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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Positionierung
einer Platte oder eines anderen Trägers mit Proben auf einer Beobachtungs- oder
Analysevorrichtung, welche die sequentielle Beobachtung oder Analyse
mehrerer nebeneinander auf der Platte angeordneter Proben oder mehrerer Regionen
derselben Probe ermöglicht.
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Die
vorliegende Erfindung zielt insbesondere darauf ab, die rasche digitale
Analyse von größeren Objekten
mittels CCD-Sensoren zu erleichtern. Letztere haben begrenzte Abmessungen
(5 bis 7 mm), und die hochauflösende
digitale Abtastung von Objekten von 10 cm und mehr erfordert die
Wiederholung der Bildaufnahmen unter reproduzierbaren Bedingungen,
bisweilen mit pixelgenauer Zusammensetzung der Bilder. Eine hochauflösende Abtastung bedeutet
dabei auch einen geringen Schärfebereich, was
unvereinbar ist mit den unvermeidlichen Verformungen des Objektes,
ob es sich um eine Glasplatte (oder gläsernen Objektträger) oder
um eine Kulturenplatte mit Vertiefungen handelt.
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Die
Anmeldeschrift WO 01/88593 offenbart ein Verfahren, das die Einhaltung
der Fokussierung in einer Analysevorrichtung ermöglicht, was jedoch mit einem
gewissen seitlichen Spiel zwischen der Probe und dem Träger erkauft
wird. Eine solche Vorrichtung ist daher nicht vereinbar mit einer
pixelgenauen Naht zwischen den Aufnahmen. Eine solche Vorrichtung
erlaubt auch nicht in angemessener Weise die Aufzeichnung der Kinetik
der Entwicklung bei den Aufnahmen. Eine dem Oberbegriff des Patentanspruchs
1 entsprechende Vorrichtung ist aus der US-A-3652146 bekannt. Andere
herkömmlichere Vorrichtungen
sind dazu ausgelegt, den Probenträger fixiert zu halten, so dass
die Aufzeichnung kinetischer Vorgänge und ggf. eine pixelgenaue
Zusammenfügung
realisiert werden können.
Diese Vorrichtungen besitzen jedoch keine Mobilität in der
Beobachtungsachse, sie ermöglichen
keine automatische Scharfeinstellung bzw. Fokussierung des Objektivs auf
die Proben.
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Die
im bisherigen Stand der Technik beschriebenen Vorrichtungen weisen
also Nachteile auf, die darin bestehen, dass keine Reproduzierbarkeit
der Abtastung besteht, und dass sie mit der raschen Abtastung mehrerer
Proben nicht vereinbar sind, z.B. wenn ein und dieselbe Platte zu
unterschiedlichen Zeitpunkten analysiert werden soll, um echte kinetische
Vorgänge
an Zellen oder anderen Einzelproben zu erstellen, die durch Pixelnummern auf
jeder Aufnahme markiert sind. Bei den herkömmlichen Vorrichtungen kann
nicht garantiert werden, dass die analysierten Zellen von einer
Aufnahme zur anderen dieselben sind. Diese Ungenauigkeit kann 100
Mikrometer überschreiten,
was bei Anwendungen im Bereich der Kinetik zu hoch ist. Außerdem weisen
die verwendeten Analyseplatten meistens Planheitsfehler ihrer Innenfläche auf,
welche die Böden
von Vertiefungen bilden, so dass diese Fehler den Abstand zwischen
Objektiv und zu analysierender Probe verändern und die Einhaltung der
Schärfe verhindern.
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Angesichts
dieser Ungenauigkeiten ist es erforderlich, bei der vollständigen Beobachtung
einer Platte oder von Proben mit großen Abmessungen häufig die
Fokussierung des Objektivs neu einzustellen, um die Schwankungen
dieses Abstandes auszugleichen und/oder die horizontale Ausrichtung
zu korrigieren, um die Bildausrichtung der Aufnahme in bezug auf
den Sensor einzuhalten.
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Dieser
Zwang, häufige
Nachstellungen vorzunehmen, ob zur Scharfstellung des Objektivs
oder zur Positionierung, wirkt sich verzögernd auf die Geschwindigkeit
der Erfassung der Aufnahmen der Proben aus und kann eine hochauflösende Abtastung ganz
unmöglich
machen.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu vermeiden.
Sie schlägt
nun eine Vorrichtung vor, die sowohl eine einwandfreie Positionierung
einer Platte (oder eines anderen Trägers) vor einem Objektiv erlaubt,
als auch diese Positionierung bei wiederholten Messungen zu reproduzieren, eine
kontrollierte Bewegung der Platte zu erlauben, und eine Scharfeinstellung
bzw. Fokussierung konstant einzuhalten. Die vorliegende Erfindung
liefert somit eine Vorrichtung zur Positionierung von Probenträgern in
bezug auf ein Analyseobjekt, welche reproduzierbare und schnelle
Messungen großer Proben
und/oder mehrerer Proben ermöglicht.
Die Erfindung betrifft des weiteren jede Analysevorrichtung, die
eine derartige Positioniervorrichtung beinhaltet.
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Gegenstand
der Erfindung ist also eine Vorrichtung zur Positionierung einer
Platte mit einer oder mehreren Probe(n) (oder zur Aufnahme von einer oder
mehreren Probe(n) ausgelegt) auf einer Beobachtungs- oder Analysevorrichtung
mit einem Objektiv zur Beobachtung oder Analyse wenigstens eines Teils
der Probe entlang einer Beobachtungsachse von einer Beobachtungsfläche der
Platte aus, und mit einem Gestell mit einer Aufnahmeeinheit für die Platte,
dadurch gekennzeichnete, dass die Aufnahmeeinheit folgendes beinhaltet:
- – einen
ersten in einer zur Beobachtungsachse senkrechten Ebene gleitend
verschiebbaren Rahmen,
- – einen,
von besagtem erstem Rahmen getragenen und in besagter zur Beobachtungsachse senkrechten
Ebene gleitend verschiebbaren zweiten Rahmen, wobei der erste und
der zweite Rahmen jeweils in einer zur Bewegungsrichtung des anderen
Rahmens senkrechten Richtung verschiebbar sind, und
- – einen
dritten Rahmen, der vom zweiten Rahmen mittels Haltemitteln getragen
wird, welche den besagten dritten Rahmen in einer Ebene im wesentlichen
senkrecht zur Beobachtungsachse blockiert, während sie gleichzeitig die
Bewegung des dritten Rahmens im wesentlichen in der Beobachtungsachse
zulassen, wobei besagter dritter Rahmen mit Mitteln zur Blockierung
der Platte versehen ist, und
- – wobei
die Vorrichtung Mittel zur Einstellung der vertikalen Position der
Beobachtungsfläche
der Analyseplatte in bezug auf das Objektiv beinhaltet.
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In
den besonderen Ausführungsformen
der Erfindung:
- – beinhaltet die Trägereinheit
Mittel zur vertikalen Festsetzung des dritten Rahmens zum Einlegen der
Analyseplatte,
- – beinhalten
die Haltemittel des dritten Rahmens wenigstens ein dünnes Federblatt,
welches ein Schwenklager bildet und vorzugsweise in der Beobachtungsebene
liegt, wobei besagtes Federblatt jeweils mit dem zweiten Rahmen
und dem dritten Rahmen verbunden ist,
- – erstrecken
sich das bzw. die ein Schwenklager bildende(n) Federblatt oder -Blätter vorzugsweise senkrecht
zur Bewegungsrichtung des zweiten Rahmens,
- – weisen
alternativ dazu die Haltemittel des dritten Rahmens einerseits eine
Gelenkachse auf, die zwischen dem zweiten und dritten Rahmen angebracht
ist und sich vorzugsweise senkrecht zur Bewegungsrichtung des zweiten
Rahmens erstreckt, und andererseits wenigstens eine Drehstabfeder,
die zwischen den besagten zweiten und dritten Rahmen angeordnet
ist,
- – verläuft die
Bewegung des dritten Rahmens im wesentlichen im Sinne der Beobachtungsachse allgemein
in einer vertikalen Ebene und gemäß eines begrenzten Neigungswinkels,
d.h. allgemein von weniger als etwa 0,5°, welcher im wesentlichen durch
die Position der Platte auf dem Objektiv bestimmt wird,
- – sind
die Mittel zum Feststellen der Platte durch Auflagebacken gebildet,
welche über
den Innenumfang des dritten Rahmens verteilt sind, und durch einen
Nocken, welcher am dritten Rahmen angebracht und durch Verschwenken
zwischen einer eingefahrenen Stellung und einer nach innen in den
dritten Rahmen vorstehenden Stellung bewegbar ist, wo er die Platte
feststellt,
- – weist
der Nocken zur Feststellung der Platte ein Niederhaltermittel des
Fußflansches
der Platte auf, z.B. verstellbare Mittel wie beispielsweise eine
Schraube, deren Kopf oder Ende auf dem Fußflansch der Platte zur Auflage
gebracht werden kann,
- – weist
wenigstens ein Teil der Auflagebacken, insbesondere die auf den
dem Feststellnocken gegenüberliegenden
Seiten des Rahmens angeordneten Backen, eine Aussparung zur Aufnahme des
Fußflansches
der Platte auf,
- – werden
die Mittel zur Festsetzung des dritten Rahmens durch zwei einander
gegenüberliegende
Auflager gebildet, die jeweils auf einer Seite des ersten Rahmens
angebracht sind, die parallel zur Bewegungsrichtung des zweiten
Rahmens verläuft,
und durch zwei einander gegenüberliegende
Zungen, die jeweils senkrecht zu einer Seite des dritten Rahmens
an diesem befestigt sind, welche parallel zu besagter Richtung verläuft, wobei
jedes Auflager eine Schräge
aufweist, welche dazu bestimmt ist, bei der Verschiebebewegung des
zweiten und dritten Rahmens in dieser Richtung mit dem freien Ende
der entsprechenden Zunge zusammenzuwirken,
- – werden
die Hilfs- bzw. Reglermittel durch eine in bezug auf das Objektiv
feste Distanzhülse
gebildet, welche eine Auflagefläche
für die
Beobachtungsfläche
der Platte aufweist,
- – werden
die Reglermittel durch ein magnetisches oder piezoelektrisches Schwebesystem
für die Platte
gebildet,
- – ist
der dritte Rahmen offen oder geschlossen,
- – erfolgen
die Bewegungen des ersten und des zweiten Rahmens motorisch.
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Die
Erfindung betrifft außerdem
eine Vorrichtung zur Beobachtung oder Analyse von Proben mit einer
Positioniereinrichtung einer Platte wie oben beschrieben. Die Vorrichtung
zur Beobachtung oder Analyse weist vorteilhaft eine Lichtquelle
zur Beleuchtung wenigstens eines Teils einer Probe auf, sowie Mittel
zur Aufzeichnung eines Bildes.
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Eine
erfindungsgemäße Vorrichtung
zur Beobachtung oder Analyse weist im typischen Fall ein Beobachtungs-
oder Analyseobjektiv wenigstens eines Teils einer Probe entlang
einer Beobachtungsachse von einer Beobachtungsfläche der Platte aus auf, sowie
eine wie oben beschriebene Trägereinheit für diese
Platte, die ausgelegt ist, eine Relativbewegung zwischen der Platte
und der Beobachtungsachse in einer zur Beobachtungsachse senkrechten Ebene
zu gewährleisten,
jedoch eine freie Beweglichkeit entlang der als vertikal angenommenen
Beobachtungsachse zuzulassen. Des weiteren beinhaltet sie Mittel
zur Beleuchtung wenigstens eines Teils einer Probe und Mittel zur
Aufnahme eines Bildes am Ausgang des Objektivs.
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Die
Lichtquelle kann eine Lampe sein, ein Laser oder eine Leuchtdiodeneinheit.
Zur Beobachtung oder Analyse von Proben wird die Platte über oder
unter dem Objektiv der Vorrichtung angeordnet, vorzugsweise über demselben,
wobei die Achse des Objektivs als vertikal angenommen wird. Die
Beobachtung erfolgt durch den Boden jeder Vertiefung, d.h. durch
die Unterseite der Platte, wobei diese Unterseite die Beobachtungsfläche bildet,
oder aber direkt über
der Probe. Durch Verschieben der Platte in einer Ebene senkrecht
zur Beobachtungsachse mittels des Trägers insgesamt werden die Proben
eine nach der anderen vor das Objektiv gebracht. Diese Einheit ist
ausgelegt, die Platte im wesentlichen bzw. nur an ihrem Rand zu
halten, so daß die
Beobachtungsfläche
der Platte freigelassen wird. Um die Fokussierung einzuhalten, liegt
die Beobachtungsfläche
auf einem Distanzstück
auf dem Objektiv fluchtend mit der Beobachtungsachse auf. Eine derartige Vorrichtung
ist besonders zur raschen Analyse von Proben geeignet.
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Die
schnelle Analyse von Zellen bei einer großen Zahl von Proben ist eine
Notwendigkeit in der pharmazeutischen Industrie, zur Sichtung neuer
aktiver Substanzen bei hohem Durchsatz, und in der kosmetischen
Industrie, wo Modellzellen zum Testen neuer Substanzen und zur Überwachung
der Herstellung verwendet werden. Die biologische Analyse von Proben
ist ebenfalls von großer
Bedeutung auf dem Gebiet der Diagnose oder der Pharmako-Genomik
(Neigung zu bestimmten Pathologien, Ansprechpotential eines Patienten
auf eine Behandlung, Allergenstoffbestimmung, usw.).
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Die
erfindungsgemäßen Einrichtungen
können
zur schnellen Analyse großer
Zahlen auf einer Platte angeordneter Proben eingesetzt werden, oder für die Analyse
von Proben (oder Objekten) mit großen Abmessungen, welche die
Aufzeichnung und Zusammensetzung mehrerer Bilder erfordern. Die Proben
sind typischerweise biologische Proben, welche z.B. Zellen beinhalten
können,
insbesondere verwachsene Zellen, Brustzellen, Prokarionten, pflanzliche
Zellen, Nukleinsäuren,
Proteine (oder Polypeptide), Viren oder andere Organismen, z.B.
Krankheitseneger, usw. Die Probe kann aber auch ein gößeres Objekt
sein, wie z.B. ein Schnitt eines Tieres (z.B. eines Nagetieres)
oder eines Organs.
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Im übrigen versteht
es sich, daß,
auch wenn die Beschreibung oder die angegebenen Beispiele insbesondere
eine Vorrichtung zur Positionierung oder Analyse behandeln, bei
welcher eine Platte zum Einsatz kommt, die Vorrichtungen gemäß der vorliegenden
Anmeldung ebenso geeignet sind für
den Einsatz jedes anderen geeigneten Probenträgers, wie, außer den
Platten (z.B. Platten mit mehreren Vertiefungen), Objektträger, Membranen,
usw.
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Anhand
der ausschließlich
als Beispiel zu verstehenden und unter Bezugnahme auf die beiliegenden
Zeichnungen gemachten nun folgenden Beschreibung soll die Erfindung
nachstehend besser verständlich
gemacht werden. Dabei zeigen:
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1:
eine schematische Schnittansicht in einer vertikalen Ebene durch
eine Beobachtungsvorrichtung mit einer erfindungsgemäßen Positioniervorrichtung
einer Analyseplatte,
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2:
eine schematische Draufsicht auf die erfindungsgemäße Positioniervorrichtung,
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3:
eine Seitenansicht der Positioniervorrichtung aus der 2,
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4:
eine schematische Schnittansicht in einer vertikalen Ebene durch
einen Positionierbacken für
die Analyseplatte mit (4A) oder ohne (4B)
Aussparung,
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5:
eine schematische Schnittansicht in einer vertikalen Ebene durch
einen Feststellnocken für
die Analyseplatte mit einem Niederhaltermittel des Fußflansches
der Platte.
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In
der 1 ist schematisch eine Beobachtungsvorrichtung
dargestellt, die in ihrer Gesamtheit mit der Bezugszahl 1 bezeichnet
ist und eine allgemein mit der Bezugszahl 10 bezeichnete
Positioniervorrichtung für
eine biologische Probenanalyseplatte 2 aufweist (Backen
nicht dargestellt), sowie ein Beobachtungsobjektiv 3, eine
lokale Beleuchtungsquelle 4 für die Platte 2, eine
hinter dem Objektiv angeordnete Kamera 5 und eine nicht
dargestellte Informationsverarbeitungseinheit, wie z.B. einen Mikrocomputer,
die/der mit der Kamera 5 und den Verschiebeantrieben für die Rahmen 1 und 2 verbunden
ist. Das Distanzstück 40 gibt
einen konstanten Abstand zwischen dem Objektiv und der Beobachtungsfläche der Platte 2 vor.
Die Positioniervorrichtung 10 umfaßt ein Gestell 11 mit
einer Trägereinheit 20 der
Platte 2. Die Trägereinheit
der Platte weist ihrerseits drei nicht dargestellte Rahmen 21, 22, 23 auf,
welche die kontrollierte und genaue Halterung, Verschiebung und
Positionierung der Platte 2 gewährleisten.
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Ein
Prisma 6 zur Ablenkung des einfallenden Lichtstrahles von
der Lichtquelle 4 ist hinter dem Objektiv 3 angeordnet,
wo es den einfallenden Lichtstrahl entlang der optischen Achse dieses
Objektivs 3 in Richtung auf die Probe ablenkt.
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Ebenso
ist ein Prisma 7 oder ein schräggestellter Spiegel hinter
dem Objektiv 3 angeordnet, um den Ausgangsstrahl vom Objektiv 3 zur
Kamera 5 hin abzulenken.
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Die
Beobachtungsvorrichtung 1 ist zur schnellen Beobachtung
von in den nebeneinander liegenden Vertiefungen 2a der
Platte 2 enthaltenen Proben ausgelegt.
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Die
zur Aufnahme der Proben verwendeten Platten haben allgemein die
Form eines Tabletts. Sie weisen eine Gesamtheit einander benachbarter
Vertiefungen auf, auch Brünnchen
genannt, wobei sich in allen diesen oder in nur einem Teil derselben
die Probe(n) befindet/befinden. Diese Brünnchen haben im allgemeinen
parallel zueinander verlaufende Achsen und erstrecken sich über die
gesamte Stärke
der Platte. An der Oberseite der Platte sind sie offen, und an der
Unterseite sind sie durch einen Boden verschlossen, der in der Regel
die Unterseite der Platte bildet. Die Böden der einander benachbarten
Brünnchen
sind also allgemein miteinander verbunden, so daß die Unterseite der Platte
im wesentlichen durchgehend ist.
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Wie
in 1 zu erkennen ist, weist die verwendete Platte 2 vorzugsweise
eine durchgehende Unterseite 2b auf, welche den Boden der
Vertiefungen 2a bildet und eine Beobachtungsfläche darstellt, durch
welche hindurch die Proben beobachtet werden.
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Die
Vertiefungen 2a sind zur Oberseite der Platte 2 hin
offen und sind im wesentlichen zylindrisch mit kreisförmigem oder
rechteckigem Querschnitt und haben einen im wesentlichen ebenen
Boden.
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Bezieht
man sich nun auf die 2 und 3, so soll
dort die Trägereinheit 20 der
Platte 2 weiter im einzelnen beschrieben werden.
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Zum
Zwecke der Vereinfachung ist das Gestell 11 in der 2 nur
teilweise dargestellt.
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Die
Trägereinheit 20 umfaßt drei
Rahmen, die sich gegenseitig tragen, nämlich einen ersten Rahmen 21,
einen zweiten Rahmen 22 und einen dritten Rahmen 23.
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Der
erste Rahmen 21, von dem in 2 nur ein
Teil dargestellt ist, ist in bezug auf das Gestell 11 horizontal
gleitend verschiebbar, und zwar in einer Ebene senkrecht zur Beobachtungsachse
des Beobachtungsobjektivs 3, zum Beispiel mittels nicht
dargestellter Kugellaufschienen oder mittels jeder beliebigen anderen
geeigneten Vorrichtung.
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Rahmen 21 ist
vorzugsweise in der Richtung X des Raumachsenkreuzes XYZ wie in 2 dargestellt
verschiebbar.
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Der
zweite Rahmen 22 wird vom ersten Rahmen 23 getragen
und ist in einer Ebene senkrecht zur Beobachtungsachse horizontal
gleitend verschiebbar, und in einer Richtung Y des Raumachsenkreuzes
XYZ.
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Somit
sind der erste Rahmen 21 und der zweite Rahmen 22 jeder
in einer Richtung senkrecht zur Bewegungsrichtung des anderen Rahmens
verschiebbar.
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Der
zweite Rahmen 22 ist gegenüber dem ersten Rahmen 21 z.B.
entlang von Kugellaufschienen 24 oder jedem anderen geeigneten
Mittel verfahrbar.
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Wie
in der 2 erkennbar ist, weisen die Seiten 22a und 22b des
Rahmens 22, die sich parallel zur Y-Bewegungsrichtung dieses
Rahmens 22 erstrecken, je eine Verlängerung 25a, 25b auf.
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Der
dritte Rahmen 23 wird von dem zweiten Rahmen 22 über Haltemittel
dieses dritten Rahmens 23 getragen, welche den besagten
dritten Rahmen 23 in einer Ebene rechtwinklig zur Beobachtungsachse
der Beobachtungsvorrichtung 3 festlegen, während sie
aber Bewegungen in einer vertikalen Ebene und unter einem begrenzten
Neigungswinkel frei zulassen.
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Hierzu
weist der dritte Rahmen 23 auf einer seiner Seiten, z.B.
auf der Seite 23a, die sich rechtwinklig zur Y-Bewegungsrichtung
des zweiten Rahmens 22 erstreckt, zwei Verlängerungen 26a und 26a auf,
die sich rechtwinklig zur besagten Seite 23a erstrecken.
Die freien Enden der Verlängerungen 26a und 26b sind über eine
Querstrebe 27 miteinander verbunden, die die Befestigungsflansche
des bzw. der Federblattes/Federblätter trägt. Es versteht sich von selbst,
daß der
Rahmen 23 offen oder geschlossen sein kann, je nach den
Erfordernissen der Umgebung.
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Die
Haltemittel des dritten Rahmens 23 beinhalten wenigstens
eine dünne
Blattfeder 30, welche ein Schwenklager zwischen dem zweiten
Rahmen 22 und dem dritten Rahmen 23 bildet.
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In
dem in der 2 dargestellten Ausführungsbeispiel
werden die Haltemittel des dritten Rahmens 23 durch ein
erstes Federblatt 30a aus Bandstahl gebildet, das zwischen
der ersten Verlängerung 25a des
zweiten Rahmens 22 und der Verlängerung 26a des dritten
Rahmens 23 angeordnet ist, und durch ein zweites dünnes Federblatt 30b,
ebenfalls aus Bandstahl, das zwischen der Verlängerung 25b des zweiten
Rahmens 22 und der Verlängerung 26b des
dritten Rahmens 23 angeordnet ist. Diese Federblätter 30a und 30b bilden
ein Schwenklager und erstrecken sich rechtwinklig zur Y-Bewegungsrichtung des
zweiten Rahmens 22. In einer besonderen Ausführungsform
werden die Haltemittel des dritten Rahmens durch ein einzelnes Federblatt 30 aus
Bandstahl gebildet, das sich von der Verlängerung 25a bis zur
Verlängerung 25b erstreckt,
an welchen es befestigt ist.
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Die
rotationsverformbaren Federblätter 30, 30a und 30b spielen
hier also die Rolle eines Schwenklagers, während sie gleichzeitig eine
Verschiebung des dritten Rahmens 23 in der Ebene rechtwinklig
zur Beobachtungsachse des Beobachtungsobjektivs 3 verhindern
und eine Bewegung des dritten Rahmens 23 entlang einer
Richtung Z des Raumachsenkreuzes, also im Sinne der Beobachtungsachse,
zulassen. Im Gebrauch ist die Bewegung in der Z-Achse mit einem begrenzten Neigungswinkel
verbunden, der insbesondere von der Lage der Platte in bezug auf
das Objektiv abhängt.
Dieser Winkel ist im typischen Falle kleiner als 0,5°. Durch die
erfindungsgemäße Positioniervorrichtung
ergibt sich aus einer vertikalen Bewegung von ± 150 μm eine sehr kleine Horizontalverschiebung
von ± 0,15 μm, die um
sehr vieles kleiner ist als die Größe eines Pixels.
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Einer
nicht dargestellten Abwandlung zufolge können die Haltemittel des dritten
Rahmens 23 auch einerseits durch eine Schwenkachse gebildet werden,
die zwischen dem zweiten Rahmen 22 und dem dritten Rahmen 23 angebracht
ist und sich rechtwinklig zur Y-Bewegungsrichtung
des zweiten Rahmens 22 erstreckt, und andererseits durch
wenigstens eine Drehstabfeder, die zwischen den besagten zweiten
und dritten Rahmen angeordnet ist, so daß sie diesen dritten Rahmen 23 auf
dem zweiten Rahmen 22 hält
und dabei gleichzeitig dessen Schwenkbewegung um die Gelenkachse
zuläßt.
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Die
Positioniervorrichtung weist außerdem Feststellmittel
zur Feststellung der Analyseplatte 2 auf dem dritten Rahmen 23 auf,
sowie Mittel zur vertikalen Festsetzung des dritten Rahmens 23 beim Einlegen
der Analyseplatte 2.
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Wie 2 zeigt,
werden die Mittel zur Feststellung der Platte 2 durch Backen 31 gebildet,
die um den Innenumfang des dritten Rahmens 23 herum verteilt
angeordnet sind, wobei jeder Backen 31 oder vorzugsweise
ein Teil derselben, insbesondere diejenigen Backen, die auf den
dem Feststellnocken gegenüberliegenden
Seite angeordnet sind, wie in 4 dargestellt
eine Aussparung 31a aufweist/aufweisen, die zur Aufnahme
des Fußflansches
der Platte 2 ausgelegt ist. Die Backen 31 sind
am dritten Rahmen 23 über
geeignete Mittel befestigt, die zum Beispiel durch Schraubelemente 32 gebildet
werden. Es können
alternativ unterschiedliche Backensätze verwendet werden, die jeweils
an die Stärke
des Fußflansches
der Analyseplatte angepaßt
sind.
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Die
Feststellmittel der Platte 2 beinhalten auch einen Nocken 33,
der um eine vertikale Schwenkachse 34 zwischen einer eingefahrenen Stellung
und einer ins Innere des besagten dritten Rahmens 23 vorstehenden
Stellung verschwenkt werden kann, so daß die Platte 2 (2)
festgestellt wird. Der Nocken ist vorteilhaft seinerseits mit einer Schraube
ausgestattet, deren Kopf oder Ende so eingestellt wird, daß er/es
am Fußflansch
der Platte 2 zur Anlage kommt (5).
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Die
Mittel zur Festsetzung des dritten Rahmens 23 beim Einlegen
einer Platte 2 werden durch zwei einander gegenüberliegende
Auflager 35a und 35b gebildet, die jeweils auf
entsprechenden Seiten 21a und 21b des ersten Rahmens 21 angebracht sind,
welche sich parallel zur Y-Bewegungsachse des zweiten Rahmens 22 erstrecken.
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Wie
aus 3 ersichtlich ist, weisen die Auflager 35a und 35b je
eine Schräge
auf. Die Mittel zur Festsetzung des dritten Rahmens 23 weisen
auch zwei einander gegenüberliegende
Zungen 36a und 36b auf, die jeweils auf einer
Seite des dritten Rahmens 23 angebracht sind, die sich
parallel zur Y-Achse der Bewegung des zweiten Rahmens 22 erstreckt.
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Jede
Zunge 36a und 36b ist dazu ausgelegt, derart mit
der Schräge
des entsprechenden Auflagers 35a und 35b zusammenzuwirken,
daß der
dritte Rahmen 23, wie weiter unten noch erläutert werden soll,
festgesetzt wird.
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Schließlich beinhaltet
die Positioniervorrichtung noch Hilfs- bzw. Reglermittel zur vertikalen
Positionierung der Beobachtungsfläche 2b der Analyseplatte 2 gegenüber dem
Beobachtungsobjektiv 3.
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In
einer ersten, in 1 dargestellten Ausführungsform
werden die Reglermittel durch ein fest mit dem Objektiv verbundenes
ein Distanzstück 40 gebildet.
Dieses Distanzstück 40 bildet
mit seinem freien Ende eine Fläche
zur Auflage der Unterseite 2b der Platte 2 in
unmittelbarer Nähe
des Bodens der Vertiefung, welche die zu beobachtende oder zu analysierende
Probe enthält.
Das andere Ende des Distanzstückes 40 liegt
am Ende des Objektivs 3 an.
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Gemäß einer
zweiten Ausführungsform
werden die Reglermittel zur Festlegung der vertikalen Position der
Beobachtungsfläche 2b der
Analyseplatte 2 durch ein magnetisches oder piezoelektrisches Schwebesystem
für diese
Platte 2 gebildet. Das Element zur Steuerung der Bewegung
des dritten Rahmens 23 entlang der Beobachtungsachse wird
durch den Widerschein eines Lichtstrahles gestellt, der derjenige
des Erregerlichtes sein kann, und der vom Boden der Platte 2 oder
von der Grenzfläche
Plattenboden-Probe reflektiert werden kann.
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Das
reflektierte Licht wird in diesem Fall von einer Diodengruppe erfaßt, und
eine Servoschleife regelt den dritten Rahmen 23 entsprechend
in der Z-Richtung derart, daß das
Gleichgewicht der Signale an den Dioden eingehalten wird.
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Zur
Beobachtung des Inhaltes einer Analyseplatte 2 erlaubt
die Trägereinheit 20 ein Verschieben
dieser Platte 2 in der Ebene senkrecht zur Beobachtungsachse
derart, daß sie
nacheinander jede Probe vor das Beobachtungsobjektiv bringt. Während der
Verschiebung und während
der Beobachtung einer Probe als solcher wird die Platte 2 im
dritten Rahmen 23 von den Backen 31 und dem Nocken 33 festgehalten,
der ins Innere des dritten Rahmens 23 vorspringend positioniert
ist, wie in 2 dargestellt ist.
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Außerdem hält der dritte
Rahmen 23 unter Einwirkung des Gewichts der beweglichen
Teile (Rahmen 23 + Platte 2) und der Federn 30a und 30b, die
eine Rückstellkraft
ausüben,
die Beobachtungsfläche 2b der
Platte 2 in Anlage auf das Ende der Distanzhülse 40,
bzw. in einem vorgegebenen und festen Abstand zum Beobachtungsobjektiv 3.
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Die
Verschiebebewegung der Platte 2 in der Ebene senkrecht
zur Beobachtungsachse wird also in der X-Richtung durch den ersten
Rahmen 21 und in der Y-Richtung durch den zweiten Rahmen 22 gesichert,
derart, daß die
Vertiefungen 2a der Beobachtungsplatte nacheinander vor
das Beobachtungsobjetiv 3 gebracht werden.
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Hierzu
sind die Verschiebebewegungen der Rahmen 21 und 22 motorisiert.
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Zum
Einlegen einer neuen Analyseplatte 2 muß der dritte Rahmen 23 selbst
in der Z-Richtung festgestellt
werden.
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Dazu
wird der zweite Rahmen 22 und folglich auch der dritte
Rahmen 23 in einer Ebene verschoben, die senkrecht zur
Beobachtungsachse verläuft, bis
die Zungen 36a und 36b zur Anlage an die Auflager 35a und 35b gelangen.
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Die
Bewegung in der Y-Richtung erfolgt solange, bis die Zungen 36a und 36b auf
den Schrägen der
Auflager 35a und 35b aufreiten, was zur Folge hat,
daß der
dritte Rahmen 23 angehoben wird, und dieser dritte Rahmen 23 nun
auf den Auflagern 35a und 35b aufliegt, so daß er vertikal
festgesetzt ist. Zu diesem Zeitpunkt gibt der Nocken 33 die
vorangehende Analyseplatte 2 frei, mit welcher nun hantiert werden
kann, und die durch eine andere Analyseplatte 2 ersetzt
werden kann.
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Die
Bewegung des Nockens 33 kann durch geeignete Mittel mechanisch
oder elektrisch mit der Bewegung des dritten Rahmens 23 gekoppelt
werden. Insbesondere kann er einen Ansatz aufweisen, der durch einen
fest mit dem Rahmen 21 verbundenen Anschlag betätigt wird.
Die Bewegung des Nockens 33 kann auch manuell vorgenommen
werden.
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Beim
Einlegen einer neuen Analyseplatte wird zuallererst die Platte 2 auf
die Backen 31 aufgelegt, danach drückt der Nocken 33 auf
diese Platte 2, deren Fußflansch in die Aussparungen 31a der
Backen 31 eingreift. Der Nocken 33 selbst drückt auf den
Fußflansch
der Platte 2 und verhindert so jede Bewegung dieser Platte 2 gegenüber dem
dritten Rahmen 23. Die Bewegung wird in der Y-Richtung fortgesetzt,
der Rahmen 23 und die damit nun fest verbundene Platte 2 gleiten
längs der
Auflager 35a und 35b nach unten, bis die Beobachtungsfläche der Platte 2 zur
Anlage an dem Distanzstück 40 gelangt. Die
Aufzeichnung der Bilder kann nun beginnen.
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Die
erfindungsgemäße Positioniervorrichtung
erlaubt nicht nur eine korrekte Positionierung der Analyseplatte
und damit der Vertiefungen vor dem Objektiv, sondern auch die Wiederherstellung derselben
Positionierung bei sich wiederholenden Messungen, wobei sie gleichzeitig
die Fokussierung wahrt, wodurch echte kinetische Beobachtungen an einzelnen
Zellen vorgenommen werden können, oder
auch Bilder von unterschiedlichen Regionen einer Probe von größeren Ausmaßen im Hinblick
auf deren pixelgenaue Zusammensetzung gemacht werden können.
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Die
erfindungsgemäßen Vorrichtungen
und Verfahren können
zur Analyse von Proben unterschiedlicher Herkunft und Art eingesetzt
werden, die nach einer beliebigen, dem Fachmann bekannten Technik
markiert sind. Es kann sich insbesondere um Proben mit Zellen säugetierischen
(tierischen oder menschlichen) Ursprungs handeln (z.B. Nervenzellen,
tumorale Zellen, Immunzellen, usw.), bakteriellen oder pflanzlichen
Ursprungs, Hefezellen, pathogene Organismen, Viren, oder jede andere
Art von Mustern oder biologischen Stichproben, Schnitte von Organen
oder ganzen Tieren, usw. Die Verfahren und Vorrichtungen sind für die Analyse
oder Erfassung von Polypeptiden, Nukleinsäuren, Fetten usw. geeignet.
Sie sind besonders bei der Messung der Wirkung von Testverbindungen,
insbesondere von Produktbibliotheken, auf Zellenpopulationen anwendbar,
zum Beispiel bei Tests mit hohem Ausstoß der Wirksamkeit, Selektivität oder Toxizität von Produkten.
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So
besteht die Erfindung bei einer besonderen Ausführungsform in einem Verfahren
zur Analyse (oder Sichtung) mit hohem Durchsatz, bei dem eine wie
oben beschriebene Vorrichtung verwendet wird, insbesondere ein solches,
wo die Probe von einer Population von Zellen gebildet wird, die
in Kontakt mit einem für
eine Zellenfunktion (z.B. die Wucherung, das Wachstum, die Reifung,
Differenzierung, das Absterben, das Überleben, den Zelltod, usw.)
repräsentativen
Fluoreszenzfarbstoff gebracht wird, wobei die Probe in den von einander
getrennten Vertiefungen einer Platte mit Verbindungen einer Testsammlung
in Kontakt gebracht wird, wobei diese Verbindungen die Intensität der betrachteten
Fluoreszenzmarkierung verändern.
Die Zellenpopulation ist z.B. eine Population oder Gesamtheit von
Neuronen, insbesondere menschlichen oder tierischen Ursprungs.
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In
einer besonderen Ausführungsform
ist der Fluoreszenzfarbstoff einem Antikörper zugeordnet, der seinerseits
einem Zell-Antigen zugeordnet ist. Diese gekoppelten Antikörper sind
im Handel erhältlich,
zum Beispiel in Form der von der Firma Immunotech (Marseille, Frankreich)
hergestellten Produkte.
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Nach
einer anderen Ausführungsform
besteht die Erfindung in einem Verfahren zum Nachweis der Vorlage
(oder vorliegenden Menge) eines Virus in einer oder mehreren Probe(n),
welches beinhaltet, daß jede
Probe mit einem für
das Virus spezifischen Markierungsstoff in Kontakt gebracht wird, und
daß die
Präsenz
des Markierungsstoffes mit einer wie oben beschriebenen Vorrichtung
analysiert wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
besteht die Erfindung in einem Verfahren zum Nachweis der Vorlage
(oder vorliegenden Menge) einer Bakterie in einer oder mehreren
Probe(n), welches beinhaltet, daß jede Probe mit einem Markierungsstoff
oder Marker der Bakterie in Kontakt gebracht wird, und daß die Präsenz des
Markierungsstoffes mittels einer wie oben beschriebenen Vorrichtung
analysiert wird. Diese Markierungsstoffe können ganz spezifisch für die Bakterie
sein, wie z.B. die Nukleinsäuresonden
des Bakteriengenoms, in Verbindung mit Fluoreszenzmarkierungsstoffen,
oder aber nicht-spezifisch, wie z.B. oranges Acridin und alle Nukleinsäurenfarbstoffe.
Diese sind in großer
Anzahl im Handel erhältlich, siehe
z.B. den Katalog Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA).
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Nach
einer weiteren Ausführungsform
besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Analyse eines Gesamtschnittes
oder Teilschnittes eines Organs oder eines Tieres, welches die Analyse,
mittels einer wie oben beschriebenen Vorrichtung, der Präsenz eines
Markierungsstoffes in verschiedenen Regionen des Schnittes beinhaltet.
Das Organ kann ein Gewebe sein, oder ein Organ von Interesse, wie
z.B. die Leber, Niere, Herz, Lunge, Hirn, Kleinhirn, Milz, usw.
Das Tier kann jedes nichtmenschliche Tier sein, wie z.B. ein Säugetier,
ein Insekt, usw., zum Beispiel ein Nagetier.
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Gemäß noch einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung beinhaltet die Vorrichtung Filter im Strahlengang
des Fluoreszenzlichtes, welche bestimmte Spektralbereiche abgrenzen,
dichroitische ("zweifarbige") Filter mit 530,
585 und 650 Nanometern Durchgang zum Beispiel ermöglichen
den Einsatz von bis zu vier verschiedenen Fluoreszenzmarkierungsstoffen
mit nur einer Erregung auf 488 nm, wie dies bei der Fluß-Cytometrie praktiziert
wird. Diese Farbstoffe erlauben die Analyse mehrerer Parameter in
derselben Zelle. Auch der Erregerlichtstrahl kann zwei Quellen miteinander
verbinden, entweder gleichzeitig mittels eines dichroitischen Spiegels, oder
hintereinander mittels eines normalen beweglichen Spiegels, oder
auch durch Trennung der Erregungsraumwinkel, wodurch die Möglichkeiten
einer multiparametralen Analyse noch weiter ausgedehnt werden.
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Die
Erfindung kann auch zur Analyse der Markierung auf Kugeln eingesetzt
werden, insbesondere der Wirkung von Proteinen aufeinander, von
Immunkomplexen, von Hybridformen, usw.
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Das
Verfahren der Erfassung auf mehreren Wellenlängen ist hier besonders vorteilhaft,
weil es die Unterscheidung mehrerer Klassen von Partikeln ermöglicht.
Sind die Partikel in ihrer Größe homogen, lassen
sich diejenigen Partikel erkennen, die jeweils quantifizierte Fluoreszenzfarbstoffschattierungen
haben, z.B. etwa zehn unterschiedliche Schattierungen. Diese Partikel
können
der Sitz analytischer Reaktionen sein, zum Beispiel einer Immunanalyse,
wobei die jeder Partikelklasse entsprechende Reaktion mit einem
anderen Marker quantifiziert werden kann, der jeweils auf einer
anderen Wellenlänge
strahlt, die für alle
Reaktionen die gleiche ist. Es können
auf diese Weise soviele verschiedene analytische Reaktionen aufgezeichnet
werden, wie Partikelklassen zu unterscheiden sind.
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Eine
andere Verwendung dieser Art von Partikeln ist die Codierung, wenn
sie in einem Kombinationssyntheseprozeß eingesetzt werden. Die Analyse der
Partikel ist die getreue Darstellung der zugehörigen chemischen Verbindung,
wobei die Kontrolle der Identifizierung außerhalb des Labors erfolgen
kann, wo die Messung vorgenommen wurde, z.B. durch elektronische
Datenübertragung.
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In
einem anderen Anwendungsfall wird eine homogene Grundeinheit oder
Population fluoreszenter Partikel dazu verwendet, eine Oberfläche für die Korrektur
der Erregungsenergie zu stellen, die nicht über das ganze Beobachtungsfeld
einheitlich ist; im Besonderen haben Laser eine gauss'sche Energieverteilung.
Die Messung der von jedem Teilchen rückgestrahlten Energie gibt
den genauen Erregungsenergiepegel an der Stelle, wo es sich befindet, wieder.
Mit einer geringen Anzahl zufällig
auf einer betrachteten Fläche
verteilter Partikel ist es dann möglich, durch Interpolation
eine Oberfläche
zu definieren, die anschließend
zur Normierung der auf den unbekannten Proben beobachteten Pixel
dient. Genauso kann zu dieser Normierung eine einheitliche Ausstrahlungsfläche dienen.
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Die
Erfindung kann des weiteren zur Analyse der Ausscheidung von Nukleinsäuren nach
Hybridisierung mit Sonden dienen, insbesondere auf Chips, Micro-Arrays,
usw. Dabei kann es sich insbesondere um DNS-Ausscheidungen nach
Hybridisierung durch entsprechende DNS- oder RNS-Ketten handeln,
die aus einer Zelle oder einer Probe entstammen und mit einem Fluoreszenzelement
markiert sind. Diese Ausscheidungen liegen vorzugsweise in regelmäßigen Anordnungen
von bis zu 5000 Ausscheidungen vor, die mit der Vorrichtungen in
einem einzigen Durchgang gelesen werden können. Mehrere nebeneinander
aufgereihte Ausscheidungsblöcke
können
hintereinander gelesen werden.
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Die
Erfindung kann auch zur Analyse von Ausscheidungen von Polypeptiden
(z.B. Proteinen) verwendet werden, insbesondere auf dem Boden des
Trägers
(z.B. auf dem Boden einer Platte), auf einem Chip, Micro-Arrays,
usw., die durch Antikörper oder
andere markierte, typischerweise fluoreszierende Liganden sichtbar
gemacht werden. Es kann sich insbesondere um Ausscheidungen von
allergenen Stoffen handeln, von bakteriellen Antigenen, von autoimmunen
Antigenen, von tumorspezifischen Antigenen, usw., ggf. auch in Kombination(en).
Diese Ausscheidungen liegen vorzugsweise in Form regelmäßiger Anordnungen
von bis zu 5000 Ausscheidungen vor. Die Ausscheidungen werden im
typischen Fall mit einer biologischen Probe eines Subjekts in Kontakt
gebracht, für
das man das Vorhandensein von Antikörpern untersuchen will, die
gegen eines oder mehrere dieser Polypeptide gerichtet sind. Die Proben
werden dann mit einem zweiten Entwicklerreagens im Brutschrank einer
Wärmebehandlung
unterzogen, z.B. mit einem fluoreszierenden Antikörper, und
die Ergebnisse können
dann mit der Vorrichtung in einem Durchgang analysiert werden. Mehrere Ausscheidungsblöcke können nebeneinander
angeordnet und dann nacheinander analysiert werden.