DE60318388T2 - Verfahren und zusammensetzungen zum sauerstofftransport mit hoher sauerstoffaffinität - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Blutprodukte und genauer gesagt Zusammensetzungen, die modifiziertes Hämoglobin mit einer hohen Sauerstoffaffinität umfassen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Blutgefäßsystem und die Natur von Hämoglobin
  • Blut dient als Mittel für die Zufuhr von Nährstoffen zu den Geweben und zur Entfernung von Abfallprodukten zu deren Ausscheidung aus den Geweben. Das Blut besteht aus Plasma, in dem rote Blutkörperchen (RBCs oder Erythrozyten), weiße Blutkörperchen (WBCs) und Blutplättchen suspendiert sind. Rote Blutkörperchen machen etwa 99% der Zellen im Blut aus, und ihre Hauptfunktion besteht im Transport von Sauerstoff zu den Geweben und der Entfernung von Kohlendioxid daraus.
  • Die linke Herzkammer pumpt das Blut durch die Arterien und die kleineren Arteriolen des Blutgefäßsystems. Das Blut dringt dann in die Kapillaren ein, wo der Großteil des Austauschs von Nährstoffen und Zellabfallprodukten stattfindet (siehe z. B. A. C. Guyton, "Human Physiology And Mechanisms Of Disease" (3. Aufl.), S. 228–229, W. B. Saunders Co., Philadelphia, Pa. (1982)). Danach fließt das Blut durch die Venolen und Venen in den rechten Vorhof des Herzens zurück. Wenngleich das Blut, das zum Herzen zurückfließt, im Vergleich mit dem Blut, das aus dem Herzen gepumpt wird, sauerstoffarm ist, enthält das zurückfließende Blut im Ruhezustand etwa noch 75% des ursprünglichen Sauerstoffgehalts.
  • Die reversible Oxygenierungs-(d. h. Sauerstoffzufuhr-)funktion der RBCs erfolgt durch das Protein Hämoglobin. In Säugetieren weist Hämoglobin ein Molekulargewicht von etwa 64.000 Dalton auf und besteht zu etwa 6% aus Häm und zu 94% aus Globin. In seiner nativen Form enthält es zwei Untereinheitenpaare (d. h. es ist ein Tetramer), wobei jede eine Häm-Gruppe und eine Globinpeptidkette umfasst. In wässriger Lösung ist Hämoglobin ausgeglichen in tetramerer (MW 64.000) und dime rer Form (MW 32.000) vorhanden; außerhalb von RBCs werden die Dimere durch die Niere vorzeitig ausgeschieden (Plasmahalbwertszeit von etwa 2–4 h). Neben Hämoglobin enthalten RBCs Stroms (die RBC-Membran), die Proteine, Cholesterin und Phospholipide umfasst.
  • Exogene Blutprodukte
  • Aufgrund der Nachfrage nach Blutprodukten in Krankenhäusern und anderen Einrichtungen wurde intensiv auf dem Gebiet der Entwicklung von Blutersatzprodukten und Plasmaexpandern geforscht. Ein Blutersatzprodukt ist ein Blutprodukt, das in der Lage ist, Gewebe Sauerstoff zuzuführen und dieses damit zu versorgen. Blutersatzprodukte finden zahlreiche Anwendungen, einschließlich das Ersetzen von Blut, das während chirurgischer Verfahren und nach akuten Blutungen verloren wurde, sowie für Reanimationsverfahren nach einem Trauma. Plasmaexpander sind Blutersatzprodukte, die in das Gefäßsystem verabreicht werden, aber typischerweise nicht in der Lage sind, Sauerstoff zu transportieren. Plasmaexpander können beispielsweise zum Ersetzen von Plasma, das durch Verbrennungen verloren wurde, zur Behandlung von Volumenmangelschock und zur Durchführung einer Blutverdünnung (z. B. zur Aufrechterhaltung von Normovolämie und zur Senkung der Blutviskosität) eingesetzt werden. Im Wesentlichen können Blutersatzprodukte für diese Zwecke und für all jene Zwecke eingesetzt werden, zu denen derzeit Patienten Blut aus Blutbanken verabreicht wird (siehe z. B. US-Patente Nr. 4.001.401 an Bonson et al. und 4.061.736 an Morris et al.).
  • Die derzeitige menschliche Blutversorgung unterliegt mehreren Einschränkungen, die durch die Verwendung eines exogenen Blutersatzprodukts verringert werden können. Zur Veranschaulichung: Die weitgehende Verfügbarkeit von sicheren und wirksamen Blutersatzprodukten würde den Bedarf nach Blutkonserven (allogenem Blut) senken. Solche Blutersatzprodukte würden ferner die unmittelbare Infusion einer Reanimationslösung nach einem Trauma ermöglichen, ohne dass (wie es für Blut erforderlich ist) eine Kreuzprobe in Betracht gezogen werden muss, wobei durch die Wiederherstellung der Sauerstoffzufuhr zu ischämischem Gewebe wertvolle Zeit gespart werden kann. Ebenso können Blutersatzprodukte Patienten vor einem chirurgischen Eingriff verabreicht werden, wodurch den Patienten Eigenblut abgenommen werden kann, das bei Bedarf später während des Verfahrens oder nach dem Eingriff wieder verabreicht werden kann. Der Einsatz von exogenen Blutprodukten schützt Patienten demnach nicht nur vor dem Ausgesetztsein gegenüber Fremdblut (allogenem Blut), sondern hilft auch, Eigenblut oder allogenes Blut (Blutkonserven, gekreuztes Blut) für dessen optimalen Einsatz aufzusparen.
  • Einschränkungen bei derzeitigen Blutersatzprodukten
  • Versuche zur Herstellung von Blutersatzprodukten (manchmal als "sauerstofftransportierende Plasmaexpander" bezeichnet) haben bisher zur Erzeugung von Produkten geführt, die nur geringe Wirksamkeit aufweisen oder deren Herstellung langwierig und kostspielig ist oder auf die beides zutrifft. Häufig sind die Kosten für die Herstellung solcher Produkte so hoch, dass diese den verbreiteten Einsatz der Produkte tatsächlich ausschließen, insbesondere auf den Märkten, wo der Bedarf am größten ist (z. B. Schwellenländer der Dritten Welt).
  • Blutersatzprodukte können in folgende drei Kategorien eingeteilt werden: i) Emulsionen auf Perfluorkohlenstoff-Basis, ii) in Liposomen verkapseltes Hämoglobin und iii) modifiziertes zellfreies Hämoglobin. Wie nachstehend erläutert war keine dieser Kategorien zur Gänze erfolgreich, wenngleich angenommen wird, dass Produkte, die modifiziertes zellfreies Hämoglobin umfassen, am vielversprechendsten sind. Zusammensetzungen auf Basis von Perfluorchemikalien lösen Sauerstoff, anstatt diesen als Ligand zu binden. Um in biologischen Systemen eingesetzt werden zu können, muss die Perfluorchemikalie mit einem Lipid, typischerweise Eigelb-Phospholipid, emulgiert werden. Wenngleich Perfluorkohlenstoffemulsionen kostengünstig hergestellt werden können, transportieren sie nicht ausreichend Sauerstoff in klinisch tolerierten Dosen, um wirksam zu sein. Umgekehrt ist mit Liposomen verkapseltes Hämoglobin, von dem gezeigt wurde, dass es wirksam ist, für den verbreiteten Einsatz viel zu teuer (siehe allgemein Robert M. Winslow, "Hemoglobin-based Red Cell Substitutes", John Hopkins University Press, Baltimore (1992)).
  • Die meisten Blutersatzprodukte in klinischen Versuchen basieren heutzutage auf modifiziertem Hämoglobin. Diese Produkte, die oft als Sauerstoffträger auf Hämoglobin-Basis (HBOCs) bezeichnet werden, umfassen im Allgemeinen eine homogene wässrige Lösung eines chemisch modifizierten Hämoglobins, das im Wesentlichen frei von anderen Resten roter Blutkörperchen (Stroms) ist. Wenngleich stromafreies Hämoglobin (SFH) von Menschen das üblichste Ausgangsmaterial für die Herstellung eines HBOC darstellt, wurden auch andere Hämoglobinquellen eingesetzt. Hämoglobin kann beispielsweise aus Tierblut (z. B. Rinder- oder Schweinehämoglobin) oder von Bakterien oder Hefe oder transgenen Tieren oder Pflanzen, die genetisch verändert wurden, um ein gewünschtes Hämoglobinprodukt zu produzieren, erhalten oder abgeleitet werden.
  • Bei der chemischen Modifikation handelt es sich im Allgemeinen um intramolekulare Vernetzung, Oligomerisation und/oder Polymerkonjugation, um das Hämoglobin so zu modifizieren, dass sein Verbleib im Blutkreislauf im Vergleich mit dem von unmodifiziertem Hämoglobin verlängert wird, und seine Sauerstoffbindungseigenschaften sind jenen von Blut ähnlich. Bei intramolekularer Vernetzung werden Untereinheiten der tetrameren Hämoglobineinheit verbunden, um die Bildung von Dimeren zu verhindern, die, wie zuvor angesprochen, vorzeitig ausgeschieden werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5.296.465 an Rausch et al.).
  • Die hohen Herstellungskosten von HBOC-Produkten haben deren kommerzielle Realisierbarkeit stark eingeschränkt. Zusätzlich dazu haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass bekannte HBOCs dazu neigen, eher an den Arteriolenwänden als in den Kapillaren überschüssige Sauerstoffmengen an die Gewebe abzugeben. Das kann dazu führen, dass nur eine unzureichende Sauerstoffmenge für die Zufuhr durch die HBOC zu den Geweben, die die Kapillaren umgeben, zur Verfügung steht. Dieses Problem besteht trotz der Tatsache, dass die anfängliche Beladung von HBOC mit Sauerstoff im Vergleich mit dem Ausmaß, das mit natürlichen roten Blutkörperchen, mit Ausnahme von Mutanten mit äußerst geringer Affinität, erzielt wird, relativ hoch ist.
  • In den meisten Fällen wurden HBOCs so entwickelt, dass sie eine Sauerstoffaffinität aufweisen, die der von nativem Hämoglobin entspricht oder niedriger ist als diese. Wie oben erläutert kann das jedoch zu einer unzureichenden Sauerstoffzufuhr zu den Geweben führen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Blutersatzprodukt, das einen HBOC mit hoher Sauerstoffaffinität in einem wässrigen Verdünner umfasst.
  • Ajisaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Band 97, Nr. 3, S. 1076–1081 (1980) beschreiben frühe Studien von Polyethylenglykol-(PEG-)Derivaten von menschlichem Hämoglobin als mögliche Kandidaten für ein Blutersatzprodukt. Die Derivate wurden offenbar durch Bindung von PEG an Aminogruppen von Hämoglobin unter Einsatz von 2,4,6-Trichlor-s-triazin als Bindungsvermittler hergestellt.
  • US-Patent Nr. 4.061.736 beschreibt frühe Arbeiten an intramolekular vernetztem Hämoglobin zur Verwendung als Blutersatzprodukt zum Sauerstofftransport. Das Hämoglobin wird durch kovalentes Vernetzen der Untereinheiten mit den entsprechenden Tetrameren von Hämoglobin (siehe z. B. Spalte 3, Zeilen 4–6) vernetzt. Das Vernetzen erfolgt in Gegenwart zumindest eines bi- oder polyfunktionellen kovalenten Vernetzers, wobei üblicherweise die primären Aminogruppen seiner Lysinreste vernetzt werden, um wasserlösliche Produkte zu ergeben (siehe z. B. Spalte 5, Zeilen 20–25). Zu den zahlreichen angeführten Vernetzern gehören Ethylenglykoldiglycidylether und Propylenglykoldiglycidylether (siehe Spalte 8, Zeilen 16–21). In den Beispielen wurden folgende Vernetzer verwendet: Hexamethylendiisocyanat, Butadiendiepoxid und Divinylsulfon.
  • US-Patent Nr. 6.054.427 beschreibt frühe Arbeiten eines der vorliegenden Erfinder. Es beschreibt Blutersatzprodukte, die eine Sauerstoffträgerkomponente und eine Nicht-Sauerstoffträgerkomponente umfassen (siehe z. B. Spalte 3, Zeilen 28–31). Vorzugsweise handelt es sich bei der Sauerstoffträgerkomponente um einen Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis (siehe z. B. Spalte 3, Zeilen 39–41). Bei dem Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis kann es sich um Hämoglobin handeln, das in der Folge durch Hinzufügung von chemischen Gruppen, einschließlich Polyalkylenoxid (PAO), wie z. B. Polyethylenglykol (PEG), modifiziert wurde (siehe z. B. Spalte 3, Zeilen 41–46; Spalte 4, Zeilen 23–25). Gemäß diesem Dokument wird das Hämoglobin mit PAO (z. B. PEG) modifiziert, um die Viskosität und die Molekülgröße zu erhöhen. Modifikationen von Hämoglobin werden beginnend mit Spalte 22 erläutert. Tabelle 3 (in den Spalten 23–26) führt eine Reihe von Modifikationen von Hämoglobin an, die zuvor vorgeschlagen wurden. Die Tabelle umfasst einen abschließenden Abschnitt mit der Überschrift "Oberflächenkonjugate", in dem die Modifikation durch Polyethylenglykol angeführt ist. Hämoglobinkonjugate (z. B. durch die Konjugation mit Polyethylenglykol modifiziertes Hämoglobin) werden beispielsweise beginnend in Spalte 69, Zeile 28 beschrieben. Im ersten Experiment ("1. An Polyoxyethylen konjugiertes Hämoglobin", Spalte 69, Zeile 33) wurde AT-Hydroxylsuccinimidylester von Methoxypoly(ethylenglykol)propansäure (M-SPA) eingesetzt. Im zweiten Experiment ("2. An Polyoxyethylen konjugiertes Hämoglobin", Spalte 69, Zeile 49) wurde Monomethoxypolyoxyethylensuccinimidylester (MPSE) eingesetzt. Im dritten Experiment ("3. Hämoglobin-Polyethylenglykol-Konjugat", Spalte 70, Zeile 1) wurde Methoxypoly(ethylenglykol)-AT-succinimidylcarbonat (SC-PEG) eingesetzt. Im vierten Experiment ("4. Hämoglobin-Polyethylen-Konjugat", Spalte 70, Zeile 21) wurde Polyethylenglkyolbis(succinimidylsuccinat) eingesetzt. In den folgenden Experimenten werden weitere Nicht-PEG-Hämoglobin-Konjugate beschrieben.
  • Die WO 2003/059286 (veröffentlicht nach dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung) beschreibt die Verwendung von oberflächenmodifiziertem Hämoglobin in Plasma als Blutersatzprodukt (siehe Absatz [0013] darin). Bei dem oberflächenmodifizierten Hämoglobin kann es sich um Hämoglobin handeln, an das Polyalkylenoxid gebunden wurde (siehe Absatz [0018] darin). In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Oberflächenmodifikation um die kovalente Bindung der frei liegenden Aminosäure-Seitenketten am Hämoglobinmolekül (siehe Absatz [0040] darin).
  • Die WO 2003/059287 (veröffentlicht nach dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung) beschreibt die Verwendung von modifiziertem Hämoglobin und eines Kristalloids in wässriger Lösung als ein Blutersatzprodukt (siehe Absatz [0013] darin). Bei dem modifizierten Hämoglobin kann es sich um Hämoglobin handeln, an das Poly alkylenoxid (z. B. PEG) gebunden wurde (siehe Absätze [0021] und [0022] darin). In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Oberflächenmodifikation um die kovalente Bindung an die frei liegenden Aminosäure-Seitenketten am Hämoglobinmolekül (siehe Absatz [0044] darin). Beispiel 1 darin beschreibt ein PEG-modifiziertes Hämoglobin, das zunächst durch Thiolierung von Hämoglobin und anschließende Umsetzung mit maleinimidaktivertem PEG 5000 hergestellt wird (siehe Absatz [0051] darin).
  • Die WO 2004/058291 (veröffentlicht nach dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung) beschreibt modifiziertes Hämoglobin, das eine Reihe von PEG-Ketten aufweist, die über Thiolgruppen (sowohl native als auch chemisch eingebaute) durch Reaktion mit PEG, das mit einer Maleinimidgruppierung funktionalisiert wurde, gebunden wurden (siehe Absätze [0009] und [0010] darin).
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem Blutersatzprodukt, das ein oberflächemodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst,
    worin es sich bei dem oberflächemodifizierten Oxyhämoglobin um ein Hämoglobin handelt, an das über eine Oberflächen-Thiolgruppe einer frei liegenden Aminosäure-Seitenkette ein Polyalkylenoxid kovalent an das Hämoglobin-Molekül gebunden ist, während das Hämoglobin im oxygenierten Zustand vorliegt; und
    worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin unter denselben Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle, wenn es unter denselben Bedingungen gemessen wird.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Polyalkylenoxid um Polyethylenoxid, Polypropylenoxid oder ein Polyethylen/Polypropylenoxid-Copolymer.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Polyalkylenoxid um Polyethylenglykol.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Polyalkylenoxid um Polyethylenglykol der Formel H(OCH2CH2)nOH, worin n ≥ 4 ist.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Blutersatzprodukt um ein Blutersatzprodukt, das oberflächemodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst,
    worin es sich bei dem oberflächemodifizierten Oxyhämoglobin um Hämoglobin handelt, an das maleinimidylaktiviertes Polyethylenglykol über eine Oberflächen-Thiolgruppe einer frei liegenden Aminosäure-Seitenkette am Hämoglobin-Molekül gebunden wurde, während das Hämoglobin in oxygeniertem Zustand vorliegt; und
    worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin unter den gleichen Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Polyethylenglykol um ein Polyethylenglykol der Formel H(OCH2CH2)nOH, worin n ≥ 4 ist.
  • In einer Ausführungsform ist das Blutersatzprodukt ein Blutersatzprodukt, das oberflächenmodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst,
    worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin die Formel Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m aufweist, worin:
    Hb tetrameres Hämoglobin ist;
    S eine Oberflächen-Thiolgruppe ist;
    Y ein kovalenter Succinimidyl-Linker ist;
    R eine Alkyl-, Amid-, Carbamat- oder Phenylgruppe ist;
    n die Länge des Polymers definiert und ≥ 4 ist; und
    m die Anzahl an PEG-Polymeren ist, die an die Oberfläche des Hämoglobins gebunden sind; und
    worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin unter den gleichen Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle.
  • In einer Ausführungsform ist m = 4–5.
  • In einer Ausführungsform wird das Hämoglobin vor der Oberflächenmodifikation thioliert.
  • In einer Ausführungsform weist das Blutersatzprodukt ein Verhältnis von Methämoglobin zu Gesamthämoglobin von weniger als 0,10 auf.
  • In einer Ausführungsform weist das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin einen P50 von weniger als 10 Torr (1333 Pa) auf.
  • In einer Ausführungsform weist das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin einen P50 von weniger als 7 Torr (933 Pa) auf.
  • In einer Ausführungsform ist das Blutersatzprodukt gegenüber Autooxidation bei 24°C stabil und umfasst ein PEG-Hämoglobin-Konjugat, worin das Verhältnis Methämoglobin/Gesamthämoglobin weniger als 0,10 beträgt und das PEG-Hämoglobin-Konjugat einen P50 unter 10 Torr (1333 Pa) aufweist.
  • In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Hämoglobin um Pferde-Hämoglobin.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einer Zusammensetzung, die als Blutersatz eingesetzt werden kann und ein Blutersatzprodukt wie oben beschrieben in einem wässrigen Verdünner umfasst.
  • In einer Ausführungsform beträgt die Hämoglobinkonzentration zwischen 0,1 und 4,0 g/dl.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in einem oben beschriebenen Blutersatzprodukt zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Therapie des menschlichen oder tierischen Körpers.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines oben beschriebenen Blutersatzprodukts zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Traumata, Ischämie, Blutverdünnung, septischen Schocks, Krebs, chronischer Anämie, Sichelzellenanämie, Kardioplegie oder Hypoxie.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines oben beschriebenen Blutersatzprodukts zur Herstellung eines Medikaments zur tierärztlichen Behandlung von Blutverlust aufgrund einer Verletzung, hämolytischer Anämie, infektiöser Anämie bei Pferden, infektiöser Anämie bei Katzen, bakteriellen Infektionen, Faktor-IV-Fragmentierung, Hypersplenismus und Hypermegalie, des hämorrhagischen Syndroms bei Geflügel, hypoplastischer Anämie, aplastischer Anämie, idiopathischer immunhämolytischer Leiden, Eisenmangel, isoimmunhämolytischer Anämie, mikroangiopathischer hämolytischer Anämie oder Parasitismus.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen können in verschiedenen Situationen eingesetzt werden, einschließlich in Notaufnahmen, Operationssälen, militärischen Auseinandersetzungen, Krebsspitälern und veterinärmedizinischen Kliniken. Die geringe Toxizität und hohe Stabilität der Zusammensetzungen ermöglichen eine Lagerung bei Raumtemperatur, ohne dass die Wirksamkeit des beschriebenen Blutersatzprodukts beeinträchtigt wird. Durch den Einsatz der Zusammensetzungen kann auch die Notwendigkeit einer Blutgruppenkreuzprobe und der damit zusammenhängenden Labortests umgangen werden, was ein rascheres und sichereres Eingreifen bei der Behandlung von Patienten ermöglicht. Die Kombination von geringer Toxizität, Langzeitstabilität und universeller Anwendbarkeit der Zusammensetzungen stellt daher einen besonders nützlichen Blutersatz bereit.
  • Hierin wird ein Blutersatzprodukt beschrieben, das oberflächenmodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst, worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin bei einer Messung unter den gleichen Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle (d. h. von derselben Tierspezies). Geeignete Tierquellen umfassen z. B. Menschen, Kühe, Schweine und Pferde.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Blutersatzprodukt die Form einer Zusammensetzung, die das oberflächemodifizierte Oxyhämoglobin und einen wässrigen Verdünner umfasst.
  • In einer spezifischen Ausführungsform weist das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin einen P50 unter 10 Torr (1333 Pa), vorzugsweise unter 7 Torr (933 Pa) auf.
  • Hierin wird auch ein Blutersatzprodukt beschrieben, das durch kovalente Bindung eines oder mehrere Polyalkylenoxide an das Oxyhämoglobin hergestellt wird.
  • In einer spezifischen Ausführungsform wird das Blutersatzprodukt durch kovalente Bindung eines Polyalkylenoxidpolymers, wie z. B. eines Polyethylenglykol-(PEG-)Polymers, der Formel H(OCH2CH2)nOH, worin n ≥ 4 ist, hergestellt. Vorzugsweise weist das Produkt ein Verhältnis Methämoglobin/Gesamthämoglobin von weniger als 0,10 auf.
  • Hierin wird auch ein Blutersatzprodukt beschrieben, das gegenüber Autooxidation bei 24°C stabil ist und ein PEG-Hämoglobin-Konjugat umfasst, worin das Verhältnis Methämoglobin/Gesamthämoglobin weniger als 0,10 beträgt und das PEG-Hämoglobin-Konjugat einen P50 von unter 10 Torr (1333 Pa) aufweist.
  • Hierin wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer Blutersatzzusammensetzung beschrieben, das folgende Schritte umfasst: a) Herstellung von Hämoglobin mit einem Methämoglobin/Gesamthämoglobin-Verhältnis von weniger als 0,10; b) kovalente Bindung von Polyalkylenoxid an das Hämoglobin zur Bildung von oberflächenmodifiziertem Oxyhämoglobin mit einem P50 von weniger als 10 Torr (1333 Pa) und c) Suspendieren des oberflächenmodifizierten Oxyhämoglobins in einem geeigneten Verdünner. Vorzugsweise umfasst die Herstellung des Hämoglobins ferner das Isolieren von Hämoglobin aus roten Blutkörperchen.
  • Zusätzlich dazu kann der Schritt der Hämoglobin-Herstellung ferner das Isolieren von Hämoglobin aus roten Blutkörperchen, wobei das Hämoglobin ein Methämoglobin/Gesamthämoglobin-Verhältnis von 0,10 oder höher aufweist, und das Aussetzen des Hämoglobins gegenüber aeroben Bedingungen (d. h. der Atmosphäre) für einen Zeitraum umfassen, der ausreicht, um das Methämoglobin/Gesamthämoglobin-Verhältnis auf unter 0,10 zu senken. Dieser Schritt kann ohne ein thiolhältiges Reduktionsmittel erfolgen.
  • Hierin wird auch ein Verfahren zur Verwendung eines Blutersatzprodukts zur Zufuhr von Sauerstoff zu einem Gewebe beschrieben, das die Verabreichung des Produkts in einem wässrigen Verdünner an ein Säugetier, das dessen bedarf, umfasst.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt das FPLC-Chromatogramm von MalPEG-Hb und SFH.
  • 2 zeigt die Sauerstoffgleichgewichtskurven für MalPEG-Hb und SFH.
  • 3 zeigt FPLC-Elutionsmuster für die beiden PEG-modifizierten Hämoglobine (PHP und POE) und unmodifiziertes Hämoglobin (SFH). Es ist anzumerken, dass die Muster für PHP und POE zwar nicht quantitativ, aber qualitativ ähnlich sind. Auch der kleine Peak von offenbar unmodifiziertem Hämoglobin in der POE-Kurve ist anzumerken.
  • 4 zeigt die Sauerstoffgleichgewichtskurven für die beiden PEG-modifizierten Hämoglobine (PHP und POE). Es ist anzumerken, dass keine der beiden signifikante Kooperativität aufweist.
  • 5 zeigt die Oxidationsrate im zeitlichen Verlauf, wenn MalPEG-Hämoglobin bei Raumtemperatur vorliegt. Die Proben wurden doppelt aus zwei getrennten Flaschen, die auf dieselbe Weise gelagert wurden, gemessen. Die Oxidationsrate beträgt für Gesamthämoglobin 1% pro h, wobei sie in 10 h von 5,0 auf 5,5% ansteigt.
  • 6 zeigt die Kaplan-Meier-Überlebensanalyse der beiden Tiergruppen, denen entweder PHP oder POE verabreicht wurde.
  • 7 zeigt den mittleren Blutdruck in Tieren, denen die beiden PEG-modifizierten Hämoglobine (PHP und POE) verabreicht wurden. Die Reaktion ist bei Tieren, denen PHP verabreicht wurde, unmittelbar und deutlicher. Während der Blutungsphase wird der Druck jedoch in den POE-Tieren besser aufrecht erhalten.
  • 8 zeigt eine Zusammenfassung verschiedener Oxidationsraten im Verlauf der Zeit, wenn MalPEG-Hb 6 Tage lang bei –20°C, 5 Tage lang bei +4°C und 10 h lang bei Raumtemperatur (24°C) gelagert wird.
  • 9 zeigt die Oxidationsrate im zeitlichen Verlauf, wenn MalPEG-Hb 5 Tage lang bei +4°C gelagert wird.
  • 10 zeigt die Oxidationsrate im zeitlichen Verlauf, wenn MalPEG-Hb 10 h lang bei Raumtemperatur gelagert wird.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Blutersatzprodukte, die HBOCs mit hoher Sauerstoffaffinität umfassen. Für bestimmte Anwendungen sind diese Zusammensetzungen in der Lage, Sauerstoff zu Geweben effizienter zuzuführen als Ersatzprodukte mit einer Sauerstoffaffinität, die etwa jener von nativem Hämoglobin entspricht.
  • Definitionen
  • Zum besseren Verständnis der in der folgenden Beschreibung dargelegten Erfindung wird nachstehend eine Reihe von Bezeichnungen definiert.
  • Die Bezeichnung "Hämoglobin" bezieht sich allgemein auf das Protein, das in roten Blutkörperchen enthalten ist und Sauerstoff transportiert. Jedes Hämoglobin-Molekül weist 4 Untereinheiten auf, 2 α-Ketten und 2 β-Ketten, die in einer Tetramerstruktur angeordnet sind. Jede Untereinheit enthält eine Hämgruppe, die das eisenhältige Zentrum darstellt, das den Sauerstoff bindet. Jedes Hämoglobin-Molekül kann demnach 4-Sauerstoffmoleküle binden.
  • Die Bezeichnung "modifiziertes Hämoglobin" umfasst durch chemische Reaktion, wie z. B. intra- oder intermolekulare Vernetzung, genetische Manipulation, Polymerisation und/oder Konjugation an andere chemische Gruppen (z. B. Polyalkylenoxide, wie z. B. Polyethylenglykol, oder andere Addukte, wie z. B. Proteine, Peptide, Kohlenhydrate, synthetische Polymere und dergleichen), verändertes Hämoglobin, ist aber nicht darauf beschränkt. Im Wesentlichen ist Hämoglobin "modifiziert", wenn eine seiner strukturellen oder funktionellen Eigenschaften in Bezug auf den nativen Zustand verändert wurde. Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Hämoglobin" selbst sowohl auf natives, unmodifiziertes, Hämoglobin als auch auf modifiziertes Hämoglobin.
  • Die Bezeichnung "oberflächenmodifiziertes Hämoglobin" bezieht sich auf oben beschriebenes Hämoglobin, an das eine chemische Gruppe, wie z. B. Dextran oder Polyalkylenoxid, üblicherweise kovalent, gebunden wurde. Die Bezeichnung "oberflächenmodifiziertes Oxyhämoglobin" bezieht sich auf Hämoglobin, das im "R"-Zustand vorliegt, wenn es oberflächemodifiziert ist.
  • Die Bezeichnung "stromafreies Hämoglobin" bezieht sich auf Hämoglobin, aus dem alle Membranen roter Blutkörperchen entfernt wurden.
  • Die Bezeichnung "Methämoglobin" bezieht sich auf eine oxidierte Form von Hämoglobin, die Eisen im Eisen(III)-Zustand enthält und nicht als Sauerstoffträger fungieren kann.
  • Die Bezeichnung "MalPEG-Hb" bezieht sich auf Hämoglobin, an das maleinimidylaktiviertes PEG konjugiert wurde. Dieses MalPEG kann ferner durch folgende Formel bezeichnet werden: Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m Formel Iworin sich Hb auf tetrameres Hämoglobin bezieht, S eine Oberflächen-Thiolgruppe ist, Y die kovalente Succinimid-Bindung zwischen Hb und Mal-PEG ist, R eine Alkyl-, Amid-, Carbamat- oder Phenylgruppe ist (in Abhängigkeit von der Quelle des Rohmaterials und dem chemischen Syntheseverfahren), [O-CH2-CH2]n die Oxyethylen-Einheiten darstellt, die das Gerüst des PEG-Polymers bilden, worin n die Länge des Polymers definiert (z. B. MG = 5000) und O-CH3 die terminale Methoxygruppe ist. PHP und POE sind zwei verschiedene PEG-modifizierte Hämoglobine.
  • Die Bezeichnung "Perfluorkohlenstoffe" bezieht sich auf synthetische inerte Moleküle, die Fluoratome enthalten und vollständig aus Halogen-(B, F, Cl) und Kohlenstoffatomen bestehen. In Form von Emulsionen befinden sie sich im Entwicklungsstadium als Blutersatzprodukte, da sie die Fähigkeit haben, viel mehr Sauerstoff zu lösen als äquivalente Plasma- oder Wassermengen.
  • Die Bezeichnung "Plasmaexpander" bezieht sich auf Lösungen, die einem Individuum zur Behandlung von Blutverlust verabreicht werden können.
  • Die Bezeichnung "Sauerstofftransportkapazität" oder einfach "Sauerstoffkapazität" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Blutersatzprodukts, Sauerstoff zu transportieren, stimmt aber nicht notwendigerweise mit der Effizienz der Sauerstoffzufuhr überein. Die Sauerstofftransportkapazität wird im Allgemeinen anhand der Hämoglobinkonzentration berechnet, da bekannt ist, dass jedes Gramm Hämoglobin 1,24 ml Sauer stoff bindet. Die Hämoglobinkonzentration in g/dl multipliziert mit dem Faktor 1,34 ergibt demnach die Sauerstoffkapazität in ml/dl. Die Hämoglobinkonzentration kann durch ein beliebiges bekanntes Verfahren gemessen werden, wie z. B. unter Einsatz des β-Hämoglobin-Photometers (HemoCue, Inc., Angelholm Schweden). Auf ähnliche Weise kann die Sauerstoffkapazität anhand der von einer Hämoglobin- oder Blutprobe freigesetzten Sauerstoffmenge beispielsweise unter Einsatz eines Brennstoffzelleninstruments (z. B. Lex-O2-Con; Lexington Instruments) gemessen werden.
  • Die Bezeichnung "Sauerstoffaffinität" bezieht sich auf die Avidität, mit der ein Sauerstoffträger, wie z. B. Hämoglobin, molekularen Sauerstoff bindet. Diese Eigenschaft ist durch die Sauerstoffgleichgewichtskurve definiert, die den Sättigungsgrad von Hämoglobinmolekülen mit Sauerstoff (Y-Achse) mit dem Sauerstoffpartialdruck (X-Achse) in Beziehung setzt. Die Position dieser Kurve wird durch den P50-Wert angegeben, der dem Sauerstoffpartialdruck entspricht, bei dem der Sauerstoffträger zur Hälfte mit Sauerstoff gesättigt ist und sich umgekehrt proportional zur Sauerstoffaffinität verhält. Je niedriger der P50 ist, desto höher ist demnach die Sauerstoffaffinität. Die Sauerstoffaffinität von Vollblut (und Vollblutkomponenten, wie z. B. roten Blutkörperchen und Hämoglobin) kann durch verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren ermittelt werden (siehe z. B. Winslow et al., J. Biol. Chem. 252(7), 2331–2337 (1977)). Die Sauerstoffaffinität kann auch unter Verwendung einer im Handel erhältlichen HEMOXTM-TM-Analysevorrichtung (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pennsylvania). (Siehe z. B. Vandegriff und Shrager in "Methods in Enzymology", 232, 460, Everse et al. (Hrsg.) (1994)).
  • Die Bezeichnung "hypertonisch" bezeichnet eine kolloidale Lösung mit einem kolloidalen osmotischen (onkotischen) Druck wie Blut (> etwa 25–27 mm Hg (3333–3600 Pa)). Der kolloidale osmotische Druck kann durch ein geeignetes Verfahren, wie z. B. in einem Wescor-Instrument, gemessen werden.
  • Die Bezeichnung "sauerstofftransportierende Komponente" bezieht sich in breitem Sinne auf eine Substanz, die in der Lage ist, Sauerstoff im Blutkreislaufsystem des Körpers zu transportieren und zumindest einen Teil dieses Sauerstoffs den Geweben zuzuführen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die sauerstofftransportierende Komponente natives oder modifiziertes Hämoglobin und wird hierin auch als "Sauerstoffträger auf Hämoglobin-Basis" oder "HBOC" bezeichnet.
  • Die Bezeichnung "hämodynamische Parameter" bezieht sich in breitem Sinne auf Messungen, die den Blutdruck-, -strom- und -volumenstatus anzeigen, einschließlich von Messungen, wie z. B. Blutdruck, Herzminutenvolumen, Druck im rechten Vorhof und linksventrikulärer enddiastolischer Druck.
  • Die Bezeichnung "Kristalloid" bezieht sich auf kleine Moleküle (üblicherweise kleiner als 10 Å (1 nm)), wie z. B. Salze, Zucker und Puffer. Anders als Kolloide enthalten Kristalloide keine onkotisch aktiven Komponenten und äquilibrieren sehr rasch zwischen dem Kreislauf und dem Interstitialraum.
  • Die Bezeichnung "Kolloid" bezieht sich im Gegensatz zu "Kristalloid" auf größere Moleküle (üblicherweise größer als 10 Å (1 nm)), die in Abhängigkeit von ihrer Größe und Ladung über biologische Membranen äquilibrieren und Proteine, wie z. B. Albumin und Gelatine, sowie Stärken, wie z. B. Pentastärke und Hetastärke, umfassen.
  • Die Bezeichnung "kolloidaler osmotischer Druck" bezieht sich auf den Druck, der durch ein Kolloid ausgeübt wird, um das Flüssigkeitsgleichgewicht einer Membran auszugleichen.
  • Die Bezeichnung "stabil gegenüber Autooxidation" bezieht sich auf die Fähigkeit von HBOC, die Autooxidation auf einem geringen Maß zuhalten. HBOC wird bei 24°C als stabil erachtet, wenn das Methämoglobin/Gesamthämoglobin-Verhältnis nach 10 h bei 24°C um nicht mehr als 2% ansteigt. Wenn die Autooxidationsrate beispielsweise 0,2 h–1 beträgt, würde HBOC bei Raumtemperatur für 10 h als stabil erachtet werden, wenn der Ausgangsanteil von Methämoglobin von 5% nicht über 7% steigen würde.
  • Die Bezeichnung "Methämoglobin/Gesamthämoglobin-Verhältnis" bezieht sich auf das Verhältnis von desoxygeniertem Hämoglobin zum Gesamthämoglobin.
  • Die Bezeichnung "Gemisch" bezieht sich auf das Vermischen zweier oder mehrerer Substanzen, ohne dass es zu einer Reaktion kommt, durch die diese ihre jeweiligen Eigenschaften verlieren würden; die Bezeichnung "Lösung" bezieht sich auf ein flüssiges Gemisch; die Bezeichnung "wässrige Lösung" bezieht sich auf eine Lösung, die Wasser enthält und auch eine oder mehrere andere flüssige Substanzen zusammen mit Wasser enthalten kann, um eine Mehrkomponentenlösung zu bilden; die Bezeichnung "etwa" bedeutet, dass der tatsächliche Wert in einem Bereich, z. B. innerhalb von 10%, des angegebenen Werts liegt.
  • Die Bezeichnung "Polyethylenglykol" bezieht sich auf flüssige oder feste Polymere der allgemeinen chemischen Formel H(OCH2CH2)nOH, worin n ≥ 4 ist. Es kann eine beliebige substituierte oder unsubstituierte PEG-Formulierung eingesetzt werden.
  • Die Bedeutung weiterer hierin verwendeter Terminologie sollte Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung verständlich sein.
  • Art der Sauerstoffzufuhr und des Sauerstoffverbrauchs
  • Wenngleich die erfolgreiche Verwendung der hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren nicht das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen der Sauerstoffzufuhr und des Sauerstoffverbrauchs voraussetzen, kann ein grundlegendes Wissen in Bezug auf einige dieser möglichen Mechanismen das Verständnis der folgenden Erörterungen unterstützen. Allgemein wird angenommen, dass die Kapillaren primär für die Versorgung der Gewebe mit Sauerstoff verantwortlich sind. Aktuelle Erkenntnisse deuten jedoch in Bezug auf Gewebe im Ruhezustand an, dass die Sauerstofffreisetzung etwa zu gleichen Teilen arteriolar und kapillar erfolgt. Das bedeutet, dass angenommen wird, dass Hämoglobin im arteriellen System etwa ein Drittel seines Sauerstoffgehalts im arteriolaren Netzwerk zuführt und ein Drittel in den Kapillaren, während der Rest die Mikrozirkulation über das Venensystem verlässt.
  • Die Arterien selbst stellen Orte der Sauerstoffnutzung dar. Die Arterienwand braucht beispielsweise Energie, um den Blutfluss durch die Konzentration gegen den vaskulären Widerstand zu regulieren. Demnach stellt die Arterienwand üblicherweise eine wichtige Stelle für die Sauerstoffdiffusion aus dem Blut dar. Es kann jedoch sein, dass derzeit existierende sauerstofftransportierende Zusammensetzungen (z. B. HBOCs) zu viel ihres Sauerstoffgehalts im arteriellen System freisetzen, wodurch eine selbstregulierende Reduktion der Kapillarperfusion erfolgt. Dementsprechend kann die Effizienz der Sauerstoffzufuhr eines Blutersatzprodukts dadurch beeinträchtigt werden, dass dieses eine zu hohe oder zu geringe Sauerstoffaffinität aufweist.
  • Die Rate des Sauerstoffverbrauchs durch die Gefäßwand, d. h. die Kombination des für mechanische Arbeit erforderlichen Sauerstoffs und des für biochemische Synthesevorgänge erforderlichen Sauerstoffs, kann durch Messung des Gradienten an der Gefäßwand bestimmt werden. Siehe z. B. Winslow et al. in "Advances in Blood Substitutes", S. 167–188, Birkhäuser (Hrsg.), Boston, Mass. (1997)). Die derzeit verfügbare Technologie ermöglicht präzise Messungen des Sauerstoffpartialdrucks in verschiedenen Gefäßen. Der gemessene Gradient verhält sich direkt proportional zur Rate des Sauerstoffverbrauchs durch das Gewebe in dem Bereich, in dem die Messung durchgeführt wurde. Solche Messungen zeigen, dass die Gefäßwand einen Grundsauerstoffverbrauch aufweist, der mit einem Anstieg von Entzündungen und Konstriktion ansteigt und durch Entspannung gesenkt wird.
  • Der Gefäßwandgradient verhält sich umgekehrt proportional zur Gewebeoxygenierung. Vaskokonstriktion steigert den Sauerstoffgradienten (Gewebestoffwechsel), während Vaskodilatation diesen senkt. Höhere Gradienten deuten darauf hin, dass mehr Sauerstoff von der Gefäßwand verbraucht wird, während weniger Sauerstoff für das Gewebe zur Verfügung steht. Es wird angenommen, dass dasselbe Phänomen auch im Bereich der Mikrozirkulation vorliegt.
  • Beziehung zwischen Vaskokonstriktion und Sauerstoffaffinität
  • Das Grundprinzip für die Entwicklung von HBOC mit hoher Sauerstoffaffinität beruht teilweise auf in der Vergangenheit durchgeführten Studien unter Einsatz von zellfreien Hämoglobinen als Alternative zu Transfusionen von roten Blutkörperchen. Einige der physiologischen Wirkungen dieser Lösungen sind weiterhin nicht vollständig geklärt. Davon ist die Neigung zu einer Hervorrufung von Vaskokonstriktion, die sich als Hypertension in Tieren und Menschen äußert, möglicherweise die kontroverseste (W. Amberson, "Clinical experience with hemoglobin-saline solutions", Science 106, 117–117 (1947)). (P. Keipert, A. Gonzales, C. Gomez, V. Macdonald, J. Hess und R. Winslow, "Acute changes in systemic blond pressure and urine Output of conscious rats following exchange transfusion with diaspirin-crosslinked hemglobin solution", Transfusion 33, 701–708 (1993)). Menschliches Hämoglobin, das zwischen den α-Ketten mit Bis-dibromsalicylfumarat vernetzt war (ααHb), wurde von der US-Armee als Modell-Ersatzprodukt für rote Zellen entwickelt, wurde aber von der Armee nicht länger verwendet, nachdem gezeigt wurde, dass es zu einem starken Anstieg der Lungenresistenz und der systemischen Gefäßresistenz kam (J. Hess, V. Macdonald, A. Murray, V. Coppes und C. Gomez, "Pulmonary and systemic hypertension alter hemoglobin administration", Blond 78, 356A (1991)). Von einer im Handel erhältlichen Version dieses Produkts kam man nach einer enttäuschenden klinischen Versuchen der Phase III ebenfalls ab (R. M. Winslow, "αα-Crosslinked hemoglobin: Was failure predicted by preclinical testing?", Vox sang 79, 1–20 (2000)).
  • Die Erklärung, die meistens für die durch zellfreies Hämoglobin hervorgerufene Vaskokonstriktion, angeführt wird, besteht darin, dass es leicht an den von Endothelzellen gebildeten Relaxationsfaktor, Stickstoffoxid (NO), bindet. Rekombinante Hämoglobine mit reduzierter Affinität für NO wurden erzeugt, die in "Top-load"-Ratten-Experimenten weniger hypertensiv zu sein scheinen (D. H. Doherty, M. P. Doyle, S. R. Curry, R. J. Vali, T. J. Fattor, J. S. Olson und D. D. Lemon, "Rate of reaction with nitric Oxide determines the hypertensive effect of cell-free hemoglobin", Nature Biotechnology 16, 672–676 (1998)). (D. D. Lemon, D. H. Doherty, S. R. Curry, A. J. Mathews, M. P. Doyle, T. J. Fattor und J. S. Olson, "Control of the nitric Oxide-scavenging activity of hemoglobin", Art Cells, Blond Subs., and Immob. Biotech. 24, 378 (1996)). Studien deuten jedoch darauf hin, dass die NO-Bindung nicht die einzige Erklärung für die Vaskoaktivität von Hämoglobin ist. Es wurde festgestellt, dass manche große Hämoglobin-Moleküle, wie z. B. die mit Polyethylenglykol (PEG) modifizierten, praktisch keine hypertensive Wirkung aufwiesen, auch wenn ihre NO-Bindungsraten jenen der stark hypertensiven ααHb entsprachen (R. J. Rohlfs, E. Bruner, A. Chiu, A. Gonzales, M. L. Gonzales, D. Magde, M. D. Magde, K. D. Vandegriff und R. M. Winslow, "Arterial blond pressure responses to cell-free hemoglobin solutions and the reaction with nitric Oxide", J. Biol. Chem. 273, 12128–12134 (1998)). Ferner wurde festgestellt, dass PEG-Hämoglobin außergewöhnlich wirksam zur Prävention der Folgen einer Blutung war, wenn es vor der Blutung als Austauschtransfusion verabreicht wurde (R. M Winslow, A. Gonzales, M. Magde, M. McCarthy, R. J. Rohlfs und K. D. Vandegriff, "Vascular resistance and the efficacy of red cell substitutes", J. Appl. Physiol. 85, 993–1003 (1998)).
  • Diese Schutzwirkung korrelierte damit, dass keine Hypertension auftrat, was andeutet, dass die Vaskokonstriktion für die enttäuschende Leistung vieler Produkte auf Hämoglobin-Basis verantwortlich ist, die bisher untersucht wurden. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde eine Hypothese zur Erklärung der Vaskokonstriktion als Alternative oder möglicherweise als Zusatz zu der Wirkung der NO-Bindung entwickelt. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, dass eine wesentliche Komponente der vaskoaktiven Wirkung von Hämoglobin in einer Reflexreaktion auf die Diffusion von Hämoglobin im zellfreien Raum besteht. Diese Hypothese wurde in einem In-vitro-Kapillarsystem getestet, und es wurde gezeigt, dass PEG-Hämoglobin, das eine reduzierte Diffusionskonstante aufweist, O2 auf sehr ähnliche Weise wie native rote Blutkörperchen transportierte (M. R. McCarthy, K. D. Vandegriff und R. M. Winslow, "The role of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-free hemoglobin: Implications for the design of hemoglobin-based oxygen carriers", Biophysical Chemistry 92, 103–117 (2001)). Man würde erwarten, dass die Sauerstoffaffinität eine Rolle bei dessen erleichterter Diffusion durch Hämoglobin im Plasmaraum spielt, da die Veränderung der Sättigung beim Übergang von Hämoglobin zu der Gefäßwand den Diffusionsgradienten des Hämoglobins selbst bestimmt.
  • Die Sauerstoffaffinität von zellfreiem Hämoglobin kann eine zusätzliche Rolle bei der Steuerung des Gefäßtonus spielen, da die Abgabe von O2 an Gefäßwände in den Arteriolen Vaskokonstriktion auslöst (L. Lindbom, R. Tuma und K. Arfors, "Influence of oxygen an perfusion capillary density and capillary red cell velocity in rabbit skeletal muscle", Microvasc. Res. 19, 197–208 (1980)). In der Hamsterhautfalte liegt der PO2 in solchen Gefäßen im Bereich von 20–40 Torr (2666–5333 Pa), wo die Sauerstoffgleichgewichtskurve normaler roter Zellen am steilsten ist (M. Intaglietta, P. Johnson und R. Winslow, "Microvascular and tissue oxygen distribution", Cardiovasc. Res. 32, 632–643 (1996)). Von einem theoretischen Standpunkt aus kann es wichtig sein, dass der P50 von zellfreiem Hämoglobin niedriger ist als der von roten Zellen (d. h. eine höhere O2-Affinität vorliegt), um die Freisetzung von O2 in arteriolaren Regulationsgefäßen zu verhindern.
  • Sauerstofftransportierende Komponente
  • Der Sauerstoffträger (d. h. die sauerstofftransportierende Komponente) ist ein Sauerstoffträger auf Hämoglobin-Basis oder HBOC. Das Hämoglobin kann nativ (unmodifiziert); durch eine chemische Reaktion, wie z. B. intra- oder intermolekulare Vernetzung, Polymerisation oder Hinzufügung von chemischen Gruppen (z. B. Polyalkylenoxiden oder anderen Addukten) modifiziert werden oder auf rekombinante Weise genetisch verändert werden. Menschliche α- und β-Globin-Gene wurden sowohl kloniert als auch sequenziert. Liebhaber et al., P.N.A.S. 77, 7054–7058 (1980); Marotta et al., J. Biol. Chem. 353, 5040–5053 (1977) (β-Globin-cDNA). Zusätzlich dazu wurden zahlreiche auf rekombinante Weise erzeugte, modifizierte Hämoglobine unter Einsatz von ortsgerichteter Mutagenese erzeugt, wenngleich berichtet wurde, dass diese "mutierten" Hämoglobinvarianten eine unerwünscht hohe Sauerstoffaffinität aufweisen. Siehe z. B. Nagai et al., P.N.A.S. 82, 7252–7255 (1985).
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht durch die Quelle des Hämoglobins eingeschränkt. Das Hämoglobin kann beispielsweise von Tieren und Menschen stammen. Bevorzugte Hämoglobin-Quellen für bestimmte Anwendungen sind Menschen, Kühe und Schweine. Zusätzlich dazu kann das Hämoglobin durch andere Verfahren, einschließlich chemischer Synthese und Rekombinationsverfahren, hergestellt werden. Das Hämoglobin kann zur Blutproduktzusammensetzung in freier Form zugesetzt werden oder kann in einem Vesikel, wie z. B. einem synthetischen Teilchen, einem Mikroballon oder einem Liposom, verkapselt sein. Bevorzugte sauerstofftransportierende Komponenten sollten stromafrei und endotoxinfrei sein. Veranschaulichende Beispiele für sauerstofftransportierende Komponenten sind in einer Reihe veröffentlichter US-Patente offenbart, einschließlich US-Patent Nr. 4.857.636 an Hsia; US-Patent Nr. 4.600.531 an Walder; US-Patent Nr. 4.061.736 an Morris et al.; US-Patent Nr. 3.925.344 an Mazur; US-Patent Nr. 4.529.719 an Tye; US-Patent Nr. 4.473.496 an Scannon; US-Patent Nr. 4.584.130 an Bocci et al.; US-Patent Nr. 5.250.665 an Kluger et al.; US-Patent Nr. 5.028.588 an Hoffman et al. und US-Patent Nr. 4.826.811 und US-Patent Nr. 5.194.590 an Sehgal et al.
  • Zusätzlich zu den zuvor angeführten Hämoglobin-Quellen wurde kürzlich festgestellt, dass Pferde-Hämoglobin bestimmte Vorteile als sauerstofftransportierende Komponente in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung aufweist. Ein Vorteil besteht darin, dass Pferdeblut, aus dem Pferde-Hämoglobin gereinigt werden kann, problemlos in kommerziellen Mengen verfügbar ist. Ein weiterer unerwarteter Vorteil besteht darin, dass Pferde-Hämoglobin chemische Eigenschaften aufweist, die seine Nützlichkeit in Blutersatzprodukten der vorliegenden Erfindung verbessern können.
  • Frühere Berichte haben gezeigt, dass Pferde-Hämoglobin schneller als menschliches Hämoglobin zu Methämoglobin autooxidiert, was es als Blutersatzkomponente weniger wünschenswert machen würde. Siehe z. B. J. G. McLean und I. M. Lewis, Research in Vet. Sci. 19, 259–262 (1975). Um die Autooxidation zu minimieren haben McLean und Lewis nach der Lyse der roten Blutkörperchen ein Reduktionsmittel, Glutathion, eingesetzt. Das Hämoglobin, das zur Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, erfordert jedoch, unabhängig davon, ob es sich bei der Hämoglobin-Quelle um Menschen oder Pferde handelt, keinen Einsatz eines Reduktionsmittels zur Prävention von Autooxidation nach der Lyse der roten Blutkörperchen.
  • In letzter Zeit wurde berichtet, dass Pferde-Hämoglobin eine Sauerstoffaffinität aufweist, die sich von der von menschlichem Hämoglobin unterscheidet. Siehe z. B. M. Mellegrini et al., Eur. J. Biochem. 268, 3313–3320 (2001). Ein solcher Unterschied würde gegen die Wahl von Pferde-Hämoglobin zur Herstellung von Blutersatzprodukten, die menschliches Hämoglobin nachahmen, sprechen. Bei Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wurde jedoch kein signifikanter Unterschied (weniger als 10%) in Bezug auf die Sauerstoffaffinität zwischen Konjugaten, die menschliches Hämoglobin, und jenen, die Pferde-Hämoglobin enthielten, beobachtet.
  • Dementsprechend ist Pferde-Hämoglobin im Gegensatz zu diesen scheinbar unerwünschten Eigenschaften in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit menschlichem Hämoglobin gleich- oder sogar höherwertig.
  • Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung weisen die HBOCs bei Messungen unter denselben Bedingungen eine Sauerstoffaffinität auf, die höher ist als jene von Vollblut, vorzugsweise doppelt so hoch wie die von Vollblut, oder alternativ dazu höher als die von stromafreiem Hämoglobin (SFH). In den meisten Fällen bedeutet das, dass die HBOC in dem Blutersatzprodukt eine P50 von weniger als 10 Torr (1333 Pa) aufweist, noch bevorzugter von weniger als 7 Torr (933 Pa). Im freien Zustand weist SFH einen P50 von etwa 15 Torr (2000 Pa) auf, während P50 von Vollblut etwa 38 Torr (3733 Pa) beträgt. Es wurde bereits früher vorgeschlagen, dass eine Steigerung der Sauerstoffaffinität und dadurch eine Senkung des P50 die Sauerstoffzufuhr zu Geweben verbessern kann, wenngleich impliziert wurde, dass ein P50, der niedriger ist als der von SFH, nicht annehmbar wäre. Siehe Winslow et al. in "Advances in Blond Substitutes", S. 167, Birkhäuser (Hrsg.), Boston, Mass. (1997) und US-Patent Nr. 6.054.427 . Dieser Vorschlag steht im Gegensatz zu der weit verbreiteten Annahme, dass modifizierte Hämoglobine für den Einsatz als Blutersatzprodukte eine nie drige Sauerstoffaffinität und einen P50 aufweisen sollten, der in etwa dem von Vollblut entspricht. Viele Forscher haben aus diesem Grund Pyridoxylphosphat eingesetzt, um den P50 von SFH von 10 Torr (1333 Pa) auf etwa 20–22 Torr (2666–2933 Pa) zu steigern, da pyridoxyliertes Hämoglobin Sauerstoff verglichen mit SFH leichter freisetzt.
  • Es gibt viele verschiedene wissenschaftliche Ansätze zur Herstellung von HBOCs mit hoher Sauerstoffaffinität (d. h. von jenen mit einem P50, der niedriger ist als der von SFH). In Studien wurden beispielsweise die Aminosäurereste identifiziert, die eine Rolle für die Sauerstoffaffinität spielen, wie z. B. B-93-Cystein, weshalb es jetzt leicht ist, ortsgerichtete Mutagenese zur Manipulation der Sauerstoffaffinität auf das gewünschte Maß durchzuführen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.661.124 . Viele andere Ansätze werden in US-Patent Nr. 6.054.427 erläutert.
  • Hämoglobinassoziierte Toxizität
  • Es ist bekannt, dass Hämoglobin Autooxidation erfährt, wenn es reversibel von der Eisen(II)-(Fe2+) in die Eisen(III)-(Fe3 +) oder Methämoglobin-Form übergeht. Wenn das passiert, wird Sauerstoff in Form eines Superoxidanions (O2 –) vom Oxyhämoglobin abgespalten. Das führt auch zu einer Destabilisierung des Häm-Globin-Komplexes und letztendlich zur Zersetzung der Globinketten. Es wird angenommen, dass sowohl die Bildung von Sauerstoffradikalen als auch die Proteinzersetzung eine Rolle bei der In-vivo-Toxizität von HBOCs spielen (K. D. Vandegriff, Blood Substitutes, Physiological Basis of Efficacy, S. 105–130, Winslow et al. (Hrsg.), Birkhäuser, Boston, Mass. (1995)).
  • Bei den meisten HBOCs besteht eine negative Korrelation zwischen der Sauerstoffaffinität und der Hämoglobinoxidation, d. h. je höher die Sauerstoffaffinität ist, desto geringer ist die Autooxidationsrate. Die Wirkung verschiedener Hämoglobinmodifikationen auf die Sauerstoffaffinität und die Autooxidationsrate ist jedoch nicht immer vorhersehbar. Zusätzlich dazu ist nicht viel über das optimale Gleichgewicht zwischen Sauerstoffaffinität und Autooxidationsrate bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft teilweise die unerwartete Erkenntnis, dass die hierin beschriebenen PEG-Hb-Konjugate sehr geringe Autooxidationsraten aufweisen. Bei Messung als Oxidationsrate sollte dieser Wert möglichst niedrig sein (d. h. 0,2% pro h für Gesamthämoglobin, noch bevorzugter 0,1% pro h für Gesamthämoglobin, bei Raumtemperatur für zumindest 3 h und noch bevorzugter zumindest 10 h). Die HBOCs der vorliegenden Erfindung bleiben demnach während der Verabreichung und/oder der Lagerung bei Raumtemperatur stabil.
  • Modifikationen der sauerstofftransportierenden Komponente
  • Die sauerstofftransportierende Komponente ist modifiziertes Hämoglobin, und bei der Modifikation von Hämoglobin handelt es sich um eine "Oberflächenmodifikation", d. h. die kovalente Bindung von chemischen Gruppen an die frei liegenden Aminosäureseitenketten an dem Hämoglobin-Molekül.
  • Die Modifikation erfolgt im Wesentlichen zur Steigerung der Molekülgröße von Hämoglobin, meistens durch die kovalente Bindung von Polymergruppierungen, wie z. B. synthetischen Polymeren, Kohlenhydraten, Proteinen und dergleichen. Im Allgemeinen sind synthetische Polymere zu bevorzugen.
  • Geeignete synthetische hydrophile Polymere umfassen unter anderem Polyalkylenoxid, wie z. B. Polyethylenoxid ((CH2CH2O)n), Polypropylenoxid ((CH(CH3)CH2O)n) oder Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Copolymere ((CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH2O)n). Weitere unverzweigte, verzweigte und gegebenenfalls substituierte synthetische Polymere, die geeignet wären, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • Meistens handelt es sich bei der an das Hämoglobin gebundenen Gruppe aufgrund der pharmazeutischen Annehmbarkeit und der kommerziellen Verfügbarkeit um Polyethylenglykol (PEG). PEGs sind Polymere der allgemeinen chemischen Formel H(OCH2CH2)nOH, worin n im Allgemeinen ≥ 4 ist. PEG-Formulierungen werden üblicherweise in Verbindung mit einer Zahl angeführt, die ihrem mittleren Molekulargewicht entspricht. PEG-200 weist beispielsweise ein mittleres Molekulargewicht von 200 auf, wobei das Molekulargewicht im Bereich von 190–210 liegen kann. PEGs sind im Handel in verschiedenen Formen verfügbar und in vielen Fällen voraktiviert und zur Konjugation an Proteine bereit erhältlich.
  • Ein wichtiger Aspekt der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Oberflächenmodifikation erfolgt, wenn sich das Hämoglobin im oxygenierten oder "R"-Zustand befindet. Dies kann leicht durchgeführt werden, indem das Hämoglobin vor der Konjugation mit der Atmosphäre äquilibrieren gelassen wird (oder alternativ dazu kann eine aktive Oxygenierung durchgeführt werden). Durch die Durchführung der Konjugation an das oxygenierte Hämoglobin wird die Sauerstoffaffinität des resultierenden Hämoglobins gesteigert. Ein solcher Schritt wird im Allgemeinen als kontraindiziert erachtet, da viele Forscher beschreiben, dass eine Desoxygenierung vor der Konjugation die Sauerstoffaffinität senkt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5.234.903 .
  • Wenngleich die Leistung von oberflächenmodifizierten Hämoglobinen in vielerlei Hinsicht nicht von der Bindung zwischen dem Hämoglobin und dem Modifikator (z. B. PEG) abhängt, wird angenommen, dass steifere Linker, wie z. B. ungesättigte aliphatische oder aromatische C1-C6-Linkersubstituenten, die Herstellung und/oder Eigenschaften der Konjugate im Vergleich mit jenen, die flexiblere und leichter deformierbare Bindungsformen aufweisen, verbessert werden können.
  • Die Anzahl an PEG, die an das Hämoglobin-Molekül zu binden ist, variiert in Abhängigkeit von der Größe des PEG. Die Molekülgröße des resultierenden modifizierten Hämoglobins sollte jedoch ausreichend groß sein, um zu verhindern, dass das Molekül von den Nieren ausgeschieden wird, um die gewünschte Halbwertszeit zu erzielen. Blumenstein et al. haben bestimmt, dass diese Größe bei einem Molekulargewicht von mehr als 84.000 erreicht wird (Blumenstein et al. in "Blond Substituents and Plasma Expanders", S. 205–212, Alan R. Liss (Hrsg.), New York, New York (1978)). Darin konjugierten die Autoren Hämoglobin an Dextran mit unterschiedlichem Molekulargewicht. Sie berichteten, dass ein Konjugat von Hämoglobin (mit einem Molekulargewicht von 64.000) und Dextran (mit einem Molekulargewicht von 20.000) langsam aus dem Blutkreislauf und vernachlässigbar durch die Nieren gereinigt wurde, aber das eine Steigerung des Molekulargewichts über 84.000 die Reinigungskurven nicht veränderte. Dementsprechend weisen HBOCs, wie von Blumenstein et al. bestimmt, vorzugsweise ein Molekulargewicht von zumindest 84.000 auf.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem HBOC um ein "MalPEG", was für ein Hämoglobin steht, an das maleinimidylaktiviertes PEG konjugiert wurde. Ein solches MalPEG kann ferner durch folgende Formel bezeichnet werden: Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m Formel Iworin Hb sich auf tetrameres Hämoglobin bezieht, S eine Oberflächen-Thiolgruppe ist, Y die kovalente Succinimid-Bindung zwischen Hb und Mal-PEG ist, R eine Alkyl-, Amid-, Carbamat- oder Phenylgruppe ist (in Abhängigkeit von der Quelle des Rohmaterials und dem chemischen Syntheseverfahren), [O-CH2-CH2]n für die Oxyethylen-Einheiten steht, die das Grundgerüst des PEG-Polymers bilden, und O-CH3 die endständige Methoxygruppe ist.
  • Kristalloidkomponente
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Blutersatzprodukt auch ein Kristalloid umfassen. Bei der Kristalloidkomponente kann es sich um ein beliebiges Kristalloid handeln, das in Form der Blutersatzzusammensetzung vorzugsweise in der Lage ist, eine Osmolarität von mehr als 800 mOsm/l zu erzielen, d. h. den Blutersatz "hypertonisch" zu machen. Beispiele für geeignete Kristalloide und deren Konzentration im Blutersatzprodukt umfassen z. B. 3% NaCl, 7% NaCl, 7,5% NaCl und 7,5% NaCl in 6% Dextran. Noch bevorzugter weist das Blutersatzprodukt eine Osmolarität zwischen 800 und 2400 mOsm/l auf. Es wurde bereits über die Verwendung von auf rekombinante Weise hergestellten Hämoglobinen in Lösungen mit einer Osmolarität zwischen 300 und 800 mOsm/l berichtet, die ferner ein Kolloid (d. h. ein Molekül, dass weniger diffundierbar ist als Dextrose) umfassen. Siehe z. B. US Patent Nr. 5.661.124 . Die Lehre dieses Patents führt jedoch weg von der Erzeugung von Blutersatzprodukten mit einer Osmolarität über 800 und schlagen vor, dass die Hämoglobinkonzentration zwischen 6 und 12 g/dl betragen sollte. Im Gegensatz dazu ermöglicht der effiziente Sauerstofftransport durch Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung den Einsatz geringerer Hämoglobinkonzentrationen, wie z. B. von über 6 g/dl oder sogar von über 4 g/dl. Wenn das Blutersatzprodukt ferner ein Kristalloid umfasst und hypertonisch ist, können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gegenüber anderen Blutersatzzusammensetzungen, die eine Kolloidkomponente umfassen, verbesserte Funktionalität für das Wiedererlangen hämodynamischer Parameter aufweisen. Hoch hypertonische Kristalloidinfusionen mit geringem Volumen (z. B. 1–10 ml/kg) stellen bedeutende Vorteile bei der raschen und anhaltenden Wiederherstellung annehmbarer hämodynamischer Parameter bei kontrollierten Blutungen bereit (siehe z. B. R. J. Przybelski, E. K. Daily und M. L. Birnbaum, "The pressor effect of hemoglobin – good or bad?" in R. M. Winslow, K. D. Vandegriff und M. Intaglietta (Hrsg.), Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and Medical Challenges, 71–85, Birkhäuser, Boston (1997)). Hypertonische kristalloide Lösungen allein stellen jedoch den Sauerstofftransport im Gehirn nicht angemessen wieder her. Siehe D. Prough et al., "Effects of hypertonic saline versus Ringer's solution an cerebral oxygen transport during resuscitation from hemorrhagic shock", J. Neurosurg. 64, 627–632 (1986).
  • Formulierung
  • Die Blutersatzprodukte der vorliegenden Erfindung werden durch Vermischen des Sauerstoffträgers und anderer optionaler Exzipienten mit einem geeigneten Verdünner hergestellt. Wenngleich die Konzentration des Sauerstoffträgers im Verdünner in Abhängigkeit von der Anwendung und insbesondere bezogen auf die erwartete Verdünnung nach der Verabreichung variieren kann, ist es in bevorzugten Ausführungsformen aufgrund der anderen Merkmale der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die eine verbesserte Sauerstoffzufuhr und therapeutische Wirkung bereitstellen, üblicherweise nicht erforderlich, dass die Konzentration mehr als 6 g/dl beträgt, wobei sie noch bevorzugter zwischen 0,1 und 4 g/dl liegt.
  • Geeignete Verdünner (d. h. solche, die für eine intravenöse Injektion pharmazeutisch annehmbar sind) umfassen unter anderem Proteine, Glykoproteine, Polysaccharide und andere Kolloide. Diese Ausführungsform sollen nicht auf einen speziellen Verdünner beschränkt sein. Der Verdünner soll demnach wässrige, zellfreie Lösungen von Albumin, anderen Kolloiden oder anderen nicht sauerstofftransportierenden Komponenten umfassen, wobei die wässrige Lösung eine Viskosität von zumindest 2,5 cp aufweist. In manchen bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Viskosität der Lösung zwischen 2,5 und 4 cp. Es wird erwogen, dass die vorliegende Erfindung auch Lösungen mit einer Viskosität von 6 cp oder mehr umfasst.
  • Anwendungen
  • A. Klinische Anwendungen
  • Es wird erwogen, dass die vorliegende Erfindung und ihre Ausführungsformen in Anwendungen nützlich sind, bei denen eine rasche Wiederherstellung des O2-Spiegels oder eine Steigerung des O2-Spiegels oder der Ausgleich des O2-Spiegels klinisch indiziert sind. Siehe z. B. US-Patent Nr. 6.054.427 . Die zahlreichen Situationen, in denen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Anwendung finden, umfassen folgende:
  • Traumata.
  • Ein akuter Verlust von Vollblut kann zu einer Flüssigkeitsverlagerung aus dem Interstitial- und Intrazellularraum führen, um das verlorene Blutvolumen auszugleichen, während Blut von den weniger wichtigen Organen, einschließlich Haut und Eingeweide, abgezogen wird. Das Abziehen von Blut aus Organen senkt oder eliminiert den O2-Spiegel in diesen Organen und verursacht das fortschreitende Absterben von Gewebe. Es wird erwogen, dass die rasche Wiederherstellung des O2-Spiegels möglicherweise zu einer deutlich verbesserten Rettung von Gewebe bei Patienten mit akutem Blutverlust führt.
  • Ischämie.
  • Bei einer Ischämie wird einem bestimmten Organ (oder bestimmten Organen) kein Sauerstoff zugeführt. Kleine Teile der Organe, die als Infarkte bekannt sind, beginnen in Folge des O2-Mangels abzusterben. Eine rasche Wiederherstellung des O2-Spiegels ist wesentlich, um die Infarktbildung in kritischen Geweben einzudämmen. Leiden, die zu einer Ischämie führen können, umfassen Herzinfarkt, Schlaganfall oder zerebrovaskuläre Traumata.
  • Blutverdünnung.
  • Bei dieser klinischen Anwendung ist das Blutersatzprodukt erforderlich, um Blut zu ersetzen, das vor einem chirurgischen Eingriff abgenommen wurde. Es wird erwogen, dass dem Patienten Blut abgenommen wird, um zu verhindern, dass nach dem Eingriff allogene Transfusionen erforderlich sind. Bei dieser Anwendung wird das Blutersatzprodukt verabreicht, um den O2-Spiegel des abgenommenen Eigenbluts auszugleichen (oder zu ersetzen). Dies ermöglicht die Verwendung des abgenommenen Eigenbluts für Transfusionen, die während des Eingriffs oder danach erforderlich sind. Ein Eingriff, bei dem eine Blutabnahme vor dem Eingriff erforderlich ist, ist ein Herz-Lungen-Bypass-Verfahren.
  • Septischer Schock.
  • Bei einer fulminant verlaufenden Sepsis werden manche Patienten trotz massiver Flüssigkeitstherapie und Behandlung mit Vasokonstringenzien hypertensiv. In diesem Fall führt die Überproduktion von Stickoxid (NO) zu einem gesenkten Blutdruck. Aus diesem Grund ist Hämoglobin annähernd das ideale Mittel zur Behandlung dieser Patienten, da Hämoglobin NO mit einer Avidität bindet, die mit der von O2 vergleichbar ist.
  • Krebs.
  • Die Zufuhr von O2 zu dem hypoxischen inneren Kern einer Tumormasse steigert deren Sensitivität gegenüber Strahlen- und Chemotherapie. Da die Mikrogefäße eines Tumors anders als jene von anderen Geweben ist, erfordert die Sensibilisierung durch eine Steigerung des O2-Spiegels, dass O2 innerhalb des hypoxischen Kerns zugeführt wird. Anders ausgedrückt sollte der P50 sehr niedrig sein, um eine verfrühte O2-Freisetzung zu verhindern, wodurch der O2-Spiegel gesteigert wird, um eine optimale Sensibilisierung des Tumors in Bezug auf folgende Strahlen- und Chemotherapiebehandlungen sicher zu stellen.
  • Chronische Anämie.
  • Bei diesen Patienten ist die Erneuerung von verlorenem oder verstoffwechseltem Hämoglobin beeinträchtigt oder überhaupt nicht vorhanden. Es wird erwogen, dass das Blutersatzprodukt den gesenkten O2-Spiegel in den Patienten wirksam wiederherstellen oder steigern muss.
  • Sichelzellenanämie.
  • Bei Sichelzellenanämie wird der Patient durch einen Rückgang des O2-Spiegels, der während des Sichelbildungsprozesses auftritt, sowie eine hohe Umsatzrate der roten Blutkörperchen entkräftet. Der Sichelbildungsprozess wird durch den PO2 beeinflusst, wobei die Sichelbildungsrate umso höher ist, desto niedriger der PO2 ist. Es wird erwogen, dass ein ideales Blutersatzprodukt den O2-Spiegel im Patienten während einer Sichelbildungskrise wieder in den Normalbereich bringen würde.
  • Kardioplegie.
  • Bei bestimmten Herzeingriffen wird das Herz durch geeignete Elektrolytlösungen und eine Reduktion der Körpertemperatur des Patienten zum Stillstand gebracht. Durch eine Reduktion der Temperatur wird der P50 deutlich gesenkt, wodurch das Freisetzen von O2 unter herkömmlichen physiologischen Bedingungen möglicherweise verhindert wird. Es wird erwogen, dass durch die Wiederherstellung des O2-Spiegels Gewebeschädigungen und Todesfälle während solcher Verfahren potentiell reduziert werden können.
  • Hypoxie.
  • Soldaten, Menschen, die sich in großen Höhen aufhalten, und Weltklasseathleten unter extremen Bedingungen können aufgrund der Einschränkung der O2-Extraktion aus der Luft in der Lunge unter einem gesenkten O2-Spiegel leiden. Durch die eingeschränkte O2-Extraktion wird auch der O2-Transport eingeschränkt. Es wird erwogen, dass ein Blutersatzprodukt den O2-Spiegel bei solchen Individuen wiederherstellen oder steigern könnte.
  • Organperfusion.
  • Wenn ein Organ ex vivo aufbewahrt wird, ist die Aufrechterhaltung des O2-Gehalts wesentlich, um die strukturelle und zelluläre Integrität zu bewahren und die Infarktbildung zu minimieren. Es wird in Betracht gezogen, dass ein Blutersatzprodukt den O2-Bedarf für ein solches Organ erhalten könnte.
  • Zellkultur.
  • Der Bedarf in diesem Fall stimmt praktisch mit der der Organperfusion überein, nur dass die O2-Verbrauchsrate höher sein kann.
  • Blutbildung.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass das Blutersatzprodukt als Quelle für Häm und Eisen zur Verwendung in der Synthese von neuem Hämoglobin während der Blutbildung dient.
  • B. Veterinärmedizinische Anwendungen
  • Die vorliegende Erfindung kann auch bei Tieren angewandt werden. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können bei Haustieren, wie z. B. Vieh und Heimtieren (z. B. Hunden, Katzen, Pferden, Vögeln, Reptilien), sowie anderen Tieren in Aquarien, Zoos, Ozeanarien und anderen Einrichtungen, die Tiere beherbergen, eingesetzt werden. Es wird in Betracht gezogen, dass die vorliegende Erfindung bei der Notfallbehandlung von Haustieren und Wildtieren, die aufgrund einer Verletzung, einer hämolytischen Anämie etc. an Blutverlust leiden, Anwendung findet. Es wird beispielsweise erwogen, dass die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Situationen, wie z. B. infektiöser Anämie bei Pferden, infektiöser Anämie bei Katzen, hämolytischer Anämie aufgrund von Chemikalien und anderen physikalischen Mitteln, bakteriellen Infektionen, Faktor-IV-Fragmentierung, Hyperspleniusmus und Hypermegalie, dem hämorrhagischen Syndrom bei Geflügel, hypoplastischer Anämie, aplastischer Anämie, idiopathischer immunhämolytischer Leiden, Eisenmangel, isoimmunhämolytischer Anämie, mikroangiopathischer hämolytischer Anämie, Parasitismus etc., nützlich sind. Insbesondere findet die vorliegende Erfindung in Bereichen Anwendung, in denen Blutspender für Tiere selten sind und/oder exotische Spezies schwierig zu finden sind.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Erzeugung von stromafreiem Hämoglobin
  • Schritt 1 – Beschaffung überalterter roter Blutkörperchen
  • Überalterte, gepackte rote Blutkörperchen wurden von einer kommerziellen Quelle bezogen, wie z. B. der San Diego Blood Bank oder dem Amerikanischen Roten Kreuz. Vorzugsweise erhält man das überalterte Material nicht mehr als 45 Tage nach der Blutabnahme. Gepackte RBCs (pRBCs) werden bis zu ihrer Weiterverarbeitung bei 4 ± 2°C (1–7 Tage lang) gelagert. Alle Einheiten werden vor der Verwendung in Bezug auf Virusinfektionen gescreent und einem Nukleinsäuretest unterzogen.
  • Schritt 2 – Poolen von überaltertem Blut
  • Gepackte rote Blutkörperchen werden in einem sterilen Gefäß in einer sterilen Einrichtung gepoolt. Das Volumen der gepackten roten Blutkörperchen wird notiert, und die Hämoglobinkonzentration wird unter Einsatz eines im Handel erhältlichen CO-Oximeters oder eines anderen auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Verfahrens bestimmt.
  • Schritt 3 – Leukodepletion
  • Leukodepletion (d. h. die Entfernung der weißen Blutkörperchen) wird mittels Membranfiltration durchgeführt. Die anfängliche und die endgültige Leukozytenzahl werden zur Überprüfung der Effizienz dieses Verfahrens herangezogen.
  • Schritt 4 – Zelltrennung und Zellwaschung
  • Rote Blutkörperchen werden mit 6 Volumina 0,9% Natriumchlorid gewaschen. Das Verfahren wird bei 4 ± 2°C durchgeführt. Die gewaschenen Zellen werden analysiert, um die Entfernung von Plasmakomponenten durch einen spektralphotometrischen Test auf Albumin zu verifizieren.
  • Schritt 5 – Lyse von roten Blutkörperchen und Entfernung der Zellreste
  • Gewaschene rote Blutkörperchen werden zumindest 4 h lang oder über Nacht bei 4 ± 2°C unter Rühren und unter Einsatz von 6 Volumina Wasser lysiert. Das Lysat wird in der Kälte zur Reinigung von Hämoglobin verarbeitet. Das erfolgt durch Verarbeitung des Lysats durch eine 0,16-μm-Membran. Gereinigtes Hämoglobin wird in einem sterilen depyrogenierten Gefäß gesammelt. Alle Schritte in diesem Verfahren werden bei 4 ± 2°C durchgeführt.
  • Schritt 6 – Virusentfernung
  • Die Virusentfernung wird mittels Ultrafiltration bei 4 ± 2°C durchgeführt.
  • Schritt 7 – Einengen und Lösungsmittelaustausch
  • Das aus dem Lysat und durch die Ultrafiltration gereinigtes Hämoglobin wird in Ringer-Lactat (RL) oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) unter Einsatz einer 10-kD-Membran ausgetauscht. Das Hämoglobin wird dann unter Einsatz derselben Membran auf eine Endkonzentration von 1,1–1,5 mM (in Tetramer) eingeengt. 10 bis 12 Volumina RL oder PBS werden für den Lösungsmittelaustausch eingesetzt. Dieses Verfahren erfolgt bei 4 ± 2°C. Der pH der in RL hergestellten Lösung beträgt 7,0 bis 7,6.
  • Schritt 8 – Sterilfiltration
  • Hämoglobin in PBS oder Ringer-Lactat (RL) wird durch eine 0,45- oder 0,2-μm-Einweg-Filterkapsel sterilfiltriert und bei 4 ± 2°C gelagert, bevor die chemische Modifikationsreaktion durchgeführt wird.
  • Weitere Verfahren zur Reinigung von Hämoglobin sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Zusätzlich dazu ist der Einsatz eines Reduktionsmittels (z. B. Glutathion oder eines anderen thiolhältigen Reduktionsmittels) zur Prävention von Autooxidation nach der Zelllyse üblicherweise nicht erforderlich.
  • Beispiel 2
  • Modifikation von stromafreiem Hämoglobin
  • Schritt 1 – Thiolierung
  • Die Thiolierung wird unter Einsatz eines 10fachen molaren Überschusses an Iminothiolan in Bezug auf Hämoglobin 4 h lang bei 4 ± 2°C unter kontinuierlichem Rühren durchgeführt.
  • Reaktionsbedingungen:
    • – 1 mM Hämoglobin (Tetramer) in RL (pH 7,0–7,5) oder PBS (pH 7,4)
    • – 10 mM Iminothiolan in RL (pH 7,0–7,5) oder PBS (pH 7,4)
  • Das Verhältnis von SFH:Iminothiolan von 1:10 und die Reaktionsdauer wurden optimiert, um die Anzahl der PEGylierten Thiolgruppen zu maximieren und die Produktheterogenität zu minimieren.
  • Schritt 2 – PEGylierung von thioliertem Hämoglobin
  • Thioliertes Hämoglobin wird unter Einsatz eines 20fachen molaren Überschusses an Mal-PEG (mit einem Alkyl- oder Phenyllinker) bezogen auf die Ausgangskonzentration von tetramerem Hämoglobin PEGyliert. Das Hämoglobin wird zunächst mit der Atmosphäre äquilibrieren gelassen, um es zu oxygenieren. Die Reaktion erfolgt 2 h lang bei 4 ± 2°C unter kontinuierlichem Rühren.
  • Reaktionsbedingungen:
    • – 1 mM thioliertes Hämoglobin in RL oder PBS (pH 7,4)
    • – 20 mM Mal-PEG in RL oder PBS (pH 7,4)
  • Schritt 3 – Entfernung von nicht umgesetzten Reagenzien
  • PEGyliertes Hb wird durch eine 70-kD-Membran geleitet, um überschüssige, nichtumgesetzte Reagenzien oder Hämoglobin zu entfernen. Eine 20-Volumina-Filtration wird durchgeführt, um die Entfernung nicht umgesetzter Reagenzien sicherzustellen, wobei diese durch eine Größenausschlusschromatographie bei 540 nm und 280 nm überprüft wird. Die Proteinkonzentration wird auf 4 g/dl verdünnt. Der pH wird unter Einsatz von 1 N NaOH auf 7,3 ± 0,3 angepasst.
  • Schritt 4 – Sterilfiltration
  • Das MalPEG-Hb-Endprodukt wird unter Einsatz einer 0,2-μm-Einwegkapsel sterilfiltriert und in einem sterilen depyrogenierten Gefäß bei 4 ± 2°C gesammelt.
  • Schritt 5 – Formulierung von MalPEG-Hb
  • PEGyliertes Hb wird auf 4 g/dl verdünnt, der pH auf 7,4 ± 0,2 eingestellt.
  • Schritt 6 – Steriles Abfüllen
  • Die endgültige Blutersatzzusammensetzung wird sterilfiltriert (0,2 μm) und je nach Gewicht in sterile Glasphiolen aliquotiert und mit einem sterilen Gummiseptum mit Crimpdichtung unter einer Laminarströmungshaube verschlossen und bis zu ihrer Verwendung bei –80°C gelagert.
  • Beispiel 3
  • Physiochemische Analyse von MalPEG-Hb
  • Methode der physiochemischen Analyse
  • Die Homogenität und Molekülgröße des MalPEG-Hb-Blutersatzprodukts werden mittels Flüssigkeitschromatographie (LC) charakterisiert. Analytische LC wird eingesetzt, um die Homogenität des PEGylierten Hämoglobins und das Ausmaß der Entfernung von nichtumgesetztem Mal-PEG zu bewerten. Das Absorptionsvermögen bei 540 nm wird herangezogen, um das Hämoglobin zu bewerten und löst PEGyliertes Hämoglobin von nicht umgesetztem Hämoglobin anhand der Peak-Position auf. Das Absorptionsvermögen bei 280 nm wird herangezogen, um PEGyliertes Hämoglobin von freiem MalPEG, das aufgrund der Ringstrukturen in MalPEG im ultravioletten (UV-)Spektrum absorbiert, aufzulösen.
  • Optische Spektren werden unter Einsatz eines Rapid-Scanning-Dioden-Array-Spektralphotometers (Milton Roy 2000 oder Hewlett Packard Modell 8453) im Soret- und sichtbaren Bereich aufgenommen, um die Hämoglobinkonzentration und den Anteil an Methämoglobin durch eine Mehrkomponentenanalyse zu analysieren (K. D. Vandegriff und R. E. Shrager, Evaluation of oxygen equilibrium binding to hemoglobin by rapid-scanning spectrophotometry and singular value decomposition., Meth. Enzymol. 232, 460–485 (1994)).
  • Die MalPEG-Hb-Konzentration und der Methämoglobin-Anteil werden unter Einsatz eines CO-Oximeters bestimmt. Die Viskosität wird unter Einsatz eines Rheometers bestimmt. Der kolloidale osmotische Druck wird unter Verwendung eines Kolloid-Osmometers ermittelt. Sauerstoffbindungsparameter werden anhand der Sauerstoffgleichgewichtskurven bestimmt.
  • Die bevorzugten Anforderungen für die Blutersatzzusammensetzung sind nachstehend in Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1
    Test Anforderung
    Hämoglobin-Konzentration (g/dl) 4,2 ± 0,2
    Methämoglobin (%) < 10
    pH 7,4 ± 0,4
    Leitfähigkeit (mS/cm) 12 ± 4
    Endotoxin (EU/ml) < 0,5
    FPLC-Retentionszeit (min) 43 ± 3
    FPLC-Peakbreite bei halber Höhe (min) 6 ± 2
    Viskosität (cp) 2,5 ± 1,0
    COP (mmHg (Pa)) 50 ± 20 (6666 ± 2666)
    P50 (Torr (Pa)) 6 ± 2 (800 ± 267)
    Hillscher Index (bei p50) 1,2 ± 0,5
    Sterilität Mindestanforderung erfüllen
  • Anzahl der PEGylierten Stellen an MalPEG-Hb
  • Für die Oberflächenmodifikation handelt es sich bei der Zahl "m" in Formel I um den Parameter, der die Anzahl der an die Oberfläche des Hämoglobins gebundenen PEG-Polymere bestimmt. Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m Formel I
  • Um diese Zahl zu bestimmen wird ein kolorimetrischer Dithiopyridin-Test (R. Ampulski, V. Avers und S. Morell, Determination of the reactive sulfhydryl groups in heure Proteins with 4,4'-dipyridinedisulfide, Biochem. Biophys. Acta, 163–169 (1969)) eingesetzt, um die Anzahl der verfügbaren Thiolgruppen auf der Oberfläche des Hb-Tetramers vor und nach dem Thiolieren und dann erneut nach dem Hb-PEGylieren zu messen. Menschliches Hämoglobin enthält 2 intrinsische reaktive Thiolgruppen an den β93-Cys-Resten, was durch die Dithiopyridin-Reaktion bestätigt wird. Nach dem Thiolieren von SFH bei einem SFH:Iminothiolan-Verhältnis von 1:10 steigt die Anzahl der reaktiven Thiolgruppen bezogen auf die Dithiopyridin-Reaktion von 2 auf 6 Thiole. Nach der PEGylierungsreaktion sinkt die Anzahl der reaktiven Thiolgruppen auf 1,3. Das deutet darauf hin, dass es 4–5 PEGylierte Stellen an MalPEG-Hb gibt.
  • Größenausschlusschromatographie von MalPEG-Hb gegen SFH
  • FPLC wird zur Analyse des MalPEG-Hb-Endprodukts durchgeführt. Typische Chromatogramme von MalPEG-Hb im Vergleich mit unmodifiziertem SFH sind in 1 dargestellt. Die Retentionszeit für SFH beträgt etwa 57 min. Die Retentionszeit für MalPEG-Hb beträgt etwa 44 min.
  • Physikalische und chemische Eigenschaften von MalPEG-Hb
  • Die physikalischen Eigenschaften von MalPEG-Hb im Vergleich mit Blut und unmodifiziertem menschlichem Hämoglobin (SFH) sind nachstehend in Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2
    Blut SFH MalPEG-Hb
    P50 (Torr (Pa)) 28 (3733) 15 (2000) 5 (667)
    N50 (Hillscher Index) 2,9 2,9 1,2
    Bohr-Effekt (Δlog p50/ΔpH) - –0,46 –0,20
    Viskosität (cp)1 4,0 0,9 2,5
    COP (mmHg1 (Pa)) 27 (3600) 16 (2133) 50 (6666)
    MW (kD)2 N/A 65 90
    Molekülradius (nm) 4000 3,22 9
    • 1 Bei 15 g/dl für Vollblut und etwa 4 g/dl für Hämoglobinlösungen bestimmt.
    • 2 Mittels COP-Messungen und FPLC bestimmt.
  • Sauerstoffaffinität
  • Hämoglobin-Sauerstoff-Gleichgewichtsbindungskurven wurden wie zuvor beschrieben gemessen (K. D. Vandegriff, R. K. Rohlfs, M. D. Magde und R. M Winslow, Hemoglobin oxygen curves measured during enzymatic oxygen consumption., Anal. Biochem. 256, 107–116 (1998)). MalPEG-Hb weist eine hohe Sauerstoffaffinität (P50 = 5 mmHg) (666 Pa) und eine geringe Kooperativität (n50 = 1,0–1,4) auf. 2 zeigt veranschaulichende Kurven, die stromafreie Hämoglobin-(SFH-) und MalPEg-Hb-Lösungen vergleichen.
  • Viskosität
  • Diese Lösungseigenschaft von MalPEG-Hb liegt aufgrund der starken Wechselwirkungen zwischen Polyethylenglykolketten und Lösungsmittel-Wasser-Molekülen vor.
  • Es wird angenommen, dass dies aus zwei Gründen eine wichtige Eigenschaft von Blutersatzprodukten ist: 1) eine höhere Viskosität senkt die Diffusionskonstante von PEG-Hb-Molekülen und gasförmigen Ligandenmolekülen, die im Lösungsmittel diffundieren, und 2) eine höhere Viskosität steigert die Scherbeanspruchung, wenn die Lösung gegen die Endothelwand fließt, was zu einer Freisetzung von Vaskodilatanzien führt, um der Vaskokonstriktion entgegenzuwirken. Wie in Tabelle 2 dargestellt beträgt die Viskosität der MalPEG-Hb-Lösung 2,5 cp.
  • Kolloidaler osmotischer Druck (COP)
  • Der COP der Hämoglobinlösungen, die unmodifiziertes, intra- und intermolekular vernetztes oder PEG-oberflächenkonjugiertes Hämoglobin enthalten, wurde gemessen, um ihre makromolekularen Lösungseigenschaften zu bestimmen (K. D. Vandegriff, R. J. Rohlfs und R. M. Wislow, "Colloid osmotic effects of hemoglobin-based oxygen carriers" in R. M. Winslow, K. D. Vandegriff und M. Intaglia (Hrsg.), Advances in Blood Substitutes – Industrial Opportunities and Medical Challenges, S. 207–232, Birkhäuser, Boston (1997)). Tetramere Hämoglobine weisen ein fast ideales Lösungsverhalten auf, während an PEG konjugierte Hämoglobine eine deutlich höhere kolloidale osmotische Aktivität und kein ideales Lösungsverhalten aufweisen (K. D. Vandegriff, M. McCarthy, R. J. Rohlfs und R. M Winslow, "Colloid osmotic properties of modified hemoglobins: chemically cross-linked versus polyethylene glycol surface-conjugated." in Biophys. Chem. 69, 23–30 (1997)). Wie in Tabelle 2 angeführt beträgt der COP der MalPEG-Hb-Lösung 50 mmHg (6666 Pa).
  • Stabilität
  • Die Stabilität von Hämoglobinlösungen, die PEG-oberflächenkonjugiertes Hämoglobin enthalten, wurde durch die Untersuchung der Autooxidationsrate bestimmt. Bei Raumtemperatur stieg die Autooxidation von MalPEG-Hb in 10 h, wie in 5 dargestellt, von etwa 5% MetHb auf 5,5% MetHb. Die Autooxidationsrate von MalPEG-Hb betrug 0,05% pro h.
  • Beispiel 4
  • Vergleich von modifizierten Hämoglobinen mit unterschiedlichen P50-Werten Die Rolle der Sauerstoffaffinität für die Wirksamkeit von zellfreiem Hämoglobin unter Verwendung von durch die Konjugation an Polyoxyethylen (POE) modifiziertem Hämoglobin ist von besonderem Interesse bei der Untersuchung der Wirksamkeit solcher Materialien als Blutersatzprodukte. Diese Modifikation, die erstmals von Iwashita und Mitarbeitern beschrieben wurde (K. Ajisaka und Y. Iwashita, "Modification of human hemoglobin with polyethylen glycol: A new candidate for blond substitute", BBRC 97, 1076–1081 (1980)), weist weiterhin eine hypertensive Wirkung auf, und es wurde festgestellt, dass sie bei der Behandlung von septischen Schocks wirksam ist. Als Teil der Herstellung dieses Produkts wurde Hämoglobin mit Pyridoxal-5-phosphat (PLP) umgesetzt, um den P50 zu steigern, damit dieser annähernd dem Wert von menschlichem Blut entspricht. Demnach war es möglich, zwei Lösungen von POE-modifiziertem Hämoglobin herzustellen, eine mit und eine ohne vorhergehende Modifikation mit PLP. Diese Lösungen waren mit Ausnahme ihrer P50-Werte identisch, und sie wurden in Bezug auf ihre Fähigkeit getestet, physiologische Funktionen in Ratten während einer schweren Blutung (Verlust von 60% des Blutvolumens) zu unterstützen.
  • Materialien und Verfahren:
  • Blutersatzprodukte
  • Die modifizierten Hämoglobinlösungen, mit oder ohne PLP-Modifikation, zur Bildung von "PHP" wurden wie obenstehend in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
  • Tiere
  • Für diese Untersuchung wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten eingesetzt. Der systolische und der diastolische Druck wurden während der Studie überwacht; der Maximal- und Minimaldruck und der mittlere Blutdruck (MAP) waren jeweils diastoli sche +1/3 (systolische-diastolische) Werte. Der dP/dt wurde für jeden Druckzyklus anhand des maximalen positiven Anstiegs berechnet. Mittelwerte von Herzfrequenz, systolischem Druck, diastolischem Druck, mittlerem Blutdruck, Puls und dP/dt wurden für jede Minute an Daten berechnet.
  • Blutgase, hämatologische und Lactatmessungen
  • Der arterielle pH-, PCO2- und PO2-Wert wurden in einer Blutgasanalysevorrichtung unter Einsatz von 100 μl heparinisierten Blutproben gemessen. Milchsäure wurde in arteriellem Blut unter Einsatz einer Lactat-Analysevorrichtung gemessen. Der Gesamt-CO2-Wert, Standard-Bicarbonat (HCO3) und Basenüberschuss (BE) wurden anhand von PO2, pH und Hämoglobinkonzentration unter Verwendung von bereits beschriebenen Algorithmen berechnet (R. Winslow, "A model for red cell O2 uptake", Int. J. Clin. Monit. Comput. 2, 81–93 (1985)). Das Gesamthämoglobin und das Plasmahämoglobin wurden jeweils unter Verwendung von im Handel erhältlichen Geräten gemessen. Der Hämatokrit wurde unter Einsatz von arteriellen Blutproben von etwa 50 μl durch Mikrozentrifugieren bestimmt.
  • Austauschtransfusion
  • Eine Austauschtransfusion wurde mit einer Rate von etwa 0,5 ml/min auf ein Lösungsgesamtvolumen, das 50% des geschätzten Blutvolumens entsprach, durchgeführt. Es wurde angenommen, dass das Blutvolumen 65 ml/kg beträgt. Die peristaltische Pumpe wurde so betätigt, dass das Blut mit genau derselben Rate entfernt wurde, mit der das Testmaterial infundiert wurde. Die Testlösungen wurden in einem Wasserbad vor der Infusion auf 37°C erwärmt und während der Infusion warm gehalten.
  • Blutung
  • Die von den Erfindern eingesetzte Arbeitsvorschrift für die Blutung basierte auf dem Modell von Hannon und Wade (J. Hannon, C. Wade, C. Bossone, M. Hunt, R. Coppes und J. Loveday, "Blond gas and acid-base status of conscious pigs subjected to fixed-volume hemorrage and resuscitated with hypertonic sali dextran", Circ. Shock 32, 19–29 (1990)). Die Blutung begann etwa 3 min nach der Beendigung der Austauschtransfusion durch das Abpumpen von arteriellem Blut aus der Oberschenkelarterie in einer Rate von 0,5 ml/min zur Entfernung von 60% des Blutvolumens im Verlauf von 60 min. Blutproben (0,3 ml) wurden alle 10 min für eine hämatologische und eine Blutgasanalyse abgenommen.
  • Statistische Analyse und Überlebensanalyse
  • Für die Überlebensanalysen wurden die Tiere zumindest 120 min lang nach Beginn der Blutung beobachtet. Die Daten wurden in 10-min-Intervalle gruppiert und für jedes Intervall wurde der kumulative Anteil lebender Individuen und die Standardabweichung berechnet.
  • Ergebnisse:
  • Lösungseigenschaften
  • Die verwendeten Lösungen werden nachstehend in Tabelle 3 beschrieben. Die Gesamthämoglobinkonzentration, die Viskosität und der kolloidale osmotische Druck (COP) passen gut zusammen. Der P50 von PHP (19,7 Torr) (2626 Pa) war höher als der von POE (12,2 Torr) (1626 Pa). Das Maß an Kooperativität (Hillscher Parameter, n) war für beide Lösungen gleich.
  • Die FPLC-Muster für die beiden Lösungen sind in 3 angeführt. Während in beiden Mustern ein kleiner Peak vorliegt, der unmodifiziertem Hämoglobin entspricht, scheint der Großteil des Hämoglobins in einer heterogenen Reihe von Peaks auf, die deutlich früher eluiert werden als das unmodifizierte Hämoglobin (SFH). Die Muster für die beiden PEG-modifizierten Hämoglobine sind einander qualitativ ähnlich. Tabelle 3 Tabelle 1. Eigenschaften der Testlösungen
    PHP POE
    Hb, g/dl 8,0 8,3
    Viskosität (cp) 2,8 2,8
    COP (mmHg (Pa)) 62,7 (8359) 56,5 (7532)
    *a1 (× 10–1) 1,368 2,228
    *a2 (× 10–3) 9,680 21,070
    *a3 (× 10–5) 0,752 46,500
    *a4 (× 10–5) 1,537 8,766
    P50 (Torr) (Pa) 19,7 (2626) 12,2 (1626)
    n50 1,48 1,49
    • * Sauerstoffaffinität gemessen bei 37°C pH 7,4
  • Die Sauerstoffaffinität von POE war deutlich höher als jene von PHP (4). Jedoch wies keines der beiden Produkte eine signifikante Kooperativität auf.
  • Tierversuche
  • Alle Versuche sind in Tabelle 4 zusammengefasst. PHP (18) wurde mehr Tieren verabreicht als POE (11), und das mittlere Gewicht der PHP-Tiere war signifikant höher als jenes der POE-Gruppe (P < 0,001). Diesem Gewichtsunterschied wurde jedoch in der Berechung des Blutungsausmaßes Rechnung getragen, wobei ein Gesamtblutvolumen von 65 ml/kg angenommen wurde. Aus diesem Grund waren die daraus folgenden Volumina der Austauschtransfusion und der Blutung ebenfalls unterschiedlich. Die mittlere Zeit bis zum Einsetzen des Todes war bei den PHP-Tieren (93 min) dennoch signifikant kürzer als bei den POE-Tieren (116 min). Dieser Unterschied war statistisch signifikant (P < 0,02). Wenn die Tiere die Beobachtungsphase von 120 min nach Beginn der Blutung überlebten, wurden sie für den Zweck der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse (5) als "zensiert" erachtet. Tabelle 4
    WT (g) *Blutvolumen (ml) Blutungsvolumen (ml) Blutungsvolumen (%) Zeit bis zum Tod (min)
    PHP n 18 18 18 18 18
    PHP 291 18,89 11,10 58,79 93
    sd 24 1,59 0,90 0,35 29
    POE n 11 11 11 11 11
    POE 334 21,74 12,78 58,77 116
    sd 41 2,65 1,60 0,39 12
    P 0,001 0,001 0,001 0,915 0,020
    • * Bezogen auf ein Gesamtblutvolumen von 65 ml/kg.
  • Hämatologie und Säure-Base-Regulation
  • Grundlinien-, Post-AT- und Post-Blutungs-(60 min)Messungen sind in Tabelle 5 angeführt. Der mittlere Hämatokrit war in den POE-Tieren etwa höher als in den PHP-Tieren, wobei der Wert nach der Austauschtransfusion (AT) in den beiden Gruppen übereinstimmte. Am Ende der Blutungsphase war der mittlere Hämatokrit der POE-Tiere wiederum etwas höher als in den PHP-Tieren. Ähnliche kleine Unterschiede bestanden bei den Gesamthämoglobinwerten, wobei die POE-Tiere bei jeder Probennahme einen leicht höheren Wert aufwiesen. In Bezug auf das Plasmahämoglobin bestand in den beiden Gruppen kein Unterschied, aber nach der Austauschphase war es in den POE-Tieren signifikant höher.
  • Die arterielle Milchsäurekonzentration war in allen Phasen der Studie in den POE-Tieren signifikant höher als in den PHP-Tieren. In Bezug auf die Basenüberschuss-Werte bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, wenngleich nahe gelegt wird, dass die Werte in den PHP-Gruppen niedriger sind als in den POE-Gruppen. Ferner ist der Unterschied zwischen den Grundlinienwerten für die PHP-Tiere (10,24 mval/l) höher als für die POE-Tiere (7,01 mval/l). Tabelle 5
    n PHP s.e.m. n POE s.e.m. P
    HCT Grundlinie 17 39,80 0,57 10 43,15 0,23 0,0032
    Post-AT 17 17,89 0,43 10 19,25 0,62 0,3568
    60 min 15 13,29 0,47 10 15,85 0,14 0,0015
    HB Grundlinie 17 13,59 0,22 10 15,08 0,17 0,0057
    Post-AT 17 8,70 0,18 10 9,74 0,07 0,0007
    60 min 15 6,34 0,21 10 7,38 0,06 0,0016
    PLHB Grundlinie 16 0,00 0,00 10 0,00 0,00
    Post-AT 16 2,86 0,07 10 2,99 0,09 0,6785
    60 min 15 1,93 0,07 10 2,47 0,02 0,0001
    LACT Grundlinie 9 0,70 0,06 7 2,68 0,16 0,0001
    Post-AT 9 1,59 0,10 7 4,21 0,24 0,0004
    60 min 9 10,62 0,89 7 17,27 1,18 0,0360
    BE Grundlinie 17 6,22 1,28 9 5,41 0,08 0,6530
    Post-AT 17 6,20 1,41 2 5,60 0,13 0,8101
    60 min 15 –4,02 1,60 6 –1,60 0,53 0,4678
  • Mittlerer Blutdruck während der Austauschtransfusion
  • Der mittlere Blutdruck während der Austauschtransfusion ist in 6 dargestellt. In Bezug auf den Grundlinienwert des mittleren Blutdrucks besteht kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Die Blutdruckreaktion auf die Infusion der PEG- Hämoglobine unterscheidet sich bei den beiden Gruppen jedoch deutlich. Der anfängliche Anstieg des MAP ist in den PHP-Tieren höher als in den POE-Tieren und wird während der gesamten Infusionsdauer aufrecht erhalten. Im Gegensatz dazu sinkt der MAP in POE-Tieren am Ende der Infusion wieder auf den Grundlinienwert.
  • Am Beginn der Blutung tritt in den PHP-Tieren ein unmittelbarer MAP-Rückgang ein, während er in der POE-Gruppe verzögert einsetzt. Ferner wird der MAP in POE-Tieren während der gesamten Blutung und darüber hinaus am oder nahe des Grundlinienwerts gehalten, während der MAP in den PHP-Tieren den Grundlinienwert nicht wieder annimmt. Besonders in den PHP-Tieren steigt die Streuung der Daten, wie durch die steigende Standardabweichung angezeigt, im Verlauf der Zeit mit dem Ausscheiden von Tieren aus der PHP-Gruppe.
  • Diskussion:
  • In dieser Studie wurden 2 sorgfältig eingestellte modifizierte Hämoglobinlösungen ("Blutersatzprodukte") in Bezug auf ihre Fähigkeit untersucht, Ratten vor einer schweren Blutung (60% des Blutvolumens) zu schützen. Um diese Fähigkeit zu testen, erhielten die Tiere zunächst eine Austauschtransfusion von 50% (des Blutvolumens) mit einer der beiden Testlösungen. Die Lösungen selbst unterschieden sich nur in Bezug auf ihre Sauerstoffaffinität und wurden in Bezug auf das FPLC-Muster, den onkotischen Druck, die Viskosität und die Konzentration sehr gut aufeinander abgestimmt. Bei anderen Untersuchungen, bei denen versucht wurde, die Auswirkungen spezifischer Variablen auf die physiologischen Ergebnisse zu zeigen, konnten nicht so gut übereinstimmende Lösungen verglichen werden. Siehe z. B. H. Sakai, H. Hara, A. G. Tsai, E. Tsuchida, P. C. Johnson und M. Intaglietta, "Changes in resistance vessels during hemorrhagic shock and resuscitation in conscious hamster model", Am. J. Physiol. 276(45), H563-H571 (1991); H. Sakai, H. Hara, M. Yuasa, A. Tsai, S. Takeoka, E. Tsuchida und M. Intaglietta, "Molecular dimensions of Hb-based O2 carriers determine constriction of resistance arteries and hypertension", Am. J. Physiol. 279, H908-H915 (2000). Diese Versuche stellen den ersten Fall dar, indem so gut übereinstimmende Lösungen verglichen werden konnten, wobei nur eine Variable, P50, deutlich abwich.
  • Die Gruppe von Tieren, die POE erhielt, wies leicht, aber signifikant, höhere Hämatokrit-, Gesamthämoglobin- und Plasmahämoglobinwerte auf. Es ist jedoch sehr unwahrscheinlich, dass diese Unterschiede das Ergebnis oder die Auslegung der Versuche erklären. Die beiden Lösungen beeinflussen den Blutdruck klar auf unterschiedliche Weise, wie in 4 dargestellt ist. Während der Infusion muss die Wirkung auf den Blutdruck eine Funktion der Eigenschaften der infundierten Lösung sein, nicht des Rezipiententiers. Die Blutdruckreaktion ist in den PHP-Tieren ausgeprägter und anhaltender als in POE-Tieren.
  • Das Überleben der Tiere steht deutlich nicht mit der blutdrucksteigernden Wirkung der Hämoglobinlösungen in Zusammenhang, wie in der Vergangenheit von einigen Forschern angenommen wurde, da das Überleben (und die Andeutung eines geringeren Basenmangels) in den POE-Tieren besser ist als in PHP-Tieren, in denen die Blutdruckwirkung geringer oder nur vorübergehend vorhanden ist. Siehe R. J. Przybelski, E. K. Daily und M. L. Birnbaum, "The pressor effect of hemoglobin – good or bad?" in R. M. Winslow, K. D. Vandegriff und M. Intaglietta (Hrsg.), Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and Medical Challenges, 71–85, Birkhäuser, Boston (1997).
  • Insgesamt unterstützen diese Ergebnisse die Hypothese, dass ein geringerer P50-Wert vorteilhaft für den Einsatz von zellfreiem Hämoglobin als Sauerstoffträger ist. Die Hypothese beruht auf 2 Konzepten. Erstens, dass der Diffusiongradient für zellfreies Hämoglobin eine Funktion des Oxyhämoglobingradienten zwischen der Sauerstoffquelle, den roten Zellen und der Gefäßwand ist. Dieser Gradient hängt wiederum von der Form und der Position der Sauerstoffgleichgewichtskurve ab (M. R. McCarthy, K. D. Vandegriff und R. M. Winslow, "The role of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-free hemoglobin: Implications for the design of hemoglobin-based oxygen carriers", Biophysical Chemistry 92, 103–117 (2001)). Zweitens führt diese Annahme zu einer zweiten konzeptuellen Grundlage der Hypothese der Erfinder, nämlich dass eine höhere Sauerstoffaffinität (niedriger P50) O2 wirksam vor dem Kreislauf "versteckt", bis das Träger-Hamoglobinmolekül in den Bereichen des Kreislaufs ankommt, in denen der PO2 sehr gering ist, wie z. B. in ischämischen oder hypoxischen Geweben.
  • Beispiel 5
  • Stabilität von MalPEG-Hb
  • Der Zweck diese Untersuchung bestand in der Bestimmung der Stabilität von MalPEG-Hb während einer Simulation von Lagerungs- und Handhabungsbedingungen der Proben für klinische Versuche der Phase I. Die Stabilität während dieser drei Handhabungsschritte wurde bewertet. Schritt I steht für die Überführung aus der gefrorenen Lagerung in der Produktionseinrichtung auf die Temperaturbedingungen während des Transports zu der klinischen Einrichtung (Untersuchung der gefrorenen Lagerung). Schritt II steht für das Auftauen von MalPEG-Hb für 24 h auf +4°C und die folgende Lagerung bei +4°C für 5 Tage (Untersuchung der Kühlung). Schritt III steht für das Auftauen von MalPEG-Hb für 24 h auf +4°C und die folgende Lagerung von MAlPEG-Hb bei Raumtemperatur für mehrere Tage vor der Verabreichung an einen Patienten (Raumtemperatur-Untersuchung).
  • Experimentelles Verfahren
  • Die Stabilität wurde durch die Oxidationsrate des MalPEG-Hb-Testmaterials definiert. Der Anteil von Methämoglobin in der Probe wurde unter Einsatz von CO-Oximetrie (IL CO-Oximetrie 682) gemessen. Die Messungen wurden zu jedem Zeitpunkt gemäß der Arbeitsvorschrift doppelt durchgeführt.
  • Die Temperaturen wurden durch ein Thermometer oder Temperaturschreiber überwacht. Die Untersuchung der gefrorenen Lagerung wurde in einem Temperaturbereich von –21,0 ± 3,0°C durchgeführt. Die Untersuchung der Kühlung wurde in einem Temperaturbereich von +4,0 ± 0,2°C durchgeführt. Die Raumtemperaturuntersuchung erfolgte in einem Temperaturbereich +21,0 ± 1,0°C.
  • Die Temperatur, das Gesamthämoglobin und der Methämoglobinanteil wurden zu jedem der angegebenen Zeitpunkte angegeben. In der Untersuchung der gefrorenen Lagerung und der Kühlung wurden die Messungen zum Zeitpunkt Null (vollständig aufgetaut), 1 h später und dann 5 Tage lang alle 24 h durchgeführt. In der Raumtemperaturuntersuchung wurden die Messungen zum Zeitpunkt Null (vollständig aufgetaut) und dann 10 h lang jede h durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • MalPEG-Hb wies während der 6-tägigen Lagerung bei –20°C, wie in 8 dargestellt, keine Veränderung in Bezug auf den Methämoglobinanteil auf. Auf ähnliche Weise wie MalPEG-Hb während der 5-tägigen Lagerung bei +4°C, wie in 9 dargestellt, keine Veränderung des Methämoglobinanteils auf. Während der Lagerung bei Raumtemperatur wies MalPEG-Hb im Verlauf von 10 h, wie in 10 dargestellt, einen Anstieg des Methämoglobinanteils von weniger als 1% auf.

Claims (19)

  1. Blutersatzprodukt, das oberflächenmodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst, worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin Hämoglobin ist, an das über eine Oberflächen-Thiolgruppe einer frei liegenden Aminosäure-Seitenkette ein Polyalkylenoxid kovalent an das Hämoglobin-Molekül gebunden ist, während das Hämoglobin im oxygenierten Zustand vorliegt; und worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin unter den gleichen Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle.
  2. Blutersatzprodukt nach Anspruch 1, worin das Polyalkylenoxid Polyethylenoxid, Polypropylenoxid oder ein Polyethylenoxid/Polypropylenoxid-Copolymer ist.
  3. Blutersatzprodukt nach Anspruch 1, worin das Polyalkylenoxid Polyethylenglykol ist.
  4. Blutersatzprodukt nach Anspruch 1, worin das Polyalkylenoxid Polyethylenglykol der Formel H(OCH2CH2)nOH ist, worin n ≥ 4 ist.
  5. Blutersatzprodukt nach Anspruch 1, das oberflächenmodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst, worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin Hämoglobin ist, an das über eine Oberflächen-Thiolgruppe einer frei liegenden Aminosäure-Seitenkette maleinimidylaktiviertes Polyethylenglykol kovalent an das Hämoglobin-Molekül gebunden ist, während das Hämoglobin im oxygenierten Zustand vorliegt; und worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin unter den gleichen Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle.
  6. Blutersatzprodukt nach Anspruch 1, worin das Polyethylenglykol Polyethylenglykol der Formel H(OCH2CH2)nOH ist, worin n ≥ 4 ist.
  7. Blutersatzprodukt nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, das oberflächenmodifiziertes Oxyhämoglobin umfasst, worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin die Formel Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m aufweist, worin: Hb tetrameres Hämoglobin ist; S eine Oberflächen-Thiolgruppe ist; Y ein kovalenter Succinimidyl-Linker ist; R eine Alkyl-, Amid-, Carbamat- oder Phenylgruppe ist; n die Länge des Polymers definiert und ≥ 4 ist; und m die Anzahl an PEG-Polymeren ist, die an die Oberfläche des Hämoglobins gebunden sind; und worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin unter den gleichen Bedingungen einen niedrigeren P50 aufweist als natives stromafreies Hämoglobin aus der gleichen Tierquelle.
  8. Blutersatzprodukt nach Anspruch 7, worin m = 4–5 ist.
  9. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Hämoglobin vor der Oberflächenmodifikation thioliert worden ist.
  10. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das ein Verhältnis Methämoglobin/Gesamthämoglobin von weniger als 0,10 aufweist.
  11. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin einen P50 unter 10 Torr (1333 Pa) aufweist.
  12. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin das oberflächenmodifizierte Oxyhämoglobin einen P50 unter 7 Torr (933 Pa) aufweist.
  13. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, das gegenüber Autooxidation bei 24°C stabil ist und ein PEG-Hämoglobin-Konjugat umfasst, worin das Verhältnis Methämoblobin/Gesamthämoglobin weniger als 0,10 beträgt und das PEG-Hämoglobin-Konjugat einen P50 unter 10 Torr (1333 Pa) aufweist.
  14. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das Hämoglobin Pferde-Hämoglobin ist.
  15. Zusammensetzung, die als Blutersatz einsetzbar ist und ein Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in einem wässrigen Verdünner umfasst.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die Hämoglobinkonzentration zwischen 0,1 und 4,0 g/dl beträgt.
  17. Blutersatzprodukt nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Therapie des menschlichen oder tierischen Körpers.
  18. Verwendung eines Blutersatzprodukts nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Traumata, Ischämie, Blutverdünnung, septischen Schocks, Krebs, chronischer Anämie, Sichelzellenanämie, Kardioplegie oder Hypoxie.
  19. Verwendung eines Blutersatzprodukts nach einem der Ansprüche 1 bis 14 bei der Herstellung eines Medikaments zur tierärztlichen Behandlung von Blutverlust aufgrund einer Verletzung, hämolytischer Anämie, infektiöser Anämie bei Pferden, infektiöser Anämie bei Katzen, bakteriellen Infektionen, Faktor-IV-Fragmentierung, Hypersplenismus und Hypermegalie, des hämorrhagischen Syndroms bei Geflügel, hypoplastischer Anämie, aplastischer Anämie, idiopathischer immunhämolytischer Leiden, Eisenmangel, isoimmunhämolytischer Anämie, mikroangiopathischer hämolytischer Anämie oder Parasitismus.
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