DE60300298T2

DE60300298T2 - Willkürliche Anordnung von Mikrokugeln für die Analyse von Nukleinsäuren unter Anwendung einer Enzym-Digestion

Info

Publication number: DE60300298T2
Application number: DE60300298T
Authority: DE
Inventors: Tiecheng A. Rochester Qiao; Krishnan Rochester Chari; Douglas L. Rochester Vizard
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Carestream Health Inc
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2023-03-04
Also published as: US6916620B2; JP2003294747A; EP1344836A3; EP1344836B1; EP1344836A2; US20030175719A1; DE60300298D1

Description

Diese Erfindung betrifft ganz allgemein die biologische Mikroarray-Technologie. Insbesondere betrifft sie ein Nukleinsäure-Mikroarraysystem mit willkürlich verteilten, mit einer Nukleinsäuresonde modifizierten Mikrokügelchen, die auf ein Substrat aufgetragen sind, das vor der Beschichtung keine gekennzeichneten Stellen aufweist. Die Mikrokugeln enthalten optische Strichcodierungen, die durch ein oder mehrere Färbemittel erzeugt sind, die den Mikrokugeln zugeordnet sind.
Nachdem in den frühen 1990iger Jahren (Science, 251, 767 – 773, 1991) hoch-dichte Anordnungen, erzeugt durch räumlich zugängliche Synthese von bioaktiven Sonden auf einem 2-dimensionalen, festen Träger erfunden worden sind, hat dies den Prozess der biologischen Forschung und Entwicklung stark gefördert und vereinfacht. Der Schlüssel zur gegenwärtigen Mikroarray-Technologie ist die Abscheidung eines bioaktiven Mittels an einer einzelnen Stelle auf einem Mikrochip in einer "räumlich zugänglichen" Weise.
Die zum gegenwärtigen Zeitpunkt bekannten Technologien haben verschiedene Wege eingeschlagen, um Mikroarrays herzustellen. Beispielsweise beschreiben die US-A-5 412 087 und 5 489 678 die Verwendung eines fotolithografischen Prozesses zur Herstellung von Peptid- und DNA-Mikroarrays. Die Patentschriften lehren die Verwendung von fotolabilen, schützenden Gruppen zur Herstellung von Peptid- und DNA-Mikroarrays durch sukzessive Zyklen der Schutzaufhebung eines definierten Spots auf einem 1 cm × 1 cm großen Chip durch Fotolithografie und anschließender Überflutung der gesamten Oberfläche mit einer aktivierten Aminosäure oder DNA-Base. Die Wiederholung dieses Prozesses ermöglicht den Aufbau eines Peptid- oder DNA-Mikroarrays mit Tausenden von willkürlich unterschiedlichen Peptid- oder Oligonukleotid-Sequenzen an unterschiedlichen Spots auf dem Array. Diese Methode ist kostspielig. Ein Tintenstrahl-Verfahren wird von anderen angewandt (zum Beispiel US-A-6 079 283; 6 083 762 und 6 094 966), um räumlich zugängliche oder aufrufbare Arrays herzustellen, doch leidet diese Technik ebenfalls an hohen Herstellungskosten zusätzlich zu der relativ großen Spotgröße von 40 bis 100 μm. Im Hinblick auf die Anzahl von bioaktiven Sonden, die auf einem einzelnen Chip angeordnet werden müssen, normalerweise 1000 bis 100000 Sonden, ist diese räumliche Adressiermethode von Natur aus kostspielig, unabhängig davon, wie der Chip hergestellt wird. Ein alternatives Verfahren zu der räumlichen Adressiermethode ist das Konzept der Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffes, der in Polymerkügelchen eingeführt wird, um biologische Vielfach-Arrays zu erzeugen. Die US-A-5 981 180 beschreibt ein Verfahren der Verwendung von farb-codierten Kügelchen in Verbindung mit der Durchlauf-Cytometrie, um eine biologische Vielfach-Bestimmung durchzuführen. Mikrokugeln, konjugiert mit DNA oder monoklonalen Antikörpersonden auf ihren Oberflächen, werden intern mit verschiedenen Verhältnissen von zwei ausgeprägten Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt. Hunderten von "spektral adressierten" Mikrokügelchen wird es ermöglicht, mit einer biologischen Probe zu reagieren und die "flüssige Anordnung" wird analysiert durch Hindurchführen einer einzelnen Mikrokugel durch eine Durchlauf-Cytometrie-Zelle unter Decodierung der Probeninformation. Die US-A-6 023 540 und 6 266 459 beschreiben die Verwendung von faseroptischen Bündeln mit vorgeätzten Mikrowellen an distalen Enden, um mit Farbstoff beladene Mikrokugeln zusammenzufassen. Die Oberfläche einer jeden spektral adressierten Mikrokugel wurde mit einem besonderen bioaktiven Mittel versehen und Tausende von Mikrokugeln, die unterschiedliche bioaktive Sonden trugen, wurden miteinander vereinigt unter Erzeugung von "Kugelarrays" auf vorgeätzten Mikrowellen von faseroptischen Bündeln. In jüngerer Zeit wurde ein neues optisch verschlüsseltes Mikrokugel-Verfahren durchgeführt durch Verwendung von unterschiedlich großen, mit Zinksulfid bedeckten Cadmiumselenid-Nanokristallen, die in Mikrokugeln eingeführt wurden (Nature Biotech. 19, 631 – 635, 2001). Unter Berücksichtigung der engen Bandbreite, die diese Nanokristalle aufweisen, dehnt dieses Verfahren die spektrale Strichcodierungskapazität in Mikrokugeln beträchtlich aus.
Obgleich das "spektral adressierte Mikrokugel-" Verfahren einen Vorteil darstellt aufgrund der Einfachheit dieses Verfahrens gegenüber dem althergebrachten, "räumlich adressierbaren" Verfahren bei der Herstellung von Mikroarrays, besteht dennoch ein Bedürfnis, die Herstellung von biologischen Mikroarrays einfacher zu gestalten und weniger kostspielig, um Nukleinsäure-Identifizierungssysteme bereitzustellen, die genau arbeiten, weniger komplex sind und weniger kostspielig.
Die EP 02078433 beschreibt eine Mikroanordnung (Microarray), die weniger kostspielig ist und leichter herzustellen ist als die zuvor offenbarten Mikroanordnungen, da der Träger nicht modifiziert werden muss; trotzdem verbleiben die Mikrokugeln auf dem Substrat immobilisiert.
Die EP 02078433 beschreibt eine Mikroanordnung (Microarray) mit: einem Substrat, das mit einer Zusammensetzung beschichtet ist aus Mikrokugeln, die in einer flüssigen Masse dispergiert sind, mit einem Gelierungsmittel oder einem Vorläufer eines Gelierungsmittels, wobei die Mikrokugeln in willkürlichen Positionen auf dem Substrat immobilisiert werden. Das Substrat ist frei von Rezeptoren, die bestimmt sind zur physikalischen oder chemischen Reaktion mit den Mikrokugeln. Diese Erfindung verwendet eine besondere Beschichtungszusammensetzung und Technologie, um eine Mikroanordnung auf einem Substrat zu erzeugen, das nicht vorgeätzt werden muss mit Mikrowellen oder in irgendeiner Weise vormarkiert werden muss mit Stellen, um die Mikrokugeln anzuziehen, wie es in dem Stande der Technik beschrieben wird.
EP 02078433 lehrt verschiedene Beschichtungsmethoden, veranschaulicht jedoch eine Maschinenbeschichtung, bei der ein Träger mit einer flüssigen Beschichtungszusammensetzung beschichtet wird mit Mikrokugeln, die in Gelatine dispergiert sind. Unmittelbar nach der Beschichtung wird der Träger durch eine Abschreckkammer in der Beschichtungsvorrichtung geführt, in der die Gelatine rasch geliert und die Mikrokugeln immobilisiert werden.
Obgleich diese Erfindung einen großen Herstellungsvorteil gegenüber den existierenden Technologien darstellt, benötigt sie eine gewisse Veredelung, um ihren vollen potentiellen Wert gegenüber dem Stande der Technik zu maximieren. Das Problem besteht darin, dass während einer solchen maschinellen Beschichtung und raschen Gelierung das Gelierungsmittel dazu neigt, die Oberfläche der Mikrokugeln zu bedecken, wodurch der Analyt (wie DNA) daran gehindert wird, durch die Gel-Deckschicht zu dringen und mit Sonden auf der Oberfläche der Mikrokugeln zu hybridisieren. Das Gelatine-Deckschichtproblem wurde gelöst durch Anwendung einer Enzym-Digestion, wie sie offenbart wird in der US-A-2 003 224 361. Es besteht ein Bedürfnis nach einem Nukleinsäure-Analysesystem unter Verwendung eines solchen mit einem Enzym behandelten, aufgetragenen, willkürlichen Mikrokugel-Array in einem Vollbild-Bildaufzeichnungs-Aufnahmesystem.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung der oben diskutieren Probleme beschrieben.
Die vorliegende Erfindung überwindet das oben beschriebene Problem durch enzymatische Entfernung des Gelierungsmittels von der Oberfläche der Mikrokugeln ohne Beschädigung ihrer Integrität der DNA-Sonden (DNA probes) auf ihren Oberflächen. Die mit Enzym behandelte Oberfläche behält ihre physikalische Integrität während des gesamten DNA-Hybridisierungsprozesses bei und die Mikroanordnung (Microarray) zeigt ein sehr starkes Hybridisierungssignal.
Der Vorteil besteht darin, dass die Enzym-Digestion leicht gesteuert werden kann, um die erforderliche Menge von der Gelatine-Deckschicht zu entfernen. Ferner ist das Enzym, eine Protease, leicht zugänglich und auf ökonomische Weise zu erhalten.
Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäureproben bereitgestellt, das umfasst: die Bereitstellung einer Mikroanordnung (Microarray), einschließlich eines Substrates, das mit einer Zusammensetzung beschichtet ist, einschließlich einer Population von mit einer Nukleinsäuresonde modifizierten Mikrokugeln, die immobilisiert sind in einer Beschichtung enthaltend ein Gelierungsmittel oder einen Vorläufer eines Gelierungsmittels, wobei ein erster Anteil der Mikrokugeln in die Gelatinebeschichtung eintaucht und ein zweiter Anteil über der Gelatinebeschichtung exponiert ist und praktisch frei von Gelatine ist, wobei mindestens eine Unter-Population der Population von Mikrokugeln eine optische Strichcodierung aufweist, erzeugt von mindestens einem Färbemittel, dass den Mikrokugeln zugeordnet ist und enthaltend eine Nukleinsäure-Sondensequenz, bei dem die Anordnung in Kontakt gebracht wird mit einer fluoreszierend/chemilumineszierend markierten Nukleinsäureproben-Ziel-Nukleinsäuresequenz; und bei dem man die farbige Strichcodierung der Unter-Population der Mikrokugeln bestimmt aufgrund der Reaktion der fluoreszierend/chemilumineszierend markierten Nukleinsäureproben-Sonden-Nukleinsäuresequenz und der Ziel-Nukleinsäuresequenz.
Die Erfindung hat die folgenden Vorteile.

1. Die Analyse von Nukleinsäuren ist einfacher, weniger kostspielig und kosteneffektiver.
2. Die Nukleinsäure-Identifizierungssysteme sind genau, weniger komplex und weniger kostspielig.

1 ist eine grafische Darstellung einer Beschichtungsvorrichtung.
2 ist eine schematische Darstellung, die darstellt das Nukleinsäurebestimmungssystem auf Basis von mit Gelatine beschichteten Mikrokugeln mit einer Instrumentation und geeigneten Steuereinheiten.
3 ist eine Arbeitsablaufkarte, die den Prozess veranschaulicht, nachdem das Mikroarray-System dazu verwendet wird, um eine unbekannte Nukleinsäureprobe zu analysieren.
4A, 4B, 4C und 4D zeigen Querschnitte eines Mikroarrays, behandelt mit Gelatinase unterschiedliche Zeitspannen lang: 0 Minuten – 4B; 5 Minuten – 4C; und 7 Minuten – 4D.
5A, 5B und 5C zeigen schematisch die entsprechenden optischen Design-Prinzipien, die angewandt wurden zur Analyse der Signale von aufgetragenen Farbkugeln in Absorptions-, Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Bestimmungssystemen.
Wie hier verwendet, steht das Merkmal "Sol-in-Gel-Übergang" oder "Gelierung" für ein Verfahren, bei dem flüssige Lösungen oder Suspensionen von Teilchen kontinuierliche dreidimensionale Netzwerke erzeugen, die keinen stationären Flusszustand zeigen. Dies kann auftreten im Falle von Polymeren durch Polymerisation in Gegenwart von polyfunktionellen Monomeren durch kovalente Quervernetzung eines gelösten Polymeren, das reaktive Seitenketten aufweist und durch sekundäre Bindung, beispielsweise eine Wasserstoffbindung zwischen Polymermolekülen in Lösung. Polymere, wie Gelatine zeigen eine thermische Gelierung, die dem letzteren Typ angehört. Der Prozess der Gelierung oder des Festwerdens ist gekennzeichnet durch eine diskontinuierliche Erhöhung der Geschwindigkeit (vergleiche P.I. Rose, "Theory of the Photographic Process", 4. Auflage, T.H. James, Herausgeber, Seiten 51 – 67).
Wie hier verwendet, steht das Merkmal "willkürliche Verteilung" für eine räumliche Verteilung von Elementen, die keinen Bezug oder keine Vorspannung zeigt. Die Willkürlichkeit kann gemessen werden unter Compliance-Bedingungen, mit denen die erwartet werden durch eine Poisson-Verteilung.
Wie hier verwendet, bezieht sich das Merkmal "Enzym" auf einen biologischen Katalysator. Ähnlich im Vergleich zu traditionellen chemischen Katalysatoren erhöhen Enzyme die Geschwindigkeit von biologischen Reaktionen durch Erzeugung eines Übergangszustandes mit einer geringeren Energie der Aktivierung im Vergleich zur nicht-katalysierten Reaktion. Mit anderen Worten Enzyme sind Proteine, die spezialisiert sind für die Reaktionen, die sie katalysieren. Die bevorzugten Enzyme, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, sind Enzyme, die auf katalytischem Wege die Bindungen von Gelatine hydrolysieren und als "Gelatinasen" bezeichnet werden können.
Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Anordnung (array) von Mikrokugeln, auch bezeichnet als "Kügelchen", auf einem Substrat, wobei die Oberfläche der Mikrokugeln ein Einfangmittel trägt oder Sonden (probes), die leicht zugänglich sind für Analyten, mit denen sie in Kontakt gelangen. Die Verteilung oder das Muster der Mikrokugeln auf dem Substrat ist vollständig willkürlich und die Mikrokugeln werden nicht angezogen oder an Stellen festgehalten, die vormarkiert sind oder vorbestimmt sind auf den Substraten, wie in anderen Verfahren, die im Vorstehenden erwähnt wurden.
Im Falle der vorliegenden Erfindung werden die Mikrokugeln willkürlich immobilisiert, wenn das Gelierungsmittel, in dem sie getragen werden, einem Sol-in-Gel-Übergang unterliegt (auch bekannt als "Gelierung").
Wie hier verwendet, steht das Merkmal "Gelierungsmittel" für eine Substanz, die, wie oben beschrieben, einer Gelierung unterliegen kann. Zu Beispielen gehören Materialien, wie Gelatine, in Wasser lösliche Celluloseether oder Poly(n-isopropylacrylamid), das einer thermischen Gelierung unterliegt oder Substanzen, wie Poly(vinylalkohol), die mittels einer Borat-Verbindung chemisch quervernetzt werden können. Ein bevorzugtes Gelierungsmittel ist mit Alkali vorbehandelte Gelatine. Andere Gelierungsmittel können Polymere sein, die quervernetzt sind durch Strahlung, wie ultraviolette Strahlung. Zu weiteren Beispielen von Gelierungsmittel gehören Akazia, Alginsäure, Bentonit, Carbomer, Carboxymethylcellulosenatrium, Cetostearylalkohol, kolloidales Siliziumdioxid, Ethylcellulose, Gelatine, Guargum, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Magnesiumaluminiumsilicat, Maltodextrin, Methylcellulose, Polyvinylalkohol, Povidon, Propylenglykolalginat, Natriumalginat, Natriumstärkeglykolat, Stärke, Tragacanth und Xanthumgum. (Bezüglich einer weiteren Diskussion von Geliermitteln sei verwiesen auf die Literaturstelle Secundrum Artem, Band 4, Nr. 5, Lloyd V. Allan). Alpha- oder Betaamylase oder Cellulase kann dazu verwendet werden, um überschüssige Polysacchardide zu entfernen, und Agarase kann dazu verwendet werden, um überschüssigen Agar zu entfernen.
Die Erfindung offenbart eine willkürliche Mikroanordnung auf Basis von Polymerlatexkugeln, wobei eine jede Kugel in der Anordnung eine ausgeprägte Signatur aufweist, die die Kugel unterscheidet. Eine derartige Signatur kann auf der Farbe, der Form oder Größe der Kugel beruhen. Im Falle von Signaturen auf Basis der Farbe, kann sich die Farbe ableiten von Mischungen aus drei Farbstoffen, die darstellen, die primären Farben R, G, B unter Erzeugung von Tausenden von unterscheidbaren Kugeln mit ausgeprägten "Farbadressen" (eindeutige RGB-Werte, zum Beispiel R = 0, G = 204, B = 153). Die Kugeln können hergestellt werden mit Zentren an ihren Oberflächen, die "aktiv" sind, was bedeutet, dass an derartigen Zentren leicht eine physikalische oder chemische Reaktion auftreten kann zwischen der Kugel und anderen Molekülen oder Verbindungen. Derartige Verbindungen können organische oder anorganische Verbindungen sein. Gewöhnlich ist das Molekül oder ist die Verbindung eine organische Nukleinsäure oder sie besteht aus Fragmenten hiervon, um Beispiele zu benennen. Wie in den unten folgenden Beispielen angegeben, kann an die Oberfläche einer jeden Farbcodierten Kugel ein vor-synthetisiertes Oligonukleotid oder ein anderes biologisches Mittel gebunden sein. Infolgedessen kann jede Farbadresse einer speziellen bioaktiven Sonde (probe) entsprechen. Diese Kugeln können in gleichen Mengen miteinander vermischt sein und die willkürliche Mikroanordnung kann hergestellt werden durch Auftragen der gemischten Kugeln in einem einschichtigen oder mehrschichtigen Format. Beschichtungsverfahren werden ausführlich beschrieben von Edward Cohen und Edgar B. Guthoff in Kapitel 1 der Literaturstelle "Modern Coating And Drying Technology", (Interfacial Engineering Series; V. 1), (1992), VCH Publishers Inc., New York, NY. Im Falle eines einschichtigen Formates können zu geeigneten Beschichtungsmethoden gehören die Tauchbeschichtung, Stabbeschichtung, Messerbeschichtung, Blattbeschichtung, Luftmesserbeschichtung, Gravure-Beschichtung, Vorwärts- und Umkehrwalzenbeschichtung und die Schlitz- oder Extrusionsbeschichtung.
Trocknungsmethoden variieren ferner gelegentlich mit überraschend unterschiedlichen Ergebnissen. Obgleich das Beschichtungsverfahren, das in Beispiel 1 beschrieben wird, mit einer Niedrig-Temperatur-Abschreckung in Kombination mit einer Hoch-Temperatur-Trocknung zu einem vorteilhaften und raschen Herstellungsverfahren führt, neigt es auch dazu, die Oberfläche der Mikrokugeln mit einer dünnen Schicht von Gelierungsmittel zurückzulassen. Eine derartige dünne Schicht aus Gelierungsmittel kann die beabsichtigte biologische Analyse stören durch Verhinderung des Zutritts des Analyten zu der biologischen Sonde auf der Oberfläche der Mikrokugeln. Es wurde festgestellt, dass, wenn die Beschichtung bei Umgebungstemperatur trocknen gelassen wird, zum Beispiel bei Raumtemperatur, nach Aufbringen von Gelatineschmelze mit Mikrokugeln, die obere Oberfläche der Mikrokugeln exponiert werden kann, ohne feststellbare Beschichtung mit Gelierungsmittel. Ein solches Trocknungsverfahren bei Umgebungstemperatur erfordert jedoch eine viel längere Zeitspanne zur Durchführung des Trocknungsprozesses, wodurch das Herstellungsverfahren beträchtlich verlängert wird. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Lösung des Problems der Gel-Beschichtung auf der Oberfläche von Mikrokugeln, wobei das Verfahren leicht integriert werden kann in ein Hochgeschwindigkeits-Beschichtungs-Herstellungsverfahren.
Ein Nukleinsäuremolekül ist ein lineares Polymer, bestehend aus vier Basen, A, T (U), G und C (T für ein DNA-Molekül und U für ein RNA-Molekül). Die Wechselwirkung zwischen vier Basen folgt der "Watson-Crick"-Basenpaar-Regel von A zu T (U) und G zu C, vermittelt durch Wasserstoffbindungen. Haben zwei einfache Stränge von DNA-Molekülen ein perfektes "Watson-Crick"-Basenpaar-Ebenbild, werden sie als komplementäre Stränge bezeichnet. Die Wechselwirkung zwischen zwei komplementären Strängen wird als Hybridisierung bezeichnet. Gelegentlich können komplementäre Stränge ein oder mehrere fehlerhafte Basenpaarungen enthalten.
Um ein Nukleinsäure-Mikroarray zur Analyse einer unbekannten Nukleinsäureprobe zu verwenden, muss die Nukleinsäureprobe, die analysiert werden soll nicht-selektiv markiert werden durch Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen oder chemilumineszierenden, aktiven Molekülen, gefolgt von einer Hybridisierung der fluoreszierend/chemilumineszierend markierten, biologischen Nukleinsäureprobe, die hybridisiert werden kann zur willkürlichen Nukleinsäure-Mikroanordnung auf Farbkügelchen-Basis. Die Methode der Markierung von Nukleinsäureproben ist allgemein etabliert und die Protokolle des Markierungsverfahrens finden sich in vielen Publikationen, beispielsweise bei http://cmgm.stanford.edu/pbrown/ protocols/index.html. Die Signale von sowohl "Farb-adressierbaren" Polymerkugeln wie auch einer biologischen Probe von einer nicht-selektiv markierten Nukleinsäure-Fluoreszenz/ Chemilumineszenz können analysiert werden durch eine Ladungs-gekoppelte Vorrichtung nach der Bildvergrößerung durch ein optisches System. Das ausgezeichnete Arraybild kann automatisch analysiert werden durch einen Bild-Entwicklungs-Algorithmus unter Erzielung einer bioaktiven Sondeninformation auf Basis der RGB-Farbcodierung einer jeden Kugel, wobei die Information verglichen wird mit dem Fluoreszenz-/Chemilumineszenzbild unter Bestimmung und Quantifizierung spezieller biologischer Analyt-Materialien in der Probe. Optische oder andere elektromagnetische Mittel können zur Feststellung der Signatur eingesetzt werden.
Obgleich Mikrokugeln oder Teilchen mit einer praktisch curvilinearen Form bevorzugt verwendet werden aufgrund ihrer leichten Herstellung, können doch auch Teilchen von anderen Formen verwendet werden, wie ellipsoidale oder kubische Teilchen. Geeignete Verfahren zur Herstellung der Teilchen sind die Emulsionspolymerisation, wie sie beschrieben wird in "Emulsion Polymerisation" von I. Piirma, Academic Press, New York (1982) oder sie können hergestellt werden durch begrenzte Koaleszenz, wie sie beschrieben wird von T.H. Whitesides und D.S. Ross in J. Colloid Interface Science, Band 169, Seiten 48 – 59 (1985). Das spezielle Polymer, das zur Herstellung der Teilchen oder Mikrokugeln verwendet wird, ist ein mit Wasser unmischbares, synthetisches Polymer, das gefärbt werden kann. Das bevorzugte Polymer ist ein beliebiges amorphes, mit Wasser unmischbares Polymer. Beispiele von Polymertypen, die geeignet sind, sind Polystyrol, Poly(methylmethacrylat) oder Poly(butylacrylat). Auch können Copolymere, wie ein Copolymer von Styrol und Butylacrylat verwendet werden. Polystyrolpolymere werden in geeigneter Weise verwendet. Die erzeugte Mikrokugel ist gefärbt unter Verwendung eines unlöslichen Färbemittels, das ein Pigment oder Farbstoff ist, das bzw. während der Beschichtung oder nachfolgenden Behandlung nicht gelöst wird. Geeignete Farbstoffe können von Natur aus Öl-löslich sein. Vorzugsweise sind die Farbstoffe nicht-fluoreszierend, wenn sie in die Mikrokugeln eingeführt werden.
Die Mikrokugeln werden in wünschenswerter Weise derart hergestellt, dass sie einen mittleren Durchmesser von 1 bis 50 Mikron aufweisen, weiter bevorzugt im Bereich von 3 bis 30 Mikron und im am meisten bevorzugter Weise im Bereich von 5 bis 20 Mikron. Vorzugs weise liegt die Konzentration der Mikrokugeln in der Beschichtung im Bereich von 100 auf eine Million pro cm², weiter bevorzugt bei 1000 bis 200 000 pro cm² und in am meisten bevorzugter Weise bei 10 000 bis 100 000 pro cm².
Die Bindung von bioaktiven Mitteln (oftmals bezeichnet als "Sonden") an die Oberfläche der chemisch funktionalisierten Mikrokugeln kann erfolgen gemäß aus dem Stande der Technik bekannten Verfahren (Bangs Laboratories, Inc. Technote #205). Zu einigen üblicherweise verwendeten, chemischen, funktionellen Gruppen gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl-, Hydrazid-, Amid-, Chlorodmethyl-, Epoxy-, Aldehydgruppen usw. Zu Beispielen von bioaktiven Mitteln oder Sonden gehören, ohne dass eine Beschränkung hierauf erfolgt, Oligonukleotide, DNA und DNA-Fragmente, PNAs und synthetische Moleküle, die dazu befähigt sind, speziell mit einem Ziel zu reagieren, wie einer Nukleinsäuresequenz.
Zu den Enzymen, die im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, gehören beliebige Enzyme, Enzympräparate oder Enzyme enthaltende Formulierungen, die dazu befähigt sind, Gelatine zu lösen oder abzubauen, oder andere Gelierungsmittel, die verwendet werden und praktisch unfähig sind, die Sonde zu digestieren oder zu inaktivieren. Mit Inaktivieren ist gemeint, dass die Probe daran gehindert wird, mit einem speziellen Ziel zu reagieren, und zwar unter normalen Reaktionsbedingungen. Dies bedeutet, dass "Enzym" im Kontext dieser Erfindung einschließt rohe Enzympräparate, wie rohe Pflanzen- oder Baktieren-Fermentationsbrühenextrakte, wie auch gereinigte Enzyme von Pflanzen, Tieren oder von bakteriellem Ursprung. Präparate von Enzymen, die in dem Verfahren geeignet sind, umfassen Aktivatoren, Cofaktoren und Stabilisatoren, die erforderlich sind für eine enzymatische Aktivität, wie auch Stabilisatoren, die die Enzymaktivität steigern oder schützen.
Zu Beispielen von geeigneten Enzymen gehören Serinprotease, wie Esperase^®, Alcalase^® und Savinase^® (handelsübliche Enzympräparate von Novo Nordisk Corporation); Multifect P-3000^®, HT Proteolytic 200^®, Protex 6L^® und Protease 899^® (im Handel erhältliche Enzympräparate von der Firma Genencor International Corporation); Sulfhydrylprotease, wie Papain und Bromelain; sowie Metaloproteasen, wie Neutrase^® (ein im Handel erhältliches, bakterielles Metaloenzympräparat von der Firma Novo Nordisk Corporation). Die Verwendung von Kombinationen von diesen Enzymen und Enzymtypen wird erfindungsgemäß ebenfalls empfohlen. Addukte von Enzymen mit synthetischen Polymeren werden ebenfalls vorgeschlagen, in denen Enzymmoleküle an synthetische Polymere gebunden sind, wobei die Polymeren größer oder kleiner sein können als das Enzym.
Andere Enzyme, vorzugsweise proteolytische Enzyme sollten ebenfalls für diese Erfindung geeignet sein. Die Verwendung von Kombinationen von diesen Enzymen und Enzymtypen im Rahmen dieser Erfindung ist ebenfalls möglich. Möglich ist auch die Verwendung von Addukten von Enzymen mit synthetischen Polymeren, in denen die Enzymmoleküle an synthetische Polymere gebunden sind, wobei die Polymeren größer oder kleiner sein können als das Enzym.
Eine erfolgreiche analytische Bildaufzeichnung (Auflösung) der farbigen Kügelchen, die andere fluoreszierende oder lumineszierende Reporter tragen, ist eine komplizierte, jedoch realisierbare Aufgabe. Das bevorzugte Bildaufzeichnungssystem muss ausreichend flexibel sein, um sämtliche Bildeinfang-Aufgaben erfüllen zu können ohne die Bewegung der hergestellten Proben-Anordnung. Aufgrund ihrer demonstrierten Meriten ist die Vollbild-Aufzeichnung (full-frame capture) der Anordnung mit einer CCD-Kamera das bevorzugte Verfahren. Eine sorgfältig konstruierte Array-Illuminierung ist kritisch sowohl für die farbige als auch fluoreszierende Sonden-Auflösung. Unter Beachtung der zusätzlichen Erfordernisse im Falle der lumineszierenden Auflösung werden die Mindestanforderungen, die an ein optisches System zu stellen sind, erfüllt von einem CCD-Sensor von mindestens 12-Bits Monochrome (< 30 Elektronen Geräuschanzeige), 1 Millionen Pixel, 40 % Quantenausbeute, abgekühlt (Dunkelstrom < 0,01 Elektron/Sek.) unter Verwendung einer f/3 Linse und einer Vergrößerung von annähernd eins. Ein Sensor-Pixel mit ungefähr der Größe einer Kugel ist am meisten wirksam; größere Pixel schließen einen Kompromiss mit der räumlichen Auflösung der Kugel und kleinere Pixel schließen einen Kompromiss mit der Signalauflösung, die gefordert wird für sowohl die Farbmessung als auch die Reportermessung. In der Theorie und begrenzt in der Praxis ermöglichen die obigen Erfordernisse die Analyse von annähernd 50 000 willkürlich dispergierten Kugeln pro Einfangfeld. Eindeutig muss eine Software-Analyse von großen Mengen an Daten durchgeführt werden, um den Durchsatz von Array-Bildern zu bewältigen. Die Software-Analyse muss ein Maß bereitstellen für die Kugel-Meldung, die Lokalisierung und Qualifizierung einer Kugel, die Berechnung ihrer Farbadresse und sie muss möglicherweise ihren Oberflächenbereich rechtzeitig bestimmen.
Ein sorgfältig ausgestaltetes Beleuchtungssystem umfasst eine gut ausgestaltete epi-Illuminierung (Array-Illuminierung für die gleiche Seite wie die CCD-Kamera). Die Illuminierung muss erfolgen mit konditioniertem/gesteuertem, monochromatischem Licht, das ausreichend monochromatisch ist, um eine geeignete Farbanalyse zu ermöglichen sowie eine Fluoreszenz-Anregung und ausreichend intensiv, um vernünftig kurze Exponierungszeiten (Minuten) zu gewährleisten. Die Illuminierung muss auf eine Intensität beschränkt werden, die eine nachteilige Fotolyse oder Wärmeentwicklung beschränkt und die lediglich Einzel-Photonen-Fluoreszenzprozesse gewährleistet unter Vereinfachung der Anstrengung zur Minimierung von unerwünschten, fluoreszierenden Artifakten von festen Trägern und verschiedenen biologischen Materialien, die für die Anordnungen wichtig sind. Die Vollbild-Einfang-Fähigkeit der in geeigneter Weise eingestellten CCD-Kamera ist besonders qualifiziert, die Anforderungen zu erfüllen, die an realisierbare Illuminierungssysteme gestellt werden, doch muss sie unterstützt werden durch präzise optische Filter zur Analyse von Licht für den Zweck der Wahrnehmung von Farbe und Fluoreszenz. Geeignete Interferenzfilter lassen sich leicht ermitteln nach Feststellung von Farbstoff und Fluoreszenz-Reporter-Charakteristika. Ferner kann die spezielle CCD-Kamera der Aufnahme und der Analyse von lumineszierenden Reportern in etwa einer 10 Minuten langen Zeitspanne pro Aufnahmefeld Rechnung tragen. Ein fest angeordneter Desktop-Computer mit der geeigneten Hardware kann sämtliche Analysen durchführen innerhalb einer Zeitspanne entsprechend den Minuten, die erforderlich sind, um sämtliche relevanten Array-Daten zu erfassen.
Obgleich die obigen Hardware-Angaben die Analyse von willkürlichen Kugelanordnungen nachvollziehen können, sind die Analysen realisierbar lediglich dann, wenn die tragenden Materialien optisch qualifiziert sind. Zu optischen Erfordernissen des Array-Trägers gehören eine geeignete Sauberheit (Artifakt-frei, zum Beispiel von Staub, Debris, Spritzern, Kratzern und Einschlüssen) sowie physikalische/optische Erfordernisse, die eine Fluoreszenz-Abschreckung minimieren, der Ausschluss von fluoreszierenden Trägern oder farbigen Farbstoffen und das Vorhandensein einer räumlichen Geräuschfrequenz und Amplitude, welche die Array-Analyse in minimaler Weise stört. Zusätzlich muss die geeignete optische Kupplung der Anordnung mit dem Bildaufzeichnungssystem den Erfordernissen von sowohl der Illuminierung als auch der Aufnahme angepasst sein.
Dass der gesamte Prozess realisierbar ist, muss angenommen werden auf der Basis, dass ein "üblicher" fotografischer Film beschichtet und entwickelt wird unter Erzeugung von Bildern, die Millionen von Farben bei einer räumlichen Auflösung von einigen wenigen Mikrometern auflösen. Bei einem Vergleich scheint die Aufgabe der Analyse der willkürlichen Kugel-Mikroanordnung bescheiden zu sein, da lediglich die Auflösung von 1000 Farben bei etwa 10 Mikrometern erforderlich ist. Jedoch bewirken die Bit-Tiefe/Empfindlichkeit, die erforderlich ist, die wesentlichen delikaten Biochemieen und die Steuerung der Fluoreszenz viele Herausforderungen und ein großer Teil der Auflösung, wie im Falle fotografischer Filme üblich ist, wird geopfert, um den Entwicklungsherausforderungen zu entsprechen, die bei der Array-Analyse vorliegen.
Eines der realisierbaren Systeme für die Nukleinsäureanalyse auf Basis der obigen Beschreibung ist in 2 schematisch dargestellt im Falle der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremikroanordnung auf Basis von farbigen Kügelchen und mit den erforderlichen Hardware-Komponenten. Das Konstruktionsprinzip für ein solches System wird im Detail in Beispiel 5 beschrieben. Jedoch kann ein Fachmann das System modifizieren unter Erzeugung von anderen Variationen ähnlich denen, die im Rahmen dieser Erfindung beschrieben werden. Wie dargestellt, wurde eine beschichtete Mikroanordnung A (microarray A) auf die Oberfläche der geschlossenen Box H aufgebracht, die die Lichtquelle B und den Licht-Deflektor D enthält. Die Oberfläche I, die mit A in Kontakt steht, kann hergestellt werden aus transparentem Glas oder anderen plastischen Materialien. E ist eine optische Linse, um ein Lichtsignal von A auf den elektronischen Vollbild-Detektor F (zum Beispiel CCD, MOS) zu fokussieren und das Signal wird durch den Computer G analysiert. In der Praxis kann die Farbkugel-Strichcodierungs-Information aufgenommen werden durch Illuminierung der Mikroanordnung (microarray) mit einem konditionierten/gesteuerten, monochromatischen Licht B. Beruht das Reporter-Signal von A auf einer Fluoreszenz, so kann die Fluoreszenz angeregt werden unter Verwendung von ausgewähltem, monochromatischem Licht von B mit der geschlossenen Abdeckung C. Beruht das Reporter-Signal von A auf einer Chemilumineszenz, so befindet sich die Mikroanordnung A in Kontakt mit einer Chemilumineszenz-Substratlösung und das Reportersignal kann im Dunkeln aufgenommen werden mit der geschlossenen Abdeckung C.
3 zeigt schematisch eine Arbeitsablaufkarte, die zeigt, wie das beschriebene Nukleinsäure-Analysesystem zu verwenden ist. In Stufe 1, Box 100, wird eine fluoreszierend/chemi lumineszierend markierte Nukleinsäureprobe hybridisiert auf die willkürliche Mikroanordnung auf Basis der Kugeln. Diese Stufe erfordert einen guten physikalischen Kontakt der aufgetragenen Mikroanordnung mit der Nukleinsäureprobe dadurch, dass entweder eine Schicht der Probenlösung auf die beschichtete Seite der Mikroanordnung gebracht wird oder durch Eintauchen der Mikroanordnung in die Probenlösung. Die nicht-spezifisch gebundene Nukleinsäure wird in Stufe 2, Box 110, entfernt durch mehrfaches Waschen der Mikroanordnung in Pufferlösung. In Stufe 3, Box 120, werden die Fluoreszenz/Chemi-lumineszenz-Signale, die sich ergeben bei der Hybridisierung der unbekannten Nuklein-säureprobe mit Sondensequenzen auf der Oberfläche der beschichteten Mikrokugeln, analysiert durch ein Bildaufzeichnungssystem, wie es in 2 dargestellt wird. Das aufgezeichnete Fluoreszenz/Chemilumineszenz-Bild, gekennzeichnet als IMAGE1, ist in dem Computer G gespeichert. In Stufe 4, Box 130, wird eine Hellfeld-Illuminierungsbedingung dazu angewandt, das Farbkugelbild aufzunehmen, um die optische Signatur/Strichcodierungs-Information der beschichteten Mikroanordnung zu erhalten. Dieses Bild wird als IMAGE2 gekennzeichnet und im Computer H gespeichert. In der abschließenden Stufe können sowohl IMAGE1 als auch IMAGE2 automatisch analysiert werden unter Anwendung eines Bild-Entwicklungs-Algorithmus zur Identifizierung von unbekannten Nukleinsäuresequenzen durch Vergleich von IMAGE1 mit IMAGE2.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von farbigen Mikrokugeln durch Einführung von Farbstoffen in die Mikrokugeln und das Verfahren zur Herstellung der Beschichtung, die farbige Mikrokugeln enthält.
24 g einer 4 %-igen wässrigen Suspension von Polystyrolkugeln, hergestellt durch Emulsionspolymerisation, sowie mit einer mittleren Größe von 9,5 Mikrometern wurden vereinigt mit 0,48 g Poly(vinylalkohol) (zu 75 % hydrolysiert, Molekulargewicht 2000).
Eine Suspension von purpurrotfarbigen Kugeln wurde dadurch hergestellt, dass zunächst 0,084 g von Farbstoff 1 in 0,08 g Toluol und 7,92 g Aceton gelöst wurden. Von der obigen Suspension von Polystyrolkugeln, enthaltend Poly(vinylalkohol) wurde dann eine Menge von 8,16 g langsam (tropfenweise) zu dieser Lösung der Farbstoffe zugegeben, wobei gerührt wurde unter Herstellung einer Suspension von farbigen Kugeln. Die Suspension von farbigen Kugeln wurde dann filtriert unter Verwendung eines porösen Baumwollfilters, worauf die Lösung in einen Dialysebeutel gebracht wurde (Molekulargewicht Cut off 12 000 bis 14 000) und worauf die Suspension eine Stunde lang mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Nach dem Waschen wurde die Suspension von farbigen Kugeln nochmals gefiltert unter Verwendung eines porösen Baumwollfilters. Die Konzentration an purpurrotfarbigen Kugeln in der Suspension nach dieser abschließenden Stufe betrug 1,2 %.
Suspensionen von Blaugrün und Orange gefärbten Kugeln wurden in ähnlicher Weise hergestellt unter Verwendung des Farbstoffes 2 bzw. des Farbstoffes 3 (Sudan Orange 220 von der Firma BASF Corporation) anstelle des Farbstoffes 1. Die Konzentration der farbigen Kugeln in diesen Suspensionen lag bei 1,6 % bzw. 1,45 %.
Zusammensetzungen für die Beschichtung wurden in folgender Weise hergestellt.
Zusammensetzung 1 (Erfindung)
Diese wurde hergestellt durch Vereinigung von 4,0 g der Suspension der Blaugrün gefärbten Kugeln, 5,33 g der Purpurrot gefärbten Kugeln und 4,41 g der Orange gefärbten Kugeln mit 13,91 g einer 11,5 %-igen Lösung von mit Kalk aufgeschlossener Knochengelatine in Wasser, 3,2 g eines Beschichtungshilfsmittels (6,8 %-ige Lösung von Triton X 200E in Wasser) und 49,15 g destilliertem Wasser.
Zusammensetzung 2 (Vergleich)
Eine zweite Zusammensetzung für die Beschichtung wurde hergestellt durch Vereinigung der gleichen Mengen an Blaugrün, Purpurrot und Orange gefärbten Kugeln mit 7,27 g Poly(vinylalkohol) (GH23 der Firma Nippon Gohsei) und 55,79 g Wasser. Die Menge an Beschichtungshilfsmittel war die gleiche wie im Falle der Zusammensetzung 1. Die Menge an Poly(vinylalkohol) wurde derart ausgewählt, dass die Viskosität der Zusammensetzung 1 bei den höheren Temperaturen erreicht wurde (siehe unten).
Beide Proben (Zusammensetzung 1 und Zusammensetzung 2) wurden in einem 50°C warmen Wasserbad 30 Minuten lang aufbewahrt bis zur Gleichgewichtseinstellung, worauf sie analy siert wurden unter Anwendung eines rheometrischen Flüssigkeits-Rheometers. Viskositäten wurden bestimmt als Funktion der Temperatur nach der dynamischen, oscillierenden Technik bei Abkühlung der Proben in einer Geschwindigkeit von 1 °C pro Minute.
Tabelle #1
Aus den obigen Daten ist ersichtlich, dass bei den höheren Temperaturen (oberhalb etwa 30 °C) sich beide Proben ähnlich bezüglich des Anstieges der Viskosität beim Abkühlen verhalten. Unterhalb etwa 25 °C jedoch zeigt die Zusammensetzung 1 (Erfindung) eine viel dramatischerer Erhöhung der Viskosität durch Gelierung. Ein solches Verhalten zeigt die Zusammensetzung 2 (Vergleich) nicht. Die Viskosität der Zusammensetzung 1 steigt um mehrere Größenordnungen, wenn die Temperatur vermindert wird von 25 °C auf 10 °C. Die Temperatur zu Beginn der Gelierung wurde zu 21,8 °C bestimmt.
Farbstoff 1
Farbstoff 2
Farbstoff 3
Farbstoff 4
Eine Suspension von Blaugrün gefärbten Kugeln wurde dadurch hergestellt, dass zunächst 0,001 g des Farbstoffes 2 in 0,05 g Toluol und 4,95 g Aceton gelöst wurden. 2,5 g einer 4 %- igen wässrigen Suspension von Polystyrolkugeln, hergestellt durch Emulsionspolymerisation mit einer mittleren Größe von 9,5 Mikrometern, wurde dann langsam (tropfenweise) zu dieser Lösung der Farbstoffe zugegeben, und zwar unter Rühren unter Herstellung einer Suspension von 1 % Farbstoff des eingeführten blaugrünen Farbstoffes. Die Suspension der farbigen Kugeln wurde dann filtriert unter Verwendung eines porösen Baumwollfilters, worauf sie in einen Dialysebeutel eingeführt wurde (Molekulargewicht Cut off 12 000 bis 14 000) und worauf sie eine Stunde lang mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Die Konzentration an blaugrünen Kugeln in der Suspension nach dieser abschließenden Stufe betrug 0,78 %.
Suspensionen der anderen 5 Mengen an blaugrünem Farbstoff, die in die Kugeln eingeführt wurden, wurden in gleicher Weise hergestellt unter Verwendung von 0,002 g Farbstoff 2, 0,006 g Farbstoff 2, 0,007 g Farbstoff 2, 0,009 g Farbstoff 2 und 0,01 g Farbstoff 2.
Zur Herstellung der letzten zwei Proben wurden 2,5 g einer 4 %-igen wässrigen Suspension von Polystyrolkugeln, hergestellt durch Emulsionspolymerisation und mit einer mittleren Größe von 9,5 Mikrometern, vereinigt mit 0,48 g Poly(vinylalkohol) (zu 75 % hydrolysiert, Molekulargewicht 2000). Diese Kombination wurde anstelle der Polystyrolkugeln allein verwendet.
Eine 4 %-ige wässrige Suspension von 2,5 g Polystyrolkugeln, hergestellt durch Emulsionspolymerisation und mit einer mittleren Größe von 9,5 Mikrometern, wurde vereinigt mit 0,4 g Poly(vinylalkohol) (zu 75 % hydrolysiert, Molekulargewicht 2000).
Eine Suspension von Purpurrot gefärbten Kugeln wurde hergestellt dadurch, dass zunächst 0,01 g von Farbstoff 1 in 0,05 g Toluol und 4,95 g Aceton gelöst wurden. Von der obigen Suspension von Polystyrolkugeln, enthaltend Poly(vinylalkohol) wurde eine Menge von 5,00 g dann langsam (tropfenweise) zu dieser Lösung der Farbstoffe zugegeben unter Rühren unter Herstellung einer Suspension mit 5 % mit purpurroten Farbstoff beladenem Farbstoff. Die Suspension von farbigen Kugeln wurden dann filtriert unter Verwendung eines porösen Baumwollfilters, worauf sie in einen Dialysebeutel gebracht wurde (Molekulargewicht Cut off 12 000 bis 14 000) und worauf sie eine Stunde lang mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Die Konzentration der blaugrünen Kugeln in der Suspension lag bei dieser abschließenden Stufe bei 2,59 %.
Suspensionen der anderen vier Farben des Farbstoffes, eingeführt in die Kugeln wurden hergestellt in ähnlicher Weise unter Verwendung von 0,05 g eines jeden der folgenden Farbstoffe: Farbstoff 2 (114FN-D89), Farbstoff 3 (BASF Sudan Orange 220), Farbstoff 4 (MM2500 FAN) und Farbstoff 5 (BASF Yellow 075). Klare Polystyrolkugeln wurden ebenfalls verwendet in einer Menge von 4 % für die Farbe Weiß.
Die Zusammensetzung 1 und die Zusammensetzung 2 von Beispiel 1 wurden auf ein 0,18 mm dickes Substrat aus Polyethylenterephthalat (PET), enthaltend 6 Gew.-% Titandioxid, aufgetragen unter Verwendung der Beschichtungsvorrichtung, die in 1 dargestellt ist. Die Zusammensetzungen wurden eingeführt durch eine Schlitz-Beschichtungsvorrichtung 2, die durch einen Motor M4 angetrieben wurden, bei einer Temperatur von 45 °C, auf eine 12,7 cm breite Bahn 6, die sich mit einer Geschwindigkeit von 3,7 m/Min. bewegte. Die Fließgeschwindigkeit wurde derart eingestellt, dass eine Menge von 0,043 g/m² für jede der Blaugrün, Purpurrot und Orange gefärbten Kugeln erzielt wurde. Die Beschichtungen wurden abgeschreckt in einem 2,4 m langen Abschreckabschnitt 8, der bei einer Temperatur von 4 °C gehalten wurde und bei 56,6 % RH, worauf die Beschichtungen durch eine Konditionierkammer 10 geführt wurden, bevor sie in einem ersten Trocknungsabschnitt 12 und dann in einem zweiten Trocknungsabschnitt 14 getrocknet wurden, wobei die Trocknungsabschnitte eine Länge von 9,8 m bzw. 11,6 m hatten. Der erste Trocknungsabschnitt 12 wurde bei einer Temperatur von 21 °C und 33,2 % RH gehalten und der zweite Trocknungsabschnitt 14 wurde bei einer Temperatur von 37,8 °C und 18,6 % RH gehalten.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bindung einer vor-synthetisierten Einzelstrang-Oligonukleotid-Sonde an die Oberfläche von Kugeln mit eingefügtem Farbstoff.
Drei DNA-Oligonukleotid-Sonden-Sequenzen und ihre komplementären Ziel-Sequenzen wurden in diesem Beispiel, wie in Tafel 1 veranschaulicht, verwendet. Die Sonden-Sequenzen wurden modifiziert mit primärem Amin an ihren 5 Prime-Ende und die Ziel-Sequenz wurde modifiziert mit Biotin an ihrem 5 Prime-Ende.
Tabelle 1
100 Mikroliter Kugeln mit eingeführtem Farbstoff (4 % w/v) wurden dreimal in Acetatpuffer gespült (0,01 M, pH 5,0) und vereinigt mit 100 Mikrolitern von 20 mM 2-(4-Dimethylcarbamoylpyridino)-ethan-1-sulfonat und 10 % Polyethylenimin. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang bewegt und dreimal mit Natriumboratpuffer (0,05 M, pH 8,3) gespült. Die Kugeln wurden in Natriumboratpuffer re-suspendiert.
Eine Oligonukleotid-DNA-Sonde mit 5'-Amino-C6-Modifizierung wurde in 100 Mikrolitern Natriumboratpuffer bis zur Endkonzentration von 40 nMol gelöst. 20 Mikroliter von Cyanurchlorid in Acetonitril wurden zu der DNA-Sondenlösung hinzugegeben und das gesamte Volumen wurde unter Verwendung von Natriumboratpuffer auf 250 Mikroliter gebracht. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang bewegt und danach gegen 1 Liter Borsäurepuffer bei Raumtemperatur drei Stunden lang dialysiert.
100 Mikroliter der dialysierten DNA-Lösung wurden vermischt mit 200 Mikrolitern der Kugel-Suspension. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang bewegt und dreimal gespült mit Natriumphosphatpuffer (0,01 M, pH 7,0). Die modifizierten Kugeln wurden auf einen transparenten, plastischen Träger aufgetragen wie die Zusammensetzung 1, wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Hybridisierung und Bestimmung von Ziel-Nuklein-säuresequenzen zu der Mikroanordnung auf Basis von mit Gelatine beschichteten Mikrokugeln.
Eine Oligonukleotid-DNA mit einer 5'-Biotinmarkierung, die eine komplementäre Sequenz zu der DNA-Sonde hat, wurde in einer Hybridisierungslösung gelöst, die enthielt 0,9 M NaCl, 0,06 M NaH₂PO₄, 0,006 M EDTA und 0,1 % SDS, pH-Wert 7,6 (6XSSPE-SDS) bis zu einer endgültigen Konzentration von 1 μm. Die mit Kugeln beschichtete Mikroanordnung wurde hybridisiert in der Hybridisierungslösung beginnend bei 68 °C bei langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur. Nach der Hybridisierung wurde die Mikroanordnung gewaschen in 0,5XSSPE-SDS dreimal 15 Minuten lang. Die Mikroanordnung wurde in einer Lösung inkubiert, die Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat in einem 0,01 M Phosphatpuffer 0,1 M NaCl pH 7,0 enthielt, eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubierung wurde die Mikroanordnung dreimal gespült mit dem Inkubationspuffer. Auf der Mikroanordnung mit vervollständigter Hybridisierung wurde mittels einer Illuminierung mit weißem Licht ein Bild aufgezeichnet unter Verwendung eines Mikroskops vom Typ Olympus BH-2 (Diagnostic Instruments, Inc. SPOT Camera, CCD-Auflösung von 1315 × 1033 Pixel) unter Gewinnung der Farbkugel-Strichcode-Signatur-Information, gefolgt von einer Dunkelfeld-Chemilumineszenz-Bildaufzeichnung durch Aufbringen einer dünnen Schicht von SuperSignal^® ELISA Chemilumineszenz-Substratlösung (erhalten von PIERCE ENDOGEN) auf die Mikroanordnung.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel veranschaulicht den Einfluss der Enzym-Digestion auf die DNA-Hybridisierung auf Beschichtungen, die farbige Mikrokugeln oder Kugeln enthalten.
Gelatinase wurde erhalten von der Firma Genencor International Inc. und sie wurde verwendet ohne weitere Reinigung. 0,5 Gelatine wurden gelöst in 60 ml Wasser. Eine Beschichtung, enthaltend farbige Mikrokugeln wurde in die Enzymlösung verschiedene Zeiten lang bei 37 °C eingetaucht und die Enzymolysereaktion wurde unterbrochen durch Eintauchen der mit dem Enzym behandelten Beschichtung in ein laufendes Wasserbad 5 Minuten lang. Von den Beschichtungen, die mit Gelatinase behandelt wurden, 0, 3, 5 und 7 Minuten lang, wurden Querschnitte angefertigt und auf den Querschnitten wurden unter dem Mikroskop Bilder aufgezeichnet, um das Ausmaß der Gelatineentfernung sichtbar zu machen. Die 4A zeigt die Behandlung nach 0 Minuten; 4B zeigt die Behandlung nach 3 Minuten; 4C zeigt die Behandlung nach 5 Minuten; und 4D zeigt die Behandlung nach 7 Minuten. Es ist festzustellen, dass, wenn die Zeit für die Behandlung ansteigt, eine größere Oberfläche der Kugel exponiert wird. Das mit Biotin markierte Ziel-DNA-Fragment, komplementär der Sonden-DNA-Sequenz auf der Oberfläche der Kugeln, wurde hybridisiert zur Beschichtung, die mit Gelatinase verschiedene Zeitspannen lang behandelt wurde. Das Chemilumineszenz-Signal wurde ermittelt, wie in Beispiel 3 beschrieben, und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Es ist wichtig, dass das festgestellte Mikrokugel-Signal sich verbessert, wenn mehr Mikrokugeloberfläche exponiert wird.
Dieses Beispiel veranschaulicht lediglich eine Bedingung für die Enzymolyse-Reaktion. Die Bedingung für die Enzymolyse-Reaktion kann jedoch ebenfalls eingestellt werden durch Auflösen des Enzyms in abgepufferten Lösungen oder organischen Lösungsmitteln und sie kann bei geeigneter Temperatur durchgeführt werden. Ein Fachmann kann den Prozess modifizieren, um ihn an bestimmte wünschenswerte Anwendungen anzupassen.
Jede beliebige Methode der Enzymolyse liegt innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung, vorausgesetzt, das Gelierungsmittel wird im Wesentlichen von der Oberfläche der Mikrokugeln entfernt, was bedeutet, dass die Sonde, die an die Oberfläche gebunden ist, im Wesentlichen frei ist von Gelatine, um mit dem beabsichtigten Ziel reagieren zu können.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel veranschaulicht das bevorzugte Design-Prinzip, um auf auf einer flachen Oberfläche aufgetragenen Farbkugeln ein Bild zu erzeugen und um eine Analyse durchzuführen.
Der am meisten geeignete Versuch zur Gewinnung von Bilddaten von einem anzeigenden, flachen Objekt ist die Vollbildaufnahme. Die wichtigsten physikalischen Aspekte des Bildaufnahmesystems sind die Balance zwischen ausreichender Lichtansammlung, optischer Auflösung und wirksamer Illumination des Gegenstandes, wobei das ausbalancierte System unterbringen muss Lumineszenz, Fluoreszenz und Absorptions-Arten von optischen Meldungen. Ferner muss das System in der Weise verfahren ohne ins Gewicht fallende Bewegung des Gegenstandes von Interesse und die Bildaufzeichnungsdaten müssen die erforderlichen Messungen bezüglich der nachfolgenden Analyse tragen. Die Design-Lösungen für viele dieser Erfordernisse sind dem Fachmann allgemein bekannt, doch erfordert das System-Design zur Unterbringung von sämtlichen Erfordernissen in eine einzelne praktische Lösung eine Erfindung.
Ein rationaler Versuch für den Entwurf besteht darin, die wichtigsten Diktate der Arten der Bildaufzeichnung/Ermittlung: Lumineszenz, Fluoreszenz und Absorption zur Haftung zu bringen. Die Design-Prinzipien sind in den 5A, 5B und 5C dargestellt. 5A zeigt eine Linse 210 und eine Objekt-Ebenen 212. 5B zeigt eine Linse 210, eine Objektebene 212 und ein Filter 214. 5C zeigt eine optische Platte 216, eine wässrige Schicht 218 und einen Gegenstand 220 auf einem Spiegelträger.
Das Haupterfordernis einer Lumineszenz-Bildaufzeichnung/Ermittlung ist die wirksame Lichtermittelung, beeinflusst von sowohl der Kollektion als auch der fotometrischen Integration. Eine wirksame Licht-Kollektion erfordert eine Linse von großer numerischer Öffnung, deren Durchmesser ungefähr der Größe des Betrachterfeldes entspricht, und positioniert ist in einer Arbeitsentfernung, die nahe dem Objekt liegt. Praktische Lösungen und Kosten führen zu der Lösung, die in 5A dargestellt ist, in welchem Falle eine optische System-Spezifizierung einer Linse 210 (ungefähr f2 (Linsendurchmesser ist etwa die Hälfte der Arbeitsdistanz zwischen der Linse 210 und der Objektebene 212) dargestellt wird. Eine fotometrische Integration erfordert einen gut konstruierten Sensor mit einem ausreichenden dynamischen Bereich zur Erzeugung eines Signal/Geräuschverhältnisses, geeignet, um die Analyse zu unterstützen. In der Praxis genügt ein integrierter, gekühlter CCD-Sensor einer Auflösung von 12 Bits und einer Quanten-Wirksamkeit von > 40 %, der ein Signal/Geräuschverhältnis von > 3000 erzeugt, der heutigen Chemilumineszenz-Bildaufnahme und ermöglicht eine fotometrische Analyse mit einem linearen, dynamischen Bereich der Messung. Eine wichtige prakti sche Beschränkung, die durch eine Linse mit einer hohen numerischen Öffnung bewirkt wird, ist eine geringe Tiefe des Focus, die eine gesteuerte Flachheit der Objektebene erfordert. Die Ebene des Objektes ist in dieser Systemart konsequenterweise beschränkt durch eine optische Platte (vergleiche 5C). Ferner ist die berichtende Oberfläche des Objektes notwendigerweise feucht, was die Möglichkeit bietet, die Probe an die optische Platte optisch zu koppeln. Eine optische Kopplung des Objektes an das System ist wesentlich für den intraszenischen, dynamischen Bereich der Messung (Minimierung von Schleier und anderen optischen Artifacten, die die Messung von kräftigen und gedämpften Merkmalen innerhalb des gleichen Betrachterfeldes vermindern).
Die Haupterfordernisse der Fluoreszenz-Bildaufzeichnung/Ermittlung sind sowohl eine wirksame Lichtermittlung als auch eine geeignete Behandlung der Illuminierung. Die Art der wirksamen Lichtermittlung, wie oben diskutiert (einschließlich der optischen Kopplung), liefert die gesamte wesentliche Fähigkeit für die Fluoreszenz-Bildaufzeichnung. Die Behandlung der Illumination erfordert, dass die Anregung und die Emission des Lichtes unterschieden werden. Design-Betrachtungen für die Konditionierung der Wellenlänge des anregenden Lichtes werden unten diskutiert (Ansprechung der Absorption). Eingeschlossen in eine geeignete Illuminierungsbehandlung ist die Eliminierung von streuendem Licht, insbesondere von dem, das von Materialien stammt, die fluoreszieren können. Zentral für die Design-Lösung dieses Systems ist die Minimierung der Anregung von Licht von dem produktiven Weg von emittiertem Licht (der Akzeptanzkegel des Linsensystems), wie in 5A dargestellt. Diese Methode der Fluoreszenz-Anregung ist traditionell denen bekannt, die mit dem Stande der Technik vertraut sind, der am effektivsten ist, wobei die Methode allgemein bezeichnet wird als epi-Illumination. Eine ideale epi-Illumination einer flachen Oberfläche (Objektebene) würde einschließen eine Illumination mit parallelem Licht eines Einfallwinkels von 45° (dargestellt als "I" in 5A). In der Praxis erhöht ein Einfallwinkel von wesentlich geringer als 45° die Möglichkeit, dass Anregungslicht von einer normalen Reflektion in den Akzeptanzkegel der Linse eintritt; zu Lieferanten einer normalen Reflektion gehören Streulicht von einer Illuminierung und Merkmale im Betrachterfeld, die von der Objektebene abweichen. Ein Beispiel für ein Design unter Anwendung eines geringen Einfallwinkels ist ein solches, das eine "Ring-Licht"-Illumination verwendet. Eine andere Beschränkung besteht darin, dass der Einfallwinkel geringer als etwa 60° sein muss, wobei ansonsten eine ansteigende Menge an anregendem Licht nicht mit der Probe reagiert aufgrund der totalen Reflek tion, die verursacht wird durch den kritischen Winkel der Platte (5C). Jedes praktische Illuminierungssystem enthält Licht, das nicht parallel ist. Es ist praktisch tatsächlich üblich, mit Licht zu belichten, das divergierend ist, wie es in 5B dargestellt ist, wo die Illuminierung dargestellt ist in Form von feineren Linien, die von beiden Seiten des Objekts eintreten, eine übliche Methode der epi-Illuminierung, die dazu verwendet wird, um die Gleichförmigkeit der Illuminierung zu steigern. Die Darstellung zeigt geringfügig divergierendes Licht (etwa 18° oder ungefähr f11), viel weniger divergierend als viele üblicherweise angewandte Methoden wie die Faser-Illuminierung. Die epi-Illuminierung, wie in 5D dargestellt, wird bevorzugt angewandt, da die extremen Einfallswinkel (und die Reflektion, wie in Form von kräftigen Linien dargestellt) die Möglichkeit von Streulicht vermindern, das in den Akzeptanzkegel der Linse eintritt oder stark von einer planaren Oberfläche reflektiert wird.
Eine weitere wichtige Systemdesign-Lösung ist in 5C dargestellt. Die Zusammensetzung der Platte ist eine gesteuerte, optische Oberfläche und kann als solche derart aufgebaut sein, dass sie Schleier, Autofluoreszenz und Reflektion minimiert. Zu bemerken ist, dass im Falle dieses Systemdesigns die Platte das einzige Material ist, mit dem das anregende Licht die Möglichkeit hat zu reagieren. Eine bevorzugte Zusammensetzung der Platte ist ein optischacrylisches Material (UV-transparent), dessen Sensor/Illuminierungsseite bedeckt ist mit einer anti-reflektierenden Schicht und dessen Proben/Objektseite beschichtet ist mit einer Anti-Abriebschicht (Hart-Beschichtung). Andere Zusammensetzungen (wie aufgeschmolzene Kieselerde (fused silica)) sind akzeptabel, bewirken jedoch eine gewisse Leistungsverminderung (sie übertragen weniger Licht). Wie oben beschrieben, koppelt die wässrige Schicht (allgegenwärtig im Falle biologischer/biochemischer Systeme) auf optischem Wege die Probenoberfläche mit der Platte und der Gegenstand (die Kugelmonoschicht) wird auf einen flexiblen Träger aufgetragen, der eine Spiegeloberfläche aufweist. Der überwiegende Hauptteil des anregenden Lichtes, der nicht mit den Objektkugeln reagiert, wird einfach von dem System reflektiert, weg von der Linse.
Zusammenfassend gilt, dass in diesem bevorzugten epi-Illuminierungssystem für eine fluoreszierende Anregung das anregende Licht lediglich mit einer gesteuerten optischen Komponente reagiert, einer dünnen wässrigen Lösung und einer Zielkugel, bevor das Licht eine ins Gewicht fallende Wahrscheinlichkeit hat, in den Akzeptanzkegel der Linse einzutreten. Infolgedessen braucht das Linsensystem lediglich anregendes Licht von emittiertem Licht zu unterscheiden, das von der Zielkugel ausgestrahlt wird. Die Unterscheidung von anregendem Licht von emittierendem Licht wird üblicherweise bei der fluoreszierenden Bildaufzeichnung/Erkennung praktiziert, üblicherweise unter Verwendung eines Interferenz-Filters (siehe Filter 214 5B). Derartige Filter können sehr kostspielig sein und die Fähigkeit des Filters, wirksam Anregungslicht und emittiertes Licht zu unterscheiden, ist oftmals die Hauptbeschränkung der Erkennungsempfindlichkeit. Im Falle dieses bevorzugten Systemdesigns wird das Erfordernis des Filters zu unterscheiden, um das etwa 1000-Fache vermindert im Vergleich zu vielen Fluoreszenz-Erkennungssystemen.
Die Haupterfordernisse der Absorptions-Bildaufzeichnung/Erkennung (im Allgemeinen als Colorimetrie bezeichnet) umfasst die spektrale Auflösung und Fotometrie. Die fotometrische Präzision des oben beschriebenen Systems ist mehr als 10 Mal besser als die grundlegenden Systemerfordernisse für die Auflösung von Tausenden von "Farben". Das Anwendungserfordernis ist ähnlich der Auflösung/Entwindung von R, G, B und Kombinationen/Niveaus hiervon. Die fundamentale Methode der Farbauflösung umfasst die Messung der relativen Absorptionscharakteristika eines Gegenstandes mit unterschiedlichen Wellenlängen des Lichtes, die relativen Unterschiede werden tabelliert, um zweckmäßige Kategorien der Farbstoffkombinationen und des Farbstoffniveaus zu definieren. Die ausgewählten Farbstoffe dürfen nicht mit anderen berichtenden optischen Elementen, wie Fluorochromen, reagieren. Eine Methode, um voraussehbare Störungen zu minieren besteht in der Auswahl von "Color" Farbstoffen, deren Absorptionsspektrum höher ist als jedes Anregungs/Emissionsspektrum der berichtenden Fluorochrome.
Unter der Annahme einer ausreichenden fotometrischen Präzision hängt die Anzahl von Farben, die aufgelöst werden können (zweckmäßig definiert) von der Bewältigung der Illumination und Erkennung von Licht ab. Zwei fundamental unterschiedliche Methoden der Lichthandhabung für den Zweck der Farbauflösung sind entweder die spektrale Auflösung von "weißem" Licht, bevor oder nachdem das Licht mit dem Gegenstand reagiert. Das obige Systemdesign erfordert, dass beide Methoden zur Sicherheit der Fluoreszenz-Bildaufzeichnung aufgerufen werden. Die bevorzugte Designlösung, die geeignet ist für sowohl die Absorptions- als auch Fluoreszenzmethode der Bildaufzeichnungserkennung besteht in der Handhabung der spektralen Auflösung der Illumination. Infolgedessen wird die Illumination gehandhabt durch eine Lichtquelle und ein Monochrometer von ausreichender Leistung und Auflösung, sodass sie an beide Arten der Bildaufzeichnung angepasst werden können. Diese Lösung ist kosteneffektiv, da das Multifilter-Design und die Arbeitsweise, die angewandt würden, um die Anregung von vielen fluoreszierenden Sonden und die Absorption von vielen farbigen Farbstoffen zu ermöglichen, leicht die Kosten des Monochromators übersteigen würden. Da die spektrale Anregung/Absorption der organischen Fluorochrome und Farbstoffe relativ breit ist, reicht eine spektrale Auflösung von lediglich etwa 20 nm aus und die gelieferte Illuminierungsenergie ist entsprechend höher als die, die mit einem Monochrometer von "hoher Auflösung" verbunden ist (in typischer Weise < 2 nm). Dass die gelieferte Energie ausreicht für eine Fluoreszenz-Bildaufzeichnung wird gewährleistet durch die Empfindlichkeit der Kamera, die für die Lumineszenz-Bildaufzeichnung entwickelt wurde.

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäureproben, bei dem man: eine Mikroanordnung mit einem Substrat, das mit einer Zusammensetzung mit einer Population von mit einer Nukleinsäureponde modifizierten Mikrokugeln beschichtet ist, die in einer Beschichtung, enthaltend ein Geliermittel oder einen Geliermittel-Vorläufer, immobilisiert sind, bereitstellt, in der ein erster Anteil der Mikrokugeln in die Beschichtung eintaucht und ein zweiter Anteil über der Beschichtung bloßliegt und von der Beschichtung praktisch frei ist, bei dem mindestens eine Unterpopulation der Populations-Mikrokugeln eine optische Strichcodierung aufweist, die von mindestens einem Färbemittel erzeugt wird, das mit den Mikrokugeln assoziiert ist und eine Nukleinsäuresondensequenz aufweist; bei dem man die Anordnung mit einer fluoreszierend/chemilumineszierend markierten Nukleinsäureprobe-Ziel-Nukleinsäuresequenz in Kontakt bringt, und bei dem man die Farb-Strichcodierung der Unterpopulation von Mikrokugeln aufgrund der Wechselwirkung der Sonden-Nukleinsäuresequenz und der fluoreszierend/chemilumineszierend markierten Nukleinsäureprobe-Ziel-Nukleinsäuresequenz ermittelt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mikroanordnung einer Population von Mikrokugeln eine Vielzahl von Unterpopulationen von Mikrokugeln einschließt, wobei eine jede der Unterpopulationen von Mikrokugeln eine einzigartige optische Strichcodierung erhält und eine einzigartige Sonden-Nukleinsäuresequenz.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die optische Strichcodierung durch zwei oder mehr Färbemittel erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die optische Strichcodierung durch eine Mischung von roten (R), grünen (G) und blauen (B) Färbemitteln erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die mindestens eine Unterpopulation von Mikrokugeln eine Lumineszenzeigenschaft aufweist und bei dem die Ermittlung umfasst: a) eine Vollrahmen-Bildaufzeichnung des Lumineszenzbildes, das sich aus der Reaktion der Sonden-Nukleinsäuresequenz und der fluoreszierend/chemilumineszierend markierten Nukleinsäureproben-Ziel-Nukleinsäuresequenz zur Erzeugung eines ersten Bildes ergibt; b) eine Vollrahmen-Bildaufzeichnung der Mikroanordnung unter heller Feldbeleuchtung unter Gewinnung eines Mikrokugel-Farbsignatur-Strichcodierungsbildes zur Erzeugung eines zweiten Bildes und c) die Entwicklung des ersten und des zweiten Bildes unter Gewinnung einer Identifikation der Nukleinsäureprobe.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Entwicklung einen Muster-Erkennungs-Algorithmus zur Gewinnung der Identifikation verwendet.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die mindestens eine Unterpopulation von Mikrokugeln eine Fluoreszenzeigenschaft aufweist und bei dem die Ermittlung umfasst: a) eine Vollrahmen-Bildaufzeichnung des Fluoreszenzbildes, das sich aus der Reaktion der Sonden-Nukleinsäuresequenz und der fluoreszierend/chemilumineszierend markierten Nukleinsäureproben-Ziel-Nukleinsäuresequenz zur Erzeugung eines ersten Bildes ergibt; b) eine Vollrahmen-Bildaufzeichnung der Mikroanordnung unter heller Feldbeleuchtung unter Gewinnung eines Mikrokugel-Farbsignatur-Strichcodierungsbildes zur Erzeugung eines zweiten Bildes und c) die Entwicklung des ersten und des zweiten Bildes unter Gewinnung einer Identifikation der Nukleinsäureprobe.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Substrat gekennzeichnet ist durch eine Abwesenheit von spezifischen Zentren, die auf physikalischem oder chemischem Wege mit den Mikrokugeln zu reagieren vermögen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mikrokugeln oberflächenaktive Zentren aufweisen, die die Nukleinsäuresonde enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Mikrokugeln einen mittleren Durchmesser zwischen 1 und 50 μm haben.