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Gebiet der Erfindung
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Die
hierin beschriebenen Verfahren, Zusammensetzungen und Kits betreffen
allgemein das Gebiet diagnostischer Hilfsmittel und Verfahren zur
Verwendung bei der Kontrolle von Pech in Zellstoff- und Papiermühlenprozessen.
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Hintergrund der Erfindung
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Eine
Minimierung oder eine Vorbeugung der Abscheidung von Pech bei Zellstoff-
und Papierherstellungsverfahren ist für eine Minimierung der Verschmutzung
und Ausfallzeiten von Anlagen, eine Maximierung der Produktionseffizienz
sowie eine Verbesserung der Produktqualität entscheidend. Pech ist aus
olefinischen Materialien mit niedrigem Molekulargewicht (hauptsächlich Triglyceride,
Fettsäuren,
Terpene, Harzsäuren
und Ester) zusammengesetzt, welche während chemischer und mechanischer
Aufschlussprozesse aus Holzfasern freigesetzt werden. Diese harzige
Substanz präzipitiert üblicherweise
als Calcium- und Magnesiumsalze, wodurch Probleme mit den Nasspartiekomponenten
von Papiermaschinen entstehen.
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Bekannte
Verfahren zur Pechkontrolle umfassen kationische Fixierung mit Alaun
oder kationischen Polymeren, Dispersion mit oberflächenaktiven
Mitteln, Absorption mit Talg und Chelatisierung von Schwermetallen.
Enzymatische Verfahren sind ebenfalls bekannt. Beispielsweise offenbart
US-Patent Nr. 5,176,796 von Irie
et al. eine Zugabe von Acylglycerinlipase zu einer mechanischen
Aufschlusspapierbrühe
oder zu Folgenutzungswasser;
US-Patent
Nr. 5,256,252 von Sarkar et al. offenbart die Zugabe einer
Lipase und eines kationischen Polymers zu einer zellulosehaltigen
Aufschlämmung
zur Papierherstellung; und
US-Patent
Nr. 5,667,634 von Fujita et al. offenbart die Zugabe eines
wasserlöslichen
Polyelektrolyts zur Erhöhung
der Hydrolyserate von Estern in Gegenwart einer Lipase.
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US-Patent Nr. 6,134,952 offenbart
ein gelöstes
festes Analysemittel, insbesondere eine Vorrichtung zur Messung
der Menge an gelöster
Substanz in einer flüssigen
Probe, wie beispielsweise Weißwasser,
online in einer Papiermühle.
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US-Patent Nr. 5,989,392 offenbart
Verfahren zur Kontrolle von anionischer Abfall- und Pechabscheidung
sowie die Behandlung von beschichtetem Fertigungsausschuss, wobei
das Verfahren umfasst Zugeben eines quarternären Polyammoniums zu einem
Zellstoff- und Papierherstellungssystem.
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Chen
et al. (TAPPT Journal, April 2001, 44–47) offenbart eine enzymatische
Pechkontrolle einer Industriepapiermühle.
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Eine
wirksame Verwendung dieser und anderer Pechkontrollverfahren erfordert
jedoch eine genaue Bestimmung der Menge an abscheidbarem Pech, welches
in der Pulpe und in den Prozesswassern an mehreren Punkten beim
Papierherstellungsprozess vorliegt. Standarddiagnoseverfahren zur
Messung von Pech umfassen einen Test, um den gesamten organischen
Extraktgehalt der Pulpe zu bestimmen. Leider benötigen bekannte Verfahren zur
Triglyceridanalyse von Pulpe zwischen etwa 8 und 24 Stunden, um
einen Probensatz abzuarbeiten. Deshalb sind die Testergebnisse nur
für die
Nachevaluierung des Prozesssystems nützlich; sie stellen keine Beurteilung
des gegenwärtigen
Prozesszustands bereit und führen
zu unverlässlichen
und nicht gerichteten Ergebnissen. Entsprechend ist die Verwendung
von analytischen Verfahren zur richtigen Anwendung von Pechkontrollmaßnahmen
ziemlich beschränkt,
da die dynamische Natur der Pechmenge in einem kontinuierlichen
Papierherstellungsprozess eine rechtzeitige Reaktion durch Pechkontrollmaßnahmen
benötigt.
Es würde
in hohem Maße
vorteilhaft sein, über
ein Verfahren zu verfügen,
welches den Triglyceridgehalt der Pulpe schnell und richtig analysiert,
so dass Prozessparameter rechtzeitig und richtig angepasst werden können, um
Pechabscheidungsproblemen vorzubeugen.
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Ein
gegenwärtig
Anwendung findendes Verfahren zur Triglyceridanalyse basiert auf
der Analyse von Fettsäuren,
welche durch die Triglyceridhydrolysereaktion in Gegenwart von Lipase
erzeugt werden:
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In
Kürze,
die Verfahrensschritte umfassen (1) Analysieren des Fettsäuregehalts
einer ersten Pulpenprobe, welche nicht mit einem Enzym behandelt
worden ist unter Verwendung eines Extraktions-, Abdampfungs- und
Titrationsarbeitsschritts; (2) Berechnen des Prozentsatzes an organischer
Säure als Ölsäure für die erste
Probe; (3) Behandeln einer zweiten Pulpenprobe mit einer hohen Enzymdosierung
unter Bedingungen, welche die vollständige Umwandlung von Triglycerid
zu Fettsäuren
und Glycerin sicherstellen; (4) Analysieren des Fettsäuregehalts
der enzymbehandelten zweiten Pulpenprobe unter Verwendung der Extraktions-,
Abdampfungs- und Titrationsarbeitsschritte; und (5) Vergleichen
des Unterschieds an organischer Säure in der ersten Probe und
in der zweiten Probe. Der Triglyceridgehalt wird bestimmt durch
den Unterschied des Fettsäuregehalts
vor und nach Lipasebehandlung der Pulpenprobe, multipliziert mit
einem Umwandlungsfaktor. Der Umwandlungsfaktor ist das Verhältnis des
Molekulargewichts der Triglyceride zum Molekulargewicht der Fettsäuren. Es
wird angenommen, dass bei einer hohen Lipasedosierung die Triglyceride
vollständig
zu Fettsäuren
und Glycerin umgewandelt werden. Es treten keine Nebenreaktionen
auf.
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Die
aufwändigen
Extraktions-, Abdampfungs- und Titrationsarbeitsschritte, welche
notwendig sind, um den Fettsäuregehalt
zu bestimmen, sind zeitaufwändig
und arbeitsintensiv. Beispielsweise werden die Fettsäuren in
der Pulpenprobe in eine Hexanschicht extrahiert und anschließend werden
Aliquote der Hexanschicht abgedampft, wobei ein organischer Rückstand
zurückbleibt,
welcher nachfolgend in einer wässrigen
Isopropanollösung
gelöst
wird, welche anschließend
mit Kaliumhydroxidlösungen
unter Verwendung von Thymolblau als pH-Indikator titriert wird.
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Ein
anderes Verfahren umfasst einen aufwändigen Lösungsmittelextraktionsschritt
mit einem anschließenden
kostenintensiven Instrumentelanalyseschritt, welcher Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC),
Dünnschichtchromatographie
(TLC) oder Gaschromatographie (GC) umfasst. Die auf Extraktion basierenden
Verfahren benötigen
typischerweise zwischen etwa 8 und 24 Stunden, um sie abzuarbeiten,
benötigen
die Verwendung von möglicherweise
gefährlichen
flüchtigen
organischen Verbindungen oder toxischen Lösungsmitteln und sind sehr
arbeitsintensiv. Die Instrumentalanalyse ist zur Vorortanalyse nicht
tragbar, die Ergebnisse sind oft nicht richtig oder nicht reduzierbar.
Es wäre
vorteilhaft, über
ein fehlerfreies Testverfahren zur verfügen, welches den Extraktionsschritt
nicht benötigt,
so dass die Pulpe direkt und schnell getestet werden könnte. Ein
derartiger Test wäre
vorzugsweise tragbar, leicht und schnell zu verwenden ohne kostenintensive
Instrumentalanalyse. Es wäre
günstig,
wenn das Verfahren auch die mögliche
Exposition der testenden Person gegenüber flüchtigen organischen Verbindungen
oder toxischen Lösungsmitteln,
welche von den auf Extraktion basierenden Verfahren benötigt werden,
minimieren oder eliminieren könnte.
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Ein
weiterer Nachteil bekannter Verfahren ist der, dass Pechabscheidung
nicht direkt mit dem organischen Gesamtextraktgehalt der Pulpe korreliert.
Vielmehr ist es das Pech auf der Oberfläche der Pulpefasern oder in
der Suspension, d. h. das abscheidbare Pech, welches bei der Pechabscheidung
am stärksten
von Belang ist. Gesamtpech besteht aus Pech, welches auf der Oberfläche der
Fasern lokalisiert ist und Pech, welches innerhalb der Pulpefasern
eingeschlossen ist. Das Pech, welches innerhalb der Fasern eingeschlossen ist,
trägt im
Allgemeinen nicht zum Pechabscheidungsproblem bei, da es innerhalb
der Fasern unberührt
bleibt und keine Chance hat, zu reagieren. Die auf Extraktion basierenden
analytischen Verfahren, welche vorausgehend beschrieben wurden,
geben den Gehalt der vollständigen
organischen extrahierbaren Chemikalien in der Pulpenprobe an, welcher
nicht in enger Korrelation mit den Pechabscheidungsproblemen steht.
Deshalb wäre
ein Testverfahren, welche Ergebnisse bereitstellt, die direkt mit
Pechabscheidungsproblemen korrelieren, in hohen Maße günstig.
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Es
wäre wünschenswert,
Verfahren, Vorrichtungen und Kits zur fehlerfreien und schnellen
Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts einer Pulpenprobe
bereitzustellen, insbesondere zur Verwendung in einem kontinuierlichen
Papierherstellungsverfahren. Es wäre auch wünschenswert, Verfahren zur
Erhöhung der
Effektivität
von Pechkontrollmaßnahmen
bei einem Papierherstellungsprozess bereitzustellen, welche auf derartigen
Bestimmungen basieren. Es wäre
ferner wünschenswert,
Verfahren zur Messung der Oberflächentriglyceride
in einer Holzpulpe bereitzustellen, wobei der Test tragbar ist,
ohne kostenintensive Instrumentalanalyse schnell und leicht auszuführen ist
und die mögliche
Exposition einer testenden Person gegenüber flüchtigen organischen Verbindungen
oder toxischen Lösungsmitteln,
welche für
auf Extraktion basierenden organische Gesamtgehalts-Diagnostikassays
benötigt
werden, minimiert oder eliminiert wird.
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Zusammensetzung der Erfindung
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Es
werden enzymatische Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts
in einer Suspension von Holzpulpe bereitgestellt. Die Verfahren
sind nützlich
zur schnellen Bewertung der Menge an Triglyceriden, welche an verschiedenen
Entnahmepunkten in Zellstoff- und Papiermühlen vorliegen, wobei dies
in vorteilhafter Weise als diagnostisches Hilfsmittel zur Verwendung
bei der Kontrolle der unerwünschten Abscheidung
von Pech während
des Aufschluss- und
Papierherstellungsverfahrens dient. Diese Verfahren können vorteilhafterweise
bei niedrigen Kosten unter Verwendung von tragbarer Ausrüstung, falls
gewünscht, durchgeführt werden.
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren
Triglyceridgehalts in einer Holzpulpenprobe, wobei das Verfahren
umfass: (a) Bestimmen der Menge an Glycerin oder Fettsäure in einer Holzpulpenprobe;
(b) Umsetzen der Holzpulpenprobe mit einer effektiven Menge an lipolytischem
Enzym zur Bildung von Glycerin und Fettsäuren; und (c) Bestimmen des
Unterschieds hinsichtlich der Menge an Glycerin oder Fettsäuren in
der Holzpulpenprobe vor der Behandlung und nach der Umsetzung mit
dem lipolytischen Enzym.
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Das
Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts in
einer Holzpulpenprobe umfasst (1) Umsetzen der abscheidbaren Triglyceride
in einer Holzpulpenprobe in Gegenwart eines lipolytischen Enzyms,
vorzugsweise einer Lipase, zur Bildung von Glycerin und Fettsäuren, und
anschließend
(2) Bestimmen des Unterschieds hinsichtlich der Menge an Glycerin
oder Fettsäure,
welches/welche in der Holzpulpenprobe vor und nach der Behandlung
mit dem lipolytischen Enzym vorliegt. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst
der zweite Schritt (a) Bilden einer messbaren Spezies aus einer
oder mehreren Reaktionen, in welcher das Glycerin oder die Fettsäuren, welches/welche
in der Holzpulpenprobe vorliegen, ein Reaktant ist und anschließend (b)
Erhalten einer quantitativen Messung der messbaren Spezies, welche
in der Probe vorliegt, vor und nach der Lipasebehandlung.
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Die
quantitative Messung kann von einem Test erhalten werden, welcher
eine Eigenschaft misst, wie beispielsweise die Konzentration einer
elektrochemischen Spezies, spektrometrische Eigenschaften oder chromatographische
Eigenschaften. In einer der stärker
bevorzugten Ausführungsformen
ist die messbare Spezies ein gefärbtes
Substrat und die quantitative Messung wird spektrophotometrisch
erhalten.
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Das
Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts kann
in einem Chargenprozess durchgeführt
werden (z. B. wobei Proben periodisch gesammelt werden und der Test
offline durchgeführt
wird). Alternativ kann das Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren
Triglyceridgehalts in einem kontinuierlichen oder halbkontinuierlichen
Prozess durchgeführt
werden (z. B. Online-Probenentnahme/Analyse).
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Eine
Vielfalt von Reaktionssequenzen kann verwendet werden, um das Glycerin
oder die Fettsäuren in
eine leicht zu quantifizierende, messbare Spezies umzuwandeln. Glycerindetektion
ist aufgrund ihrer niedrigen Kosten, Portabilität, Genauigkeit sowie der kurzen
Assayzeit bevorzugt.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das Glycerin in einer Reaktionssequenz enzymatisch umgesetzt,
welche die messbare Spezies erzeugt. Das GlycerinI kann phosphoryliert
werden, wie beispielsweise zur Erzeugung von Glycerin-1-phosphat,
oder Glycerin-3-phosphat. In einer bevorzugten Ausführungsform wird
Glycerin, Glycerin-1-phosphat oder Glycerin-3-phosphat anschließend mit einem Elektronenakzeptor
enzymatisch oxidiert.
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Bevorzugte
Beispiele für
Elektronenakzeptoren umfassen Sauerstoff (O2),
Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) und
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP+).
In einer Ausführungsform
kann Glycerin-1-phosphat oder Glycerin-3-phosphat mit Sauerstoff (O2)
zur Bildung Dihydroxyacetonphosphat (DAP) und Wasserstoffperoxid
umgesetzt werden. Das Wasserstoffperoxid kann anschließend mit
einem beliebigen Farbstoffprecursor aus einer Vielfalt an Farbstoffprecursoren
zur Erzeugung einer messbaren Farbveränderung umgesetzt werden. Beispielsweise
kann ein Quinonimin-Farbstoff erzeugt werden durch Umsetzung des
Wasserstoffperoxids mit 4-Aminoantipyrin (welches umfasst Natrium-N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)m-anisidin
(ESPA), p-Chlorphenol oder 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat (DHBS))
in Gegenwart einer Peroxidase. Diese Verfahren sind bevorzugt, wenn
die Holzpulpenprobe weniger als etwa 100 ppm Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit vor der Lipasebehandlung umfasst.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird Glycerin, Glycerin-1-phosphat oder Glycerin-3-phosphat umgesetzt
mit oxidiertem Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+)
zur Bildung von reduziertem Nicotinamidadenindinukleotid (NADH).
Das NADH kann anschließend
umgesetzt werden mit einem beliebigen Farbstoffprecursor auf einer
Vielfalt von Farbstoffprecursoren zur Bildung einer messbaren Farbveränderung.
Beispielsweise kann ein Formazan-Farbstoff erzeugt werden durch
Umsetzen des NADH mit 2-(p-Jodphenyl)-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolimchlorid
(INT) oder mit Nitroblau-Tetrazolium (NBT) in Gegenwart einer Diaphorase.
Diese Verfahren sind insbesondere dann nützlich, wenn die Holzpulpenprobe
mehr als etwa 100 ppm Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit vor der
Lipasebehandlung umfasst.
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In
anderen Ausführungsformen
wird das Glycerin enzymatisch umgesetzt mit Adenosintriphosphat (ATP).
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Glycerin umgesetzt mit Adenosintriphosphat in Gegenwart
einer Glycerinkinase zur Erzeugung von Adenosin-5'-diphosphat (ADP).
Das ADP kann anschließend
mit Phosphoenolpyruvat zur Erzeugung von Pyruvat umgesetzt werden.
Pyruvat kann anschließend
mit einem Farbstoffprecursor zur Erzeugung einer detektierbaren
Veränderung
hinsichtlich der Lichtabsorption umgesetzt werden. Beispielsweise
kann NAD+ erzeugt werden durch Umsetzen
des Pyruvats mit NADH in Gegenwart einer Lactatdehydrogenase.
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Es
ist auch möglich,
eher die Menge an Fettsäuren
als die Menge an Glycerin zu messen, welche durch die enzymatische
Hydrolyse von Triglyceriden erzeugt wird. Beispielsweise können Fettsäuren unter Verwendung
eines beliebigen Verfahrens aus einer Vielfalt bekannter Verfahren
detektiert werden, umfassend aber nicht beschränkt auf Hochleistungs-Flüssigchromatographie,
Gaschromatographie, Dünnschichtchromatographie,
Kernmagnetresonanzabbildung, Massenspektroskopie, Flammenionisierungsdetektion
und Gasflüssigchromatographie
sowie Filtrationstechniken.
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Die
Verfahren können
ferner umfassen Zugeben einer effektiven Menge eines Faseroberflächenmodifizierungsmittels
zu einer Holzpulpenprobe zur Freisetzung wenigstens eines Teils
und vorzugsweise aller abscheidbaren Triglyceride aus zellulosehaltigen
Fasern der Holzpulpenprobe. Repräsentative
Beispiele für Faseroberflächenmodifizierungsmittel
umfassen Enzyme (z. B. Zellulasen, Hemi-Zellulasen, Xylanasen, Ligninasen,
Pectinasen, Proteasen, Manninasen, Glucomanninasen, Arabinonasen
und/oder Amilasen), oberflächenaktive
Mittel, polymere Additive und Polyelektrolyte.
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In
einigen Ausführungsformen
umfasst der Schritt zur Bestimmung des Unterschieds zwischen der Menge
an Glycerin oder Fettsäuren,
welche in der Holzpulpenprobe vorliegen, (1) Erzeugen oder Verbrauchen einer
messbaren elektrochemischen Spezies während einer oder mehrerer Reaktionen,
umfassend das Glycerin oder die Fettsäuren, welche in der Holzpulpenprobe
vorliegen, und (2) Bestimmen der Konzentrationsveränderung
der elektrochemischen Spezies, welche als Ergebnis der Behandlung
der Holzpulpenprobe mit dem lipolytischen Enzym erhalten wird. Vorzugsweise
umfasst die Bestimmung der Konzentrationsveränderung der elektrochemischen
Spezies die Verwendung einer Elektrodenanordnung, wobei dies insbesondere
in einem kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Diagnostikprozess
nützlich
ist.
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Beispielsweise
kann die Elektrodenanordnung bekannte Verfahren und Mittel zur Messung
einer Veränderung
einer elektrischen Spannung oder eines Potenzials umfassen. Beispiele
für derartige
Elektrodenanordnungen können
eine sauerstoffmessende Elektrode oder eine ionenselektive Elektrode
umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Veränderung
der Konzentration der elektrochemischen Spezies potentiometrisch
bestimmt. Beispiele für
nützliche
elektrochemische Spezies umfassen sind aber nicht beschränkt auf
Sauerstoff und Wasserstoffperoxid. Beispielsweise kann eine Veränderung
des elektrischen Stroms durch Platin-katalysierte Reduktion von
Wasserstoffperoxid erreicht werden.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Verbesserung der Pechkontrolle
in einer Zellstoff- und Papiermühle
umfassend: (a) Erhalten einer oder mehrerer Holzpulpenproben von
einer Entnahmestelle in einer Zellstoff- und Papiermühle; (b)
Untersuchen der abscheidbaren Triglyceride in einer oder mehreren
Holzpulpenproben, wobei das Untersuchen das Verfahren nach Anspruch
1 umfasst; und (c) Aktivieren nach Bedarf von einer oder mehreren
Pechkontrollmaßnahmen
auf Grundlage der in Schritt (b) erhaltenen Ergebnisse nach Bedarf.
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Es
werden auch Verfahren und Systeme zur Verbesserung der Pechkontrolle
in einer Zellstoff- und Papiermühle
bereitgestellt durch Bestimmen des abscheidbaren Triglyceridgehalts
in einer Suspension von Holzpulpe. Diese Verfahren umfassen (1)
Erhalten einer oder mehrerer Holzpulpenproben von einer Entnahmestelle
in einer Zellstoff- und Papiermühle,
(2) Untersuchen der abscheidbaren Triglyceride in der Holzpulpenprobe und
(3) Aktivieren von einer oder mehreren Pechkontrollmaßnahmen
auf Grundlage des erhaltenen Assays für abscheidbare Triglyceride
nach Bedarf. Die Systeme umfassen ein Mittel zur Untersuchung hinsichtlich
abscheidbarer Triglyceride in einer Holzpulpenprobe, welche aus
einer oder mehreren Entnahmestellen in einer Zellstoff- und Papiermühle erhalten
worden ist und eine Vorrichtung zum Anwenden von einer oder mehreren Pechkontrollmaßnahmen,
wobei die Vorrichtung in betriebsfähiger Kommunikation mit dem
Mittel zur Untersuchung steht, so dass die Vorrichtung nach Bedarf
in Reaktion auf den Assay für
abscheidbare Triglyceride aktiviert werden kann. Vorzugsweise werden
die Pechkontrollmaßnahmen
in Reaktion auf den Assay für
abscheidbare Triglyceride automatisch aktiviert. Das Mittel zur
Untersuchung hinsichtlich abscheidbarer Triglyceride verwendet vorzugsweise
eines oder mehrere der hierin beschriebenen enzymatischen Verfahren.
Das Mittel zur Untersuchung kann in wünschenswerter Weise eine Elektrodenanordnung
umfassen, welche geeignet ist zum Messen, vorzugsweise kontinuierlich,
der Konzentrationsveränderung
einer elektrochemischen Spezies, wobei die Veränderung durch Behandlung der
Holzpulpenprobe mit einem lipolytischen Enzym erzeugt wird.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein Graph von Δ der
veränderten
Absorption von destilliertem Wasser mit Triglyceriden gegen eine
Triglyceridmenge, welche zu destilliertem Wasser zugegeben ist.
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2 ist
ein Graph von Δ der
veränderten
Absorption einer Pulpenprobe (aus Eindickerzuführung Nr. 1) behandelt mit
PC-B gegen die Inkubationszeit.
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3 ist
ein Graph der veränderten
Absorption einer Pulpenprobe (aus einer Papiermaschinen- Nr. 2 Bütte) mit
zugegebenen Triglyceriden gegen eine Triglyceridmenge zugegeben
zu der Pulpenprobe.
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4 ist
ein Graph der veränderten
Absorption einer Pulpenprobe (aus Niedrigdichtestoffbütte Nr.
1) mit zugegebenen Triglyceriden gegen eine Triglyceridmenge zugegeben
zu der Pulpenprobe.
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5 ist
ein Graph der veränderten
Absorption einer Pulpenprobe (aus Papiermaschine Nr. 1 Einsatz-Weißwasser)
mit zugegebenen Triglyceriden gegen eine Triglyceridmenge zugegeben
zu der Pulpenprobe.
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6 ist
ein Graph der veränderten
Absorption einer Pulpenprobe (aus Eindickerzuführung Nr. 1) mit zugegebenen
Triglyceriden gegen eine Triglyceridmenge zugegeben zu der Pulpenprobe.
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7 ist
ein Graph der Nettoveränderung
der Absorption bei 540 nm gegen die Peroxidkonzentration, welcher
den Effekt der Peroxidkonzentration auf den Assay für Pulpe
ohne rückständiges Wasserstoffperoxid oder
Hydrosulfit (PC-A
und PC-B) zeigt, wobei 50 ppm Glycerin oder 100 ppm Triolein verwendet
wurde.
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8 ist
ein Graph der Nettoveränderung
der Absorption bei 540 nm gegen die Hydrosulfitkonzentration, welcher
den Effekt der Hydrosulfitkonzentration auf den Assay für Pulpe
ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit (PC-A und PC-B) zeigt, wobei 50 ppm Glycerin oder
100 ppm Triolein verwendet wurde.
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9 ist
ein Graph der Nettoveränderung
der Absorption bei 500 nm gegen die Peroxidkonzentration, welcher
den Effekt der Peroxidkonzentration auf den Assay für Pulpe
enthaltend Wasserstoffperoxid (PC-Y und PC-Z) zeigt, wobei 50 ppm
Glycerin oder 100 ppm Triolein verwendet wurde.
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10 ist
ein Graph der Nettoveränderung
der Absorption bei 500 nm gegen die Hydrosulfitkonzentration, welcher
den Effekt der Hydrosulfitkonzentration auf den Assay für Pulpe
enthaltend Hydrosulfit (PC-Y und PC-Z) zeigt, wobei 50 ppm Glycerin
oder 100 ppm Triolein verwendet wurde.
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11 ist
ein Graph der finalen Absorption bei 500 nm gegen die Peroxidkonzentration,
welcher den Effekt von Peroxid auf eine 100 ppm Trioleinprobe mit
1000 ppm Hydrosulfit zeigt, wobei der Assay für Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit, verwendet wird.
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12 ist
eine schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Durchführung eines
Online-Triglyceridassays.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Es
wurden Verfahren entwickelt zur Verwendung als schneller, tragbarer
und genauer Assay bei niedrigen Kosten zur Bestimmung der Menge
an abscheidbaren Triglyceriden („TG"), die an verschiedenen Entnahmepunkten
in Papiermühlen
vorliegen, welche insbesondere als wichtiges Diagnosemittel zur
Verwendung bei der Voraussage und Kontrolle der unerwünschten
und schädlichen
Abscheidung von Pech auf Papiermaschinenkomponenten dienen.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich die Formulierung „abscheidbare Triglyceride" sowohl auf Triglyceride,
welche auf der Oberfläche
der Pulpefasern vorliegen als auch auf freie Triglyceride, welche
im Prozesswasser mit den Pulpefasern vorliegen oder auf freie Triglyceriden,
welche im Prozesswasser vorliegen, von dem Pulpefasern abgetrennt
worden sind, wie beispielsweise Weißwasser. Dies steht im Gegensatz
zu den Gesamtriglyceriden, welche die Triglyceride umfassen, die
innerhalb der Pulpefasern eingeschlossen sind, welche typischerweise
nicht zur Pechabscheidung beitragen, aber welche von dem organischen
Gesamtextraktgehalt der Pulpe umfasst sind. Es kann üblicherweise
nur eine mangelhafte Korrelation zwischen der Menge der eingeschlossenen
Triglyceride oder den Gesamttriglyceriden und der beobachteten Pechabscheidungsmenge
vorliegen.
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I. Die Verfahren zur Analyse abscheidbarer
Triglyceride
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Das
Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts in
einer Holzpulpenprobe umfasst (1) Umsetzen der abscheidbaren Triglyceride
in einer Holzpulpenprobe in Gegenwart eines lipolytischen Enzyms
zur Bildung von Glycerin und Fettsäuren und anschließend (2)
Bestimmen des Unterschieds hinsichtlich der Menge an Glycerin oder
freien Fettsäuren,
welche in der Holzpulpenprobe vorliegen, vor und nach der Behandlung
mit dem lipolytischen Enzym. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der zweite
Schritt (a) Bilden einer messbaren Spezies aus einer oder mehreren
Reaktionen, bei der das Glycerin oder die Fettsäuren, welche in der Holzpulpenprobe
vorliegen, ein Reaktant ist und anschließend (b) Erhalten einer quantitativen
Messung der messbaren Spezies, welche in der Probe vorliegt, vor
und nach der Lipasebehandlung. Eine breite Vielfalt an Verfahren,
welche zur Untersuchung von Triglyceriden in biologischen Anwendungen
entwickelt worden sind, kann zur Verwendung bei der Untersuchung
von Pulpentriglyceriden wie hierin beschrieben ebenfalls verwendet
werden.
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Die
bevorzugten Verfahren können
aufgrund der wesentlich kürzeren
Untersuchungszeit im Vergleich zu den gegenwärtig verwendeten, auf Extraktion
basierenden Verfahren, vorteilhafterweise als diagnostisches Hilfsmittel
zur Analyse von Papiermaschinenabscheidungsproblemen online so wie
sie auftreten verwendet werden. Der TG-Assay kann vorzugsweise in
weniger als 6 Stunden durchgeführt
werden, stärker
bevorzugt weniger als 4 Stunden, stärker bevorzugt weniger als
2 Stunden und am stärksten
bevorzugt weniger als 1 Stunde (z. B. weniger als 30 Minuten, weniger
als 20 Minuten).
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Das
Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts kann
in einem Chargenverfahren durchgeführt werden (z. B. wobei die
Proben periodisch gesammelt werden und der Test offline durchgeführt wird).
Alternativ kann das Verfahren zur Bestimmung des abscheidbaren Triglyceridgehalts
in einem kontinuierlichen oder semikontinuierlichen Prozess durchgeführt werden
(z. B. Online-Probenentnahme/Analyse).
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A. Holzpulpe und Entnahmestellen
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Die
hierin beschriebenen analytischen Verfahren für Triglyceride können auf
jede tatsächliche
Holzpulpenprobe angewendet werden. Wie hierin verwendet umfasst
der Begriff „Holzpulpenprobe" Holzpulpensuspensionen,
Holzpulpenfasern und Prozesswasser, welches im Wesentlichen aus
einer jeden Entnahmestelle der Nasspartie einer Papiermühle entnommen
worden ist. Die Entnahmestelle kann jede beliebige Stelle in der Mühle sein,
an welcher Pechprobleme auftreten können. Repräsentative Beispiele für Entnahmestellen
umfassen die Niedrigdichtestoffbütte
(Low Densitiy Chest) (LD), wobei es sich um den Lagerkasten für Pulpe
handelt; die Hochdichtestoffbütte
(High Densitiy Chest) (HD), wobei es sich um einen anderen Lagerkasten
für Pulpe handelt;
den Eindicker, welcher die Pulpe verdickt; die Weißwasserprobe,
wobei es sich um eine Probe von Wasser innerhalb der Systemschleife
handelt; den Mischungskasten; die Bütte, wobei es sich um einen
Ort direkt vor der Papiermaschine handelt, an welchem die Brühe zur Papierherstellung
vorbereitet wird; und die Papiermaschine (PM), in welcher das Papier
tatsächlich
hergestellt wird.
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Die
Verfahren sind insbesondere in Papiermühlen, welche eine mechanische
Pulpe verwenden, nützlich.
Die Verfahren sind auch mit anderen Pulpen anwendbar, wie beispielsweise
Kraft-Pulpe oder andere chemische Pulpen.
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B. Enzymatische Hydrolyse der Triglyceride
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Die
abscheidbaren Triglyceride in einer Holzpulpenprobe werden reduziert
(d. h. hydrolysiert) in Gegenwart eines lipolytischen Enzyms zur
Bildung von Glycerin und Fettsäuren.
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Bevorzugt
ist das lipolytische Enzym eine Triglycerinlipase. Geeignete Lipasen
für die
Hydrolyse von Triglyceriden können
aus pflanzlichen, tierischen oder vorzugsweise mikrobiellen Quellen
stammen. Repräsentative
Beispiele für
Quellen für
mikrobielle Lipasen umfassen Candida rugosa, Rhizopus arrhizus und
Chromobacterium viscosum.
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Andere
geeignete lipolytische Enzyme gehören zur Familie der Carbonsäureester-hydrolasen.
Geeignete Beispiele für
diese umfassen Phospholipasen, Lipoproteinlipase und Acylglycerinlipase.
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Alternativ
kann es sich beim lipolytischen Enzym um ein Nichtlipaseenzym handeln.
Beispielsweise kann das lipolytische Enzym eine Carboxylesterase
sein, wie beispielsweise Acetylesterase oder Aceylesterase, welche
niedere Fettsäureester
hydrolysieren. Beispiele für
andere geeignete lipolytische Enzyme umfassen Cholesterinesterase,
welche Steroidester hydrolysiert und welche in Kombination mit der
Lipase verwendet werden kann, z. B. wie beschrieben in
US-Patent
Nr. 4,259,440 .
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C. Detektion der Veränderung der Glycerin- oder
Fettsäurekonzentration
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Der
Schritt zur Bestimmung des Unterschieds der Menge an Glycerin oder
Fettsäuren,
welche in der Holzpulpenprobe vorliegen, vor und nach der Behandlung
mit dem lipolytischen Enzym kann durchgeführt werden unter Verwendung
einer Vielfalt an verschiedenen Techniken und Reaktionssequenzen.
Diese Techniken werden wünschenswerterweise
schnell, einfach, genau und zu niedrigen Kosten durchgeführt. In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Schritt in hohem Maße
automatisiert und zur Verwendung in einer kontinuierlichen oder
semikontinuierlichen Diagnoseausrüstung geeignet. In einer anderen
bevorzugten Ausführungsform
wird der Schritt in einem Chargenprozess durchgeführt, in
welchem beispielsweise die Pulpenproben periodisch gesammelt werden
und offline getestet werden (z. B. periodische manuelle Probenentnahme
und anschließend
Feldaustestung oder Laboraustestung dieser Proben).
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In
bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die Detektion eine Veränderung
hinsichtlich des Glycerins oder der Fettsäuren (a) Bildung einer messbaren
Spezies aus einer oder mehreren Reaktionen, wobei das Glycerin oder
die Fettsäuren,
welche in der Holzpulpenprobe vorliegen, ein Reaktant ist und anschließend (b)
Erhalten einer quantitativen Messung für die messbare Spezies, welche
in der Probe vorliegt. Beispielsweise wird ein Vergleich angestellt
zwischen der Konzentration des Glycerins in einer Holzpulpensuspension
vor und nach der Behandlung mit dem lipolytischen Enzym. Die Auswahl
einer messbaren chemischen Spezies, welche zu erzeugen ist, geht
Hand in Hand mit der Auswahl des gewünschten Messmittels.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Verfahren ein auf Enzym basierendes kolorimetrisches Verfahren,
das zur Detektion ein Spektrophotometer verwendet. Es bedarf im
Allgemeinen nur zwischen etwa 20 und 30 Minuten, um einen Probensatz
unter Verwendung eines derartigen Verfahrens zu untersuchen. Die Ergebnisse
sind genau und reproduzierbar und das Verfahren bedarf vorteilhafterweise
nicht der Verwendung der flüchtigen
organischen Verbindungen und der Lösungsmittel, welche zur Verwendung
in auf Extraktion basierenden Verfahren nötig sind. Das Verfahren misst
auch den Oberflächentriglyceridgehalt
in der Pulpe und im Wassers, welcher direkt mit dem Oberflächenpechgehalt
korreliert, welcher wiederum in direkter Beziehung zu Pechabscheidungsproblemen
steht.
-
In
anderen Ausführungsformen
werden nichtkolorimetrische Verfahren verwendet, um den abscheidbaren
Triglyceridgehalt in einer Holzpulpenprobe zu bestimmen. Repräsentative
Beispiele für
nichtkolorimetrische Verfahren verwenden Tests, welche auf Trübungen,
Titrierungen, Einflüssen
auf Stromschaltungen basieren oder spektroskopische Verfahren, wie
beispielsweise GC, HPLC und NMR.
-
(a) Glycerindetektion
-
Es
kann eine Vielfalt an Reaktionssequenzen verwendet werden, um das
Glycerin in eine leicht quantifizierbare messbare Spezies umzuwandeln.
Die Glycerindetektion ist aufgrund ihrer niedrigen Kosten, Portabilität, Genauigkeit
und kurzen Assayzeit bevorzugt.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das Glycerin automatisch umgesetzt in einer Reaktionssequenz,
welche eine messbare Spezies erzeugt. Beispielsweise kann das Glycerin
phosphoryliert werden zur Erzeugung von Glycerin-1-phosphat oder
Glycerin-3-phosphat. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Glycerin, Glycerin-1-phosphat
oder Glycerin-3-phosphat anschließend mit einem Elektronenakzeptor
enzymatisch oxidiert.
-
Bevorzugte
Beispiele für
Elektronenakzeptoren umfassen Sauerstoff (O2),
Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) und
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP+).
Bestimmte Indolphenole, Kaliumferricyanid und bestimmte Tetrazoliumsalze
können
ebenfalls als Elektronenakzeptoren verwendet werden. In einer Ausführungsform
kann Glycerin-1-phosphat oder Glycerin-3-phosphat umgesetzt werden
mit Sauerstoff (O2) zur Bildung von Dihydroxyactonphosphat
(DAP) und Wasserstoffperoxid. Das Wasserstoffperoxid kann anschließend umgesetzt werden mit einem beliebigen Farbstoffprecursor
aus einer Vielfalt an Farbstoffprecursoren zur Erzeugung einer messbaren
Farbveränderung,
welche beispielsweise unter Verwendung eines Spektrophotometers
quantifiziert werden kann. Beispielsweise kann ein Quinonimin-Farbstoff
erzeugt werden durch Umsetzen des Wasserstoffperoxids mit 4-Aminoantipyrin
(welches umfasst Natrium-N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)m-anisidin (ESPA),
p-Chlorphenol oder 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat
(DHBS)) in Gegenwart einer Peroxidase. Diese Verfahren sind bevorzugt,
wenn die Holzpulpenprobe weniger als etwa 100 ppm Wasserstoffperoxid oder
Hydrosulfit vor Lipasebehandlung umfasst.
-
In
einer anderen Ausführungsform
wird Glycerin, Glycerin-1-phosphat oder Glycerin-3-phosphat umgesetzt
mit Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+)
zur Bildung von reduziertem (NADH). Wie das Wasserstoffperoxid kann
das NADH anschließend
umgesetzt werden mit einem beliebigen Farbstoffprecursor aus einer Vielfalt
an Farbstoffprecursoren zur Erzeugung einer messbaren Farbveränderung.
Beispielsweise kann ein Formazan-Farbstoff erzeugt werden durch
Umsetzen von NADH mit 2-(p-Jodphenyl)-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazolimchlorid
(INT) oder mit Nitroblautetrazolim (NBT) in Gegenwart einer Diaphorase.
Anstelle von INT oder NBT kann ein beliebiges Tetrazoliumsalz verwendet
werden. Repräsentative
Beispiele für
andere derartige Tetrazoliumsalze umfassen 3-(4',5'-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,4-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT); 2,2',5,5'-tetra-(p-Nitrophenyl)-3,3'-(3-dimethoxy-4-diphenylen)-ditetrazolium-chlorid
(TT); und Neotetrazoliumchlorid (NT). Diese Verfahren sind insbesondere
nützlich,
wenn die Holzpulpenprobe mehr als etwa 100 ppm Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit vor Lipasebehandlung umfasst.
-
In
anderen Ausführungsformen
wird das Glycerin enzymatisch umgesetzt mit Adenosintriphosphat (ATP).
In einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Glycerin umgesetzt mit Adenosintriphosphat in Gegenwart
einer Glycerinkinase zur Erzeugung von Adenosin-5'-diphosphat (ADP).
Das ADP kann anschließend
umgesetzt werden mit Phosphoenolpyruvat zur Erzeugung von Pyruvat.
Pyruvat kann anschließend
umgesetzt werden mit einem Farbstoffprecursor zur Erzeugung einer
messbaren Farbveränderung.
Beispielsweise kann NAD erzeugt werden durch Umsetzen des Pyruvats
mit NADH in Gegenwart einer Lactatdehydrogenase. NAD kann spektrophotometrisch
bei 340 nm detektiert werden.
-
Es
kann ein iterativer Ansatz mit bekannten Triglyceridkonzentrationen
verwendet werden, um die Absorption der Probe mit einer quantitativen
Triglyceridkonzentration zu korrelieren. Die Korrelation zwischen
der Absorption und der Triglyceridkonzentration einer spezifischen
Pulpenprobe ist eine Funktion einer jeden Baumspezies und eines
jeden Zellstoffmühlenwassersystems,
wobei sie aber auf einfache Weise bestimmt werden kann unter Verwendung
eines enzymatischen kolorimetrischen Triglyceridanalyse-Arbeitsverfahrens zur
Messung der Absorption der gleichen Pulpenproben mit verschiedenen
Mengen an zugegebenem Triglyceridstandard.
-
Die
Absorptionsanalyse kann durchgeführt
werden unter Verwendung von im Wesentlichen einem jeden kommerziell
erhältlichen
Spektrophotometer, welches bei einer nützlichen Wellenlänge betrieben
werden kann. Das Spektrophotometer ist vorzugsweise tragbar, wie
beispielsweise das HACH DR/2000. In einer alternativen Ausführungsform
können
die hierin beschriebenen Verfahren angepasst werden, um Transmission
zu messen (welche mit Absorption in Zusammenhang steht) und wobei
die Oberflächentriglyceridergebnisse
entsprechend berechnet werden.
-
Das
im Einzelnen zu verwendende Verfahren kann sowohl von der Art der
zu analysierenden Pulpe abhängig
sein wie auch von anderen Bestandteilen, welche in der Probe vorliegen.
Beispielsweise ist wenigstens ein Verfahren für Pulpenproben bevorzugt, welche
frei sind oder weniger enthalten als 100 ppm Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit, während
wenigstens ein unterschiedliches Verfahren bevorzugt ist für Pulpenproben,
welche mehr als 100 ppm Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit enthalten.
Dies liegt daran, dass herausgefunden wurde, dass rückständiges Wasserstoffperoxid
und Hydrosulfit (z. B. welche als Bleichmittel verwendet werden)
mit den Ergebnissen Wechselwirken können, welche bei einem Verfahren
erhalten werden, in welchem Wasserstoffperoxid und Peroxidase Zwischenprodukte
und Testmaterialien des Verfahrens sind.
-
Im
Folgenden werden einige nicht beschränkend wirkende spezifische
Beispiele für
verschiedene Reaktionssequenzen beschrieben, welche verwendet werden
können.
-
Assay (1)
-
In
dieser bevorzugten Ausführungsform,
welche für
Pulpe ohne (oder weniger als 100 ppm) rückständiges Wasserstoffperoxid oder
Hydrosulfit bevorzugt ist, verwendet der Assay die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Die
Triglyceride werden reduziert durch eine Lipase zu Glycerin und
freien Fettsäuren.
Das Glycerin wird umgesetzt mit Adenosintriphosphat (ATP) unter
Bildung von Adenosin-5'-diphosphat
(ADP) und Glycerin-1-phosphat, welches mit Sauerstoff unter Bildung
von Dihydroxyacetonphosphat und Peroxid reagiert. Das Peroxid reagiert
mit 4-Aminoantipyrin und Natrium-N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)m-anisidin (ESPA) unter
Bildung von Quinonimin-Farbstoff und Wasser.
-
Aus
dieser Reaktionsserie ist die Konzentration an als Endprodukt gebildetem
Quinonimin-Farbstoff direkt proportional zur Konzentration von abscheidbaren
Triglyceriden, welche ursprünglich
in der Probe vorliegen, und kann mit einem Spektrophotometer detektiert
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Absorption
gemessen bei einer Wellenlänge
von 540 nm, wobei es sich um die Optimum-Wellenlänge handelt, bei welcher die
Absorption bei ihrem maximalen Wert liegt, aber es kann auch ein
Bereich anderer Wellenlängen
verwendet werden, z. B. zwischen etwa 500 und 580 nm.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
eines Verfahrens, welches diese Reaktionssequenz verwendet, werden
drei Reagenzien hergestellt und im Assay verwendet: (1) ein erstes
Triglyceridreagenz („PC-A"), welches mit Glycerin
unter Bildung eines Farbstoffs reagiert; (2) ein zweites Triglyceridreagenz
(„PC-B"), wobei es sich
um eine Standardlipoproteinlipase handelt; und (3) Trioleinstandard,
99%. Die Reagenzien werden vorzugsweise als ein Kit aus Teilen bereitgestellt,
umfassend wenigstens PC-A und PC-B und gegebenenfalls ferner umfassend
den Trioleinemulsionsstandard. Diese Kits können ferner Assayausstattung
enthalten, wie beispielsweise Teströhrchenglasgefäße, Filter,
Spritzen, Wasserbad, Pipetten, Zeitnehmer und/oder ein Spektrophotometer.
-
Das
PC-A umfasst vorzugsweise ATP, Magnesiumsalz (oder eine andere divalente
Metallionenquelle), 4-Aminoantipyrin, ESPA, Glycerinkinase, Glycerinphosphatoxidase,
und Peroxidase und gegebenenfalls Stabilisierungsmittel, Füllmittel
und Konservierungsstoffe. Glycerinkinase benötigt Mg+2 oder
ein anderes divalentes Metallion, wie beispielsweise Mn+2,
zur Aktivität.
-
Tabelle
1 listet geeignete, bevorzugte und stärker bevorzugte Bereiche für die Komponenten
von PC-A auf. Tabelle 1: PC-A-Komponenten und die jeweils
bevorzugte Konzentration
Komponente | Am
stärksten
bevorzugte Konzentration | Bevorzugte
Konzentration | Geeignete
Konzentration |
ATP | 0,375
mM | 0,3
bis 0,45 mM | 0,05
bis 50 mM |
Magnesiumsalz | 3,75
mM | 3,0
bis 4,5 mM | 0,1
bis 500 mM |
4-Aminoantipyrin | 0,188
mM | 0,1
bis 0,25 mM | 0,01
bis 50 mM |
(ESPA) | 2,11
mM | 0,5
bis 10 mM | 0,01
bis 300 mM |
Glycerinkinase | 1250
U/L | 1000
bis 15000/L | 10
bis 50000 U/L |
Glycerinphosphatoxidase | 2500
U/L | 2000
bis 3000 U/L | 100
bis 50000 U/L |
Peroxidase | 2500
U/L | 2000
bis 3000 U/L | 100
bis 50000 U/L |
-
In
anderen Ausführungsformen
können
Oxidase, ESPA und 4-Aminoantipyrin
mit funktionell äquivalenten
Materialien ersetzt werden. Die Peroxidase katalysiert die Oxidation
eines Chromogens von Peroxidase in Gegenwart von Wasserstoffperoxid.
Beispiele für
geeignete Substanzen, bei denen es sich nicht um Oxidasen handelt,
aber welche peroxidaseartige Aktivität besitzen, umfassen Eisensulfozyanat,
Eisentannat, Eisen(II)-ferrozyanid, und in Silikagel absorbierte
Chromsalze. ESPA und 4-Aminoantipyrin kombinieren mit Wasserstoffperoxid
in Gegenwart von Peroxidase unter Erzeugung von Quinonimin-Farbstoff.
-
Chromogene
von Peroxidase sind farbbildende Substrate, welche eine Farbveränderung
in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase erzeugen. Repräsentative
Beispiele für
Peroxidase-Chromogene umfassen Monoamine, wie beispielsweise Anilin
und seine Derivate; Diamine, wie beispielsweise ortho-Phenylendiamin,
Dianisidin und Benzidin; Phenole wie beispielsweise Thymol; Polyphenole,
wie beispielsweise Catechol; aromatische Säuren wie beispielsweise Salicylsäure; Leukofarbstoffe,
wie beispielsweise Leucomalachitgrün; und bunte Farbstoffe wie
beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindophenol.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist PC-B zusammengesetzt aus 250000 U/L-Lipase (mikrobiell), nicht
reaktiven Stabilisierungsmitteln und Füllmitteln und Natriumazid,
0,05%, welches als Konservierungsmittel zugegeben ist. Darüber hinaus
ist ein 3000 mg/L Trioleinemulsionsstandard bevorzugt.
-
Die
PC-A- und PC-B-Reagenzzusammensetzungen sind vorzugsweise stabilisiert
mit einem nicht reaktiven Stabilisierungsmittel, wie beispielsweise
Sorbitol, und konserviert mit einem Konservierungsmittel, wie beispielsweise
Natriumazid in einer Konzentration von 0,05%. Beispiele für geeignete
Puffer zur Verwendung in der Reagenzzusammensetzung umfassen Tris(hydroxymethyl)aminoethan
(TRIS) und/oder 3-(4-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS). In bevorzugten
Ausführungsformen
liegt der pH von PC-A und PC-B zwischen pH 6,5 und 8,5. Stärker bevorzugt
ist der pH von PC-A und PC-B 7,0 bzw. 7,8.
-
Assay (2)
-
In
dieser bevorzugten Ausführungsform,
welche bevorzugt ist für
Pulpe mit rückständigem (z.
B. größer als
100 ppm) Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit, verwendet der Assay
die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Die
Triglyceride werden reduziert zu Glycerin und Fettsäuren durch
eine Lipase. Das Glycerin wird umgesetzt mit Adenosintriphosphat
(ATP) unter Bildung von Adenosin-5'-diphosphat (ADP) und Glycerin-1-Phosphat,
welches mit Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) reagiert unter Bildung
von Dihydroxyacetonphosphat (DAP) und NADH (die reduzierte Form
von NAD). Die Reduktion von NAD wird katalysiert durch Glycerin-1-phosphatdehydrogenase
(G-1-PDH). NADH
reagiert mit 2-(p-Iodophenyl)-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid (INT) unter
Bildung von Formazan-Farbstoff und NAD. Diese Reaktion wird durch
Diaphorase katalysiert.
-
Aus
dieser Reaktionsserie ist die Konzentration an Quinonimin-Farbstoff,
welcher als Endprodukt gebildet wird, direkt proportional zur Konzentration
an abscheidbaren Triglyceriden, welche ursprünglich in der Probe vorliegen
und kann mit einem Spektrophotometer, wie vorausstehend beschrieben,
detektiert werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
eines Verfahrens unter Verwendung dieser Reaktionssequenz werden
drei Reagenzien hergestellt und im Assay verwendet: (1) ein erstes
Triglyceridreagenz („PC-Y") umfassend INT,
welches mit Glycerin unter Bildung eines Farbstoffs reagiert; (2)
ein zweites Triglyceridreagenz („PC-Z"), wobei es sich um eine Standardlipoproteinlipase
handelt und (3) Trioleinstandard, 99%. Die Reagenzien werden vorzugsweise
als Kit aus Teilen bereitgestellt, umfassend wenigstens PC-Y und
PC-Z und gegebenenfalls ferner umfassend den Trioleinemulsionsstandard.
Die Kits können
ferner Assayaausstattung umfassen, wie Teströhrchenglasgefäße, Filter, Spritzen,
Wasserbad, Pipetten, Zeitnehmer und/oder ein Spektrophotometer.
-
Das
PC-Y umfasst vorzugsweise ATP, Magnesiumsalz (oder eine andere Quelle
für divalente
Metallionen), NAD, INT, Glycerinkinase, G-1-PDH, und Diaphorase
und umfasst gegebenenfalls Stabilisierungsmittel, Füllmittel
und Konservierungsmittel. Glycerinkinase erfordert Mg
+2 oder
ein anderes bivalentes Metallion, wie beispielsweise Mn
+2 für Aktivität. Tabelle
2 listet geeignete, bevorzugte und stärker bevorzugte Bereiche für die Reagenzien
von PC-Y auf. Tabelle 2: PC-Y-Komponenten und jeweils
bevorzugte Konzentrationen
Komponente | Am
stärksten
bevorzugte Konzentration | Bevorzugte
Konzentration | Geeignete
Konzentration |
ATP | 2,0
mM | 1,5
bis 2,5 mM | 0,05
bis 50 mM |
NAD | 2,0
mM | 1,5
bis 2,5 mM | 0,05
bis 50 mM |
Magnesiumionen | 3,0
mM | 2,0
bis 4,0 mM | 0,1
bis 500 mM |
INT | 1,0
mM | 0,5
bis 10 mM | 0,01
bis 100 mM |
Glycerinkinase | 200
U/L | 150
bis 250 U/L | 10
bis 50000 U/L |
G-1-PDH | 4000
U/L | 3000
bis 5000 U/L | 100
bis 50000 U/L |
Diaphorase | 455
U/L | 300
bis 600 U/L | 10
bis 50000 U/L |
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist PC-Z zusammengesetzt aus 250000 U/L Lipase (mikrobiell), nicht
reaktiven Stabilisierungsmitteln und Füllmitteln und Natriumazid 0,05%,
welches als Konservierungsmittel zugegeben ist. Darüber hinaus
ist ein 3000 mg/L Trioleinemulsionsstandard bevorzugt. Geeignete
Lipasen, Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel und Puffer
für die
PC-Y und PC-Z-Reagenzien sind die gleichen wie vorausstehend für die PC-A
und PC-B-Reagenzien beschrieben.
-
In
alternativen Ausführungsformen
des Verfahrens können
die PC-Y-Reagenzkomponenten
mit funktionell äquivalenten
Materialien ersetzt werden. Beispielsweise ist 2-(p-Iodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid
(INT) als Tetrazoliumsalz klassifiziert. Es kann ein beliebiges
Tetrazoliumsalz anstelle von INT verwendet werden. Repräsentative
Beispiele für
andere Tetrazoliumsalze umfassen Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT);
3-(4',5'-Dimethyl thiazolyl-2)-2,4-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT), 2,2',5,5'-Tetra-(p-nitrophenyl)-3,3'-(3-dimethoxy-4-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid
(TT) und Neotetrazoliumchlorid (NT).
-
Diaphorase
ist ein Elektronentransfermittel. Repräsentative Beispiele für andere
Elektronentransfermittel, welche mit Tetrazoliumsalzen verwendet
werden können,
umfassen Phenazinmethosulfat (PMS); 8-Dimethylamino-2,3-benzophenoxazin (Meldolablau);
und 1-Methoxy-5-methylphenaziniummethylsulfat.
-
NAD
ist klassifiziert als ein Pyrindinukleotid. Repräsentative Beispiele für andere
Pyrindinukleotide, welche anstelle von NAD verwendet werden können, umfassen
NADP (Nikotinamidadenindinukleotidphosphat) und Derivate von NAD.
-
Assay (3)
-
Diese
Ausführung
verwendet die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Assay (4)
-
Diese
Ausführungsform
verwendet die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Assay (5)
-
Diese
Ausführungsform
verwendet die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Assay (6)
-
Diese
Ausführungsform
verwendet die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Assay (7)
-
Diese
Ausführungsform
verwendet die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Assay (8)
-
Diese
Ausführungsform
verwendet die folgenden Enzym-gekoppelten Reaktionen:
-
Ähnlich wie
die Assays 1 und 2 können
die Assays 3 bis 8 unter Verwendung von äquivalenten Komponenten auf
einfache Weise modifiziert werden und können durchgeführt werden
durch Herstellen und Verwenden von Reagenzien in Analogie zu PC-A,
PC-B, PC-Y, und/oder PC-Z.
-
Die
Reagenzien für
diese Assays sind nicht auf flüssige
Formen begrenzt. Beispielsweise ist es auch umfasst, dass Enzyme
und/oder andere Reagenzien in Teststreifen eingebracht werden können, wie
es im Fachbereich bekannt ist. Siehe, z. B.
US-Patente Nrn. 5,110,724 und
5,597,532 . Derartige Teststreifen
könnten
ein fertiges, leicht zu verwendendes Format zur Untersuchung von
TG bereitstellen. Es kann ein Mikroprozessor-kontrolliertes Reflexionsphotometer
verwendet werden, um eine Reflexionsmessung auf Trockenteststreifen
durchzuführen,
welche die Reagenzien enthalten, die zur Durchführung des Assays notwendig
sind und wobei anschließend
ein quantitativer Triglycerid-Wert, wie im
US-Patent Nr. 5,597,532 beschrieben,
berechnet wird.
-
Repräsentative
Beispiele für
andere Verfahrensschritte, welche verwendet werden können, um
Glycerin zu untersuchen, werden beschrieben in den
US-Patenten
Nrn. 4,273,870 ; Nr.
4,394,445 ;
Nr.
4,142,938 ; Nr.
4,245,041 ; Nr.
4,241,178 ; Nr.
4,223,090 ; Nr.
5,221,615 ; Nr.
4,923,796 ; Nr.
4,259,440 ; Nr.
4,309,502 ; und Nr.
4,636,465 .
-
(b) Fettsäuredetektion
-
Es
kann eine Vielfalt an Reaktionssequenzen verwendet werden, um die
freien Fettsäuren
zu einer quantifizierbaren; messbaren Spezies umzuwandeln. Beispielsweise
kann die quantitative Messung erhalten werden aus einem Test, welcher
eine Eigenschaft misst, die ausgewählt ist aus der Konzentration
einer elektrochemischen Spezies, spektrometrischen Eigenschaften
und chromatographischen Eigenschaften. Repräsentative Beispiele für bekannte
Verfahren zur Fettsäuredetektion
umfassen HPLC, Gaschromatographie, TLC, kernmagnetische Resonanz,
Massenspektroskopie, Flammenionisierungs detektion, Gasflüssigchromatographie
und Titrationsverfahren. In einer Ausführungsform wird der pH gemessen,
um die Veränderung
hinsichtlich der vorliegenden Fettsäuren zu bewerten (siehe z.
B.
US-Patent Nr. 4,713,165 ).
-
D. Optionale Prozessierungsmittel
-
Optional
kann ein Faseroberflächenmodifzierungsmittel
zu der Probe mit der Lipase zugegeben werden, um die Oberfläche der
Holzpulpefasern zu modifizieren, um dabei zu helfen, Oberflächentriglyceride
freizusetzen. Repräsentative
Beispiele für
derartige Faseroberflächenmodifizierungsmittel
umfassen andere Enzyme, oberflächenaktive
Mittel und polymere Additive. Beispiele für derartige Enzyme umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Zellulasen, Hemizellulasen, Xylanasen, Ligninasen, Pectinasen,
Proteasen, Manninasen, Glucomanninasen, Arabinonasen und Amylasen.
Repräsentative
oberflächenaktive
Mittel umfassen kationische, anionischen, nicht ionische und amphotere
oberflächenaktive
Mittel. Polymere Additive umfassen beispielsweise Polyelektrolyte.
-
E. Detektion mittels elektrochemischem
Mittel
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Schritt des Bestimmens des Unterschieds zwischen den
Mengen an Glycerin oder Fettsäuren,
welche in der Holzpulpenprobe vorliegen (i) Herstellen oder Verbrauchen
einer messbaren elektrochemischen Spezies während einer oder mehrerer Reaktionen,
umfassend das Glycerin oder die Fettsäuren, welche in der Holzpulpenprobe
vorliegen und (ii) Bestimmen der Veränderungen hinsichtlich der
Konzentration der elektrochemischen Spezies, welche erhalten wurde
als Ergebnis der Behandlung der Holzpulpenprobe mit dem lipolytischen
Enzym.
-
Die
Bestimmung der Veränderung
hinsichtlich der Konzentration der elektrochemischen Spezies verwendet
typischerweise und vorzugsweise eine Elektrodenanordnung. Beispielsweise
kann die Elektrodenanordnung eine sauerstoffmessende Elektrode oder
eine ionenselektive Elektrode, wie sie im Fachbereich bekannt sind,
umfassen. Typischerweise arbeiten die Elektroden durch elektrochemisch
aktive Spezies, welche sich elektrochemischen Reaktionen (Oxidation
oder Reduktion) auf der Oberfläche
der Elektrode unterziehen. Die Rate dieser Reaktionen steht mit
der Reaktivität
der Spezies, dem Elektrodenmaterial und dem elektrischen Potenzial,
welches an die Elektrode angelegt ist, in Zusammenhang. Die elektrochemische
Spezies kann beispielsweise Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid sein.
Die Elektrodenanordnung kann eine Veränderung eines elektrischen
Stroms messen, beispielsweise eine Veränderung, welche durch eine
Metall- (z. B. Platin) katalysierte Reduktion von Wasserstoffperoxid
verursacht wird. In einer Ausführungsform
der Elektrodenanordnung kann die Veränderung der Konzentration der
elektrochemischen Spezies potentiometrisch bestimmt werden.
-
In
einer Ausführungsform
wird Glycerin umgesetzt mit ATP unter Bildung von Glycerin-1-phosphat
und ADP, wobei die Reaktion durch Glycerinkinase katalysiert wird.
Das Glycerin-1-phosphat reagiert mit Sauerstoff in einer Reaktion,
welche durch Glycerinphosphatoxidase katalysiert wird, unter Bildung
von Dehydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid. Das Wasserstoffperoxid
wird anschließend
infolge der elektrochemischen Reduktion durch Platin zu einem messbaren
elektrischen Strom umgewandelt. Der elektrische Strom kann gemessen
werden unter Verwendung einer Elektrodenanordnung und von Sensoren,
welche im Fachbereich bekannt sind. Beispielsweise beschreibt
US-Patent Nr. 5,989,409 von Kurnik
et al. (welches hierein einbezogen ist) ein Verfahren und eine Apparatur
zur Glukosemessung, welches modifiziert werden kann von Glukosemessung
zu Glycerinmessung durch Verändern
der biochemischen Reaktionssequenz zu der vorausstehend beschriebenen.
-
In
einer anderen Ausführung
wird ein Sauerstoffsensor verwendet, um den Sauerstoffverbrauch
oder die Sauerstoffproduktion aus einer enzymatischen Reaktionssequenz
zu messen, welche dem Glycerin oder den Fettsäuren entspricht, die durch
TG-Hydrolyse erzeugt werden. Siehe beispielsweise
US-Patent
Nr. 4,045,297 , welches eine Sauerstoffelektrodenmessvorrichtung
unter Verwendung einer Enzym-gekoppelten Reaktionsserie beschreibt.
Beispielsweise kann die Reaktionsserie wie folgt sein:
-
Die
Aufnahme von Sauerstoff ist proportional zur Menge der Oberflächentriglyceride,
welche in der Pulpenprobe vorliegen. Es können bekannte Konzentrationen
von Triglyceriden verwendet werden, um eine Beziehung zwischen Sauerstoffaufnahme
und Triglyceridkonzentration zu bestimmen.
-
In
einer anderen Ausführungsform
wird die Potenzierung eines elektrischen Felds verwendet, um die Ergebnisse
einer enzymatischen Reaktionssequenz korrespondierend zu Glycerin
oder Fettsäuren,
welche durch TG-Hydrolyse hergestellt werden, zu messen. Vorzugsweise
werden derartige Verfahren unter Verwendung ionenselektiver Elektroden
durchgeführt.
Die Veränderung
der Iononenkonzentration (z. B. pH) entspricht der Veränderung
des elektrischen Potenzials. Die Elektrodenanordnung kann ein immobilisiertes
Enzym umfassen, welches in der Reaktionssequenz verwendet wird.
Siehe, z. B.
US-Patent Nr. 4,713,165 .
Beispielsweise kann das Triglycerid, welches in der Holzpulpe vorliegt,
umgesetzt werden mit einer Lipase zur Erzeugung von kationischen
Fettsäuren,
deren Produktion gemessen wird durch eine Veränderung des pH-Werts der Probe.
Die Triglyceridkonzentration kann quantifiziert werden durch Messen
der pH-Veränderung
in Proben mit bekannter Triglyceridkonzentration zur Bestimmung
einer Beziehung zwischen Triglyceridkonzentration und pH-Änderung.
-
II. TG-Assay-Vorrichtungen
-
Ein
Beispiel für
eine Vorrichtung zur Durchführung
des Triglyceridassays on-line
ist schematisch in 12 dargestellt. Hierin verwendet,
bezieht sich der Begriff „on-line" in Bezug auf Assays,
Tests oder Messungen, auf Prozesse, oder Schritte, welche eine Rolle
spielen in Assays, Tests oder Messungen, welche kein menschliches
Eingreifen benötigen,
d. h. die Schritte oder Tests können
durchgeführt
werden und ein Ergebnis wird erhalten ohne manuelles Entnehmen der
Probe, manuelles Mischen der Probe mit einem Reagenz oder manuelles
Messen einer sich ergebenden Eigenschaft.
-
Die
TG-Assay-Vorrichtung 10 umfasst ein Entnahmemittel, gezeigt
als Ventil 12, zum Entnehmen eines Aliquots an Pulpe aus
einem Prozess 11. Das Entnahmemittel lenkt eine ausgewählte Menge
einer Holzpulpenprobe in einen Reaktionsbehälter 14. Dies kann
entweder unter Verwendung eines positiven Druckstroms oder durch
eine physikalische Umlenkung des Aliquots aus dem Prozess erreicht
werden. Beispielsweise kann ein Ventil lang genug geöffnet werden,
um es der Prozesspulpe, welche unter Druck durch eine Röhre fließt, zu ermöglichen,
in einen Reaktionsbehälter
bei Umgebungs-(Atmosphären)Druck
abgelenkt zu werden und anschließend kann das Ventil geschlossen
werden. Ein Deflektor (nicht gezeigt) kann verwendet werden, um
ein Drücken
der Pulpe in den Behälter
zu erleichtern. Der Reaktionsbehälter,
wobei es sich um einen geschlossenen rostfreien Stahlbehälter handeln
kann, umfasst vorzugsweise ein Rührmittel
(nicht gezeigt) zum Vermischen der Pulpenprobe und der Reagenzien
miteinander. Beispiele für
Rührmittel
umfassen statische und dynamische Mixer, Zirkulationspumpen und ähnliches,
oder die Reaktionskammer kann mechanisch geschüttelt oder vibriert werden,
um eine Vermischung zu erleichtern.
-
Die
Vorrichtung 10 umfasst auch ein Reagenzzuführmittel 16,
welches die Reagenzienvorratsbehälter 18a und 18b umfasst,
und entsprechende Reagenzienkontrollmittel 20a und 20b zum
Kontrollieren der Einführung
einer Reagenzienformulierung A (welche alle die Reagenzien enthält, die
zur Messung der Glycerin- oder Fettsäurekonzentration vor der/ohne
die lipolytische Enzymreaktion benötigt werden) und eine Reagenzienformulierung
B (welche alle die Reagenzien enthält, welche zur Messung der
Glycerin- oder freien-Fettsäuren-Konzentration
nach/mit lipolytischer Enzymreaktion benötigt werden). Die Reagenzienkontrollmittel 20a und 20b kontrollieren
die Zeit und die Zugabemenge an Reagenzienformulierungen A und B
in den Reaktionsbehälter 14,
wodurch es den Reagenzien ermöglicht
wird, mit der hierin enthaltenen Holzpulpenprobe in Kontakt zu treten
und zu reagieren. Diese Reagenzien können entweder in flüssiger oder
fester Form eingeführt werden.
Beispielsweise kann eine Festform für die Reagenzien einen Papierbogen
oder -streifen als Träger oder
Abgabevehikel umfassen.
-
Die
Vorrichtung 10 weist ferner ein Trennmittel zum Abtrennen
der Pulpefasern von dem Filtrat auf, welches sich an die Vervollständigung
der Reaktionssequenz anschließt.
Dieses Trennmittel kann eine Filtrationseinheit, wie sie im Fachbereich
bekannt ist, umfassen.
-
In
der in 12 gezeigten Ausführungsform
umfasst das Trennmittel eine Zentrifuge 22 und einen optionalen
Sekundärfilter 24.
Die Zentrifuge 22 kann sowohl als Reaktionsbehälter 14 und
auch als Trennmittel wirken, obwohl diese in 12 als
unterschiedliche Elemente dargestellt sind. Beim typischen Betrieb
der Zentrifuge wird die umgesetzte Pulpensuspension in einem perforierten
rotierenden Korb gedreht, was dazu führt, dass die wässrige Lösung (d.
h. das Pulpendispersionsmedium) durch die kleinen Perforationen
in dem rotierenden Korb gefiltert wird, während die getrockneten Pulpefasern
auf der Innenoberfläche
des rotierenden Korbs (oder eines Filterstoffs, welcher darin befestigt
ist) zurückerhalten
werden. Die wässrige
Lösung,
d. h. das Filtrat, fließt
anschließend
zu und durch den optionalen Sekundärfilter 24 und in
die Messkammer 26.
-
In
der Messkammer 26 wird die Konzentration der messbaren
Spezies mit der Messvorrichtung 28 gemessen, welche beispielsweise
ein Spektrophotometer oder eine Elektrodenanordnung enthalten kann.
Die Messvorrichtung 28 erzeugt typischerweise ein elektrisches
Signal, welches mit dem gemessenen Wert korrespondiert (z. B. pH,
Transmission, Veränderung
hinsichtlich der Spannung oder des Stroms etc.), welches durch einen
Mikroprozessor (nicht gezeigt) geleitet werden kann und darin unter
Verwendung von vorprogrammierten Matrizen in einen numerischen Wert
zur Anzeige und zur Verwendung als Operator für den Pulpen- und Papierherstellungsprozess
umgewandelt wird. In einer Abwandlung kann es das elektrische Signal
gekoppelt werden mit einem on-line
Pulpenkonsistenzmeter (nicht gezeigt), um einen quantitativen TG-Wert
zu ergeben, z. B. einen Prozentsatz von TG in der trockenen Pulpenaufschlämmung am
Punkt X im Prozess.
-
Die
Vorrichtung kann optional Mittel umfassen zur Aufnahme oder zum
Verfolgen der gemessenen Triglyceride über die Zeit. Beispielsweise
können
die Ausgabedaten aus der Vorrichtung 10 dargestellt werden als
Liniengraph auf einem Computermonitor 30 in einem Zellstoff-/Papiermühlenkontrollraum.
Diese Daten können
auch verwendet werden, um eine oder mehrere Pechkontrollmaßnahmen
(weiter unten ausführlich
beschrieben) manuell oder automatisch zu regulieren. Mit anderen
Worten können
TG-Daten aus der Vorrichtung als Eingabewerte für einen Mühlenoperator oder einen Computerkontroller
zur Regelung der Triglyceride im Mühlenprozess verwendet werden,
um so Pechabscheidungen vorzubeugen oder diese zu minimieren. Entsprechend
ist in einer Ausführungsform
die Vorrichtung operativ verknüpft
mit einem Computerprozesskontroller für die Mühle und insbesondere operativ
verknüpft
mit einem Pechkontrollsystem.
-
Im
Anschluss an die Vervollständigung
dieses Assayschemas kann die Anlage automatisch gespült und gereinigt
werden mit Wasser oder einer wässrigen
Lösung
zur Wiederverwendung, z. B. in einem voreingestellten Interval.
Die Zentrifuge und der Putzfilter werden typischerweise rückgespült oder
anderweitig gewaschen, nachdem jede Charge (d. h. Aliquot) verarbeitet
ist.
-
III. Verwendung der TG-Analyseverfahren
-
Es
wird in Erwägung
gezogen, dass die hierin beschriebenen Triglyceridassayverfahren
automatisiert werden können
und integriert werden können
in eine Kontroll-(Rückkopplungs)schleife
zur Erleichterung der Automatisierung eines Pechkontrollsystems.
Beispielsweise kann beständiges
Helligkeitsmessinstrument oder ein elektromagnetisches Feld zur
Verwendung genau standardisiert werden (unter Verwendung der hierin beschriebenen
Assayverfahren). Derartige beständige
Zähler
können
als Vertreter verwendet werden, um relative Mengen des Materials,
von dem eine Detektion gewünscht
ist, zu bestimmen, ohne dass die Notwendigkeit besteht, spezifische
nominelle Mengen zu identifizieren.
-
Wie
hierin verwendet, bezieht sich ein „Pechkontrollsystem", „Pechkontrollmaßnahme" oder „System zur
Pechkontrolle" auf
beliebige Verfahren, Anlagen, Chemikalien, Enzyme oder Kombinationen
davon, welche in einem oder mehreren Prozessen in einer Zellstoffmühle und/oder
einer Papiermühle
angewendet werden, um den Gehalt an abscheidbaren Pech in den Prozessmaterialien
(z. B. Holzpulpe und Prozesswasser) zu reduzieren, um so die Abscheidung
von Pech auf die Mühlenanlage,
auf das Papierprodukt oder auf beides zu reduzieren. Beispiele für Pechkontrollmaßnahmen
umfassen die Kontrolle von Mühlenbetriebsparametern (z.
B. Temperaturen, pH, Tankmengen, Strömungsraten, Holzplatzmanagment,
das Maß der
Verwendung von Frischwasser und dergleichen) und die Kontrolle der
Dosierung eines Pechkontrolladditivs (z. B. Enzymen, Alaun, Polymeren,
Talk und dergleichen) zum Zwecke der Kontrolle der Triglyceride
in der Mühle,
um so Pechablagerungen vorzubeugen oder um diese zu minimieren.
Repräsentative
Beispiele für
Pechkontrollsysteme umfassen Systeme zur kationischen Fixierung
von Pech mit Alaun oder kationischen Polymeren, zur Pechdispersion
mit oberflächenaktiven
Mitteln bei alkalischen Bedingungen, zur Pechabsorption mit Talk,
zur Pechchelatisierung mit Schwermetallen und zur enzymatischen
Pechkontrolle. Pechkontrollsysteme werden beispielsweise beschrieben
in
US-Patent Nr. 5,256,252 von Sarkar
et al.,
US-Patent-Nr. 5,176,796 von
Irie et al., und
US-Patent-Nr.
5,667,634 von Fujita et al.
-
Es
werden auch Verfahren und Systeme bereitgestellt zur Verbesserung
der Kontrolle von Pech in einer Zellstoff- und Papiermühle durch
Bestimmen des abscheidbaren Triglyceridgehalts in einer Suspension aus
Holzpulpe. Diese Verfahren umfassen (1) Erhalten einer oder mehrerer
Holzpulpenproben aus einer Entnahmestelle in einer Zellstoff- und
Papiermühle,
(2) Untersuchen der abscheidbaren Triglyceride in einer Holzpulpenprobe
und (3) Aktivieren von einer oder mehreren Pechkontrollmaßnahmen
auf Grundlage des erhaltenen Assays für abscheidbare Triglyceride
nach Bedarf. Die Systeme umfassen ein Mittel zur Untersuchung hinsichtlich
abscheidbarer Triglyceride in einer Holzpulpenprobe, welche aus
einer oder mehreren Entnahmestellen in einer Zellstoff- und Papiermühle enthalten
wurde, und eine Vorrichtung zum Anwenden einer oder mehrerer Pechkontrollmaßnahmen,
welche in operativer Kommunikation mit dem Mittel zur Untersuchung steht,
so dass die Vorrichtung in Reaktion auf den Assay für abscheidbare
Triglyceride nach Bedarf aktiviert werden kann. Vorzugsweise werden
die Pechkontrollmaßnahmen
in Reaktion auf den Assay für
abscheidbare Triglyceride automatisch aktiviert. Das Mittel zur
Untersuchung hinsichtlich abscheidbarer Triglyceride verwendet vorzugsweise
eines oder mehrere der hierin beschriebenen enzymatischen Verfahren.
Die Mittel zur Untersuchung können
in wünschenswerter
Weise eine Elektrodenanordnung umfassen, welche geeignet ist, die Konzentrationsveränderung
einer elektrochemischen Spezies zu messen, vorzugsweise kontinuierlich,
wobei die Veränderung
erzeugt wird durch Behandeln der Holzpulpeprobe mit einem lipolytischen
Enzym.
-
Die
vorliegende Erfindung kann ferner unter Bezug auf die folgenden
nicht limitierend wirkenden Beispiele verstanden werden.
-
Beispiel 1: Enzymatisches kolorimetrisches
TG-Verfahren unter Verwendung von PC-A/PC-B
-
Die
Triglyceride werden zu Glycerin und Fettsäuren durch eine Lipase reduziert.
Das Glycerin wird mit Adenosintriphosphat (ATP) unter Bildung von
Adenosin-5'-diphosphat
(ADP) und Glycerin-1-phosphat reagieren, welches mit Sauerstoff
unter Bildung von Dihydroxyacetonphosphat und Peroxid reagiert.
Das Peroxid reagiert mit 4-Aminoantipyrin und Natrium-N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)
m-anisidin (ESPA)
unter Bildung von Quinonimin-Farbstoff und Wasser. Aus dieser Reaktionsserie
ist die Konzentration des Quinonimin-Farbstoffs, welcher als Endprodukt
gebildet wird, direkt proportional zur Konzentration abscheidbarer
Triglyceride, welche ursprünglich
in der Probe vorliegen, und welcher mit einem Spektrophotometer
bei einer Wellenlänge
von 540 nm detektiert wird.
-
Reagenzien
-
Drei
Primärreagenzien
(PC-A, PC-B, und Trioleinstandard) werden verwendet. Das PC-A weist
die folgende Zusammensetzung auf:
– ATP | 0,375
mM |
– Magnesiumsalz | 3,75
mM |
– 4-Aminoantipyrin | 0,188
mM |
– Natrium-N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)m- | 2,11
mM |
anisid
(ESPA) | |
– Glycerinkinase
(mikrobiell) | 1250
U/L |
– Glycerinphosphatoxidase
(mikrobiell) | 2500
U/L |
– Peroxidase
(Merrettich) | 2500
U/L |
– Puffer | pH
7,0 ± 0,1 |
– Nicht
reaktive Stabilisierungsmittel und | |
Füllmittel | |
-
Das
PC-B weist die folgende Zusammensetzung auf:
– Lipase
(mikrobiell) | 250000
U/L |
– nicht
reaktive Stabilisierungsmittel und | |
Füllmittel | |
-
Natriumazid
0,05% wird sowohl zu PC-A und PC-B als Konservierungsmittel zugesetzt.
-
Es
wird ein 3000 mg/L Triolein Emulsionsstandard hergestellt durch
Mischen von 300 mg Triolein mit 9,6 g Triton X-100; Erwärmen des
Gemischs bis eine klare Einzelphase erscheint; Zugeben von 90 ml
destillierten Wassers zu der Phase; gleichmäßiges Vermischen und anschließendes Erwärmen der
Lösung
und mehrmaliges Mischen durch Inversion.
-
Arbeitsverfahren
-
Das
Arbeitsverfahren umfasst Bestimmen der Absorption mit Lipasebehandlung,
Bestimmen der Absorption ohne Lipasebehandlung und anschließend Berechnen
des Triglyceridgehalts bezogen auf die Unterschiede zwischen den
beiden Absorptionen.
-
(I) Bestimmung der Absorption mit Lipasebehandlung
-
- A. Wiege 2,0 g einer Pulpenprobe mit bekannter
Konsistenz (vorzugsweise < 1%)
in ein Röhrchen
mit Schraubverschluss ab. Wenn die Pulpenkonsistenz sehr viel größer als
1% ist, verdünne
sie auf etwa 1% unter Verwendung von destilliertem Wasser.
- B. Gebe 1,0 mL destilliertes Wasser zu.
- C. Gebe 2,0 mL PC-A-Lösung
zu der Probe.
- D. Gebe 0,5 mL PC-B-Lösung
zu der Probe und mische durch Umkehren.
- E. Inkubiere für
12 min. bei 37°C,
beispielsweise mit einem Heizblock oder einem Wasserbad. Kehre das Röhrchen alle
drei Minuten um, um die Gleichmäßigkeit
der Pulpenlösung
sicherzustellen.
- F. Platziere die Röhrchen
sofort in eiskaltem Wasser, um die Reaktion zu stoppen.
- G. Filtere die Pulpe mit einem 0,45 μm Glasfaserspritzenfilter und
platziere das Filtrat in dem Röhrchen.
- H. Stelle das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge bei
540 nm und die abgelesene Absorption auf Null unter Verwendung von
destilliertem Wasser als Referenz.
- I. Lese die Absorption bei 540 nm der Filtratprobe (AA+B) aus und nehme diese auf.
-
(II) Bestimmung der Absorption ohne Lipasebehandlung
-
- A. Wiege 2,0 g einer Pulpenprobe mit bekannter
Konsistenz in ein Röhrchen
mit Schraubverschluss.
- B. Gebe 1,0 mL destilliertes Wasser zu.
- C. Gebe 2,0 mL PC-A-Lösung
dazu und mische.
- D. Inkubiere für
12 min. bei 37°C,
beispielsweise mit einem Heizblock oder einem Wasserbad. Kehre das Röhrchen alle
3 Minuten um, um die Gleichmäßigkeit
der Pulpenlösung
sicherzustellen.
- E. Platziere das Röhrchen
sofort in kaltem Wasser, um die Reaktion zu stoppen.
- F. Filtriere die Pulpe mit einem 0,45 μm Glasfaserspritzenfilter und
platziere das Filtrat in den Röhrchen.
- G. Stelle das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge bei
540 nm und die abgelesene Absorption auf Null unter Verwendung von
destilliertem Wasser als Referenz.
- H. Lese die Absorption bei 540 nm der Filtratprobe (AA) aus und nehme diese auf.
-
(III) In-Beziehung-Setzen der Absorption
zur Triglyceridkonzentration
-
Eine
relative Menge an abscheidbarem Triglycerid wird bestimmt aus der
Differenz zwischen den gemessenen Absorptionswerten AA und
AA+B. Ein iterativer Ansatz mit bekannten
Triglyceridkonzentrationen kann verwendet werden, um die Absorption
der Probe mit einer quantitativen Triglyceridkonzentration zu korrelieren.
-
Beispiel 2: Enzymatisches kolorimetrisches
TG-Verfahren unter Verwendung von PC-Y/PC-Z
-
Die
Triglyceride werden reduziert zu Glycerin und Fettsäuren durch
eine Lipase. Das Glycerin wird umgesetzt mit Adenosintriphosphat
(ATP) unter Bildung von Adenosin-5'-diphosphat (ADP) und Glycerin-1-phosphat,
welches mit Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) unter Bildung von
Dihydroxyacetonphosphat (DAP) und NADH (die reduzierte Form von
NAD) reagiert. Die Reduktion von NAD wird katalysiert durch Glycerin-1-phosphatdehydrogenase
(G-1-PDH). NADH reagiert mit 2-(p-Iodphenyl)-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid
(INT) unter Bildung von Formazan-Farbstoff und NAD. Diese Reaktion
wird katalysiert durch Diaphorase. Aus dieser Reaktionsserie ist
die Konzentration an Formazan-Farbstoff, welcher als Endprodukt
gebildet wird, direkt proportional zur Konzentration an abscheidbaren
Triglyceriden, welche ursprünglichen
Probe vorliegen und wird detektiert mit einem Spektrophotometer
bei einer Wellenlänge
von 500 nm.
-
Reagenzien
-
Es
werden drei Primärreagenzien
(PC-Y, PC-Z und Trioleinstandard) verwendet. Das PC-Y hat die folgende
Zusammensetzung:
– ATP | 2,0
mM |
– NAD | 2,0
mM |
– Magnesiumionen | 3,0
mM |
– INT | 1,0
mM |
– Glycerinkinase
(mikrobiell) | 200
U/L |
– G-1-PDH
(Kaninchenmuskel) | 4000
U/L |
– Diaphorase
(mikrobiell) | 455
U/L |
– Triton
X-100 | 0,2% |
– Puffer | pH
7,8 ± 0,1 |
– Nicht
reaktive Stabilisierungsmittel und | |
Füllmittel | |
-
Das
PC-Z hat die folgende Zusammensetzung:
Lipase
(mikrobiell) | 250000
U/L |
Nicht
reaktive Stabilisierungsmittel und | |
Füllmittel | |
-
Natriumazid
0,05% wird sowohl zu PC-Y als auch zu PC-Z als Konservierungsmittel
zugegeben.
-
Zur
Verwendung werden PC-Y und PC-Z-Lösungen hergestellt durch Rekonstituieren
von trockenem PC-Y und PC-Z mit einem Volumen an deionisiertem Wasser
in markierten Glasgefäßen. Nach
Zugabe von Wasser werden die Gläser
mit einem Stopfen verschlossen und unverzüglich gemischt. Ein 3000 mg/L
Triolein-Emulsionsstandard wird wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
-
Arbeitsverfahren
-
Das
Arbeitsverfahren umfasst Bestimmen der Absorption mit Lipasebehandlung,
Bestimmen der Absorption ohne Lipasebehandlung und anschließend Berechnen
des Triglyceridgehalts bezogen auf die Unterschiede zwischen den
zwei Absorptionen.
-
(I) Bestimmung der Absorption mit Lipase-Behandlung
-
- A. Wiege 2,0 g einer Pulpenprobe mit bekannter
Konsistenz in ein Röhrchen
mit Schraubverschluss ein.
- B. Falls Hydrosulfit in der Pulpenprobe mit einer Konzentration
von weniger als 1000 ppm vorliegt, gebe 1000 ppm Wasserstoffperoxid
zu der Pulpenprobe und inkubiere bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
Für den
unwahrscheinlichen Fall, dass die Konzentration 1000 ppm Hydrosulfid übersteigt,
kann es notwendig sein, zusätzliches
Wasserstoffperoxid zuzugeben.
- C. Gebe 1,0 mL destilliertes Wasser zu.
- D. Gebe 2,0 mL PC-Y-Lösung
zu der Probe.
- E. Gebe 0,5 mL PC-Z-Lösung
zu der Probe und mische.
- F. Inkubiere für
12 Minuten bei 37°C.
Kehre das Röhrchen
alle 3 Minuten um, um die Gleichmäßigkeit der Pulpenlösung sicherzustellen.
- G. Platziere das Röhrchen
sofort in kaltem Wasser, um die Reaktion zu stoppen. Da Formazan-Farbstoff dazu
neigt, in der Pulpe hängenzubleiben,
wird ein oberflächenaktives
Mittel wie beispielsweise Triton X-100, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol,
zu der Lösung
zur Freisetzung des Farbstoffs aus der Pulpe zugegeben. Die Zugabe
von etwa 0,2% Triton X-100 ist zur Farbstofffreisetzung üblicherweise
ausreichend.
- H. Filtriere die Pulpe mit einem 0,45 μm Glasfaserspritzenfilter und
platziere das Filtrat in dem Röhrchen.
- I. Stelle das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge bei
500 nm und die abgelesene Absorption auf Null unter Verwendung von
destilliertem Wasser als Referenz.
- J. Lese die Absorption bei 500 nm der Filtratprobe (AY+Z) aus und nehme diese auf.
-
(II) Bestimmung der Absorption ohne Lipasebehandlung
-
- A. Wiege 2,0 g einer Pulpenprobe mit bekannter
Konsistenz in ein Röhrchen
mit Schraubverschluss.
- B. Falls Hydrosulfid in der Pulpenprobe mit einer Konzentration
von weniger als 1000 ppm vorliegt, gebe 1000 ppm Wasserstoffperoxid
zu der Pulpenprobe und lasse sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten
inkubieren.
- C. Gebe 1,0 mL destilliertes Wasser zu der Probe. Zur Standardisierung
neuer Pulpen gebe insgesamt 1,0 mL eines bestimmten Volumens an
Trioleinemulsion und destilliertem Wasser hinzu.
- D. Gebe 2,0 mL PC-Y-Lösung
zu der Probe und mische.
- E. Inkubiere für
12 min. bei 37°C.
Kehre das Röhrchen
alle 3 Minuten um, um die Gleichmäßigkeit der Pulpenlösung sicherzustellen.
- F. Platziere das Röhrchen
sofort in kaltem Wasser, um die Reaktion zu stoppen. Gebe oberflächenaktives Mittel,
wie beispielsweise Triton X-100, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol zu der
Lösung
nach Bedarf hinzu, um den Farbstoff aus der Pulpe freizusetzen.
Die Zugabe von etwa 0,2% Triton X-100 ist üblicherweise eine ausreichende
Menge zur Farbstofffreisetzung.
- G. Filtriere die Pulpe mit einem 0,45 μm Glasfaserspritzenfilter und
platziere das Filtrat in dem Röhrchen.
- H. Stelle das Spektrophotometer auf eine Wellenlänge bei
500 nm und die abgelesene Absorption auf Null unter Verwendung von
destilliertem Wasser als Referenz.
- I. Lese die Absorption bei 500 nm der Filtratprobe (AY) aus und nehme diese auf.
-
(II) In-Beziehung-Setzen von Absorption
mit der Triglyceridkonzentration
-
Eine
relative Menge abscheidbarer Triglyceride wird bestimmt aus der
Differenz zwischen den gemessenen Absorptionswerten AY und
AA+Z. Ein iterativer Ansatz mit bekannten
Triglyceridkonzentrationen kann verwendet werden, um die Absorption
einer Probe mit einer quantitativen Triglyceridkonzentration zu
korrelieren.
-
Beispiel 3: Testen des enzymatischen kolorimetrischen
TG-Verfahrens für
Pulpe
-
Es
wurden Testgefäße präpariert,
welche 2 mL Wasser enthielten, zu denen 2 mL PC-A zusammen mit variierenden
Triglyceridmengen (Standardkonzentration 3000 mg/L) wie in Tabelle
3 gezeigt, zugegeben wurden. Es wurden die Arbeitsverfahren gemäß Beispiel
1 verwendet, um die Ergebnisse zu erhalten.
-
Um
der Klarheit Genüge
zu tragen, der tatsächliche
Messwert, welcher genommen wird, wenn die Probe im Spektrophotometer
platziert wird, wird als „Absorption" bezeichnet. „Veränderte Absorption" ist die Absorption
der Probe mit Lipasebehandlung, multipliziert mit 1,1, wobei es
sich um das Verhältnis
des Gesamtvolumens der Pulpensuspension mit und ohne Zugabe von
Lipase handelt minus die Absorption der Probe ohne Lipasebehandlung.
Die „Δ veränderte Absorption" stellt die normalisierten
Datenwerte dar, welche durch Subtrahieren des veränderten
Absorptionswertes erhalten werden, welcher für die Probe mit 0 μg zugegebenen
Triglyceriden erhalten wird, von allen Datenpunkten.
-
Ergebnisse
-
Die
in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse sind in
1 dargestellt.
1 kann
entnommen werden, dass die Absorption gegen das Triglyceridgewicht,
welches in das Wasser zugegeben wurde, eine lineare Beziehung zeigt,
wenn die Triglyceride weniger als 600 μg pro Gefäß betragen, wodurch nahegelegt
wird, dass 600 μg
das maximale Triglyceridgewicht ist, welches auf einfache Art und
Weise unter Verwendung der Spezifikationen dieser Technik gemessen
werden kann. In
1 wird eine Steigung von 0,00252
Abs/μg erhalten. Tabelle 3: Ergebnisse der Zugabe von Triglyceriden
in destilliertes Wasser
Test-Nr. | Wasserprobenvolumen | TG-Probe | Destilliertes Wasser | AA | AA+B | Verändert | Δ-verändert |
| mL | mL | μg | mL | abs | abs | abs | abs |
1 | 2 | 0 | 0 | 1,000 | 0,025 | 0,030 | 0,0080 | 0,0000 |
2 | 2 | 0,05 | 150 | 0,950 | 0,027 | 0,386 | 0,3976 | 0,3896 |
3 | 2 | 0,1 | 300 | 0,900 | 0,031 | 0,730 | 0,7720 | 0,7640 |
4 | 2 | 0,15 | 450 | 0,850 | 0,034 | 1,090 | 1,1650 | 1,1570 |
6 | 2 | 0,2 | 600 | 0,800 | 0,036 | 1,389 | 1,4919 | 1,4839 |
-
Der
Effekt der Inkubationszeit nach Zugabe von PC-B auf die veränderte Absorption
unter Verwendung der Eindicker Nr. 1-Probe ist in Tabelle 4 und
in
2 gezeigt. Das Probengewicht betrug 2 g und die Menge
an zu jedem Gefäß zugegebenem
PC-A war 2,0 mL und die Menge an PC-B war 0,5 mL. Der Triglyceridstandard
ist 300 mg/L Triolein. Nach 10 Minuten erreichte die veränderte Absorption
ein Maximum und verblieb nahezu unverändert. Basierend auf diesen
Tests wurde die nahegelegte Inkubationszeit bestimmt zu etwa 12
Minuten. Bei diesen Proben wurden keine Triglyceride zugegeben.
Test „0" ist die Kontrollprobe
und die Tests 1–5
sind Eindickerzuführung
Nr. 1-Proben. Tabelle 4: Effekt der Inkubationszeit
nach Behandlung mit PC-B
Inkubationszeit | Test
Nr. | TG-Probe | Destilliertes Wasser | AA | AA+B | Verändert | Δ-verändert |
Min | | mL | μg | mL | Abs | abs | abs | Abs |
| 0 | 0 | 0 | 3,000 | 0,021 | 0,030 | 0,000 | |
0 | 1 | 0 | 0 | 1,000 | 0,034 | 0,030 | 0,0000 | 0,0000 |
5 | 2 | 0 | 0 | 1,000 | 0,034 | 0,211 | 0,1981 | 0,1981 |
10 | 3 | 0 | 0 | 1,000 | 0,034 | 0,252 | 0,2432 | 0,2432 |
15 | 4 | 0 | 0 | 1,000 | 0,034 | 0,249 | 0,2399 | 0,2399 |
20 | 5 | 0 | 0 | 1,000 | 0,034 | 0,248 | 0,2388 | 0,2388 |
-
Triglyceride
wurden zur Pulpe zugegeben und es wurden Prozesswasserproben von
verschiedenen Punkten in einer wirklichen, Papiermühle im Originalmaßstab entnommen,
um die industrielle Anwendbarkeit des Tests zu bewerten. Das Probengewicht
betrug 2 g und die Menge an PC-A, welche zu jedem Gefäß zugegeben
wurde, war 2,0 ml und die Menge an PC-B ist 0,5 ml. Der Triglyceridstandard
ist 3000 mg/L Triolein. Die Ergebnisse aus den folgenden Probenpunkten
sind in den angegebenen Tabellen und Figuren gezeigt:
Papiermaschine
Nr. 2 Büttenbrühe | Tabelle
5 | Figur
3 |
Niedrigdichtestoffbütten Nr.
1 Brühe | Tabelle
6 | Figur
4 |
Papiermaschinen
Nr. 1 Einsatz-Weißwasser | Tabelle
7 | Figur
5 |
Eindickerzuführungs Nr.
1 Brühe | Tabelle
8 | Figur
6 |
Tabelle 5: Ergebnisse der Zugabe von Triglyceriden
in die Papiermaschine Nr. 2 Büttenbrühe
Test
Nr. | Probe | Probengewicht | TG-Probe | Destilliertes Wasser | AA | AA+B | Verändert | Δ-Verändert |
| | g | mL | μg | mL | abs | abs | abs | Abs |
0 | Kontrolle | 0 | 0 | 0 | 3,000 | 0,025 | 0,026 | 0,000 | |
1 | PM
Nr. 2 Bütte | 2 | 0 | 0 | 1,000 | 0,067 | 0,112 | 0,0562 | 0,0000 |
2 | PM
Nr. 2 Bütte | 2 | 0,05 | 150 | 0,950 | 0,079 | 0,338 | 0,2928 | 0,2366 |
3 | PM
Nr. 2 Bütte | 2 | 0,1 | 300 | 0,900 | 0,088 | 0,613 | 0,5863 | 0,5301 |
4 | PM
Nr. 2 Bütte | 2 | 0,2 | 600 | 0,800 | 0,091 | 1,117 | 1,1377 | 1,0815 |
Tabelle 6: Ergebnisse der Zugabe von Triglyceriden
in die Niedrigdichtenstoffbütten
Nr. 1 Brühe
Test
Nr. | Probe | Probengewicht | TG-Probe | Destilliertes Wasser | AA | AA+B | verändert | verändert |
| | g | mL | μg | mL | Abs | abs | Abs | abs |
0 | Kontrolle | 0 | 0 | 0 | 3,000 | 0,025 | 0,026 | 0,000 | |
1 | LD
Nr. 1 Durchschn. | 2 | 0 | 0 | 1,000 | 0,092 | 0,327 | 0,2672 | 0,0000 |
2 | LD
Nr. 1 | 2 | 0,05 | 150 | 0,950 | 0,124 | 0,515 | 0,4425 | 0,1754 |
3 | LD
Nr. 1 | 2 | 0,1 | 300 | 0,900 | 0,147 | 0,797 | 0,7297 | 0,4626 |
4 | LD
Nr. 1 | 2 | 0,2 | 600 | 0,800 | 0,167 | 1,170 | 1,1200 | 0,8529 |
Tabelle 7: Ergebnisse der Zugabe von Triglyceriden
in Papiermaschinen Nr. 1 Einsatz-Weißwasser
Test
Nr. | Probe | Probengewicht | TG-Probe | Destilliertes Wasser | AA | AA+B | verändert | Δ-verändert |
| | g | mL | μg | mL | abs | abs | abs | abs |
0 | Kontrolle | 0 | 0 | 0 | 3,000 | 0,025 | 0,026 | 0,000 | |
1 | PM
Nr. 1 ww | 2 | 0 | 0 | 1,000 | 0,040 | 0,101 | 0,0706 | 0,0000 |
2 | PM
Nr. 1 ww | 2 | 0,05 | 150 | 0,950 | 0,036 | 0,369 | 0,3699 | 0,2994 |
3 | PM
Nr. 1 ww | 2 | 0,1 | 300 | 0,900 | 0,038 | 0,657 | 0,6847 | 0,6142 |
4 | PM
Nr. 1 ww | 2 | 0,2 | 600 | 0,800 | 0,039 | 1,224 | 1,3074 | 1,2369 |
Tabelle 8: Ergebnisse der Zugabe von Triglyceriden
in Eindickerzuführung
Nr. 1 Brühe
Test
Nr. | Probe | Probengewicht | TG-Probe | Destilliertes Wasser | AA | AA+B | verändert | Δ-verändert |
| | G | mL | μg | mL | abs | abs | abs | abs |
0 | Kontrolle | 0 | 0 | 0 | 3,000 | 0,025 | 0,026 | 0,000 | |
1 | Eindicker
Nr. 1 | 2 | 0 | 0 | 1,000 | 0,038 | 0,245 | 0,2304 | 0,0000 |
2 | Eindicker
Nr. 1 | 2 | 0,05 | 150 | 0,950 | 0,069 | 0,436 | 0,4106 | 0,1802 |
3 | Eindicker
Nr. 1 | 2 | 0,1 | 300 | 0,900 | 0,065 | 0,665 | 0,6665 | 0,4361 |
4 | Eindicker
Nr. 1 | 2 | 0,2 | 600 | 0,800 | 0,075 | 1,081 | 1,1141 | 1,8837 |
-
Die 3–6 zeigen,
dass die Absorption von Pulpe plus zugegebenen Triglyceriden eine
lineare Beziehung mit zugegebenen Triglyceriden aufweist, wenn die
zugegebenen Triglyceride weniger als oder gleich 600 μg sind.
-
Es
wurde herausgefunden, dass die Pulpe einer jeden Baumspezies und
das Wasser einer jeden Mühle
eine unterschiedliche Beziehung zwischen den Absorptionsfiguren
und dem rückständigem TG
aufweist. Ein kontrolliertes Austesten einer jeden Baumspezies und
von Mühlenwasser
kann verwendet werden, um diese Beziehung zu kalibrieren. Tabelle
9 zeigt die Reproduzierbarkeit der Triglycerid-Ergebnisse, welche
bei einer Mühle
durch dieses neue Verfahren analysiert wurden. Die Ergebnisse zeigen,
dass die Reproduzierbarkeit des neuen Verfahrens sehr hoch ist.
Der relative Fehler für
die Analyse der Pulpeproben ist im Allgemeinen niedriger als 5%. Tabelle 9: Reproduzierbarkeit des Triglyceridanalyseverfahrens
Probe | Triglyceride
ppm |
Eindicker
Nr. 1
Eindicker Nr. 1
Eindicker Nr. 1 | | 82,4
79,7
78,2 |
| Mittelwert
(ppm)
Standardabweichung
Variationskoeffizient (%)
Assayzahl | 80,1
2,13
2,7
3 |
Niedrigdichtestoffbütte Nr.
1
Niedrigdichtestoffbütte
Nr. 1
Niedrigdichtestoffbütte
Nr. 1
Niedrigdichtestoffbütte
Nr. 1
Niedrigdichtestoffbütte
Nr. 1 | | 196,4
210,9
203,1
217,9
195,3 |
| Mittelwert
(ppm)
Standardabweichung
Variationskoeffizient (%)
Assayzahl | 204,7
9,65
4,7
5 |
Niedrigdichtestoffbütte Nr.
2
Niedrigdichtestoffbütte
Nr. 2 | | 274,3
269,0 |
| Mittelwert
(ppm)
Standardabweichung
Variationskoeffizient (%)
Assayzahl | 271,7
3,80
1,4
2 |
Papier
Maschine Nr. 1 Bütte
Papier
Maschine Nr. 1 Bütte
Papier
Maschine Nr. 1 Bütte | | 29,3
29,4
33,4 |
| Mittelwert
(ppm)
Standardabweichung
Variationskoeffizient (%)
Assayzahl | 30,7
2,34
7,6
2 |
-
Schlussfolgerungen
-
Es
wurde ein enzymatischer kolorimetrische Triglyceridassay entwickelt,
welcher schnell ist (z. B. ~20 min. bis zur Vervollständigung)
und welcher eine hohe Reproduzierbarkeit aufweist sowie einen kleinen
relativen Fehler (z. B. < 5
bis 10%). Es wesentlich, dass kein flüchtiges organisches Lösungsmittel
benötigt
wurde, um die Triglyceridanalyse durchzuführen.
-
Beispiel 4: Der Effekt von Wasserstoffperoxid
und Hydrosulfit auf Triglyceridassayverfahren
-
Es
wurde ein Experiment durchgeführt,
um zu bestimmen, wie der Assay für
Pulpe ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
und Hydrosulfit und der Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit durch das Vorliegen
von Wasserstoffperoxid und Hydrosulfit beeinflusst werden, da diese
Substanzen in vielen Pulpeproben vorliegen. Die Experimente unter
Verwendung des Assays für
Pulpe ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit, welche nachstehend beschrieben werden, zeigten,
dass das Wasserstoffperoxid mit der Reaktionssequenz wechselwirkt,
das ein Zwischenprodukt ist und ein Reaktant in der Reaktionssequenz
für diesen
Assay. Hydrosulfit wechselwirkt ebenfalls mit diesem Assay, da Hydrosulfit
als ein Reduktionsmittel für
viele Farbstoffe wirkt und das Endprodukt dieses Assays ein Farbstoff
ist, wie beispielsweise Quinonimin-Farbstoff. Die Ergebnisse der
Experimente mit dem Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit zeigen, dass
Wasserstoffperoxid nicht mit der Reaktionssequenz wechselwirkt und
deshalb keinen Effekt auf dieses Assayverfahren aufweist. Hydrosulfit
wechselwirkt mit dem Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit, da zwei verschiedene
Farbstoffe in der Reaktionssequenz eine Rolle spielen: INT und Formazan.
Um die Beschränkungen
des Assays für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit auszuräumen, wurden
Experimente durchgeführt,
um zu bestimmen, ob das Hydrosulfit mit dem Wasserstoffperoxid umgesetzt
werden konnte, bevor der Assay durchgeführt wurde.
-
Arbeitsverfahren
-
Dieses
Experiment bestand aus drei Bestimmungen: (i) wie der Assay für Pulpe
ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit durch variierende Konzentrationen von Peroxid und
Hydrosulfit beeinflusst wurde, wobei 50 ppm Glycerin und 100 ppm
Triolein als Substrate verwendet wurden; (ii) wie der Assay für Pulpe
enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit durch variierende
Konzentrationen and Peroxid und Hydrosulfit beeinflusst wurde, wobei
50 ppm Glycerin und 100 ppm Triolein als Substrate verwendet wurden;
und (iii) unter welchen Bedingungen 1000 ppm Hydrosulfit umgesetzt
werden konnten mit Peroxid, so dass der Assay für Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit verwendet werden konnte, um Triglyceride zu untersuchen.
-
Es
wurden Experimente unter Verwendung von zwei verschiedenen Assayverfahren
mit 100 ppm Triolein und 50 ppm Glycerin als Substraten bei den
folgenden variierten Konzentrationen an Wasserstoffperoxid und Hydrosulfit
durchgeführt:
0, 50, 100, 200, 400 und 1000 ppm. Eine Kontrollprobe, welche kein
Substrat enthielt, wurde für
jedes Experiment verwendet.
-
Ergebnisse und Diskussion
-
PC-A
zusammen mit der Zugabe von PC-B wurde verwendet, um das Vorliegen
von Triglyceriden zu untersuchen. Die enzymatischen Reaktionen,
welche in dieser Ausführungsform
des Assays eine Rolle spielen, waren wie folgt:
Die Triglyceride
wurden zu Glycerin und Fettsäuren
durch eine Lipase reduziert. Das Glycerin wurde umgesetzt unter
Bildung von Glycerin-1-phosphat, welches mit Sauerstoff unter Bildung
von Peroxid reagiert. Das Peroxid reagierte mit 4-Aminoantipyrin und
ESPA unter Bildung von Quinonimin-Farbstoff und Wasser. Aus dieser
Reaktionsserie war die Konzentration an Quinonimin-Farbstoff, welcher
als Endprodukt gebildet wurde, direkt proportional zur Konzentration
von Triglyceriden, welche ursprünglich
in der Probe vorlag.
-
Wasserstoffperoxid
ist ein Reaktionsprodukt in der dritten Reaktion und ein Reaktant
in der vierten Reaktion, so dass die Menge an Wasserstoffperoxid,
welche gebildet wird, proportional ist zur ursprünglichen Konzentration an Triglyceriden.
Jedoch gibt es bei diesem Reaktionsschema ein Problem, wenn Wasserstoffperoxid
bereits in der Pulpenprobe vorliegt, da das Wasserstoffperoxid beginnen
kann zu reagieren mit dem 4-Aminoantipyrin und ESPA und den Quinonimin-Farbstoff
bilden kann oder es kann die Umkehrung der dritten Reaktion stattfinden,
wenn Peroxid im Überschuss
vorliegt.
-
Der
Effekt von Peroxid auf den Assay für Pulpe ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit ist in Tabelle 10 und
7 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass ohne die Zugabe von entweder Glycerin oder
Triolein das Peroxid unter Bildung von Quinonimin-Farbstoff bei
niedrigen Peroxid-Konzentrationen
reagiert und dass die Menge des erzeugten Farbstoffs abnimmt, wenn
die Konzentration erhöht
wird. Die Menge an Quinonimin-Farbstoff nimmt ab, wenn sich die
Peroxidmenge erhöht,
da Wasserstoffperoxid im Überschuss vorliegt,
was dazu führt,
dass sich die dritte Reaktion umkehrt. Die gleichen Trends waren
auch bei Zugabe von 100 ppm Triolein oder 50 ppm Glycerin zu dem
PC-A-Reagenz vor der Zugabe von Peroxid offensichtlich.
7 zeigt
eine Veränderung
der. Absorption (Endabsorption – leer)
als eine Funktion der Peroxidkonzentration. Die Nettoveränderung
für alle
Peroxidkonzentrationen ist nahe Null. Wenn Wasserstoffperoxid anfänglich in
einer Pulpenprobe vorliegt, kann es wahrscheinlich nicht möglich sein,
die Konzentration von Triglyceriden unter Verwendung dieses Verfahrens
genau zu bestimmen. Tabelle 10: Effekt von Peroxid auf den
Assay für
Pulpe ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit
Peroxidkonzentration (ppm) | Leerabsorption
540 nm | Glycerin
50 ppm Absorption 540 nm | Triolein
100 ppm Absorption 540 nm |
0 | 0,0535 | 2,6469 | 1,0942 |
50 | 2,9166 | 2,3206 | 2,6096 |
100 | 1,7511 | 1,5177 | 1,7357 |
200 | 1,3324 | 1,0922 | 1,3567 |
400 | 0,9592 | 0,7091 | 1,0311 |
1000 | 0,5420 | 0,4589 | 0,5263 |
-
Es
ist bekannt, dass Hydrosulfit als Reduktionsmittel für viele
Farbstoffe wirken kann, da es effektiv als Bleichmittel für den Farbstoff
wirkt. Der Effekt von Hydrosulfit auf den Assay für Pulpe
ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit ist in Tabelle 11 und
8 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass ohne die Zugabe von entweder Glycerin
oder Triolein die Reaktionsserie nicht stattfindet und dass keine
Farbveränderung
vorliegt. Mit Zugabe von 100 ppm Triolein oder 50 ppm Glycerin zu
dem PC-A-Reagenz vor der Zugabe von Hydrosulfit, reduziert das Hydrosulfit
den Farbstoff, so dass die Absorption abnimmt, so wie die Konzentration
an Hydrosulfit ansteigt.
8 zeigt die Veränderung
der Absorption (Endabsorption-leer) als eine Funktion der Hydrosulfit-Konzentration.
Die Nettoänderung
der Absorption ist nahe Null, für
Hydrosulfitkonzentrationen über
100 ppm. Bei Konzentrationen unter 100 ppm ist die Nettoveränderung
der Absorption niedriger als die 0 ppm Kontrolle, aber es kann noch
immer möglich
sein, dieses Verfahren zu verwenden. Wenn Hydrosulfit anfänglich in
einer Pulpenprobe mit einer Konzentration über 100 ppm vorliegt, könnte es
nicht möglich
sein, die Konzentration von Triglyceriden unter Verwendung dieses
Verfahrens genau zu bestimmen. Tabelle 11: Effekt von Hydrosulfit auf
den Assay für
Pulpe ohne rückständiges Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit
Peroxidkonzentration (ppm) | Leerabsorption
540 nm | Glycerin
50 ppm Absorption 540 nm | Triolein
100 ppm Absorption 540 nm |
0 | 0,0848 | 2,5643 | 1,1661 |
50 | 0,0981 | 1,5911 | 0,6557 |
100 | 0,0076 | 1,4768 | 0,5799 |
200 | 0,0977 | 0,1537 | 0,0248 |
400 | 0,0275 | 0,0301 | 0,0082 |
1000 | 0,0451 | 0,0266 | 0,0554 |
-
Es
wurde PC-Y zusammen mit der Zugabe von PC-Z verwendet, um das Vorliegen
von Triglyceriden zu untersuchen. Die enzymatischen Reaktionen,
welche bei diesem Assay eine Rolle spielen, waren wie folgt: Die
Triglyceride wurden zu Glycerin und Fettsäuren durch eine Lipase reduziert.
Das Glycerin wurde umgesetzt unter Bildung von Glycerin-1-phosphat,
welches mit NAD unter Bildung von NADH reagiert. Das NAD reagierte
mit INT unter Bildung von Quinonimin-Farbstoff und NAD. Aus dieser
Reaktionsserie war die Konzentration von Quinonimin-Farbstoff, welcher
als Endprodukt gebildet wurde, direkt proportional zur Konzentration an
Triglyceriden, welche ursprünglich
in der Probe vorlag. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin,
dass Wasserstoffperoxid im Reaktionsschema nicht auftritt. In der
Theorie sollte Wasserstoffperoxid, wenn es anfänglich in der Pulpenprobe vorliegt,
die Reaktionssequenz nicht beeinflussen.
-
Der
Effekt von Peroxid auf den Assay für Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid
ist in Tabelle 12 und
9 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen,
dass ohne die Zugabe von entweder Glycerin oder Triolein die Reaktionsserie
nicht stattfindet und dass keine Farbveränderung vorliegt. Mit Zugabe
von entweder Glycerin oder Triolein findet die Reaktionsserie statt
und wird nicht beeinflusst durch die Zugabe von Peroxid.
9 zeigt
die Veränderung
der Absorption (Endabsorption-leer) als Funktion der Peroxidkonzentration.
Die Nettoveränderung
für alle
Peroxidkonzentrationen bleibt relativ konstant von 0 bis 1000 ppm.
Wenn Wasserstoffperoxid ursprünglich
in einer Pulpenprobe vorliegt, ist es möglich, die Konzentration von
Triglyceriden unter Verwendung dieses Verfahrens genau zu bestimmen. Tabelle 12: Effekt von Peroxid auf den
Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid
Peroxidkonzentration (ppm) | Leer
Absorption 500 nm | Glycerin
50 ppm Absorption 500 nm | Triolein
100 ppm Absorption 500 nm |
0 | 0,0951 | 3,1230 | 1,5927 |
50 | 0,0942 | 2,8973 | 1,6696 |
100 | 0,1349 | 3,2614 | 1,6273 |
200 | 0,1366 | 2,8027 | 1,6427 |
400 | 0,1389 | 2,9470 | 1,6100 |
1000 | 0,1359 | 3,3193 | 1,6427 |
-
Der
Effekt von Hydrosulfit auf den Assay für Pulpe enthaltend Hydrosulfit
ist in Tabelle 13 und
10 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen,
dass ohne die Zugabe von entweder Glycerin oder Triolein das Hydrosulfit
reagiert unter Reduzierung des INT-Farbstoffs, welcher in der PC-Y-Reagenzformulierung
vorliegt und eine Farbveränderung
erzeugt. Wenn die Konzentration an Hydrosulfit steigt, steigt die
Absorption der Leerprobe. Mit Zugabe von 100 ppm Triolein oder 50
ppm Glycerin zu Reagenz A vor der Zugabe von Hydrosulfit, reduziert das
Hydrosulfit das Formazan-Farbstoff-Produkt, so dass die Absorption
abnimmt, wie die Konzentration von Hydrosulfit ansteigt.
10 zeigt
die Veränderung
der Absorption (Endabsorption-leer) als Funktion der Hydrosulfitkonzentration.
Die Nettoveränderung
der Absorption nimmt ab, wie die Konzentration von Hydrosulfit ansteigt.
Es ist noch immer möglich,
dieses Verfahren bei niedrigen Hydrosulfitkonzentrationen, um 100
ppm oder weniger, zu verwenden. Tabelle 13: Effekt von Hydrosulfit auf
den Assay für
Pulpe enthaltend Hydrosulfit
Hydrosulfitkonzentration
(ppm) | Leer
Absorption (500 nm) | Glycerin
50 ppm Absorption 500 nm | Triolein
100 ppm Absorption 500 nm |
0 | 0,1355 | 3,5701 | 1,6069 |
50 | 0,3215 | 3,0930 | 2,1249 |
100 | 0,4086 | 3,5191 | 2,0858 |
200 | 0,5266 | 3,3593 | 1,7457 |
400 | 0,6873 | 2,6537 | 1,1205 |
1000 | 0,9937 | 1,5784 | 0,9974 |
-
Da
der Assay für
Pulpe enthaltend das Wasserstoffperoxid- oder Hydrosulfitreaktionsschema
durch Hydrosulfit beeinflusst wird, aber nicht durch Wasserstoffperoxid,
sollte es möglich
sein, das Hydrosulfit mit Wasserstoffperoxid vor Initiierung des
Assays umzusetzen, so dass der Assay nicht durch Hydrosulfit beeinflusst
wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 und
11 gezeigt.
Für dieses
Experiment wurde die Hydrosulfitkonzentration bei 1000 ppm konstant
gehalten und es wurden verschiedene Peroxidkonzentrationen zugegeben,
bevor das PC-Y-Reagenz zugegeben wurde. Es wurde Triolein als Substrat
mit einer Konzentration von 100 ppm verwendet. Die Ergebnisse zeigen,
dass so wie die Konzentration an Peroxid zunimmt, die Absorption bis
zu 200 ppm zunimmt und sich anschließend einpendelt. Diese Ergebnisse
zeigen, dass es möglich
sein kann, diesen Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit zu verwenden,
um die Triglycerid-Konzentration in einer Pulpenprobe zu bestimmen,
welche Hydrogensulfit enthält,
wenn zuerst Wasserstoffperoxid zugegeben wird, um mit Hydrogensulfit
zu reagieren. Tabelle 14: Effekt von Peroxid auf den
Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit mit 100 ppm
Triolein und 1000 ppm Hydrosulfit
Peroxidkonzentration
(ppm) | Endabsorption
500 nm |
0 | 0,3391 |
100 | 0,5060 |
200 | 1,7361 |
400 | 1,6094 |
800 | 1,6792 |
1000 | 1,6175 |
-
Schlussfolgerungen
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass der Assay für Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid
oder Hydrosulfit verwendet werden kann, um Untersuchungen nach Triglyceriden
durchzuführen,
wenn das anfänglich
vorliegende Hydrosulfit mit Wasserstoffperoxid umgesetzt wird. Eine
Menge von 200 ppm Peroxid konnte effektiv umgesetzt werden mit 1000
ppm Hydrosulfit. Der Assay für
Pulpe enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit kann verwendet
werden, um die Untersuchungen nach Triglyceriden durchzuführen, auch
dann, wenn Wasserstoffperoxid in der Probe vorliegt, da Wasserstoffperoxid
in der Reaktionssequenz keine Rolle spielt. Wenn Hydrosulfit in
der Probe vorliegt ist es notwendig, eine entsprechende Menge an
Peroxid zu der Probe hinzu zugeben, bevor der Assay für Pulpe
enthaltend Wasserstoffperoxid oder Hydrosulfit durchgeführt wird.