DE60220671T2

DE60220671T2 - Anlagen und Verfahren für Zellkulturen auf pharmakokinetischer Basis

Info

Publication number: DE60220671T2
Application number: DE60220671T
Authority: DE
Inventors: Michael Ithaca SHULER; Gregory T. Salinas BAXTER; Aaron Ithaca SIN; Scott Norristown MEYERS; Robert Andrew Toronto HARRISON
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2022-04-26
Also published as: US9732316B2; US20080166795A1; EP1392814A2; US8030061B2; CA2445458C; US20160281048A1; AU2002359234B2; ES2287351T3; WO2003027223A2; DK1392814T3; US20100304355A1; US20070037273A1; EP1392814B1; ATE364685T1; US9273276B2; US20070026519A1; US7288405B2; US20070015273A1; US20070015274A1; DE60220671D1

Description

Die Erfindung betrifft Zellkulturvorrichtungen und Verfahren zu deren Gebrauch.
Pharmakokinetik ist die Untersuchung des Schicksals von pharmazeutischen Produkten und anderen biologisch aktiven Verbindungen von dem Zeitpunkt, an dem sie in den Körper gelangen, bis sie beseitigt sind. Z. B. kann die Kette der Ereignisse für ein oral verabreichtes Arzneimittel die Absorption durch die verschiedenen Schleimhautoberflächen, die Verteilung über den Blutstrom zu verschiedenen Geweben, die Biotransformation in der Leber und in anderen Geweben, die Tätigkeit am Zielort und die Ausscheidung des Arzneimittels oder von Stoffwechselprodukten über den Urin oder die Gallenflüssigkeit einschließen. Pharmakokinetik liefert ein rationales Mittel, um sich dem Stoffwechsel einer Verbindung in einem biologischen System zu nähern. Für Übersichten pharmakokinetischer Gleichungen und Modelle, siehe z. B. Poulin und Theil (2000) J. Pharm. Sci. 89 (1): 16–35; Slob et al. (1997) Crit. Rev. Toxicol. 27 (3): 261–72; Haddad et al. (1996) Toxicol. Lett. 85 (2): 113–26; Hoang (1995) Toxicol Lett. 79 (1–3): 99–106; Knaak et al. (1995) Toxicol. Lett. 79 (1–3): 87–98; und Ball und Schwartz (1994) Comput. Biol. Med. 24 (4): 269–76.
Eine der grundlegenden Herausforderungen, mit denen sich Forscher bei Wirkstoff-, Umwelt-, Ernährungs-, Verbrauchsproduktsicherheits- und Toxikologiestudien konfrontiert se hen, ist die Extrapolation von Stoffwechseldaten und der Risikobeurteilung aus in vitro Zellkulturuntersuchungen auf Tiere. Obgleich durch die Anwendung der passenden pharmakokinetischen Prinzipien einige Schlüsse gezogen werden können, gibt es noch erhebliche Beschränkungen. Eine Sorge ist, dass gegenwärtige Screening-Verfahren Zellen unter Bedingungen verwenden, die nicht deren Funktion in ihrer natürlichen Einstellung replizieren. Der Flüssigkeitskreislauf, die Wechselwirkung mit anderen Geweben und andere Parameter, die mit einer physiologischen Reaktion verbunden sind, werden in den üblichen Formen von Gewebekulturen nicht vorgefunden. Zum Beispiel werden in einem im Makromaßstab ausgeführten zu einer Zellkultur analogem (CCA) System Zellen auf dem Boden von Kammern gezüchtet. Diese Systeme weisen hohe Verhältnisse von Flüssigkeit zu Zellen auf, die nicht den physiologischen Gegebenheiten entsprechen, und weisen ein unrealistisches Verhältnis der Zellarten auf (z. B. das Verhältnis von Leber- zu Lungenzellen). In einer abgewandelten Form des im Makromaßstab ausgeführten CCA Systems werden die Zellen auf mikroskopisch kleinen Trägerperlen gezüchtet. Diese Systeme ähneln physiologischen Bedingungen stärker, sind aber immer noch unzulänglich, weil sie physiologische Bedingungen nicht genau genug für prognostizierende Studien nachahmen. Folglich beruhen die resultierenden Untersuchungsdaten nicht auf dem Muster der Wirkstoff- oder Toxineinwirkung, das man in einem Tier finden würde.
Im Inneren von Lebewesen Wechselwirken Konzentration, Zeit und Stoffwechsel, um die Intensität und die Dauer einer pharmakologischen oder toxischen Reaktion zu beeinflussen. Zum Beispiel beeinflusst in vivo das Vorhandensein der Leberfunktion stark den Wirkstoffstoffwechsel und die Bioverfügbarkeit. Die Beseitigung eines aktiven Wirkstoffs durch die Leber erfolgt durch Biotransformation und Aus scheidung. Biotransformationsreaktionen schließen Reaktionen ein, die durch die Cytochrom P450 Enzyme katalysiert werden, die viele chemisch unterschiedliche Wirkstoffe umwandeln. Eine zweite Phase der Biotransformation kann eine hydrophile Gruppe wie Glutathion, Glucuronsäure oder -sulfat, hinzufügen, wodurch die Wasserlöslichkeit erhöht und die Ausscheidung über die Nieren beschleunigt wird.
Während Biotransformation von Vorteil sein kann, kann sie auch unerwünschte Folgen haben. Toxizität resultiert aus einem komplizierten Zusammenspiel zwischen einem Wirkstoff und dem Organismus. Während des Vorgangs der Biotransformation kann das resultierende Stoffwechselprodukt stärker toxisch sein als die ursprüngliche Verbindung. Den von vielen für Toxizitäts-Reihenuntersuchungen verwendeten Untersuchungen an einzelnen Zellen fehlen diese komplexen Effekte zwischen den Zellen und zwischen den Gewebearten.
Infolgedessen ist eine genaue Vorhersage der menschlichen Reaktionsfähigkeit auf potentielle pharmazeutische Produkte schwierig, häufig unzuverlässig und immer kostspielig. Traditionelle Verfahren zur Voraussage der menschlichen Reaktion verwenden Surrogate – typischerweise entweder statische, homogene in vitro Zellkulturuntersuchungen oder in vivo Studien an Tieren. In vitro Zellkulturuntersuchungen sind von begrenztem Wert, weil sie nicht genau die komplexe Umgebung nachahmen, der ein Wirkstoffkandidat im Inneren eines Menschen ausgesetzt ist und folglich das Risiko für den Menschen nicht genau vorhersagen kann. In ähnlicher Weise können in vivo Studien an Tieren zwar diese komplexen Effekte zwischen den Zellen und zwischen den Gewebearten berücksichtigen, die bei auf Zellen beruhenden in vitro Untersuchungen nicht zu beobachten sind, aber in vivo Studien an Tieren sind extrem kostspielig, arbeitsintensiv, zeitraubend, und häufig sind die Resultate von zweifelhafter Bedeutung, wenn sie sich auf Risiken beim Menschen beziehen.
US-Patent Nr. 5 612 188 von Shuler et al. beschreibt ein Zellkultursystem mit mehreren Kammern. Dieses Kultursystem benutzt große Komponenten, wie Kulturkammern, Sensoren und Pumpen, die den Gebrauch von großen Mengen von Kulturmedium, Zellen und Testverbindungen erfordern. Dieses System ist sehr kostspielig im Betrieb und hat einen erheblichen Platzbedarf, um zu arbeiten. Weil dieses System so groß dimensioniert ist, weichen die physiologischen Parameter beträchtlich von denen ab, die in einer in vivo Situation gefunden werden. Es ist unmöglich, physiologisch realistische Bedingungen in so großem Maßstab originalgetreu zu erzeugen.
"In vitro Toxizität in Hepatozyten-Bioreaktoren – die extrazelluläre Ansäuerungsrate (EAR) in einer Ziel-Zellinie zeigt hepato-aktivierte Umwandlung von Substraten an ("In vitro toxicology in the hepatocyte bioreactors – extracellular acidification rate (EAR) in a target cell line indicates hepato-activated transformation of substrates") von H. G. Koebe et al in Toxicology, Vol. 154, Nr. 1–3, S. 31–44 offenbart eine von Flüssigkeit durchströmte Zellkulturkammer mit einem Volumen von 50 ml mit Flüssigkeitskreislauf, in der primäre Schweine-Hepatozyten kultiviert werden. Die Kammer ist mit drei durchströmten Kammern eines Mikrophysiometer-Systems verbunden.
WO 93/11498 A offenbart eine Vorrichtung mit mehreren untereinander verbundenen Kulturkammern, in denen verschiedene Zelltypen gezüchtet werden, bei der die Flüssigkeitsströme zwischen den Kammern durch eine Pumpe oder mehrere Pumpen kontrolliert werden, um die Durchflussraten so anzupassen, dass sie physiologische Durchflussraten nachbilden.
Die Entwicklung von im Mikromaßstab ausgeführten Screening-Verfahren und -Vorrichtungen, die eine bessere, schnellere und leistungsfähigere Vorhersage von in vivo Toxizität und klinischer Performance von Wirkstoffen ermöglicht, ist von großem Interesse in einer Reihe von Bereichen und ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Solch eine im Mikromaßstab ausgeführte Vorrichtung würde realistische physiologische Parameter richtig erzeugen und würde ein genaueres Modell des gewünschten in vivo Systems, das untersucht wird, darstellen.
Unter einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine Kulturvorrichtung bereit, umfassend eine Kammer zur Aufnahme von Zellen, wobei die Kammer mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt, und wobei die Kammer die Zellen unter Bedingungen hält, die in vitro einen Wert mindestens eines pharmakokinetischen Parameters zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit dem in vivo gefundenen Wert mindestens eines pharmakokinetischen Parameters, und wobei die Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom aufweist.
Unter einem zweiten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Kulturvorrichtung bereit, wobei das Verfahren die Herstellung einer Kammer zur Aufnahme von Zellen umfasst, wobei die Kammer mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt, und wobei die Kammer die Zellen unter Bedingungen hält, die in vitro einen Wert mindestens eines pharmakokinetischen Parameters zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit dem in vivo gefundenen Wert mindestens eines pharmakokinetischen Parameters, und wobei die Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom aufweist.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen erlauben es, Zellen in vitro unter Bedingungen mit Werten pharmakokinetischer Parameter zu halten, die den in vivo gefundenen Werten vergleichbar sind. Pharmakokinetische Parameter, die von Interesse sind, umfassen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Verweilzeiten von Flüssigkeiten, das Verhältnis von Flüssigkeit zu Zellen, die relative Größe von Organen, Stoffwechsel durch die Zellen, Scherbeanspruchung und dergleichen mehr. Durch die Bereitstellung eines auf Pharmakokinetik beruhenden Kultursystems, das den natürlichen Zustand der Zellen nachahmt, wird die Vorhersagequalität und die in vivo Relevanz von Screening- und Toxizitätsuntersuchungen erhöht.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung ein Netzwerk von Flüssigkeitskanälen, das in einzelne, aber untereinander verbundene Kammern aufgeteilt ist. Die spezielle Kammergeometrie ist dafür entworfen, Wechselwirkungen zwischen den Zellen, Flüssigkeitsdurchfluss und Verweilzeitparameter der Flüssigkeit zur Verfügung zu stellen, die mit denen korrelieren, die in vivo für die entsprechenden Zellen, Gewebe oder Organe gefunden werden. Die Flüssigkeitsführung ist dafür entworfen, primäre Elemente des Kreislaufsystems oder des lymphatischen Systems genau abzubilden. In einer Ausführungsform werden diese Komponenten in einem Chip integriert. Der Entwurf und die Validierung dieser Geometrien basiert auf einem physiologisch-basierten pharmakokinetischen (PBPK) Modell; ein mathematisches Modell, das den Körper als untereinander verbundene Kompartimente darstellt, die unterschiedliche Gewebe darstellen.
Die Vorrichtung kann mit den für jede Kulturkammer geeigneten Zellen besiedelt werden. Zum Beispiel wird eine Kammer, die dafür vorgesehen ist, pharmakokinetische Parameter der Leber zur Verfügung zu stellen, mit Hepatozyten besiedelt und kann über eine Flüssigkeit in Verbindung mit Fettzellen stehen, die in einer Kammer angesiedelt wurden, die dafür entworfen wurde, Pharmakokinetik in einem Fettgewebe zur Verfügung zu stellen. Das Resultat ist ein auf Pharmakokinetik beruhendes Zellkultursystem, das zum Beispiel das Größenverhältnis der Gewebe, das Verhältnis von Gewebe- zu Blutvolumen, die Wirkstoffverweilzeit in dem Tier, dessen Modell es ist, genau nachstellt.
In einer Ausführungsform schließt ein System eine erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung und ein Steuerinstrument mit ein. Die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung weist eine Anzahl von im Mikromaßstab ausgeführten Kammern auf mit Geometrien, die eine Vielzahl von in vivo Wechselwirkungen mit einem Kulturmedium simulieren, wobei jede Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für den Fluss des Kulturmediums aufweist, und einen Mikro-Strömungskanal, der die Kammern untereinander verbindet. Das Steuerinstrument ist mit der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung verbunden und enthält einen Computer für das Sammeln von Daten aus der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung und die Steuerung von pharmakokinetischen Parametern der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung.
In einer anderen Ausführungsform schließt ein Computer einen Mikroprozessor, einen allgemeinen Speicher, ein nicht flüchtiges Speicherelement, eine Schnittstelle für Eingabe und Ausgabe, die eine Schnittstelle zu einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung, die einen oder mehrere Sensoren enthält, aufweist, und Computer-Software ein. Die Computer-Software ist auf dem Mikroprozessor ausführbar, um Daten von den Sensoren zu analysieren, um physiologische Ereignisse in einer Anzahl von Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu messen, die Durchflussraten eines Kulturmediums in den Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu regulieren, biologische oder toxikologische Reaktionen in den Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu detektieren und nach der Detektion einen oder mehrere pharmakokinetische Parameter der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu verändern.
So wie sie hierin verwendet werden, schließen die Singularformen "ein" bzw. "eine" und "der" bzw. "die" bzw. "das" den Plural mit ein, es sei denn, dass der Kontext offensichtlich etwas anders vorschreibt. Zum Beispiel bezieht sich "eine Verbindung" auf eine oder mehrere solcher Verbindungen, und "die Zelle" schließt eine bestimmte Zelle genauso wie andere Familienmitglieder und Äquivalente davon ein, die dem Fachmann bekannt sind.
Bevorzugte Ausführungsformen werden nun lediglich als Beispiele und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
1 ein Blockdiagramm eines Systems gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
2 eine vereinfachte perspektivische Außenansicht einer Ausführungsform des Systems der vorliegenden Erfindung ist.
3 eine ausführliche schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform des Systems der vorliegenden Erfindung ist.
4 eine schematische Darstellung noch einer anderen Ausführungsform des Systems der vorliegenden Erfindung ist.
5A bis 5G Schritte der Herstellung eines Chips aus Kunststoff zeigen. 5A zeigt das Beschichten eines Siliziumwafers mit einem Positiv-Fotolack. 5B zeigt das Belichten des mit dem Fotolack beschichteten Siliziumwafers mit UV-Licht durch ein Fotomaterial hindurch. 5C zeigt das Entwickeln des Fotolacks. 5D zeigt das Ätzen des Siliziums. 5E zeigt die Entfernung des Fotolacks und das Aufdampfen von Gold. 5F zeigt die Galvanisierung mit Nickel. 5G zeigt die Entfernung des Siliziums und das Prägen von Polymer.
6 eine schematische Ansicht von wieder einer anderen Ausführungsform des Systems der vorliegenden Erfindung ist.
7 ein Diagramm ist, das einen Computer näher beschreibt, der mit den Chips in Verbindung steht.
8 ein Diagramm ist, das mehr als einen Chip innerhalb eines Gehäuses zeigt.
9 ein Diagramm eines Systems ist, das Chipsätze aus unterschiedlichen Gehäusen einschließt.
10 ein Diagramm von wieder einer anderen Ausführungsform eines Chips ist.
11 eine isometrische, teilweise als Explosionsdarstellung ausgeführte Ansicht eines Systems ist.
12 eine isometrische Ansicht der Schritte der Herstellung des zu dem in 11 gezeigten System gehörenden Chips ist.
13 eine isometrische Ansicht eines aus Elastomeren bestehenden Teils eines einzelnen Trogs einer Pumpe ist, die mit dem System verbunden ist, das in 11 gezeigt wird.
14 eine isometrische Ansicht eines aus Elastomeren bestehenden Teils eines Mehrfachtrogs einer Pumpe ist.
15 ein schematisches Diagramm des Chips mit vier Kompartimenten ist.
16 Dosis-Wirkungs-Beziehung für Tegafur. Chips wurden mit HepG2-C3A Zellen im Leberkompartiment und HCT 116 Dickdarmkrebszellen im Zielgewebekompartiment besiedelt. Die Chips wurden 24 Stunden lang mit den angegebenen Konzentrationen von Tegafur behandelt. Das erste Diagramm (16A) ist ein Plot des Prozentsatzes toter Zellen gegen die Konzentration von Tegafur oder 5-FU nach 24 Stunden Kreislauf auf dem Chip. Das zweite Diagramm (16B) ist eine ähnliche Dosis-Wirkungs-Beziehung, die unter Verwendung einer traditionellen in vitro Zellkulturuntersuchung mit HCT 116 Zellen nach 48 Stunden Einwirkung erhalten wurde. HCT 116 Zellen wurden auf mit Polylysin behandelten Glasobjektträgern angesiedelt und den angegebenen Konzentrationen von entweder Tegafur oder 5-FU ausgesetzt. Nach einer 48 Stunden dauernden Inkubation wurden die Objektträger behandelt, wie oben beschrieben und der Prozentsatz von toten Zellen wurde bestimmt.
17A eine Vorrichtung mit drei Kompartimenten der "ersten Generation" darstellt. 17B zeigt eine Querschnittsansicht der Vorrichtung.
18A eine Vorrichtung der „zweiten Generation" darstellt. 18B stellt 5 μm hohe Grate in einer Kammer dar, und 18C stellt 20 μm hohe Säulen in einer Kammer dar.
19 eine Vorrichtung der „dritten Generation" darstellt.
20 ein Flussdiagramm für ein auf einem PBPK Modell beruhendes CCA mit fünf Kompartimenten ist.
21 einen Prototyp eines menschlichen Biochips bildlich darstellt, der Kompartimente für Lungengewebe, Zielgewebe und andere Gewebe enthält. Die Abmessungen der Kompartimente und der Kanäle sind wie folgt:

Zulauf: 1 mm × 1 mm
Leber: 3,2 mm breit und 4 mm lang
Zielgewebe: 2 mm breit und 2 mm lang
Andere Gewebe: 340 μm breit und 110 mm lang
Ablauf: 1 mm × 1 mm
Kanal, der die Leber mit dem Y-Anschluss verbindet: 440 μm breit
Kanal vom Y-Anschluss zum Zielgewebe: 100 μm breit

22 eine schematische Zeichnung des im Mikromaßstab ausgeführten Chipsystems bildlich darstellt.
23 basale CYP Expressionsniveaus für Hep G2, HepG2/C3A und menschliche Leber bildlich darstellt. Standardabweichungen aus 3 verschiedenen Bestimmungen.
24A Wachstumskurven von HepG2/C3A in EMEM, DMEM, Mc-Coys und RPMI bildlich darstellt. 24B stellt Wachstumskurven von HCT 116 in EMEM, DMEM, McCoys und RPMI bildlich dar. Standardabweichungen aus 3 verschiedenen Bestimmungen.
25 die RT-PCR Ermittlung der Expression von CYP Isoformen in HepG2/C3A unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und in unterschiedlichen Kulturmedien bildlich darstellt.
26 die Bestimmung der Expression von CYP Isoformen mit RT-PCR in auf unterschiedlichen Substraten gewachsenen HepG2/C3A bildlich darstellt.
27 einen Prototyp eines menschlichen Biochips bildlich darstellt.
28A eine Blockdiagrammdarstellung ist, die ein System zur Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. 28B ist eine Blockdiagrammdarstellung, die ein System zur Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
29 ein Flussdiagramm ist, das ein rechnergestütztes Verfahren zur dynamischen Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
30 eine Blockdiagrammdarstellung ist, die einen Computer zur Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein im Mikromaßstab ausgeführtes zu einer Zellkultur analoges (CCA) Sy stem entwickelt. Solch ein im Mikromaßstab ausgeführtes CCA System hat viele Vorteile gegenüber den früheren im Makromaßstab ausgeführten Systemen. Die im Mikromaßstab ausgeführten Systeme benutzen kleinere Mengen Reagenzien, weniger Zellen (die den Gebrauch von authentischen Primärzellen anstelle von kultivierten Zellen erlauben), sind der physiologischen Realität näher (zum Beispiel Verweilzeiten, Organverhältnisse, Scherbeanspruchungen), verursachen niedrigere Kosten für die Vorrichtung und sind kleiner (Mehrfachtests und statistische Analyse sind möglich). Außerdem können mehrere Biosensoren auf demselben Chip untergebracht werden.
In einfachster Weise ausgedrückt stellt der Chip der vorliegenden Erfindung ein genaues in vitro Surrogat eines vollständigen Tieres oder Menschen zur Verfügung. Um dies zu erreichen, wurde ein Ausgangsdesign produziert, das eine physiologie-basiertes pharmakokinetisches (PBPK) Modell verwendet – ein mathematisches Modell, das den Körper als untereinander verbundene Kompartimente darstellt, die für ein bestimmtes Organ spezifisch sind. Ausgehend von dem PBPK Modell und veröffentlichten empirischen Daten ergab sich aus einem langwierigen und umfangreichen Entwicklungsprogramm eine im Mikromaßstab ausgeführte Vorrichtung, die genau das bekannte Verhältnis der Gewebeabmessungen, das Verhältnis von Gewebe- zu Blutvolumen, die Verweilzeit von Wirkstoffen und andere wichtige physiologische Parameter eines vollständigen Tieres oder Menschen nachahmt. Im Wesentlichen ist die Chiptechnologie der vorliegenden Erfindung ein im Mikromaßstab ausgeführtes Modell eines vollständigen Tieres oder Menschen (ca. 1 : 100.000 für den Menschen).
Im Betriebszustand repliziert die Vorrichtung ein Multiorgan-System mit Flüssigkeitskreislauf, indem sie lebende Zellen auf getrennte, untereinander verbundene "Organ"-Kompartimente aufteilt (siehe zum Beispiel 15). Die Flüssigkeitsführung ist so ausgelegt, dass die primären Elemente des Kreislaufsystems und die Wechselwirkungen der Organsysteme genau abgebildet werden. Jedes Organkompartiment enthält eine bestimmte Zellart, die sorgfältig ausgewählt oder dafür gestaltet wurde, die Primärfunktionen) des entsprechenden vollständigen Organs nachzuahmen (z. B. xenobiotischen Metabolismus durch die Leber). Die Zellart kann anhaftend oder nicht anhaftend sein und aus Standardzellkulturlinien oder aus Primärgewebe abgeleitet sein. Es werden menschliche Zellen für menschliche Surrogate eingesetzt oder Zellen von anderen Spezies benutzt, wie es jeweils passend ist.
Die Organkompartimente werden durch ein im Umlauf geführtes Kulturmedium verbunden, das als "Blutsurrogat" dient. Testsubstanzen im Medium werden verteilt und wirken auf die Zellen in den Organkompartimenten ein, in ähnlicher Weise wie sie dies im menschlichen Körper oder im vollständigen Tier tun würden. Die Wirkungen dieser Verbindungen und/oder ihrer Stoffwechselprodukte auf die verschiedenen Zellarten werden ermittelt, indem man physiologische Schlüsselereignisse wie Zelltod, Zellvermehrung, Differenzierung, Immunantwort oder Störungen im Stoffwechsel oder in den Signalübertragungswegen misst oder überwacht. Zusätzlich können pharmakokinetische Daten bestimmt werden, indem man Aliquote des Kulturmediums sammelt und auf Stoffwechselprodukte von Wirkstoffen analysiert.
Die im Mikromaßstab ausgeführte Chipvorrichtung der vorliegenden Erfindung bietet sowohl die Vorteile der traditionellen Zellkulturuntersuchungen hinsichtlich Kosten und Durchsatz als auch den hohen Informationsgehalt von Ganztiermodellen an. Jedoch ist, anders als Tests am ganzen Tier, der Chip billig und weitgehend ein Einwegartikel. Das kleine Flüssigkeitsvolumen (ca. 5 μl) der Vorrichtung liefert die hohe Empfindlichkeit und den hohen Durchsatz, die für mikrofluidische Vorrichtungen charakteristisch sind. Außerdem ist das Auslesen der Vorrichtung in hohem Grade flexibel und unabhängig vom Assay – fast jede Zellart oder jedes Assay können ohne Änderung verwendet werden. Es sind zahlreiche biologische Assays verfügbar, die auf optischer Abfrage und optischem Auslesen (zum Beispiel Fluoreszenz, Lumineszenz) beruhen, wodurch eine Überwachung in Echtzeit möglich wird. Alternativ können übliche pathologische, biochemische, Genom- oder Proteom-Assays direkt verwendet werden, da das System dafür ausgelegt werden kann, mit dem traditionellen Objektträgerformat (22 mm × 22 mm) oder dem Format von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen völlig kompatibel zu sein. Weiterhin können genetisch veränderte Zellen für spezialisierte Endnutzeranwendungen benutzt werden. Zusätzlich können „3D"-Chips benutzt werden, um zusätzliche Kompartimente und Module für die Untersuchung der Absorption im Magen-Darm-Trakt oder in der Blut-Hirn-Schranke zu umfassen.
Anders als traditionelle in vitro Assays ahmt der Chip der vorliegenden Erfindung genauer die komplexe Biologie der vielen Gewebearten (Leber, Lunge, Körperfett, Kreislaufsystem etc.) des vollständigen Organismus nach. Wirkstoffkandidaten werden einer realistischeren tierischen oder menschlichen physiologischen Umgebung ausgesetzt, und liefern dadurch einen höheren und genaueren Informationsgehalt (zum Beispiel, Absorption, Verteilung, Bioakkumulation, Metabolismus, Ausscheidung, Wirksamkeit und Toxizität) als typische in vitro Assays. Diese Vorteile haben direkten Einfluss auf die Sicherheit und Wirksamkeitsvorhersagen für Leitverbindungen für Wirkstoffe und insbesondere ihre Priorisierung, bevor sie an kostspieligen und zeitraubenden präklinischen oder klinischen Versuchen teilnehmen. Dieses Priorisierung erhöht den Durchsatz in der Wirkstoffentwicklung, verringert die Zahl der Tiere, die für das toxikologische Screening benötigt werden, verringert die Kosten von präklinischen Studien und erhöht die Leistungsfähigkeit von klinischen Versuchen, indem es eine schnelle und direkte Feststellung der potentiellen Toxizität oder eines Mangels an Wirksamkeit vor dem Beginn dieser Versuche erlaubt.
Dies zeigt einige der Vorteile der Chiptechnologie der vorliegenden Erfindung. Insgesamt ist das Sammeln von Daten schnell, wenn es mit traditionellen in vitro Zellkulturuntersuchungen, Studien an Tieren oder klinischen Versuchen verglichen wird. Die Daten sind auch robust und stellen Aussagen mit hohem prognostischem Wert zur Verfügung, der aus traditionellen in vitro Untersuchungen nicht erhältlich sind. Die Chipplattform ist so entworfen, dass sie mit existierenden Assays völlig kompatibel ist – sowohl im üblichen Objektträgerformat oder im Format von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen. Die Vorrichtung selbst ist konfigurierbar für jede Tierspezies oder jede Kombination von mehreren Organkompartimenten. Die einzelnen Chips sind kostengünstige Einwegteile. Außerdem verringert das geringe Volumen der Vorrichtung die Kosten für die Reagenzien bei Reihenuntersuchungen möglicher Wirkstoffe weiter.
Anders als derzeit verfügbare Technologien erhöht das vorliegende Chipsystem erheblich die Erfolgsraten nicht nur in der klinischen Phase, sondern auch durch Verringerung der Anzahl von Verbindungen, die eine präklinische Prüfung durchlaufen müssen. Infolgedessen kann eine pharmazeutische Firma (1) zu einem frühen Zeitpunkt im Entwicklungsprozess feststellen, welche Wirkstoffkandidaten das Potential haben, für den Menschen toxisch zu sein; (2) besser die Tierspezies auswählen, die am besten die menschliche Reaktion vorhersagen kann; und (3) feststellen, welcher Wirkstoffkandidat das Potential hat, wirksam zu sein. So erhöht der Chip der vorliegenden Erfindung erheblich die Erfolgsraten und verringert die Entwicklungszeit von vermarktungsfähigen Arzneimitteln.
Auf Pharmakokinetik beruhende im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung
Vorrichtungen, in vitro Zellkulturen und Verfahren für eine CCA Vorrichtung werden zur Verfügung gestellt. Die betreffenden Verfahren und Vorrichtungen stellen ein Mittel bereit, mit dem Zellen in vitro in einer für die Physiologie repräsentativen Umgebung gehalten werden, wodurch man den prognostischen Wert und die in vivo Relevanz von Reihen- und Toxizitätsuntersuchungen verbessert. Eine im Mikromaßstab ausgeführte pharmakokinetische Kulturvorrichtung der vorliegenden Erfindung wird mit den geeigneten Zellen für jede Kulturkammer besiedelt, und das Kultursystem kann dann für Wirkstoffscreening, Toxizitätsuntersuchungen, Modelle für die Entwicklung von Zellen von Interesse, Modelle für Infektionskinetik und dergleichen mehr verwendet werden. Eine Eingangsvariable, die zum Beispiel eine Verbindung, eine Probe, eine Gensequenz, ein Krankheitserreger, eine Zelle (wie beispielsweise eine Stammzelle oder eine Vorläuferzelle) sein kann, wird zu einem eingerichteten Kultursystem hinzugefügt. Verschiedene zelluläre Ausgabeparameter können abgeschätzt werden, um die Reaktion der Zellen auf die Eingangsvariable zu bestimmen, einschließlich des pH-Wert des Mediums, den Konzentrationen von O₂ und CO₂ im Medium, der Expression von Proteinen und von anderen zellulären Markern, der Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit der Zellen oder der Freisetzung zellulärer Produkte in das Kulturmedium.
Die Gestaltung und die Geometrie des Kultursubstrates oder der Vorrichtung sorgen für die einzigartigen Wachstumsbedingungen der Erfindung. Jede Vorrichtung enthält eine oder mehrere Kammern, die durch Flüssigkeitskanäle untereinander verbunden sind. Jede Kammer kann eine geometrische Konfiguration haben, die anders ist als die von anderen auf der Vorrichtung vorhandenen Kammern. Zum Beispiel besteht eine Ausführungsform der Vorrichtung aus Kammern, die Lunge, Leber und andere Gewebe (18A) darstellen. Die Lungenkammer in dieser Ausführungsform enthält 5 um hohe Grate, um ein realistisches Verhältnis von Zellen zu Flüssigkeitsvolumen und eine realistische Verweilzeit der Flüssigkeit zu erzielen (18B). Die Leberkammer in dieser Ausführungsform enthält 20 μm hohe Säulen, um ein realistisches Verhältnis von Zellen zu Flüssigkeitsvolumen eine realistische Verweilzeit der Flüssigkeit zu erzielen (18C). Die Vorrichtung enthält auch Zulauf- und Ablauföffnungen, damit das Kulturmedium verteilt werden kann.
In einer Ausführungsform liegt die Kulturvorrichtung in einem Chipformat vor, d. h. die Kammern und die Flüssigkeitskanäle werden mit einer vorgefertigten Vorlage hergestellt oder geformt, so dass die Vorrichtung entweder als einzelne Einheit oder als modulares System mit einer oder mehreren Kammern auf unterschiedlichen Einheiten gebaut wird. Im Allgemeinen wird das Chipformat in einem kleinen Maßstab ausgeführt, normalerweise mit einer Seitenlänge von nicht mehr als ungefähr 10 cm oder sogar mit einer Seitenlänge von nicht mehr als ungefähr 5 cm. Es kann sogar eine Seitenlänge von nur ungefähr 2 cm aufweisen oder sogar noch kleiner sein. In einem anderen Beispiel kann der Chip im Format einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen untergebracht werden, in dem die einzelnen Chips kleiner als 0,9 cm × 0,9 cm sind. Die Kammern und die Flüssigkeitskanäle sind entsprechend im Mikromaßstab ausgeführt.
In einer anderen Ausführungsform hat die Kulturvorrichtung die Form einer integrierten Vorrichtung, die aus einem Tischgerät besteht, in dem mehrere Mikrochips untergebracht sind, die als auf Polymeren basierende Einwegkomponenten aus Kunststoff gefertigt werden. Das Gerät kann aus einem Unterteil mit Vertiefungen bestehen, um einzelne Zellchips unterzubringen oder alternativ ein einzelner "Chip" im Standardformat einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen sein (d. h. 96 einzelne Chips im Format 8 × 12). Wenn das Oberteil des Geräts geschlossen wird, versiegelt es die Chips und bildet Verbindungskanäle für Flüssigkeit. Das Gerät enthält Pumpen für kleine Volumina, um Flüssigkeit im Kreislauf zu den Chips zu führen und kleine Dreiwege-Ventile mit Injektionsschleifen, um die Einleitung von Testverbindungen zu ermöglichen, oder zieht alternativ Verbindungen direkt von einer Platte mit 96 oder 384 Vertiefungen. Mit diesem Gerät können mehrere Verbindungen gleichzeitig auf Wirksamkeit, Toxizität und/oder Produktion von Stoffwechselprodukten untersucht werden. Das Gerät kann auch die Detektion von Fluoreszenz auf dem Chip integrieren für die Überwachung der Physiologie in Echtzeit unter Verwendung gut charakterisierter Biomarker.
Die Vorrichtung kann einen Mechanismus für die Messung von Signalen der Zellen und des Kulturmedium umfassen. Die Signale aus unterschiedlichen Kammern und Kanälen können in Echtzeit überwacht werden. Zum Beispiel können Biosensoren in die Vorrichtung integriert sein oder sich außerhalb der Vorrichtung befinden, die es ermöglichen, den physiologischen Status der Zellen im System in Echtzeit auszulesen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein ideales System für Reihenuntersuchungen mit hohem Durchsatz zur Verfügung, um positive oder negative Reaktionen auf eine Reihe von Sub stanzen zu identifizieren, wie beispielsweise pharmazeutische Zusammensetzungen, Impfstoffzubereitungen, cytotoxische Chemikalien, Mutagene, Cytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, Hemmstoffe, chemotherapeutische Wirkstoffe und eine Unmenge anderer Verbindungen oder Faktoren. Die zu prüfende Substanz kann entweder natürlich vorkommend oder synthetisch sein, und sie kann organisch oder anorganisch sein.
Zum Beispiel kann die Wirksamkeit einer cytotoxischen Verbindung durch ihre Fähigkeit gemessen werden, Zellen in einer Kultur zu beschädigen oder zu töten. Dieses kann durch Verfahren der Lebendfärbung leicht festgestellt werden. Der Effekt von Wachstums- oder regulierenden Faktoren kann festgestellt werden, indem man den Zellgehalt der Matrix analysiert, zum Beispiel durch Gesamtzellzählung oder Differentialzellzählung. Dieses kann unter Verwendung von cytologischen und/oder histologischen Standardtechniken erfolgen, einschließlich des Gebrauchs von immuno-cytochemischen Techniken, die Antikörper einsetzen, die Art-spezifische zelluläre Antigene definieren. Der Effekt von verschiedenen Wirkstoffen auf normale Zellen, die in der Vorrichtung gezüchtet wurden, kann ermittelt werden. Zum Beispiel können Wirkstoffe, die die Bildung von roten Blutkörperchen erhöhen, in Knochenmarkkulturen geprüft werden. Wirkstoffe, die den Stoffwechsel von Cholesterin beeinflussen, zum Beispiel indem sie die Cholesterinproduktion verringern, können in einem Lebersystem geprüft werden. Kulturen von Tumorzellen können als Modellsysteme benutzt werden, um zum Beispiel die Wirksamkeit von Antitumormitteln zu prüfen.
Die Vorrichtung der Erfindung kann als Modellsystem für die Untersuchung von physiologischen oder pathologischen Zuständen genutzt werden. Zum Beispiel kann in einer spezifi schen Ausführungsform der Erfindung eine Vorrichtung als Modell für die Blut-Hirn-Schranke eingesetzt werden; solch ein Modellsystem kann benutzt werden, um die Penetration von Substanzen durch die Blut-Hirn-Schranke zu studieren. In einer zusätzlichen Ausführungsform, und nicht als Beschränkung gedacht, kann eine Vorrichtung, die Schleimhaut-Epithel enthält, als Modellsystem benutzt werden, um Infektionen mit Herpesviren oder Papillomaviren zu studieren; solch ein Modellsystem kann benutzt werden, um die Wirksamkeit von antiviralen Medikamenten zu prüfen.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann auch benutzt werden, um die Diagnose und die Behandlung von bösartigen Geschwulsten und Krankheiten zu unterstützen. Zum Beispiel können Biopsien irgendeines Gewebes (z. B. Knochenmark, Haut, Leber) einem Patienten entnommen werden, bei dem das Vorliegen einer bösartigen Geschwulst vermutet wird. Die Kultur des Patienten kann in vitro benutzt werden, um eine Reihenuntersuchung cytotoxischer und/oder pharmazeutischer Verbindungen durchzuführen, um diejenigen zu ermitteln, die am wirkungsvollsten sind; d. h. diejenigen, die die bösartigen oder kranken Zellen töten, aber die normalen Zellen verschonen. Diese Mittel können dann benutzt werden, um den Patienten therapeutisch zu behandeln.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Vorrichtung in vitro verwendet werden, um biologische Produkte in hoher Ausbeute zu produzieren. Zum Beispiel kann eine Zelle, die auf natürliche Weise große Mengen eines bestimmten biologischen Produktes produziert (z. B. einen Wachstumsfaktor, einen regulierenden Faktor, ein Peptidhormon, einen Antikörper) oder eine Wirtszelle, die genetisch verändert wird, um ein Produkt eines fremden Gens zu produzieren, mit der in vitro Vorrichtung durch Klonen vermehrt werden. Wenn eine transformierte Zelle das Produkt des Gensin das Nährmittel ausscheidet, kann das Produkt aus dem verbrauchten oder konditionierten Medium mit Standard-Trenntechniken leicht isoliert werden (z. B. HPLC, Säulenchromatographie, elektrophoretische Techniken, um nur einige zu nennen). Ein „Bioreaktor" kann geplant werden, der die Vorteile der Methode des kontinuierlichen Flusses nutzt, um Kulturen in vitro zu ernähren. Im Wesentlichen wird in dem Maße, in dem frisches Medium durch die Kulturen in der Vorrichtung geführt wird, das Produkt des Gens aus der Kultur ausgewaschen, zusammen mit den Zellen, die aus der Kultur freigesetzt werden. Das Produkt des Gens kann aus dem Abfluss des verbrauchten oder konditionierten Mediums isoliert werden (z. B. durch HPLC Säulenchromatographie, Elektrophorese).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein System für die Reihenuntersuchung oder die Messung der Effekte von verschiedenen Umweltbedingungen oder Verbindungen auf ein biologisches System zur Verfügung. Zum Beispiel könnten Luft- oder Wasserbedingungen in der Vorrichtung nachgeahmt oder variiert werden. Die Auswirkung von unterschiedlichen bekanntermaßen oder vermutlich toxischen Substanzen könnte geprüft werden. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein System für Reihenuntersuchungen von Verbrauchsprodukten, wie beispielsweise Kosmetika, Reinigungsmitteln oder Lotionen zur Verfügung. Es stellt auch ein System für die Bestimmung der Sicherheit und/oder der Wirksamkeit von Nahrungsmitteln zugesetzten Wirkstoffen, von Nahrungsergänzungen oder von Nahrungsmittelzusätzen zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung könnte auch als miniaturisierter Bioreaktor oder zelluläre Produktionsplattform verwendet werden, um größere Mengen zellulärer Produkte zu produzieren.
Typische Wirksamkeits- oder Toxizitätsexperimente, welche die im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung im Chip format der vorliegenden Erfindung verwenden, sind innerhalb von 24 bis 48 Stunden oder weniger abgeschlossen, abhängig von der Gestaltung des Experiments. Es können jedoch auch ausgedehnte Experimente durchgeführt werden, um die Effekte chronischer Exposition zu ermitteln (z. B. Gentoxizität, Karzinogenizität oder latente Krankheiten).
Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Vorrichtungen, Systeme und Verfahren zur Verfügung, wie im Rahmen dieser Beschreibung ausgeführt wird. Im Allgemeinen haben alle technischen und wissenschaftlichen Bezeichnungen, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie der Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet, zu dem diese Erfindung gehört, üblicherweise verstehen würde, soweit es nicht eindeutig anders angegeben ist. Zur Klarstellung sind nachstehend Definitionen für bestimmte Bezeichnungen aufgeführt worden, die hierin verwendet werden, um die vorliegende Erfindung zu beschreiben. Diese Definitionen treffen auf die Bezeichnungen zu, wie sie durchgehend in dieser Beschreibung verwendet werden, soweit es nicht eindeutig anders angegeben ist.
Definition von Bezeichnungen
Auf Pharmakokinetik beruhendes Kultursystem:
Ein in vitro Zellkultursystem, in dem die Zellen unter Bedingungen gehalten werden, die Werte für pharmakokinetische Parameter zur Verfügung stellen, die in vivo gefundenen Werten entsprechen. Eine pharmakokinetische Kulturvorrichtung enthält ein Netz von Flüssigkeitskanälen, die in einzelne aber untereinander verbundene Kammern aufgeteilt sind, in denen die spezifische Kammergeometrie dafür entworfen ist, Wechselwirkungen zwischen Zellen, Flüssigkeitsströme und Verweilzeitparameter für Flüssigkeit zur Verfügung zu stellen, die mit denen korrelieren, die in vivo für die entsprechenden Zellen, das entsprechende Gewebe oder das entsprechende Organsystem gefunden werden. Die Vorrichtung wird mit Zellen besiedelt, die für die nachzubildenden Bedingungen geeignet sind, z. B. Leberzellen in einer auf der Leber beruhenden Kulturkammer, Lungenzellen in einer auf der Lunge beruhenden Kulturkammer und dergleichen mehr, um das Kultursystem herzustellen.
Die Kultursysteme der Erfindung stellen einen Wert mindestens eines pharmakokinetischen Parameters zur Verfügung, der mit Werten vergleichbar ist, welche für die Zelle, das Gewebe oder das Organsystem von Interesse in vivo gefunden werden, vorzugsweise Werte mindestens zweier Parameter, und können vergleichbare Werte von drei oder mehr Parametern zur Verfügung stellen. Pharmakokinetische Parameter von Interesse schließen z.B. Wechselwirkungen zwischen Zellen, Verweilzeit von Flüssigkeiten, Verhältnisse von Flüssigkeit zu Zellen, Stoffwechsel durch Zellen oder Scherbeanspruchung ein.
Unter vergleichbaren Werten wird verstanden, dass die tatsächlichen Werte nicht mehr als 25% von den theoretischen Werten abweichen. Zum Beispiel beträgt der errechnete oder theoretische Wert für die Verweilzeit der Flüssigkeit im Lungenkompartiment für eine Ratte 2 Sekunden, und der tatsächliche Wert, der in der Lungenzellen-Kulturkammer einer eine Ratte nachbildenden CCA Vorrichtung gemessen wurde, betrug 2,5 ± 0,7 Sekunden.
Der Wert des pharmakokinetischen Parameters wird erhalten, indem man die Gleichungen eines PBPK Modells verwendet. Solche Gleichungen sind im Stand der Technik beschrieben worden, siehe z.B. Poulin und Theil (2000) J. Pharm. Sci. 89 (1) : 16–35; Slob et al. (1997) Crit. Rev. Toxicol. 27 (3) : 261–72; Haddad et al. (1996) Toxicol. Lett. 85 (2): 113–26; Hoang (1995) Toxicol. Lett. 79 (1–3): 99–106; Knack et al. (1995) Toxicol. Lett. 79 (1–3): 87–98; und Ball und Schwartz (1994) Comput. Biol. Med. 24 (4): 269–76, die durch Bezugnahme Teil dieser Beschreibung werden sollen. Pharmakokinetische Parameter können auch aus der veröffentlichten Literatur erhalten werden, siehe z.B. Buckpitt et al. (1984) J. Pharmacol. Exp. Ther. 231: 291–300; DelRaso (1993) Toxicol. Lett. 68: 91–99; Haies et al. (1981) Am. Rev. Respir. Dis. 123: 533–541.
Spezifische physiologische Parameter von Interesse schliessen die Verweilzeit der Flüssigkeit im Gewebe oder im Organ, die Masse des Gewebes oder des Organs, das Volumenverhältnis von Flüssigkeit zu Zellen, die Scherbeanspruchung der Zellen etc. mit ein. Werte physiologisch relevanter Parameter können nach herkömmlichen Methoden empirisch erhalten werden oder können aus den Werten erhalten werden, die im Fachgebiet bekannt und öffentlich zugänglich sind. Werte pharmakokinetischer Parameter von Interesse werden für ein Tier ermittelt, normalerweise ein Säugetier, obgleich andere Tiermodelle auch Gebrauch finden können, z. B. Insekten, Fische, Reptilien oder Vögel. Säugetiere schließen Labortiere mit ein, z. B. Maus, Ratte, Kaninchen oder Säugetier-Versuchstiere von wirtschaftlichem Wert, z. B. pferdeartige, schafartige, ziegenartige, rinderartige, hundeartige oder katzenartige; Primaten, einschließlich Affen, Menschenaffen oder Menschen; und dergleichen mehr. Unterschiedliche Werte können erhalten und verwendet werden für Tiere unterschiedlichen Alters, z. B. Föten, Neugeborene, Säuglinge, Kinder, Erwachsene oder Senioren; und für unterschiedliche physiologische Zustände, z. B. krank, nach Kontakt mit einem pharmazeutisch wirksamen Mittel, nach Infektion oder unter Bedingungen geänderten atmosphärischen Drucks.
Die Informationen, die für die Werte der pharmakokinetischen Parameter von Bedeutung sind, sowie Massenbilanzgleichungen, die anwendbar sind auf verschiedene im System zu modellierende Substanzen, werden optional in einer Daten verarbeitenden Komponente des Kultursystems zur Verfügung gestellt, Z. B. Nachschlagetabellen in einem für die Datenspeicherung reservierten allgemeinen Speicher, und dergleichen. Diese Gleichungen stellen physiologie- basierte pharmakokinetische Modelle für verschiedene biologische bzw. chemische Substanzen in den Systemen dar.
Pharmakokinetische Kulturvorrichtung:
Die Kulturvorrichtung der Erfindung stellt ein Substrat zur Züchtung von Zellen zur Verfügung. Jede Vorrichtung enthält mindestens eine Kammer, normalerweise mindestens zwei Kammern, und kann drei oder mehr Kammern enthalten, wobei die Kammern durch Flüssigkeitskanäle untereinander verbunden sind. Die Kammern können sich auf einem einzigen Substrat oder auf unterschiedlichen Substraten befinden. Vorzugsweise hat jede Kammer eine geometrische Konfiguration, die sich von der der anderen Kammer(n) unterscheidet, die auf der Vorrichtung vorhanden ist bzw. sind. Die Vorrichtung enthält eine Abdeckung, um die Kammern und die Kanäle zu versiegeln und enthält mindestens eine Zulauf- und eine Ablauföffnung, die es ermöglichen, das Kulturmedium im Kreislauf zu führen. Die Vorrichtung enthält einen Mechanismus, um das Kulturmedium durch das System zu pumpen. Das Kulturmedium ist dafür ausgelegt, die Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit der kultivierten Zellen zu erhalten. Die Vorrichtung enthält einen Mechanismus, durch den Testverbindungen in das System eingeführt werden können.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Vorrichtung im Mikromaßstab als einzelne Einheit von nicht mehr als ungefähr 2,5 cm Seitenlänge fabriziert und enthält vorzugs weise mindestens zwei miteinander verbundene Kammern. Die zwei Organkompartimente sind durch einen ungefähr 50–150 μm breiten und 15–25 μm tiefen Kanal miteinander verbunden. Zum Beispiel kann eine Kammer die Lunge darstellen und eine untereinander verbundene Reihe von parallelen Kanälen, normalerweise mindestens ungefähr 10 Kanälen, vorzugsweise mindestens ungefähr 20 Kanälen enthalten. Solch ein Kanal kann typische Abmessungen für Mikro-Strömungskanäle haben, z. B. ungefähr 30–50 μm breit, 5–15 μm tief und 3–7 mm lang sein. Eine anderes Kompartiment kann die Leber darstellen und zwei oder mehr parallele Kanäle enthalten, die normalerweise ungefähr 50–150 μm breit, 15–25 μm tief und 5–15 cm lang sind und eine Form einer Serpentine haben.
Die Vorrichtung wird normalerweise eine Einheit bzw. einen Mechanismus für die Aufnahme von Signalen aus den Zellen und dem Kulturmedium umfassen. Die Signale aus unterschiedlichen Kammern und Kanälen können in Echtzeit überwacht werden. Zum Beispiel können Biosensoren in die Vorrichtung integriert werden oder sich außerhalb der Vorrichtung befinden, die das Auslesen des physiologischen Status der Zellen im System in Echtzeit ermöglichen.
Die pharmakokinetische Kulturvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann als Chip oder als Substrat zur Verfügung gestellt werden. Zusätzlich zur Verbesserung der Strömungseigenschaften sparen solche Mikrosysteme Platz ein, besonders wenn sie in hochgradig parallelisierten Systemen verwendet werden, und sie können billig produziert werden. Die Kulturvorrichtung kann aus einem Polymer gebildet werden, wie beispielsweise (aber nicht begrenzt auf) Polystyrol, und nach einmaligem Gebrauch entsorgt werden, was die Notwendigkeit einer Sterilisation beseitigt. Infolgedessen kann das in vitro Teilsystem billig produziert und in großem Um fang benutzt werden. Zusätzlich können die Zellen in dreidimensionaler Weise gezüchtet werden, z. B. um eine Röhre zu bilden, die die Umgebung in vivo genauer nachbildet.
Um die Reaktion des Stoffwechsels eines Tieres auf irgendeinen bestimmten Wirkstoff zu modellieren, kann eine Reihe von Parallel- oder Multiplex-Arrays eingesetzt werden, die mehrere (d. h. mindestens zwei) der Zellkultursysteme enthält, wobei alle Systeme identisch sein können oder durch vorbestimmte Parameterwerte oder zugeführte Verbindungen und Eingangskonzentrationen verändert werden können. Das Array kann mindestens ungefähr 10 Systeme enthalten oder sogar aus bis zu 100 oder mehr Systemen bestehen. Vorteilhaft können die sich auf Mikrochips befindenden Zellkultursysteme innerhalb einer einzigen Kammer untergebracht werden, so dass alle Zellkultursysteme darunter während einer Untersuchung den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind.
Alternativ können mehrere Chips untereinander verbunden werden, um eine einzige Vorrichtung zu bilden, z. B. um die Magen-Darm-Schranke oder die Blut-Hirn-Schranke nachzubilden.
Zellen:
Zellen für den Einsatz in den Assays der Erfindung können ein Organismus, eine von einem Organismus abgeleitete Art von einzelnen Zellen oder eine Mischung von Zellarten sein, wie es für in vivo Situationen typisch ist. Die Kulturbedingungen können z.B. Temperatur, pH-Wert, Anwesenheit von Faktoren, Anwesenheit anderer Zellarten und dergleichen mehr einschließen. Eine Vielzahl von Tierzellen kann benutzt werden, die all die Tiere einschließt, für die Werte pharmakokinetischer Parameter erhalten werden können, wie bereits beschrieben. Die Erfindung ist geeignet dafür, mit jeglicher Art von Zellen benutzt zu werden, einschließlich Primärzellen, Stammzellen, Vorläuferzellen, normaler Zellen, genetisch modifizierter Zellen, genetisch veränderter Zellen, immortalisierter Zellen und umgewandelter Zelllinien. Die vorliegende Erfindung ist geeignet dafür, mit Arten einzelner Zellen oder mit Zelllinien verwendet zu werden, oder mit Kombinationen verschiedener Zellarten. Vorzugsweise behalten die kultivierten Zellen die Fähigkeit bei, auf Reize zu reagieren, die in ihren natürlich vorkommenden Gegenstücken eine Reaktion hervorrufen. Diese können von allen Quellen abgeleitet sein wie beispielsweise eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen. Die eukaryotischen Zellen können pflanzlicher oder tierischer Natur sein, wie Menschen-, Affen- oder Nagetierzellen. Sie können von irgendeiner Gewebeart (z. B. Herz, Magen, Niere, Darm, Lunge, Leber, Fett, Knochen, Knorpel, Skelettmuskel, glatter Muskel, Herzmuskel, Knochenmark, Muskel, Gehirn, Pankreas) und Zellart (z. B. Epithel-, Endothel-, Mesenchym-, Fett-, Blutzellen) sein. Außerdem können ein Querschnitt eines Gewebes oder ein Organ benutzt werden. Zum Beispiel könnte ein Querschnitt einer Arterie, einer Vene, des Magen-Darm-Trakts, der Speiseröhre oder des Kolons verwendet werden.
Zusätzlich können Zellen, die genetisch verändert oder modifiziert worden sind, um eine nicht native „rekombinante" (auch „exogen" genannte) Nukleinsäuresequenz zu enthalten, oder die durch Antisense-Technologie verändert worden sind, um zusätzliche genetische Funktionen zu aktivieren oder genetische Funktionen zu deaktivieren, in der Erfindung verwendet werden. Methoden zur Erzeugung genetisch veränderter Zellen sind dem Fachmann bekannt, siehe zum Beispiel „Aktuelle Protokolle in der molekularen Biologie" („Current Protocols in Molecular Biology"), Ausubel et al., Hrsg., John Wiley u. Söhne, New York, NY, 2000. Die Zellen könnten terminal differenziert oder undifferenziert sein, wie beispielsweise eine Stammzelle. Die Zellen der vorliegenden Erfindung könnten kultivierte Zellen aus einer Vielzahl von genetisch unterschiedlichen Einzelpersonen sein, die auf biologische und pharmakologische Wirkstoffe unterschiedlich reagieren können. Genetische Verschiedenartigkeit kann indirekten oder direkten Einfluss auf die Anfälligkeit für Krankheiten haben. In einem Fall von direktem Einfluss kann sogar die Änderung eines einzigen Nukleotids mit dem Ergebnis eines „Single Nucleotide Polymorphism" (SNP) die Aminosäurereihenfolge eines Proteins ändern und direkt zu einer Krankheit oder zur Anfälligkeit für eine Krankheit beitragen. Zum Beispiel sind bestimmte APO-Lipoprotein E Genotypen mit dem Einsetzen und Fortschreiten der Alzheimerschen Krankheit in manchen Personen in Verbindung gebracht worden.
Wenn bestimmte Polymorphismen mit dem Phänotyp einer bestimmten Krankheit verbunden sind, können Zellen von Personen, die als Träger des Polymorphismus identifiziert worden sind, auf Entwicklungsanomalien untersucht werden, wobei Zellen von Nicht-Trägern als Kontrollproben dienen können. Die vorliegende Erfindung stellt ein experimentelles System für das Studium von Entwicklungsanomalien zur Verfügung, die mit der Präsentation bestimmter genetisch bedingter Krankheiten verbunden sind, da mehrere unterschiedliche Zellarten gleichzeitig studiert und mit ähnlichen Zellen in Verbindung gebracht werden können. Zum Beispiel können Vorläufer von Neuronen, Gliazellen oder andere Zellen neuralen Ursprungs in einer Vorrichtung benutzt werden, um die zellulären Wirkungen einer Verbindung auf das Nervensystem zu charakterisieren. Auch können Systeme so eingerichtet werden, dass Zellen studiert werden können, um genetische Faktoren, die die Empfindlichkeit gegenüber Wirkstoffen, die Reaktion auf Chemokine und Cytokine, die Reaktion auf Wachstumsfaktoren, Hormone und Hemmstoffe beeinflussen, sowie Reaktionen auf Veränderungen in der Expression und/oder der Funktion von Rezeptoren zu ermitteln. Diese Informationen können unschätzbar sein für die Entwicklung von Behandlungsmethoden für Krankheiten mit genetischen Ursachen oder für Krankheiten, für die eine genetische Prädisposition vorliegt.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Zellen an der Entgiftung und dem Metabolismus pharmazeutisch aktiver Verbindungen beteiligt, z. B. Leberzellen, einschließlich Hepatozyten; Nierenzellen einschließlich Zellen der Tubuli; Fettzellen einschließlich Adipozyten, die organische Verbindungen über lange Zeiträume speichern können. Diese Zellen können in einem Kultursystem mit Zellen wie beispielsweise Lungenzellen kombiniert werden, die an Atmungs- und Oxygenierungsprozessen beteiligt sind. Diese Zellen können auch mit Zellen kombiniert werden, die besonders anfällig für Schädigung durch einen Wirkstoff von Interesse sind, z. B. Darmepithelzellen, Knochenmarkzellen und andere sich normalerweise schnell teilende Zellen für Wirkstoffe, die die Zellteilung beeinflussen. Nervenzellen können anwesend sein, um die neurotoxische Wirkung eines Wirkstoffs zu überwachen, und dergleichen mehr.
Die Wachstumseigenschaften von Tumoren und die Reaktion der umgebenden Gewebe und des Immunsystems auf das Tumorwachstum sind ebenfalls von Interesse. Degenerative Krankheiten, einschließlich betroffener Gewebe und deren Umgebung können genutzt werden, um sowohl die Reaktion des betroffenen Gewebes als auch die Wechselwirkungen mit anderen Teilen des Körpers festzustellen.
Die Bezeichnungen „Umweltbedingungen" oder „Kulturbedingungen" umfassen Zellen, Medien, Faktoren, Zeit und Temperatur. Umweltbedingungen können auch Wirkstoffe und andere Verbindungen, bestimmte atmosphärische Bedingungen, pH- Wert, Salzzusammensetzung, Mineralien, etc. mit einschliessen. Die Kultivierung von Zellen wird gewöhnlich in einer sterilen Umgebung durchgeführt, die physiologische Bedingungen nachahmt, z.B. bei 37°C in einem Inkubator, der eine befeuchtete Atmosphäre aus 92–95% Luft und 5–8% CO₂ enthält. Die Kultivierung von Zellen kann in Nährmischungen durchgeführt werden, die undefinierte biologische Flüssigkeiten enthalten, wie beispielsweise fötales Kälberserum, oder in Medien, die vollständig definiert und serumfrei sind. Es ist eine Vielzahl von Kulturmedium in der Fachwelt bekannt und im Handel erhältlich.
Die Bezeichnung „physiologische Bedingungen", wie sie hierin verwendet wird, soll bedeuteten, dass die Zellkulturbedingungen ganz speziell überwacht werden, um die natürlichen Bedingungen im Gewebe in vivo für eine bestimmte Art von Zellen so genau wie möglich nachzuahmen. Diese Bedingungen schließen Parameter ein wie die Verweilzeit der Flüssigkeit (d. h. die Zeit, die eine Flüssigkeit in einem Organ bleibt), das Verhältnis von Zellen- zum Blutvolumen, die Scherbelastung der Zellen, eine mit dem natürlichen Organ vergleichbare Größe der Kompartimente.
Screening-Untersuchungen:
Wirkstoffe, Toxine, Zellen, Krankheitserreger, Proben, etc., die hierin generisch als „Eingangsvariablen" bezeichnet werden, werden auf ihre biologische Aktivität untersucht, indem sie dem auf Pharmakokinetik beruhenden Kultursystem hinzugefügt werden, und die kultivierten Zellen anschließend auf Änderungen der Ausgabegrößen von Interesse untersucht werden, z.B. den Verbrauch von O₂, die Produktion von CO₂, die Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit der Zellen oder die Expression von Proteinen von Interesse. Die Eingangsvariablen werden gewöhnlich in gelöster Form oder in leicht löslicher Form dem Medium der Zellen in der Kultur hinzugefügt. Die Ein gangsvariablen können über ein Durchflusssystem zugegeben werden oder alternativ durch Zugabe eines Bolus zu einer sonst statischen Lösung. In einem Durchflusssystem werden zwei Flüssigkeiten benutzt, von denen die eine eine physiologisch neutrale Lösung und die andere die gleiche Lösung ist, der die Testverbindung zugegeben wurde. Die erste Flüssigkeit wird über die Zellen geleitet, gefolgt von der zweiten. In einem Verfahren mit nur einer einzigen Lösung wird ein Bolus der zu prüfenden Eingangsvariablen dem Volumen des die Zellen umgebenden Mediums hinzugefügt. Die Gesamtzusammensetzung des Kulturmediums sollte sich durch die Zugabe des Bolus oder zwischen der einen und der anderen Lösung in einer Durchflussmethode nicht wesentlich ändern.
Bevorzugte Formulierungen von Eingangsvariablen enthalten keine zusätzlichen Bestandteile, wie beispielsweise Konservierungsmittel, die einen signifikanten Effekt auf die Gesamtformulierung haben. Daher enthalten bevorzugte Formulierungen einen biologisch aktiven Wirkstoff und einen physiologisch annehmbaren Träger, z. B. Wasser, Ethanol oder DMSO. Wenn jedoch ein Wirkstoff ohne einen Hilfsstoff flüssig ist, kann die Formulierung auch nur der Wirkstoff selbst sein.
Bevorzugte Eingangsvariablen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Viren, virale Partikel, Liposomen, Nanopartikel, biologisch abbaubare Polymere, radioaktiv markierte Partikel, radioaktiv markierte Biomoleküle, mit Toxinen konjugierte Partikel, mit Toxinen konjugierte Biomoleküle, und Partikel oder Biomoleküle, die mit stabilisierenden Mitteln konjugiert sind. Ein „stabilisierendes Mittel" ist ein Mittel, das verwendet wird, um Wirkstoffe zu stabilisieren und eine kontrollierte Freigabe zu bewirken. Solche Mittel schließen Albumin, Polyethylenglykol, Poly(ethylenco-vinylacetat) und Poly(lactid-co-glycolid) ein.
Mehrere Untersuchungen mit unterschiedlichen Konzentrationen der Eingangsvariablen können parallel durchgeführt werden, um eine differenzierte Reaktion auf die verschiedenen Konzentrationen zu erhalten. Wie in der Fachwelt bekannt ist, wird bei der Bestimmung der effektiven Konzentration eines Mittels gewöhnlich eine Konzentrationsreihe benutzt, die aus Verdünnungen im Verhältnis 1 : 10 oder einer anderen logarithmischen Skala resultiert. Die Konzentrationen können, wenn notwendig, durch eine zweite Verdünnungsreihe weiter verfeinert werden. Gewöhnlich dient eine dieser Konzentrationen als negative Kontrollprobe, d. h. bei einer Konzentration von Null oder unterhalb der Nachweisgrenze.
Eingangsvariablen von Interesse umfassen zahlreiche chemische Kategorien, obwohl sie häufig organische Moleküle sind. Eine bevorzugte Ausführungsform ist der Gebrauch der erfindungsgemäßen Verfahren, um Proben auf ihre Toxizität zu untersuchen, z. B. Proben aus der Umwelt oder Wirkstoffe. Kandidatenagenzien können funktionelle Gruppen enthalten, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen, insbesondere für die Wasserstoffbrückenbindung, notwendig sind, und enthalten gewöhnlich mindestens eine Amino-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, bevorzugt mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kanndidatenagenzien enthalten häufig zyklische Kohlenstoffstrukturen oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der oben genannten funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidatenagenzien finden sich auch unter Biomolekülen einschließlich Peptiden, Zuckern, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, sowie Derivaten, strukturellen Analoga oder Kombinationen davon.
Eingeschlossen sind pharmakologisch aktive Wirkstoffe und genetisch aktive Moleküle. Verbindungen, die von Interesse sind, schließen chemotherapeutische Mittel, entzündungshemmende Mittel, Hormone oder Hormonantagonisten, Ionenkanalmodifikatoren und neuroaktive Mittel mit ein. Beispiele von pharmazeutischen Mitteln, die für die vorliegende Erfindung verwendbar sind, sind diejenigen, die beschrieben werden in „Die pharmakologische Grundlage der Therapeutik" („The Pharmacological Basis of Therapeutics") Goodman und Gilman, McGraw-Rill, New York, New York, (1996), 9. Ausgabe, in den Abschnitten: Wirkstoffe, die an Synapsen- und Neuroeffektor-Junktionen wirken („Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites"); Wirkstoffe, die auf das zentrale Nervensystem wirken („Drugs Acting an the Central Nervous System"); Autakoide: Medikamentöse Behandlung von Entzündungen („Autacoids: Drug Therapy of Inflammation"); Wasser, Salze und Ionen („Water, Salts and Ions"); Wirkstoffe, die die Nierenfunktion und den Elektrolytstoffwechsel beeinflussen („Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism"); Kardiovaskuläre Wirkstoffe („Cardiovascular Drugs"); Die Magen-Darm-Funktion beeinflussende Wirkstoffe („Drugs Affecting Gastrointestinal Function"); Die Uterus-Motilität beeinflussende Wirkstoffe („Drugs Affecting Uterine Motility"); Chemotherapie von Infektionen mit Parasiten („Chemotherapy of Parasitic Infections"); Chemotherapie von mikrobiellen Krankheiten („Chemotherapy of Microbial Diseases"); Chemotherapie von neoplastischen Krankheiten („Chemotherapy of Neoplastic Diseases"); Zur Immunsuppression benutzte Wirkstoffe („Drugs Used for Immunosuppression"); Wirkstoffe, die auf blutbildende Organe wirken („Drugs Acting an Blood-Forming Organs"); Hormone und Hormon-Antagonisten („Hormones and Hormone Antagonists"); Vitamine („Vitamins"); Dermatologie („Dermatology"); und Toxikologie („Toxicology"), die alle durch Bezugnahme Bestandteil dieser Beschreibung werden sollen. Ebenfalls ein geschlossen sind Toxine und Mittel der biologischen und chemischen Kriegsführung, siehe z.B. Somani, S. M. (Hrsg.), „Chemische Kampfstoffe" („Chemical Warfare Agents"), Academic Press, New York, 1992.
Testverbindungen schließen alle Kategorien von Molekülen ein, die oben beschrieben worden sind und können weiterhin Proben mit unbekanntem Inhalt enthalten. Zwar werden viele Proben Verbindungen in gelöster Form enthalten, aber es können auch feste Proben, die in einem verwendbaren Lösungsmittel aufgelöst werden können, geprüft werden. Proben, die von Interesse sind, schließen Proben aus der Umwelt mit ein, z. B. Grundwasser, Meerwasser oder Abfälle aus dem Bergbau; biologische Proben, z. B. Lysate aus Nutzpflanzen oder Gewebeproben; Produktionsproben, z. B. aus dem zeitlichen Ablauf während der Herstellung von Pharmazeutika; sowie Bibliotheken von Verbindungen, die für die Analyse hergestellt wurden; und dergleichen mehr. Proben von Interesse schließen Verbindungen mit ein, die auf ihren möglichen therapeutischen Wert geprüft werden, z. B. Wirkstoffkandidaten aus Pflanzen- oder Pilzzellen.
Die Bezeichnung „Proben" umfasst auch oben beschriebene Flüssigkeiten, denen zusätzliche Komponenten zugegeben worden sind, z.B. Komponenten, die die Ionenstärke, den pH-Wert oder die Gesamtproteinkonzentration beeinflussen. Zusätzlich können die Proben behandelt werden, um eine mindestens teilweise Fraktionierung oder Konzentrierung zu erzielen. Biologische Proben können gelagert werden, wenn dafür Sorge getragen wird, einen Abbau der Verbindung zu verringern, z. B. unter Stickstoff, eingefroren, oder eine Kombination davon. Das Volumen der Probe, das benutzt wird, ist ausreichend, um eine messbare Detektion zu ermöglichen, normalerweise sind ungefähr 0,1 μl bis 1 ml einer biologischen Probe ausreichend.
Verbindungen und Kandidatenagenzien können aus einer großen Vielzahl von Quellen einschließlich Bibliotheken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen erhalten werden. Zum Beispiel sind zahlreiche Mittel für die zufällige oder die gerichtete Synthese einer großen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen verfügbar, einschließlich der Expression von randomisierten Oligonukleotiden und Oligopeptiden. Alternativ sind Bibliotheken natürlich vorkommender Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten verfügbar oder leicht herstellbar. Zusätzlich können natürlich vorkommende oder synthetisch hergestellte Verbindungen und Bibliotheken davon leicht durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel verändert werden und sie können dazu verwendet werden, kombinatorische Bibliotheken zu produzieren. Bekannte pharmakologische Wirkstoffe können gezielten oder zufälligen chemischen Veränderungen wie Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung unterzogen werden, um strukturelle Analoga herzustellen.
Ausgabevariablen:
Ausgabevariablen sind quantifizierbare Bestandteile von Zellen, insbesondere Bestandteile, die in einem System mit hohen Durchsatz genau gemessen werden können. Eine Ausgabegröße kann jeder mögliche Zellbestandteil oder jedes Zellprodukt sein, einschließlich z. B. Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit, Atmung, Stoffwechsel, Determinanten der Zelloberfläche, Rezeptoren, Proteine oder Konformations- oder posttranslationale Modifikationen davon, Lipide, Kohlenhydrate, organische oder anorganische Moleküle, mRNS, DNS oder ein von solch einem Zellbestandteil abgeleiteter Anteil. Während die meisten Ausgabegrößen ein quantitatives Auslesen ermöglichen, wird in einigen Fällen ein semiquantitatives oder qualitatives Resultat erhalten werden. Die Ausgabewerte können einen einzelnen be stimmten Wert enthalten oder sie können einen Mittelwert, Median oder die Varianz enthalten. Charakteristischerweise wird ein Ausgabewertebereich für jeden Ausgabewert erhalten. Streuung ist zu erwarten und ein Wertebereich für einen Satz von Ausgabewerten eines Tests kann mit üblichen statistischen Methoden erstellt werden.
Verschiedene Methoden können für die quantitative Bestimmung der Anwesenheit der ausgewählten Marker verwendet werden. Eine bequeme Methode für die Bestimmung der Menge eines anwesenden Moleküls ist es, das Molekül mit einer nachweisbaren Einheit zu markieren, die fluoreszierend, lumineszierend, radioaktiv, oder enzymatisch aktiv sein kann. Fluoreszierende und lumineszierende Einheiten sind leicht verfügbar für das Markieren praktisch jeden Biomoleküls, jeder Struktur oder jeder Zellart. Immunofluoreszente Einheiten können so gesteuert werden, dass sie nicht nur an spezifische Proteine, sondern auch an spezifische Konformationen, Spaltprodukte oder Modifikationen von Bindungsstellen, wie beispielsweise durch Phosphorylierung, binden. Einzelne Peptide und Proteine können verändert werden, um Autofluoreszenz zu zeigen, z. B. indem man sie als grün fluoreszierende Proteinchimären innerhalb der Zellen exprimiert (für eine Übersicht siehe Jones et al. (1999) Trends Biotechnol. 17 (12): 477–81).
Ausgabegrößen können durch Immunoassay-Techniken wie Immunohistochemie, Radioimmunoassay (RIA) oder Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und verwandte nicht enzymatische Methoden gemessen werden. Diese Methoden verwenden spezifische Antikörper als Reportermoleküle, die auf Grund ihrer hochgradigen Spezifität für die Anbindung an ein einziges molekulares Ziel besonders nützlich sind. Auf Zellen beruhendes ELISA oder verwandte nicht enzymatische oder auf Fluoreszenz basierende Verfahren ermöglichen die Messung von Parametern der Zelloberfläche. Ausgabewerte von solchen Untersuchungen können die mittlere Fluoreszenz, die mit einzelnen fluoreszierenden von Antikörpern detektierten Molekülen der Zelloberfläche oder Cytokinen verbunden ist, oder die durchschnittliche Fluoreszenzintensität, die mittlere Fluoreszenzintensität, die Varianz der Fluoreszenzintensität oder irgendeine Beziehung zwischen diesen sein.
Datenanalyse:
Die Resultate von Screening-Untersuchungen können mit den Resultaten verglichen werden, die aus der Untersuchung von Referenzverbindungen, aus Konzentrationskurven, Kontrollexperimenten etc. erhalten werden. Der Vergleich von Resultaten wird durch den Gebrauch von geeigneten Auswertungsprotokollen, KI-Systemen, statistischen Vergleichen etc. bewerkstelligt.
Eine Datenbank von Referenzausgabedaten kann zusammengestellt werden. Diese Datenbanken können Resultate von bekannten Mitteln oder Kombinationen von Mitteln enthalten, sowie Hinweise aus der Analyse von Zellen, die unter Umweltbedingungen behandelt wurden, in denen einzelne oder mehrere Umweltbedingungen oder Parameter entfernt oder spezifisch verändert werden. Eine Datenmatrix kann erzeugt werden, in der jeder Punkt der Datenmatrix einem Ausgabewert einer Ausgabevariablen entspricht, wobei die Daten für jeden Ausgabewert aus wiederholten Bestimmungen stammen können, z. B. mehreren einzelnen Zellen der gleichen Art.
Der Ausgabewert kann ein Mittelwert, Durchschnittswert, Median oder die Varianz oder ein anderer statistisch oder mathematisch abgeleiteter Wert sein, der mit der Messung in Zusammenhang steht. Die durch Auslesen der Ausgabegröße erhaltenen Informationen können durch direkten Vergleich mit dem entsprechenden Referenzausgabewert weiter verfeinert werden. Die Absolutwerte, die für jede Ausgabegröße unter identischen Bedingungen erhalten werden, werden eine Streuung zeigen, die lebenden biologischen Systemen inhärent ist und auch die Unterschiede zwischen einzelnen Zellen sowie die inhärenten Unterschiede zwischen Individuen widerspiegelt.
Zellkulturen und Zellkultur-Vorrichtungen
Die Kulturvorrichtungen der Erfindung enthalten ein Netz von Mikro-Strömungskanälen, das in eine oder mehrere getrennte aber untereinander verbundene Kammern aufgeteilt ist, vorzugsweise integriert in ein Chipformat. Die spezifische Kammergeometrie ist dafür entworfen, Wechselwirkungen zwischen Zellen, Parameter für Flüssigkeitsstrom und Verweilzeit der Flüssigkeit zur Verfügung zu stellen, die mit denen vergleichbar sind, die in vivo für die entsprechenden Zellen, Gewebe oder Organsysteme gefunden werden.
Optimierte Kammergeometrien können entwickelt werden, indem man das Verfahren der Prüfung von Parameterwerten in Abhängigkeit von Flüssigkeitsströmen und Veränderungen der Abmessungen wiederholt, bis die gewählten Werte erreicht werden. Die Optimierung des Substrates schließt die Wahl der Anzahl von Kammern, die Auswahl einer Kammergeometrie, die das korrekte Verhältnis von Zellen zu Volumen zur Verfügung stellt, die Auswahl einer Kammergröße, die das korrekte Verhältnis von Gewebe- oder Organgröße liefert, die Wahl der optimalen Durchflussraten der Flüssigkeit, die die korrekte Verweilzeit der Flüssigkeit bewirkt und dann die Berechnung der Scherbeanspruchung der Zellen auf Basis dieser Werte ein. Wenn die Scherbeanspruchung der Zellen über dem maximal zulässigen Wert liegt, werden neue Parameterwerte gewählt und das Verfahren wird wiederholt. Eine andere Ausführungsform der CCA Vorrichtung schließt mit ein, dass die Zellen im Inneren hohler Röhren anstatt auf dem Boden und den Seitenwänden von Kanälen oder Kammern gezüchtet werden. Es ist gezeigt worden, dass die Zellen, die in solch einem dreidimensionalen Gewebekonstrukt wachsen, im Hinblick auf bestimmte in vivo Gewebe authentischer sind. (Griffith (1998) Pharma Biol. Biotech. Conf., Coronado, CA, 15. bis 18. März).
Drei primäre Designparameter werden bei der Erstellung der 3-D Kulturvorrichtung berücksichtigt. Der erste ist die Verweilzeit, die die Flüssigkeit in Verbindung mit einem bestimmten Gewebe steht oder sich innerhalb einer Vertiefung befindet. Die Verweilzeiten werden ausgewählt, um die Zeitdauer widerzuspiegeln, die Blut während eines Durchgangs durch das Kreislaufsystem in Verbindung mit Organgewebe steht, das durch eine Vertiefung dargestellt wird. Der zweite ist der Radius der Röhren, in denen die Zellen gezüchtet werden. Zum Beispiel liegt der Radius der Röhren, die die Leber nachbilden sollen, innerhalb eines Bereiches von 200–400 μm. Es sollte angemerkt werden, dass, wenn der Radius der Röhren zu groß wird, die Zellen im Wesentlichen eine flache Oberfläche sehen und eine einlagige Schicht auf der Röhre bilden werden.
Der dritte Parameter ist der Anteil des Flüssigkeitsstroms, der in jedem Modul ankommt. Die Anpassung der Geometrie der Flüssigkeitskanäle teilt den Flüssigkeitsstrom aus den Kammern auf. Die Kanäle oder Röhren zu jedem Modul oder zu jeder Kammer sind gewöhnlich von unterschiedlicher Länge, um den Druckabfall auszugleichen und den Flüssigkeitsstrom auszubalancieren. Nachdem die Flüssigkeit die anderen Gewebe verlässt, kann sie durch eine Pumpe wieder an den Anfang des. Kreislaufs zurückgeführt werden. Die Durchflussrate durch die Röhren wurde aus den Abmessungen der Röhren und der Verweilzeit errechnet. Für eine gegebene Durchflussrate wurde die Scherbeanspruchung der Zellen errechnet, um si cherzugehen, dass der Wert nicht die Grenze der Belastbarkeit der Zellen überstieg. Die sehr kurze Verweilzeit, die in dem Lungengewebe erforderlich ist, macht es unmöglich, für dieses Organ eine Konstruktion mit Vertiefungen und Röhren zu benutzen. Die Scherbeanspruchung ist zu hoch und folglich bleibt die Lungengewebesektion eine überströmte Sektion mit einer einlagigen Schicht von Lungengewebe.
Da das System der vorliegenden Erfindung interaktiv ist (d. h. der Computer fragt nicht nur Messwerte ab, sondern steuert auch. die Bedingungen innerhalb des Tests), können Korrekturen dynamisch in das System eingeführt werden und in geeigneter Weise festgehalten und dokumentiert werden, um Forscher von der Dynamik des gerade laufenden Tests in Kenntnis zu setzen.
Datensammlung durch den Computer besteht aus der Sammlung von Daten, die erforderlich sind für die kontinuierliche Inline-Überwachung des Abflusses der Testchemikalien aus jedem Kompartiment. Sensoren, die vorzugsweise Durchflusssensoren sind, werden inline in dem Abfluss aus jedem Kompartiment angebracht, um so quantitative Daten über den Abfluss der Testchemikalien aus jedem Kompartiment zu ermitteln, zu analysieren und zur Verfügung zu stellen.
Mikroprozessoren können auch dazu dienen, ein physiologiebasiertes pharmakokinetisches (PBPK) Modell für eine bestimmte Testchemikalie zu berechnen. Diese Berechnungen können als Grundlage für die Einstellung der Durchflussraten zwischen den Kompartimenten und der Ausscheidungsraten der Testchemikalie aus dem System dienen. Jedoch können sie auch als theoretischer Schätzwert für die Testchemikalie dienen. Nach der Beendigung des Experiments können die Vorhersagen hinsichtlich der Konzentrationen der Testchemikalien und der Stoffwechselprodukte, die mit der PBPK Be stimmung ermittelt wurden, mit den Sensor-Daten verglichen werden. Ein Ausdruck der Daten ermöglicht den Vergleich des PBPK Modells mit den experimentellen Resultaten.
Einige Prototypen der CCA Systeme sind konstruiert und geprüft worden. 17A stellt eine Vorrichtung der „ersten Generation" mit drei Kompartimenten dar. Die Abmessungen waren wie folgt: Der Wafer war 2 cm × 2 cm groß; die Lungenkammer wies 20 Kanäle (5 mm lang) 40 μm × 20 μm (Breite × Tiefe) auf; die Leberkammer enthielt 2 Kanäle (100 mm lang) 100 μm × 20 μm (Breite × Tiefe). Der erste Schritt bei der Verwendung dieser Vorrichtung ist, die Flüssigkeit mit einer Spritzenpumpe zu injizieren, bis alle Kanäle gefüllt sind. Als Zweites wird eine peristaltische Pumpe benutzt, um die Flüssigkeit im Kreislauf zu führen. 17B zeigt eine Querschnittsansicht der Vorrichtung, die die Flüssigkeitsführung im System veranschaulicht. Es wurde gefunden, dass 400 μm starkes Elastomer eine bessere Dichtung ergab, und dass Plexiglas und Spitzen zum Beladen mit Gel viel weniger zerbrechlich sind als andere Materialien. Diese Vorrichtung hatte Probleme mit einem hohen Druckabfall und an 90° Krümmungen traten Leckstellen auf.
Mit dieser Vorrichtung der „ersten Generation" wurden Studien der Zellanhaftung durchgeführt. L2 Zellen wurden in die Lungenkammer gebracht und H4IIE Zellen wurden in die Leberkammer gebracht. Poly-D-Lysin wurde auf der Oberfläche der Kammern absorbiert, um das Anhaften der Zellen innerhalb der Kanäle zu fördern. Leider setzten sich Zellen außerhalb der Gräben fest, daher wurden andere Substrate geprüft und die Oberflächen wurden modifiziert.
18A stellt eine Vorrichtung der „zweiten Generation" dar. Die Abmessungen waren wie folgt: Der Chip war 2 cm × 2 cm groß; die geätzten Strukturen sind 20 μm tief; die Lungenkammer war 2 mm × 2 mm groß (Breite × Länge); die Leberkammer war 7,5 mm × 10 mm groß (Breite × Länge). Die Lungenkammer enthielt 5 μm hohe Grate, um das Anhaften der Zellen zu verstärken (18B) und die Leberkammer enthielt 20 μm hohe Säulen, um Perkolation zu simulieren ( 18C) .
19 stellt eine Vorrichtung der „dritten Generation" dar. Die Abmessungen waren wie folgt: Der Chip war 2 cm × 2 cm groß; die Lungenkammer war 2 mm × 2 mm groß (Breite × Länge); die Leberkammer war 3,7 mm × 3,8 mm groß (Breite × Länge); und die Kammer „anderes Gewebe" war 7 mm × 7 mm groß (Breite × Länge). Die Flüssigkeit aus der Lungenkammer wurde aufgeteilt, wobei 20% in die Leberkammer und 80% in die Kammer „anderes Gewebe" gingen. Teile der Kammern (gestrichelt) sind 100 μm tief, um den Druckabfall zu verringern, und andere Teile (durchgezogen) sind 20 μm tief, um realistische Verhältnisse von Flüssigkeit zu Zellen zu erhalten.
20 ist ein Flussdiagramm für ein auf einem PBPK-Modell beruhendes CCA mit fünf Kompartimenten. Diese Vorrichtung fügt Kammern für Fettzellen, eine Kammer für langsam perfundierende Flüssigkeit und eine für schnell perfundierende Flüssigkeit hinzu. Solch eine Vorrichtung kann für Bioakkumulationstudien, Cytotoxizitätstudien und Stoffwechseltätigkeiten benutzt werden. Andere Vorrichtungen können durch verschiedene Permutationen entwickelt werden. Zum Beispiel kann eine Membranpumpe mit Gasaustausch hinzugefügt werden oder ein online Biosensor oder eine mikroelektromechanische (MEM) Pumpe oder ein Biosensor und eine elektronische Schnittstelle. Eine Vorrichtung kann entwickelt werden, um die orale Verabreichung einer pharmazeutischen Substanz nachzubilden. Alternativ kann eine Vorrichtung entwickelt werden, um die Blut-Hirn-Schranke nachzubilden.
Herstellung
Die Zellkulturvorrichtung enthält gewöhnlich einen Zusammenschluss separater Elemente, z. B. Kammern, Kanäle, Einlässe oder Auslässe, die, wenn Sie in geeigneter Weise aneinander angepasst oder zusammengefügt werden, die Kulturvorrichtung der Erfindung bilden. Vorzugsweise werden die Elemente in einem integrierten, „chip-basierten" Format zur Verfügung gestellt.
Die Flüssigkeitsführungen bzw. die Fluidtechnik einer Vorrichtung werden der Größe der Vorrichtung entsprechend dimensioniert. In einem auf einem Chip beruhenden Format sind die Flüssigkeitsanschlüsse „Mikroströmungselemente", solch ein System enthält ein Flüssigkeitsführungselement, wie beispielsweise einen Durchgang, eine Kammer oder ein Rohr, das mindestens eine interne Querschnittsabmessung, Z. B. Tiefe oder Breite, von zwischen ungefähr 0,1 μm und 500 μm aufweist. In den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung schließen die Kanäle zwischen Kammern gewöhnlich mindestens einen im Mikromaßstab ausgeführten Kanal ein.
Gewöhnlich enthalten Vorrichtungen mit Mikroströmungselementen (engl.: "microfluidic devices") einen oberen Teil, einen unteren Teil und einen Innenteil, worin der Innenteil im Wesentlichen die Kanäle und die Kammern der Vorrichtung bildet. In bevorzugten Ausführungsformen enthält der untere Teil ein festes Substrat, das eine im Wesentlichen planare Struktur aufweist und das mindestens eine im Wesentlichen flache Oberfläche an der Oberseite aufweist. Eine Vielzahl von Substratmaterialien kann als unterer Teil eingesetzt werden. Typischerweise werden, weil die Vorrichtungen im Mikromaßstab fabriziert werden, die Substratmaterialien im Allgemeinen nach ihrer Kompatibilität mit bekannten Verfahren der Mikrofabrikation ausgewählt, Z. B. Fotolitho graphie, Dünnfilmabscheidung, nasschemischem Ätzen, reaktivem Ionenätzen, Tiefätzen von Silizium mit induktiv gekoppeltem Plasma, Laserablation, Luftabrasionsverfahren, Spritzguss, Prägung und anderen Verfahren.
Die Substratmaterialien der vorliegenden Erfindung umfassen polymere Materialien, z. B. Kunststoffe wie beispielsweise Polystyrol, Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (TEFLON^TM), Polyvinylchlorid (PVC), Polydimethylsiloxan (PDMS), Polysulfon und dergleichen mehr. Solche Substrate können in einfacher Weise aus im Mikromaßstab hergestellten Vorlagen hergestellt werden, unter Verwendung wohlbekannter Formverfahren wie Spritzguss, Prägen oder Stempeln oder durch Polymerisation des Polymervorläufermaterials innerhalb der Form. Solche polymeren Substratmaterialien sind bevorzugt wegen ihrer einfachen Herstellung, der niedrigen Kosten und der Verfügbarkeit bzw. einfachen Entsorgbarkeit, sowie ihrer allgemeinen Unempfindlichkeit gegenüber den meisten extremen Reaktionsbedingungen. Diese polymeren Materialien können behandelte Oberflächen umfassen, z. B. derivatisierte oder beschichtete Oberflächen, um ihre Nützlichkeit im System zu erhöhen, z. B. verbesserte Flüssigkeitsführung, besseres Anhaften von Zellen oder verbesserte Segregation von Zellen zur Verfügung zu stellen.
Die Kanäle und/oder Kammern der Vorrichtungen mit Mikroströmungselementen werden gewöhnlich mit den oben beschriebenen Verfahren zur Mikrofabrikation in die Oberfläche der Oberseite des Substrates oder in den unteren Teil als im Mikromaßstab ausgeführte Rillen oder Vertiefungen hergestellt. Die Oberfläche der Unterseite des oberen Teils der Vorrichtung mit Mikroströmungselementen, wobei der obere Teil gewöhnlich ein zweites planares Substrat enthält, wird dann über die Oberfläche des unteren Substrates gelegt und damit verbunden, wodurch die Kanäle und/oder die Kammern (der Innenteil) der Vorrichtung an der Schnittstelle dieser zwei Bestandteile versiegelt werden. Die Verbindung des oberen Teils mit dem unteren Teil kann mit einer Vielzahl bekannter Methoden durchgeführt werden, abhängig von der Art des Substratmaterials. Zum Beispiel können bei Glassubstraten thermische Verbindungstechniken verwendet werden, die erhöhte Temperaturen und Druck einsetzen, um den oberen Teil der Vorrichtung mit dem unteren Teil zu verbinden. Aus Polymeren bestehende Substrate können mit ähnlichen Techniken verbunden werden, außer dass die Temperaturen, die verwendet werden, im Allgemeinen niedriger sind, um übermäßiges Schmelzen des Substratmaterials zu verhindern. Es können auch alternative Methoden verwendet werden, um aus Polymeren bestehende Teile der Vorrichtung zu verbinden, einschließlich akustischer Schweißverfahren oder der Verwendung von Klebstoffen, z. B. UV-härtenden Klebstoffen und dergleichen mehr.
Die Vorrichtung wird im Allgemeinen eine Pumpe enthalten, wie beispielsweise eine peristaltische Pumpe mit geringen Durchflussraten. Ein flexibler Schlauch mit kleinem Durchmesser würde an den Ablauf der Vorrichtung angebracht, durch die peristaltische Pumpe geführt und an den Zulauf der Vorrichtung angeschlossen werden, um so ein System mit geschlossenem Kreislauf zu bilden. Die Pumpe arbeitet im Allgemeinen mit Durchflussraten in der Größenordnung von 1 μl/min. Das Pumpensystem kann jede Vorrichtung zum Pumpen von Flüssigkeiten sein, wie beispielsweise eine Membran und kann entweder in die CCA Vorrichtung (auf einem Chip beruhendes System) integriert sein oder eine separate Komponente sein, wie oben beschrieben.
Die Vorrichtung kann mit einem Prozessor verbunden werden oder eine Schnittstelle zu einem Prozessor aufweisen, der das Signal von jedem der Biosensoren speichert und/oder analysiert. Der Prozessor wiederum leitet die Daten an einen Computerspeicher weiter (entweder eine Festplatte oder ein RAM), wo sie durch ein Software-Programm benutzt werden können, um die Resultate weiter zu analysieren, zu drucken und/oder anzuzeigen.
Beschreibung exemplarischer Ausführungsformen In der folgenden ausführlichen Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen wird Bezug auf die beigefügten Zeichnungen genommen, die einen Teil dieser Beschreibung darstellen, und in denen durch Veranschaulichung spezifische Ausführungsformen für die Anwendung der Erfindung gezeigt werden. Es versteht sich, dass andere Ausführungsformen verwendet werden können und strukturelle Veränderungen vorgenommen werden können, ohne dass der Anwendungsbereich bhzw. der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
1 ist ein Blockdiagramm eines in vitro Systems gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Lungenzellen simulierende Kammer 102 empfängt mit Sauerstoff angereichertes Kulturmedium aus der Gasaustauschvorrichtung 103. Solch ein mit Sauerstoff angereichertes Medium wird erhalten, indem ein Kulturmedium mit Sauerstoff enthaltendem Gas in Kontakt gebracht wird, so dass das Kulturmedium Sauerstoff enthaltendes Gas absorbiert und Kohlendioxid enthaltendes Gas desorbiert. Das die Lungenzellen simulierende Kammer 102 verlassende Kulturmedium ist vergleichbar mit arteriellem Blut 106 in Säugetieren. Das Sauerstoff enthaltende Kulturmedium, das arterielles Blut 106 darstellt, wird dann der die Leber simulierenden Kammer 108, der anderes Gewebe simulierenden Kammer 110, der Fett simulierenden Kammer 112 und der die Niere simulierenden Kammer 114 zugeführt. Das die Leber simulierende Kammer 108, die anderes Gewebe simulie rende Kammer 110, die Fett simulierende Kammer 112 und die eine Niere simulierende Kammer 114 verlassende Kulturmedium ist vergleichbar mit venösem Blut 104 in Säugetieren. Wie in 1 gezeigt, wird das venösem Blut 104 entsprechende Kulturmedium zu der Lungenzellen simulierenden Kammer 102 zurückgeführt. Das System der vorliegenden Erfindung schließt auch eine den Darm simulierende Kammer 116 und eine die Bauchhöhle simulierende Kammer 118 ein, die beide Orte für die Einführung von Testverbindungen darstellen. Wie in Säugetieren wird Abfallflüssigkeit 115 aus der eine Niere simulierenden Kammer 114 abgezogen.
2 ist eine vereinfachte schematische Ansicht einer Ausführungsform des Systems 200 der vorliegenden Erfindung. Das System 200 umfasst eine Lungenzellen-Kulturkammer 210, eine Leberzellen-Kulturkammer 212, eine Fettzellen-Kulturkammer 213, eine Kammer anderer Gewebe 214 und eine Gasaustauschkammer 250. Die Kammern 210, 212, 213, 214 und 250 werden auf einem Siliziumsubstrat gebildet, das im Allgemeinen als Chip 230 bezeichnet wird. Es sollte beachtet werden, dass mehr als vier Zellkulturkammern auf einem einzelnen Chip 230 untergebracht werden oder gebildet werden können. Eine Flüssigkeitsführung 240 verbindet die Kammern 210, 212, 213, 214 und 250.
Die Kammern haben einen Zulauf 211 und einen Ablauf 215. Der Zulauf 211 befindet sich an einem Ende der Gasaustauschkammer 250. Der Ablauf 215 befindet sich an einem Ende der Leberzellenkulturkammer 212. Die Kammern 210, 212, 213, 214 und 250 und die Flüssigkeitsführung 240 befinden sich im Wesentlichen zwischen dem Zulauf 211 und dem Ablauf 215. Das System schließt eine Pumpe 260 für das Verteilen der Flüssigkeit im System 200 mit ein. Eine im Mikromaßstab ausgeführte Röhre 270 stellt eine Verbindung zwischen dem Ablauf 215 und der Eingangsseite der Pumpe 260 her. Eine im Mikromaßstab ausgeführte Röhre 271 stellt eine Verbindung zwischen der Ausgangsseite der Pumpe 260 und dem Zulauf 211 her. Die Zellkulturkammern 210, 212, 213, 214, die Gasaustauschkammer 250, die Flüssigkeitsführung 240 und die Pumpe 260 bilden das System 200. Das System kann zusätzliche Zellkulturkammern einschließen. Eine häufig zusätzlich hinzugefügte Zellkulturkammer ist eine, die eine Niere simuliert.
3 ist ein Diagramm einer anderen Ausführungsform der Erfindung. In 3 werden ein erster Signalweg 310, ein zweiter Signalweg 320, und ein dritter Signalweg 330 auf dem Chip 230 zur Verfügung gestellt. Signale für die Oberwachung verschiedener Aspekte jedes Zellkultursystems 200 können an dem Chip 230 und an spezifischen Positionen auf dem Chip 230 abgenommen werden und zu Ausgängen außerhalb des Chips 230 weitergeleitet werden. In einem Beispiel sind die Signalwege 310, 320, 330 auf dem Chip 230 integrierte eingebettete Wellenleiter. Der Chip 230 könnte in solch einer Ausführungsform aus Silizium, Glas oder einem Polymer gefertigt werden. Der Wellenleiter 310, 320, 330 würde Licht zu den Kanten des Chips leiten, wo sich ein Signalumformer 312, 322, 332 befinden würde, um das Lichtsignal in ein elektrisches Signal umzuwandeln. Die Zellen innerhalb des Systems 200 könnten dann auf Fluoreszenz, Lumineszenz oder Absorption oder alle diese Eigenschaften überwacht werden, um die Zellen innerhalb des Systems 200 abzufragen und zu überwachen. Die Überprüfung von Fluoreszenz erfordert eine Lichtquelle. Die Lichtquelle wird verwendet, um das Molekül abzufragen und ein Signalträger, wie beispielsweise ein Wellenleiter 310, 320, 330, oder eine Glasfaseroptik fängt das Signal ein und überträgt es aus dem Chip 230 heraus. Der Signalträger 310, 320, 330 würde Licht zu einem Fotodetektor in der Nähe des Endes des Signale transportierenden Teils des Chips 310, 320, 330 leiten.
4 ist eine schematische Ansicht einer anderen Ausführungsform des Systems 200 der vorliegenden Erfindung. In dieser Ausführungsform befinden sich Biosensoren 410, 420, 430, 440, 450 und 460 auf dem Chip vor und nach jeder der Zellkulturkammern des Chips 230. Die Biosensoren 410, 420, 430, 440, 450, 460 überwachen den Sauerstoffgehalt, den Kohlendioxidgehalt und/oder den pH-Wert des Mediums. Diese Sensoren ermöglichen die Überwachung des Systems 200 und die Anpassung von Gaskonzentrationen, wie es für die Aufrechterhaltung gesunder Umweltbedingungen erforderlich ist. Zusätzlich können Biosensoren nützliche Informationen über den Zellstoffwechsel und die Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit der Zellen zur Verfügung stellen, wenn sie kurz vor und hinter jedem Zellkompartiment angebracht werden.
5A bis 5G zeigen Schritte der Herstellung eines auf Polymeren beruhenden Einwegchips 230. Ein Siliziumwafer 20 wird durch Rotationsbeschichtung mit einer dünnen Schicht Fotolack 21 beschichtet (5A). Der Fotolack 21 wird durch eine Fotomaske 23, die die gewünschten Strukturen enthält, mit UV-Licht 22 belichtet (5B). Der mit UV-Licht belichtete Fotolack 21 wird in einem geeigneten Lösungsmittel herausgelöst, wodurch das Silizium 20 freigelegt wird (5C). Das Silizium 20 wird bis zu einer gewünschten Tiefe mit einem mit induktiv gekoppeltem Plasma arbeitenden Ätzsystem geätzt (5D). Der restliche Fotolack wird mit einem passenden Lösungsmittel entfernt ( 5E). Eine sehr dünne Basisschicht für die Galvanisierung aus Gold (oder Ti) 24 wird auf dem Siliziumsubstrat 20 abgeschieden, wodurch eine Schablone für den Galvanisierprozess entsteht, wie in 5E gezeigt. Die Probe wird in ein Galvanisierbad vom Nickelsulfamattyp eingetaucht und Nickel 25 wird auf der Siliziumschablone 20 galvanisch ab geschieden, bis die Dicke der Nickelschicht ausreichend ist, wobei das Gold als eine leitende Schicht dient. Die Vorlage aus Nickel wächst auf der Goldschicht, und das Gold wird ein Teil der Vorlage aus Nickel. Dieses bildet die Strukturen aus Nickel 25, gezeigt in 5F. Die Galvanisiergeschwindigkeit, die eine Funktion des Galvanisierstroms, des Durchmessers der Schablone und der Dicke der Schablone ist, wird auf ungefähr 45 nm/min eingeregelt. Nach der Herstellung werden die Strukturen 25 mit einem Mikroskop untersucht, um die Abmessungen der Strukturen zu überprüfen. Die resultierenden Strukturen aus Nickel 25 müssen einheitlich sein und die gewünschte Form haben. Die Vorlage aus Nickel 25 und das Polymersubstrat 26 werden auf eine Temperatur gerade oberhalb der Glasübergangstemperatur des Polymeren erhitzt. Die Vorlage aus Nickel 25 und das Polymer 26 werden in Kontakt gebracht und die Strukturen der Vorlage aus Nickel 25 werden dem Polymersubstrat 26 eingeprägt. Die Vorlage aus Nickel 25 wird entfernt, wodurch ein Polymer 26 erhalten wird, welches die gleichen Strukturen aufweist wie der ursprüngliche Siliziumwafer 20 (5G).
6 ist eine schematische Ansicht einer dritten Ausführungsform des Systems 200 der vorliegenden Erfindung. In dieser Ausführungsform befinden sich Biosensoren 600, 602, 604 an der Peripherie des Chips 230. Die Biosensoren 600, 602, 604 werden benutzt, um den Status der Zellen des Systems 200, das auf dem Chip 230 erzeugt wurde, weiter zu überwachen. Vorteilhafterweise könnte der Chip 230 als Einwegartikel zu geringst möglichen Kosten ausgeführt werden, indem man die Biosensoren 600, 602, 604 an der Peripherie des Chips 230 anbringt. Das heißt, die Biosensoren 600, 602, 604 müssten nicht mit dem Chip 230 weggeworfen werden. Es sollte beachtet werden, dass die Biosensoren 600, 602, 604 sich auch auf dem Einwegchip 230 befinden können. Diese spezielle Möglichkeit würde nicht so kostengünstig sein, da die Biosensoren 600, 602, 604 das Wegwerfen des Chips 230 auch zur Folge hat dass die Biosensoren 600, 602, 604 weggeworfen werden. Es ist kostengünstiger, wenn sich die Biosensoren 600, 602, 604 außerhalb des Chips 230 befinden, da die Biosensoren 600, 602, 604 nach jedem Gebrauch besser wiederverwendet anstatt weggeworfen werden. Jeder der Biosensoren 600, 602, 604 wird an die Eingänge eines Computers 620 angeschlossen.
7 ist ein Diagramm, das den Computer 620 genauer beschreibt. Der Computer 620 überwacht und reguliert den Betrieb des Systems 200 jedes Chips 230. Der Computer 620 schließt einen Mikroprozessor mit ein, der mit einer Schnittstelle 700 für Eingabe und Ausgabe und einem internen Register/Cachespeicher 702 ausgestattet ist. Wie gezeigt ist, ist der Mikroprozessor 798 über die Verbindung 716 an die Tastatur 704 angeschlossen, an das nicht flüchtige Speicherelement 706, den allgemeinen Speicher 708 und die Nachschlagetabellen 710 über die Verbindung 718 und an das Drucker/Plotter-Aufzeichnungsgerät 712 und die Anzeige 714 über die Verbindung 720.
Das nicht flüchtige Speicherelement 706 kann in Form eines beschreibbaren CD-Speichers, eines Magnetbandspeichers, eines Plattenlaufwerks oder dergleichen ausgeführt sein. Die Nachschlagetabellen 710 können körperlich einen Teil des allgemeinen Speichers 708 umfassen, der für das Speichern eines Satzes von Massebilanzgleichungen reserviert ist, die auf die verschiedenen im System zu modellierenden Substanzen anwendbar sind. Diese Gleichungen stellen physiologiebasierte pharmakokinetische Modelle für verschiedene biologische bzw. chemische Substanzen in den Systemen dar. Internes Register/Cachespeicher 702 und allgemeiner Speicher 708 enthalten ein Systemprogramm in Form mehrerer Programm anweisungen und spezieller Daten für die automatische Steuerung praktisch jeder Funktion im System 200 jedes Chips 230. Der Computer kann auch die Pumpe 260 steuern und regulieren, die mit dem System 200 verbunden ist.
Der von Durchflussmessern ermittelte Flüssigkeitsstrom kann über die Schnittstelle 700 für Eingabe und Ausgabe ebenfalls als Eingangsgröße dem Mikroprozessor 798 zur Verfügung gestellt werden. Dies ermöglicht eine exakte Kontrolle der Durchflussraten der Flüssigkeiten innerhalb des Systems durch Anpassung von Programmbefehlen, die den Pumpen 260 jeweils über Pumpensteuerleitungen übermittelt werden. Zum Beispiel können die Durchflussraten in Rohr 58 auf 9,5 μl/min eingestellt werden, auf 2,5 μl/min im Durchflussmesser 66, auf 7 μl/min im Durchflussmesser 78 und 2,5 μl/min in Rohr 70. Die Temperatur des Kulturmediums in Vorratsbehälter 50 kann ebenfalls durch den Mikroprozessor 798, der durch die Schnittstelle 700 für Eingabe und Ausgabe und die Temperaturanzeigeleitung 728 Temperaturmesswerte von dem Temperaturfühler 792 erhält, reguliert werden. Als Reaktion auf diese Signale wird die Heizspule 790 von dem Mikroprozessor 798 über die Schnittstelle 700 für Eingabe und Ausgabe und die Heizspulensteuerleitung 730 ein- und ausgeschaltet.
Biologische und toxikologische Reaktionen oder dadurch hervorgerufene Änderungen in den Zellkulturkammern 210 und 212 werden jeweils durch einen der Sensoren 600, 602 und 604 ermittelt und dem Mikroprozessor 798 über Steuerleitungen sowie über die Schnittstelle 700 für Eingabe und Ausgabe übermittelt. Die Sensoren können dafür ausgelegt werden, Untersuchungsergebnisse in Form von spezifischen Werten anzuzeigen oder als Wellenlängenbereiche, die die Untersuchungsergebnisse darstellen.
Der Mikroprozessor 798 kann auch ziemlich leicht angepasst werden, um ein Programm zu umfassen, das dem Forscher eine interaktive Steuerung über die Tastatur 704 ermöglicht. Dieses ermöglicht es z.B., den Computer so zu steuern, dass er speziell die Bedingungen in irgendeinem der Kulturkompartimente zu jedem beliebigen Zeitpunkt überprüft.
Eine weitere Option, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, ist die Möglichkeit, vorher gespeicherte Untersuchungsergebnisse für ähnliche Experimente wieder aufzurufen, indem Informationen vom CD/Magnetband-Speicher 706 abgerufen werden. So kann der Speicher 706 vorprogrammiert werden, um historische Daten aus veröffentlichten Informationen, Daten aus früher mit dem System der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests, oder Daten, die aus theoretischen Berechnungen abgeleitet wurden, zu enthalten. Die Bereitstellung des CD/Magnetband-Speichers ermöglicht es auch, das System als Werkzeug für Recherchen zu nutzen. Es kann zum Beispiel die Forschungsdaten, die eine bestimmte Testchemikalie oder eine bestimmte Kulturlinie betreffen, ermitteln, auf der Basis der Auswahlinformationen, die dem Mikroprozessor 798 über die Tastatur 704 eingegeben werden. Indem sie eine große Bibliothek von Informationen in den Speicher 706 aufnehmen oder darin entwickeln, werden Forscher in der Lage sein, Testreihen intelligenter zu gestalten und zu planen.
8 ist eine schematische Darstellung, die zeigt, dass mehr als ein Chip 230 innerhalb eines einzelnen Gehäuses 800 untergebracht werden kann. Das Gehäuse 800 kann eine Klimakammer sein, die die gleichen Bedingungen für jeden der Chips 230 innerhalb des Gehäuses aufrechterhält. Das Gehäuse 800 umfasst mehrere Chipplätze 810, 812, 814, 816. Die Ausgangssignale aus jedem Chip 230 oder jedem Chipplatz 810, 812, 814, 816 werden einem Computer 620 als Eingangs signale zugeführt. Der Computer 620 ist dann in der Lage, die Systeme 200 von mehreren Chips 230 in Echtzeit zu überwachen.
9 ist eine schematische Darstellung, die zeigt, dass eine Untersuchung Sätze von Chips 230 umfassen kann, die sich in unterschiedlichen Gehäusen 800, 900 befinden. Die Ausgangssignale von jedem der Chips 230 können auf Veränderungen in den Umweltbedingungen, wie beispielsweise wenn die Temperatur leicht erhöht wird oder dergleichen, überwacht werden. Es wird weiter erwogen, dass jeder der Chips in einem Gehäuse die gleiche Zellkultur aufweisen kann, oder dass die Chips 230 im Gehäuse 800 Chips aufweisen können, die untereinander verbunden sind, um innerhalb eines Gehäuses unterschiedliche Teile eines Säugetiers oder voneinander abhängiger Organe zu bilden.
Die Chips 230, die in Bezug auf 2–4 und 6–9 behandelt wurden, benutzen zweidimensionale Zellkulturkammern 210, 212, 213, 214. Da dreidimensionale Gewebekulturkonstrukte in ihrem Stoffwechsel wesentlich authentischer sein können, befasst sich ein weiterer Chip 1000 mit der Einbeziehung von dreidimensionalen Konstrukten. Im Folgenden wird die Erzeugung einer im Mikromaßstab ausgeführten zu einer Zellkultur analogen Vorrichtung („CCA") beschrieben, die dreidimensionale Gewebe in einem modularen Format enthält. Die CCA Vorrichtung oder der Chip 1000 benutzt eine überströmte Ausführungsform für Lungenzellenkammern und eine durchströmte Ausführungsform für andere Organe. Die durchströmte Ausführungsform für die Gestaltung der CCA Vorrichtung wird im Folgenden weiter besprochen.
10 zeigt eine schematische Darstellung und ein Fließregime für einen. Chip 1000. Der Chip 1000 umfasst vier Vertiefungen oder Gewebemodule. Der Chip 1000 umfasst eine Lungenvertiefung 1010, eine Lebervertiefung 1020, eine Fettvertiefung 1030, und eine langsam durchströmte Vertiefung 1040, und eine schnell durchströmte Vertiefung 1050. Röhren werden benutzt, um eine Flüssigkeit durch den Chip 1000 zirkulieren zu lassen. Eine Pumpe 1060 bewegt die Flüssigkeit durch die Röhren. Die Lungenvertiefung 1010 erhält am Anfang den gesamten Flüssigkeitsstrom. Nach der Lunge 1010 verteilt sich die Flüssigkeit auf die vier Gewebemodule. Das Lebermodul erhält 25% des Flüssigkeitsstroms, das Fettmodul 9%, das langsam durchströmte Modul 15% und die schnell durchströmte Sektion 51%. Durch Anpassung der Geometrie der Flüssigkeitskanäle wird der Flüssigkeitsstrom aus der Lungenvertiefung 1010 aufgeteilt. Die Kanäle zu jedem Modul werden von unterschiedlicher Länge sein, um den Druckabfall auszugleichen und den Flüssigkeitsstrom auszubalancieren. Nachdem die Flüssigkeit die anderen Gewebe verlassen hat, wird sie über die Pumpe 1060 zurück in das Lungenkompartiment geführt werden. Jede der Vertiefungen oder Gewebemodule 1020, 1030, 1040, 1050 enthält Gewebe. Das Gewebe ist in im Mikromaßstab ausgeführten Röhren 1022, 1032, 1042, 1052 innerhalb der Vertiefungen 1020, 1030, 1040, 1050 enthalten. Wie in 10 gezeigt, gibt es nur eine im Mikromaßstab ausgeführte Röhre 1022, 1032, 1042, 1052 pro Vertiefung 1020, 1030, 1040, 1050. Es soll angemerkt werden, dass in einer Vertiefung mehrere im Mikromaßstab ausgeführte Röhren untergebracht werden können.
Im Betriebszustand gibt es zwei Verfahren, die es ermöglichen, dreidimensionales Gewebe in eine CCA Vorrichtung oder einen Chip 1000 aufzunehmen. Beide Verfahren schließen den Durchfluss von inokuliertem Medium durch im Mikromaßstab ausgeführte Röhren aus Polystyrol oder Glas ein. Die untersuchten Zellen haften an der Innenseite der Röhren an und vereinigen sich zu dreidimensionalem Gewebe. Die Röhren werden gesammelt, gebündelt und in Vertiefungen auf einen Chip 1000 eingebracht. Jede Vertiefung wird zu einem Organmodul, durch das die wässrige Lösung des Wirkstoffs fließen wird, um mit dem Gewebe in Kontakt zu treten.
Die erste Methode, die es ermöglicht, dreidimensionales Gewebe aufzunehmen, bedient sich einer einen Durchflussreaktor verwendenden Strategie. In einem Siliziumwafer werden Öffnungen erzeugt und kanalisiertes Medium wird dann durch die Öffnungen geleitet. Das Silizium auf der Innenfläche der Öffnungen stellte ein Gerüst für die Zellen zur Verfügung und sie vereinigten sich zu einem dreidimensionalen Gewebe. Um diese Technik an einem CCA 1000 aus Polymeren anwenden zu können, können die Polymerröhren entweder mit einem Adhäsionsprotein behandelt werden, oder die Zellen können in einem Medium gezüchtet werden, dem Serum zugegeben wurde. Sowohl Serum als auch ein Adhäsionsprotein ermöglichen es den Zellen, an der Innenfläche der Röhre zu haften.
Die zweite Methode benutzt einen HARV Mikrogravitationsreaktor, um die Zellen darin zu züchten. Indem die Röhren in der Mitte des sich drehenden Reaktors als Gerüst aufgebaut werden oder indem man sich frei hin- und herbewegende Röhren in das Kulturmedium einbringt, bilden die Zellen dreidimensionale Aggregate in einigen der Röhren. Wegen der erhöhten Aktivität von Zellen, die unter Mikrogravitation gewachsen sind, haben diese Gewebekonstrukte überlegene Funktionseigenschaften im Vergleich zu zweidimensionalem Gewebe oder dem in dem oben beschriebenen Verfahren gebildeten Gewebe. Die Gewebe enthaltenden Röhren können entsprechend ihrem Gewicht oder ihrer Dichte separiert und in der Vorrichtung montiert werden.
11 ist eine teilweise als Explosionsdarstellung ausgeführte isometrische Darstellung einer zu einer Zellkultur analogen Vorrichtung 1100, die den Chip 1000 enthält. Der Chip 1000 enthält einen Lungenzellkulturbereich 1010 und mehrere Vertiefungen, die mit dem Lungenzellkulturbereich 1010 verbunden sind. Die Vertiefung umfassen eine Vertiefung 1020 mit Lebergewebe, eine Vertiefung 1030 mit Fettgewebe, eine langsam durchströmte Vertiefung 1040, und eine schnell durchströmte Vertiefung 1050. Im Mikromaßstab ausgeführte Röhren, welche die verschiedenen Gewebe enthalten, passen in die Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050. Jede Vertiefung umfasst einen Ablauf zu einem aus Elastomer bestehenden Unterteil 1110, das an dem Chip 1000 angebracht ist. Das Elastomer 1110 ist ein Teil einer Pumpe. Ein Aktuator 1120 drückt gegen das Elastomer, um eine Pumpwirkung zu erzeugen, um die Flüssigkeit des Systems 1100 zu bewegen oder die Flüssigkeit des Systems 1100 von den Vertiefungen über eine Rückführleitung 1130 zu dem Lungengewebemodul 1010 zurückzuleiten. Eine Glasschicht wird über der Oberseite des Chips angebracht, um das Lungengewebemodul 1010 und die verschiedenen Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 abzudecken. Es sollte beachtet werden, dass die Kanäle 1021, 1031, 1041 und 1051 so dimensioniert sind, dass sie bestimmte Durchflussraten durch die verschiedenen Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 erzeugen. Anstatt die Länge und Breite der verschiedenen Kanäle 1021, 1031, 1041, 1051 anzupassen, wird es erwogen, andere Durchflussbegrenzer entlang des Kanals anzubringen, um zu erreichen, dass die Durchflussraten zu den verschiedenen Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 variiert werden können. Der Glasdeckel 1140 kann durch eine biegsame Membran ersetzt werden, und druckgesteuerte Kugelventile können hinzugefügt werden, damit die Flüssigkeitsströme in den Kanälen 1021, 1031, 1041 und 1051 durch andere Maßnahmen als die Abmessungen der Kanäle reguliert werden können.
Der Chip 1100 kann aus Silizium hergestellt werden, aber es ist kostengünstiger, den Chip 1000 aus Polystyrol oder irgendeinem anderen geeigneten Kunststoff herzustellen. Jeder Chip wird zuerst mit herkömmlichen Mitteln auf Silizium hergestellt. Eine Vorlage aus Nickel wird dann aus dem Siliziumvorstück hergestellt. Mit anderen Worten wird der Chip 1000 durch Formen von Kopien aus Polystyrol und Silikonelastomer auf Vorlagen aus Silizium und Nickel hergestellt. Selbstverständlich ist der erste Schritt in der Herstellung eines Polymerchips, den Chip auf einem Siliziumwafer zu erzeugen. Zuerst wird eine Schicht Fotolack 1210 auf einen Siliziumwafer 1200 aufgebracht. Eine Schablone wird über den Fotolack 1210 positioniert. Die Schablone enthält das Muster eines Lungengewebe-Kulturbereichs 1010. Die Schablone lässt UV-Licht passieren, um gerade den Teil des Fotolacks zu belichten, der dem Lungenareal 1010 entspricht. Der Fotolack wird dann entwickelt, um eine Öffnung 1211 zu erzeugen, die dem Lungengewebekulturareal 1010 entspricht. Der Siliziumwafer mit dem Fotolack wird dann geätzt, um die Lungenöffnung 1010 in dem Siliziumwafer 1200 zu erzeugen. Der Fotolack 1210 wird dann von dem Siliziumwafer 1200 entfernt und hinterlässt die Lungenvertiefung 1010 in dem Siliziumwafer. Eine weitere Schicht Fotolack 1220 wird dann auf den Wafer 1200 aufgebracht. Eine Schablone wird über den Wafer positioniert. Die Schablone ermöglicht die Belichtung der verschiedenen Vertiefungen oder Flüssigkeitskanäle einschließlich 1021, 1031, 1041 und 1051, die verwendet werden, um die Lungenvertiefung 1010 mit den verschiedenen Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 zu verbinden. Die Schablone lässt den Fotolack im Bereich des Flüssigkeitskanals frei. Der Fotolack wird dann entwickelt, um den belichteten Fotolack zu entfernen, der den Kanälen für den Flüssigkeitsstrom entspricht. Der freigelegte Bereich wird dann bis zu einer gewünschten Tiefe geätzt. Danach wird der restliche Fotolack 1220 entfernt, wodurch ein Siliziumwafer 1200 mit einer Lungenvertiefung 1010 und anderen Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 erhalten wird. Der nächste Schritt ist, noch eine dritte Schicht Fotolack 1230 aufzubringen. Eine Schablone wird über den Fotolack positioniert wobei die Schablone Öffnungen aufweist, die den verschiedenen Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 entsprechen. Der Fotolack wird mit der Schablone bedeckt und UV-Licht ausgesetzt, um Öffnungen zu erzeugen, die den verschiedenen Vertiefungen entsprechen. Der Fotolack wird entwickelt und hinterlässt freigelegte Bereiche auf dem Silizium für die Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050. Der Chip und der Fotolack 1230 werden dann geätzt, um die Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 herzustellen. Die Öffnungen, die den Gewebemodulen 1020, 1030, 1040, 1050 entsprechen, werden mit Plasma geätzt bis zu einer Tiefe von ungefähr 750 Mikrometern. Die Öffnungen werden dann weitere 250 Mikrometer mit KOH nass geätzt, um ein sich verjüngendes Ende zu erzeugen. Das KOH ätzt Silizium entlang seiner Gitterebene in einem Winkel von 54,7 Grad. Der Fotolack wird dann entfernt und man hat einen Siliziumwafer erzeugt, aus dem die Vorlage aus Nickel hergestellt werden kann.
Nickel wird durch Galvanisieren auf den Silizium-Chip aufgebracht, um eine Vorlage 1250 aus Nickel herzustellen. Die Vorlage aus Nickel wird dann benutzt, um das Polymersubstrat 1000 zu gießen oder zu prägen. Zum Formen von Abdrücken wird das Polymer geschmolzen oder in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und auf die Vorlage 1250 aus Nickel gegossen und erstarrt in der gleichen Form wie der ursprüngliche Siliziumchip. Für die Prägung siehe 5. Der Polymerchip 1000 wird dann auf einem Trog 1110 aus Silikonelastomer angebracht. Das Polymer und das Silikon sind selbstdichtend, so dass die Schichten eine einzige Einheit bilden werden. Ein pneumatischer Aktuator 1120 wird unter dem Chip angebracht, um die aus den verschiedenen Gewebemodulen 1020, 1030, 1040, 1050 gesammelte Flüssigkeit zu pumpen. Jede Sekunde wird sich der Trog mit 0,032 Mikrolitern Flüssigkeit füllen. Der Aktuator wird dann das Silikon nach oben drücken und die Flüssigkeit veranlassen, durch die Mikroröhren zurück zum Lungenkompartiment 1010 zu fließen. Der Elastomertrog 1110 und der Aktuator 1120 bilden die Pumpe 260 (gezeigt in 12). Das Elastomer-überzogene Polymethylmethacrylat (PLEXIGLAS^TM) 1140 wird dann zur Versiegelung des Oberteils des Wafers oder des Chips 1000 benutzt.
Um den Unterdruck auszugleichen, der verursacht wird, wenn das Silikon sich mit Flüssigkeit füllt, wird das Polymethylmethacrylat (PLEXIGLAS^TM) über dem Lungenzellenkompartiment 1010 entfernt und durch eine Silikonmembran ersetzt. Diese Membrane hebt und senkt sich entsprechend der Tätigkeit der Silikonpumpe und hält den Druck in der Vorrichtung ausgeglichen. Die verschiedenen Mikroröhren werden in die Vertiefungen eingebracht, bevor das Elastomer-überzogene Polymethylmethacrylat (PLEXIGLAS^TM) über dem Chip 1000 angebracht wird. Ein Mechanismus für die Handhabung der Mikroröhren schließt einen Haftarm mit ein, der sich absenkt und eine bestimmte Anzahl von Gewebe enthaltenden Röhren sammelt. Der Mechanismus transportiert die Röhren zur Vorrichtung und packt die Röhren kompakt in die Vertiefungen des jeweiligen Moduls 1020, 1030, 1040, 1050. Die dichte Packung sorgt dafür, dass die Reibungskraft die Röhren der Zellkultur-analogen Vorrichtung auch bei beliebigen Bewegungen der Vorrichtung in Position hält. Dadurch wird ein Durchsickern des Flüssigkeitsstroms um die Röhren in den jeweiligen Vertiefungen 1020, 1030, 1040, 1050 minimiert. Sogar bei festem Sitz fließen ungefähr 5–10 des Flüssigkeitsstroms um die Röhren herum und fließen direkt in den Silikonunterteil oder den Elastomertrog 1110.
13 zeigt den Elastomertrog. Der Elastomertrog ist ein Stück Silikonelastomer mit einer im Wesentlichen rechteckigen Öffnung darin. Die rechteckige Öffnung dient als Vorratsbehälter für die Flüssigkeiten, die aus den Vertiefungen 1020, 1030, 1040 und 1050 kommen. Der Elastomertrog 1110 weist eine Öffnung an einer Seite auf, die durch Bezugsziffer 1300 gekennzeichnet ist. Die Rückführleitung 1130 hat ein Ende, das an die Öffnung 1300 in dem Elastomertrog 1110 angeschlossen wird und ein anderes Ende, das an die Lungenvertiefung 1010 des Chips 1000 angeschlossen wird.
In wieder einer anderen Ausführungsform wird der Elastomertrog 1110 durch eine Pumpe 1400 aus Silikonelastomer ersetzt, die in 14 gezeigt ist. Die Pumpe 1400 aus Silikonelastomer ist dafür entworfen, den Flüssigkeitsstrom innerhalb des Kreislaufsystems auf dem Chip 1000 und durch das gesamte durch Bezugsziffer 1100 bildlich dargestellte System hindurch genauer nachzubilden. Die Pumpe 1400 umfasst eine erste Lungenkammer 1410 und eine zweite Systemkammer 1412, die durch unterschiedliche Aktuatoren 1420 und 1422 betätigt werden. Durch die mehreren Kammern 1410 und 1412 wird mit dem Multitrog-Elastomerunterteil am Boden des Chips 1000 ein physiologisch realistischeres Pumpmuster erzeugt. Indem man Aktuatoren in bestimmten Zeitabständen den Abschnitt des Unterteils nach oben drücken lässt und dadurch die mehreren Kammern 1410 und 1412 in dem Silikonelastomertrog 1400 erzeugt wird die Pumpwirkung eines Herzens nachgebildet.
28A ist eine Blockdiagrammdarstellung, die ein System zur Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. In dieser Ausführungsform ent hält das System 2800 eine erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806, die mit zu einem Steuerinstrument 2802 verbunden ist. Die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806 enthält eine Anzahl von im Mikromaßstab ausgeführten Kammern (2808, 2810, 2812 und 2814) mit Geometrien, die eine Anzahl von in vivo Wechselwirkungen mit einem Kulturmedium simulieren, zusammenschalten, wobei jede Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für den Durchfluss des Kulturmediums aufweist und einen Mikro-Strömungskanal, der die Kammern untereinander verbindet. Das Steuerinstrument 2802 umfasst einen Computer 2804 für das Sammeln von Daten und die Steuerung von pharmakokinetischen Parametern der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806.
In einer anderen Ausführungsform wird die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806 auf einem rechnergestützten Chip gebildet. Die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806 umfasst weiterhin einen oder mehrere mit dem Steuerinstrument 2802 verbundene Sensoren für die Messung physiologischer Ereignisse in den Kammern. Die Sensoren umfassen einen oder mehrere Biosensoren, die den Sauerstoffgehalt, den Kohlendioxidgehalt oder den pH-Wert des Kulturmediums überwachen. Das Steuerinstrument 2802 enthält die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806 und versiegelt eine Oberseite der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806, um den Mikro-Strömungskanal herzustellen. Das Steuerinstrument 2802 stellt die Querverbindungen des Mikro-Flüssigkeitsstroms bereit, so dass der Mikro-Flüssigkeitsstrom in die Vorrichtung hinein und aus ihr heraus fließen kann. In einer anderen Ausführungsform steuert der Computer 2804 einen pharmakokinetischen Parameter, der ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus der Gruppenpumpengeschwindigkeit, der Temperatur, der Zeitdauer des Experi ments und der Häufigkeit der Erfassung der Daten der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806. In einer Ausführungsform stellt der Computer 2804 einen Installations-Bildschirm zur Verfügung, damit ein Operator die Pumpengeschwindigkeit, die Temperatur der Vorrichtung, die Zeitdauer des Experimentes und die Häufigkeit der Datenerfassung (z. B. alle fünfzehn Minuten) auch manuell einstellen kann. In einer anderen Ausführungsform steuert der Computer 2804 einen pharmakokinetischen Parameter, der ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Durchflussrate, Kammergeometrie und Anzahl der Zellen in der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806. In dieser Ausführungsform stellt das System 2800 schnellere und empfindlichere Reaktionen zur Verfügung als Ganztierstudien und traditionelle Gewebekulturuntersuchungen. Da Parameter gesteuert werden, ist das System 2800 kein auf Physiologie beruhendes System mehr. In einer anderen Ausführungsform steuert der Computer 2804 auch eine oder mehrere Pumpen in der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806, um Verweilzeiten des Kulturmediums in den Kammern (2808, 2810, 2812 und 2814) zu erzeugen, die vergleichbar sind mit denen, die im lebenden Körper angetroffen werden. In einer anderen Ausführungsform steuert der Computer 2804 auch ein oder mehrere Ventile, die entlang des Mikro-Strömungskanals in einer Weise angeordnet sind, die mit einem Wert eines pharmakokinetischen Parameters konsistent ist, der mit einem simulierten Teil eines lebenden Körpers verbunden ist.
In einer anderen Ausführungsform schließt das System 2800 zusätzlich eine zweite im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung ein, die eine Anzahl von im Mikromaßstab ausgeführten Kammern mit Geometrien enthält, die eine Anzahl von in vivo Wechselwirkungen mit einem Kulturmedium simulieren, wobei jede Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für den Durchfluss des Kulturmediums aufweist und einen Mikro-Strömungskanal, der die Kammern untereinander verbindet. Das Steuerinstrument 2802 ist mit der zweiten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung verbunden.
28B ist eine Blockdiagrammdarstellung, die eine andere Ausführungsform eines Systems zur Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung veranschaulicht. In dieser Ausführungsform umfasst das System 2816 die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806, die mit einem Steuerinstrument 2818 verbunden ist. Das Steuerinstrument 2818 umfasst den Computer 2804, eine Pumpe 2820 zur Steuerung der Zirkulation von Mikroflüssigkeitsströmen in dem Mikro-Strömungskanal der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806, ein Heizelement 2822 zur Steuerung der Temperatur der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806, eine Lichtquelle 2824 und einen Fotodetektor 2826 für die Detektion von Fluoreszenzemissionen aus den Zellen enthaltenden Kompartimenten innerhalb der ersten im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung 2806. In einer Ausführungsform zeichnet der Computer 2804 Fluoreszenzintensitätsdaten auf, wobei die Art des benutzten Messinstruments ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus kolorimetrischen, Fluoreszenz messenden, Lumineszenz messenden, und radiometrischen Messinstrumenten. In einer anderen Ausführungsform hält das Heizelement 2822 die erste im Mikromaßstab ausgeführte Kulturvorrichtung 2806 bei einer Temperatur von siebenunddreißig Grad Celsius.
29 ist eine Darstellung eines Flussdiagramms, das ein rechnergestütztes Verfahren für die dynamische Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. In dieser Ausführungsform umfasst die rechner gestützte Methode 2900 die Blöcke 2902, 2904, 2906 und 2908. Block 2902 umfasst das Analysieren von Daten von einer Anzahl von Sensoren, um physiologische Ereignisse in einer Anzahl von Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu messen. Block 2904 umfasst das Regulieren der Durchflussraten der Flüssigkeit eines Kulturmediums in den Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung. Block 2906 umfasst die Detektion biologischer oder toxikologischer Reaktionen in den Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung. Wenn eine solche Detektion erfolgt ist, umfasst Block 2908 das Verändern eines oder mehrerer pharmakokinetischer Parameter der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung.
In einer Ausführungsform umfasst Block 2906 (d. h. die Detektion) die Detektion einer Änderung der Abmessungen eines Zellen enthaltenden Kompartiments der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung. In einer Ausführungsform umfasst Block 2908 (d. h. das Verändern) das Verändern eines pharmakokinetischen Parameters, der ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus den Wechselwirkungen zwischen Zellen, der Verweilzeit der Flüssigkeit, den Verhältnissen von Flüssigkeit zu Zellen, dem Stoffwechsel durch Zellen und der Scherbeanspruchung in der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung. In einer anderen Ausführungsform umfasst Block 2908 das Verändern eines pharmakokinetischen Parameters ein, der ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus der Durchflussrate, der Kammergeometrie und der Anzahl von Zellen in der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das rechnergestützte Verfahren 2900 weiterhin die Optimierung der Kammergeometrie innerhalb der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung, wobei die Optimierung die Auswahl einer Anzahl von Kammern, die Wahl einer Kammergeometrie, die ein korrektes Verhältnis von Gewebe- oder Organgröße liefert, die Wahl einer optimalen Durchflussrate der Flüssigkeit, die eine korrekte Verweilzeit der Flüssigkeit liefert und die Berechnung der Scherbeanspruchung der Zellen einschließt.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die automatisierte Methode 2900 auch das Regulieren einer Temperatur des Kulturmediums. In wieder einer anderen Ausführungsform umfasst die automatisierte Methode 2900 auch die Detektion von Fluoreszenzemissionen aus einem Zellen enthaltenden Kompartiment der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein computerlesbares Medium von einem Computer ausführbare Anweisungen, die darauf gespeichert sind, zur Ausführung der verschiedenen Ausführungsformen des oben beschriebenen rechnergestützten Verfahrens. In einer Ausführungsform umfasst das computerlesbare Medium einen Datenspeicher oder eine Speichervorrichtung. In einer anderen Ausführungsform umfasst das computerlesbare Medium ein Computerdatensignal, das in einer Trägerwelle enthalten ist.
30 ist eine Blockdiagrammdarstellung, die einen Computer zur Steuerung einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. In dieser Ausführungsform umfasst der Computer 3000 einen Mikroprozessor 3002, einen allgemeinen Speicher 3004, ein nicht flüchtiges Speicherelement 3006, eine Schnittstelle 3008 für Eingabe und Ausgabe, die eine Schnittstelle zu einer im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung einschließt, die eine oder mehrere Sensoren aufweist, und Computer-Software. Die Computer-Software ist auf dem Mikroprozessor 3002 ausführbar, um die Durchflussraten der Flüssigkeit eines Kulturmediums in einer Anzahl von Kammern in der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu regulieren, biologische oder toxikologische Reaktionen in den Kammern der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu detektieren und nach Detektion einen oder mehrere pharmakokinetische Parameter der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu verändern.
In einer Ausführungsform enthält das nicht flüchtige Speicherelement 3006 aus veröffentlichten Informationen entnommene historische Daten, aus früher durchgeführten Untersuchungen gewonnene Daten oder aus theoretischen Berechnungen abgeleitete Daten. Die Computer-Software reguliert die Durchflussraten der Flüssigkeit, indem sie über Pumpenkontrollleitungen Befehle an eine oder mehrere Pumpen der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung übermittelt. In einer Ausführungsform ist die Computer-Software auch auf dem Mikroprozessor 3002 ausführbar, um eine Temperatur des Kulturmediums zu regulieren. Die Computer-Software reguliert die Temperatur, indem sie über Heizspulen-Kontrollleitungen Befehle an eine Heizspule der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung übermittelt.
In einer anderen Ausführungsform schließt der Computer 3000 auch einen mit dem allgemeinen Speicher 3004 verbundenen Speicher für Nachschlagetabellen ein, für die Speicherung eines Satzes von Massebilanzgleichungen, die physiologiebasierte pharmakokinetische Modelle für verschiedene biologische oder chemische Substanzen im System darstellen, und einen mit dem Mikroprozessor 3002 verbundenen Cachespeicher für die Speicherung der Computer-Software.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die Schnittstelle 3008 für Eingabe und Ausgabe auch eine Tastatur-Schnitt stelle, eine Anzeige-Schnittstelle und eine Aufzeichnungs-Schnittstelle zu einem Drucker oder Plotter. In einer Ausführungsform benutzt der Computer 3000 diese Schnittstellen für Eingabe und Ausgabe, um Verbindung zu den Peripheriegeräten Tastatur, Anzeige und Drucker/Plotter-Aufzeichnungsgerät herzustellen.
Experimenteller Teil
Die folgenden Beispiele werden angeführt, um dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet eine vollständige Offenbarung und Beschreibung davon zur Verfügung zu stellen, wie man die vorliegende Erfindung ausführt und verwendet, und sollen nicht den Bereich dessen begrenzen, was als die Erfindung angesehen wird.
Es sind Anstrengungen unternommen worden, die Genauigkeit der verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen) sicherzustellen, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen treten auf. Falls nicht anders angegeben sind Teile Gewichtsteile, Molekulargewicht ist gewichtsmittleres Molekulargewicht, Temperatur ist in Grad Celsius; und Druck ist bei oder nahe an atmosphärischem Druck.
Methoden
Die folgenden Methoden wurden im experimentellen Verfahren verwendet:
Zellkultur. Zellen wurden von der amerikanischen Typus-Kultursammlung (Manassas, VA) („ATCC") erhalten und vermehrt in dem empfohlenen vollständigen Nährmedium in einem Inkubator für Gewebekulturen (95% O₂/5% CO₂). Für HepG2 und HepG2/C3A Zellen ist das empfohlene Medium Eagles Minimalmedium (mit Earles Mineralsalzmedium (engl.: "Earle's balanced salts solution"), 2 mM L-Glutamin, 1,0 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 10% fötalem Kälberserum) (EMEM). Mc- Coys 5a Medium mit 1,5 mM L-Glutamin, 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 10% fötalem Kälberserum wird für HCT 116 empfohlen.
Wachstumskurven. Wachstumskurven wurden ermittelt, indem man die Zellen mit einer niedrigen Anfangsdichte in 35 mm Schalen auftrug. Jeden Tag wurden Zellen mit Trypsin-EDTA abgelöst und die Zellanzahl wurde visuell bestimmt, indem man die Zellen mit einem Hemacytometer auszählte. Die Bestimmungen wurden dreifach durchgeführt.
Reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Zellen wurden auf Glasdeckgläsern gezüchtet, die mit Kollagen, MATRIGEL^TM, oder Polylysin behandelt worden waren, wie jeweils angemessen. Zu einer zu ca. 90% konfluenten einlagigen Schicht gezüchtete HepG2/C3A Zellen wurden mit Trypsin-EDTA abgelöst und 5 min lang bei ca. 500 g pelletiert. RNS wurde mit einem RNEASY^TM Kit (Qiagen) entsprechend der Gebrauchsanweisung des Herstellers isoliert und gereinigt. Gesamt-RNS der Leber eines erwachsenen Menschen wurde von Ambion gekauft. Die Menge und die Reinheit (Verhältnis 260/280 nm) der isolierten RNS wurden auf einem BIOFOTOMETER^TM SpektroFotometer (Eppendorf) gemessen. Die isolierte RNS wurde dann 25 Minuten lang bei 37 °C mit 2 U DNase I inkubiert und anschließend mit DNase-Inaktivierungsreagens (Ambion) inaktiviert.
Die RT Reaktion wurde durchgeführt unter Verwendung einer Mischung von 5 μg RNS, 10 μM oligo(dT) Primern, die 2 min lang auf 72 °C erhitzt und dann 2 min auf Eis gekühlt worden waren. Als nächstes wurden 5 mM DTT, 600 μM dNTP Mischung, 40 U rRNasin, 200 U SUPERSCRIPT II^TM in Reverse Transkriptase Puffer vermischt und 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert.
2,0 μl First Strand cDNA wurde in 50 μl PCR Reaktionen, die spezifische Primer für Cytochrom P450 Isoformen einsetzen, verwendet (Rodriguez-Antona, C., Jover, R., Gomez-Lechon, M.-J. und Castell, J. V. (2000). Quantitative RT-PCR Bestimmungen von menschlichen Cytochromen P-450: Anwendung auf Studien der Einführung von Wirkstoffen („Quantitative RT-PCR measurement of human cytochrome P-450s: application to drug induction studies"), Arch. Biochem. Biophys., 376: 109–116). Die PCR Bedingungen waren: 4 min lang 94°C, gefolgt von 28 Zyklen von je 40 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 60°C, 50 Sekunden bei 72°C, und eine abschließende 4 min dauernde Verlängerung bei 72°C.
PCR Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1,2% Agarose-Gel getrennt und sichtbar gemacht durch Anfärben mit SYBR Gold und mit passenden Molekulargewichtstandards verglichen, um die Authentizität zu überprüfen. Um die verstärkte cDNS zu quantifizieren, wurden 15 μl jeder PCR Reaktion mit 0,1 × Tris-EDTA Puffer verdünnt und mit PICOGREEN^TM (Molecular Probes) bei einer Endkonzentration von 1 : 400 angefärbt. Fluoreszenz wurde bei 480 nm Anregung und 520 nm Emission gemessen. Die Resultate wurden gegen β-Actin standardisiert und von mindestens zwei verschiedenen Experimenten je dreifach wiederholt.
Untersuchungen von Zellentwicklungsfähigkeit bzw. -lebensfähigkeit, Zelltod und Apoptose. Zellentwicklungsfähigkeit bzw. -Lebensfähigkeit und Zelltod wurden mittels Trypanblau-Ausschluss oder LIVE/DEAD Färbung (Molecular Probes) bestimmt. Trypanblau (GIBCO), das normalerweise nicht in das Zytoplasma gelangen kann, identifiziert Zellen mit beschädigten Membranen, indem es tote oder sterbende Zellen sichtbar blau anfärbt. Eine 1 : 1 Verdünnung einer 0,4 prozentigen Lösung (Gewicht/Volumen) von Trypanblau wird dem im Kreislauf geführten Kulturmedium der Chipvorrichtung bei Beendigung des Experiments hinzugefügt. Diese Lösung wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur durch den zur Entsorgung vorgesehenen Chip gepumpt. Das Gehäuse wurde von der Pumpe entfernt und unter einem Auflichtmikroskop (Micromaster, Fischer) sichtbar gemacht.
LIVE/DEAD Färbemittel ist ein aus zwei Komponenten bestehendes Färbemittel aus Calcein AM und Ethidium Homodimer. Lebende Zellen hydrolysieren aktiv die Acetoxymethylester (AM)-Gruppe von Calcein AM, wodurch hellgrüne Fluoreszenz des Calceins erzeugt wird. Im Gegensatz dazu kann bei Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität das Ethidium Homodimer, das normalerweise die Membran nicht durchdringen kann, den Kern von toten oder sterbenden Zellen fluoreszierend rot färben. Das Zellen durchdringende Färbemittel Hoechst 33342 dient als allgemeines Färbemittel für alle Zellen. Zusammen mit den passenden Filtersätzen fluoreszieren lebende Zellen grün, sterbende oder tote Zellen rot, und alle Zellen werden durch eine blaue Kernfluoreszenz quantifiziert. Für die hierin beschriebenen Experimente wurde Trypanblau in einer Konzentration von 0,2% (Gewicht/Volumen), Calcein AM in einer Verdünnung von 1:20.000, Propidiumiodid in einer Verdünnung von 1 : 5.000 und Hoechst 33342 in einer Konzentration von 10 μg/ml. Zellen wurden mit einem M2Bio Fluoreszenz-Stereomikroskop (Zeiss) sichtbar gemacht. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt, und die Messungen wurden dreifach durchgeführt.
Apoptose, oder programmierter Zelltod, kann mit einer Anzahl von Verfahren überwacht werden (Smyth, P. G., Berman, S. A. und Bursztajn, S. (2000) Apoptosemarker: Methoden zur Aufklärung des Mechanismus des apoptotischen Zelltods aus dem Nervensystem. („Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.") Biotechniques, 32: 648–665). Um Apoptose von Nekrose zu unterscheiden, sind mindestens zwei verschiedene Indikatoren für Apoptose nötig (Wronski, R., Golob, N. und Gryger, E. (2002), Zweifarbiges, auf Fluoreszenz beruhendes Mikrotiterplatten-Assay für den Nachweis von Apoptose ("Two-color, fluorescence-based microplate assay for apoptosis detection") Biotechniques 32: 666–668. Eine Methode, die Bindung von Annexin V-FITC, beruht auf der Beobachtung, dass Annexin V in Gegenwart von zweiwertigem Calcium fest an Phosphatidylserin bindet (Williamson, P., Eijnde, S. v. d. und Schlegel, R. A. (2001), Phosphatidylserinexposition und Phagozytose von apoptotischen Zellen („Phosphatidylserine exposure and phagocytosis of apoptotic cells") in Apoptosis, L. M. Schwartz und J. D. Ashwell (Hrsg.), (San Diego, Academic Press), S. 339–364). Normalerweise ist Phosphatidylserin auf der inneren Grenzschicht von Zellmembranen anwesend, aber es wandert in einem frühen Stadium der Apoptose in die Zellmembran. Apoptotische Zellen, die mit einem Fluorophor markiertem Annexin ausgesetzt werden, zeigen eindeutige Membrananfärbung. Mit dem im Mikromaßstab ausgeführten Chip wurde die Markierung mit Annexin V-FITC direkt auf dem Chip sichtbar gemacht, indem das System zuerst mit PBS gespült wurde und dann Annexin V-FITC (10 μg/ml in Annexin V Bindungspuffer, Clontech) 30 min lang im Kreislauf geführt wurde. Zellen wurden dann direkt mit einem FITC Filtersatz sichtbar gemacht.
Im Gegensatz zu der Markierung mit Annexin V benutzt das APOPTAG^TM Kit (Intergen Co., MA) Terminal-Desoxynucleotidyl-Transferase, um freie 3'-OH-Termini der DNS zu markieren, die während des apoptotischen Abbaus von DNS freigesetzt werden, und Sichtbarmachung mittels Immunofluoreszenz (Li, X., Traganos, F., Melamed, M. R. und Darzynkiewicz, Z. (1995). Einschrittverfahren für die Markierung von DNS-Strangbrüchen mit Flourescein- oder BODIPY-konjugierten De soxynukleotiden: Detektion von Apoptose und Einbau von Bromdesoxyuridin. („Single-Steg procedure for labeling DMA strand breaks with fluorescein- or BODIPY-conjugated deoxynucleotides: detection of apoptosis and bromodeoxyuridine incorporation") Cytomety 20, 172–180). Obgleich diese Methode in hohem Grade spezifisch für Apoptose ist, kann das Verfahren wegen der Fixierungs- und Inkubationsschritte nicht auf dem Chip durchgeführt werden. Kurz dargestellt, es wurden Mikrochips unter spezifizierten experimentellen Bedingungen betrieben, die Zellen enthaltenden Chips wurden aus ihren Gehäuseeinheiten entfernt, in 1% Paraformaldehyd fixiert und mit dem APOPTAG^TM Kit gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstellers verarbeitet.
Herstellung von Mikrochips und experimentelle Methoden. Mikrochips wurden wie folgt hergestellt: Mittels einer Software (Cadence) für computerunterstütztes Entwerfen(CAD) wurde ein Muster entworfen und es wurde mittels eines GCA/Mann 3600F optischen Mustergenerators eine Fotomaske aus Chrom hergestellt. Dieses hochauflösende Muster wurde dann auf einen Siliziumwafer (mit 3 Zoll Durchmesser) übertragen, der mit einem dünnen Überzug (ca. 1 μm) eines Positiv-Fotolacks (Shipley 1813) aufwies, indem der Wafer durch die Fotomaske hindurch UV-Licht ausgesetzt wurde, wobei ein Karl Suss MA6 Contact Aligner verwendet wurde. Nach Belichtung wurde der Fotolack entwickelt und so das Silizium im definierten Muster unter der Fotolackschicht freigelegt. Das freigelegt Silizium wurde unter Verwendung eines PlasmaTherm SLR 770 ICP Siliziumtiefätzsystems bis zu einer spezifizierten Tiefe geätzt (20 bis 100 μm). Der Fotolack wurde mit Aceton von dem Wafer abgelöst. Einzelne quadratische Mikrochips mit 22 mm Kantenlänge wurden von dem Wafer abgetrennt, in Nanostrip (Cyantek) gewaschen, mit destilliertem Wasser gespült und in einem Trockenofen bei 170°C getrocknet.
Die Oberfläche des Siliziums in den Organkompartimenten wurde mit Kollagen behandelt, um die Anhaftung von Zellen zu erleichtern. Ungefähr 10 μl einer 1 mg/ml Lösung von Kollagen Typ I wurden auf die Oberfläche des Mikrochips aufgetragen und bei Zimmertemperatur 30 min lang inkubiert. Die Kollagenlösung wurde entfernt und die Organkompartimente wurden mit Zellkulturmedium gespült.
Zellen wurden aus den Gewebekulturschalen gelöst, die Zellanzahl wurde bestimmt, und die Konzentration wurde so eingestellt, dass sie zur Ausbildung einer konfluenten einlagigen Schicht von Zellen in jedem Zellkompartiment führen würde. Zum Beispiel wurden für den in 2 (siehe oben) beschriebenen Mikrochip 10 μl einer 2.400 Zellen/μl enthaltenden Suspension der L2 Zellen auf die Lungenkammer des Zellchips aufgetragen und 15 μl einer 3.400 Zellen/μl enthaltenden Suspension der H4IIE Zellen wurden auf die Leberkammer aufgetragen. Um die Anhaftung zu ermöglichen, ließ man die Zellen über Nacht in einem CO₂ Inkubator. Nachdem die Zellen angehaftet waren wurde der Chip in Chipgehäusen aus Acryl zusammengebaut. Die Oberteile der Gehäuse enthalten Verbindungen für den Flüssigkeitsstrom, um dem Chip Zellkulturmedium zur Verfügung zu stellen. Röhren aus rostfreiem Stahl werden an Pumpenschläuche mit mikroskopisch kleinem Innendurchmesser angeschlossen und in eine kleine Öffnung in der Oberseite eines Mikrozentrifugenschlauchs eingesetzt, der Kulturmedium mit oder ohne Testverbindung enthält. Der Pumpenschlauch wird an die peristaltische Pumpe angeschlossen, mit dieser Lösung gefüllt und an die Zulauföffnungen des Chipgehäuses angeschlossen. Ein kurzer Abschnitt eines Pumpenschlauchs, dessen Ende mit einer Röhre aus rostfreiem Stahl verbunden ist, wird an die Ablauföffnung angeschlossen und die Röhre wird in eine kleine Öffnung in der Oberseite des Schlauchs mit mikroskopisch kleinem Innendurchmesser eingesetzt und komplettiert so das Kreislaufsystem für den Flüssigkeitsstrom. Das gesamte Instrument wird bei 37°C in einen CO₂ Inkubator gelegt. Ein schematisches Diagramm dieses Aufbaus ist in 22 dargestellt.
Beispiel 1
Berechnungen für ein System, das eine Ratte nachstellt

Beim Entwurf des Chips 1000 wurden alle notwendigen Kammern auf einen Silizium-Chip untergebracht, der nicht größer als 2 cm mal 2 cm war. Diese Chipgröße ist einfach herzustellen und ist mit den Größen der Verbindungsschläuche und der Pumpvorrichtungen kompatibel, die dafür vorgesehen sind, den Flüssigkeitsstrom zu lenken. Es gab auch einige andere wichtige Faktoren, die das Design der Vorrichtung, die nachstehend aufgeführt wird, einschränkten, einhergehend mit annehmbaren Werten für jede Variable. Diese eine Ausführungsform der Vorrichtung besteht aus einem System mit zwei Kompartimenten, einem Kompartiment, welches die Leber einer Ratte darstellt und einem Kompartiment, das die Lunge einer Ratte darstellt. Die Gesamtgröße des Chips beträgt 2 cm mal 2 cm und besteht aus einer verbundenen Anordnung von 20 parallelen Kanälen, die 40 μm breit, 10 μm tief und 5 mm lang sind und als „Lungen"-Kammer dienen und zwei parallelen Kanälen, die 100 μm breit, 20 μm tief und 10 cm lang sind und die Form einer Serpentine haben, die als „Leber"-Kammer dienen. Die zwei Organkompartimente werden durch einen 100 μm breiten und 20 μm tiefen Kanal verbunden. Es gibt viele andere mögliche Geometrien, Abmessungen, Anzahlen von Kammern etc. Dieses Design wurde als ein Beispiel ausgewählt. Tabelle 1 Randbedingungen beim Entwurf der Vorrichtung

Einschränkende Variable	Annehmbare Werte
Chipgröße	2 cm × 2 cm
Verweilzeit der Flüssigkeit in der „Lunge"	1,5 Sekunden
Verweilzeit der Flüssigkeit in der „Leber"	25 Sekunden
Verweilzeit der Flüssigkeit in den „anderen Geweben"	204 Sekunden
Zellanzahl jeder Zellart	> 10.000
Scherbeanspruchung der Zellen	8–14 dyn/cm²
Volumenverhältnis Flüssigkeit zu Zellen im Kanal	1 bis 2

Beispielberechnungen
Berechnungen von Kanälen oder Kammern:
Diese Berechnungen nehmen an, dass wir aus einer vorhergehenden Iteration nach dem Verfahren, das oben in Bezug auf Chip 1000 für System 1100 beschrieben wird, eine Durchflussrate erhalten haben.
Dadurch ist Q = 8,05 × 10⁵ μm³/Vertiefung·Sekunde. Die Verweilzeit der Flüssigkeit in einer Vertiefung wurde dann in folgender Weise errechnet:
Anschließend wurde die Anzahl von Zellen in einer "Zellenlänge" berechnet
NLänge = 7 Zellen (Jeder Ausdruck wird einzeln abgerundet)
Anschließend wurde ein Volumen für eine Zellenlänge eines Kanal bzw. einer Kammer berechnet VTCL = (Zelldurchmesser)·(Querschnittsfläche der Vertiefung) VTCL = (7,41 μm)· (400 μm2) VTCL = 2960 μm3
Das Volumen für die Zellenlänge wurde ebenfalls bestimmt.
Das Flüssigkeitsvolumen für die Zellenlänge ist einfach das Zellenvolumen für die Zellenlänge, das von dem Volumen für die Zellenlänge des Kanals bzw. der Kammer subtrahiert wird. Das Verhältnis des Zellenvolumens für die Zellenlänge und des Flüssigkeitsvolumens für die Zellenlänge ergibt das Volumenverhältnis von Flüssigkeit zu Zellen für das System:
Die auf einzelne Zellen wirkenden Scherkräfte, die mit einer gegebenen Durchflussrate verbunden sind, wurden bestimmt. Auf Basis des Flüssigkeitsvolumens für die Zellenlänge und des Zelldurchmessers wurde eine mittlere für den Durchfluss von Flüssigkeit verfügbare Oberfläche errechnet.
Dann wurde eine mittlere lineare Geschwindigkeit der Flüssigkeit in dem Kanal errechnet.
Unter der Annahme laminarer Strömung wurde das Stokessche Gesetz für die Berechnung des Strömungswiderstands einer Kugel benutzt, um die Gesamtscherkraft abzuschätzen, die eine einzelne Zelle erfährt.
Als Nächstes wurde die tatsächliche Verweilzeit der Flüssigkeit in einem Kanal bzw. in einer Kammer überprüft und auf eine Gesamtanzahl von Zellen in dem Kanal bzw. in der Kammer umgerechnet.
I. B. Berechnungen der Membran für die Anreicherung mit Sauerstoff:
Die Fläche der Silikonmembran für die Anreicherung mit Sauerstoff wurde in der folgenden Weise bestimmt:
Zuerst schätzen Sie die Sauerstoffaufnahmerate (OUR) für die Zellen ab:
Dann errechnen Sie den Sauerstoff-Partialdruck auf der Innenseite der Membran, um festzustellen, ob er ausreichend ist, um das flüssige Medium wieder mit Sauerstoff anzureichern. Dieses wurde mittels einer Gleichung für den Fluss eines Gases durch eine poröse Membrane durchgeführt, in der Q die Membrandurchlässigkeit ist. J stellt den Fluss des Gases in die Zellen dar, und z ist die Dicke der Membran:

²⁾ Anm. des Übesertzers: richtig:

Dieser Druck ist ausreichend, um das flüssige Medium in den 200 Sekunden, die es in Kontakt mit der Membran steht, mit Sauerstoff zu sättigen. Die Fläche der Membran wurde in iterativer Weise bestimmt, um den Partialdruck des Sauerstoffs im Inneren zu maximieren. Grundlegende Berechnungen für den Entwurf Modell einer Ratte:

	Lunge (L2)	Leber (H4IIE)
Primäre Zellcharakteristika
Oberfläche (cm²/Organ)	4890	21100
Zellvolumen (μm³/Zelle)	320	4940
Auftragungsfläche (μm²/Zelle)	320	988
Zelldurchmesser (μm)	7,41	18,5
Stokessches Gesetz: 3πηDU = FD	(Auftragungsfläche ist der Kehrwert der experimentell ermittelten Sättigungsdichten für L2 und H4IIE Zellen.)

BERECHNUNGEN FÜR LUNGENZELLEN:
Berechnung der Zell- und Flüssigkeitsvolumina in einer Zellenlänge eines Kanals bzw. einer Kammer
Zelldurchmesser	7,41 μm	(eine Zellenlänge umfasst sowohl den Durchmesser der Zelle als auch den Zwischenraum auf jeder Seite, der dem "Abstand zwischen Zellen" entspricht
Zellvolumen	320 μm³/Zelle
Kanalbreite	40 μm
Kanaltiefe	10 μm
Kanalabstand	30 μm
Kanalquerschnittsfläche	400 μm²
Zellen quer zum Kanal	5
Zellen auf der Seite des Kanals	1
Gesamtzahl der Zellen in einer Zellenlänge	7
Volumen für die Zellenlänge des Kanals	2964 μm³
Volumen für die Zellenlänge der Zelle	1120 μm3
Flüssigkeitsvolumen für die Zellenlänge	1844 μm³
Volumenverhältnis Flüssigkeit zu Zellen	1,65

Berechnung der Flüssigkeitsgeschwindigkeit und der Scherbelastung einzelner Zellen
Viskosität des Zellplasma-Mediums	9,60E-04 N-s/m² ³⁾
Anzahl der Kanäle	20	(diese Zahl wurde gewählt, um eine adäquate Zahl von Zellen und realisierbare Flussraten zu ergeben)
Durchflussrate pro Kanal	8,05E + 05 μm³/sec	(diese Zahl wurde gewählt, um eine Scherbelastung von 12 dyn zu erhalten)
Mittlere Flüssigkeitsoberfläche	249 μm²
Mittlere lineare Flüssigkeitsgeschwindigkeit U	3,23E + 03 μm/sec 3,23E – 03 m/sec
Zugkraft auf eine einzelne Zelle	1,08E–10 Newton 1,08E–04 μN 1,08E–05 dyn	(für eine Halbkugel)
Oberfläche einer einzelnen Zelle	8,63E + 01 μm² 8,63E – 07 cm²	(für eine Halbkugel)
Scherbelastung einer einzelnen Zelle	12,6 dyn/cm²	(dieses Resultat beruht auf der Annahme, dass die Zellen die Gestalt einer glatten Halbkugel haben; es ist wahrscheinlich, dass die tatsächliche Zahl auf Grund größerer Oberfläche oder von Unregelmäßigkeiten der Oberfläche klein ist)

³⁾ Anm. des Übersetzers: richtig: 9,60E–04 N·s/m²

BERECHNUNGEN FÜR LUNGENZELLEN:
Gesamtflussrate	1,61E + 07 μm³/sec
Gewünschte Verweilzeit	1,5 Sekunden
Kanallänge	5 mm	(diese Zahl wird gewählt, um die gewünschte Verweilzeit zu erhalten)
Gesamtflüssigkeitsvolumen des Kanals	2,49E + 07 μm³
Tatsächliche Verweilzeit	1,55 Sekunden
Gesamtzahl der Zellen	9,45E + 04 Zellen

BERECHNUNGEN FÜR LEBERZELLEN:
Berechnung der Zell- und Flüssigkeitsvolumina in einer Zellenlänge eines Kanals bzw. einer Kammer
Zelldurchmesser	18,5 μm
Zellvolumen	4940 μm³/Zelle
Kanalbreite	100 μm
Kanaltiefe	20 μm
Kanalabstand	50 μm
Kanalquerschnittsfläche	2000 μm²
Zellen quer zum Kanal	5
Zellen auf der Seite des Kanals	1
Gesamtzahl der Zellen in einer Zellenlänge	7
Volumen für die Zellenlänge des Kanals	36918 μm³
Volumen für die Zellenlänge der Zelle	17290 μm3
Flüssigkeitsvolumen für die Zellenlänge	19628 μm³
Volumenverhältnis Flüssigkeit zu Zellen	1,14

Berechnung der Flüssigkeitsgeschwindigkeit und der Scherbelastung einzelner Zellen
Viskosität von Zellplasma-Medium	9,60E–04 N-s/m² ⁴⁾
Gesamtdurchflussrate aus Berechnungen für Lunge	1,61E + 07 μm³/sec	(aus den obigen Be rechnungen)
Anzahl der Kanäle	2
Durchflussrate pro Kanal	8,05E + 06 μm³/sec
Mittlere Flüssigkeitsoberfläche	1063 μm²
Mittlere lineare Flüssigkeitsgeschwindigkeit U	7,57E + 03 μm/sec
	7,57E – 03 m/sec
Zugkraft auf eine einzelne Zelle	6,32E–10 Newton 6,32E–05 dyn	Stokessches Gesetz: 3πηDU = F_D
Oberfläche einer einzelnen Zelle	535,24 μm² 5,35E–06 cm²	(für eine Halb kugel)
Scherbelastung einer einzelnen Zelle	11,81 dyn/cm²
Gewünschte Verweilzeit	25 sec
Kanallänge	100 mm
Gesamtflüssigkeitsvolumen des Kanals	4,00E + 08 μm³
Tatsächliche Verweilzeit	24,86 sec
Gesamtzahl der Zellen	7,58E + 04 Zellen

⁴⁾ Anm. des Übersetzers: richtig: 9,60E–04 N-s/m²

Lunge	1,5 sec
Leber	25 sec
Andere Gewebe	204 sec

	Blutflussrate (ml/min)	Volumen (ml)
Lunge	73,3	1,2
Leber	18,3	7,4
Anderes Gewebe	55	190

Vorläufige Durchflussrate

0,85 μl/min 0,0142 μl/sec

1 μm 0,000001 m

1 μl 1,00E – 06 l 1,00E – 09 m³ 1,00E + 09 μm³

Vorläufige Verweilzeitberechnungen für Leber bzw. Lunge:
Kanaltiefe			310 μm
Kanalbreite			500 μm
Kanalquerschnittsfläche			0,155 mm² 155000 μm²
Zellanzahl pro Fläche			3200 Zellen/mml
	Verweilzeit(sec)	Kanalvolu- men (μl)	Kanal länge (mm)	Ober fläche (mm²)	Max. Zellzahl
Lunge	1,5	0,02125	0,1	6,85E + 01	2,58E + 04
Leber	25	0,4	2	1,14E + 03	3,66E + 06

Vorläufige Verweilzeitberechnungen für Andere Gewebe:
Kanaltiefe		50 μm
Kanalbreite		2000 μm
Kanalquerschnittsfläche		0,1 mm² 100000 μm²
Verweilzeit (sec)	KANALVOLUMEN (μl)	Kanallänge (mm)	Oberfläche (mm² ⁾
204	2,89	29	57,8

Beispiel 2
Ein Chip mit vier Organkompartimenten
Ein Chip wurde entworfen, der aus vier Organkompartimenten besteht – einem „Leber"-Kompartiment, das ein Organ darstellt, das verantwortlich für xenobiotischen Stoffwechsel ist, einem „Lungen"-Kompartiment, das ein Zielgewebe darstellt, einem „Fett"-Kompartiment, das einen Ort für die Bioakkumulation hydrophober Mittel bereitstellt, und einem Kompartiment „Anderes Gewebe", das die Nachstellung des Kreislaufmusters in Geweben, die weder Stoffwechsel aufweisen noch akkumulieren (15), unterstützen soll. Diese und andere Organkompartimente (z. B. Niere, Herz, Kolon oder Muskel) können als CAD Dateien vollständig modularisiert werden und in jeder möglichen Konfiguration oder Kombination hergestellt werden. Die Vorrichtung selbst kann aus einer beliebigen Anzahl von Substraten produziert werden (z. B. Silizium, Glas oder Kunststoff).
Sobald die Zellen in den passenden Kompartimenten angesiedelt worden waren, wurde der Chip in einem Verteiler aus Lucite^® (Acrylglas) zusammengebaut. Dieser Verteiler enthält vier Chips und enthielt ein transparentes Oberteil, so dass die Zellen in situ beobachtet werden konnten. Das Oberteil enthielt Verbindungselemente für den Flüssigkeits strom, um den Chip mit Zellkulturmedium zu versorgen. Das Kulturmedium wurde von einer peristaltischen Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,5 μl/min durch den Chip gepumpt. Das Kulturmedium wurde in einem geschlossenen Kreislauf zirkuliert, der aus einem Vorratsbehälter für Flüssigkeit (ca. 15 bis 50 μl Gesamtvolumen), Schläuchen mit mikroskopisch kleinem Innendurchmesser und den Kompartimenten und Kanälen des Chips besteht.
Unter Verwendung eines Systems mit drei Kompartimenten mit menschlichen HepG2-C3A Zellen im Leberkompartiment und HT29 Dickdarmkrebszellen im Zielgewebe-Kompartiment wurde gefunden, dass die Zellen bei kontinuierlichem Betrieb für mehr als 144 lang Stunden lebensfähig bzw. entwicklungsfähig blieben. HepG2-C3A Zellen sind eine gut charakterisierte menschliche Leberzelllinie, die dafür bekannt ist, verschiedene Stoffwechselenzyme der Leber in Konzentrationen zu exprimieren, die mit denen in frischen primären menschlichen Hepatozyten exprimierten vergleichbar sind. In diesen Experimenten wurden Zellen in den geeigneten Kompartimenten angesiedelt und ein speziell zusammengesetztes Zellkulturmedium wurde bis zu 144 Stunden lang im Kreislauf durch das System geführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde das Kulturmedium für 30 Minuten durch PBS das LIVE/DEAD Fluoreszenzreagens (ein duales fluoreszierendes Färbemittel, [Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA]) enthielt, ersetzt. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und unter Verwendung der passenden Filtersätze wurden Fluoreszenzbilder von identischen Feldern erhalten. Lebende Zellen fluoreszierten grün, während tote Zellen rot waren (die Daten sind nicht wiedergegeben).
Beispiel 3
Wirkstoffstoffwechsel im Chip
Der Stoffwechsel von zwei weit verbreiteten Wirkstoffvorläufern, Tegafur und Sulindac-Sulfoxid, wurde mit einem Mikrochip studiert, der drei Kompartimente enthielt, Leber, Zielgewebe und andere Gewebe. Beide Wirkstoffvorläufer müssen durch Enzyme, die in der Leber vorhanden sind, in ein aktives Stoffwechselprodukt umgewandelt werden und haben einen cytotoxischen Effekt auf ein Zielorgan. Bei dem Wirkstoffvorläufer Sulindac-Sulfoxid sind seine entzündungshemmenden und Krebs chemisch vorbeugenden Eigenschaften von seinen Sulfid- und Sulfon-Stoffwechselprodukten abgeleitet, deren Bildung durch das Leberenzym Sulfoxidreduktase katalysiert wird. Es ist gezeigt worden, dass das Sulfid-Stoffwechselprodukt (und ein zweites Sulfon-Stoffwechselprodukt) Apoptose in bestimmten Krebszellen (z.B. Dickdarmkrebs) verursacht bzw. verursachen.
Eine richtiges Behandlungsprogramm erfordert die Verabreichung seines Wirkstoffvorläufers, Tegafur [5-fluor-1-(2-tetrahydrofuryl)-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion], da 5-FU selbst für normale Zellen ziemlich toxisch ist. Tegafur wird jedoch, anders als Sulindac, in der Leber in erster Linie durch Cytochrom P450 2A6 in 5-FU umgewandelt.
Um die Wirksamkeit von Sulindac zu prüfen, wurde der Mikrochip im Leberkompartiment mit HepG2-C3A Zellen und im Zielgewebekompartiment mit menschlichen HT29 Dickdarmkrebszellen besiedelt. Einhundert Mikromol Sulindac (Angaben zum Hersteller erforderlich) wurden über einen Zeitraum von 24 Stunden dem im Kreislauf geführten Medium zugegeben und der Chip wurde behandelt wie oben beschrieben – lebende Zellen fluoreszierten grün und tote Zellen fluoreszierten rot (die Daten sind nicht wiedergegeben). In Abwesenheit von HepG2-C3A Leberzellen wurden minimale Niveaus von Zelltod (ver gleichbar mit den Niveaus im Vehikel verwendenden Kontrollexperiment) beobachtet. Diese Resultate zeigen, dass ein Wirkstoff im Leberkompartiment verstoffwechselt werden und in der Folge zu einem Ziel weitergeleitet werden kann, in dem sein Stoffwechselprodukt bzw. seine Stoffwechselprodukte eine biologische Wirkung verursachen, ebenso wie sie es in einem lebenden Tier oder in einem Menschen tun würden.
Der in der Krebstherapie eingesetzte Wirkstoffvorläufer Tegafur wurde in dem Mikrochipsystem untersucht. Um Wirksamkeit entfalten zu können, benötigt Tegafur metabolische Aktivierung durch Cytochrom P450 Enzyme, die in der Leber vorhanden sind, zu seiner aktiven Form, Fluoruracil 5 (5-FU) (Ikeda, K., Yoshisue, K., Matsushima, E., Nagayama, S., Kobayashi, K., Tyson, C. A., Chiba, K. und Kawaguchi, Y. (2000). Bioaktivierung von Tegafur zu Fluoruracil 5 wird von Cytochrom P-450 A26 in menschlichen Lebermikrosomen in vitro katalysiert („Bioactivation of tegafur to 5-fluorouracil is catalyzed by cytochrome P-450 A26 in human liver microsomes in vitro."), Clin. Cancer Res., 6, 4409–4415; Komatsu, T., Yamazaki, H., Shimada, N., Nakajima, M. und Yokoi, T. (2000). Die Rollen von Cytochrom P450 1A2, 2A6 und 2C8 bei der Bildung von 5-Fluoruracil aus Tegafur, einem Krebs bekämpfenden Wirkstoffvorläufer, in menschlichen Lebermikrosomen. („Roles of cytochromes P450 1A2, 2A6, and 2C8 in 5-fluorouracil formation from tegafur, an anticancer prodrug, in human liver microsomes"), Drug. Met. Disp., 28, 1457–1463; Yamazaki, H., Komatsu, T., Takemoto, K., Shimada, N., Nakajima, M. und Yokoi, T. (2001). Cytochrom P450 1A und 3A Enzyme der Ratte, die an der Bioaktivierung von Tegafur zu 5-Fluoruracil beteiligt und durch Tegafur in Lebermikrosomen autoinduziert werden. („Rat cytochrome P450 1A and 3A enzymes involved in bioactivation of tegafur to 5-fluorouracil and autoinduced by tegafur liver microsomes."), Drug Met. Disp., 29, 794–797. Ein richti ges therapeutisches Programm erfordert die Verabreichung seines Wirkstoffvorläufers Tegafur, da 5-FU selbst für normale Zellen sehr giftig ist. 5-FU ist zur Zeit die wirkungsvollste Zusatztherapie für Patienten mit Dickdarmkrebs (Hwang, P. M., Bunz, F., Yu, J., Rago, C., Chan, T. A., Murphy, M. P., Kelso, G. F., Smith, R. A. J., Kinzler, K. W. und Vogelstein, B. (2001). Ferredoxin-Reduktase beeinflusst von p53 abhängige, durch 5-Fluoruracil verursachte Apoptose in kolorektalen Krebszellen. („Ferredoxin reductase affects p53-dependent, 5-fluorouracil-induced apoptosis in colorectal cancer cells"), Nat. Med., 7, 1111– 1117). Wie die meisten chemotherapeutischen Mittel verursacht 5-FU durch die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies ausgeprägte Apoptose in empfindlichen Zellen (Hwang, P. M., Bunz, F., Yu, J., Rago, C., Chan, T. A., Murphy, M. P., Kelso, G. F., Smith, R. A. J., Kinzler, K. W. und Vogelstein, B. (2001). Ferredoxin-Reduktase beeinflusst von p53 abhängige, durch 5-Fluoruracil verursachte Apoptose in kolorektalen Krebszellen. („Ferredoxin reducetase affects p53-dependent, 5-fluorouracil-induced apoptosis in colorectal cancer cells"), Nat. Med., 7, 1111–1117).
Um die cytotoxischen Effekte von Tegafur auf Dickdarmkrebszellen zu messen, wurde der Mikrochip mit HepG2-C3A Zellen im Leberkompartiment und HCT 116 menschlichen Dickdarmkrebszellen im Zielgewebekompartiment vorbereitet. Tegafur wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden in verschiedenen Konzentrationen dem im Kreislauf geführten Medium zugegeben und die Zellen wurden markiert mit Hoechst 33342, einem die Membran durchdringenden Färbemittel für DNS und Ethidium Homodimer, einem die Membran nicht durchdringenden Färbemittel für DNS (siehe den Abschnitt „Methoden"). Alle Zellen fluoreszieren blau, aber tote Zellen wurden durch das fluoreszierende rote Ethidium Homodimer markiert (die Daten sind nicht wiedergegeben). In diesem im Mikrochipsystem war Tegafur in dosisabhängiger Weise cytotoxisch für HCT 116 Zellen, während es in den traditionellen Zellkulturuntersuchungen wirkungslos war (16A und 16B). Außerdem wurde gefunden, dass 5-FU zwar in der traditionellen Zellkulturuntersuchung Zelltod auslöste, Cytotoxizität aber erst nach 48 Stunden Einwirkung beobachtet wurde, verglichen mit 24 Stunden Einwirkungszeit von Tegafur bei dem Mikrochip.
Um zu zeigen, dass das Leberkompartiment für die Bioaktivierung von Tegafur verantwortlich war, wurden die Mikrochips nur mit HCT 116 Zellen besiedelt. Im Leberkompartiment befanden sich keine Zellen. Tegafur oder 5-FU wurden über einen Zeitraum von 24 Stunden dem im Kreislauf geführten Kulturmedium zugesetzt und der Chip wurde behandelt, wie oben beschrieben (die Daten sind nicht wiedergegeben). Tegafur verursachte in Abwesenheit eines Leberkompartiments kein signifikantes Ausmaß von Zelltod bei den HCT 116 Zellen, während das aktive Stoffwechselprodukt 5-FU in erheblichem Ausmaß Zelltod verursachte. Weiterhin war Tegafur wirkungslos, wenn HCT 116 durch HT 29 Dickdarmkrebszellen ersetzt wurden (die Daten sind nicht wiedergegeben). Dies lag wahrscheinlich an dem in HT 29 Zellen vorhandenen mutierten p53, das für die Cytotoxizität von 5-FU erforderlich ist. Zusammen zeigen diese Experimente, dass Tegafur, wie Sulindac, im Leberkompartiment zu einem aktiven Wirkstoff verstoffwechselt wurde, von wo aus es zu einem anderen Organkompartiment weitergeleitet wurde, wo es die Krebszellen beseitigte. Diese Effekte waren mit dem Chip mechanistisch unterscheidbar – Sulindac war wirkungsvoll sogar in Abwesenheit von aktivem p53, während Tegafur dies nicht war.
Beispiel 4
Mehrere Zellkulturen in einem einzigen Organkompartiment
Es ist auch möglich, eine Mischung mehrerer Zellarten in einem einzigen Organkompartiment zu verwenden. In einer Studie wird die Hepatozyten-Zelllinie HepG2/C3A (von der ATCC) im Leberkompartiment verwendet. Die Zellen werden in McCoys 5A Medium mit 1,5 mM L-Glutamin, 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 10% fötalem Kälberserum vermehrt. Um ein in vivo Organ genauer nachzuahmen, kann eine Mischung von primären Hepatozyten und Fibroblasten in einem Verhältnis von 1 zu 2 zusammen mit Makrophagen (Kupfferschen Sternzellen) verwendet werden.
In einem anderen Beispiel wird eine Mischung von Zellen oder Zelllinien, die von Lungenepithelzellen abgeleitet sind, verwendet um das Lungengewebe genauer nachzuahmen. Dieses schließt eine Mischung aus Typ I Epithelzellen, Typ II Epithelzellen (granulären Pneumozyten), Fibroblasten, Makrophagen und Mastzellen ein.
Beispiel 5
Optimierung der Gewebekulturbedingungen im auf dem Chip beruhenden System
Ein mit zwei unterschiedlichen Rattenzellkulturlinien, H4IIE (eine Rattenleberzelllinie) und L2 (eine Rattenlungenzelllinie) kompatibles Gewebekulturmedium wurde entwickelt. Vorbereitende Experimente zeigten an, dass eine 1 : 1 Mischung von DMEM und Hams F12K Medium, ergänzt mit 2mM L-Glutamin, 1mM Natriumpyruvat und 10% fötalem Kälberserum (FBS) die Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit sowohl von H4IIE Zellen als auch von L2 Zellen in einem Mikrochip für bis zu 20 Stunden Dauerbetrieb aufrechterhält. Diese Zusammensetzung des Mediums wurde für alle auf einem Rattenmodell beruhenden Studien mit Mikrochips verwendet.
Die geeignete menschliche Leberzelllinie, die die Funktion der menschlichen Leber realistisch nachahmt, wurde ausgewählt. Zusätzlich wurde die optimale Zusammensetzung des Zellkulturmediums für die Versorgung von menschlichen Zelllinien auf einem Mikrochip bestimmt. Die Basisniveaus der Expression von drei Schlüssel-Isoformen von Cytochrom P450 (CYP) (1A2, 3A4 und 2D6) in HepG2 und in HepG2/C3A (ein HepG2 Subklon) Zelllinien wurden untersucht. CYP-1A2, 2D6 und 3A4 wurden untersucht, weil sie für den Stoffwechsel von 80–90% aller bekannten Wirkstoffe verantwortlich sind (Hodgson, J., (2001). ADMET – Umwandlung von Chemikalien in Wirkstoffe („ADMET – Turning chemicals into drugs"), Nat. Biotech., 19, 722–726. Der C3A Subklon der HepG2 Leberzelllinie wurde untersucht, da berichtet worden ist, dass diese Zelllinie eine besonders ausgewählte Zelllinie ist, die mehr „Leber-artige" Eigenschaften zeigt, insbesondere viel höhere CYP Expression als die elterliche Zelllinie (Kelly, J. H. (1994). Permanente menschliche Hepatozyten-Zelllinie und ihr Gebrauch in einer die Leber unterstützenden Vorrichtung (LAD) („Permanent human hepatocyte cell line and ist use in a liver assist device (LAD)"), U. S. Patent Nr. 5 290 684). Die RT-PCR Analyse bestätigte, dass die CYP Basisniveaus in HepG2/C3A Zellen erheblich größer als in denen der HepG2 Elternzelllinie, und vergleichbar mit denen in der Leber eines erwachsenen Menschen waren (23).
HepG2/C3A Zellen wurden in allen folgenden Experimenten als Lebersurrogat benutzt. Um ein gemeinsames Medium zum Gebrauch in den Experimenten mit dem Mikrochip auszuwählen, wurden die Bestandteile einer Anzahl von Medien verglichen DMEM, McCoys 5a, RPMI 1640, MEM, F12, F12K, Waymouths, CMRL, MEM und Iscove's Modified Dulbecco's Medium). Die Analyse der anorganischen Salze, Glukose, Aminosäurenzusammensetzung und des Vitamingehalts deutete darauf hin, dass von den untersuchten Medien EMEM, DMEM, McCoys 5a und RPMI die am besten geeigneten „gemeinsamen" Medien waren. Nach einigen Durchläufen wurden die Zellen dann aufgetrennt und in den folgenden Medien weitergezüchtet:

Eagles Minimalmedium (EMEM) mit Earles Mineralsalzmedium, 2 mM L-Glutamin, 1,0 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 10% fötalem Kälberserum.
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) mit 4 mM L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose, 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 10% fötalem Kälberserum.
McCoys 5a Medium (McCoys) mit 1,5 mM L-Glutamin, 1,5 g/l Natriumbicarbonat und 10 fötalem Kälberserum.
RPMI 1640 Medium (RPMI) mit 2 mM L-Glutamin, 4,5 g/l Glukose, 1,0 mM Natriumpyruvat, 1,5 g/l Natriumbicarbonat.

Wachstumskurven für beide Zelllinien in jedem Medium wurden dann ermittelt, wie im Abschnitt „Methoden" beschrieben (24). Es zeigte sich, dass DMEM für die HepG2/C3A Zellen ungeeignet war, da nach ca. 5 Durchgängen signifikante Änderungen der Zellmorphologie und der Adhäsion beobachtet wurden (nicht dargestellt). In ähnlicher Weise wurde in RPMI nach 3 Tagen eine signifikante Abnahme der Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit und des Wachstums von HepG2/C3A und HCT 116 beobachtet. Beide Zelllinien wuchsen gut in McCoys und in EMEM, verglichen mit ihrem bevorzugten Medium.
Als Nächstes wurden die Expressionsniveaus dieser CYP Isoformen in HepG2/C3A Zellen, die entweder in EMEM oder Mc-Coys wuchsen, mittels RT-PCR untersucht (siehe Abschnitt „Methoden") (25). Die Resultate zeigten an, dass EMEM besser war als McCoys, um die CYP Expression aufrechtzuerhalten und das bevorzugte Medium für HepG2/C3A war. Der Effekt unterschiedlicher Wachstumssubstrate auf die Expression von CYP wurde untersucht (26). Ein Vergleich von entweder mit Poly-D-Lysin oder mit Kollagen behandeltem Silizium als Haftsubstrat mit Zellen, die auf handelsüblichem für die Verwendung in Gewebekulturen behandeltem Polystyrol gewachsen waren, wurde durchgeführt. Zusammengenommen zeigten die Resultate, dass EMEM das Wachstum sowohl von HepG2/C3A als auch von HCT 116 Zellen unterstützte und dass Kollagen auf Grundlage der RT-PCR CYP Expressionsanalyse das bevorzugte Substrat war.
Unter Verwendung dieser Bedingungen wurde die langfristige Entwicklungsfähigkeit dieser Zellen, HepG2/C3A und HCT 116, bei Dauerbetrieb im Mikrochipsystem studiert. Unter Verwendung eines Systems mit drei Kompartimenten mit menschlichen HepG2/C3A Zellen im Leberkompartiment und HCT 116 Dickdarmkrebszellen im Zielgewebekompartiment wurde gezeigt, dass Zellen bei Dauerbetrieb mehr als 144 Stunden lang entwicklungsfähig bzw. lebensfähig bleiben. In diesen Experimenten wurden Zellen in den entsprechenden Kompartimenten angesiedelt und EMEM wurde über einen Zeitraum von bis zu 144 Stunden im Kreislauf durch das System geleitet. Zu verschiedenen Zeitpunkten (nach 6, 24, 48, 72, 96, 120 und 144 Stunden) wurden die gesamten lebenden oder toten Zellen mit LIVE/DEAD Färbung sichtbar gemacht (die Daten sind nicht wiedergegeben). Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und mit den passenden Filtersätzen wurden Fluoreszenzbilder von identischen Feldern erhalten. Lebende Zellen fluoreszierten grün, während tote Zellen rot waren (die Daten sind nicht wiedergegeben).
Beispiel 6
Assay bzw. Untersuchung für die Detektion von Cytotoxizität auf einem Mikrochip
Trypanblau ist das meist verbreitete zur Unterscheidung entwicklungsfähiger bzw. lebensfähiger Zellen von nicht entwicklungsfähigen bzw. lebensfähigen Zellen benutzte Färbemittel; nur nicht entwicklungsfähige bzw. nicht lebensfähige Zellen absorbieren das Färbemittel und erscheinen dann blau. Andererseits erscheinen lebende, gesunde Zellen rund und lichtbrechend und absorbieren den blauen Farbstoff nicht. Es wurden Experimente mit Trypanblau durchgeführt, um die Entwicklungsfähigkeit bzw. Lebensfähigkeit von Zellen in einem Mikrochip zu ermitteln. Obgleich Trypanblau (siehe Abschnitt „Methoden"), einfach zu verwenden ist und für die Sichtbarmachung nur ein Lichtmikroskop erfordert, absorbieren entwicklungsfähige Zellen mit der Zeit Trypanblau, was die Resultate beeinflussen kann. Zusätzlich hat Trypanblau eine höhere Affinität für Serumproteine als für zelluläre Proteine, so dass der Hintergrund bei Verwendung Serum enthaltender Medien dunkel ist. Daher wurden alternative Verfahren gesucht, um die entwicklungsfähigen bzw. lebensfähigen Zellen von den toten Zellen zu unterscheiden.
Die LIVE/DEAD Untersuchungsmethode wurde mit auf Glasdeckgläsern gezüchteten Zellen optimiert (siehe Abschnitt "Methoden"). Kurz gesagt wurden HepG2/C3A Zellen auf mit Poly-D-Lysin behandelten Glasdeckgläsern angesiedelt und mit bzw. ohne 1 μM Staurosporin 24 Stunden lang behandelt. Staurosporin ist ein Breitband-Proteinkinase-Inhibitor und ist dafür bekannt, in einer Vielzahl von Zellen Apoptose zu verursachen (Smyth, P. G., Berman, S. A. und Bursztajn, S. (2002), Apoptosemarker: Methoden zur Aufklärung des Mechanismus des apoptotischen Zelltods aus dem Nervensystem. („Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.") Biotechniques, 32: 648–665). Deckgläser wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und LIVE/DEAD Reagenzien wurden hinzugefügt und bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Deckgläser wurden entfernt und sichtbar gemacht (die Daten sind nicht wiedergegeben). Es wurde gefunden, dass Staurosporin eindeutig den Zelltod von HepG2/C3A Zellen verursacht (die Daten sind nicht wiedergegeben.
Die Untersuchungsmethode für die Detektion von Cytotoxizität auf dem Mikrochipsystem wurde dann optimiert. Mikrochip-Zellchips wurden mit HepG2/C3A Zellen im Leberkompartiment und HCT 116 Zellen im Zielgewebekompartiment besiedelt, wie im Abschnitt „Methoden" beschrieben. Zellchips wurden in das Mikrochipsystem eingebaut und mit bzw. ohne 1 μM Staurosporin behandelt, wie oben beschrieben. Nach einer 24 Stunden dauernden Inkubation wurde das im Kreislauf geführte Medium durch PBS ersetzt, das für 30 Minuten durch das zur Entsorgung vorgesehene System fließen gelassen wurde, dann wurde umgestellt auf PBS, welches die LIVE/DEAD Reagenzien enthielt, das weitere 30 Minuten lang durch das System geleitet wurde. Das die Zellchips enthaltende Acrylgehäuse wurde von dem System entfernt und unter ein Fluoreszenz-Stereomikroskop gelegt und der Zellchip wurde durch das transparente Oberteil des Gehäuses hindurch sichtbar gemacht (die Daten sind nicht wiedergegeben). Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und mit den passenden Filtersätzen wurden Fluoreszenzbilder von identischem Feldern erhalten. Lebende Zellen fluoreszierten grün, während tote Zellen rot waren (die Daten sind nicht wiedergegeben). Durch 1 μM Staurosporin wurde nach 24 Stunden dauernder Behandlung ein signifikantes Ausmaß von Zelltod von HCT 116 Zellen verursacht, verglichen mit unbehandelten Kontrollzellchips (die Daten sind nicht wiedergegeben).
Beispiel 7
Auf einem Chip beruhende Assays bzw. Untersuchungen zur Detektion des Auftretens von Zelltod und zur Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose
Zwei unterschiedliche Assays für die Detektion von Apoptose wurden untersucht. Das erste Assay war die auf Immunofluoreszenz beruhende Methode der Markierung von Terminal-Desoxynucleotidyltransferase-Schnittenden mit BrdU (terminal deoxynucleotidyl transferase BrdU nick end labeling, TUNEL), die in Form eines Kits als APOPTAG^TM (Intergen Co., MA) erhältlich ist (siehe Abschnitt „Methoden"). Das Assay wurde zuerst mit auf Glasdeckgläsern gewachsenen Zellen optimiert. Kurz gesagt wurden HepG2/C3A Zellen auf mit Poly-D-Lysin behandelten Glasdeckgläsern angesiedelt und mit bzw. ohne Staurosporin behandelt. Die Deckgläser wurden wie beschrieben verarbeitet (siehe Abschnitt „Methoden"). Verschiedene Staurosporinkonzentrationen und Behandlungszeiten wurden geprüft, und die Resultate zeigten, dass 1 μM Staurosporin nach einer 24 Stunden dauernden Inkubation ein signifikantes Ausmaß von Apoptose verursachte, verglichen mit unbehandelten Kontrollproben (die Daten sind nicht wiedergegeben). Als Nächstes wurde das Assay für die Detektion von Apoptose auf dem Mikrochipsystem optimiert und ein Vergleich der APOPTAG^TM Methode mit der LIVE/DEAD Färbetechnik wurde durchgeführt. Die Zell-Mikrochips wurden im Leberkompartiment mit HepG2/C3A Zellen und im Zielgewebekompartiment mit HCT 116 Zellen besiedelt, wie im Abschnitt "Methoden" beschrieben. Zellchips wurden in das Mikrochipsystem eingebaut und mit bzw. ohne 1 μM Staurosporin behandelt, wie oben beschrieben. Nach einer 24 Stunden dauernden Inkubation wurde das im Kreislauf geführte Medium für 30 Minuten durch PBS ersetzt. Die Hälfte der Zellchips wurde aus dem Gehäuse entfernt und das APOPTAG^TM Assay wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Hälfte der Zellchips wurde im Mikrochipsystem belassen und wie vorher beschrieben der LIVE/DEAD Färbtechnik unterworfen. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und mit den passenden Filtersätzen wurden Fluoreszenzbilder von identischen Feldern erhalten. Lebende Zellen fluoreszierten grün, während tote Zellen rot waren (die Daten sind nicht wiedergegeben). Beide Techniken produzierten sehr ähnliche Resultate, d. h. eine 24 Stunden andauernde Einwirkung von 1 μM Staurosporin bewirkte ein signifikantes Ausmaß von Apoptose (oder Cytotoxizität) bei den HCT 116 Zellen, verglichen mit unbehandelten Kontrollproben (die Daten sind nicht wiedergegeben).
Annexin V-FITC wurde benutzt, um Apoptose im Mikrochipsystem zu ermitteln, wie im Abschnitt „Methoden" beschrieben. Kurz gesagt wurden die Mikrochip-Zellchips im Leberkompartiment mit HepG2/C3A Zellen und im Zielgewebekompartiment mit HCT 116 Zellen besiedelt. Zellchips wurden in das Mikrochipsystem eingebaut und mit bzw. ohne 1 μM Staurosporin wie oben beschrieben behandelt. Nach einer 6-stündigen Inkubation wurde das im Kreislauf geführte Medium durch PBS ersetzt, das Annexin V-FITC und Hoechst 33342 enthielt und das man für 30 Minuten durch das System fließen ließ. Die Zellchips wurden aus dem Acrylgehäuse entfernt und unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und mit den passenden Filtersätzen wurden Fluoreszenzbilder von identischen Feldern erhalten. Lebende Zellen fluoreszierten grün, während tote Zellen rot waren (die Daten sind nicht wiedergegeben). 1 μM Staurosporin bewirkte nach einer 6 Stunden andauernden Behandlung ein signifikantes Ausmaß von Apoptose, verglichen mit unbehandelten Kontrollzellchips (die Daten sind nicht wiedergegeben).
Beispiel 8
Verwendung von Naphthalin als Modelltoxin
Naphthalin wurde für Toxikologiestudien benutzt, weil für Lungentoxizität enzymatische Umwandlung in der Leber erforderlich ist. Daher wurden die Effekte von Naphthalin auf eine Rattenlungenzelllinie studiert. Diese Experimente benutzten einen auf einem Rattenmodell beruhenden Mikrochip mit drei Kompartimenten (Leber, Lunge und andere Gewebe) mit H4IIE Zellen im Leberkompartiment und L2 Rattenzellen im Lungenkompartiment. Mikrochips wurden für Experimente fabriziert und vorbereitet, wie im Abschnitt „Methoden" beschrieben worden ist.
Das Mikrochipsystem wurde 20 Stunden lang in Gegenwart oder in Abwesenheit von 250 μg/ml Naphthalin betrieben, bevor auf Trypanblau enthaltendes PBS umgestellt wurde. Diese Lösung wurde 30 Minuten lang im Kreislauf durch den Zellchip geführt und der Chip wurde unter einem Lichtmikroskop sichtbar gemacht (siehe Abschnitt „Methoden"). Naphthalin verursachte ein signifikantes Ausmaß von Zelltod der L2 Rattenzellen im Lungenkompartiment des Zellchips, während in Abwesenheit von Naphthalin kein Zelltod beobachtet wurde (die Daten sind nicht wiedergegeben). Im H4IIE Zellkompartiment wurde mit oder ohne Naphthalin kein Zelltod beobachtet, ebenso wenig im L2 Zellkompartiment in Abwesenheit von H4IIE Zellen (die Daten sind nicht wiedergegeben).
Diese Resultate zeigen, dass Naphthalin im „Leber"-Kompartiment aktiviert wird und die toxischen Stoffwechselprodukte zur „Lunge" weiterwandern und Zelltod verursachen. Diese Resultate sind konsistent mit Daten, die mit dem CCA Tischgerät erhalten wurden und aus dem PBPK Modell erwartet worden waren (Sweeney, L. M., Shuler, M. L., Babish, J. G. und Ghanem, A. (1995). Ein Zellkulturanalogon der Nagetierphysiologie: Anwendung von Napthalin-Toxikologie („A cell cul ture analogue of rodent physiology: application of naphthalene toxicology"), Toxicol. in Vitro 9, 307–316).
Beispiel 9
Ein Prototyp eines menschlichen Mikrochips
Ein Prototyp eines menschlichen Biochips wurde hergestellt, der Kompartimente für Lunge, Zielgewebe und andere Gewebe enthielt. Die Abmessungen der Kompartimente und Kanäle waren wie folgt:

Zulauf: 1 mm mal 1 mm
Leber: 3,2 mm breit und 4 mm lang
Zielgewebe: 2 mm mal 2 mm
Andere Gewebe: 340 μm breit und 110 mm lang
Ablauf: 1 mm mal 1 mm
Die Leber mit dem Y-Anschluss verbindender Kanal: 440 μm breit
Kanal vom Y-Anschluss zum Zielgewebe: 100 μm breit

Der Prototyp des menschlichen Biochips wird hergestellt wie vorher beschrieben. Die Platzierung der Organkompartimente soll die Einwirkung eines Mittels (eines Wirkstoffs) simulieren, das oral eingenommen worden ist. Wenn ein Mittel oral eingenommen wird, wird es im Dünndarm oder im Dickdarm absorbiert und gelangt in das Blut. Von hier wandert es über die Leberpfortader direkt zur Leber weiter und wird dann im Körper verteilt (27). Folglich ist bei dieser Bauart die Leber das erste Organkompartiment, gefolgt von einer Aufteilung auf ein Kompartiment mit anderen Geweben und einer Kammer für das Zielgewebe. Das Kompartiment mit den anderen Geweben repräsentiert die Verteilung und das Verweilen des Bluts im Körper, das Zielgewebekompartiment stellt das therapeutische Ziel von Interesse dar (z. B. Dickdarmkrebszellen, die einen Tumor des Kolons repräsentieren).
Zusammenfassung
Die Erfindung liefert eine auf Pharmakokinetik beruhende Kulturvorrichtung und Systeme, die normalerweise eine erste Zellkulturkammer, die ein Eingangsende und ein Ausgangsende aufweist, und eine zweite Zellkulturkammer, die ein Eingangsende und ein Ausgangsende aufweist, und eine Rohrleitung, die das Ausgangsende der ersten Zellkulturkammer mit dem Eingangsende der zweiten Zellkulturkammer verbindet, umfasst. Vorzugsweise beruht die Vorrichtung auf einem Chip, d.h. sie weist eine Größe im Mikromaßstab auf. Ein Kulturmedium kann durch die erste Zellkulturkammer, durch die Rohrleitung und durch die zweite Kulturkammer geleitet werden. Das Kulturmedium kann auch an einem oder mehreren Punkten in der Umlaufschleife mit Sauerstoff angereichert werden.
Die Vorrichtung kann eine Einheit für die Übermittlung von Signalen aus Teilen der Vorrichtung zu einer Stelle außerhalb des Chips einschließen, z. B. mit einem Wellenleiter, um Signale aus Teilen der Vorrichtung zu einer Stelle außerhalb des Chips zu übermitteln. Mehrere Wellenleiter können vorhanden sein, z.B. ein erster Wellenleiter, der Signale aus der ersten Kammer übermittelt und ein zweiter Wellenleiter, der Signale aus einer zweiten Kammer übermittelt, und so weiter.
In einer Ausführungsform ist mindestens eine von beiden, die erste Zellkulturkammer oder die zweite Zellkulturkammer, dreidimensional. In einer anderen Ausführungsform sind sowohl die erste Zellkulturkammer als auch die zweite Zellkulturkammer dreidimensional.
Die Vorrichtung, mit der Zellen in einem entwicklungsfähigen bzw. lebensfähigen Zustand erhalten werden, umfasst auch einen Mechanismus zur Verteilung von Flüssigkeit, der ein Durchfluss-Flüssigkeitsverteilungsmechanismus sein kann oder ein Flüssigkeitsverteilungsmechanismus, der die Flüssigkeit im Kreislauf führt. Die Vorrichtung, mit der Zellen in einem entwicklungsfähigen bzw. lebensfähigen Zustand erhalten werden, umfasst auch einen Fließweg, der mindestens das erste Kompartiment und das zweite Kompartiment verbindet. In einer Ausführungsform entfernt ein Debubbler blasen im Fließweg. Die Vorrichtung kann weiterhin einen Pumpenmechanismus umfassen. Der Pumpenmechanismus kann sich auf dem Substrat befinden.
Es wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, um ein Substrat so zu dimensionieren, dass mindestens zwei Arten von Zellen in mindestens zwei Zellkammern in einem entwicklungsfähigen bzw. lebensfähigen Zustand erhalten werden. Das Verfahren umfasst die Schritte der Festlegung der Art der Zellen, die auf dem Substrat gehalten werden sollen, und der Anwendung der Randbedingungen aus einem physiologisch-basierten pharmakokinetischen Modell, um die physikalischen Eigenschaften des Substrates festzulegen. Der Schritt der Anwendung der Randbedingungen aus einem physiologie-basierten pharmakokinetischen Modell umfasst die Festlegung der Art der Kammern, die auf dem Substrat gebildet werden sollen, was auch die Festlegung der Geometrie mindestens einer der Zellkammern und die Festlegung der Geometrie eines Fließweges, der zwei Zellkammern miteinander verbindet, mit einschließen kann. Der Schritt der Anwendung der Randbedingungen aus einem physiologischbasierten pharmakokinetischen Modell kann auch die Festlegung der Zusammensetzung des flüssigen Mediums im Fließweg einschließen.
Alle Publikationen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert wurden, sollen durch Bezugnahme Bestandteil der Beschreibung werden, so als ob für jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln erwähnt wäre, dass sie durch Bezugnahme Bestandteil der Beschreibung werden soll.
Es soll deutlich gemacht werden, dass die oben gegebene Beschreibung veranschaulichend und nicht einschränkend sein soll. Viele andere Ausführungsformen werden für die Fachleute auf dem Gebiet nach der Durchsicht der oben gegebenen Beschreibung offensichtlich sein. Der Umfang der Erfindung sollte folglich durch Bezug auf die beigefügten Ansprüche, einschließlich des vollen ihnen zukommenden Äquivalenzbereichs ermittelt werden.

Claims

Eine Kulturvorrichtung umfassend eine Kammer zur Aufnahme von Zellen, wobei die Kammer mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt, und wobei die Kammer die Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, und wobei die Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 1, der zusätzlich mindestens eine zweite Zellen enthaltende Kammer umfasst, wobei die zweite Kammer mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt, und wobei die zweite Kammer Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, wobei die zweite Kammer einen zweiten Zulauf und einen zweiten Ablauf für den Flüssigkeitsstrom und mindestens einen mikrofluidischen Kanal aufweist, der die erste und zweite Kammer untereinander verbindet, wobei der mikrofluidische Kanal mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 1, die außerdem mindestens einen mikrofluidischen Kanal aufweist, der eine Verbindung zu der Kammer herstellt, wobei der mikrofluidische Kanal mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der die Geometrie der Verbindung der Kammern untereinander den mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert liefert.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der von Anspruch 1 abhängigen Ansprüche, bei der die Kammer ein Kanal bzw. eine Rinne oder eine Röhre bzw. ein Schlauch ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der Flüssigkeitsstrom durch die Kammer den mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert zur Verfügung stellt.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 1, bei der die Geometrie der Kammer auf einem mathematischen Modell basiert.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 4, bei der die Geometrie der Verbindung der Kammern untereinander auf einem mathematischen Modell basiert.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der die charakteristischen Eigenschaften des Flüssigkeitsstroms auf einem mathematischen Modell basieren.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, bei der das mathematische Modell ein physiologisch basiertes pharmakokinetisches („PBPK") Modell ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 7, bei der die Geometrie der Kammer zusätzlich mindestens ein Element aus der Gruppe bestehend aus parallelen Graten und versetzten Säulen aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der die zweite Kammer eine andere Geometrie aufweist als die erste Kammer.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der die Zellen an einer inneren Oberfläche der Kammer befestigt werden.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem ein Teil der Kammer, um die Befestigung der Zellen zu erleichtern, mit mindestens einem Element aus der Gruppe bestehend aus einem Klebeprotein, Kollagen, Polylysin, und MATRIGEL beschichtet ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem eine oder mehrere zusätzliche Kammern aufweist, die eine oder mehrere zusätzliche Art(en) von Zellen enthält bzw. enthalten, unter Bedingungen, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, wobei die eine oder mehrere zusätzliche Kammer(n) einen Zulauf und einen Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom aufweist bzw. aufweisen.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem mindestens einen Sensor für die Aufnahme von Signalen aus kultivierten Zellen aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 16, bei der der mindestens eine Sensor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Biosensor und einem Wellenleiter.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 16 oder 17, bei der der mindestens eine Sensor ein Biosensor ist, der mindestens ein Element aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Kohlendioxid, und pH der Flüssigkeit, überwacht.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, bei dem der mindestens eine Sensor physiologische Ereignisse misst.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 19, bei der die physiologischen Ereignisse ausgewählt sind von mindestens einem Ereignis aus der Gruppe bestehend aus Zelltod, Zellvermehrung, Differenzierung, Immunantwort, oder Störungen im Stoffwechsel oder den Signalübertragungswegen.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 20, bei dem von dem mindestens einen Sensor pharmakokinetische Daten erlangt werden.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 21, bei dem die Sensoren in die Vorrichtung integriert sind und die Ausgabe des physiologischen Zustands der Zellen in Echtzeit ermöglichen.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem die Flüssigkeit enthält.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 23, bei der die Flüssigkeit durch mindestens eine Kammer fließt.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 23, bei der die Flüssigkeit im Kreislauf geführt wird und durch mindestens eine Kammer fließt.
Das Kultursystem gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem der mindestens eine pharmakokinetische Parameter ausgewählt ist von mindestens einem aus der Gruppe bestehend aus dem Verhältnis der Gewebeabmessungen, dem Volumenverhältnis von Gewebe zu Blut, der Verweilzeit des Arzneimittels, der Messung der Wechselwirkungen zwischen Zellen, der Verweilzeit der Flüssigkeit, den Flüssigkeit zu Zellen-Verhältnissen, dem Stoffwechsel der Zellen, der Scherbeanspruchung, der Fließrate, der Geometrie der Kammer, und der Anzahl der Zellen in der Kulturvorrichtung.
Das Kultursystem gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem jede Kammer die Zellen unter Bedingungen hält, die in vitro Werte von mindestens zwei pharmakokinetischen Parametern zur Verfügung stellen, die vergleichbar sind mit mindestens zwei in vivo erhaltenen pharmakokinetischen Parameterwerten.
Die Kulturvorrichtung oder das Kultursystem gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend zusätzlich einen Pumpmechanismus.
Die Kulturvorrichtung oder das Kultursystem gemäß Anspruch 28, worin der Pumpmechanismus eine Auswahl ist von mindestens einem Pumpmechanismus aus der Gruppe bestehend aus einer in die Vorrichtung integrierten Pumpe, einer Pumpe, die sich außerhalb der Vorrichtung befindet, einer peristaltischen Pumpe, einer Diaphragma-Pumpe, oder einer elektromechanischen Mikropumpe.
Die Kulturvorrichtung oder das Kultursystem gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die bzw. das außerdem einen Debubbler aufweist, der sich innerhalb des mikrofluidischen Kanals befindet.
Die Kulturvorrichtung oder das Kultursystem gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die bzw. das außerdem einen Debubbler umfasst, der sich außerhalb der Vorrichtung befindet.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung mittels Mikrostrukturtechnik hergestellt ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung aus einer mittels Mikrostrukturtechnik hergestellten Vorlage bzw. einem mittels Mikrostrukturtechnik hergestellten Vorstück hergestellt wird.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der mindestens eine der Kammern ein dreidimensionales Wachstum von Zellen ermöglicht.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der mindestens eine der Kammern eine Vielzahl von Zellen enthält.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der die Zellen ausgewählt sind von mindestens einem Element aus der Gruppe bestehend aus gesundem Gewebe, krankem Gewebe, einem Quantum einer Gewebebiopsie, einem Quantum eines Gewebes, einem Teil einer Arterie, einem Teil einer Vene, einem Teil eines Gastrointestinaltrakts, einem Teil einer Speiseröhre, einem Teil eines Ko lons, einem Teil eines Organs, einem Teil eines Herzens, einem Teil eines Gehirns, einem Teil einer Niere, einem Teil einer Lunge, einem Teil eines Muskels, einer eukaryotischen Zelle, einer Pflanzenzelle, einer Tierzelle, einer Säugetierzelle, einer prokaryotischen Zelle, einer Primärzelle, einer Tumorzelle, einer Stammzelle, einer genetisch veränderten Zelle, einer transformierten Zelle, und einer immortalisierten Zelle.
Die Kulturvorrichtung oder das Kultursystem gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, worin mindestens eine der Kammern zirkulierende oder anhaftende Zellen enthält.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der die Kammer aus einem Material gebildet ist, das aus der Gruppe bestehend aus einem Kunststoff und Silizium ausgewählt ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 38, bei dem der Kunststoff mindestens ein Kunststoff aus der Gruppe bestehend aus Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Polycarbonat, Polytetrafluorethylen, Polyvinylchlorid, Polydimethylsiloxan und Polysulfon ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem eine an den ersten Zulauf angeschlossene Pumpe aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 2, die außerdem eine an den zweiten Ablauf und den ersten Zulauf angeschlossene Pumpe aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der die Geometrie der Kammer Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, der in Zusammenhang mit der Funktion eines Teils eines lebenden Körpers steht, und eine Pumpe für das Umwälzen von Flüssigkeiten.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 2, bei der die Geometrie der Verbindung der Kammern untereinander Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, der in Zusammenhang mit der Funktion eines Teils eines lebenden Körpers steht, und eine Pumpe für das Umwälzen von Flüssigkeiten.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der mindestens eine Kammer Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, der in Zusammenhang mit der Wechselwirkung der Flüssigkeit mit mindestens zwei Elementen aus der Gruppe bestehend aus Leber, Lunge, einen Bereich von langsam durchströmender Flüssigkeit, Fett, und einen Bereich von schnell durchströmender Flüssigkeit.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem eine Kontrollvorrichtung aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 45, bei der die Kontrollvorrichtung eine Pumpe kontrolliert, um in mindestens einer Kammer Verweilzeiten für Flüssigkeiten zu erzeugen, die denen in einem oder mehreren Teilen des lebenden Körpers vergleichbar sind.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 oder 46, die außerdem Ventile bzw. Klappen aufweist, die entlang mindestens einer Leitung für Flüssigkeiten angeordnet sind, und wobei die Kontrollvorrichtung die Ventile bzw. Klappen kontrolliert, um pharmakokinetische Parameterwerte, die mit der Funktion mindestens eines Teils des lebenden Körpers in Zusammenhang stehen, zu erzeugen.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 47, bei der die Kammer auf einem Substrat gebildet ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 48, bei der die Kontrollvorrichtung elektronisch mit dem Substrat verbunden ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 48, bei der die Kontrollvorrichtung mit einem oder mehreren Sensor(en) verbunden ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 45 bis 50, die außerdem eine pharmakokinetische Parameterwerte, die mit der Funktion mindestens eines Teils des lebenden Körpers in Zusammenhang stehen, enthaltende Nachschlagetabelle für die Nutzung durch die Kontrollvorrichtung aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 2, umfassend: eine Pumpe; mindestens zwei Kammern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Leberkammer, die Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, der in Zusammenhang mit einer Leber steht, einer langsam perfundierten Kammer, einer rasch perfundier ten Kammer, und einer Fettkammer, die Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, der in Zusammenhang mit der Funktion von Fett steht; und eine Vielzahl von mikrofluidischen Kanälen, die die Pumpe und die mindestens zwei Kammern in serieller oder paralleler Weise miteinander verbinden.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem ein Array von Kulturvorrichtungen umfasst, in dem die Vorrichtungen unabhängig voneinander und parallel zueinander arbeiten.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, außerdem umfassend eine Reihe von durch Flüssigkeitsströme miteinander verbundenen Vorrichtungen, wobei ein Flüssigkeitsablauf einer ersten Vorrichtung direkt oder indirekt mit mindestens einem Flüssigkeitszulauf zu einer oder mehreren zweiten Vorrichtung(en) verbunden ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 54, bei der die Reihe von durch Flüssigkeitsströme miteinander verbundenen Vorrichtungen außerdem Flüssigkeitsabflüsse von der einen oder den mehreren zweiten Vorrichtung(en) zu mindestens einem Flüssigkeitszulauf einer oder mehrerer zusätzlicher Vorrichtung(en) aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 53 bis 54, bei der die Vorrichtungen miteinander verbunden sind, um biologische Barrieren zu simulieren.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 56, bei der die biologischen Barrieren gastro-intestinale Schranken oder die Blut-Gehirn-Schranke sind.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 53 bis 57, bei der die Anzahl der Vorrichtungen größer ist als ungefähr 10.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem ein Gehäuse zum Umhüllen bzw. Verkapseln der Kulturvorrichtung aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, die außerdem ein an die Kulturvorrichtung angeschlossenes Kontrollinstrument umfasst, wobei das Kontrollinstrument einen Computer für das Sammeln von Daten aus der Kulturvorrichtung und die Kontrolle von pharmakokinetischen Parametern der Kulturvorrichtung aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 60, wobei die Kulturvorrichtung auf einem Chip ausgebildet ist, der außerdem elektronische Schaltkreise aufweist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 60 oder 61, bei der das Kontrollinstrument die Kulturvorrichtung enthält und ein oberes Ende der Kulturvorrichtung verschließt bzw. abdichtet, um einen mikrofluidischen Kanal zu schaffen.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 60 bis 62, bei der das Kontrollinstrument außerdem mindestens ein Element aus der Gruppe bestehend aus einer Pumpe zur Kontrolle der Zirkulation der Flüssigkeit in der Kulturvorrichtung, einem Heizinstrument zur Kontrolle der Temperatur der Kulturvorrichtung, einer Lichtquelle, und einem Fotode tektor für die Detektion fluoreszenter Strahlung aus Zellen innerhalb der Kulturvorrichtung umfasst.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 63, bei der ein Computer außerdem Daten über die Intensität der Fluoreszenz aufzeichnet.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 64, bei der der Computer Daten über die Intensität der Fluoreszenz aufzeichnet unter Verwendung mindestens eines Messinstruments eines Typs, der ausgewählt ist von mindestens einem Messinstrument aus der Gruppe bestehend aus colorimetrischen, fluorometrischen, Lumineszenz messenden und radiometrischen Messinstrumenten.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 63 bis 65, worin das Heizelement die Kulturvorrichtung bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius hält.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 63 bis 66, bei der der Computer einen pharmakokinetischen Parameter kontrolliert, der ausgewählt ist von mindestens einem Parameter aus der Gruppe bestehend aus Pumpengeschwindigkeit, Temperatur, Dauer des Experiments und Häufigkeit der Datensammlung der Kulturvorrichtung.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 63 bis 67, bei der der Computer einen pharmakokinetischen Parameter kontrolliert, der ausgewählt ist von mindestens einem Parameter aus der Gruppe bestehend aus Fließrate, Kammergeometrie und der Anzahl der Zellen in der Kulturvorrichtung.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 63 bis 68, bei der der Computer außerdem eine oder mehrere Pumpen in der Kulturvorrichtung kontrolliert, um den mindestens einen pharmakokinetischen Wert zur Verfügung zu stellen.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 63 bis 69, bei der der Computer außerdem eine oder mehrere Ventile oder Klappen, die entlang des mikrofluidischen Kanals verteilt sind, in einer Weise kontrolliert, die mit einem pharmakokinetischen Parameterwert, der in Zusammenhang mit einem Teil eines lebenden Körpers steht, konsistent ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei der die Flüssigkeit ausgewählt ist von mindestens einer Flüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus einem Kulturmedium, einer biologischen Flüssigkeit, Blut, Serum und Plasma.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, umfassend außerdem einen Computer, wobei der Computer einen Mikroprozessor enthält; einen allgemeinen Speicher, ein nicht flüchtiges Speicherelement; eine Schnittstelle für Eingabe und Ausgabe, die eine Schnittstelle zu der mikroskaligen Kulturvorrichtung, die einen oder mehrere Sensoren enthält, aufweist; und auf dem Mikroprozessor ausführbare Computer-Software für die Analyse von Sensordaten, um physiologische Ereignisse in einer Vielzahl von Kammern der Kulturvorrichtung zu messen, die Fließraten eines Kulturmediums in den Kammern der Kulturvorrichtung zu regulieren, biologische oder toxikologische Reaktionen in den Kammern der Kulturvorrichtung zu detektieren und nach der Detektion einen oder mehrere pharmakokinetische Parameter der im Mikromaßstab ausgeführten Kulturvorrichtung zu verändern.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 72, bei der der Computer in Reaktion auf die Daten einen oder mehrere pharmakokinetische Parameter der Kulturvorrichtung verändert.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 72, bei der das nicht flüchtige Speicherelement aus veröffentlichten Informationen entnommene historische Daten, aus früheren Testläufen gewonnene Daten, oder aus theoretischen Berechnungen abgeleitete Daten enthält.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 72 bis 74, bei der die Computer-Software die Fließraten der Flüssigkeit reguliert, indem über Pumpen-Kontrollleitungen Befehle an eine oder mehrere Pumpen der Kulturvorrichtung übermittelt werden.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 72 bis 75, bei der die Computer-Software außerdem auf dem Mikroprozessor ausführbar ist, um eine Temperatur der Flüssigkeit zu regulieren.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 76, bei der die Computer-Software die Temperatur reguliert, indem über Heizschlangen-Kontrollleitungen Befehle an eine Heizschlange der Kulturvorrichtung übermittelt werden.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 72 bis 77, die außerdem mindestens ein Element aus der Gruppe bestehend aus einem Speicher für eine Nachschlagetabelle zum Speichern eines Satzes von Massebilanzgleichungen, die physiologisch-basierte pharmakokinetische Modelle für verschiedene biologische oder chemische Substanzen in dem System repräsentieren, und einem an den Mikroprozessor angeschlossenen Cache-Speicher zum Speichern von Computer-Software.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 72 bis 78, bei der die Schnittstelle für Eingabe und Ausgabe mindestens eine Schnittstelle aus der Gruppe bestehend aus einer Tastatur-Schnittstelle, einer Anzeige-Schnittstelle und einer Aufzeichnungs-Schnittstelle ist.
Die Kulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 79, bei der der mindestens eine pharmakokinetische Parameterwert in vitro nicht mehr als 25% von einem theoretischen Wert abweicht.
Die Kulturvorrichtung gemäß Anspruch 26, bei der die Scherbeanspruchung im Wesentlichen 8–14 dyn pro cm² beträgt.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Kulturvorrichtung, wobei das Verfahren die Herstellung einer Kammer zur Aufnahme von Zellen umfasst, wobei die Kammer mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt, und wobei die Kammer die Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit Wert mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, und wobei die Kammer einen Zulauf und einen Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom aufweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, das außerdem die Herstellung einer zweiten Kammer zur Aufnahme von Zellen umfasst, wobei die zweite Kammer mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt, und wobei die zweite Kammer Zellen unter Bedingungen hält, die mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert in vitro zur Verfügung stellen, der vergleichbar ist mit mindestens einem in vivo gefundenen pharmakokinetischen Parameterwert, wobei die zweite Kammer einen zweiten Zulauf und einen zweiten Ablauf für einen Flüssigkeitsstrom aufweist, und die Herstellung eines mikrofluidischen Kanals umfasst, der die erste und die zweite Kammer untereinander verbindet, wobei der mikrofluidische Kanal mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, das außerdem die Herstellung mindestens eines mikrofluidischen Kanals umfasst, der an die Kammer angeschlossen ist, wobei der mikrofluidische Kanal mindestens eine innere Querschnittsabmessung aufweist, die zwischen 0,1 μm und 500 μm beträgt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 84, bei der die Geometrie der Verbindung der Kammern untereinander so ausgebildet ist, dass sie den mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert zur Verfügung stellt.
Das Verfahren gemäß einem von Anspruch 82 abhängigen Anspruch, bei dem die Kammer als ein Kanal bzw. eine Rinne oder eine Röhre bzw. ein Schlauch ausgebildet wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, bei dem der Flüssigkeitsstrom durch die Kammer den mindestens einen pharmakokinetischen Parameterwert zur Verfügung stellt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, bei dem die Geometrie der Kammer basierend auf einem mathematischen Modell ausgestaltet wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 85, bei dem die Geometrie der Verbindung der Kammern untereinander auf einem mathematischen Modell basiert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 82 bis 89, bei dem der Flüssigkeitsstrom auf einem mathematischen Modell basiert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 88 bis 90, bei dem das mathematische Modell ein physiologisch-basiertes pharmakokinetisches („PBPK") Modell ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, bei dem außerdem in der Kammer mindestens ein Element aus der Gruppe bestehend aus parallelen Graten und versetzten Säulen ausgebildet wird.
Das Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem außerdem die Zellen an einer inneren Oberfläche der Kammer mit mindestens einem Element aus der Gruppe bestehend aus einem Klebeprotein, Kollagen, Polylysin, und MATRIGEL befestigt werden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, bei dem die Kammer durch Einprägen, Spritzguss, oder Prägen bzw. Stanzen geformt wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 82 bis 94, das außerdem die Polymerisation von Oberflächen der Kammer umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 95, bei dem polymere Materialien auf der Oberfläche der Kammer oder des Kanals für eine Verbesserung der Lenkung der Flüssigkeit, der Zellbefestigung oder der zellulären Segregation sorgen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, das außerdem das in Kontakt bringen der Zellen mit einer Eingangsgröße und die Überwachung mindestens eines Ausgabeparameters umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 97, bei dem der Schritt der Überwachung des mindestens einen Ausgabeparameters das Beschaffen von Informationen von mindestens einem Sensor in der Vorrichtung mit einschließt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 97 oder 98, bei dem die Eingangsgröße ausgewählt ist von mindestens einem Element der Gruppe bestehend aus einer organischen Verbindung, einer anorganischen Verbindung, einer komplexen Probe, einer pharmazeutischen, der Umwelt entnommenen Probe, einer Nahrungsmittelprobe, einem Konsumartikel bzw. einem Endprodukt, einem Virus, Liposom, Nanopartikel, biologisch abbaubaren Polymer, radioaktiv markierten Teilchen oder Toxin, Biomolekül, einem mit einem Toxin konjugiertem Teilchen, und einem Stabilisierungsmittel.
Das Verfahren gemäß Anspruch 99, bei dem das Stabilisierungsmittel ausgewählt ist von mindestens einem Stabilisierungsmittel aus der Gruppe bestehend aus Albumin, Polyethylenglykol, Poly(ethylen-co-vinylacetat), oder Poly(lactid-co-glycolid).
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, das außerdem die Bereitstellung von Zellen umfasst, die ein biologisches Produkt erzeugen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 101, bei dem die Zellen eine Wirtszelle umfassen, die gentechnisch modifiziert wurde, um ein Produkt eines exogenen Gens herzustellen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 101, bei dem das biologische Produkt ein Wachstumsfaktor, ein regulierender Faktor, ein Peptidhormon oder ein Antikörper ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 101, das außerdem die Abtrennung des biologischen Produkts aus der Flüssigkeit mit Hilfe einer üblichen Isolationsmethode umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 104, bei dem die Isolationsmethode HPLC, Säulenchromatographie oder Elektrophorese ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, das außerdem ein computergestütztes Verfahren zur dynamischen Kontrolle der Kulturvorrichtung umfasst, wobei das computergestützte Verfahren eine Auswahl ist von mindestens einem Verfahren aus der Gruppe bestehend aus: Analyse von Daten von einer Vielzahl von Sensoren, um physiologische Ereignisse in einer Vielzahl von Kammern der Kulturvorrichtung zu messen; Regulieren der Fließraten einer Flüssigkeit in den Kammern der Kulturvorrichtung; Detektieren von biologischen oder toxikologischen Reaktionen in den Kammern der Kulturvorrichtung; und Verändern eines oder mehrerer pharmakokinetischer Parameter(s) der Kulturvorrichtung.
Das Verfahren gemäß Anspruch 82, das außerdem ein computer-lesbares Medium umfasst, das darauf gespeicherte von einem Computer ausführbare Anweisungen enthält, um ein Verfahren durchzuführen, das mindestens ein Verfahren umfasst aus der Gruppe bestehend aus: Analyse von Daten von einer Vielzahl von Sensoren, um physiologische Ereignisse in einer Vielzahl von Kammern der Kulturvorrichtung zu messen; Regulieren der Fließraten einer Flüssigkeit in den Kammern der Kulturvorrichtung; Detektieren von biologischen oder toxikologischen Reaktionen in den Kammern der Kulturvorrichtung; und Verändern eines oder mehrerer pharmakokinetischer Parameter(s) der Kulturvorrichtung.
Das Verfahren gemäß Anspruch 106 oder 107, bei dem die Detektion die Detektion einer Größenveränderung der Kammer einschließt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 106 bis 108, bei dem die Veränderung die Veränderung mindestens eines pharmakokinetischen Parameters umfasst, der ausgewählt ist von mindestens einem Parameter aus der Gruppe bestehend aus Wechselwirkungen zwischen Zellen, Verweilzeit der Flüssigkeit, Flüssigkeit zu Zellen-Verhältnisse, Stoffwechsel von Zellen, und Scherbeanspruchung in der Kulturvorrichtung.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 106 bis 108, bei dem die Veränderung die Veränderung eines pharmakokinetischen Parameters umfasst, der ausgewählt ist von mindestens einem Parameter aus der Gruppe bestehend aus Fließrate, Kammergeometrie, und der Anzahl von Zellen in der Kulturvorrichtung.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 106 bis 110, bei dem das Verfahren außerdem die Optimierung der Geometrie der Kammern innerhalb der Kulturvorrichtung umfasst, und wobei die Optimierung mindestens einen Schritt aus der Gruppe bestehend aus Auswahl einer Anzahl von Kammern, Auswahl einer Kammergeometrie, die ein geeignetes Größenverhältnis für Gewebe oder Organe bereitstellt, Auswahl einer optimalen Fließrate, die eine angemessene Verweilzeit der Flüssigkeit bewirkt, und Berechnung einer Scherbelastung in der Kultvorrichtung einschließt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 106 bis 111, bei dem das Verfahren außerdem das Regulieren einer Temperatur der Flüssigkeit umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 106 bis 112, bei dem das Verfahren außerdem die Detektion von fluoreszenten Emissionen aus der Kammer umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 82 bis 113, bei dem der mindestens eine pharmakokinetische Parameterwert in vitro nicht mehr als 25% von einem theoretischen Wert abweicht.
Das Verfahren gemäß Anspruch 111, bei dem die Scherbeanspruchung im Wesentlichen 8–14 dyn pro cm² beträgt.