DE69132581T3

DE69132581T3 - Verbesserte chimäre toxine

Info

Publication number: DE69132581T3
Application number: DE69132581T
Authority: DE
Inventors: Diane Williams; John R. Murphy
Original assignee: Boston Medical Center Corp
Current assignee: Boston Medical Center Corp
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1991-02-28
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2011-03-01
Also published as: ES2155821T3; US5703039A; GR3036081T3; US5932471A; FI923915A; DK0517829T3; CA2076678C; US5616482A; EP0517829A4; JPH06500531A; ATE200493T1; AU7493191A; ES2155821T5; WO1991013090A1; US5677148A; EP0517829A1; US5863891A; US5763250A; DE69132581D1; DE69132581T2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zur Konstruktion chimärer Toxinmoleküle.
Die Literatur enthält viele Beispiele fusionierter Gene, die für chimäre Proteine codieren. Zum Beispiel beschreibt Villa-Komaroff et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727-3731, ein fusioniertes Gen, das aus einem eukaryotischen Strukturgen besteht, das mit einem nicht-zytoplasmatischen bakteriellen Gen fusioniert ist. Das fusionierte Gen codiert für ein chimäres Protein, das aus dem Zytoplasma transportiert wird. Murphy U.S. Patent Nr. 4,675,382 beschreibt die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zur Erzeugung eines hybriden, oder chimären, Proteins, das aus einem Teil des Diphtherietoxin-(DT-)Moleküls besteht, das durch eine Peptidverbindung mit einem zellspezifischen Liganden, wie α-melanozytenstimulierendem Hormon (MSH), verbunden ist. Das chimäre DT-MSH-Toxin war für bestimmte Zielzellen selektiv toxisch, d. h., α-MSH-Rezeptor-positive, humane, maligne Melanomzellen.
Ein Diphtherietoxin-verwandtes Fusionsprotein, DAB₄₈₆-IL-2, in dem die native Rezeptorbindungsdomäne von DT genetisch durch einen Teil des Polypeptidhormons Interleukin-2 (IL-2) ersetzt wurde, ist in Williams et al. (1987), Protein Engineering 1: 493-498, beschrieben. DAB₄₈₆-IL-2 ist ein 68142 Da Fusionsprotein, das in der folgenden Reihenfolge besteht aus: Met; DT-Resten 1-485; und Aminosäuren 2 bis 133 von reifem Human-IL-2. Es wurde gezeigt, dass DAB₄₈₆-IL-2 an den IL-2-Rezeptor bindet und selektiv Lymphozyten vergiftet, welche die Hochaffinitätsform des IL-2-Rezeptors tragen, Bacha et al. (1988), J. Exp. Med., 167: 612-622. Des weiteren erfordert die zytotoxische Wirkung von DAB₄₈₆-IL-2, wie jene von nativem Diphtherietoxin, eine rezeptorvermittelte Endozytose, einen Durch-gang durch einen säurehaltigen Abschnitt, und die Abgabe von Fragment A, das mit ADP-Ribosyltransferase assoziiert ist, an das Zytosol von Zielzellen, Bacha et al. (1988) supra.
US-A-4830962 offenbart rekombinante Vektoren, von welchen behauptet wird, dass sie zum Exprimieren von DNA-Sequenzen wirksam sind, die für spezifische Fragmente von Diphtherietoxinen in hohen Werten in rekombinanten Wirtszellen codieren. Ein Polypeptidfragment, das aus der enzymatisch aktiven A-Kette von Diphtherietoxin besteht, und ein Polypeptidfragment, das sowohl aus dem A-Abschnitt als auch einer B-Abschnitt-Teilsequenz besteht, können durch die Verwendung dieser Vektoren konstruiert werden.
Williams et al., Protein Engineering, 1: 493-498 (1987) offenbaren die Substitution einer Diphtherietoxin-Rezeptor-Bindungsdomäne mit Interleukin-2, so dass ein Fusionsprotein erhalten wird.
Cabiaux et al., J. Biol. Chem., 246(9): 4928-2938 (1989) analysieren die Sekundärstruktur von Diphtherietoxin und seinen Fragmenten. Die Wechselwirkung mit säurehaltigen Liposomen wird durch polarisierte Infrarotspektroskopie untersucht.
Bachs et al., J. Biol. Chem., 258(3): 1565-1570 (1983) besprechen Thyreotropin freisetzende Hormon-Diphtherietoxin-verwandte Polypeptidkonjugate und betrachten die mögliche Rolle einer hydrophoben Domäne im Toxin-Eintrag.
Colombatti et al., J. Biol. Chem., 261(7): 3030-3035 (1986) verwenden ein geklontes Fragment von Diphtherietoxin, das an einen T-zellspezifischen Antikörper gebunden ist, zur Identifizierung von Regionen einer B-Kette, die beim Zelleintritt aktiv sind.
WO91/19745 offenbart chimäre Toxine, die Fragmente von Diphtherietoxin enthalten. Von den chimären Toxinen wird behauptet, dass sie eine verbesserte Inter-Domäne-Geometrie aufweisen.
EP-A-0332174 offenbart zellspezifische, zytotoxische Agenzien, die auf einem modifizierten Diphtherietoxin beruhen.
EP-A-0259904 offenbart verschiedene zytotoxische Medikamente, von welchen behauptet wird, dass sie in der krebsbekämpfenden Therapie nützlich sind. Die Medikamente umfassen chemische Konjugate mit einer zytotoxischen Komponente (die zum Beispiel Diphtherietoxin sein kann).
WO87/02987 offenbart ein zielgerichtetes Toxinmolekül. Das Molekül enthält einen toxischen Teil (umfassend z. B. Diphtherietoxin), der groß genug ist, um eine zyotoxische Aktivität aufzuweisen, und klein genug ist, um keine generalisierte eukaryotische Zellbindung zu haben. Der toxische Teil enthält ein nicht von Natur aus vorkommendes Cystein, und ist durch dieses Cystein chemisch an einen zellspezifischen Liganden gebunden, umfassend ein Peptid, einen proteinhaltigen Wachstumsfaktor, oder ein Steroidhormon.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein chimäres Toxin bereit, welches Proteinfragmente, die durch Peptidbindungen verbunden sind, aufweist, wobei das chimäre Toxin in aufeinanderfolgender Reihenfolge, beginnend am Amino-Terminus des chimären Toxins, umfasst:

(a) das enzymatisch aktive Fragment A von Diphtherietoxin,
(b) ein erstes Fragment, das die Spaltungsdomäne I₁ neben dem Fragment A von Diphtherietoxin enthält,
(c) ein zweites Fragment, das zumindest einen Teil der hydrophoben Transmembranregion von Fragment B von Diphtherietoxin aufweist, wobei das zweite Fragment eine Deletion von mindestens 50 Diphtherietoxinaminosäureresten aufweist, wobei die Deletion C-terminal zu dem Teil der Transmembranregion ist, und wobei das zweite Fragment auch nicht die Domäne I₂ oder die generalisierte Bindungsdomäne von Diphtherietoxin enthält; und
(d) ein drittes Fragment, welches einen Teil eines zellspezifischen Polypeptidliganden aufweist, wobei der Teil zumindest einen Teil der Bindungsdomäne des Polypeptidliganden enthält, der bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an eine vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die von dem enzymatisch aktiven Fragment A angegriffen werden; wobei das chimäre Toxin die Sequenzen des Fragments B zwischen Ser 292 und Thr 382 umfasst und eine größere Toxizität gegenüber dieser Klasse von Zellen aufweist als jene eines Toxins, das aus DAB₄₈₆ besteht, das an das dritte Fragment fusioniert ist.

In bevorzugten Ausführungsbeispielen besitzt das chimäre Toxin zumindest eines, und mehr bevorzugt zumindest zwei, und ganz bevorzugt mindestens drei von: höhere Toxizität für rezeptortragende Zellen als jene eines analogen DAB₄₈₆-enthaltenden Toxins (ein analoges DAB₄₈₆ enthaltendes Toxin ist ein Toxin, das mit dem chimären Toxin des bevorzugten Ausführungsbeispiels identisch ist, mit der Ausnahme, dass DAB₄₈₆ die Fragmente von DT ersetzt, die oben unter (a), (b) und (c) genannt sind, d. h., ein Toxin, das aus DAB₄₈₆ besteht, das mit dem Fragment fusioniert ist, das oben unter (d) definiert ist); einen geringeren K_d-Wert (d. h., eine größere Bindungsaffinität) für den Rezeptor (d. h., die Stellen, an welche das dritte Fragment (zuvor beschrieben) an den anzugreifenden Zellen bindet) als jenen eines analogen DAB₄₈₆ enthaltenden Toxins; eine größere Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau als jene eines DAB₄₈₆ enthaltenden Toxins; eine größere Resistenz gegenüber der Hemmung seiner Zytotoxizität durch kompetitive Inhibitoren, z. B. das oben unter (d) genannte Polypeptid, als jene, die ein analoges DAB₄₈₆ enthaltendes Toxin aufweist; die Fähigkeit, die Proteinsynthese in Zielzellen durch eine Einwirkungsdauer auf ein bestimmtes Maß zu hemmen, die kürzer als die Einwirkungsdauer ist, die von einem analogen DAB₄₈₆ enthaltenden Toxin benötigt wird, um die Proteinsynthese auf dasselbe Maß zu hemmen; oder die Möglichkeit, einen Beginn der Hemmung der Proteinsynthese rascher herbeizuführen, als bei einem analogen DAB₄₈₆ enthaltenden Toxin beobachtet wird.
Zu weiteren bevorzugten Ausführungsbeispielen zählen: chimäre Toxine, welchen die Diphtherietoxin-Sequenzen C-terminal zu dem Aminosäurerest 386 des nativen Diphtherietoxins fehlen; und chimäre Toxine, welche DAB₃₈₉, fusioniert mit dem dritten, zuvor definierten Fragment, enthalten.
Zu weiteren bevorzugten Ausführungsbeispielen zählen: ein chimäres Toxin, in dem das dritte Fragment zumindest einen Abschnitt von Interleukin-2 umfasst, der bewirkt, dass das chimäre Toxin an IL-1-Rezeptor-tragende Zellen, insbesondere T-Zellen, bindet, wobei dieser Abschnitt vorzugsweise die Bindungsdomäne und insbesondere die Aminosäuren 2 bis 133 von Human-IL-2 ist; ein chimäres Toxin, bei dem das dritte Fragment zumindest einen Abschnitt von EGF aufweist, der bewirkt, dass das chimäre Toxin an Zellen bindet, die den EGF-Rezeptor tragen, wobei dieser Abschnitt vorzugsweise die Bindungsdomäne von EGF ist und insbesondere das dritte Fragment EGF umfasst; das chimäre Toxin DAB₃₈₉-IL-2, und das chimäre Toxin DAB₃₈₉-EGF.
In anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen, in welchen der Ligand IL-2 oder ein Teil davon ist, besitzt das chimäre Toxin zumindest eines der folgenden: eine größere Toxizität gegenüber IL-2-Rezeptor-tragenden Zellen als jene, die DAB₄₈₆-IL-2 aufweist, einen geringeren K_d-Wert für den IL-2-Hochaffinitätsrezeptor als jenen von DAB₄₈₆-IL-2, oder eine größere Resistenz als jene, die DAB₄₈₆-IL-2 aufweist.
Das dritte Fragment kann einen Teil der Bindungsdomäne von EGF aufweisen, welche bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an eine bestimmte Klasse von Zellen bindet, die einen Rezeptor für EGF tragen. Das dritte Fragment kann EGF aufweisen.
In anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen, in welchen der Ligand EGF oder ein Teil davon ist, besitzt das chimäre Toxin zumindest eines der folgenden: eine größere Toxizität gegenüber EGF-Rezeptor-tragenden Zellen als jene, die DAB₄₈₆-EGF aufweist; einen geringeren K_d-Wert für den EGF-Rezeptor als jenen von DAB₄₈₆-EGF, eine größere Resistenz gegenüber der Hemmung seiner Zytotoxizität durch kompetitive Inhibitoren, z. B., EGF, als jene von DAB₄₈₆-EGF; die Fähigkeit, die Proteinsynthese in EGF-Rezeptor-tragenden Zellen auf ein bestimmtes Maß durch eine Einwirkungsperiode zu hemmen, die kürzer ist als die Einwirkungsperiode, die von DAB₄₈₆-EGG benötigt wird, um die Proteinsynthese auf dasselbe Maß zu hemmen; oder die Fähigkeit, einen rascheren Beginn der Hemmung der Proteinsynthese in EGF-Rezeptor-tragenden Zellen herbeizuführen als bei DAB₄₈₆-EGF beobachtet wird.
Das dritte Fragment kann zumindest einen Teil der Bindungsdomäne von IL-4 oder IL-6 aufweisen, die bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an die vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die einen Rezeptor für IL-4 bzw. IL-6 tragen. Vorzugsweise weist das dritte Fragment IL-4 oder IL-6 auf.
Die Deletion im zweiten Fragment ist vorzugsweise mindestens 80 Diphtherietoxin-Aminosäurereste. Sie kann eine Sequenz bis zu 97, vorzugsweise 99, Diphtherietoxin-Aminosäurereste aufweisen, wobei die Sequenz die I₂-Domäne enthält.
Das chimäre Toxin des ersten Aspekts der Erfindung kann zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt werden.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung eine rekombinante Molekül-DNA bereit, die für das chimäre Toxin des ersten Aspekts codiert, sowie einen Expressionsvektor, der ein solches rekombinantes DNA-Molekül aufweist, und eine Zelle, die mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines chimären Toxins des ersten Aspekts bereitgestellt, umfassend das Kultivieren einer Zelle, die mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, so dass das chimäre Toxin, das von dem DNA-Molekül exprimiert wird, von der kultivierten Zelle oder dem Überstand isoliert werden kann.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge des chimären Toxins des ersten Aspekts und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann die Form einer injizierbaren Zusammensetzung, eines Implantats mit zeitlich verzögerter Freisetzung oder einer topischen Creme aufweisen. Eine solche Zusammensetzung kann in der Medizin verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines Toxins des ersten Aspekts in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereit, zur Behandlung eines Zustandes, der Krebs oder ein anderer Zustand ist, der durch die Gegenwart einer Klasse unerwünschter Zellen gekennzeichnet ist, an welche ein Polypeptid selektiv binden kann, vorzugsweise zur Behandlung von Menschen.
Die chimären Toxine der Erfindung werden vorzugsweise von fusionierten Genen codiert, welche Regionen enthalten, die für die Proteinfragmente des chimären Toxins codieren, DNA-Sequenzen, welche für die chimären Toxine der Erfindung codieren, Expressionsvektoren, die für diese DNA-Sequenzen codieren, Zellen, die mit diesen Expressionsvektoren transformiert sind, und Verfahren zur Herstellung der chimären Toxine, welche das Züchten von Zellen beinhalten, die mit Expressionsvektoren transformiert sind, welche DNA enthalten, die für die chimären Toxine codiert, und zur Isolierung der chimären Toxine von den Zellen oder deren Überständen.
Natives Diphtherietoxin, wie hierin verwendet, bezeichnet das 535-Aminosäure-Diphtherietoxinprotein, das von Corynebacterium diphtheriae sezerniert wird. Die Sequenz eines Allels des Gens, das für das native Diphtherietoxin codiert, ist in Greenfield et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6853-6857, beschrieben. Enzymatisch aktives Frag-ment A, wie hierin verwendet, bezeichnet die Aminosäurereste Gly 1 bis Arg 193 des nativen DT, oder ein enzymatisch aktives Derivat oder Analog der natürlichen Sequenz. Die Spaltungsdomäne I₁, wie hierin verwendet, bezeichnet die proteaseempfindliche Domäne in-nerhalb der Region, die von Cys 186 bis Cys 201 des nativen DT reicht. Fragment B, wie hierin verwendet, bezeichnet die Region von Ser 194 bis Ser 535 des nativen DT. Die hydrophobe Transmembranregion von Fragment B, wie hierin verwendet, bezeichnet die Aminosäuresequenz, die eine Strukturähnlichkeit mit den Bilayer-überspannenden Helices integraler Membranproteine aufweist, und ungefähr bei Aminosäurerest 346 bis Aminosäurerest 371 des nativen Diphtherietoxins angeordnet oder davon abgeleitet ist. Die Domäne I₂, wie hierin verwendet, bezeichnet die Region, welche von Cys 461 bis Cys 471 des nativen DT reicht.
Die generalisierte eukaryotische Bindungsstelle von Fragment B, wie hierin verwendet, bezeichnet eine Region innerhalb der C-terminalen 50 Aminosäurereste von nativem DT, die für die Bindung von DT an seinen nativen Rezeptor an der Oberfläche eukaryotischer Zellen verantwortlich ist. Die chimären Toxine der Erfindung beinhalten nicht die generalisierte eukaryotische Bindungsstelle von Fragment B.
Toxisch oder zytotoxisch, wie hierin verwendet, bedeutet die Fähigkeit, die Proteinsynthese in einer Zelle zu hemmen, das Zellwachstum oder die Zellteilung zu hemmen, oder eine Zelle zu töten.
DAB₄₈₆ besteht, in der folgenden Reihenfolge, aus Methionin und den Aminosäureresten 1-485 von nativem DT.
DAB₃₈₉ besteht, in der folgenden Reihenfolge, aus Methionin, den Aminosäureresten 1-386 von nativem DT, und den Aminosäurereste 484-485 von nativem DT.
DAB₄₈₆-IL-2 ist ein Fusionsprotein, das in der folgenden Reihenfolge aus Methionin, den Aminosäureresten 1-485 von nativem DT und den Aminosäureresten 2-133 von IL-2 besteht. DAB₄₈₅-IL-2 ist identisch, mit der Ausnahme, dass der anfängliche Methioninrest fehlt.
DAB₃₈₉-IL-2 besteht aus DAB₃₈₉, das an die Aminosäurereste 2-133 von IL-2 fusio-niert ist.
DAB₃₈₉-EGF besteht aus DAB₃₈₉, das an EGF fusioniert ist.
Als Rezeptor wird die Stelle bezeichnet, an welche der zellspezifische Polypeptidligand (oben unter (d) beschrieben) bindet.
Chimäre Toxine der Erfindung haben einen oder mehrere der folgenden Vorteile: größere Toxizität als jene des analogen DAB₄₈₆-haltigen Toxins; eine größere Affinität für den Rezeptor als jene eines analogen DAB₄₈₆-haltigen Toxins; bei Expression in dem Zytoplasma von E. coli, eine größere Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau als jene, die ein analoges DAB₄₈₆-haltiges Toxin aufweist; eine größere Resistenz gegenüber der Hemmung seiner Zytotoxizität durch kompetitive Inhibitoren, z. B. dem zuvor unter (d) genannten Polypeptid, als jene, die ein analoges DAB₄₈₆-haltiges Toxin aufweist; die Fähigkeit, die Proteinsynthese in Zielzellen auf ein bestimmtes Maß durch eine Einwirkungsperiode zu hemmen, die kürzer als die Einwirkungsperiode ist, die ein analoges DAB₄₈₆-haltiges Toxin benötigt, um die Proteinsythese auf dasselbe Maß zu hemmen; oder die Fähigkeit, einen rascheren Beginn der Hemmung der Proteinsynthese herbeizuführen, als bei einem analogen DAB₄₈₆-haltigen Toxin beobachtet wird.
Eine atypische Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors ist eine Eigenschaft mehrerer Malignitäten, einschließlich jener der Brust, Blase, Prostata, Lunge und der Neuroglia. Chimäre Toxine der Erfindung ermöglichen die therapeutische Ausrichtung der zytotoxischen Wirkung von Diphtherietoxin auf EGF-Rezeptor-positive Tumorzellen. In diesen chimären Toxinen wurden die Sequenzen für die Bindungsdomäne von Diphtherietoxin durch jene für Human-EGF ersetzt. Diese chimären Toxine hemmen die Proteinsynthese durch denselben Mechanismus wie Diphtherietoxin und sind besonders zytotoxisch für Tumorzellen des Menschen, die erhöhte Werte von EGF-Rezeptoren exprimieren. Die Aufnahme dieser chimären Toxine erfolgt mit einer Kinetik, welche die Verwendung dieses Moleküls als starkes therapeutisches Mittel zur Behandlung von Malignitäten ermöglicht, die durch die EGF-Rezeptor-Expression gekennzeichnet sind.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und aus den Ansprüchen hervor.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
Zunächst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
Zeichnungen
1 ist ein Diagramm des DT-Moleküls und verschiedener Fusionsproteine.
2 ist eine Darstellung der Konstruktion der Plasmide eines bevorzugten Ausführungsbeispiels.
3 ist eine Restriktionskarte von DNA-Sequenzen, die für verschiedene chimäre Toxine codieren.
4 ist eine Graphik der Wirkungen verschiedener Dosen von chimären Toxinen auf kultivierte Zellen.
5 ist eine Graphik der Fähigkeit chimärer Toxine, kompetitiv [¹²⁵I]-markiertes IL-2 von dem Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor zu verdrängen.
6 ist die Sequenz eines synthetischen EGF-Gens.
7 ist eine schematische Darstellung von DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF.
8 ist eine Graphik, welche die Wirkung von EGF auf die DAB₄₈₆EGF-Zytotoxizität zeigt.
9 ist eine Graphik, welche die Wirkung von EGF auf die DAB₃₈₉EGF-Zytotoxizität zeigt.
10 ist eine Graphik, welche die Wirkung von EGF und DAB₃₈₉EGF auf die EGF-Bindungskapazität von A431-Zellen zeigt.
11 ist eine Graphik, welche die Fähigkeit von EGF oder DAB₃₈₉EGF zeigt, [¹²⁵I]-EGF von EGF-Rezeptoren zu verdrängen.
12 ist eine Graphik der Wirkung der DAB₄₈₆EGF-Einwirkungsdauer auf die Hemmung der Proteinsynthese.
13 ist eine Graphik der Wirkung der DAB₃₈₉EGF-Einwirkungsdauer auf die Hemmung der Proteinsynthese.
14 ist eine Graphik der Kinetik der Hemmung der Proteinsythese auf Zellen, die mit DAB₄₈₆EGF oder DAB₃₈₉EGF inkubiert sind.
Struktur und Synthese des chimären Toxins DAB₄₈₆-IL-2
DAB₄₈₆-IL-2 ist ein chimäres Toxin, das aus Met, gefolgt von Aminosäureresten 1 bis 485 des reifen DT, die an die Aminosäurereste 2 bis 133 von IL-2 fusioniert sind, besteht. Der DT-Teil des chimären Toxins DAB₄₈₆-IL-2 enthält das gesamte DT-Fragment A und den Teil des DT-Fragments B, der sich bis zum Rest 485 des reifen nativen DT erstreckt. Somit erstreckt sich DAB₄₈₆-IL-2 über die Disulfidbrücke hinaus, die Cys 461 mit Cys 471 verbindet. Die Struktur von DT ist in 1a dargestellt. (Die verwendete Nomenklatur für IL-2-Toxin ist DAB₄₈₆-IL-2, wobei D für Diphtherietoxin steht, A und B die Wildtyp-Sequenzen für diese Fragmente bezeichnen, und IL-2 die Human-Interleukin-2-Sequenzen angibt. Mutante Allele sind durch eine Zahl in Klammer nach DAB angegeben. Die tiefgestellte Zahl gibt die Anzahl DT-verwandter Aminosäuren in dem Fusionsprotein an. Da die Deletion der tox-Signalsequenz und die Expression von dem trc-Promotor zu dem Hinzufügen eines Methioninrestes am N-Terminus führt, ist die Numerierung von DAB-II-2 Fusionstoxinen +1 zu jener von nativem Diphtherietoxin verschoben).
pDW24, das DAB₄₈₆-IL-2 trägt, wurde wie folgt konstruiert. pUC18 (New England BioLabs) wurde mit PstI und BglI aufgeschlossen, und das PstI-BglI-Fragment, das den E. coli-Replikationsursprung, die Polylinkerregion, und den 3'-Abschnitt des β-Lactamasegens (amp^r) trägt, wurde gewonnen. Plasmid pKK-233-2 (Pharmacia) wurde mit PstI und BglI aufgeschlossen, und das PstI-BglI-Fragment, das zwei Transkriptionsterminatoren und den 5'-Abschnitt des β-Lactamasegens trägt, wurde gewonnen. pDW22 wurde durch Ligieren dieser beiden gewonnenen Fragmente konstruiert.
pDW23 wurde durch Isolieren eines BamHI-SalI-Fragments, das für Human-IL-2 ko-diert, von Plasmid pDW15 (Williams et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16: 10453-10467) und Ligieren desselben an BamHI/SalI-aufgeschlossenes pDW22 (zuvor beschrieben) kon-struiert.
pDW24 wurde wie folgt konstruiert. Ein BamHI-NcoI-Fragment, das den trc-Promotor und ein translationales Initiationskodon (ATG) trägt, wurde von Plasmid pKK233-2 (Pharmacia) isoliert. Die DNA-Sequenz, die für die Aminosäurereste 1 bis 485 von DT codiert, wurde erhalten durch den Aufschluss von pABC508 (Williams et al (1987), Protein Engineering 1: 493-498) mit SphI und HaeII und Gewinnen des HaeII-SphI-Fragments, welches die Sequenz enthält, die für die Aminosäurereste 1 bis 485 von DT codiert. Ein NcoI/HaeII-Linker (5'CCATGGGCGC3') wurde an das HaeII-SphI-Fragment ligiert und diese Konstruktion wurde dann an das zuvor isolierte BamHI-NcoI-Fragment ligiert, das den trc-Promotor trug. Dies ergibt ein BamHI-SphI-Fragment, das in der folgenden Reihenfolge den trc-Promotor, die NcoI-Stelle (welche das ATG-Initiatorkodon für Met liefert), und die Sequenz, die für die Reste 1 bis 485 des nativen DT codiert, trägt. Dieses Fragment wurde in pDW23 eingesetzt, das mit BamHI und SphI aufgeschlossen worden war. Das erhaltene Plasmid wurde als pDW24 bezeichnet. Das Fusionsprotein (DAB₄₈₆-IL-2), für das pDW24 codiert, wird von dem trc-Promotor exprimiert, und besteht aus Met, gefolgt von den Aminosäuren 1 bis 485 von reifem DT, fusioniert mit Aminosäuren 2 bis 133 von Human-IL-2.
Die Sequenz von DT ist in Greenfield et al. (1983) supra, angegeben. Die Sequenz, die für IL-2 codiert, wurde auf einem Applied Biosystems DNA-Synthesizer synthetisiert, wie in Williams et al. (1988), Nucleic Acids Res., 16: 10453-10467, beschrieben ist. Die Sequenz von IL-2 ist in Williams et al. (1988), Nucleic Acids Res., 16: 10453-10467, angegeben. Die Fusion der Sequenz, die reifes DT bis ATG codiert, unter Verwendung eines Oligonucleotidlinkers ist in Bishai et al. (1987), J. Bact. 169: 5140-5151, beschrieben.
pDW24 ist in 2 dargestellt. Der Einschub, der DAB₄₈₆-IL-2 entspricht, ist als starke Linie dargestellt. In 2 markieren volle Kreise NcoI-Stellen, leere Kreis markieren NsiI-Stellen, leere Rauten markieren ClaI-Stellen, volle Quadrate markieren HpaII-Stellen, leere Quadrate markieren SphI-Stelle und volle Dreiecke markieren SalI-Stellen.
Oligonucleotide und Nucleinsäuren wurden wie folgt manipuliert. Oligonucleotide wurden unter Verwendung von Cyanoethylphosphoramiditchemie auf einem Applied Biosystems 380A DNA Synthetisiergerät (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) synthetisiert. Nach der Synthese wurden Oligonucleotide durch Chromatographie auf Oligonucleotide Purification Cartridges (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) laut Angaben des Herstellers gereinigt. Gereinigte Oligonucleotide wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Zum Verschmelzen komplementärer Stränge wurden äquimolare Konzentrationen jedes Strangs in Gegenwart von 100 mM NaCl gemischt, 10 min auf 90°C erwärmt, und langsam auf Raumtemperatur kühlen gelassen.
Plasmid-DNA wurde durch das alkalische Lyse-/Cäsiumchloridgradientenverfahren von Ausebel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., gereinigt. DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen laut Empfehlungen des Herstellers (New England Biolabs, Beverly, MA und Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD) aufgeschlossen. Restriktionsfragmente zur Plasmidkonstruktion wurden von Agarose-TBE-Gelen extrahiert, ligiert (mit oder ohne Oligonucleotidlinkern) und zur Transformation von E. coli unter Anwendung von Standardverfahren verwendet. Ausebel et al. (1989), supra, und Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Plasmid-DNA-Sequenzierung wurde gemäß dem Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, modifiziert von Kraft et al. (1988), Bio Techniques 6: 544-547, unter Verwendung von Sequenase (United States Biochemicals, Cleveland, OH) durchgeführt.
Struktur verbesserter chimärer Diphtherie-IL-2-Toxine
Die Expression und Reinigung chimärer Toxine war wie folgt. Alle DT-verwandten IL-2 Fusionsproteine, die hierin verwendet werden, wurden im Zytoplasma des E. coli Strangs JM101 vom trc-Promotor exprimiert, Amann et al. (1985), Gene 40: 183-190. Re-kombinantes E. coli wurde in M9 Minimalmedium (Maniatis et al. (1982) supra), das mit 10 mg/ml Casaminosäuren (Difco, Detroit MI), 50 μg/ml Ampicillin und 0,5 ng/ml Thymin ergänzt war, in 10 Liter Volumina in einem Microgen Fermentor (New Brunswick Scientific, Edison, N. J.) gezüchtet. Bakterienkulturen wurden bei 30°C gezüchtet und mit Luft bei 5 l/min durchperlt. Sobald die Extinktion (A₅₉₀ nm) der Kultur 0,3 erreichte, wurde die Expression des chimären tox-Gens durch Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid ausgelöst. Zwei Stunden nach der Auslösung wurden Bakterien durch Zentrifugation geerntet, in Puffer #101 resuspendiert (50 mM KH₂PO₄, 10 mM EDTA, 750 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 8,0) und durch Beschallung aufgelöst (Branson Sonifier). Ganze Zellen und Trümmer wurden durch Zentrifugation bei 27000 × g entfernt, und das geklärte Extrakt wurde dann filtersterilisiert und auf eine Anti-Diphtherietoxin-Immunoaffinitätssäule aufgebracht. Gebundene Proteine wurden mit 4 M Guanidinhydrochlorid eluiert, durch die Zugabe von β-Mercaptoethanol auf 1% reduziert und dann durch Hochdruckflüssigchromatographie auf einer 7,5 × 600 mm G4000PW-Säule (TosoHass) größenklassiert. Vor der Verwendung wurden Fusionstoxine vollständig gegen HEPES-gepufferte Hanksche ausgewogene Salzlösung (Gibco), pH 7,4, dialysiert. Gereinigtes Diphtherietoxin wurde von List Biological Laboratories (Cambell, CA) gekauft. Für die Herstellung des nichttoxischen CRM1001, wur-de C7(βtox-1001) in 100 ml Volumina C-Y-Medium (Rappuoli et al. (1983), J. Bact. 153: 1201-1210) in 2 l Erlenmeyer-Kolben 20 h unter Schütteln (240 U/min) bei 35°C gezüchtet. Bakterien wurden durch Zentrifugation bei 20000 × g über 15 min entfernt. CRM1001 wurde aus dem Kulturmedium durch Zugabe von NH₄SO₄ auf eine 70% Sättigung ausgefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Nach der Dialyse gegen 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2, wurde CRM1001 durch Ionenaustauschchromatographie auf DE-52 Zellulose gereinigt, wie zuvor von Pappenheimer et al. (1972), Immunochem. 9: 891-906, beschrieben wurde. Die Konzentration aller gereinigten Proteine wurde unter Verwendung des Pierce Protein Assay-Reagens (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) bestimmt.
DAB(1001)₄₈₆-IL-2 ist ein chimäres Toxin, das mit DAB₄₈₆-IL-2 identisch ist, mit der Ausnahme, dass die Disulfidbrücke zwischen Cys462 und Cys472 in DAB(1001)₄₈₆-IL-2 aufgebrochen ist. DAB(1001)₄₈₆-IL-2 wurde durch Ersetzen des 587 Basenpaar (bp) ClaI-SphI-Restriktionsfragments, das für den Großteil des Fragments B von DT von Plasmid pDW24 (das DAB₄₈₆-IL-2 trägt) codiert, durch das analoge Fragment von DNA, das für das TOX-1001 mutante Allel von DT codiert, konstruiert. TOX-1001 codiert für das nichttoxische Diphtherietoxin-verwandte Protein CRM1001, und ist nachweislich das Ergebnis einer einfachen Punktmutation, die Cys471 zu Tyr471 ändert, Rappuoli et al. (1986), in Protein Carbohydrate Interactions in Biological Systems, Academic Press, Inc., London, S. 295-296. 3 zeigt die Restriktionskarten von DNA, die für DAB₄₈₆-IL-2 codiert, und des entsprechenden Fusionsproteins, das durch DAB₄₈₆-IL-2 codiert wird. (In 3 bezeichnen punktierte Kästen zwischen den NsiI und HpaII Restriktionsendonukleasenstellen die Diphtherietoxin-Fragment B-verwandten Sequenzen, welche für die membranassoziierenden Domäne codieren. Die amphipathische Domäne wird zwischen der NsiI- und ClaI-Stelle codiert, und die mutmaßlichen, membranüberspannenden Domäne werden zwischen den ClaI- und HpaII-Stellen codiert. Schraffierte Kästen geben die relative Position von internen Deletionsmutationen innerhalb des Rahmens an). Die Konstruktion von pDW26, das für das chimäre Toxin mit der Cys472 zu Tyr472 Mutation codiert, ist in 2 dargestellt. Nach der Ligation und Transformation wurde die DNA-Sequenz des tox-1001 Abschnitts der Genfusion DAB(1001)₄₈₆-IL-2 bestimmt, um sicherzustellen, dass die Cys471 zu Tyr471 Mutation zurückgeklont war. E. coli (pDW26) wurde in M9 Minimalmedien gezüchtet, die Zellen wurden geerntet, aufgelöst und das Fusionstoxin mit der Bezeichnung DAB(1001)₄₈₆-IL-2 durch Immunoaffinitätschromatographie und HPLC gereinigt.
Die Dosis-Wirkungs-Kapazität von DAB₄₈₆-IL-2, CRM1001 und DAB(1001)₄₈₆-IL-2 zur Blockierung des [¹⁴C]-Leucin-Einbaus durch Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor tragende HUT 102/6GT Zellen wurde bestimmt. Wie angenommen, war DAB₄₈₆-IL-2 für diese Zellen höchst toxisch (IC₅₀ = 4 × 10^–10 M); während CRM1001 sich als nichttoxisch erwies. In deutlichem Gegensatz zu CRM1001 jedoch erwies sich das Fusionstoxin, das die Cys472 zu Tyr472 Mutation aufwies, DAB(1001)₄₈₆-IL-2, als ebenso toxisch für HUT 102/6GT Zellen wie Wildtyp DAB₄₈₆-IL-2. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Fragment B-Disulfidbindung für die biologische Aktivität des Fusionstoxins nicht erforderlich ist.
HUT 102/6TG Zytotoxizitätstests wurden wie folgt ausgeführt. Gezüchtete HUT 102/6GT Zellen wurden in RPMI 1640 Medium (Gibco, Grand Island, NY) gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum (Cellect, GIBCO), 2 mM Glutamin, und Penicillin und Streptomycin auf 50 IE bzw. 50 μg/ml ergänzt war. Für Zytotoxizitätstests wurden die Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen mit V-förmigen Böden (Linbro-Flow Laboratories, McLean, VA) bei einer Konzentration von 5 × 10⁴ pro Vertiefung in Komplettmedium geimpft. Toxine, oder toxinverwandte Materialien, wurden auf verschiedene Konzentrationen (10^–12 M bis 10^–6 M) zugegeben und die Kulturen wurden 18 h bei 37°C in einer 5% CO₂ Atmosphäre inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten 5 min bei 170 × g zentrifugiert und das Medium entfernt und durch 200 μl leucinfreies Medium (MEM, GIBCO) ersetzt, das 1,0 μCi/ml [¹⁴C]-Leucin (New England Nuclear, Boston, MA) enthielt. Nach weiteren 90 min bei 37°C wurden die Platten 5 min bei 170 × g zentrifugiert, das Medium entfernt und die Zellen durch Zugabe von 4 M KOH aufgelöst. Protein wurde durch Zugabe von 10% Trichloressigsäure ausgefällt und das unlösliche Material wurde dann auf Glasfaserfilter unter Verwendung eines Zellerntegerätes (Skatron, Sterling, VA) gesammelt. Die Filter wurden gewaschen, getrocknet und nach Standardmethoden ausgezählt. Zellen, die nur mit Medium gezüchtet worden waren, dienten als Kontrolle. Alle Tests wurden vierfach ausgeführt.
Da die Disulfidbindung zwischen Cys462-Cys472 für die zytotoxische Wirkung von DAB₄₈₆-IL-2 nicht erforderlich war, war die Bestimmung interessant, welche DT-Fragment B-Sequenzen für die Abgabe von Fragment A an das Zytosol wesentlich sind. Mehrere Mutationen innerhalb des Rahmens wurden in den Fragment B-codierenden Teil des DAB₄₈₆-IL-2 Toxingens eingeführt, 1b, 2 und 3. 1b zeigt die Struktur von DAB₄₈₆-IL-2 und verschiedener Mutanten, die von DAB₄₈₆-IL-2 abgeleitet sind. In 1b stellt ein breiter Balken das Fusionsprotein dar, schmale Verbindungslinien stellen Deletionen dar, Zahlen über den Balken sind Aminosäurerestnummern in der DAB-Nomenklatur, Zahlen unterhalb der Balken entsprechen der Aminosäurerestnumerierung von nativem DT, Schraffierungen geben amphipathische Regionen an, verdunkelte Flächen entsprechen der Transmembranregion, IL-2-2-133 gibt die Aminosäurereste 2-133 von IL-2 an, Ala = Alanin, Asn = Asparagin, Asp = Asparaginsäure, Cys = Cystein, Gly = Glycin, His = Histidin, Ile = Iso-leucin, Met = Methionin, Thr = Threonin, Tyr = Tyrosin und Val = Valin.
Die erste Mutante, DAB₃₈₉-IL-2 wurde durch Entfernen eines 309 bp HpaII-SphI-Restriktionsfragments von pDW24 und Ersetzen desselben mit Oligonucleotidlinker 261/274 (Tabelle 1) konstruiert, um Plasmid pDW27 zu erzeugen (1). Dieser Linker stellt die Fragment B-Sequenzen von Pro383 bis Thr387 wieder her und ermöglicht eine Fusion innerhalb des Rahmens an IL-2-Sequenzen an dieser Position. Somit wurden in DAB₃₈₉-IL-2 die 97 Aminosäuren zwischen Thr387 und His485 deletiert.
Auf ähnliche Weise wurde eine 191 Aminosäure-Deletion innerhalb des Rahmens durch Entfernen eines ClaI-SphI Restriktionsfragments von pDW24 und Ersetzen desselben mit dem 292/293 Oligonucleotidlinker (Tabelle 1) konstruiert, um Plasmid pDW28 zu bilden, das für DAB₂₉₅-IL-2 codiert. In diesem Fall umfasst die Deletion innerhalb des Rahmens die mutmaßlichen, membranüberspannenden Helices, von welchen Lambotte et al. (1980), J. Cell. Biol. 87: 837-840, vorhersagte, dass sie eine Rolle in der Abgabe von Fragment A an das eukaryotische Zellzytosol spielen.
Es zeigte sich, dass gereinigtes DAB₃₈₉-IL-2 und DAB₂₉₅-IL-2 eine elektrophoretische Mobilität von 57 kDa bzw. 47 kDa haben. Die Dosis-Wirkungs-Analyse auf HUT 102/6GT Zellen ist in 4 dargestellt. In 4 ist DAB₄₈₆-IL-2 durch volle Quadrate dargestellt; DAB₃₈₉-IL-2 ist durch volle Kreise dargestellt; DAB₂₉₅-IL-2 ist durch leere Kreise dargestellt; DAB(Δ205-289)₄₈₆-IL-2 (siehe unten) ist durch leere Quadrate dargestellt; und DAB(Δ205-289)₃₈₉-IL-2 (siehe unten) ist durch leere Dreiecke dargestellt. DAB₄₈₆-IL-2 und DAB₃₈₉-IL-2 wiesen einen IC₅₀ von etwa 4 × 10^–10 M bzw. 1 × 10^–10 M auf. Im deutlichen Gegensatz war der IC₅₀ von DAB₂₉₅-IL-2 etwa 1000-fach geringer (4 × 10^–7 M). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Fragment B-Sequenzen zwischen Thr387 und His486 keine wesentliche Rolle in der Abgabe von Fragment A an das Zytosol spielen. Sequenzen zwischen Ser292 und Thr387 sind andererseits für die wirksame Abgabe von Fragment A wesentlich.
Überraschenderweise besaß DAB₃₈₉-IL-2 eine viel größere Aktivität als DAB₄₈₆-IL-2. DAB₃₈₉-IL-2, dem native DT-Reste 387 bis 483 fehlen, und das eine erhöhte toxische Aktivität besitzt, läßt das hydrophobe Transmembransegment intakt, das ungefähr zwischen den nativen DT-Resten 346 und 371 angeordnet ist. Siehe Lambotte et al. (1980), J. Cell. Biol. 87: 837-840, für eine Charakterisierung der Transmembranregion. DAB₂₉₅-IL-2, das die nativen DT-Reste 291 bis 481 entfernt, und das eine deutlich verringerte Toxizität aufweist, entfernt die Transmembranregion (346-371).
Um jede Möglichkeit auszuschließen, dass der Grund für die geringe Potenz von DAB₂₉₅-IL-2 für HUT 102/6GT Zellen mit einer veränderten Bindung an den Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor zusammenhängt, wurde ein Reihe von kompetitiven Verdrängungstests unter Verwendung von [¹²⁵I]-rIL-2 durchgeführt. 5 zeigt die kompetitive Verdrängung von [¹²⁵I]-markiertem IL-2 von dem Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor durch unmarkiertes rIL-2, dargestellt durch volle Kreise; DAB₄₈₆-IL-2, dargestellt durch leere Dreiecke; DAB₃₈₉-IL-2, dargestellt durch volle Quadrate; DAB₂₉₅-IL-2, dargestellt durch volle Dreiecke; DAB(Δ205-289)₄₈₆-IL-2 (siehe unten), dargestellt durch leere Kreise; und DAB(Δ205-289)₃₈₉-IL-2 (siehe unten), dargestellt durch leere Quadrate. Die verwendete Konzentration von [¹²⁵I]-IL-2 war 10 pM und die spezifische Aktivität betrug etwa 0,7 μCi/pmol. Wie in Tabelle 2 dargestellt, zeigte sich, dass sowohl DAB₃₈₉-IL-2 als auch DAB₂₉₅-IL-2 eine apparente K_d haben, die etwa dreimal geringer als jene von DAB₄₈₆-IL-2 ist (K_d = 8 × 10^–9 M gegenüber K_d = 2,5 × 10^–8 M). Es ist insbesondere signifikant, dass kompetitive Verdrängungsexperimente zeigten, dass sowohl DAB₃₈₉-IL-2 als auch DAB₂₉₅-IL-2 eifriger an den Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor binden, als DAB₄₈₆-IL-2 (Kd = 8 × 10^–9 und 8,4 × 10^–9 M gegenüber Kd = 2,5 × 10^–8 M). Diese Ergebnisse liefern den Beweis, dass die Fusion von IL-2-Sequenzen an Toxophore geringerer Masse dazu dienen können, die IL-Bindungsdomäne für eine günstigere Rezeptorwechselwirkung anzuordnen.

Es muss festgehalten werden, dass, obwohl DAB₂₉₅-IL-2 eifriger an den Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor bindet als DAB₄₈₆-IL-2, seine zytotoxische Aktivität zumindest 1000-fach geringer ist (4). Diese Ergebnisse zeigen, dass eine eifrige Bindung an den Zielrezeptor an sich für die biologische Aktivität der DT-verwandten IL-2-Fusionstoxine nicht ausreichend ist, und dass Fragment B-Sequenzen zwischen Ser292 und Thr 387 für einen Post-Rezeptor-Bindungsvorgang im Intoxikationsprozess wesentlich sind. Tabelle 2

Relative Fähigkeit von rIL-2 und DAB-IL-2-verwandten Fusionsproteinen, [¹²⁵I]-rIL-2 von Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptoren auf HUT 102/6TG Zellen zu verdrängen
Unmarkierter Ligand	Scheinbare K_d	K_d DAB-IL-2/rIL-2
rIL-2	1,7 × 10^–10	-
DAB₄₈₅-IL-2	2,5 × 10^–8	147
DAB₃₈₉-IL-2	8,0 × 10^–9	47
DAB₂₉₅-IL-2	8,4 × 10^–9	49
DAB(Δ205-289)₄₈₆-IL-2	1,0 × 10^–7	588
DAB(Δ205-289)₃₈₉-IL-2	2,9 × 10^–8	170

Die kompetitive Verdrängung von [¹²⁵I]-rIL-2- durch rIL-2 und DAB-IL-2-Fusionstoxine wurde wie folgt bestimmt. Der radiomarkierte IL-2-Bindungstest wurde im Wesentlichen wie in Wang et al. (1987), J. Exp. Med. 166: 1055-1069 beschrieben, durchgeführt. Die Zellen wurden geerntet und mit Zellkulturmedium gewaschen. HUT 102/6GT Zellen wurden auf 5 × 10⁶ pro ml resuspendiert und mit [¹²⁵I]-rIL-2 (0,7 μCi/pmol), in Gegenwart oder Abwesenheit steigender Konzentrationen von unmarkierten rIL-2 oder den DAB-IL-2 Fusionstoxinen, 30 min bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Die Reaktion wurde dann auf eine Mischung aus 80% 550 Fluid (Accumetric Inc., Elizabethtown, KN): 20% Paraffinöl (d = 1,03 g/ml) gelegt und mikrozentrifugiert. Die wäßrige Phase und das Pellet jeder Probe, welche einen freien bzw. gebundenen Liganden darstellten, wurden dann in einem Nuclear Chicago Gammazähler gezählt. Apparente Dissoziationskonstanten, K_d, wurden aus den Konzentrationen des unmarkierten Liganden bestimmt, die erforderlich waren, um 50% der radiomarkierten rIL-2 Bindung an Rezeptoren zu verdrängen.
Zur Überprüfung der Hypothese, dass eine amphipathische Region (Aminosäuren 210-252 in DAB₄₈₆-IL-2) eine Rolle im Intoxikationsproze spielt, wurden Deletionen innerhalb des Rahmens der 85 Aminosäuren codierenden Region von NsiI bis ClaI sowohl von pDW24 als auch pDW27 konstruiert, um pDW30 (enthaltend DAB(Δ205-289)₄₈₆-IL-2) bzw. pDW31 (enthaltend DAB(Δ205-289)₃₈₉-IL-2) zu bilden (2 und 3; Tabelle 1). Nach der Ligation und Transformation wurden die DAB-IL-2-verwandten Fusionsproteine exprimiert und gereinigt, wie zuvor beschrieben. Wie in 4 dargestellt, führte die Deletion von Fragment B-Sequenzen, welche die amphipathische Region enthalten, zu einem deutlichen Verlust der zytotoxischen Aktivität gegenüber Hochaffinitäts-IL-2-Rezeptor positiven Zellen in vitro. Es ist wesentlich festzuhalten, dass DAB(Δ205-289)₃₈₉-IL-2 nachweislich radiomarkiertes IL-2 von dem Hochaffinitätsrezeptor fast genauso gut verdrängte, wie DAB₄₈₆-IL-2; während sich zeigte, dass DAB(Δ205-289)₄₈₆-IL-2 viermal weniger häufig an den Rezeptor band (5).
Erhöhte Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau
Das chimäre Toxin, für das DAB₃₈₉-IL-2 codiert, ist gegenüber einem proteolytischen Abbau resistenter als das chimäre Toxin, für das DAB₄₉₆-IL-2 codiert. Bei einer Reinigung, wie zuvor beschrieben, und Analyse auf SDS-Polyacrylamidgelen, ist das hybride DAB₃₈₉-IL-2 Toxin von einigen wenigen Abbauprodukten begleitet (wie durch das relative Fehlen von Banden geringerer Größe als jener des intakten chimären Toxins gezeigt wird). Gereinigtes DAB₄₈₆-IL-2 ist andererseits von zahlreichen dunklen Banden geringeren Molekulargewichts als das intakte chimäre Toxin begleitet. Diese Banden geringeren Molekulargewichts reagieren mit Anti-DAB₄₈₆-IL-2-Antikörpern, was den Schluss bestätigt, dass sie Abbauprodukte sind.
Natriumdodecylsulfat-(SDS-)Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wurde nach dem Verfahren von Laemmli (1970), Nature 227: 680-685, unter Verwendung von 12% Gelen und einer Mini-Protein II Gelvorrichtung (BioRad) durchgeführt. Proteine wurden in 12,5% Trichloessigsäure 5 min fixiert und mit Coomassie-Brillantblau nach dem Diezal-Verfahren gefärbt, Diezal et al. (1972), Anal. Biochem. 48: 617-624.
Konstruktion von Fusionsgenen, die für chimäre DT-EGF Toxine codieren
DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF können durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in analoger Weise zu jener konstruiert werden, in welcher DAB₄₈₆-IL-2 und DAB₃₈₉-IL-2 konstruiert wurden. Zur Konstruktion eines Plasmids, das DAB₄₈₆ fusioniert an EGF ko-diert, wird Plasmid pDW24 (das für DAB₄₈₆ fusioniert an IL-2 codiert) mit SphI und HindIII aufgeschlossen, um die IL-2-Codierungssequenz zu entfernen. Das erhaltene pDW24 SphI-HindIII-Fragment, welches die Sequenz enthält, die für die DT-Reste 1-485 codiert, wird an ein synthetisches SphI-HindIII Fragment ligiert, das für EGF codiert, um ein Plasmid zu erhalten, das für DAB₄₈₆ codiert, das an EGF fusioniert ist. Das EGF-Fragment, das in 6 dargestellt ist, wurde, wie beschrieben, unter Verwendung bevorzugter Kodons zur Expression in E. coli synthetisiert (siehe Grosjean et al. (1982), Gene 18: 199-209). Das synthetische Fragment enthält geeignete Linker an den 5'- und 3'-Enden für das Einsetzen in das Plasmid und zur Fusion innerhalb des Rahmens an die DT-Codierungssequenz.
Zur Konstruktion eines Plasmids, das für DAB₃₈₉ codiert, welches an EGF fusioniert ist, kann nach einem ähnlichen Protokoll vorgegangen werden, mit der Ausnahme, dass pDW27 (das für DAB₃₈₉ codiert, das an IL-2 fusioniert ist) anstelle von pDW24 verwendet wird. Die IL-2 codierende DNA wird von pDW27 durch Aufschluss mit SphI und HindIII entfernt, und EGF codierende DNA wird statt dessen eingesetzt, wodurch ein DAB₃₈₉ erhalten wird, das innerhalb des Rahmens an EGF fusioniert ist. Es kann dasselbe synthetische EGF-Fragment verwendet werden, das in der Konstruktion der DAB₄₈₉EGF-Fusion verwendet wird (6).
Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die obengenannten Protokolle nicht die einzige Möglichkeit darstellen, die chimären Toxine der Erfindung herzustellen. Verfeinerungen enthalten Änderungen in pDW24, pDW27 und davon abgeleiteten Plasmiden, die den Good Manufacturing Practises der Food and Drug Administration (Amerikanische Nahrungs- und Arzneimittelbehörde) entsprechen, z. B. den Einschluss des lacI^q Gens (Amersham) und den Ersatz des Ampicillin-Resistenzgens (amp^r) durch das Gen für Neomycin/Kanamycin-Resistenz von Tn5 (Pharmacia) in den Plasmiden, die zur Expression der chimären Toxine der Erfindung verwendet werden. Diese Änderungen können von einem Fachmann ohne unnötige Experimente durchgeführt werden.
Biologische Aktivität chimärer DT-EGF-Toxine
DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF sind die Produkte von Fusionsgenen, in welchen die Rezeptor-Bindungsdomäne von DT entfernt und durch DNA ersetzt wurde, die für Human-EGF codiert. Wie in 7 dargestellt, enthalten die erhaltenen Proteine das enzymatisch aktive Fragment A von DT und die lipidassoziierenden Domäne von Fragment B von DT, die zur Translokation von Fragment A in das Zytosol erforderlich sind. DAB₃₈₉EGF unterscheidet sich von DAB₄₈₆EGF durch die Deletion der 97 Aminosäuren unmittelbar 5' zu dem Aminosäurerest 484 von DT. Der EGF-Teil sowohl von DAB₄₈₆EGF als auch von DAB₃₈₉EGF lenkt die Rezeptorbindung. Somit haben diese Moleküle das Potential, die Zytotoxizität von DT spezifisch auf Tumorzellen zu richten, die durch EGF-Rezeptorexpression charakterisiert sind.
Chimäre DT-EGF Toxine sind für EGF-Rezeptor tragende Zellen toxisch

Die Zytotoxizität von DAB₄₈₆EGF für eine Reihe von menschlichen Zelllinien wurde bewertet und mit A431 Zellen (ATCC CRL 1555) verglichen, einer menschlichen Plattenepithelkarzinom-Zelllinie mit einer hohen Zahl von EGF-Rezeptoren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. In der Studie waren menschliche TumorZelllinien enthalten, von welchen berichtet wurde, dass sie hohe Zahlen von EGF-Rezeptoren exprimieren (z. B. BT-20, HeLa, LNCaP und U-87 MG), wie auch menschliche Tumor-Zelllinien (z. B. C91/PL, BeWo und A375) und normale Gewebe-Zelllinien (z. B. WI-38, Hs67 und HEPM), die einige oder keine EGF-Rezeptoren exprimieren. Die Zytotoxizität wurde wie folgt ausgewertet. Zellen wurden in dreifachen Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen mit DAB₄₈₆EGF in Testmedium, das für die Zellart geeignet war (siehe Tabelle 3), ausgestrichen. DAB₄₈₆EGF Konzentrationen lagen zwischen 10^–15 und 10^–7 M. Nach einer 20-stündigen Inkubation wurden die Zellen mit [¹⁴C]Leucin markiert, trypsiniert, auf Glasfaserfiltermatten geerntet und zur Bestimmung des Kontrolleinbaus in Prozent ausgezählt. Zelllinien, die einen IC₅₀ für DAB₄₈₆EGF von weniger als 0,5 nM aufwiesen, wurden als empfindlich erachtet. Tabelle 3: Die Wirkung eines chimären DT-EGF Toxins auf verschiedene Zelllinien

Zelllinie	Tumor-Zelllinien Gewebe/Art	Empfindlichkeit
A431	Vulva-Plattenepithelkarzinom	+
A549	Lungenkarzinom	+
KB	orales Plattenepithelkarzinom	+
BT-20	Brust-Adenokarzinom	+
HeLa S3	Gebärmutterhalskarzinom	+
T47D	Milchgangskarzinom	+
LNCaP.FG	Prostatakarzinom	+
HOS	Osteosarkom	+
U-87 MG	Glioblastom/Astrozytom	+
C91/PL	HTLV-1 transformierte T-Zelle	–
BeWo	Choriokarzinom	–
A375	malignes Melanom	–
MCF-7	Brust-Adenokarzinom	–
SNU-C2B	Zökumkarzinom	–
Zelllinie	Normale Zelllinien Gewebe	Empfindlichkeit
WI-38	diploides Lungenfibroblast	–
Hs 67	Thymus	–
CCD-18Co	Dickdarmfibroblast	–
HISM	glatter Muskel, Jejunum	–
FH74s Int	fötaler Dünndarm	–
HEPM	embryonales palatales Mesenchym	–

Die verwendeten Wachstumsbedingungen und Durchlasspläne waren jene, die von ATCC definiert sind (mit Ausnahme der in der Folge genannten). Kulturmedien waren folgende: A431 (ATCC CRL1555), DMEM + 10% FCS; A549 (ATCC CCL185) Ham'sches F12 + 10% FCS; KB (ATCC CCL17), DMEM + NEAA + 10% FCS; BT-20 (ATCC HTB19), MEM + 10% FCS; HeLa S3 (ATCC CCL2.2), Ham'sches F12 + 10% FCS; T47D (ATCC HTB133), RPMI 1640 + 10% FCS; LNCaP.FG (ATCC CRL1740), RPMI 1640 + 10% FCS; HOS (ATCC CRL1543), MEM + 10% FCS; U-87 MG (ATCC HTB14), MEM + 10% FCS; C91/PL (von Robert Swartz, NEMC, Boston, MA, siehe Bacha et al. (1988), J. Exp. Med. 167: 612 für Wachstumsbedingungen), RPMI 1640 + 15% FCS; BeWo (ATCC CCL98), Ham'sches F12 + 15% FCS; A375 (ATCC CRL 1619), DMEM + 10% FCS; MCF-7 (ATCC TB22) MEM + 10% FCS; SNU-C2B (ATCC CCL250) RPMI 1640 + 10% FCS; WI-38 (ATCC CCL75), Eagle's Basal + 10% FCS; Hs 67 (ATCC HTB 163), DMEM + 10% FCS; CCD-18Co (ATCC CRL 1459), MEM + 10% FCS; HISM (ATCC CRL 1692), DMEM + 10% FCS; FHs74Int (ATCC CCL241), DMEM + 10% FCS; HEPM (ATCC CRL 1486), MEM + 10% FCS.

DMEM = Dulbecco's modifiziertes Eagles Medium;
MEM = Minimalmedium;
NEAA = nichtessentielle Aminosäuren;
FCS = fötales Kälberserum;
ATCC = American Type Culture Collection.

Zur Demonstration, dass die zyotoxische Wirkung von DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF selektiv durch den EGF-Rezeptor vermittelt werden, wurden A431-Zellen in dreifachen Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen mit DAB₄₈₆EGF (8) oder DAB₃₈₉EGF (9) in Gegenwart des spezifischen Konkurrenten des EGF-Rezeptors, Human-EGF (Upstate Biotechnologies, Inc.) (10^–7 M) in Testmedium (DMEM + 10% FCS) ausgestrichen. In 8 stellen volle Quadrate DAB₄₈₆EGF dar und volle Dreiecke stellen DAB₄₈₆EGF + EGF dar. In 9 stellen volle Quadrate DAB₃₈₉EGF dar und volle Dreiecke stellen DAB₃₈₉EGF + EGF dar. Nach einer 20-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit [¹⁴C]Leucin markiert, trypsiniert, auf Glasfaserfiltermatten geerntet und gezählt, um den Kontrolleinbau in Prozent zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Fehlen von EGF, DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF die Proteinsynthese mit einem IC₅₀ von 3 × 10^–12 M bzw. 3 × 10^–13 M hemmen. EGF tilgt diese Aktivität fast vollständig. Ebenso tilgen Anti-EGF (Biomedical Technologies, Inc.) und Anti-EGF-Rezeptor (Upstate Biotechnologies, Inc.) die Zytotoxizität von DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF, während die nichtspezifischen Konkurrenten, Transferrin (Sigma), Anti-Transferrin (Dako) und Anti-Transferrin-Rezeptor (Dako), keine Wirkung haben. Diese Ergebnisse zeigen, dass DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF starke und spezifische zytotoxische Mittel sind. Es ist zu beachten, dass DAB₃₈₉EGF etwa zehnmal stärker als DAB₄₈₆EGF ist.
DAB₃₈₉EGF, wie EGF, führt eine Abwärtsregulierung des EGF-Rezeptors herbei, was einen weiteren Beweis für die EGF-Rezeptor-spezifische Eigenschaft von chimären DT-EGF Toxinen liefert. Die Bindung und Internalisierung von EGF führt eine Abwärtsregulierung des EGF-Rezeptors herbei, die als Abnahme in der [¹²⁵I]EGF-Bindungskapazität nachgewiesen werden kann (Krupp et al. (1982), J. Biol. Chem. 257: 11489). Die Fähigkeit von DAB₃₈₉EGF, die EGF-Rezeptor-Internalisierung und anschließende Abwärtsregulierung herbeizuführen, wurde bewertet und mit jener verglichen, die von nativem EGF herbeigeführt wird. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt. In 10 stellen die leeren Quadrate EGF dar und die vollen Rauten stellen DAB₃₈₉EGF dar. A431-Zellen in dreifachen Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen wurden mit EGF oder DAB₃₈₉EGF (10^–8 M) über die angegebenen Zeitperioden in DMEM + 0,1% BSA (Rinderserumalbumin) bei 37°C vorinkubiert. Die Zellen wurden dann auf Eis gelegt und säuregestrippt (mit 0,2 M Essigsäure, 0,5 M NaCl), um gebundenes aber nicht internalisiertes EGF oder DAB₃₈₉EGF zu entfernen. Die EGF-Bindungskapazität wurde durch Inkubieren der Zellen, auf Eis, mit [¹²⁵I]EGF gemessen. Nach einer 90-minütigen Inkubation wurden die Zellen gewaschen, löslich gemacht und gezählt.
Eine EGF-Rezeptor-abhängige Wechselwirkung zeigt sich auch durch die Tatsache, dass DAB₃₈₉EGF, wie EGF, [¹²⁵I]EGF vom EGF-Rezeptor verdrängt, wie in 11 dar-gestellt. In 11 stellen leere Quadrate EGF dar und volle Rauten stellen DAB₃₈₉EGF dar. Die Ergebnisse in 11 sind in Prozent der Kontroll(keine Konkurrenz) cpm dargestellt. Die Fähigkeit von DAB₃₈₉EGF, die Hochaffinitäts-[¹²⁵I]EGF-Bindung an A431-Zellen zu verdrängen, wurde wie folgt bewertet. A431-Zellen, die in dreifachen Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen ausgestrichen wurden, wurden in Bindungsmedien (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2, + 0,1% BSA und 15 mM Natriumazid + 50 mM 2-Desoxyglucose) 1 Stunde bei 37°C vorinkubiert und dann mit [¹²⁵I]EGF in Bindungsmedien in Gegenwart von DAB₃₈₉EGF oder EGF inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen, löslich gemacht und gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
In Tabelle 4 ist EC₅₀ die Konzentration, die zu einer Verdrängung von 50% des [¹²⁵I)EGF führt. Tabelle 4: Verdrängung der [¹²⁵I]EGF-Bindung durch EGF und DAB₃₈₉EGF

Konkurrenz EC₅₀ ... fach gegenüber [¹²⁵I]EGF ... fach gegenüber EGF

EGF 1,0 × 10^–8 M 20 -

DAB₃₈₉EGF 4,5 × 10^–7 M 900 45
Zytotoxizität von chimären DT-EGF Toxinen ist DT-abhängig
Nach der Bindung an seinen Rezeptor erfolgt die zelluläre Aufnahme von nativem DT durch Endozytose von clathrinbeschichteten Vesikeln (Middlebrook et al. (1978), J. Biol. Chem. 253: 7325). DT wird dann in Endosomen gefunden, wo der geringe pH eine gleichförmige Veränderung herbeiführt, welche die Translokation des enzymatischen Fragment A-Teils von DT in das Zytosol erleichtert. Zur Bestimmung, ob die Zytotoxizität von DAB₄₈₆EGF und DAB₃₈₉EGF auch von demselben Pfad abhängig ist, wurden A431-Zellen in sechsfachen Vertiefungen von Platten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen, die DAB₄₈₆EGF, DAB₃₈₉EGF oder DMEM + 10% FCS enthielten, in Gegenwart oder Abwesenheit von Chloroquin (10^–5 M) (Sigma). Chloroquin ist eine lysosomotrope Verbindung, welche die Azidifizierung von Endosomen verhindert (Kim et al. (1965), J. Bacteriol. 90: 1552). Nach einer 20-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit [³H]Leucin markiert, trypsiniert, auf Glasfaserfiltermatten geerntet und gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt, angegeben als Prozent des Kontroll-(kein DAB₄₈₆EGF oder DAB₃₈₉EGF) Einbaus, und stellen das Mittel der drei Versuche dar. Die Ergebnisse zeigen, dass Chloroquin die Zytotoxizität von chimären DT-EGF Toxinen blockiert. Tabelle 5: Empfindlichkeit der chimären DAB-EGF Toxin-Zytotoxizität gegenüber Chloroquin Prozent des Kontrolleinbaus

DAB₄₈₆EGF-Konzentration Keine Zugabe Chloroquin

0 100 86

10^–8 M 5 60

10^–9 M 25 96

DAB₃₈₉EGF Konzentration

0 100 73

10^–11 M 4 61

10^–12 M 57 100

Nach der Translokation in das Zytosol katalysiert Fragment A die Spaltung von NAD und der kovalenten Bindung von ADP-Ribose an Verlängerungsfaktor 2 (EF-2), was zu der Hemmung der Proteinsynthese führt (Bachs et al. (1983), J. Biol. Chem. 258: 1565). Zur Bewertung des Mechanismus, durch welchen DAB₄₈₆EGF die Proteinsynthese hemmt, wurden A431-Zellen in dreifachen Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen ausgestrichen, die DT, DAB₄₈₆EGF oder Komplettmedium enthielten. Nach einer 20-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen gewaschen und in Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Thymidin, 1 mM EGTA, 1% TRITON X-100) mit [³²P]NAD in Gegenwart von gereinigtem DT Fragment A (Calbiochem) inkubiert. TCA ausfällbare Extrakte wurden auf Glasfaserfiltern gesammelt und zur quantitativen Bestimmung der Prozent des Kontroll-EF-2 gezählt, der zur ADP-Ribosylierung zur Verfügung steht. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 6 dargestellt. DAB₄₈₆EGF verringert, wie DT, (in dosisabhängiger Weise) die Menge an EF-2, die zur ADP-Ribosylierung zur Verfügung steht.

Tabelle 6: ADP-Ribosylierung von EF-2 durch DAB₄₈₆EGF
Toxin	Konzentration	Prozent des Kontrollwertes von EF-2, das zur ADP-Ribosylierung zur Verfügung steht
DT	10^–8 M	< 1
	10^–9 M	17
DAB₄₈₆EGF	10^–8 M	13
	10^–9 M	20

DAB₃₈₉EGF ist ein verbessertes chimäres Toxin
DAB₃₈₉EGF ist weitaus toxischer als DAB₄₈₆EGF. Wie in 8 und 9 dargestellt, weist DAB₃₈₉EGF einen IC₅₀ für die Hemmung der Proteinsynthese in A431-Zellen auf, der etwa zehnmal geringer als jener von DAB₄₈₆EGF ist (DAB₃₈₉EGF IC₅₀ = 3 × 10^–13 M; DAB₄₈₆EGF IC₅₀ = 3 × 10^–12 M).
Die größere Wirksamkeit von DAB₃₈₉EGF zeigt sich auch in Versuchen, welche die Geschwindigkeit messen, mit welcher DAB₃₈₉EGF und DAB₄₈₆EGF A431-Zellen töten. 12 und 13 zeigen die Behandlungsdauer (von A431 Zellen mit DAB₄₈₆EGF oder DAB₃₈₉EGF), die zur Herbeiführung einer maximalen Hemmung der Proteinsynthese erforderlich ist. Zellen wurden DAB₄₈₆EGF (5 × 10^–9 M (12) oder DAB₃₈₉EGF (5 × 10^–9 M) (13) über die angegebenen Zeitperioden ausgesetzt und dann wurde ungebundenes DAB₄₈₆EGF oder DAB₃₈₉EGF abgewaschen. Nach einer Inkubation über Nacht in Komplettmedium (DMEM + 10% FCS) wurden die Zellen mit [¹⁴C]Leucin markiert. Die Ergebnisse zeigen, dass eine annähernd maximale Hemmung der Proteinsynthese nach einer 15-minütigen Einwirkung von DAB₃₈₉EGF eintritt, während eine längere als 75-minütige Einwirkung für DAB₄₈₆EGF erforderlich ist.
Die Kinetik der Proteinsynthese-Hemmung in mit DAB₃₈₉EGF oder DAB₄₈₆EGF behandelten A431-Zellen ist in 14 dargestellt. Zur Untersuchung der Kinetik der Proteinsynthese-Hemmung wurden A431-Zellen mit DAB₄₈₆EGF (5 × 10^–9) oder DAB₃₈₉EGF (5 × 10^–9 M) in Komplettmedium bei 37°C inkubiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde DAB₄₈₆EGF oder DAB₃₈₉EGF entfernt und die Zellen wurden mit [¹⁴C]Leucin 1 Stunde markiert. Die Ergebnisse zeigen, dass es zu einer 50% Reduktion in der Proteinsynthese nach einer 1-stündigen Inkubation mit DAB₃₈₉EGF kommt, während eine maximale Hemmung nach 4 Stunden auftritt. Die maximale Hemmung der Proteinsynthese tritt mehr als 6 Stunden nach der Inkubation mit DAB₄₈₉EGF ein.
Verwendung
Die verbesserten chimären Toxine der Erfindung werden einem Säugetier, z. B. einem Menschen, verabreicht, das an einer medizinischen Erkrankung, z. B. Krebs, oder anderen Zuständen leidet, die durch die Gegenwart einer Klasse unerwünschter Zellen gekennzeichnet sind, an welche ein Polypeptidligand selektiv binden kann. Die verabreichte Proteinmenge ist abhängig von der Art der Erkrankung, der Schwere der Erkrankung und der Größe der Säugetierart, die an der Erkrankung leidet, unterschiedlich. Im Allgemeinen liegen die Mengen in dem Bereich, der für andere zyotoxische Mittel verwendet wird, die in der Behandlung von Krebs eingesetzt werden, obwohl unter gewissen Umständen wegen der Spezifität und erhöhten Toxizität der verbesserten chimären Toxine geringere Mengen erforderlich sind.
Die verbesserten chimären Toxine können unter Verwendung jedes herkömmlichen Verfahrens verabreicht werden; z. B. durch Injektion oder durch ein Implantat mit zeitlich verzögerter Freisetzung. Im Falle von verbesserten chimären MSH-Toxinen können topische Cremen zum Abtöten primärer Krebszellen verwendet werden, und Injektionen oder Implantate können zum Abtöten metastatischer Zellen verwendet werden. Die verbesserten chimären Toxine können mit jeder nicht-toxischen, pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz kombiniert werden.
Andere Ausführungsbeispiele
Andere Ausführungsbeispiele sind in den folgenden Ansprüchen enthalten. Zum Beispiel wurden chimäre Toxine durch Verfahren konstruiert, die dem Fachmann bekannt sind, wobei DAB₃₈₉ und DAB₄₈₆ an Interleukin 4 (IL-4) fusioniert wurden. DAB₃₈₉-IL-4 ist etwa zehnmal zytotoxischer als DAB₄₈₆-IL-4. DAB₃₈₉ wurde auch an Interleukin 6 fusioniert. DAB₄₈₆ und DAB₃₈₉ wurden auch an Human-Choriongonadotropin fusioniert. Die verbesserten chimären Toxine der Erfindung enthalten Abschnitte von DT, fusioniert an einen beliebigen zellspezifischen Polypeptidliganden, der eine Bindungsdomäne aufweist, die für die bestimmte Klasse von Zellen, die zu vergiften sind, spezifisch ist. Polypeptidhormone sind nützliche derartige Liganden. Chimäre Toxine, z. B. jene, die unter Verwendung der Bin-dungsdomäne eines α- oder β-MSH hergestellt werden, können selektiv an Melanozyten binden, wodurch die Konstruktion verbesserter chimärer DT-MSH-Toxine möglich ist, die in der Behandlung eines Melanoms nützlich sind. Andere Liganden mit spezifischer Bindung, die verwendet werden können, umfassen Insulin, Somatostatin, Interleukin I und III, und granulozytenkoloniestimulierenden Faktor. Andere nützliche Polypeptidliganden mit zellspezifischen Bindungsdomänen sind das follikelstimulierende Hormon (spezifisch für Ovarzellen), luteinisierende Hormon (spezifisch für Ovarzellen), thyroidstimulierende Hormon (spezifisch für Thyroidzellen), Vasopressin (spezifisch für Uteruszellen, wie auch Blasen- und Darmzellen), Prolactin (spezifisch für Brustzellen) und Wachstumshormon (spezifisch für gewisse Knochenzellen). Verbesserte chimäre Toxine unter Verwendung dieser Liganden sind in der Behandlung von Krebs und anderen Erkrankungen der Zellart, an welche eine spezifische Bindung erfolgt, nützlich.
Für eine Reihe von zellspezifischen Liganden ist die Region innerhalb jedes solchen Liganden, in welcher sich die Bindungsdomäne befindet, nun bekannt. Des Weiteren ermöglichen die jüngsten Fortschritte in der Festphasenpolypeptidsynthese den Fachleuten in dieser Technologie die Bestimmung der Bindungsdomäne von praktisch jedem solchen Liganden durch die Synthese verschiedener Fragmente des Liganden und deren Testung auf die Fähigkeit, an die zu markierende Zellklasse zu binden. Somit müssen die chimären Toxine der Erfindung nicht einen vollständigen Liganden enthalten, sondern können vielmehr nur ein Fragment eines Liganden enthalten, welches die gewünschte Zellbindungskapazität auf-weist. Ebenso können Analoge des Liganden oder seiner Zellbindungsregion mit geringfügigen Sequenzvariationen synthetisiert, auf ihre Fähigkeit, an Zellen zu binden, getestet, und in die hybriden Moleküle der Erfindung eingebaut werden. Andere mögliche Liganden umfassen monoklonale Antikörper oder antigenbindende, einfachkettige Analoge monoklonaler Antikörper, wobei das Antigen ein Rezeptor oder eine andere Komponente ist, die an der Oberfläche der Zielzellmembran exprimiert wird.

Claims

Chimäres Toxin, umfassend Proteinfragmente, die durch Peptidbindungen verbunden sind, wobei das chimäre Toxin in aufeinanderfolgender Reihenfolge, beginnend am Amino-Terminus des chimären Toxins umfasst: (a) das enzymatisch aktive Fragment A von Diphtherietoxin, (b) ein erstes Fragment, das die Spaltungsdomäne I₁ neben dem Fragment A von Diphtherietoxin enthält, (c) ein zweites Fragment, das zumindest einen Teil der hydrophoben Transmembranregion von Fragment B von Diphtherietoxin umfasst, wobei das zweite Fragment eine Deletion von mindestens 50 Diphtherietoxinaminosäureresten aufweist, wobei die Deletion C-terminal zu dem Teil der Transmembranregion ist, und wobei das zweite Fragment auch nicht die Domäne I₂ oder die generalisierte Bindungsdomäne von Diphtherietoxin enthält; und (d) ein drittes Fragment, umfassend einen Teil eines zellspezifischen Polypeptidliganden, wobei der Teil zumindest einen Teil der Bindungsdomäne des Polypeptidliganden enthält, der bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an eine vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die von dem enzymatisch aktiven Fragment A angegriffen werden; wobei das chimäre Toxin die Sequenzen des Fragments B zwischen Ser 292 und Thr 387 umfasst und eine größere Toxizität gegenüber der Klasse von Zellen aufweist als jene eines Toxins, das aus DAB₄₈₆ besteht, das an das dritte Fragment fusioniert ist.
Chimäres Toxin nach Anspruch 1, wobei die Deletion mindestens 80 Diphtherietoxinaminosäurereste ist.
Chimäres Toxin nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Deletion eine Sequenz von bis zu 97 Diphtherietoxinaminosäureresten umfasst, wobei die Sequenz die I₂ Domäne enthält.
Chimäres Toxin nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Deletion eine Sequenz von bis zu 99 Diphtherietoxinaminosäureresten umfasst, wobei die Sequenz die I₂ Domäne enthält.
Chimäres Toxin nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fragment B von Diphtherietoxin keine Diphtherietoxinsequenzen C-terminal zu dem Aminosäurerest 386 des nativen Diphtherietoxins enthält.
Chimäres Toxin nach Anspruch 5, wobei (a), (b) und (c) aus DAB₃₈₉ bestehen.
Chimäres Toxin nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das dritte Fragment einen Teil der Bindungsdomäne von EGF umfasst, der bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an die vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die einen Rezeptor für EGF tragen.
Chimäres Toxin nach Anspruch 7, wobei das dritte Fragment EGF umfasst.
Chimäres Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das dritte Fragment zumindest einen Teil der Bindungsdomäne von IL-2 umfasst, der bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an die vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die einen Rezeptor für IL-2 tragen.
Chimäres Toxin nach Anspruch 9, wobei das dritte Fragment die Aminosäuren 2-133 von human IL-2 umfasst.
Chimäres Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das dritte Fragment zumindest einen Teil der Bindungsdomäne von IL-4 umfasst, der bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an die vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die einen Rezeptor für IL-4 tragen.
Chimäres Toxin nach Anspruch 11, wobei das dritte Fragment IL-4 umfasst.
Chimäres Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das dritte Fragment zumindest einen Teil der Bindungsdomäne von IL-6 umfasst, der bewirkt, dass das chimäre Toxin selektiv an die vorbestimmte Klasse von Zellen bindet, die einen Rezeptor für IL-6 tragen.
Chimäres Toxin nach Anspruch 13, wobei das dritte Fragment IL-6 umfasst.
Chimäres Toxin nach Anspruch 1, das DAB₃₈₉-IL-2(2-133) ist.
Chimäres Toxin nach Anspruch 1, das DAB₃₈₉-EGF ist.
Rekombinante Molekül-DNA, die für das chimäre Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 16 codiert.
Expressionsvektor, umfassend das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 17.
Zelle transformiert mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 17.
Pharmzeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des chimären Toxins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, welche die Form einer injizierbaren Zusammensetzung aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, welche die Form eines Implantats mit zeitlich verzögerter Freisetzung aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, welche die Form einer topischen Creme aufweist.
Toxin nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Toxins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines Zustandes, der Krebs oder ein anderer Zustand ist, der durch die Gegenwart einer Klasse unerwünschter Zellen gekennzeichnet ist, an welche ein Polypeptid selektiv binden kann.
Verwendung in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 25 zur Behandlung von Menschen.
Verfahren zur Herstellung eines chimären Toxins nach einem der Ansprüche 1 bis 16, umfassend das Kultivieren einer Zelle, die mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 17 transformiert ist, so dass das chimäre Toxin, das von dem DNA-Molkül exprimiert wird, von der kultivierten Zelle oder dem Überstand isoliert werden kann.