DE60222427T2 - Puffer-arrays zum nachweis von biomolekülen anhand ihres isoelektrischen punktes - Google Patents

Puffer-arrays zum nachweis von biomolekülen anhand ihres isoelektrischen punktes Download PDF

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    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren zur Präparierung, Sortierung, Konzentrierung oder Analyse von Biomolekülen auf der Basis einer eindimensionalen Auftrennung nach ihren isoelektrischen Punkten in einem elektrischen Feld, gegebenenfalls gefolgt von einer zweiten Analysetechnik in einer zweiten Dimension, sowie Anwendungen für diese.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das grundlegende Prinzip der isoelektrischen Fokussierung oder der Fokussierung in einem pH-Gradienten besteht darin, dass ein geladenes Molekül in einem elektrischen Feld immobilisiert wird, wenn es zu einer Position im pH-Gradienten wandert, die seinem isoelektrischen Punkt (Nettoladung Null) entspricht. Dieser Prozess läuft unabhängig von der anfänglichen Position eines spezifischen Proteins in der Lösung ab. Er resultiert aus dem Verschwinden einer effektiven elektrischen Ladung des Proteins, wenn es in den Bereich wandert, wo der pH gleich dem pI ist.
  • Es sind verschiedene Techniken zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes eines Proteins beschrieben worden. Typischerweise wird das interessierende Protein direkt in ein Gel, das einen pH-Gradienten enthält, injiziert oder eingebracht, wobei der pH-Gradient parallel zur Richtung des elektrischen Feldes verläuft, und das Protein kann lediglich dadurch von anderen Proteinen abgetrennt werden, dass es in einer Richtung durch viele verschiedene pH-Umgebungen wandert, ehe es eine pH-Umgebung erreicht, die seinem isoelektrischen Punkt äquivalent ist. Diese Techniken leiden unter den Nachteilen, dass 1) sie eine relativ lange Zeit für die Abtrennung des Proteins erfordern, da die Geschwindigkeit der Fraktion dazu neigt, asymptotisch gegen null zu gehen, 2) sie relativ hohe Spannungen erfordern (typischerweise 1000 V oder mehr) und 3) sie einen Kühlmechanismus erfordern. Die herkömmlichen IEF-Verfahren sind arbeitsintensiv, zeitaufwendig, nicht standardisiert, teuer und nicht empfindlich. Eine andere praktische Einschränkung herkömmlicher Gele zur isoelektrischen Fokussierung besteht darin, dass es schwierig ist, Gele herzustellen, die inkrementell kleine pH-Veränderungen in einem pH-Gradienten zur Verbesserung der linearen Verteilung der Proteine aufweisen.
  • Die zweidimensionale Analyse von Proteinen, die den oben beschriebenen Schritt der isoelektrischen Fokussierung einsetzt, leidet unter den gleichen Problemen. Zum Beispiel beschreiben Zuo et al. (2000), Analytical Biochemistry 284: 266-278, die Auftrennung von Proteinen auf der Basis ihrer isoelektrischen Punkte durch die unidirektionale Wanderung durch einen pH-Bereich gefolgt von einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Becker et al. (1998), J. Micromech. Microeng. 8: 24-28, schlagen die unidirektionale Wanderung von Proteinen durch einen pH-Bereich gefolgt von einer Auftrennung in der zweiten Dimension auf einem planaren Chip vor. Siehe auch US 6 254 754 (Ross).
  • Aufgrund dieser Einschränkungen sind nur bestimmte Konstruktionen der Zellen, Spuren und der Matrix sowie Orientierungen der Zellen, Spuren und Matrizes in einer Klammer und bestimmte Systeme für die ein- und zweidimensionale Analyse möglich, wodurch die Entwicklung schnellerer, empfindlicherer, genauerer, flexiblerer und weniger teurer Verfahren für die ein- und zweidimensionale Analyse von Proben, einschließlich von automatisierten Systemen für eine High-Throughput-Analyse, eingeschränkt wird. Bessere Werkzeuge und Verfahren für die ein- und zweidimensionale Analyse von Biomolekülen sind z. B. für die Arzneimittelentwicklung, die medizinische Forschung und die Früherkennung und/oder Diagnose von Erkrankungen nützlich. Insbesondere werden bessere Werkzeuge und Verfahren für die Proteomanalyse benötigt. Die vorliegende Erfindung löst diese und andere Probleme.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es sind Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren zur Analyse oder Präparierung von Biomolekülen über ihren elektrischen Punkt in einer Dimension und gegebenenfalls in Kombination mit anderen Analyseverfahren entwickelt worden. Die Arrays enthalten Kammern oder Zellen, in denen Biomoleküle über die Wanderung durch einen und in einem Puffer für die isoelektrische Fokussierung („IEF") isoliert werden können. Der pH-Bereich des IEF-Puffers kann ultra-eng sein (z. B. 0,1 pH-Einheiten oder weniger, 0,02 pH-Einheiten oder weniger oder 0,01 pH-Einheiten oder weniger abdecken). Gemäß einer Ausführungsform wandert ein Biomolekül durch den Laufpuffer einer Kammer und wird in einem IEF-Puffer in der Kammer oder in einer Zelle, die einen IEF-Puffer umfasst, gefangen. Biomoleküle mit pI-Werten, die nicht den pH-Werten des IEF-Puffers entsprechen, werden durch das Wechseln der Richtung des elektrischen Feldes entfernt. Wenn die Kammer oder die Zelle geschlossen ist, sodass der elektrische Strom daran gehindert wird, aus dem Ende, das seinem Eintritt in den IEF-Puffer oder in die Zelle gegenüberliegt, auszutreten, dann ist das elektrische Feld gemäß einer bevorzugten Ausführungsform reversibel. Wenn die Kammer oder Zelle offen ist, dann kann das elektrische Feld unidirektional sein.
  • Die Bewegung des Biomoleküls im Laufpuffer kann durch die vom elektrischen Feld erzeugte Konvektionswärme erhöht werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Wanderung des Biomoleküls im Laufpuffer durch eine Vorrichtung erhöht, die den Laufpuffer, der die Biomoleküle umfasst, quer zum IEF-Puffer zirkuliert (z. B. über einen Rührstab, eine Pumpe oder über die Bewegung des IEF-Puffers relativ zum Laufpuffer).
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die Kammer, die den Laufpuffer enthält, eine Vielzahl von IEF-Puffern und/oder Zellen, die voneinander entweder über eine physikalische Trennung oder durch ein Substrat, das die Wanderung von Biomolekülen direkt aus einem IEF-Puffer/einer Zelle in einen anderen bzw. eine andere statt über den Laufpuffer im Wesentlichen verhindert, isoliert. Das Biomolekül wandert in erster Linie durch den Laufpuffer, bis es einen anderen IEF-Puffer oder eine andere Zelle erreicht. Bei einer weiteren Ausführungsform haben die IEF-Puffer oder die Zellen den gleichen pH-Wert oder unterschiedliche pH-Werte. Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Vorrichtung eine Vielzahl diskreter isolierter IEF-Puffer mit ultra-engen, im Wesentlichen nicht-überlappenden pH-Bereichen, sodass das resultierende Bild des aufgetrennten Materials bezüglich der Positionen dem Bild eines herkömmlichen IEF-Gels entspricht, aber eine bessere Auflösung, als ein herkömmliches IEF-Gel aufweist.
  • Die Biomoleküle können als einzelne Einheit oder als Teil eines Komplexes auf der Basis ihres isoelektrischen Punktes aufgetrennt werden. Zum Beispiel kann das Biomolekül („Zielbiomolekül") einen Komplex mit einem anderen Molekül bilden, das es spezifisch erkennt („Zielerkennungsmolekül"). Der Komplex kann von anderen, nicht komplexierten Biomolekülen auf der Basis des isoelektrischen Punktes des Komplexes abgetrennt werden. Es werden ein- oder zweidimensionale Analyseverfahren, die eine Vielzahl diskreter isolierter IEF-Puffer mit engen pH-Bereichen und -Stufen, zum Beispiel von 0,1 pH-Einheiten oder weniger, bereitgestellt. Bevorzugter umfasst der pH-Bereich oder die pH-Stufe 0,02 pH-Einheiten oder weniger für die Analyse von Biomolekülen mit pI-Werten, die 0,02 pH-Einheiten oder weniger auseinander liegen. Das vermeidet die Diffusion des Biomoleküls aus einer Zelle in eine angrenzende Zelle, z. B. zwischen Zellen, die IEF-Puffer mit leicht unterschiedlichen pH-Werten umfassen, indem Membranen oder Materialien verwendet werden, die für das Biomolekül impermeabel sind. Jeder IEF-Puffer oder jede Zelle, die den IEF-Puffer umfasst, kann eine physikalisch abgetrennte, nicht-kontinuierliche diskrete Einheit sein.
  • Es ist ein Analyseverfahren entwickelt worden, das den Einsatz eines starken elektrischen Feldes bei einer niedrigen angelegten Spannung ermöglicht, gegebenenfalls unter Vermeidung des Einsatzes einer Stromversorgung im kV-Bereich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vorrichtung für das reversible Lenken eines elektrischen Feldes in den IEF-Puffer in den Zellen und aus diesen heraus sowie, gegebenenfalls, eine Vorrichtung zur Umwälzung des Puffers um eine Vielzahl von Zellen herum gleichzeitig in den Verfahren und Systemen angesetzt. Es wird auch ein Analyseverfahren bereitgestellt, das nur eine kleine oder gar keine Vorrichtung für das Kühlen der Kammer erfordert. Die zweidimensionale Matrix erfordert nur eine minimale oder gar keine Manipulation des Biomoleküls während der Auftrennungen in der ersten und der zweiten Dimension, wodurch Zeit und Arbeit gespart werden und der Verlust an getestetem Biomolekül minimiert wird.
  • Eine weitere Ausführungsform stellt eine IEF-Technik bereit, die für den Einsatz in Kombination mit einem zweiten Analyseverfahren (z. B. Hochdruck-Flüssigchromatografie (HPLC), Massenspektrometrie, Affinitätschromatografie, Gelelektrophorese etc.) geeignet ist.
  • Die Systeme und Verfahren sind für die Auftrennung und/oder Reinigung kleiner oder großer Mengen eines spezifischen Biomoleküls, wie eines Protein- oder Nucleinsäuremoleküls, geeignet. Es werden auch Verfahren zum Nachweis eines Zielbiomoleküls („ZB"), das durch ein Zielerkennungsbiomolekül („ZEB") komplexiert ist, bereitgestellt. Das Zielbiomolekül kann einen Komplex mit dem ZB in Umgebungen bilden, die die Komplexbildung fördern oder behindern. Bei einer Ausführungsform wird ein markiertes Zielerkennungs-Biomolekül direkt in die Zelle, die Spur oder die Matrix mit dem IEF-Puffer gegeben, ehe die Probe, die das Zielmolekül enthält, zugegeben wird.
  • Diese Systeme und/oder Verfahren für die ein- oder zweidimensionale Analyse können miniaturisiert werden und für die High-Throughput-Analyse von Proben für ein Arzneimittelscreening, die medizinische Forschung, wie die verbesserte Erkennung biologischer Reaktionsmuster für die Arzneimittelentwicklung, die Überwachung von Arzneimitteltherapien, die genetische oder die Proteomanalyse und die klinische Diagnose sowie für diagnostische Zwecke, z. B. die Proteomanalyse, automatisiert werden. Das System kann so konstruiert werden, dass es automatisch zusammenwirkende Komponenten aufweist, zum Beispiel Titratoren zur Auffüllung der Kanäle mit pH-Lösungen oder -Gelen (Immobilinen, Ampholyt-Mischungen etc.), Extraktoren zur Gewinnung von Biomolekülen aus den die IEF-Puffer enthaltenden Zellen, Vorrichtungen zur Färbung der Biomoleküle, Vorrichtungen zum Nachweis und Scannen der Biomoleküle und Vorrichtungen zur Aufnahme und Analyse der Bilder. Das System und/oder Verfahren kann für das High-Throughput-Screening von Kandidaten, die für eine gewünschte Arzneimittelwirkung nützlich sind, automatisiert werden.
  • Das System dieser Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung des Nachweises von Biomolekülen bei der Reaktion auf verschiedene Störungen und Stimuli, wie die Reaktion auf ein Arzneimittel, einen Arzneimittelkandidaten oder eine experimentelle Bedingung, die so gewählt ist, dass sie bestimmte biologische Wege testet, sowie von Veränderungen, die einer bestimmten Krankheit oder einem bestimmten Krankheitszustand oder einer Behandlung einer bestimmten Krankheit oder eines bestimmten Krankheitszustands entsprechen, in einem Tier oder Menschen bereit.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt (A) eine Zelle, die einen IEF-Puffer enthält und eine Protein- und Ionen-permeable Membran an den gegenüberliegenden Seiten der Zelle aufweist, und (B) eine Matrix, die eine Vielzahl von Zellen umfasst.
  • 2 zeigt eine Apparatur, die zwei Elektrodenplatten auf den beiden Seiten einer Zelle umfasst, und eine Matrix, die eine Vielzahl von Zellen zwischen den Elektroden umfasst. Die Kammer sitzt auf einem Magnetrührer. Die Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
  • 3 zeigt eine Apparatur, die eine Matrix umfasst, die über der Unterseite der Kammer zwischen zwei Elektrodenplatten gehalten wird, wobei der Laufpuffer mithilfe des Rührstabs um die Matrix herum fließen kann. Die Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
  • 4 zeigt eine Apparatur, bei der die Matrix rotiert, um das Biomolekül im Laufpuffer über die Öffnungen der Zelle zu verteilen. Gegebenenfalls kann die Kammer auch einen Rührstab für die Umwälzung des Laufpuffers aufweisen. Die Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
  • 5 zeigt drei Apparaturen: A, bei der eine Vielzahl von Zellen einzeln und zufällig auf einem isolierten Träger im Laufpuffer in der Kammer und zwischen zwei Elektrodenplatten montiert ist, B, bei der eine Vielzahl von Zellen frei in der Kammer zwischen zwei Elektrodenplatten schwimmt, und C, bei der eine Vielzahl von Zellen aneinander befestigt ist und zwischen zwei Elektrodenplatten rotiert. Ein Rührstab wird zur Umwälzung des Laufpuffers eingesetzt. Die Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
  • 6 zeigt eine Aufsicht auf eine Kammer, die eine Vielzahl von Zellen umfasst, die in einer Reihe hintereinanderliegen, getrennt von Membranen, die den in jeder Zelle vorliegenden pH-Bereich im Wesentlichen aufrecht halten, und die A) parallel oder B) senkrecht zur Richtung des elektrischen Feldes angeordnet sind. Ein Rührstab wird zur Umwälzung des Laufpuffers eingesetzt. Die Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
  • 7 zeigt, wie ein Biomolekül in den Zellen einer Matrix einer SDS-PAGE-Kapillarelektrophorese in einer zweiten Dimension unterzogen wird.
  • 8 zeigt eine Matrix, bei der die Zellen in einer linearen Reihe ausgerichtet werden können, sodass sie an einem SDS-Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese in einer zweiten Dimension befestigt werden können.
  • 9 zeigt eine Matrix, die aus einem Agarosegel mit Kanälen besteht, die eine Vielzahl von IEF-Puffern umfassen. Jede vertikale Reihe aus Kanälen enthält den gleichen IEF-Puffer, außer der Reihe von Kanälen, die keinen Puffer enthalten. Ferritin, Phycocyanin (erste Bande), Phycocyanin (zweite Bande) und Hämoglobin akkumulierten in der ersten, zweiten, dritten bzw. fünften senkrechten Reihe.
  • 10 ist ein Bild eines Chips, der für die Analyse von drei Zielbiomolekülen in einer Probe konstruiert wurde. Jeder IEF-Puffer in jeder Zelle des Chips in der ersten, zweiten und dritten Reihe hat einen pH, der gleich dem pI der Komplexe ist, die verschiedene ZBs/ZEMs umfassen, z. B. ZB1/ZEM1, ZB2/ZEM2 oder ZB3/ZEM3. Die vierte Reihe umfasst Zellen, die so ausgelegt sind, dass sie Moleküle, die keine ZB sind und die dem Laufpuffer als Kontrolle, als Standard oder als Datenpunkt für die Erstellung einer Eichkurve zugesetzt wurden, aufnehmen. Demgemäß haben die IEF-Puffer in der vierten Reihe einen pH-Wert, der gleich dem pI-Wert des Biomoleküls ist, das kein ZB ist.
  • 11 ist ein Bild einer Kammer, die einen Chip mit mehreren Zellen umfasst, der zwischen zwei Elektrodenplatten angeordnet ist. Die Kammer kann an eine Stromversorgung angeschlossen werden, die in der Lage ist, die Polarität des elektrischen Feldes umzukehren. Die Kammer kann ferner einen Mechanismus oder Mechanismen zum Rühren des Laufpuffers in beiden Kompartimenten auf den beiden Seiten des Chips aus mehreren Zellen umfassen.
  • 12 ist ein Bild einer Nachweisvorrichtung für einen Chip aus mehreren Zellen. Nachdem ein Komplex oder mehrere Komplexe in einer Vielzahl der Zellen des Chips angekommen ist bzw. sind, kann der Chip in eine Vorrichtung für einen Nachweis gegeben werden. Fluoreszenzmarkierte Komplexe in einem Chip mit mehreren Zellen können für den Nachweis durch eine Lichtquelle (zum Beispiel eine monochromatische Lichtquelle) angeregt werden, dann kann das von der Markierung ausgesandte Licht von einer Fotodiode registriert werden, in ein elektrisches Signal (Ausgabeeinheit) umgewandelt werden und mittels eines Computers analysiert werden. Der Chip kann in einer Halterung eingeschlossen sein, deren Position bezüglich der Lichtquelle oder der Diode verändert werden kann. Alternativ kann die Position der Lichtquelle oder der Diode relativ zum Chip verändert werden.
  • 13 ist eine grafische Darstellung der Extinktion des Hämoglobins bei 610 nm für unterschiedliche Konzentrationen. Jeder Datenpunkt repräsentiert einen Extinktionsmesswert, der mittels einer Standardküvette mit rechteckiger Form erhalten wurde, die mit Lösungen mit unterschiedlichen Hämoglobinkonzentrationen gefüllt war.
  • 14 ist eine grafische Darstellung einer Eichkurve für eine Blutprobe, die auf Diabetes getestet wurde. Die X-Achse ist das Verhältnis zwischen der molaren Konzentration des glykierten Hämoglobins und der Summe aus der molaren Konzentration des glykierten und des nicht-glykierten Hämoglobins, ausgedrückt als Prozent. Die Y-Achse ist das Verhältnis zwischen der Absorption des glykierten Hämoglobins und der Summe aus der Absorption des glykierten und des nicht-glykierten Hämoglobins, ausgedrückt als Prozent.
  • 15 zeigt Beispiele für Matrizes und einen Array. 15A zeigt Seitenansichten von vier Beispielen von Matrizes, die alle einen IEF-Puffer enthalten („b"). Die Matrizes A und D enthalten Rinnen, die den IEF-Puffer enthalten. Die Matrizes B und C enthalten IEF-Puffer auf der Oberfläche der Matrix. Die Matrizes C und D enthalten einen als „c" bezeichneten Bereich, der eine Spur ist. Die Matrizes A-D können in Kombination mit einer zweiten Schicht in dem System für eine zweidimensionale Analyse eingesetzt werden. Die Richtung des elektrischen Feldes für den Schritt der isoelektrischen Fokussierung ist als „E1" bezeichnet. Ein Teil von „b" in Matrix A und B kann als eine Spur für die Auftrennung in der zweiten Dimension dienen (z. B. über die Zugabe von Natriumdodecylsulfat zum Laufpuffer während der Auftrennung in der zweiten Dimension). Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die Matrizes A-D während des Schrittes der isoelektrischen Fokussierung im gleichen E1-Feld in jeder Richtung um 90 Grad gedreht werden (nicht gezeigt). 15B zeigt einen Array, bei dem eine zweite Schicht mit einer Perforation so auf eine Matrix gegeben werden kann, dass der IEF-Puffer in der Matrix in der Lage ist, während der Trennung in der ersten Dimension mit einem Laufpuffer in Kontakt zu treten.
  • 16 betrifft ein Beispiel für einen Array. 16A ist eine Aufsicht auf ein Beispiel für eine zweite Schicht eines Array. Bei diesem Beispiel ist die zweite Schicht aus einem Material hergestellt, das für biologische Moleküle impermeabel ist, für Ionen im Laufpuffer aber permeabel ist. 16B ist eine Aufsicht auf ein Beispiel für eine Matrix. Die Matrix umfasst eine rechteckige Rinne, die so mit Gel gefüllt ist, dass die Spur gebildet wird, und eine runde Vertiefung, die mit IEF-Puffer gefüllt ist. 16C ist eine Aufsicht auf die zweite in der 16A gezeigte Schicht, die so auf der Matrix der 16B ausgerichtet ist, dass der IEF-Puffer durch die Perforation in der zweiten Schicht exponiert ist. 16D ist eine Seitenansicht einer der IEF-/Spur-Einheiten des Arrays aus der 16C. 16E ist eine Vergrößerung einer Seitenansicht eines Teiles des Arrays aus der 16C (gestrichelter Kreis). Die oberste Schicht ist die in der 16A gezeigte zweite Schicht, und die untere Schicht ist die in der 16B gezeigte Matrix.
  • 17 zeigt eine Aufsicht auf ein Beispiel für ein System, das einen Array in einer Kammer, die einen Laufpuffer umfasst, zeigt. In der Kammer befindet sich ein Rührstab, um eine Umwälzung des Biomoleküls quer zum IEF-Puffer oder den IEF-Puffern oder Zellen in „b" zu ermöglichen. Die Elektroden A1 und B1 erzeugen ein elektrisches Feld, das während des Schrittes der isoelektrischen Fokussierung in regelmäßigen Abständen seine Richtung umkehrt.
  • 18 ist ein elektronischer Scan eines silbergefärbten Gels eines im Handel erhältlichen Proteinstandards, das wie im Beispiel 1 unten beschrieben hergestellt wurde.
  • 19 ist ein optischer Scan eines silbergefärbten Gels eines humanen Plasmas, wobei das Gel wie in Beispiel 2 unten hergestellt wurde.
  • 20 ist eine Aufsicht auf eine Matrix, die zu Auftrennung von humanen Plasma-Proteinen mit pI-Werten von 7,5 bis 8,5 eingesetzt wurde. Die Matrix ist ein LUCITETM-Chip von 1 × 10 cm. Jede Linie auf der Matrix wurde von einem modifizierten Tintenstrahldrucker gezogen, der IEF-Puffer und Acrylamid-Mischungen so auftrug, dass parallele Gelspuren gebildet wurden, wobei jede Spur eine gleichmäßige Breite und Dicke von 100 μm und eine Länge von 1 cm, aber einen anderen pH-Wert hatte (d. h. fünfzig Spuren von pH 7,50, 7,52, 7,54, 7,56, 7,58 etc. bis 8,50). Die Matrix wurde so in etwas Laufpuffer in einer Kammer gegeben, dass jeweils eine Spitze der Spuren in den Laufpuffer eingetaucht war. Eine menschliche Plasmaprobe wurde im Laufpuffer quer zu den Spitzen der Spuren mit einem Rührstab umgewälzt, während ein elektrisches Feld, das in regelmäßigen Abständen seine Richtung umkehrte, an den Laufpuffer angelegt wurde. Nach einigen Minuten wurde das elektrische Feld abgeschaltet, eine 3%-ige SDS-Lösung wurde zum Laufpuffer gegeben, und der gesamte Chip wurde in den Laufpuffer eingetaucht. Dann wurde ein unidirektionales elektrisches Feld parallel zu den Spuren in einer Richtung weg von der Spitze des beim Schritt der isoelektrischen Fokussierung verwendeten IEF-Puffers und entlang der Länge der Spuren angelegt. Der Chip wurde dann silbergefärbt. Die grauen und schwarzen Flecken, die in der 20 zu sehen sind, sind silbergefärbte Proteine.
  • 21 ist ein Vergleich des menschlichen Plasmas, der gemäß der zweidimensionalen Analyse und gemäß einer herkömmlichen zweidimensionalen IEF-SDS-PAGE-Analyse erstellt wurde. 21A ist ein digitalisierter optischer Scan des im Beispiel 3 eingesetzten und silbergefärbten Chips. Der Scan wurde maßstabsgerecht vergrößert, um einen Vergleich mit dem Swiss-Protein-2D-Bild zu ermöglichen. 21B ist ein veröffentlichtes silbergefärbtes zweidimensionales Gel von humanen Plasmaproteinen mit pI-Werten von 7,50 bis 8,50.
  • 22 ist ein Vergleich des humanen Plasmas, der gemäß der zweidimensionalen Analyse und gemäß einer herkömmlichen zweidimensionalen IEF-SDS-PAGE-Analyse erstellt wurde. 22A ist ein veröffentlichtes silbergefärbtes zweidimensionales Gel humaner Plasmaproteine mit pI-Werten von 5,50 bis 6,00. 22B ist ein digitalisierter optischer Scan des im Beispiel 4 eingesetzten und silbergefärbten Chips. Der Scan wurde um den Faktor 10 vergrößert.
  • 23 ist ein optischer Scan einer einzigen kapillaren SDS-PAGE-Spur. Die dunkleren Bereiche in der Spur sind silbergefärbte humane Plasmaproteine mit einem pI von ungefähr 7,0. Das humane Plasmaprotein wurde einer Trennung mit einem Array unterzogen, der hergestellt wurde, wie es im Beispiel 5 beschrieben wird.
  • 24 ist ein optischer Scan einer einzigen kapillaren SDS-PAGE-Spur. Die dunkleren Bereiche in der Spur sind silbergefärbte humane Plasmaproteine mit einem pI von ungefähr 7,0. Das humane Plasmaprotein wurde einer Trennung mittels eines Arrays unterzogen, der hergestellt wurde, wie es im Beispiel 5 beschrieben wird, und zwar in einem System mit drei Elektroden, wie es im Beispiel 6 beschrieben wird.
  • 25 ist eine schematische Darstellung einer Apparatur, die auf einer Matrix einen Bereich aus einem IEF-Puffer erzeugen kann. Eine Vorrichtung wird zur Mischung einer sauren und einer basischen Lösung unter Bildung eines Puffers verwendet, der den gewünschten pH-Wert hat („Titrator"). Der Puffer wird mit einem Monomer (z. B. Acrylamid) und einem Polymerisationsmittel zusammengegeben und in eine weitere Vorrichtung („Matrixdrucker") geladen, die den IEF-Puffer in einer gewünschten Position auf den Array aufbringt.
  • 26 ist eine schematische Darstellung •einer Apparatur, die die Spuren auf einer Matrix ziehen kann. Eine Acrylamidlösung und ein Polymerisationsmittel werden in eine Vorrichtung („Matrixdrucker") geladen, die Spuren in einer gewünschten Position auf den Array aufbringt.
  • 27 ist ein Schema eines Beispiels für ein automatisches System. Das System stellt zum Beispiel eine Vorrichtung zur Einspeisung einer Probe in die Kammer für die zweidimensionale elektrophoretische Analyse („Probengeber") bereit, eine Vorrichtung zur Entfernung von Abfall („Abfallentsorgung"), eine Vorrichtung für die Zugabe von neuem Laufpuffer („Pufferzuleitung"), eine Vorrichtung zur Färbung der Matrix nach der zweidimensionalen Analyse („Färbereagenszugeber"), eine Vorrichtung zur Verbringung des gefärbten Chips in einen Scanner („System zum Array-Handling"), eine Vorrichtung zum Scannen des Chips („Scanner"), eine Vorrichtung für den Empfang und die Aufzeichnung des gescannten Bildes („Computer"), eine Vorrichtung für die Analyse des aufgezeichneten Bildes („Software") und eine Vorrichtung für die Wiedergabe des aufgezeichneten Bildes („Display").
  • 28 ist eine schematische Darstellung eines Beispiels für ein System mit drei Elektroden.
  • 29 ist ein Diagramm, das die Wirksamkeit der Auftrennung im IEF-System durch das Plotten der kalibrierten Fluoreszenz, wie sie über die Verteilung eines markierten Proteins in einem Gel bestimmt wurde, gegen die beobachtete Fluoreszenz eines markierten Antikörpers nach 10-minütiger isoelektrischer Fokussierung demonstriert. Die Zahlen geben die Gesamtzahl der Proteinmoleküle in der Probe an, wodurch eine nahezu 100%-ige Effizienz der Proteintrennung gezeigt wird.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • I. Das IEF-System
  • Das IEF-System schließt die folgenden Elemente ein: einen oder mehrere IEF-Puffer, einen Laufpuffer, eine Vorrichtung, die Kammern und/oder Zellen für die Aufnahme des Puffers einschließt, und eine Einrichtung zur Anlegung eines elektrischen Stroms an die Vorrichtung. Das System kann auch eine Einrichtung zur Kühlung der Vorrichtung und der Zielerkennungs-Biomoleküle („ZEB") enthalten.
  • A. Der IEF-Puffer
  • Ein IEF-Puffer enthält Komponenten, die eine Pufferkapazität um einen gegebenen pH-Wert herum aufweisen (Puffersubstanzen), oder Komponenten, die sich unter Ausbildung eines pH-Gradienten organisieren (z. B. Ampholyte, Immobiline oder eine Kombination von Puffersubstanzen). Der IEF-Puffer liegt so in Form einer Flüssigkeit oder einer Aufschlämmung oder eines Gels vor, dass ein Biomolekül durch den IEF-Puffer wandern kann, es sei denn, der pI des Biomoleküls liegt im pH-Bereich des IEF-Puffers. Ein IEF-Puffer kann, wenn es erforderlich ist, andere Komponenten enthalten, wie Harnstoff, ein Detergens oder ein Reduktionsmittel. Siehe z. B. Malloy et al., Anal. Biochem. 280: 1-10 (2000). Es ist erwünscht, dass die IEF-Puffer unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes funktionell stabil sind.
  • Der IEF-Puffer oder die Zelle, die den IEF-Puffer umfasst, kann per Hand oder mittels verschiedener Vorrichtungen gebildet werden. Zum Beispiel kann der IEF-Puffer auf die Oberfläche eines Substrats oder in einer Rinne oder in einem Kanal auf einem Substrat aufgebracht (z. B. geschichtet, gedruckt oder aufgetupft) werden. Das Substrat kann eine Matrix sein, wie es unten beschrieben wird, oder ein Kügelchen, das aus dem gleichen Material wie die Matrix besteht. Gemäß einer Ausführungsform kann der IEF-Puffer mittels einer Vorrichtung hergestellt werden, die eine saure und eine basische Lösung unter Bildung eines Puffers mit dem gewünschten pH-Wert mischt („Titrator"). Der Puffer wird mit einem Monomer (z. B. Acrylamid) und einem Polymerisationsmittel zusammengegeben und in eine weitere Vorrichtung („Matrixdrucker") gegeben, die den IEF-Puffer in einer gewünschten Position auf die Matrix aufbringt. Siehe z. B. 25. Diese Vorrichtungen können in ein automatisches System inkorporiert werden.
  • Ampholine sind eine Gruppe verschiedener Oligoamino- und/oder Oligocarbonsäuren, die amphoter sind (d. h. in sauren Medien positiv geladen und in basischen Medien negativ geladen sind), löslich sind und Mr-Werte von ungefähr 300 bis zu 1000 aufweisen. Ampholyte können hergestellt oder gekauft werden. Zum Beispiel sind verschiedene Trägerampholyte in diesem Gebiet bekannt (z. B. Seiten 31-50, Righetti, P. G. (1983), Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Hrsg. T. S. Work und R. H. Burdon, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam; US-Patent 3 485 736 ). Alternativ gehören zu im Handel erhältlichen Ampholyten die Ampholine (LKB), Servalyte (Serva), Biolyte und Pharmalyte (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden).
  • Immobiline sind nicht-amphotere, bifunktionelle Acrylamidderivate mit der allgemeinen Formel CH2=CH-CO-NH-R. Immobiline können hergestellt oder gekauft werden. Zum Beispiel sind Verfahren zur Synthese von Immobilinen in diesem Gebiet bekannt (Bjellquist et al. (1983), J. Biochem. Biophys. Methods 6: 317). Die Immobiline können mit dem Acrylamid unter Bildung von IPGs (immobilisierten pH-Gradienten) copolymerisiert werden. IPGs können mittels Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt werden, oder sie können gekauft werden.
  • pH-Gradienten können durch das Mischen amphoterer oder nicht-amphoterer Puffer hergestellt werden. Zum Beispiel werden derartige Pufferkombinationen bei R. C. Allen et al., Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing of Proteins: Selected. Technigues, Berlin: Walter de Gruyter & Co. (1984) und im US-Patent Nr. 5 447 612 (Bier) beschrieben. Zu IEF-Pufferagenzien gehören 50 mM Glycin und 14 mM NaOH, 50 mM HEPES und 12 mM NaOH, 50 mM THMA und 44,6 mM HCl, 52 mM Zitronensäure und 96 mM Na2HPO4, 50 mM BICIN und 18 mM NaOH sowie 50 mM DMGA und 40 mM NaOH.
  • Der durch den IEF-Puffer in jeder Zelle gebildete pH-Gradient kann einen engen oder einen weiten pH-Bereich aufweisen (z. B. pH 6,8-pH 7,8 bzw. pH 6,8-pH 12,8). Ein IEF-Puffer kann einen extrem engen pH-Bereich aufweisen, z. B. 5,50-5,60 (0,1 pH-Einheiten oder weniger Unterschied) oder einen ultra-engen pH-Bereich, z. B. 5,52-5,54 (0,02 pH-Einheiten Unterschied oder weniger). Das ist möglich, da ein IEF-Puffer ein Puffermittel sein kann, das auf einen bestimmten pH-Wert eingestellt wurde. In diesem Falle ist der pH-Bereich des IEF-Puffers der Pufferkapazität der Puffersubstanz um den pH-Wert herum, auf den die Puffersubstanz eingestellt wurde, äquivalent.
  • Der Begriff „Intervall" bezieht sich auf den inkrementellen Unterschied von pH-Werten innerhalb des durch den IEF-Puffer gebildeten pH-Gradienten. Der Begriff „Stufe" bezieht sich auf den inkrementellen Unterschied der pH-Werte zwischen zwei verschiedenen IEF-Puffern. Zum Beispiel können in einer Zelle die Intervalle lediglich 0,02 pH-Einheiten über den vollen pH-Bereich in dieser Zelle betragen (z. B. pH 6,8, pH 7,0, pH 7,2 etc. in dieser Zelle). Bei einem weiteren Beispiel kann die pH-„Stufe" zwischen einem IEF-Puffer in der Zelle Nr. 1 und dem in der Zelle Nr. 2 0,1 pH-Einheiten betragen. Zum Beispiel kann der IEF-Puffer in der Zelle Nr. 1 einen pH-Gradienten aufweisen, der bei pH 6,8 beginnt und bei pH 7,8 endet, und der IEF-Puffer in der Zelle Nr. 2 kann einen pH-Gradienten aufweisen, der bei pH 7,9 beginnt und bei pH 8,9 endet (d. h. pH 7,9 minus 7,8). Der „pH-Bereich" bezieht sich auf den höchsten und den niedrigsten pH-Wert in einem IEF-Puffer oder in einer Zelle, die einen IEF-Puffer enthält (z. B. pH 7,9-pH 8,9), oder auf den Unterschied zwischen dem höchsten und dem niedrigsten pH-Wert in einem IEF-Puffer oder in einer Zelle, die einen IEF-Puffer enthält (z. B. 1,0 pH-Einheiten). Die Intervalle in einer Zelle müssen nicht gleichmäßig sein. Weiterhin müssen die pH-Stufen zwischen zwei Zellen aus einer Vielzahl von Zellen nicht gleichmäßig sein. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die Matrix IEF-Puffer oder Zellen mit IEF-Puffern, die einen extrem engen oder ultra-engen pH-Bereich und kleine pH-Stufen zwischen den einzelnen Zellen umfassen.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist der pH-Bereich eines IEF-Puffers in einer Zelle ein enger pH-Gradient, z. B. von weniger als einer pH-Einheit oder von bis zu wenigen pH-Einheiten. Gemäß einer anderen Ausführungsform erstreckt sich der pH-Gradient in der Zelle über mehrere pH-Einheiten. Gemäß einer Ausführungsform beträgt das pH-Intervall eines IEF-Puffers 0,1 pH-Einheiten oder weniger. Bei einer weiteren Ausführungsform beträgt das pH-Intervall eines IEF-Puffers 0,02 Einheiten oder weniger. Gemäß einer Ausführungsform liegen die pH-Stufen zwischen zwei oder mehr IEF-Puffern bei 0,01 Einheiten oder weniger. Gemäß einer weiteren Ausführungsform liegen die pH-Stufen zwischen zwei oder mehr IEF-Puffern bei 0,02 Einheiten oder weniger.
  • B. Zellen
  • Eine Zelle ist eine hohle Struktur, die einen IEF-Puffer in sich und/oder in eine ihrer Wände integriert enthält. Die Zelle kann jede beliebige Form aufweisen, einschließlich einer Kugel, eines Dreiecks, eines Quadrates, eines Rechtecks und eines Zylinders. Eine Zelle kann, in Abhängigkeit von der Form der Struktur, eine Wand oder mehrere Wände aufweisen. Die Wände der Zelle haben eine Innenseite, die in Richtung des Zentrums der Struktur gerichtet ist, und eine Außenseite, die von den Zellen gesehen nach außen gerichtet ist. Siehe z. B. 1. In Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung kann eine Wand der Zelle aus einer Membran, einem Netz oder einem Feststoff bestehen, der für das Biomolekül permeabel, impermeabel und/oder für ein elektrisches Feld durchdringbar oder undurchdringbar ist.
  • Einige der Wände der Zelle können für ein elektrisches Feld undurchdringbar sein. Jedoch sollten die Wände der Zelle so konstruiert sein, dass ein elektrischer Strom in die Zelle eintreten kann. Ein IEF-Puffer kann in eine Wand der Zelle integriert sein. Zum Beispiel kann ein GF/D-Glasfaserfilter von Whatman in Acrylamid eingetaucht werden, das man zu einem Gel polymerisieren lässt, und dann in einem IEF-Puffer eingeweicht werden. Die Scheibe kann dann zur Bildung einer Wand der Zelle eingesetzt werden. Somit kann ein Biomolekül in einer Zelle gefangen werden, die eine Wand aufweist, die in einem IEF-Puffer eingeweicht ist, dessen pH-Wert gleich dem pI-Wert des Biomoleküls ist.
  • Wenn eine Probe, die ein interessierendes Biomolekül oder interessierende Biomoleküle aufweist, zu dem Laufpuffer im System gegeben wird, sollte wenigstens eine Wand der Zelle für ein interessierendes Biomolekül oder für mehrere interessierende Biomoleküle durchlässig sein. Bei einer Ausführungsform sind alle Wände der Zelle für das interessierende Biomolekül permeabel. Bei einer weiteren Ausführungsform sind alle Wände der Zelle außer einer impermeabel für das Biomolekül und/oder undurchdringbar für ein elektrisches Feld. Bei einer Ausführungsform sind die Wände der Zelle, die in der ersten Dimension in das elektrische Feld und in die gleiche Richtung wie dieses gerichtet sind, für das interessierende Biomolekül permeabel. Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann eine Wand oder können die Wände der Zelle im Wesentlichen impermeabel für das interessierende Biomolekül sein, wenn das interessierende Biomolekül präpariert wird durch 1) Zugeben einer Probe, die das interessierende Biomolekül umfasst, zu dem IEF-Puffer in einer Zelle des Systems und 2) das Ermöglichen, dass Biomoleküle und/oder Ionen, die uninteressant sind, aus der Zelle hinauswandern. Auf diese Weise kann die Zelle im Schritt der ersten Dimension zusammen mit den Matrizes, Arrays, Systemen und Verfahren eingesetzt werden.
  • Die Zellen können räumlich auf verschiedene Weise angeordnet werden. Zum Beispiel können die Zellen zusammenhängend angeordnet werden, wobei z. B. ein Biomolekül-permeables oder Biomolekül-impermeables Material zwei aneinander angrenzende Zellen voneinander trennt. Siehe z. B. 6a und 6b. Gemäß einer Ausführungsform sind die IEF-Puffer oder die Zellen so „isoliert", dass die Biomoleküle im Wesentlichen von einem IEF-Puffer in einen anderen gelangen, indem sie durch den Laufpuffer wandern, der um die IEF-Puffer oder die Zellen zirkuliert, und nicht durch einen IEF-Puffer direkt in einen anderen IEF-Puffer oder durch die Wand einer Zelle direkt in eine andere Zelle. Siehe z. B. 5a, b oder 2. Gemäß einer Ausführungsform grenzen die isolierten Zellen aneinander an, sind aber durch ein Biomolekül-impermeables Material getrennt. Siehe z. B. 6. Alternativ grenzen die isolierten IEF-Puffer oder die Zellen nicht aneinander an. Gemäß einer Ausführungsform, wenn die IEF-Puffer oder die Zellen zusammenhängend angeordnet sind, steht wenigstens eine der Wände der IEF-Puffer oder Zellen, die nicht mit einem anderen IEF-Puffer oder einer anderen Zelle in Kontakt steht, mit dem Laufpuffer in Kontakt und ist für das getestete Biomolekül permeabel. Die IEF-Puffer oder die Zellen können einen Teil einer Matrix bilden. Die IEF-Puffer oder die Zellen müssen nicht in einer Reihe miteinander verbunden sein, wenn die Zellen parallel zum elektrischen Feld der ersten Dimension angeordnet sind.
  • Das Biomolekül-permeable oder Biomolekül-impermeable Material kann in Abhängigkeit vom gewünschten Ergebnis eine Membran sein. Die Membran kann so hergestellt werden, dass sie an den Poren der Membran im elektrischen Feld praktisch keine Nettoladung aufweist. Bei einer alternativen Ausführungsform kann der pH der Membran ein pH-Wert sein, der zwischen den pH-Werten auf den beiden Seiten der Membran liegt. Das ist erwünscht, um den Flüssigkeitsstrom durch die Membranen, der durch das Vorliegen oder die Aneignung einer elektrischen Ladung auf der Membran verursacht wird (Elektroendoosmose), zu minimieren. In Abhängigkeit vom gewünschten Ergebnis gehören zu nützlichen Membranen diejenigen, die im US-Patent Nr. 4 243 507 an Martin beschrieben werden. Alternativ können zu den Membranen solche gehören, an die kovalent Immobiline gebunden sind, wie es im US-Patent Nr. 4 971 670 an Faupel beschrieben wird.
  • Die Zellen können direkt oder indirekt an der Kammer befestigt sein, solange die Zellen in der Lage sind, mit dem Laufpuffer in Kontakt zu treten. Zum Beispiel können die Zellen direkt an die Unterseite oder den Seiten der Kammer befestigt sein oder mit einem isolierenden Träger an der Kammer befestigt sein. Siehe z. B. 5a oder 5c. Alternativ können die Zellen in eine Matrix gegeben werden, die an der Kammer befestigt ist, oder an einem Pflock befestigt sein, der an der Kammer befestigt ist. Bei noch einer weiteren Ausführungsform können die Zellen, die einen IEF-Puffer enthalten, der eine Puffersubstanz ist, frei im Laufpuffer schwimmen, aber die Zellen sollten unterscheidbar sein, sodass der pH-Bereich des IEF-Puffers in der Zelle erkenntlich ist. Siehe z. B. 5b. Die Matrix oder die einzelne Zelle kann so an der Kammer befestigt sein, dass sie in der Kammer rotiert.
  • Die Empfindlichkeit der Verfahren und Systeme steigt mit der Abnahme der Größe der IEF-Puffer oder der Zelle an. Gemäß einer Ausführungsform ist die Größe des IEF-Puffers oder der Zelle, insbesondere die Länge des IEF-Puffers oder der Zelle, so klein wie möglich. Die Länge des IEF-Puffers oder der Zelle bezieht sich auf den breitesten Querschnitt des IEF-Puffers oder der Zelle, der parallel zur Richtung des elektrischen Feldes in der zweiten Dimension liegt. Die Breite des IEF-Puffers oder der Zelle bezieht sich auf den breitesten Querschnitt des IEF-Puffers oder der Zelle, der senkrecht zur Richtung des elektrischen Feldes in der zweiten Dimension liegt. Bei einer Ausführungsform kann die Zelllänge beliebig sein, zum Beispiel 10 μm bis 5,0 mm. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Zellbreite beliebig sein, z. B. 10 μm bis 10,0 mm.
  • Die Spur kann unterschiedliche Größen haben. Gemäß einer Ausführungsform beträgt die Breite der Spur 20 μm bis 1 mm. Zum Beispiel kann die Breite der Spur bei 100 μm liegen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Länge aller Spuren bei 3-10 mm liegen.
  • Die Spur kann Materialien umfassen, die für Trenntechniken geeignet sind (z. B. bezüglich der Größe, der Form, der Ladung, der Affinität oder Kombinationen von diesen). Zu diesen Materialien können diejenigen gehören, die für eine Chromatografie, eine Elektrophorese wie die SDS-PAGE, eine Zonenelektrophorese, eine Affinitätselektrophorese, eine Kapillarelektrophorese und eine Elektrochromatografie geeignet sind. Demgemäß kann bei einer Ausführungsform die Spur ein Kapillarröhrchen sein, das mit chromatografischen Materialien (z. B. für die Flüssigkeitschromatografie) oder Substanzen, die für eine Elektrophorese (z. B. eine Kapillarzonenelektrophorese, Kapillargelelektrophorese unter Verwendung vernetzter und unvernetzter Gele) und für eine kapillare isoelektrische Fokussierung geeignet sind, gefüllt ist. Gemäß einer Ausführungsform ist die zweite Dimension eine von einem elektrischen Feld vermittelte Trenntechnik.
  • Eine Spur gemäß einer Ausführungsform kann ein gelartiges Material umfassen, das für eine elektrophoretische Trennung geeignet ist, z. B. US 6 197 173 (Kirpatrick). Das gelartige Material kann aus Monomeren, die polymerisiert wurden, bestehen. Das Gel kann für das untersuchte Biomolekül denaturierend oder nicht-denaturierend sein. Das Gel kann unterschiedliche Porengrößen aufweisen. Demgemäß kann die Spur je nach Bedarf zusätzliche Komponenten, wie Harnstoff, ein Detergens und ein Reduktionsmittel, umfassen. Siehe z. B. Malloy et al., Anal. Biochem. 280: 1-10 (2000). Die Spur selbst kann einen IEF-Puffer für die weitere Trennung des Biomoleküls umfassen, das im IEF-Puffer der ersten Dimension akkumuliert wurde. Alternativ kann eine Spur, die einen IEF-Puffer umfasst, durch die Zugabe von SDS zum Laufpuffer in ein SDS-haltiges Gel umgewandelt werden, und somit kann das Biomolekül in der zweiten Dimension auf der Basis des Molekulargewichts aufgetrennt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird die Spur so hergestellt, dass sie Natriumdodecylsulfat (SDS) und ein Polyacrylamidgel umfasst. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Spur über ihre Länge zwischen zwei für das Biomolekül impermeablen Schichten sandwichartig eingeschlossen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die Spur, wenn sie SDS und ein Polyacrylamidgel umfasst, sandwichartig zwischen einer Matrixschicht und einer weiteren Schicht eingeschlossen sein, wobei beide Schichten impermeabel für das Biomolekül und impermeabel für Ionen sein können, solange ein elektrisches Feld die Spur durchdringen und ein elektrisches Feld entlang der Spur weg vom IEF-Puffer richten kann. Siehe z. B. 16.
  • Die Spur kann per Hand oder mittels verschiedener Vorrichtungen erzeugt werden. Zum Beispiel können eine Acrylamid-Lösung und ein Polymerisationsmittel in eine Vorrichtung („Matrixdrucker") gegeben werden, die Spuren in einer gewünschten Position auf einen Array aufbringt. Siehe z. B. 26. Ein modifizierter Büro-Tintenstrahldrucker ist ein Beispiel. Derartige Vorrichtungen können in ein automatisches System inkorporiert sein.
  • Es können verschiedene Monomere zusätzlich zur herkömmlichen Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung oder zu Agarose-Lösungen verwendet werden, um ein Geld für den Einsatz in Schritten der ersten und/oder der zweiten Dimension herzustellen. Es ist für herkömmliche chemisch polymerisierte Gele bekannt, Hydroxyethylmethacrylat und andere niedermolekulare Verbindungen vom Acrylat-Typ als Monomere zu verwenden. Sie werden als „Lone-Ranger"-Gele kommerzialisiert. Die Verwendung von Polymeren, die mit einer Gruppe oder mit mehreren Gruppen vom Acrylat-Typ substituiert sind, ist ebenfalls in der Literatur beschrieben worden (Zewert und Harrington, Electrophoresis 13: 824-831 (1992)), und zwar als besonders geeignet für Trennungen in gemischten Lösemitteln aus Wasser und wassermischbaren organischen Lösemitteln, wie Alkohol oder Aceton. Die gelbildenden Monomere können ebenfalls beliebige, im Wesentlichen wasserlösliche Moleküle sein, die eine mittels Licht polymerisierbare reaktive Gruppe enthalten, in Kombination mit einem Material, das Vernetzungen ausbilden kann, vorausgesetzt, dass die Kombination nach der Polymerisation ein Gel bildet, das für den jeweiligen Elektrophorese-Typ geeignet ist.
  • Zu exemplarischen Materialien gehören Acrylamid in Kombination mit Methylenbisacrylamid oder anderen bekannten Vernetzungsmitteln; Hydroxyethylmethacrylat und andere niedermolekulare (Molekulargewicht unter ungefähr 300 Dalton) Derivate der Acrylsäure, Methacrylsäure und alkylsubstituierte Derivate von diesen, wie Crotonsäure; Vinylpyrrolidon und andere niedermolekulare Vinyl- und Allylverbindungen; Vinyl-, Allyl-, Acryl- und Methacryl-Derivate nichtionischer Polymere, einschließlich derartiger Derivate von Agarose („Acrylaid"-Crosslinker, FMC Corp.), Dextran und anderen Polysacchariden und Derivaten, wie Cellulosederivaten einschließlich von Hydroxyethylcellulose; Polyvinylalkohol; monomere, oligomere und polymere Derivate von Glykolen, einschließlich der Polymere von Ethylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxid und Copolymeren von diesen; Acryl-, Vinyl- und Allyl-Derivate anderer wasserkompatibler Polymere, wie polyHEMA (Polyhydroxyethylacrylsäure), polymeres N-Isopropylacrylamid (das temperaturempfindlich ist), Maleinsäure-Polymere und -Copolymere, partiell hydrolysiertes EVAC (Polymer von Ethylen mit Vinylacetat), Ethylenimin, Polyaminosäuren, Polynucleotide und Copolymere aus den Untereinheiten von diesen miteinander und mit hydrophoberen Verbindungen, wie Pyridin, Pyrrolidin, Oxazolidin, Styrol und Hydroxysäuren. Die polymerisierbaren Materialien müssen nicht vollständig wasserlöslich sein, insbesondere wenn Lösemittel oder Tenside in der gelbildenden Lösung enthalten sind.
  • Verfahren zur Herstellung polymerisierbarer Derivate üblicher Polymere sind in diesem Gebiet bekannt. Zum Beispiel kennt man die Zugabe von Allylglycidylether zu Hydroxygruppen, wie auch die Veresterung von Hydroxylen mit Säuren, Anhydriden oder Säurechloriden, wie Acrylsäureanhydrid. Amine können leicht mit Acrylsäureanhydriden oder -chloriden derivatisiert werden. Viele der oben beschriebenen derivatisierten Polymere enthalten mehr als eine reaktive Gruppe und sind somit selbstvernetzend. Die Zugabe eines Vernetzungsmittels, das im Durchschnitt mehr als eine reaktive Gruppe pro Molekül enthält, ist für die Bildung von Gelen aus Monomeren erforderlich, die nur eine reaktive Gruppe aufweisen, wie Acrylamid. Zu diesen gehören, zusätzlich zu mehrfach derivatisierten Polymeren, Methylenbisacrylamid, Ethylenglykoldiacrylat und andere kleine Moleküle mit mehr als einer ethylenisch ungesättigten funktionellen Gruppe, wie Acryl, Vinyl oder Allyl.
  • Zu Kandidaten für Monomere, bei denen es sich nicht um Acrylamid handelt, gehören z. B. Allylalkohol, HEMA (Hydroxyethyl(meth)acrylat), Polyethylenglykolmonoacrylat, Polyethylenglykoldiacrylat, Ethylenglykolmonoacrylat, Ethylenglykoldiacrylat, Vinylcaprolactam, Vinylpyrrolidon, Allylglycidyldextran, Allylglycidyl-Derivate von Polyvinylalkohol oder von Cellulose und Derivaten, Vinylacetat und andere Moleküle, die eine oder mehrere Acryl-, Vinyl- oder Allyl-Gruppen enthalten.
  • Eine IEF/Spur-Einheit ist ein IEF-Puffer oder eine Zelle, die einen IEF-Puffer zusammen mit einer Spur umfasst. Bei einer Ausführungsform ist die IEF/Spur-Einheit so vorgefertigt, dass der IEF-Puffer mit der Spur in Kontakt steht. Siehe z. B. 16D. Bei einer anderen Ausführungsform kann die IEF/Spur-Einheit so vorgefertigt sein, dass der IEF-Puffer und die Spur getrennt vorliegen, aber miteinander verbunden werden können. Zum Beispiel können der IEF-Puffer und die Spur in der Matrix beweglich sein, sodass sie zum gewünschten Zeitpunkt zusammengebracht werden können. Bei einem anderen Beispiel können der IEF-Puffer und die Spur über einen Gelpfropfen, der die beiden miteinander verbindet, zusammengebracht werden. Wenn ein IEF-Puffer oder eine Zelle mit einer Spur verbunden ist, muss die Verbindung zwischen dem IEF-Puffer oder der Zelle und der Spur den Transfer des interessierenden oder gerade untersuchten Biomoleküls erlauben.
  • C. Matrizes
  • Eine Matrix (oder Matrixschicht) ist ein festes Material oder ein halbfestes Material, z. B. eine Keramik, ein Glas, Polystyrol, Poly(methylmethacrylat) wie Lucit oder ein Gel, das eine Zelle oder eine Vielzahl von Zellen und/oder IEF/Spur-Einheiten umfasst. Gemäß einer Ausführungsform ist das Material, das die Matrix bildet, schlecht leitend. Gemäß einer anderen Ausführungsform besteht die Matrix teilweise oder vollständig aus einem Material, das impermeabel für das Biomolekül und impermeabel für Ionen (BIA) ist und über die ganze Länge mit der Spur in Kontakt steht. Eine IEF/Spur-Einheit kann auf die Oberfläche der Matrix gegeben werden, zum Beispiel in Form eines Gels, 15, Matrix B oder C, sie kann in eine in die Matrixschicht geätzte Rinne eingebracht werden kann, oder sie kann sich durch die Matrixschicht erstrecken, solange der IEF-Puffer oder die Zelle mit dem Laufpuffer in der ersten Dimension in Kontakt stehen kann. Gemäß einer Ausführungsform ist, wenn sich der IEF-Puffer, die Zelle oder die Spur durch die Matrix erstreckt, dann eine der Seiten des IEF-Puffers, der Zelle oder der Spur, die mit dem Laufpuffer in Kontakt steht, mit einer für das Biomolekül impermeablen Schicht bedeckt. Die Matrix kann beweglich sein oder sich in der Kammer befinden.
  • Die Matrix kann beispielsweise durch das Bohren eines Loches oder von Löchern durch eine Seite der Matrix und hinaus durch die gegenüberliegende Seite der Matrix, das Füllen des Kanals mit einem IEF-Puffer und das Verschließen der Öffnungen im Kanal mit einer Ionen-permeablen, Protein-permeablen Membran hergestellt werden. Alternativ können die Kanäle mit einem Polymer gefüllt werden, wie Agarose oder einem Polyacrylamidgel, das mit einem IEF- Puffer gemischt ist, der sich zu einem Gel mit einem bestimmten pH-Bereich verfestigt. Die Zellen in der Matrix können auch durch das Erzeugen eines Rinne oder einer Vielzahl von Rinnen, die sich nicht durch die gegenüberliegende Seite der Matrix erstreckt bzw. erstrecken, erzeugt werden, z. B. 15, Matrix A oder D. Die Rinnen können an einer beliebigen Seite der Matrix angebracht werden. Gemäß einer Ausführungsform befinden sich die Rinnen auf einer Seite der Matrix. Die Rinnen können mit einem IEF-Puffer oder mit einer Vielzahl von IEF-Puffern gefüllt werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform sind die IEF-Puffer oder die Zellen isoliert, sodass die Biomoleküle im Wesentlichen aus dem IEF-Puffer oder der Zelle in einen anderen IEF-Puffer oder eine andere Zelle über den Laufpuffer wandern, und nicht direkt von dem/der einen zum/zur anderen. Wenn sich eine Zelle durch eine Seite der Matrix zur gegenüberliegenden Seite der Matrix erstreckt, kann man sie als einen Kanal bezeichnen. Die Kanäle in der Matrix sind typischerweise parallel zueinander angeordnet. Gemäß einer Ausführungsform umfasst die Matrixschicht eine Vielzahl identisch ausgerichteter IEF/Spur-Einheiten. Gemäß einer anderen Ausführungsform kann die Vielzahl der identisch ausgerichteten IEF/Spur-Einheiten parallel zueinander und/oder tandemartig ausgerichtet sein. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Matrix oder der Chip so konstruiert, dass sie bzw. er eine Untergruppe von Zellen mit IEF-Puffern enthält, die für die Generierung einer Eichkurve eingesetzt werden können oder einen Standard für den Vergleich der Ergebnisse mit denen aus den anderen Zellen enthält, z. B. 15. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Matrix oder der Chip ein vorgefertigtes diagnostisches Werkzeug, das eine ausgewählte Gruppe von IEF-Puffern mit pH-Werten umfasst, die den pI-Werten bekannter interessierender Biomoleküle (z. B. einem Biomolekül-Marker für einen Krankheitszustand) oder einer Reihe von Biomolekülen, die einen Krankheitszustand anzeigen, entsprechen.
  • Eichkurven sind für die Bestimmung der Menge eines Zielbiomoleküls („ZB") in einer Probe nützlich. Eine quantitative Eichkurve kann durch das Zumischen bekannter Konzentrationen bekannter Biomoleküle oder Komplexe, die bekannte Biomoleküle umfassen, und das Bestimmen der Akkumulation des bekannten Biomoleküls oder Komplexes in Zellen mit dem entsprechenden IEF-Puffer generiert werden. Vorzugsweise wird, wenn das ZB und/oder Zielerkennungsmolekül („ZEM") kommerziell verfügbar oder leicht erhältlich ist, das kommerziell verfügbare oder leicht erhältliche ZB als das bekannte Biomolekül verwendet oder mit dem kommerziell verfügbaren oder leicht erhältlichen ZEM zur Bildung des Komplexes für die Eichkurve in Kontakt gebracht. Das bekannte Biomolekül kann markiert sein oder in einem Komplex vorliegen, der markiert ist. Vorzugsweise wird die gleiche Markierung im Prozess der Generierung der Eichkurve und bei der Testung der Probe eingesetzt. Die Konzentration des bekannten Biomoleküls oder Komplexes, das bzw. der zum Laufpuffer gegeben wurde, kann gegen die Höhe des Signals in der Zelle, in der es bzw. er akkumulierte, grafisch aufgetragen werden. Das Diagramm kann als Mittel zur Extrapolation der Konzentration des ZB in einer Probe basierend auf der Höhe des Signals in der Zelle, in der es akkumulierte, verwendet werden. Siehe z. B. 29.
  • Nachdem sich die Komplexe in die einzelnen Zellen verteilt haben, kann der Komplex einer Analyse in einer zweiten Dimension unterzogen werden, d. h. einer Analyse außerhalb der Zelle. Zum Beispiel gehören zu Analysen in der zweiten Dimension Analyseverfahren wie eine SDS-PAGE, eine Massenspektrometrie und eine HPLC-Chromatografie.
  • Das elektrische Feld in der ersten Dimension sollte in der Lage sein, in den IEF-Puffer einzutreten. Der Winkel zwischen der Richtung des elektrischen Feldes und der Matrix kann zwischen +90 und -90 Grad liegen, solange das elektrische Feld in den IEF-Puffer in den Kanälen eintreten kann. Bei einer Ausführungsform liegt der Winkel bei +90 Grad. Bei einer anderen Ausführungsform ist der elektrische Strom nicht reversibel und fließt nur in einer Richtung quer zu einem System, bei dem der IEF-Puffer und die Zelle nicht aneinandergrenzen und die Wände, die für das fragliche Biomolekül permeabel sind, senkrecht zur Richtung des elektrischen Stromes ausgerichtet sind, wobei die Probe direkt zum Laufpuffer gegeben wird. Bei einer anderen Ausführungsform ist das genannte System mit einer Rührvorrichtung, zum Beispiel einem magnetischen Rührstab, versehen. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist der Konvektionsstrom, der während des Experiments im Laufpuffer erzeugt wird, das einzige Mittel, durch das das System gerührt wird.
  • Bei einer Ausführungsform für das High-Throughput-Screening von Proben ist es nützlich, wenn die Matrix, die die Zellen umfasst, eine kleine Chip-artige Struktur ist. Der Chip kann aus jedem beliebigen Material bestehen, das mikrofabriziert werden kann, zum Beispiel trocken geätzt, nass geätzt, lasergeätzt oder bearbeitet, geformt oder geprägt sein kann, sodass es gewünschte miniaturisierte Oberflächenstrukturen aufweist. Der Chip kann ein Polymer, ein Keramikmaterial, ein Glas, ein Verbundstoff aus diesen, ein Laminat aus diesen oder dergleichen sein. Der Einsatz von Mikrofabrikationstechniken, wie zum Beispiel, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, eines großflächigen Ätzens, einer Oberflächenmikrobearbeitung, einer Dickschichtprozessierung, einer Laserablation, eines Laserätzens, eines Formens und Prägens, ermöglicht in der Praxis ein hohes Ausmaß an Präzision bei der Ausrichtung der Komponenten und Strukturen im Mikromaßstab, siehe z. B. E. W. Becker et al. (1986), Microelectronic Engineering 4: 45-56. Bei einer Ausführungsform umfasst der Chip eine Vielzahl von Zellen, wobei zwei oder mehr Zellen unterschiedliche IEF-Puffer enthalten. Siehe z. B. 11. Bei einer anderen Ausführungsform sind die pH-Werte der IEF-Puffer der Untergruppe von Zellen nicht die gleichen wie die pH-Werte der IEF-Puffer der Zellen, in denen die Komplexe, die das ZB umfassen, akkumulieren.
  • Die Abmessungen der Matrix können zum Beispiel bei 1 × 1 cm bis 10 × 10 cm liegen. Gemäß einer Ausführungsform ist die Matrix 5 × 5 cm oder 4 × 10 cm, in Abhängigkeit von der Zahl der Spuren, der Länge dieser Spuren und dem Abstand zwischen ihnen. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Dicke der Matrix bei 1 mm.
  • D. Arrays
  • Ein Array ist eine Matrix, die zusätzlich eine zweite Schicht umfasst. Die zweite Schicht hat generell die Funktion, eine Seite der Spur abzudecken und zu verhindern, dass erhebliche Mengen des Biomoleküls während des Schrittes der IEF-Trennung in die Spur geraten, wobei sie es aber gleichzeitig einem elektrischen Feld erlaubt, die Spur während des Schrittes in der zweiten Dimension zu durchdringen. Dementsprechend umfasst die zweite Schicht eine sog. Lane-Screening-Area (LSA), die die gleiche Länge und Breite wie die Spur hat oder größer ist, wobei die LSA impermeabel für ein Biomolekül und permeabel für Ionen ist. Die zweite Schicht kann vollständig aus dem LSA-Material bestehen, oder sie kann so konstruiert sein, dass sie Abschnitte aus dem LSA-Material mit den Abmessungen der Spur enthält. Gemäß einer Ausführungsform ist die LSA nicht leitfähig. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die Spur sandwichartig zwischen der Matrixschicht und der LSA eingeschlossen.
  • Materialien, die impermeabel für Biomoleküle, aber permeabel für Ionen sind, sind in diesem Gebiet bekannt, z. B. Cellophan, Polyethersulfon, Nylon, Celluloseacetat, Polyvinylidenfluorid (PVDF), Perfluorsulfonat-Kationenaustauschmembranen (z. B. Nafion-Membranen) und andere perfluorierte Ionenaustauschmembranen.
  • Eine zweite Schicht kann gegebenenfalls zusätzlich eine Perforation durch die Ebene der zweiten Schicht aufweisen. Die Perforation kann so angeordnet sein, dass die Perforation über dem IEF-Puffer oder der Zelle, die den IEF-Puffer umfasst, angeordnet ist. Die Funktion der Perforation besteht darin, dem Biomolekül in der Probe während des Schrittes der IEF-Trennung den Zutritt zum IEF-Puffer oder zu der Zelle zu ermöglichen. Siehe z. B. 16a und b. Die zweite Schicht kann von der Matrix entfernbar sein, permanent an der Matrix befestigt sein oder überhaupt nicht mit der Matrix verbunden sein. Beispiele für Arrays kann man in 15B und 16C sehen und die Kombination aus der „zweiten Schicht" und der „Matrix" in 17.
  • E. Kammern
  • Eine Kammer ist ein Behälter, der einen Laufpuffer enthält. Siehe z. B. 2. Gemäß einer Ausführungsform ist die Kammer so konstruiert, dass sie ein kleines Volumen des Laufpuffers enthält, d. h. die minimale Menge, die benötigt wird, um einen Kontakt mit den Zellen und den Elektroden herzustellen, sodass ein elektrisches Feld in den IEF-Puffer oder die Zelle und die Spur eintreten kann. Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst die Außenseite der Kammer ferner Anschlüsse, die es dem elektrischen Strom ermöglichen, durch sie hindurch in die Kammer zu den Elektroden zu gelangen. Gemäß noch einer anderen Ausführungsform ist die Kammer ein Einmalartikel.
  • F. Laufpuffer
  • Ein Laufpuffer ist eine Lösung in der Kammer, die einen elektrischen Strom tragen kann. Zum Beispiel kann der Laufpuffer 0,01 M K2SO4 sein. Der Laufpuffer kann andere Mittel umfassen, zum Beispiel solche, die für Aufrechterhaltung der Aktivität und/oder der Stabilität des Biomoleküls nützlich sind, wie Proteaseinhibitoren oder Detergenzien. Der in der ersten Dimension eingesetzte Laufpuffer kann gegebenenfalls beim Schritt der zweiten Dimension durch den gleichen oder einen anderen Puffer ersetzt werden. Alternativ liegt beim Schritt der zweiten Dimension kein Laufpuffer vor. Gemäß einer Ausführungsform ist der Laufpuffer bezüglich des pH-Bereichs des IEF-Puffers und des interessierenden Biomoleküls optimiert, sodass es den Komplexen möglich ist, in den geeigneten Zellen zu akkumulieren. Ein Laufpuffer kann auf einen pH-Wert eingestellt sein, der die Beweglichkeit eines Biomoleküls, das in einen IEF-Puffer oder eine Zelle eintritt, erhöht oder erniedrigt.
  • G. Vorrichtungen zur Erzeugung und/oder Lenkung eines elektrischen Feldes
  • Eine Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen Feldes durch den IEF-Puffer oder die Zelle kann z. B. den Einsatz einer Kathodenelektrode und einer Anodenelektrode und einer Spannungsquelle einschließen. Gemäß einer Ausführungsform ist die Vorrichtung in der Lage, ein elektrisches Wechselfeld zu erzeugen. Die Elektroden können so an gegenüberliegenden Seiten des IEF-Puffers oder der Zelle angeordnet sein, dass das elektrische Feld durch den IEF-Puffer oder die Zelle gelenkt wird. Gemäß einer Ausführungsform sind die Elektroden Drähte. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die Elektroden parallele Gruppen von Drähten oder dünnen Platten. Siehe z. B. 2-6. Die Vorrichtung kann eine Wechselspannung oder eine Gleichspannung bereitstellen. Wenn sich der IEF-Puffer oder die Zelle in einem geschlossenen System befindet (z. B. das elektrische Feld nicht durch eine Seite des IEF-Puffers oder der Zelle eintreten und durch die gegenüberliegende Seite des IEF-Puffers oder der Zelle austreten kann), dann ist es vorteilhaft, dass die Vorrichtung in der Lage ist, ein elektrisches Feld in den IEF-Puffer oder die Zelle, die den IEF-Puffer enthält, und aus diesem bzw. dieser wieder hinauszulenken (d. h. ein elektrisches Wechselfeld). Die Orientierung des Wechselfeldes muss nicht senkrecht zur Ebene des Arrays oder der vorderen Ebene des IEF-Puffers oder der Zelle sein. Sie kann zwischen +90 und -90 Grad bezüglich der Ebene des Arrays liegen, wobei immer eine Feldkomponente parallel zur Achse des IEF-Puffers oder der Zelle erhalten bleibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform bestehen die Elektroden aus Platin oder Titan oder sind mit Platin oder Titan beschichtet. Gemäß einer Ausführungsform haben die Elektroden einen Abstand zwischen 0,5 und 10 cm voneinander. Gemäß einer anderen Ausführungsform sind die Elektroden in einem Abstand von 5 cm angeordnet. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist der Abstand zwischen den Elektroden der minimale Abstand, der es dem Laufpuffer noch erlaubt, quer zu den Zellen zu zirkulieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform entspricht der Abstand der Elektroden ungefähr der Länge der Matrix oder der Länge der Zelle.
  • Die auf den Laufpuffer einwirkende Spannung kann eine Gleichspannung oder eine Wechselspannung sein. Wenn der IEF-Puffer oder die Zelle geschlossen ist und die einwirkende Spannung eine Gleichspannung ist, dann muss ein Weg zur Verfügung stehen, die Richtung des elektrischen Feldes manuell oder automatisch so alternieren zu lassen, dass das elektrische Feld in den IEF-Puffer oder die Zelle und aus diesem bzw. aus dieser hinaus gerichtet ist. Gemäß einer Ausführungsform kann die Richtung des elektrischen Feldes durch das manuelle oder automatische Umschalten der Polarität der einwirkenden Spannung oder durch das Rotieren des IEF-Puffers oder der Zelle um 180 Grad in einem konstanten elektrischen Feld verändert werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Spannung eine Wechselspannung.
  • H. Vorrichtungen für die Umwälzung des Puffers
  • Eine Vorrichtung für die Umwälzung des Laufpuffers quer zum IEF-Puffer oder zur Zelle umfasst gleichzeitig z. B. ein Rührstäbchen, das in der Kammer vorhanden ist und von einer magnetischen Platte gesteuert wird, oder andere Vorrichtungen zur Umwälzung von Flüssigkeiten, die in diesem Gebiet bekannt sind (z. B. Pumpen, Vibratoren, z. B. Piezo-Vibratoren, Rührer, Kippvorrichtungen). Siehe 2. Bei einer anderen Ausführungsform kann die Vorrichtung zur Umwälzung ein Mechanismus zur Bewegung des IEF-Puffers oder der Zelle relativ zum Laufpuffer sein. Zum Beispiel kann der IEF-Puffer oder die Zelle im Laufpuffer rotiert werden. Die Aktivität derartiger Vorrichtungen ist während des Schrittes der ersten Dimension (des IEF-Schrittes) in den Verfahren und Systemen nützlich. Die Zirkulation des Laufpuffers oder der Zellen relativ zum Laufpuffer fördert eine gute Exposition der interessierenden Biomoleküle gegen ihre jeweiligen IEF-Puffer oder Zellen. Alternativ können die Verfahren und Systeme keinerlei derartige Umwälzvorrichtung aufweisen. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Umwälzung ausschließlich durch die Konvektionsströme bereitgestellt, die während der isoelektrischen Fokussierung auf natürliche Weise erzeugt werden. Gemäß einer Ausführungsform liegt die Konvektionsenergie, die für die Umwälzung des Biomoleküls ausreicht, bei 10-10 Joule pro 1 cm3 des Laufpuffers.
  • I. Vorrichtungen zur Lenkung eines elektrischen Feldes
  • Eine Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen Feldes längs der Spur und weg vom IEF-Puffer oder der Zelle kann mehrere unterschiedliche Anordnungen von Komponenten umfassen. Diese Vorrichtung bewirkt die Bewegung der Biomoleküle im IEF-Puffer in die Spur hinein und entlang der Spur. Demgemäß sollte die Richtung des elektrischen Feldes in der zweiten Dimension, die eine Auftrennung der Spur bewirkt, in erster Linie weg vom IEF-Puffer und entlang der Spur gerichtet sein. Zum Beispiel kann eine Elektrode an einem Ende der IEF/Spur-Einheit angeordnet sein (z. B. an der Spitze des IEF-Puffers) und eine weitere am anderen Ende der IEF/Spur-Einheit (zum Beispiel am Ende der Spur). Alternativ kann eine Elektrode am Ende der Spur angeordnet sein, und die andere Elektrode kann eine sein, die im vorhergehenden Schritt der IEF-Trennung eingesetzt wurde. Siehe z. B. 28. Die bereitgestellte Spannung kann eine Gleichspannung sein. Netzgeräte und Elektroden, die einen Gleichstrom bereitstellen können, sind im Handel erhältlich und in diesem Gebiet bekannt.
  • J. Systeme oder Kits
  • Ein System umfasst mehrere Komponenten, die als ein Kit, das zerlegt oder zusammengebaut ist, verkauft werden können. Zu Komponenten des Kits gehören ein IEF-Puffer, eine Zelle, eine Matrix oder ein Array und gegebenenfalls eine Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen Feldes in den IEF-Puffer und die Zelle hinein und heraus und/oder eine Kammer mit einem Laufpuffer. Das System schließt gegebenenfalls auch eine Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen Feldes entlang einer Spur und weg vom IEF-Puffer oder der Zelle ein. Das System schließt gegebenenfalls ferner eine Vorrichtung zur Umwälzung des Laufpuffers quer zum IEF-Puffer oder zu der Zelle ein. Beispiele für Systeme sind in 17 und 28 gezeigt. Gemäß einer Ausführungsform ist die Kammer ein Einmalartikel und weist Anschlüsse auf, die für eine Anbindung an die Spannungsquelle an der Unterseite oder an der Seite der Kammer angebracht sind.
  • Ein System kann ferner eine beliebige der folgenden Komponenten umfassen: eine Vorrichtung zum Nachweis der Biomoleküle der Probe in einer Zelle oder Spur, eine Vorrichtung zur Aufnahme der Daten aus der Nachweisvorrichtung und eine Vorrichtung zur Verarbeitung der aufgenommenen Daten. Gemäß einer Ausführungsform weist ein Scanning-Mikrodensitometer das Signal aus der Zelle oder den Zellen oder der Spur oder den Spuren nach, nimmt es auf und verarbeitet es.
  • Nachweisvorrichtungen
  • Es kann eine der Vorrichtungen oder es können mehrere der Vorrichtungen, die zum Nachweis der Biomoleküle der Probe in der Zelle oder der Spur, zum Empfang der Daten aus der Nachweisvorrichtung und zur Verarbeitung der empfangenen Daten erforderlich ist bzw. sind, in einem Computer gebündelt vorliegen.
  • Eine Nachweisvorrichtung kann so ausgelegt sein, dass sie elektromagnetische Strahlung, das heißt, ein Spektrum an Wellenlängen, eine Vielzahl von Wellenlängen oder eine Wellenlänge gleichzeitig oder nacheinander auf eine Spur projiziert. Gemäß einer Ausführungsform ist die einstrahlende Lichtquelle monochromatisch. Zum Beispiel kann die Nachweisvorrichtung ein speziell angefertigtes Fotometer sein, das schnell und nacheinander die Extinktion eines jeden IEF-Puffers einer jeden Zelle oder Spur bei einer spezifischen Wellenlänge aufzeichnet, nachdem ein enges Lichtspektrum auf einen jeden IEF-Puffer, eine jede Zelle oder Spur projiziert worden ist. Alternativ kann die Nachweisvorrichtung so konstruiert sein, dass sie jeden IEF-Puffer, jede Zelle oder Spur gleichzeitig vermisst und/oder bei verschiedenen Wellenlängen Messungen vornimmt, die die elektromagnetischen Strahlung betreffen, die von einem jeden IEF-Puffer, einer jeden Zelle oder Spur emittiert wird.
  • Zu geeigneten Nachweisvorrichtungen gehören, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, das bloße Auge, Spektralfotometer, Instrumente, die Chemilumineszenz nachweisen, fotometrische/densitometrische Instrumente, elektrochemische oder radiochemische Instrumente, und zwar in Abhängigkeit davon, ob das Biomolekül markiert ist, und in Abhängigkeit vom Typ der Markierung. Die Markierung kann andere Komponenten zur Erzeugung einer Reaktion erfordern, die ein Signal erzeugt oder das Signal verstärkt, das mittels der oben erwähnten Verfahren nachweisbar ist. Eine detaillierte Diskussion geeigneter signalerzeugender Systeme findet sich bei Ullman et al., US-Patent Nr. 5 185 243 , Spalten 11-13. Details der Techniken zur Anbringung von Markierungen sind in diesem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. Matthew et al., Anal. Biochem. (1985) 151: 205-209 und Engelhardt et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0302175.
  • Anforderungen an den Computer
  • Gemäß einer Ausführungsform enthält der Computer ein Modul, das in der Lage ist, die Durchführung der folgenden Schritte durch den Computer zu bewirken: a) die Aufnahme experimenteller Daten aus der Spur bzw. den Spuren und b) die Erzeugung eines Profils, das für die Biomoleküle in der Probe und/oder die interessierenden Biomoleküle in der Probe repräsentativ ist. Ein derartiges Modul kann für die schnelle Identifizierung, Sichtung und Auswahl weiterer funktionell annotierter Arzneimittel-Targets bei Erkrankungen nützlich sein. Gemäß einer anderen Ausführungsform enthält der Computer ein Modul, das in der Lage ist die Durchführung der folgenden Schritte durch den Computer zu bewirken: a) die Aufnahme experimenteller Daten aus der Spur bzw. den Spuren und Erzeugung eines Profils von Biomolekülen in der Probe, b) die Aufnahme eines Vergleichsprofils und c) das Berechnen einer objektiven Maßes für die Ähnlichkeit der beiden Profile. Die Vergleichsprofile können Werte umfassen, die in diesem Gebiet bekannt sind oder Werte, die vom Forscher einprogrammiert wurden.
  • Vernetzung
  • Der Computer kann mit einem Netzwerk verbunden sein, das ein Teil einer Ethernet-Verknüpfung mit anderen lokalen Computersystemen, entfernten Computersystemen oder Großraum-Kommunikationsnetzwerken wie dem Internet sein kann. Die Netzwerkanknüpfung ermöglicht es dem Computer, Daten und Datenverarbeitungsaufgaben mit anderen Computerverknüpfungen zu teilen. Der Zugriff auf gemeinsame Daten ist besonders für genetische Analysen oder Proteomanalysen, für diagnostische Zwecke, Früherkennungszwecke oder generelle Forschungszwecke nützlich. Zum Beispiel kann der Computer auf die Erkennung eines bestimmten Profils (z. B. eines Protein- oder RNA-Expressionsmusters), das einen bestimmten Krankheitszustand oder eine Anfälligkeit gegenüber einem bestimmten Krankheitszustand auf Basis bekannter Informationen anzeigt, voreingestellt sein. Dann kann eine Probe eines Subjekts mittels des Systems zur Bestimmung, ob die Biomoleküle in der Probe das gleiche Profil aufweisen, getestet werden.
  • Handhabung der Probe und des Puffers
  • Weiterhin kann das System zusätzlich wenigstens eine, eine Kombination oder alle der folgenden Komponenten umfassen: einen Probengeber, eine Abfallentsorgung, eine Pufferzuleitung, einen Färbereagenszugeber, ein System zum Array-Handling und ein Display. Ein Probengeber kann so programmiert sein, dass er ein Aliquot einer Probe in die Kammer gibt. Eine Abfallentsorgung kann so programmiert sein, dass sie Abfallmaterial (z. B. Laufpuffer nach dessen Verwendung) zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Analyse entfernt. Eine Pufferzuleitung kann so programmiert sein, dass sie neuen oder einen anderen Puffer zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Analyse abgibt. Ein Färbereagenszugeber kann so programmiert sein, dass er die Biomoleküle für einen vorgewählten Zeitraum für die Färbung abgibt und exponiert. Ein System zum Array-Handling kann so programmiert sein, dass es die Matrix, den Array oder die Kammer nach Bedarf während der Analyse bewegt. Ein Display kann ein Bildschirm oder eine sonstige Vorrichtung sein, die Informationen bezüglich der Ergebnisse der ein- oder zweidimensionalen Analyse bereitstellt. Siehe z. B. 27.
  • Automatisierung
  • Gemäß einer Ausführungsform ist das System vollständig oder teilweise automatisiert, sodass eine Probe oder mehrere Proben mittels der Verfahren analysiert werden kann bzw. können. Zum Beispiel könnte eine Probe zu dem System gegeben werden, das so programmiert ist, dass es alle Schritte der ein- oder zweidimensionalen Analyse durchführt, ein Bild der Spuren aufnimmt und die Information empfängt, verarbeitet und bestimmt, ob ein spezifisches Biomolekül oder Muster von Biomolekülen vorliegt.
  • Ein System kann so konstruiert sein, dass es zusätzliche automatisierte, interagierende Komponenten aufweist, zum Beispiel Titratoren zur Füllung der Kanäle mit pH-Lösungen oder Gelen (Immobilinen, Ampholytmischungen etc.) und Extraktoren zur Gewinnung von Biomolekülen aus den IEF-Puffern, Zellen oder Spuren. Gemäß einer Ausführungsform ist das System für ein High-Throughput-Screening von Proben, Verbindungen oder Arzneimitteln automatisiert.
  • II. Proben, die analysiert oder getrennt werden sollen
  • A. Biomoleküle, die analysiert oder getrennt werden sollen
  • Zu Biomolekülen gehören beliebige organische Moleküle, die in einer biologischen Probe vorhanden sind und die eine Ladung aufweisen, wie Peptide, Proteine, Oligosaccharide, Lipide, Steroide, Prostaglandine, Prostacycline und Nucleinsäuren (einschließlich von DNA und RNA). So, wie er hier verwendet wird, schließt der Begriff „Biomolekül" unmodifizierte, glykierte, nicht glykierte, phosphorylierte, unphosphorylierte und auf sonstige Weise modifizierte Biomoleküle ein. Zum Beispiel kann ein Biomolekül vor der Trennung in der ersten Dimension markiert werden (zum Beispiel durch eine Markierung mit 35S-Methionin oder eine Markierung mit 32P). Gemäß einer Ausführungsform sind die Biomoleküle Proteine, die vom Menschen hergestellt worden sein können oder natürlich vorkommen. Ein Protein ist ein Peptid, das eine Länge haben kann, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, aus weniger als 500 Resten, weniger als 300 Resten, weniger als 200 Resten, weniger als 100 Resten, weniger als 50 Resten, weniger als 25 Resten und weniger als 15 Resten besteht.
  • B. Ziel-Biomoleküle und Zielerkennungsmoleküle
  • Ein Ziel-Biomolekül („ZB") ist ein interessierendes Biomolekül, das spezifisch von einem Zielerkennungsmolekül („ZEM") erkannt werden kann. Bei einer Ausführungsform ist das Ziel-Biomolekül ein Marker für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand. Das Ziel-Biomolekül kann ein Biomolekül sein, das bezüglich der Probe endogen ist, oder das exogen ist, d. h. der Probe oder dem Laufpuffer zugesetzt wurde. Das interessierende Biomolekül kann so modifiziert sein, dass es ein ZB ist, das eine Affinität oder größere Affinität für ein ZEM aufweist. Zum Beispiel kann das interessierende Biomolekül kovalent modifiziert sein, sodass es zusätzlich ein Peptid aufweist, das ein Epitop enthält, das spezifisch an ein ZEM, wie einen Antikörper, bindet.
  • Ein ZEM ist ein Molekül, das spezifisch einen Teil des ZB bindet. Das ZEM kann für die Bereitstellung oder Verstärkung eines Signals zum Nachweis und/oder zur Bereitstellung eines Signals, das sich vom Hintergrund unterscheidet, nützlich sein. Zum Beispiel kann ein ZEM ein markierter Antikörper sein, der spezifisch das ZB erkennt, wie ein monovalenter (monoepitopischer) oder ein polyvalenter (polyepitopischer) polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper oder ein Antikörperfragment (z. B. Fab, Fv und F(ab')2, Fab' und dergleichen). Zusätzlich können gegebenenfalls Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder deren Fragmente eingesetzt werden, solange die Bindungsaffinität für ein bestimmtes Zielbiomolekül erhalten bleibt. In dem Falle, in dem das Zielbiomolekül ein Antikörper ist, können Antikörper eingesetzt werden, die spezifisch diesen Antikörper binden. Bei einem anderen Beispiel kann das ZEM ein Ligand oder ein Rezeptor sein, der an das ZB bindet, wenn das ZB ein Rezeptor bzw. ein Ligand ist. Bei noch einem anderen Beispiel kann das ZEM ein einsträngiges Nucleinsäuremolekül sein, das spezifisch an das ZB bindet oder mit ihm hybridisiert, wenn das ZB ein Nucleinsäuremolekül ist. Alternativ kann das ZEM ein Nucleinsäure-bindendes Protein sein, wie ein Transkriptionsfaktor, ein Spleißfaktor, ein Histon oder dergleichen, der bzw. das an ein Nucleinsäuremolekül bindet. Bei noch einem anderen Beispiel kann ein ZEM ein Molekül sein, das spezifisch an die aktive Stelle eines Enzyms bindet, wenn das ZB dieses Enzym ist.
  • Dementsprechend können das ZB und das ZEM sm-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA, DNA-RNA-Duplexe; an Polynucleotide bindende Agenzien wie, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, Restriktionsenzyme, Aktivatoren, Repressoren, Nucleasen, Polymerasen, Histone, Reparaturenzyme und Chemotherapeutika; Antigene und Antikörper; nicht-immunologische Paare wie Avidin und Biotin; Rezeptoren und Liganden, einschließlich membrangebundener Rezeptoren wie G-Protein-Rezeptoren (z. B. muscarinische und adrenerge Rezeptoren, Prostaglandin- und Dopamin-Rezeptoren, wie der D2-Rezeptor), Tyrosinkinaserezeptoren (für die Wachstumsfaktoren IGF, EGF, NGF und FGF), Ionenkanäle und T-Zell-Rezeptoren sein.
  • C. Markierungen oder Tags für die Biomoleküle
  • Die Biomoleküle können vor dem Schritt der IEF-Trennung oder nach der Trennung in der zweiten Dimension für einen Nachweis markiert sein, z. B. mittels Verfahren mithilfe des bloßen Auges, mittels spektralfotometrischer Verfahren, mittels Chemilumineszenzverfahren, fotometrischer/densitometrischer Verfahren, elektrochemischer oder radiochemischer Verfahren oder mittels einer bildgebenden Darstellung mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz. Die Markierung kann ein nachweisbares Molekül sein, wie eine Verbindung, eine Nucleinsäure oder ein Protein (z. B. ein Antikörper), die bzw. das markiert ist oder endogen nachweisbar ist und spezifisch das Biomolekül erkennt. In dem Falle, in dem das Biomolekül vor dem Schritt der IEF-Trennung markiert wurde, wird sich der pI des Biomoleküls wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins der Markierung ändern, und somit werden sich die für das Fangen des Komplexes geeigneten pH-Werte der IEF-Puffer oder der Zellen ändern. Das Biomolekül kann mittels Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, nach der zweiten Dimension markiert werden, z. B. durch ein Western Blotting.
  • Es sind verschiedene unspezifische Farbstoffe für Biomoleküle in diesem Gebiet bekannt und für die Markierung von Biomolekülen nützlich, z. B. Coomassie-Blue, eine Silberfärbung, der Hoechst-Farbstoff und 4',6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Die jeweils verwendeten Farbstoffe und Markierungen hängen vom interessierenden Biomolekül ab.
  • Zu Markierungen, die für den Nachweis von Biomolekülen nützlich sind, können Fluorophore, Substrate, Elektronentransferagenzien, Coenzyme, Verstärker, Enzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Scavenger, Metallionen und eine spezifisch bindende Substanz, die für die Bindung der signalerzeugenden Substanzen erforderlich ist, gehören. Beispielen für Markierungen sind Fluorophore wie Fluorescein, Cyaninfarbstoffe, Cumarine, Phycoerythrin, Phycobiliproteine, Dansylchlorid, Isothiocyanat, Rhodamin-Verbindungen, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin und Texasrot gehören. Zu geeigneten Markierungen gehören, und zwar zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung, Enzyme wie die alkalische Phosphatase, die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase („G6PDH") und die Meerrettichperoxidase; Promotoren; Farbstoffe; elektrolumineszierende Markierungen wie Rutheniumchelate; chemilumineszierende Verbindungen wie Isoluminol; Sensitizer; Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive Markierungen wie 125I, 131I, 14C, 3H, 57Co und 75Se. Geeignete Enzyme und Coenzyme werden im US-Patent Nr. 4 275 149 an Litman et al., Spalten 19-28, und im US-Patent Nr. 4 318 980 an Bogulaski, Spalten 10-14, offenbart. Geeignete fluoreszierende und chemilumineszierende Substanzen werden bei Litman et al. in den Spalten 30 und 31 offenbart.
  • Ein gegen ein interessierendes Biomolekül generierter Antikörper kann mit einem Fluorophor markiert sein. Das Fluorophor kann so ausgewählt werden, dass es bei einer spezifischen Wellenlänge einen hohen Extinktionskoeffizienten oder eine hohe Fluoreszenz-Ausbeute zeigt.
  • Es kann ein markierungsfreier Nachweis (z. B. eine Oberflächenplasmonresonanz) zum Nachweis einzelner Biomoleküle oder Komplexe eingesetzt werden. Zum Beispiel können die Zellen oder Matrizes auf einem festen Träger in der Kammer sitzen, der auf eine Weise biotinyliert wurde, dass Zellen mit unterschiedlichen pH-Bereichen auf einem oder mehreren Biotin-Molekül(en) sitzen. Ziel-Biomoleküle oder Zielerkennungsmoleküle können so modifiziert werden, dass sie vom Streptavidin gebunden werden, und dann in die Zellen oder in den Laufpuffer eingebracht werden. Komplexe mit dem passenden pI diffundieren in eine Zelle oder mehrere Zellen mit dem passenden pH und bilden einen tertiären Komplex mit den vorhandenen Biotinmolekülen. Eine derartige Bindung kann mittels eines Oberflächenplasmonresonanz-Sensors unterhalb des festen Trägers nachgewiesen werden, wobei das Resonanzsignal mittels der besagten Nachweiseinrichtung nachgewiesen und verarbeitet wird.
  • Ein Komplex, der ein ZB und ein ZEM umfasst, wobei die Komponenten des Komplexes kovalent oder nicht-kovalent aneinander gebunden sind, kann lediglich ein ZB und ein ZEM umfassen, oder er kann zusätzlich weitere Moleküle umfassen, wie andere Biomoleküle, Metallionen, Nachweisgruppen oder Markierungen. Der letztendliche pI-Wert des Komplexes bestimmt, ob der Komplex in einer bestimmten Zelle oder in keiner der Zellen der Apparatur akkumuliert. Wenn in einer einzigen Probe mehrere interessierende Komplexe vorliegen, die bestimmt werden sollen, ist es äußerst erwünscht, dass die Komplexe nicht die gleichen pI-Werte aufweisen oder die gleiche Markierung haben.
  • D. Proben
  • „Probe" bezieht sich auf eine beliebige feste oder flüssige Probe, die erhalten wird, ausgeschieden wird oder sezerniert wird von einem beliebigen lebenden Organismus, einschließlich einzelliger Mikroorganismen (wie von Bakterien und Hefen) und vielzelliger Organismen (wie von Pflanzen und Tieren, zum Beispiel eines Wirbeltiers oder eines Säugetiers, und insbesondere eines gesunden oder anscheinend gesunden Menschen oder eines menschlichen Patienten, der unter einer Erkrankung oder Krankheit leidet, die diagnostiziert oder untersucht werden soll). Eine biologische Probe kann eine biologische Flüssigkeit sein, die von einem beliebigen Ort stammt (z. B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Galle, Synovialflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser, Samen, Zervixschleim, Sputum, Speichel, Gingivalflüssigkeit, Kammerwasser oder Glaskörperflüssigkeit oder eine beliebige Absonderung des Körpers), ein Transsudat, ein Exsudat (z. B. eine Flüssigkeit, die aus einem Abszess oder einer anderen infizierten oder entzündeten Stelle erhalten wurde), oder eine Flüssigkeit, die aus einem Gelenk erhalten wurde (z. B. einem normalen Gelenk oder einem Gelenk, das unter einer Erkrankung wie rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, Gicht oder einer septischen Arthritis leidet).
  • Alternativ kann eine Probe von jedem beliebigen Organ oder Gewebe (einschließlich einer Biopsie- oder eine Autopsieprobe) erhalten werden, oder sie kann Zellen umfassen (seien es primäre Zellen oder kultivierte Zellen) oder Medium, das von einer beliebigen Zelle, einem beliebigen Gewebe oder Organ konditioniert wurde. Wenn es gewünscht ist, kann die biologische Probe einer vorläufigen Bearbeitung, einschließlich einer Vortrennung, unterzogen werden. Zum Beispiel können Zellen oder Gewebe extrahiert und einer subzellulären Fraktionierung unterzogen werden, damit Biomoleküle in verschiedenen subzellulären Fraktionen separat analysiert werden können, zum Beispiel Proteine oder Arzneimittel, die in unterschiedlichen Teilen der Zelle vorkommen. Siehe Deutscher (Hrsg.), Methods in Enzymology, Bd. 182, S. 147-238 (1990).
  • III. Anwendungsverfahren
  • A. Analyse
  • Die Matrix, Arrays, Systeme und Verfahren sind für die schnelle Bestimmung des pI eines Biomoleküls nützlich, indem sie es dem Forscher ermöglichen, unterschiedliche breite oder enge pH-Wert-Bereiche zu testen. Bei einer Ausführungsform kann ein interessierendes Biomolekül in einer Probe direkt in eine Vielzahl von Zellen mit unterschiedlichen pH-Bereichen gegeben und manuell oder automatisch mittels der zuvor erwähnten Nachweisvorrichtungen und -systeme analysiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann ein interessierendes Biomolekül in einer Probe direkt in den Laufpuffer gegeben werden, wobei die IEF-Puffer/Zellen oder Spuren manuell oder automatisch mittels der zuvor erwähnten Nachweiseinrichtungen und -systeme analysiert werden.
  • Ein Biomolekül, das sortiert, abgetrennt, charakterisiert, quantifiziert und/oder mit anderen Molekülen verglichen worden ist, kann mittels Verfahren und kommerzieller Systeme weiter untersucht werden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind (z. B. eine Silberfärbung, Immunfärbung, Hochdruckflüssigchromatografie (HPLC), Affinitätschromatografie, Kapillarelektrophorese, Polyacrylamidelektrophorese, SDS-PAGE, Zentrifugation, Gradientengelelektrophorese, Techniken einer isoelektrischen Fokussierung, Ausschneiden des proteinhaltigen Bereiches gefolgt von anderen Analyseverfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, z. B. einer Massenspektrometrie (PE Biosystems, PerSeptive-DE-STR-MALDI-TOF-MS und Bruker-Esquire-Ion-Trap-MS). Im Gegensatz zur herkömmlichen IEF-Fokussierung gefolgt von einer MALDI-TOF-Spektrometrie ermöglicht das System den Nachweis kleiner Mengen an Biomolekülen. Zum Beispiel ist das System in der Lage, bei Einsatz einer Silberfärbung Femtomol-Mengen an Protein nachzuweisen, hohe Attomol-Mengen an Protein oder 1-200 pg Protein im Standardbereich von 10-200 kDa.
  • Das kann erreicht werden, indem eine zweidimensionale Analyse im kleinen Maßstab unter Verwendung einer Matrix von 5 cm × 5 cm oder kleiner, die Einheiten aus IEF-Puffern/Spuren umfasst, durchgeführt wird, die aufgetrennten Biomoleküle mit Biomolekülen verglichen werden, die auf einem herkömmlichen, größeren IEF-Fokussierungsgel aufgetrennt wurden, und die Analyse im kleineren Maßstab zur Bestimmung der Lage des entsprechenden Bereiches auf dem herkömmlichen IEF-Fokussierungsgel, der für die weitere Analyse mit einer anderen Technik (z. B. Massenspektrometrie) ausgeschnitten werden soll, eingesetzt wird. Eine spezielle Halterung mit einem Vergrößerungsglas und einer speziell angefertigten Schneidevorrichtung kann das Ausschneiden der Stelle, die das interessierende Biomolekül enthält, erleichtern. Die Menge des Proteins in dem ausgeschnittenen Stück kann zum Beispiel über eine Eichskala für die optische Dichte bestimmt werden, die durch das Färben bekannter Mengen des mittels der Verfahren aufgetrennten Biomoleküls erstellt wird.
  • Somit erweitert das System den Bereich der mittels Massenspektrometrie nachweisbaren Biomoleküle und ermöglicht die Analyse von Proteinen, die dazu tendieren, in der Zelle in sehr geringen Mengen exprimiert zu werden. Demgemäß kann ein Protein im Bereich von Subpicogrammmengen nachgewiesen und mittels Massenspektrometrie sichtbar gemacht werden. Das System stellt ein genaues und reproduzierbares Verfahren zur Ermittlung des pI-Wertes und der Masse eines Biomoleküls bereit.
  • Wenn das Protein in der Probe aus dem Blut oder aus einer Gewebeprobe stammt, können krankheitsspezifische Proteine in einer oder zwei Dimension(en) aufgetrennt werden, und diese Proteine in den Spuren können mittels in diesem Gebiet bekannter Verfahren bestimmt werden (z. B. Silberfärbung, Immunfärbung, Hochdruckflüssigchromatografie (HPLC), Affinitätschromatografie, Kapillarelektrophorese, Polyacrylamidelektrophorese, SDS-PAGE, Zentrifugation, Gradientengelelektrophorese, Techniken der isoelektrischen Fokussierung, Ausschneiden des proteinhaltigen Bereichs gefolgt von anderen in diesem Gebiet bekannten Analyseverfahren, z. B. einer Massenspektrometrie etc.).
  • Es kann ein Biomolekül oder es können mehrere Biomoleküle entsprechend seinem bzw. ihres pI fokussiert, sortiert, abgetrennt, gereinigt, charakterisiert, quantifiziert und/oder mit anderen Biomolekülen verglichen werden. Die Konzentration der Biomoleküle kann in einer Probe zunehmen oder abnehmen, oder sie können als Reaktion auf ein Ereignis physikalisch modifiziert werden. Zum Beispiel können die Verfahren und Systeme quantitativ und/oder qualitativ eine Veränderung eines Biomoleküls als Reaktion auf eine Erkrankung, eine Behandlung mit einem Arzneimittel, den Lebenszyklus oder einen anderen Stimulus verfolgen. Zum Beispiel kann die Modifikation eines Proteins mit Phosphat oder ein Proteinspiegel vor und nach der Behandlung des Proteins oder der Umgebung um das Protein herum mit einem Stimulus verfolgt werden. Das System und die Verfahren können dazu eingesetzt werden, die Akkumulation des Proteins in einer Zelle zu beobachten, deren pH-Wert sich nach der Behandlung mit dem Stimulus von dem vorherigen pH-Wert unterscheidet.
  • Die anormale Expression von Proteinen in der Probe aus einem Tier oder aus einer Pflanze im Vergleich zu einem nicht erkrankten Tier oder einer nicht erkrankten Pflanze kann das charakteristische Kennzeichen einer spezifischen Erkrankung sein. Die relative Häufigkeit von Biomolekülen kann für eine Diagnose oder Früherkennung einer Erkrankung (z. B. Krebs) mit einem normalen Muster verglichen werden. Die relative Häufigkeit eines Biomoleküls in Zellen kann durch die Zugabe einer bekannten Menge eines spezifischen Proteins in die Probe vor der Trennung und den Vergleich der Messungen der optischen Dichte mit der optischen Dichte des zugefügten Proteins normalisiert werden. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Auftreten oder das Verschwinden oder die Veränderung der physikalischen Eigenschaften eines Biomoleküls im getesteten Tier oder in der getesteten Pflanze im Vergleich zu einem normalen Tier oder einer normalen Pflanze zur Diagnose oder Früherkennung einer Erkrankung eingesetzt werden. Bei noch einer anderen Ausführungsform kann die Modifikation eines Biomoleküls im getesteten Tier oder in der getesteten Pflanze im Vergleich zu einem normalen Tier oder einer normalen Pflanze zur Diagnose oder Früherkennung einer Erkrankung herangezogen werden.
  • Ein Krankheitszustand ist eine beliebige Erkrankung, die über eine Veränderung eines Biomoleküls in einer Probe (z. B. des Hämoglobins bei Diabetikern) oder über das Fehlen oder das Neuvorhandensein eines Biomoleküls (z. B. Proteinen aus bakteriellen Infektionen) nachgewiesen werden kann. Zum Beispiel können die folgenden genetischen Erkrankungen über eine Veränderung der DNA- oder Proteinspiegel diagnostiziert werden: die Huntington-Krankheit, Prostatakrebs, das Fragile-X-Syndrom vom Typ A, die Myotone Dystrophie vom Typ I, Kennedys Krankheit, die Machado-Joseph-Krankheit, die Dentato-Rubro-Pallido-Luysische Atrophie und die Spinobulbäre Muskelatrophie. Die Krankheit oder die Erkrankung kann auch mit einem Gen assoziiert sein, wie Genen, die für BRCA1, BRCA2 oder APC codieren, einem Gen, das für Dystrophin, Beta-Globin, den Faktor IX, den Faktor VIIc, die Ornithin-d-Aminotransferase, die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase oder den Cystic Fibrosis Transmembrane Receptor (CFTR) oder ein Protoonkogen codiert. Beispiele für Proteine, die bestimmt werden können, sind die Prostata-spezifischen Antigene (PSA) beim Prostatakrebs und Herzenzyme bei Herzerkrankungen. Alternativ kann eine Gruppe von Proteinen bestimmt werden. Bei noch einer anderen Ausführungsform können die Konzentrationsprofile spezifischer mRNAs zur Ermittlung eines potenziellen Krankheitszustandes analysiert werden.
  • Bei noch einer anderen alternativen Ausführungsform kann die Probe aus einer Zellkultur oder einem zellfreien In-vitro-Test erhalten werden. Zum Beispiel können Proben aus Tests, die die Verwendung von Zellfraktionen umfassen, der ein- oder zweidimensionalen Analyse unterzogen werden, bevor und nachdem die Zellfraktion von einem Arzneimittel oder einem anderen Stimulus beeinflusst worden ist. Bei einer anderen Ausführungsform können Extrakte aus einem sich entwickelnden Organismus oder aus dem Gewebe eines Subjekts analysiert werden, um die Veränderungen zu verstehen, die im Organismus oder im Tier während seines Lebenszyklus ablaufen. Zum Beispiel können Verbindungen, die Inhibitoren, Verstärker oder Auslöser eines biologischen Ereignisses sind, identifiziert werden. In allen diesen Tests können das ZB und das ZEM zu dem Extrakt gegeben werden, nachdem ein Stimulus auf den Extrakt, auf das Subjekt oder auf den Organismus, der/das getestet werden soll, eingewirkt hat. Bei einer Ausführungsform stellt man sich ein Verfahren für das High-Throughput-Screening von Kandidatenmolekülen, einschließlich von Proteinen und Verbindungen, die zu einer biologischen Reaktion führen, vor, das den Schritt des Nachweises eines ZB oder von ZBs in einer Probe mittels eines Systems oder Verfahrens umfasst.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann das ZEM zu der Probe gegeben werden, bevor oder nachdem die Probe, die das ZB umfasst, zu dem Laufpuffer gegeben worden ist. Gemäß einer Ausführungsform wird das ZEM zu der Probe, die das ZB umfasst, gegeben, bevor die Probe zum Laufpuffer gegeben wird. In allen Fällen ist es äußerst erwünscht, das ZB und das ZEM unter Bedingungen gegeneinander zu exponieren, die ihre Bindung aneinander nicht hemmen oder aufheben.
  • Der Begriff Proteom bezieht sich auf alle von einem Genom exprimierten Proteine. Proteomics umfasst die Identifizierung und Untersuchung von Proteinen im Körper und die Bestimmung ihrer Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Funktionen. Die Verfahren, Matrizes, Arrays und Systeme ermöglichen schnellere, empfindlichere Techniken zur Untersuchung des Proteoms. Mit dieser Erfindung können detailliertere und genauere funktionelle Proteomkarten der zellulären Aktivität entwickelt werden, was zu einem besseren Verständnis von Krankheiten und der Entdeckung neuer Arzneimittel führt.
  • Der Begriff „Verfolgen", wie er hier verwendet wird, soll sowohl kontinuierliche Messungen als auch Endpunktsbestimmungen einschließen. Bei einigen Ausführungsformen werden die Biomoleküle der Proben kontinuierlich gemessen. Bei anderen Ausführungsformen werden die Biomoleküle analysiert, bevor und nachdem eine Zelle oder ein Subjekt stimuliert oder auf sonstige Weise gestört worden ist (z. B. durch die Gabe eines Arzneimittels oder eine Veränderung der Umgebung um die Zelle oder um das Subjekt herum). Bei noch anderen Ausführungsformen werden die Biomoleküle in einer Kontrollgruppe von Proben gemessen, die nicht gestört wurden, und die zellulären Bestandteile verschiedener experimenteller Gruppen werden gemessen und mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Es ist Fachleuten auf diesem Gebiet klar, dass andere experimentelle Designs ebenfalls für das Verfahren zum Nachweis der Veränderung von Biomolekülen als Reaktion auf Störungen geeignet sind.
  • B. Trennungen
  • Das System stellt ein Verfahren zur Auseinandersortierung von Biomolekülen in einer Probe bereit. Gemäß einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird eine Probe, die die Biomoleküle umfasst, zu einem System gegeben und quer zu einem IEF-Puffer oder einer Zelle zirkuliert, einem in den IEF-Puffer oder die Zelle hinein und heraus gerichteten reversiblen elektrischen Wechselfeld exponiert und dann gegebenenfalls in einer zweiten Dimension aufgetrennt, zum Beispiel durch das Exponieren der Biomoleküle gegen ein elektrisches Feld, das entlang der Spur und weg vom IEF-Puffer oder von der Zelle gerichtet ist.
  • Das System stellt ein Verfahren zur Charakterisierung eines Biomoleküls in einer Probe bereit. Gemäß einer Ausführungsform kann das interessierende Biomolekül oder können die interessierenden Biomoleküle getrennt, isoliert und/oder in einer Dimension analysiert werden, indem die Probe zum Laufpuffer in einer IEF-Apparatur gegeben wird, das elektrische Feld erzeugt wird, der Laufpuffer zirkuliert wird und die Richtung des elektrischen Feldes in regelmäßigen Abständen umgekehrt wird. Alternativ könnte die Probe direkt zur Zelle, zum Kanal oder zu der Spur gegeben werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform des Verfahrens wird eine Probe, die das Biomolekül umfasst, zu einem System gegeben und quer zu einem IEF-Puffer oder einer Zelle zirkuliert, einem in den IEF-Puffer oder die Zelle hinein und heraus gerichteten elektrischen Wechselfeld exponiert, in einer zweiten Dimension aufgetrennt, zum Beispiel durch das Exponieren der Biomoleküle gegen ein elektrisches Feld, das entlang der Spur und weg vom IEF-Puffer oder der Zelle gerichtet ist, und anschließend werden die Position und die Menge des Biomoleküls in der Spur bestimmt. Die Identifizierung der Position oder der Menge des Biomoleküls in der Spur kann für die Bestimmung des pI des Biomoleküls, des Molekulargewichts des Biomoleküls und/oder seines Modifizierungszustandes nützlich sein. Eine Veränderung der Position eines Biomoleküls in einer Testprobe im Vergleich zum gleichen Biomolekül in einer Kontrollprobe kann eine Modifikation des Biomoleküls anzeigen (z. B. eine Phosphorylierung etc.). Eine Veränderung der Menge eines Biomoleküls in einer Testprobe im Vergleich zum gleichen Biomolekül in einer Kontrollprobe kann ein Ansteigen oder eine Abnahme der Menge des getesteten Biomoleküls aufgrund zum Beispiel einer Veränderung der Expression des Biomoleküls oder der Stabilität des Biomoleküls anzeigen.
  • Das System stellt ein Verfahren zur Quantifizierung der Menge eines Biomoleküls in einer Probe unter Verwendung einer Matrix, eines Arrays oder eines Systems bereit. Die Menge eines Biomoleküls in einer Spur kann mit Instrumenten bestimmt werden, die in diesem Gebiet bekannt sind und oben diskutiert wurden. Alternativ kann das Biomolekül in der Spur von einem anderen Molekül gebunden werden, das mit Instrumenten, die in diesem Gebiet bekannt sind, nachgewiesen werden kann. Die Menge des Biomoleküls kann aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen des gleichen Biomoleküls oder ähnlicher Typen von Biomolekülen (BSA für die Proteinbestimmung) extrapoliert werden. Das Biomolekül in der Spur kann auch für die Analyse und Quantifizierung aus der Spur ausgeschnitten werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird ein Biomolekül gemessen. Gemäß einer anderen Ausführungsform dieses Verfahrens wird eine Vielzahl von Biomolekülen mithilfe eines Computers gemessen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die Daten, die dem interessierenden Biomolekül oder der Vielzahl interessierender Biomoleküle in der Testprobe entsprechen, mit den Daten verglichen, die dem interessierenden Biomolekül oder der Vielzahl interessierender Biomoleküle aus einem Subjekt, das die Krankheit nicht hat oder nicht für diese Erkrankung prädisponiert ist (d. h. aus einem normalen Subjekt), verglichen. Es ist erwünscht, dass der Computer imstande ist, die Ähnlichkeiten und die Unterschiede zwischen den beiden Datensets zu vergleichen und zu berechnen. Die Parameter des Computers können so eingestellt sein, dass eine Schwelle erreicht wird, oberhalb der ein Ergebnis als positiv oder negativ erachtet wird.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform kann ein System zur Abtrennung von Biomolekülen und/oder Ionen in einer Probe von einem interessierenden Biomolekül durch die Zugabe der das interessierende Biomolekül umfassenden Probe zu einer Zelle im System verwendet werden. In diesem Falle hätte der IEF-Puffer in der Zelle einen pH-Wert oder pH-Werte, der bzw. die den pI des interessierenden Biomoleküls einschließt bzw. einschließen. Somit würden, wenn das reversible elektrische Feld und die Umwälzvorrichtung im System eingesetzt werden, andere Biomoleküle oder Ionen aus der Zelle hinauswandern, aber das interessierende Biomolekül würde in der Zelle verbleiben. Das interessierende Biomolekül kann aus dem IEF-Puffer oder aus der Zelle gewonnen werden. Alternativ kann eine Probe in eine Zelle gegeben werden und ein elektrischer Strom durch den IEF-Puffer oder die Zelle in nur einer Richtung senkrecht zur Ebene der für das Biomolekül permeablen Wände des Puffers oder der Zelle gelenkt werden.
  • In der gesamten vorliegenden Beschreibung soll das Wort „umfassen" oder sollen Varianten wie „umfasst" oder „umfassend" so verstanden werden, dass es bzw. sie den Einschluss einer genannten ganzen Zahl oder einer Gruppe ganzer Zahlen impliziert bzw. implizieren, aber nicht den Ausschluss einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder einer beliebigen Gruppe ganzer Zahlen.
  • Es sind zwar verschiedene Ausführungsformen vorgestellt worden, aber es ist offensichtlich, dass die grundlegende Konstruktion zur Bereitstellung anderer Ausführungsformen abgeändert werden kann, die die Zusammensetzungen und Verfahren einsetzen. Somit dürfte klar sein, dass der Umfang der Erfindung durch die Ausführungsformen der Erfindungen, die hier vorgestellt werden, und durch die Beschreibung abgesteckt wird und nicht durch die spezifischen Beispiele, die im Folgenden vorgestellt werden.
  • BEISPIEL 1
  • Molekulargewichtsstandards
  • Eine Rinne mit den Maßen 0,1 × 0,1 × 3,0 mm wurde in ein dünnes Plättchen aus para-Methoxymethylamphetamin (PMMA) eingraviert. Die Rinne wurde mit einem 10%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel gefüllt. An dem einen Ende der Spur wurde ein Fleck mit IEF-Puffer mit einem immobilisierten pH von 8,80 (willkürlich gewählt) aufgebracht. Es wurden 100 ng des Proteinleiter-Markers RPN 800 von Amersham Pharmacia Biotech (Molekulargewichte 10 bis 250 kDa) in den Fleck injiziert. Eine Metallelektrode wurde mit dem Gel mit dem immobilisierten pH-Gradienten verbunden, und eine weitere Metallelektrode wurde mit dem Ende der Spur, das am weitesten entfernt war, verbunden.
  • Das Plättchen wurde in einen Puffer aus 50 mM Tris-Glycin (pH 8,3) mit 1% SDS getaucht. Es wurde eine Spannung von 36 Volt (Feld ~100 V/cm) 5 Minuten an die Elektroden angelegt. Als Nächstes wurde die Spur silbergefärbt und fixiert. 18 ist ein optischer Scan der getrennten Banden, wie sie unter einem Mikroskop aussehen.
  • BEISPIEL 2
  • Zweidimensionale Analyse der Proteine des Blutplasmas bei pH 8,65 ± 0,05
  • Ein Fleck von 100 μm Durchmesser aus einem pH-Gel mit einem pH-Wert von 8,65 ± 0,05 (mit einer Pufferlösung gemischtes Polyacrylamidgel) wurde auf einen Polymer-Wafer, wie aus PMMA, von 1 cm × 1 cm × 0,3 mm aufgebracht. Der Wafer wurde in eine kleine Kammer gegeben, die ein Rührstäbchen enthielt und mit 1 M Natriumsulfat-Puffer als Laufpuffer gefüllt war. 100 ng einer Blutplasmaprobe wurden in die Kammer gegeben (1 cm × 1 cm × 0,2 cm), die 200 μl Laufpuffer enthielt. Es wurde eine Spannung von 50 V senkrecht zur Ebene des Wafers für 5 Minuten angelegt, wobei alle 0,5 Minuten die Richtung des Stromes um 180 Grad gedreht wurde. Als Nächstes wurde der Wafer aus dem Laufpuffer entnommen und in destilliertem Wasser gespült. Der Gelfleck wurde vom Wafer entfernt und an ein Ende einer Spur (10% SDS-PAGE) auf einem Plättchen, wie es im Beispiel 1 beschrieben wurde, gebracht.
  • Das Plättchen wurde in einen Puffer aus 50 mM Tris-Glycin (pH 8,3) mit 1% SDS getaucht. Es wurde eine Spannung von 36 Volt (Feld ~100 V/cm) 5 Minuten an die Elektroden angelegt. Als nächstes wurde die Spur silbergefärbt und fixiert. 19 ist ein optischer Scan der Proteine in der Plasmaprobe, die einen isoelektrischen Punkt von ungefähr 8,65 ± 0,05 haben und durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in der Spur getrennt wurden. Die Spur sieht aus, wie sie unter einem Mikroskop erscheinen würde.
  • BEISPIEL 3
  • Zweidimensionale Analyse von Blutplasma bei pH 7,50 bis 8,50
  • 1) Die IEF-Puffer
  • Es wurden fünfzig IEF-Puffer mit pH-Werten von 7,50 bis 8,50 in Schritten von 0,02 pH-Einheiten hergestellt.
  • a. IEF-Puffer mit pH 7,50-7,68, 10% Polyacrylamid
  • 25 ml 0,1 M N-2-Hydroxyethylpiperidin-N-3-propansulfonsäure (EPPS) (25,232 g/l) wurden mit 5 Gramm Polyacrylamid (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,1 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser von 25°C auf 50 ml gebracht.
    pH = 7,50 0,1 M NaOH 5,9 ml
    pH = 7,52 0,1 M NaOH 6,1 ml
    pH = 7,54 0,1 M NaOH 6,3 ml
    pH = 7,56 0,1 M NaOH 6,7 ml
    pH = 7,58 0,1 M NaOH 6,9 ml
    pH = 7,60 0,1 M NaOH 7,0 ml
    pH = 7,62 0,1 M NaOH 7,2 ml
    pH = 7,64 0,1 M NaOH 7,3 ml
    pH = 7,66 0,1 M NaOH 7,4 ml
    pH = 7,68 0,1 M NaOH 7,5 ml
  • b. IEF-Puffer mit pH 7,70-7,88, 7% Polyacrylamid
  • 25 ml 0,1 M N,N-Bis(2-hydroxymethyl)glycin (BICIN) (16,317 g/l) wurden mit 3,5 Gramm Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,1 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser von 25°C auf 50 ml gebracht.
    pH = 7,70 0,1 M NaOH 6,5 ml
    pH = 7,72 0,1 M NaOH 6,6 ml
    pH = 7,74 0,1 M NaOH 6,7 ml
    pH = 7,76 0,1 M NaOH 7,9 ml
    pH = 7,78 0,1 M NaOH 7,2 ml
    pH = 7,80 0,1 M NaOH 7,5 ml
    pH = 7,82 0,1 M NaOH 7,7 ml
    pH = 7,84 0,1 M NaOH 8,0 ml
    pH = 7,86 0,1 M NaOH 8,2 ml
    pH = 7,88 0,1 M NaOH 8,6 ml
  • c. IEF-Puffer mit pH 7,90-8,26, 10% Polyacrylamid
  • 50 ml 0,1 M Trisaminomethan (Tris) (12,114 g/l) wurden mit 7,0 Gramm Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,1 M HCl gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser auf 100 ml gebracht.
    pH = 7,90 0,1 M HCl 34,5 ml
    pH = 7,92 0,1 M HCl 34,3 ml
    pH = 7,94 0,1 M HCl 34,1 ml
    pH = 7,96 0,1 M HCl 34,0 ml
    pH = 7,98 0,1 M HCl 33,6 ml
    pH = 8,00 0,1 M HCl 33,5 ml
    pH = 8,02 0,1 M HCl 33,2 ml
    pH = 8,04 0,1 M HCl 33,0 ml
    pH = 8,06 0,1 M HCl 32,9 ml
    pH = 8,08 0,1 M HCl 32,7 ml
    pH = 8,10 0,1 M HCl 32,5 ml
    pH = 8,12 0,1 M HCl 32,2 ml
    pH = 8,14 0,1 M HCl 32,0 ml
    pH = 8,16 0,1 M HCl 31,8 ml
    pH = 8,18 0,1 M HCl 31,7 ml
    pH = 8,20 0,1 M HCl 31,5 ml
    pH = 8,22 0,1 M HCl 31,3 ml
    pH = 8,24 0,1 M HCl 31,2 ml
    pH = 8,26 0,1 M HCl 31,1 ml
    pH = 8,26 0,1 M HCl 30,8 ml
  • d. IEF-Puffer mit pH 8,30-8,50, 8% Polyacrylamid
  • 100 ml 0,04 M 5,5-Diethylbarbitural-Na (Veronal-Na) wurden mit 8,9 Gramm Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,2 M HCl gemischt.
    pH = 8,30 0,2 M HCl 13,4 ml
    pH = 8,32 0,2 M HCl 13,1 ml
    pH = 8,34 0,2 M HCl 12,9 ml
    pH = 8,36 0,2 M HCl 12,7 ml
    pH = 8,38 0,2 M HCl 12,5 ml
    pH = 8,40 0,2 M HCl 12,1 ml
    pH = 8,42 0,2 M HCl 11,7 ml
    pH = 8,44 0,2 M HCl 11,2 ml
    pH = 8,46 0,2 M HCl 11,0 ml
    pH = 8,50 0,2 M HCl 10,74 ml
  • Die IEF-Puffer wurden einzeln mit Ammoniumpersulfat gemischt und in parallelen Linien auf einen dünnen Lucit-Chip aufgebracht, wobei jede Linie eine Breite und Dicke von 100 μm und eine Länge von 1 cm und einen anderen pH hatte. Die Abmessungen des Chips, auf dem die IEF-Puffer aufgetragen wurden, lagen bei 1,2 cm × 1,2 cm.
  • 2) Der Laufpuffer
  • Fünf ml einer Lösung mit 7 M Harnstoff, 2,2 M Thioharnstoff 1,1% (Gew./Vol.) Tetradecanoylamidopropyldimethylammoniopropansulfonat (ASB14), 10% (Gew./Vol.) Dimethylacetamid (DMAc), 0,55 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in entionisiertem und destilliertem Wasser (ddH2O) wurden bei 30°C auf einer rotierenden Plattform 30 Minuten gemischt, bis sich alles gelöst hatte. Es wurden bei Bedarf 5 ml ddH2O zum Auflösen zugegeben. Als Nächstes wurden 0,4 g Amberlit zugegeben, und die Lösung wurde 10 Minuten bei 32°C rotiert. Die Lösung wurde dann durch einen Spritzenfilter von 0,45 μm geleitet, ohne dass dabei ein Schaum gebildet wurde. Als Nächstes wurden die folgenden Bestandteile in Wasser zugegeben (Endkonzentrationen): 2% (Gew./Vol.) Zitronensäure-Na-Citrat-Puffer (pH 4,0), 2 mM Tri(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), 2 mM Acrylamid, 1% Glycerin. Endvolumen: 10 ml. Die Endkonzentrationen einiger Komponenten des Laufpuffers sahen folgendermaßen aus: 7,7 M Harnstoff, 2,2 M Thioharnstoff, 1,1% ASB14, 11% DMAc, 0,55 mM EDTA. Der pH des Laufpuffers wurde mit Salzsäure auf 4,0 eingestellt.
  • 3) Die Trennung in der ersten Dimension: Schritt der isoelektrischen Fokussierung
  • Zur Durchführung der Trennung in der ersten Dimension (IEF) wurde der Chip mit den oben beschriebenen aufgetragenen IEF-Puffern in eine Kammer zwischen zwei Elektroden, die einen Abstand von 1 cm hatten, gegeben. Die Kammer hatte ein Volumen von 2 ml. Bei diesem Schritt war sie jedoch nur mit einer solchen Menge an Laufpuffer gefüllt, dass ein Ende des Lucit-Chips bis zu einer Tiefe von 0,2 mm im Laufpuffer eingetaucht war. Als Ergebnis davon war ein kleiner Bereich an den Enden der einzelnen Spuren, aber nicht die gesamte Fläche der Spuren, im Laufpuffer untergetaucht. Es wurde ein Mikrogramm einer humanen Plasmaproteinmischung zum Laufpuffer gegeben. Es wurde ein elektrisches Feld an den Chip angelegt. Das Feld wurde in Form einer Rechteckfunktion von +80 V bis -80 V mit einer Frequenz von 1 Hz generiert. Während der 10 Minuten wurde ein Rührstäbchen zur Umwälzung der Plasmaproteine um die Kammer herum und in Richtung der IEF-Puffer eingesetzt.
  • 4) Die Trennung in der zweiten Dimension: SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
  • Nach der Durchführung der Trennung in der ersten Dimension wurde der Chip in der Kammer zwischen zwei Elektroden, die einen Abstand von 1,3 cm hatten, neu orientiert und im gleichen Laufpuffer so untergetaucht, dass ein zwischen den Elektroden generiertes elektrisches Feld parallel zu den Spuren und weg von dem Bereich der Spuren, wo die Proteine im IEF-Schritt akkumuliert waren, in Richtung der gegenüberliegenden Enden der Spuren verlief. Eine 3%-ige SDS-Lösung wurde zum Laufpuffer gegeben, sodass eine Endkonzentration von 2% SDS im Laufpuffer erhalten wurde. Unmittelbar nach der Zugabe des SDS wurde ungefähr 5 Minuten lang das elektrische Feld mit 100 V generiert.
  • Nach der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Chip in eine Silbernitritlösung getaucht und für eine schnelle Silberfärbung gegen UV-Licht exponiert. Nach der Silberfärbung wurde der Chip mit einem kommerziellen Büroscanner (UMAX ASTRA 2200) gescannt. Das gescannte Bild wurde digitalisiert und 10-fach vergrößert (7A). 7B ist ein optischer Scan eines mittels eines herkömmlichen Verfahrens der isoelektrischen Fokussierung erhaltenen, silbergefärbten Gels von humanem Plasma mit einem pI von 7,50-8,50 (aus der Swiss Data Base). Die Positionen vieler der Proteine in 21A und 21B sind gleich. Die 21A veranschaulicht, dass die Verwendung der Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren viel bessere Ergebnisse als herkömmliche Verfahren liefert. Die Auflösung und die Empfindlichkeit der zweidimensionalen IEF-SDS-Analyse sind stark verbessert.
  • BEISPIEL 4
  • Zweidimensionale Analyse von Blutplasma bei pH 5,50 bis 6,00
  • 1) Die IEF-Puffer
  • Es wurden fünfundzwanzig IEF-Puffer mit pH-Werten von 5,50 bis 6,00 in Stufen von 0,02 pH-Einheiten hergestellt.
  • a. IEF-Puffer mit pH 5,50-5,72, 7% Polyacrylamid
  • 25 ml 0,1 M 2-(N-Morpholin)ethanolsulfonsäure (MES) wurden mit 3,5 Gramm Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,1 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser auf 50 ml gebracht.
    pH = 5,50 4,4 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,52 4,8 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,54 5,1 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,56 5,3 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,58 5,5 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,60 5,7 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,62 5,9 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,64 6,0 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,66 6,4 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,68 6,5 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,70 6,7 ml 0,1 M NaOH
    pH = 5,72 6,8 ml 0,1 M NaOH
  • b. IEF-Puffer mit pH 5,74-5,98, 9% Polyacrylamid
  • 25 ml 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanmaleat (Tris-Maleat) wurden mit 9 Gramm Polyacrylamid (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,2 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser auf 100 ml gebracht.
    pH = 5,74 7,8 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,76 7,9 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,78 8,1 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,80 8,2 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,82 8,4 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,84 8,8 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,86 9,3 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,88 9,8 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,90 10,5 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,92 11,6 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,94 12,0 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,96 12,5 ml 0,2 M NaOH
    pH = 5,98 12,97 ml 0,2 M NaOH
  • Die IEF-Puffer wurden einzeln mit Ammoniumpersulfat gemischt und in parallelen Linien auf einem dünnen Lucit-Chip aufgebracht, wobei jede Linie eine Breite und Dicke von 100 μm und eine Länge von 1 cm und einen anderen pH hatte. Die Abmessungen des Chips, auf dem die IEF-Puffer aufgetragen wurden, lagen bei 1,2 cm × 1,2 cm.
  • 2) Der Laufpuffer
  • Der Laufpuffer war der gleiche wie im Beispiel 3.
  • 3) Die Trennung in der ersten Dimension: Schritt der isoelektrischen Fokussierung
  • Zur Durchführung der Trennung in der ersten Dimension (IEF) wurde der Chip mit den oben beschriebenen aufgetragenen IEF-Puffern in eine Kammer zwischen zwei Elektroden, die einen Abstand von 1 cm hatten, gegeben. Die Kammer hatte ein Volumen von 2 ml. Bei diesem Schritt war sie jedoch nur mit einer solchen Menge an Laufpuffer gefüllt, dass ein Ende des Lucit-Chips bis zu einer Tiefe von 0,2 mm im Laufpuffer eingetaucht war. Als Ergebnis davon war ein kleiner Bereich an den Enden der einzelnen Spuren, aber nicht die gesamte Fläche der Spuren, im Laufpuffer untergetaucht. Es wurde ein Mikrogramm einer humanen Plasmaproteinmischung zum Laufpuffer gegeben. Es wurde ein elektrisches Feld an den Chip angelegt. Das Feld wurde in Form einer Rechteckfunktion von +80 V bis -80 V mit einer Frequenz von 1 Hz generiert. Während der 10 Minuten wurde ein Rührstäbchen zur Umwälzung der Plasmaproteine um die Kammer herum und in Richtung der IEF-Puffer eingesetzt.
  • 4) Die Trennung in der zweiten Dimension: SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
  • Nach der Durchführung der Trennung in der ersten Dimension wurde der Chip in der Kammer zwischen zwei Elektroden, die einen Abstand von 1,3 cm hatten, neu orientiert und im gleichen Laufpuffer so untergetaucht, dass ein zwischen den Elektroden generiertes elektrisches Feld parallel zu den Spuren und weg von dem Bereich der Spuren, wo die Proteine im IEF-Schritt akkumuliert waren, in Richtung der gegenüberliegenden Enden der Spuren verlief. Eine 3%-ige SDS-Lösung wurde zum Laufpuffer gegeben, sodass eine Endkonzentration von 2% SDS im Laufpuffer erhalten wurde. Unmittelbar nach der Zugabe des SDS wurde ungefähr 5 Minuten lang das elektrische Feld mit 100 V generiert.
  • Nach der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Chip in eine Silbernitritlösung getaucht und für eine schnelle Silberfärbung gegen UV-Licht exponiert. Nach der Silberfärbung wurde der Chip mit einem kommerziellen Büroscanner (UMAX ASTRA 2200) gescannt. Das gescannte Bild wurde digitalisiert und 10-fach vergrößert (22B). 22A ist ein optischer Scan eines mittels eines herkömmlichen Verfahrens der isoelektrischen Fokussierung erhaltenen, silbergefärbten Gels von humanem Plasma mit einem pI von 5,50-6,00 (aus der Swiss Data Base).
  • Die Positionen vieler der Proteine in 22A und 22B sind gleich. Die 22B veranschaulicht, dass die Verwendung der Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren viel bessere Ergebnisse als herkömmliche Verfahren liefert. Die Auflösung und die Empfindlichkeit der zweidimensionalen IEF-SDS-Analyse sind stark verbessert.
  • BEISPIEL 5
  • Zweidimensionale Analyse unter Verwendung eines Arrays
  • Es wurde ein Array, der eine IEF-Einheit/Spur enthielt, konstruiert und in einer zweidimensionalen Trennung eingesetzt.
  • 1) Der Array
  • Ein 10%-iges Polyacrylamidgel mit 2% SDS wurde als schmale Spur auf einem 1 mm dicken Acrylglasplättchen aufgetragen. Die Abmessungen der Spur lagen bei 10 mm Länge, 0,1 mm Breite und 50 Mikrometer Dicke. Die Spur wurde dann mit einer 100 Mikrometer dicken Cellophanschicht bedeckt, die eine kreisrunde Perforation von 200 Mikrometer Durchmesser aufwies. Die Cellophanschicht wurde so mit der Spur ausgerichtet, dass die kreisrunde Perforation an einem Ende der Spur zu liegen kam.
  • Es wurde ein IEF-Puffer durch das Mischen von Polyacrylamidgel, Puffer von pH 7,00 und Ammoniumpersulfat unter Bildung eines 7%-igen Polyacrylamidgels hergestellt. Der Puffer von pH 7,00 wurde durch das Mischen von 50 ml N-Ethylmorpholin-HCl (Sigma) mit 8 ml 1 M HCl und 42 ml Wasser hergestellt. Ein Tropfen des IEF-Puffers wurde in die Perforation gegeben, und dann ließ man in fest werden.
  • 2) Die Trennung in der ersten Dimension: Isoelektrische Fokussierung
  • Der wie oben beschrieben hergestellte Array wurde in eine Kammer gegeben, die Laufpuffer (pH 6,9), ein Rührstäbchen und Elektroden enthielt. Der Laufpuffer bestand aus mit HCl gemischtem 1 μM K2SO4. Es wurde eine Probe, die 1 Mikrogramm humane Plasmaproteine umfasste, zu dem Laufpuffer gegeben. Es wurde eine Spannung in Form einer Rechteckfunktion von +30 V bis -30 V und einer Frequenz von 1 Hz über einen Zeitraum von 8 Minuten generiert, während dessen der Laufpuffer zirkuliert wurde.
  • 3) Die Trennung in der zweiten Dimension: SDS-PAGE
  • Für die Trennung in der zweiten Dimension wurde eine Gleichspannung von 30 V 5 Minuten entlang der Spur angelegt.
  • Nach der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Array zur Färbung der Spur in eine Silbernitratlösung getaucht. Die Spur wurde unter Bestrahlung mit UV-Licht drei Minuten silbergefärbt.
  • 23 zeigt einen vergrößerten, optischen Scan des silbergefärbten Plättchens. Die dunklen Bereiche sind gefärbte humane Plasmaproteine mit pI-Werten von ungefähr 7,0.
  • BEISPIEL 6
  • Zweidimensionale Analyse unter Verwendung von drei Elektroden
  • Es wurde ein Array wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt.
  • 1) Die Trennung in der ersten Dimension: Isoelektrische Fokussierung
  • Der Array wurde in eine Kammer gegeben, die Laufpuffer (pH 6,9), ein Rührstäbchen und drei Elektroden enthielt. Der Laufpuffer bestand aus mit HCl gemischtem 1 μM K2SO4. Es wurde eine Probe, die 1 Mikrogramm humane Plasmaproteine umfasste, zu dem Laufpuffer gegeben. Mittels zweier Elektroden, die parallel zur Ebene des Arrays angeordnet waren, wurde eine Spannung in Form einer Rechteckfunktion von +30 V bis -30 V und einer Frequenz von 1 Hz 8 Minuten generiert, während der der Laufpuffer zirkuliert wurde.
  • 2) Die Trennung in der zweiten Dimension: SDS-PAGE
  • Für die Trennung in der zweiten Dimension wurde eine Gleichspannung von 30 V 5 Minuten entlang der Spur angelegt. Das wurde erreicht, indem eine der Elektroden im IEF-Schritt eingesetzten Elektroden von der Stromversorgung getrennt wurde, wieder an dem Ende der Spur befestigt wurde, das am weitesten vom IEF-Puffer entfernt war, und das elektrische Feld aktiviert wurde etc., 28. In diesem Fall ist, obwohl eine kleine, unerwünschte elektrische Kraft, die nicht parallel zur Spur gerichtet ist, vorliegt, eine signifikant größere elektrische Kraft entlang der Spur in Richtung weg vom IEF-Puffer angelegt, die eine signifikante und effiziente Auftrennung der Proteine in der Spur ermöglicht.
  • Nach der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Array zur Färbung der Spur in eine Silbernitratlösung getaucht. Die Spur wurde unter Bestrahlung mit UV-Licht drei Minuten silbergefärbt.
  • 24 zeigt einen vergrößerten, optischen Scan des silbergefärbten Plättchens. Die dunklen Bereiche sind gefärbte humane Plasmaproteine mit pI-Werten von ungefähr 7,0.
  • BEISPIEL 7
  • Auftrennung der Komponenten der Proteinmischung unter Verwendung einer Acrylglasmatrix
  • Es wurden fünfundzwanzig Löcher mit einem Durchmesser von 1 mm und einer Tiefe von 2 mm in die Oberfläche eines rechteckigen Plättchens aus Kunststoff (Acrylglas) gebohrt und mit einem 2%-igen Agarosegel gefüllt. Die Löcher (hier im Folgenden „Kanäle" genannt) wurden in Art eines Gitternetzes in einem Abstand von ungefähr 3 mm voneinander angeordnet. Eine Seite eines jeden Kanals wurde mit einer für Proteinionen durchlässigen Membran verschlossen, die aus einer im Handel erhältlichen Nylonmembran (ICN, Irvine, Kalifornien) hergestellt worden war.
  • Es wurden Puffer für die isoelektrische Fokussierung mit pH-Werten, die den isoelektrischen Punkten (pI) von Cytochrom c, Desoxyhämoglobin, Hämoglobin α2β2, C-Phycocyanin, Linsenlektin und Ferritin (BioRad) entsprachen, hergestellt. Die Puffer für die Kanäle (hier im Folgenden „IEF-Puffer") wurden durch das Mischen von entweder Glycin, HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (THMAM), Zitronensäure, BICIN (N,N-Bis(2-hydroxymethylglycin oder β,β-Dimethylglutarsäure (DMGA) mit Wasser und das Titrieren eines jeden IEF-Puffers auf einen anderen pH mit Natriumhydroxid, Salzsäure oder Na2HPO4 hergestellt. Siehe Tabelle 1 unten. Tabelle 1. IEF-Puffer und entsprechende Proteine
    Puffer-Nr. IEF-Puffer, Konzentration (in H2O) Protein pI des Proteins Farbe des Proteins im Puffer
    1 50 mM Glycin, 14 mM NaOH Cytochrom c 9,28 ± 0,02 rot
    2 50 mM HEPES, 12 mM NaOH Desoxyhämoglobin 7,07 ± 0,02 braunrot
    3 50 mM THMAM, 44,6 mM HCl Hämoglobin α+ 2β+ 2 7,2 ± 0,04 rot
    4 52 mM Zitronensäure, 96 mM Na2HPO4 C-Phycocyanin 4,65 ± 0,02 blau
    5 50 mM BICIN, 18 mM NaOH Linsenlektin 8,2 ± 0,07 farblos
    6 50 mM DMGA, 40 mM NaOH Ferritin 4,6 ± 0,05 rot
  • Jede senkrechte Reihe der Kanäle in der Matrix wurde mit 3 μl eines IEF-Puffer-Typs aus der Tabelle 1 gefüllt. Die gefüllten Kanäle wurden mit einer für Proteinionen durchlässigen Membran (der gleichen, wie oben beschrieben) verschlossen.
  • Die die Kanäle und die IEF-Puffer umfassende Matrix wurde zwischen zwei Platinelektroden in einer Kammer mit den Innenmaßen 50 mm Breite, 100 mm Höhe und 50 mm Länge gegeben. Die beiden Elektroden hatten ungefähr die gleichen Abmessungen wie die Matrix und wurden parallel zueinander in einem Abstand von ungefähr 5 cm angeordnet. Die Kammer umfasste ferner 50 ml eines Laufpuffers aus 0,01 M K2SO4, sodass die Matrix und die Elektroden im Laufpuffer eingetaucht waren. Ein Rührstäbchen war in der Kammer vorhanden, um die Umwälzung des Laufpuffers quer zu den Kanälen zu gewährleisten. Die Kammer wurde auf einen Magnetrührer gesetzt.
  • Es wurde ein Mikrogramm von jedem der folgenden Proteine zu dem Laufpuffer in der Kammer gegeben: Cytochrom c, Desoxyhämoglobin, Hämoglobin α+ 2β+ 2, C-Phycocyanin, Linsenlektin und Ferritin (BioRad). Während die Proteine in der Kammer bei 25°C gerührt wurden, wurde eine Gleichspannung von 100 V (E = 20 V/cm) für 2 Minuten an die Elektroden angelegt. Danach wurde die Richtung des elektrischen Feldes für weitere 2 Minuten umgekehrt. Dieser Prozess wurde fünfmal wiederholt.
  • Die Sortierung der einzelnen Proteine wurde durch das Beobachten der Akkumulation der Proteine in den vertikalen Reihen (Säulen) der Kanäle verfolgt. Generell war die Auftrennung der Proteine nach 10 Minuten abgeschlossen.
  • BEISPIEL 8
  • Eine Matrix mit 25 Kanälen wurde wie im Beispiel 7 beschrieben hergestellt, außer dass jede der fünf vertikalen Kanalreihen mit dem Folgenden gefüllt wurde: Puffer Nr. 6, Puffer Nr. 4 und Puffer Nr. 3 aus Tabelle 1. Siehe 9, von links nach rechts. Die Matrix wurde dann in eine Kammer mit Laufpuffer, wie sie im Beispiel 7 beschrieben wurde, gegeben. Ein Mikrogramm Ferritin, Phycocyanin (erste Bande des IEF-Standards von BioRad, Kat.-Nr. 161-0310), Phycocyanin (zweite Bande des IEF-Standards von BioRad, Kat.-Nr. 161-0310) und Hämoglobin α+ 2β+ 2 wurden zu dem Laufpuffer gegeben. Während die Proteine in der Kammer bei 25°C gerührt wurden, wurde eine Gleichspannung von 100 V (E = 20 V/cm) für 2 Minuten an die Elektroden angelegt. Danach wurde die Richtung des elektrischen Feldes für weitere 2 Minuten umgekehrt. Dieser Prozess wurde fünfmal wiederholt.
  • Die Sortierung der einzelnen Proteine wurde durch das Beobachten der Akkumulation des Ferritins in der ersten vertikalen Reihe der Kanäle, des Phycocyanins (erste Bande) in der zweiten vertikalen Reihe der Kanäle, des Phycocyanins (zweite Bande) in der dritten vertikalen Reihe der Kanäle und des Hämoglobins α+ 2β+ 2 in der fünften vertikalen Reihe der Kanäle verfolgt. Siehe 9. Die Negativkontrolle, d. h. die vierte vertikale Reihe der Kanäle, zeigte keine Akkumulation irgendeines der Proteine. Weiter wurde eine geringe oder keine Akkumulation von Proteinen in Kanälen beobachtet, die IEF-Puffer mit pH-Werten enthielten, die nicht den isoelektrischen Punkten der Proteine entsprachen. Generell war die Auftrennung der Proteine nach 10 Minuten abgeschlossen.
  • BEISPIEL 9
  • Verfahren zur Diagnostizierung von Diabetes
  • Ein charakteristisches Kennzeichen für die Diagnose von Diabetes ist ein Anstieg der Menge an glykiertem Hämoglobin im Blut des untersuchten Patienten. Die Menge des glykierten Hämoglobins im Blut kann als das prozentuale Verhältnis des glykierten Hämoglobins zum Gesamthämoglobin ausgedrückt werden. Dementsprechend sollten die Konzentrationen des glykierten Hämoglobins (HbA1c) und des nicht-glykierten Hämoglobins (HbA1) für die Diagnostizierung von Diabetes gemessen werden.
  • Mittels herkömmlicher IEF-Gelelektrophorese wurde bestimmt, dass die pI-Werte von glykiertem und nicht-glykiertem Hämoglobin bei pH 6,95 bzw. pH 7,22 liegen. Dementsprechend wurde ein diagnostischer Chip mit zwei pH-Kompartimenten, d. h. von pH 6,95 und pH 7,22, hergestellt.
  • Der Chip wurde durch das Bohren von zwei Löchern von 2 mm Durchmesser und 1 mm Tiefe in die Oberseite eines rechteckigen Plättchens aus Kunststoff (Acrylglas) und das Füllen der Löcher mit einem 3%-igen Polyacrylamidgel hergestellt. Die Löcher (hier im Folgenden „Kanäle") wurden in einem Abstand von ungefähr 3 mm voneinander angeordnet. Eine Seite eines jeden Kanals wurde mit einer für Proteinionen durchlässigen Membran verschlossen, die aus einer im Handel erhältlichen Nylonmembran (ICN, Irvine, Kalifornien) hergestellt worden war.
  • Ein Puffer für die isoelektrische Fokussierung mit einem pH-Wert von 6,95 wurde durch das Mischen von 22,4 ml 0,1 M NaOH mit 50 ml 0,1 M KH2PO4 und die Zugabe von H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml hergestellt. Ein Puffer für die isoelektrische Fokussierung mit einem pH-Wert von pH 7,22 wurde durch das Mischen von 36 ml of 0,2 M Na2HPO4 mit 14 ml 0,2 M NaH2PO4 und die Zugabe von H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml hergestellt. Die IEF-Puffer wurden mit Acrylamid und Persulfat gemischt. Die Mischungen wurden in separate Kanäle gegeben und in diesen polymerisiert. Die gefüllten Kanäle wurden mit einer für Proteinionen durchlässigen Membran (der gleichen wie der oben beschriebenen) verschlossen.
  • Der Chip wurde in eine Trennkammer zwischen zwei Platinelektroden gegeben, wie es in der 2 gezeigt ist. Die Innenmaße der Trennkammer lagen bei 50 mm Breite, 100 mm Höhe und 50 mm Länge. Die Elektroden hatten ungefähr die gleichen Abmessungen wie die Matrix und wurden parallel zueinander in einem Abstand von ungefähr 5 cm voneinander angeordnet. Die Kammer umfasste ferner 10 ml Laufpuffer aus 10%-igem HEPES-Puffer (pH 7,44), sodass die Matrix und die Elektroden im Laufpuffer eingetaucht waren. Ein Rührstäbchen war in der Kammer vorhanden, um die Umwälzung des Laufpuffers quer zu den Kanälen zu gewährleisten. Die Kammer wurde auf einen Magnetrührer gesetzt. Die Elektroden wurden an eine Stromversorgung, die die Polarität umkehren konnte, angeschlossen.
  • Glykiertes Hämoglobin wurde von Abbot [N1A86-10] gekauft. Nicht-glykiertes Hämoglobin, H-3883 und 9008-02-0, wurde von Sigma für die Verwendung zur Erstellung von Eichkurven gekauft. Vor dem Herstellen der Mischungen aus beiden für eine Eichkurve wurden die Extinktionskoeffizienten von glykiertem und nicht-glykiertem Hämoglobin bei verschiedenen Konzentrationen gemessen, um zu bestätigen, dass sie in dem für die Eichkurve eingesetzten Bereich konstant waren. Siehe z. B. Tabelle 1 unten und 13. Der Extinktionskoeffizient war für beide über zwei Größenordnungen der Konzentration konstant. Die Messung erfolgte mittels des im Handel erhältlichen Spektralfotometers LKB 2202 von Pharmacia.
    C (mol/l) Extinktion (willkürliche Einheiten
    1 × 10-6 0,015
    3 × 10-6 0,044
    4 × 10-6 0,063
    5 × 10-6 0,077
    6 × 10-6 0,092
    7 × 10-6 0,107
    8 × 10-6 0,121
    9 × 10-6 0,138
    1 × 10-5 0,151
    2 × 10-5 0,317
    3 × 10-5 0,456
    4 × 10-5 0,611
    5 × 10-5 0,748
    6 × 10-5 0,901
    7 × 10-5 1,06
    8 × 10-5 1,196
    9 × 10-5 1,377
    1 × 10-4 1,497
  • Für die Erstellung der Eichkurve wurden sechs mehrzellige Chips mit jeweils zwei Zellen – eine Zelle mit pH 6,95 und eine mit pH 7,22 – gegen Mischungen mit unterschiedlichen Verhältnissen von im Handel erhältlichem Hämoglobin und glykiertem Hämoglobin exponiert. Zum Beispiel wurden Mischungen von glykiertem Hb und nicht-glykiertem Hb in einem konstanten Volumen HEPES-NaOH (pH 7,5) resuspendiert. Siehe Tabelle 2. Für jede Zelle wurde die Extinktion bei 610 nm bestimmt. Die prozentuale Extinktion wurde durch das Teilen des Extinktionswertes für das glykierte Hämoglobin durch die Summe der Extinktionswerte für das glykierte Hämoglobin und das Hämoglobin berechnet. Die prozentuale Konzentration an glykiertem Hämoglobin für jede Mischung (x-Achse) wurde durch das Teilen der bekannten molaren Konzentration des glykierten Hämoglobins in jeder Mischung durch die Summe der bekannten molaren Gesamtkonzentration an glykiertem Hämoglobin und nicht-glykiertem Hämoglobin in jeder Mischung berechnet. Eine wurde dann eine Linie, die die Korrelation der prozentualen Extinktion mit der prozentualen Konzentration des glykierten Hämoglobins darstellt, anhand der berechneten Daten gezogen. Das „x" gibt an, wo die aus den Extinktionswerten für die Probe bei pH 6,95 und pH 7,22 berechnete prozentuale Extinktion auf der Eichkurve liegt. Der prozentuale Anteil des glykierten Hämoglobins am Gesamthämoglobin in der Probe wurde aus der Eichkurve extrapoliert. Siehe Tabelle 2. Tabelle 2. Eichung mit verschiedenen Konzentrationen von HbA1c und HbA1
    Konz. C1 HbA1c (mol/l) Extinktion (willkürliche Einheiten) Konz. C2 HbA1 (mol/l) Extinktion (willkürliche Einheiten) C1/(C1 + C2) (%) A1/(A1 + A2) (%)
    1 × 10-6 0,0157 1 × 10-4 1,495 0,99 1,03
    2 × 10-6 0,037 7 × 10-5 1,090 2,77 3,28
    4 × 10-6 0,661 1 × 10-4 1,5 3,8 4,22
    5 × 10-6 0,070 1 × 10-4 1,461 4,76 4,57
    7 × 10-6 0,111 9 × 10-5 1,333 7,2 7,69
    9 × 10-6 0,141 1 × 10-4 1,421 8,25 9,02
  • Von jeder Mischung wurde eine Probe von 10 μl in eine Kammer gegeben, die einen Chip, wie er oben beschrieben wurde, enthielt, und 10 Minuten 150 Volt ausgesetzt. Die Richtung des elektrischen Feldes wurde einmal pro Minute umgekehrt. Hämoglobin zeigt eine starke Absorption bei 610 nm, die in diesem Assay nachgewiesen werden konnte. Deshalb musste kein ZEM oder keine Markierung für den Nachweis des glykierten oder nicht-glykierten Hämoglobins zugegeben werden.
  • Die Extinktion des glykierten und des nicht-glykierten Hämoglobins, das in den Kompartimenten von pH 6,95 bzw. pH 7,22 akkumulierte, wurde mittels eines Spektralfotometers gemessen. Die Ergebnisse wurden als prozentuale Konzentration in Abhängigkeit von der prozentualen Extinktion des glykierten Hämoglobins bezogen auf das Gesamthämoglobin (X- gegen Y-Achse) ausgedrückt. Siehe 14. Im Einzelnen wurde die prozentuale Extinktion des glykierten Hämoglobins in der getesteten Mischung durch das Teilen des Extinktionswertes des Kompartiments mit pH 6,95 durch die Summe der Extinktionswerte der Kompartimente mit pH 6,95 und pH 7,22 und das Multiplizieren mit 100 berechnet. Die prozentuale Konzentration des glykierten Hämoglobins in jeder Mischung wurde durch das Teilen der bekannten Konzentration des glykierten Hämoglobins in jeder Mischung durch die Summe aus den bekannten Konzentrationen des glykierten Hämoglobins und des nicht-glykierten Hämoglobins in jeder Mischung berechnet. Mit den berechneten Daten konnte eine Linie gezogen werden, die die Korrelation der prozentualen Extinktion mit der prozentualen Konzentration des glykierten Hämoglobins darstellt. Siehe 14.
  • Als Nächstes wurde einem Patienten eine Blutprobe abgenommen. Das Blut wurde bei 500 g zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstands von 10 μl wurde in eine Kammer gegeben, die einen Chip, wie er oben beschrieben wurde, enthielt, und 10 Minuten 150 Volt ausgesetzt. Die prozentuale Extinktion des glykierten Hämoglobins in the Probe wurde wie oben beschrieben berechnet („Y"-Wert). Die prozentuale Konzentration des glykierten Hämoglobins in der Probe lag bei ungefähr 5,2% auf der Basis der Extrapolation mithilfe der Linie aus 14. Dieses Ergebnis zeigt, dass die getestete Person Diabetes hat. Der Prozentsatz ist typisch für Personen mit kontrolliertem Diabetes, liegt aber über dem Normalbereich von of 3-4%.
  • BEISPIEL 10
  • Verfahren zur Bestimmung der Sammeleffizienz der isoelektrischen Fokussierung
  • Zur Bestimmung der Effizienz, mit der Proteine durch den Prozess der isoelektrischen Fokussierung voneinander getrennt werden, wurde bekannte Mengen an Alexa-Fluor-594-Ziege-anti-Maus-IgG (schwere und leichte Ketten, Jackson Immuno Research Laboratories, pI = 8,2) in den Laufpuffer eines Systems gegeben. Die Kammer enthielt einen „Trennchip", d. h. einen einzelnen Kanal mit einem Durchmesser von 100 Mikrometer und einem Gesamtvolumen von 1 nl. Jeder Kanal enthielt einen IEF-Puffer mit einem pH-Bereich von pH 8,2 ± 0,05 pH-Einheiten. Der IEF-Puffer wurde durch das Mischen von Tris-Glycin (pH 8,20 ± 0,05, BioRad, Katalognummer 161-0771) mit einem Standard-Polyacrylamidgel hergestellt.
  • Zur Eichung des Systems wurden 10 000, 50 000, 100 000, 300 000, 700 000 und 1 000 000 Moleküle des obigen IgG zu dem Acrylamid gegeben und in einzelnen Kanälen von pH 8,2 polymerisiert. Ihre Fluoreszenz wurde mit dem Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axiovert 200 unter Verwendung von AxioVision 2.05 zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität gemessen. Es wurde eine Eichkurve aus der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Konzentration des fluoreszierenden Markers für den Vergleich mit den experimentellen Fluoreszenzintensitäten erstellt.
  • Als Nächstes wurden 50 000, 100 000 und 1 000 000 Moleküle des obigen IgG im obigen System getestet. Die einzelnen Mengen wurden einzeln in einen Laufpuffer in einer Kammer gegeben. Die isoelektrische Fokussierung wurde für jede Menge unter festen Trennbedingungen unter Einsatz identischer Trennchips wie oben beschrieben durchgeführt (10 Minuten durch die engen pH-Kanäle in 0,1 ml eines Tris-Glycin-Puffers (pH 4,8) bei 30 V Gleichspannung). Nach jedem Experiment wurde die Fluoreszenzintensität mit dem Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axiovert 200 gemessen und mit der Eichkurve verglichen.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass die Sammeleffizienz des Prozesses nahe bei 100% liegt, mit einem Korrelationskoeffizienten von r = 0,9999, was zeigt, dass fast alle Proteine während der 10-minütigen Dauer des Experiments in ihre pH-Kammern verteilt werden. Siehe 29. Der S-Wert der Anpassung lag bei 45,85. Die Abszisse repräsentiert den im Eichdurchgang gemessenen Fluoreszenzwert, während die Ordinate die Fluoreszenz repräsentiert, die nach den isoelektrischen Fokussierungen erhalten wurde. Die Zahlen repräsentieren die Gesamtzahl der Proteinmoleküle in der Probe, und sie demonstrieren die hohe Empfindlichkeit der isoelektrischen Fokussierung in Kanälen mit engem pH.

Claims (23)

  1. Matrix für die isoelektrische Fokussierung (IEF), wobei die Matrix wenigstens ein Kompartiment oder eine Zelle umfasst, das bzw. die einen ersten IEF-Puffer und wenigstens einen Bereich enthält, der einen zweiten, anderen IEF-Puffer enthält, wobei die IEF-Puffer einen pH-Bereich von 0,1 pH-Einheiten oder weniger abdecken, und wobei der erste IEF-Puffer und der zweite IEF-Puffer einen pH-Unterschied von 0,1 pH-Einheiten oder weniger aufweisen.
  2. Matrix gemäß Anspruch 1, wobei die IEF-Puffer einen pH-Bereich von 0.02 pH-Einheiten oder weniger abdecken.
  3. Matrix gemäß Anspruch 1, wobei die Matrix eine Vielzahl von Kompartimenten oder Zellen umfasst, die einen IEF-Puffer enthalten.
  4. Matrix gemäß Anspruch 1, die für Moleküle impermeable Bereiche umfasst.
  5. Matrix gemäß Anspruch 1, die für Ionen impermeable Bereiche umfasst.
  6. Matrix gemäß Anspruch 1 in einem System, das ferner eine Vorrichtung für das Zirkulieren eines Laufpuffers durch den IEF-Puffer oder die Zelle umfasst.
  7. Matrix gemäß Anspruch 3, die die Vielzahl von IEF-Puffern, Kompartimenten oder Zellen umfasst, die voneinander isoliert sind, wenn sie auf einer Linie parallel zu einem elektrischen Feld angeordnet sind.
  8. Matrix gemäß Anspruch 3, wobei die Vielzahl von IEF-Puffern, Kompartimenten oder Zellen parallel zueinander und parallel zur Richtung eines elektrischen Feldes angeordnet ist.
  9. Matrix gemäß Anspruch 3, wobei die Vielzahl von Kompartimenten oder Zellen in eine Matrix eingebettet ist.
  10. Matrix gemäß Anspruch 1, die ein Polyacrylamidgel umfasst.
  11. System, dass umfasst: (a) eine Kammer, die einen Laufpuffer enthält, (b) eine Matrix gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, (c) eine Vorrichtung für das Erzeugen eines elektrischen Wechselfeldes in den IEF-Puffer oder die Zelle hinein und aus diesem bzw. dieser hinaus.
  12. System nach Anspruch 11, wobei the Matrix in der Kammer beweglich ist.
  13. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung eines Moleküls in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Aussetzen der Probe einem elektrischen Feld, das in den IEF-Puffer oder die Zelle, die den IEF-Puffer enthält, und aus diesem bzw. dieser hinaus gerichtet ist, unter Verwendung der Matrix oder des Systems nach irgendeinem der Ansprüche 1-12 und/oder Zirkulieren eines das Molekül umfassenden Laufpuffers durch den IEF-Puffer oder die Zelle und (2) Fangen des Moleküls in dem IEF-Puffer oder der Zelle.
  14. Verfahren nach Anspruch 13 zur Charakterisierung eines Moleküls in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Aussetzen der Probe einem elektrischen Feld, das in den IEF-Puffer oder die Zelle und aus diesem bzw. dieser hinaus gerichtet ist, Zirkulieren eines die Probe umfassenden Laufpuffers durch den IEF-Puffer oder die Zelle, und (2) Bestimmen, ob das Molekül in dem IEF-Puffer oder der Zelle vorhanden ist und, gegebenenfalls, Vergleichen des Moleküls im IEF-Puffer oder der Zelle mit einem Molekül aus einer anderen Probe oder Quantifizieren des Moleküls.
  15. Verfahren nach Anspruch 14 zum Diagnostizieren oder Prognostizieren eines Krankheitszustandes bei einem Subjekt, wobei das Verfahren den Schritt des Vergleichens der Moleküle mit Molekülen einer Probe eines normalen Subjekts, das keine Krankheit hat oder nicht dafür prädisponiert ist, die Krankheit zu haben, umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 13 zur Gewinnung eines Moleküls, wobei das Verfahren umfasst das Fangen des Moleküls in einem IEF-Puffer oder einer Zelle durch das Erzeugen eines elektrisches Feld in den IEF-Puffer oder die Zelle hinein und aus diesem bzw. dieser hinaus, das Zirkulieren eines Laufpuffers, der das Molekül umfasst, durch den IEF-Puffer oder die Zelle und das Gewinnen des Moleküls.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 13, das ferner den Schritt des Analysierens des Moleküls in einer zweiten Dimension umfasst.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die Analyse in der zweiten Dimension mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder Flüssigchromatografie erfolgt.
  19. Verfahren nach Anspruch 15 zum Diagnostizieren oder Prognostizieren eines Krankheitszustandes bei einem Subjekt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (1) Zugeben einer Probe, die Moleküle des Subjekts umfasst, das unter einer Krankheit leidet oder im Verdacht steht, für eine Krankheit prädisponiert zu sein, zu dem System, (2) Erzeugen eines elektrisches Feldes, (3) Erzeugen des elektrischen Feldes entlang der Spur weg vom IEF-Puffer oder der Zelle zur Bildung eines Molekülmusters, und (4) Vergleichen des Molekülmusters in der Spur mit dem Molekülmuster einer Probe eines normalen Subjekts, das die Krankheit nicht hat oder nicht für die Krankheit prädisponiert ist.
  20. System nach Anspruch 11 oder 12, wobei das elektrische Feld durch eine Wechselspannungsquelle erzeugt wird.
  21. System nach Anspruch 11 oder 12, wobei das elektrische Feld durch eine Gleichspannungsquelle erzeugt wird.
  22. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 19, wobei das elektrische Feld durch eine Wechselspannungsquelle erzeugt wird.
  23. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 13 bis 19, wobei das elektrische Feld durch eine Gleichspannungsquelle erzeugt wird.
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