DE69133508T2

DE69133508T2 - Verbessertes immunohistochemisches Färbeverfahren und Reagenzien dafür

Info

Publication number: DE69133508T2
Application number: DE69133508T
Authority: DE
Inventors: Phillip C. Baton Rouge Miller; Michael J. Tucson Degroff; Michael J. Tucson Gizinski; James A. Tucson Rybski; Pamela S. Tucson Vandivort; Anthony L. Tucson Hartman
Original assignee: Ventana Medical Systems Inc
Current assignee: Ventana Medical Systems Inc
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: JP3168195B2; ATE317978T1; JP3503890B2; EP0517818A4; EP0517818A1; JP2966522B2; CA2077451A1; US5418138A; WO1991013336A1; DE69133006D1; JP2000046827A; DE69133508D1; EP0517818B1; DK1030178T3; ES2258422T3; CA2077451C; DE69133006T2; ES2177521T3; ATE217418T1; EP0517818B9

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft stabilisierte Lösungen, beispielsweise zur Verwendung in biologischen Färbeverfahren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gegenwärtig sind im Allgemeinen vier Hauptverfahren, bei denen Peroxidase (HRPO) eingesetzt wird, für Immunfärbeverfahren anerkannt. Die Verfahren basieren auf der Immunreaktion eines im Prüfling zu detektierenden Antigens, das mit einem für das Antigen spezifischen Antikörper komplexiert. Die Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich in der Art der Detektion des Antigen-Antikörper-Komplexes. Die Verfahren umfassen direkte Verfahren, indirekte Verfahren unter Verwendung eines Enzym-konjugierten Sekundärantikörpers, der für die Spezies des Primär- bzw. ersten Antikörpers spezifisch ist, das Peroxidase-Anti-Peroxidase- (PAP-) Verfahren und ein indirektes Biotin-Avidin-Verfahren unter Verwendung eines Biotin-konjugierten Sekundärantikörpers und eines Komplexes einer Biotin-konjugierten Peroxidase und entweder Avidin oder Streptavidin.
Sämtliche immunhistochemische Verfahren sowie andere immunchemische Verfahren sind Mehrschrittverfahren, die aus einer Reihe von Reagenszugaben, Inkubationen und Waschungen bestehen. Die meisten dieser Verfahren erfordern hochqualifiziertes Personal, und die Ergebnisse können zwischen den einzelnen Labors stark variieren. Zur Kostenersparnis, Einheitlichkeit der Objektträgervorbereitung und Reduktion von bei Verfahren auftretenden menschlichen Fehlern sind automatisierte Systeme erforscht worden.
Sowohl für automatisierte als auch für manuelle Verfahren gibt es eine Reihe von zu beachtenden kritischen Punkten. Es muss darauf geachtet werden, dass der Prüfling nicht vom Objektträger verloren geht. Gründliches Waschen des Prüflings zwischen den einzelnen Reagensanwendungen ist essenziell, insbesondere um ungebundene Antikörper zu entfernen, da Rückstände amplifiziert werden würden. Überschüssige Flüssigkeit muss entfernt werden, um ungewollte Verdünnungen von Antikörpern zu verhindern, wobei das Austrocknen von Prüflingen nie zugelassen werden darf. Es muss eine ausreichende Menge Antikörperreagens aufgebracht werden, damit die Objektträgerfläche, auf der der Prüfling aufliegen kann, vollständig bedeckt ist, wobei Abfälle auf ein Minimum reduziert werden müssen.
Darüber hinaus weisen viele der in immunhistochemischen Verfahren als auch in immunchemischen Verfahren verwendeten Reagenzien, wie z.B. Enzymlösungen und Peroxidase-Farbentwicklungsreagenzien, bei Betriebstemperatur und sogar bei Raumtemperatur eine eingeschränkte Stabilität auf. Dies erfordert häufiges Herstellen der Reagenzien. Zudem stellt unspezifische Antikörperbindung, die zu fehlerhaften Ergebnissen führt, nach wie vor ein Problem dar.
Verfahren und Reagenzien, die zu einer Verbesserung der Ergebnisse und Minimierung der Reagensvorbereitung führen, würden sowohl manuelle als auch automatisierte immunhistochemische Verfahren vereinfachen. Viele Verbesserungen könnten ohne weiteres bei verwandten immunchemischen Verfahren, wie z.B. Enzymimmunoassays (ELISA), Immunfluoreszenzassays und In-situ-Hybridisierungen, angewandt werden.
STAND DER TECHNIK
Cosgrove et al. beschreiben in ACL, 23–27 (Dezember 1989), Immunfärbeverfahren, insbesondere Peroxidasefärbeverfahren, und einen automatisierten Färbeapparat. Brigati und Kollegen [Brigati et al., J. Histotechnology 11, 165–183 (1988); Unger et al., J. Histotechnology 11, 253–258 (1988)] beschreiben den automatisierten Fisher-Arbeitsplatz (der immunhistochemische Färbe- und In-situ-Hybridisierungsverfahren durchführen kann) und in den automatisierten Verfahren verwendete Reagenzien. Das System und die Reagenzien sind zudem in den US-Patenten 4.777.020, 4.798.706 und 4.801.431 beschrieben. In jedem dieser Geräte wird ein anderes Verfahren zur Konservierung kostenintensiver (antikörperhältiger) Reagenzien verwendet.
Stross et al. beschreiben in J. Clin. Pathol 42, 106–112 (1989), ein automatisiertes Gewebefärbungssystem, das die Objektträger nach manueller Aufbringung antikörperhältiger Reagenzien verarbeitet. Stark et al. beschreiben in J. Immunol. Methods 107, 89–92 (1988), ein mikroprozessorgesteuertes automatisiertes Färbesystem.
In der JP 61 108387A ist eine Lösung zur Stabilisierung von alkalischer Protease beschrieben, die Aminosäuren wie z.B. Glycin und Calciumsulfat enthält.
In der GB-A-2.070.767 sind stabilisierte Peroxidasechromophorlösungen, die Metabisulfate oder Thiosulfate enthalten, beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft stabilisierte Lösungen, die beispielsweise in Verfahren zum Färben von Objektträgern, bei denen immunchemische Reagenzien eingesetzt werden, verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Vorbehandlung von Gewebeschnitten zum immunhistochemischen Färben unter Verwendung einer stabilisierten proteolytischen Enzymlösung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in einem automatisierten Verfahren verwendet. Das Verfahren kann folgende Schritte umfassen: Die Testfläche (welche den Gewebeabschnitt enthält) eines Objektträgers wird mit aus Wasser und einem Detergens bestehender verbesserter Spüllösung gewaschen. Auf dem Objektträger wird eine verdampfungshemmende Flüssigkeit aufgebracht, um die Testfläche abzudecken. Für Antigene, die eine Demaskierung benötigen, wird der Gewebeabschnitt mit einer verbesserten, stabilisierten proteolytischen Enzymlösung kombiniert. Der Objektträger wird abgespült und die verdampfungshemmende Flüssigkeit erneut auf den Objektträger aufgebracht. Ein Primärantikörper in einem verbesserten Verdünner, der Globuline aus der gleichen Spezies als einen zweiten Antikörper enthält, wird mit dem Gewebeabschnitt für eine Dauer kombiniert, die ausreicht, um eine im Wesentlichen vollständige Antikörperbindung zu erzielen. Der Objektträger wird abgespült und die verdampfungshemmende Flüssigkeit wieder aufgebracht. Ein markierter zweiter Antikörper im verbesserten Verdünner wird mit dem Gewebeabschnitt für ei ne Dauer kombiniert, die ausreicht, um eine im Wesentlichen vollständige Antikörperbindung zu erzielen. Der Objektträger wird abgespült und die verdampfungshemmende Flüssigkeit wieder auf den Objektträger aufgebracht. Farbentwicklungsreagenzien, einschließlich, in einer bevorzugten Ausführungsform, einer stabilisierten Diaminobenzidin- (DAB-) Lösung, werden mit dem Gewebeabschnitt für eine Dauer kombiniert, die zur Farbentwicklung ausreicht. Nach dem Abspülen und gegebenenfalls der DAB-Farbentwicklung und/oder Gegenfärbung ist der Gewebeabschnitt bereit, analysiert zu werden.
Im Folgenden sind im Verfahren verwendete verbesserte Reagenzien beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Zusammensetzungen und Testverfahrensschritte bereit, die sich für immunhistochemische (IHC-) Färbeverfahren im Allgemeinen und insbesondere für IHC-Verfahren eignen, bei denen ein Peroxidase-Markierungsreagens verwendet wird. Viele der Zusammensetzungen und Verfahrensschritte verfügen jedoch, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar ist, über eine allgemeinere Anwendbarkeit.
Gegenwärtig werden im Allgemeinen vier Hauptverfahren für Immunfärbungen angewandt. Die Verfahren basieren auf der Immunreaktion eines Antigens von Interesse im Prüfling, der mit einem für das Antigen spezifischen Antikörper komplexiert. Die Verfahren unterscheiden sich hauptsächlich in der Art und Weise, wie der Antigen-Antikörper-Komplex detektiert wird. In jedem der Verfahren wird ein markierter Antikörper verwendet.
Markierungen, die sich für Immunoassayverfahren, einschließlich IHC-Verfahren, eignen, sind allgemein bekannt. Solche Markierungen umfassen Markierungen, die direkt verfolgt oder gemessen werden können, wie z.B. radioaktive Markierungen, die mit Strahlungszählungsgeräten gemessen werden können; Pigmente, Farbstoffe oder andere Chromogene, die sichtgeprüft oder mit einem Spektralphotometer gemessen werden können; Spinmarker, die mit einem Spinmarkeranalysiergerät gemessen werden können; und fluoreszierende Gruppierungen, die unter UV-Licht vi sualisiert oder beispielsweise mit Standardfluorimetern gemessen werden können. Die Markierung kann eine lumineszierende Substanz, wie z.B. ein Phosphor oder Fluorogen, eine biolumineszierende Substanz, eine chemilumineszierende Substanz oder eine metallhältige Substanz sein.
Amplifikation und bessere Hervorhebung vom Hintergrund können durch die Verwendung von Enzymmarkierungen oder Enzymmarkierungssystemen erzielt werden. Das Enzym spaltet ein Substrat auf, um ein Chromogen herzustellen, das die Stelle des Antigen/Antikörper-Komplexes auf dem Objektträger visualisiert. Das Substrat wird ausgewählt, um das bevorzugte messbare Produkt zu erhalten. Chromogene und fluorogene Enzyme werden dabei bevorzugt. Diese umfassen Enzyme, für die Substrate bekannt sind, die Chromogene bzw. Fluorogene ergeben.
Eine bevorzugte Kombination aus chromogenem Substrat und Enzym verwendet Oxidoreductasen, wie z.B. Meerrettichperoxidase, und ein Substrat, wie z.B. Diaminobenzidin (DAB) und Aminoethylcarbozol (AEC), die eine unterschiedliche Farbe (braun bzw. rot) ergeben. Beliebige andere Kombinationen aus Enzym und Chromogen bildendem Substrat können verwendet werden, wenn diese charakteristische Pigmentierungen bereitstellen.
Enzymkombinationen mit verwendbaren Fluorogensubstraten sind beispielsweise im US-Patent 4.190.496 beschrieben. Die bevorzugten fluorogenen Substrate und geeigneten Enzyme, die dazu entsprechen, umfassen Meerrettichperoxidase, für die Homovanillinsäure oder 4-Hydroxy-3-methoxyphenylessigsäure ein geeignetes Substrat darstellt, β-Galactosidase, für die 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid ein geeignetes Substrat darstellt, alkalische Protease, für die 4-Methylumbelliferylphosphat ein geeignetes Substrat darstellt, andere Umbelliferylphosphate, wie z.B. 4-Carboxyumbelliferylphosphat und Umbelliferylphosphat-4-carboxyalkylester, etc.
Im direkten Verfahren wird der Antikörper chemisch an eine Markierung, vorzugsweise ein Enzym, wie z.B. Peroxidase oder Fluorophor, gebunden. Nach Hinzufügen des markierten Antikörperreagens bindet sich der Antikörper an das Antigen, um ei nen Antigen/Antikörper-Markierungskonjugatkomplex zu bilden. Ein Fluorophor kann direkt visualisiert werden. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wird das Enzymsubstrat aufgebracht und an der Stelle des Antigen/Antikörper-Enzymkonjugatkomplexes ein gefärbter Niederschlag hergestellt.
Die Anwendung des direkten Verfahrens ist eingeschränkt, da ein markierter Antikörper erforderlich ist, der für jedes zu detektierende Antigen spezifisch ist. Solche Reagenzien sind für gewöhnlich nicht im Handel erhältlich. Wenn die Reagenzien jedoch verfügbar sind und die Empfindlichkeit ausreicht, stellt das direkte Verfahren ein bevorzugtes Verfahren der Antigendetektion dar.
Im zweiten Verfahren kommt ein erster Antikörper bzw. Primärantikörper zum Einsatz, der für das Antigen von Interesse spezifisch ist, um den Anfangs-Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Anschließend wird ein markierter Antikörper, vorzugsweise ein enzymkonjugierter Antikörper, der als zweiter Antikörper bzw. Sekundärantikörper bezeichnet wird, der für die Spezies des Primärantikörpers spezifisch ist, verwendet, um den Primärantikörper zu detektieren. Wenn die Markierung ein Enzym ist, wird das Substrat zugesetzt, um den Komplex zu detektieren. Auf diese Weise kann eine Reihe von Primärantikörpern, die in der gleichen Tierspezies hergestellt wurden, mit einem einzigen markierten Sekundärantikörper zur Visualisierung verwendet werden. Zusätzlich wird durch Verwendung des zweiten Antikörpers eine erhöhte Empfindlichkeit erzielt.
Das dritte Verfahren, das als Peroxidase-Anti-Peroxidase-Verfahren oder PAP-Verfahren bezeichnet wird, findet allgemein Anwendung. Das PAP-Verfahren weist drei Hauptreagenzien auf. Zusätzlich zu den Primär- und Sekundärantikörpern wird die Peroxidase mit einem Antikörper gegen Peroxidase komplexiert. Der zweite Antikörper bzw. Bindungsantikörper ist für die Spezies sowohl des Primär- als auch des Antiperoxidase-Antikörpers spezifisch. Der Komplex wird unter Verwendung einer Substrat-Chromogen-Reaktion visualisiert.
Im vierten Verfahren, dem indirekten Biotin-Avidin-Verfahren, wird der Sekundärantikörper an das Vitamin Biotin konjugiert. Das dritte Reagens hängt vom Verfahren ab. Im ABC-Verfahren wird vor oder gleichzeitig mit der biotinkonjugierten Peroxidase Avidin oder Strepavidin zugesetzt. Im LAB-Verfahren ist das dritte Reagens Peroxidase-markiertes Avidin oder Strepavidin. Die freien Stellen des Avidinmoleküls binden sich an das Biotin des Sekundärantikörpers. Der Komplex wird mit einem geeigneten Chromogen visualisiert. Durch die starke Affinität von Avidin für Biotin wird diesem Verfahren eine größere Empfindlichkeit verliehen als anderen konjugierten Antikörperverfahren.
Zum besseren Verständnis und nicht als Einschränkung dienend, wird die Erfindung im Folgenden hinsichtlich eines immunhistochemischen Verfahrens anhand eines indirekten Biotin-Avidin-Peroxidase-Verfahrens beschrieben. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass die verbesserten Verfahrensschritte in anderen immunhistochemischen Verfahren verwendet werden können. In der Tat können viele der verbesserten Schritte allgemein in immunchemischen Verfahren angewandt werden. Manche der Reagenzien und Schritte sind in beliebigen volumenarmen Tests anwendbar, die kritische Reagenskonzentrationsbereiche umfassen und auf einem Objektträger durchgeführt werden. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass die verbesserten Reagenzien auch in beliebigen HRPO-Färbeverfahren verwendet werden können. Zudem können viele der Reagenzien in anderen immunhistochemischen Färbeverfahren, die nicht auf Peroxidase basieren, sowie in anderen immunchemischen Verfahren verwendet werden. Jedes der im veranschaulichenden Verfahren verwendeten Reagenzien ist nachstehend in der in diesem Verfahren verwendeten Reihenfolge beschrieben.
Die hierin verwendete Bezeichnung „Testfläche" stellt eine Fläche eines Objektträgers dar, an die beliebige Testreagenzien oder Proben, wie z.B. Antikörper oder Gewebeabschnitte, gebunden sind. Die Bezeichnung „Gewebeabschnitt" wird verwendet, um die Gewebeabschnitte (sowohl Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Abschnitte und gefrorene Abschnitte), Abstriche, Knochenmarkaspirate, Cytospins und andere Probennmaterialien, die auf einem Objektträger zur Bewertung, insbesondere zur histologischen Bewertung, aufgebracht sind, zu bezeichnen.
REAGENZIEN
ALLGEMEIN
Spüllösungen oder Salzpuffer können verwendet werden, um die Testfläche eines Objektträgers zwischen der Zugabe der Färbungsreagenzien oder anderer Antikörper-, Enzym- oder Nucleinsäure-hältiger Reagenzien abzuspülen.
Eine Spüllösung kann eine Detergensmenge umfassen, die ausreicht, um die Oberflächenspannung der wässrigen Lösung zu reduzieren, damit eine gleichmäßige Verteilung der Spüllösung sichergestellt ist.
Wie zuvor erläutert, stellt das Detergens eine gleichmäßige Verteilung der Spüllösung bereit, damit die gesamte Objektträgerfläche wirksam abgespült wird. Das Detergens sollte mit immunhistochemischen Färbereagenzien und immunchemischen Reagenzien im Allgemeinen verträglich sein und kann beliebige nichtionische biologische Detergenzien umfassen, die von Biochemikern zur Löslichmachung von Proteinen und Membrankomponenten verwendet werden. Dabei werden Polyoxyethylensorbitane und Polyoxyethylenether bevorzugt. Noch bevorzugter ist Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (im Handel unter der Bezeichnung Tween 20 erhältlich) und Polyoxyethylen-23-laurylether (im Handel unter der Bezeichnung Brij 35 erhältlich). Beide Detergenzien sind zahlreich erhältlich, beispielsweise von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO (USA).
Die erfindungsgemäßen stabilisierten Lösungen umfassen vorzugsweise Konservierungsmittel, wie z.B. antimykotische und antimikrobielle Mittel in einer wirksamen Konzentration, um das Wachstum von Mikroorganismen in der Lösung zu hemmen. Konservierungsmittel, die nicht mit immunchemischen Reaktionen wechselwirken, sind allgemein bekannt. Beispiele für Mittel umfassen Gentamycin, Penicillin, Strep tomycin und vorzugsweise Thimerosal. Natriumazid ist dafür bekannt, die Peroxidaseenzymaktivität zu inaktivieren, und wird vorzugsweise nicht mit HRPO-IHC-Färbereagenzien verwendet. Die Mittel sind in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,001% bis 0,1% wirksam und werden vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 0,1%, noch bevorzugter etwa 0,05%, verwendet.
STABILISIERTE PROTEOLYTISCHE ENZYME
Eine Proteaselösung wird als Vorbehandlung für das immunhistochemische Färben mit einer Reihe von Antikörpern, wie z.B. den meisten Antidesmin- und Antikeratin-Antikörpern, auf Paraffin-eingebettete, Formalin-fixierte Gewebeabschnitte aufgebracht. Antikörper, die eine solche Gewebebehandlung zur Antigenerkennung erfordern, das als Antigendemaskieren bzw. Demaskieren bezeichnet wird, sind bereits empirisch bestimmt und in die Literatur aufgenommen. Die Proteaselösung wird vor Aufbringen der Antikörper und vorzugsweise direkt nach der Peroxidasebehandlung aufgebracht.
Es wird angenommen, dass die Protease Gewebe vor Schäden schützt, die während des Fixierens durch Formalin verursacht werden. Formalinfixierung führt zu Vernetzungsbindungen, die die Gewebsantigene maskieren, wodurch die Antikörpererkennung der Antigene und folglich das Färben verhindert wird. Dies kann zu falschnegativen Ablesungen führen, die zu Fehldiagnosen der Gewebsprobe führen können. Die Protease unterbricht die Formalinvernetzung, wodurch die Gewebeantigene den Markierungsreagenzien ausgesetzt werden.
Ein großer Nachteil bei der Verwendung von Protease ist, dass das Enzym nur in gefrorenem Zustand über einen längeren Zeitraum hinweg stabil blieb. Bei Raumtemperatur war das Enzym bei Arbeitsverdünnung nur wenige Minuten stabil. Dies stellt einen erheblichen Nachteil, insbesondere für automatisierte Verfahren, dar.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren die Bereitstellung eines Verdünners, der als Stabilisator für ein proteolytisches Enzym dient. In diesem Verdünner ist das Enzym über längere Zeiträume hinweg bei unterschiedlichen Temperaturen stabil. Insbesondere erwies sich das Enzym im Verdünner in einer wirksamen Konzentration nach 10-wöchiger Lagerung bei 2 bis 8°C und bei Raumtemperatur, wie detailliert in Beispiel 4 beschrieben, als stabil (zumindest 90% der ursprünglichen Enzymaktivität wurde beibehalten). Die stabilisierte Enzymformulierung kann Verschiffung und Versand bei Umgebungstemperaturen sowie wiederholtem Einfrieren und Auftauen standhalten und weist eine stark verlängerte Lebensdauer auf.
Die stabilisierte proteolytische Enzymformulierung umfasst eine wirksame Menge des Enzyms, vorzugsweise bei Arbeitsverdünnung, in einem Puffer, der ein Glykol enthält, ein Reduktionsmittel, eine Calciumionenquelle und gegebenenfalls ein Konservierungsmittel. Eine bevorzugte stabilisierte proteolytische Enzymlösung umfasst einen physiologischen Puffer, etwa 40 bis etwa 60% eines Glykols, eine wirksame Menge eines Reduktionsmittels, eine Calciumionenquelle in einer Konzentration, die ausreicht, um die Enzymstabilität zu erhöhen, und eine wirksame Menge des Enzyms.
Der Puffer ist ein physiologischer Puffer bei einem pH von etwa 7,0 bis etwa 7,5, vorzugsweise 7,4. Der Puffer ist kein Puffer auf Phosphatbasis, da das Calcium in Phosphatpuffer bei einer wirksamen Konzentration ausfällt. Der Puffer kann Folgendes sein: MOPS (2-[N-Morpholino]propansulfonsäure), TES (2-(Hydroxy-1,1-[bis(hydroxymethyl)ethyl]amino)ethansulfonsäure), Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), BES (2-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]ethansulfonsäure), Barbitalpuffer oder Kakodylsäurepuffer, Trismaleat oder vorzugsweise Tris/HCl in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 0,1 M, vorzugsweise etwa 0,025 M.
Das Reduktionsmittel kann Dithiothreit, Ascorbinsäure oder vorzugsweise Natriummetabisulfit (MBS) sein. Diese Mittel eignen sich zur Stabilisierung von Enzymen bei einer Konzentration im Bereich von etwa 0,0005 bis 0,05% (für MBS beträgt diese Konzentration etwa 0,026 bis 2,6 mM). MBS in einer Konzentration von etwa 0,3 mM stellt ein bevorzugtes Reduktionsmittel dar.
Das Glykol kann jedes beliebige Glykol sein, wobei es vorzugsweise Polypropylenglykol, Polyethylenglykol oder noch bevorzugter Propylenglykol ist. Das Glykol liegt in einer wirksamen Menge vor, die ausreicht, um ein Enzym zu stabilisieren, vorzugsweise in etwa 40 bis etwa 60 Vol.-% des Verdünners, noch bevorzugter etwa 50 Vol.-%.
Der Verdünner umfasst auch eine Calciumionenquelle, für gewöhnlich Calciumchlorid, in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 10 mM, vorzugsweise etwa 5 mM. Die Calciumionenquelle ist aufgrund der zuvor dargelegten Probleme hinsichtlich der Unlöslichkeit des Calciums vorzugsweise nicht Calciumphosphat.
Die Lösung enthält gegebenenfalls ein Konservierungsmittel. Geeignete Konservierungsmittel unterscheiden sich nicht von den zuvor erwähnten.
Das Enzym ist ein proteolytisches Enzym, das in zumindest einer wirksamen Menge vorliegt, jedoch für spätere Verdünnungen konzentriert sein kann. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich beträgt etwa 0,1 bis etwa 10 Einheiten pro ml, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,5 Einheiten pro ml. Insbesondere werden etwa 0,25 Einheiten pro ml verwendet. Die Enzymaktivität kann unter Verwendung eines Standardcaseintests und der Gesamtproteinkonzentration, basierend auf der Extinktion bei 280 nm, gemessen werden.
Das Enzym kann eine Exopeptidase (wie z.B. Carboxy- und Aminopeptidase, Dipeptidase) oder vorzugsweise eine Endopeptidase (wie z.B. Pepsin, Cathepsin und Papain) sein. Vorzugsweise ist das Enzym eine alkalische Protease vom Typ VIII, die im Handel von Sigma Chemical Co. erhältlich ist. Eine insbesondere bevorzugte Formulierung ist in nachstehender Tabelle 1 angeführt. TABELLE 1 Stabilisierte proteolytische Enzymformulierung

50% Propylenglykol

0,025 M Tris/HCl, pH 7,4

0,3 mM Natriummetabisulfit

5 mM Calciumchlorid

0,05% Thimerosal

0,025 Einheiten pro ml alkalische Protease vom Typ VIII
Die stabilisierte Enzymformulierung wird durch Vermischen der Bestandteile hergestellt. Nach der Zubereitung wird die Formulierung vorzugsweise bei 2 bis 8°C gelagert, ist jedoch bei Lagerung bei –20°C stabil.
Stabilisierte Peroxidasechromophorformulierung
Peroxidasechromophore sind Elektronen-abgebende Chromophore, die in wässrigen Lösungen bei geringen Konzentrationen im Bereich der Arbeitsverdünnungen der Lösungen eine eingeschränkte Stabilität aufweisen. Die am häufigsten für immunhistochemische Zwecke verwendeten Peroxidasechromophore sind 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, ein braunes unlösliches Endprodukt) und 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC, rotes unlösliches Endprodukt). Für Enzymimmunoassays ist auch ortho-Phenyldiaminhydrochlorid (OPD, ein orange-braunes lösliches Endprodukt) gebräuchlich. Andere Peroxidasechromophore umfassen 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS, grünes lösliches Endprodukt), 5-Aminosalicylsäure (SAS, braunes lösliches Endprodukt), 4-Chlor-1-naphthol (4C1N, blaues unlösliches Endprodukt), ortho-Dianisidin (OD, gelb-orangefarbenes lösliches Endprodukt) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, blassblaues lösliches Endprodukt).
Gegenwärtig wird eine stabilisierte flüssige Formulierung von DAB von Kirkegaard und Perry Laboratories (KPL) vertrieben. Die Formulierung umfasst eine hohe DAB-Konzentration (25 mg/ml), die etwa dem 10fachen der Arbeitskonzentration ent spricht, und erfordert eine Lagerung bei 4°C bei niedrigem pH in Gegenwart eines Glykols unbekannten Typs. Die Lösung bleibt bei 2 bis 8°C etwa 30 Tage lang stabil und ist nach einer Verdünnung auf Arbeitskonzentration gebrauchsfertig. Das KPL-Produkt ist bei der Arbeitskonzentration von 2 mg/ml bei 45°C nicht einmal 1 Tag lang stabil. Ein Standardbeanspruchungstest erfordert Enzymaktivität bei antigenspezifischem Färben nach drei Tagen bei 45°C.
Eine flüssige AEC-Lösung ist auch erhältlich (Sigma Chemical Company). Die Formulierung ist zwar unbekannt, umfasst jedoch eine hohe AEC-Konzentration, etwa das 200fache der Arbeitskonzentration. Die Formulierung wird verdünnt und Wasserstoffperoxid zugesetzt, um die Arbeitslösung zu bilden. Nach der Verdünnung mit zugesetztem Wasserstoffperoxid ist die Arbeitslösung vermutlich nur wenige Stunden stabil.
Für andere HPRO-Chromophore stellt der Anwender die Chromophorlösungen im Allgemeinen in Arbeitskonzentrationen her und vermischt die Lösung am Verwendungstag frisch mit verdünntem Wasserstoffperoxid. Solche Chromophorlösungen können in gefrorenem Zustand vor der Zugabe von Wasserstoffperoxid gelagert werden. Im Gegensatz dazu umfasst die zur Verwendung in vorliegender Erfindung bevorzugte Chromophorlösung kein Peroxid und ist dazu gedacht, auf dem Objektträger mit Peroxid kombiniert zu werden. Dies verhindert die Beschleunigung der durch Vermischen von Peroxid mit dem Chromophor verursachten Oxidation.
Vorzugsweise wird eine stabilisierte Lösung verwendet, die im Arbeitsbereich des Chromophors eine geringe Konzentration an flüssigem HRPO-Chromophor aufweist. Der allgemeine Bereich für Redoxchromophore beträgt etwa 1 bis 2 mg/ml (etwa 1 bis etwa 10 mM). Für DAB beträgt der insbesondere bevorzugte Bereich etwa 4,6 bis 9,2 mM. In der stabilisierten Formulierung bleibt der Chromophor in antigenspezifischen Immunfärbeverfahren nach einem standardisierten dreitägigen Beanspruchungstest bei 45°C biologisch aktiv. Da die stabilisierten Formulierungen den Chromophor vorzugsweise bei Arbeitskonzentration enthalten, ist keine Verdünnung des Reagens seitens des Anwenders erforderlich.
Zusätzlich zum Chromophor besteht die Formulierung im Wesentlichen aus einem sauren Puffer, der fähig ist, einen pH von weniger als 6,0 beizubehalten, aus einer wirksamen Menge eines Reduktionsmittels zur Stabilisierung des Chromophors und aus einem Glykol in einer Menge, die ausreicht, um den Chromophor zu stabilisieren.
Der Puffer ist ein saurer Puffer, der den pH der stabilisierten Lösung unter einem pH von 6,0 hält, vorzugsweise zwischen 5,0 und 5,5. Der Puffer stellt vorzugsweise einen wirksamen pH für die Enzymaktivität (etwa 6 bis 7) bereit, wenn die Chromophorlösung zum enzymhältigen Gemisch auf dem Objektträger zugesetzt wird. Geeignete saure Puffer umfassen Citrat-Phosphat, Citrat-Acetat-, Acetat-, Succinat-, Phthalat- und Maleatpufter. Die Molarität des Puffers ist so eingestellt, dass ein geeignetes Puffervermögen für eine wirksame Enzymaktivität bereitgestellt wird. Die Auswahl eines geeigneten Puffers für einen bestimmten Chromophor ist Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar.
Insbesondere liegt immunhistochemische pH-Optimum für DAB über 6,5, wobei DAB bei einem pH von etwa 5 am stabilsten ist. Zur Erreichung dieser pH-Änderung wird ein schwacher Citrat-Phosphat-Puffer verwendet, der in Kombination mit 0,02 Wasserstoffperoxid in PBS bei einem pH von 7,3 und der auf dem Objektträger verbleibenden Spüllösung (bei pH 7,6) bewirkt, dass der pH des Reaktionsgemisches höher als 7 ist.
Im Gegensatz dazu beträgt enzymatische pH-Optimum für AEC 5,3. Deshalb wird ein stärkerer saurer Puffer (z.B. 0,1 M Acetat, pH 5,3) in der Chromophorformulierung verwendet. Für Chromophore, die einen geringen pH für optimale Aktivität erfordern, wird die Wasserstoffperoxidlösung auch im sauren Puffer hergestellt. In Kombination mit der auf dem Objektträger verbleibenden Spüllösung ergibt sich ein „Objektträger-pH" von weniger als 6, was eine annehmbare AEC-Färbung bereitstellt.
Zusammengefasst kann gesagt werden, dass das Puffervermögen hinsichtlich des optimalen pH für den Chromophor und das Volumen sowie des Puffervermögens und pH der auf den jeweiligen Objektträgern verbleibenden Flüssigkeit ausgewählt wird.
Ein ähnliches Pufferauswahlverfahren wird für andere Peroxidasechromophore durchgeführt, das auf den einzigartigen Erfordernissen des Chromophors und der Färbungseigenschaften des Objektträgers basiert.
Ein zur Verwendung mit DAB bevorzugter Puffer ist ein schwacher Puffer, vorzugsweise Citrat-Phosphat-Puffer bei einer Konzentration von zwischen etwa 5 und etwa 10 mM, vorzugsweise zwischen etwa 7 und etwa 8 mM, noch bevorzugter in einer Konzentration von etwa 7,5 mM. Der Puffer weist einen sauren pH von vorzugsweise zwischen etwa 4,0 und 6,0, noch bevorzugter zwischen etwa 5,0 und 5,5, auf. Insbesondere wird ein pH von 5,3 bevorzugt, sodass bei Vermischung der DAB-Formulierung mit H₂O₂ auf dem Objektträger zum Starten der Farbentwicklungsreaktion der pH des Gemischs 6,5 oder mehr, vorzugsweise etwa 7,0, beträgt, um einen perinukleären DAB-Niederschlag zu vermeiden, was zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse führen kann.
Ein zur Verwendung mit AEC bevorzugter Puffer ist ein relativ stark saurer Puffer, vorzugsweise Acetatpuffer bei einer Konzentration von zwischen etwa 0,5 und etwa 0,01 M, vorzugsweise zwischen etwa 0,25 und etwa 0,05 M, noch bevorzugter etwa 0,1 M. Der Puffer weist einen sauren pH von vorzugsweise zwischen etwa 4,0 und 6,0, noch bevorzugter zwischen etwa 4,5 und 5,5, auf. Insbesondere wird ein pH von 5,0 bevorzugt.
Die Chromophorformulierung enthält darüber hinaus ein Glykol und ein Reduktionsmittel in wirksamen Konzentrationen, die ausreichen, um kleine Moleküle, wie z.B. DAB und AEC, zu stabilisieren. Solche Konzentrationen und die Chromophorkonzentration muss jedoch ausgeglichen werden, damit eine Störung der enzymatischen Aktivität verhindert wird. In diesem Fall stellt Polyethylenglykol (PEG) in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 10%, vorzugsweise etwa 5%, ein bevorzugtes Glykol mit jedem beliebigem HRPO-Chromophor dar.
Das Reduktionsmittel kann eines der zuvor dargestellten sein. Die Konzentration hängt vom ausgewählten HRPO-Chromophor ab und ist auch von Charge zu Charge eines vorgegebenen Chromophors aufgrund der unterschiedlichen Verunreinigungen pro Charge verschieden. Solche Mittel eignen sich beispielsweise zur Stabilisierung von DAB in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,0005 bis 0,05% (etwa 0,026 bis 2,6 mM) sowie zur Stabilisierung von AEC in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,0008 bis 0,008% (etwa 40 bis 400 μm). In den Beispielen ist ein veranschaulichendes Titrierungsverfahren beschrieben, das dazu verwendet werden kann, die geeignete Konzentration des Reduktionsmittels für jeden beliebigen Chromophor zu bestimmen.
Eine für DAB insbesondere bevorzugte Formulierung umfasst etwa 5% Polyethylenglykol und etwa 1 mM Natriummetabisulfit (MBS) (etwa 0,02%). Eine für AEC insbesondere bevorzugte Kombination umfasst etwa 5% Polyethylenglykol und etwa 200 μM MBS (etwa 0,2%).
Der Puffer enthält gegebenenfalls ein Konservierungsmittel. Geeignete Konservierungsmittel unterscheiden sich nicht von den zuvor beschriebenen. Der Puffer umfasst gegebenenfalls auch das gleiche biologische Detergens wie im Antikörperverdünner, um die Detergenskonzentration im Reaktionsgemisch während des Verfahrens auf einem konstanten Wert zu halten. Die stabilisierte DAB-Formulierung wird hergestellt, indem das Glykol zur Pufferlösung (die, falls gegenwärtig, das Detergens enthält) zugesetzt wird. Das Reduktionsmittel wird zu dieser Lösung zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von DAB. Für AEC wird das Reduktionsmittel nach Zugabe des AEC zur glykolhältigen Pufferlösung zugesetzt. Die Herstellung der stabilisierten HRPO-Chromophorlösungen ist detailliert in den Beispielen beschrieben. Nach der Herstellung wird die Chromophorformulierung im Dunkeln bei 2 bis 8°C gelagert.
Die Verwendung einer stabilisierten HRPO-Chromophorlösung unterscheidet sich nicht von der Verwendung von Formulierungen nach dem Stand der Technik, mit der Ausnahme, dass Wasserstoffperoxid nicht in der Formulierung vorliegt und direkt zum Objektträger zugesetzt wird. Die Formulierung ist bei Arbeitskonzentrationen je doch stabil. Deshalb ist es nicht mehr erforderlich, jeden Tag eine frische Arbeitslösung herzustellen.
In der folgenden Tabelle ist ein Vergleich zwischen den Eigenschaften stabilisierter DAB- und AEC-Formulierungen, die zur Verwendung in vorliegender Erfindung bevorzugt werden, sowie im Handel erhältlichen Zubereitungen von DAB (Kirkegaard und Perry Laboratories) und AEC (Sigma Chemical Company) veranschaulicht. TABELLE 2 Chromophorformulierungen

¹ n.e.: nicht vom Hersteller erhältlich
² n.g.: nicht getestet

Wasserstoffperoxid-Farbentwicklungslösung
Bei Peroxidverfahren beginnt die Farbentwicklung, wenn die Chromophorlösung mit einer Wasserstoffperoxidlösung vermischt wird. Die N₂O₂-Lösung kann eine herkömmliche Lösung sein. Eine bevorzugte H₂O₂-Lösung umfasst einen physiologischen Puffer. Geeignete physiologische Puffer waren wie zuvor beschrieben. Insbesondere wird 0,1 M PBS mit einem pH von 7,3 bevorzugt. Die Lösung umfasst gegebenenfalls auch ein Detergens und ein Konservierungsmittel, vorzugsweise 0,1 Tween 20 und 0,05% Thimerosal.
Die H₂O₂-Lösung wird mit der Chromophorlösung vermischt und mit dem Gewebeabschnitt etwa 4 bis etwa 5 Minuten bei etwa 40°C inkubiert.
DAB-Farbverstärkerlösung
Eine DAB-Farbverstärkerlösung wird gegebenenfalls vor Anbringen des Deckglases verwendet, um die DAB-Farbe charakteristischer wiederzugeben. Die DAB-Färbung ist braun. Metallionenlösungen können verwendet werden, um die Farbe dunkler zu machen (Kupfer) oder die Farbe der Färbung auf schwarz (Nickel) oder Blau (Cobalt) zu ändern. Kupfersulfatlösung in Acetatpuffer wird bevorzugt.
Gegenfärbung
Eine Gegenfärbung wird gegebenenfalls vor Anbringen des Deckglases verwendet, um die immunhistochemische Färbung chrakteristischer wiederzugeben. Gegenfärbungen unterscheiden sich in ihrer Farbe von der ersten Färbung und weisen eine Affinität für Gewebe, Zellen oder Zellteile auf, die nicht zu jenen der ersten Färbung zählen. Zahlreiche Gegenfärbungen sind allgemein bekannt. Hämatoxylin stellt eine bevorzugte Gegenfärbung dar.
VERFAHREN
Ein verbessertes immunchemisches Verfahren umfasst die folgenden Schritte. Im Folgenden wird das Verfahren zum besseren Verständnis, ohne als Einschränkung verstanden zu werden, bezugnehmend auf ein immunhistochemisches Verfahren beschrieben, das durch ein indirektes Biotin-Avidin-Peroxidaseverfahren unter Verwendung von DAB als Chromophor veranschaulicht ist. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass ein verbesserter Schritt im Verfahren für andere immunhistochemische Verfahren sowie andere immunchemische Verfahren, wie z.B. ELISA-Immunoassays, verwendet werden kann.
Ein Objektträger mit einem Gewebeabschnitt wird in einer erfindungsgemäßen Spüllösung gewaschen. Der Objektträger kann gewaschen werden, indem dieser in ein Spüllösungsbad eingetaucht wird, wobei das Eintauchen vorzugsweise nacheinander in drei Lösungsbädern erfolgt. Alternativ dazu kann die Spüllösung unter Verwendung einer Spritzflasche auf den Objektträger aufgespritzt werden. Überschüssige Flüssigkeit kann entfernt werden, indem sie vom Objektträger abtropfen gelassen wird oder der Rand des Objektträgers auf eine saugende Oberfläche geblottet wird.
Für jedes der Färbereagenzien wird der Gewebeabschnitt, wie allgemein bekannt ist, während der Inkubationsdauer mit dem Reagens bedeckt. Für Verfahren, bei denen die Objektträger in einem Reagensbad in vertikaler Lage inkubiert werden, reicht die Badstandhöhe aus, um den gesamten Gewebeabschnitt zu bedecken. Für Objektträger, die horizontal inkubiert werden, reichen üblicherweise etwa 100 bis 150 μl des Reagens aus, um das Gewebe zu bedecken; dazu eignen sich 200 μl.
Die Inkubationszeiten sind unterschiedlich und hängen von der Inkubationstemperatur ab. Die Inkubationszeiten für im Wesentlichen vollständige Antikörperbindung, Farbentwicklung und andere Verfahrensschritte sind allgemein bekannt. Viele der Schritte, z.B. Antigendemaskierung, Antikörperbindung und Farbentwicklung, werden vorzugsweise bei erhöhten Temperaturen von zumindest etwa 35°C, vorzugsweise von etwa 40 bis etwa 45°C, durchgeführt. Mit Ausnahme von Schritten, die von der Enzymaktivität abhängen (Antigendemaskierung und Farbentwicklung), können die meisten Schritte jedoch bei Temperaturen von nur 4°C durchgeführt werden, wenn die Inkubationszeit entsprechend erhöht wird. Die für jeden der folgenden Schritte beschriebene Inkubationszeit gilt für eine bevorzugte Inkubationstemperatur von 40°C, sofern nicht anders angegeben.
Eine Flüssigkeit zur Verdampfungshemmung wird auf den Objektträger aufgebracht, um die Gewebeabschnitte zu bedecken, indem die Flüssigkeit auf den nassen Gewebeabschnitt aufgetropft wurde. Dazu wird eine ausreichende Menge der Flüssigkeit, vorzugsweise 500 μl, zugesetzt, um den Gewebeabschnitt zu bedecken.
Zu den Objektträgern wird eine Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt, um endogene Peroxidase-induzierte Störung des Färbens zu beseitigen. Die H₂O₂-Lösung wird zur verdampfungshemmenden Flüssigkeit, die den Gewebabschnitt bedeckt, zugesetzt und dringt durch die verdampfungshemmende Flüssigkeit zum darunter liegenden Gewebeabschnitt. Die H₂O₂-Lösung wird für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreicht, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu beseitigen, vorzugsweise 4 bis 6 Minuten.
Wenn das Antikörperfärbereagens für ein Antigen spezifisch ist, das ein Demaskieren erforderlich macht, wie z.B. Desmin oder Keratin, wird der Gewebeabschnitt vor der Zugabe des Primärantikörpers mit einer stabilisierten proteolytischen Enzymlösung der vorliegenden Erfindung behandelt. Die stabilisierte proteolytische Enzymlösung wird zur verdampfungshemmenden Flüssigkeit zugesetzt, die den Gewebeabschnitt bedeckt, und dringt durch die verdampfungshemmende Flüssigkeit zum darunter liegenden Gewebeabschnitt. Nach einer Inkubationszeit, die zur Antigendemaskierung ausreicht, optimalerweise etwa 4 bis etwa 5 Minuten, wird der Objektträger gewaschen und die verdampfungshemmende Flüssigkeit zur Verdampfungshemmung erneut aufgebracht.
Vor Aufbringung des Antikörpers und vorzugsweise unmittelbar nach der Peroxidbehandlung wird eine Proteaselösungsmenge, die ausreicht, um den Gewebeabschnitt zu bedecken, geeigneterweise etwa 200 μl, auf das Paraffin-eingebettete, Formalinfixierte Gewebe aufgebracht. In diesem Verdünner unterbricht die Protease die Formalinvernetzung ohne dabei die Gewebeantigene zu schädigen. Die Antigene sind somit den Markierungsreagenzien ausgesetzt, was genauere Ergebnisse ermöglicht.
Die Inkubationszeit reicht aus, um das Vernetzen zu unterbrechen, jedoch nicht lange genug, dass die Antikörper dabei zerstört werden. Die Zeitdauer hängt von der Temperatur, Enzymkonzentration, Gewebedicke, vom Gewebetyp und der Zeitspanne in Formalin ab. Eine geeignete Zeit kann ohne weiteres bestimmt werden. In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich eine Inkubation von 4 bis 5 Minuten bei 40°C, vorzugsweise 4 Minuten und 30 Sekunden bei 40°C. Nach der Inkubation wird die Proteaselösung abgewaschen und das nächste Reagens im Färbungs/Markierungs-Verfahren aufgebracht. Wenn diese Bereiche nicht eingehalten werden, kann es leicht zu einem Über- und/oder Unterverdau des Gewebes durch Protease kommen, was zu zerstörten bzw. maskierten Antigenen führen kann. Nach der Inkubation wird der Objektträger abgespült.
Nach der Inkubation, dem Waschen und Wiederaufbringen der verdampfungshemmenden Flüssigkeit werden die Markierungsreagenzien zum Gewebeabschnitt zugesetzt. Zuerst wird eine Primärenzymlösung dieser Erfindung zum Objektträger zugesetzt. Die Antikörperlösung wird für eine Zeitdauer inkubiert, die für eine im Wesentlichen vollständige Antikörperbindung ausreicht, zumindest etwa 5 Minuten. Nach der Inkubation, dem Waschen und Wiederaufbringen der verdampfungshemmenden Flüssigkeit wird die HRPO-markierte Avidinlösung mit dem Gewebeabschnitt bei etwa 37 bis 40°C für eine Zeitdauer inkubiert, die für eine im Wesentlichen vollständige Biotin-Avidin-Bindung ausreicht, nämlich etwa 4 bis 5 Minuten.
Nach der Inkubation, dem Waschen und Wiederaufbringen der verdampfungshemmenden Flüssigkeit werden die Farbentwicklungsreagenzien zum Objektträger zugesetzt. Die Farbentwicklungsreagenzien umfassen eine stabilisierte DAB-Lösung dieser Erfindung und eine Wasserstoffperoxidlösung. Die Reagenzien können vermischt werden und anschließend nicht länger als etwa 15 Minuten vor Gebrauch zum Ob jektträger zugesetzt werden. Vorzugsweise wird die DAB-Lösung gefolgt von einer Zugabe der H₂O₂-Lösung zum Objektträger zugesetzt. Die Lösungen werden vermischt, um die Farbentwicklungsreaktion zu starten. Die Lösungen können auf dem Objektträger vermischt werden, indem der Objektträger in einen Rüttler platziert wird. Nach einer Inkubationszeit, die zur Farbentwicklung ausreicht, etwa 5 Minuten, und Waschen ist das immunhistochemische Färbeverfahren beendet. Eine DAB-Farbverstärkungslösung, vorzugsweise eine Kupfersulfatlösung, und/oder eine Gegenfärbung werden gegebenenfalls vor Anbringen des Deckglases zugesetzt.
Die Schritte für ein automatisiertes Verfahren unterscheiden sich nicht von denen eines manuellen Verfahrens. Insbesondere sind die Reagenzien, die Zugabereihenfolge der Reagenzien sowie die Inkubationszeit und -temperatur gleich. Die Art der Aufbringung der Reagenzien auf den Gewebeabschnitt und das Inkubieren damit sowie die Art, wie der Gewebeabschnitt abgespült und die überschüssige Spüllösung entfernt wird, hängt von der Vorrichtung ab. Ein bevorzugtes automatisiertes Verfahren ist detailliert in Beispiel 2 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden durch nachstehende spezifische, jedoch nicht einschränkende, Beispiele näher veranschaulicht. Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben und die Konzentrationen, sofern nicht anders angegeben, in Gewichtsprozent. Zweckdienlich auf die Praxis eingeschränkte Verfahren sind im Präsens beschrieben, während die im Labor durchgeführten Verfahren im Präteritum erläutert sind.
BEISPIEL 1
Herstellung neuartiger Färbereagenzien
Jedes der neuartigen erfindungsgemäßen Reagenzien wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Spüllösung
Durch Zugabe von 1,0 ml Tween 20 (Sigma P-1379) und 500 mg Thimerosal zu einem Liter destilliertem Wasser werden 0,1% Tween 20 und 0,05% Thimerosal erhalten.
Stabilisierte Proteaseformulierung
0,5 M Tris/HCl mit einem pH von 7,4 wird durch Herstellung der Lösung A (0,2 M Trizma Base) zubereitet, indem 24,2 g Trizma Base zu 1 l destilliertem Wasser und Lösung B (0,2 M HCl) zugesetzt werden. Durch Zugabe von 50 ml der Lösung A, 41,4 ml der Lösung B und 108,6 ml destilliertem Wasser werden 0,05 M Tris/HCl mit einem pH von 7,4 erhalten.

Für 400 ml der stabilisierten Proteaseformulierung wird Folgendes vermischt:

200 ml	Tris/HCl-Puffer mit einem pH von 7,4
200 ml	Propylenglykol
0,02 g	Natriummetabisulfit
0,294 g	Calciumchlorid
0,20 g	Thimerosal
100	Einheiten der alkalischen Protease vom Typ VIII

Verdünner für Primär- und Sekundärantikörperreagenzien
Der Verdünner wird durch Herstellung von 0,1 M Phosphatpuffer (PBS) mit einem pH von 7,3 zubereitet. Die nachstehenden Reagenzien werden zum Puffer zugesetzt und vermischt:

3 mg/ml (0,3%) Ziegenglobuline (Sigma Chemical Co., Katalognr. G 5640)

0,1% Tween 20 und

0,05% Thimerosal.
Stabilisierte DAB-Formulierung
Zur Herstellung eines Liters von 7,5 mM Citrat-Phosphat-Puffer mit einem pH von 5,3 werden nachstehende Reagenzien in folgender Reihenfolge in 800 ml destilliertem Wasser gelöst:

1. 510,5 mg Zitronensäure (Sigma C-7129)
2. 1,17 gm Kaliumphosphat (Sigma P-5504)
3. 1 ml Tween 20 (Sigma P-1379)
4. 0,5 g Thimerosal
5. Zugabe von destilliertem Wasser auf 1 Liter.

Als Nächstes werden 5% Polyethylenglykol (PEG) (Sigma P-5413) in Citrat-Phosphat-Puffer hergestellt, indem 5 g PEG in 80 ml Puffer gelöst werden, wonach mit zusätzlichem Puffer auf 100 ml verdünnt wird. Zur Herstellung von Lösung A werden 95,05 mg Natriummetabisulfit (MBS) (Sigma S-9000) in 5 ml Citrat-Phosphat-Puffer, der 5% PEG enthält, gelöst (100 mM MBS). Zur Herstellung der Lösung B werden 100 μl der Lösung A in 10 ml Citrat-Phosphat-Puffer, der 5% PEG enthält, verdünnt.
Damit 2 mg DAB/ml von 7,5 mM Citrat-Phosphat-Puffer mit einem pH von 5,3, der 1,0 mM Natriummetabisulfit und 5% Polyethylenglykol enthält, erhalten werden, werden 20 mg DAB (Sigma D-5637) in 10 ml der Lösung B gelöst. Bis zum Gebrauch erfolgt die Lagerung nach der Herstellung bei 2 bis 8°C im Dunkeln.
Stabilisierte AEC-Formulierung
Zur Herstellung eines Liters von 0,1 M Acetatpufter mit einem pH von 5,0 werden nachstehende Reagenzien in folgender Reihenfolge in 800 ml destilliertem Wasser gelöst:

1. 9,58 gm Natriumacetattrihydrat (Sigma S-8625)
2. 1,70 ml Eisessig (Sigma A-6283)
3. 1,7 ml Brij-35 (Sigma 430AG-6)
4. Zugabe von destilliertem Wasser auf 1 Liter.

Als Nächstes werden 5% Polyethylenglykol (PEG) (Sigma P-5413) in Acetatpuffer hergestellt, indem 5 g PEG in 80 ml Puffer gelöst werden, wonach mit zusätzlichem Puffer auf 100 ml verdünnt wird. Danach werden 100 mg AEC (Sigma A-5754) in 10 ml Dimethylformamid (Baker 9221-01) gelöst. Anschließend werden 10 ml des gelösten AEC zu 90 ml des Acetatpuffers mit PEG zugesetzt. Dann wird die Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und die Lösung durch ein Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert, um etwa 1 mg/ml AEC, 0,1 M Acetatpufter mit einem pH von 5,0 und 5% Polyethylenglykol zu erhalten, damit die AEC-Lösung hergestellt werden kann.
Dann werden 40,9 mg Natriummetabisulfit (MBS) (Sigma S-9000) in 10 ml Acetatpuffer, der 5% PEG enthält, gelöst (21,5 mM MBS). Es folgt eine Titrierung der MBS-Lösung in die AEC-Lösung, bis das MBS die AEC-Reaktion um etwa 0,2 Extinktionseinheiten hemmt. Die MBS-Endkonzentration variiert, je nach Reinheit der AEC-Charge, zwischen etwa 100 bis etwa 200 μM. Nach der Herstellung erfolgt die Lagerung bei 2 bis 8°C im Dunkeln bis zum Gebrauch. Die Titrierung wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Der Chromophor Aminoethylcarbazol (AEC) ist als ein zu etwa 90% reines Produkt von SIGMA Chemical Company erhältlich. Der Chromophor ist nicht rein, und während der in Beispiel 1 beschriebenen Solubilisierung fällt der Chromophor aus, wenn AEC (gelöst in Dimethylformamid) zu 0,1 M Natriumacetatpuffer zugesetzt wird. Folglich ist die Endkonzentration von AEC vor der Zugabe von MBS nicht bekannt. Deshalb muss die verwendete MBS-Menge für jede der hergestellten flüssigen AEC-Chargen durch Titrierung experimentell bestimmt werden.
In Gegenwart verschiedener Konzentrationen von MBS zur Bestimmung der MBS-Konzentration, die die AEC-Reaktion um etwa 0,2 Extinktionseinheiten hemmt, wird eine enzymatische Reaktion des AEC durchgeführt. Diese liegt üblicherweise im Bereich von 100 bis 200 μM MBS (Endkonzentration). Die Reaktanten sind nachstehend beschrieben:

a. 483,4 μl frisches AEC (vor der Zugabe von MBS, wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt)
b. 8,4 μl 0,3 mg Avidin-D-Meerrettichperoxidase/ml 0,1 M Natriumacetatpuffer mit einem pH von 5,0, der 5% Polyethylenglykol und 0,05% des Detergens Brij 35 enthält
c. 8,4 μl 180 mM Wasserstoffperoxid in 0,1 M Natriumacetatpuffer mit einem pH von 5,0, der 5% Polyethylenglykol enthält, und
d. 5,0 μl verschiedener MBS-Konzentrationen in 0,1 M Natriumacetatpuffer mit einem pH von 5,0, der 5% Polyethylenglykol und das Detergens Brij 35 enthält.

Die Titrierung wurde wie folgt durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, wonach 100 μl des AEC-Reaktionsgemischs zu 900 μl entionisiertem Wasser (1:10-Verdünnung) zugesetzt werden. Die Extinktion des verdünnten AEC wird von 800 bis 400 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer gescannt. Als Blindprobe wird eine 1:10-Verdünnung von 0,1 M Natriumacetatpuffer mit einem pH von 5,0, der 5% Polyethylenglykol enthält, mit entionisiertem Wasser verwendet.
Die verschiedenen Extinktionskurven werden in Diagrammform dargestellt und die Peak-Extinktion für jede der MBS-Konzentrationen bei 480 nm ermittelt. Aus diesen Daten wird die geeignete MBS-Endkonzentration ausgewählt und ausreichend MBS aus der 21,5 mM Stammlösung zur AEC-Massenlösung zugesetzt. Die MBS-hältige AEC-Endlösung wird sodann getestet und mit der kein MBS enthaltenden AEC-Lösung verglichen, um zu bestätigen, dass die Extinktionskurve für die MBS-hältige Lösung etwa um 0,2 Extinktionseinheiten niedriger ist als die Kurve für die nichtstabilisierte Formulierung. Das fertige Reagens wird bis zum Gebrauch gekühlt im Dunkeln gelagert.
BEISPIEL 2
Händisches indirektes Biotin-Avidin-Färbeverfahren zur Detektion von Desmin
Ein entparaffinierter Gewebeschnitt wurde unter Verwendung der Spüllösung gewaschen, indem etwa 10 ml aus einer Spritzflasche über dem Gewebeschnitt auf den Objektträger gespritzt wurden. Der Gewebeschnitt wurde danach mit einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit bedeckt, indem 500 μl Dodecan zugesetzt wurden. Der Waschvorgang und der Zusatz einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit wurden im verbleibenden Teil des Verfahrens nach dem Ende einer jeden Inkubation jeweils auf die gleiche Weise durchgeführt.
Eine Lösung von 3% H₂O₂ in 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung (0,1 M Phosphat, 0,055 M NaCl), pH 7,3, 0,1% Tween 20, (200 μl) wurde dem Objektträger zugesetzt, indem die Lösung auf die verdampfungshemmende Flüssigkeit aufgetropft wurde. Die H₂O₂-Lösung wurde 5 min lang bei 40°C inkubiert.
Die Proteaselösung (200 μl) wurde auf den Objektträger aufgebracht und 5 min lang bei 40°C inkubiert.
Was das Desmin betrifft, so handelte es sich bei der Primärantikörperlösung um monoklonales Maus-Anti-Desmin (Klon DE-R-11; Dako, Carpenteria, CA), das mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verdünnungsmittel im Verhältnis von 1:7 verdünnt wor den war. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei 40°C wurde der Objektträger gewaschen und die verdampfungshemmende Flüssigkeit aufgebracht.
Die zweite Antikörperlösung (200 μl), vorzugsweise in einem Verhältnis von 1:50 im Lösungsmittel verdünnter biotinylierter Ziege-Anti-Maus-Antikörper, Fab'2-Fraktion (Jackson Immuno Research), wurde 5 min lang bei 40°C inkubiert. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei 40°C wurde der Objektträger gewaschen und die verdampfungshemmende Flüssigkeit aufgebracht.
Peroxidase-markiertes Streptavidin (200 μl) (Jackson Immuno Research), das in einem Verhältnis von 1:100 in dem wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Antikörper-Verdünnungsmittel (wobei Rinderglobuline für Ziegenglobuline subsituiert waren) verdünnt worden war, wurde dem Objektträger zugesetzt und das Ganze 5 min lang bei 40°C inkubiert. Der Objektträger wurde gewaschen und die verdampfungshemmende Flüssigkeit erneut aufgebracht.
Die stabilisierte DAB-Lösung (200 μl) wurde dem Objektträger zugesetzt. Eine Lösung von 0,02% H₂O₂ in 0,1 M PBS, pH 7,3, 0,1% Tween 20, wurde zugesetzt und mit der DAB-Lösung gemischt, um die Reaktion auszulösen. Das Gemisch wurde 5 min lang bei 40°C inkubiert.
Der Objektträger wurde gespült, die verdampfungshemmende Flüssigkeit aufgebracht und daraufhin die DAB-Farbe mit der Kupfersulfatlösung (0,5% CuSO₄ in 0,1 M Acetatpuffer, pH 5,0, 0,1% Tween 20) verstärkt, indem die Lösung 5 min lang bei 40°C inkubiert wurde. Nach der DAB-Verstärkung wurde der Objektträger gespült, mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydratisiert (unter Verwendung von Alkohol/Xylol) und mit einem Deckglas eingedeckt.
BEISPIEL 3
Automatisiertes indirektes Biotin-Avidin-Färbeverfahren zur Detektion von Desmin Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde unter Verwendung einer am meisten bevorzugten automatisierten Färbevorrichtung wiederholt. Die Vorrichtung ist in einer gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung derselben Anmelder mit der Seriennummer 07/488.601, eingereicht am 2. März 1990 unter dem Titel „Automated Biological Reaction Apparatus" von Copeland et al., in ihren Einzelheiten beschrieben.
Ein entparaffinierter Gewebeschnitt wurde gespült, in das Gerät eingebracht und mit einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit bedeckt. Der Objektträger wurde nach der auf die DAB-Verstärkung folgenden Spülung entnommen, und der verbleibende Teil des Verfahrens wurde händisch durchgeführt. Jeder der automatisierten Schritte wurde vom Gerät so wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Inkubationszeit 4 min 20 s betrug.
Das Verfahren wurde mit einer Inkubationszeit von 4 min 37 s wiederholt.
BEISPIEL 4
Automatisiertes indirektes Biotin-Avidin-Färbeverfahren zur Detektion von Desmin
Das Verfahren aus Beispiel 3 wurde bis auf die folgenden Ausnahmen wiederholt:
Die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte stabilisierte AEC-Lösung wurde anstelle der stabilisierten DAB-Lösung verwendet, und beim Puffer in der Wasserstoffperoxidlösung handelte es sich um 0,1 M Natriumacetat. Nach der Farbentwicklung wurde der Objektträger gespült, mit Hämotoxylin gegengefärbt und mit einem wässrigen Einschließmittel eingedeckt.
BEISPIEL 5
Untersuchung der Enzymaktivität in stabilisierter Proteaseformulierung Zwei Proben einer stabilisierten Proteaseformulierung, die zur Verwendung in dieser Erfindung bevorzugt ist, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass eine Formulierungsprobe kein Thimerosal enthielt. Jede Lösung wurde in drei aliquote Teile aufgeteilt und in Phiolen eingefüllt. Die Phiolen wurden sofort nach der Bestimmung der Enzymaktivität einer jeden Charge (Anfangsaktivität am Tag 0) mithilfe eines Caseinlösungstests bei Atmosphären von 2–8°C, Raumtemperatur (RT, ca. 23°C) bzw. 45°C gelagert. Die Aktivität aller Phiolen bei jeder der Temperaturen wurde dann mithilfe desselben Caseinlösungstests als Prozentsatz der Anfangsaktivität periodisch gemessen. Der Test wurde dreifach durchgeführt und der Mittelwert herangezogen. Diagramme wurden unter Verwendung des Werts von 5,0 Caseinaktivitätseinheiten (mittlere Anfangsaktivität) als 100% erstellt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt. Die Werte der Enzymaktivität der Formulierung ohne Thimerosal wurden nach 11 Wochen, jene der Formulierung mit Thimerosal nach 10 Wochen bestimmt. TABELLE 2 Prozentsatz der Anfangsenzymaktivität
Wie aus der Tabelle hervorgeht, behielt die stabilisierte Proteaseformulierung mindestens 10 Wochen lang mehr als 90% der Anfangsenzymaktivität bei 2 bis 8°C und bei Raumtemperatur bei.
Weiters ist ein Verfahren zur Verhinderung der Verdampfung von auf einem Testbereich eines Objektträgers aufgebrachten Reagenzien mithilfe einer verdampfungs hemmenden Lösung bereitgestellt. Die verdampfungshemmende Lösung kann hauptsächlich aus einem Öl der mittelkettigen Alkanfamilie bestehen. Das Alkan kann 10 bis 16 Kohlenstoffatome aufweisen. Die verdampfungshemmenden Flüssigkeit kann hauptsächlich aus Pentadecan bestehen.
Außerdem ist ein verbessertes Testverfahren bereitgestellt, bei dem ein Testreagens oder -probe an einen Testbereich eines Objektträger gebunden ist, wobei die Verbesserung das Bedecken des Testbereich mit einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit, die hauptsächlich aus einem Öl der mittelkettigen Alkanfamilie besteht, umfasst. Das Verfahren kann gegebenenfalls ein immunhistochemisches Färbeverfahren sein. Das Verfahren ist gegebenenfalls ein In-situ-Hybridisierungsvertahren.
Auch ist ein verbessertes immunhistochemisches Verfahren bereitgestellt, das die folgende Schrittabfolge umfasst:

a. das Spülen eines Gewebeschnitts mit einer wässrigen Spüllösung, die hauptsächlich aus einer im Wesentlichen salzfreien wässrigen Lösung und einer ausreichenden Menge eines nichtionischen biologischen Detergens besteht, zur Senkung der Oberflächenspannung; um eine ebenmäßige Verteilung der Lösung zu ermöglichen;
b. das Auftragen einer zum Bedecken des Gewebeschnitts ausreichenden Menge einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit;
c. das Kombinieren eines Primärantikörpers in einem Verdünnungsmittel, das im Wesentlichen aus einem physiologischen Puffer besteht, mit der Globulinfraktion von nichtimmunem Serum derselben Spezies als zweiten Antikörper in einer Proteinkonzentration, die ausreicht, die nichtspezifische Antikörperbindung mit dem Gewebeschnitt für einen für die im Wesentlichen vollständige Antikörperbindung ausreichenden Zeitraum zu hemmen;
d. das Spülen des Gewebes mit einer Spüllösung, die hauptsächlich aus einer im Wesentlichen salzfreien wässrigen Lösung und einer ausreichenden Menge eines nichtionischen biologischen Detergens besteht, zur Senkung der Oberflächenspannung, um eine ebenmäßige Verteilung der Lösung zu ermöglichen;
e. das Auftragen einer zum Bedecken des Gewebeschnitts ausreichenden Menge einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit;
f. das Kombinieren eines markierten zweiten Antikörpers in einem Verdünnungsmittel, das im Wesentlichen aus einem physiologischen Puffer besteht, mit der Globulinfraktion von nichtimmunem Serum derselben Spezies als ebendiesen zweiten Antikörper in einer Proteinkonzentration, die ausreicht, die nichtspezifische Antikörperbindung mit dem Gewebeschnitt für einen für die im Wesentlichen vollständige Antikörperbindung ausreichenden Zeitraum zu hemmen;
g. das Spülen des Gewebeschnitts mit einer Spüllösung, die hauptsächlich aus einer im Wesentlichen salzfreien wässrigen Lösung und einer ausreichenden Menge eines nichtionischen biologischen Detergens besteht, zur Senkung der Oberflächenspannung, um eine ebenmäßige Verteilung der Lösung zu ermöglichen;
h. das Auftragen einer zum Bedecken des Gewebeschnitts ausreichenden Menge einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit;
i. das Kombinieren von Farbentwicklungsreagenzien mit dem Gewebeschnitt für einen zur Farbentwicklung ausreichenden Zeitraum; und
j. das Spülen des Gewebeschnitts mit einer Spüllösung, die hauptsächlich aus einer im Wesentlichen salzfreien wässrigen Lösung und einer ausreichenden Menge eines nichtionischen biologischen Detergens besteht, zur Senkung der Oberflächenspannung, um eine ebenmäßige Verteilung der Lösung zu ermöglichen.

Beim obigen Verfahren, das die Schritte (a) bis (j) umfasst, kann die Markierung eine Peroxidasemarkierung sein und das Verfahren zusätzlich nach Schritt (b) und vor Schritt (c) Folgendes umfassen:

i. das Kombinieren einer Wasserstoffperoxidlösung mit dem Gewebeschnitt für einen Zeitraum, der ausreicht, endogene Peroxidaseaktivität auszuschalten;
ii. das Spülen des Gewebeschnitts mit einer Spüllösung, die hauptsächlich aus einer im Wesentlichen salzfreien wässrigen Lösung und einer ausreichenden Menge eines nichtionischen biologischen Detergens besteht, zur Senkung der Oberflächenspannung, um eine ebenmäßige Verteilung der Lösung zu ermöglichen; und
iii. das Auftragen einer zum Bedecken des Gewebeschnitts ausreichenden Menge einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit.

Ein obgenanntes Verfahren kann zudem nach Schritt (d) und vor Schritt (e) Folgendes umfassen:

i. das Bedecken des Gewebeschnitts mit einer stabilisierten proteolytischen Enzymlösung, die 40 bis 60% eines Glykols, einen physiologischen Puffer, eine effektive Menge eines Reduktionsmittels, eine Calciumionenquelle in einer zur Verstärkung der Enzymstabilität ausreichenden Menge, eine effektive Menge besagten Enzyms und gegebenenfalls eine effektive Menge eines Konservierungsmittels umfasst, für einen zur Demaskierung von Gewebeantigenen ausreichenden Zeitraum; und
ii. das Auftragen einer zum Bedecken des Gewebeschnitts ausreichenden Menge einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit.

Beim markierten zweiten Antikörper kann es sich um einen biotinylierten Antikörper handeln, und das Verfahren kann zusätzlich nach Schritt (h) und vor Schritt (i) Folgendes umfassen:

i. Das Kombinieren von Peroxidase-markiertem Avidin in einem geeigneten Verdünnungsmittel mit dem Gewebeschnitt für einen Zeitraum, der für die im Wesentlichen vollständige Biotin-Avidin-Bindung ausreicht;
ii. das Spülen des Gewebeschnitts mit einer Spüllösung, die hauptsächlich aus einer im Wesentlichen salzfreien wässrigen Lösung und einer ausreichenden Menge eines nichtionischen biologischen Detergens besteht, zur Senkung der Oberflächenspannung, um eine ebenmäßige Verteilung der Lösung zu ermöglichen; und
iii. das Auftragen einer zum Bedecken des Gewebeschnitts ausreichenden Menge einer verdampfungshemmenden Flüssigkeit.

Die Farbentwicklungsreagenzien aus Schritt (i) können eine stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung umfassen, die im Wesentlichen aus Folgendem besteht:

(a) einem Peroxidasechromophor in einer Konzentration im Arbeitsbereich des Enzyms:
(b) einem sauren Puffer, der zur Aufrechterhaltung eines pH-Werts von unter 6,0 imstande ist;
(c) einer effektive Menge eines Reduktionsmittels; und
(d) 1 bis 10% eines Glykols.

Claims

Stabilisierte proteolytische Enzymlösung, umfassend: a. 40 bis 60% eines Glykols; b. einen physiologischen Puffer, c. eine effektive Menge eines Reduktionsmittels; d. eine Calciumionenquelle in einer Konzentration, die ausreicht, um die Enzymstabilität zu erhöhen; e. eine effektive Menge des Enzyms.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach Anspruch 1, die ferner eine effektive Menge eines Konservierungsmittels umfasst.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Enzym eine alkalische Protease vom Typ VIII ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Puffer ein Tris-Puffer mit einem pH von 7,0 bis 7,5 ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach Anspruch 4, worin der Puffer 0,01 bis 0,1 M Tris/HCl, pH 7,4, ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Reduktionsmittel aus der aus Dithiothreit, Ascorbinsäure und Natriummetabisulfit bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach Anspruch 6, worin das Reduktionsmittel Natriummetabisulfit in einer Konzentration im Bereich von 0,0005 bis 0,05% ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Glykol Propylenglykol ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Calciumionenquelle Calciumchlorid in einer Konzentration von 1 bis 10 mM ist.
Stabilisierte proteolytische Enzymlösung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, worin das Konservierungsmittel Thimerosal in einer Konzentration im Bereich von 0,001% bis 0,1% ist.
Verbessertes immunhistochemisches Färbeverfahren für einen Gewebeabschnitt, worin Antigene demaskiert werden, wobei die Verbesserung das Bedecken des Gewebes mit einer stabilisierten proteolytischen Enzymlösung, die einen physiologischen Puffer, 40 bis 60% eines Glykols, eine effektive Menge eines Reduktionsmittels, eine Calciumionenquelle in einer Konzentration, die ausreicht, um die Enzymstabilität zu erhöhen, und eine effektive Menge des Enzyms umfasst, für eine Dauer umfasst, die ausreicht, um die Antigene zu demaskieren.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die stabilisierte proteolytische Enzymlösung ferner eine effektive Menge eines Konservierungsmittels umfasst.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung, die im Wesentlichen aus Folgendem besteht: a. einem Peroxidasechromophor in einer Konzentration im Arbeitsbereich des Enzyms; b. einem sauren Puffer, der einen pH von unter 6,0 aufrechterhalten kann; c. einer effektiven Menge eines Reduktionsmittels; und d. 1 bis 10% eines Glykols.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach Anspruch 13, worin das Peroxidasechromophor 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) ist und der saure Puffer ein Citrat-Phosphat-Puffer in einer Konzentration zwischen 5 und 10 mM ist.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach Anspruch 13, worin das Peroxidasechromophor 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC) ist und der saure Puffer ein Acetatpuffer in einer Konzentration zwischen 0,01 und 0,5 M ist.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin das Reduktionsmittel aus der aus Dithiothreit, Ascorbinsäure und Natriummetabisulfit bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach Anspruch 16, worin das Reduktionsmittel Natriummetabisulfit ist.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, worin das Glykol Polyethylenglykol ist.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach Anspruch 18, worin Polyethylenglykol in einer Konzentration von 1 bis 10% vorhanden ist.
Stabilisierte wässrige Peroxidasechromophorlösung nach einem der Ansprüche 13 bis 19, die ferner ein Detergens in ausreichender Menge umfasst, um die Oberflächenspannung zu verringern, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung bereitzustellen.
Stabilisierte wässrige 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid- (DAB-) Peroxidasechromophorlösung nach Anspruch 13, umfassend: a. 2 mM 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB); b. 5 bis 10 mM Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5,0 bis 5,5; c. 0,0005 bis 0,05% Natriummetabisulfit; d. 1 bis 10% Polyethylenglykol; und e. gegebenenfalls 0,01 bis 5 Vol.-% eines nichtionischen Detergens, ausgewählt aus einem Polyoxyethylensorbitan und einem Polyoxyethylenether.
Stabilisierte wässrige 3-Amino-9-ethylcarbazol- (AEC-) Peroxidasechromophorlösung nach Anspruch 13, umfassend: a. 1 mg/ml 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC); b. 0,01 bis 0,5 M Acetatpuffer, pH 4,5 bis 5,5; c. 0,0008 bis 0,008% Natriummetabisulfit; d. 1 bis 10% Polyethylenglykol; und e. gegebenenfalls 0,01 bis 5 Vol.-% eines nichtionischen Detergens, ausgewählt aus einem Polyoxyethylensorbitan und einem Polyoxyethylenether.
Verbessertes immunchemisches Verfahren auf Peroxidasebasis, wobei die Verbesserung das Kombinieren einer stabilisierten wässrigen Peroxidasechromophorlösung, die im Wesentlichen aus einem Peroxidasechromophor in einer Konzentration im Arbeitsbereich des Peroxidasechromophors besteht; eines sauren Puffers, der einen pH von unter 6,0 aufrechterhalten kann; einer effektiven Menge eines Reduktionsmittels; und eines Glykols in einer Konzentration, die zur Stabilisierung des Peroxidasechromophors mit der Peroxidase effektiv ist, umfasst.