DE69034138T2 - Rezeptorverbindungen von glutamin und herstellung - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft eine Familie neuer DNA-Sequenzen und codierte Rezeptorproteine, die das Glutamat-Neurotransmittersystem umfassen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Glutamat-Rezeptoren und die Verwendung der Rezeptorproteine in Assays, die Glutamat-Agonisten und -Antagonisten identifizieren und charakterisieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Aminosäure L-Glutamat ist ein erregungsübermittelnder Hauptneurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugern. Anatomische, biochemische und elektrophysiologische Analysen lassen vermuten, daß Glutamat betreffende Systeme an dem großen Feld von neuronalen Verfahren beteiligt sind, einschließlich schneller erregender synaptischer Transmission, Regulierung der Neurotransmitterausschüttung, Dauerpotentierung, Lernen und Erinnerungsvermögen, synaptische Entwicklungsplastizität, hypoxischen-ischämischen Schaden und Neuronenzelltod, epilepsieartige Anfälle sowie die Pathogenese verschiedener neurodegenerativer Störungen. Siehe z.B. Monaghan et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29, 365–402 (1989). Dieses umfassende Repertoire an Funktionen, insbesondere solchen die das Lernvermögen Neurotoxizität und Neuropathologie betreffen, hat dazu beigetragen, daß sich in der letzten Zeit Versuche darauf konzentrierten, die Mechanismen zu beschreiben und zu definieren durch die Glutamat seine Wirkungen entfaltet.
  • Derzeitig basieren Schemata der Glutamat-Rezeptorklassifizierung auf pharmakologischen Kriterien, die dazu dienen, fünf Rezeptorsubtypen oder Klassen zu definieren: solche die durch N-Methyl-D-aspartinsäure (NMDA), Kaininsäure (KA), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isooxazol-4-propionsäure (AMPA, zuvor Quisalinsäure oder QUIS-Rezeptor genannt), 2-Amino-4-phosphonobuttersäure (AP4 oder APB) und 1-Amino-cyclopentyl-1,3-dicarbonsäure (ACPD) aktiviert werden. Die Glutamatwirkungen werden primär über Wechselwirkungen mit Kationen-selektiven ionotropen Rezeptoren vermittelt (Foster und Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103–164 (1984); Strange, Biochem. J. 249, 309–318 (1988)). Eine Ausnahme ist der ACPD-Rezeptorsubtyp, der die Eigenschaften eines metabotropen Rezeptors aufweist. Diese Klasse von Glutamat-Rezeptoren verändert die synaptische Physiologie über GTP-Bindungsproteine und die zweiten Messenger Diacylglycerol und Inositol-1,4,5-triphosphat (Gunderson et al., Proc. R. Soc. London Ser. B 221, 127 (1984); Sladeczek et al., Nature 317, 717 (1985); Nicoletti et al., J. Neurosci. 6, 1905 (1986); Sugiyama et al., Nature 325, 531 (1987)).
  • Die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der Glutamat-Rezeptoren wurden eingehend untersucht und sind sehr gut etabliert. Siehe zum Beispiel Foster und Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984); Cotman et al., Trends Neurosci. 10, 263 (1987); Mayer und Westbrook, Prog. Neurobiol. 28, 197 (1987); Watkins und Olvermann, Trends, Neurosci. 10, 264 (1987); und Blair et al., Science 242, 577 (1988). Dies steht in Kontrast zu ihren biochemischen Charakteristika und der Struktur auf Molekularniveau, das bis zur erfindungsgemäßen Lehre weitgehend unbekannt war.
  • Orlova et al. (Chemical Abstracts 110: 70440g (1989), S. 172) beschreiben kurz eine nicht-charakterisierte cDNA, von der angenommen wurde, daß sie einen Glutamat-Rezeptor im Hirn codiert.
  • Definitionen
  • In der Beschreibung und den Ansprüchen wird Bezug genommen auf Redewendungen und Ausdrücke des Standes der Technik, die hier ausdrücklich wie folgt definiert werden:
  • Glutamat-Rezeptoren betreffen hier Neurotransmitter-Rezeptorproteine, die durch L-Glutamat und verwandte Verbindungen aktiviert werden. Diese Rezeptorproteine werden auf der Basis ihrer "Pharmakologie" klassifiziert. Derzeit gibt es fünf Rezeptorklassen: solche die durch N-Methyl-D-aspartat (NMDA), Kaininsäure (KA), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionsäure (AMPA, zuvor Quisqualinsäure oder QUIS-Rezeptor genannt), 2-Amino-4-phosphonobutansäure (AP4 oder APB) und 1-Amino-cyclopentyl-1,3-dicarbonsäure (ACPD) aktiviert werden.
  • NMDA bedeutet hier N-Methyl-D-aspartat, das ein Ligand (Agonist) des NMAD-Glutamat-Rezeptorssubtyps ist.
  • AMPA bedeutet hier α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionat, das ein Ligand (Agonist) des AMPA-Glutamat-Rezeptorsubtyps ist. Der AMPA-Rezeptor wurde zuvor QUIS (Quisqualat)-Rezeptor genannt.
  • QUIS bedeutet Quasilinsäure oder Quisqualat, das ein Ligand (Antagonist) des pharmakologisch definierten Rezeptor-Subtyps ist, der zuvor als QUIS (Quisqualat)-Rezeptor bezeichnet wurde. Der Rezeptor, der zuvor als QUIS-Rezeptor bezeichnet wurde, wird jetzt AMPA-Rezeptor genannt.
  • KA bedeutet hier Kaininsäure oder Kainat, die ein Ligand (Agonist) des Kainat-Glutamat-Rezeptorsubtyps ist.
  • APB bedeutet hier 2-Amino-4-phosphonobutyrat, die ein Ligand (Agonist) des APB-Glutamat-Rezeptorsubtyps ist. Das Acronym AP4 wird auch manchmal als 2-Amino-4-phosphonobutyratglutamat-Rezeptorsubtyp bezeichnet.
  • ACPD bedeutet hier 1-Amino-cyclopentyl-1,3-dicarbonsäure, die ein Ligand (Agonist) des ACPD-Glutamat-Rezeptorsubtyps ist.
  • Sofern als Modifizierer des erfindungsgemäßen Glutamat-Rezeptorproteins/proteine bedeutet die Redewendung "mit elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften, die für einen Glutamatrezeptor charakteristisch sind" hier, daß das neuronale Signal/die Signale, die durch das Rezeptorprotein als Folge von Glutamat oder Glutamatähnlichen Liganden erzeugt werden, mit denen von bekannten Glutamat-Rezeptoren vergleichbar sind. Siehe auch die Definition "funktional", die nachfolgend aufgeführt wird.
  • Homomerisch bedeutet hier Rezeptoren, die nur einen Typ einer Untereinheit umfassen.
  • Heteromerisch bedeutet hier Rezeptoren, die mehr als einen Typ einer Untereinheit umfassen.
  • Funktional bedeutet hier, wenn es als Modifizierer des erfindungsgemäßen Glutamat-Rezeptorproteins/der -proteine verwendet wird, daß das Binden eines Glutamats (oder eines Glutamat-ähnlichen Liganden) an ein Rezeptorprotein/Rezeptorproteine bewirkt, daß sich Membranen "Ionenkanäle" öffnen. Dies ermöglicht, daß sich Ionen durch die Membran bewegen, was wiederum die Zelle depolarisiert und ein neuronales Signal erzeugt. Auf eine andere Weise ausgedrückt, bedeutet funktional, daß ein neuronales Signal als Konsequenz der Ligandenbindung an das Rezeptorprotein/proteine erzeugt wird.
    • GABA bedeutet hier γ-Aminobutansäure.
    • γ-DGG bedeutet hier γ-D-Glutamylglycin.
    • GAMS bedeutet hier γ-D-Glutamylaminomethyl-sulfonat.
    • PDA bedeutet hier 2,3-Cis-Piperidindicarbonsäure.
    • GDEE bedeutet hier Glutamatdiethylester.
    • TMDs bedeutet hier Transmembrandomänen.
    • APV bedeutet hier 2-Amino-5-phosphonovalerinsäure.
    • CPP bedeutet hier 3-(2-Carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphat.
    • nAchRs bedeutet hier neuronale Nicotinacetylcholin-Rezeptoren.
    • CNS bedeutet hier zentrales Nervensystem.
    • PNS bedeutet hier peripheres Nervensystem.
  • Eine Agonisten-Bindungsuntereinheit ist eine Rezeptoruntereinheit, die eine Bindungsstelle für eine pharmakologische Verbindung enthält, die durch Bindung den Rezeptor aktiviert.
  • Bindungsuntereinheit eines Nicht-Agonisten bedeutet hier eine Rezeptoruntereinheit, die keinen Agonisten bindet.
  • Der Ausdruck Antagonist bezieht sich hier auf eine Substanz, die die Rezeptorfunktion beeinträchtigt. Zwei Typen von Antagonisten gibt es: kompetitive und nicht-kompetitive. Ein kompetitiver Antagonist (auch als kompetitiver Blockierer bezeichnet) konkurriert mit einem Agonisten für überlappende Bindungsstellen. Eine nicht-kompetitiver Antagonist oder Blockierer inaktiviert das Funktionsvermögen des Rezeptors, indem es an eine Stelle auf dem Rezeptor bindet, die nicht der Agonistenbindungsstelle entspricht.
  • GluR1 bezieht sich hier auf den cDNA-Klon, der ein einzelnes Protein eines Glutamat-Rezeptors codiert, das den gleichen Namen trägt mit einem Mr = ca. 99 769 Daltons. GluR1 war die erste cDNA, die isoliert wurde und eine Glutamat-Rezeptoruntereinheit codiert, und wurde zuvor als GluR-K1 bezeichnet. GluR-K1 wurde umbenannt zu Glutamat-Rezeptoruntereinheit Gen 1 oder einfacher GluR1. Zusätzliche Gene von Glutamat-Rezeptoruntereinheiten oder verwandte Gene von Untereinheiten wurden GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6, GluR7 usw. genannt. Die GluR1-cDNA wurde bei der American Type Collection hinterlegt, die ATCC-Nr. 68134 wurde zugewiesen.
  • GluR2 betrifft einen cDNA-Klon, der eine einzelne Glutamat-Rezeptoruntereinheit codiert, wobei das Protein den gleichen Namen trägt und ein Mr = ca. 96 400 Daltons aufweist. GluR2 cDNA wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt, es wurde die ATCC-Nr. 68132 zugewiesen.
  • GluR3 betrifft einen cDNA-Klon, der eine einzelne Glutamat-Rezeptoruntereinheit codiert, wobei das Protein den gleichen Namen hat und ein Mr = 98 000 Daltons aufweist. GluR3 cDNA wurde bei der American Type Cluture Collection hinterlegt, es wurde die ATCC-Nr. 68133 zugewiesen.
  • GluR4 bezieht sich hier auf einen cDNA-Klon, der ein einzelnes Protein vom gleichen Namen codiert und ein Mr = 98 500 aufweist. GluR4 cDNA wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt, es wurde die ATCC-Nr. 68375 zugewiesen.
  • GluR5 betrifft hier einen GluR5 cDNA-Klon, der ein einzelnes Protein mit dem gleichen Namen codiert, das ein Mr = ca. 100 000 Daltons aufweist. GluR5 cDNA (wie GluR5-1) wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt, die ATCC-Nr. 68374 wurde zugewiesen. (Es gibt zwei Längenvarianten von GluR5 cDNA, die hier als GluR5-1 und GluR5-2 bezeichnet werden. Die Translation der GluR5 cDNA läßt auf einen einzelnen langen offenen Leserahmen von 920 Aminosäuren schließen. Der Unterschied zwischen GluR5-1 und GluR5-2 DNA stammt von einer Insertion von 45 Nukleotiden (15 Aminosäuren) in der GluR5-1 DNA, die diesen Leserahmen nicht unterbricht. Die Insertion von 15 Aminosäuren in dem GluR5-1-Rezeptorprotein ist unter den Rezeptorproteinen, die hier offenbart sind, einzigartig, folglich ist die kürzere GluR5-2-Variante das Gegenstück von GluR1-, GluR2-, GluR3-, GluR4-, GluR6-, GluR7-Untereinheiten.)
  • GluR6 bezieht sich auf einen cDNA-Klon, der ein einzelnes Protein codiert, das den gleichen Namen trägt und ein Mr = ca. 100 000 aufweist.
  • GluR7 bezieht sich hier auf einen cDNA-Klon, der ein einzelnes Protein mit dem gleichen Namen codiert. GluR7-codierende Fragmente 35-T3 und U35 sind in 12 gezeigt.
  • GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6 und GluR7 werden hier austauschbar verwendet, um Gene, cDNA-Klone und Glutamat-Rezeptorproteine, die sie codieren, zu bezeichnen. Die Verwendung des Ausdrucks "substantielle Sequenzhomologie" bedeutet in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen, daß die DNA, RNA oder Aminosäuresequenzen, die leichte und Sequenzvariationen ohne Konsequenz von hier tatsächlich offenbarten und beanspruchten Sequenzen aufweisen, äquivalent zu den erfindungsgemäßen Sequenzen anzusehen sind und als solches vom Umfang der geltenden Ansprüche umfaßt sind. In dieser Hinsicht bedeutet "leichte und Sequenzvariationen ohne Konsequenz", daß in "Homologe" Sequenzen (d.h. die Sequenzen, die substantielle Sequenzhomologie mit den hier offenbarten und beanspruchten DNA, RNA oder Proteinen aufweisen) funktional äquivalent zu den erfindungsgemäß offenbarten und beanspruchten Sequenzen sind. Funktional äquivalente Sequenzen wirken im wesentlichen auf die gleiche Weise und erzeugen im wesentlichen die gleichen Zusammensetzungen wie die hier offenbarten und beanspruchten Nukleinsäure- und Aminosäure-Zusammensetzungen.
  • Der Ausdruck "im wesentlichen rein" in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen als Modifizierer von DNA-, RNA-Polypeptiden oder -Proteinen bedeutet, daß die DNA-, RNA-Polypeptid oder -Proteine, die so genannt werden, aus ihrer zellulären in vivo-Umgebung durch Verfahren unter menschlichen Anstrengungen getrennt worden sind und als Folge dieser Trennung und Reinigung, die im wesentlichen reinen DNA-, RNA-Polypeptid und -Proteine auf eine Art und weise nützlich sind, die die nicht-getrennten unreinen DNA-, RNA-Polypeptid oder Proteine nicht sind.
  • Die Aminosäuren, die die hier beschriebenen verschiedenen Aminosäuresequenzen umfassen, können gemäß den folgenden dreibuchstabigen oder einbuchstabigen Abkürzungen identifiziert werden:
  • Figure 00090001
  • Die Nukleotide, die die hier beschriebenen verschiedenen Nukleotidsequenzen umfassen, haben die gewöhnlichen einbuchstabigen Bezeichnungen (A, G, T, C oder U), die routinemäßig im Stand der Technik verwendet werden.
  • Die Wörter "Protein", "Peptid" und "Polypeptid" sind hier als äquivalente Ausdrücke anzusehen und werden austauschbar verwendet.
  • Bp bedeutet hier Basenpaare. Kbp bedeutet hier Kilobasenbaare oder Basenpaare mal 1000.
  • Alle Temperaturen, die hier angegeben, sind in Grad Celsius angegeben, sofern es nicht anders angezeigt ist.
  • Hinterlegungen
  • cDNA-Klone, die erfindungsgemäße repräsentative Glutamat-Rezeptorproteinuntereinheiten codieren, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA (ATCC) hinterlegt, um dem Fachmann die Möglichkeit zu geben, die Sonden herzustellen und zu verwenden, die notwendig sind, um zusätzliche Mitglieder der L-Glutamatfamilie von Genen zu identifizieren. Die Hinterlegungen wurden unter den Bedingungen des Budapest-Vertrages der internationalen Anerkennung von Hinterlegungen und Mikroorganismen zum Zweck der Patentverfahren und den Bestimmungen, die unter diesen Vertrag fallen, gemacht. Proben der klonierten DNA-Sequenzen sind und werden für Industrieabteilungen und andere Personen verfügbar, die gesetzlich berechtigt sind, diese unter den Bedingungen des Vertrages und im Einverständnis mit den Patentgesetzen und Bestimmungen der Vereinigten Staaten von Amerika und anderer Nationen oder internationaler Organisationen, in denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, die die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht ist oder in denen jedes Patent, das auf diese Anmeldung erteilt ist, zu erhalten.
  • Die ATCC-Hinterlegungsnummern und -Hinterlegungsdaten der hinterlegten repräsentativen cDNA-Klone sind wie folgt:
  • Figure 00100001
  • Zusätzlich sind die folgenden cDNA-Klone hinterlegt worden:
  • Figure 00110001
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung offenbart eine Familie von neuen Glutamat-Rezeptorproteinen und DNA-Sequenzen, die diese codieren. Die erfindungsgemäßen Glutamat-Rezeptoren weisen elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften auf, die für Glutamat-Rezeptoren des zentralen Nervensystems charakteristisch sind. Die erfindungsgemäßen Glutamat-Rezeptoren sind durch Proteine vom Kationen-selektiven Ionenkanal-Typ, die durch cDNA-Klone GluR1, GluR2 und GluR3 codiert sind, exemplarisch dargestellt. Zusätzlich zu der Nützlichkeit zur Herstellung von Glutamat-Rezeptorproteinen sind die cDNA auch als Sonden nützlich, die es dem Fachmann ermöglichen, ohne übermäßige Experimente, zusätzliche Protein der Glutamat-Rezeptorfamilie zu identifizieren und isolieren.
  • Die erfindungsgemäßen neuen funktionalen Glutamat-Rezeptoren können entweder aus einzelnen GluR-Untereinheiten (homomerisch) oder aus Kombinationen von Untereinheit-Polypeptiden (heteromerisch) zusammengefügt werden. GluR1, GluR2 und GluR3 sind Beispiele der vorliegenden bevorzugten Untereinheiten zur Bildung homomerer Rezeptoren, wohingegen deren Kombinationen aus GluR1, GluR2 und GluR3 Beispiele von bevorzugten Untereinheiten sind zur Bildung heteromerer Rezeptoren.
  • Zusätzlich zu der Offenbarung neuer DNA und Proteine umfassen die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Glutamat-Rezeptoren und die Verwendung dieser zum Identifizieren und charakterisieren von Agonisten und Antagonisten, die Glutamat-Rezeptorwirkung aufweisen. Die Erfindung umfaßt auch Verfahren, um zu bestimmen, ob ein unbekanntes Protein/Proteine als Glutamat-Rezeptoren funktional sind.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung offenbart eine Familie von Glutamat-Rezeptoren und neue DNA-Sequenzen, die diese Rezeptoren codieren.
  • Genauer gesagt umfaßt die Erfindung in einem Aspekt reine funktionale Proteine oder deren funktionale Fragmente oder funktionale Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder Fragmente, wobei die Proteine oder Fragmente oder funktionalen Kombinationen elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die für einen Glutamat-Rezeptor charakteristisch sind.
  • In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine funktionale Proteine oder deren funktionalen Fragmente oder funktionale Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder Fragmente, wobei die Proteine oder funktionalen Fragmente oder Kombinationen elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die für einen Glutamat-Rezeptor-Subtyp, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N-Methyl-D-aspartat (NMDA), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionsäure (AMPA), Kainat (KA) und 2-Amino-4-phosphonobutyrat (APB) charakteristisch sind.
  • In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine funktionale Proteine oder funktionale Fragmente davon oder funktionale Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder Fragmenten, wobei die Proteine oder funktionalen Fragmente elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die für KA und/oder AMPA-Glutamat-Rezeptorsubtypen charakteristisch sind.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine Proteine oder Fragmente davon oder funktionale Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder Fragmenten, wobei die Proteine oder Fragmente oder funktionalen Kombinationen elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften eines Glutamat-Rezeptors aufweisen und durch DNA mit mindestens 40%iger Homologie mit mindestens einem Mitglied der Gruppe bestehend aus GluR1-DNA, GluR2-DNA und GluR3-DNA codiert werden.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine Proteine oder Fragmente davon oder funktionale Kombinationen aus Protein und/oder Fragmenten, wobei die Proteine und Fragmente oder funktionalen Kombinationen elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften eines Glutamat-Rezeptors aufweisen und mindestens ungefähr 40 % Aminosäurehomologie mit mindestens einem Mitglied der Gruppe, bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4) aufweisen.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GluR1, GluR2 und GluR3 und Kombinationen davon, wobei diese Kombination als Glutamat-Rezeptor/Rezeptoren funktional sind.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine Proteine mit Mrs von ungefähr 99 769 (GluR1), 94 400 (GluR2), 98 000 (GluR3), die Ionenkanäle bilden, die elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften besitzen, die für Glutamat-Rezeptoren der KA und/oder AMPA-Subtypen charakteristisch sind.
  • In wiederum einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine funktionale Proteine mit wesentlicher Sequenzhomologie mit den im wesentlichen reinen funktionalen erfindungsgemäßen Proteinen.
  • Die Erfindung umfaßt auch im wesentlichen reine DNA, die funktionale Proteine oder funktionale Fragmente davon codieren und elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die für Glutamat-Rezeptoren charakteristisch sind.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine DNA, die funktionale Proteine oder funktionale Fragmente mit elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften, die für einen Glutamat-Rezeptorsubtyp ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-D-aspartat (NMDA), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionsäure (AMPA), Kainat (KA) und 2-Amino-4-phosphonobutyrat (APB) charakteristisch sind, codieren.
  • Weiterhin umfaßt die Erfindung DNA, die KA oder AMPA-Glutamat-Rezeptoren codieren.
  • In einem weitere Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine DNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GluR1-DNA, GluR2-DNA und GluR3-DNA.
  • Darüber hinaus umfaßt die Erfindung im wesentlichen reine DNA mit mindestens ungefähr 40 % Homologie mit mindestens einem Mitglied aus der Gruppe bestehend aus GluR1-DNA, GluR2-DNA und GluR3-DNA.
  • In einem weiteren damit in Beziehung stehenden Aspekt umfaßt die Erfindung DNA, die Proteine mit mindestens ungefähr 40 % Homologie mit mindestens einem Mitglied aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 codieren.
  • Die Erfindung umfaßt außerdem im wesentlichen reine DNA, die im wesentlichen reine Proteine mit Mrs von ungefähr 99 769 (GluR1), 96 400 (GluR2) und 98 000 (GluR3) codieren, die Ionenkanäle bilden, die elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften besitzen, die für einen Glutamat-Rezeptor der Subtypen KA und/oder AMPA charakteristisch sind.
  • Die Erfindung umfaßt außerdem im wesentlichen reine DNA, die funktional äquivalent zu jedem der im wesentlichen reinen DNA der Erfindung ist, wobei funktional äquivalent bedeutet, daß die im wesentlichen reine DNA Proteine oder funktionale Fragmente davon codiert, die Ionenkanal/kanäle als Folge von Liganden für Glutamat-Rezeptoren bilden würden.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung im wesentlichen Sinn- oder Antisinn-RNA, die aus erfindungsgemäßen DNA transkribiert werden, wobei die DNA im wesentlichen reine funktionale Proteine codieren, die elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die für einen Glutamat-Rezeptor charakteristisch sind.
  • In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung cDNA-Klone, die Aminosäuresequenzen der funktionalen Peptide mit elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften, die für einen Glutamat-Rezeptor charakteristisch sind, aufweisen, codieren. Repräsentative Klone wurden bei der American Type Culture Collection hinterlegt, um dem Fachmann die notwendigen Ausgangsmaterialien (d.h. Sonden) bereitzustellen, um zusätzliche Mitglieder der Glutamat-Rezeptorfamilie zu identifizieren und isolieren. Die repräsentativen cDNA-Klone umfassen: GluR1 (ATCC Nr. 68134), GluR2 (ATCC Nr. 68132) und GluR3 (ATCC Nr. 68133).
  • Entweder die vollständigen cDNA-Klone oder Fragmente davon können als Sonden verwendet werden. Wenn Fragmente als Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, daß die DNA-Sequenzen aus dem Carboxy-codierenden Teil der DNA stammen und am meisten bevorzugt umfassen sie Ionenkanal-codierende Teile der DNA-Sequenzen.
  • In einem anderen Aspekt umfaßt die Erfindung funktionale Peptid-Fragmente und funktionale Kombinationen davon, die von den erfindungsgemäßen DNA codiert werden. Solche funktionalen Peptid-Fragmente können von dem Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren hergestellt werden, indem einige oder alle Aminosäuren in der Sequenz, die für das Peptid nicht wesentlich sind, um als Glutamat-Rezeptor zu wirken, ausgeschlossen werden. Eine Bestimmung der Aminosäuren, die für die Glutamat-Rezeptorwirkung wesentlich sind, erfolgt z.B. durch systematischen Verdau der die Peptide codierenden DNA und/oder durch Einführung von Deletionen in die DNA. Die modifizierten (z.B. deletierten oder verdauten) DNA werden zum Beispiel exprimiert, indem die DNA transkribiert wird und anschließend die resultierende mRNA in Xenopus oocytes eingeführt wird, wo die Translation der mRNA erfolgt. Funktionale Analysen der in Oocyten derart exprimierten Proteine erfolgt indem die Oocyten Liganden ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, daß sie Glutamat-Rezeptoren binden und funktional aktivieren, und anschließend werden die Oocyten verfolgt, um zu sehen, ob die exprimierten Fragmente einen Ionenkanal/Ionenkanäle bilden. Wenn ein Ionenkanal/Ionenkanäle nachgewiesen werden, sind die Fragmente als Glutamat-Rezeptoren funktional.
  • In wiederum einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung Zellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA transformiert sind. In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung Xenopus oocyten, in die erfindungsgemäße mRNA eingeführt worden ist, z.B. durch Injektion.
  • Des weiteren umfaßt die Erfindung neue Glutamat-Rezeptoren, die durch Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Translation der entsprechenden RNA hergestellt werden. Solche neuen Rezeptoren umfassen im einzelnen die GluR1, GluR2 und GluR3-Rezeptoren, Fragmente davon sowie funktionale Kombinationen der Rezeptoren oder Fragmente.
  • Darüber hinaus umfaßt die Erfindung DNA, RNA und Proteine, die funktional äquivalent zu den erfindungsgemäßen DNA, RNA und Proteinen sind. Solche funktional äquivalenten DNA, RNA und Proteine wirken im wesentlichen auf die gleiche Weise wie die erfindungsgemäßen DNA, RNA und Proteine.
  • Zusätzlich zu den DNA, RNA und Protein-Zusammensetzungen umfaßt die Erfindung Verfahren und ein erstes erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Verfahren zum identifizieren von DNA, die homolog mit DNA ist, von der bekannt ist, daß sie ein Glutamat-Rezeptorprotein/proteine codiert. Dieses Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen einer "unbekannten" DNA oder einer Untersuchungsprobe mit einer Glutamat-Rezeptor-DNA-Sonde (z.B. GluR1, GluR2 und GluR3) unter niedrig und/oder hoch stringenten Hybridisierungsbedingungen und anschließendes Identifizieren der "unbekannten" oder Test-DNA, die mit der Glutamatsonden-DNA hybridisiert, als Glutamat-Rezeptor homologe DNA.
  • Ein zweites erfindungsgemäßes Verfahren ist auf das Identifizieren funktionaler Glutamat-Rezeptoren (d.h. Glutamat-Rezeptoren, die Ionenkanäle bilden) gerichtet. Dieses Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen von Proteinen, bevorzugt in einem Oocyt-Expressionssystem, mit mindestens einem Liganden, von dem bekannt ist, daß er Glutamat-Rezeptor aktiviert, Messen der Ionenkanalantwort auf den Liganden/die Liganden und Identifizieren von solchen Proteinen als funktionalen Glutamat-Rezeptor/Glutamat-Rezeptoren, die eine Ionenkanalantwort als Folge des Inkontaktbringens entfalten.
  • Ein drittes erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Verfahren zur Bestimmung ob eine Substanz ein funktionaler Ligand des Glutamat-Rezeptorproteins ist. Gemäß diesem Verfahren werden Proteine, von denen bekannt ist, daß sie als Glutamat-Rezeptoren wirken, mit einer "unbekannten" oder Testsubstanz in Kontakt gebracht, wobei die Ionenkanalaktivität des bekannten Glutamat-Rezeptors nach dem Inkontaktbringen mit der "unbekannten" oder Testsubstanz verfolgt wird und solche Substanzen als funktionale Liganden der Rezeptorproteine identifiziert werden, die eine Ionenkanalantwort bei dem bekannten Glutamat-Rezeptor/Glutamat-Rezeptoren bewirken.
  • Jetzt wird auf einige erfindungsgemäße spezifische DNA eingegangen; der cDNA-Klon GluR1 wurde aus einer cDNA-Bibliothek vom Rattenvorderhirn isoliert durch Screening nach der Expression von Ionenkanälen mit Kainat-Durchlaß in den Xenopus oocyten. Ein Insert aus dem Klon GluR1 wurde als Sonde verwendet, um cDNA Hirnbibliotheken zu screenen (zunächst unter niedrig-stringenten Hybridisierungsbedingungen und anschließend unter hochstringenten Bedingungen), um cDNA-Klone aufzufinden, die andere Mitglieder der Glutamat-Rezeptorfamilie codieren. Die Verwendung der GluR1-Sonden-cDNA führte zu der Identifizierung und Isolierung der GluR2- und GluR3-Klone. Eine Sonde aus GluR2 wurde verwendet, um die Klone GluR4 und GluR5 zu identifizieren und isolieren und GluR5 wurde verwendet, um die GluR6- und GluR7-Klone zu isolieren.
  • Der cDNA-Klon GluR1 codiert eine funktionale Glutamat-Untereinheit, die aus einem einzelnen Protein von ungefähr Mr = 99 769 vor jeder posttranslationalen Modifizierung besteht. Dieses Protein bildet einen Ionenkanal, der elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften von KA und AMPA-Rezeptoren besitzt.
  • Die Proteine, die durch GluR1-, GluR2-, GluR3-, GluR4-, GluR5-, GluR6- und GluR7-Gene codiert werden, entfalten beträchtliche Identität zwischen den Aminosäuresequenzen der Untereinheiten. Siehe Tabelle 2. Bei diesen Proteinen wurde festgestellt, daß sie merkliche homomere und heteromere KA/AMPA-empfindliche Ionenkanäle in Xenopus oocyten bilden. Zum Beispiel reichen die einzelnen Protein-Untereinheiten von Glutamat-Rezeptoren, GluR1, GluR2, GluR3, GluR4 und GluR5 aus, um homomere funktionale Rezeptor-Ionenkanal-Komplexe zu bilden, und werden durch KA, AMPA, QUIS aber nicht durch NMDA und APB aktiviert. Während GluR2-Untereinheiten funktionale homomere Komplex bilden können, führt diese Untereinheit effizient Rezeptor-Ionenkanal-Komplexe in heteromeren Kombinationen mit GluR1 oder GluR3 Untereinheiten zusammen.
  • Das GluR5-Protein bildet in Xenopus oocyten einen homomeren Ionenkanal, der schwach auf Glutamat aber nicht auf N-Methyl-D-aspartat, Kainat, Quisqualat und 2-Amino-4-phosphonobutyrat reagiert. Die Tatsache, daß GluR5-exprimierende Oocyten auf L-Glutamat aber nicht auf KA, Quisqualat oder AMPA reagieren, kann bedeuten, daß dieses Protein bei der Bildung von Rezeptoren mit unterschiedlichen pharmakologischen Profilen als den KA/AMPA-Untereinheiten teilnehmen kann. Diese Annahme wird durch in situ-Hybridisierungsdaten gestützt.
  • Während der embryonalen und postnatalen Entwicklung wird das GluR5-Gen in Teilen neuronaler Zellen im CNS und PNS exprimiert und das räumliche und temporale Expressionsmuster des GluR5-Gens überschneidet sich mit der KA/AMPA-Untereinheit GluR4. Im Gehirn von Erwachsenen wird das GluR5-Gen jedoch in einem Muster exprimiert, daß es sich von den KA/AMPA-Untereinheit-Genen unterscheidet, was in Übereinstimmung steht mit der Annahme, daß GluR5 einen Subtyp der Glutamat-Rezeptoren darstellt, der sich von den KA/AMPA-Rezeptoren unterscheidet.
  • Ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann unter Anwendung der vorliegenden Beschreibung und der folgenden Beispiele und detaillierten Beschreibung der Abbildungen die vorliegende Erfindung in ihrem größtem Ausmaß nutzen kann. Das in den Beispielen offenbarte Material dient, sofern nicht anders angegeben, zu beispielhaften Zwecken und sollte daher nicht so interpretiert werden, daß es in irgendeiner Weise die geltenden Ansprüche einschränkt.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Herstellung von cDNA-Bibliotheken vom Hirn
  • Poly(A)+-RNA wird durch das Guanidinthiocyanat-CsCl-Verfahren (Chirgwin et al., Biochem. 18, 5298 (1979) aus verschiedenen Hirnbereichen, z.B. Säugerhirn, oder einer geeigneten Zellinie, z.B. der NCB-20-Zellinie, gereinigt. Die gereinigte RNA wird als Matrix verwendet, um doppelsträngige cDNA herzustellen. Ein Poly-dT-Primer, der an eine Xho I-Restriktionsstelle gebunden ist, wird als Primer der Mononey-Revers-Transkriptase zur Synthese des ersten Stranges unter Verwendung von 5-Methyl-dCTP anstatt von cCTP als Vorläufer verwendet. RNase H und DNA-Polymerase I werden zur Vervollständigung des zweiten Stranges zugegeben. Die cDNA wird mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt (blunt-ended), wodurch die Wahrscheinlichkeit der Herstellung einer vollständigen cDNA erhöht wird. Eco RI-Adaptoren werden an die glatten Enden ligiert und die Enden werden mit Kinase behandelt. Die cDNA wird anschließend mit dem Xho I-Restriktionsenzym verdaut. Dieses Enzym kann keine hemimethylierte DNA spalten, so daß es lediglich die nicht-methylierte Xho I-Restriktionsstelle spaltet, die an den dT-Primer am 3'-Ende der mRNA angebracht worden ist. Die resultierende doppelsträngige cDNA weist eine Xho I-Restriktionsstelle am 3'-Ende der mRNA und eine Eco RI-Stelle am 5'-Ende auf. Diese cDNA wird anschließend in einen geeigneten Vektor, wie λZAP-Vektor gebracht, deren Teil des λZAP-cDNA-Klonierungssystems von Stratagene ist. Wenn der λZAP-Vektor verwendet wird, wird die cDNA in den Vektor eingeführt, so daß sich das 5'-Ende der mRNA in der Nähe des lacZ-Promotors befindet. (Der λZAP-Vektor hat einen T3-DNA-Polymerase-Promotor an einem Ende des cDNA-Inserts und einen T7-RNA-Polymerase-Promotor am anderen Ende, wodurch es möglich ist, entweder Sinn- oder Antisinn-RNA für weitere Experimente, einschließlich der Expression in Oocyten, zu synthetisieren.
  • Beispiel 2
  • Niedrig- und hochstringente Hybridisierung
  • cDNA-Bibliotheken werden bevorzugt aus dem in Beispiel 1 beschriebenen λZAP-cDNA-System hergestellt. Eine Hybridisierungssonde wird bevorzugt aus DNA hergestellt, die aus den GluR1-, GluR2-, GluR3-, GluR4-, GluR5-, GluR6- oder GluR7-Klonen oder einem anderen geeigneten Klon, oder einer Quelle erhalten wurde. Die DNA wird durch das zufällige Primeverfahren markiert, bevorzugt unter der Verwendung des Amersham Multiprime DNA-Markierungs-Kit. Bevorzugt werden zunächst zumindest niedrig-stringente Hybridisierungsbedingungen verwendet. Eine geeignete Hybridisierungslösung ist: (1 M NaCl, 50 mM Tris [pH 8,0], 0,5 % SDS, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 100 mg/ml denaturierte Spermien-DNA vom Hering und jeweils 0,1 % [G/V] Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin). Beim Screening unter niedriger Stringenz ist eine Temperatur von 50°C bevorzugt und die Filter werden in 2 × SSPE bei Raumtemperatur gewaschen (1 × SSPE entspricht 180 mM NaCl, 9 mM Na2HPO4, 0,8 mM NaH2PO4 und 1 mM EDTA, pH 7,4) und einem Kodak XAR-5-Film bei –70°C ausgesetzt. Beim Screening unter hoher Stringenz wird die Temperatur auf 65°C eingestellt und die Filter werden bei dieser Temperatur in 0,2 × SSPE, enthaltend 0,5 % Natriumdodecylsulfat, gewaschen. Die Filter werden einem Kodak XAR-5-Film mit einem Cronex Quanta II/III Intensivierungsscreen bei –70°C 18–48 Stunden belichtet.
  • Bei den Hybridisierungsbedingungen unter niedriger Stringenz zeigen ungefähr einer von zweitausend cDNA-Klonen vom Hirn etwas Hybridisierung mit der Sonde, die aus dem GluR1-cDNA-Insert hergestellt wurde.
  • Beispiel 3
  • Analyse von durch Hybridisierung identifizierten Klonen
  • Mindestens zwei unterschiedliche Ansätze können verwendet werden, um Klone zu analysieren, die durch das Hybridisierungsscreening bei niedriger Stringenz identifiziert werden. Ein Ansatz ist posititive λZAP-Klone herauszupicken und sie in Mischungen von ungefähr 100 Klonen zusammenzuführen. mRNA wird in vitro aus diesen Ansammlungen von λZAP-Klonen hergestellt und die mRNA wird in Oocyten injiziert, um die Fähigkeit der mRNA zu untersuchen, die Synthese funktionaler Glutamat-Rezeptoren zu bewirken. Wenn ein positiver Klon ermittelt wird, wird der einzelne λZAP-cDNA-Klon isoliert, indem die Ansammlung unterteilt wird, bis der funktionale Klon isoliert ist. (Siehe Beispiel 5 unten, bezüglich der Diskussion wie dieser Ansatz verwendet wurde, um den GluR-Klon zu isolieren.) Ein zweiter Weg der eingesetzt werden kann, um positive Klone zu beurteilen, ist jedes einzelne Insert zu analysieren. Obgleich dies sehr langwierig ist, weist der "einzelne Klon"-Ansatz den Vorteil auf, daß anfänglich keine funktionale Expression erforderlich ist.
  • Wenn der "einzelne Klon"-Ansatz verwendet wird, wird jeder Klon Plaque-gereinigt und das cDNA-Insert wird einzeln analysiert. Dies wird durch die Tatsache erleichtert, daß zumindest in dem λZAP-cDNA-System die cDNA in eine Kassette kloniert wird, die von dem Bakteriophagen f1-Replikationsursprung flankiert ist. Die cDNA befindet sich innerhalb eines pBluescript-Plasmids, das aus dem λZAP-Bakteriophagen durch Helferinfektion gewonnen werden kann. (Sofern dies bewältigt ist, befindet sich die cDNA in dem kleinen pBluescript-Plasmid, mit dem es sich wesentlich leichter arbeiten läßt als mit dem viel größeren λBakteriophagen.) Sinn- oder Antisinn-RNA wird aus dem cDNA-Insert in dem pBluescript-Plasmid unter Verwendung entweder des T3 (Sinn)- oder T7 (Antisinn)-Promotors hergestellt.
  • Das cDNA-Insert wird außerdem bevorzugt mit Restriktionsenzymen kartiert. Zum Beispiel werden die cDNA-Inserts mit häufig schneidenden Restriktionsenzymen geschnitten. Die resultierenden Fragmente werden nach Größe auf einem Gel fraktioniert und die Fragmente werden auf einem Filter zur Southern-Blot-Analyse übertragen. Die Filter werden in einer Sonde aus bekannten Glutamat-Rezeptoren, z.B. GluR1, GluR2, GluR3, GluR4, GluR5, GluR6 oder GluR7 hybridisiert. Die hybridisierten Fragmente jedes Klons werden in den einzelsträngigen Vektor M13 (mp18 oder mp19) subkloniert und das Fragment wird sequenziert. Die DNA-Sequenzierung wird unter Verwendung des Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahrens von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977) oder eines automatischen Sequenzierers, z.B. einem von Applied Biosystems, durchgeführt. Die Sequenz wird bevorzugt mittels eines Computers unter Verwendung einer Software, wie den von Intelligenetics, Staden und der University von Wisconsin entwickelten Programmen, analysiert.
  • mRNA, die aus Klonen voller Länger oder fast voller Länge hergestellt ist, wird in dem Oocyten-System exprimiert und die funktionalen Eigenschaften der neuen Rezeptoren werden charakterisiert. Wenn ein Klon nicht funktional ist, wenn er selbst exprimiert wird, wird er in der Gegenwart von mRNA untersucht, die aus anderen Kandidatklonen hergestellt ist.
  • Beispiel 4
  • Expression, Klonierung und Assay in Xenopus oocyten
  • Dieses Assay ist eine Adaptierung des Assays von Masu et al., Nature 329, 836 (1987). Es hängt von der Tatsache ab, daß wenn fremde mRNA in Xenopus oocyten injiziert wird, die mRNA in ein funktionales Protein translatiert wird.
  • DNA-Matrizen, entweder ein λZAP-cDNA-Präparat oder ein Plasmid, das die zu untersuchenden cDNA enthält, werden stromabwärts des cDNA-Inserts mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Der Verdau nach der Restriktion wird mit Proteinase K verdaut und anschließend durch zwei Phenol: Chloroform (1:1)-Extraktionen extrahiert. Die DNA-Matrix wird anschließend mit Ethanol ausgefällt. Die Matrix wird entweder mit T3 RNA-Polymerase zur Herstellung eines Sinn-Stranges oder mit T7-RNA-Polymerase zur Herstellung eines Antisinn-Stranges plus rART, rCTP, rGTP, rUTP und RNase-Inhibitor gemischt. Gleichzeitig werden die RNA-Transkripte mit einem 7meGpppG-Kappe bestückt. Durch das Verfahren werden Handschuhe getragen, und das Wasser wird mit Diethylpyrocarbonat behandelt, um RNasen zu inaktivieren.
  • Die in vitro-synthetisierten mRNA-Transkripte werden in Xenopus oocyten injiziert. 50 nl einer RNA-Lösung, 0,5-0,6 mg/ml, werden in das Stadium V der Oocyten injiziert. Die injizierten Oocyten werden bei 16°C in Barths-Medium 2 bis 7 Tage inkubiert bevor sie auf die Gegenwart von funktionalen Rezeptoren analysiert werden.
  • Aufzeichnungen der Spannung werden gemacht, indem der Oocyt von einer Mikroelektrode durchdrängt, die mit 3M KCl gefüllt ist und mit einer Brückenschaltung einer geeigneten Spannungsklemmvorrichtung, z.B. der Dagan 8500-Spannungsvorrichtung, verbunden wird. Spannungsuntersuchungen werden bevorzugt mit zwei Elektroden durchgeführt, einer Spannungselektrode, die mit 3M KCl gefüllt ist und einer Spannungselektrode, die mit 0,25 M CsCl, 0,25 M CsF und 50 mM EGTA gefüllt ist. (Siehe Beispiel 6 unten, hinsichtlich der Diskussion der Ergebnisse der Aufzeichnungen von Oocyten, die mit RNA aus GluR1-cDNA, die einen KA/AMPA-Glutamat-Rezeptor codiert, injiziert ist.)
  • Vor der Injektion werden die Oocyten hergestellt indem die Eierstöcke aus anästhesiertem erwachsenen weiblichen Xenopus enthalten werden. Das Eierstockgewebe wird mit Collagenase, 2 mg/ml, zwei Stunden behandelt und anschließend werden das Eierstockepithelium und die follukulären Zellen herausseziert.
  • Beispiel 5
  • Expression, Klonierung des GluR1-Rezeptors
  • Xenopus oocyten werden mit Poly(A)+-RNA aus dem Vorderhirn von Ratten isoliert, injiziert. 2–10 Tage später werden die Oocyten elektrophysiologisch auf ihre Fähigkeit untersucht, auf selektive Agonisten der Glutamat-Rezeptorsubtypen zu reagieren. Sowohl Glutamat als auch Quisqualat entfernen Depolarisierungen, wobei sie ein zweiphasiges Muster aufweisen, das sich aus einer schnellwirkenden und gleichmäßigen Ionenkanalantwort vermutlich mit Ligandendurchlaß und einer langandauernden, fluktuierenden wahrscheinlich durch Second-Messenger vermittelten Antwort zusammensetzt. NMDA und KA entfalteten gleichmäßige Antworten mit schnellem Beginn. APB ergab keine Reaktion.
  • Eine cDNA-Richtungsbibliothek (λZAPII RTB1; Komplexizität: 8 × 105 Elemente), bestehend aus jeweils 18 unabhängigen Unterbibliotheken von 44 000 Klonen wurden aus dieser Poly(A)+-RNA unter Verwendung des Bakteriophagen-Expressionsvektor λZAPII hergestellt. Eine Ansammlung von in vivo-Transkripten, umfassend Transkripte, die getrennt aus allen 18 amplifizierten Unterbibliotheken hergestellt wurden, wurden in Oocyten injiziert. Kleine Depolarisierungen (1-3 mV) wurden bei Spannungsaufzeichnungen der Oocyten gesehen, die 100 μM Kainat 10 Tage nach der Injektion ausgesetzt wurden. Keine Reaktion auf NMDA oder Quisqualat wurde nachgewiesen. Nicht-injizierte Oocyten sowie mit Wasser injizierte Oocyten zeigten keine Reaktion auf Glutamat-Rezeptoragonisten. Daraufhin wurden Ansammlungen von 44 000 Klonen (= die einzelnen Untereinheiten), 4000, 400 und 40 Klonen untersucht. In jeder dieser Untersuchungen reagierte mindestens ein Pool auf KA. Die folgenden Kriterien wurden durch das Screening-Verfahren hinweg angesetzt, um sicherzustellen, daß die sehr kleinen Reaktionen, die anfänglich beobachtet wurden, nicht auf Artifakte zurückzuführen sind: (a) Reaktionen in einem gegebenen Oocyten waren reproduzierbar, (b) die Reaktionen waren schnell (innerhalb einer Sekunde nach Agonisten-Applikation), (c) Antworten waren leicht umkehrbar durch Überfusion des Oocyten mit der Kontroll-Ringer-Lösung, (d) 10 μM Domoat ergab eine Reaktion, die der von 100 μM Kainat beobachteten ähnlich ist. Die Ansammlungen, die die größten Reaktionen bei jedem Stadium ergaben, wurden für die weitere Unterteilung ausgewählt. Die Klone in der positiven Endansammlung von 40 Klonen wurde auf ihre Insertgröße untersucht und die 12 Klone mit den größten Inserts (alle >2 kb) wurden einzeln auf ihre Fähigkeit untersucht, die Synthese eines funktionalen Kainat-Rezeptors zu bewirken. Lediglich bei einem Klon, der ein 3,0 kb-Insert trägt, wurden Kainat-Reaktionen festgestellt und er wurde λZAPII-GluRI genannt.
  • Beispiel 6
  • Elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierung des GluR1-Klons
  • Das Plasmid pGluR1 wurde anschließend aus dem Bakteriophagen λZAPII-GluR1 gewonnen und nach der Transkription induzierte in vitro-Sinn-RNA aber nicht Antisinn-RNA Kainat-Reaktionen, wenn sie in Oocyten injiziert wurde. So wenig wie 10 pg GluR1-Sinn-Transkript unter Spannungsbedingungen (–70 mV gehaltenes Potential) ergaben nachweisbare Reaktionen auf 100 μM KA.
  • Um die Möglichkeit auszuschließen, daß GluR1 einen Transkriptionsfaktor codiert, wurden mit pGluR1 in vitro-Transkripten injizierte Oocyten in einem Medium gehalten, das mit 50 μg/ml Actinomycin D ergänzt worden war, um endogene Transkription zu inhibieren. Diese Oocyten entfalteten die gleichen Reaktionen auf Kainat wie die, die in dem Kontrollmedium gehalten wurden. Es scheint daher unwahrscheinlich daß Injektion-induzierte Transkription des Oocyten-Genoms zu den beobachteten Reaktionen beiträgt.
  • L-Glutamat ruft wesentlich geringere Reaktionen hervor als KA und selbst bei 1 mM wurde nur eine 50%ige Depolarisierung im Vergleich zu 30 μM KA hervorgerufen. Dies steht in Übereinstimmung mit vorherigen Berichten, daß Glutamat nur ein schwacher Agonist des KA-Rezeptor-Subtyps ist (Monaghan et al., Nature 306, 176 (1983)). Andere Glutamat-Rezeptoragonisten, wie NMDA, Quisqualat und L-Aspartat riefen keine Reaktionen hervor wenn jeweils 150 μM, 10 μM und 100 μM eingesetzt wurden. Nicht-verwandte Neurotransmitter-Rezeptoragonisten, wie Glycin, GABAA, Serotonin und Nicotin führten ebenfalls zu keinen Reaktionen, selbst wenn sie bei Konzentrationen so hoch wie 1 mM untersucht wurden. Glycin potentierte die KA-Reaktion nicht. Dosiswirkungskurven für KA und Domoat wurden aufgezeichnet und EC50-Werte von jeweils 39 μM und 1,8 μM wurden ermittelt. Das durchschnittliche Umkehrpotential, das aus gegenwärtigen Antworten auf 10 μM Kainat extrapoliert wurde, die bei einer Reihe von Haltepotentialen zwischen 0 und –130 mV erhalten wurden, betrug 10 mV. Reaktionen auf KA setzten die Ansprechempfindlichkeit nicht herab, selbst nach langer (bis zu 10 Minuten) Superfusion mit hohen Konzentrationen (10 μM) des Agonisten. Diese Ergebnisse sind konsistent mit vorherigen Berichten über Experimente mit KA-Rezeptoren, exprimiert durch Gesamt-Poly(A)+-RNA (Verdoorn & Dingledine, Molecular Pharmacology 34, 298 (1988)). Das pharmakologische Profil von GluR1 (siehe Tabelle 1), das sich durch Inhibierungseigenschaften verschiedener bekannter Glutamat-Rezeptorantagonisten zeigte, steht ähnlich in Übereinstimmung mit vorherigen Berichten über KA-Rezeptoren in Systemen, wenn Gesamtpoly(A)+-RNA als Quelle der Kainat-Rezeptor-Message verwendet wurde (Hirono et al., Neurosci. Res. 6, 106 (1988); Lerma et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2083 (1989)). Von allen untersuchten Verbindungen (jede 1 mM) war der breitspezifische Glutamat-Rezeptorantagonist Kynureninsäure eindeutig der wirksamste Inhibitor der Kainat-ausgelösten Depolarisierungen in Oocyten, die mit in vitro synthetisierter GluR1-RNA injiziert sind. Zu einem geringeren Grad inhibierte γ-D-Glutamylglycin (γ-DGG), über das berichtet wurde, daß es bevorzugt KA und NMDA aber nicht Qusqualat-Rezeptoren blockiert (Davies und Watkins, Brain Res. 206, 172 (1981)), Kainat-Reaktionen, so auch γ-D-Glutamylaminomethyl-sulfonat (GAMS), das nach Berichten KA- und AMPA-Rezeptoren bevorzugt (Fagg, Trends Neurosci. 8, 207 (1985)). Gleichermaßen blockierte 2,3-cis-Piperidindicarbonsärue (PDA), von der bekannt ist, daß sie alle Subtypen der Glutamat-Rezeptoren blockiert (Foster und Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984)), die GluR1-Reaktion. Glutamatdiethylester (GDEE), von dem angenommen wird, daß es bevorzugt Glutamat-Rezeptoren vom AMPA-Typ inhibiert (Foster and Fagg, Brain Res. Rev. 7, 103 (1984)), blockierte die Reaktion nicht signifikant aber entfaltete statt dessen schwache Agonist-Eigenschaften. Die NMDA-Rezeptorantagonisten 2-Amino-5-phosphonovalerinsäure (APV) und 3-(2-Carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphat (CPP) sowie NMDA selbst inhibierten die KA-Reaktionen leicht, folglich wirkten sie als schwache Antagonisten. Sie zeigten keine Eigenschaften von Agonisten.
  • Zusammengefaßt deuten die elektrophysiologischen Eigenschaften, die bei Oocyten beobachtet wurden, die mit GluR1-Transkript injiziert sind, sowie die beobachteten pharmakologischen Eigenschaften daraufhin hin, daß GluR1 einen funktionalen RA-Rezeptor darstellt, der nichtunterscheidbar von dem ist, der in mit Gesamtpoly(A)+-RNA injizierten Oocyten beobachtet wurde. Die einzelne Protein-Untereinheit, die durch GluR1 codiert wird, ist folglich ausreichend, um einen aktiven Rezeptor-Ionenkanal-Komplex zu bilden.
  • Beispiel 7
  • Sequenzierung und Primärstruktur von GluR1
  • Das cDNA-Insert des Plasmids pGluR1 wurde in M13mp19 subkloniert und sequenziert (1). Ein offener Leserahmen von 2721 Bp wurde in der Gesamtlänge von 2992 Bp festgestellt. Das vorhergesagte Protein bestand daher aus 889 Aminosäuren mit einem berechneten Mr von ungefähr 99 769. Die davon abgeleitete Proteinsquenz enthält ein putatives Signalpeptid von 18 Aminosäuren an seinem N-Terminus mit einer vorhergesagten Spaltungsstelle, die mit empirischen Regeln übereinstimmt (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)). Vom N-Terminus des Proteins wird daher angenommen, daß er sich extrazellulär befindet. Es gibt 6 mögliche N-Glycosylierungsstellen die in der angenommenen extrazellulären Domäne vorhanden sind. Sequenzvergleiche mit anderen Liganden-kontrollierten Ionenkanälen, Nicotinacetylcholin-Rezeptoren, GABAA-Rezeptoren und Glycin-Rezeptoren ergaben insgesamt wenig Homologie.
  • Alle Liganden kontrollierten Ionenkanal-Untereinheiten, die vor dieser Offenbarung sequenziert wurden, weisen einen konservierten extrazellulären Bereich auf, der durch zwei Cystein-Reste charakterisiert ist, die 14 Aminosäuren voneinander entfernt liegen, wobei konservierte Prolin- und Aspartat-Reste jeweils 8 und 10 Aminosäuren stromabwärts vom ersten der beiden Cysteine liegen (Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)). Diese hypothetische Signatur der Neurotransmitterrezeptor-Kanalkomplexe ist in dem durch GluR1 codieren Protein kaum konserviert. Die Prolin- und Aspartat-Reste sind vorhanden, aber der ersten Cystein-Rest befindet sich nur 7 Reste stromaufwärts des Prolin-Restes und der zweite Cystein-Rest fehlt.
  • Eine Analyse des Hydropathie-Diagramms von GluR1 ergaben verschiedene Bereiche, die Kandidaten für Transmembrandomänen (TMDs) sind. Der Bereich zwischen den Aminosäuren 455 und 810 war auffallend, da sein Hydropathie-Profil dem entspricht, das in anderen Liganden-kontrollierten Ionenkanälen festgestellt wurde: drei eng beieinanderliegende mutmaßliche TMDs, die ungefähr 175 Aminosäure-Reste entfernt von einem vierten mutmaßlichen TMDs liegen, der nahe am C-Terminus des Proteins liegt. Innerhalb dieses Bereichs werden die folgenden vier Transmembranbereiche in GluR1 zugewiesen: TMD I, der zwischen den Aminosäuren 463 und 480 liegt, TMD II, der zwischen den Resten 521 und 539 liegt, TMD III, der zwischen den Resten 596 und 614 liegt, und TMD IV, der zwischen den Resten 788 und 808 liegt.
  • Beispiel 8
  • Isolierung und Charakterisierung von GluR2 und GluR3
  • cDNA-Klone, die die GluR2- und GluR3-Gene codieren, wurden aus einer Vorderhirnbibliothek einer erwachsenen Ratte unter Verwendung eines Screening-Protokolls bei niedrig-stringenter Hybridisierung (siehe Beispiel 2) und eines radioaktiv markierten Fragmentes der GluR1 cDNA als Sonde isoliert. 3 und 4 zeigen die Nukleotid- und davon abstammende Aminosäuresequenz des Klons λRB14 (GluR2) und λRB312 (GluR3). Die berechneten Molekulargewichte der reifen, nichtglycolysierten Formen von GluR2 und GluR3 betragen jeweils 96 400 Daltons (826 Aminosäuren) und 98 000 Daltons (866 Aminosäuren). Die potentiellen N-gebundenen Glycolisierungs-Stellen treten beim GluR2-Protein auf an Asn-235, Asn-349, Asn-385, Ans-392 und Asn-835 und beim GluR3-Protein an Asn-35, Asn-238, Asn-352, Asn-387 und Asn-394. Wie bei GluR1 ergab das Hydrophobizitätsprofil sowohl von GluR2 als auch GluR3 fünf stark hydrophobe Bereiche: eine dieser Domänen befindet sich am Amino-Terminus jeden Proteins und weist Eigenschaften eines Signalpeptids auf, während vier zusätzliche hydrophobe Bereiche wahrscheinlich Membrandurchdringende Helixen (MSR I–IV) bilden und sich in der Carboxy-terminalen Hälfte jedes Polypeptids befinden.
  • 5 ist eine Anordnung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Proteine, die durch GluR1, GluR2 und GluR3 (und GluR4 und GluR5)-Gene codiert sind. Die angeordneten Sequenzen zeigen daß signifikante Sequenzidentität zwischen GluR1 als auch GluR2 (70 %) und GluR3 (69 %) sowie zwischen GluR2 und GluR3 (74 %) besteht. (Siehe auch Tabelle 2). Die Sequenzidentität ist in der Carboxy-terminalen Hälfte jedes Proteins am deutlichsten.
  • Beispiel 9
  • Elektrophysiologischer Vergleich: GluR1, GluR2 und GluR3
  • Die hohe Sequenzähnlichkeit zwischen den durch GluR1, GluR2 und GluR3 codieren Proteinen deutet darauf, daß wie bei GluR1, die GluR2- und GluR3-Proteine als homomere, Kainatempfindliche Ionenkanäle in Xenopus oocyten wirken. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurden Oocyten mit in vitro synthetisierten RNA-Transkripten, die von den einzelnen cDNA-Klonen hergeleitet wurden, injiziert. 6A zeigt, daß sowohl GluR2- als auch GluR3-injizierte Oocyten als Antwort auf die Anwendung von 100 μM KA depolarisieren.
  • Die Amplituden der KA-Reaktionen waren nicht für die drei Glutamat-Rezeptoruntereinheiten äquivalent: bei gleichen Mengen injizierter RNA (2 ng) waren die Reaktionen in GluR3-RNA-injizierten Oocyten gleichbleibend größer als bei GluR1-Reaktionen. Die KA-ausgelösten Depolarisierungen und GluR2-injizierten Oocyten waren die schwächsten und konnten nur in Oocyten nachgewiesen werden, die mit großen RNA-Mengen injiziert waren (10 bis 25 ng).
  • Die Daten in 6B zeigen, daß zusätzlich zu KA Oocyten die mit GluR1 oder GluR3 RNA injiziert waren, auch auf QUIS (10 μM), AMPA (50 M), Glutamat (GLU, 100 μM) reagierten. Keine nachweisbaren Reaktionen wurden mit NMDA (30 μM plus 10 μM Glycin) oder APB (50 μM) erhalten. Die Reaktionen, die bei Oocyten erhalten wurden, wie mit GluR2-RNA injiziert waren, waren für eine reproduzierbare Quantifizierung zu gering, und wurden daher von der Analyse ausgeschlossen. Bei GluR1-injizierten Oocyten lagen die Reaktionen auf AMPA und QUIS gewöhnlich bei 35–40 % der maximalen KA-Reaktion, während bei GluR3 sie ungefähr 10 % der KA-Reaktion betrugen. Im Verhältnis zu KA war die Reaktion von GluR1 auf Domoinsäure (DOM, 10 μM) ungefähr 6-fach größer als die bei GluR3 beobachtete. Zusammengenommen zeigen diese Daten das Rezeptoren, die aus GluR1 oder GluR3 Untereinheiten zusammengefügt sind, pharmakologisch unterschiedlich sind. Darüber hinaus liefert die Beobachtung, daß homomere GluR1- und GluR3-Rezeptoren auf sowohl QUIS als auch AMPA reagieren, obgleich mit verringerten Wirksamkeiten, einen direkten Beweis, daß KA, QUIS und AMPA an das gleiche Glutamat-Rezeptor-Polypeptid binden können.
  • 6B zeigt außerdem, daß das pharmakologische Profil von Oocyten, die mit RNA einer einzelnen GluR1- oder GluR3-Untereinheit injiziert sind, signifikant unterschiedlich ist, als das, das bei Oocyten beobachtet wurde, die mit Hyppocampuspoly(A)+-RNA vom Rattenhirn injiziert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Reaktionen, die bei Hyppocampus-RNA-injizierten Oocyten beobachtet wurden, durch heteromere Glutamat-Rezeptoren ausgelöst wurden, die aus verschiedenen Kombinationen von GluR1-, GluR2- und GluR3-Untereinheits-Polypeptiden zusammengefügt sind. Diese Annahme wird durch die Tatsache gestützt, daß alle drei GluR-Untereinheits-Gene im Hyppocampus aktiv transkribiert werden.
  • Beispiel 10
  • Pharmakologischer Vergleich von GluR1, GluR2 und GluR3
  • Dieses Beispiel richtet sich an die Frage, ob Glutamat-Rezeptoren, die zusammengesetzt sind aus Mischungen der Proteine, die durch die GluR1-, GluR2- und GluR3-Untereinheits-Gene codiert sind, pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die sich voneinander oder von denen die bei einzelnen Untereinheits-Rezeptoren beobachtet wurden, stark unterscheiden.
  • Ein Vergleich der Daten in 6B und 7B deutet darauf hin, daß bei den untersuchten Agonisten geringe substantielle Unterschiede in der Pharmakologie bestehen. Die Reaktionen aus QUIS, AMPA und GLU sind jedoch im Verhältnis von GluR1 signifikant verringert in Oocyten, die Untereinheitskombinationen exprimieren. Außer der NMDA-Reaktion sind die Agonistenprofile bei Oocyten, die mit GluR-Untereinheitskombinationen injiziert sind, insgesamt ähnlicher zu Oocyten, die Hyppocampuspoly(A)+-RNA enthalten als bei denen die entweder mit RNA der GluR1- oder GluR3-Untereinheit allein injiziert sind.
  • Beispiel 11
  • Vergleich der KA-aktivierten Ströme, die für GluR1, GluR2 und GluR3 aufgezeichnet wurden
  • 7A vergleicht KA-aktivierte Ströme, die in Oocyten aufgezeichnet wurden, die mit Mischungen aus GluR1-, GluR2- und GluR-Untereinheit (gestreiften Säulen) injiziert wurden, wobei die summierten Ströme der einzelnen Untereinheiten gemessen wurden (leere Säulen). Die grundsätzliche Feststellung ist eine signifikante Potentierung der KA-ausgelösten Ströme in Oocyten, die GluR1- und GluR2-Untereinheiten (ungefähr 4-facher Anstieg über die summierten Reaktionen der einzeln initiierten Oocyten) oder GluR2- und GluR3-Untereinheiten (ungefähr 2-facher Anstieg) co-exprimieren. Die Injektion der RNA der drei Untereinheiten resultiert in einem durchschnittlichen 2,5-fachen Anstieg in den durch KA ausgelösten Strömen.
  • Diese Ergebnisse stützen die Schlußfolgerung daß in Oocyten einzelne Glutamat-Rezeptor-Untereinheitspolypeptide sich nicht auf eine einfache unabhängige Weise verhalten, sondern vielmehr miteinander wechselwirken. Es ist wahrscheinlich, daß eine solche Wechselwirkung zu der Herstellung heteromerer Glutamat-Rezeptoren mit Eigenschaften führt, die sich von Rezeptoren unterscheiden, die aus einzelnen Glutamat-Rezeptoruntereinheiten bestehen.
  • Beispiel 12
  • Beziehungen von Strom-Spannung bei KA-ausgelösten Reaktionen
  • Dieses Beispiel untersucht die Beziehungen von Strom-Spannung (I/V) bei KA-ausgelösten Reaktionen, die in Oocyten gemessen wurden, die mit einzelnen GluR-Untereinheiten, deren Kombinationen oder Hippocampuspoly(A)+-RNA injiziert wurden.
  • Die I/V-Daten sind in 8 dargestellt, wobei Oocyten, die mit RNA von einzelnen Glutamat-Rezeptoruntereinheiten injiziert wurden, in Feld 1 gezeigt sind, Oocyten, die mit Kombinationen aus Untereinheiten injiziert wurden, in den Feldern B und C gezeigt sind, und zu Vergleichszwecken Oocyten, die Hippocampuspoly(A)+-RNA exprimieren, in Feld A gezeigt sind. Die KA-Reaktionen, die in mit Hirnpoly(A)+RNA injizierten Oocyten gemessen wurden, zeigen eine ungefähr lineare I/V-Beziehung mit einem Umkehrpotential von ungefähr –10 mV. Dieses Ergebnis steht in ausgesprochenem Gegensatz zu den I/V-Kurven, die bei Oocyten erhalten wurden, die mit RNA einer einzelnen GluR1- oder GluR3-Untereinheit injiziert wurden. Die GluR1- und GluR3-I/V-Kurven zeigen starken nach innen gehende Rektifikation und Umkehrpotentiale nahe von –40 mV. Durch diese Daten ist klar, daß die KA-empfindlichen Rezeptoren, die in mit Hyppocampus-RNA injizierten Oocyten vorhanden sind, sich unterscheiden von denen die sich in Oocyten zusammensetzen, die mit RNA der GluR1- oder GluR3-Untereinheiten injiziert wurden.
  • In 8B unterscheidet sich die I/V-Kurve der GluR1- plus GluR2-Kombination merklich von der die bei der GluR1-Untereinheit allein beobachtet wurde. Die Oocyten, die mit diesem RNA-Paar injiziert wurden, zeigen ein nahezu lineares I/V-Diagramm und haben ein Umkehrpotential von ungefähr –10 mV. Dieses Diagramm ist auffallend ähnlich zu dem, das bei mit Hyppocampus-RNA injizierten Oocyten festgestellt wurde (Feld A). Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die I/V-Kurve der GluR1- plus GluR3-Kombination nur marginal von denen die in Oocyten gemessen wurden, die einzelne Untereinheiten exprimieren. 8C zeigt etwas nach innen gehende Rektifikation in der I/V-Kurve der Kombination der GluR2- plus GluR3-Untereinheit, sowie ein Umkehrpotential, das etwas negativer (–20 mV) ist als das, das bei GluR1 plus GluR2 oder Hyppocampus-RNA I/V-Diagrammen (–10 mV) bestimmt wurde. Wenn die RNA aller drei Glutamat-Rezeptoruntereinheiten in einem einzelnen Oocyten kombiniert wurde, nähert sich die resultierende I/V-Kurve der an, die bei der GluR1- plus GluR2-Kombination festgestellt wurde, hinsichtlich des Umkehrpotentials und Anstiegs, die Reaktionen mit den drei Untereinheiten zeigen jedoch eine deutliche nach innen gehende Rektifikation, die nicht bei GluR1 plus GluR2 beobachtet wurde.
  • Beispiel 13
  • Verteilung der GluR1, GluR2 und GluR3 mRNA im zentralen Nervensystem vom Säuger
  • Die Hypothese, daß sich Proteine die von GluR1-, GluR2- und GluR3-Genen codiert werden, zusammenfügen, um heteromere Glutamat-Rezeptoren in vivo zu bilden, kann widerlegt werden, indem gezeigt wird, daß die einzelnen Untereinheits-Gene in verschiedenen neuroanatomischen Orten transkribiert werden. Die Verteilung der GluR1-, GluR2- und GluR3-RNA im Hirn der erwachsenen Ratte wurde daher untersucht unter Verwendung von radioaktiv markierten Antisinn-RNA-Sonden und in situ Hybridisierungshistochemie, die im wesentlichen von Deneris et al., J. Biol. Chem. 264, 6268 (1989) beschrieben wurde.
  • Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Hybridisierungsmuster, die bei GluR1-, GluR2- und GluR3-Sonden erhalten wurden, nahezu identisch waren, wobei die stärkere Hybridisierung in den KA1-KA3-Bereichen des Hyppocampus und dem Gyrus dentatus bestimmt wurde. Die Hochauflösungsuntersuchung dieser Gebiete läßt vermuten, daß das Hybridisierungssignal seinen Ursprung in der pyramidalen Zellschicht der Bereiche KA1–KA3 und der inneren Körnerschicht des Gyrus dentatus hat. Eine etwas schwächere Hybridisierung der drei Sonden wurde in dem Piriform-Cortex Caudat-putamen, Aygdala und Hypothalamus beobachtet. Geringere Hybridisierungsgehalte wurden im Thalamus nachgewiesen, wobei ein geringes oder kein Signal in Faserbahnen beobachtet wurde. Während differentielle Hybridisierung im medialen Habenula und Neocortex festgestellt wurde, zeigte das Gesamtmuster der Expression der GluR1-, GluR2- und GluR3-Untereinheit-Gene substantielle Übereinstimmung.
  • Beispiel 14
  • Isolierung der cDNA von GluR4 und GluR5
  • Unter Verwendung eines Fragmentes der GluR2-cDNA (Nukleotide 1793–2240) als Sonde und einem Hybridisierungsprotokoll bei niedriger Stringenz wurden verschiedene GluR4- und GluR5-Klone aus einer Rattenvorderhirnbibliothek isoliert. Die Sequenzanalyse zeigte, daß keines der cDNA-Klone, einen vollständigen offenen Leserahmen enthielt. Northern Blots mit mRNA aus unterschiedlichen Hirngeweben der erwachsenen Ratte deuteten darauf hin, daß die GluR4- und GluR5-Transkripte im Cerebellum am häufigsten waren. Die Teil-GluR4- und GluR5-cDNA-Klone wurden folglich als Sonden verwendet bei Screening-Bedingungen unter hoher Stringenz, um cDNA aus einer Cerebellum-cDNA-Bibliothek der erwachsenen Ratte zu isolieren, die große offene Leserahmen codieren.
  • Von den so isolierten cDNA-Klonen codierten zwei GluR-verwandte Klone (λCER112 und λCER121B) nur Teile des GluR4-Gens besaßen aber eine ausreichende Überlappung, um einen vollständiges exprimierbares Konstrukt in dem pBS Sk (+)-Vektor (Stratagene Cloning Systems) herzustellen. Die Nukleotidsequenz dieses GluR4-Konstruktes, da pK45 genannt wurde, wurde bestimmt und die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 9 gezeigt.
  • Unter den 29 GluR5-verwandten cDNA, die aus der Cerebellum-Bibliothek isoliert wurden, wurden drei Klone, die λRB12, λRB15 und λRB20 genannt wurden, identifiziert, die einen identischen großen offenen Leserahmen codieren. Die Sequenz des cDNA-Klons λRB20 (GluR5-1) ist in 10 gezeigt. λRB15 und λRB12 sind am 5'-Ende kürzer als λRB20. Die λRB20-cDNA besteht aus einem 187 Bp 5'-nicht-translatierten Bereich, einem kontinuierlichen offenen Leserahmen von 2760 Bp und einem 3'-nicht-translatierten Bereich von 303 Bp. Der 5'-nicht-translatierte Bereich endet mit der Sequenz AAGATGG, die für eine translationale Startstelle charakteristisch ist.
  • Die zusätzlichen ursprünglich aus der Vorderhirnbibliothek isolierten cDNA-Klone wurden ebenfalls untersucht. Die Sequenzen dieser cDNA sind zu λRB20 in dem vorhergesagten Translationsanfangsbereich identisch. Die Sequenzanalyse ergab, daß zwei Varianten der GluR5-cDNA in den Bibliotheken vom Vorderhirn und Cerebellum vorliegen. Diese Heterogenizität stammt von der Insertion von 45 Nukleotiden, die in λRB20 aufgefunden wurde und 17 der isolierten 29 GluR5-verwandten cDNA-Klone (10). Diese Insertion unterbricht den offenen Leserahmen nicht. Darüber hinaus fehlen Konsensusspleiß-Donor und -Akzeptorstellen (Breathnach und Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50, 349–383 (1981)), was darauf hindeutet, daß die Insertion nicht durch ein nicht-gespleißtes Intron entsteht, sondern höchstwahrscheinlich das Ergebnis eines alternativen Spleißvorkommnisses ist. Die Nukleotidsequenz-Analyse deutet darauf hin, daß die zwei GluR5-Varianten ansonsten identisch sind.
  • Kein cDNA-Klon wurde für die kürzere Spleiß-Variante festgestellt, die den gesamten offenen Leserahmen codiert. Daher wurde ein Klon (λRBΔ20) hergestellt, dem das 45-Nukleotidinsert, das in λRB20 (GluR5-1) festgestellt wurde, fehlt, das aber ansonsten mit diesem Klon identisch ist. Der kürzere Klon der Spleißvariante (λRBΔ20) wird als GluR5-2 bezeichnet. Sowohl λRB20 als auch λRBΔ20 wurden in Xenopus oocyten-Expressionsexperimenten (siehe Beispiel 16) verwendet, und die unterschiedlichen codierten Proteine wurden jeweils GluR5-1 und GluR5-2 genannt.
  • Die GluR4-mRNA wurden auf Northern Blots von Cerebellum-RNA als 4,5 Kb-Art nachgewiesen. Die mRNA geringerer oder kleinerer Größe kann Spleißvarianten darstellen. Die Northern Blot-Analyse deutete ebenfalls darauf hin, daß die Haupt-GluR5-mRNA eine Größe von 6 Kilobasen aufweist.
  • Beispiel 15
  • Strukturmerkmale der GluR5-cDNA und des Proteins
  • Die Translation der cDNA-Nukleotidsequenz von GluR5-1 läßt auf einen einzelnen langen offenen Leserahmen von 920 Aminosäureresten schließen (10). Die GluR5-Sequenz weist insgesamt Aminosäuresequenzidentität mit jeder KA/AMPA-Untereinheit auf (5 und Tabelle 2). Die Insertion von 15 Aminosäuren in GluR5-1 ist unter den aufgeführten Proteinen einzigartig, folglich ist die kürzere GluR5-2-Variante das Gegenstück der charakterisierten KA/AMPA-Untereinheiten. Tabelle 2 zeigt, daß GluR5 die bisher unähnlichste identifizierte Glutamat-Rezeptoruntereinheit ist und der Vergleich von GluR5 mit den KA/AMPA-Untereinheiten hebt die konserviertesten Sequenzelemente hervor (5). Unter den anderen Familien der Liganden-kontrollierten Ionenkanäle, den neuronalen Acetylcholin-Rezeptor-, den GABAA-Rezeptor und den Glycin-Rezeptorfamilien, wobei die N-terminale extrazelluläre Domäne am konserviertesten ist, während sich die C-terminalen Sequenzen zwischen den Membrandurchdringenden Bereichen (MSR) III und IV unterscheiden. Im Gegensatz dazu weisen bei der Genfamilie der Glutamat-Rezeptoruntereinheit die Bereiche, die N-terminal von dem angenommenen MSR I liegen (Hollman et al., Nature 342, 643 (1989)) nur 17 % Identität auf und sind sich weniger ähnlich als die Bereiche C-terminal vom MSR I, die 45 % Identität aufweisen. Die "Cyc-Cys-Schleife", eine Handschrift der Liganden-kontrollierten Neurotransmitter-Rezeptor-Kanalkomplexe (Barnard, et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)) ist bei der Glutamat-Rezeptoruntereinheitfamilie nicht konserviert (5). Von der C-terminalen Hälfte der Glutamat-Rezeptoruntereinheit wird angenommen, daß sie an der Kanalbildung beteiligt ist und die vorausgesetzten Membrandurchdringenden Helixe (MSR I–IV, 5) enthält (Hollmann et al., Nature 342, 643 (1989)). Die angenommene MSR III ist die konservierteste kontinuierliche Sequenz mit nur einem konservativen Aminosäureaustausch (Val zu Ile) im GluR5-Protein (5). Wie oben erwähnt, differiert in anderen Liganden-kontrollierten Kanalfamilien das Segment zwischen MSR III und IV in Länge und Sequenz. Bei der Glutamat-Rezeptoruntereinheitsfamilie ist die Ähnlichkeit in diesem Segment hoch (48 %) und nur GluR5 entfaltet eine Sequenzlängenvariation. Die KA/AMPA-Rezeptoren und das GluR5-Protein weichen im allgemeinen C-terminal von dem angenommenen MSR IV ab.
  • Das Hydrophobizitäts-Diagramm von GluR5 ist ähnlich zu denen der KA/AMPA-Rezeptoren, was auf eine konservierte Sekundärstruktur in dem angenommenen Ionenkanal-bildenden Teil des Proteins schließen läßt. Die N-terminale Hälfte des GluR5-Hydrophobizitäts-Diagramms ist ungewöhnlich. In diesem Bereich ist GluR5 im Vergleich zu KA/AMPA-Untereinheiten hydrophober und enthält mehrere Segmente, die die Membran durchdringen könnten. Auf Basis von Algorithmen, die nach Membran-verbundenen Helixen suchen können, konnten vier (Rao und Argos, Biochim. Biophys. Acta 869, 197–214 (1986)) oder sieben (Eisenberg, et al., J. Mol. Biol. 179, 125–142 (1984) mutmaßliche Transmembranbereiche GluR5 zugeordnet werden.
  • Ein Vergleich der C-terminalen Bereiche von allen fünf Glutamat-Rezeptoruntereinheiten mit KA-Bindungsproteinen vom Frosch (Gregor et al., Nature 342, 689 (1989)) und vom Hühnchen (Wada et al., Nature 342, 684 (1989)) zeigt ein ähnliches Ausmaß an Sequenzkonservierung (35–40 % Aminosäurenidentität). Eine FASTA-Suche (Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 2444 (1988)) der GenBank, EMBL und SWISS-PROT-Datenbaken mit der GluR5-Sequenz entdeckte keine signifikanten Ähnlichkeiten zu anderen Proteinen.
  • Beispiel 16
  • Elektrophysiologische Eigenschaften von Oocyten, die mit GluR5-mRNA injiziert sind und L-Glutamat ausgesetzt werden
  • In vitro-synthetisierte GluR5-1- und GluR5-2-cRNA wurden einzeln in Xenopus oocyten exprimiert. Bei beiden cRNA wurden durch die Glutamat-Rezeptoragonisten KA (100 μM), AMPA (50 μM), Quisqualat (10 μm), APB (100 μM) und NMDA (100 μM, mit 10 μM Glycin appliziert) keine Membrandepolarisierungen in mit cRNA injizierten Oocyten ausgelöst. Schwache Membrandepolarisierungen durch L-Glutamat (100 μM) wurden jedoch in Oocyten aufgezeichnet, die mit GluR5-1 cRNA (maximale Depolarisierung 3,5 mV) und GluR5-2 cRNA (maximale Depolarisierung 4,5 mV) injiziert wurden.
  • Signifikant stärkere Membrandepolarisierungen wurden als Reaktion auf L-Glutamat in Oocyten festgestellt, die mit GluR5-1 und GluR5-2 cRNA injiziert wurden im Vergleich zu Oocyten, die mit GluR5-2 cRNA allein injiziert wurden. Für jeden bestimmten Oocyten, der mit GluR5-1 oder GluR5-2 cRNA injiziert wurde, waren die Depolarisierungen reproduzierbar, zeigten einen schnellen Start und kehrten (innerhalb 5 Minuten) langsam um, wenn die Agonistenfusion auf Pufferfusion geändert wurde. Weder nicht-injizierte Oocyten noch mit Wasser-injizierte Oocyten zeigten eine Reaktion auf den untersuchten Glutamat-Rezeptoragonisten. Reaktionen auf L-Glutamat wurden aufgezeichnet in 7 (von 7) Oocyten für GluR5-1 (Membrandepolarisierung 2,29 ± 0,26 mV s.e.m) und in 29 (von 33) Oocyten für GluR5-2 (2,27 ± 0,19 mV s.e.m).
  • Beispiel 17
  • Verteilung der GluR4 und GluR5-mRNA in sich entwickelnden zentralen und peripheralen Nervensystemen
  • Bei der Entwicklungsuntersuchung von GluR4- und GluR5-Gen-Expression wurden Abschnitte der Maus vom embryonalen Tag 10 (E10) bis zum postnatalen Tag 21 (P21) unter Verwendung von in situ-Hybridisierung und Histochemie untersucht.
  • Bei dem gesamten CNS wurden eine diffuse Expression der GluR4- und GluR5-Gene bei E10 nachgewiesen. Diese ersten Hybridisierungssignale stammen von postmitotischen Neuronen.
  • Dies wird am besten im Myelencephalon bei E12 gezeigt. Die ependymale Schicht liegt gegenüber vom neuralen Kanal und enthält sich teilende Neuroblasten. Keine Hybridisierung war in diesen Zellen nachweisbar. Die postmitotischen Zellen befinden sich im äußeren Teil des Neuralrohrs und exprimieren beide Gene. Später in der Entwicklung, wurden Transkripte für GluR5 und zu einem geringeren Ausmaß für GluR4 in Bereichen besonders auffallend, in denen Neuronen differenzieren und sich zu Kernen zusammenfügen. Diese temporalen Änderungen beim Hybridisierungsmuster wurden bei GluR5 am besten in den primären Sinneskernen der Medulla oblongata und den Kernen der Brücken festgestellt, die mit größerer Intensität hybridisieren als bei den umgebenden Strukturen At E14, wobei GluR5-Gen-Expression besonders intensiv in verschiedenen bestimmten Hirnkernen war, wohingegen die GluR-Gen-Expression über die gesamten rostralen und kaudalen Teile des Hirns nachweisbar war. Während der postnatalen Entwicklung änderte sich die räumliche Verteilung der GluR4-Gentranskripte nicht, aber gewöhnlich waren geringere mRNA-Mengen als zu den späteren embryonalen Stadien nachweisbar. Im Gegensatz dazu erschien die GluR5-Gen-Expression während der Entwicklung räumlich restriktiver zu werden und Transkriptgehalte wurden herunterreguliert. Extreme Änderung im temporalen GluR5-Hybridisierungsmuster waren in der Kleinhirnrinde zu erkennen. Bis zu P12 wurden GluR5-Transkriptgrade in der granulären und Purkinje-Zellschicht nachgewiesen. Später war die Intensität der Hybridisierungssignale in der granulären Zellschicht verringert im Verhältnis zu der Purkinje-Zellschicht und mit P14 beginnend wurde nur ein schwaches Hybridisierungssignal in der granulären Zellschicht nachgewiesen. Im allgemeinen hatten die Bereiche des Gehirns, die eine dichte Markierung während der embryonalen Entwicklung entfalteten, auch nachweisbare Transkriptgrade bei Erwachsenen. Bei P21-Tieren wurden die höchsten GluR4-Transkriptgrade in den Zellschichten des Riechkolbens, Hyppocampus, Cerebellum und der Retina festgestellt. Bei der Retina wurde starke Hybridisierung in der Ganglionzellschicht und den amakrinen Zellen der inneren nuklearen Schicht festgestellt. Keine Expression wurde in Muller-Zellen nachgewiesen. Bei GluR5 wurden die stärksten Hybridisierungssignale bei P21 im Riechkolben, dem Amygdala, dem Colliculi und einigen hypothalamischen Kernen festgestellt.
  • Bei dem sich entwickelnden peripheralen Nervensystem (PNS) zeigten die Hybridisierungsuntersuchungen, daß die GluR5- und GluR5-Gene, in verschiedenen Graden exprimiert wurden, in den cranialen Ganglia (z.B. trigeminalen Ganglion, akustischen Ganglia), dorsalen Wurzelganglia und den muralen Ganglia der Eingeweide. Vergleichbar mit dem CNS wurden Transkripte im PNS durch E10 für GluR4 und durch E11 für GluR5 nachgewiesen. Während der Entwicklung stiegen die Hybridisierungssignale für GluR4 kontinuierlich bis zu den frühen postnatalen Stadien an und setzten sich dann mit ähnlicher Intensität bei Erwachsenen fort. Hybridisierungssignale für GluR5 stiegen bis zu E16 und blieben mit vergleichbarer Intensität bei späteren Entwicklungsstadien. In postnatalen Tieren entfalteten dorsale Wurzelganglia (GluR5) und murale Ganglia der Eingeweide (GluR4 und GluR5) höhere Gehalte an Hybridisierung als beim CNS. Hochauflösende Autoradiographie in den dorsalen Wurzelganglia zeigten Hybridisierung der GluR5-Sonde bei muralen Zellen während Satellitzellen unmarkiert blieben.
  • Beispiel 18
  • Verteilung von GluR4- und GluR5-mRNA im Hirn eines erwachsenen Säugers (Ratte)
  • Die Verteilung der GluR4 und GluR5 mRNA-Transkripte im CNS vom Erwachsenen wurde durch in situ-Hybridisierung untersucht. Im Vorderhirnbereich wurden hohe GluR4-Transkriptgrade in den KA1 und dem Gyrus dentatus vom Hippocampus, in dem medialen Habenula und insbesondere retikulären Thalamuskern. Der Hippocampus zeigte nur eine schwache Expression des GluR5-Gens und keine Transkripte wurden in den medialen Habenula nachgewiesen. Das GluR5-Hybridisierungssignal war im Singulat und Piriform-Cortes, verschiedenen hypothalamischen Kernen, dem Amygdala und dem lateralen Septum stark. Im Cerebellum überlappten die Hybridisierungsmuster für GluR4- und GluR5-Sonden, waren aber unterschiedlich. Beide Sonden wurden in hohen Mengen in der Purkinje-Zellschicht nachgewiesen. In der granulären Zellschicht erzeugte die GluR4-Sonde starke Markierung, während die Markierung der GluR5-Sonde schwach war.
  • Beispiel 19
  • Isolierung von GluR6 und GluR7
  • cDNA-Klone, die GluR6- und GluR7-Gene codieren, wurden aus einer Vorderhirnbibliothek einer erwachsenen Ratte unter Verwendung eines Screening-Protokolls über die Hybridisierungsbedingungen bei niedriger Stringenz (siehe Beispiel 2) und einem radioaktiv markierten Fragment von ungefähr 1,2 kbp (Nukleotide 705–2048) der GluR5 cDNA als Sonde isoliert. Die ausgewählten Klone wurden durch Verdau unter Verwendung einer Restriktionskarte und Sequenzierung identifiziert. 11 zeigt die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des GluR6-Klons; 12 zeigt das gleiche für die Fragmente 35-T3 (12A) und U35 (12B) aus dem GluR7-Klon.
  • Beispiel 20
  • GluR-verwandte Assays
  • Die GluR-cDNA, mRNA, Proteine und funktionale Fragmente davon sind bei verschiedenen Assays nützlich, die L-Glutamat-Rezeptoren und Liganden identifizieren und charakterisieren. Die cDNA sind als Sonden nützlich, um zusätzliche Mitglieder der Glutamat-Rezeptor-Genfamilie zu identifizieren. mRNA, die durch die erfindungsgemäße DNA transkribiert wird, sind insbesondere in Assays nützlich, bei denen sowohl funktionale Rezeptoren als auch Liganden identifiziert und charakterisiert werden. Diese Verwendung ist besonders wichtig zur Identifizierung und zum Entwerfen von Verbindungen, die die L-Glutamat-Rezeptorwirkung beeinträchtigen.
  • Bei einem Assay zum Identifizieren und Charakterisieren funktionaler Rezeptoren, wird mRNA aus der erfindungsgemäßen DNA transkribiert (entweder vollständige oder Fragmente davon, hergestellt durch Deletionen, Substitionen, Synthese, usw.) und anschließend translatiert, um GluR-Proteine zu erzeugen. In einer bevorzugten Form werden die mRNA in Oocyten, bevorzugt in Xenopus oocyten translatiert. Die exprimierten Glutamat-Rezeptorproteine werden anschließend Liganden ausgesetzt, von denen bekannt ist, daß sie Glutamat-Rezeptoren binden und aktivieren. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Glutamat-Rezeptorproteine werden gemessen, solche die funktionale Ionenkanäle bilden, werden als funktionaler Glutamat-Rezeptor angesehen.
  • Bei einem verwandten Assay, durch das funktionale Liganden für Glutamat-Rezeptoren identifiziert werden, werden Proteine, von denen bekannt ist, daß sie funktional an Glutamat-Rezeptor-aktivierende Verbindung/Verbindungen binden, mit mindestens einer "unbekannten" oder Testverbindung, bei der die Fähigkeit, Glutamat-Rezeptoren auszulösen, um Ionenkanäle zu bilden bestimmt werden soll, in Kontakt gebracht. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Glutamat-Rezeptoren werden im Anschluß an das Inkontaktbringen mit der Testverbindung/den Testverbindungen gemessen und solche, die eine Ionenkanalreaktion auslösen werden als funktionale Liganden für Glutamat-Rezeptoren angesehen.
  • Abbildungen
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • Im folgenden werden die Abbildungen kurz beschrieben.
  • Die Abbildungen umfassen 10 Figuren:
  • 1 ist eine Abbildung, die die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons GluR1 zeigt.
  • 2 (a und b) umfaßt zwei Sequenzhomologieanalysen. 2a vergleicht den extrazellulären Bereich, der sich zwischen den Aminosäureresten 89 und 106 vom GluR1 befindet, wobei der "Cys-Cys-Schleifen"-Bereich, der in allen anderen Ligandenkontrollierten Ionenkanälen vorhanden ist, Sequenzhomologie zeigt. 2b vergleicht den mutmaßlichen TMD II-Bereich von GluR1 mit hypothetischen TMD II-Bereichen anderer Liganden-gesteuerten Ionenkanäle, was aus Proteinsequenzkonservierung schließen läßt.
  • 3 ist eine Abbildung, die die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons GluR2 zeigt.
  • 4 ist eine Abbildung, die die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons GluR3 zeigt.
  • 5 ist eine Abbildung, die die Anordnung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für GluR1, GluR2, GluR3, GluR4 und GluR (GluR5-1) Untereinheiten der Glutamat-Rezeptorgenfamilie zeigt.
  • 6 (A und B) umfaßt zwei Diagramme, die Stromreaktionen vergleichen, die in Xenopus oocyten gemessen wurden, die mit RNA einzelner GluR1-, GluR2- und GluR3-Untereinheiten (6A) oder Rattenhirn-Hippocampuspoly(A)+-RNA (6B) injiziert worden waren.
  • 7 (A und B) umfaßt zwei Digaramme, die Stromreaktionen vergleicht, die in Xenopus oocyten gemessen wurden, die in Kombinationen aus GluR1-, GluR2- und GluR3-RNA injiziert worden sind.
  • 8 umfaßt drei Diagramme, die die Abhängigkeit der Stromreaktionen auf 100 mM KA nach dem Membranpotential darstellt.
  • 9 ist eine Abbildung, die zeigt, daß die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons GluR4 zeigt.
  • 10 ist eine Abbildung, die die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Klons zeigt, der die Glutamat-Rezeptoruntereinheit GluR5-1 codiert.
  • 11 ist eine Abbildung, die die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons GluR6 zeigt.
  • 12 (A und B) ist eine Abbildung, die die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz der Fragmente 35-T3 und U35 des Klons GluR7 zeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Abbildungen
  • 1. Die Nukleotid- und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Klons pGluR1. Nukleotide sind in der 5'- bis 3'-terminalen Richtung numeriert, wobei mit dem ersten Nukleotid des Codons von dem mutmaßlichen aminoterminalen Rest des reifen Proteins begonnen wird. Es wird angenommen, daß die Spaltung des angenommenen Signalpeptids (von Heijne, Nucl. Acids Res., 14, 4683 (1986)) an Position 1 auftritt. Nukleotide, die sich stromaufwärts der vorhergesagten 5'-terminalen Base befinden, wurden mit negativen Zahlen versehen. Die Nukleotide –1 bis –54 codieren ein mutmaßliches Signalpeptid (von Heijne, supra) und die Basen –55 bis –251 stellen einen 5'-nicht-translatierten Bereich dar. Am 3'-Terminus des Klons wurden 71 Nukleotide der nicht-translatierten Sequenz festgestellt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz für GluR1 ist über der Nukleotidsequenz gezeigt, wobei die Numerierung mit dem ersten Rest des reifen Proteins beginnt. Mögliche extrazelluläre N-Glycosylierungsstellen wurden mit einem Asterisk über der Aminosäuresequenz markiert. Der Bereich, der durch zwei Pfeile (Aminosäuren 89–103) markiert ist, zeigt etwas Ähnlichkeit mit der Liganden-kontrollierten Ionenkanalhandschrift, die von einigen postuliert wurde (Grenningloh et al., Nature 330, 25 (1987); Barnard et al., TINS 10, 502 (1987)).
  • 1 Verfahren. Die Insert-cDNA des Bakteriophagen-Klons λZAPP-GluR-K1 wurde mit Eco RI/Xho I geschnitten, mit glatten Enden versehen und in die Sma I-Stelle des Bakteriophagenvektors M13mp19 subkloniert (Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3642 (1977)), wodurch Klone mit beiden Orientierungen der cDNA erhalten wurden. Überlappende deletierte Subklone wurden aus jeder Strangorientierung unter Verwendung des CycloneTM-Kits von USB hergestellt. Einzelsträngige Sequenzierung durch das Didesoxynukleotid-DNA-Sequenzierungsverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)) wurde mit allen 45 Subklonen durchgeführt und zusätzlich wurden 10 Oligonukleotidprimer synthetisiert, um das Sequenzieren in Bereichen zu erleichtern, in denen mit Kompressionen oder Abständen in den Sequenzen, die von den Deletionssubklonen abstammen, zu rechnen sind. Vollständige Sequenzen beider Stränge wurden so erhalten. Intelli-Genetics Software packages (IntelliGenetics Version 5.0, und PC/GeneTM) wurden zum Analysieren der Sequenzen verwendet.
  • 2a. Vergleich des extrazellulären Bereichs, der sich zwischen den Aminosäureresten 89 und 106 von GluR1 befindet, wobei der "Cys-Cys-Schleifen"-Bereich, der in allen Ligandenkontrollierten Ionenkanälen festgestellt wurde, Sequenzhomologie zeigt. Sequenzen der nAchR-Untereinheiten α1, β1, γ und δ sind vom Mäusemuskel (Heinemann et al., in: Molecular Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (Hrs. Heinemann, S. & Patrick, J.), 45–96 (Plenum Press, New York, 1987)), die von nAChR-Untereinheiten α2, α3, α4, β2, β3 und βb sind vom Rattenhirn (Deneris et al., J. biol. Chem. 264, 6268 (1989); Duvoison et al., Neuron 3, 487 (1989)); GABAA Untereinheiten α und β sind vom Kalbserum (Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987)). GlyR 48k ist die Mr = 48 kDa Untereinheit des Glycin-Rezeptors vom Rattenhirn (Grenningloh et al., Nature 328, 215–220 (1987)). Aminosäurereste in Kästen werden an identischen Positionen in GluR1 festgestellt, sowie in mindestens einer anderen Rezeptorsequenz. Ein Abstand wurde arbiträr eingefügt.
  • 2b. Vergleich des mutmaßlichen TMD II-Bereichs von GluR1 mit hypothetischen TMD II-Bereichen anderer Ligandenkontrollierter Ionenkanäle (Barnard et al., Trends Neurosci. 10, 502 (1987); Deneris et al., J. Biol. Chem. 264, 6268 (1989); Duvoisin et al., Neuron 3, 487 (1989); Grenningloh et al., Nature 328, 215 (1987); Heinemann et al., in Molecular Neurobiology: Recombinant DNA Approaches (Hrsg. Heinemann. S. & Patrick, J.) 45–96 (Plenum Press, New York, 1987)), was auf Protein-Sequenzkonservierung schließen läßt.
  • 3. Nukleotid und abgeleitete Aminosäuresequenz des cDNA-Klons 1RB14, der das Glutamat-Rezeptor-Untereinheitsgen GluR2 der Ratte codiert. Die Nukleotide sind in der 5'- bis 3'-Richtung markiert, wobei mit dem ersten Nukleotid in dem Codon begonnen wird, das dem mutmaßlichen aminoterminalen Rest des reifen Proteins entspricht. Die Nukleotide, die über 5' der Base 1 hinausreichen, werden mit negativen Nummern versehen und umfassen den Bereich, der das mutmaßliche Signalpeptid und den 5'-nicht-translatierten Bereich codiert. Es gibt fünf potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen, die sich an Asn-235, Asn-349, Asn-385, Asn-392 und Asn-835 befinden. Die berechnete Molekularmasse der reifen nichtglycolysierten Form des GluR2-Proteins beträgt 96 400 Daltons. Das Asterisk zeigt ein Translationsterminations-Codon an.
  • 4. Nukleotid und abgeleitete Aminosäuresequenzen des Klons 1RB312, der das Glutamat-Rezeptor-Untereinheitsgen GluR3 der Ratte codiert. Die Nukleotide sind in der 5'- bis 3'-Richtung numeriert, wobei mit dem ersten Nukleotid in dem Codon begonnen wird, das den mutmaßlichen aminoterminalen Rest des reifen Proteins entspricht. Die Nukleotide, die über 5' der Base 1 hinausreichen, sind mit negativen Zahlen versehen und umfassen den Bereich, der das mutmaßliche Signalpeptid und den 5'-nichttranslatierten Bereich codiert. Es gibt fünf potentielle N-gebundene Glycosylierungsstellen, die sich an Asn-35, Asn-238, Asn-352, Asn-387 und Asn-394 befinden. Die berechnete Molekularmasse der reifen, nichtglycosylierten Form des GluR3-Proteins beträgt 98 000 Daltons. Das Asterisk zeigt ein Translationsendcodon an.
  • 5. Anordnung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Glutamat-Rezeptoruntereinheiten der Ratte. Identische Reste in allen miteinander verglichenen Sequenzen sind umrahmt, Freistellen wurden eingeführt, um die Homologie zu maximieren. Vorherbestimmte Signalpeptide und vier angenommene Membran-durchdringende Bereiche (MSR I–IV) sind angezeigt. Zwei Pfeilköpfe
    Figure 00510001
    grenzen einen Bereich in GluR1 ab, von dem angenommen wird, daß er der "Cys-Cys"-Schleife, die in allen Liganden-kontrollierten Ionenkanaluntereinheiten festgestellt wurde (Barnard et al., Trends, Neurosci. 10, 502 (1987)) entspricht (Hollman, et al., Nature 342, 643 (1989)). Die gestrichelte Linie zeigt die Insertion von 15 Aminosäureresten an, die im GluR5-1- aber nicht im GluR5-2-Protein festgestellt wurde.
  • 6. Vergleich der Stromreaktionen, die Xenopus oocyten gemessen wurden, die mit RNA einzelner GluR1-, GluR2- und GluR3-Untereinheiten oder mit Rattenhirn-Hyppocampuspoly(A)+-RNA injiziert worden sind.
  • (A) Reaktionen der Oocyten auf 100 mM KA, die 3 Tage nach der Injektion der einzelnen GluR1 (2 ng), GluR2 (10 ng) oder GluR3 (2 ng) RNA gemessen wurden. Das Insert zeigt Beispiele von Spannungsaufzeichnungen, die von solchen Oocyten erhalten wurden, außer daß die GluR2-Reaktion 5 Tage nach der Injektion von 25 ng RNA gemessen wurde. (B) Reaktionen der Oocyten auf die angezeigten Agonisten, die 3 Tage nach der Injektion mit GluR1 (2 ng) oder GluR3 (2 ng) RNA oder mit Rattenhirn-Hyppocampuspoly(A)+-RNA (ca. 50 ng) gemessen wurden. Alle Werte werden auf die Reaktion normalisiert, die mit 100 mM KA erhalten wurde und sind als Mittelwerte ± S.E.M. mit n ≥ 3 bei allen Messungen. Alle Oocyten wurden mit einer Spannungsklemme bis auf –70 mV versehen und Aufzeichnungen wurden wie von Hollmann et al., Nature 342, 643 (1989) beschrieben, durchgeführt.
  • 7. Vergleich der Stromreaktionen, die in Xenopus oocyten gemessen wurden, die mit Kombinationen aus GluR1-, GluR2- und GluR3-RNA injiziert worden sind.
  • (A) Reaktionen der Oocyten auf 100 mM KA, die 3 Tage nach Injektion von 2 ng RNA jeder der angezeigten GluR-Untereinheiten gemessen wurden. Die offenen Säulen stellen die Summe der Reaktionen dar, die in Oocyten gemessen wurden, die die einzelnen GluR-Untereinheits-RNA exprimieren, während die gestrichelten Säulen die gemessenen Amplituden nach der Co-Expression der RNA der GluR-Untereinheiten in einzelnen Oocyten darstellen. (B) Reaktionen von Oocyten auf die angezeigten Agonisten, die 3 Tage nach der Injektion von 2 ng RNA jeder der angezeigten GluR-Untereinheiten oder 50 ng Rattenhirn-Hyppocampuspoly(A)+-RNA gemessen wurden. Die Werte sind auf die Reaktion normalisiert worden, die mit 100 mM KA erhalten worden ist und sind als Mittelwert ± S.E.M. mit n > 3 für alle Messungen dargestellt. Alle Oocyten wurden auf –70 mV geklammert und die Aufzeichnungen wurden wie von Hollmann et al., Nature 341, 643 (1989) beschrieben, durchgeführt.
  • 8. Die Abhängigkeit der Stromreaktionen auf 100 mM KA nach dem Membranpotential. (A) Daten, die bei Oocyten erhalten wurden, die injiziert worden sind mit Rattenhirn-Hyppocampuspoly(A)+-RNA (50 ng, ausgefülltes Quadrat ∎), GluR1 (offenes Quadrat O) oder GluR3-RNA (offener Kreis, O), (B) GluR1- plus GluR2-RNA (ausgefülltes Quadrat ∎) oder GluR1- plus GluR3-RNA (offenes Quadrat ⎕) und (C) GluR2- plus GluR3-RNA (ausgefülltes Quadrat ∎) oder die RNA aller drei GluR-Untereinheiten (offenes Quadrat ⎕). Die Aufzeichnungen wurden bei Oocyten 3 Tage nach der Injektion von 2 ng RNA jeder GluR-Untereinheit gemacht. Die Spannungen lagen in 10 mV-Schritten zwischen –150 mV und +50 mV und alle Werte sind auf die Reaktion, die bei –70 mV gemessen wurde, normalisiert.
  • 10. Nukleotid- und Aminosäuresequenz eines einzelnen cDNA-Klons (λRB20), der die Ratten-Glutamat-Rezeptoruntereinheit GluR5-1 codiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist über der Nukleotidsequenz gezeigt. Die Spaltung des angenommenen Signalpeptids wird an der Aminosäureposition 1 angenommen (von Heijne, Nucl. Acids Res. 14, 4683 (1986)). Diese Spaltungsstelle liegt nach einem Prolinrest, was untypisch ist. Die Aminosäuren, die das Signalpeptid codieren, wurden mit negativen Zahlen versehen. Die Nukleotide sind in der 5'- bis 3'-Richtung numeriert, wobei mit dem ersten Rest des Codons für den mutmaßlichen aminoterminalen Rest des reifen Proteins begonnen wird. Die Nukleotide auf der 5'-Seite des Aminosäure-Restes 1 sind durch negative Zahlen angezeigt. Stopp-Codone, die den offenen Leseramen (ORF) flankieren, sind mit "END" bezeichnet, die Polyadenylierungssignale sind unterstrichen. Stellen mutmaßlicher N-gebundener Glycolysierung sind durch Asterisks (*) angezeigt. Die Pfeilköpfe
    Figure 00540001
    grenzen die Insertion von 45 Nukleotiden zwischen Nukleotiden 1113 und 1159 ab, die in λRB20 festgestellt wurde, die aber nicht in 12 der 29 isolierten cDNA-Klone gefunden wurde.
  • Tabellen Tabelle 1: Pharmakologie des Glutamat-Rezeptors der durch GluR1 codiert wird: Eigenschaften verschiedener Glutamat-Rezeptorantagonisten, die in Oocyten gemessen wurden, die mit GluR1 in vitro RNA injiziert worden sind.
    Figure 00540002
  • Oocyten sind mit 1,25 ng GluR1 in vitro Sinn-RNA 3 Tage vor der Aufzeichnung injiziert worden. Die Oocyten, die mit einer Spannungsklammer versehen worden sind, wurden –70 mV ausgesetzt und die Testverbindung (alle bei 1 mM, außer Kainat, das 30 μM) betrug, wurden durch schnelle Superfusion mit 5-minütigen Intervallen zwischen den Medikamenten appliziert. Der Höhepunkt der Ströme wurde aufgezeichnet und jede Zahl stellt den Durchschnitt von drei Aufzeichnungen aus drei unterschiedlichen Oocyten ± SEM dar. Die 100%ige Stromreaktion entspricht 50 bis 200 nA, in Abhängigkeit der Oocyten.
  • Tabelle 2: Prozentuale Aminosäuresequenzidentität unter paarweisen Kombinationen der Mitglieder der Glutamat-Rezeptoruntereinheits-Genfamilie
    Figure 00550001
  • Die Sequenzen wurden unter Verwendung einer Sequenzanalysen-Software von der Universität von Wisconsin Genetics Computer Group (Devereux, et al., Nucl. Acids Res., 12, 387 (1984)) miteinander verglichen. Die prozentuale Sequenzidentität zwischen dem gepaarten Sequenzen wurde berechnet durch Dividieren der Zahl der angeordneten Positionen zwischen identischen Aminosäuren durch die Gesamtzahl der angeordneten Positionen in der vierten untersuchten Sequenz und der Quotient wurde mit 100 multipliziert.
  • Zusammenfassung der Beschreibung
  • Aus der vorhergehenden Beschreibung versteht der Fachmann, daß erfindungsgemäß substantiell reine DNA-Segmente offenbart werden, die eine Familie von Glutamat-Rezeptoruntereinheitsproteinen codieren. Die erfindungsgemäßen Glutamat-Rezeptoren sind Proteine oder funktionale Fragmente davon, die elektrophysiologische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, die bei Glutamat-Rezeptoren charakteristisch sind, einschließlich Glutamat-Rezeptorsubtypen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-D-aspartat (NMDA), AMPA oder Quisqualat, Kainat (KA) und 2-Amino-4-phosphonobutyrat (APB). Die erfindungsgemäßen neuen Glutamat-Rezeptoren werden durch Proteine dargestellt, die durch cDNA-Klone GluR1, GluR2 und GluR3 codiert werden und funktionale Kombinationen davon sowie funktionale Peptid-Fragmente, die dadurch codiert werden. Sowohl die Glutamat-Rezeptorgene als auch die Proteine der Erfindung sind zum Drug-Screening nützlich. Zusätzlich können die cDNA von GluR1–GluR3 als Sonden verwendet werden, so daß der Fachmann ohne aufwendige Experimente andere neue Glutamat-Rezeptoren identifizieren und isolieren kann. Solche anderen neuen Glutamat-Rezeptoren sind erfindungsgemäß umfaßt.
  • Ohne den erfindungsgemäßen Umfang zu verlassen, kann ein Fachmann verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung durchführen, um sie an seine Verwendungen und Bedingungen anzupassen. Als solches sind diese Änderungen und Modifikationen vom Äquivalenzbereich der folgenden Ansprüche vollständig umfaßt.

Claims (20)

  1. Im wesentlichen reine Proteine oder Fragmente davon oder Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder diesen Fragmenten, wobei diese Proteine oder Fragmente oder Kombinationen ein neuronales Signal als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamat-ähnlichen Liganden an mindestens einem Glutamatrezeptor erzeugen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4), und wobei diese Proteine oder Fragmente oder Kombinationen durch DNA mit mindestens ungefähr 40 % Nukleotidsequenzhomologie mit mindestens einem Mitglied aus der Gruppe dieser Glutamatrezeptoren kodiert wird.
  2. Im wesentlichen reine Proteine oder Fragmente davon oder Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder diesen Fragmenten, wobei diese Proteine oder Fragmente oder Kombinationen ein neuronales Signal als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamat-artigen Liganden an mindestens einem Glutamatrezeptor erzeugen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4), und wobei die Proteine oder Fragmente oder Kombinationen mindestens ungefähr 40 % Aminosäurehomologie mit mindestens einem Mitglied dieser Gruppe von Glutamatrezeptoren haben.
  3. Proteine oder Fragmente davon oder Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder diesen Fragmenten gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Proteine oder Fragmente oder Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder diesen Fragmenten ein neuronales Signal als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamat-artigen Liganden an einen Glutamatrezeptor-Subtypen erzeugen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-D-aspartat-(NMDA), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionsäure- (AMPA), Kainat- (KA) und 2-Amino-4-phosphonobutyrat- (APB)-Subtypen.
  4. Proteine oder Fragmente davon oder Kombinationen aus diesen Proteinen und/oder diesen Fragmenten gemäß Anspruch 3, wobei diese Proteine oder Fragmente oder Kombinationen ein neuronales Signal als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamat-artigen Liganden eines Glutamatrezeptors der KA- und/oder AMPA-Subtypen erzeugen.
  5. Im wesentlichen reines Protein, ausgewählt aus der Gruppe an Proteinen bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4) und Kombinationen daraus, wobei diese Kombinationen als Glutamatrezeptoren funktionieren.
  6. Proteine gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei diese Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (Mr ca. 99.769), GluR2 (Mr ca. 96.400) und GluR3 (Mr ca. 98.000).
  7. Im wesentlichen reine DNA, kodierend funktionale Proteine, oder funktionale Fragmente davon, welche ein neuronales Signal als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamat-artigen Liganden an mindestens einen Glutamatrezeptor erzeugen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4), wobei die DNA mindestens 40 % Nukleotidsequenzhomologie mit mindestens einem Mitglied dieser Gruppe von Glutamatrezeptoren aufweist.
  8. Im wesentlichen reine DNA, kodierend funktionale Proteine, oder funktionale Fragmente davon, die als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamatartigen Liganden an mindestens einen Glutamatrezeptor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4) ein neuronales Signal erzeugen, wobei diese DNA ein Protein mit mindestens ungefähr 40 % Aminosäurehomologie mit mindestens einem Mitglied dieser Gruppe an Glutamatrezeptoren kodiert.
  9. DNA gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei die kodierten Proteine oder Fragmente ein neuronales Signal als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamatartigen Liganden an einen Glutamatrezeptor-Subtyp erzeugen, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-D-aspartat- (NMDA), α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-isoxazol-4-propionsäure- (AMPA), Kainat- (KA) und 2-Amino-4-phosphonobutyrat- (APB)-Subtypen.
  10. DNA gemäß Anspruch 9, wobei die kodierten Proteine oder Fragmente als Reaktion auf die Bindung von Glutamat oder Glutamat-artigen Liganden an die Glutamatrezeptoren von KA- und/oder AMPA-Subtypen ein neuronales Signal erzeugen.
  11. DNA gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die DNA aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4) DNA besteht.
  12. DNA gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei diese DNA ein Glutamatrezeptorprotein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GluR1 (Mr ca. 99.769), GluR2 (Mr ca. 96.400) und GluR3 (Mr ca. 98.000) besteht.
  13. DNA gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die DNA der DNA, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GluR1, GluR2 und GluR3 besteht, funktional äquivalent ist.
  14. DNA-Sonden umfassend GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4), cDNA oder Fragmente davon, wobei diese Fragmente mindestens 20 Basenpaare lang sind und von den zusammenhängenden Carboxyl kodierenden Enden der DNA-Sequenzen stammen.
  15. DNA-Sonden gemäß Anspruch 14, wobei diese Sonden von den Ionenkanal kodierenden Teilen dieser cDNA-Sequenzen stammen.
  16. Sense- oder Antisense-mRNA-Sequenzen, die von der DNA gemäß Anspruch 8 oder 9 transkribiert werden.
  17. Nichtmenschliche Oozyten, die die Sense- oder Antisense-mRNA nach Anspruch 16 exprimieren.
  18. Verfahren zum Identifizieren von DNA, die homolog zu der DNA ist, die mindestens ein Glutamatrezeptorprotein kodiert, in einer Testprobe, wobei dieses Verfahren das Kontaktieren von Test-DNA mit Sonden-DNA gemäß Anspruch 14 unter hoch- oder niedrigstringenten Hybridisierungsbedingungen und das Identifizieren der Test-DNA, die mit dieser Sonde hybridisiert, als homolog mit der DNA, die Glutamatrezeptorprotein(e) kodiert, umfaßt.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die DNA-Sequenzen, die als Sonden verwendet werden, den Ionenkanal kodierenden Teil(e) von GluR1, GluR2 und GluR3 einschließen.
  20. Verfahren zum Bestimmen, ob eine Substanz ein funktionaler Ligand für mindestens ein Glutamatrezeptorprotein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GluR1 (1), GluR2 (3) und GluR3 (4), ist, wobei dieses Verfahren das Kontaktieren dieses funktionalen Glutamatrezeptors mit dieser Substanz, das Überwachen der Ionenkanalaktivität und das Identifizieren solcher Substanzen, die eine Ionenkanalantwort bewirken, als funktionale Liganden umfaßt.
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