DE69133579T2

DE69133579T2 - Automatisierte Polymerasekettenreaktion

Info

Publication number: DE69133579T2
Application number: DE69133579T
Authority: DE
Inventors: Albert Carmelo Mossa; Lisa May Goven; John Girdner Atwood; Fenton Williams; Timothy M. Woudenberg; Marcel Margulies; Robert P. Ragusa; Richard Leath
Original assignee: Applera Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2011-11-30
Also published as: DK1510823T3; EP1510823A3; JP4795089B2; DE810030T1; EP0810030B1; DE69133211T2; DE69133579D1; CA2436618A1; DE69133376T2; CA2266010A1; EP0810030B2; CA2395941C; IL111092A0; EP1275438A3; DE69133605D1; IE20080750A1; DE812621T1; EP1510823B1; ATE373107T1; EP0488769B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet von rechneradressierten Instrumenten zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (nachstehend PCR). Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf automatisierte Instrumente, die die Polymerase-Kettenreaktion gleichzeitig an vielen Proben mit einem sehr hohen Präzisionsgrad durchführen können, was die für jede Probe erhaltenen Ergebnisse betrifft. Diese hohe Präzision stellt unter anderem die Fähigkeit zum Durchführen sogenannter "quantitativer PCR" bereit.
Um DNA (Desoxyribonukleinsäure) unter Verwendung des PCR-Verfahrens zu amplifizieren, ist es notwendig, dass ein speziell konstituiertes flüssiges Reaktionsgemisch durch ein PCR-Protokoll einschließlich mehrerer verschiedener Temperatur-Inkubationsperioden zyklisch durchläuft. Das Reaktionsgemisch besteht aus verschiedenen Komponenten, wie der zu amplifizierenden DNA, und wenigstens zwei Primern, die in einer vorbestimmten Weise ausgewählt wurden, um hinreichend komplementär zu der Proben-DNA und damit in der Lage zu sein, Verlängerungsprodukte der zu amplifizierenden DNA zu schaffen. Das Reaktionsgemisch schließt verschiedene Enzyme und/oder andere Reagenzien ein, genauso wie mehrere Desoxyribonukleinsäure-Triphosphate wie dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Im Allgemeinen sind die Primer Oligonukleotide, die in der Lage sind, als Ausgangspunkt der Synthese zu fungieren, wenn sie unter Bedingungen gestellt werden, in welchen die Synthese eines Primer-Verlängerungsprodukts, das zu einem Nukleinsäurestrang komplementär ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nukleotiden und induzierenden Mitteln wie thermostabile DNA-Polymerase bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat sich als eine außergewöhnlich erfolgreiche Technologie zur genetischen Analyse erwiesen, größtenteils, da sie so einfach ist und eine relativ kostengünstige instrumentelle Ausrüstung erfordert.
Ein Schlüssel zur PCR ist das Konzept der Thermozyklierung (thermocycling): abwechselnde Schritte des DNA-Schmelzens, des Anlagerns kurzer Primer an die resultierenden Einzelstränge und des Verlängerns jener Primer, um neue Kopien der doppelsträngigen DNA herzustellen. Bei der Thermozyklierung durchläuft das PCR-Reaktionsgemisch wiederholt einen Kreislauf von hohen Temperaturen (> 90°C) zum Schmelzen der DNA zu niedrigeren Temperaturen (40°C bis 70°C) für das Primer-Anlagern und die Verlängerung. Das erste kommerzielle System zur Durchführung der in der Polymerase-Kettenreaktion erforderlichen Thermozyklierung, der Perkin-Elmer Cetus DNA-Thermocycler, wurde 1987 vorgestellt.
Anwendungen der PCR-Technologie bewegen sich nun von der Basisforschung zu Anwendungen, in denen große Anzahlen von ähnlichen Amplifikationen routinemäßig durchgeführt werden. Diese Bereiche schließen die diagnostische Forschung, biopharmazeutische Entwicklung, genetische Analyse und Umweltuntersuchung ein. Anwender in diesen Bereichen würden von einem Hochleistungs-PCR-System profitieren, welches den Anwender mit hohem Durchgang, rascher Umkehrzeit und reproduzierbaren Ergebnissen versorgt. Den Anwendern in diesen Bereichen muss die Reproduzierbarkeit von Probe-zu-Probe, Lauf-zu-Lauf, Labor-zu-Labor und Instrument-zu-Instrument sichergestellt sein.
Beispielsweise könnte der physikalische Kartierungsvorgang in dem Menschliches-Genom-Projekt (Human Genome Projekt) durch Verwendung sequenz-markierter (tagged) Stellen (STS) in hohem Maß vereinfacht werden. Eine STS ist eine kurze, einzigartige Sequenz, die durch PCR leicht amplifiziert wird und die eine Stellung auf dem Chromosom identifiziert. Das Überprüfen solcher Stellen, um Genomkarten herzustellen, erfordert das Amplifizieren einer großen Anzahl von Proben in kurzer Zeit mit Protokollen, welche reproduzierbar auf der ganzen Welt durchlaufen werden können.
Da die Anzahl von PCR-Proben ansteigt, wird es wichtiger, die Amplifikation mit der Probenherstellung und der Nachamplifikationsanalyse zu verbinden. Die Probengefäße müssen nicht nur rasche Thermozyklierung erlauben, sondern ebenso eine mehr automatisierte Handhabung für Vorgänge gestatten wie Lösungsmittelextraktionen und Zentrifugation. Die Gefäße sollten gleichbleibend bei niedrigen Volumina funktionieren, um die Reagenzkosten zu reduzieren.
Im Allgemeinen schließt die PCR-Temperaturzyklierung wenigstens zwei Inkubationen bei unterschiedlichen Temperaturen ein. Eine dieser Inkubationen dient zur Primer-Hybridisierung und einer katalysierten Primer-Verlängerungsreaktion. Die andere Inkubation dient zur Denaturierung, d. h. Trennung der doppelsträngigen Verlängerungs-Produkte in Einzelstrang-Template zur Verwendung im nächsten Hybridisierungs- und Verlängerungs-Inkubationsintervall. Die Einzelheiten der Polymerase-Kettenreaktion, die Temperaturzyklierung und die zur PCR notwendigen Reaktionsbedingungen sowie die verschiedenen Reagenzien und Enzyme, die zur Durchführung der Reaktion notwendig sind, sind in den US-Patentschriften 4,683,202 , 4,683,195 , der EP-Offenlegungsschrift 258,017 und 4,889,818 (Taq-Polymerase-Enzym-Patent) und allen anderen auf die Cetus Corporation übertragenen PCR-Patenten beschrieben.
Der Zweck einer Polymerase-Kettenreaktion besteht darin, ein großes Volumen an DNA herzustellen, das mit einem anfänglich bereitgestellten kleinen Volumen der "Saat"-DNA identisch ist. Die Reaktion schließt das Kopieren der DNA-Stränge ein und verwendet dann die Kopien, um andere Kopien in nachfolgenden Zyklen zu erzeugen. Unter idealen Bedingungen wird jeder Zyklus die Menge der vorliegenden DNA verdoppeln und hat dadurch eine geometrische Progression im Volumen der Kopien der im Reaktionsgemisch vorliegenden "Ziel-oder"Saat"-DANN-Stränge zur Folge.
Ein typischer PCR-Temperaturzyklus erfordert, dass das Reaktionsgemisch bei jeder Inkubationstemperatur für eine vorgeschriebene Zeit genau gehalten wird und dass der identische Zyklus oder ein ähnlicher Zyklus mehrere Male wiederholt wird (siehe auch W=89/009437). Ein typisches PCR-Programm beginnt bei einer Probentemperatur von 94°C, die 30 Sekunden gehalten wird, um das Reaktionsgemisch zu denaturieren. Dann wird die Temperatur des Reaktionsgemisches auf 37°C abgesenkt und 1 Minute gehalten, um Primer-Hybridisierung zu erlauben. Daraufhin wird die Temperatur des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur im Bereich von 50°C bis 72°C angehoben, bei welcher dieses 2 Minuten gehalten wird, um die Synthese von Verlängerungsprodukten zu unterstützen. Dies vervollständigt einen Zyklus. Der nächste PCR-Zyklus beginnt dann durch Anheben der Temperatur des Reaktionsgemisches wieder auf 94°C für die Strangtrennung der Verlängerungsprodukte, die im vorherigen Zyklus ausgebildet worden sind (Denaturierung): Typischerweise wird der Zyklus 25 bis 30 Mal wiederholt.
Im Allgemeinen ist es wünschenswert, die Probentemperatur zu der nächsten Temperatur im Zyklus so schnell wie möglich zu ändern, und zwar aus verschiedenen Gründen. Zunächst weist die chemische Reaktion eine optimale Temperatur für jede ihrer Stufen auf. Daher bedeutet eine kürzere Zeit, die bei nicht-optimalen Temperaturen zugebracht wird, dass ein besseres chemisches Resultat erzielt wird. Ein weiterer Grund besteht darin, dass eine minimale Zeit zum Halten des Reaktionsgemisches bei jeder Inkubationstemperatur erforderlich ist, nachdem die jeweilige Inkubationstemperatur erreicht ist. Diese minimalen Inkubationszeiten begründen die "Boden"- oder minimale Zeit, die es braucht, um einen Zyklus zu vervollständigen. Jedweder Zeitübergang zwischen Proben-Inkubationstemperaturen stellt Zeit dar, die zu dieser minimalen Zykluszeit addiert wird. Da die Anzahl der Zyklen ziemlich groß ist, dehnt diese zusätzliche Zeit die Gesamtzeit, die benötigt wird, um die Amplifikation zu vervollständigen, unnötig aus.
In einigen früheren automatisierten PCR-Instrumenten wurde das Reaktionsgemisch in einem wegwerfbaren Kunststoffröhrchen, das mit einer Kappe geschlossen war, gesammelt. Ein typisches Probenvolumen für solche Röhrchen betrug etwa 100 μL.
Typischerweise verwendeten solche Instrumente viele solcher Röhrchen, die mit Proben-DNA und Reaktionsgemisch gefüllt waren, die in Probenvertiefungen (sample wells) genannte Löcher in einem Metallblock eingeführt wurden. Um das PCR-Verfahren durchzuführen, wurde die Temperatur des Metallblocks gemäß vorgeschriebener Temperaturen und Zeiten geregelt, die von dem Benutzer in einer PCR-Protokolldatei spezifiziert wurden. Ein Rechner und dazugehörige Elektronik regelte sodann die Temperatur des Metallblocks gemäß den von dem Benutzer gelieferten Daten in der PCR-Protokolldatei, welche die Zeiten, Temperaturen und die Anzahl der Zyklen, usw. definierte. Sobald der Metallblock die Temperatur veränderte, folgten die Proben in den verschiedenen Röhrchen mit entsprechenden Temperaturveränderungen. Bei diesen bekannten Instrumenten haben jedoch nicht alle Proben genau den gleichen Temperaturzyklus erfahren. Bei diesen bekannten PCR-Instrumenten wurden Fehler in der Probentemperatur durch Ungleichmäßigkeit der Temperatur von Stelle zu Stelle innerhalb des Metallprobenblocks erzeugt, d. h., es existierten Temperaturgradienten innerhalb des Metalls des Blocks, wodurch bewirkt wurde, dass einige Proben unterschiedliche Temperaturen als andere Proben zu einzelnen Zeiten im Zyklus aufwiesen. Weiterhin gab es Verzögerungen im Wärmetransfer von dem Probenblock zu der Probe, aber die Verzögerungen waren nicht dieselben für alle Proben. Um das PCR-Verfahren erfolgreich und effizient durchzuführen und um die sogenannte "quantitative" PCR zu ermöglichen, müssen diese Zeitverzögerungen und Temperaturfehler in großem Umfang minimiert werden.
Die Probleme, Zeitverzögerungen für den Wärmetransfer zu und von der Probenflüssigkeit zu minimieren und Temperaturfehler, die auf Temperaturgradienten oder Ungleichmäßigkeit in der Temperatur an verschiedenen Punkten des Metallblocks zurückzuführen sind, zu minimieren, werden insbesondere akut, wenn die Ausdehnung des Proben-enthaltenden Bereichs groß wird. Eine in hohem Maß wünschenswerte Eigenschaft für ein PCR-Instrument liegt darin, dass es einen Metallblock aufweist, der groß genug ist, um 96 Probenröhrchen aufzunehmen, die im Format einer Industriestandard-Mikrotiterplatte angeordnet sind.
Die Mikrotiterplatte ist eine weitreichend verwendete Einrichtung zum Handhaben, Verarbeiten und Analysieren großer Anzahlen von kleinen Proben auf den Gebieten der Biochemie und der Biotechnologie. Typischerweise ist eine Mikrotiterplatte ein Einsatz, welcher 9,21 cm (3 5/8 Inch) breit und 12,7 cm (5 Inch) lang ist und 96 identische Probenvertiefungen in einer rechtwinkligen 8 × 12-Vertiefungen-Anordnung auf 9-mm-Mittelpunkten enthält. Obwohl Mikrotiterplatten in einer breiten Vielfalt von Materialien, Formen und Volumina der Probenvertiefungen erhältlich sind, welche für viele verschiedene Verwendungen optimiert sind, weisen alle Mikrotiterplatten die gleichen Gesamtaußenabmessungen und die gleiche 8 × 12-Anordnung der Vertiefungen auf 9-mm-Mittelpunkten auf. Es ist eine große Vielzahl von Apparaturen zum Automatisieren des Handhabens, Verarbeitens und Analysierens der Proben in diesem Standard-Mikrotiterplattenformat erhältlich.
Im Allgemeinen sind Mikrotiterplatten aus Spritzgusskunststoff oder vakuumgeformtem Kunststoff gefertigt und sind preiswert und werden als wegwerfbar betrachtet. Die Wegwerfbarkeit ist eine äußerst erwünschte Eigenschaft wegen der aus der Kreuzkontaminierung erwachsenden Rechtshaftung und der Schwierigkeit, die Mikrotiterplatten nach Gebrauch zu waschen und zu trocknen.
Daher liegt eine in hohem Maße wünschenswerte Eigenschaft für ein PCR-Instrument darin, dass es in der Lage ist, die PCR-Reaktion an bis zu 96 Proben gleichzeitig auszuführen, wobei die Proben in einem Mikrotiterplattenformat angeordnet sind.
Natürlich ist die Abmessung des Metallblocks, die notwendig ist, um 96 Proben in einer 8 × 12-Vertiefungen-Anordnung auf 9-mm-Mittelpunkten zu erwärmen und abzukühlen, ziemlich groß. Dieser Block mit großer Oberfläche schafft mehrere herausfordernde technische Probleme für das Design eines PCR-Instruments, das in der Lage ist, einen derartigen Block sehr schnell in einen Temperaturbereich, der im Allgemeinen von 0 bis 100°C liegt, mit sehr geringer Toleranz für Temperaturschwankungen zwischen den Proben zu erwärmen und abzukühlen. Diese Probleme erwachsen aus verschiedenen Quellen. Zunächst macht es die große thermisch wirksame Masse des Blocks schwierig, die Blocktemperatur nach oben und nach unten in dem Betriebsbereich mit großer Schnelligkeit zu verstellen. Zweitens erzeugt der Bedarf, den Block an verschiedenen äußeren Vorrichtungen, wie Verteiler für die Zufuhr und den Abzug von Kühlflüssigkeit, Blockhalterungsbefestigungspunkte und dazugehörige andere Peripheriegeräte, zu befestigen, das Potenzial, dass Temperaturgradienten über dem Block existieren, die tolerierbare Grenzen überschreiten.
Es bestehen ferner zahlreiche andere Konflikte zwischen den Erfordernissen im Design eines Thermozyklierungssystems für die automatisierte Durchführung der PCR-Reaktion oder anderen Reaktionen, die eine schnelle, genaue Temperaturzyklierung einer großen Anzahl von Proben erfordern. Beispielsweise muss, um die Temperatur eines Metallblocks schnell zu ändern, eine große Wärmemenge in einer kurzen Zeitdauer dem Probenblock zugeführt oder aus dem Probenblock abgeführt werden. Wärme kann von elektrischen Widerstandsheizelementen oder durch Anströmen eines geheizten Fluids in Berührung mit dem Block zugeführt werden. Wärme kann durch Anströmen eines abgekühlten Fluids in Berührung mit dem Block schnell abgeführt werden. Es ist jedoch scheinbar unmöglich, große Wärmemengen in einem Metallblock durch diese Mittel schnell zuzuführen oder abzuführen, ohne große Unterschiede in der Temperatur von Stelle zu Stelle im Block zu verursachen, wodurch Temperaturgradienten ausgebildet werden, die zu einer Ungleichmäßigkeit der Temperatur zwischen den Proben führen können.
Temperaturgradienten können sogar, nachdem der Vorgang der Zuführung oder Abführung von Wärme abgeschlossen ist, für eine Zeit weiter bestehen, die etwa proportional zu dem Quadrat des Abstands ist, den die in verschiedenen Punkten im Block gespeicherte Wärme zu kühleren Bereichen wandern muss, um den Temperaturgradienten zu eliminieren. Wenn daher ein Metallblock größer hergestellt wird, um mehr Proben aufzunehmen, kann die Zeit, die im Block existierende Temperaturgradienten brauchen, um nach einer Temperaturänderung, die Temperaturgradienten verursacht, die sich über die größten Abmessungen des Blocks ausdehnen, abzuklingen, ausgesprochen lang werden. Dies macht es zunehmend schwierig, die Temperatur des Probenblocks schnell zyklisch zu durchlaufen, während eine genaue Temperaturgleichmäßigkeit zwischen allen Proben beibehalten wird.
Aufgrund der Zeit, die die Temperaturgradienten benötigen, um zu dissipieren, erwuchs ein bedeutender Bedarf im Design eines Hochleistungs-PCR-Instruments, die Erzeugung von Temperaturgradienten zu verhindern, die sich über große Entfernungen im Block ausdehnen. Ein weiterer Bedarf besteht darin, das Erfordernis soweit wie möglich zu vermeiden, dass Wärme über mechanische Grenzen zwischen Metallteilen oder anderen Peripheriegeräten, die an dem Block befestigt sind, transportiert werden muss. Es ist schwierig, Metallteile auf eine Art und Weise zu verbinden, die einen gleichmäßig hohen Wärmeleitwert (thermal conductance) überall an der Verbindung sicherstellt. Ungleichmäßigkeiten des Wärmeleitwerts erzeugen unerwünschte Temperaturgradienten.
Gemäß der Lehre der Erfindung wird ein System bereitgestellt zur Kontrolle eines Apparats zur automatisierten Durchführung von Polymerasekettenreaktionen in zumindest einem Probenröhrchen, enthaltend eine bekanntes Volumen einer flüssigen Probenmischung, wobei das System folgendes umfaßt:

(a) einen Probenblock (12) mit mindestens einer Vertiefung für das mindestens eine Probenröhrchen (10),
(b) einen Rechner (20),
(c) Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40), gesteuert durch den Rechner (20) zur Veränderung der Temperatur des Probenblocks (12) und
(d) einen Blocktemperatursensor (21), thermisch an den Probenblock (12) gekoppelt, wobei der Sensor dem Rechner (20) die Temperatur des Probenblocks (12) über die Zeit bereitstellt,

20

12

Bezug nehmend auf eine Vorrichtung zum Erreichen einer sehr genauen Temperaturregelung für eine sehr große Anzahl von Proben, die in dem Mikrotiterplattenformat angeordnet sind, während der Durchführung des sehr schnellen Temperaturzyklierungs-PCR-Protokolls schließen hier einen Probenblock, Probenröhrchen und -stützgestell, eine Heiz- und Kühlvorrichtung, Steuerelektronik und -software, eine Benutzeroberfläche und ein Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung, um das PCR-Protokoll durchzuführen, ein.
Das hier beschriebene Instrument ist ausgelegt, um PCR-Genamplifikation an bis zu 96 Proben mit sehr geringen Toleranzen der Temperaturregelung über die Gesamtheit von Proben durchzuführen. Dies bedeutet, dass alle Proben einen gleichzeitigen Anstieg und Abfall in der Temperatur mit sehr geringer Temperaturdifferenz zwischen unterschiedlichen Vertiefungen, die unterschiedliche Proben enthalten, erfahren, wobei dies während des Polymerase-Kettenreaktionszyklus gilt. Das hier beschriebene Instrument ist ferner zu einer sehr engen Kontrolle der Reaktionsgemischkonzentration durch die Kontrolle der Verdampfungs- und Kondensationsvorgänge in jeder Probenvertiefung in der Lage. Ferner ist das hier beschriebene Instrument in der Lage, bis zu 96 Proben von jeweils 100 μl von unterschiedlichen Donor-Quellen mit im Wesentlichen keiner Kreuzkontaminierung zwischen den Probenvertiefungen zu verarbeiten.
Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Regelung des PCR-Instruments sind vorgesehen, die die Fähigkeit einschließen, die Temperatur der zu verarbeitenden Proben kontinuierlich zu berechnen und anzuzeigen, ohne diese Temperaturen direkt zu messen. Diese berechneten Temperaturen werden verwendet, um die Zeit zu regeln, die die Proben innerhalb des gegebenen Temperaturtoleranzbandes für jede Inkubationssolltemperatur gehalten werden. Das Steuersystem steuert ferner ein Dreizonen-Heizgerät, das mit dem Probenblock thermisch gekoppelt ist und einen Fluidfluss durch gerichtet verflochtene (directionally interlaced) Rampenkühlungskanäle im Probenblock durchlässt, der dann, wenn er mit einem konstanten Vorkühlungsfluss von Kühlmittel durch den Probenblock kombiniert wird, eine Einrichtung bereitstellt, um schnelle Temperaturänderungen auf und eine genaue Temperaturregelung bei von dem Benutzer spezifizierten Solltemperaturen zu erreichen. Das Verfahren und die Vorrichtung zum Steuern des Dreizonen-Heizgeräts schließt eine Vorrichtung ein, die unter anderem die Netzspannung, die Blocktemperatur, die Kühlmitteltemperatur und die Umgebungstemperatur beim Berechnen der Menge an elektrischer Energie, die an die verschiedenen Zonen des Dreizonen-Heizgeräts geliefert werden soll, berücksichtigt. Dieses Heizgerät weist Zonen auf, die getrennt steuerbar sind unter den Kanten oder "Sicherheitsbändern" des Probenblocks, so dass überschüssige Wärmeverluste an die Umgebung durch Peripheriegeräte, die an den Kanten des Probenblocks angebracht sind, kompensiert werden können. Dies trägt dazu bei, die Ausbildung von Temperaturgradienten zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung wird ferner nur beispielsweise unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, in denen zeigt:
1 ein Blockdiagramm des erfindungsgemäßen Thermocyclers;
2 eine Draufsicht auf einen Probenblock;
3 eine Seitenaufrissansicht des Probenblocks, die die Vor- und Rampenkühlungskanäle zeigt;
4 und 5 Endaufrissansichten des Probenblocks;
6 eine Schnittansicht des Probenblocks entlang der Schnittlinie 6-6' in 2;
7 eine Schnittansicht des Probenblocks entlang der Schnittlinie 7-7' in 2;
8 eine Schnittansicht des Probenblocks entlang der Schnittlinie 8-8' in 2;
9 eine Querschnittsaufrissansicht der Probenblockstruktur nach dem Zusammenbau mit dem Dreizonen-Filmheizgerät und der Blockhalterung;
10 einen Graph der Netzspannung, der die Form der Leistungssteuerung für das Dreizonen-Filmheizgerät darstellt;
11 einen Temperaturgraph, der ein typisches PCR-Protokoll mit drei Inkubationstemperaturen zeigt;
12 eine Querschnittsansicht des Probenblocks, der das Konzept der lokalen Zone darstellt;
13 eine Draufsicht auf das Dreizonen-Heizgerät;
14 einen Graph der Probentemperatur über der Zeit, der den Effekt eines τ einer Probenröhrchen-Befestigungskraft F darstellt, die zu niedrig ist;
15 eine Querschnittsansicht eines im Probenblock eingesetzten Probenröhrchens 30 und einer Kappe;
16A einen Graph des Impulsverhaltens eines RC-Schaltkreises;
16B einen Graph eines Impulsanregungsimpulses;
16C einen Graph, der darstellt, wie die Faltung des thermischen Impulsverhaltens und des Temperaturverlaufs des Blocks die berechnete Probentemperatur ergeben;
16D das elektrische Analogon des thermischen Verhaltens des Probenblock-/Probenröhrchen-Systems;
17, wie die berechneten Temperaturen sechs verschiedener Proben alle auf einer Solltemperatur innerhalb etwa 0,5°C voneinander zusammenlaufen, wenn die Proportionalitätskonstanten für die Gleichungen, die verwendet werden, um das Dreizonen-Heizgerät zu steuern, richtig eingestellt sind;
18 einen Graph, der darstellt, wie die Denaturierungssolltemperatur die Menge an erzeugter DNA beeinflusst;
19 eine Querschnittsansicht der Gleitabdeckung und der beheizten Platte;
20 eine perspektivische Ansicht der Gleitabdeckung, des Probenblocks und des zum Herablassen der beheizten Platte verwendeten Knaufs;
21A eine Querschnittsansicht des Aufbaus einer Ausführungsform des Rahmens, des Halters, des Probenröhrchens und der Kappe, wenn sie in einem Probenblock eingesetzt sind;
21B eine Querschnittsansicht des Aufbaus der bevorzugten Ausführungsform des Rahmens, des Halters, des Probenröhrchens und der Kappe, wenn sie in einem Probenblock eingesetzt sind;
22 eine Draufsicht von oben auf den Einweg-Kunststoffrahmen für die Mikrotiterplatte;
23 eine Draufsicht auf die Unterseite des Rahmens;
24 eine Endaufrissansicht des Rahmens;
25 eine weitere Endaufrissansicht des Rahmens;
26 eine Schnittsansicht des Rahmens entlang der Schnittlinie 26-26' in 22;
27 eine Schnittsansicht des Rahmens entlang der Schnittlinie 27-27' in 22;
28 eine Kantenaufrissansicht und einen Teilschnitt des Rahmens;
29 eine Schnittansicht des bevorzugten Probenröhrchens;
30 eine Schnittansicht des oberen Teils des Probenröhrchens;
31 eine Aufrissansicht eines Abschnitts des Kappenstreifens;
32 eine Draufsicht auf einen Abschnitt des Kappenstreifens;
33 eine Draufsicht von oben auf den Einweg-Kunststoffhalterabschnitt des 96-Vertiefungen-Mikrotitereinsatzes;
34 eine Seitenaufrissansicht mit einem teilweisen Ausschnitt des Halters;
35 eine Endaufrissansicht des Halters;
36 eine Schnittansicht des Halters entlang der Schnittlinie 36-36' in 33;
37 eine Schnittansicht des Halters entlang der Schnittlinie 37-37' in 33;
38 eine Draufsicht auf den Einweg-Kunststoffstützsockel des 96-Vertiefungen-Mikrotitereinsatzes;
39 eine Draufsicht auf die Unterseite des Sockels;
40 eine Seitenaufrissansicht des Sockels;
41 eine Endaufrissansicht des Sockels;
42 eine Schnittansicht des Stützsockels entlang der Schnittlinie 42-42' in 38;
43 eine Schnittansicht des Stützsockels entlang der Schnittlinie 43-43' in 38;
44 eine Schnittansicht des Sockels entlang der Schnittlinie 44-44' in 38;
45 eine perspektivische Explosionsansicht der Einweg-Kunststoffgegenstände, welche den Mikrotitereinsatz mit einigen Probenröhrchen und Kappen in Position umfassen;
46 ein Diagramm des Kühlmittelsteuersystems 24 in 1;
47A und 47B Blockdiagramme der erfindungsgemäßen Steuerelektronik;
48 ein Schaltbild eines typischen Zener-Temperatursensors;
49 ein Zeitstrahldiagramm einer typischen Abtastperiode;
50 eine Aufrissschnittansicht eines hohen dünnwandigen, unter der Marke MAXIAMP vertriebenen Probenröhrchens;
51 einen Graph, der den Unterschied in der Ansprechzeit zwischen den dünnwandigen Probenröhrchen und den dickwandigen Röhrchen des Standes der Technik zeigt;
52 eine Draufsicht eines Probenröhrchens und einer Kappe; und
53 und 54 Ablaufdiagramme der Einschalttestsequenz.
Es wird auf 1 Bezug genommen, in der ein Blockdiagramm der Hauptsystemkomponenten einer Ausführungsform eines rechnergesteuerten Instruments zum Durchführen von PCR gezeigt wird. Probengemische, die die zu amplifizierende DNA oder RNA einschließen, werden in den temperaturprogrammierten Probenblock 12 eingebracht und mit der beheizten Abdeckung 14 bedeckt.
Ein Benutzer liefert Daten, die Zeit- und Temperaturparameter des gewünschten PCR-Protokolls über eine Bedienkonsole 16 einschließlich einer Tastatur und einer Anzeige definieren. Die Tastatur und Anzeige sind über Bus 18 an einen Steuerrechner 20 (nachstehend manchmal als eine zentrale Verarbeitungseinheit (central processing unit) oder CPU bezeichnet). Diese zentrale Verarbeitungseinheit 20 schließt einen Speicher ein, welcher das nachstehend beschriebene Steuerprogramm, die Daten, die das gewünschte PCR-Protokoll definieren, und gewisse nachstehend beschriebene Kalibrierungskonstanten speichert. Das Steuerprogramm bewirkt, dass die CPU 20 die Temperaturzyklierung des Probenblocks 12 regelt, und implementiert eine Benutzeroberfläche, die bestimmte Anzeigen für den Benutzer bereitstellt und die von dem Benutzer über die Tastatur der Bedienkonsole 16 eingegebene Daten empfängt.
In der bevorzugten Ausführungsform ist die zentrale Verarbeitungseinheit 20 individuell entworfen.
Ein Blockdiagramm der Elektronik wird nachstehend detaillierter diskutiert. In alternativen Ausführungsformen können die zentrale Verarbeitungseinheit 20 und damit verbundene periphere Elektronik, um die verschiedenen Heizgeräte und andere elektromechanische Systeme des Instruments zu steuern und verschiedene Sensoren abzulesen, ein beliebiger Universalrechner sein, wie ein auf geeignete Weise programmierter Personalcomputer oder Mikrocomputer.
Die Proben 10 werden in mit einer Kappe versehenen Einwegröhrchen gesammelt, die in den Probenblock 12 eingesetzt werden und von der Umgebungsluft durch eine beheizte Abdeckung 14 thermisch isoliert werden, welche mit einem nachstehend beschriebenen Einweg-Kunststoffeinsatz in Kontakt steht, um eine beheizte geschlossene Box auszubilden, in der die Probenröhrchen vorliegen. Die beheizte Abdeckung dient unter anderem dazu, unerwünschte Wärmetransfers zu und von den Probenröhrchen durch Verdunstung, Kondensation und Rückfluss innerhalb der Probenröhrchen zu reduzieren. Sie reduziert ferner die Möglichkeit einer Kreuzkontaminierung durch Trockenhalten der Kappeninnenseiten, wodurch Aerosolbildung verhindert wird, wenn die Röhrchen nicht mit Kappen versehen sind. Die beheizte Abdeckung steht in Kontakt mit den Probenröhrchen-Kappen und hält diese bis zu einer Temperatur von etwa 104°C oder oberhalb der Kondensationspunkte der verschiedenen Komponenten des Reaktionsgemisches beheizt.
Die zentrale Verarbeitungseinheit 20 schließt eine geeignete Elektronik ein, um die Temperatur der beheizten Abdeckung 14 abzufühlen und die elektrischen Widerstandsheizgeräte darin zu steuern, um die Abdeckung 14 bei einer vorbestimmten Temperatur zu halten. Das Abfühlen der Temperatur der beheizten Abdeckung 14 und die Steuerung der Widerstandsheizgeräte darin wird über einen Temperatursensor (nicht gezeigt) und Bus 21 erreicht.
Ein Kühlmittelsteuersystem 24 zirkuliert ein abgekühltes flüssiges Kühlmittel, z. B. ein Gemisch aus Automobilfrostschutzmittel und Wasser, durch Vorkühlungskanäle (nicht gezeigt) im Probenblock 12 über Eingangsrohre 26 und Ausgangsrohr 28. Das Kühlmittelsteuersystem 24 steuert ebenso den Fluidfluss durch Rampenkühlungs-Fluidflusswege mit größerem Volumen (nicht gezeigt) im Probenblock 12. Die Rampenkühlungskanäle werden verwendet, um die Temperatur des Probenblocks 12 schnell zu ändern, indem große Volumina von abgekühltem flüssigen Kühlmittel durch den Block bei einer relativ hohen Flussrate gepumpt werden. Das flüssige Rampenkühlungskühlmittel tritt in den Probenblock 12 durch Rohr 30 ein und verlässt den Probenblock durch Rohr 32. Die Einzelheiten des Kühlmittelsteuersystems sind in 46 gezeigt. Das Kühlmittelsteuersystem wird nachstehend bei der Beschreibung der Elektronik und der Software des Steuersystems ausführlicher beschrieben.
Typischerweise besteht das flüssige Kühlmittel, das verwendet wird, um den Probenblock 12 abzukühlen, hauptsächlich aus einem Gemisch von Wasser und Ethylenglykol. Das flüssige Kühlmittel wird über einen Wärmetauscher 34 abgekühlt, der flüssiges Kühlmittel empfängt, das dem Probenblock 12 über das Eingangsrohr 36 Wärme entzogen hat. Der Wärmetauscher 34 empfängt über das Eingangsrohr 38 von einer Kühleinheit 40 verdichtetes flüssiges Freon-Kältemittel. Diese Kühleinheit 40 schließt einen Kompressor (nicht gezeigt), einen Ventilator 42 und einen Röhrenlamellen-Wärmestrahler (fin tube heat radiator) 44 ein. Die Kühleinheit 40 verdichtet von dem Wärmetauscher 34 über das Rohr 46 empfangenes Freon-Gas. Im Röhrenlamellenkondensator 44 wird das gasförmige Freon abgekühlt und zu einer Flüssigkeit kondensiert. Der Druck des flüssigen Freon wird durch ein Drosselkörper-Kapillarrohr 47 oberhalb dessen Dampfdruck im Röhrenlamellenkondensator gehalten. Der Ausgang dieses Kapillarrohrs ist mit dem Eingang des Wärmetauschers 34 über das Rohr 38 verbunden. In dem Wärmetauscher wird dem Druck des Freon ermöglicht, unter den Freon-Dampfdruck abzusinken, und das Freon dehnt sich aus. Bei diesem Ausdehnungsprozess wird Wärme von dem erwärmten flüssigen Kühlmittel absorbiert, das in dem Wärmetauscher zirkuliert, und diese Wärme wird an das Freon übertragen, wodurch das Freon zum Sieden gebracht wird. Das erwärmte Freon wird dann von dem Wärmeaustauscher über das Rohr 46 abgezogen und wird verdichtet und wieder durch den Röhrenlamellenkondensator 44 zirkuliert. Der Ventilator 42 bläst Luft durch den Röhrenlamellenkondensator 44, um zu bewirken, dass Wärme in dem Freon aus dem Rohr 46 mit der Umgebungsluft, wie durch die Pfeile 48 angedeutet, ausgetauscht wird. Die Kühleinheit 40 sollte in der Lage sein, dem flüssigen Kühlmittel 400 Watt Wärme bei 30°C und 100 Watt Wärme bei 10°C zu entziehen, um die erfindungsgemäße schnelle Temperaturzyklierung zu unterstützen.
Bei der bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung von 1 in einem Gehäuse (nicht gezeigt) eingeschlossen. Die an die Umgebungsluft ausgestoßene Wärme 48 wird innerhalb des Gehäuses gehalten, um bei der Verdunstung jedweder Kondensation zu helfen, die an den verschiedenen Röhren auftritt, die das abgekühlte flüssige Kühlmittel oder das Freon von einer Stelle zu einer anderen führen. Diese Kondensation kann Korrosion von Metallen bewirken, die bei der Konstruktion der Einheit oder des elektrischen Schaltkreises verwendet werden, und sollte beseitigt werden. Das Ausstoßen der Wärme 48 innen im Gehäuse trägt dazu bei, jedwede Kondensation zu verdampfen, um Korrosion zu verhindern.
Nach dem Austausch seiner Wärme mit dem Freon verlässt das flüssige Kühlmittel den Wärmetauscher 34 über das Rohr 50 und tritt wieder in das Kühlmittelsteuersystem ein, wo dieses bei Bedarf zu dem Probenblock während schneller Kühlungsabschnitte des PCR-Zyklus, die durch Daten definiert sind, die von dem Benutzer über die Bedienkonsole 16 eingegeben werden, durchgelassen wird.
Wie vorstehend angemerkt, schließt das PCR-Protokollinkubationen bei wenigstens zwei verschiedenen Temperaturen und oftmals drei verschiedenen Temperaturen ein. In 11 ist ein typischer PCR-Zyklus gezeigt mit einer Denaturierungsinkubation 170, die bei einer Temperatur nahe 94°C, einer Hybridisierungsinkubation 122, die bei einer Temperatur nahe Raumtemperatur (25°C–37°C), sowie einer Verlängerungsinkubation 174, die bei einer Temperatur nahe 50°C durchgeführt wird. Diese Temperaturen unterscheiden sich wesentlich und es müssen daher Mittel bereitgestellt werden, um die Temperatur des Reaktionsgemisches aller Proben schnell von einer Temperatur zu einer anderen zu verstellen. Das Rampenkühlungssystem stellt das Mittel dar, durch welches die Temperatur des Probenblocks schnell von der hohen Temperatur der Denaturierungs-Inkubation zu der niedrigeren Temperatur der Hybridisierungs- und Verlängerungs-Inkubation heruntergebracht wird. Typischerweise liegt die Kühlmitteltemperatur im Bereich von 10–20°C. Liegt das Kühlmittel bei 20°C vor, kann es etwa 400 Watt Wärme aus dem Probenblock abführen. Typischerweise sind Rampenkühlkanal-Abmessungen, Kühlmitteltemperatur und Kühlmittelflussrate derart eingestellt, dass eine maximale Kühlung von 5–6°C pro Sekunde in der Nähe des oberen Endes des Betriebsbereichs (100°C) erreicht werden kann, und eine durchschnittliche Kühlungsrate von 2,5°C pro Sekunde wird beim Absenken der Probenblocktemperatur von 94°C auf 37°C erreicht.
Geringe Temperaturänderungen des Probenblocks 12 in der Abwärtsrichtung werden, um die Sollinkubationstemperatur zu halten, durch das Vorkühlungssystem durchgeführt.
Wie in 46 gesehen werden kann, pumpt eine Pumpe 41 konstant Kühlmittel von einem Filter/Reservoir 39 (130 mm Fassungsvermögen) über eine 1,3 cm-(1/2'')Leitung und pumpt dieses über eine 1,3-cm-(1/2'')Leitung zu einer Verzweigungskreuzung 47. Die Pumpe 41 liefert Kühlmittel an die Leitung 45 bei einer konstanten Flussrate von 3,8–4,9 Lt/min (1–1,3 Gallonen pro Minute). Bei der Kreuzung 47 wird ein Teil des Flusses im Rohr 45 als konstanter Fluss durch die Vorkühlungskanäle 49 umgeleitet. Ein anderer Teil des Flusses im Rohr 45 wird durch einen Drosselkörper 51 zu dem Ausgangsrohr 38 umgeleitet. Der Drosselkörper 51 hält einen ausreichenden Druck im System, so dass ein positiver Druck an dem Eingang 53 eines Zwei-Zustands-Solenoid-betriebenen Ventils 55 unter der Steuerung der CPU 20 über Bus 54 vorliegt. Wird gewünscht, dass die Rampenkühlung eine schnelle abwärts gerichtete Temperaturänderung durchführt, bewirkt die CPU 20, dass das Solenoid-betriebene Ventil 55 öffnet, um Kühlmittelfluss durch die Rampenkühlungskanäle 57 zu erlauben. Es gibt acht Rampenkühlungskanäle. Somit beträgt die Flussrate durch jeden Rampenkühlungskanal etwa 0,5 Lt/min (1/8 Gallonen pro Minute). Die Flussrate durch die Vorkühlungskanäle ist aufgrund deren sehr eingeschränkter Querschnittsfläche viel geringer.
Das Vorkühlungssystem stellt einen geringen konstanten Fluss von abgekühltem Kühlmittel durch die Vorkühlungskanäle 49 im Probenblock 12 bereit. Dies bewirkt einen konstanten geringen Wärmeverlust aus dem Probenblock 12, welcher durch ein Mehrzonenheizgerät 156 kompensiert wird, welches thermisch mit dem Probenblock 12 für Inkubationssegmente gekoppelt ist, bei weichem die Temperatur des Probenblocks auf einem konstanten Wert gehalten werden soll. Der durch den Vorkühlungsfluss bewirkte konstante geringe Wärmeverlust erlaubt dem Regelungssystem, proportionale Regelung sowohl aufwärts als auch abwärts in der Temperatur für niedrige Temperaturen durchzuführen. Dies bedeutet, dass sowohl Heizen als auch Abkühlen bei geregelten vorhersagbaren geringen Raten für das Temperatur-Servosystem verfügbar ist, um Blocktemperaturfehler zu korrigieren, um zu bewirken, dass die Blocktemperatur ein von dem Benutzer eingegebenes PCR-Temperaturprofil originalgetreu verfolgt. Die Alternative würde darin bestehen, die Leistung an das Filmheizgerät abzuschalten und dem Probenblock zu erlauben, durch Abgabe von Wärme an die Umgebung durch Strahlung und Konvektion abzukühlen, wenn die Blocktemperatur zu hoch geworden ist. Dies würde zu langsam und zu wenig vorhersagbar sein, um die engen Temperaturregelungs-Spezifikationen für quantitative PCR-Zyklierung zu erfüllen.
Dieses Mehrzonenheizgerät 156 wird durch die CPU 20 über Bus 52 in 1 gesteuert und ist das Mittel, durch welches die Temperatur des Probenblocks 12 schnell auf höhere Inkubationstemperaturen von niedrigeren Inkubationstemperaturen erhöht wird, und ist das Mittel, durch welches Vorkühlung kompensiert und Temperaturfehler in der Aufwärtsrichtung während der Temperaturverfolgung und -regelung während Inkubationen korrigiert werden.
In alternativen Ausführungsformen kann die Vorkühlung durch andere Mittel, wie durch die Verwendung eines Ventilators und im Metall des Probenblocks ausgebildeter Kühlrippen, Peltier-Verbindungen oder konstant zirkulierendem Leitungswasser, geliefert werden. Es muss jedoch bei diesen alternativen Ausführungsformen darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass im Probenblock keine Temperaturgradienten erzeugt werden, die bewirken würden, dass die Temperatur einiger Proben von der Temperatur anderer Proben abweicht, wodurch in einigen Probenröhrchen unterschiedliche PCR-Amplifikationsergebnisse als in anderen bewirkt werden könnten. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Vorkühlung proportional zu der Differenz zwischen der Blocktemperatur und der Kühlmitteltemperatur.
Die CPU 20 regelt die Temperatur des Probenblocks 12 durch Abfühlen der Temperatur des Metalls des Probenblocks über den Temperatursensor 21 und Bus 52 in 1 und durch Abfühlen der Temperatur der zirkulierenden Kühlmittelflüssigkeit über Bus 54 und einen Temperatursensor im Kühlmittelsteuersystem. Der Temperatursensor für das Kühlmittel ist bei 61 in 46 gezeigt. Die CPU fühlt ferner die innere Umgebungsluft-Temperatur innerhalb des Gehäuses des Systems über einen Umgebungslufttemperatur-Sensor 56 in 1 ab. Darüber hinaus fühlt die CPU 20 die Netzspannung für die Eingangsleistung an Leitung 58 über einen bei 63 symbolisierten Sensor ab. Alle diese Datenelemente, zusammen mit Datenelementen, die von dem Benutzer eingegeben werden, um das gewünschte PCR-Protokoll zu definieren, wie z. B. Solltemperaturen und Zeiten für Inkubationen, werden von einem Steuerprogramm verwendet, das nachstehend detaillierter beschrieben werden soll. Dieses Steuerprogramm berechnet die Leistungs-Menge, die an die verschiedenen Zonen des Mehrzonen-Probenblock-Filmheizgeräts 156 über den Bus 52 anzuwenden ist, und erzeugt ein Kühlmittelsteuersignal, um das Solenoidbetriebene Ventil 55 im Kühlmittelsteuersystem 24 über Bus 54 zu öffnen oder zu schließen, um so zu bewirken, dass die Temperatur des Probenblocks dem durch die von dem Benutzereingegebenen Daten definierten PCR-Protokoll folgt.
In 2 ist eine Draufsicht auf den Probenblock 12 gezeigt. Der Zweck des Probenblocks 12 ist es, ein mechanisches Stütz- und Wärmeaustauschelement für eine Gruppierung von dünnwandigen Probenröhrchen bereitzustellen, wobei Wärme zwischen der Probenflüssigkeit in jedem Probenröhrchen und dem flüssigen Kühlmittel ausgetauscht werden kann, das in den im Probenblock 12 ausgebildeten Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanälen fließt. Des weiteren besteht die Funktion des Probenblocks 12 darin, diese Wärmeaustauschfunktion ohne die Erzeugung großer Temperaturgradienten zwischen den verschiedenen Vertiefungen der Probenvertiefungen derart bereitzustellen, dass alle Probengemische in der Gruppierung den gleichen PCR-Zyklus erfahren, selbst wenn diese räumlich getrennt sind. Es ist ein Gesamtziel des hierin beschriebenen PCR-Instruments, eine sehr enge Temperaturregelung über die Temperatur der Probenflüssigkeit für eine Vielzahl von Proben derart bereitzustellen, dass die Temperatur einer beliebigen Probenflüssigkeit nicht merklich (etwa plus oder minus 0,5°C) von der Temperatur einer beliebigen anderen Probenflüssigkeit in einer anderen Vertiefung an einem beliebigen Punkt im PCR-Zyklus abweicht.
Es gibt eine sich entwickelnde Branche der PCR-Technologie, die "quantitative" PCR genannt wird. Bei dieser Technologie besteht das Ziel darin, die PCR-Amplifikation so genau wie möglich durchzuführen, indem die Menge der Ziel-DNA veranlasst wird, sich mit jedem Zyklus exakt zu verdoppeln. Exaktes Verdoppeln mit jedem Zyklus ist schwierig oder unmöglich zu erreichen, jedoch hilft eine enge Temperaturregelung.
Es gibt viele Fehlerquellen, die ein Versagen des PCR-Zyklus verursachen können, die Menge an Ziel-DNA (nachstehend ist DNA dahingehend zu verstehen, dass ebenso auf RNA Bezug genommen wird) während eines Zyklus exakt zu verdoppeln. Beispielsweise beginnt das Verfahren in einigen PCR-Amplifikationen mit einer einzelnen Zelle der Ziel-DNA. Ein Fehler, der leicht vorkommen kann, entsteht, wenn diese einzelne Zelle an der Wand des Probenröhrchens klebt und in den ersten paar Zyklen nicht amplifiziert.
Ein anderer Fehlertyp ist der Eintritt einer fremden Nuklease in das Reaktionsgemisch, welche die "fremde" Ziel-DNA angreift. Alle Zellen weisen etwas nicht spezifische Nuklease auf, welche die lose in der Zelle vorkommende fremde DNA angreift. Wenn dies passiert, stört oder stoppt dies das Replikationsverfahren. Folglich könnten die Nukleasematerialien in diesen Zellen dann, wenn ein Tropfen Speichel oder ein Kopfschuppenteilchen oder Material von einem anderen Probengemisch unbeabsichtigt in ein Probengemisch gelangt ist, die Ziel-DNA angreifen und einen Fehler im Amplifikationsverfahren verursachen. Es ist höchst wünschenswert, alle diese Quellen einer Kreuzkontamination auszuschalten.
Eine weitere Fehlerquelle ist eine ungenaue Regelung über die Probengemischtemperatur wie zwischen mehreren einer Vielzahl verschiedener Proben. Beispielsweise werden sich dann, wenn alle Proben nicht genau geregelt werden, so dass sie die richtige Anlagerungstemperatur (eine vom Benutzer ausgewählte Temperatur, gewöhnlich im Bereich von 50 bis 60°C) zur Verlängerungsinkubation haben, bestimmte Formen der DNA nicht richtig verlängern. Dies geschieht, da die im Verlängerungsverfahren verwendeten Primer an die falsche DNA anlagern, wenn die Temperatur zu niedrig ist. Ist die Anlagerungstemperatur zu hoch, werden die Primer überhaupt nicht an die Ziel-DNA anlagern.
Man kann sich leicht die Folgen einer ungenauen Durchführung des PCR-Amplifikationsverfahrens vorstellen, wenn die PCR-Amplifikation Teil einer diagnostischen Untersuchung ist, wie auf die Anwesenheit von HIV-Antikörpern, Hepatitis oder die Anwesenheit genetischer Erkrankungen wie Sichelzellenanämie, usw. Ein falsch positives oder falsch negatives Ergebnis bei einer solchen diagnostischen Untersuchung kann verheerende persönliche und gesetzliche Folgen haben. Demgemäß sollte die Ausführung des hier beschriebenen PCR-Instruments derart sein, dass sie möglichst viele dieser Quellen möglicher Fehler wie Kreuzkontamination oder schlechte Temperaturregelung eliminiert, während ein Instrument bereitgestellt ist, das mit dem Industriestandard-96-Vertiefungen-Mikrotiterplattenformat kompatibel ist. Das Instrument muss PCR schnell auf flexible Art und Weise mit einer einfachen Benutzeroberfläche durchführen.
In der bevorzugten Ausführungsform ist der Probenblock 12 aus einem festen Block aus relativ reinem, jedoch korrosionsbeständigem Aluminium, wie z. B. der 6061 Aluminiumlegierung, maschinell herausgearbeitet. Das maschinelle Herausarbeiten der Blockstruktur aus einem festen Block Aluminium führt zu einer thermisch gleichförmigeren Struktur. Aluminiumgussstrukturen neigen dazu, thermisch nicht so gleichförmig zu sein, wie dies notwendig ist, um die erwünschten, sehr engen Temperaturregelspezifikationenen zu erfüllen.
Der Probenblock 12 ist zu raschen Temperaturwechseln in der Lage, da die thermisch wirksame Masse des Blocks niedrig gehalten wird. Dies geschieht durch die Ausbildung vieler Kühlungsverbindungsgänge, Probenvertiefungen, Rillen und anderer Bohrungen mit oder ohne Gewinde in dem Block. Einige dieser Bohrungen werden verwendet, um den Block an Halterungen anzubringen und um externe Vorrichtungen wie Verteiler oder Überlaufeinsätze (spillage trays) daran anzubringen.
Um die "Waben"-Natur der Probenblockstruktur am besten beurteilen zu können, sollte sich der Leser gleichzeitig auf 2, die den Block in Draufsicht zeigt, sowie auf die 3 bis 8 beziehen, die Aufrissansichten und strategisch angeordnete Ausschnittsansichten des Probenblocks zeigen. Beispielsweise ist 3 eine Seitenaufrissansicht, die die Kühlungs kanalpositionen von dem Ausgangspunkt der Sichtlinie 3-3 in 2 zeigt. Die Aufrissansicht des Probenblocks 12, betrachtet von der gegenüberliegenden Kante, ist identisch. 4 ist eine Aufrissansicht der Kante des Probenblocks 12 aus der Perspektive der Sichtlinie 4-4' in 2. 5 ist eine Aufrissansicht des Endes des Probenblocks 12 aus der Perspektive der Sichtlinie 5-5' in 2. 6 ist eine Ausschnittsansicht des Probenblocks 12 entlang der Schnittlinie 6-6' in 2. 7 ist eine Ausschnittsansicht des Probenblocks 12 entlang der Schnittlinie 7-7' in 2. 8 ist eine Ausschnittsansicht des Probenblocks 12 entlang der Schnittlinie 8-8' in 2.
Die Oberseite des Probenblocks 12 ist mit einer 8 × 12-Gruppierung konischer Probenvertiefungen gebohrt, von denen die Vertiefungen 66 und 68 typisch sind. Die konische Konfiguration jeder Probenvertiefung kann am besten in 8 gesehen werden. Die Wände jeder Probenvertiefung sind in einem Winkel von 17°C gebohrt, um mit dem Winkel des konischen Abschnitts jedes Probenröhrchens zusammenzupassen. Dies geschieht durch Bohren eines Führungslochs mit dem Durchmesser D_w in 8. Dann wird ein 17°-Kegelsenker verwendet, um die konischen Wände 67 auszubilden.
Der Boden jeder Probenvertiefung schließt eine Senkgrube 70 ein, die eine Tiefe aufweist, die die Eindringtiefe der Probenröhrchenspitze übersteigt. Diese Senkgrube 70 wird durch das Führungsloch erzeugt und stellt einen kleinen offenen Raum unterhalb des Probenröhrchens bereit, wenn das Probenröhrchen in die entsprechende Probenvertiefung eingesetzt ist. Diese Senkgrube stellt einen Raum für Flüssigkeit wie Kondensat bereit, die sich an den Wänden der Vertiefung bildet, um sich dort niederzuschlagen, ohne die feste Passung jedes Probenröhrchens mit den Wänden der Probenvertiefung zu stören. Diese feste Passung ist notwendig, um sicherzustellen, dass der Wärmeleitwert von der Vertiefungswand zur Probenflüssigkeit für jedes Probenröhrchen gleichmäßig und hoch ist. Jegliche Kontamination in einer Vertiefung, welche eine lose Passung für eines der Röhrchen verursacht, zerstört die Gleichmäßigkeit der Wärmeleitwerte über die Gruppierung. Das bedeutet, dass die Gegenwart von Flüssigkeit im Boden der Probenvertiefung ein Probenröhrchen an dem vollständigen Einsetzen in seine Probenvertiefung hindern könnte, wenn es keine Senkgrube 70 gäbe, da Flüssigkeit bei den Drücken, die beim Einsetzen der Probenröhrchen in die Probenvertiefungen angewandt werden, im Wesentlichen inkompressibel ist. Weiterhin stellt die Senkgrube 70 einen Raum bereit, in welchem sich eine Gasphase irgendeiner in der Senkgrube stehenden Flüssigkeit während der Hochtemperaturinkubationen derart ausdehnen kann, dass große Kräfte einer solchen Ausdehnung, welche vorhanden wären, wenn es keine Senkgrube 70 gäbe, auf das Probenröhrchen nicht aufgebracht werden, um das Probenröhrchen aus dessen bündigem Kontakt mit der Probenvertiefung zu drücken.
Es wurde experimentell herausgefunden, dass es für jedes Probenröhrchen wichtig ist, dass es in bündigem Kontakt mit seiner entsprechenden Probenvertiefung steht und dass eine bestimmte minimale Schwellenkraft auf jedes Probenröhrchen aufgebracht werden soll, um die Wärmeleitfähigkeit zwischen den Wänden der Probenvertiefung und dem Reaktionsgemisch gleichmäßig überall in der Gruppierung zu halten. Diese minimale Schwellenbefestigungskraft ist als der Kraftvektor F in 15 gezeigt und ist ein Schlüsselfaktor dabei, zu verhindern, dass die Wärmeleitfähigkeit durch die Wände eines Probenröhrchens von der Wärmeleitfähigkeit durch die Wände eines anderen Probenröhrchens, das an anderer Stelle im Block angeordnet ist, verschieden ist. Die minimale Schwellenbefestigungskraft F beträgt 30 g (0,294 N) und das bevorzugte Kraftniveau liegt zwischen 50 (0,49 N) und 100 g (0,981 N).
Die Gruppierung von Probenvertiefungen ist im Wesentlichen vollständig von einer am besten in den 2, 6 und 8 zu sehenden Rille 78 umgeben, welche zwei Funktionen hat. Die Hauptfunktion besteht darin, die Wärmeleitfähigkeit von dem zentralen Bereich des Probenblocks zu der Kante des Blocks zu reduzieren. Die Rille 78 dehnt sich über zwei Drittel der Dicke des Probenblocks aus. Diese Rille minimiert die Auswirkungen von unvermeidbaren Wärmegradienten, die durch notwendige mechanische Verbindungen der Haltestifte, Verteiler, usw. zu dem Block verursacht werden. Eine zweite Funktion besteht darin, thermisch wirksame Masse aus dem Probenblock 12 zu entfernen, um so der Temperatur des Probenblocks 12 zu ermöglichen, schneller verändert zu werden und eine "Sicherheitsband" genannte Reihe von Vertiefungen im Randbereich zu simulieren. Die Menge des durch den Abschnitt der Rille 78 zwischen den Punkten 80 und 82 in 2 entfernten Metalls ist ausgelegt, um der Menge des durch die angrenzende Spalte von acht Probenvertiefungen 83 bis 90 entfernten Metalls im Wesentlichen zu entsprechen. Der Zweck davon besteht darin, die thermisch wirksame Masse des Sicherheitsbandes mit der thermisch wirksamen Masse der angrenzenden "lokalen Zone" abzustimmen, einem Term, der nachstehend ausführlicher erklärt werden wird.
Insbesondere in den 3, 6 und 8 sind die Anzahl und relativen Positionen der verschiedenen Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanäle gezeigt, die im Metall des Probenblocks ausgebildet sind. Es gibt neun Vorkühlungskanäle, die mit den Bezugszeichen 91 bis 99 gekennzeichnet sind. Ebenso gibt es 8 Rampenkühlungskanäle, die mit den Bezugszeichen 100 bis 107 gekennzeichnet sind.
Jeder dieser Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanäle ist durch das Aluminium des Probenblocks hindurch tiefgebohrt. Das Tiefbohrungsverfahren ist bekannt und stellt die Fähigkeit bereit, ein langes, sehr gerades Loch zu bohren, das so nahe wie möglich an der Bodenfläche 110 des Probenblocks 12 liegt. Da das Tiefbohrungsverfahren ein gerades Loch bohrt, wird dieses Verfahren bevorzugt, um so zu verhindern, dass irgendeiner der Vorkühlungs- oder Rampenkühlungskanäle während des Bohrverfahrens streut und die Bodenfläche 110 des Probenblocks durchdringt, oder auf andere Weise seine Position relativ zu den anderen Kühlungskanälen ändert. Eine solche Fehlpositionierung könnte unerwünschte Temperaturgradienten bewirken, indem sie den "lokalen Ausgleich" und die "lokale Symmetrie" der lokalen Zonen durcheinander bringt. Diese Konzepte werden nachstehend erläutert, jedoch sollte der Leser vorab verstehen, dass diese Begriffe und die jene implementierenden Strukturen der Schlüssel dafür sind, eine schnelle Temperaturzyklierung von bis zu 96 Proben zu erreichen, ohne übermäßige Temperaturfehler z. B. zwischen unterschiedlichen Probenvertiefungen zu erzeugen.
Die Vorkühlungskanäle 91 bis 99 sind in der bevorzugten Ausführungsform mit Silikonkautschuk ausgekleidet, um die Wärmeleitfähigkeit durch die Wand des Vorkühlungskanals zu reduzieren. Das Verringern der Wärmeleitfähigkeit durch die Kanalwand in den Vorkühlungskanälen wird bevorzugt, um so eine zu schnelle Veränderung in der Temperatur des Probenblocks 12 zu verhindern, wenn das Mehrzonenheizgerät 156 abgeschaltet wird und der Wärmeverlust von dem Probenblock 12 hauptsächlich durch die Vorkühlungskanäle erfolgt. Dies ist die Situation während des Regelungsvorgangs, der durchgeführt wird, wenn die Probenblocktemperatur leicht über die gewünschte Sollinkubationstemperatur gestreut hat und das Regelungssystem versucht, die Probenblocktemperatur auf die benutzerdefinierte Inkubationstemperatur wieder abzusenken. Eine zu schnelle Kühlungsrate in dieser Situation würde ein Überschwingen der gewünschten Inkubationstemperatur bewirken, bevor der Servoregelkreis des Regelungssystems ansprechen kann, obwohl ein Algorithmus für "geregeltes Überschwingen" verwendet wird, wie nachstehend beschrieben ist. Da der Blocktemperatur-Servoregelkreis eine Zeitkonstante zum Reagieren auf Anregungen aufweist, ist es wünschenswert, die Heiz- und Kühlmenge und die resultierende Rate der Temperaturänderung des Probenblocks derart zu regeln, dass ein Überschwingen minimiert wird, indem die Probenblocktemperatur nicht bei einer Rate geändert wird, die schneller ist, als das Regelungssystem auf Temperaturfehler ansprechen kann.
In der bevorzugten Ausführungsform sind die Vorkühlungskanäle 4 mm im Durchmesser und die Silikonkautschukröhre weist einen Innendurchmesser von 1 mm und eine 1,5-mm-Wandstärke auf. Dies stellt eine Vorkühlungsrate von etwa 0,2°C pro Sekunde bereit, wenn sich der Block an dem oberen Ende des Betriebsbereichs, d. h. nahe 100°C befindet, sowie eine Vorkühlungsrate von etwa 0,1°C pro Sekunde, wenn sich der Probenblock 12 bei einer Temperatur am unteren Ende des Betriebsbereichs befindet. Das Kühlmittelsteuersystem 24 in 1 bewirkt eine Flussrate für das Kühlmittel in den Vorkühlungskanälen von etwa 1/20 bis 1/30 der Flussrate für das flüssige Kühlmittel durch die Rampenkühlungskanäle 100 bis 107. Die Vor- und Rampenkühlungskanäle weisen die gleiche Größe auf, d. h. 4 mm im Durchmesser, und dehnen sich vollständig durch den Probenblock 12 aus.
Die Vorkühlungskanäle werden ausgekleidet, indem ein starrer Draht mit einem Haken an dessen Ende durch den Vorkühlungskanal eingeschoben wird und dieser durch ein Loch im Ende eines Silikonkautschukröhrchens eingehakt wird, das einen Außendurchmesser aufweist, der geringfügig größer als 4 mm ist. Der Haken im Draht wird dann durch das Loch in dem Silikonkautschukröhrchen gelegt und das Silikonröhrchen wird durch den Vorkühlungskanal gezogen und bündig mit den Endflächen des Probenblocks 12 abgeschnitten.
Mit Gewinde versehene Löcher 108 bis 114 werden verwendet, um einen Kühlmittelverteiler an jede Seite des Probenblocks 12 zu schrauben. Es gibt einen Kühlmittelverteiler, der mit jedem Ende des Blocks verschraubt ist. Diese zwei Kühlmittelverteiler werden mit den Kühlmittelkanälen 26, 28, 30 und 32 in 1 verbunden und werden an dem Probenblock 12 mit einem Dichtungsmaterial (nicht gezeigt), das zwischen den Verteiler und das Probenblockmetall eingeschoben ist, befestigt. Diese Dichtung verhindert Kühlmittellecks und begrenzt die Wärmeleitfähigkeit zwischen dem Probenblock 12 und dem Verteiler, der eine Wärmesenke darstellt.
Jedwedes Dichtungsmaterial, das den vorstehend genannten Zwecken dient, reicht aus, um die Erfindung auszuüben.
Die Positionen der Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanäle relativ zu der Position der Rille 78 können am besten in der Ausschnittsansicht von 6 gesehen werden. Die Positionen der Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanäle relativ zu den Positionen der Probenvertiefungen können am besten in 8 gesehen werden. Die Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanäle sind im Allgemeinen zwischen die Positionen der Spitzen der Probenvertiefungen eingeschoben. Ferner zeigt 8, dass die Vorkühlungs- und Rampenkühlungskanäle wie Kanäle 106 und 97 nicht sehr weit in die positive z-Richtung bewegt werden können, ohne das Durchdringen der Wände einer oder mehrerer Probenvertiefungen zu riskieren. Ebenso können die Kühlungskanäle nicht sehr weit in die negative z-Richtung bewegt werden, ohne die Möglichkeit des Durchdringens der Bodenfläche 116 des Probenblocks 12 zu schaffen. Aus Gründen der Klarheit sind die Positionen der Vor- und Rampenkühlungskanäle nicht in verdeckten Linien in 2 relativ zu den Positionen der Probenvertiefungen und anderer Strukturen gezeigt. Es befindet sich jedoch entweder ein Vorkühlungskanal oder ein Rampenkühlungskanal zwischen jeder Spalte von Probenvertiefungen.
In 2 sind die Löcher 118, 119, 120 und 121 mit Gewinde versehen und werden verwendet, um den Probenblock 12 an der Maschine zu befestigen, die verwendet wird, um die darin ausgebildeten unterschiedlichen Löcher und Rillen herauszuarbeiten. In den 2, 4 und 5 werden die Löcher 124, 125, 126 und 127 verwendet, um den Probenblock 12 an einen in 9 gezeigten Stützwinkel zu befestigen, der nachstehend detaillierter beschrieben werden soll. Stahlbolzen erstrecken sich durch diesen Stützwinkel in die mit Gewinde versehenen Löcher 124 bis 127, um eine mechanische Halterung des Probenblocks 12 bereitzustellen. Diese Stahlbolzen stellen ferner Wärmesenken oder Wärmequellen dar, die dazu tendieren, thermisch wirksame Masse zu dem Probenblock 12 hinzuzufügen und zusätzliche Wege für den Transfer von thermischer Energie zwischen dem Probenblock 12 und der Umgebung bereitzustellen. Diese Haltestifte und die Verteiler sind zwei wichtige Faktoren beim Schaffen des Bedarfs an Sicherheitsbändern, um zu verhindern, dass die thermische Energie, die hin und zurück zu diesen peripheren Strukturen übertragen wird, diese Probentemperaturen beeinträchtigt.
In 5 sind die Löcher 128, 130 und 132 Befestigungslöcher für einen Temperatursensor mit integriertem Schaltkreis (nicht gezeigt), der in den Probenblock durch das Loch 128 eingeführt und daran durch Bolzen befestigt wird, die an den mit Gewinde versehenen Löchern 130 und 132 festmachen. Der Umfang des Durchdringens des Lochs 128 und die relative Position des Temperatursensors zu der Rille 78 und der angrenzenden Spalte von Probenvertiefungen kann am besten in 2 gesehen werden.
In 2 sind die Löcher 134 bis 143 Befestigungslöcher, die verwendet werden, um einen Überlaufkragen (spill collar) 147 (nicht gezeigt) zu befestigen. Dieser Überlaufkragen 147 ist in 19 gezeigt, die die Struktur der beheizten Platte 14, der Gleitabdeckung 316 und des Leitspindelaufbaus 312 detaillierter darstellt. Der Zweck des Überlaufkragens besteht darin, zu verhindern, dass jedwede von den Probenröhrchen überlaufende Flüssigkeit in das Innere des Instrumentgehäuses gelangt, wo diese Korrosion verursachen könnte.
In 9 ist im Querschnitt eine Ansicht der Konfiguration des Stützsystems und des Mehrzonenheizgeräts 156 für den Probenblock 12 gezeigt. Der Probenblock 12 wird durch vier Bolzen gehalten, von denen der Bolzen 146 typisch ist. Diese vier Bolzen gehen durch die aufrechten Elemente eines Stahlstützwinkels 148. Zwei große Schraubenfedern 150 und 152 sind zwischen einem horizontalen Abschnitt des Stützwinkels 148 und einer Stahldruckplatte 154 zusammengedrückt. Die Federn 150 und 152 sind ausreichend zusammengedrückt, um etwa 20,68 × 10⁵ Pa (300 pounds per square Inch of force) in der positiven z-Richtung zu liefern, die wirken, um ein Filmheizgerät 156 auf die Bodenfläche 116 des Probenblocks 12 zu drücken. Diese dreilagige Filmheizgerät-Struktur umfasst ein Mehrzonen-Filmheizgerät 156, eine Silikonkautschuk-Druckunterlage 158 und eine Schicht von Epoxidharz-Schaumstoff 160. Bei der bevorzugten Ausführungsform weist das Filmheizgerät 156 drei getrennt steuerbare Zonen auf. Der Zweck des Filmheizgeräts 156 liegt darin, den Probenblock 12 unter der Steuerung der CPU 20 in 1 mit Wärme zu versorgen. Der Zweck der Silikonkautschuk-Druckunterlage 158 besteht darin, die Wärmeleitfähigkeit von der Filmheizgerätschicht 156 zu den darunter liegenden Strukturen zu erniedrigen. Diese niedrigeren Strukturen dienen als Wärmesenken und Wärmequellen, zwischen denen unerwünschte Wärmeenergie zu und von dem Probenblock 12 übertragen werden kann. Die Silikonkautschuk-Druckunterlage 158 hat die zusätzliche Funktion, Oberflächenunregelmäßigkeiten in dem Filmheizgerät 156 zu kompensieren, da einige Filmheizgeräte Nichromdrähte umfassen und nicht vollkommen flach sein können.
Der Zweck der Stahlplatte 154 und des Epoxidharz-Schaumstoffs 160 liegt darin, die Kraft von den Federn 150 und 152 an die Silikonkautschuk-Druckunterlage 158 und das Mehrzonen-Filmheizgerät 156 zu überfragen, um so das Filmheizgerät auf die Bodenfläche 116 des Probenblocks mit einer Passung zusammenzudrücken, die so bündig wie möglich ist. Der Epoxidharz-Schaumstoff sollte steif sein, so dass er nicht unter der Kraft der Federn zerquetscht wird, jedoch sollte dieser ebenso ein guter Isolator sein und sollte eine geringe thermisch wirksame Masse aufweisen, d. h., dieser sollte eine nicht-dichte Struktur sein. In einer Ausführungsform wird der Schaumstoff 160 unter der Marke ECKO-Schaumstoff hergestellt. In alternativen Ausführungsformen können die Silikonkautschukschicht 158 und/oder die Epoxidharz-Schaumstoffschicht 160 durch andere Strukturen ersetzt werden. Beispielsweise könnte eine steife Wabenstruktur, wie diese bei der Flugzeugkonstruktion verwendet wird, zwischen die Druckplatte 154 und das Filmheizgerät 156 mit dazwischen liegenden isolierenden Schichten eingebracht werden. Welche Struktur auch immer für die Schichten 158 und 160 verwendet wird, diese sollte keine wesentlichen Wärmemengen von dem Probenblock 12 absorbieren, während der Block geheizt wird, und sollte keine wesentlichen Wärmemengen an den Probenblock 12 übertragen, wenn der Block gekühlt wird. Vollkommene Isolierung des Blocks von dessen umgebenden Strukturen ist jedoch faktisch unmöglich. Es sollte kein Aufwand beim Gestalten alternativer Strukturen gescheut werden, die in Kontakt mit dem Probenblock 12 sein werden, um so den Probenblock von seiner Umgebung so gut wie möglich thermisch zu isolieren, um die thermisch wirksame Masse des Blocks zu minimieren und schnelle Temperaturänderungen des Probenblocks und der darin gesammelten Probengemische zu ermöglichen.
Eine genaue Temperaturregelung der Probenblocktemperatur wird durch die CPU 20 in 1 erreicht, indem die auf den Probenblock durch das Mehrzonen-Filmheizgerät 156 in 9 angewandte Wärmemenge gesteuert wird. Das Filmheizgerät wird unter Verwendung einer modifizierten Form von Pulsbreitenmodulation angesteuert. Zunächst wird die 120-Volt-Wellenform aus der Stromleitung gleichgerichtet, um lediglich Halbperioden der gleichen Polarität zu erhalten. Dann werden Abschnitte jeder Halbperiode zu den passenden Zonen des Folienheizgeräts durchgelassen, wobei der Prozentsatz jeder Halbperiode, der auf die verschiedenen Zonen des Folienheizgeräts angewandt wird, durch die CPU 20 gesteuert wird.
10 stellt eine Ausführungsform eines Leistungssteuerkonzepts für das Filmheizgerät 156 dar. 10 ist ein Diagramm der Spannungswellenform der Zuleitungsspannung. Eine Gleichrichtung findet statt, um die negative Halbperiode 162 zu eliminieren. Lediglich positive Halbperioden verbleiben, von denen die Halbperiode 164 typisch ist. Die CPU 20 und deren dazugehörige Peripherieschaltungen steuern dann den Abschnitt jeder Halbperiode, der auf die verschiedenen Zonen des Filmheizgeräts 156 angewandt wird, indem ein Abschnitt jeder gemäß eines Leistungsniveaus anzuwendenden Halbperiode ausgewählt wird, der für jede Zone auf der Basis der nachstehend für jede Zone gegebenen Gleichungen berechnet ist. Das heißt, die Trennungslinie 166 wird vorwärts oder rückwärts entlang der Zeitachse bewegt, um die Leistungsmenge an das Filmheizgerät auf der Basis einer Anzahl von Faktoren zu steuern, die in einer besonderen Gleichung für jede Zone in Beziehung gesetzt sind. Die kreuzweise schraffierte Fläche unter der positiven Halbperiode 164 stellt die Leistungsmenge dar, die auf das Filmheizgerät 156 für die dargestellte Position der Trennungslinie 166 angewandt wird. Wird die Trennungslinie 166 nach rechts bewegt, wird mehr Leistung auf das Filmheizgerät angewandt und der Probenblock 12 wird heißer. Wird die Trennungslinie nach links entlang der Zeitachse bewegt, wird die kreuzweise schraffierte Fläche kleiner und weniger Leistung wird auf das Filmheizgerät angewandt. Die Art und Weise, auf die die CPU 20 und deren dazugehörige Software und Peripherieschaltungen die Temperatur des Blocks 12 regeln, wird nachstehend detaillierter beschrieben.
Die an das Filmheizgerät gelieferte Leistungsmenge ist von 0 bis 600 Watt stufenlos einstellbar. in alternativen Ausführungsformen kann die an das Filmheizgerät gelieferte Leistungsmenge unter Verwendung anderer Schemata, wie z. B. der Rechnersteuerung über den Stromfluss durch ein Gleichstrom-Filmheizgerät oder der an ein Gleichstrom-Filmheizgerät angelegten Spannung oder durch das nachstehend beschriebene Nulldurchgangsschaltschema, gesteuert werden.
In anderen Ausführungsformen kann die Wärmeregelung des Probenblocks 12 durch die Steuerung über die Flussrate und/oder die Temperatur von heißen Gasen oder heißer Flüssigkeit, die durch die Wärmeregelungskanäle durchgelassen werden, die durch das Metall des Probenblocks 12 ausgebildet sind, durchgeführt werden. Natürlich würde bei solchen alternativen Ausführungsformen die Anzahl der Probenvertiefungen im Block reduziert werden müssen, da in dem in den 2 bis 8 gezeigten Probenblock 12 kein Raum für zusätzliche Heizkanäle ist. Solche alternativen Ausführungsformen könnten dennoch mit dem 96-Vertiefungen-Mikrotiterplattenformat kompatibel sein, wenn beispielsweise jede zweite Vertiefung entfernt werden würde, um Raum für einen Heizkanal im Probenblock zu schaffen. Dies würde Kompatibilität lediglich im Hinblick auf die Abmessungen solcher Mikrotiterplatten bereitstellen und nicht im Hinblick auf die gleichzeitige Verarbeitung von 96 verschiedenen Proben. Es muss darauf geachtet werden, den lokalen Ausgleich und die lokale Symmetrie bei diesen alternativen Ausführungsformen beizubehalten.
In der hier beschriebenen Ausführungsform beträgt die maximale Leistung, die an den Block über das Filmheizgerät geliefert werden kann, 1100 Watt. Diese Begrenzung rührt von der Wärmeleitfähigkeit der Block-/Heizgerät-Grenzfläche her. Es wurde experimentell herausgefunden, dass die Lieferung von mehr als etwa 1100 Watt an das Filmheizgerät 156 häufig zur Selbstzerstörung der Vorrichtung führen wird.
Eine typische Leistung für das Heizen oder Kühlen, wenn die Blocktemperaturen bei oder nahe der Sollinkubationstemperaturen geregelt werden, liegt im Bereich von plus oder minus 50 Watt.
In 11 ist ein Zeit-versus-Temperatur-Diagramm eines typischen PCR-Protokolls gezeigt. Große Abwärtsänderungen in der Blocktemperatur werden erreicht, indem abgekühltes flüssiges Kühlmittel durch die Rampenkühlungskanäle durchgelassen wird, während die Probenblocktemperatur durch den Temperatursensor 21 in 1 überwacht wird. Typischerweise werden diese schnellen, abwärtsgerichteten Temperaturänderungen während der der Denaturierungsinkubation 170 folgenden Rampe zu der Temperatur der Hybridisierungsinkubation 172 durchgeführt. Typischerweise muss der Benutzer das Protokoll spezifizieren, indem er die Temperaturen und Zeiten auf die eine oder andere Art derart definiert, dass die Positionen auf der Temperatur-/Zeitebene der Kontrollpunkte, die durch die einge kreisten Schnittpunke zwischen den Rampenschenkeln und den Inkubationsschenkeln symbolisiert sind, für die CPU 20 definiert werden. Im Allgemeinen werden die Inkubationsschenkel mit den Bezugszeichen 170, 172 und 174 und die Rampen mit den Bezugszeichen 176, 178 und 180 gekennzeichnet. Im Allgemeinen werden die Inkubationsintervalle bei einer einzigen Temperatur durchgeführt, jedoch können diese in alternativen Ausführungsformen abgestuft oder stufenlos mit einer Rampe zu verschiedenen Temperaturen innerhalb eines Bereichs von Temperaturen versehen sein, der für die Durchführung des speziellen Abschnitts des betroffenen PCR-Zyklus akzeptabel ist. Das heißt, die Denaturierungsinkubation 170 muss nicht bei einer Temperatur, wie sie in 11 gezeigt ist, ausgeführt werden, sondern kann bei irgendeiner einer Vielzahl unterschiedlicher Temperaturen innerhalb des Bereichs von Temperaturen ausgeführt werden, der für die Denaturierung akzeptabel ist. Bei einigen Ausführungsformen kann der Benutzer die Länge der Rampensegmente 176, 178 und 180 spezifizieren. In anderen Ausführungsformen kann der Benutzer lediglich die Temperatur oder die Temperaturen und die Dauer jedes Inkubationsintervalls spezifizieren und das Instrument wird dann die Temperatur des Probenblocks so schnell wie möglich zwischen den Inkubationstemperaturen nach dem Abschluss einer Inkubation und dem Beginn einer weiteren verstellen. Bei der bevorzugten Ausführungsform kann der Benutzer ferner Temperaturen und/oder Inkubationszeiten haben, die für jeden Zyklus unterschiedlich sind oder die automatisch bei jedem Zyklus ansteigen.
Die durchschnittliche Leistung der Rampenkühlung während eines Übergangs von einer 95°C-Denaturierungsinkubation zu einer 35°C-Hybridisierungsinkubation beträgt typischerweise mehr als 1 Kilowatt. Dies führt zu einer Temperaturänderung für den Probenblock von etwa 4–6°C pro Sekunde, wenn sich die Blocktemperatur an dem oberen Ende des Betriebsbereichs befindet, und etwa 2°C pro Sekunde, wenn sich die Blocktemperatur an dem unteren Ende des Betriebsbereichs befindet. Im Allgemeinen ist es wünschenswert, für die Rampenkühlung eine möglichst große Kühlungsrate zu haben.
Da während der Rampenkühlung eine so große Wärmemenge aus dem Probenblock entfernt wird, könnten Temperaturgradienten über dem Probenblock von einem Ende eines Rampenkühlungskanals zu dem anderen auftreten. Um dies zu verhindern und diese Art von Temperaturgradienten auf ein Mindestmaß zu beschränken, sind die Rampenkühlungskanäle gerichtet verflochten. Das bedeutet, in 3 ist die Richtung des Kühlmittelflusses durch die Rampenkühlungskanäle 100, 102, 104 und 106 in die Seite hinein, wie dies durch die x's im Inneren dieser Rampenkühlungskanallöcher symbolisiert ist. Der Rampenkühlungsflüssigkeitsfluss in den verflochtenen Rampenkühlungskanälen 101, 103, 105 und 107 geht aus der Seite heraus, wie dies durch die einzelnen Punkte in der Mitte dieser Rampen kühlungskanallöcher symbolisiert ist. Diese Verflechtung sowie die hohe Flussrate durch die Rampenkühlungskanäle minimiert jedwede Temperaturgradienten, die sonst bei Verwendung nicht verflochtener Strömungsbilder oder geringerer Flussraten auftreten könnten, da der Abstand zwischen den heißen und kalten Enden der Kanäle geringer ausgeführt ist. Eine langsamere Flussrate führt dazu, dass der größte Teil oder die gesamte Wärmemenge aus dem Block in etwa den ersten 2,54 cm (1 Inch) des Weges entzogen wird, was bedeutet, dass die Eingangsseite des Blocks eine niedrigere Temperatur als die Ausgangsseite des Blocks haben wird. Eine hohe Flussrate minimiert den Temperaturgradienten entlang des Kanals. Verflechtung bedeutet, dass die heißen Enden der in einer Richtung laufenden Kanäle "schichtweise" zwischen den kalten Enden der Kanäle angeordnet sind ("sandwiched"), bei denen der Fluss in die entgegengesetzte Richtung ist. Dies ist eine geringere Entfernung als die Länge des Kanals. Daher werden die Temperaturgradienten reduziert, da die Entfernungen, die Wärme zurücklegen muss, um die Temperaturgradienten zu eliminieren, reduziert werden. Dies führt dazu, dass jedwede Temperaturgradienten, die sich aufgrund der Kühlung in den Rampenkanälen ausbilden, schnell eliminiert werden, bevor diese Zeit haben, einige Proben und andere nicht unterschiedlich zu erwärmen. Ohne die Verflechtung würde eine Seite des Probenblocks etwa 1°C heißer als die andere Seite sein. Die Verflechtung führt zur Dissipation jedweder Temperaturgradienten, die zu weniger als etwa 15 Sekunden führen.
Um die dem Block zugeführte oder aus dem Block abgeführte Wärmemenge genau abzuschätzen, misst die CPU 20 die Blocktemperatur unter Verwendung des Temperatursensors 21 in 1 und misst die Kühlmitteltemperatur durch den Temperatursensor 61 in 46, der mit Bus 54 in 1 verbunden ist. Die Umgebungslufttemperatur wird ebenso durch den Temperatursensor 56 in 1 gemessen und die Netzspannung, die die Leistung steuert, die an das Filmheizgerät an Bus 52 angewandt wird, wird ebenso gemessen. Die Wärmeleitwerte von dem Probenblock zur Umgebung und von dem Probenblock zu dem Kühlmittel sind der CPU 20 bekannt, und zwar als ein Ergebnis von Messungen, die während eines Initialisierungsverfahrens, um die Steuerparameter des Systems einzustellen, gemacht wurden.
Für eine gute Temperaturgleichförmigkeit der Probenpopulation kann der Block bei konstanter Temperatur keinen ein- oder ausgehenden Nettowärmestrom aufweisen. Temperaturgradienten können jedoch innerhalb des Probenblocks auftreten, und zwar entstehend aus lokalen Wärmeströmen von heißen Stellen zu kalten Stellen, die einen Nullnettowärmetransfer (zero net heat transfer) relativ zu den Blockgrenzen aufweisen. Beispielsweise befindet sich ein plattenförmiges Material, das an einem Ende geheizt und am anderen gekühlt wird, auf einer konstanten durchschnittlichen Temperatur, wenn der Nettowärmestrom im Block Null ist. Jedoch kann in dieser Situation eine bedeutende Temperaturungleichförmigkeit, d. h. ein Temperaturgradient, innerhalb der Platte aufgrund des Wärmestroms von der heißen Kante zu der kalten Kante gebildet werden. Wird das Heizen und Kühlen der Kanten des Blocks unterbrochen, führt der Wärmestrom von der heißen Kante zur kalten Kante schließlich diesen Temperaturgradienten ab und der Block erreicht durchgehend eine gleichförmige Temperatur, die der Durchschnitt zwischen der heißen Temperatur und der kalten Temperatur zu Beginn des Wärmestroms ist.
Weist eine Platte der Querschnittsfläche A in der Länge L eine gleichförmige Wärmeleitfähigkeit K auf und wird die Platte auf konstanter durchschnittlicher Temperatur gehalten, ist, da der Wärmeeinstrom von einer Wärmequelle Q_ein auf den Wärmeausstrom an eine Wärmesenke Q_aus abgestimmt ist, das Temperaturprofil in stabilem Zustand, das von dem Wärmestrom resultiert:
wobei

Delta T: = der Temperaturgradient
L: = die thermische Weglänge
A: = die Fläche des thermischen Weges
K: = der Wärmeleitwert durch den Weg.

Im Allgemeinen wird der Temperaturgradient innerhalb jedweden Materials mit gleichförmigem Wärmeleitwert im Verhältnis zu dem Wärmestrom pro Einheit Fläche gebildet werden. Der Wärmestrom und die Temperaturungleichförmigkeit sind daher eng miteinander verknüpft.
Praktisch gesehen ist es nicht möglich, die Temperatur eines Probenblocks ohne einen gewissen Wärmestrom hinein und hinaus zu regeln. Die kalte Vorregelkühlung (cold bias control cooling) erfordert einen gewissen Wärmestrom hinein von den Heizbändern, um die durch das durch die Vorkühlungskanäle fließende Kühlmittel abgeführte Wärme auszugleichen, um die Blocktemperatur auf einem stabilen Wert zu halten. Der Schlüssel zu einer gleichförmigen Probenblocktemperatur unter diesen Bedingungen liegt in einer Geometrie, die "lokalen Ausgleich" und "lokale Symmetrie" von Wärmequellen und Wärmesenken sowohl statisch als auch dynamisch aufweist und die derart angeordnet ist, dass jedweder Wärmestrom von heißen Stellen zu kalten Stellen lediglich über eine kurze Entfernung auftritt.
Kurz gesagt bedeutet das Konzept des "statischen lokalen Ausgleichs", dass in einem Block bei konstanter Temperatur, bei welcher die gesamte Wärmezufuhr der gesamten Wärmeabfuhr entspricht, die Wärmequellen und Wärmesenken derart angeordnet sind, dass innerhalb eines klar begrenzten lokalen Bereichs alle Wärmequellen vollständig in Bezug auf Wärmeströme in den Block hinein und Wärmeströme aus dem Block heraus durch Wärmesenken ausgeglichen sind. Daher würde jeder lokale Bereich, wenn er isoliert ist, auf einer konstanten Temperatur gehalten werden.
Das Konzept der "statisch lokalen Symmetrie" bedeutet, dass innerhalb eines lokalen Bereichs und für eine konstante Temperatur der Massenschwerpunkt der Wärmequellen mit dem Massenschwerpunkt der Wärmesenken zusammenfällt. Wäre dies nicht der Fall, kann innerhalb jedes lokalen Bereichs ein Temperaturgradient über jeden lokalen Bereich existieren, welcher zu einem Temperaturgradienten in einem angrenzenden lokalen Bereich addieren kann, wodurch ein Gradient über dem Probenblock bewirkt wird, der aufgrund des Fehlens von lokaler Symmetrie zweimal so groß wie die Größe eines einzelnen lokalen Bereichs ist, auch wenn ein lokaler Ausgleich innerhalb jedes lokalen Bereichs existiert. Das Konzept des lokalen Ausgleichs und der lokalen Symmetrie ist für das Erreichen eines statischen Temperaturausgleichs wichtig, bei welchem die Temperatur des Probenblocks auf einem konstanten Niveau während beispielsweise eines Inkubationsintervalls gehalten wird.
Für den dynamischen Fall, bei welchem schnelle Temperaturänderungen im Probenblock auftreten, wird die thermisch wirksame Masse oder Wärmekapazität jedes lokalen Bereichs wichtig. Dies ist der Fall, da die Wärmemenge, die in jeden lokalen Bereich fließen muss, um seine Temperatur zu ändern, proportional zu der thermisch wirksamen Masse dieses Bereichs ist.
Daher kann das Konzept des statischen lokalen Ausgleichs auf den dynamischen Fall durch die Forderung ausgedehnt werden, dass dann, wenn ein lokaler Bereich x Prozent der gesamten dynamischen Wärmequelle und Wärmesenke einschließt, jener ebenso x Prozent der thermisch wirksamen Masse einschließen muss, damit ein "dynamischer lokaler Ausgleich" existiert. Ebenso erfordert die "dynamische lokale Symmetrie", dass der Massenschwerpunkt der Wärmekapazität mit dem Massenschwerpunkt der dynamischen Wärmequellen und -senken zusammenfällt. Was dies in einfachen Worten bedeutet, ist, dass die thermisch wirksame Masse des Probenblocks dessen Metall ist und dass die maschinelle Bearbeitung des Probenblocks symmetrisch und ausgeglichen sein muss, so dass die gesamte Masse des Metalls innerhalb jeder lokalen Zone die gleiche ist. Ferner sollte der Massenschwerpunkt des Metalls in jeder lokalen Zone mit dem Massenschwerpunkt der dynamischen Wärmequellen und -senken zusammenfallen. Daher müssen der Massenschwerpunkt des Mehrzonenheizgeräts 156, d. h., dessen geometrisches Zentrum, und das geometrische Zentrum der Vor- und Rampenkühlungskanäle zusammenfallen. Aus einem Studium der 2–9 wird aus der nachstehenden Diskussion ersichtlich sein, dass sowohl der/die statische als auch dynamische lokale Ausgleich und lokale Symmetrie im Probenblock 12 existieren.
12 stellt zwei lokale Bereiche für die Ausführung des Probenblocks 12 gemäß den Lehren der Erfindung nebeneinander dar. In 12 sind die Grenzen der zwei lokalen Bereiche 200 und 202 durch gestrichelte Linien 204, 206 und 208 gekennzeichnet. 12 zeigt, dass jeder lokale Bereich, der nicht im Sicherheitsband ist, umfasst: zwei Spalten von Probenvertiefungen; einen Abschnitt des Folienheizgeräts 156, der sich als 1/8 der Gesamtfläche des Heizgeräts herausstellt; einen Rampenkühlungskanal wie die Rampenkühlungskanäle 210 und 212; und einen Vorkühlungskanal. Um die lokale Symmetrie beizubehalten, ist jeder lokale Bereich auf seinem Rampenkühlungskanal zentriert und weist eine Hälfte eines Vorkühlungskanals an jeder Grenze auf. Beispielsweise weist der lokale Bereich 200 ein Zentrum über dem Rampenkühlungskanal 210 auf und die Vorkühlungskanäle 214 und 216 sind durch die Grenzen des lokalen Bereichs 204 bzw. 206 zergliedert. Daher fällt der Massenschwerpunkt des Rampenkühlungskanals (dessen Mitte) mit dem Massenschwerpunkt der Vorkühlungskanäle (das Zentrum des lokalen Bereichs) und mit dem Massenschwerpunkt des Filmheizgerätabschnitts, der mit jedem lokalen Bereich verbunden ist, (horizontal) zusammen. Ein statischer lokaler Ausgleich wird in jedem lokalen Bereich existieren, wenn die CPU 20 das Filmheizgerät 156 ansteuert, um eine Wärmeenergiemenge zuzuführen, die der Wärmeenergiemenge entspricht, die durch die Rampenkühlungs- und Vorkühlungskanäle abgeführt wird. Ein dynamischer lokaler Ausgleich für jeden lokalen Bereich existiert, da jeder lokale Bereich im zentralen Abschnitt des Blocks, in dem die 96 Probengemische liegen, etwa 1/8 der gesamten thermisch wirksamen Masse des gesamten Probenblocks, 1/8 der gesamten Anzahl der Rampenkühlungskanäle und 1/8 der gesamten Anzahl von Vorkühlungskanälen enthält. Eine dynamische lokale Symmetrie existiert für jeden lokalen Bereich, da der Massenschwerpunkt des Metalls jedes lokalen Bereichs horizontal zusammenfällt mit: dem Zentrum des Filmheizgerätabschnitts, der unter jedem lokalen Bereich liegt; dem Zentrum des Rampenkühlungskanals und dem Massenschwerpunkt der zwei halben Vorkühlungskanäle.
Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften, die als statische(r) und dynamische(r) lokaler Ausgleich und lokale Symmetrie bezeichnet werden, heizt und kühlt der Probenblock alle Proben in der Population viel gleichförmiger als bekannte Thermocycler.
In 2 ist die Draufsicht der Grenzen der lokalen Bereiche durch die gestrichelten Linien 217 bis 225 dargestellt. Die Prüfung von 2 offenbart, dass der zentrale Bereich der 96 Probenvertiefungen in sechs benachbarte lokale Bereiche geteilt ist, die durch die Grenzen 218 bis 224 begrenzt sind. Außerdem sind zwei lokale Bereiche mit Sicherheitsband an jeder Kante hinzugefügt. Der lokale Bereich an der Kante (lokale Bereiche werden hierin manchmal auch lokale Zonen genannt), der die negativste x-Koordinate aufweist, ist durch die Grenzlinien 217 und 218 begrenzt. Der lokale Bereich an der Kante, der die positivste x-Koordinate aufweist, ist durch die Grenzlinien 224 und 225 begrenzt. Es ist zu beachten, dass die lokalen Bereiche an der Kante keine Probenvertiefungsspalten enthalten, jedoch die Rille 78 enthalten, die eine Spalte von Vertiefungen simuliert. Die Tiefe und Breite der Rille 78 ist ausgelegt, um die gleiche Metallmasse wie eine Spalte von Vertiefungen wegzunehmen, wodurch in gewisser Weise die dynamische lokale Symmetrie beibehalten wird. Die lokalen Zonen der Kante unterscheiden sich daher in der thermisch wirksamen Masse (diese weisen außerdem zusätzliche thermisch wirksame Masse aufgrund der externen Verbindungen wie Verteiler und Haltestifte auf) von den sechs lokalen Zonen im zentralen Teil des Probenblocks. Dieser Unterschied wird berücksichtigt, indem die lokalen Zonen der Kante oder Sicherheitsbänder mit getrennt steuerbaren Zonen des Mehrzonenheizgeräts beheizt werden, so dass dem Sicherheitsband mehr Energie zugeführt werden kann als der zentralen Zone des Blocks.
Die lokalen Bereiche an jeder Kante des Blocks nähern sich den thermischen Eigenschaften der sechs zentral angeordneten lokalen Bereiche an, stimmen jedoch nicht genau mit diesen überein. Die lokalen Bereiche an der Kante werden "Sicherheitsband"-Bereiche genannt, da sie ein Sicherheitsband vervollständigen, das um die Peripherie des Probenblocks 12 läuft. Der Zweck dieses Sicherheitsbandes besteht darin, eine gewisse thermische Isolierung des zentralen Abschnitts des die 96 Probenvertiefungen enthaltenden Probenblocks von unkontrollierten Wärmesenken und -quellen bereitzustellen, die inhärent in den mechanischen Verbindungen zu dem Block durch solche Dinge wie Haltestifte, Verteiler, Ablaufkrägen und andere Vorrichtungen, die mechanisch am Probenblock 12 befestigt werden müssen, umfasst sind. In 2 beispielsweise weisen die Kantenflächen 228 und 230 des Probenblocks daran befestigte Kunststoffverteiler auf, die Kühlmittel zu und von den Rampen- und Vorkühlungsverbindungsgängen führen. Das Sicherheitsband entlang der Kanten 228 und 230 besteht aus Abschnitten des Schlitzes 78, die parallel zu den Kanten 228 und 230 und jenen am nächsten sind. Die Tiefe der Rille 78 ist derart, dass der Boden der Rille so nah wie möglich an den Umfängen der Vor- und Rampenkühlungskanäle liegt, ohne diese tatsächlich zu schneiden. Die Breite der Rille 78, die mit dieser Tiefe gekoppelt ist, ist derart, dass das durch den Schlitz 78 zwischen den Punkten 82 und 232 in 2 entfernte Metallvolumen ungefähr dem durch die angrenzende Reihe von Probenvertiefungen entfernten Metallvolumen entspricht, ausgegangen von der Probenvertiefung 234 bis einschließlich der Probenvertiefung 83. Ferner ist der Schlitz 78 rund um den Umfang des Blocks ungefähr da angeordnet, wo eine solche zusätzliche Reihe von Vertiefungen wäre, wenn das periodische Muster der Probenvertiefungen um eine Reihe oder eine Spalte von Vertiefungen in jeder Richtung ausgedehnt wäre.
Entlang der Kanten 250 und 252, und zwar da, wo die Stützverbindungen zum Probenblock hergestellt sind, enthalten die lokalen Bereiche des Sicherheitsbandes zusätzlich zu einem Abschnitt des Schlitzes 78 die volle Länge mehrerer Kühlungskanäle. Bezugnehmend auf 3 schließen diese ein: ½ eines Vorkühlungskanals (z. B. 92), der mit dem angrenzenden ½-Vorkühlungskanal des angrenzenden lokalen Bereichs zusammenfließt, um einen ganzen Vorkühlungskanal auszubilden; einen Rampenkühlungskanal (z. B. 100); und einen ganzen Vorkühlungskanal (z. B. 91). Für den lokalen Bereich an der Kante bei Kante 250 sind diese Kühlungskanäle 107, 198 und 99.
Die ganzen Vorkühlungskanäle im Sicherheitsband sind leicht nach innen von der Kante des Blocks verschoben. Der Grund dafür, dass diese ganzen Vorkühlungskanäle verwendet werden, besteht darin, dass es unzweckmäßig ist, einen "halben" Kühlungskanal zu bauen. Da die Vorkühlungskanäle einen solchen dickwandigen Gummibelag erfordern, wäre es schwierig, ein Loch durch einen Belag eines "halben" Vorkühlungskanals zuverlässig offen zu halten. Diese Asymmetrie in den lokalen Bereichen an der Kante bewirkt einen geringen überschüssigen Wärmeverlust an das Kühlmittel von den lokalen Bereichen des Kantensicherheitsbandes, liegt jedoch ausreichend entfernt von dem zentralen Bereich des die Probenvertiefungen enthaltenden Probenblocks, so dass dessen Beitrag zu den Ungleichförmigkeiten der Probentemperatur gering ist. Ferner kann die Wirkung, da die Temperatureinflüsse dieser kleinen Asymmetrie vorhersagbar sind, durch die Verwendung einer getrennt steuerbaren Zone des Mehrzonenheizsystems unter jedem Sicherheitsband weiter minimiert werden.
In 13 sind drei getrennt gesteuerte Zonen innerhalb der Filmheizgerätschicht 156 in 9 gezeigt. Diese getrennt gesteuerten Zonen schließen Kantenheizzonen ein, die unter den Sicherheitsbändern an den offenen Kanten des Probenblocks 12 liegen, die mit dem Stützwinkel 148 verbunden sind. Es sind ferner getrennt gesteuerte Verteilerheizzonen vorhanden, die unter den Sicherheitsbändern für die Kanten 228 und 230 liegen, die an den Kühlmittelverteilern angebracht sind. Schließlich gibt es eine zentrale Heizzone, die unter den Probenvertiefungen liegt. Die an jede dieser Zonen angewandte Leistung wird durch die CPU 20 und die Steuersoftware getrennt gesteuert.
Das Filmheizgerät 156 besteht aus einem Muster von elektrischen Leitern, die durch Ätzen einer dünnen Schicht einer Metalllegierung, wie z. B. Inconel^TM, ausgebildet sind, Die ausgewählte Metalllegierung sollte einen großen elektrischen Widerstand und eine gute Hitzebeständigkeit aufweisen. Das so geätzte Leitermuster ist zwischen dünnen Schichten eines elektrisch isolierenden Polymermaterials, wie z. B. Kapton^TM, gebondet. Unabhängig davon, welches Material verwendet wird, um das elektrische Widerstandsheizelement zu isolieren, muss das Material beständig gegenüber hohen Temperaturen sein, eine hohe Durchschlagfestigkeit und eine gute mechanische Stabilität aufweisen.
Die zentrale Zone 254 des Filmheizgeräts weist ungefähr die gleichen Abmessungen wie der zentrale Abschnitt des Probenblocks im Inneren des Sicherheitsbandes auf. Der zentrale Bereich 254 liefert eine gleichförmige Leistungsdichte an die Probenvertiefungsfläche.
Die Kantenheizbereiche 256 und 258 sind ungefähr so weit wie die Kantensicherheitsbänder, jedoch nicht ganz so lang.
Die Verteilerheizbereiche 260 und 262 liegen unter den Sicherheitsbändern für die Kanten 228 und 230 in 2.
Die Verteilerheizzonen 260 und 262 sind elektrisch miteinander verbunden, um eine getrennt steuerbare Heizzone auszubilden. Außerdem sind die Kantenheizabschnitte 256 und 258 elektrisch miteinander gekoppelt, um eine zweite getrennt steuerbare Heizzone auszubilden. Die dritte getrennt steuerbare Heizzone ist der zentrale Abschnitt 254. Jede dieser drei getrennt steuerbaren Heizzonen weist getrennte elektrische Anschlüsse auf und jede Zone wird durch einen getrennten Steueralgorithmus gesteuert, der auf getrennten Mikroprozessoren oder einer gemeinsame CPU laufen gelassen werden kann, wie dies bei der bevorzugten Ausführungsform gemacht wird.
Die Kantenheizzonen 256 und 258 werden angesteuert, um Wärmeverluste an die Stützwinkel zu kompensieren. Dieser Wärmeverlust ist proportional zu der Temperaturdifferenz zwischen dem Probenblock 12 und der diesen umgebenden Umgebungsluft. Die Kantenheizzo nen 256 und 258 kompensieren außerdem den überschüssigen Wärmeverlust vom Probenblock an die vollen Vorkühlungskanäle an jeder Kante des Blocks. Dieser Wärmeverlust ist proportional zur Temperaturdifferenz zwischen dem Probenblock 12 und dem Kühlmittel, das durch diese Vorkühlungskanäle fließt.
Die Verteilerheizabschnitte 260 und 262 sind ebenso angesteuert, um so Wärmeverluste an die Kunststoffkühlmittelverteiler 266 und 268 in 13 zu kompensieren, die an den Kanten des Probenblocks 12 angebracht sind. Die Leistung für die Verteilerheizabschnitte 260 und 262 kompensiert den Wärmeverlust, der hauptsächlich zur Temperaturdifferenz zwischen dem Probenblock und dem Kühlmittel und zu einem geringeren Grad zwischen dem Probenblock und der Umgebungsluft proportional ist.
Aus praktischen Gründen ist es nicht möglich, die thermisch wirksame Masse der lokalen Bereiche des Sicherheitsbandes mit den thermisch wirksamen Massen der lokalen Bereiche abzustimmen, die die über dem zentralen Heizabschnitt 254 liegenden Probenvertiefungen einschließen. Beispielsweise leiten die Kunststoffkühlmittelverteiler 266 und 268 nicht nur Wärme weg von dem Sicherheitsband, sondern addieren außerdem einen gewissen Betrag an thermisch wirksamer Masse zu den lokalen Bereichen des Sicherheitsbandes, an welchem diese angebracht sind. Das Ergebnis besteht darin, dass während schneller Blocktemperaturänderungen die Raten des Anstiegs und des Abfalls der Sicherheitsbandtemperatur nicht genau auf die der lokalen Probenvertiefungsbereiche angepasst sind. Dies erzeugt einen dynamischen Temperaturgradienten zwischen den Sicherheitsbändern und den Probenvertiefungen, welcher, wenn man ihn groß werden lässt, für eine Zeit bestehen bleiben könnte, die länger ist, als tolerierbar wäre. Diese Temperaturgradientenwirkung ist ungefähr proportional zur Änderungsrate der Blocktemperatur und wird minimiert, indem Wärme jeder lokalen Zone des Sicherheitsbandes zugeführt oder von dieser abgezogen wird bei einer Rate, die proportional zur Änderungsrate der Blocktemperatur ist.
Die Proportionalitätskoeffizienten für die Sicherheitsbandzonen-Heizgeräte stellen relativ stabile Eigenschaften der Ausführung des Systems dar und werden durch technische Messungen an Prototypen ermittelt. Die Werte für diese Proportionalitätskoeffizienten sind nachstehend in Verbindung mit den Definitionen der Gleichungsterme (3) bis (5) gegeben. Diese Gleichungen definieren die an die Verteilerheizzone, die Kantenheizzone bzw. die zentrale Zone in einer alternativen Ausführungsform anzuwendenden Leistungsmengen. Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten Gleichungen sind nachstehend bei der Beschreibung der Software (Gleichungen (46)–(48), Leistung verteilt über Fläche) gegeben, Pm = Am P + Km1 (TBLK – TAMB) + KM2 (TBLK – TKÜHL) + KM3 (dtBLK/dt) (3) wobei

P_m: = an die Verteilerheizzonen 260 und 262 gelieferte Leistung.
A_m: = Fläche der Verteilerheizzone.
P: = benötigte Leistung, um zu bewirken, dass die Blocktemperatur zu jeder speziellen Zeit in einem PCR-Thermozyklusprotokoll auf der gewünschten Temperatur bleibt oder sich auf diese verstellt.
K_M1: = eine experimentell ermittelte Proportionalitätskonstante, um den überschüssigen Wärmeverlust an die Umgebung durch die Verteiler zu kompensieren, gleich 0 Watt/Grad Kelvin.
K_M2: = eine experimentell ermittelte Proportionalitätskonstante, um den überschüssigen Wärmeverlust an das Kühlmittel zu kompensieren, gleich 0,4 Watt/Grad Kelvin.
K_M3: = eine experimentell ermittelte Proportionalitätskonstante, um Zusatzleistung bereitzustellen, um die zusätzliche, durch die Anbringung der Kunststoffverteiler usw. verursachte thermisch wirksame Masse der Verteilerkanten-Sicherheitsbänder zu kompensieren, gleich 66,6 Watt-Sekunden/Grad Kelvin.
T_BLK: = die Temperatur des Probenblocks 12.
T_AMB: = die Temperatur der Umgebungsluft.
T_KÜHL: = die Temperatur des Kühlmittels.
dt_BLK/dt: = die Änderung in der Probenblocktemperatur pro Zeiteinheit.

PE = AEP + KE1 (TBLK – TAMB) + KE2 (TBLK – TKÜHL) + KE3 (dtBLK/dt) (4)

P_E: = an die Kantenheizzonen anzuwendende Leistung.
A_E: = die Fläche der Kantenheizzonen.
K_E1: = eine experimentell ermittelte Proportionalitätskonstante, um den überschüssigen Wärmeverlust an die Umgebung durch die Verteiler zu kompensieren, gleich 0,5 Watt/Grad Kelvin.
K_E2: = eine experimentell ermittelte Proportionalitätskonstante, um den überschüssigen Wärmeverlust an das Kühlmittel zu kompensieren, gleich 0,15 Watt/Grad Kelvin.
K_E3: = eine experimentell ermittelte Proportionalitätskonstante, um eine Zusatzleistung bereitzustellen, um die zusätzliche, durch die Anbringung des Probenblocks 12 an den Haltestiften und dem Stützwinkel, den Temperatursensor usw. verursachte thermisch wirksame Masse der offenen Kantensicherheitsbänder zu kompensieren, gleich 15,4 Watt-Sekunden/Grad Kelvin.

Pc = Ac P (5)

P_c: = die an die zentrale Zone 254 des Mehrzonenheizgeräts anzuwendende Leistung.
A_c: = die Fläche der zentralen Zone 254.

In jeder der Gleichungen (3) bis (5) ist der Leistungsterm P eine Variable, die durch den Abschnitt des durch die CPU in 1 abgearbeiteten Regelalgorithmus berechnet wird, der die benutzerdefinierten Sollwerte liest und ermittelt, was als nächstes zu tun ist, um zu bewirken, dass die Probenblocktemperatur bei der korrekten Temperatur bleibt oder diese annimmt, um das PCR-Temperaturprotokoll umzusetzen, das durch die Zeit- und Temperatursollwerte definiert ist, die im Speicher durch den Benutzer gespeichert werden. Die Art und Weise, auf welche die Sollwerte gelesen und die Leistungsdichte berechnet wird, wird nachstehend detaillierter beschrieben.
Der von der CPU 20 aus 1 abgearbeitete Regelalgorithmus fühlt die Temperatur des Probenblocks über den Temperatursensor 21 in 1 und 9 und Bus 52 in 1 ab, Diese Temperatur wird differenziert, um die Änderungsrate der Temperatur des Probenblocks 12 abzuleiten. Die CPU misst dann die Temperatur der Umgebungsluft über den Temperatursensor 56 in 1 und misst die Temperatur des Kühlmittels über den Temperatursensor 61 in dem in 46 gezeigten Kühlmittelsteuersystem 24. Die CPU 20 berechnet dann den Leistungsfaktor, der dem speziellen Segment des umzusetzenden PCR-Protokolls entspricht, und macht drei Berechnungen gemäß den Gleichungen (3), (4) und (5) durch Einsetzen aller gemessener Temperaturen, der Proportionalitätskonstanten (die in dem nicht-flüchtigen Speicher gespeichert sind), des Leistungsfaktors P für diese spezielle Iteration des Steuerprogramms und der Flächen der verschiedenen Heizzonen (die in dem nicht-flüchtigen Speicher gespeichert sind). Der Leistungsfaktor ist die gesamte benötigte Leistung, um die Blocktemperatur von ihrem momentanen Niveau auf das durch den Benutzer über einen Sollwert spezifizierte Temperaturniveau zu verstellen. Weitere Einzelheiten hinsichtlich der durch die CPU durchgeführten Berechnungen, um das Heizen und Kühlen zu steuern, sind nachstehend in der Beschreibung der Steuersoftware "PID-Rechenprozess (task)" gegeben.
Nachdem die erforderliche, an jede der drei Zonen des Heizgeräts 156 anzuwendende Leistung berechnet worden ist, wird eine weitere Berechnung gemacht, die das Verhältnis jeder Halbperiode der Eingangsleistung betrifft, die an jede Zone in einigen Ausführungsformen anzuwenden ist. Bei der nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform besteht der Berechnungsmodus darin, wie viele Halbperiode der Gesamtzahl der Halbperioden, die während einer 200-ms-Abtastperiode auftreten, an jede Zone anzuwenden sind. Dieses Verfahren ist nachstehend in Verbindung mit der Diskussion der 47A und 47B (nachstehend bezeichnet als 47) und des "PID-Rechenprozesses" der Steuersoftware beschrieben. Bei der durch 10 symbolisierten alternativen Ausführungsform berechnet der Rechner für jede Zone die Position der Trennungslinie 166 in 10. Nachdem diese Berechnung durchgeführt worden ist, werden geeignete Steuersignale erzeugt, um zu bewirken, dass die Stromversorgung für das Mehrzonenheizgerät 156 die geeignete Schaltung durchführt, um zu bewirken, dass die berechnete Leistungsmenge für jede Zone auf diese angewandt wird.
In alternativen Ausführungsformen kann das Mehrzonenheizgerät unter Verwendung eines einzelnen Filmheizgeräts implementiert werden, das eine gleichförmige Leistungsdichte an den gesamten Probenblock liefert, plus einem oder zwei zusätzlichen Filmheizgeräten, mit lediglich jeweils einer Zone für die Sicherheitsbänder. Diese zusätzlichen Heizgeräte werden über das einzelne Filmheizgerät gelegt, das den gesamten Probenblock bedeckt. Bei einer solchen Ausführungsform wird lediglich die Leistung, die notwendig ist, um die Sicherheitsbandverluste zu bilden, an die zusätzlichen Heizzonen geliefert.
Der Leistungsfaktor P in den Gleichungen (3) bis (5) wird durch die CPU 20 für verschiedene Punkte auf dem PCR-Temperaturprotokoll berechnet, und zwar basierend auf den durch den Benutzer spezifizierten Sollwerten und Rampenzeiten. Es wird jedoch eine Begrenzung basierend auf der maximalen Leistungsabgabefähigkeit des vorstehend erwähnten Zonenheizgeräts auferlegt.
Die Proportionalitätskonstanten in den Gleichungen (3) bis (5) müssen genau eingestellt werden, um die überschüssigen Wärmeverluste im Sicherheitsband für eine gute Temperaturgleichförmigkeit hinreichend zu kompensieren.
In 17 ist ein Graph der Unterschiede zwischen den berechneten Probentemperaturen für eine Vielzahl verschiedener Proben in Reaktion auf eine Stufenänderung in der Blocktemperatur, um die Temperatur des Probenblocks hin zu einer Denaturierungsinkubations-Solltemperatur von etwa 94°C von einer wesentlich niedrigeren Temperatur zu erhöhen, gezeigt. 17 stellt die berechneten Probenflüssigkeitstemperaturen dar, wenn das Mehrzonenheizgerät 156 richtig unter Verwendung der vorstehend in den Definitionen der Terme für die Gleichungen (3) bis (5) gegebenen Proportionalitätskonstanten gehandhabt wird. Die verschiedenen Vertiefungen, die verwendet werden, um den Graph von 17 abzuleiten, sind darin durch eine Kombination aus einem einzelnen Buchstaben und einer Zahl angegeben. Die 8 × 12-Vertiefungen-Gruppierung, die 2 zeigt, ist durch mit Buchstaben versehene Spalten und mit Zahlen versehenen Reihen kodiert. Daher wird beispielsweise die Probenvertiefung 90 auch als Probenvertiefung A12 bezeichnet, während die Probenvertiefung 89 auch als Probenvertiefung B12 bezeichnet wird. Ebenso wird die Probenvertiefung 68 auch als Probenvertiefung D6 bezeichnet, und so weiter. Es ist zu beachten, dass die Temperaturen der Vertiefungen asymptotisch bei Temperaturen ausschwingen, die innerhalb etwa 0,5°C voneinander liegen, und zwar aufgrund der gesamten hierin beschriebenen thermischen Ausgestaltung, um Temperaturgradienten zu eliminieren.
Die vorstehende Beschreibung stellt dar, wie die Probenblocktemperatur geregelt werden kann, um gleichförmig und schnell veränderbar zu sein. In den PCR-Verfahren ist es jedoch die Temperatur des Probenreaktionsgemisches und nicht die Blocktemperatur, die zu programmieren ist. Bei der bevorzugten Ausführungsform gemäß den Lehren der Erfindung spezifiziert der Benutzer eine Folge von Solltemperaturen für die Probenflüssigkeit selbst und spezifiziert die Inkubationszeiten für die Probenflüssigkeit an jeder dieser Solltemperaturen für jede Stufe im PCR-Verfahren. Die CPU 20 handhabt dann die Probenblocktemperatur, um so die Probenreaktionsgemische auf die spezifizierten Sollinkubationstemperaturen zu bekommen und die Probengemische bei diesen Solltemperaturen für die spezifizierten Inkubationszeiten zu halten. Der durch die CPU 20 abgearbeitete Benutzeroberflächencode zeigt bei allen Stufen dieses Verfahrens die momentane berechnete Probenflüssigkeitstemperatur auf der Anzeige der Bedienkonsole 16 an.
Die Schwierigkeit bei der Anzeige einer tatsächlich gemessenen Probentemperatur besteht darin, dass das Messen der tatsächlichen Temperatur des Reaktionsgemisches den Einsatz einer Temperaturmesssonde darin erfordert. Die thermisch wirksame Masse der Sonde kann die Temperatur jeder Vertiefung, in welche jene eingebracht wird, wesentlich verändern, da das Probenreaktionsgemisch in jeder speziellen Vertiefung oftmals lediglich ein Volumen von 100 μl aufweist. Daher kann der bloße Einsatz einer Temperatursonde in ein Reaktionsgemisch bewirken, dass ein Temperaturgradient zwischen diesem Reaktionsgemisch und den benachbarten Gemischen existiert. Da die zusätzliche thermisch wirksame Masse des Temperatursensors bewirken würde, dass das Reaktionsgemisch, in das dieser eingetaucht ist, in der Temperatur hinter den Temperaturen der Reaktionsgemische in anderen Vertiefungen zurückbleibt, die eine geringere thermisch wirksame Masse haben, können sich Fehler bei der Amplifikation einfach durch den Versuch, die Temperatur zu messen, ergeben.
Demgemäß berechnet das hierin beschriebene Instrument die Probentemperatur aus bekannten Faktoren wie dem Blocktemperaturverlauf und der thermischen Zeitkonstante des Systems und zeigt diese Probentemperatur auf der Anzeige an. Es wurde für das hierin beschriebene System experimentell herausgefunden, dass dann, wenn die Probenröhrchen in die Probenvertiefungen mit wenigstens einer minimalen Schwellenkraft F gedrückt werden, für die Größe und Form der in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten Probenröhrchen und die Probenvolumina von etwa 100 μl eine thermisch angetriebene Konvektion im Probenreaktionsgemisch auftritt und das System thermisch wie ein lineares System mit einer einzelnen Zeitkonstante wirkt. Versuche haben gezeigt, dass jedes Probenröhrchen mit etwa 0,49 N (50 grams of force) für eine gute Vertiefung-Wand-zu-Flüssigkeit-Wärmeleitfähigkeit von Vertiefung zu Vertiefung gedrückt werden muss. Die nachstehend beschriebene Ausführung der beheizten Platte ist ausgelegt, um auf jedes Probenröhrchen mit etwa 0,98 N (100 grams of force) zu drücken. Diese minimale Kraft, symbolisiert durch den Kraftvektor F in 15, ist nötig, um sicherzustellen, dass unabhängig von geringen Unterschieden in den äußeren Abmessungen, wie zwischen verschiedenen Probenröhrchen und verschiedenen Probenvertiefungen im Probenblock, jene alle mit einer ausreichenden Kraft heruntergedrückt werden, um die satt anliegende und bündige Passung für jedes Röhrchen zu garantieren, um eine gleichförmige Wärmeleitfähigkeit zu garantieren. Jede Ausführung, die einige Probenröhrchen mit losen Passungen in deren entsprechenden Probenvertiefungen und einige Röhrchen mit fasten Passungen aufweist, wird nicht in der Lage sein, eine enge Temperaturregelung für alle Probenröhrchen zu erreichen, und zwar aufgrund der ungleichförmigen Wärmeleitfähigkeit. Ein ungenügendes Kraftniveau F führt zu einem Temperaturverhalten der Probenflüssigkeit auf eine Stufenänderung in der Blocktemperatur, wie dies bei 286 in 14 gezeigt ist. Ein angemessenes Kraftniveau F führt zu dem bei 282 gezeigten Temperaturverhalten.
Das durch die erfindungsgemäß gebaute Vorrichtung erreichte Ergebnis besteht darin, dass sich die Temperatur jedes Probengemisches verhält, als ob die Probe während der Übergänge auf neue Temperaturen physikalisch gut gemischt wird. In der Tat wird das Proben reaktionsgemisch in jedem Probenröhrchen aufgrund der in jedem Probengemisch bewirkten Konvektionsströme gut durchmischt.
Das überraschende Ergebnis liegt darin, dass das thermische Verhalten des gesamten Systems einem elektrischen RC-Schaltkreis mit einer einzelnen Zeitkonstante von 9 Sekunden entspricht, die etwa 1,44 mal der Halbzeit des Abfalls der Differenz zwischen der Blocktemperatur und der Probentemperatur ist. Ein mit 50 ml der Probe gefülltes Gene-Amp^®-Probenröhrchen weist eine Zeitkonstante von etwa 23 Sekunden auf. Mit anderen Worten, während einer Aufwärtsänderung in der Temperatur des Probenblocks wirkt die Temperatur des Reaktionsgemisches wie der Anstieg in der Spannung am Kondensator C in einer elektrischen RC-Reihenschaltung, wie der in 16D gezeigten, in Reaktion auf eine Stufenänderung am Spannungsausgang der Spannungsquelle V.
Um diese Konzepte darzustellen, wird auf 14 verwiesen, die unterschiedliches Temperaturverhalten der Probenflüssigkeit auf eine Stufenänderung in der Blocktemperatur zeigt, sowie auf 15, die einen Querschnitt durch eine Probenvertiefung-/Probenröhrchen-Kombination zeigt. Es wurde experimentell herausgefunden, dass dann, wenn das Volumen der Probenflüssigkeit 276 etwa 100 μl beträgt und die Abmessungen des Röhrchens derart sind, dass der Meniskus 278 unterhalb der Oberseite 280 des Probenblocks 12 angeordnet ist, und die Kraft F, die das Probenröhrchen in die Probenvertiefung drückt, wenigstens 30 g (0,294 N) beträgt, die thermische Zeitkonstante τ (tau) des in 15 gezeigten Systems ungefähr 9 Sekunden für eine Probenröhrchen-Wandstärke im konischen Abschnitt von 0,229 mm (0,009 Inch) (Abmessung A) beträgt. Es wurde außerdem experimentell herausgefunden, dass für diese Bedingungen die thermische Zeitkonstante τ um etwa 1 Sekunde für jede 0,025-mm-(0,001 Inch)Änderung in der Wandstärke für den Probenröhrchenstumpf (Kegel) variiert. Es wurde für die hierin beschriebenen dünnwandigen Probenröhrchen herausgefunden, dass jene thermische Zeitkonstanten zwischen etwa 5 und etwa 14 Sekunden aufweisen, wenn diese zwischen 20 und 100 μl Probe enthalten. Dickere Röhrchenwände führen zu längeren Zeitkonstanten und einer größeren Verzögerung zwischen einer Änderung in der Probenblocktemperatur und der resultierenden Änderung in der Probenflüssigkeitstemperatur.
Mathematisch ist der Ausdruck für das thermische Verhalten der Probenflüssigkeitstemperatur auf eine Änderung in der Temperatur des Probenblocks: TProbe = ΔT (1 – e–t/τ) (6) wobei

T_Probe: = die Temperatur der Probenflüssigkeit.
ΔT: = die Temperaturdifferenz zwischen der Temperatur des Probenblocks 12 und der Temperatur der Probenflüssigkeit.
t: = verstrichene Zeit
τ: = thermische Zeitkonstante des Systems oder die Wärmekapazität der Probe geteilt durch den Wärmeleitwert von der Probenvertiefungswand zur Probenflüssigkeit.

In 14 stellt die Kurve 282 dieses exponentielle Temperaturverhalten auf eine theoretische Stufenänderung in der Probenblocktemperatur dar, wenn die Kraft F, die auf das Probenröhrchen drückt, ausreichend groß ist. Die Stufenänderung in der Temperatur des Probenblocks ist als Funktion 284 gezeigt, mit einem schnellen Anstieg in der Temperatur beginnend bei der Zeit T₁. Es ist zu beachten, wie die Temperatur der Probenflüssigkeit exponentiell in Reaktion auf die Stufenänderung ansteigt und sich asymptotisch der Probenblockendtemperatur nähert. Wie vorstehend kurz erwähnt, stellt die Kurve 286 das thermische Verhalten dar, wenn die abwärts gerichtete Befestigungskraft F in 15 nicht ausreicht, um eine satt anliegende, glatte Passung zwischen dem Kegel des Probenröhrchens und der Wand 290 der Probenvertiefung zu bewirken. Im Allgemeinen wird das thermische Verhalten der Kurve 286 resultieren, wenn die Kraft F geringer als 30 g (0,294 N) ist. Es ist zu beachten, dass, obwohl 15 eine dünne Luftschicht zwischen dem Kegel des Probenröhrchens und der Probenvertiefungswand aus Gründen der Klarheit zeigt, dies genau das Gegenteil der gewünschten Situation ist, da Luft ein guter Isolator ist und die thermische Zeitkonstante des Systems wesentlich erhöhen würde.
Die thermische Zeitkonstante τ ist analog der RC-Zeitkonstante in einer RC-Reihenschaltung, wobei R dem thermischen Widerstand zwischen der Wand der Probenvertiefung und der Probenflüssigkeit entspricht und C die Wärmekapazität der Probenflüssigkeit ist. Der thermische Widerstand entspricht dem inversen Wärmeleitwert, der in den Einheiten Watt-Sekunden pro Grad Kelvin ausgedrückt ist.
Aufgrund der in der Probenflüssigkeit in 15 gezeigten Konvektionsströme 292 befindet sich die Probenflüssigkeit überall in dem Reaktionsgemisch auf nahezu der gleichen Temperatur; und der Wärmefluss zwischen dem Block und der Probe ist nahezu proportional zur Differenz in der Temperatur zwischen dem Probenblock und dem Probenreaktionsgemisch. Die Proportionalitätskonstante ist der Wärmeleitwert zwischen der Wand der Probenvertiefung im Probenblock 12 und dem Reaktionsgemisch. Für unterschiedliche Probenvolumina oder unterschiedliche Röhrchen, d. h., unterschiedlichen Wandstärken oder -materialien, wird die thermische Zeitkonstante unterschiedlich sein. In einem solchen Fall kann der Benutzer als Teil seiner Spezifikation des PCR-Protokolls das Probenvolumen oder den Röhrchentyp eingeben und der Rechner wird automatisch die richtige thermische Zeitkonstante für die Verwendung bei der Berechnung der Probentemperatur nachschlagen. In einigen Ausführungsformen kann der Benutzer die tatsächliche Zeitkonstante eingeben und der Rechner wird diese zur Temperaturberechnung der Probentemperatur verwenden.
Um die thermische Zeitkonstante so gering wie möglich zu halten, sollten die konischen Wände des Probenröhrchens so dünn wie möglich sein. In der bevorzugten Ausführungsform sind diese konischen Wände 0,229 mm (0,009 Inch) dick, wohingegen die Wände des zylindrischen Abschnitts des Probenröhrchens 0,762 mm (0,030 Inch) dick sind. Die konische Form des Probenröhrchens stellt eine relativ große Mantelfläche des Kontakts mit dem Metall der Probenvertiefungswand im Verhältnis zum Volumen des Probengemisches bereit.
Das Spritzgießen der Probenröhrchen wird unter Verwendung eines "Kaltkanal"-("cold runner")Systems und eines Spritzgießwerkzeugs mit vier Kavitäten durchgeführt, so dass vier Probenröhrchen bei jeder Einspritzung spritzgegossen werden. Der geschmolzene Kunststoff wird an der Spitze des Probenröhrchenkegels eingespritzt, so dass jedweder Kunststoffrest in den Hohlraum 291 zwischen der Spitze des Probenröhrchens und der Spitze der Probenvertiefung hineinragen wird. Dies verhindert, dass irgendein Rest- die glatte Passung zwischen den Röhrchen und der Vertiefung stört. Ein maximaler Grenzwert von 0,762 mm (0,030 Inch) wird für die Länge irgendeines Kunststoffrestes bestimmt.
In verschiedenen Ausführungsformen können drei unterschiedliche Klassen von Polypropylen, jeweils mit unterschiedlichen Vorteilen, verwendet werden. Das bevorzugte Polypropylen ist PD701 von Himont, da dieses autoklavierbar ist. Dieser Kunststoff ist jedoch schwer spritzgießbar, da jener einen niedrigen Schmelzindex aufweist. Dieser Kunststoff weist einen Schmelzindex von 35 und eine molekulare Dichte von 9 auf. PD701 neigt dazu, einen Gussgrat zurückzulassen und erzeugt Teile von auf gewisse Weise fleckiger Qualität, würde jedoch besser funktionieren, wenn dieses in den dickwandigen Teil des Spritzgießwerkzeugs statt an der Spitze des konischen Abschnitts, wie dies momentan durchgeführt wird, eingespritzt werden würde. Im Allgemeinen ist es wünschenswert, einen großen Schmelzindex für eine leichte Spritzgießbarkeit zu haben, jedoch auch eine große molekulare Dichte, um eine gute Festigkeit zu erhalten und um die Haarrissbildung oder Brüche unter der thermischen Beanspruchung des Autoklavierprozesses bei 127°C (260°F) zu verhindern. Ein weiterer Kunststoff, PPW 1780 von American Hoescht, weist einen Schmelzindex von 75 und eine molekulare Dichte von 9 auf und ist autoklavierbar. Ein weiterer Kunststoff, der in einigen Ausführungsformen verwendet werden kann, ist Himont 444. Dieser Kunststoff ist nicht autoklavierbar und muss auf andere Art und Weise sterilisiert werden.
In alternativen Ausführungsformen können die Röhrchen unter Verwendung eines "Heißkanal"-("hot runner") oder "Heißdüsen"-("hot nozzle")Systems spritzgegossen werden, wobei die Temperatur des geschmolzenen Kunststoffs gerade bis zum Eingusskanal des Spritzgießwerkzeugs geregelt wird. Ferner können in einigen Ausführungsformen mehrere Eingusskanäle verwendet werden. Keine dieser Techniken hat sich jedoch experimentell zum Zeitpunkt der Anmeldung als besser als das momentan verwendete "Kaltkanal"-System erwiesen.
Die Tatsache, dass das System thermisch wie ein RC-Schaltkreis mit einer einzelnen Zeitkonstante wirkt, ist ein wichtiges Ergebnis, da es bedeutet, dass dann, wenn der Wärmeleitwert vom Probenblock zum Probenreaktionsgemisch bekannt und gleichförmig ist, das thermische Verhalten des Probengemisches bekannt und gleichförmig sein wird. Da die Wärmekapazität des Probenreaktionsgemisches bekannt und konstant ist, kann die Temperatur des Probenreaktionsgemisches unter Verwendung lediglich des gemessenen Verlaufs der Blocktemperatur über der Zeit genau berechnet werden. Dies eliminiert die Notwendigkeit, die Probentemperatur zu messen, wodurch die Fehler und die mechanische Schwierigkeit, eine Sonde mit nicht-vernachlässigbarer thermisch wirksamer Masse in eine Probenvertiefung einzusetzen, um die Probentemperatur direkt zu messen, wodurch die thermisch wirksame Masse der Probe in der abgetasteten Vertiefung verändert wird, eliminiert werden.
Der Algorithmus, der diese Berechnung durchführt, modelliert das thermische Verhalten des Systems nach einer elektrischen RC-Reihenschaltung mit einer einzigen Zeitkonstante. Dieses Modell verwendet das Verhältnis der Wärmekapazität der flüssigen Probe geteilt durch den Wärmeleitwert vom Probenblock zum Probenreaktionsgemisch. Die Wärmekapazität des Probenreaktionsgemisches entspricht der spezifischen Wärmekapazität der Flüssigkeit mal der Masse der Flüssigkeit. Der thermische Widerstand entspricht eins geteilt durch den Wärmeleitwert vom Probenblock zum flüssigen Reaktionsgemisch durch die Probenröhrchenwände. Wenn dieses Verhältnis der Wärmekapazität geteilt durch den Wärmeleitwert in passenden Einheiten ausgedrückt wird, weist dieses die Dimension der Zeit auf. Für ein festes Probenvolumen und eine feste Probenzusammensetzung, wobei beide in jeder Probenvertiefung die gleichen sind, und einen festen Wärmeleitwert ist das Verhältnis auch eine Konstante für jede Probenvertiefung und wird die thermische Zeitkonstante des Systems genannt. Dies ist die Zeit, die die Probentemperatur benötigt, um in den Bereich von 36,8% der Blocktemperatur nach einer plötzlichen Stufenänderung in der Blocktemperatur zu kommen.
Es gibt ein mathematisches Theorem, das bei der Analyse von elektrischen Schaltkreisen verwendet wird, das besagt, dass es möglich ist, das Ausgangsverhalten eines Filters oder eines anderen linearen Systems zu berechnen, wenn man das Impulsverhalten des Systems kennt. Dieses Impulsverhalten ist ferner bekannt als die Übertragungsfunktion. Im Fall einer RC-Reihenschaltung ist das Impulsverhalten eine exponentielle Funktion, wie sie in 16A gezeigt ist. Die zum Verhalten von 16A führende Impulsanregung ist wie in 16B gezeigt. Das vorstehend erwähnte mathematische Theorem besagt, dass das Aus gangsverhalten eines solchen linearen Systems durch Berechnen der Faltung des Eingangssignals und einer Gewichtsfunktion ermittelt werden kann, wobei die Gewichtsfunktion das in der Zeit umgekehrte Impulsverhalten des Systems ist. Die Faltung ist sonst als laufendes gewichtetes Mittel (running weighted average) bekannt, obwohl eine Faltung ein Rechenkonzept mit unendlich kleinen Schrittweiten ist, wohingegen ein laufendes gewichtetes Mittel diskrete Schrittweiten, d. h. mehrere Abtastwerte, aufweist. Das Impulsverhalten der in 16D gezeigten RC-Reihenschaltung ist derart, dass dann, wenn die Spannung des Spannungsgenerators V plötzlich ansteigt und mit einer Spannungsspitze fällt, wie in 16B gezeigt, die Spannung am Kondensator C plötzlich zu einer Spitze bei 294 in 16A ansteigt, welcher der Spitzenspannung des in 16B gezeigten Impulses entspricht, und dann exponentiell zurück zu der stationären Spannung V₁ abklingt. Die resultierende Gewichtsfunktion ist das Impulsverhalten von 16A, das in der Zeit, wie in 16C bei 385 gezeigt, umgedreht ist.
Über 16C gelegt ist eine hypothetische Kurve 387, die einen typischen Temperaturverlauf für die Temperatur des Probenblocks 12 für eine angenäherte Stufenänderung in der Temperatur darstellt. Ebenso über 16C gelegt gezeigt sind die Zeiten von fünf Temperaturabtastperioden, bezeichnet mit T₁ bis T₅. Erfindungsgemäß wird die Probentemperatur berechnet, indem die Temperatur an jedem dieser Zeitpunkte T₁ bis T₅ mit dem Wert der Gewichtsfunktion zu diesem speziellen Zeitpunkt multipliziert wird und dann alle diese Produkte summiert und durch 5 geteilt werden. Die Tatsache, dass das thermische System wie ein linearer Schaltkreis mit einer einzigen Zeitkonstante wirkt, ist ein überraschendes Ergebnis basierend auf der Komplexität der Überlegungen zu dem thermischen Wärmetransfer für dieses komplizierte thermische System.
In einer Ausführungsform wird die Berechnung der Probentemperatur durch eine kurze Verzögerung eingestellt, um die Transportverzögerung zu berücksichtigen, die durch unter schiedliche thermische Weglängen zum Blocktemperatursensor und der Probenflüssigkeit verursacht wird. Die berechnete Probentemperatur wird zur Information des Benutzers auf der in 1 gezeigten Bedienkonsole 16 angezeigt.
17 zeigt die Ergebnisse des Temperaturverhaltens für sechs unterschiedliche Vertiefungen, die über den 96-Vertiefungen-Probenblock verteilt sind, für eine Stufenänderung in der Probenblocktemperatur von einer relativ niedrigen Temperatur im Hybridisierungs-/Verlängerungstemperaturbereich zu der relativ hohen Temperatur von ungefähr 94°C, die für die Denaturierung verwendet wird. Der Graph von 17 zeigt eine gute Übereinstimmung zwischen dem vorhergesagten exponentiellen Anstieg in der Probentemperatur, wenn das System vollkommen analog zu der in 16D gezeigten RC-Reihenschaltung wäre, und zeigt ferner eine ausgezeichnete Gleichförmigkeit des Temperaturverhaltens dadurch, dass die Temperaturen der für diese Untersuchung verwendeten sechs Probenvertiefungen asymptotisch bei Temperaturen ausschwingen, die sehr nahe beieinander und in einem Denaturierungstemperatur-"Toleranz"-Band, das ungefähr 0,5°C breit ist, liegen.
In einer Ausführungsform können die zehn jüngsten Blocktemperatur-Abtastwerte für das laufende gewichtete Mittel verwendet werden, jedoch kann in anderen Ausführungsformen eine unterschiedliche Anzahl von Temperaturverlauf-Abtastwerten verwendet werden. Die gute Übereinstimmung mit den theoretisch vorhergesagten Ergebnissen rührt von der Tatsache her, dass die thermischen Konvektionsströme die Probenflüssigkeiten gut durchmischen, wodurch bewirkt wird, dass das System auf eine lineare Art und Weise wirkt.
Die Gleichförmigkeit zwischen den Probentemperaturen in verschiedenen Probenvertiefungen, die über die 96 Vertiefungen-Gruppierung verteilt sind, resultiert aus dem/der dynamischen und statischen lokalen Ausgleich und lokalen Symmetrie in der Probenblockstruktur sowie aus allen anderen hierin ausführlich beschriebenen thermischen Gestaltungsfaktoren. Es ist jedoch zu beachten, dass während schneller Temperaturänderungen alle Probenvertiefungen Temperaturen innerhalb von 0,5°C voneinander lediglich dann haben, wenn der Benutzer jede Probenvertiefung mit der gleichen Masse an Probenflüssigkeit sorgfältig befüllt hat. Eine Ungleichheit der Masse in verschiedenen Vertiefungen bewirkt keine unterschiedlichen Temperaturen bei stationären, unveränderlichen Bedingungen, lediglich während schneller Änderungen. Die Masse der Probenflüssigkeit in jeder Vertiefung ist der maßgebliche Faktor beim Bestimmen der Wärmekapazität jeder Probe und ist daher der maßgebliche Faktor in der thermischen Zeitkonstante für diese spezielle Probenvertiefung.
Es ist zu beachten, dass die Fähigkeit, zu bewirken, dass die Probenflüssigkeit in allen Probenvertiefungen die Temperatur in Einklang zyklisch auf und ab durchläuft, und bei sehr nahe beieinander liegenden Solltemperaturen stabilisiert, d. h. in Toleranzbändern, die lediglich 0,5°C breit sind, auch von der Kraft F in 15 abhängt. Diese Kraft muss eine minimale Schwellenkraft überschreiten, bevor die thermischen Zeitkonstanten aller mit ähnlichen Massen an Probenflüssigkeit befüllten Probenvertiefungen die gleiche Zeitkonstante aufweisen werden. Diese minimale Schwellenkraft ist experimentell als 30 g (0,29 N) für die hierin beschriebene Konfiguration des Probenröhrchens und der Probenvertiefung ermittelt worden. Für ein größeres Genauigkeitsniveau sollte die minimale Schwellenkraft F in 15 bei wenigstens 50 g (0,49 N) eingerichtet sein und vorzugsweise bei 100 g (0,98 N) für eine zusätzliche Sicherheitsreserve, wie vorstehend beschrieben.
Die Bedeutung der thermischen Gleichförmigkeit in der Probenvertiefungstemperatur lässt sich unter Bezugnahme auf 18 erkennen. Diese Figur zeigt die Beziehung zwischen der Menge an erzeugter DNA in einem PCR-Zyklus und der tatsächlichen Probentemperatur während des Denaturierungsintervalls für ein Beispiel der Amplifikation eines bestimmten DNA-Segments. Die Steigung der Funktion 298 zwischen den Temperaturen 93 und 95°C beträgt etwa 8% pro Grad Celsius für dieses spezielle DNA-Segment und Primer. 18 zeigt die allgemeine Form der Kurve, die die Menge an durch Amplifikation erzeugter DNA in Beziehung bringt, jedoch variieren die Einzelheiten der Form der Kure mit jedem unterschiedlichen Fall von Primern und DNA-Ziel. Temperaturen für eine Denaturierung oberhalb von 97°C sind im Allgemeinen zu heiß und führen zu einer abnehmenden Amplifikation für eine ansteigende Denaturierungstemperatur. Temperaturen zwischen 95 und 97°C sind im Allgemeinen gerade richtig.
18 stellt dar, dass jedwede diese spezielle DNA-Ziel- und Primer-Kombination enthaltende Probenvertiefung, die bei einer Denaturierungstemperatur von ungefähr 93°C stabilisiert, wahrscheinlich 8% weniger DNA über den Verlauf eines typischen PCR-Protokolls erzeugt als bei 94°C denaturierte Vertiefungen. Ebenso erzeugen Probenflüssigkeiten dieses Gemisches, die bei Denaturierungstemperaturen von 95°C stabilisieren, wahrscheinlich 8% mehr DNA darin, als in Probenvertiefungen erzeugt wird, die bei Denaturierungstemperaturen von 94°C stabilisieren. Da alle Kurven dieser Art die gleiche allgemeine Form aufweisen, ist es wichtig, eine Gleichförmigkeit in der Probentemperatur zu haben.
Die wie vorstehend beschrieben berechneten Probentemperaturen werden durch den Steueralgorithmus zum Steuern der Heizgeräte und des Flusses durch die Rampenkühlungskanäle verwendet und, um zu ermitteln, wie lange die Proben bei verschiedenen Solltempera turen gehalten worden sind. Der Steueralgorithmus verwendet diese Zeiten für den Vergleich mit den gewünschten Zeiten für jede Inkubationsperiode, wie sie durch den Benutzer eingegeben ist. Stimmen diese Zeiten überein, nimmt der Steueralgorithmus die geeigneten Schritte vor, um den Probenblock hin zu der durch den Benutzer für die nächste Inkubation definierten Solltemperatur zu heizen oder zu kühlen.
Liegt die berechnete Probentemperatur innerhalb von 1°C vom Sollwert, d. h., der vom Benutzer programmierten Inkubationstemperatur, veranlasst das Steuerprogramm einen Zeitgeber, zu starten. Dieser Zeitgeber kann voreingestellt sein, um von einer eingestellten Zahl herunterzuzählen, um so die Zeitbegrenzung für das vorn Benutzer für die durchzuführende Inkubation spezifizierte Intervall auszulösen. Der Zeitgeber beginnt mit dem Herunterzählen von der voreingestellten Zahl, wenn die berechnete Probentemperatur innerhalb von 1°C liegt. Wenn der Zeitgeber einen Null-Zählerstand erreicht, wird ein Signal aktiviert, das die CPU veranlasst, Handlungen vorzunehmen, um das nächste Segment des PCR-Protokolls auszuführen. Jeder Weg, um das spezifizierte Intervall zeitlich einzurichten, wird für die Zwecke des Durchführens der Erfindung ausreichen.
Typischerweise liegt das Toleranzband um jedwede spezielle Solltemperatur bei plus oder minus 0,5°C. Sobald die Solltemperatur erreicht ist, hält der Rechner den Probenblock bei dieser Solltemperatur unter Verwendung der Vorkühlungskanäle und des Filmheizgeräts, so dass alle Proben nahe an der Solltemperatur für das spezifizierte Intervall bleiben.
Damit des hierin beschriebene thermische System gut funktioniert, muss der Wärmeleitwert vom Probenblock zu jeder Probe bekannt und innerhalb einer sehr engen Toleranz gleichförmig sein. Andernfalls werden nicht alle Proben innerhalb des spezifizierten Toleranzbandes der Solltemperatur gehalten werden, wenn der Zeitgeber beginnt, und nicht alle Proben werden die gleichen Inkubationsintervalle bei der Solltemperatur erfahren.
Außerdem müssen, damit dieses thermische System gut funktioniert, alle Probenröhrchen von Variablen in der Umgebung isoliert werden. Das heißt, es ist nicht wünschenswert, dass einige Probenröhrchen durch Luftströmungen gekühlt werden, während andere Probenröhrchen in unterschiedlichen physikalischen Positionen nicht die gleichen Kühlwirkungen erfahren. Für eine gute Gleichförmigkeit ist es äußerst wünschenswert, dass die Temperaturen aller Proben durch die Temperatur des Probenblocks und durch nichts anderes ermittelt werden.
Die Isolierung der Röhrchen von der Umgebung und die Aufbringung der minimalen, auf die Probenröhrchen niederdrückenden Schwellenkraft F wird durch eine beheizte Abdeckung über dem Probenröhrchen und dem Probenblock erreicht.
Selbst wenn sich die Probenflüssigkeit in einem fest gedeckelten Probenröhrchen befindet, welches in einem temperaturgeregelten Metallblock fest gepresst ist, mit einer Meniskusvertiefung (meniscus well) unterhalb der Oberfläche des temperaturgeregelten Metallblocks, verlieren die Proben dennoch ihre Wärme nach oben durch Konvektion. Bezeichnenderweise kann die Probenflüssigkeit durch Rückfluss von Wasserdampf eine sehr beträchtliche Wärmemenge verlieren, wenn die Probe sehr heiß ist (die Denaturierungstemperatur liegt typischerweise nahe dem Siedepunkt der Probenflüssigkeit). Bei diesem Prozess verdampft Wasser von der Oberfläche der heißen Probenflüssigkeit und kondensiert an den inneren Wänden der Kappe und den kühleren oberen Teilen des Probenröhrchens oberhalb der Oberseite des Probenblocks. Wenn das Probenvolumen relativ groß ist, dauert die Kondensation an und Kondensat bildet sich und läuft zurück an den Wänden des Probenröhrchens hinunter in des Reaktionsgemisch. Dieser "Rückfluss"-Prozess trägt etwa 2300 Joule Wärme pro Gramm des zurückgeflossenen Wassers. Dieser Prozess kann ein Absinken von einigen Grad in der Oberflächentemperatur eines 100-μl-Reaktionsgemisches verursachen, wodurch eine große Verminderung der Wirksamkeit der Reaktion verursacht wird.
Wenn das Probengemisch klein ist, angenommen 20 μl, und das Probenröhrchen einen relativ großen Oberflächenbereich oberhalb der Oberseite des Probenblocks aufweist, kann ein beträchtlicher Bruchteil des Wassers im Reaktionsgemisch verdampfen. Dieses Wasser kann sodann innerhalb des oberen Teils des Probenröhrchens kondensieren und verbleibt dort durch Oberflächenspannung während des Rests des Hochtemperaturteils des Zyklus. Dies kann das verbleibende Reaktionsgemisch so konzentrieren, dass die Reaktion beeinträchtigt wird oder vollständig ausbleibt.
Bei den bekannten PCR-Thermocyclern wurde dieses Rückflussproblem umgangen, indem das Reaktionsgemisch mit einer Schicht von Öl oder geschmolzenem Wachs bedeckt wurde. Diese unvermischbare Schicht von Öl oder Wachs schwamm auf dem wässrigen Reaktionsgemisch und verhinderte schnelle Verdampfung. Es war jedoch mühsam, das Öl zuzugeben, was die Verarbeitungskosten erhöhte. Ferner störte die Anwesenheit von Öl spätere Schritte der Verarbeitung und Analyse und schuf eine Möglichkeit der Kontaminierung der Probe. Tatsächlich ist bekannt, dass industrielle Standardmineralöle in der Vergangenheit Proben durch unerkannte Anwesenheit von Kontaminierungsfaktoren im Öl kontaminiert haben, welche den Benutzern unbekannt waren.
Die Notwendigkeit für eine Ölüberlagerung ist eliminiert und die Probleme des Wärmeverlusts und der Konzentration des Reaktionsgemisch durch Verdampfung und unvorhersehbare, durch Rückfluss verursachte Wärmewirkungen werden gemäß den Lehren der Erfindung vermieden, indem das Volumen oberhalb des Probenblocks, in welches die oberen Teile der Probenröhrchen hineinragen, eingeschlossen wird, und indem dieses Volumen von oben durch eine beheizte Abdeckung, die nachstehend manchmal auch (die) Platte genannt wird, beheizt wird.
Bezugnehmend auf 19 ist dort eine Querschnittsansicht der Struktur gezeigt, die zum Einschließen der Probenröhrchen verwendet wird und zum Aufbringen einer Abwärtskraft auf diese, um so die minimale Schwellenkraft F in 15 zu liefern. Eine beheizte Platte 14 ist an eine Leitspindel 312 gekoppelt, um sich so mit Drehung der Leitspindel 312 aufwärts und abwärts entlang der durch Pfeil 314 gekennzeichneten Achse zu bewegen. Die Leitspindel ist durch eine Öffnung in einer Gleitabdeckung 316 gewindet und wird mittels eines Knaufs 318 gedreht. Die Platte 314 wird mittels durch den Rechner 20 gesteuerter Widerstandsheizgeräte (nicht gezeigt) auf eine Temperatur oberhalb des Siedepunkts von Wasser erhitzt.
Die Gleitabdeckung 316 gleitet entlang der Y-Achse auf Schienen 320 und 322 hin und her. Die Abdeckung 316 schließt senkrechte Seiten 317 und 319 ein, und schließt ebenfalls senkrechte Seiten parallel zur X-Z-Ebene (nicht gezeigt) ein, welche den Probenblock 12 und die Probenröhrchen umschließen. Diese Struktur verhindert im Wesentlichen, dass Luftströmungen auf die Probenröhrchen, von denen die Röhrchen 324 und 326 typisch sind, einwirken.
20 ist eine perspektivische Ansicht der Gleitabdeckung 316 und des Probenblocks 12 mit der sich in zurückgezogener Stellung befindlichen Gleitabdeckung, um den Zugriff auf den Probenblock zu gestatten. Die Gleitabdeckung 316 gleicht dem Deckel einer rechtwinkligen Kiste mit einer senkrechten Wand 328, die einen Abschnitt 330 aufweist, der entfernt ist, um es der Gleitabdeckung 316 zu erlauben, über den Probenblock 12 zu gleiten. Die Gleitabdeckung wird entlang der Y-Achse in 20 bewegt, bis die Abdeckung über dem Probenblock 12 zentriert ist. Der Benutzer dreht sodann den Knauf 318 in eine Richtung, um die beheizte Platte 14 abzusenken, bis eine Markierung 323 am Knauf 318 auf einer Linie mit einer Markierung 334 an einer Abdeckungsplatte (escutcheon plate) 336 liegt. In einigen Ausführungsformen kann die Abdeckungsplatte 336 dauerhaft an der Oberseite der Gleitabdeckung 316 befestigt sein. In anderen Ausführungsformen kann die Abdeckung 336 dreh bar sein, so dass die Indexmarkierung 334 in verschiedene Stellungen gebracht werden kann, wenn verschieden große Probenröhrchen verwendet werden. Mit anderen Worten, wenn größere Probenröhrchen verwendet werden, muss die beheizte Platte 14 nicht so weit abgesenkt werden, um die minimale Schwellenkraft F in 15 aufzubringen. Bei Gebrauch schraubt der Benutzer die Schraube 318, um die Platte 14 abzusenken, bis die Indexmarkierungen auf einer Linie liegen. Der Benutzer weiß dann, dass die minimale Schwellenkraft F auf jedes Probenröhrchen aufgebracht wird.
Gemeinsam auf die 15 und 19 Bezug nehmend, steht vor dem Absenken der beheizten Platte 14 in 19 die Kunststoffkappe 338 für jedes Probenröhrchen etwa 0,5 mm über das Niveau der oberen Enden der Wände des Kunststoffeinsatzes 340 (19) hervor, welcher alle Probenröhrchen in einer losen 8 × 12-Gruppierung auf 9-mm-Mittelpunkten hält. Die Gruppierung von Probenvertiefungen kann bis zu 96 MicroAmp^TM-PCR-Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 100 μl oder 48 größere GeneAmp^TM-Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml halten. Die Einzelheiten dieses Einsatzes werden nachstehend detaillierter diskutiert. Der Einsatz 340 hat eine ebene Fläche mit einer 8 × 12-Gruppierung von Ausnehmungen für Probenröhrchen. Diese ebene Fläche ist in den 15 und 19 als eine horizontale Linie gezeigt, die die Probenröhrchen 324 und 326 in 19 schneidet. Der Einsatz 340 weist ferner vier senkrechte Wände auf, von denen zwei bei 342 und 344 in 19 gezeigt sind. Das bei 346 in 19 gezeigte obere Niveau dieser senkrechten Wände begründet eine rechtwinklige Kiste, welche eine Bezugsebene definiert.
Wie am besten aus 15 zu ersehen ist, stehen die Kappen 338 für alle Probenröhrchen über diese Bezugsebene 346 um einen gewissen geringen Betrag hervor, welcher ausgelegt ist, um es den Kappen 338 zu erlauben, durch die beheizte Platte 14 erweicht und deformiert zu werden und auf das Niveau der Bezugsebene 346 "zusammengequetscht" zu werden. Bei der bevorzugten Ausführungsform wird die beheizte Platte 14 bei einer Temperatur von 105°C durch die CPU 20 in 1 und den Bus 22, der mit den Widerstandsheizgeräten (nicht gezeigt) in der Platte 14 gekoppelt ist, gehalten. In der bevorzugten Ausführungsform werden der Knauf 318 in 19 und die Leitspindel 312 gedreht, bis die beheizte Platte 14 auf die Oberseiten der Kappen 338 herabkommt und mit diesen einen Kontakt herstellt, in der bevorzugten Ausführungsform sind die Kappen 338 für die Probenröhrchen aus Polypropylen hergestellt. Diese Kappen erweichen kurz nachdem sie in Kontakt mit der beheizten Platte gelangen. Sobald die Kappen erweichen, verformen sie sich, verlieren jedoch nicht ihre ganze Elastizität. Nach dem Berühren der Kappen wird die beheizte Platte weiter abgesenkt, bis sie auf der Bezugsebene 346 ruht. Dieses weitere Absenken deformiert die Kappen 338 und bewirkt, dass eine minimale Schwellenkraft F von wenigstens 50 g (0,49 N) auf jedes Probenröhrchen herabdrückt, um jedes Röhrchen gut sitzend fest in seiner Probenvertiefung zu halten. Der Betrag, um den die Kappen 338 über die Bezugsebene 346 hervorstehen, und der Betrag der Verformung und Restelastizität, wenn die erwärmte Platte 14 auf der Bezugsebene 346 ruht, ist derart ausgelegt, dass eine minimale Schwellenkraft F von wenigstens 50 g (0,49 N) und vorzugsweise 100 g (0,98 N) für alle Probenröhrchen, die dann vorhanden sind, erreicht wird, nachdem die beheizte Platte 14 auf das Niveau der Bezugsebene 346 herabgekommen ist.
Die beheizte Platte 14 und die vier senkrechten Wände und die ebene Fläche des Einsatzes 340 bilden eine beheizte, abgedichtete Kammer aus, wenn sich die Platte 14 in Kontakt mit der oberen Kante 346 des Einsatzes befindet. Der Kunststoff des Einsatzes 340 weist ein relativ schlechtes Wärmeleitvermögen auf. Es wurde experimentell herausgefunden, dass des in-Kontakt-Gelangen der beheizten Platte 14 mit den Kappen 338 und die Isolierung des Abschnitts der Probenröhrchen 288, der über die obere Ebene 280 des Probenblocks 12 hervorsteht, mittels einer Wand aus einem Material, das eine relativ schlechte Wärmeleitfähigkeit aufweist, eine vorteilhafte Konsequenz hat. Mit dieser Struktur wird der gesamte obere Teil des Röhrchens und der Kappe auf eine Temperatur gebracht, die hoch genug ist, dass sich wenig oder keine Kondensation auf den Innenflächen des Röhrchens und der Kappe bildet, da die beheizte Platte bei einer Temperatur oberhalb des Siedepunkts von Wasser gehalten wird. Dies gilt sogar dann, wenn die Probenflüssigkeit 276 in 15 auf eine Temperatur nahe ihrem Siedepunkt erhitzt wird. Dies eliminiert die Notwendigkeit für eine Schicht aus unmischbarem Material wie Öl oder Wachs, das auf der Oberfläche des Probengemisches 276 schwimmt, wodurch der Arbeitsaufwand, der mit einer PCR-Reaktion verbunden ist, reduziert und eine Quelle möglicher Kontamination der Probe eliminiert wird.
Es wurde experimentell herausgefunden, dass trotz der sehr hohen Temperatur der beheizten Abdeckung und ihrer engen Nähe zum Probenblock 12 dies wenig Einfluss auf die Fähigkeit des Probenblocks 12 hat, genau und rasch einen Zyklus zwischen hohen und niedrigen Temperaturen zu durchlaufen.
Die beheizte Platte 14 verhindert das Abkühlen der Proben durch den vorstehend erwähnten Rückflussprozess, da sie die Temperatur der Kappen oberhalb des Kondensationspunkts des Wassers hält, wodurch die Innenflächen der Kappen trockengehalten werden. Dies verhindert ferner die Ausbildung von Aerosolen, wenn die Kappen von den Röhrchen entfernt werden.
In alternativen Ausführungsformen wird jedwedes Mittel, durch das die minimale annehmbare Abwärtskraft F in 15 auf jedes einzelne Probenröhrchen unabhängig von der Anzahl der vorliegenden Probenröhrchen aufgebracht werden kann und das Kondensation und Rückfluss und Konvektionskühlung verhindert, für die Zwecke des Durchführens der Erfindung ausreichen. Die Aufbringung dieser Abwärtskraft F und die Anwendung von Wärme, um Rückfluss und ungewünschte Probenflüssigkeitskonzentrierung zu verhindern, müssen nicht beide durch das gleiche System umgesetzt werden, wie dies in der bevorzugten Ausführungsform geschehen ist.
Die Probenröhrchen können über einige Tausendstel Inch in ihrer Gesamthöhe variieren. Weiterhin können die Kappen für die Probenröhrchen ebenso in der Höhe über einige Tausendstel Inch variieren. Ebenso kann jede konische Probenvertiefung im Probenblock 12 nicht auf genau die gleiche Tiefe ausgebohrt sein und jede konische Probenvertiefung im Probenblock kann auf einen leicht unterschiedlichen Durchmesser und Winkel ausgebohrt sein. Folglich werden die Oberseiten der Kappen nicht alle notwendigerweise auf der gleichen Höhe liegen, wenn eine Gesamtzahl von mit Kappen versehenen Röhrchen im Probenblock angeordnet werden, damit diese in die entsprechende Probenvertiefung eingesetzt werden. Die Diskrepanz für diese Höhe könnte im ungünstigsten Fall soviel wie 0,5 mm vom höchsten bis zum niedrigsten Röhrchen betragen.
Wenn eine vollkommen flache, nicht beheizte Platte 14 so angebracht wird, dass sie selbständig ihre eigene Stellung findet, an welcher sie auf eine solche Gruppierung von Kappen herabgedrückt wird, würde sie zuerst die drei längsten Röhrchen berühren. Sobald weiterer Druck aufgebracht wird und die längsten Röhrchen etwas zusammengedrückt werden, würde die Platte anfangen, einige Kappen von niedrigeren Röhrchen zu berühren. Es besteht eine offensichtliche Möglichkeit, dass die längsten Röhrchen beschädigt werden würden, bevor die kürzesten Röhrchen überhaupt kontaktiert werden, es sei denn, die Röhrchen- und Kappenanordnungen würden nachgeben. Alternativ könnte die Kraft, die notwendig ist, um alle langen Röhrchen ausreichend zusammenzudrücken, um das kürzeste Röhrchen zu berühren, für die Aufbringung durch die Vorrichtung zu groß sein. In jedem Fall könnten ein oder mehrere kurze Röhrchen überhaupt nicht herabgedrückt werden oder könnten mit einem Kraftbetrag heruntergedrückt werden, der nicht genügt, um sicherzustellen, dass die thermische Zeitkonstante für jenes Röhrchen der thermischen Zeitkonstante für alle anderen Röhrchen entspricht. Dies würde verhindern, den gleichen PCR-Zyklus für alle Röhrchen im Probenblock zu erreichen, da einige Röhrchen mit unterschiedlichen thermischen Zeitkonstanten nicht gleichlaufend mit den anderen Röhrchen wären. Das Heizen der Platte und Erweichen der Kappen eliminiert diese Risiken durch Eliminieren der Fertigungstoleranzfehler, die zu abweichenden Röhrchenhöhen als einem Faktor führen.
In einer alternativen Ausführungsform ist die gesamte beheizte Platte 14 mit einer nachgiebigen Gummischicht bedeckt. Eine nachgiebige Gummischicht auf der beheizten Platte würde das Höhentoleranzproblem lösen, würde jedoch auch als eine Wärmeisolationsschicht wirken, die den Wärmefluss von der beheizten Platte zu den Röhrchenkappen verzögern würde. Überdies, und zwar bei langem Gebrauch bei hohen Temperaturen, verschlechtern sich die meisten Gummimaterialien oder werden hart. Es ist daher wünschenswert, dass die Fläche der beheizten Platte ein Metall und ein guter Wärmeleiter ist.
In einer alternativen Ausführungsform könnten 96 einzelne Federn auf der Platte angebracht werden, so dass jede Feder einzeln auf ein einzelnes Probenröhrchen herabdrückt. Dies ist jedoch eine komplexe und kostspielige Lösung und sie erfordert, dass die Platte über der Röhrchengruppierung mit einer mechanischen Präzision ausgerichtet wird, die schwierig oder mühsam zu erreichen wäre.
Für die notwendige einzelne Nachgiebigkeit für jedes Probenröhrchen in der bevorzugten Ausführungsform wird durch die Verwendung von Kunststoffkappen gesorgt, welche auf vorbestimmte Weise unter der Kraft der Platte zusammenfallen, die jedoch sogar, wenn diese zusammengefallen sind, noch eine Abwärtskraft F auf die Probenröhrchen ausüben, die ausreichend ist, um jedes Probenröhrchen festsitzend in seiner Vertiefung zu halten.
In der in 15 gezeigten Probenröhrchenkappe 338 sollte die Oberfläche 350 frei von Kerben, Graten und Einschnitten sein, so dass diese eine hermetische Abdichtung mit den Innenwänden 352 des Probenröhrchens 288 bereitstellen kann. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Material für die Kappe Polypropylen. Ein geeignetes Material könnte Valtec HH-444- oder PD701-Polypropylen sein, das, wie vorstehend beschrieben, von Himont hergestellt wird, oder PPW 1780 von American Hoescht. In der bevorzugten Ausführungsform liegt die Wandstärke für den gewölbten Abschnitt der Kappe bei 3,302 + 0,000 – 0,013 mm (0,130 + 0,000 – 0,005 Inch). Die Dicke des Absatzabschnitts 355 liegt bei 0,635 mm (0,025 Inch) und die Weite des kuppelförmigen Abschnitts der Kappe liegt bei 5,155 mm (0,203 Inch) in der bevorzugten Ausführungsform.
Jedwedes Material und jedwede Konfiguration für die Kappen, die bewirken, dass die minimale Schwellenkraft F in 15 auf alle Probenröhrchen aufgebracht wird, und die erlauben, dass die Kappe und die oberen Abschnitte der Probenröhrchen auf eine Temperatur erwärmt werden, die hoch genug ist, um Kondensation und Rückfluss zu verhindern, reicht für die Zwecke des Durchführens der Erfindung aus. Die kuppelförmige Kappa 338 weist eine dünne Wand auf, um die Verformung der Kappe zu unterstützen. Da die beheizte Platte auf einer hohen Temperatur gehalten wird, kann die Wanddicke der kuppelförmigen Kappe dick genug sein, um auf einfache Weise durch Spritzgießen hergestellt zu werden, da die notwendige Nachgiebigkeit, die den Unterschieden in der Röhrchenhöhe Rechnung trägt, bei Raumtemperatur nicht notwendig ist.
Die Platte kann bei einer Temperatur gehalten werden, die erfindungsgemäß irgendwo zwischen 94°C und 110°C liegt, obwohl der Bereich von 100°C bis 110°C bevorzugt ist, um Rückfluss zu verhindern, da der Siedepunkt von Wasser bei 100°C liegt.
Man hat experimentell herausgefunden, dass die Kappen in diesem Temperaturbereich gerade genug erweichen, um soviel wie 1 mm leicht zusammenzufallen, Studien haben gezeigt, dass die elastischen Eigenschaften des verwendeten Polypropylens derart sind, dass sogar bei diesen Temperaturen das Zusammenfallen nicht vollkommen unelastisch ist. Das heißt, dass das Material der Kappen, obwohl die beheizte Platte eine ständige Verformung der Kappen bewirkt, dennoch einen durchaus wesentlichen Bruchteil seines Raumtemperatur-Elastizitätsmoduls beibehält, so dass die minimale Schwellenkraft F auf jedes Probenröhrchen aufgebracht wird. Ferner macht die beheizte Platte alle Kappen, welche sie ohne übermäßige Kraft berührt, aufgrund des Erweichens der Kappe bündig, ungeachtet dessen, wie viele Röhrchen im Probenblock vorliegen.
Da die Kappentemperatur während des gesamten PCR-Zyklus oberhalb des Siedepunkts von Wasser liegt, bleiben die Innenflächen jeder Kappe vollkommen trocken. Somit besteht keine Möglichkeit, dass am Ende des PCR-Verfahrens, wenn die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, bevor sie aus dem Probenblock entfernt werden, wenn die Kappen auf jedem Probenröhrchen geöffnet werden, ein Aerosolspray des Probenrörhrcheninhalts erzeugt wird, das zu einer Kreuzkontaminierung führen könnte. Dies ist deshalb so, weil sich keine Flüssigkeit an der Kappe-zu-Röhrchen-Dichtung befindet, wenn die Dichtung unterbrochen wird.
Dies ist äußerst vorteilhaft, da winzige Aerosolpartikel, die amplifizierte Produkt-DNA enthalten, ein Labor kontaminieren und in Probenröhrchen gelangen können, die Proben von anderen Quellen, wie beispielsweise von anderen Patienten, enthalten, wodurch sie möglicherweise falsch positive oder negative Diagnoseergebnisse verursachen, was äußerst problematisch sein kann. Benutzer des PCR-Amplifikationsverfahrens sind extrem daran interessiert, dass keine Aerosole entstehen, die andere herzustellende Proben kontaminieren können.
Ein System von Einweg-Kunststoffteilen wird verwendet, um die einzelnen Probenröhrchen auf eine 8 × 12-Gruppierung umzusetzen, welche mit der Mikrotiter-Plattenformat-Laborausrüstung kompatibel ist, welche jedoch ausreichenden individuellen Bewegungsfreiraum behält, um Unterschiede in den verschiedenen Wärmeausdehnungsraten der Systemkomponenten zu kompensieren. Die Beziehung der thermisch nachgiebigen Kappe zum Rest dieses Systems ist am besten aus 21A zu ersehen, welche eine Querschnittsansicht des Probenblocks ist sowie zweier Probenröhrchen mit Kappen an der Verwendungsstelle, wobei die Probenröhrchen durch die Kombination einer Ausführungsform eines 96-Vertiefungen-Mikrotiter-Kunststoffeinsatzes und eines Halters an der Verwendungsstelle gehalten werden. 21B ist eine alternative bevorzugte Ausführungsform, die die Struktur und das Zusammenwirken der meisten der verschiedenen Einweg-Kunststoffteile des Systems zeigt. Der rechtwinklige 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten-Kunststoffeinsatz 342 liegt auf der Oberfläche des Probenblocks 12 auf. Die Oberkante 346 des Rahmens 342 weist eine Höhe auf, die ungefähr 0,5 mm kürzer ist als die Höhe der Kappen, von denen die Kappe 364 beispielhaft ist. Alle mit Kappen versehenen Röhrchen werden höher herausstehen als die Kante 346 des Rahmens 342. Der Rahmen 342 ist derart gestaltet, dass sich ein abwärts erstreckender Grat 366 in die Sicherheitsbandrille 78 über seine gesamte Länge erstreckt. Der Rahmen 342 weist jedoch einen Spalt (nicht gezeigt) auf, der mit dem Spalt in der Rille 78 für den in 2 in Draufsicht und in 7 in Querschnittsansicht gezeigten Temperatursensor korrespondiert.
Die vorstehend erwähnte Bezugsebene 346 wird durch das Oberteil des Rahmens 342 gebildet. Wie diese Bezugsebene mit der beheizten Platte wechselwirkt, geschieht wie folgt. Vor dem Herabschrauben des Knaufs 318 in 20, um die Indexmarkierungen 332 und 334 in eine Linie zu bringen, um einen Amplifikationsdurchlauf zu starten, wird ein Kalibrierungsverfahren durchgeführt, um die Position der Indexmarkierung auf der Abdeckungsplatte 336 in 20 zu lokalisieren. Diese Kalibrierung wird gestartet, indem der Rahmen 342 in 1 in Position auf dem Probenblock gebracht wird. Der Rahmen 342 wird jedoch leer sein oder jedwede Probenröhrchen darin werden nicht mit Kappen an der Verwendungsstelle versehen sein. Dann wird der Knauf 318 heruntergeschraubt, bis die beheizte Platte 14 fest in Kontakt mit der Oberkante 346 des Rahmens 342 um dessen gesamten Umfang ist. Wenn der Knauf 318 genügend heruntergeschraubt worden ist, um es der beheizten Platte zu gestatten, auf der Bezugsebene 346 aufzuliegen und den Rahmen 342 fest gegen die Oberseite 280 des Probenblocks zu drücken, wird die drehbare Abdeckung 336 der bevorzugten Ausführungsform gedreht, bis die Indexmarkierung 334 auf der Abdeckung auf einer Linie mit der Indexmarkierung 332 auf dem Knauf 318 liegt. Dann wird der Knauf 318 gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um die Platte 14 anzuheben, und die Abdeckung 316 in 19 wird in die negative Y-Richtung geschoben, um den Rahmen 342 und den Probenblock 12 aufzudecken. Die mit einem Probengemisch befüllten Probenröhrchen mit Kappen können dann in Position im Rahmen 342 angebracht werden. Die beheizte Abdeckung 316 wird dann zurück über dem Probenblock angebracht und der Knauf 318 wird im Uhrzeigersinn gedreht, um die beheizte Platte 14 abzusenken, bis die Indexmarkierung 332 auf dem Knauf auf einer Linie mit der Indexmarkierung 334 wie vorher positioniert liegt. Dies stellt sicher, dass alle Röhrchen mit der minimalen aufgebrachten Kraft F fest eingesetzt worden sind. Die Verwendung der Indexmarkierungen gibt dem Benutzer eine einfache, überprüfbare Aufgabe zur Durchführung.
Wenn nur wenige Probenröhrchen an der Verwendungsstelle sind, wird nur ein geringer Betrag des Drehmoments gebraucht, um die Indexmarkierungen 332 und 334 in eine Linie zu bringen. Liegen jedoch viele Röhrchen vor, wird ein größeres Drehmoment auf den Knauf 318 gebraucht, um die Indexmarkierungen in eine Linie zu bringen. Dies ist deshalb so, da jedes Röhrchen der Abwärtsbewegung der beheizten Platte 14 Widerstand entgegensetzt, wenn sich die Kappen verformen. Jedoch ist für den Benutzer sichergestellt, dass dann, wenn die Indexmarkierungen 332 und 334 in einer Linie sind, die beheizte Platte noch einmal fest gegen die Oberkante 346 des Rahmens 342 gesetzt wird und auf alle Röhrchen die minimale Schwellenkraft F aufgebracht wird. Dies stellt praktisch sicher, dass die thermische Zeitkonstante für alle Röhrchen im Wesentlichen die gleiche ist.
In alternativen Ausführungsformen kann auf die Indexmarkierungen 332 und 334 verzichtet werden und der Knauf 318 kann einfach im Uhrzeigersinn gedreht werden, bis er sich nicht mehr weiter dreht. Dieser Zustand tritt auf, wenn die beheizte Platte 14 die Oberkante oder die Bezugsebene 346 erreicht hat und der Kunststoffrahmen 342 eine weitere Abwärtsbewegung der erwärmten Platte 14 gestoppt hat. Offensichtlich hat in dieser alternativen Ausführungsform und vorzugsweise in der vorstehend beschriebenen Indexmarkierungs-Ausführungsform der Kunststoff des Rahmens 342 eine Schmelztemperatur, die ausreichend hoch ist, um eine Verformung des Kunststoffs des Rahmens 342 zu verhindern, wenn dieser in Kontakt mit der beheizten Platte 14 gerät. In der bevorzugten Ausführungsform ist der Kunststoff des Rahmens 342 Celanese Nylon 1503 mit einer Wandstärke von 1,27 mm (0,05 Inch).
Ein Vorteil des vorstehend beschriebenen Systems liegt darin, dass die Probenröhrchen mit unterschiedlichen Höhen einfach durch Verwendung von Rahmen 342 mit unterschiedlichen Höhen verwendet werden können. Der Rahmen 342 sollte eine Höhe haben, die ungefähr 0,5 mm kürzer ist als die Ebene der Spitzen der mit Kappen versehenen Röhrchen, wenn beide im Probenblock eingesetzt sind. In der bevorzugten Ausführungsform werden zwei unterschiedliche Röhrchenhöhen verwendet. Der Bewegungsbereich der Leitspindel 312, die die beheizte Platte in 19 anzieht, muss für alle unterschiedlichen Größen von zu verwendenden Probenröhrchen ausreichend sein. Natürlich müssen alle Röhrchen während eines bestimmten PCR-Verarbeitungszyklus die gleiche Höhe haben.
Das vorstehend beschriebene System stellt gleichförmige Temperaturen im Probenblock bereit, einen gleichförmigen Wärmeleitwert vom Block zur Probe sowie eine Isolierung der Probenröhrchen von den "Launen" der Umgebung. Eine beliebige Anzahl von Probenröhrchen bis zu 96 kann in dem Mikrotiterplattenformat angeordnet werden. Das System erlaubt eine genaue Temperaturregelung für eine sehr hohe Anzahl von Proben und eine Sichtanzeige der Probentemperaturen für alle Proben ohne tatsächliches Messen der Temperatur einer beliebigen Probe.
Als Behälter für PCR-Reaktionen ist es allgemein im Stand der Technik üblich, Polypropylenröhrchen zu verwenden, die ursprünglich für Mikrozentrifugen gebaut wurden. Dieses bekannte Röhrchen wies einen zylindrischen Querschnitt auf, der an der Oberseite durch einen Schnappverschluss verschlossen wurde, der eine gasdichte Abdichtung herstellte. Dieses bekannte Röhrchen wies einen Bodenabschnitt auf, welcher einen Kegelstumpf mit einem eingeschossenen Winkel von etwa 17° umfasste.
Wenn ein solches konisches Probenröhrchen in eine Probenvertiefung eines Probenblocks mit einer konischen Aushöhlung mit dem gleichen eingeschlossenen Winkel herabgedrückt wird und wenn das Probengemisch in dem Röhrchen vollständig innerhalb des konischen Volumens und unterhalb der Oberseite des Probenblocks liegt, kann der Wärmeleitwert zwischen dem Block und der Flüssigkeit hinreichend vorhersagbar für eine gute Gleichförmigkeit der Probentemperatur in der ganzen Gruppierung gemacht werden. Um eine hinreichende Kontrolle des Wärmeleitwerts zwischen dem Probenblock und dem Probengemisch zu erreichen, müssen die eingeschlossenen Winkel des konischen Röhrchens und der Probenvertiefung eng zusammenpassen und die konischen Flächen des Röhrchens und der Vertiefung müssen glatt sein und in bündiger Beziehung zusammengehalten werden. Weiterhin muss die minimale Schwellenkraft F auf jedes Röhrchen aufgebracht werden, um jedes Röhrchen fest in die Probenvertiefung zu drücken, so dass es sich nicht abhebt oder sich während des Thermozyklus aus der Vertiefung aus irgendeinem Grund löst, wie durch Dampfbildung aus eingeschlossener Flüssigkeit im Raum 291 in 15. Schließlich muss jedes Röhrchen mit der gleichen Menge an Probenflüssigkeit befüllt sein. Wenn die vorstehend aufgeführten Bedingungen erfüllt sind, wird der Wärmeleitwert zwischen dem Probenblock und der Probenflüssigkeit in jedem Röhrchen überwiegend durch die Konduktanz bzw. den Leitwert der konischen Kunststoffwand 368 in 15 und einer Grenzschicht (nicht gezeigt) der Probenflüssigkeit an der Innenfläche 370 der konischen Probenröhrchenwand bestimmt.
Der Wärmeleitwert der Kunststoffröhrchenwände ist durch ihre Dicke bestimmt, die durch das Spritzgießverfahren der Herstellung der Röhrchen genau gesteuert werden kann. Die Probenflüssigkeit in allen Probenröhrchen weist praktisch identische thermische Eigenschaften auf.
Durch Experimente und Berechnung wurde herausgefunden, dass eine spritzgegossene, einstückige 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatte nur bedingt für die PCR geeignet ist, da die Unterschiede in den thermischen Ausdehnungskoeffizienten zwischen Aluminium und Kunststoff zu Größenänderungen führen, die die Gleichförmigkeit des Wärmeleitwerts zur Probenflüssigkeit durch die Gruppierung zerstören können. Das heißt, da jede Vertiefung in solch einer einstückigen Platte mit jeder anderen Vertiefung durch die Fläche der Platte verbunden ist, werden die Abstände zwischen den Vertiefungen zum Zeitpunkt der ursprünglichen Herstellung der Platte bestimmt, jedoch verändern sie sich mit dem Verändern der Temperatur, da der Kunststoff der Platte einen signifikanten Wärmeausdehnungskoeffizienten aufweist. Außerdem sind die Abstände zwischen den Probenvertiefungen im Metall probenblock 12 von der Temperatur des Probenblocks abhängig, da Aluminium ebenfalls einen signifikanten Wärmeausdehnungskoeffizienten aufweist, der sich von dem von Kunststoff unterscheidet. Um einen guten Wärmeleitwert zu haben, müsste jede Probenvertiefung in einer einstückigen 96-Vertiefungen-Mikrotiterplatte nahezu perfekt in die entsprechende Vertiefung im Probenblock bei allen Temperaturen hineinpassen. Da sich die Temperatur des Probenblocks über einen sehr weiten Bereich von Temperaturen ändert, variieren die Abstände zwischen den Probenvertiefungen im Probenblock zyklisch während des PCR-Zyklus. Da sich die Wärmeausdehnungskoeffizienten für Kunststoff und Aluminium wesentlich unterscheiden, würden die Abstände der Vertiefungstrennung im Probenblock über Temperaturänderungen anders variieren, als es die Abstände zwischen den Probenvertie fungen einer einstückigen 96-Vertiefungen-Kunststoff-Mikrotiterplatte tun würden.
Folglich ist es als ein wichtiges Kriterium für eine perfekte Passung zwischen einem Probenröhrchen und der entsprechenden Probenvertiefung über den PCR-Temperaturbereich notwendig, dass jedes Probenröhrchen in der 96-Vertiefungen-Gruppierung einzeln frei ist sich seitlich zu bewegen, und jedes Röhrchen muss einzeln frei sein, senkrecht durch welchen auch immer notwendigen Betrag herabgedrückt zu werden, um einen bündigen Kontakt mit den Wänden der Probenvertiefung herzustellen.
Die in der Erfindung verwendeten Probenröhrchen unterscheiden sich von bekannten Mikrozentrifugenröhrchen darin, dass die Wanddicke der Kegelstumpfposition des Probenröhrchens viel dünner ist, um einen schnelleren Wärmetransfer zu und von der Probenflüssigkeit zu erlauben. Der obere Teil dieser Röhrchen weist eine stärkere Wanddicke auf als der konische Teil. In 15 ist die Wanddicke im zylindrischen Teil 288 in 15 im Wesentlichen 0,762 mm (0,030 Inch), während die Wanddicke für die konische Wand 368 0,229 mm (0,009 Inch) beträgt. Da dünne Teile im Spritzgießverfahren schneller abkühlen als dicke Teile, ist es wichtig, das Spritzgießwerkzeug zu füllen, bevor die dünnen Teile abkühlen.
Das Material des Probenröhrchens muss mit der PCR-Reaktion chemisch kompatibel sein. Glas ist kein PCR-kompatibles Material, da DNA an Glas haftet und nicht abgehen wird, was die PCR-Amplifikation stören würde. Vorzugsweise wird ein autoklavierbares Polypropylen verwendet. Drei Typen von geeignetem Polypropylen wurden vorstehend genannt. Einige Kunststoffe sind aufgrund des Ausgasens von Stoffen aus dem Kunststoff oder, da DNA an den Kunststoffwänden haftet, nicht mit dem PCR-Verfahren kompatibel. Polypropylen ist derzeit die beste bekannte Klasse von Kunststoffen.
Herkömmliche Spritzgießtechniken und Formfertigungstechniken für das Spritzgießwerkzeug reichen für die Zwecke des Ausübens der Erfindung aus.
Die Verwendung konisch geformter Probenröhrchen setzt im Wesentlichen alle Herstellungstoleranzfehler in Höhenfehler um, d. h., eine Abweichung von Röhrchen zu Röhrchen in der Höhe der Kappenspitze zum Oberteil des Probenblocks, wenn das Probenröhrchen in die Probenvertiefung eingesetzt ist. Beispielsweise wird ein Winkelfehler für den Winkel der Probenröhrchenwände umgewandelt in einen Höhenfehler, wenn das Röhrchen in den Probenblock eingebracht ist, aufgrund der Fehlanpassung zwischen dem Röhrchenwandwinkel und dem Probenvertiefungswandwinkel. Entsprechend würde ein Durchmesserfehler in den Abmessungen des Kegels ebenso in einen Höhenfehler umgesetzt werden, da der konische Teil des Röhrchens entweder tiefer oder nicht so tief wie ein korrekt dimensioniertes Röhrchen eindringen würde.
Für eine gute Gleichförmigkeit des Wärmeleitwerts über die Gruppierung muss zwischen dem Probenröhrchen und der Probenvertiefung für alle 96 Vertiefungen über den vollen Temperaturbereich von 0 bis 100°C eine gute Passung vorhanden sein, ungeachtet der Unterschiede in den Wärmeausdehnungsraten. Überdies muss jedes der 96 Probenröhrchen Wände mit Abmessungen und Wanddicken aufweisen, die zu einem sehr hohen Grad einheitlich sind. Jedes Probenröhrchen, in welchem ein Probengemisch gehalten werden soll, sollte mit einer abnehmbaren gasdichten Kappe ausgerüstet sein, die eine gasdichte Abdichtung herstellt, um den Verlust von Wasserdampf aus dem Reaktionsgemisch zu verhindern, wenn sich dieses Gemisch bei oder nahe seinem Siedepunkt befindet, so dass das Volumen des Probengemisches nicht abnimmt. Alle diese Faktoren spielen zusammen, dass eine einstückige Mikrotiterplatte mit 96 einzelnen Probenvertiefungen extrem schwierig auf eine Weise herstellbar ist, dass sie einen gleichförmigen Wärmeleitwert für alle 96 Vertiefungen erreicht.
Jedwede Struktur, welche die notwendigen individuellen seitlichen und senkrechten Freiheitsgrade für jedes Probenröhrchen bereitstellt, reicht für die Zwecke des Ausübens der Erfindung aus.
Gemäß den Lehren der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind alle vorstehend aufgeführten Erfordernisse erfüllt durch Verwendung eines Vierstück-Einweg-Kunststoffsystems. Dieses System verleiht jedem Probenröhrchen ausreichend Bewegungsfreiheit in alle notwendigen Richtungen, um unterschiedliche Wärmeausdehnungsraten zu kompensieren, und hält außerdem bis zu 96 Probenröhrchen in einem 96-Vertiefungen-Mikrotiterplattenformat aus Gründen der Benutzerfreundlichkeit und der Kompatibilität mit anderer Laborausrüstung, welche dimensioniert ist, um mit der Industriestandard-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatte zu arbeiten. Das mehrstückige Einweg-Kunststoffsystem ist gegenüber Herstellungstoleranzfehlern und gegenüber unterschiedlichen Wärmeausdehnungsraten über den weiten Temperaturbereich, den man während der PCR-Thermozyklierung antrifft, sehr tolerant.
Die 21A und 21B zeigen alternative Ausführungsformen der meisten der Vierstück-Kunststoffsystemkomponenten im Querschnitt, wenn sie montiert sind, um eine Vielzahl von Probenröhrchen in ihren Probenvertiefungen mit ausreichend Bewegungsfreiheit zu halten, um den unterschiedlichen Wärmeausdehnungsraten Rechnung zu tragen. 45 zeigt alle Teile des Einweg-Kunststoff-Mikrotiterplatte-Emulationssystems in einer Explosionszeichnung. Diese Figur stellt dar, wie die Teile zusammenpassen, um eine Mikrotiterplatte auszubilden, bei der alle Probenröhrchen lose in einer 96-Vertiefungen-Gruppierung mit 8 × 12-Mikrotiterplattenformat gehalten werden. 22 zeigt eine Draufsicht auf einen erfindungsgemäßen Mikrotiterplattenrahmen 342, welcher teilweise im Querschnitt in den 21A und 21B gezeigt ist. 23 zeigt eine Draufsicht auf die Unterseite des Rahmens 342. 8 ist eine Endansicht des Rahmens 342 entlang der Sichtlinie 24-24' in 22. 25 ist eine Endansicht des Rahmens 342 entlang der Sichtlinie 25-25' in 22. 26 ist ein Querschnitt durch den Rahmen 342 bei der Schnittlinie 26-26' in 22. 27 ist eine Querschnittsansicht durch den Rahmen 342 entlang der Schnittlinie 27-27' in 22. 28 ist eine Seitenansicht des Rahmens 342 entlang der Sichtlinie 28-28' in 22 mit einem teilweise herausgeschnittenen Teil, um die Stelle detaillierter zu zeigen, an der ein Halter, der nachstehend beschrieben wird, am Rahmen 342 festklemmt.
Gemeinsam auf die 21A, 21B und 22 bis 28 Bezug nehmend, besteht der Rahmen 342 aus einer horizontalen Kunststoffplatte 372, in welcher 96 Ausnehmungen ausgebildet sind, die mit 9-mm-Mittelpunkten im Standard-Mikrotiterplattenformat beabstandet sind. Es sind 8 Reihen mit A bis H und 12 Spalten mit 1 bis 12 bezeichnet. Die Ausnehmung 374 an Reihe D, Spalte 7, ist typisch für diese Ausnehmungen. In jeder Ausnehmung im Rahmen 342 ist ein konisches Probenröhrchen wie das in 15 gezeigte Probenröhrchen 376 untergebracht. Jedes Probenröhrchen ist kleiner im Durchmesser als die Ausnehmung, in welcher es untergebracht ist, und zwar um etwa 0,7 mm, so dass eine lose Passung in der Ausnehmung vorliegt. Dies ist am besten aus den 21A und 21B zu sehen, wenn man den Abstand zwischen der Innenkante 378 einer typischen Ausnehmung und der Seitenwand 380 des darin untergebrachten Probenröhrchens betrachtet. Das Bezugszeichen 382 in den 21A und 21B zeigt die gegenüberliegende Kante der Ausnehmung, welches ebenfalls weg von der Außenwand des zylindrischen Abschnitts des Probenröhrchens 376 beabstandet ist.
Jedes Probenröhrchen weist einen bei 384 in den 15, 21A und 21B gezeigten Absatz auf. Dieser Absatz ist um den gesamten Umfang des zylindrischen Abschnitts 288 jedes Probenröhrchens spritzgegossen. Der Durchmesser dieses Absatzes 384 ist groß genug, dass er nicht durch die Ausnehmungen im Rahmen 342 hindurchpasst, jedoch nicht so groß, um die Absätze der angrenzenden Röhrchen in benachbarten Ausnehmungen zu berühren.
Sobald alle Röhrchen in ihren Ausnehmungen im Rahmen 342 untergebracht sind, wird ein Kunststoffhalter 386 (am besten zu sehen in den 21A und 21B und in 45) in Öffnungen im Rahmen 342 eingerastet. Der Zweck dieses Halters liegt darin, alle Röhrchen an ihrer Verwendungsstelle zu halten, so dass sie nicht herausfallen oder aus dem Rahmen 342 herausgestoßen werden können, aber gleichzeitig nicht ihr Passungsspiel im Rahmen 342 zu stören. Der Halter 386 ist dimensioniert und an den Rahmen 342 angepasst, so dass jedes Probenröhrchen die Freiheit hat, sich in einem gewissen Maß senkrecht nach oben und nach unten zu bewegen, bevor der Absatz 384 des Röhrchens entweder auf den Halter 386 oder den Rahmen 342 trifft. Somit stellen der Rahmen und der Halter, wenn sie verbunden sind, ein Mikrotiterplattenformat für bis zu 96 Probenröhrchen bereit, gleichwohl stellen sie ausreichend horizontalen und senkrechten Freiraum bereit, so dass jedes Probenröhrchen frei ist, seine beste Passung bei allen Temperaturen unter dem Einfluss der minimalen Schwellenkraft F in 15 zu finden.
Eine noch klarere Ansicht des Probenröhrchens und des Absatzes hat man unter Bezugnahme auf die 29 und 30. Die 29 und 30 sind eine Aufrissschnittansicht bzw. ein teilweiser oberer Ausschnitt des Absatzabschnitts eines typischen Probenröhrchens. Eine kuppelförmige Kunststoffkappe, wie sie nachstehend detaillierter beschrieben wird, wird in das in 29 gezeigte Probenröhrchen eingesetzt und bildet einen hermetischen Verschluss mit der Innenwand 390 des Oberteils am Probenröhrchen. Ein in der Innenwand des Probenröhrchens ausgebildeter Grat 392 wirkt als ein Anschlag für die kuppelförmige Kappa, um weiteres Eindringen zu verhindern. Normalerweise liegen die kuppelförmigen Kappen in durch ein Netz verbundenen Streifen vor.
31 zeigt drei Kappen in Aufrissansicht, die durch ein Netz 394 verbunden sind und in einer Lasche 396 enden. Die Lasche unterstützt den Benutzer beim Entfernen einer ganzen Reihe von Kappen durch einen einzigen Zug. Üblicherweise liegt das Netz 324 auf der Oberseite 398 des Probenröhrchens auf und verhindert weiteres Eindringen der Kappe in das Probenröhrchen. Jede Kappe schließt einen Grat 400 ein, der den hermetischen Verschluss zwischen der Kappe und der Innenwand des Probenröhrchens ausbildet. 32 zeigt eine Draufsicht der drei Kappen in einem typischen Streifen von 12 verbundenen Kappen.
Für ein detaillierteres Verständnis des Halters wird auf die 33–37 verwiesen. 33 ist eine Draufsicht des Kunststoffhalters. 34 ist eine Aufrissansicht des Halters entlang der Sichtlinie 34-34' in 33. 35 ist eine Endaufrissansicht des Halters entlang der Sichtlinie 35-35' in 33. 36 ist eine Ausschnittsansicht entlang der Schnittlinie 36-36' in 33. 37 ist eine Ausschnittsansicht durch den Halter entland der Schnittlinie 37-37' in 33.
Gemeinsam auf die 33–37 Bezug nehmend besteht der Halter 386 aus einer einzigen horizontalen Kunststoffebene 402, die von einer senkrechten Wand 404 umgeben ist. Die Ebene 402 weist eine 8 × 12-Gruppierung von 96 darin ausgebildeten Ausnehmungen auf, welche in 24 Gruppen von 4 Ausnehmungen pro Gruppe aufgeteilt ist. Diese Gruppen werden durch in der Ebene 402 ausgebildete Grate, wie die Grate 406 und 408, abgesetzt. Jede Ausnehmung, von denen die Ausnehmung 410 typisch ist, weist einen Durchmesser D auf, der größer ist als der Durchmesser D₁ in 29 und kleiner als der Durchmesser D₂. Dies erlaubt dem Halter, über die Probenröhrchen geschoben zu werden, nachdem diese im Rahmen 342 untergebracht worden sind, hindert jedoch die Probenröhrchen daran, aus dem Rahmen herauszufallen, da der Absatz 384 zu groß ist, um durch die Ausnehmung 410 hindurchzupassen.
Der Halter rastet mittels in den 34 und 36 gezeigten Kunststofflaschen 414 in den Rahmen 342 ein. Diese Kunststofflaschen werden durch die Schlitze 416 und 418 im Rahmen, wie in 23 gezeigt, hindurchgedrückt. Es gibt zwei Kunststofflaschen 414, eine an jeder langen Kante des Halters. Diese zwei Kunststofflaschen sind als Bezugszeichen 414A und 414B in 33 gezeigt.
Der Rahmen 342 aus den 22–28 bildet mit bis zu 96 darin untergebrachten Probenröhrchen und mit dem an seiner Verwendungsstelle eingerasteten Halter 386 eine einzige Einheit, wie sie in den 21A und 21B gezeigt ist, welche für die PCR-Verarbeitung im Probenblock 12 untergebracht werden kann.
Nach der Verarbeitung können alle Röhrchen gleichzeitig durch Anheben des Rahmens 342 aus dem Probenblock entfernt werden. Aus Gründen der Zweckdienlichkeit und Lagerung kann der Rahmen 342 mit Probenröhrchen und an der Verwendungsstelle befindlichen Halter in eine andere Kunststoffkomponente eingesetzt werden, die Sockel (base) genannt wird. Dieser Sockel weist die Außenabmessungen und die Standfläche einer Standard-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatte auf und ist in den 38 bis 44 gezeigt. 38 ist eine Draufsicht auf den Sockel 420, während 39 eine Draufsicht auf die Unterseite des Sockels ist. 40 ist eine Aufrissansicht des Sockels entlang der Sichtlinie 40-40' in 38. 41 ist eine Endaufrissansicht entlang der Sichtlinie 41-41' in 38. 42 ist eine Ausschnittsansicht durch den Sockel entlang der Schnittlinie 42-42' in 38. 43 ist eine Ausschnittsansicht durch den Sockel entlang der Schnittlinie 43-43' in 38. 44 ist eine Ausschnittsansicht entlang der Schnittlinie 44-44' in 38.
Der Sockel 420 schließt eine flache Ebene 422 aus Kunststoff ein, in welcher eine 8 × 12-Gruppierung von Ausnehmungen mit schräg abfallenden Kanten ausgebildet ist. Diese Ausnehmungen weisen Abmessungen und Zwischenräume auf, so dass dann, wenn der Rahmen 342 in den Sockel eingesetzt wird, die Böden der Probenröhrchen in die konischen Ausnehmungen im Sockel hineinpassen, derart, dass die Probenröhrchen in der gleichen Beziehung zum Rahmen 342 gehalten werden, wie die Probenröhrchen gehalten werden, wenn der Rahmen 342 auf dem Probenblock montiert ist. Die Ausnehmung 424 ist eine typische der 96 Ausnehmungen, die im Sockel ausgebildet sind, und ist in den 38, 44 und 43 gezeigt. Die einzelnen Probenröhrchen erhalten einen festen Sitz und werden unbeweglich, wenn der Rahmen in den Sockel eingesetzt wird, obgleich sie lose zwischen dem Einsatz und dem Halter aufgenommen sind. Die Art und Weise, in welcher ein typisches Probenröhrchen 424 in den Sockel hineinpasst, ist in 44 gezeigt.
Mit anderen Worten, wenn der Rahmen, die Probenröhrchen und der Halter in den Sockel 420 eingesetzt sind, wird der gesamte Aufbau zu einem exakt funktionellen Äquivalent einer Industriestandard-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatte und kann praktisch in jedem beliebigen automatisierten Pipettier- oder Probensystem für 96-Vertiefungen-Industriestandard-Miktrotiterplatten für die weitere Verarbeitung untergebracht werden.
Nachdem die Probenröhrchen mit den notwendigen Reagenzien und der zu amplifizierenden DNA-Probe befüllt wurden, können die Probenröhrchen mit Kappen versehen werden. In einer alternativen Ausführungsform des in den 31 und 32 gezeigten Kappenstreifens kann eine ganze Matte von 96 Kappen mit einem diese verbindenden nachgiebigen Netz in einer 8 × 12-Gruppierung verwendet werden. Dieses unter dem Bezugszeichen 394 in 31 gezeigte Netz muss ausreichend nachgiebig sein, so dass die Kappen die Probenröhrchen nicht davon abhalten, die kleinen Bewegungen zu machen, die diese Probenröhrchen machen müssen, um bei allen Temperaturen perfekt in die konischen Vertiefungen des Probenblocks zu passen.
Die Anordnung der Röhrchen, der Kappenrahmen, des Halters und des Sockels wird nach dem Befüllen der Röhrchen zum Thermocycler gebracht. Dort werden der Rahmen, die mit Kappen versehenen Röhrchen und die Halterplatte vom Sockel als eine Einheit entfernt. Diese Einheit wird sodann in den Probenblock 12 eingesetzt, um die in den 21A oder 21B gezeigte Anordnung mit den lose in den konischen Vertiefungen gehaltenen Pro benröhrchen in dem Probenblock herzustellen. Wie in 21 gezeigt, sitzt der Rahmen 342 auf der Oberseite 280 des Sicherheitsbandes. In der bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich der Grat 396 abwärts in die Rille 78 des Sicherheitsbandes hinein, dies ist jedoch nicht wesentlich.
Als nächstes wird die beheizte Abdeckung über die Proben geschoben und die beheizte Platte wird wie vorstehend beschrieben heruntergeschraubt, bis diese die Oberkante 346 des Rahmens 342 berührt.
Innerhalb von Sekunden, nachdem die beheizte Platte 14 in 19 die Kappen berührt, beginnen die Kappen zu erweichen und unter dem Abwärtsdruck der Leitspindel 312 in 19 nachzugeben. Der Benutzer fährt dann fort, den Knauf 318 zu drehen, bis die Indexmarkierungen 332 und 334 in 20 auf einer Linie sind, was anzeigt, dass jedes Probenröhrchen mit wenigstens der minimalen Schwellenkraft F fest in den Probenblock gedrückt worden ist und alle Luftspalte zwischen der beheizten Platte 14, dem Probenblock und der Oberkante 346 des Rahmens 342 fest verschlossen worden sind. Die Probenröhrchen befinden sich nun in einer vollkommen geschlossenen und geregelten Umgebung und das Präzisionszyklieren der Temperatur kann beginnen.
Am Ende des PCR-Protokolls wird die beheizte Platte 14 nach oben und weg vom Probenröhrchen bewegt und die beheizte Abdeckung 316 wird aus dem Weg geschoben, um den Rahmen 342 und die Probenröhrchen freizulegen. Der Rahmen, die Probenröhrchen und der Halter werden dann entfernt und zurück in einen leeren Sockel gestellt und die Kappen können entfernt werden. Nachdem jede Kappe oder der Kappenstrang abgezogen ist, hält der Halter das Röhrchen davon ab, aus dem Einsatz herauszukommen. Im Sockel ausgebildete Rippen (nicht gezeigt in den 38–44) berühren die in 33 gezeigten Halterlaschen 414A und 414B, um den Halter eingerastet an seiner Verwendungsstelle zu halten, derart, dass die auf die Röhrchen ausgeübte Kraft durch Entfernen der Kappen den Halter 386 nicht verrückt.
Offensichtlich kann der Rahmen 342 gegebenenfalls mit weniger als 96 Röhrchen verwendet werden. Ebenso kann der Halter 386 gegebenenfalls durch Entriegeln entfernt werden.
Ein Benutzer, der nur wenige Röhrchen gleichzeitig laufen lassen und diese Röhrchen einzeln behandeln möchte, kann einen leeren Rahmen 342 ohne Halter auf dem Probenblock anbringen. Der Benutzer kann dann den Sockel als ein "Teströhrchengestell" verwenden und eine kleine Anzahl von Röhrchen darin einrichten. Diese Röhrchen können dann von Hand befüllt und mit einzelnen Kappen versehen werden. Der Benutzer kann dann die Röhrchen einzeln in die Vertiefungen im Probenblock überführen, die beheizte Abdeckung schließen und die beheizte Platte 14 herunterschrauben, bis die Markierungen in einer Linie liegen. Die PCR-Zyklierung kann dann beginnen. Wenn die Zyklierung vollständig abgeschlossen ist, wird die Abdeckung 316 entfernt und die Probenröhrchen werden einzeln in einen verfügbaren Sockel eingesetzt. Der Halter ist bei diesem Typ der Verwendung nicht notwendig.
In den 47A und 47B (nachstehend 47) ist ein Blockdiagramm für die Elektronik einer bevorzugten Ausführungsform eines Steuersystems in einer Klasse von Steuersystemen, die durch den CPU-Block 10 in 1 dargestellt sind, gezeigt. Der Zweck der Steuerelektronik von 47 besteht unter anderem darin, Benutzereingabedaten, die das gewünschte PCR-Protokoll definieren, zu empfangen und zu speichern, die verschiedenen Temperatursensoren abzulesen, die Probentemperatur zu berechnen, die berechnete Probentemperatur mit der gewünschten Temperatur, wie sie durch das benutzerdefinierte PCR-Protokoll definiert ist, zu vergleichen, die Netzspannung zu überwachen und die Filmheizgerätzonen und die Rampenkühlungsventile zu steuern, um das gewünschte Temperaturprofil des benutzerdefinierten PCR-Protokolls auszuführen.
Ein Mikroprozessor (nachstehend CPU) 450 führt das nachstehend beschriebene und in Anhang C in Quellcodeform gegebene Steuerprogramm aus. In der bevorzugten Ausführungsform ist die CPU 450 ein OKI CMOS 8085. Die CPU steuert einen Adressbus 452 an, durch welchen verschiedene der anderen Schaltkreiselemente in 47 adressiert werden. Die CPU steuert ferner einen Datenbus 454 an, durch welchen Daten an verschiedene der anderen Schaltkreiselemente in 47 übertragen werden.
Das Steuerprogramm von Anhang C und einige Systemkonstanten werden in EPROM 456 gespeichert. Benutzereingegebene Daten und andere Systemkonstanten und während des Installationsprozesses gemessene Kenndaten (Ausführung des Install-Programms nachstehend beschrieben) werden im batteriegestützten RAM 458 gespeichert. Ein(e) Uhr/Kalender des Systems 460 versorgt die CPU 450 mit Datum- und Zeitinformationen zum Zwecke der Aufzeichnung eines Verlaufs von Ereignissen während eines PCR-Durchlaufs und der Dauer von Netzausfällen, wie dies nachstehend in der Beschreibung der Steuersoftware beschrieben wird.
Ein Adressendekodierer 462 empfängt und dekodiert Adressen vom Adressbus 452 und aktiviert geeignete Chip-Auswahlleitungen (chip select lines) auf einem Chip-Auswahlbus (chip select bus) 464. Der Benutzer gibt PCR-Protokolldaten über eine Tastatur 466 in Reaktion auf durch die CPU auf der Anzeige 468 angezeigte Informationen ein. Die Zwei-Wege-Kommunikation zwischen dem Benutzer und der CPU 450 wird nachstehend im Benutzeroberfläche-Abschnitt der Beschreibung der Steuersoftware detaillierter beschrieben. Eine Tastatur-Schnittstellenschaltung 470 konvertiert die Tastenanschläge des Benutzers zu Daten, die durch die CPU über den Datenbus 454 abgelesen werden.
Zwei programmierbare Intervallzeitgeber 472 und 474, die jeweils Zähler enthalten, die mit Zählständen geladen sind, die von der CPU 450 berechnet werden, um die Intervalle, während derer Leistung an die verschiedenen Filmheizgerätzonen angewandt wird, zu steuern.
Eine Unterbrechungssteuerschaltung (interrupt controller) 476 sendet alle 200 ms Unterbrechungsanforderungen an die CPU 450, wodurch die CPU 450 veranlasst wird, den nachstehend in der Beschreibung der Steuersoftware beschriebenen PID-Rechenprozess abzuarbeiten. Dieser Rechenprozess liest die Temperatursensoren ab und berechnet die Heiz- oder Kühlleistung, die notwendig ist, um die Probentemperatur von ihrem momentanen Niveau auf das vom Benutzer für diesen Zeitpunkt in dem auszuführenden PCR-Protokoll gewünschten Niveau zu verstellen.
Eine UART 478 bedient eine RS232-Schnittstellenschaltung 480, so dass im RAM 480 gespeicherte Daten an einen Drucker ausgegeben werden können. Die Steuersoftware unterhält eine Aufzeichnung jedes PCR-Durchlaufs, die hinsichtlich der tatsächlichen Temperaturen durchgeführt wird, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des Durchlaufs bestanden, zum Zwecke der Benutzervalidierung, dass das tatsächlich ausgeführte PCR-Protokoll dem vom Benutzer gewünschten PCR-Protokoll entsprach. Überdies werden vom Benutzer eingegebene Daten, die die speziellen, während eines speziellen PCR-Protokolls gewünschten Zeitpunkte und Temperaturen definieren, ebenso gespeichert. Alle diese Daten und auch andere Daten können durch die CPU 450 abgelesen und an einen Drucker ausgegeben werden, der mit dem RS232-Port über die UART 478 verbunden ist. Die RS232-Schnittstelle erlaubt ferner, dass ein externer Rechner die Steuerung der Adress- und Datenbusse zum Zwecke der Überprüfung übernimmt.
Ein peripherer Schnittstellen-Chip (nachstehend PIC, peripheral interface chip) 482 dient als ein programmierbarer Satz von vier Eingangs-/Ausgangsregistern. Beim Einschalten wählt die CPU 450 den PIC 482 über den Adressendekodierer 462 und den Chip-Auswahlbus 464 aus. Die CPU schreibt dann ein Datenwort an den PIC über den Datenbus 454, um den PIC 482 dahingehend zu programmieren, welche Register die Ausgabe-Ports sein sollen und welche die Eingabe-Ports sein sollen. Anschließend verendet die CPU 450 die Ausgaberegister, um darin durch die CPU über den Datenbus 454 geschriebene Datenworte zu speichern, um den internen Logikzustand eines programmierbaren Matrixlogik-Chips (PAL, programmable array logic chip) 484 zu steuern.
Die PAL 484 ist eine Ablaufsteuereinheit (state machine), die eine Vielzahl von Eingangssignalen und eine Vielzahl von Ausgangssignalen aufweist. PALs enthalten im Allgemeinen eine Matrixlogik, die eine Anzahl von unterschiedlichen Zuständen aufweist. Jeder Zustand ist durch die Matrix oder den Vektor von Logikzuständen an den Eingängen definiert und jeder Zustand führt zu einem/einer unterschiedlichen Matrix oder Vektor von Logikzuständen an den Ausgängen. Die CPU 450, der PIC 482, die PAL 484 und mehrere andere, nachstehend zu definierende Schaltkreise wirken zusammen, um unterschiedliche Zustände der verschiedenen Ausgangssignale aus der PAL 484 zu generieren. Diese unterschiedlichen Zustände und dazugehörigen Ausgangssignale sind die, die den Betrieb der in 47 gezeigten Elektronik steuern, wie nachstehend beschrieben wird.
Ein 12-Bit-Analog-Digitalwandler (A/D) 486 wandelt analoge Spannungen an den Leitungen 488 und 490 zu digitalen Signalen an den Datenbus 454 um. Diese werden durch die CPU gelesen, indem eine Adresse für den A/D-Wandler generiert wird, so dass ein Chip-Auswahlsignal am Bus 464, der mit dem Chip-Auswahleingang am A/D-Wandler verbunden ist, aktiv wird und den Wandler aktiviert. Die analogen Signale an den Leitungen 488 und 490 sind die Ausgangsleitungen der zwei Multiplexer 492 und 494. Der Multiplexer 492 weist vier Eingabe-Ports auf, die jeweils zwei Signalleitungen aufweisen. Jeder dieser Ports ist mit einem der vier Temperatursensoren im System gekoppelt. Der erste Port ist mit dem Probenblock-Temperatursensor gekoppelt. Der zweite und der dritte Port sind mit dem Kühlmittel- bzw. dem Umgebungstemperatursensor gekoppelt und der vierte Port ist mit dem Temperatursensor der beheizten Abdeckung gekoppelt. Ein typischer Schaltkreis für jeden dieser Temperatursensoren ist in 48 gezeigt. Ein 20 000-Ohm-Widerstand 496 empfängt am Knoten 497 eine geregelte +15-Volt-Spannungsversorgung 498 in 47 über eine Busverbindungsleitung, die nicht gezeigt ist. Dieses +15-Volt-Gleichspannungssignal spannt eine Zenerdiode 500 sperrgepolt vor. Dieser Sperrvorspannungsstrom (reverse bias current) und der Spannungsabfall über der Zenerdiode sind Funktionen der Temperatur. Der Spannungsabfall über der Diode wird an den Multiplexer 292 über die Leitungen 502 und 504 eingegeben. Jeder Temperatursensor weist eine ähnliche Verbindung zum Multiplexer 292 auf.
Der Multiplexer 494 weist ferner 4 Eingabe-Ports auf, von denen jedoch lediglich drei verbunden sind. Der erste Eingabe-Port ist mit einem Eichspannungsgenerator 506 gekoppelt. Dieser Spannungsgenerator gibt zwei genau geregelte Spannungsniveaus zu den Multiplexereingaben aus und ist thermisch sehr stabil. Das heißt, die Bezugsspannungsausgabe durch die Spannungsquelle 506 driftet, wenn überhaupt, sehr wenig mit der Temperatur. Diese Spannung wird von Zeit zu Zeit durch die CPU 450 gelesen und mit einer gespeicherten Konstante verglichen, die das Niveau darstellt, das diese Bezugsspannung bei einer bekannten Temperatur, wie sie während der Ausführung des nachstehend beschriebenen Installationsprozesses gemessen wurde, aufwies. Wenn die Bezugsspannung von dem während des Installationsprozesses gemessenen und gespeicherten Niveau gedriftet ist, weiß die CPU 450, dass die andere elektronische Schaltung, die zum Abfühlen der verschiedenen Temperaturen und Netzspannungen verwendet wird, ebenso gedriftet ist, und stellt ihre Ausgaben entsprechend ein, um eine sehr genaue Kontrolle über das Temperaturmessverfahren beizubehalten.
Der andere Eingang an den Multiplexer 494 ist über die Leitung 510 an einen Effektivwert-Gleichspannungswandler-Schaltkreis (RMS-to-DC converter circuit) 512 gekoppelt. Dieser Schaltkreis weist einen Eingang 414 auf, der mit einem Abwärtstransformator (step-down-transformer) 516 gekoppelt ist und eine Wechselspannung am Eingang 514 empfängt, die zu der dann vorhandenen Netzspannung beim Wechselstromeingang 518 proportional ist. Der Effektivwert-Gleichspannungswandler 512 richtet die Wechselspannung gleich und mittelt diese, um eine Gleichspannung an der Leitung 510 zu entwickeln, die ebenso zu der Eingangswechselspannung an der Leitung 518 proportional ist.
Vier optisch gekoppelte Triac-Treiber 530, 532, 534 und 536 empfangen Eingangssteuersignale über den Steuerbus 538 von der PAL-Logik 484. Jeder dieser Triac-Treiber 530, 532 und 534 steuert die Leistung an eine der drei Filmheizgerätzonen. Diese Heizzonen werden durch die Blöcke 254, 260/262 und 256/258 dargestellt (unter Verwendung der gleichen Bezugszeichen wie in 13). Der Triac-Treiber 536 steuert die Leistung an die beheizte Abdeckung, dargestellt durch den Block 544, über einen thermischen Schutzschalter (cut-out switch) 546. Die Heizzonen des Filmheizgeräts werden durch einen thermischen Blockschutzschalter 548 geschützt. Der Zweck dieser thermischen Schutzschalter besteht darin, das Einschmelzen des Filmheizgeräts/Probenblocks auf die beheizte Abdeckung im Falle eines Ausfalls zu verhindern, der dazu führt, dass die Triac-Treiber für ein gefährlich langes Intervall angelassen werden. Tritt ein solches Ereignis ein, erfassen die Schalter einen überheißen Zustand und schalten die Triacs über Signale an den Leitungen 552 oder 554 ab.
Die Hauptheizzone des Filmheizgeräts ist für eine Nennleistung von 360 Watt ausgelegt, während die Verteiler- und Kantenheizzonen für Nennleistungen von 180 Watt bzw. 170 Watt ausgelegt sind. Die Triac-Treiber sind Motorola MAC 15A10 15 amp Triacs. Jede Heizzone ist in zwei elektrisch isolierte Abschnitte aufgeteilt, die jeweils die Hälfte der Leistung abführen. Die zwei Hälften sind für Netzspannungen bei 518, die geringer als 150 Volt RMS sind, parallel geschaltet. Für Netzspannungen, die größer als dieser Wert sind, sind die zwei Hälften in Reihe geschaltet. Diese wechselnden Verbindungen werden durch einen "Personality"-Stecker 550 erreicht.
Die Wechselstromversorgung für die Filmheizgerätzonen erfolgt über die Leitung 559 und die Wechselstromversorgung für die beheizte Abdeckung erfolgt über die Leitung 560.
Ein Nulldurchgangsdetektor (zero crossing detector) 566 stellt eine zeitliche Grundsteuerung des Systems bereit, indem dieser einen Impuls an der Leitung 568 bei jedem Nulldurchgang des Wechselstroms an der Leitung 518 aussendet. Der Nulldurchgangsdetektor ist ein National LM 311N, bezogen auf analoge Masse, und weist eine 25 mV Hysterese auf. Der Nulldurchgangsdetektor nimmt seine Eingabe vom Transformator 516, der ein Wechselspannungssignal von 0 bis 5,52 Volt für ein Wechselspannungseingangssignal von 0 bis 240 Volt Wechselspannung ausgibt.
Ein Leistungstransformator 570 liefert Wechselstrom an die Pumpe 41, die Kühlmittel durch die Rampen- und Vorkühlungskanäle pumpt. Die Kühleinheit 40 empfängt ebenso ihren Wechselstrom vom Transformator 570 über einen anderen Abschnitt des Personality-Steckers 550. Der Transformator 550 liefert ferner Strom an drei geregelte Spannungsversorgungen 572, 498 und 574 und eine ungeregelte Spannungsversorgung 576.
Für Genauigkeitszwecke beim Messen der Temperaturen verwendet der Eichspannungsgenerator 506 eine Reihe von sehr genauen 20-kOhm-Dünnfilmwiderständen mit extrem niedriger Temperaturdrift (nicht gezeigt in 47).
Diese gleichen Widerstände mit extrem niedriger Drift werden verwendet, um die Verstärkung eines analogen Verstärkers 578 einzustellen, der die Ausgangsspannung aus dem ausgewählten Temperatursensor vor der Umwandlung in einen digitalen Wert verstärkt. Diese Widerstände driften lediglich 5 ppm/°C.
Alle Temperatursensoren werden kalibriert, indem diese (getrennt von den Strukturen, deren Temperaturen jene messen) zunächst in ein stabiles, temperaturgeregeltes gerührtes Ölbad bei 40°C gelegt und die tatsächlichen Ausgangsspannungen an den Eingängen zum Multiplexer 492 gemessen werden. Die Temperatursensoren werden dann in ein Bad bei einer Temperatur von 95°C gelegt und deren Ausgangsspannungen werden wiederum bei den gleichen Punkten gemessen. Die Ausgangsspannung des Eichspannungsgenerators 506 wird ebenso am Eingang des Multiplexers 494 gemessen. Für jede Temperatur wird die digitale Ausgabedifferenz aus dem A/D-Wandler 486 zwischen jeder der Temperatursensorausgaben und der digitalen Ausgabe, die von der durch den Eichspannungsgenerator 506 generierten Spannung resultiert, gemessen. Die Kalibrierkonstanten für jeden Temperatursensor, um jeden für Änderungen in der Temperatur zu kalibrieren, können dann berechnet werden.
Der Probenblocktemperatursensor wird dann einem weiteren Kalibrierverfahren unterzogen. Dieses Verfahren umfasst das Verfahren des Probenblocks auf zwei unterschiedliche Temperaturen. Auf jedem Temperaturniveau wird die tatsächliche Temperatur des Blocks in 16 unterschiedlichen Probenvertiefungen gemessen, wobei 16 auf innerhalb von 0,02°C genaue RTD-Thermoelementsonden verwendet werden. Ein Durchschnittsprofil für die Temperatur des Blocks wird dann generiert und die Ausgabe des A/D-Wandlers 464 wird mit dem Blocktemperatursensor an seiner Verwendungsstelle im Probenblock gemessen. Dies erfolgt bei zwei Temperaturniveaus. Aus der tatsächlichen Blocktemperatur, wie sie durch die RTD-Sonden und die A/D-Ausgabe für den Blocktemperatursensor gemessen wird, kann ein weiterer Kalibrierfaktor berechnet werden. Die so generierten Temperaturkalibrierfaktoren werden in dem batteriegestützten RAM 458 gespeichert. Sobald diese Kalibrierfaktoren für das System ermittelt worden sind, ist es wichtig, dass das System nicht merklich von den elektrischen Kenndaten driftet, die zur Zeit der Kalibrierung vorhanden waren. Es ist daher wichtig, dass driftarme Schaltkreise ausgewählt werden und dass äußerst driftarme Widerstände verwendet werden.
Die Art und Weise, auf die die CPU 450 die Probenblocktemperatur regelt, lässt sich am besten unter Bezugnahme auf den nachstehenden, das Steuerprogramm beschreibenden Abschnitt verstehen. Um jedoch darzustellen, wie der elektrische Schaltkreis von 47 mit der Steuersoftware zusammenwirkt, um ein PCR-Protokoll auszuführen, ist das Folgende zu bedenken.
Der Nulldurchgangsdetektor 566 weist zwei Ausgänge im Ausgangsbus 568 auf. Einer dieser Ausgänge sendet einen negativen Impuls für jeden positiven Übergang des Wechselspannungssignals über den Nullspannungsbezug. Der andere sendet einen negativen Impuls über jeden negativen Übergang des Wechselspannungssignals über das Nullspan nungsbezugsniveau aus. Diese zwei Impulse, auf typische Weise gezeigt beim Bezugszeichen 580, definieren eine Vollperiode oder zwei Halbperioden. Es sind die Impulsfolgen an Bus 568, die die 200-ms-Abtastperioden definieren. Bei 60 Perioden/s Wechselstrom, wie man sie in den USA findet, enthalten 200 ms 24 Halbperioden.
Eine typische Abtastperiode ist in 49 gezeigt. Jede "Häkchen"-Markierung in 49 stellt eine Halbperiode dar. Während jeder 200-ms-Abtastperiode berechnet die CPU 450 den Betrag an Heiz- oder Kühlleistung, der gebraucht wird, um die Probenblocktemperatur an einer benutzerdefinierten Sollwert- oder Inkubationstemperatur zu halten, oder um die Blocktemperatur auf eine neue Temperatur zu verstellen, abhängig davon, an welcher Stelle die spezille Abtastperiode im PCR-Protokollzeitstrahl liegt. Der Betrag an Leistung, die in jeder Filmheizgerätzone benötigt wird, wird in eine Anzahl von Halbperioden umgewandelt, die jede Heizzone während der nächsten 200-ms-Abtastperiode abgeschaltet bleiben soll. Gerade vor dem Ende der momentanen Abtastperiode, in welcher diese Berechnungen durchgeführt werden, adressiert die CPU 450 jeden der vier Zeitgeber in dem programmierbaren Intervallzeitgeber (programmable interval timer, PIT) 472. An jeden Zeitgeber schreibt die CPU Daten, die einen "vorliegenden" Zählstand bilden, der die Anzahl von Halbperioden darstellt, die die zu diesem Zeitgeber gehörige Heizzone in der nächsten Abtastperiode abgeschaltet bleiben soll. In 49 werden diese Daten an die Zeitgeber während des Intervalls 590 gerade vor der Startzeit 592 der nächsten Abtastperiode geschrieben. Es ist anzunehmen, dass ein schneller Rampenanstieg auf die Denaturierungstemperatur von 94°C durch die Sollwertdaten des Benutzers für ein Intervall, das das Abtastintervall zwischen den Zeiten 592 und 594 einschließt, angefordert wird. Demgemäß wird das Filmheizgerät für den größten Teil der Periode angeschaltet sein. Es ist anzunehmen, dass das Heizgerät der zentralen Zone für alle außer dreien der Halbperioden während der Abtastperiode angeschaltet sein soll. In diesem Fall schreibt die CPU 450 eine 3 in den Zähler in den zum Heizgerät der zentralen Zone gehörigen PIT 472 während des Intervalls 590. Diese Schreiboperation veranlasst den Zeitgeber automatisch, ein "Abschalt"-Signal an der speziellen Steuerleitung von Bus 592 auszugeben, das das Heizgerät der zentralen Zone steuert. Dieses "Abschalt"-Signal veranlasst die PAL 484, ein "Abschalt"-Signal an die spezielle, zu der zentralen Zone zugehörige Leitung der Signalleitungen in Bus 538 auszugeben. Der Triac-Treiber 530 schaltet dann beim nächsten Nulldurchgang, d. h. bei Zeit 592, ab. Der PIT empfängt eine Pulsfolge von positiven Impulsen an der Leitung 594 von der PAL 484. Diese Impulse sind Übersetzungen der Nulldurchgangsimpulse am Zwei-Leitungsbus 568 durch die PAL 484 in positive Imulse bei allen Nulldurchgangsimpulsen an einer einzelnen Leitung, d. h. Leitung 494. Der Zeitgeber in dem zu der zentralen Filmheizgerätzone gehörigen PIT 472 beginnt mit dem Abwärtszählen von seinem vorliegenden Zählstand von 3 unter Ver wendung der Halbperioden-Markierungsimpulse an der Leitung 494 als seinen Takt. Am Ende der dritten Halbperiode erreicht dieser Zeitgeber 0 und veranlasst seine Ausgangssignalleitung an Bus 592, Zustände zu ändern. Dieser Übergang vom abgeschalteten in den angeschalteten Zustand ist bei 596 in 49 gezeigt. Dieser Übergang wird an die PAL 484 kommuniziert und veranlasst diese, den Zustand des geeigneten Ausgangssignals an Bus 538 zu ändern, um den Triac-Treiber 530 beim dritten Nulldurchgang anzuschalten. Es ist zu beachten, dass durch Anschalten der Triacs an den Nulldurchgängen, wie dies in der bevorzugten Ausführungsform gemacht wird, das Abschalten eines grollen, durch einen Induktor (den Filmheizgerätleiter) fließenden Stroms vermieden wird. Dies beschränkt die Erzeugung einer Hochfrequenzstörung oder von anderem Rauschen auf ein Mindestmaß. Es ist zu beachten, dass die Technik des Umschaltens eines Abschnitts jeder Halbperiode zum Filmheizgerät gemäß dem berechneten Betrag an benötigter Leistung ebenso als eine alternative Ausführungsform funktionieren wird, jedoch aufgrund des durch diese Technik erzeugten Rauschens nicht bevorzugt ist.
Die anderen Zeitgeber von PIT 472 und 474 funktionieren auf eine ähnliche Art und Weise, um die an die anderen Heizzonen und an die beheizte Abdeckung anzuwendende Leistung entsprechend der durch die CPU berechneten Leistung zu handhaben.
Die Rampenkühlung wird durch CPU 450 direkt durch die periphere Schnittstelle 482 gesteuert. Wenn die während jeder Abtastperiode durchgeführten Heiz-/Kühlleistungsberechnungen anzeigen, dass Rampenkühlleistung benötigt wird, adressiert die CPU 450 die periphere Schnittstellensteuerschaltung (PIC) 482. Ein Datenwort wird dann in das geeignete Register geschrieben, um die Ausgangsleitung 600 auszusteuern. Diese Ausgangsleitung triggert ein Paar von monostabilen Multivibratoren 602 und 604 und veranlasst jeden, einen einzelnen Impuls an den Leitungen 606 bzw. 608 auszusenden. Diese Impulse haben jeweils Spitzenströme gerade unterhalb von 1 Ampere und eine Pulsdauer von etwa 100 ms. Der Zweck dieser Impulse liegt darin, die Solenoidventilspulen, die den Fluss durch die Rampenkühlungskanäle steuern, sehr hart anzusteuern, um den Rampenkühlungsfluss schnell anzuschalten. Der Impuls an der Leitung 606 veranlasst einen Treiber 610, eine Leitung 612, die mit einer Seite der Solenoidspule 614 eines der solenoidbetriebenen Ventile gekoppelt ist, zu erden. Die andere Anschlussklemme der Spule 614 ist mit einer Spannungsversorgungs-"Schiene" 616 bei +24 Volt Gleichspannung aus der Spannungsversorgung 576 gekoppelt. Der monostabile Multivibrator (one shot) 602 steuert das solenoidbetriebene Ventil für die Rampenkühlung für den Fluss in eine Richtung und der monostabile Multivibrator 604 steuert das solenoidbetriebene Ventil für den Fluss in die entgegengesetzte Richtung.
Gleichzeitig bewirkt die Aktivierung des RCOOL-Signals an der Leitung 600, dass ein Treiber 618 aktiviert wird. Dieser Treiber legt die Leitung 612 durch einen strombegrenzenden Widerstand 620 an Masse. Der Wert dieses strombegrenzenden Widerstands ist derart, dass der Strom, der durch die Leitung 622 fließt, wenigstens dem Haltestrom entspricht, der notwendig ist, um das Solenoidventil 614 offen zu halten. Solenoidspulen weisen transiente Kenndaten auf, die große Ströme benötigen, um ein solenoidbetriebenes Ventil zu betätigen, jedoch wesentlich weniger Strom, um das Ventil offen zu halten. Wenn der 100-ms-Impuls an der Leitung 606 niedriger wird, hört der Treiber 612 auf, die Leitung 612 direkt an Masse zu legen, wodurch lediglich der Masseanschluss durch den Widerstand 620 und den Treiber 618 zum Hatten des Stroms gelassen wird.
Das Solenoidventil 614 steuert den Fluss des Rampenkühlungskühlmittels durch den Probenblock in lediglich der Hälfte der Rampenkühlungsrohre, d. h. der Rohre, die das Kühlmittel in eine Richtung durch den Probenblock führen. Ein anderes solenoidbetriebenes Ventil 624 steuert den Kühlmittelfluss von Kühlmittel durch den Probenblock in der entgegengesetzten Richtung. Dieses Ventil 624 wird auf exakt die gleiche Art und Weise wie das solenoidbetriebene Ventil 614 durch die Treiber 626 und 628, den monostabilen Multivibrator 604 und die Leitung 608 angesteuert.
Die Notwendigkeit für die Rampenkühlung wird einmal je Abtastperiode bewertet. Ermittelt der PID-Rechenprozess der Steuersoftware vom Messen der Blocktemperatur und deren Vergleich mit der gewünschten Blocktemperatur, dass die Rampenkühlung nicht länger benötigt wird, wird das RCOOL-Signal an der Leitung 600 deaktiviert. Dies wird durch die CPU 450 durch Adressieren des PIC 482 und das Schreiben von Daten an diesen durchgeführt, was den Zustand des passenden Bits im Register im PIC 482 umkehrt, der mit der Leitung 600 gekoppelt ist.
Der PIT 474 enthält ferner zwei andere Zeitgeber, die eine 20-Hz-Unterbrechung zeitlich festlegen, sowie eine Heiz-LED, die eine sichtbare Anzeige gibt, wenn der Probenblock heiß und gefährlich zu berühren ist.
Das System schließt ferner einen monostabilen Multivibrator 630 des Tongebers und einen Tongeber 632 ein, um den Benutzer zu warnen, wenn ein falscher Tastenanschlag gemacht wurde.
Die programmierbare Unterbrechungssteuerschaltung 476 wird verwendet, um sieben Unterbrechungen zu erfassen; Ebene 1 – Test; Ebene 2–20 Hz; Ebene 3 – Übertragen fertig; Ebene 4 – Empfangen fertig; Ebene 5 – Tastaturunterbrechung; Ebene 6 – Hauptheizgerät angeschaltet; und Ebene 7 – Wechselstromleitung-Nulldurchgang.
Die periphere Schnittstellensteuerschaltung 482 weist vier Ausgänge (nicht gezeigt) zum Steuern der Multiplexer 492 und 494 auf. Diese Signale MUX1 EN und MUX2 EN geben den einen oder den anderen der zwei Multiplexer 492 und 494 frei, während die Signale MUX 0 und MUX 1 steuern, welcher Kanal für die Eingabe an den Verstärker 578 ausgewählt wird. Diese Signale werden so gehandhabt, dass lediglich ein Kanal aus den zwei Multiplexern zu irgendeiner beliebigen Zeit ausgewählt werden kann.
Ein RLTRIG*-Signal setzt einen monostabilen Multivibrator 632 der Zeitbegrenzung für die Heizgeräte zurück, was die Heizgeräte über die Aktivierung des Signals TIMEOUT EN* an die PAL 484 deaktiviert, wenn die CPU abstürzt. Das heißt, der monostabile Multivibrator 632 weist ein vorbestimmtes Intervall auf, das dieser nach jedem Trigger warten wird, bevor jener das Signal TIMEOUT EN* aktiviert, welches alle Heizzonen deaktiviert. Die CPU 450 führt eine Routine periodisch aus, die den PIC 482 adressiert und Daten an das geeignete Register schreibt, um die Aktivierung eines Signals an der Leitung 634 zu veranlassen, um den monostabilen Multivibrator 632 zu triggern. Wenn die CPU 450 aus irgendeinem Grund "abstürzt" und diese Routine nicht ausführt, deaktiviert der monostabile Multivibrator 632 der Zeitbegrenzung alle Heizzonen.
Der PIC 482 weist ferner die Ausgaben COVHTR EN* und BLKHTREN* (nicht gezeigt) zum Aktivieren der beheizten Abdeckung und des Probenblockheizgeräts auf. Beide Signale sind L-aktiv und werden durch die CPU 450 gesteuert. Sie sind Ausgaben an die PAL 484 über den Bus 636.
Der PIC 482 gibt ferner die Signale BEEP und BEEPCLR* an den Bus 640 aus, um den monostabilen Multivibrator 630 des Tongebers zu steuern.
Der PIC 482 gibt ferner ein Signal MEM1 (nicht gezeigt) aus, das verwendet wird, um Seiten zwischen dem oberen Adressenabschnitt des EPROM 456 und dem unteren Adressenabschnitt des Batterie-RAM 458 umzuschalten. Die zwei weiteren Signale PAGE SEL 0 und PAGE SEL 1 (nicht gezeigt) sind Ausgaben, um zwischen vier 16K-Seiten im EPROM 456 auszuwählen.
Die vier Temperatursensoren sind National LM 135-Sensoren des Zenerdiodentyps mit einer Zenerspannung/Temperaturabhängigkeit von 10 mV/°K. Die Zenerdioden werden von der geregelten Spannungsversorgung 498 durch den 20K-Widerstand 496 angesteuert. Der Strom durch die Zener variiert von etwa 560 μA bis 615 μA über den 0°C–100°C-Betriebsbereich. Die Zener-Selbstheizung variiert von 1,68 mW bis 2,10 mW über den gleichen Bereich.
Die Multiplexer 492 und 494 sind DG409-Analogschalter. Die Spannungen an den Leitungen 488 und 490 werden durch einen AD625KN-Messverstärker mit einer Übertragungsfunktion V_AUS = 3·V_EIN – 7,5 verstärkt. Der A/D-Wandler 486 ist ein AD7672 mit einem Eingangsbereich von 0–5 Volt. Mit der Zener-Temperatursensorausgabe von 2,73 bis 3,73 Volt über den 0°C bis 100°C-Bereich wird die Ausgabe des Verstärkers 578 0,69 Volt bis 3,69 Volt betragen, was bequem innerhalb des A/D-Eingangsbereichs liegt.
Der Schlüssel zu einem hochgenauen Systemverhalten ist eine gute Genauigkeit und eine geringe Drift mit Änderungen in der Umgebungstemperatur. Beide Ziele werden erreicht durch Verwendung einer Präzisionsbezugsspannungsquelle, d. h., dem Eichspannungsgenerator 506, und dem fortlaufenden Überwachen von dessen Ausgabe durch die gleiche Elektronikkette, wie sie verwendet wird, um die Ausgaben der Temperatursensoren und die Wechselspannung der Leitung 510 zu überwachen.
Der Eichspannungsgenerator 506 gibt zwei Präzisionsspannungen an den Leitungen 650 und 652 aus. Eine Spannung beträgt 3,75 Volt und die andere beträgt 3,125 Volt. Diese Spannungen werden erhalten, indem eine geregelte Netzspannung unter Verwendung einer Kette von extrem driftarmen integrierten Dünnfilmwiderständen mit einer 0,05%-Übereinstimmung zwischen den Widerständen und einem 5 ppm/Grad Celsius-Temperaturdriftkoeffizienten zwischen den Widerständen unterteilt wird. Der Eichspannungsgenerator generiert ferner –5 Volt für die A/D-Wandler-Bezugsspannung und –7,5 Volt für die Messverstärkerverschiebung. Diese zwei Spannungen werden an den A/D 486 und den Verstärker 578 durch nicht gezeigte Leitungen kommuniziert. Diese zwei negativen Spannungen werden unter Verwendung des gleichen Dünnfilmwiderstandnetzwerks und OP27 GZ-Operationsverstärker (nicht gezeigt) generiert. Die Verstärkungseinstellungswiderstände für den Operationsverstärker 578 sind ebenso die extrem driftarmen, integrierten, übereinstimmenden Widerstände.
Die Steuer-Firmware, die Steuerelektronik und die Blockausführung sind derart ausgelegt, dass die Vertiefung-zu-Vertiefung- und Instrument-zu-Instrument-Übertragbarkeit von PCR-Protokollen möglich ist.
Laboratorien mit hohem Durchsatz ziehen einen Nutzen aus Instrumenten, die für ein weites Spektrum von Laborpersonal benutzungsfreundlich sind und die einen minimalen Trainingsaufwand erfordern. Die Software für die Erfindung wurde entwickelt, um komplexe PCR-Thermozyklierungsprotokolle auszuführen, während diese leicht programmierbar bleibt. Überdies wird diese mit Sicherungen bereitgestellt, um die Unversehrtheit der Proben während Stromunterbrechungen sicherzustellen und diese kann die detaillierten Ereignisse jedes Durchlaufs in einem gesicherten Speicher dokumentieren.
Nach Beendigung der in den 53 und 54 gezeigten Einschalt-Selbstprüfungen, um dem Bediener zu versichern, dass das System richtig funktioniert, bietet die Benutzeroberfläche der Erfindung ein einfaches oberste-Ebene-Menü (top-level menu), das den Benutzer einlädt, eine Datei laufen zu lassen, zu erzeugen oder zu editieren, oder auf eine Dienstprogrammfunktion zuzugreifen. Es werden keine Programmierfähigkeiten benötigt, da schon vorhandene Vorgabedateien (default files) schnell mit anwendungsspezifischen Zeiten und Temperaturen editiert und dann im Speicher für die spätere Verwendung gespeichert werden können. Ein Dateischutzschema verhindert unautorisierte Änderungen an Programmen eines beliebigen Benutzers. Eine Datei besteht normalerweise aus einem Satz von Anweisungen, um eine gewünschte Temperatur zu halten oder um einen Thermozyklus zu durchlaufen. Komplexe Programme werden erzeugt, indem Dateien miteinander verbunden werden, um ein Verfahren zu bilden. Eine gemeinsam benutzte Datei, wie beispielsweise eine 4°C-Inkubation, die einem Thermozyklus folgt, kann gespeichert werden und dann in Verfahren integriert werden, die von anderen Benutzern erzeugt werden. Eine neue Art von Datei, die AUTO-Datei, ist ein PCR-Zyklierungsprogramm, das dem Benutzer erlaubt, zu spezifizieren, welche von mehreren Arten von Änderungen an Steuerparametern jeden Zyklus stattfinden werden: Zeitinkrementierung (Autosegmentverlängerung, für Ausbeuteerhöhung), Zeitdekrementierung oder Temperaturinkrementierung oder -dekrementierung. Für den höchsten Grad an Steuerpräzision und die verlässlichste Verfahrensübertragbarkeit sind die Temperaturen auf 0,1°C genau einstellbar und die Zeiten werden auf die nächste Sekunde programmiert. Die Erfindung weist die Fähigkeit auf, eine planmäßige PAUSE bei einem oder mehreren Sollwerten während eines Durchlaufs für Reagenzzugaben oder für die Entfernung von Röhrchen bei speziellen Zyklen zu programmieren.
Das System der Erfindung weist die Fähigkeit auf, eine 500-Aufzeichnungen-Verlaufsdatei für jeden Durchlauf zu speichern. Dieses Merkmal erlaubt dem Benutzer, die einzelnen Stufen in jedem Zyklus zu überprüfen und irgendwelche speziellen Zustands- oder Fehlermeldungen bezüglich Unregelmäßigkeiten zu markieren. Mit dem optionalen Drucker stellt die Erfindung eine Hardcopy-Dokumentation der Datei und der Verfahrensparameter, der Laufzeit-Zeit/Temperaturdaten mit einem Zeit-/Datumsstempel, der Konfigurationsparameter und sortierter Dateiverzeichnisse bereit.
Um eine reproduzierbare Thermozyklierung sicherzustellen, wird die berechnete Probentemperatur während der Rampen- und Haltesegmente jedes Zyklus angezeigt. Eine Temperatur, die 1°C niedriger ist als die Solltemperatur, wird normalerweise verwendet, um die Rampenzeit- und Haltezeituhren zu triggern, jedoch kann dies durch den Benutzer geändert werden. Vorausgesetzt, die richtige Zeitkonstante für die Art des Röhrchens und des Volumens wird verwendet, wird sich die Probe immer der gewünschten Probentemperatur mit der gleichen Genauigkeit nähern, ungeachtet dessen, ob lange oder kurze Probeninkubationszeiten programmiert worden sind. Die Benutzer können langsame Rampen für die spezialisierten Anlagerungserfordernisse von degenerierten Primer-Pools oder sehr kurze (1–5 s) Hochtemperatur-Denaturierungsperioden für äußerst GC-reiche Ziele programmieren. Intelligente Vorgaben sind für 2- und 3-Temperatur-PCR-Zyklen vorprogrammiert.
Auf Diagnoseüberprüfungen kann durch beliebige Benutzer zugegriffen werden, um den Heiz- und Kühlsystemzustand zu überprüfen, da die Software Bestanden/Nicht-Bestanden-Reporte (pass/fail reports) gibt. Überdies führt ein Systemverhaltensprogramm eine umfassende Untersystemauswertung durch und generiert einen zusammenfassenden Zustandsreport.
Die Steuer-Firmware umfasst mehrere Abschnitte, die nachstehend aufgelistet sind:

– Diagnoseprogramme
– Kalibrierung
– Installation
– Echtzeitbetriebssystem
– Neun priorisierte Rechenprozesse, die das System handhaben
– Startsequenz
– Benutzeroberfläche

Die verschiedenen Abschnitte der Firmware werden entweder anhand textlicher Beschreibung, Pseudocode oder anhand von beiden beschrieben.
Merkmale der Firmware sind:

1. Ein Steuersystem, das die durchschnittliche Probenblocktemperatur auf innerhalb von +/– 0,1°C handhabt sowie die Temperaturungleichförmigkeit, wie zwischen den Vertiefungen im Probenblock, auf innerhalb von +/– 0,5°C hält.
2. Ein Temperatursteuersystem, das Netzspannungsschwankungen und elektronische Temperaturdrift misst und kompensiert.
3. Umfangreiche Einschaltdiagnoseprogramme, die ermitteln, ob die Systemkomponenten funktionieren.
4. Umfassende Diagnoseprogramme im Install-Programm, die die Heiz- und Kühlsysteme qualifizieren, um sicherzustellen, dass diese richtig funktionieren.
5. Eine logische und organisierte Benutzeroberfläche, die ein menügesteuertes System verwendet, das eine Instrumentoperation mit einer minimalen Abhängigkeit von der Bedienungsanleitung zulässt.
6. Die Fähigkeit, bis zu 17 PCR-Protokolle zu verbinden und diese als ein Verfahren zu speichern.
7. Die Fähigkeit, bis zu 150 PCR-Protokolle und Verfahren in der Benutzeroberfläche zu speichern.
8. Eine Ereignisdatei, die bis zu 500 Ereignisse des vorhergehenden Durchlaufs als Teil des Sequenz-Rechenprozesses (sequence task) aufzeichnet.
9. Die Fähigkeit, das Reaktionsvolumen und den Röhrchengrößentyp zu Beginn eines Durchlaufs für maximale Temperaturgenauigkeit und -regelung als Teil der Benutzeroberfläche zu definieren, und tau (die Röhrchenzeitkonstante) im PID-Rechenprozess zu modifizieren.
10. Nach der Wiederherstellung von einem Netzausfall fährt das System den Probenblock auf 4°C, um beliebige Proben zu retten, die in das Probenfach geladen werden können. Der Analysator berichtet ferner die Dauer des Netzausfalls als Teil des Sequenz-Rechenprozesses.
11. Die Fähigkeit, den Inhalt der Ereignisdatei, die "Laufzeit"-Parameter und die Parameter des gespeicherten PCR-Protokolls als Teil des Druck-Rechenprozesses (print task) zu drucken.
12. Die Fähigkeit, zu konfigurieren, auf was die Vorrichtung während eines Leerlaufzustands rückspringen wird.
13. Die Fähigkeit, zu überprüfen, dass die Sollwerttemperatur innerhalb einer vernünftigen Zeit erreicht wird.
14. Die Fähigkeit, das Instrument aus der Entfernung über einen RS232-Port zu steuern.

Es gibt mehrere Ebenen von Diagnoseprogrammen, die nachstehend beschrieben werden:
Eine Reihe von Einschalttests wird automatisch jedes Mal durchgeführt, wenn das Instrument eingeschaltet wird. Diese bewerten kritische Bereiche der Hardware ohne das Eingreifen des Benutzers. Jeder Test, der ein Komponentenversagen erfasst, wird erneut durchlaufen. Versagt der Test zweimal, wird eine Fehlermeldung angezeigt und die Tastatur wird elektronisch gesperrt, um den Benutzer am Fortfahren zu hindern.
Die folgenden Bereiche werden geprüft:
Programmierbare periphere Schnittstellenvorrichtung
Batterie-RAM-Vorrichtung
Batterie-RAM-Kontrollsumme
EPROM-Vorrichtungen
Programmierbare Schnittstellen-Zeitgeber-Vorrichtungen
Uhr-/Kalendervorrichtung
Programmierbare Unterbrechungssteuerungsvorrichtung
Analog-zu-Digital-Abschnitt
Temperatursensoren
Verifiziere-richtige-Konfiguration-Stecker
Eine Reihe von Nur-Bedienung-Diagnoseprogrammen ist für Endtester beim Hersteller oder für Außendienstingenieure durch eine "verborgene" Tastenfolge (d. h., dem Kunden unbekannt) verfügbar. Viele der Tests sind die gleichen wie die in den Einschaltdiagnoseprogrammen, mit der Ausnahme, dass diese fortlaufend bis zu 99 Mal ausgeführt werden können.
Die folgenden Bereiche werden geprüft:
Programmierbare periphere Schnittstellenvorrichtung
Batterie-RAM-Vorrichtung
Batterie-RAM-Kontrollsumme
EPROM-Vorrichtungen
Programmierbare Schnittstellen-Zeitgeber-Vorrichtungen
Uhr-/Kalendervorrichtung
Programmierbare Unterbrechungssteuerungsvorrichtung
Analog-zu-Digital-Abschnitt
RS-232-Abschnitt
Anzeigeabschnitt
Tastatur
Tongeber
Rampenkühlungsventile
Oberprüfung für EPROM-Fehljustierung (mismatch)
Firmware-Versionsebene
Batterie-RAM-Kontrollsumme und -Initialisierung
Autostart-Programm-Flag
Lösche-Kalibrierung-Flag
Heizgerät und Steuerschaltung der beheizten Abdeckung
Heizgerät und Steuerschaltung der Kante
Heizgerät und Steuerschaltung des Verteilers
Zentrale(s) Heizgerät und Steuerschaltung
Test der thermischen Abschaltung des Probenblocks
Test der thermischen Abschaltung der beheizten Abdeckung
Benutzerdiagnoseprogramme sind ebenso verfügbar, um dem Benutzer zu erlauben, einen schnellen Kühl- und Heizrampen-Verifikationstest und eine umfassende Bestätigung des Heiz- und Kühlsystems durchzuführen. Diese Diagnoseprogramme erlauben dem Benutzer ferner, die Ereignisdatei zu betrachten, welche eine sequenzielle Aufzeichnung von Ereignissen ist, die im vorhergehenden Durchlauf stattgefunden haben. Diese Aufzeichnungen enthalten die Zeit, die Temperatur, die Sollwertanzahl, die Zyklusanzahl, die Programmanzahl und Zustandsmeldungen.
Ferndiagnoseprogramme sind verfügbar, um die Steuerung des Systems von einem externen Rechner über den RS-232-Port zu erlauben. Die Steuerung ist auf die Bedienungsdiagnoseprogramme und die Instrumentkalibrierung beschränkt.
Die Kalibrierung, um verschiedene Parameter zu ermitteln, wie beispielsweise den Heizgerätwiderstand usw., wird durchgeführt. Der Zugriff auf den Kalibrierungsbildschirm (calibration screen) ist durch eine "verborgene" Tastenfolge (d. h., dem Kunden unbekannt) eingeschränkt. Die folgenden Parameter werden kalibriert:
Der Konfigurationsstecker ist ein Modul, das die Kühlereinheit, die Probenblockheizgeräte, die Kühlmittelpumpe und die Spannungsversorgungen für die richtige Spannung und Frequenz (100 V/50 Hz, 100/60 Hz, 120/60 Hz, 220/50 Hz oder 230/50 Hz) neu verdrahtet. Der Benutzer gibt den Typ des installierten Konfigurationssteckers ein, Die Firmware benutzt diese Information, um den äquivalenten Widerstand der Probenblockheizgeräte zu berechnen. Nach dem Einschalten verifiziert das System, dass der ausgewählte Konfigurationsstecker mit der momentanen Netzspannung und Frequenz übereinstimmt.
Der Heizgerätwiderstand muss im Kalibrierungsverfahren ermittelt werden, so dass genaue Berechnungen der gelieferten Heizleistung durchgeführt werden können. Der Benutzer gibt die tatsächlichen Widerstände der sechs Probenblockheizgeräte (zwei Hauptheizgeräte, zwei Verteilerheizgeräte und zwei Kantenheizgeräte) ein. Der Konfigurationsstecker verdrahtet die Heizgeräte physikalisch in Reihe für den 220–230-Volt-Wechselspannungsbetrieb und parallel für den 100–120-Volt-Wechselspannungsbetrieb. Die Firmware berechnet den äquivalenten Widerstand von jedem der drei Heizgeräte anhand der folgenden Formel: Für 100–120 Volt Wechselspannung: Req = (R1·R2)/R1 + R2 (7) Für 220–230 Volt Wechselspannung: Req = R1 + R2 (8)
Der äquivalente Widerstand wird verwendet, um einen genauen Betrag an Heizleistung an den Probenblock zu liefern (Leistung = Spannung² × Widerstand).
Die Kalibrierung des A/D-Schaltkreises ist notwendig, damit die Temperaturen genau gemessen werden können. Dies wird durch Messen zweier Prüfpunktspannungen (TP6 und TP7 auf der CPU-Platte) und Eingeben der gemessenen Spannungen durchgeführt. Die Ausgabe des A/D bei jeder Spannung bildet die Basis einer Zweipunkt-Kalibrierungskurve. Diese Spannungen werden aus einer 5-Volt-Präzisisionsquelle abgezweigt und sind genau und temperaturunabhängig. Beim Start jedes Durchlaufs werden diese Spannungen durch das System abgelesen, um die elektronische Drift aufgrund der Temperatur zu messen, da jedwede Änderung in der A/D-Ausgabe durch die Temperaturabhängigkeiten in der analogen Kette (Multiplexer, Analogverstärker und A/D-Wandler) bedingt ist.
Die Kalibrierung der vier Temperatursensoren (Probenblock, Umgebung, Kühlmittel und beheizte Abdeckung) wird für genaue Temperaturmessungen durchgeführt. Vor dem Einbau in ein Instrument werden der Umgebungs-, Kühlmittel- und der Temperatursensor der beheizten Abdeckung in ein Wasserbad gelegt, wo deren Ausgabe aufgezeichnet wird (XX.X°C bei YYYY mV). Diese Werte werden dann in das System eingegeben. Da die Temperaturgenauigkeit in diesen Bereichen nicht kritisch ist, wird eine Einpunkt-Kalibrierungskurve verwendet.
Der Probenblocksensor wird im Instrument kalibriert. Eine Anordnung von 15 genauen Temperatursonden wird strategisch im Probenblock in der bevorzugten Ausführungsform angebracht. Die Ausgabe der Temperatursonden wird gesammelt und durch einen Rechner gemittelt. Die Firmware befiehlt dem Block, auf 40°C zu fahren. Nach einer kurzen Stabilisierungsperiode gibt der Benutzer die durchschnittliche Blocktemperatur, wie sie durch die 15 Sonden abgelesen wird, ein. Diese Prozedur wird bei 95°C wiederholt, wobei eine Zweipunkt-Kalibrierungskurve gebildet wird.
Die Kalibrierung der Wechselspannung-Gleichspannung-Abtastschaltung wird durchgeführt, indem die Ausgabe der Wechselspannung-Gleichspannung-Schaltung für zwei gegebene Eingangswechselspannungen in das System eingegeben wird, wobei eine Zweipunkt-Kalibrierungskurve ausgebildet wird. Die Ausgabe der Schaltung ist nicht linear über den benötigten Bereich (90–260 Volt Wechselspannung) und erfordert daher zwei Punkte an jedem Ende (100 und 120, 220 und 240 Volt Wechselspannung), verwendet jedoch lediglich einen Satz basierend auf der momentanen Eingangsspannung.
Eine genaue Messung der Wechselspannung ist notwendig, um einen genauen Leistungsbetrag an den Probenblock zu Tiefem (Leistung = Spannung² × Widerstand).
Das Install-Programm ist eine Diagnoseeinrichtung, die einen umfassenden Test der Kühl- und Heizsysteme durchführt. Install misst oder berechnet die Regelkühlungskonduktanz, die Rampenkühlungskonduktanz bei 10°C und 18°C, die Kühlleistung bei 10°C und 20°C, die Probenblockwärme- und Kühlmittelkapazität und die Probenblocksensorverzögerung. Der Zweck von Install ist dreifach:

1. Störanfällige oder fehlerhafte Komponenten aufzudecken.
2. Einige der gemessenen Werte als Systemkonstanten, die in dem batteriegestützten RAM gespeichert sind, zu verwenden, um das Steuersystem für ein gegebenes Instrument zu optimieren.
3. Den Leistungsabfall des Heiz- und Kühlsystems über der Zeit zu messen.

Install wird einmal ausgeführt, bevor das System ausgeliefert wird, und sollte außerdem vor der Verwendung oder wann immer eine Hauptkomponente ersetzt wird, laufen gelassen werden. Das Install-Programm kann ferner durch den Benutzer unter den Benutzerdiagnoseprogrammen laufen gelassen werden.
Der Heizgerätsonarimpulstest verifiziert, dass die Heizgeräte für die momentane Netzspannung richtig konfiguriert sind (d. h., parallel geschaltet für 90–132 Volt Wechselspannung und in Reihe geschaltet für 208–264 Volt Wechselspannung). Die Firmware liefert einen Leistungsstoß an den Probenblock und überwacht dann den Anstieg in der Temperatur über ein 10-Sekunden-Zeitintervall. Liegt der Temperaturanstieg außerhalb eines spezifizierten Rampenratenfensters, sind die Heizgeräte für die momentane Netzspannung falsch verdrahtet und der Install-Prozess wird beendet.
Der Regelkühlungskonduktanztest misst die thermische Konduktanz bzw. den Wärmeleitwert K_cc über dem Probenblock zu den Regelkühlungsverbindungsgängen. Dieser Test wird durchgeführt, indem zunächst die Probenblocktemperatur auf 60°C gefahren wird (die Rampenventile sind geschlossen), dann die Heizleistung, die benötigt wird, um den Block bei 60°C über ein 30-Sekunden-Zeitintervall zu halten, integriert wird. Die integrierte Leistung wird durch die Summe der Differenz zwischen der Block- und Kühlmitteltemperatur über das Intervall geteilt. Kcc = Σ Heizleistung 60°C/Σ Block – Kühlmittel Temp (9)
Typische Werte liegen bei 1,40 bis 1,55 Watt/°C. Ein niedriger K_cc kann (ein) verschmutzte(s) Futterrohr(e) anzeigen. Ein hoher K_cc kann durch ein Rampenventil, das nicht vollständig geschlossen ist, eine Leckage des Kühlmittels zum Außendurchmesser des Futterrohrs oder ein Futterrohr bedingt sein, das sich verschoben hat.
Der Blockwärmekapazität-(Blk Cp)Test misst die Wärmekapazität des Probenblocks, indem zunächst der Block bei 35°C geregelt wird, dann die maximale Leistung an die Heizgeräte für 20 Sekunden angewandt wird. Die Blockwärmekapazität entspricht der integrierten Leistung geteilt durch die Differenz in der Blocktemperatur. Um die Genauigkeit zu erhöhen, wird der Effekt der Vorkühlleistung von der integrierten Leistung subtrahiert. Blk Cp = Rampenzeit·(Heizleistung – Regelkühlleistung)/delta Temp (10) wobei

Rampenzeit: = 20 Sekunden
Heizleistung: = 500 Watt
Regelkühlleistung: = (Σ Block – Kühlmittel Temp)·K_cc
delta Temp: = TBlock_t=20 – TBlock_t=0

Der typische Wert von Block Cp liegt bei 440 Wattsekunden/°C ± 30. Unter der Annahme eines normalen K_cc-Werts ist ein Anstieg in der Blockwärmekapazität durch einen Anstieg in den Wärmebelastungen bedingt, wie beispielsweise Feuchtigkeit in der Schaumstoffbeschichtung, Verlust der Isolierung um den Probenblock oder durch einen Abfall in der Heizleistung, wie beispielsweise einem Versagen einer der sechs Heizzonen oder einem Versagen der elektronischen Schaltung, die die Heizzonen ansteuert, oder durch ein falsches oder ein falsch verdrahtetes Spannungskonfigurationsmodul.
Ein Kühlertest misst die Kühlausgabe des Systems in Watt bei 10°C und 18°C. Die Kühlleistung des Systems oder die Kühlerausgabe entspricht bei einer gegebenen Temperatur der Summe der Wärmebelastungen bei dieser Temperatur. Die Hauptkomponenten sind: 1. benötigte Heizleistung, um den Block bei einer gegebenen Temperatur zu halten, 2. Leistung, die durch die Pumpe abgeführt wird, die verwendet wird, um das Kühlmittel um das System zu zirkulieren, und 3. Verluste in den Kühlmittelleitungen an die Umgebung. Der Kühlerleistungs-(chiller power)Parameter wird gemessen, indem die Kühlmitteltemperatur bei entweder 10°C oder 18°C geregelt wird und die an den Probenblock angewandte Leis tung, um eine konstante Kühlmitteltemperatur über ein 32-Sekunden-Intervall zu halten, integriert wird. Die Differenz zwischen der Block- und Kühlmitteltemperatur wird ebenso integriert, um Verluste an die Umgebungstemperatur zu berechnen. Kühlerleistung = Σ Heizleistung + Pumpenleistung + (Kamb·Σ (Blk – Kühl Temp)) (11)wobei:

Heizleistung: = Summe der Heizleistung, die benötigt wird, um das Kühlmittel bei 10°C oder 18°C über eine Zeit von 32 Sekunden zu halten
Pumpenleistung: = Umwälzpumpe, 12 Watt
Kamb: = Konduktanz zur Umgebung, 20 Watt/°C
Blk – Kühl Temp: = Summe der Differenz in der Block- und Kühlmitteltemperatur über eine Zeit von 32 Sekunden.

Der typische Wert für die Kühlerleistung beträgt 230 Watt ± 40 bei 10°C und 370 Watt ± 30 bei 18°C. Eine niedrige Kühlerleistung kann durch ein Hindernis in dem Ventilatorweg, einem defekten Ventilator oder eine störanfällige oder fehlerhafte Kühlereinheit bedingt sein. Jene kann außerdem durch einen fehlverdrahteten Spannungskonfigurationsstecker bedingt sein.
Ein Rampenkühlungskonduktanz-(ramp cooling conductance, K_c)Test misst den Wärmeleitwert bei 10°C und 18°C über den Probenblock zu den Rampen- und Regelkühlungsverbindungsgängen. Dieser Test wird durchgeführt, indem zunächst die Kühlmitteltemperatur bei 10°C oder 18°C geregelt wird, dann die angewandte Heizleistung, um das Kühlmittel bei der gegebenen Temperatur zu halten, über ein 30-Sekunden-Zeitintervall integriert wird, dividiert durch die Differenz der Block- und Kühlmitteltemperatur über das Zeitintervall. Kc = Σ Heizleistung/(Block – Kühlmittel Temperatur) (12)
Typische Werte für K_c sind 28 Watt/°C ± 3 bei 10°C und 31 Watt/°C ± 3 bei 18°C. Ein niedriger K_c kann durch ein geschlossenes oder verstopftes Rampenventil, eine geknickte Kühlmittelrohrleitung, eine schwache Pumpe oder ein hartes Wasser/Prestone^TM-Gemisch bedingt sein.
Ein Sensorverzögerungs-(sensor lag)Test misst die Blocksensorverzögerung, indem zunächst die Blocktemperatur auf 35°C geregelt wird und dann 500 Watt an Heizleistung für 2 Sekunden angewandt wird und die Zeit gemessen wird, die die Blocktemperatur benötigt, um 1°C anzusteigen. Typische Werte liegen bei 13 bis 16 Einheiten, wobei jede Einheit 200 ms entspricht. Eine langsame oder lange Sensorverzögerung kann durch eine schlechte Schnittstelle zwischen dem Sensor und dem Block bedingt sein, wie beispielsweise dem Fehlen von Thermoschmierfett, einem schlecht gefertigten Sensorhohlraum oder einem fehlerhaften Sensor.
Die verbleibenden Install-Tests werden derzeit durch das Install-Programm ausgeführt, weisen jedoch aufgrund der Tatsache, dass diese berechnete Werte sind oder eine Funktion von so vielen Variablen, dass ihre Ergebnisse die Quelle eines Problems nicht genau bestimmen, eingeschränkte Diagnosezwecke auf.
Das Install-Programm berechnet die Steigung der Rampenkühlungskonduktanz (S_c) zwischen 18°C und 10°C. Jene stellt ein Maß der Linearität der Konduktanzkurve dar. Jene wird außerdem verwendet, um die Rampenkühlungskonduktanz bei 0°C anzunähern. Typische Werte betragen 0,40 ± 0,2. Die Streubreite in den Werten bestätigt die Tatsache, dass es sich lediglich um eine Annäherung handelt. Sc = (Kc_18° – Kc_10°)/(18°C – 10°C) (13)
Das Install-Programm berechnet ferner die Kühlungskonduktanz K_c0. K_c0 ist eine Annäherung der Kühlungskonduktanz bei 0°C. Der Wert wird von der tatsächlichen Konduktanz bei 10°C extrapoliert. Typische Werte betragen 23 Watt/C° ± 5. Die verwendete Formel ist: Kc0 = Kc_10 – (Sc·10°C) (14)
Das Install-Programm berechnet ferner die Kühlmittelkapazität (coolant capacity, Cool Cp), die eine Annäherung der Wärmekapazität des gesamten Kühlmittelstroms ist (Kühlmittel, Rohrleitungen, Wärmetauscher und Ventile). Die Kühlkapazität entspricht den Komponenten, die Wärme in das Kühlmittel pumpen, minus der Komponenten, die Wärme vom Kühlmittel abführen. Die verwendete Mechanik, um die Komponenten zu messen und zu berechnen, ist komplex und wird im Detail im Quellcode-Beschreibungsabschnitt beschrieben. Bei dieser Messung wird es dem Kühlmittel ermöglicht, sich bei 10°C zu stabilisieren, Die maximale Heizleistung wird am Probenblock für ein Zeitintervall von 128 Sekunden angewandt. Cool Cp = Wärmequellen – Kühlmittelquellen (15) Cool Cp = Heizleistung + Pumpenleistung + Kamb·(ΣTamb – ΣTkühl) – Block Cp·(Tblockt=0 – Tblockt=128) – Durchschnittskühlerleistung zwischen Tkühlt=0 und Tkühlt=128 (16)
In { } eingeschlossene Zeichen geben die im Quellcode verwendeten Variablennamen an.
Heizgerät-Sonarimpulstest-Pseudocode:
Der Heizgerät-Sonarimpulstest verifiziert, dass die Heizgeräte für die momentane Netzspannung richtig verdrahtet sind.

Bringe den Probenblock und das Kühlmittel auf einen bekannten und stabilen Punkt.

Schalte die Rampenkühlungsventile EIN
Warte, bis der Block und das Kühlmittel 5°C unterschreitet
Schalte die Rampenkühlungsventile AUS

Messe die Kühlwirkung der Regelkühlung durch Messen des Blocktemperaturabfalls über ein 10-Sekunden-Zeitintervall. Warte 10 Sekunden zur Stabilisierung vor der Durchführung irgendwelcher Messungen.

Warte 10 Sekunden
temp1 = Blocktemperatur
Warte 10 Sekunden
temp2 = Blocktemperatur
{tempa} = temp2 – temp1

Prüfe die Variable {linevolts}, die die tatsächlich gemessene Netzspannung enthält. Betätige das Heizgerät durch Impulse mit 75 Watt für eine Netzspannung, die größer als 190 Volt ist, oder mit 300 Watt, wenn jene kleiner als 140 Volt ist.

wenn ({linevolts} > 190 Volt) dann
liefere 75 Watt an Heizgerät
sonst
liefere 300 Watt an Heizgerät

Messe den Temperaturanstieg über ein 10-Sekunden-Zeitintervall. Das Ergebnis ist die durchschnittliche Heizrate (heat rate) in 0,01°/Sekunde.

temp1 = Blocktemperatur
Warte 10 Sekunden
temp2 = Blocktemperatur
{tempb} = temp2 – temp1

Subtrahiere die durchschnittliche Heizrate {tempb} von der Regelkühlwirkung, um die wahre Heizrate zu berechnen. heat_rate = {tempb} – {tempa} (17) Bewerte die Heizrate (heat_rate). Für 220 Volt–230 Volt sollte die Heizrate geringer als 0,30°/Sekunde sein. Für 100 Volt–120 Volt sollte die Heizrate größer als 0,30°/Sekunde sein.

wenn (linevoltage = 220 Volt und heat_rate > 0,30°/Sekunde) dann
Fehler → Heizgeräte für 120 verdrahtet
Sperre Tastatur
wenn (linevoltage = 120 Volt und heat_rate < 0,30°/Sekunde) dann
Fehler → Heizgeräte für 220 verdrahtet
Sperre Tastatur
KCC_Test-Pseudocode
Dieser Test misst die Regelkühlungskonduktanz, auch bekannt als K_cc.

K_cc wird bei einer Blocktemperatur von 60°C gemessen.

Steuere Block auf 60°C
Halte Blocktemperatur bei 60°C für 300 Sekunden

Integriere die an die Probenblockheizgeräte über ein 30-Sekunden-Zeitintervall angewandte Leistung. Messe und integriere die Leistung, die benötigt wird, um die Blocktemperatur zu halten, mit Regelkühlungsvorspannung (control cooling bias).

{dt_sum} = 0 (delta-Temperatursumme; delta temperature sum)
{main_pwr_sum} = 0 (Hauptheizgerät-Leistungssumme; main heater power sum)
{aux_pwr_sum} = 0 (Hilfsheizgerät-Leistungssumme; auxiliary heater power sum)

für (Zählstand = 1 bis 30)
{
{dt_sum} = {dt_sum} + (Blocktemperatur – Kühlmitteltemperatur)
warte 1 s

Akkumuliere die an die Haupt- und Hilfsheizgeräte angewandte Leistung. Der tatsächliche Code liegt im PID-Regelrechenprozess und wird daher alle 200 ms summiert.

{main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + {actual_power}
{aux_pwr_sum} = {aux_pwr_sum} + {aux1_actual} + {aux2_actual}
}

Berechne die Konduktanz durch Teilen der Leistungssumme durch die Temperatursumme. Beachte, dass die Einheiten 10 mW/°C sind. Kcc = ({main_pwr_sum} + {aux_pwr_sum})/{dt_sum} (18)
BLOCK_CP-Test-Pseudocode
Dieser Test misst die Probenblockwärmekapazität.

Steuere den Block auf 35°C
Regle Blocktemperatur bei 35°C für 5 Sekunden und zeichne Anfangstemperatur (initial temperature) auf.

initial_temp = Blocktemperatur

Liefere maximale Leistung an Heizgeräte für 20 Sekunden, während die Differenz von Block- zu Kühlmitteltemperatur sowie Heizleistung summiert wird.

Liefere 500 Watt
{dt_sum} = 0
für (Zählerstand = 1 bis 20 Sekunden)
{
{dt_sum} = {dt_sum} + (Blocktemperatur – Kühlmitteltemperatur)
warte 1 Sekunde
} delta_temp = Blocktemperatur – initial_temp (19) Berechne die Joule in Kühlleistung, die durch die Regelkühlung bedingt sind, die während der Rampe auftritt. cool_joule = Regelkühlungskonduktanz (Kcc)·{dt_sum} (20) Berechne die gesamten an den Block von dem Hauptheizgerät und der Regekühlung angewandten Joule. Dividiere durch Temperaturänderung über dem Intervall, um Wärmekapazität zu berechnen. Block CP = Rampenzeit·(Heizleistung – cool_joule)/delta_temp (21)wobei:

Rampenzeit: = 20 Sekunden
Heizleistung: = 500 Watt

COOL_PWR_10:
Dieser Test misst die Kühlerleistung bei 10°C.

Regle die Kühlmitteltemperatur bei 10°C und stabilisiere für 120 s.
Zählerstand = 120
führe aus solange (Zählerstand ! = 0)
{
wenn (Kühlmitteltemperatur = 10 ± 0,5°C) dann
Zählerstand = Zählerstand – 1
sonst
Zählerstand = 120
warte 1 Sekunde
}

An diesem Punkt ist das Kühlmittel bei 10°C für 120 Sekunden gewesen und hat sich stabilisiert. Integriere die angewandte Leistung, um eine Kühlmitteltemperatur von 10°C zu halten, über 32 Sekunden.

{cool_init} = Kühlmitteltemperatur
{main_pwr_sum} = 0
{aux_pwr_sum} = 0
{delta_temp_sum} = 0
für (Zählerstand = 1 bis 32)
{

Akkumuliere die an die Haupt- und Hilfsheizgeräte angewandte Leistung. Der tatsächliche Code liegt im Steuerungs-Rechenprozess (control task).

{main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + actual_power
{aux_pwr_sum} = {aux_pwr_sum} + aux1_actual + aux2_actual
delta_temp_sum = delta_temp_sum + (Umgebungstemp. – Kühlmitteltemp.)
warte 1 Sekunde
}

Berechne die Anzahl von Joule an Energie, die der Kühlmittelmasse während des Integrationsintervalls zugeführt wird. "(Kühlmitteltemperatur – cool_init)" ist die Änderung in der Kühlmitteltemperatur während des Integrationsintervalls. 550 ist der Cp des Kühlmittels in Joule. Daher ist das Produkt in Joule angegeben. Dieses stellt die dem Kühlmittel zugeführte Zusatzwärme dar, welche dieses zum Driften vom Sollwert während des Integrationsintervalls veranlasste. Dieser Fehler wird nachstehend von der gesamten angewandten Wärme subtrahiert, bevor die Kühlleistung berechnet wird. cool_init = (Kühlmitteltemperatur – cool_init)·550 J (22) Addiere die Hauptheizgerät-Leistungssumme zu der Hilfsheizgerät-Leistungssumme, um die in 32 Sekunden abgeführten Joule zu erhalten. Dividiere durch 32, um die durchschnittlichen Joule/s zu erhalten. {main_pwr_sum} = ({main_pwr_sum} + {aux_pwr_sum} – cool_init)/32 (23) Berechne die Kühlerleistung bei 10°C durch Summieren aller Kühlerleistungskomponenten. Leistung10°C = main_power_sum + PUMP PWR + (K_AMB·delta_temp_sum) (24)wobei:

{main_pwr_sum}: = Summierung der Heizleistung über Intervall
PUMP: PWR = 12 Watt, Pumpe, die Kühlmittel zirkuliert
delta_temp_sum: = Summierung von Umgebung – Kühlmittel über Intervall
K_AMB: = 20 Watt/K, Wärmeleitwert von Kühlung zu Umgebung

KC_10-Test-Pseudocode
Dieser Test misst die Rampenkühlungskonduktanz bei 10°C.

Regle die Kühlmitteltemperatur bei 10°C ± 0,5 und erlaube dieser für 10 Sekunden, sich zu stabilisieren.

An diesem Punkt befindet sich das Kühlmittel am Sollwert und wird geregelt. Integriere über ein 30-Sekunden-Zeitintervall die an die Heizgeräte angewandte Leistung, um das Kühlmittel bei 10°C zu halten. Summiere die Differenz zwischen der Block- und Kühlmitteltemperatur.

{main_pwr_sum} = 0
{aux-pwr_sum} = 0
{dt_sum} = 0
für (Zählerstand = 1 bis 30)
{

Akkumuliere die an die Haupt- und Hilfsheizgeräte angewandte Leistung. Der tatsächliche Code steht im PID-Regelrechenprozess.

{main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + actual_power
{aux_pwr_sum} = {aux_pwr_sum} + aux1_actual + aux2_actual

{dt_sum} = {dt_sum} + (Blocktemperatur – Kühlmitteltemperatur)
warte 1 Sekunde
}

Berechne die Energie in Joule, die an den Block über das Summierungsintervall geliefert wird. Einheiten sind in 0,1 Watt. {main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + {aux_pwr_sum} (25) Dividiere die Leistungssumme durch Block- – Kühlmitteltemperatursumme, um die Rampenkühlungskonduktanz in 100 mW/K zu erhalten. Kc_10 = {main_pwr_sum}/{dt_sum} (26)
COOL_PWR 18-Test-Pseudocode:
Dieser Test misst die Kühlerleistung bei 18°C.

Bringe den Probenblock und das Kühlmittel auf einen bekannten und stabilen Punkt. Regle die Kühlmitteltemperatur bei 18°C und stabilisiere für 128 s.

Zählerstand = 128
führe aus solange (Zählerstand ! = 0)
{
wenn (Kühlmitteltemperatur = 18 ± 0,5°C) dann
Zählerstand = Zählerstand – 1
sonst
Zählerstand = 120
warte 1 Sekunde
}

An diesem Punkt ist das Kühlmittel bei 18°C für 120 Sekunden gewesen und hat sich stabilisiert. Integriere die angewandte Leistung, um eine Kühlmitteltemperatur von 18°C zu halten, über 32 Sekunden.

{cool_init} = Kühlmitteltemperatur
{main_pwr_sum} = 0
{aux_pwr_sum} = 0
{delta_temp_sum} = 0
für (Zählerstand = 1 bis 32)
{
Akkumuliere die an die Haupt- und Hilfsheizgeräte angewandte Leistung. Der tatsächliche Code steht im Steuerungs-Rechenprozess (control task).

{main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + actual_power
{aux_pwr_sum} = {aux_pwr_sum} + aux1_actual + aux2_actual
delta_temp_sum = delta_temp_sum + (Umgebungstemp. – Kühlmitteltemp.)
warte 1 Sekunde
}

Berechne die Anzahl von Joule an Energie, die der Kühlmittelmasse während des Integrationsintervalls zugeführt wird. "(Kühlmitteltemperatur – cool_init)" ist die Änderung in der Kühlmitteltemperatur während des Integrationsintervalls. 550 ist der Cp des Kühlmittels in Joule. Daher ist das Produkt in Joule angegeben. Dieses stellt die dem Kühlmittel zugeführte Zusatzwärme dar, welche dieses zum Driften vom Sollwert während des Integrationsintervalls veranlasste. Dieser Fehler wird nachstehend von der gesamten angewandten Wärme subtrahiert, bevor die Kühlleistung berechnet wird. cool_init = (Kühlmitteltemperatur – cool_init)·550 J (27)Addiere Hauptheizgerät-Leistungssumme zu Hilfsheizgerät-Leistungssumme, um die in 32 Sekunden abgeführten Joule zu erhalten. Dividiere durch 32, um die durchschnittlichen Joule/s zu erhalten. {main_pwr_sum} = ({main_pwr_sum} + {aux_pwr_sum} – cool_init)/32 (28) Berechne die Kühlerleistung bei 18°C durch Summieren aller Kühlerleistungskomponenten. Leistung18°C = main_power_sum + PUMP PWR + (K_AMB·delta_temp_sum) (29) wobei:

{main_pwr_sum}: = Summierung der Heizleistung über Intervall
PUMP PWR: = 12 Watt, Pumpe, die Kühlmittel zirkuliert
delta_temp_sum: = Summierung von Umgebung – Kühlmittel über Intervall
K_AMB: = 20 Watt/K, Wärmeleitwert von Kühlung zu Umgebung

KC_18-Test-Pseudocode:
Dieser Test misst die Rampenkühlungskonduktanz bei 18°C.

Regle die Kühlmitteltemperatur bei 18°C ± 0,5 und erlaube dieser für 10 Sekunden, sich zu stabilisieren.

An diesem Punkt befindet sich das Kühlmittel am Sollwert und wird geregelt. Integriere über ein 30-Sekunden-Zeitintervall die an die Heizgeräte angewandte Leistung, um das Kühlmittel bei 18°C zu halten. Summiere die Differenz zwischen der Block- und Kühlmitteltemperatur.

{main_pwr_sum} = 0
{aux_pwr_sum} = 0
{dt_sum} = 0
für (Zählerstand = 1 bis 30)
{
Akkumuliere die an die Haupt- und Hilfsheizgeräte angewandte Leistung. Der tatsächliche Code steht im Regel-Rechenprozess.

{main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + actual_power
{aux_pwr_sum} = {aux_pwr_sum} + aux1_actual + aux2_actual
{dt_sum} = {dt_sum} + (Blocktemperatur – Kühlmitteltemperatur)
warte 1 Sekunde
}

Berechne die Energie in Joule, die an den Block über das Summierungsintervall geliefert wird. Einheiten sind in 0,1 Watt. {main_pwr_sum} = {main_pwr_sum} + {aux_pwr_sum} (30)Dividiere Leistungssumme durch Block- – Kühlmitteltemperatursumme, um Rampenkühlungskonduktanz in 100 mW/K zu erhalten. Kc_18 = {main_pwr_sum}/{dt_sum} (31)
SENLAG-Test-Pseudocode:
Dieser Test misst die Probenblock-Sensorverzögerung (sensor lag).

Steuere den Block auf 35°C. Halte innerhalb ± 0,2°C für 20 Sekunden, dann zeichne Temperatur des Blocks auf.

{tempa} = Blocktemperatur

Liefere 500 Watt Leistung an Probenblock.

Wende 500 Watt Leistung für die nächsten 2 Sekunden an und zähle die Anzahl an Iterationen durch die Schleife, damit die Blocktemperatur 1°C ansteigt. Jede Iterationsschleife führt alle 200 ms aus, daher entspricht die tatsächliche Sensorverzögerung Zählerstand·200 ms.

secs = 0
Zählerstand = 0

führe aus solange (WAHR)
wenn (secs ≥ 2 Sekunden) dann
schalte Heizgeräte ab
wenn (Blocktemperatur – tempa > 1,0°C) dann
beende solange Schleife
Zählerstand = Zählerstand + 1
}

Ende führe aus solange

Sensorverzögerung = Zählerstand
Kühlmittel-CP-Test-Pseudocode:
Dieser Test berechnet die Kühlmittelkapazität des gesamten Systems.

Stabilisiere die Kühlmitteltemperatur bei 10°C ± 0,5.

Sende Meldung an den PID-Regel-Rechenprozess, um die Kühlmitteltemperatur von ihrem momentanen Wert (etwa 10°C) auf 18°C linear zu erhöhen (ramp).

Warte, dass das Kühlmittel 12°C überschreitet, so dass die Kühlmittel CP-Rampe immer bei der gleichen Temperatur beginnt und das Ramping glatt begonnen hat. Beachte die anfängliche Umgebungs- und Blocktemperatur.

führe aus solange (Kühlmitteltemperatur < 12°C)
{
warte 1 Sekunde
}
{blk_delta} = Blocktemperatur
{h2o_delta} = Kühlmitteltemperatur

Für die nächsten 2 Minuten, solange die Kühlmitteltemperatur linear auf 18°C ansteigt, summiere die Kühlmitteltemperatur und die Differenz zwischen der Umgebungs- und Kühlmitteltemperatur.

{temp_sum} = 0
{cool_sum} = 0

für (Zählerstand 1 bis 128 Sekunden)
{ {cool_sum} = cool_temp_sum + Kühlmitteltemperatur. (32) {temp_sum} = Umgebungstemperatur – Kühlmitteltemperatur (33) warte 1 Sekunde
Zählerstand = Zählerstand + 1
}

Berechne die Änderung in den Temperaturen über das 2-Minuten-Zeitintervall. {blk_delta} = Blocktemperatur – {blk_delta} (34) {h2o_delta} = Kühlmitteltemperatur – {h2o_delta} (35)Berechne KChill, d. h., die Änderungsrate der Kühlerleistung mit der Kühlmitteltemperatur über den Kühlmittelbereich von 10°C bis 20°C. Beachte, dass die Einheiten in Watt/10°C sind. KChill = (Kühlerleistung bei 18°C – Kühlerleistung bei 10°C) (36)Berechne Sc, welches die Steigung der Rampenkühlungskonduktanz über dem Temperaturbereich von 18°C bis 10°C ist. Die Einheiten sind in Watt/10°C/10°C. Sc = (Kc_18 – Kc_10)/8 (37)Berechne Kc_0, die Rampenkühlungskonduktanz extrapoliert auf 0°C. Kc_0 = Kc_10 – (Sc·10) (38)Berechne Cp_Cool, den Cp des Kühlmittels durch: Cp_Cool = (HEATPOWER·128 + PUMP_PWR·128 – Leistung bei 0°C·128 – Block_Cp·blk_delta + K_AMB·temp_sum – Kchill·cool_temp_sum)/h2o_delta (39)wobei:

HEATPOWER: = 500 Watt, die Heizleistung, die angewandt wird, um den Block zu wärmen, wodurch das Kühlmittel erhitzt wird. Diese wird mit 128 multipliziert, da das Heizintervall 128 s betrug.
PUMP_PWR: = 12 Watt, die Leistung der Pumpe, die das Kühlmittel zirkuliert, multipliziert mit 128 Sekunden.
Pwr_0°C: = Die Kühlerleistung bei 0°C, multipliziert mit 128 Sekunden.
Block_Cp: = Wärmekapazität des Probenblocks.
blk_delta: = Änderung in der Blocktemperatur über das Heizintervall.
K_AMB: = 200 Watt/K, Wärmeleitwert von Kühlung zu Umgebung.
temp_sum: = Die Summe einmal pro Sekunde von Umgebungs- – Kühlmitteltemperatur über das Intervall.
h2o_delta: = Änderung in der Kühlmitteltemperatur über das Heizintervall (etwa 6°C).
Kchill: = Steigung der Kühlerleistung über die Kühlmitteltemperatur.
cool_sum: = Die Summe der Kühlmitteltemperatur, einmal pro Sekunde, über das Heizintervall.

Echtzeitbetriebssystem – CRETIN
CRETIN ist ein unabhängiger Multitasking Kernel, der Systemdienste an andere Softwaremodule bereitstellt, die Rechenprozesse bzw. Tasks genannt werden. Rechenprozesse sind in der "C"-Sprache geschrieben, wobei einige zeitkritische Bereiche in Intel 8085 Assembler geschrieben sind. Jeder Rechenprozess weist eine Prioritätsebene auf und stellt eine unabhängige Funktion bereit. CRETIN steht im unteren Speicher und läuft ab, nachdem die Einschaltdiagnoseprogramme erfolgreich ausgeführt worden sind.
CRETIN wickelt die Prozessplanung ab und gestattet lediglich einem Rechenprozess, zu einer Zeit abzulaufen. CRETIN empfängt alle Hardwareunterbrechungen, wodurch Rechenprozesse im Wartezustand zum Ablaufen aktiviert werden, wenn die richtige Unterbrechung empfangen wird. CRETIN stellt eine Echtzeituhr bereit, um es Rechenprozessen zu erlau ben, auf zeitlich festgelegte Ereignisse zu warten oder für bekannte Intervalle anzuhalten. CRETIN stellt ferner Intertask-Kommunikation durch ein System von Meldungsknoten bereit.
Die Firmware ist aus neun Rechenprozessen zusammengesetzt, die nachstehend in Prioritätsreihenfolge kurz beschrieben werden. Nachfolgende Abschnitte werden jeden Rechenprozess ausführlicher beschreiben.

1. Der Regel-Rechenprozess (PID) ist verantwortlich für das Regeln der Probenblocktemperatur.
2. Der Tastatur-Rechenprozess ist verantwortlich für das Verarbeiten der Tastatureingabe von dem Tastenblock.
3. Der Zeitgeber-Rechenprozess wartet auf eine halbsekundliche Hardwareunterbrechung, sendet dann eine Reaktivierungsmeldung (wake up message) an sowohl den Sequenz- als auch den Anzeige-Rechenprozess.
4. Der Sequenz-Rechenprozess führt die Benutzerprogramme aus.
5. Der Pause-Rechenprozess führt programmierte und Tastenblock-Pausen aus, wenn ein Programm abläuft.
6. Der Anzeige-Rechenprozess aktualisiert die Anzeige in Echtzeit.
7. Der Drucker-Rechenprozess führt die RS-232-Port-Kommunikation und das Drucken aus.
8. Der LED-Rechenprozess ist verantwortlich für das Ansteuern der Heiz-LED. Jener wird ferner verwendet, um die Kühlmitteltemperatur zu regeln, solange Install ausgeführt wird.
9. Der Verbindungs-Rechenprozess startet Dateien, die miteinander in einem Verfahren verbunden sind, durch Simulieren eines Tastenanschlags.

Blocktemperaturregelprogramm (PID-Rechenprozess)
Der Proportional-Integral-Differential-(PID)Rechenprozess ist verantwortlich für das Regeln der absoluten Probenblocktemperatur auf 0,1°C sowie für das Regeln der Probenblocktemperaturungleichförmigkeit (temperature non-uniformity, TNU, definiert als die Temperatur der heißesten Vertiefung minus der Temperatur der kältesten Vertiefung) auf weniger als ± 0,5°C durch Anwenden einer größeren Heizleistung an den Umfang des Blocks, um Verluste durch die Sicherheitsbandkanten zu kompensieren. Der PID-Rechenprozess ist ferner verantwortlich für das Regeln der Temperatur der beheizten Abdeckung zu einem weniger genauen Grad. Dieser Rechenprozess läuft fünfmal pro Sekunde ab und weist die höchste Priorität auf.
Der Betrag an Heiz- oder Kühlleistung, die an den Probenblock geliefert wird, ist von der Differenz oder dem "Fehler" zwischen der benutzerdefinierten, im Speicher gespeicherten Probentemperatur, genannt der Sollwert, und der momentanen berechneten Probentemperatur abgeleitet. Dieses Schema folgt der Standard-Regelkreispraxis. Zusätzlich zu einem Leistungsbeitrag an die Filmheizgeräte, der direkt proportional zu dem momentanen Fehler ist, d. h., die proportionale Komponente (Sollwerttemperatur minus Probenblocktemperatur), enthält die berechnete Leistung außerdem einen integralen Term, der dazu dient, jedweden statischen Fehler auszuschließen (Sollwerttemperatur minus Blocktemperatur kleiner als 0,5°C). Diese Komponente wird die integrale Komponente genannt. Um eine Akkumulation oder ein "Hochschrauben" des integralen Terms zu vermeiden, werden Beiträge zu dem Integral auf ein schmales Band um die Sollwerttemperatur eingeschränkt. Die Verstärkungen der proportionalen und integralen Komponente wurden sorgfältig ausgewählt und geprüft, da die zu dem Blocksensor und dem Probenröhrchen gehörigen Zeitkonstanten den Phasenrand des Systems schwer einschränken, wodurch ein Potenzial für Schleifeninstabilitäten erzeugt wird. Die Verstärkung des proportionalen Terms ist P in nachstehender Gleichung (46) und die Verstärkung des integralen Terms ist Ki in nachstehender Gleichung (48).
Der PID-Rechenprozess verwendet einen "Algorithmus für geregeltes Überschwingen", wo die Blocktemperatur oft ihren stationären Endwert überschwingt, damit die Probentemperatur bei ihrer gewünschten Temperatur so schnell wie möglich ankommt. Die Verwendung des Überschwing-Algorithmus bewirkt, dass die Blocktemperatur in einer kontrollierten Weise überschwingt, bewirkt jedoch nicht, dass die Probentemperatur überschwingt. Dies spart Leistung und wird für neu in der PCR-Instrumentierung gehalten.
Die Gesamtleistung, die an alle Heizgeräte des Probenblocks geliefert wird, um eine gewünschte Rampenrate zu erreichen, ist gegeben durch: Leistung = (CP/ramp_rate) + bias (40)wobei:

CP: = Thermisch wirksame Masse des Blocks
bias: = Vor- oder Regelkühlungsleistung
ramp_rate: = T_Ende – T_Anfang/gewünschte Rampenrate

Diese Leistung ist aus Sicherheitsgründen an eine maximale Heizleistung von 500 Watt geklemmt.
Mit jeder Iteration des Rechenprozesses (alle 200 ms) wendet das System Heiz- oder Rampenkühlungsleistung (wenn nötig) basierend auf den nachfolgenden Algorithmen an.
Das Regelsystem wird durch die berechnete Probentemperatur angesteuert. Die Probentemperatur wird definiert als die durchschnittliche Temperatur der Flüssigkeit in einem dünnwandigen Kunststoffprobenröhrchen, das in eine der Vertiefungen des Probenblocks (nachstehend der "Block") eingesetzt ist. Die Zeitkonstante des Systems (Probenröhrchen und dessen Inhalt) ist eine Funktion des Röhrchentyps und des Volumens. Zu Beginn eines Durchlaufs gibt der Benutzer den Röhrchentyp und die Menge an Reaktionsvolumen ein. Das System berechnet eine resultierende Zeitkonstante (τ oder tau). Für das MicroAmp^TM-Röhrchen und 100 μl Reaktionsvolumen beträgt tau etwa 9 Sekunden. TBlk-neu = TBlk + Leistung·(200 ms/CP) (41) TProb-neu = TProb + (TBlk-neu – TProb)·200 ms/tau (42)wobei:

T_Blk-neu: = momentane Blocktemperatur
T_Blk: = Blocktemperatur vor 200 ms
Leistung: = auf den Block angewandte Leistung
CP: = thermisch wirksame Masse des Blocks
T_Prob-neu: = momentane Probentemperatur
T_Prob: = Probentemperatur vor 200 ms
tau: = thermische Zeitkonstante des Probenröhrchens, abgeglichen für die Sensorverzögerung (etwa 1,5).

Das Fehlersignal oder die Temperatur ist einfach: Fehler = Sollwert – TProb-neu (43)
Wie in jedem geschlossenen Regelsystem wird ein korrigierender Eingriff (Heiz- oder Kühlleistung) angewandt, um einen Teil des momentanen Fehlers auszuschließen. In nachstehender Gleichung (45) ist F der Bruchteil des Fehlersignals, der in einer Abtastperiode (200 ms) ausgeschlossen werden soll. TProb-neu = TProb + F·(SP – TProb) (44)wobei SP = die Benutzer-Sollwerttemperatur (user setpoint temperature).
Aufgrund der großen Verzögerung im System (lange Röhrchen-Zeitkonstante) wird der Bruchteil F niedrig eingestellt.
Die Kombination der Formeln (42) und (44) ergibt: TProb-neu = TProb + (TBlk-neu – TProb)·0,2/tau = TProb + F·(SP – TProb) (45)
Die Kombination der Formeln (41) und (45) und die Addition eines Terms P (die Verstärkung des proportionalen Terms), um Blocktemperaturschwingungen einzuschränken und die Systemstabilität zu verbessern, ergibt: Pwr = CP·P/T·((SP – TProb)·F·tau/T + TProb – TBlk) (46)wobei

P: = die Verstärkung des proportionalen Terms und
T: = die Abtastperiode von 0,2 Sekunden (200 ms) und
P/T: = 1 in der bevorzugten Ausführungsform.

Gleichung (46) ist eine theoretische Gleichung, die die Leistung (Pwr), die benötigt wird, um die Blocktemperatur auf irgendeinen gewünschten Wert zu verstellen, angibt, ohne Verluste an die Umgebung durch die Sicherheitsbänder usw. zu berücksichtigen.
Sobald die Leistung, die benötigt wird, um den Block anzusteuern, über Gleichung (46) ermittelt ist, wird diese Leistung in die Leistung aufgeteilt, die an jede der drei Heizzonen durch die Bereiche dieser Zonen geliefert werden soll. Dann werden die Verluste an die Verteiler ermittelt und ein Leistungsterm mit einer Größenordnung, die ausreicht, um diese Verluste zu kompensieren, wird zu dem Betrag der Leistung addiert, der an die Verteilerheizzone geliefert werden soll. Ebenso wird ein weiterer Leistungsterm, der ausreicht, um die an die Blockhaltestifte, den Blocktemperatursensor und die Umgebung verlorene Leistung zu kompensieren, zu der Leistung, die an die Kantenheizzonen zu liefern ist, addiert. Diese zusätzlichen Terme und die Teilung der Leistung durch die Fläche der Zonen wandeln die Gleichung (46) in die vorstehend gegebenen Gleichungen (3), (4) und (5) um.
Gleichung (46) ist die Formel, die von der bevorzugten Ausführungsform des Regelsystems verwendet wird, um die benötigte Heiz- oder Kühlleistung an den Probenblock zu ermitteln.
Liegt die berechnete Probentemperatur innerhalb des "Integralbandes", d. h. ± 0,5°C um die Solltemperatur (SP), ist die Verstärkung des proportionalen Terms zu gering, um den verbleibenden Fehler auszuschließen. Daher wird ein integraler Term zu dem proportionalen Term addiert, um kleine Fehler auszuschließen. Der integrale Term wird außerhalb des integralen Bandes deaktiviert, um zu verhindern, dass sich ein großes Fehlersignal akkumuliert. Der Algorithmus innerhalb des "Integralbandes" lautet wie folgt: Int_sum (neu) = Int_sum (alt) + (SP – TProb) (47) pwr_adj = Ki·Int_sum (neu) (48)wobei,

Int_sum: = die Summe der Abtastperiode der Differenz zwischen der SP und der T_Prob-Temperatur, und
Ki: = die integrale Verstärkung (512) in der bevorzugten Ausführungsform.

Sobald eine Heizleistung berechnet worden ist, führt die Steuersoftware die Leistung an die drei Filmheizgerätzonen 254, 262 und 256 in 13 basierend auf der Fläche in der bevorzugten Ausführungsform ab. Die Kantenheizgeräte empfangen zusätzliche Leistung basierend auf der Differenz zwischen der Blocktemperatur und der Umgebungstemperatur. Ebenso empfangen die Verteilerheizgeräte zusätzliche Leistung basierend auf der Differenz zwischen der Blocktemperatur und der Kühlmitteltemperatur.
PID-Pseudocode
Nach Einschalten oder Rücksetzung (Reset) des Systems

Schalte Rampenkühlung aus
Schalte alle Heizgeräte aus
Berechne Widerstände der Heizgeräte

Führe endlos aus (Do Forever) – führt alle 200 ms aus

Wenn (Blocktemperatur > 105) dann
Schalte Heizgeräte aus
Schalte Rampenventile ein
Zeige Fehlermeldung an

Lese die Netzspannung {linevolts} ab

Lese den Kühlmittelsensor ab und wandle in Temperatur um {h2otemp}

Lese den Umgebungssensor ab und wandle in Temperatur um {ambtemp}

Lese den Sensor der beheizten Abdeckung ab und wandle in Temperatur um {cvrtemp}

Lese den Probenblocksensor ab und wandle in Temperatur um {blktemp}. Dieser Abschnitt des Codes liest ferner die temperaturstabile Bezugsspannungsquelle ab und vergleicht die Spannung mit einer Bezugsspannung, die während der Kalibrierung des instruments ermittelt wurde. Besteht irgendeine Diskrepanz, ist die Elektronik gedriftet und die Spannungsablesungen aus den Temperatursensoren werden entsprechend eingestellt, um genaue Temperaturablesungen zu erhalten.
Berechne die Probentemperatur {tubetenths} oder die Temperatur, die durch Verwendung eines digitalen Tiefpassfilters angezeigt wird. tubetenths = TTn–1 + (TBn – TTn–1)·T/tau (49)wobei

TT_n–1: = letzte Probentemperatur {tubetenths}
TB_n: = momentane Blocksensortemperatur {blktenths}
T: = Abtastintervall in Sekunden = 200 ms
tau: = tau Röhrchen {cf_tau} – tau Sensor {cf_lag}

Gleichung (49) stellt die ersten Terme einer Taylor-Reihenentwicklung der Exponentialreihe dar, die die als Gleichung (6) vorstehend gegebene berechnete Probentemperatur definiert.

Berechne die Temperatur der Schaumstoffbeschichtung unterhalb des Probenblocks, {phantenths}, bekannt als die Phantommasse. Die Temperatur der Phantommasse wird verwendet, um die Leistung einzustellen, die an den Block geliefert wird, um den Wärmefluss in die und aus der Phantommasse zu berücksichtigen. Die Temperatur wird berechnet unter Verwendung eines digitalen Tiefpassfilters, der in der Software implementiert ist. phantenths = TTn–1 + (TBn – TTn–1)·T/tau (50)wobei

TT_n–1: = letzte Phantommassetemperatur {phantenths}
TB_n: = momentane Blocksensortemperatur {blktenths}
T: = Abtastintervall in Sekunden = 200 ms
tau_Schaum: = tau des Schaumstoffblocks = 30 s.

Wenn (Probentemperatur ist innerhalb ERR des Sollwerts (SP)) dann

PID nicht in schnellem Übergangsmodus (fast transition mode) {fast_ramp} = AUS (OFF)
wobei ERR = die Temperaturbreite des "Integralbandes", d. h. des Fehlerbandes, das die Soll- oder Sollwerttemperatur umgibt.

Berechne die momentane Regelkühlungsleistung {cool_ctrl}, um zu ermitteln, wie viel Wärme an die Vorkühlungskanäle verloren geht.

Berechne die momentane Rampenkühlungsleistung {cool_ramp}.

Berechne {cool_brkpt}. {cool_brkpt} ist eine Kühlleistung, die verwendet wird, um zu ermitteln, wann ein Übergang von Rampen- zu Regelkühlung an abfallenden Rampen zu machen ist. Jene ist eine Funktion der Block- und Kühlmitteltemperatur.
Die Regelkühlungsleistung {cool_ctrl} und die Rampenkühlungsleistung {cool_ramp} sind Faktoren, die die CPU wissen muss, um die abfallenden Temperaturrampen zu regeln, d. h. um zu berechnen, wie lange die solenoidbetriebenen Rampenkühlungsventile offen zu halten sind. Die Regelkühlungsleistung entspricht einer Konstante plus der Temperatur des Kühlmittels mal dem Wärmeleitwert von dem Block zu den Vorkühlungskanälen. Ebenso entspricht die Rampenkühlungsleistung der Differenz zwischen der Blocktemperatur und der Kühlmitteltemperatur mal dem Wärmeleitwert von dem Block zu den Rampenkühlungskanälen. Der Kühlungshaltepunkt (cooling breakpoint) entspricht einer Konstante mal der Differenz in der Temperatur zwischen dem Block und dem Kühlmittel.

Berechne eine Heiz- oder Kühlleistung {int_pwr}, die benötigt wird, um die Blocktemperatur von ihrer momentanen Temperatur auf die gewünschte Sollwert-(SP)Temperatur zu verstellen. {int_pwr} = KP·CP·[(SP – TPROB)·{cf_kd} + Ts – TBLK] (51)wobei:

KP: = Proportionale Verstärkung = P/T in Gleichung (46) = etwa 1 in der bevorzugten Ausführungsform
CP: = Thermisch wirksame Masse des Blocks
SP: = Temperatursollwert
T_PROB: = Probentemperatur
T_BLK: = Blocktemperatur
cf_kd: = Tau·K_d/Delta_t, wobei tau das gleiche tau ist, wie es in Gleichung (49) verwendet wird, und K_d eine Konstante ist und Delta t die 200-ms-Abtastperiode ist.

setze auf 0 {i_sum = 0}. (52)

integraler Term = {i_sum}·Konstante {cf_term}. (53)

{int_pwr} = {int_pwr} + integraler Term. (54)

Stelle die Leistung ein, um die Wärmebelastung aufgrund der Auswirkungen der Phantommasse (Schaumstoffbeschichtung) zu kompensieren zunächst durch Finden der Phantommassenleistung, dann durch Addition jener zu der Leistung {int_pwr}.

Berechne Phantommassenleistung {phant_pwr} durch: phant_pwr = C·(blktenths – phantenths)/10 (55)wobei:

C: = thermisch wirksame Masse der Schaumstoffbeschichtung (1,0 W/K)

{int_pwr} = {int_pwr} + {phant_pwr}

{aux1_power} = K1·(TBLK – TAMB) + K2·(TBLK – TKÜHL) + K5·(dT/dt) (57)

K1: = Koeffizient {cf_1coeff}
K2: = Koeffizient {cf_2coeff}
K5: = Koeffizient {cf_5coeff}
dT/dt: = Rampenrate
T_BLK: = Blocktemperatur
T_AMB: = Umgebungstemperatur
T_KÜHL: = Kühlmitteltemperatur

{aux2_power} = K3·(TBLK – TAMB) + K4·(TBLK – TKÜHL) + K6·(dT/dt) (58)

K3: = Koeffizient {cf_3coeff}
K4: = Koeffizient {cf_4coeff}
K6: = Koeffizient {cf_6coeff}
dT/dt: = Rampenrate
T_BLK: = Blocktemperatur
T_AMB: = Umgebungstemperatur
T_KÜHL: = Kühlmitteltemperatur

{int_pwr} = {int_power} – {aux1_power} – {aux2_power} (59)

An diesem Punkt enthält {int_pwr} die gesamte Heizleistung und {aux1_power} und {aux2_power} enthalten den Verlust aus dem Block zu den Kanten. Die an die Hilfsheizgeräte gelieferte Leistung setzt sich aus zwei Komponenten zusammen: aux_power und int_power. Die Leistung wird abgeführt {int_pwr} an die Haupt- und Hilfsheizgeräte basierend auf der Fläche.
total_pwr = int_pwr
int_pwr = total_pwr·66%
aux1_power = total_pwr·20% + aux1_power
aux2_power = total_pwr·14% + aux2_power
Berechne die Anzahl von durch den Triac für jede Endzone und jede Iteration des Regelkreises durchzuführenden Heizperioden, um den richtigen Betrag an Leistung an die Heizgeräte zu schicken. Diese Schleife läuft einmal alle 1/5 Sekunden ab, daher gibt es 120/5 = 24 Halbperioden bei 60 Hz oder 100/5 = 20 bei 50 Hz. Die Anzahl an Halbperioden ist eine Funktion der angeforderten Leistung {int_pwr}, der momentanen Netzspannung {linevolts} und des Heizgerätwiderstands. Da die genaue benötigte Leistung nicht jede Schleife geliefert werden kann, wird ein Rest berechnet {delta_power}, um zu verfolgen, was aus der letzten Schleife einzubeziehen ist. int_pwr = int_pwr + delta_power (60)
Berechne die Anzahl der Halbperioden, die der Triac eingeschaltet gehalten werden soll. Index entspricht der Anzahl an Perioden, die der Triac eingeschaltet gehalten werden soll. Index = Leistung·Hauptheizgerät Ohm·[20 oder 24]/linevolts im Quadrat, (61)wobei Gleichung (61) einmal für jede Heizzone durchgeführt wird und wobei "Leistung" = int_pwr für die Hauptheizzone, aux1_pwr für die Verteilerheizzone und aux2_pwr für die Kantenheizzone ist.
Berechne den Betrag an tatsächlich gelieferter Leistung. actual_power = linevolts im Quadrat·Index/Hauptheizgerätwiderstand (62)Berechne den das nächste Mal zu addierenden Rest. delta_power = int_pwr – actual_power (63)
Berechne die Anzahl an Halbperioden für die Kanten- und Verteilerheizgeräte unter Verwendung der für die Hauptheizgeräte beschriebenen entsprechenden Technik durch Ersetzen durch {aux1_pwr} und {aux2_pwr} in Gleichung (60).
Lese die berechneten Zählstände in die Zähler ein, die die Haupt-, Verteiler- und Kanten-Triacs steuern.
Betrachte den Sensor der beheizten Abdeckung. Wenn die beheizte Abdeckung weniger als 100°C hat, dann lese Zähler der beheizten Abdeckung ein, um 50 Watt Leistung zu liefern.
Betrachte die Probentemperatur. Wenn diese größer als 50°C ist, schalte HOT LED ein, um den Benutzer davor zu warnen, den Block zu berühren.
ENDE DER ENDLOSSCHLEIFE
Tastatur-Rechenprozess
Der Zweck des Tastatur-Rechenprozesses liegt darin, darauf zu warten, dass der Benutzer eine Taste auf dem Tastenblock drückt, die Taste mit einer Liste von zulässigen Tastenanschlägen für den momentanen Zustand zu vergleichen, die zu der zulässigen Taste gehörige Befehlsfunktion auszuführen und zu einem neuen Zustand zu ändern. Unzulässige Tastenanschläge werden durch einen Piepton angezeigt und dann ignoriert. Dieser Rechenprozess ist das Herz der zustandsangetriebenen Benutzeroberfläche. Jene ist "zustandsangetrieben", da der vorgenommene Eingriff vom momentanen Zustand der Benutzeroberfläche abhängt.
Tastatur-Rechenprozess-Pseudocode:
Initialisiere Tastatur-Rechenprozess-Variablen.
Schalte den Cursor aus.
Wenn (Install Flag nicht gesetzt) dann
Arbeite Install-Programm ab.
Sende eine Meldung an den PID-Rechenprozess, um die beheizte Abdeckung einzuschalten.
Wenn (die Leistung fiel aus, während der Benutzer ein Programm ablaufen ließ) dann
Berechne und zeige die Anzahl an Minuten an, für die die Leistung ausgeschaltet war.
Schreibe eine Zustandsaufzeichnung des Leistungsausfalls an die Ereignisdatei.
Sende eine Meldung an den Sequenz-Rechenprozess, um eine 4°C-Durchwärmung zu starten.
Gebe dem Benutzer die Option, die Ereignisdatei zu prüfen.
Wenn (der Benutzer fordert die Prüfung der Ereignisdatei an) dann
Gehe zu der Ereignisdateianzeige.
Zeige den Bildschirm der obersten Ebene an.
Führe endlos aus
Sende eine Meldung an das System, dass dieser Rechenprozess auf eine Hardwareunterbrechung vom Tastenblock wartet.
Gehe in den Ruhezustand (go to sleep), bis diese Unterbrechung empfangen wird.
Wenn aktiviert, lese und decodiere die Taste von dem Tastenblock.
Hole eine Liste der zulässigen Tasten für den momentanen Zustand.
Vergleiche die Taste mit der Liste der zulässigen Tasten.
Wenn (die Taste ist zulässig für diesen Zustand) dann
Hole den "Eingriff" und die nächste Zustandsinformation für diese Taste.
Führe den "Eingriff" (eine Befehlsfunktion) für diesen Zustand aus.
Gehe zum nächsten Zustand.
Sonst
Lasse den Tongeber bei einer unzulässigen Taste piepen.
Ende der Endlosschleife
Übersicht Zeitgeber-Rechenprozess
Der Zweck des Zeitgeber-Rechenprozesses besteht darin, den Sequenz- und den Echtzeitanzeige-Rechenprozess jede halbe Sekunde zu reaktivieren. Der Zeitgeber-Rechenprozess fordert das System (CRETIN) auf, diesen immer dann zu reaktivieren, wenn die halbsekundliche Hardwareunterbrechung, die von der Uhr-/Kalendervorrichtung erzeugt wird, empfangen wird. Der Zeitgeber-Rechenprozess sendet dann wiederum zwei Reaktivierungsmeldungen an den Sequenz-Rechenprozess bzw. an den Echtzeitanzeige-Rechenprozess. Dieser Zwischen-Rechenprozess ist notwendig, da CRETIN lediglich einen Rechenprozess pro Unterbrechung abarbeiten wird und daher lediglich den Rechenprozess mit höherer Priorität (den Sequenz-Rechenprozess) ausführen würde.
Zeitgeber-Rechenprozess-Pseudocode:
Führe endlos aus
Sende eine Meldung an das System, dass dieser Rechenprozess auf eine Hardwareun
terbrechung von der Uhr-/Kalendervorrichtung wartet.
Gehe in den Ruhezustand, bis diese Unterbrechung empfangen wird.
Wenn reaktiviert, sende eine Meldung an den Sequenz- und an den Echtzeitanzeige-Rechenprozess.
Ende der Endlosschleife
Übersicht Sequenz-Rechenprozess
Der Zweck des Sequenz-Rechenprozesses liegt darin, den Inhalt eines benutzerdefinierten Programms auszuführen. Dieser geht sequenziell durch jeden Sollwert in einem Zyklus, bestehend aus einer Rampe und einem Haltesegment, und sendet Sollwerttemperaturmeldungen an den PID-Rechenprozess aus, der wiederum die Temperatur des Probenblocks regelt. Am Ende jedes Segments sendet dieser eine Meldung an den Echtzeitanzeige-Rechenprozess, um die Anzeige umzuschalten, und eine Meldung an den Drucker-Rechenprozess, um die Laufzeitinformationen des Segments zu drucken. Der Benutzer kann ein laufendes Programm durch Drücken der PAUSE-Taste auf dem Tastenblock anhalten, dann das Programm durch Drücken der START-Taste wieder aufnehmen. Der Benutzer kann ein Programm vorzeitig durch Drücken der STOP-Taste abbrechen. Dieser Rechenprozess läuft jede halbe Sekunde ab, warm dieser durch den Zeitgeber-Rechenprozess reaktiviert wird.
Sequenz-Rechenprozess-Pseudocode:
Übersicht Pause-Rechenprozess
Der Zweck des Pause-Rechenprozesses liegt darin, entweder eine Pause auszuführen, die der Benutzer in ein CYCLE-Programm programmiert, oder eine Pause, wenn der Benutzer die PAUSE-Taste auf dem Tastenblock drückt.
Wenn der Sequenz-Rechenprozess auf eine programmierte Pause trifft, während er ein CYCLE-Programm ausführt, geht dieser in den Ruhezustand und reaktiviert den Pause-Rechenprozess. Der Pause-Rechenprozess wiederum sendet eine Meldung an den Echtzeitanzeige-Rechenprozess, kontinuierlich anzuzeigen und die Zeit zu erniedrigen, die der Benutzer anzuhalten fordert. Wenn der Pausezeitgeber die Zeitbegrenzung auslöst, sendet der Pause-Rechenprozess eine Meldung, um den Sequenz-Rechenprozess zu reaktivieren, und geht dann in den Ruhezustand. Der Benutzer kann vorzeitig das Programm wieder aufnehmen, indem er die START-Taste auf dem Tastenblock drückt, oder kann vorzeitig das Programm abbrechen, indem er die STOP-Taste drückt.
Wenn der Tastatur-Rechenprozess eine PAUSE-Taste erfasst, solange ein Programm abläuft, setzt dieser einen Flag {pause_flag} und wartet dann, dass der Sequenz-Rechenprozess jenen bestätigt. Wenn der Sequenz-Rechenprozess diesen Flag gesetzt sieht, sendet dieser eine Bestätigungsmeldung zurück an den Tastatur-Rechenprozess und setzt sich dann selbst in den Ruhezustand. Wenn der Tastatur-Rechenprozess diese Meldung empfängt, reaktiviert dieser den Pause-Rechenprozess. Der Pause-Rechenprozess sendet eine Meldung an den Echtzeitanzeige-Rechenprozess, das dieser kontinuierlich anzeigt und den Betrag an Zeit, für den das Programm angehalten wird, erhöht. Der Zeitgeber wird die Zeitbegrenzung auslösen, wenn dieser die durch den Benutzer im Konfigurationsabschnitt gesetzte Pausendauerbegrenzung erreicht. Der Benutzer kann das Programm durch Drücken der START-Taste auf dem Tastenblock wieder aufnehmen oder das Programm durch Drücken der STOP-Taste vorzeitig abbrechen.
Pause-Rechenprozess-Pseudocode:
Übersicht Anzeige-Rechenprozess
Der Zweck des Echtzeitanzeige-Rechenprozesses liegt darin, Temperaturen, Zeitgeber, Sensorablesungen, ADC-Kanalablesungen und weitere Parameter, die kontinuierlich jede halbe Sekunde aktualisiert werden müssen, anzuzeigen.
Anzeige-Rechenprozess-Pseudocode: Initialisiere Anzeige-Rechenprozessvariablen
Übersicht Drucker-Rechenprozess
Der Zweck des Drucker-Rechenprozesses hegt darin, den Laufzeitdruckvorgang auszuführen. Jener ist ein Rechenprozess mit niedriger Priorität und sollte nicht andere zeitkritische Rechenprozesse stören.
Drucker-Rechenprozess-Pseudocode
Übersicht LED-Rechenprozess
Der Zweck des LED-Rechenprozesses liegt darin, dafür zu sorgen, dass die Ausleuchtung der "Heizungs"-LED die auf das Hauptheizgerät angewandte Leistung reflektiert. Dies ist ein Rechenprozess von niedriger Priorität, der einmal pro Sekunde abläuft.
LED-Rechenprozess-Pseudocode:
Initialisiere LED-Rechenprozessvariablen.
Führe endlos aus
Sende eine Meldung an das System, um diesen Rechenprozess jede Sekunde zu reaktivieren.
Gehe in den Ruhezustand.
Wenn reaktiviert, lese Zähler 2 des PIC-Zeitgebers A mit einem Wert ein, der die auf das Hauptheizgerät angewandte Leistung wie folgt reflektiert: lese Zähler mit Wert ein = {K_htled}·{ht_led}wobei:

{K_htled} eine Konstante enthält, um die Zeit zum Betätigen der Heizungs-LED durch Impulse zu berechnen, und entspricht 15200/500. 15200 ist wenig größer als der Takt des PICs von 14,4 kHz und dies ist der Wert, der in den Zeitgeber eingelesen wird, um die LED ständig eingeschaltet zu halten. 500 ist die Leistung des Hauptheizgeräts.

{ht_led} ein Wert zwischen 0 und 500 sein und den auf das Hauptheizgerät angewandten Watt entsprechen wird.
Ende der Endlosschleife
Übersicht Verbindungsrechenprozess
Der Zweck des Verbindungsrechenprozesses liegt darin, das Drücken der START-Taste auf dem Tastenblock durch den Benutzer zu simulieren. Dieser Rechenprozess ist notwendig, damit Programme sofort nacheinander (wie in einem Verfahren) ohne Eingreifen des Benutzers ausgeführt werden können. Der Verbindungsrechenprozess reaktiviert den Sequenz-Rechenprozess und jener beginnt, das nächste Programm abzuarbeiten, als ob die START-Taste gedrückt worden wäre.
Verbindungsrechenprozess-Pseudocode:
Initialisiere Verbindungsrechenprozessvariablen.
Führe endlos aus
Wenn (der Flag {weird_flag} ist gesetzt und es ist nicht die erste Datei in dem Verfahren)
dann
Sende eine Meldung an den Sequenz-Rechenprozess, um diesen zu reaktivieren.
Ende der Endlosschleife
Startsequenz
EINSCHALTSEQUENZ
Wenn die Leistung an das Instrument eingeschaltet wird oder die Software einen RESET bzw. Warmstart ausführt, findet die folgende Sequenz statt. Beachte: die nachstehenden Nummern entsprechen den Nummern im Ablaufdiagramm.

1. Übertrage ein Ctrl-G-(dezimal 7)Zeichen aus dem RS-232-Drucker-Port. Frage den RS-232-Port für wenigstens 1 Sekunde zyklisch ab und wenn ein Ctrl-G empfangen wird, wird angenommen, dass ein externer Rechner an den Port angehängt ist, und die gesamte Kommunikation während der Einschaltsequenz wird von dem Tastenblock zum RS-232-Port umadressiert. Wenn kein Ctrl-G empfangen wird, fährt die Einschaltsequenz wie normal fort.
2. Prüfe, ob die MORE-Taste gedrückt ist. Wenn dies so ist, gehe geradewegs zu den Nur-Bedienung-Hardware-Diagnoseprogrammen.
3. Die nächsten 3 Tests sind Audio-/visuelle Überprüfungen und können keinen Fehler berichten: 1) der Tongeber piept, 2) die Heiß-(hot), Kühlungs-(cooling) und Heizungs-(heating)LEDs auf dem Tastenblock werden blinkend aufleuchten gelassen, 3) jeder Pixel auf der Anzeige wird hervorgehoben. Die Copyright- und Instrument-ID-Bildschirme werden angezeigt, wenn die Einschaltdiagnoseprogramme ablaufen.
4. Sollte ein Fehler in einem der Einschaltdiagnoseprogramme auftreten, wird der Name der Komponente, die ausfiel, angezeigt und der Tastenblock wird gesperrt mit Ausnahme des Codes 'MORE 999', der auf die Nur-Bedienung-Hardware-Diagnoseprogramme Zugriff haben wird.
5. Prüfe Kanal 0 auf der PPI-B-Vorrichtung, um zu sehen, ob das automatisierte Testbit in den L-Zustand gesetzt ist. Wenn dem so ist, läuft der UART-Test ab. Wenn der Test durchgeht, piept der Tongeber ununterbrochen.
6. Starte das CRETIN-Betriebssystem, das wiederum jeden Rechenprozess nach Prioritätsebene starten wird.
7. Prüfe einen Flag im Batterie-RAM, um zu sehen, ob das Instrument kalibriert worden ist. Falls nicht, zeige eine Fehlermeldung an und sperre den Tastenblock mit der Ausnahme des Codes 'MORE 999', der auf die Nur-Bedienung-Kalibrierungstests Zugriff haben wird.
8. Lasse einen Test ablaufen, der die Spannung und Netzfrequenz misst und finde heraus, ob diese beiden Werte mit dem ausgewählten Konfigurationsstecker zusammenpassen, während der Kalibrierung des Instruments. Falls nicht, zeige eine Fehlermeldung an und speie den Tastenblock mit Ausnahme des Codes 'MORE 999', der auf die Nur-Bedienung-Kalibrierungstests Zugriff haben wird.
9. Führe den Heizgerät-Sonarimpulstest wie im Install-Abschnitt beschrieben durch. Wenn die Heizgeräte falsch verdrahtet sind, zeige eine Fehlermeldung an und sperre den Tastenblock mit Ausnahme des Codes 'MORE 999', der auf die Nur-Bedienung-Kalibrierungstests Zugriff haben wird.
10. Prüfe einen Flag im Batterie-RAM, um herauszufinden, ob das Instrument installiert worden ist. Falls nicht, zeige eine Fehlermeldung an und sperre den Tastenblock mit Ausnahme des Codes 'MORE 999', der Zugriff zur Install-Routine haben wird.
11. Falls nicht im Fernmodus (remote mode), prüfe einen Flag im Batterie-RAM, um herauszufinden, ob es einen Leistungsausfall gab, während das Instrument lief. Wenn dem so war, starte eine 4°C-Durchwärmung und zeige die Zeitdauer an, für die die Leistung ausgeschaltet war. Frage den Benutzer, ob jener die Ereignisdatei ansehen möchte, die ihm genau mitteilen wird, wie weit der Durchlauf bereits fortgeschritten war, als die Leistung ausfiel. Wenn dieser 'ja' auswählt, geht dieser geradewegs zu den Benutzerdiagnoseprogrammen.
12. Lasse den Tongeber piepen und lösche den Fernmodus-Flag, so dass die gesamte Kommunikation nun wieder durch den Tastenblock erfolgt.
13. Prüfe einen Flag im Batterie-RAM, um herauszufinden, ob die Fertigung möchte, dass deren Testprogramm automatisch startet. Wenn dem so ist, starte den Programmdurchlauf und setze das Instrument zurück, nachdem dieser beendet ist.
14. Zeige den Benutzeroberflächenbildschirm der obersten Ebene an.

In 50 ist eine Querschnittsansicht eines dünnwandigen Reaktionsröhrchens mit größerem Volumen gezeigt, das unter der Marke MAXIAMP vertrieben wird. Dieses Röhrchen ist brauchbar für PCR-Reaktionen, bei denen Reagenzien oder andere Materialien zum Reaktionsgemisch zugegeben werden müssen, welches das Gesamtvolumen auf über 200 μl bringen wird. Das in 50 gezeigte größere Röhrchen ist aus Himont PD701-Polypropylen oder Valtec HH-444-Polypropylen hergestellt und weist eine dünne mit dem Probenblock in Kontakt stehende Wand auf. Unabhängig davon, welches Material ausgewählt wird, sollte jenes mit der DNA und anderen Komponenten des PCR-Reaktionsgemisches kompatibel sein, so dass es die PCR-Reaktionsverarbeitung nicht beeinträchtigt, wie beispielsweise dadurch, dass die Ziel-DNA an den Wänden klebt und nicht repliziert. Glas ist im Allgemeinen keine gute Wahl, da DNA bekanntlich an den Wänden von Glasröhrchen kleben bleibt.
Die Abmessung A in 50 liegt typischerweise bei 0,305 ± 0,025 mm (0,012 ± 0,001 Inch) und der Wandwinkel relativ zur Längsachse des Röhrchens beträgt typischerweise 17°. Der Vorteil eines 17°-Wandwinkels liegt darin, dass die Röhrchen, während eine Abwärtskraft einen guten thermischen Kontakt mit dem Probenblock bewirkt, nicht in den Probenvertiefungen festklemmen. Der Vorteil der dünnen Wände liegt darin, dass dies die Verzögerung zwischen Änderungen in der Temperatur des Probenblocks und entsprechenden Änderungen in der Temperatur des Reaktionsgemisches auf ein Mindestmaß beschränkt. Dies bedeutet, dass dann, wenn der Benutzer möchte, dass das Reaktionsgemisch im Denaturierungssegment innerhalb 1°C von 94°C für 5 Sekunden bleibt, und diese Parameter einprogrammiert, er oder sie das 5-Sekunden-Denaturierungsintervall mit einer geringeren Zeitverzögerung erhält als mit herkömmlichen Röhrchen mit dickeren Wänden. Dieses Leistungsmerkmal, und zwar, in der Lage zu sein, ein kurzes Durchwärmungsintervall wie eine 5-Sekunden-Denaturierungsdurchwärmung zu programmieren und eine Durchwärmung bei der programmierten Temperatur für die genau programmierte Zeit zu erhalten, wird durch die Verwendung einer berechneten Probentemperatur zur Steuerung des Zeitgebers ermöglicht. in dem hierin beschriebenen System wird der Zeitgeber, um ein Inkubations- oder Durchwärmungsintervall zeitlich festzulegen, nicht gestartet, bis die berechnete Probentemperatur die programmierte Durchwärmungstemperatur erreicht.
Ferner dauert es mit den dünnwandigen Probenröhrchen lediglich etwa ein halb Mai bis zwei Drittel Mal so lang, das Probengemisch innerhalb 1°C der Solltemperatur zu bringen, wie mit dickwandigen Mikrozentrifugenröhrchen des Standes der Technik, und dies trifft sowohl für das große, in 50 gezeigte MAXIAMP^TM-Röhrchen als auch das kleinere dünnwandige, in 15 gezeigte MICROAMP^TM-Röhrchen zu.
Die Wanddicke von sowohl dem MAXIAMP^TM- als auch dem MICROAMP^TM-Röhrchen wird beim Herstellungsverfahren in genauen Toleranzgrenzen gehalten, um in Einklang mit einer angemessenen konstruktiven Festigkeit so dünn wie möglich zu sein. Typischerweise wird dies für Polypropylen irgendwo zwischen 0,229 mm (0,009 Inch) und 0,305 mm (0,012 Inch) sein. Werden neue, "exotischere" Materialien, die starker als Polypropylen sind, verwendet, um den Vorteil des Beschleunigens der PCR-Reaktion zu erreichen, kann die Wandstärke geringer sein, solange eine angemessene Festigkeit beibehalten wird, um der Abwärtskraft standzuhalten, um einen guten thermischen Kontakt sicherzustellen, sowie anderen Belastungen des normalen Gebrauchs. Mit einer Höhe (Abmessung B in 50) von 28,4 mm (1,12 Inch) und einer Abmessung C von 19,8 mm (0,780 Inch) und einer Wandstärke des oberen Abschnitts (Abmessung D) von 10 mm (0,395 Inch) beträgt die Zeitkonstante des MAXIAMP-Röhrchens etwa 14 Sekunden, obwohl diese zum Zeitpunkt der Anmeldung nicht genau gemessen worden ist. Die Zeitkonstante des MICROAMP-Röhrchens für das in 15 gezeigte kürzere Röhrchen liegt typischerweise bei etwa 9,5 Sekunden mit einer Röhrchenwandstärke im konischen Abschnitt von 0,229 mm (0,009 Inch) plus oder minus 0,025 mm (0,001 Inch).
51 zeigt die Ergebnisse der Verwendung des dünnerwandigen MICROAMP-Röhrchens. Eine ähnliche beschleunigte Erreichung der Solltemperaturen wird sich aus der Verwendung des dünnwandigen MAXIAMP-Röhrchens ergeben.
In 51 ist ein Graph der relativen Zeiten für die berechnete Probentemperatur in einem MICROAMP-Röhrchen versus die Zeit gezeigt, die ein bekanntes Röhrchen braucht, um eine Temperatur innerhalb von 1°C einer Denaturierungssolltemperatur von 94°C von einer Starttemperatur von 72°C zu erreichen. In 51 lag eine 100-μl-Probe in jedem Röhrchen vor. Die Kurve mit durch offene Kästchen gekennzeichneten Datenpunkten ist das berechnete Probentemperaturverhalten für ein MICROAMP-Röhrchen mit einer 9,5-Sekunden-Ansprechzeit und einer Wandstärke von 0,229 mm (0,009 Inch). Die Kurve mit den durch X's gekennzeichneten Datenpunkten stellt die berechnete Probentemperatur für eine 100-μl-Probe in einem bekannten dickwandigen Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Wandstärke von 0,762 mm (0,030 Inch) dar. Dieser Graph zeigt, dass die Probe in dem dünnwandigen MICROAMP-Röhrchen eine berechnete Temperatur innerhalb 1°C der 94°C-Durchwärmungssolltemperatur in etwa 36 Sekunden erreicht, während die bekannten Röhrchen etwa 73 Sekunden brauchen. Dies ist von Bedeutung, da in Instrumenten, die ihre Zeitgeber nicht starten, bis die Durchwärmungstemperatur im Wesentlichen erreicht ist, die bekannten Röhrchen die Gesamtverarbeitungszeit wesentlich erhöhen können, besonders dann, wenn man dies im Licht der Tatsache betrachtet, dass jeder PCR-Zyklus wenigstens zwei Rampen und Durchwärmungen aufweisen wird und im Allgemeinen sehr viele Zyklen durchgeführt werden. Das Verdoppeln der Rampenzeit für jede Rampe kann daher bei Verwendung bekannter Röhrchen die Verarbeitungszeit drastisch erhöhen. In Systemen, die ihre Zeiten basierend auf der Block-/Bad-/Heizkammertemperatur ohne Berücksichtigung der tatsächlichen Probentemperatur starten, können diese langen Verzögerungen zwischen Änderungen in der Block-/Bad-/Heizkammertemperatur und entsprechenden Änderungen in der Probengemischtemperatur schwerwiegende negative Konsequenzen haben. Das Problem besteht darin, dass sich die lange Verzögerung mit der Zeit überschneiden kann, die das Reaktionsgemisch tatsächlich bei der für eine Durchwärmung programmierten Temperatur ist. Für sehr kurze Durchwärmungen, wie diese in den neuesten PCR-Verfahren verbreitet sind, könnte das Reaktionsgemisch tatsächlich nie die programmierte Durchwärmungstemperatur erreichen, bevor das Heiz-/Kühlsystem beginnt, die Änderung der Reaktionsgemischtemperatur in Angriff zu nehmen.
50 zeigt eine Polypropylenkappe 650, die mit dem MAXIAMP-Probenröhrchen durch einen Kunststoffsteg 652 verbunden ist. Der Außendurchmesser E der Kappe und der Innendurchmesser F des oberen Abschnitts des Röhrchens sind für eine Presspassung von zwischen 0,051 mm (0,002 Inch) und 0,127 mm (0,005 Inch) dimensioniert. Die Innenfläche 654 des Röhrchens sollte frei von Graten, Kerben und Kratzern sein, so dass ein gasdichter Verschluss mit der Kappe ausgebildet werden kann.
52 zeigt eine Draufsicht des Röhrchens 651, der Kappe 650 und des Stegs 652. Ein Absatz 656 verhindert, dass die Kappe zu weit hinunter in das Röhrchen geschoben wird, und erlaubt einen ausreichenden Vorsprung der Kappe oberhalb der Oberkante des Probenröhrchens, um einen Kontakt mit der beheizten Platte herzustellen. Dies erlaubt ferner eine ausreichende Kappenverformung, so dass die minimale annehmbare Kraft F in 15 durch die Verformung der Kappe aufgebracht werden kann.
In der bevorzugten Ausführungsform sind das Röhrchen und die Kappe aus Himont PD701-Polypropylen hergestellt, welches bei Temperaturen bis zu 126°C für Zeiten bis zu 15 Minuten autoklavierbar ist. Dies erlaubt, dass die Einweg-Röhrchen vor der Verwendung sterilisiert werden. Da die Kappen in Gebrauch in Maschinen mit beheizten Platten permanent deformiert werden, sind die Röhrchen lediglich für den Einmalgebrauch ausgelegt.
Kappen für die MICROAMP-Röhrchen sind in verbundenen Streifen von 8 oder 12 Kappen erhältlich, wobei jede Kappe nummeriert ist, oder als einzelne Kappen. Einzelne Reihen von Kappen können verwendet werden und die Reihen können leicht auf so wenige wie gewünscht gekürzt werden oder einzelne Kappen können vom Streifen abgeschnitten werden. Kappen für die MAXIAMP-Röhrchen sind entweder wie in 50 gezeigt befestigt oder sind getrennte einzelne Kappen.
Das maximale Volumen für Post-PCR-Reagenzzugaben, um das Mischen am MICROAMP-Röhrchen zu erlauben, beträgt 200 μl und beträgt bis zu 500 μl für das MAXIAMP-Röhrchen. Temperaturgrenzen liegen zwischen –70°C und 126°C.
Die Ansprechzeit hängt vom Volumen der Probe ab. Das Verhalten wird als die Zeit gemessen, die die Probe braucht, um innerhalb von 37% der neuen Temperatur zu kommen, wenn der Block plötzlich die Temperatur ändert. Typische Ansprechzeiten für eine 50-μl-Füllung liegen bei 7,0 Sekunden und für eine 20-μl-Füllung bei 5,0 Sekunden.
ANHANG A
Benutzeroberfläche
Das Ziel der GeneAmp-PCR-System-9600-Benutzeroberfläche liegt darin, einen einfachen Weg bereitzustellen, Programme zu entwickeln und laufen zu lassen, welche PCR durchführen.
3 Typen von Programmen sind verfügbar. Das HOLD-Programm besteht aus einem einzigen Sollwert, der für eine eingestellte Zeitdauer gehalten wird oder der für eine unendliche Zeitdauer gehalten und durch die STOP-Taste beendet wird. Das CYCLE-Programm fügt die Merkmale der zeitlich festgelegten Rampen und programmierbaren Pausen hinzu. Dieses Programm erlaubt bis zu 9 Sollwerte und bis zu 99 Zyklen. Das AUTO-Programm erlaubt dem Benutzer, die Sollwertzeit und/oder -temperatur um einen festen Betrag jeden Zyklus zu erhöhen oder zu erniedrigen. Dieses Programm erlaubt ferner bis zu 9 Sollwerte und bis zu 99 Zyklen. Ein METHOD-Programm stellt einen Weg bereit, um bis zu 17 HOLD-, CYCLE- oder AUTO-Prgramme miteinander zu verbinden.
Insgesamt 150 Programme können gespeichert werden, wobei die Nummern von 1 bis 150 reichen. Programme können erzeugt, gespeichert, geschützt, gedruckt oder gelöscht werden. Ein Verzeichnis der gespeicherten Programme kann angesehen oder gedruckt werden. DER SYSTEM-9600-TASTENBLOCK

RUN: startet einen Programmdurchlauf von der Programmanzeige oder startet eine programmierte oder Tastenblock-Pause neu.
MORE: kippt die Laufzeitanzeigen und greift ferner auf die Nur-Bedienung-Funktionen zu (wenn sich Code 999 anschließt).
BACK: bewegt zu dem vorhergehenden Feld innerhalb des gleichen Bildschirms (screen). Wenn momentan auf dem ersten Feld positioniert, bewegt es zu dem vorhergehenden Bildschirm.
STEP: bewegt abwärts zu dem ersten Feld im nächsten Bildschirm.
PAUSE: startet eine angehaltene Zeitbegrenzung (paused time-out) für manuelle Unterbrechungen.
OPTION: bewegt entweder den Cursor von links nach rechts durch die Menüpunkte (Abrollen über die höchstwertige Option) oder kippt die YES/NO-Antwort.
STOP: bricht ein ablaufendes Programm vorzeitig ab oder bewegt den Benutzer eine Ebene nach oben in der Benutzeroberfläche.
CE: löscht ungültige Zahleneingaben.
ENTER: nimmt die momentane Zahleneingabe an, nimmt einen Menüpunkt an, nimmt eine YES/NO-Antwort an oder springt zum nächsten Feld einer Anzeige. Wenn die Zahleneingabe die letzte einer Anzeige ist, geht ENTER zur nächsten Anzeige.

GEMEINSAME SYSTEM-9600-ANZEIGEN
OBERSTE EBENE DER BENUTZEROBERFLÄCHE
Programme werden erzeugt durch Auswählen eines Programmtyps in der CREATE-Anzeige. Der Benutzer wird direkt zur ersten Anzeige des zu editierenden Programms gebracht.
Gespeicherte Programme werden abgerufen durch Eingeben einer Zahl 1 bis 150 von den RUN-, EDIT- oder der Programmanzeige. Das Eingeben einer gültigen Programmnummer aus der RUN-Anzeige startet automatisch den Durchlauf. Das Eingeben einer gültigen Programmnummer aus der EDIT- oder Program-Anzeige bringt den Benutzer zur ersten Anzeige des zu editierenden Programms.
Programme werden editiert durch Drücken von STEP (nach unten Bewegen eines Bildschirms), BACK (bewegen zum vorhergehenden Feld) oder ENTER (bewegen zum nächsten Feld).
Programme werden laufen gelassen durch Auswählen von RUN im RUN-STORE-PRINT-HOME-Menü oder durch Drücken der RUN-Taste auf dem Tastenblock. Der Benutzer muss zuerst zwei Parameter eingeben, die für jeden Durchlauf benötigt werden.
Die Annahme von HOME im RUN-STORE-PRINT-HOME-Menü ohne Sichern eines Programms zeigt den Bildschirm an:
HOLD-PROGRAMM
HOLD-PROGRAMM – Laufzeit-Anzeigen
HOLD-PROGRAMM – Laufzeitausdruck
CYCLE-PROGRAMM
CYCLE-PROGRAMM – Laufzeitanzeigen
CYCLE-PROGRAMM – Laufzeitausdruck
AUTO-PROGRAMM
AUTO-PROGRAMM – Laufzeitanzeigen
AUTO-PROGRAMM – Laufzeitausdruck
METHOD-PROGRAMM
METHOD-PROGRAMM – Laufzeiganzeigen
Die LAUFZEIT-, MORE- und PAUSE-Anzeigen werden die des momentan ablaufenden Programms sein. Zwei zusätzliche MORE-Anzeigen werden angeboten, wenn der Programmdurchlauf in einem Verfahren verbunden ist.
METHOD-PROGRAMM – Laufzeitausdruck
METHOD-PROGRAMM – Druck

METHOD: druckt den Kopf jedes in dem Verfahren verbundenen Programms.
PROGRAM DATA: druckt den Kopf und den Inhalt jedes in dem Verfahren verbundenen Programms.

SPEICHERN EINES PROGRAMMS (STORING A PROGRAM)
Wenn STORE aus dem RUN-STORE-PRINT-HOME-Menü ausgewählt wird, ist die Routine zum Speichern eines Programms die gleiche für eine Datei und für ein Verfahren. Das Schützen eines Programms stellt für den Benutzer sicher, dass das Programm nicht ohne Kenntnis der Benutzernummer überschrieben oder gelöscht wird. Andere Benutzer werden in der Lage sein, die geschützte Datei anzusehen, zu editieren, laufen zu lassen und in ihren Verfahren zu verbinden, werden jedoch nicht in der Lage sein, die gespeicherte Version zu ändern.

DIENSTPROGRAMMFUNKTIONEN (UTILITY FUNCTIONS)

DIR: erlaubt dem Benutzer, ein Verzeichnis (directory) der gespeicherten Programme anzusehen oder zu drucken über entweder deren Programmnummer, der Benutzernummer oder des Programmtyps.
CONFIG: erlaubt dem Benutzer, die Verwendung des Instruments auf seine speziellen Bedürfnisse zuzuschneiden.
DIAG: bietet dem Benutzer ein Mittel zur Diagnose von Laufzeitproblemen und zum Verifizieren der Leistung des Instruments an.
DEL: erlaubt dem Benutzer, gespeicherte Programme über Programmnummer, Benutzernummer oder Programmtyp zu löschen.

UTIL-VERZEICHNIS
UTIL – BENUTZERKONFIGURATION
UTIL – BENUTZERKONFIGURATION (Forts.)
UTIL – LÖSCHEN (DELETE)
UTIL – LÖSCHEN (Forts.)
UTIL – BENUTZERDIAGNOSEPROGRAMME
Solange irgendein Diagnosetest läuft, bringt die STOP-Taste den Benutzer immer zum Diagnosebildschirm der obersten Ebene zurück und erhöht automatisch die/den Testnummer und -namen auf den nächsten Test. Dies erleichtert das manuelle zyklische Durchlaufen durch die verfügbaren Diagnoseprogramme.
PRÜFEN EREIGNISDATEI (REVIEW HISTORY FILE)
Die zwei Typen von Aufzeichnungen sind 1) Zustandsaufzeichnungen, die Informationen über das Programm geben, und 2) Datenaufzeichnungen, die Informationen über jedes Halte- und Rampensegment in einem Programm geben. Ein HOLD-Programm wird behandelt als ein Haltesegment und die Datenaufzeichnung wird gespeichert werden, wenn die Datei endet.
Da es Hunderte von Einträgen geben könnte (50 Zyklen × 6 Sollwerte = 350 Einträge), wird eine schnelle, bi-direktionale Bewegung durch die Datei benötigt. Beachte, dass die meisten PCR-Programme 3 oder 6 Sollwerte und 40 Zyklen oder weniger haben werden. Die Einträge werden normalerweise in umgekehrter Reihenfolge geprüft, daher wird die erste gesehene Aufzeichnung die letzte geschriebene Aufzeichnung sein.
Wenn der Benutzer einen Aufzeichnungstyp zur Betrachtung ausgewählt hat, wird STEP oder BACK den Puffer um einen Eintrag des gewählten Typs nach oben oder nach unten bewegen. Durch Voranstellen von STEP oder BACK mit einer Zahl wird die zweite Zeile durch "Skip #XXX entries" ersetzt. Der Benutzer gibt eine Zahl ein und drückt ENTER, um den Wert anzunehmen und diese Zahl an Einträgen wird übersprungen, wenn vorwärts (STEP) oder rückwärts (BACK) gegangen wird.
Durch Voranstellen von STEP oder BACK mit der RUN-Taste kann der Benutzer schnell zur höchsten Aufzeichnungs-Nr. (die neueste Aufzeichnung) oder Aufzeichnung #1 (die älteste Aufzeichnung) des gewählten Typs gelangen.

STOP beendet den Prüfungsmodus und zeigt den Dateikopf an. ZUSTANDSAUFZEICHNUNG

Zustandsmeldungen

Tube Type: xxxxx	Typ des im Durchlauf verwendeten Probenröhrchens
Reaction vol: xxxuL	Im Durchlauf verwendetes Reaktionsvolumen
Clk starts w/in x.xC	Die Halteuhr startet innerhalb dieser Temperatur des Sollwerts
Start xx/xx/xx xx:xx	Zeit und Datum des Starts des Durchlaufs
End xx/xx/xx xx:xx	Zeit und Datum des Endes des Durchlaufs
Meth Complete	Alle im Verfahren verbundenen Programme sind abgeschlossen
Pause xx:xx at xx.xC	Das Programm hielt für diese Zeit bei dieser Temperatur an

Meldungen von Zuständen, die zum Abbruch führen können (Fatal status messages)

Sensor Error	Ein Sensor hat eine schlechte Ablesung 10 Mal hintereinander
Power fail xxx.x hrs	Die Leistung war für diese Zeitdauer ausgeschaltet
User Abort	Der Benutzer drückte die STOP-Taste während des Durchlaufs
Pause Timeout xx:xx	Die Tastenblockpause hat ihre konfigurierbare Zeitbegrenzung erreicht.
Fatal Setpoint Error	Es ist ein Erfordernis, ein Programm vorzeitig abzubrechen, wenn der Sollwert nicht innerhalb einer berechneten Zeitdauer erreicht wird. Eine 10 × 10 Nachschlagetabelle der Startrampentemperatur (0°C–100°C in 10°C-Schritten) versus die Endrampentemperatur (gleiche Achsenbenennung) wird die durchschnittliche Zeit enthalten, die der TC2 brauchen sollte, um um jedwede gegebene Anzahl von Graden linear zu erhöhen oder zu erniedrigen. Die Datei wird vorzeitig abgebrochen werden, wenn der Sollwert nicht in der wie folgt berechneten Zeitdauer erreicht wird:

	programmierte Rampenzeit + (2·Nachschlagetabellenwert) + 10 Minuten

DATENAUFZEICHNUNG
Die Zyklus- und Sollwertnummerfelder werden weggelassen bei einem HOLD-Programm.
DATENFEHLER-AUFZEICHNUNG

Nicht zum Abbruch führende FEHLER-Meldungen (Non-fatal ERROR messages)

Setp Error	Der Sollwert wurde nicht in der berechneten Zeit erreicht:

	programmierte Rampenzeit + (2·Nachschlagetabellenwert)
Prog Error	Ein Auto-Programm-Autoinkrement/-dekrement der Sollwerttemperatur oder -zeit bewirkte, dass die Haltezeit negativ wurde oder die Temperatur aus dem Bereich von 0,1°C bis 100°C herausfuhr.
Temp Error	Am Ende des Segments ist die Sollwerttemperatur um +/– einen benutzerkonfigurierbaren Betrag gedriftet.

Für das HOLD-Programm werden die Zyklus- und Sollwertfelder weggelassen.
DRUCKEN DER EREIGNISDATEI
Zugriff auf die Ereignisdatei-Druckroutinen erfolgt durch das Ereignisdateikopfmenü. Die OPTION-Taste führt den Cursor zyklisch durch die Optionen:
Drücken der ENTER-Taste, wenn der Cursor unter PRNT positioniert ist, zeigt den Druckbildschirm an:

ALL: druckt alle Aufzeichnungen in der Datei
STAT: druckt lediglich die Zustandsaufzeichnungen
ERRORS: druckt lediglich die Datensätze mit Fehlermeldungen

Wenn eine der Druckoptionen ausgewählt wird, wird der folgende Bildschirm angezeigt:
Die erste (neueste) Programmnummer wird das Vorgabeprogramm sein. Der Benutzer kann die Programmnummer ändern, von der an zu drucken begonnen wird. Während des Druckens wird der folgende Bildschirm angezeigt:
Am Ende des Druckvorgangs wird wieder das Print History-Menü angezeigt. HEIZGERÄTETEST
Der Heizgerätetest berechnet die Heizrate des Probenblocks, wenn dessen Temperatur von 35°C auf 65°C ansteigt. Der folgende Bildschirm wird angezeigt, wenn jener die Blocktemperatur auf 35°C zwingt.
Wenn sich die Temperatur stabilisiert, werden alle Heizgeräte auf volle Leistung gestellt. Die Anzeige lautet nun "going to 65C" und die Blocktemperatur wird für 20 Sekunden überwacht, nachdem jene 50°C durchlaufen hat. Nach 20 Sekunden wird eine Bestanden- oder Nicht-Bestanden-Meldung (pass or fail message) angezeigt.
KÜHLERTEST
Der Kühlertest berechnet die Kühlrate des Probenblocks, wenn dessen Temperatur von 35°C auf 15°C abfällt. Der folgende Bildschirm wird angezeigt, wenn jener die Blocktemperatur auf 35°C zwingt.
Wenn sich die Temperatur stabilisiert, ist der Kühler eingeschaltet. Die Anzeige lautet nun "going to 15C" und die Blocktemperatur wird für 20 Sekunden überwacht, nachdem jene 25°C durchlaufen hat. Nach 20 Sekunden wird eine Bestanden- oder Nicht-Bestanden-Meldung angezeigt.

Claims

System zur Kontrolle eines Apparats zur automatisierten Durchführung von Polymerasekettenreaktionen in zumindest einem Probenröhrchen, enthaltend eine bekanntes Volumen einer flüssigen Probenmischung, wobei das System folgendes umfasst: (a) einen Probenblock (12) mit mindestens einer Vertiefung für das mindestens eine Probenröhrchen (10), (b) einen Rechner (20), (c) Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40), gesteuert durch den Rechner (20) zur Veränderung der Temperatur des Probenblocks (12) und (d) einen Blocktemperatursensor (21), thermisch an den Probenblock (12) gekoppelt, wobei der Sensor dem Rechner (20) die Temperatur des Probenblocks (12) über die Zeit bereitstellt, wobei der Rechner (20) Mittel zur Bestimmung der Temperatur der flüssigen Probenmischung beinhaltet, wobei die Mittel zur Bestimmung der Temperatur der flüssigen Probenmischung so angeordnet sind, um eine thermische System-Zeitkonstante (τ) zu verwenden, um die Temperatur der flüssigen Probenmischung als Funktion der Temperatur des Probenblocks (12) über die Zeit zu berechnen.
System gemäß Anspruch 1, wobei das System Mittel umfasst, damit der Nutzer die thermische System-Zeitkonstante eingeben kann.
System gemäß Anspruch 1, wobei das System eine Eingabevorrichtung umfaßt, um ein Probenvolumen und einen Probenröhrchentyp von einem Nutzer aufzunehmen, und wobei der Rechner Mittel zur Bestimmung einer ersten thermischen Zeitkonstante von dem Eingabeprobenvolumen und Probenröhrchentyp umfasst.
System gemäß Anspruch 3, wobei der Rechner Mittel zur Speicherung einer Temperatursensorzeitkonstante umfasst.
System gemäß Anspruch 4, wobei der Rechner Mittel umfasst, die so angeordnet sind, um die thermische System-Zeitkonstante aus der ersten thermischen Zeitkonstante und der Temperatursensorzeitkonstante zu berechnen.
System gemäß Anspruch 5, wobei das Mittel, das so angeordnet ist, um die thermische System-Zeitkonstante zu berechnen, so angeordnet ist, um die Temperatursensorzeitkonstante von der ersten thermischen Zeitkonstante abzuziehen.
System gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das System so angeordnet ist, damit es die Temperatur der flüssigen Probenmischung anzeigt.
System gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Rechner (20) die Probentemperatur in einem gegebenen Probenintervall zu einer gegebenen Zeit n bestimmt als:
wobei
der Probentemperatur zum Zeitpunkt n entspricht,
oder Probentemperatur in dem direkt davor liegenden Probenintervall zum Zeitpunkt n – 1 entspricht,
der Blocktemperatur zum Zeitpunkt n entspricht, ^tinterval eine Zeit in Sekunden zwischen Probenintervallen ist und tau die thermische System-Zeitkonstante ist.
System gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die oder eine Eingabevorrichtung zum Erhalt von nutzerdefinierten Sollwerten vorgesehen ist, optional Zielprobentemperaturen, Definition eines Haltezeit/Temperaturprofils, wobei der Rechner (20) Mittel zur Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte und der Probentemperatur beinhaltet.
System gemäß Anspruch 9, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei der Rechner (20) weiterhin Mittel umfasst, damit die Nutzer die Profilläufe aufrufen können.
System gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei der Rechner (20) weiterhin Mittel zur Verbindung multipler Profile in jeder Reihenfolge zur Bildung eines Protokolls umfasst, wobei das Protokoll eine Sequenz der zu laufenden Profile definiert, wobei das Aufrufen der Sequenz von Profilen, die gelaufen werden sollen, das Laufen des Protokolls als Protokollauf bildet.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei der Rechner (20) weiterhin Mittel zur Verbindung eines einzelnen Profils eine Vielzahl von Malen in einem einzelnen Protokoll umfasst.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei der Rechner (20) weiterhin Mittel zur Speicherung einer Vielzahl von Protokollen umfasst.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei der Rechner (20) weiterhin Mittel zum Einschließen von jedem dieser Profile in einer Vielzahl der Protokolle umfasst.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei die Eingabevorrichtung weiterhin Mittel umfasst, um eine nutzerdefinierte Zykluszahl für jedes dieser Profile zu erhalten, wobei die Zykluszahl die Anzahl von Malen bildet, die das Profil gelaufen wird, wenn es aufgerufen wird.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei das System weiterhin Mittel zur automatischen Erhöhung und/oder Verminderung der Haltezeit von irgendeinem oder allen Sollwerten von Zyklus zu Zyklus in der Zykluszahl beinhaltet.
System gemäß Anspruch 16, wobei die Aktivierung des Mittels zur automatischen Erhöhung der Haltezeit für irgendeinen oder alle Sollwerte von Zyklus zu Zyklus als eine Nutzerleveloption über die Eingabevorrichtung wählbar ist.
System gemäß Anspruch 17, wobei die automatischen Erhöhungen in der Haltezeit von irgendeinem oder allen Sollwerten von Zyklus zu Zyklus durch erste und/oder zweite nutzerdefinierte Werteeingabe über die Eingabevorrichtung geschehen und geometrisch oder linear sein können, basierend auf den ersten und/oder zweiten nutzerdefinierten Werten.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 18, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei das System weiterhin Mittel zur automatischen Erhöhung und/oder Verminderung der Sollwerttemperatur von irgendeinem oder allen Sollwerten von Zyklus zu Zyklus in der Zykluszahl beinhaltet.
System gemäß Anspruch 19, wobei die Aktivierung des Mittels zur automatischen Erhöhung und/oder Verminderung der Sollwerttemperatur von irgendeinem oder allen Sollwerten von Zyklus zu Zyklus als Nutzerleveloption über die Eingabevorrichtung wählbar ist.
System gemäß Anspruch 20, wobei die automatischen Erhöhungen und/oder Verminderungen in der Sollwerttemperatur von irgendeinem oder allen Sollwerten von Zyklus zu Zyklus durch dritte und/oder vierte nutzerdefinierte Werteeingabe über die Eingabevorrichtung geschehen und geometrisch oder linear sein können, basierend auf den dritten und/oder vierten nutzerdefinierten Werten.
System gemäß einem der Ansprüche 9 bis 21, wobei die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der nutzerdefinierten Sollwerte den Durchlauf des Profils als Profillauf bildet, wobei das System weiterhin ein programmiertes Pausenoptionsmittel umfasst, um automatisch einen Lauf für eine nutzerdefinierte Zeitspanne anzuhalten.
System gemäß Anspruch 22, wobei das Pausenoptionsmittel Mittel umfasst, um den Lauf anzuhalten, nachdem irgendeiner oder alle Sollwerte vollständig sind, während irgendeinem oder allen Zyklen und nach irgendeinem oder nachdem alle Profile in dem Protokoll gelaufen sind.
System gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die thermische System-Zeitkonstante zwischen 3,5 und 12,5 Sekunden liegt.
Verfahren zur Computerkontrolle der automatisierten Durchführung von Polymerasekettenreaktionen in mindestens einem Probenröhrchen (10), enthaltend ein bekanntes Volumen einer flüssigen Probenmischung, durch einen computergesteuerten Thermocycler, beinhaltend einen Rechner (20), einen Probenblock (12) mit mindestens einer Vertiefung für das mindestens eine Probenröhrchen (10), einen Blocktemperatursensor (21), thermisch gekoppelt an den Probenblock (12), und Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40), kontrolliert durch den Rechner (20) zur Veränderung der Temperatur des Probenblocks, umfassend die Schritte durch den Rechner (20) von: (a) Ablesen der Blocktemperatur zu bestimmten Zeiten, (b) Bestimmung der Temperatur der flüssigen Probenmischung als Funktion der Temperatur des Probenblocks (12) über die Zeit, wobei der Bestimmungsschritt den folgenden Schritt umfasst: Bestimmung der Probentemperatur in einem laufenden Probenintervall zu einer gegebenen Zeit n gemäß der folgenden Formel:
wobei
der Probentemperatur zum Zeitpunkt n entspricht,
der Probentemperatur in dem direkt davorliegenden Probenintervall zum Zeitpunkt n – 1 entspricht,
der Blocktemperatur zum Zeitpunkt n entspricht, ^tinterval eine Zeit in Sekunden zwischen Probenintervallen ist und tau die thermische System-Zeitkonstante ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, weiterhin umfassend die Kontrolle der Erwärmungsmittel (14, 156) und Kühlmittel (34, 40) als Funktion der Probentemperatur, wobei der Schritt der Kontrolle der Erwärmungs- und Kühlmittel die folgenden Schritte umfasst: (i) Bestimmung einer theoretischen zweiten Kraft, repräsentierend die gesamte Kraft, die auf den Block in einem gegebenen Probenintervall zu einer gegebenen Zeit n angewandt werden muss, ohne Kraftverluste mit in die Betrachtung einzubeziehen, (ii) Teilen der theoretischen zweiten Kraft in theoretische Kräfte, wobei eine auf jede der Erwärmungszonen des Probenblocks angewandt werden soll, (iii) Bestimmung von Kraftverlusten durch die Regionen in dem gegebenen Probenintervall und (iv) Bestimmung einer tatsächlichen dritten Kraft für jede der Zonen in dem gegebenen Probenintervall, um einen Kraftverlust durch jede Zone mit auszugleichen, und optional wobei der Thermocycler zusätzlich eine Vor-Kühlung beinhaltet, die konstant auf den Probenblock (12) angewandt wird, wobei das computerkontrollierte Kühlmittel selektiv betreibbare Rampenkühlmittel umfasst, um eine Kühlflüssigkeit zu dem Probenblock (12) selektiv zuzuführen, und wobei der Schritt der Kontrolle der selektiv betreibbaren Rampenkühlmittel die folgenden Schritte beinhaltet: (v) Bestimmung, dass die Probentemperaturrampenrichtung nach unten führt, (vi) Bestimmung der Temperatur der Kühlflüssigkeit, (vii) Bestimmung als Funktion der Probentemperatur einer Gesamtkühlkraft, die auf den Block in dem gegebenen Probenintervall anzulegen ist, ohne dass Kraftverluste mit einbezogen werden, (viii) Bestimmung einer intermediären Kühlkraft durch Abzug des Kraftverlusts an das mindestens eine Verteilerrohr und an die Umgebung von der gesamten Kühlkraft, (x) Bestimmung einer Kühlbelastungsgrenze als Funktion der Differenz zwischen der Blocktemperatur und der Temperatur der Kühlflüssigkeit in dem gegebenen Probenintervall und (xi) selektiver Betrieb des Rampenkühlmittels als Funktion der Differenz zwischen der intermediären Kühlkraft und der Kühlbelastungsgrenze.