Form eines Erfassungsantikörpers (50-100 ul), der sich an kolloidales Gold angelagert hat (Teilchengröße 20-50 nm). In der Vorinkubationskammer wird die Probe 30 Sekunden lang nach mäßigem Pipettieren, um ein gutes Vermischen sicherzustellen, mit dem Goldkonjugat (O.D.4) vorinkubiert. Nach 30 Sekunden wird die Kammer in den Raum 20 der Testkassette 12 gedrückt. Nach der Berührung mit der Membran 16, welche die Erfassungszone enthält, wird die Lösung durch die Absorbensschicht 18 darunter hindurchgefiltert. Das Vorfilter 14 wird weggeworfen, nachdem die Lösung hindurchgefiltert war, und zwei Tropfen der PBSA-Waschpuffer-Flüssigkeit werden dann der Reaktionsmembran zugegeben, um überschüssiges Goldkonjugat abzuwaschen und die Untersuchungsergebnisse auf der Membran 16 zu verdeutlichen.
Die Verwendung der Vorinkubation der Probe mit dem Erfassungsanalyten erhöht die Empfindlichkeit um nahezu das 10-fache. Ferner können jegliche Feststoffe in der Vorinkubationskammer zurückgehalten werden, die alle entfernt werden können, um ein klares Signal zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung der Vorinkubationskammer mit den Doppelrollen, einen Vorinkubationsschritt und einen Vorfilterschritt zu gestatten, erlaubt auch die Mehrfachanalyterfassung auf der Reaktionsmembran durch Vorinkubieren mit einer Mehrfachanalytsonde, z. B. kolloidales Gold, welches an unterschiedliche Erfassungsanalyten angelagert ist. Zusätzlich können Störanalyten oder Substanzen, die falsche positive oder negative Werte in der Untersuchung verursachen könnten, in dem Vorinkubationsschritt entfernt oder herausabsorbiert werden, z. B. menschliche Antikörper zu Mausantigenen können durch Anti-HAMA-Antikörper herausabsorbiert werden.
Obwohl das oben beschriebene Beispiel sich auf die Antigene bezieht, welche auf Krankheit bezogen sind, könnte die Immununtersuchungsvorrichtung z. B. wie eine Allergietesteinrichtung verwendet werden, als eine Versuchseinrichtung für Drogenmißbrauch oder für das Analysieren von nichtmenschlichen Derivatproben, z. B. Bovin, Porcin, Veterinärtests und Versuche in der Landwirtschaft, wie z. B. Auswertung der Getreidequalität usw.
Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet für die Verwendung mit Tupfern, die in einfacher Weise in die Kammer 21 gebracht und in einer Flüssigkeit herumgewirbelt werden können, welche einen Erfassungsantikörper enthält (50-100 ul), der an kolloidales Gold angelagert ist, und zwar 30 Sekunden lang, bevor die Vorfiltereinheit niedergedrückt wird, um die Membranen 22 und 16 in Berührung miteinander zu bringen.
Eine beliebige Kombination von Liganden und Analyten kann bei dem System der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Die Wahl von Liganden könnte darauf zugeschnitten sein, vorherrschende Krankheiten in einem besonderen Land oder einer Bevölkerung zu erfassen. Z. B. könnten Analyten aus der folgenden Kombination von Krankheiten unter Verwendung dieser Anordnung für die Diagnose verwendet werden.

1. TB und HIV
2. Hepatitis B und C, HIV
3. Chagas-Krankheit, HIV, TB, Syphilis und Hepatitis B und C
4. Malaria, Dengue-Fieber, TB, Chagas-Krankheit.

Alternativ könnten Antigene, welche unterschiedliche Arten von Weizen oder anderen landwirtschaftlichen Produkten darstellen, auf die Reaktionsmembran gedruckt werden, wobei die Erfassung von Mehrfachstämmen mit einem einzigen Test ermöglicht würde.
Beispiel 2
Die Untersuchungsvorrichtung kann auch für die Erfassung von Analyten in Körperfluiden außer Blut benutzt werden, wie z. B. Plasma, Seren, Urin, Speichel und Sputum. In diesem System kann die Probe in der Vorinkubationskammer 21 durch die Verwendung einer hydrophoben Membran zurückgehalten werden, z. B. Reemay oder Hollingsworth and Vose 7303 anstelle der Whatman-Klasse 1-Membran oder eines 0,22 μm hydrophilen Durapore-Membran-Filters, der oben beschrieben ist. Die Probe wird mit dem Erfassungsanalyt die erforderliche Vorinkubationszeit lang gemischt. Um eine wirksame Durchfluß-Kapillartätigkeit zu der Absorbensschicht 18 zu erhalten, wenn die Vorinkubationskammer 21 auf die Kassette 12 abgesenkt wird, kann eines der zwei folgenden Verfahren durchgeführt werden:

1. Die Membran 16, welche den Einfanganalyten enthält, wird mit mindestens einem Tropfen Waschpufferlösung benetzt, die 0,01 M Phosphat, 0,15 M NaCl, 0,0% Azid, 0,5% Tween 20 oder ein beliebiges Benetzungsmittel enthält, welches ein Detergens enthält.
2. Die Membran 16, welche den Einfanganalyten enthält, wird mit einer hygroskopischen Lösung blockiert, wie z. B. Saccharose, Trehalose, Fructose oder alternativ Glycerin. Dies verändert die Eigenschaften der Membran 16 von einer nichthygroskopischen zu einer hygroskopischen Membran, wodurch die Möglichkeit vorgesehen ist, daß die Probe nach dem Kontakt der Membran an der Basis der Vorinkubationskammer 21 mit der Membran 16 durch die Absorbensschicht 18 fließt.

Beispiel 3 (Vergleichsbeispiel)
Vergleich einer fehlenden Vorinkubation und einer einminütigen Vorinkubation einer Probe, die mit Alpha-Amylase bei der oben beschriebenen Ausführungsform gespiket ist.
Verfahren
Eine 6%-ige Lösung von Rinderserumalbumin wurde mit 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 500 ng/ml und 1.000 ng/ml gespiket und gemäß dem folgenden Verfahren auf die obige Ausführungsform angewendet:
Keine Vorinkubation

I. Die Vorinkubationskammer wurde so niedergedrückt, daß die Basis der Kammer mit dem ersten Teil, welches den Einfangantikörper gegen Alpha-Amylase enthält, in Berührung kommt.
II. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde zu der Vorinkubationskammer dazugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
III. Einhundert Mikroliter von gespiketer Alpha-Amylase-Probe wurde der Kammer zugegeben, und man ließ sie durch das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
IV. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
V. Sechzig Mikroliter von Anti-Alpha-Amylase-Antikörper, mit kolloidalem Gold (Partikelgröße 20 bis 50 nm) verknüpft, wurde der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
VI. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial unter der ersten Membran hindurchfiltrieren.
VII. Die Vorinkubationskammer wurde entfernt und das Ergebnis auf der Reaktionsmembran mit einem dichten Messer abgetastet. Die Signalstärke wurde in Pixel-Intensität gemessen.

Eine Minute Vorinkubation

I. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde der ersten Membran zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial darunter hindurchfiltrieren.
II. Die Vorinkubationskammer wurde über der ersten Membran so abgehängt, daß es einen Raum gab zwischen der Kammer und der Membran.
III. 100 μl von gespiketer Alpha-Amylase-Probe und 60 Mikroliter von Anti-Alpha-Amylase-Antikörper, verknüpft mit kolloidalem Gold (Partikelgröße 20-50 nm) wurden in der Vorinkubationskammer eine Minute lang inkubiert.
IV. Die Kammer wurde abgesenkt, bis sie mit der ersten Membran in Kontakt kam, und man ließ das Gemisch der Probe und des Antikörper-Gold-Konjugates durch das Absorbensmaterial hindurchfiltrieren.
V. Sechzig Mikroliter von 0,5% Tween in Salzlösung wurde der Vorinkubationskammer zugegeben, und man ließ es durch das Absorbensmaterial hindurchfiltrieren.
VI. Die Vorinkubationskammer wurde entfernt, und das Ergebnis auf der Reaktionsmembran wurde mit einem Dichtemesser abgetastet. Die Signalstärke wurde in Pixel-Intensität gemessen.

Jeder Datenpunkt auf der Kurve ist das Mittel zweier Experimente unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung. Die Ergebnisse zeigen, daß die Vorinkubation der Probe mit dem Erfassungsanalyten eine minimale Erfassungsgrenze hat, die in Pixeldichte von etwa 500 pg/ml der Alpha-Amylase gebildet ist. Dies wird verglichen mit einer minimalen Erfassungsgrenze ohne die Vorinkubation von etwa 50 ng/ml und zeigt die Vorinkubationszunahmen der Empfindlichkeit um rund das 10-fache an.
Beispiel 4 (Vergleichsbeispiele)
Demonstration erhöhter Empfindlichkeit bei erhöhter Vorinkubation der Probe mit dem Erfassungsanalyt.
Amylase-Proben, die in 0,5% Salzlösung bis 400 ng/mL gelöst sind, wurden mit Immungoldkonjugat gegen Amylase behandelt und auf die Durchflußausführung in unterschiedlichen Protokollen aliquotiert, wie unten gezeigt ist.

A. Die Probe wurde der Ausführungsform zugegeben (ohne einen vorhandenen Filter), und man ließ sie vor der Zugabe des Konjugats hindurchfiltrieren, gefolgt von einem Konjugat-Aliquot, unmittelbar nachdem die Probe durch die Membran hindurchgegangen ist.
B. Die Probe wurde in richtigen Verhältnissen mit Goldkonjugat vermischt und unmittelbar auf die Durchflußausführung aliquotiert.
C. Die Probe wurde mit dem Protokoll B gemischt, aber der Durchfließausführungsform nach einer Zeit von 60 Sekunden zugegeben.

Die in Pixel-Intensität dargestellten Ergebnisse sind in den Tabellen unten gezeigt (für zwei Experimente):

Protokoll Probenspitze Kontrollspitze Probenbereich Kontrollbereich S/PC-Verhältnis

A 82 286 657 2120 317

B 288 758 2062 5509 383

C 823 949 5843 6765 884

Protokoll Probenspitze Kontrollspitze Probenbereich Kontrollbereich S/PC-Verhältnis

A 89 516 588 3890 588

B 482 830 3736 6345 602

C 708 829 4506 5822 792
Eindeutig gibt es eine bemerkenswerte Zunahme des Probensignals, wenn der Analyt mit der Konjugatsonde vorinkubiert ist im Unterschied zu einer folgenden Erfassung auf der Durchflußausführung. Die Differenz der Erfassungsniveaus (für die 400 ng/ml-Probe) glich einer 7,5-fachen bis 10-fachen Zunahme in erfassbarer Amylase in der Durchflußausführungsform, wenn die Probe getrennt von dem Erfassungseinfangantikörper vorinkubiert ist.
Der Fachmann weiß, daß zahlreiche Veränderungen und/oder Modifikationen an der Erfindung vorgenommen werden können, wie sie in den speziellen Ausführungsformen gezeigt ist.
Die vorliegenden Ausführungsformen werden deshalb in jeder Beziehung als illustrativ und nicht als beschränkend betrachtet.

Claims

Verfahren zum Prüfen auf die Gegenwart mindestens eines vorbestimmten Reagenzes in einer flüssigen Probe mit folgenden Schritten: a) Vorsehen einer ersten porösen Membran, an welcher Einfanganalyte zum Anlagern an das Reagenz angebunden wurden; b) Anordnen einer flüssigen, zu untersuchenden Probe und eines Mehrfacherfassungsanalytes in einer Kammer mit einer Basis, welche durch eine zweite poröse Membran festgelegt ist; c) Ermöglichen des Durchganges für den Mehrfacherfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang zum Anlagern an das mindestens eine Reagenz, wenn es vorhanden ist; d) Inberührungbringen der Basis der Kammer mit der ersten porösen Membran; und e) Veranlassen der Probe, durch die Membranen zu fließen, um für das Reagenz die Möglichkeit vorzusehen, sich an den auf der ersten Membran getragenen Einfanganalyten anzulagern.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit folgendem Schritt: Entfernen der Kammer und Waschen der ersten Membran mit einer Pufferlösung vor dem Kontrollieren der Membran auf die Gegenwart des Mehrfacherfassungsanalyten.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner mit folgendem Schritt: Waschen der ersten Membran mit einer Pufferlösung durch Zugabe durch die Kammer vor dem Entfernen und Kontrollieren der ersten Membran auf die Gegenwart des Mehrfacherfassungsanalyten.
Verfahren zum Prüfen auf die Gegenwart mindestens eines vorbestimmten Reagenzes unter Verwendung einer Vorrichtung mit einem ersten Teil mit einer ersten, porösen Reaktionsmembran, an welcher ein Einfanganalyt angebunden ist für das Anlagern an ein zu erfassendes Reagenz, wobei das Teil eine obere Fläche und eine untere Fläche hat; einen zweiten Teil, der ein Körper von absorbierendem Material ist mit Anordnung unter der unteren Fläche des ersten Teiles und unter Berührung dieser unteren Fläche; einer Kammer für die Aufnahme einer flüssigen Probe, die im Abstand über dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände und eine Basis hat, die von einer zweiten Membran festgelegt ist; wobei die Kammer in der Lage ist, eine flüssige Probe eine vorbestimmte Inkubationszeit lang zurückzuhalten; und Mitteln zum Haltern der Kammer über dem ersten Teil in zwei Positionen, einer ersten Position, in welcher die Membran in einem ausreichenden Abstand von dem ersten Teil so angeordnet ist, daß nicht ein Fluidtransfer von der Kammer zu dem Körper des absorbierenden Materials möglich ist, und einer zweiten Position, in welcher die Membran sich mit dem ersten Teil in Berührung befindet, wobei diese Berührung den Fluidtransfer von der Kammer durch die erste und zweite Membran zu dem Körper des absorbierenden Materials ermöglicht, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: a) Anordnen einer flüssigen, zu untersuchenden Probe und eines Mehrfacherfassungsanalyten in der Kammer, wobei die Kammer in der ersten Position angeordnet ist; b) Erlauben des Durchganges für den Mehrfacherfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang, um sich an das Reagenz, wenn es vorhanden ist, anzulagern; c) Niederdrücken der Kammer auf die zweite Position, um die Basis der Kammer mit der ersten porösen Membran in Berührung zu bringen; d) Vorsehen der Möglichkeit, daß die Probe durch die erste und zweite Membran fließt, um es dem Reagenz zu ermöglichen, wenn es vorhanden ist, sich an den Einfanganalyten anzulagern, der auf der ersten Membran getragen wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die zweite Membran, die an der Basis der Kammer festgelegt ist, hydrophob ist, und die Schaffung der Möglichkeit für die Probe, durch die erste und zweite Membran zu fließen, die Zugabe eines Benetzungsmittels auf die obere Fläche der zweiten Membran vor dem Bewegen der Kammer in die zweite Position einschließt.
Verfahren zum Untersuchen auf die Gegenwart mindestens eines vorbestimmten Reagenzes unter Verwendung einer Vorrichtung mit einem ersten Teil, welches eine erste poröse Reaktionsmembran aufweist, an welche ein Einfanganalyt zum Anlagern an ein zu erfassendes Reagenz angebunden ist, wobei das Teil eine obere und eine untere Fläche hat; einem zweiten Teil, welches ein Körper absorbierenden Materials ist, der unter der unteren Fläche des ersten Teils angeordnet ist und diese berührt; einer Kammer für die Aufnahme einer flüssigen Probe, die im Abstand über dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände und eine Basis hat, welche von einer zweiten hydrophoben Membran festgelegt ist, eine obere und untere Fläche hat, wobei die Kammer über dem ersten Teil gehalten ist mit der unteren Fläche der hydrophoben Membran in Berührung mit der oberen Fläche des ersten Teiles, wobei die Basis in der Lage ist, eine flüssige Probe in der Kammer eine vorbestimmte Inkubationszeit lang zurückzuhalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Anordnen einer zu untersuchenden Probe und eines Mehrfacherfassungsanalyten in der Kammer; b) Erlauben des Durchganges für den Mehrfacherfassungsanalyten eine ausreichende Zeit lang, um sich an das Reagenz, wenn es vorhanden ist, anzulagern; c) Hinzugeben eines Benetzungsmittels zu der Kammer; d) Schaffen der Möglichkeit, daß die Probe durch die erste und zweite poröse Membran fließt, um es dem Reagenz, wenn es vorhanden ist, zu ermöglichen, sich an den von der ersten Membran getragenen Einfanganalyten anzulagern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Mehrfacherfassungsanalyt eine Erfassungsverbindung aufweist, die aus der Gruppe mit einem Antikörper, Liganden und Antigen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Antikörper ein Immunoglobulin ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Mehrfacherfassungsanalyt zwei oder mehr Antikörper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Mehrfacherfassungsanalyt drei oder mehr Antikörper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei mindestens ein Antikörper ein Kontrollantikörper ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Mehrfacherfassungsanalyt ein erfaßbares Element aufweist, welches aus der Gruppe ausgewählt ist mit kolloidalem Goldpartikel, Latexperle, Farbstoff und kolloidalem Kohlenstoff.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das erfaßbare Element ein kolloidaler Goldpartikel ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das erfaßbare Element eine Latexperle ist, die mit einem Farbstoff verknüpft ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das erfaßbare Element kolloidaler Kohlenstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zwei oder mehr Antikörper mit einem kolloidalen Goldpartikel konjugiert bzw. verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kammer ein Teil einer Vorfiltereinheit ist, die auch das Vorfiltern der Probe vor der Berührung mit der oberen Fläche des ersten Teils bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 6, wobei die Kammer ein Teil einer Vorfiltereinheit ist, die auch das Vorfiltern der Probe vor der Berührung mit der oberen Fläche des ersten Teils bewirkt.
Vorrichtung für die Benutzung bei einem Prüfungsverfahren mit einem ersten Teil mit einer ersten, porösen Reaktionsmembran (16), an welche ein Einfanganalyt angelagert ist für das Anlagern an ein zu erfassendes Reagenz, wobei das Teil eine obere und eine untere Fläche hat; einem zweiten Teil, welches ein Körper eines absorbierenden Materials (18) ist, wie z. B. Seidenpapier oder dergleichen, welches unter der unteren Fläche des ersten Teils angeordnet ist und diese berührt; einer Kammer (21) für die Aufnahme einer flüssigen Probe, die im Abstand über dem ersten Teil angeordnet ist, wobei die Kammer Seitenwände und eine Basis hat, die von einer zweiten Membran (22) festgelegt ist; wobei die Kammer in der Lage ist, eine vorbestimmte Inkubationszeit lang eine flüssige Probe zurückzuhalten; und Mitteln (24) für das Halten der Kammer über dem ersten Teil in zwei Positionen, einer ersten Position, in welcher die Membran in einem ausreichenden Abstand von dem ersten Teil so angeordnet ist, daß sie nicht einen Fluidtransfer von der Kammer zu dem Körper des absorbierenden Materials gestattet, und einer zweiten Position, in welcher sich die Membran mit dem ersten Teil in Berührung befindet, wobei diese Berührung einen Fluidtransfer von der Kammer durch die erste und zweite Membran zu dem Körper von absorbierendem Material gestattet.
Vorrichtung für die Benutzung in einem Untersuchungsverfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Kammer ein Teil einer Vorfiltereinheit ist.