DE69233008T2 - Fusionierung von Peptiden und Proteinen mit Thioredoxin und thioredoxin-ähnlichen Molekülen - Google Patents

Fusionierung von Peptiden und Proteinen mit Thioredoxin und thioredoxin-ähnlichen Molekülen Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft allgemein die Herstellung von Fusionsproteinen in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Expression von rekombinanten Fusionssequenzen umfassend Thioredoxin oder Thioredoxin-ähnliche Sequenzen fusioniert mit Sequenzen für ausgewählte heterologe Peptide oder Proteine in Wirtszellen und die Verwendung derartiger Fusionsmoleküle zur Erhöhung der Produktion, Aktivität, Stabilität oder Löslichkeit von rekombinanten Proteinen und Peptiden.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Viele Peptide und Proteine können rekombinant in verschiedenen Expressionssystemen, z. B. verschiedenen Stämmen von Bakterien-, Pilz-, Säuger- oder Insektenzellen hergestellt werden. Sofern jedoch Bakterien als Wirtszellen für die heterologe Genexpression verwendet werden, treten häufig verschiedene Probleme auf.
  • Beispielsweise werden heterologe Gene, die kleine Peptide exprimieren, in Bakterien oft schlecht exprimiert. Auf Grund ihrer Größe können die meisten kleinen Peptide keine stabilen löslichen Konformationen annehmen und sind Gegenstand intrazellulärer Degradation durch in der Wirtszelle vorhandene Proteasen und Peptidasen. Diejenigen kleinen Peptide, welche bei direkter Expression in E. coli oder anderen bakteriellen Wirten akkumulieren können, werden üblicherweise in der unlöslichen oder „Einschlusskörper-" Fraktion gefunden, eine Gegebenheit, die sie nahezu wertlos für Screeningzwecke in biologischen oder biochemischen Tests macht.
  • Darüber hinaus stellen sich weitere Probleme bei der Herstellung kleiner Peptide als Kandidaten für neue Arzneimittel oder Enzyminhibitoren durch rekombinante Mittel, selbst wenn die kleinen Peptide nicht in Einschlusskörpern produziert werden. Selbst kleine lineare Peptide können auf Grund ihrer Konformationsfreiheitsgrade eine enorm hohe Anzahl möglicher Strukturen annehmen. So kann ein kleines Peptid die „gewünschte" Aminosäuresequenz aufweisen und trotzdem eine sehr niedrige Aktivität im Test zeigen, da die „aktive" Peptidkonformation lediglich eine von vielen in freier Lösung angenommenen alternativen Strukturen ist. Dies stellt eine andere, in der rekombinanten Herstellung kleiner heterologer Peptide für die effektive Forschung und therapeutische Verwendung beobachtete Schwierigkeit dar.
  • Die Bildung von Einschlusskörpern wird ebenfalls häufig beobachtet, wenn die Gene für heterologe Proteine in Bakterienzellen exprimiert werden. Diese Einschlusskörper erfordern üblicherweise weitere Manipulationen, um die heterologen Proteine zu solubilisieren und eine Rückfaltung durchzuführen, wobei die Bedingungen für jeden Fall empirisch und mit Unsicherheiten behaftet ermittelt werden müssen.
  • Sofern diese zusätzlichen Verfahrensmaßnahmen nicht erfolgreich sind, kann wenig bis kein biologisch aktives Protein aus den Wirtszellen gewonnen werden. Darüber hinaus sind diese zusätzlichen Verfahren oft technische schwierig und zu teuer für die praktische Herstellung von rekombinanten Proteinen für therapeutische, diagnostische oder andere Forschungszwecke.
  • Um diese Probleme auszuräumen, sind im Stand der Technik verschieden Peptide oder Proteine als Fusions- „Partner" mit einem gewünschten heterologen Peptid oder Protein eingesetzt worden, um die rekombinante Expression und/oder Sezernierung kleiner Peptide oder größerer Proteine als Fusionsproteine in bakteriellen Expressionssystemen zu ermöglichen. Solche Fusionspartner schließen lacZ- und trpE- Fusionsproteine, Maltose-Bindungsprotein Fusionen und Glutathion-S-Transferase Fusionsproteine ein (vgl. allgemein, „Current Protocols in Molecular Biology", Band 2, Sppl. 10, Hrsg. John Wiley and Sons, New York, NY, Seiten 16.4.1–16.8.1 (1990), und Smith et al., Gene 67 (1988), 31–40). US-A 4,801,536 beschreibt die Fusion eines bakteriellen Flagellin-Proteins mit einem gewünschten Protein, wodurch die Herstellung eines heterologen Gens als Fusionsprotein in einer Bakterienzelle und seine Sezernierung daraus in das Kulturmedium ermöglicht wird. Die PCT Veröffentlichung WO91/11454 beschreibt Fusionsproteine unter Verwendung von biotinyliertem Renin als Fusionspartner. Das Renin wird an eine Aufreinigungssäule immobilisiert, um die Abtrennung und Spaltung zu vereinfachen.
  • Häufig jedoch weisen Fusionen gewünschter Peptide oder Proteine mit anderen Proteinen (d. h. als Fusionspartner) am Amino- oder Carboxyterminus dieser Fusionspartner-Proteine andere mögliche Nachteile auf. Die Erfahrung mit E. coli hat gezeigt, dass ein wesentlicher Faktor für den Erhalt hoher Gen-Expressionswerte die Effizienz der Translationsinitiation ist. Die Initiation der Translation in E. coli hängt in starkem Maße von der Nukleotidsequenz ab, die das Methionin-Startkodon der gewünschten heterologen Peptid- oder Proteinsequenz umgeben, obgleich die diesem Phänomen zu Grunde liegenden Regeln nicht klar sind. Aus diesem Grunde beeinflussen Fusionen von Sequenzen am Aminoterminus vieler Fusionspartner-Proteine die Expressionswerte auf nicht vorhersagbare Weise. Darüber hinaus gibt es viele Amino- oder Carboxypeptidasen in E. coli, die amino- oder carboxyterminale Peptidverlängerungen an Fusionspartner-Proteinen abbauen, so dass eine Anzahl von bekannten Fusionspartnern eine niedrige Erfolgsrate in der Herstellung von stabilen Fusionsproteinen aufweist.
  • Die Reinigung von Proteinen, die vermittels rekombinanter Expressionssysteme hergestellt wurden, ist oft eine ernste Herausforderung. Es existiert ein fortwährendes Bedürfnis nach neuen und einfacheren Verfahren zur Herstellung homogener Präparationen an rekombinanten Proteinen. Dennoch weist eine Anzahl von gegenwärtig im Stand der Technik verwendeten Fusionspartnern keine inhärenten Eigenschaften auf, die das Reinigungsverfahren vereinfachen würden. Daher besteht im Bereich, rekombinanter Expressionssyteme weiterhin ein Bedarf an neuen Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Reinigung von stabilen, löslichen Peptiden und Proteinen zur Verwendung in der Forschung sowie in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Fusionssequenz umfassend eine Thioredoxin-ähnliche Proteinsequenz, die mit einem ausgewählten heterologen Peptid oder Protein fusioniert ist. Das Peptid oder Protein kann an den Aminoterminus der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz, den Carboxyterminus der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz oder innerhalb der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz (zum Beispiel innerhalb der das aktive Zentrum umfassenden Schleife von Thioredoxin) angeheftet sein. Die erfindungsgemäße Fusionssequenz kann gegebenenfalls ein Linkerpeptid zwischen der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz und dem ausgewählten Peptid oder Protein enthalten. Dieser Linker stellt, sofern erforderlich, eine ausgewählte Spaltstelle oder einen Bereich von Aminosäuren bereit, der sterische Behinderungen zwischen dem Thioredoxin-ähnlichen Molekül und dem ausgewählten Peptid oder Protein vermeiden kann.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein DNA-Molekül bereit, das die vorstehend definierte Fusionssequenz zusammen mit und unter der Kontrolle von einer Expressionskontrollsequenz kodiert, die die Expression des Fusionsproteins in einer gewünschten Wirtszelle steuern kann.
  • Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz, umfassend eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz fusioniert mit einer DNA-Sequenz eines ausgewählten heterologen Peptids oder Proteins transformiert ist oder diese in ihr Genom integriert hat. Diese Fusionssequenz befindet sich vorzugsweise unter der Kontrolle einer Expressionskontrollsequenz, welche die Expression eines Fusionsproteins in der Zelle steuern kann.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein neues Verfahren zur Erhöhung der Expression löslicher rekombinanter Proteine bereit. Das Verfahren schließt die Züchtung der vorstehend beschriebenen Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen ein, wodurch das Fusionsprotein hergestellt wird.
  • In einer Ausführungsform dieses Verfahrens und falls das erhaltene Fusionsprotein ein zytoplasmatisches Protein ist, kann die Zelle durch übliche Mittel lysiert werden, um das lösliche Fusionsprotein zu erhalten. Im Falle zytoplasmatischer Fusionsproteine ist stärker bevorzugt, dass das Verfahren die Freisetzung des Fusionsproteins aus der Wirtszelle durch Anwendung osmotischen Schocks oder Einfrieren/Auftauen der Zelle umfasst. In diesem Falle wird das Fusionsprotein selektiv aus dem Zellinneren über die Adhäsionszonen freigesetzt, die zwischen den inneren und äußeren Membranen von E. coli existieren. Das Fusionsprotein wird nachfolgend mittels üblicher Mittel aufgereinigt.
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens und falls ein sekretorisches Signalpeptid im Fusionsprotein-Konstrukt eingesetzt wird, kann das Fusionsprotein aus einem periplasmatischen Extrakt oder aus dem Zellkultur-Medium gewonnen werden.
  • Ein zusätzlicher Schritt in diesen beiden Verfahren ist die Abspaltung des gewünschten Proteins von dem Thioredoxin-ähnlichen Protein durch übliche Mittel.
  • Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Betrachtung der nachfolgenden detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen davon offensichtlich.
  • Zusammenfassung der Figuren
  • 1 beschreibt die DNA-Sequenz des Expressionsplasmids pALTRXA/EK/IL11Δ Pro-581 und die Aminosäure-Sequenz für das darin enthaltene Fusionsprotein, beschrieben in Beispiel 1.
  • 2 beschreibt die DNA-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz des Makrophagen-Hemmprotein-1α (MIP-1α) Proteins, das in der Konstruktion eines in Beispiel 3 beschriebenen Thioredoxin Fusionsproteins verwendet wurde.
  • 3 erläutert die DNA-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz des Knochen-Morphogen-Protein-2 (BMP-2) Proteins, das in der Konstruktion eines in Beispiel 4 beschriebenen Thioredoxin Fusionsproteins verwendet wurde.
  • 4 ist eine schematische Darstellung, welche die Einfügung einer Spaltstelle für eine Enterokinase in die das aktive Zentrum enthaltende Schleife von E. coli Thioredoxin (trxA) erläutert, beschrieben in Beispiel 5.
  • 5 ist eine schematische Darstellung, welche die Einfügung von Zufallspeptiden in die das aktive Zentrum enthaltende Schleife von E. coli Thioredoxin (trxA) erläutert, beschrieben in Beispiel 5.
  • 6 beschreibt die DNA-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz des menschlichen Interleukin-6 (IL-6) Proteins, das in der Konstruktion eines in Beispiel 6 beschriebenen Thioredoxin Fusionsproteins verwendet wurde.
  • 7 beschreibt die DNA-Sequenz des M-CSF Proteins, das in der Konstruktion eines in Beispiel 7 beschriebenen Thioredoxin Fusionsproteins verwendet wurde.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung erlaubt die Herstellung großer Mengen an heterologen Peptiden oder Proteinen in einer stabilen, löslichen Form in bestimmten Wirtszellen, die normalerweise beschränkte Mengen derartiger Peptide oder Proteine exprimeren. Sie ermöglicht die Freisetzung des Fusionsproteins aus den zur Herstellung verwendeten Zellen ohne dass die Zellen lysiert werden müssen, wodurch der Aufreinigungsprozeß gestrafft wird. Durch die Verwendung einer kleinen Peptidinsertion in einem internem Bereich der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz (z. B. der das aktive Zentrum von Thioredoxin umfassenden Schleife) stellt die Erfindung eine verwendbare Spaltstelle bereit, die auf der Oberfläche des Moleküls zugänglich ist. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine ermöglichen auch, dass die gewünschten Peptide oder Proteine die gewünschte Konformation einnehmen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die ein heterologes, zur Expression in einem rekombinanten System ausgewähltes Peptid oder Protein kodierende DNA-Sequenz mit einer Thioredoxin-ähnlichen DNA-Sequenz für die Expression in der Wirtszelle fusioniert. Eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz ist hier definiert als eine DNA-Sequenz, die ein Protein oder ein Fragment eines Proteins kodiert, das durch eine Aminosäure-Sequenz mit einer Homologie von mindestens 18% mit der Aminosäure-Sequenz von E. coli Thioredoxin über eine Länge der Aminosäure-Sequenz von mindestens 80 Aminosäuren gekennzeichnet ist. In einer anderen Ausführungsform ist eine Thioredoxin DNA-Sequenz definiert als eine DNA-Sequenz, die ein Protein oder Proteinfragment kodiert, das durch eine Kristallstruktur gekennzeichnet ist, die im wesentlichen gleich mit der von menschlichem oder E. coli Thioredoxin ist. Die DNA-Sequenz von Glutaredoxin ist eine derartige Sequenz. Die Aminosäure-Sequenz von E. coli Thioredoxin ist beschrieben in H. Eklund et al., EMBO J. 3 (1984), 1443–1449. Die dreidimensionale Struktur von E. coli Thioredoxin ist in 2 von A. Holmgren, J. Biol. Chem. 264 (1989), 13963–13966 dargestellt. 1 unterhalb der Nukleotide 2242–2568 enthält eine DNA-Sequenz, die das E. coli Thioredoxin-Protein kodiert (Lim et al., J. Bacteriol. 163 (1985), 311–316) Die drei letztgenannten Publikationen sind hier zur Bereitstellung von Information über Thioredoxin eingeführt, die dem Fachmann bekannt ist.
  • Als das wichtigste Beispiel eines Thioredoxin-ähnlichen Proteins, das in dieser Erfindung eingesetzt werden kann, weist das E. coli Thioredoxin die folgenden Eigenschaften auf. E. coli Thioredoxin ist ein kleines Protein mit lediglich 11,7 kD und kann auf hoher Ebene exprimiert werden (>10%, entsprechend einer Konzentration von 15 μM, wenn Zellen bei 10 A550/ml lysiert werden). Die kleine Größe und die Fähigkeit zur hohen Expression des Proteins tragen zu einer hohen intrazellulären Konzentration bei. E. coli Thioredoxin ist ferner durch eine sehr stabile, feste Struktur gekennzeichnet, welche die durch die Fusion mit dem gewünschten Peptid oder Protein verursachten Effekte auf die Stabilität der Gesamtstruktur minimieren kann.
  • Die dreidimensional Struktur von E. coli Thioredoxin ist bekannt. Es enthält mehrere Schleifen an der Oberfläche, einschließlich einer einzigartigen Schleife mit dem aktiven Zentrum zwischen den Resten Cys33 und Cys36, die aus dem Körper des Proteins herausragt. Die Schleife mit dem aktiven Zentrum ist eine identifizierbare, zugängliche Schleifenregion an der Oberfläche und ist nicht in irgendwelche Interaktionen mit dem übrigen Protein involviert, die zur Stabilität der Gesamtstruktur beitragen. Sie ist daher ein guter Kandidat als eine Stelle für Peptidinsertionen. Sowohl die Amino- wie auch die Carboxytermini von E. coli Thioredoxin befinden sich auf der Oberfläche des Proteins und sind für Fusionen gut zugänglich.
  • E. coli Thioredoxin ist ferner stabil gegenüber Proteasen. E. coli Thioredoxin kann somit wünschenswert zur Verwendung in E. coli Expressionssystemen sein, da es als ein E. coli Protein durch Stabilität gegenüber E. coli Proteasen gekennzeichnet ist. E. coli Thioredoxin ist außerdem stabil gegenüber Hitze bis zu 80°C und gegenüber niedrigen pH-Werten. Andere durch Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenzen kodierte Thioredoxin-ähnliche Proteine, die nützlich im Zusammenhang mit dieser Erfindung sind, können die homologen Aminosäure-Sequenzen sowie ähnliche physikalische und strukturelle Eigenschaften teilen. Daher können erfindungsgemäß anstelle von E. coli Thioredoxin DNA-Sequenzen eingesetzt werden, die andere Thioredoxin-ähnliche Proteine kodieren. Beispielsweise können die Thioredoxin aus anderen Arten, z. B. menschliches Thioredoxin, kodierenden DNA-Sequenzen in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren eingesetzt werden. Sowohl die Primärsequenz als auch die durch Computer vorhergesagte Sekundärstruktur ist bei menschlichem und E. coli Thioredoxin sehr ähnlich. Menschliches Thioredoxin trägt ferner dieselbe Schleife mit dem aktiven Zentrum, wie sie im E. coli Protein gefunden wird. Insertionen in die Schleife mit dem aktiven Zentrum von menschlichem Thioredoxin wie auch an die Amino- und Carboxytermini werden daher gegebenenfalls genauso toleriert wie jene in E. coli Thioredoxin.
  • Andere Thioredoxin-ähnliche Sequenzen, die in dieser Erfindung eingesetzt werden können, schließen die vollständigen Proteine oder Teile der Proteine Glutaredoxin und Homologe davon aus verschiedenen Arten ein (A. Holmgren, vorstehend zitiert). Obwohl E. coli Glutaredoxin und E. coli Thioredoxin eine Aminosäure-Homologie von weniger als 20% aufweisen, zeigen die beiden Proteine Ähnlichkeiten in Konformation und Funktion (Eklund et al., EMBO J. 3 (1984), 1443–1449).
  • Die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz, welche das Protein Disulfid-Isomerase (PDI) kodiert und Homologe davon aus verschiedenen Arten (J. E. Edman et al., Nature 317 (1985), 267–270) kann ebenfalls als eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz eingesetzt werden, da eine wiederholt auftretende Domäne von PDI eine Homologie von >18% mit E. coli Thioredoxin aufweist. Die beiden letztgenannten Publikationen sind hier inkorporiert, um Informationen über Glutaredoxin und PDI bereit zu stellen, die dem Fachmann bekannt und verfügbar sind.
  • Auf der Basis der Aminosäure-Sequenz-Homologie mit E. coli Thioredoxin kann in gleicher Weise die Phosphoinositid-spezifische Phospholipase C (PI-PLC), Fragmente davon und Homologe davon aus verschiedenen Arten (C. F. Bennett et al., Nature 334 (1988), 268–270) kodierende DNA-Sequenz erfindungsgemäß als Thioredoxin-ähnliche Sequenz eingesetzt werden. Die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz, welche ein Protein des endoplasmatischen Retikulums kodiert, beispielsweise Erp72 oder Homologe davon aus verschiedenen Arten sind ebenso für die Zwecke dieser Erfindung als Thioredoxin-ähnliche Sequenzen eingeschlossen (R. A. Mazzarella et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 1094-1101). Eine weitere Thioredoxin-ähnliche Sequenz ist eine DNA-Sequenz, die den gesamten oder einen Teil eines adulten T-Zell-Leukämie abgeleiteten Faktors) (ADF) oder Homologe davon aus anderen Arten kodiert (N. Wakasugi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 8282–8286) und zwar auf der Basis der Homologie der Aminosäure-Sequenz mit E. coli Thioredoxin. Die drei letztgenannten Publikationen sind hier inkorporiert, um Informationen über PI-PLC, Erp72 und ADF bereit zu stellen, die dem Fachmann bekannt und verfügbar sind.
  • Aus der vorstehend verwendeten Definition für eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz wird erwartet, dass andere, vorstehend nicht gesondert identifizierte Sequenzen oder bislang noch nicht identifizierte oder publizierte Sequenzen auf der Grundlage ihrer Aminosäure-Sequenz-Ähnlichkeiten mit E. coli Thioredoxin und charakteristischen Ähnlichkeiten in der kristallinen Struktur mit E. coli Thioredoxin und den anderen Thioredoxin-ähnlichen Proteinen als Thioredoxin-ähnliche Sequenzen eingesetzt werden können. Auf der Basis der vorstehenden Definition sollte ein Fachmann ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand in der Lage sein, eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz zur erfindungsgemäßen Verwendung auszuwählen und zu identifizieren oder, falls erwünscht, zu modifizieren. Beispielsweise stellen in Bereichen von nativem Thioredoxin oder von nativen Thioredoxin-ähnlichen Sequenzen eingeführte einfache Punktmutationen, die die Struktur des so erhaltenen Moleküls nicht beeinflussen, alternative Thioredoxin-ähnliche Sequenzen dar. Das gleiche gilt für allele Varianten von nativem Thioredoxin oder von nativen Thioredoxin-ähnlichen Sequenzen.
  • DNA-Sequenzen, die entweder unter stringenten oder milden Hybridisierungsbedingungen an die Sequenz für E. coli Thioredoxin oder ihre strukturellen Homologen hybridisieren, kodieren ebenfalls Thioredoxin-ähnliche Proteine für die erfindungsgemäße Verwendung. Stringente Hybridisierung ist hier definiert als Hybridisierung in 4XSSC bei 65°C, gefolgt von Waschen in 0,1XSSC bei 65°C für eine Stunde. In einer anderen Ausführungsform ist stringente Hybridisierung definiert als Hybridisierung in 50% Formamid, 4XSSC bei 42° C. Nicht-stringente Hybridisierung ist hier definiert als Hybridisierung in 4XSSC bei 50°C oder Hybridisierung in 30–40% Formamid bei 42°C. Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung von all diesen Thioredoxin-ähnlichen Sequenzen von dieser Erfindung umfasst ist.
  • Die Konstruktion einer erfindungsgemäßen Fusionssequenz, die die DNA-Sequenz eines ausgewählten Peptids oder Proteins und die DNA-Sequenz einer Thioredoxin-ähnlichen Sequenz umfasst, setzt übliche Genmanipulationstechniken ein (vgl. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)). Fusionssequenzen können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die ausgewählten heterologen Proteine mit dem Aminoterminus des Thioredoxin-ähnlichen Moleküls fusioniert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die ausgewählte Protein-Sequenz mit dem Carboxyterminus des Thioredoxin-ähnlichen Moleküls fusioniert werden. Kurze Peptidsequenzen können ebenfalls an die vorstehend genannten Positionen der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz angeheftet werden, wodurch sie in einer strukturell nicht erzwungenen Weise hergestellt werden.
  • Diese Fusion eines gewünschten heterologen Peptids oder Proteins mit dem Thioredoxin-ähnlichen Protein erhöht die Stabilität des Peptids oder Proteins. Entweder am Amino- oder am Carboxyterminus wird das gewünschte heterologe Peptid oder Protein derart fusioniert, dass die Fusion die native Struktur beider Protein nicht destabilisiert. Darüber hinaus verbessert die Fusion mit dem löslichen Thioredoxin-ähnlichen Protein die Löslichkeit des ausgewählten heterologen Peptids oder Proteins.
  • Es kann aus einer Reihe von Gründen heraus bevorzugt sein, dass Peptide mit der das aktive Zentrum tragenden Schleife des Thioredoxin-ähnlichen Moleküls fusioniert werden. Die die das aktive Zentrum tragende Schleife umgebende Oberfläche hat sich im Einklang mit der Hauptfunktion des Proteins als einer nicht spezifischen Protein-Disulfid-Oxidoreduktase entwickelt, wodurch eine Interaktion mit einer großen Vielfalt von Proteinoberflächen möglich ist. Der Bereich der das aktive Zentrum tragenden Schleife befindet sich zwischen Segmenten stark ausgeprägter Sekundärstrukturen und bietet viele Vorteile für Peptidfusionen. Ein kleines Peptid, das in die das aktive Zentrum tragende Schleife eines Theoredoxin-ähnlichen Proteins eingefügt wurde, ist in einem Bereich des Proteins vorhanden, der nicht in die Aufrechterhaltung der tertiären Struktur eingebunden ist. Daher sollte die Struktur eines derartigen Fusionsproteins stabil sein. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass E. coli Thioredoxin an einer Position nahe der das aktive Zentrum tragenden Schleife in zwei Fragmente gespalten werden kann und die das Protein stabilisierenden tertiären Interaktionen dennoch verbleiben.
  • Die das aktive Zentrum tragende Schleife von E. coli Thioredoxin weist die Sequenz NH2...Cys33-Gly-Pro-Cys36...COOH auf. Die Fusion eines ausgewählten Peptids mit einem Thioredoxin-ähnlichen Protein im Bereich der aktiven Schleife des Proteins bindet das Peptid an beiden Enden, reduziert die Konformationsfreiheitsgrade des Peptids und vermindert folgerichtig die Anzahl von vom Peptid eingenommenen alternativen Strukturen. Das eingefügte Peptid ist an beiden Enden an Cysteinreste gebunden, die miteinander eine Disulfidbrücke bilden können, wie sie es in nativem Thioredoxin tun, wodurch die Konformationsfreiheit des eingefügten Peptids weiter eingeschränkt wird.
  • Darüber hinaus lokalisiert diese Erfindung das Peptid an die Oberfläche des Thioredoxin-ähnlichen Proteins. Somit stellt die Erfindung einen besonderen Vorteil für die Verwendung der Peptide beim Screenen auf biologisch aktive Peptid-Konformationen und andere Tests durch Präsentation von in die das aktive Zentrum tragende Schleife eingefügten Peptiden in diesem strukturellen Kontext bereit.
  • Darüber hinaus schützt die Fusion des Peptids mit der Schleife dieses vor den Aktivitäten von E. coli Amino- und Carboxypeptidasen. Weiterhin gibt es bereits eine Spaltstelle für die Restriktionsendonuklease RsrII in dem Bereich der E. coli Thioredoxin DNA-Sequenz, die den Schleifenbereich kodiert und zwar genau an der richtigen Stelle für eine Peptidfusion (vgl. 4). RsrII erkennt die DNA-Sequenz CGG(A/T)CCG und hinterlässt ein 3 Nukleotide langes 5'-überstehendes Ende. DNAs, die die komplementären überstehenden Enden tragen, werden sich daher an dieser Stelle in lediglich einer Orientierung einfügen.
  • Eine Fusionssequenz einer Thioredoxin-ähnlichen Sequenz und einer gewünschten Protein- oder Peptidsequenz gemäß dieser Erfindung kann gegebenenfalls ein Linkerpeptid, eingefügt zwischen der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz und dem ausgewählten heterologen Peptid oder Protein enthalten. Diese Linkersequenz kann, falls gewünscht, ein Polypeptid kodieren, das durch übliche chemische oder enzymatische Verfahren selektiv spaltbar oder verdaubar ist. Beispielsweise kann die ausgewählte Spaltstelle eine enzymatische Spaltstelle sein. Beispiele für enzymatische Spaltstellen schließen Stellen für die Spaltung mit einem proteolytischen Enzym wie Enterokinase, Faktor Xa, Trypsin, Collagenase und Thrombin ein. In einer anderen Ausführungsform kann die Spaltstelle in dem Linker eine Stelle sein, die nach Kontakt mit einer ausgewählten Chemikalie, z. B. Bromcyan, Hydroxylamin oder niedrigem pH-Wert gespalten werden kann.
  • Die Spaltung an der ausgewählten Spaltstelle ermöglicht. die Abtrennung des heterologen Proteins oder Peptids aus dem Thioredoxin Fusionsprotein, wodurch das reife heterologe Peptid oder Protein erhalten wird. Das reife Peptid oder Protein kann dann in aufgereinigter Form erhalten werden, frei von jeglichem Polypeptidfragment des Thioredoxin-ähnlichen Proteins, mit dem es zuvor verknüpft war. Die Spaltstelle, sofern in einen für die erfindungsgemäßen Fusionssequenzen nützlichen Linker eingefügt, schränken diese Erfindung nicht ein. Jede gewünschte Spaltstelle, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind, kann für diesen Zweck eingesetzt werden.
  • Die gegebenenfalls vorhandene Linkersequenz der erfindungsgemäßen Fusionssequenz kann einen anderen Zweck als die Bereitstellung einer Spaltstelle erfüllen. Der Linker kann ebenso eine einfache Aminosäure-Sequenz mit ausreichender Länge sein, die eine sterische Behinderung zwischen dem Thioredoxin-ähnlichen Molekül und dem ausgewählten heterologen Peptid oder Protein vermeidet.
  • Ob eine solche Linkersequenz notwendig ist oder nicht, wird von den strukturellen Eigenschaften des ausgewählten heterologen Peptids oder Proteins abhängen und davon, ob das erhaltene Fusionsprotein ohne Spaltung nützlich ist. Sofern beispielsweise die Thioredoxin-ähnliche Sequenz eine menschliche Sequenz ist, kann das Fusionsprotein selbst als Therapeutikum verwendbar sein und zwar ohne die Abspaltung des ausgewählten Proteins oder Peptids davon. In einer anderen Ausführungsform und in Fällen, in denen die reife Protein-Sequenz auf natürliche Weise gespalten werden kann, wird gegebenenfalls kein Linker benötigt.
  • Daher enthält die erfindungsgemäße Fusionssequenz in einer Ausführungsform eine Thioredoxin-ähnliche Sequenz, die an ihrem Amino- oder Carboxyterminus direkt mit der Sequenz des ausgewählten Peptids oder Proteins verknüpft ist. Das so erhaltene Fusionsprotein ist somit ein lösliches zytoplasmatisches Fusionsprotein. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Fusionssequenz darüber hinaus eine Linkersequenz, die zwischen die Thioredoxin-ähnliche Sequenz und die Sequenz des ausgewählten Peptids oder Proteins gesetzt wurde. Dieses Fusionsprotein wird ebenfalls als ein lösliches zytoplasmatisches Protein hergestellt. In Fällen, in denen die ausgewählte Peptidsequenz in den Bereich der das aktive Zentrum tragenden Schleife oder an anderer Stelle innerhalb der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz eingefügt ist, wird in gleicher Weise ein zytoplasmatisches Fusionsprotein hergestellt.
  • Das zytoplasmatische Fusionsprotein kann auf übliche Weise aufgereinigt werden. Als ein neuer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise verschiedene erfindungsgemäße Thioredoxin Fusionsproteine unter Ausnutzung einer ungewöhnlichen Eigenschaft von Thioredoxin aufgereinigt werden. Das Zytoplasma von E. coli ist durch eine zwei Membranen, eine innere und eine äußere, umfassende zelluläre Umhüllung wirksam von dem äußeren Medium abgetrennt. Die Membranen sind durch den periplasmatischen Raum voneinander getrennt, in dem sich eine steife Peptidoglykan-Zellwand befindet. Die Peptidoglykan-Zellwand trägt sowohl zur Form als auch zur Festigkeit der Zelle bei. An bestimmten Stellen in der Zellumhüllung gibt es „Lücken" (in verschiedener Weise Bayer-Flecken („Bayer patches"), Bayer-Verbindung („Bayer junctions") oder Adhäsionsstellen genannt) in der Peptidoglykan-Zellwand, wo die inneren und äußeren Membranen sich offenbar treffen und möglicherweise miteinander fusionieren. Vgl. M. E. Bayer, J. Bacteriol. 93 (1967), 1104–1112 und J. Gen. Microbiol. 53 (1968), 395–404. Der größte Teil des zellulären Thioredoxins befindet sich lose assoziiert mit der inneren Oberfläche der Membran an diesen Adhäsionsstellen und kann in quantitativer Weise durch einen plötzlichen osmotischen Schock oder durch ein einfaches Einfrier-/Auftau-Verfahren durch diese Adhäsionsstellen hindurch aus der Zelle ausgeschleust werden. Vgl. C. A. Lunn und V. P. Pigiet, J. Biol. Chem. 257 (1982), 11424– 11430 und in „Thioredoxin and Glutaredoxin Systems: Structure and Function" (1986), 165–176, Hrsg. A. Holmgren et al., Raven Press, New York. In geringerem Ausmaß kann etwas EF-Tu (Elongationsfaktor-Tu) auf die gleiche Weise ausgeschleust werden (Jacobsen et al., Biochemistry 15 (1976), 2297–2302). Mit Ausnahme des periplasmatischen Inhalts kann die große Mehrheit der E. coli Proteine durch diese Behandlungen jedoch nicht aus der Zelle freigesetzt werden.
  • Obgleich es Berichte gibt, nach denen eine begrenzte Anzahl von im Zytoplasma von E. coli produzierten heterologen Proteinen durch osmotischen Schock freigesetzt wurde (Denefle et al., Gene 85 (1989), 499–510; Joseph-Liauzun et al., Gene 86 (1990), 291–295; Rosenwasser et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 13066–13073), ist die Fähigkeit, freigesetzt zu werden, eine seltene und erwünschte Eigenschaft, die von der Mehrheit der heterologen Proteine nicht geteilt wird. Die Fusion eines heterologen Proteins mit Thioredoxin, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, erhöht nicht nur seine Expression, Löslichkeit und Stabilität, wie vorstehend dargestellt, sondern kann auch für seine Freisetzung aus der Zelle durch osmotischen Schock oder Einfrier-/Auftau-Behandlungen sorgen, wodurch seine Aufreinigung stark vereinfacht wird. Der Theoredoxin Bestandteil des Fusionsproteins lenkt das Fusionsprotein in einigen Fällen, z. B. bei MIP, zu den Adhäsionsstellen, von denen aus es durch diese Behandlungen nach außen freigesetzt werden kann.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung einen anderen Bestandteil einsetzen, nämlich eine sekretorische Signalsequenz, von denen viele im Stand der Technik bekannt sind, z. B. die Signalsequenzen von phoA, MBP, β-Lactamase und die im selben Leseraster funktionell mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein verknüpft ist, wodurch die Expression und Sezernierung des reifen Fusionsproteins in den bakteriellen periplasmatischen Raum oder das Kulturmedium ermöglicht wird. Die Signalsequenz kann an den Aminoterminus des Thioredoxin-ähnlichen Moleküls geheftet sein, wenn die ausgewählte Peptid- oder Proteinsequenz an den Carboxyterminus angeheftet oder mit einer internen Stelle innerhalb der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz verknüpft ist. Ein fakultativer Linker kann ebenfalls vorhanden sein, wenn das Peptid oder Protein mit dem Carboxyterminus fusioniert ist. Es wird erwartet, dass dieses Fusionssequenz-Konstrukt als sezerniertes Fusionsprotein und nicht als zytoplasmatisches Fusionsprotein exprimiert wird, wenn es in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird. Es sollten jedoch Stabilität, Löslichkeit und hohe Expression die mit jeder dieser alternativen Ausführungsformen hergestellten Fusionsproteine kennzeichnen.
  • Diese Erfindung ist nicht eine bestimmte Art von heterologem Peptid oder Protein beschränkt. Eine große Vielfalt von heterologen Genen oder Genfragmenten können für die Bildung der erfindungsgemäßen Fusionssequenzen eingesetzt werden. Während die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren besonders nützlich für Peptide oder Proteine sind, die nicht exprimiert, in Einschlusskörpern exprimiert oder in Bakterien- und Hefewirten in sehr kleinen Mengen exprimiert werden, können die heterologen Peptide oder Proteine jedes Peptid oder Protein einschließen, das für die menschliche oder veterinäre Therapie, Diagnose oder Anwendungen in der Forschung nützlich ist und zwar in jedem Expressionssystem. Zum Beispiel können Hormone, Zytokine, Wachstums- oder Hemmfaktoren, Enzyme, modifizierte oder vollständig synthetische Proteine oder Peptide erfindungsgemäß in bakteriellen, Hefe-, Säuger- oder anderen eukaryotischen Zellen und Expressionssytemen produziert werden, die dafür geeignet sind.
  • In den nachstehenden und diese Erfindung erläuternden Beispielen schließen die durch diese Erfindung exprimierten Proteine IL-11, MIP-1α, IL-6, M-CSF, einen Knochen induzierenden Faktor mit der Bezeichnung BMP-2 und eine Auswahl an kleinen Peptiden mit zufällig gewählter Sequenz ein. Diese Proteine umfassen Beispiele von Proteinen, die in E. coli instabil sind oder in Einschlusskörpern gefunden werden, wenn sie ohne einen Thioredoxin Fusionspartner exprimiert werden.
  • Eine Vielzahl von DNA-Molekülen kann zur erfindungsgemäßen Expression des heterologen Peptids oder Proteins konstruiert werden, die die vorstehend beschriebenen Fusionssequenzen inkorporieren. Eine gewünschte DNA-Sequenz gemäß dieser Erfindung umfasst mindestens eine wie vorstehend beschriebene Fusionssequenz zusammen mit und unter der Kontrolle von einer Expressionskontroll-Sequenz, welche die Expression des Fusionsproteins in einer gewünschten Wirtszelle steuern kann. Wenn die Wirtszelle beispielsweise ein E. coli Stamm ist, enthält das DNA-Molekül wünschenswerterweise einen Promotor, der in E. coli funktioniert, eine Ribosomen-Bindungsstelle und gegebenenfalls ein selektierbares Marker-Gen wie auch einen Replikationsursprung, falls das DNA-Molekül extrachromosomaler Natur ist. Zahlreiche bakterielle Expressionsvektoren, die diese Bestandteile enthalten, sind im Stand der Technik für die bakterielle Expression bekannt und können auf einfache Weise durch übliche molekularbiologische Techniken konstruiert werden. Gleichermaßen können bekannte Hefe- und Säugerzell-Vektoren und Vektorbestandteile verwendet werden, wenn die Wirtszelle eine Hefezelle oder eine Säugerzelle ist.
  • Die die Fusionssequenzen enthaltenden DNA-Moleküle können weiter modifiziert werden, um verschiedene Kodons zu enthalten, um die Expression in der ausgewählten Wirtszelle zu optimieren, wie im Stand der Technik bekannt ist.
  • Diese DNA-Moleküle können zusätzlich multiple Kopien der Thioredoxin-ähnlichen DNA-Sequenz enthalten, wobei das heterologe Protein lediglich mit einer dieser DNA-Sequenzen verknüpft ist oder wobei das heterologe Protein mit allen Kopien der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz fusioniert ist. Es sollte auch möglich sein, eine Thioredoxin-ähnliche/heterologes Peptid oder Protein kodierende Fusionssequenz in das Chromosom eines ausgewählten Wirts zu integrieren, entweder um eine native Thioredoxin-ähnliche Sequenz zu ersetzen oder um sie zu duplizieren.
  • Für die vorliegende Erfindung geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise bakterielle Zellen. Beispielsweise sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z. B. HB101, W3110 und in den nachfolgenden Beispielen eingesetzte Stämme) als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Der E. coli Stamm GI724, der in den nachfolgenden Beispielen eingesetzt wurde, wurde bei einer US Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, wie nachfolgend im Detail beschrieben hinterlegt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas und anderen Bakterien können auch in diesem Verfahren eingesetzt werden. Viele dem Fachmann bekannte Hefestämme und andere eukaryotische Zellen können als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide ebenfalls nützlich sein. In gleicher Weise können bekannte Säugerzellen für die Expression dieser Fusionsproteine eingesetzt werden.
  • Um das erfindungsgemäße Fusionsprotein herzustellen, ist die Wirtszelle entweder mit einem DNA-Molekül transformiert, die eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz fusioniert mit der DNA-Sequenz eines ausgewählten heterologen Peptids oder Proteins umfasst, vorzugsweise unter der Kontrolle einer Expressionskontroll-Sequenz, die die Expression eines Fusionsproteins steuern kann oder hat die Wirtszelle ein derartiges DNA-Molekül in ihr Genom integriert. Die Wirtszelle wird sodann unter bekannten Bedingungen gezüchtet, die für die Produktion von Fusionsproteinen geeignet sind. Falls das Fusionsprotein im Zytoplasma der Zelle akkumuliert, kann es durch übliche bakterielle Zelllyse-Techniken freigesetzt und mittels üblicher Verfahren einschließlich selektiver Fällungen, Solubilisierungen und Säulen-chromatographischer Verfahren gereinigt werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine selektive Freisetzung aus der Zelle für zytoplasmatische Thioredoxin Fusionsproteine durch osmotischen Schock oder Gefrier-/Auftau-Verfahren erreicht werden. Obwohl eine abschließende Aufreinigung für die meisten Zwecke immer noch erforderlich ist, ist die anfängliche Reinheit von Fusionsproteinen in Präparationen, die mit diesen Verfahren erhalten werden, höher als die, die mit üblichen Lysaten ganzer Zellen erhalten werden. Dadurch wird die Anzahl der für den Erhalt der Homogenität erforderlichen nachfolgenden Reinigungsschritte reduziert. In einem typischen Verfahren unter Verwendung von osmotischem Schock werden die das Fusionsprotein enthaltenden gepackten Zellen auf Eis in einem EDTA enthaltenden Puffer mit hoher Osmolarität, die üblicherweise auf der Zugabe eines gelösten Stoffes, z. B. 20 Gew.-% Sucrose, beruht, und der die zytoplasmatische Membran nicht einfach durchqueren kann, resuspendiert. Während der kurzen Inkubation auf Eis plasmolysieren die Zellen, da Wasser das Zytoplasma gemäß dem abfallenden osmotischen Gradienten verlässt. Die Zellen werden anschließend in einen Puffer mit niedriger Osmolarität übertragen und während des osmotischen Reequilibriums werden sowohl der Inhalt des Periplasmas als auch die an den Bayer-Flecken lokalisierten Proteine ausgeschleust. Eine einfache Zentrifugation nach dieser Freisetzung entfernt den Großteil der bakteriellen zellulären Kontaminanten aus den Fusionsprotein Präparaten. In einer anderen Ausführungsform werden in einem Einfrier-/Auftau-Verfahren die das Fusionsprotein enthaltenden gepackten Zellen zunächst in einem EDTA enthaltenden Puffer resuspendiert und dann eingefroren. Die Freisetzung des Fusionsproteins wird nachfolgend durch Auftauen der gefrorenen Zellen erreicht. Wie vorstehend beschrieben, kann der Großteil der Kontaminanten durch einen Zentrifugationsschritt entfernt werden.
  • Diese Behandlungen setzen typischerweise mindestens 30% der Fusionsproteine frei, ohne dass die Zellkulturen lysiert werden. Der Erfolg dieser Verfahren bei der Freisetzung signifikanter Mengen einer großen Vielzahl von Thioredoxin Fusionsproteinen ist überraschend, da diese Techniken üblicherweise bei einem großen Bereich von Proteinen nicht zum Erfolg führen. Die Möglichkeit, diese Fusionsproteine durch solche, bedeutend einfachere und im Vergleich zu bei anderen Fusionsprotein-Systemen notwendigen Aufreinigungsverfahren kostengünstigere Behandlungen wesentlich aufzureinigen, kann für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine einen bedeutsamen Vorteil gegenüber anderen Systemen darstellen, die zur Herstellung von Proteinen in E. coli verwendet werden.
  • Das so erhaltene Fusionsprotein ist stabil und löslich, wobei das heterologe Peptid oder Protein oft seine biologische Aktivität beibehält. Wie vorstehend diskutiert, kann das heterologe Peptid oder Protein bei Bedarf durch Spaltung von dem Thioredoxin-ähnlichen Protein abgetrennt werden.
  • In den spezifischen und erläuternden Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren wurde das Thioredoxin-Gen (trxA) aus E. coli kloniert und in ein E. coli Expressionssystem eingefügt. Es wurde ein Expressionsplasmid pALtrxA-781 konstruiert. Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 enthält modifiziertes IL-11 verknüpft mit der Thioredoxin Sequenz und ist in Beispiel 1 und in 1 beschrieben. Eine modifizierte Version dieses Plasmids, die eine andere Ribosomen-Bindungsstelle enthält, wurde in den anderen Beispielen eingesetzt und ist spezifisch in Beispiel 3 dargestellt. In dieser Erfindung können andere übliche Vektoren eingesetzt werden. Die Erfindung ist nicht auf die in diesen Beispielen beschriebenen Plasmide beschränkt.
  • Das Plasmid pALtrxA-781 (ohne das modifizierte IL-11) steuert im E. coli Wirtsstamm GI724 die Ansammlung von >10% des gesamten zellulären Proteins als Thioredoxin. Die Beispiele 2 bis 6 beschreiben die Verwendung dieses Plasmids in der Bildung und Expression von Thioredoxin Fusionsproteinen mit den Polypeptiden BMP-2, IL-6 und MIP-1α.
  • Als ein Beispiel der Expression kleiner Peptide, die in die Schleife mit dem aktiven Zentrum eingefügt wurden, wurde ein Derivat von pALtrxA-781 konstruiert, in das eine 13 Aminosäuren lange Linkerpeptid-Sequenz, die eine Spaltstelle für die spezifische Protease Enterokinase (Leipnieks und Light, J. Biol. Chem. 254 (1979), 1077–1083) enthält, in die Schleife von Thioredoxin mit dem aktiven Zentrum eingefügt wurde. Dieses Plasmid (pALtrxA-EK) steuert die Ansammlung von >10% des gesamten zellulären Proteins als das Fusionsprotein. Das Fusionsprotein ist vollständig löslich, was darauf hinweist, dass es vermutlich eine „native" tertiäre Struktur angenommen hat. Es ist bei verlängerten Inkubationen bei 80°C ebenso stabil wie Wildtyp Thioredoxin, was nahe legt, dass die stabile tertiäre Struktur von Thioredoxin durch die Insertion in die Schleife mit dem aktiven Zentrum nicht beeinträchtigt wurde. Das Fusionsprotein wird im Gegensatz zu Thioredoxin durch Enterokinase spezifisch gespalten, was darauf hindeutet, dass das in die Schleife mit dem aktiven Zentrum eingefügte Peptid sich auf der Oberfläche des Fusionsproteins befindet.
  • Wie genauer in dem nachfolgenden Beispiel 5 beschrieben, wurden kleine Peptide in die Schleife von Thioredoxin mit dem aktiven Zentrum eingefügt. Die eingefügten Peptide wiesen eine Länge von 14 Aminosäuren auf und waren von rein zufälliger Zusammensetzung. Hierdurch wurde das System auf seine Fähigkeit hin getestet, hydrophobe, hydrophile und neutrale Sequenzen zu verarbeiten.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen ermöglichen die Herstellung von in der Forschung sowie in diagnostischen und therapeutischen Bereichen nützlichen Proteinen und Peptiden. Die Herstellung von Fusionsproteinen gemäß dieser Erfindung weist eine Reihe von Vorteilen auf. Ein Beispiel dafür ist, dass die Herstellung eines ausgewählten Proteins durch die vorliegende Erfindung über eine carboxyterminale Fusion mit E. coli Thioredoxin oder mit einem anderen Thioredoxin-ähnlichen Protein die Vermeidung von Problemen mit der Initiation der Translation ermöglicht, die oft in der Herstellung von eukaryotischen Proteinen in E. coli vorgefunden werden. Darüber hinaus fehlt das üblicherweise am N-Terminus des heterologen Proteins verbleibende Initiations-Methionin und muß somit nicht entfernt werden, falls das heterologe Protein über eine carboxyterminale Fusion mit Thioredoxin hergestellt wird.
  • Die Herstellung der Fusionsproteine gemäß dieser Erfindung verbessert die Löslichkeit der gewünschten heterologen Proteine und erhöht ihre Stabilität in dem Expressionssystem gegenüber Proteasen in verlässlicher Weise. Die Erfindung ermöglicht ferner die Expression von bestimmten gewünschten therapeutischen Proteinen, z. B. IL-11, auf hoher Ebene, die ansonsten auf niedriger Ebene in bakteriellen Wirtszellen hergestellt werden. Diese Erfindung kann dem Fusionsprotein ferner Hitzestabilität verleihen, insbesondere falls das heterologe Protein selbst hitzestabil ist. Da Thioredoxin und vermutlich sämtliche Thioredoxin-ähnlichen Proteine hitzestabil bis 80°C sind, kann die vorliegende Erfindung die Verwendung einer einfachen Hitzebehandlung als einen ersten wirkungsvollen Reinigungsschritt für einige Thioredoxin Fusionsproteine ermöglichen.
  • Zusätzlich zu der Bereitstellung von großen Mengen des ausgewählten heterologen Proteins oder Peptids nach Abspaltung von dem Fusionsprotein für therapeutische oder andere Zwecke können die erfindungsgemäßen Fusionsproteine oder Fusionspeptide selbst nützlich als Therapeutika sein. Darüber hinaus können die Thioredoxin-ähnlichen Fusionsproteine einen Träger für die Verabreichung von biologisch aktiven Peptiden bereitstellen. Beispielsweise wäre menschliches Thioredoxin im Menschen nicht antigen. Daher kann ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein mit menschlichem Thioredoxin als Träger zur Verabreichung des damit fusionierten biologisch aktiven Peptids beim Menschen nützlich sein. Menschliche Thioredoxin Fusionsproteine können in intrazellulären E. coli Expressionssystemen hergestellt werden, da menschliches Thioredoxin ein intrazelluläres Protein ist. Somit stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Verabreichung von biologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in Form eines Fusionsproteins mit einem verträglichen Thioredoxin-ähnlichen Protein an einen Patienten bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Reagenzien bereit, um Bibliotheken von Zufallspeptiden auf ihre potentiellen Enzym-inhibitorischen Aktivitäten sowie ihre Aktivitäten als Hormon-/Wachstumsfaktor-Agonisten und Hormon-/Wachstumsfaktor-Antagonisten zu screenen. Ferner bereit gestellt werden Verfahren und Reagenzien für die Kartierung bekannter Protein-Sequenzen auf Bereiche von potentiellen Interesse, einschließlich Rezeptor-Bindungsstellen, Substrat-Bindungsstellen, Phosphorylierungs-/Modifizierungsstellen, Protease-Spaltstellen und Epitopen.
  • Bakterielle Kolonien, die Thioredoxin-ähnliche/Zufallspeptid Fusionsproteine exprimieren, können unter Verwendung radiomarkierter Proteine wie Hormonen oder Wachtstumsfaktoren als Sonden gescreent werden. In dieser Art von Test identifizierte positive Klone würden Moleküle identifizieren, die Rezeptor-Bindungsstellen nachahmen und zum Design von Stoffen mit therapeutischen Verwendungen führen. Bakterielle Kolonien, die Fusionsproteine aus Thioredoxin-ähnlichen Proteinen und Zufallspeptiden exprimieren, können auch unter Verwendung von Antikörpern gescreent werden, die gegen native, aktive Hormone oder Wachstumsfaktoren gewonnen wurden. In dieser Art von Test identifizierte positive Klone könnten Moleküle darstellen, die Oberflächenepitope auf dem Originalantigen nachahmen. Wenn derartige Oberflächenepitope für die Rezeptorbindung verantwortlich sind, würden die „positiven" Fusionsproteine biologische Aktivität aufweisen.
  • Die erfindungsgemäßen Thioredoxin-ähnlichen Fusionsproteine oder Fusionspeptide können auch zur Entwicklung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper oder rekombinanter oder chimärer Antikörper eingesetzt werden, die nach bekannten Verfahren für diagnostische, Reinigungs- oder therapeutische Zwecke hergestellt werden. Untersuchungen mit Thioredoxin-ähnlichen Molekülen deuten auf eine mögliche B Zell-/ T Zell-Wachstumsfaktor-Aktivität hin (N. Wakasuki et al., vorstehend zitiert), die Immunantworten verstärken könnten. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine oder – peptide können als Antigene eingesetzt werden, um gewünschte Antikörper zu erzeugen, die ihrerseits nach bekannten Verfahren weiter manipuliert werden können, um monolonale oder rekombinante Antikörper zu erhalten.
  • In einer anderen Ausführungsform können gegen Thioredoxin-ähnliche Sequenzen erzeugte Antikörper auch in der Reinigung vieler verschiedener Thioredoxin Fusionsproteine nützlich sein.
  • Die nachfolgenden Beispiele erläutern Ausführungsformen der Erfindung, sollen den Schutzbereich der Offenbarung jedoch nicht einschränken.
  • Beispiel 1 – Thioredoxin- IL-11 Fusionsmolekül
  • Ein erfindungsgemäßes Thioredoxin-ähnliches Fusionsmolekül wurde unter Verwendung von E. coli Thioredoxin als der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz und rekombinantem IL-11 als dem ausgewählten heterologen Protein hergestellt: Die DNA- und Aminosäuresequenz von IL-11 wurde publiziert. Vgl. Paul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 7512– 7516 und die PCT Veröffentlichung WO91/0749, publiziert am 30. Mai 1991. IL-11 DNA kann durch Klonierung auf der Basis seiner publizierten Sequenz erhalten werden. Das E. coli Thioredoxin- (trxA) Gen wurde auf der Grundlage seiner publizierten Sequenz kloniert und zur Herstellung verschiedener. verwandter E. coli Expressionsplasmide eingesetzt. Dabei wurden übliche DNA-Manipulationsverfahren eingesetzt, die ausführlich in Sambrook, Fritsch und Maniatis, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) dargestellt sind. Ein erstes Expressionsplasmid pALTRxa-781 wurde hergestellt, das das E. coli trxA-Gen enthielt, das nicht mit einer anderen Sequenz fusioniert war. Dieses Plasmid enthielt weiterhin Sequenzen, die nachstehend im Detail für das verwandte IL-11 Fusionsplasmid beschrieben sind. Dieses erste Plasmid, das die Ansammlung von >10% Thioredoxin vom gesamten zellulären Protein in einem E. coli Wirtsstamm GI724 steuert, wurde weiter, wie nachstehend beschrieben, zur Konstruktion einer trxA/IL-11 Fusionssequenz manipuliert. Die Gesamtsequenz des verwandten Plasmid-Expressionsvektors pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 ist in 1 dargestellt und enthält die nachfolgend dargestellten wesentlichen Eigenschaften:
    Die Nukleotide 1-2060 enthalten DNA-Sequenzen, die aus dem Plasmid pUC-18 (Norrander et al., Gene 26 (1983), 101–106) stammen und schließen das Gen für β-Lactamase, das in E. coli Wirtsstämmen Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin vermittelt sowie einen von colE1 abgeleiteten Replikationsursprung ein. Die Nukleotide 2061–2221 enthalten DNA-Sequenzen für den wichtigen linkswärtigen Promotor (pL) des Bakteriophagen λ (Sauger et al., J. Mol. Biol. 162 (1982), 729–773) einschließlich dreier Operator-Sequenzen, OL1, OL2 und OL3. Die Operatoren stellen die Bindungsstellen für das λ cI Repressorprotein dar, dessen intrazelluläre Mengen die Initiation der Transkription von pL quantitativ kontollieren. Die Nukleotide 2222–2241 enthalten eine starke Ribosomen-Bindungsstelle, die aus der des Gens 10 des Bakteriophagen T7 abgeleitet ist (Dunn und Studier, J. Mol. Biol. 166 (1983), 477–535).
  • Die Nukleotide 2242–2568 enthalten eine DNA-Sequenz, die das E. coli Thioredoxin Protein kodiert (Lim et al., J. Bacteriol. 163 (1985), 311–316). Am Ende der Thioredoxin kodierenden Sequenz in diesem Plasmid gibt es kein Translationsterminations-Kodon.
  • Die Nukleitide 2569–2583 enthalten eine DNA-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz für ein kurzes, hydrophiles, flexibles Spacerpeptid „-GSGSG--„ kodiert. Die Nukleotide 2584-2598 stellen eine DNA-Sequenz bereit, die die Aminosäure-Sequenz für die Erkennungssequenz für die Spaltung mit Enterokinase (EC 3.4.4.8), „--DDDDK--„ (Maroux et al., J. Biol. Chem. 246 (1971), 5031–5039) kodiert.
  • Die Nukleotide 2599–3132 enthalten eine DNA-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz einer modifizierten Form von reifem menschlichem IL-11 (Paul et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 7512–7516) kodiert, in der der N-terminale Prolylrest deletiert ist, der normalerweise im natürlichen Protein gefunden wird. Die Sequenz enthält ein Translationsterminations-Kodon am 3'-Ende der IL-11 Sequenz.
  • Die Nukleotide 3133–3159 stellen eine „Linker" DNA-Sequenz bereit, die Spaltstellen für Restriktionsendonukleasen enthält. Die Nukleotide 3160-3232 stellen eine Translationsterminations-Sequenz bereit, die auf der Grundlage derjenigen des E. coli aspA-Gens beruht (Takagi et al, Nucl. Acids Res. 13 (1985), 2063–2074). Die Nukleotide 3233–3632 sind aus pUC-18 stammende DNA-Sequenzen.
  • Wie nachstehend in Beispiel 2 dargestellt, kann (lieser Plasmidvektor die Produktion großer Mengen (etwa 10% des gesamten zellulären Proteins) eines Thioredoxin-IL-11 Fusionsproteins steuern, wenn die Züchtung unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten E. coli Wirtsstamm erfolgt. Im Gegensatz dazu akkumulierte IL-11 nur zu 0,2% des gesamten zellulären Proteins, wenn es in einem analogen Wirt/Vektor System exprimiert wurde und nicht mit Thioredoxin fusioniert war.
  • Beispiel 2 – Expression eines Fusionsproteins
  • Unter Verwendung des in Beispiel 1 konstruierten Plasmids wurde ein Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein gemäß den nachfolgend dargestellten Versuchsanleitungen hergestellt. pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 wurde nach dem Verfahren von Dagert und Ehrlich, Gene 6 (1979), 23, in den E. coli Wirtsstamm GI724 (F-, lacIq, lacPL8, ampC::λ cI+) transformiert. Der nicht transformierte Wirtsstamm E. coli GI724 wurde am 31. Januar 1991 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland unter der ATCC Hinterlegungsnummer 55151 für Patentzwecke gemäß geltenden Gesetzen und Bestimmungen hinterlegt. Transformanten wurden auf 1,5 Gew.-% Agarplatten enthaltend IMC Medium selektioniert, das aus M9 Medium (Miller, „Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972) ), supplementiert mit 0,5 Gew.-% Sukrose, 0,2 Gew.-% Casaminosäuren und 100 μg/ml Ampicillin zusammengesetzt ist.
  • GI724 enthält eine Kopie des Wildtyp λ cI Repressor-Gens, das im ampC-Lokus stabil in das Chromosom integriert ist und dort unter die Transkriptionskontrolle von Salmonella typhimurium trp-Promotor-/Operatorsequenzen gestellt wurde. In GI724 wird das λ cI Protein nur bei Wachstum in Tryptophan-freiem Medien synthetisiert, wie Minimalmedien oder einem Minimalmedium, das durch Casaminosäuren ergänzt ist, wie das vorstehend beschriebene IMC. Die Zugabe von Tryptophan zu einer Kultur von GI724 wird den trp-Promotor unterdrücken und die Synthese von λ cI beenden, wodurch allmählich die Induktion der Transkription von pL-Promotoren bewirkt wird, sofern diese in der Zelle vorhanden sind.
  • GI724, transformiert mit pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581, wurde bei 37°C in IMC Medium bis zu einer A550 von 0,5 gezüchtet. Tryptophan wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben und die Kultur weitere 4 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit akkumulierte Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein auf einen Wert von etwa 10 % des gesamten zellulären Proteins.
  • Das gesamte Fusionsprotein befand sich in der löslichen zellulären Fraktion und wurde, wie nachfolgend beschrieben, aufgereinigt. Die Zellen wurden in einer French-press-Zelle bei 20.000 psi in 50 mM HEPES, pH 8,0, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation bei 15.000 × g 30 Minuten geklärt und der Überstand auf eine QAE-Toyopearl Säule geladen. Die Durchfluß-Fraktionen wurden verworfen und das Fusionsprotein mit 50 mM HEPES, pH 8,0, 100 mM NaCl eluiert. Das Eluat wurde auf 2 M NaCl eingestellt und auf eine Phenyl-Toyopearl Säule geladen. Die Durchfluß-Fraktionen wurden wiederum verworfen und das Fusionsprotein mit 50 mM HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl eluiert.
  • Das Fusionsprotein wurde anschließend gegen 25 mM HEPES, pH 8,0 dialysiert und war in diesem Stadium >80% rein. Gemessen in einem T1165 Bioassay (Paul et al., vorstehend zitiert), zeigte das aufgereinigte Thioredoxin-IL-11 Protein eine Aktivität von 8 × 105 Einheiten/mg. Dieser Wert stimmt auf molarer Basis sehr gut mit der Aktivität von 2 × 106 Einheiten/mg überein, die bei aus COS Zellen stammendem und bis zur Homogenität aufgereinigtem IL-11 in demselben Test gemessen wurde. Ein Milligramm des Fusionsproteins wurde anschließend 20 Stunden bei 37°C mit 1.000 Einheiten Rinder-Enterokinase (Leipnieks und Light, J. Biol. Chem. 254 (1979), 1677–1683) in 1 ml 10 mM Tris-Cl(pH 8,0)/10 mM CaCl2 gespalten. Aus den Reaktionsprodukten wurde IL-11 durch Passagieren über eine QAE-Toyopearl Säule in 25 mM HEPES, pH 8,0 gewonnen, wobei homogenes IL-11 in den Durchfluß-Fraktionen gefunden wurde. Nicht gespaltenes Fusionsprotein, Thioredoxin und Enterokinase blieben an die Säule gebunden.
  • Das auf diese Weise hergestellte IL-11 wies in dem T1165 Test eine biologische Aktivität von 2 × 106 Einheiten/mg auf. Seine physikalischen und chemischen Eigenschaften wurden, wie nachstehend aufgeführt, ermittelt:
  • (1) Molekulargewicht
  • Es wurde ermittelt, dass das Molekulargewicht von IL-11, gemessen durch 10% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (Tricin-System) gemäß den Verfahren nach Schagger et al., Anal. Biochem. 166 (1987), 368–379, etwa 21 kD betrug. Der Stoff lief als einzelne Bande.
  • (2) Endotoxin-Gehalt
  • Der Endotoxin-Gehalt des IL-11 betrug weniger als 0,1 ng pro Milliliter IL-11 im LAL („Limulus Amebocyten Lysat", Pyrotel, erhältlich über Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hole, Massachusetts, USA) Test, der gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt wurde.
  • (3) Isoelektrischer Punkt
  • Der theoretische isoelektrische Punkt von IL-11 beträgt pH 11,70. Wie durch isoelektrische Polyacrylamidgel-Fokussierung unter Verwendung einer LKB „Ampholine PAGplate" mit einem pH-Bereich von 3,5 bis 9,5 gemessen wurde, lief das IL-11 bei einem höheren Wert als 9,5. Eine genaue Messung konnte nicht durchgeführt werden, da IL-11 ein zu basisches Protein für die verfügbaren verlässlichen Gele ist.
  • (4) Fluoreszenz-Absorptionsspektrum
  • Das Fluoreszenz-Absorptionsspektrum von IL-11, gemessen in einer 0,1%igen wässrigen Lösung in einer 1 cm Quarzküvette zeigte ein Emissionsmaximum bei 335–337 nm.
  • (5) UV-Absorption
  • Die UV-Absorption des IL-11 in einer 0,1%-igen wässrigen Lösung in einer 1 cm Quarzküvette zeigte ein Absorptionsmaximum bei 278–280 nm.
  • (6) Aminosäure-Zusammensetzung
  • Die theoretische Aminosäure-Zusammensetzung von IL-11, basierend auf seiner Aminosäure-Sequenz ist wie folgt:
    Figure 00240001
  • Eine Probe an homogenem IL-11 wurde, wie nachfolgend beschrieben, einer Gasphasen-Hydrolyse unterworfen:
    6 N HCl und 2 N Phenol Reagenzien wurden einem Hydrolysegefäß zugegeben, in das 45 μl von 1 : 10 verdünntem (Gew./H2O) IL-11, konzentriert zur Trockne, enthaltende Röhrchen eingesetzt waren. Die Proben wurden unter Vakuum versiegelt und 36 Stunden bei 110°C hydrolysiert. Nach der Hydrolyse wurden die Proben getrocknet und in 500 μl Na-S Proben-Verdünnungspuffer resuspendiert. Die Aminosäure-Analyse wurde mit einem automatischen Beckman 7300 Aminosäure-Analysegerät durchgeführt. Für die Auftrennung der Aminosäuren nach der Derivatisierung mit Ninhydrin, die nach der Säulenauftrennung stattfand, wurde eine Kationen-Austauschersäule verwendet. Primäre Aminosäuren wurden bei 570 nm und sekundäre Aminosäuren bei 440 nm nachgewiesen. Für jede der Aminosäuren wurden acht Punkt-Eichungskurven erstellt.
  • Da bestimmte Aminosäure üblicherweise nicht wieder gewonnen werden, sind nachfolgend lediglich die Ergebnisse für 5 Aminosäuren dargestellt. Da die Hydrolyse ohne Entsalzung des Proteins durchgeführt wurde, wurde für die meisten Aminosäuren eine Rückgewinnung von 100% erreicht.
  • Die relative Rückgewinnung jedes einzelnen Aminosäurerestes pro Molekül an rekombinantem IL-11 wurde durch Normalisierung GLX = 10 bestimmt (die auf der Grundlage der cDNA-Sequenz voraus gesagte Anzahl von Glutamin- und Glutaminsäureresten in IL-11). Der für die Rückgewinnung von GLX in Picomol erhaltene Wert wurde durch 10 dividiert, um den GLX-Quotienten zu erhalten. Wenn man den für die Rückgewinnung jeder Aminosäure in Picomol erhaltenen Wert durch den GLX-Quotienten für diese Probe dividiert, so erhält man eine Zahl, die die relative Rückgewinnung jeder Aminosäure in der Probe wiederspiegelt, normalisiert gegen die quantitative Rückgewinnung von GLX-Resten. Der Korrelationskoeffizient, mit dem die erwarteten mit den beobachteten durchschnittlichen Anzahlen an Resten jeder Aminosäure verglichen werden, ist größer als 0,985. Dies deutet darauf hin, dass die für jede Aminosäure beobachtete Anzahl von Resten mit der voraus gesagten Sequenz gut übereinstimmt.
  • Figure 00250001
  • (7) Aminoterminale Sequenzierung
  • IL-11 (gepuffert in 95%-igem Acetonitril TFE („TFA")) wurde unter Verwendung eines ABI 471A Protein-Sequenziergerätes (ABI, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Sequenzierung des Aminoterminus bestätigte, dass das aus dem Thioredoxin Fusionsprotein hergestellte IL-11 die richtige IL-11 Aminosäure-Sequenz und lediglich einen beobachteten Aminoterminus enthielt.
  • (8) Peptid-Kartierung
  • Das IL-11 wurde mit Endoproteinase Asp-N (Boehringer Mannheim) (1 : 500 Verhältnis von Asp-N zu IL-11) in 10 mM Tris, pH 8, 1 M Harnstoff und 2 mM 4-Aminobenzamidindihydrochlorid (PABA) 4 Stunden bei 37°C gespalten. Mit der Probe wurde anschließend eine HPLC auf einer C4 Vydac-Säule durchgeführt, wobei ein A-Puffer aus 50 mM NaHPO4, pH 4,3, in dH2O, und ein B-Puffer aus 100% Isopropanol mit einem Gradienten bei 1 ml/Min. von 100% A zu 25% A und 75% B (Wechsel 1%/Minute) eingesetzt wurden. Die eluierten Peptidfragmente wurden dann mittels eines ABI 471A Protein-Sequenziergerätes (ABI, Inc.) gemäß den Anleitungen des Herstellers sequenziert. Die Peptid-Kartierung bestätigte, dass das aus dem Thioredoxin Fusionsprotein hergestellte IL-11 die richtigen N-terminalen und C-terminalen IL-11 Sequenzen enthielt.
  • (9) Löslichkeit
  • Das IL-11 Protein wurde in den nachfolgend aufgeführten Substanzen auf seine Löslichkeit getestet, wobei die folgenden Ergebnisse erzielt wurden:
    Wasser sehr gute Löslichkeit
    Ethylalkohol sehr gute Löslichkeit
    Aceton sehr gute Löslichkeit
    1 M Natriumchlorid sehr gute Löslichkeit
    10% Sukrose sehr gute Löslichkeit
  • (10) Zucker-Zusammensetzung und Gehalt an Protein/Polysaccharid in %
  • Das Fehlen von an das Polypeptid-Rückrad des IL-11 Proteins angehefteten Zuckerresten wird durch seine Aminosäure-Sequenz angezeigt, die keine der üblichen Anheftungsstellen für Zucker aufweist.
  • Beispiel 3 – Thioredoxin-MIP Fusionsmolekül
  • Das menschliche Makrophagen-Hemmprotein-1α (MIP-1α) wurde als ein Thioredoxin Fusionsprotein in E. coli auf hoher Ebene exprimiert. Dazu wurde ein Expressionsvektor ähnlich dem vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 verwendet, der jedoch in der nachfolgend beschriebenen Weise modifiziert wurde, um die Ribosomen-Bindungsstelle des Bakteriophagen T7 durch die von λ CII zu ersetzen. In dem Plasmid nach Beispiel 1 wurden die Nukleotide 2222 und 2241 nach konventionellen Verfahren ersetzt. Eine Nukleotid-Sequenz, gebildet durch die Nukleotide 35566 bis 35472 und 38137 bis 38361 des Bakteriophagen lambda, wie in Sanger et al. (1982), vorstehend zitiert, beschrieben, wurde anstelle dieser Nukleotide eingefügt. Um ein Thioredoxin-MIP-1α Fusionsprotein zu exprimieren, wurde in dem derart veränderten Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 die menschliches IL-11 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide 2599–3132) durch die in 2 gezeigte 213 Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die reifes menschliches MIP-1α voller Länge (Nakao et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 3646–3658) kodiert.
  • Der Wirtsstamm und das für die Herstellung des Thioredoxin-MIP-1α Fusionsproteins verwendete Expressionsprotokoll entsprechen der Darstellung in Beispiel 1. Wie mit dem Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein beobachtet wurde, wurde das gesamte Thioredoxin-MIP-1α Fusionsprotein in der löslichen zellulären Fraktion gefunden und stellte bis zu 20% des gesamten Proteins dar.
  • Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, lysiert, wodurch eine Protein-Konzentration von 10 mg/ml im Rohlysat erhalten wurde. Anschließend wurde dieses Lysat 10 Min. auf 80° C erhitzt, wodurch die Mehrzahl der kontaminierenden E. coli Proteine ausgefällt wurde, und durch Zentrifugation für 60 Min. bei 130.000 × g geklärt. Der Niederschlag wurde entfernt und der Überstand auf eine Mono Q-Säule geladen. Das Fusionsprotein eluierte bei etwa 0,5 M NaCl von dieser Säule und war in diesem Stadium zu >80% rein. Nach einer Dialyse zur Entfernung von Salz konnte das Fsuionsprotein durch Behandlung mit Enterokinase, wie in Beispiel 1 beschrieben gespalten werden, wodurch MIP-1α freigesetzt wurde.
  • Beispiel 4 – Thioredoxin-BMP-2 Fusionsmolekül
  • Menschliches Knochen-Morphogen-Protein-2 (BMP-2) wurde auf hoher Ebene als ein Thioredoxin Fusionsprotein in E. coli exprimiert, wobei der in Beispiel 3 beschriebene modifizierte Expressionsvektor verwendet wurde. In dem modifizierten Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 wurde die menschliches IL-11 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide 2599–3132) durch die in 3 gezeigte 345 Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die reifes menschliches BMP-2 voller Länge (Wozney et al., Science 242 (1989), 1528–1534) kodiert.
  • In diesem Fall trat das Thioredoxin-BMP-2 Fusionsprotein in der unlöslichen zellulären Fraktion auf, wenn der den Expressionsvektor enthaltende Stamm GI724 in einem Tryptophan enthaltenden Medium bei 37°C gezüchtet wurde. Wenn die Temperatur des Wuchsmediums jedoch auf 20°C erniedrigt wurde, wurde das Fusionsprotein in der löslichen zellulären Fraktion gefunden.
  • Beispiel 5 – Fusionsmoleküle aus Thioredoxin und kleinem Peptid
  • Natives E. coli Thioredoxin wurde in E. coli auf hoher Ebene unter Verwendung des Stammes GI724 exprimiert, der denselben, in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid-Expressionsvektor enthielt, aus dem die Nukleotide 2569–3129 deletiert worden waren. Dabei wurde dasselbe Wachstums- und Induktionsprotokoll, wie in Beispiel 1 dargestellt verwendet. Unter diesen Bedingungen akkumulierte Thioredoxin zu etwa 10% des gesamten Proteins, das vollständig in der löslichen zellulären Fraktion gefunden wurde.
  • 4 stellt die Insertion von 13, eine Spaltstelle für eins Enterokinase darstellenden Aminosäure-Resten in die Schleife mit dem aktiven Zentrum von Thioredoxin dar und zwar zwischen die Reste G34 und P35 der Thioredoxin Protein-Sequenz. Das diese interne Enterokinase-Spaltstelle enthaltende Fusionsprotein wurde in Mengen exprimiert, die denen nativen Thioredoxins entsprachen. Es wurde durch Behandlung mit Enterokinase gespalten, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben. Das Fusionsprotein war gegenüber Hitzebehandlung ebenso stabil wie natives Thioredoxin. Es war resistent bei einer 10-minütigen Inkubation bei 80°C, wie in Beispiel 4 beschrieben.
  • Nachstehend sind zwölf weitere Peptid-Insertionen aufgeführt, die auch in der Schleife mit dem aktiven Zentrum von Thioredoxin zwischen den Resten G34 und P35 durchgeführt wurden. Die Sequenzen weisen in der Länge jeweils 14 Aminosäure-Reste auf und sind zufällig zusammengesetzt. Jedes dieser Thioredoxin Fusionsproteine mit diesen auf dem Zufallsprinzip beruhenden Insertionen wurde in Mengen hergestellt, die mit denen von nativem Thioredoxin vergleichbar waren. Sie wurden alle in der löslichen zellulären Fraktion gefunden. Diese Peptide schließen die folgenden Sequenzen ein:
    Figure 00280001
  • Die eingefügten Sequenzen umfassten Beispiele, die sowohl hydrophob als auch hydrophil waren sowie Beispiele, die Cystein-Reste enthielten. Es hat den Anschein, dass die Schleife mit dem aktiven Zentrum von Thioredoxin eine große Vielfalt von Peptid-Insertionen tolerieren kann und so lösliche Fusionsproteine erhalten werden. Zur Reinigung dieser Scheifen- „Insertionen" können Standardverfahren eingesetzt werden.
  • Beispiel 6 – Menschliches Interleukin-6
  • Menschliches Interleukin-6 (IL-6) wurde auf hoher Ebene als ein Thioredoxin Fusionsprotein in E. coli exprimiert, wobei ein ähnlicher Vektor wie der vorstehend in Beispiel 3 beschriebene modifizierte Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 eingesetzt wurde. Um ein Thioredoxin-IL-6 Fusionsprotein zu exprimieren, wurde in dem veränderten Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 die menschliches IL-11 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide 2599–3132) durch die in 6 gezeigte 561 Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die reifes menschliches IL-6 voller Länge (Hirano et al., Nature 324 (1986), 73–76) kodiert. Der Wirtsstamm und das für die Herstellung des Thioredoxin-IL-6 Fusionsproteins verwendete Expressionsprotokoll entsprechen der Darstellung in Beispiel 1.
  • Wenn das Fusionsprotein bei 37°C synthetisiert wurde, wurden etwa 50% davon in der „Einschlusskörper-" oder unlöslichen Fraktion gefunden. Sofern die bei der Synthese eingesetzte Temperatur auf 25°C erniedrigt wurde, wurde jedoch das gesamte Thioredoxin-IL-6 Fusionsprotein, das bis zu 10% des gesamten zellulären Proteins darstellte, in der löslichen Fraktion vorgefunden.
  • Beispiel 7 – Menschlicher Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
  • Menschlicher Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) wurde auf hoher Ebene als ein Thioredoxin Fusionsprotein in E. coli exprimiert, wobei der modifizierte Expressionsvektor ähnlich dem vorstehend in Beispiel 3 beschriebenen Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 eingesetzt wurde.
  • Die menschliches IL-11 in dem modifizierten Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide 2599–3135) wurde durch die 669 Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die in 7 gezeigt ist und die ersten 223 Aminosäuren von reifem menschlichem M-CSFβ kodiert (G. G: Wong et al., Science 235 (1987), 1504–1508). Der Wirtsstamm und das für die Herstellung des Thioredoxin-M-CSF Fusionsproteins verwendete Expressionsprotokoll entsprechen der Darstellung in Beispiel 2, oben.
  • Wie mit dem Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein beobachtet wurde, wurde das gesamte Thioredoxin-M-CSF Fusionsprotein in der löslichen zellulären Fraktion vorgefunden und stellte bis zu 10% des gesamten Proteins dar.
  • Beispiel 8 – Freisetzung des Fusionsproteins durch osmotischen Schock oder Einfrieren/Auftauen
  • Um zu bestimmen, ob die erfindungsgemäßen Fusionen der heterologen Proteine mit Thioredoxin die Zielführung auf die Adhäsionsstellen der Wirtszelle ermöglichen und die Freisetzung der Fusionsproteine aus der Zelle erlauben, wurden die Zellen einfachem osmotischem Schock und Einfrier-/Auftau-Verfahren unterworfen.
  • Zellen, die Wildtyp E. coli Thioredoxin, menschliches Thioredoxin, das E. coli Thioredoxin-MIP-1α Fusionsprotein oder das E. coli Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein überproduzierten, wurden in den nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet.
  • Für die Behandlung mit osmotischem Schock wurden die Zellen bei 2 A550/ml in 20 mM Tris-Cl, pH 8,0/2,5 mM EDTA/20 Gew.-% Sukrose resuspendiert und 10 Minuten kalt auf Eis gehalten. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation pelletiert (12.000 × g, 30 Sekunden) und vorsichtig in demselben Puffer, wie vorstehend beschrieben, jedoch ohne Sukrose resuspendiert. Nach einer zusätzlichen 10-minütigen Verweildauer auf Eis, die zur osmotischen Freisetzung der Proteine diente, wurden die Zellen durch Zentrifugieren (12.000 × g, 2 Minuten) noch einmal pelletiert und der Überstand (durch den Schock freigesetzte Proteine; „shockate") auf seinen Proteingehalt hin untersucht. Wildtyp E. coli Thioredoxin und menschliches Thioredoxin wurden quantitativ freigesetzt, wobei durch den Schock freigesetzte Protein-Präparate erhalten wurden, die zu >80% aus reinem Thioredoxin bestanden. Wichtiger war, dass >80% der Thioredoxin-MIP-1α- und >50% der Thioredoxin-IL-11 Fusionsproteine durch diese osmotische Behandlung freigesetzt wurden.
  • Ein einfaches Einfrier-/Auftau-Verfahren lieferte ähnliche Ergebnisse. Thioredoxin Fusionsproteine wurden selektiv freigesetzt, während die meisten anderen zellulären Proteine in der Zelle verblieben. Ein typisches Einfrier-/Auftau-Verfahren erfordert die Resuspendierung der Zellen bei 2 A550/ml in 20 mM Tris-Cl, pH 8,0/2,5 mM EDTA und das rasche Einfrieren der Suspension in Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. Die gefrorene Suspension wird dann langsam aufgetaut, bevor die Zellen abzentrifugiert werden (12.000 × g, 2 Minuten) und der Überstand auf Protein hin untersucht wird.
  • Obwohl die so erhaltenen, durch den Schock freigesetzten Proteine („shockate") gegebenenfalls eine weitere Aufreinigung erfordern, sind die zunächst durch den Schock freigesetzten Proteine durch das Fehlen von Nukleinsäure-Kontaminanten gekennzeichnet. Verglichen mit einem Ausgangslysat ist die Reinheit der durch Schock freigesetzten Proteine („shockate") wesentlich höher und erfordert nicht das aufwendige Entfernen von DNA aus bakteriellen Lysaten.
  • Somit kann dieser Freisetzungsschritt den in Beispiel 2 beschriebenen Lyseschritt ersetzen. Der nach der Zentrifugation erhaltene Überstand wird dann weiter in der in dem Beispiel beschriebenen Weise aufgereinigt.
  • Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der verstehend dargestellten Beschreibung eingeschlossen und werden für den Fachmann als offensichtlich angesehen. Derartige Modifikationen und Variationen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren sollen vom Schutzbereich der anhängigen Ansprüche eingeschlossen sein.

Claims (20)

  1. Fusions-DNA, umfassend eine erste DNA, codierend ein Thioredoxin-ähnliches Protein, die mit einer zweiten DNA fusioniert ist, codierend ein heterologes Protein, das kein Thioredoxin-ähnliches Protein ist, wobei die Fusions-DNA in der Lage ist, ein Fusionsprotein zu codieren, wobei die Fusions-DNA weder eine Fusions-DNA ist, die ein E. coli-Anabaena-Hybrid-Thioredoxin codiert, noch eine Fusions-DNA ist, die ein Anabaena-E. coli-Hybrid-Thioredoxin codiert, wobei die Fusionsstelle in jeder der Hybrid-Thioredoxine zwischen den Aminosäuren Glycin und Prolin des Disulfidrings an der aktiven Stelle des Thioredoxins liegt.
  2. Fusions-DNA nach Anspruch 1, wobei die erste DNA den Amino-Terminus des Fusionsproteins codiert.
  3. Fusions-DNA nach Anspruch 1, wobei die erste DNA den Carboxyl-Terminus des Fusionsproteins codiert.
  4. Fusions-DNA nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die erste DNA ein Thioredoxin-ähnliches Protein codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E. coli-Thioredoxin, menschlichem Thioredoxin, Glutaredoxin und den Thioredoxin-ähnlichen Domänen von Proteindisulfidisomerase, Form-1-Phosphoinositidspezifischer Phospholipase C und ERp72.
  5. Fusions-DNA nach Anspruch 4, wobei die erste DNA E. coli-Thioredoxin (1C; Nucleotide 2242-2568) codiert.
  6. Fusions-DNA nach Anspruch 1, wobei die zweite DNA ein Protein codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-11, IL-6, Makrophagen-Hemmprotein 1α oder dem Knochen-Morphogen-Protein 2.
  7. Fusions-DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die außerdem eine dritte, ein Linkerpeptid codierende DNA umfasst, die zwischen die erste und die zweite DNA fusioniert ist.
  8. Fusions-DNA nach Anspruch 7, wobei die dritte DNA eine Spaltstelle codiert.
  9. Fusions-DNA nach Anspruch 7, wobei der Linker außerdem für die Vermeidung einer sterischen Hinderung zwischen dem Thioredoxin-ähnlichen Protein und dem heterologen Protein sorgt.
  10. Fusions-DNA nach Anspruch 7, wobei die dritte DNA-Sequenz die Aminosäuresequenz G-S-G-S-G-D-D-D-D-K (Aminosäuren 110 bis 119 in 1C) codiert.
  11. Fusions-DNA nach Anspruch 7, umfassend die Aminosäuren 1 bis 296 in 1C.
  12. Fusions-DNA nach Anspruch 1, umfassend pALtrxA/EK/IL11ΔPro-581, mit der Nucleotidsequenz wie in 1 dargestellt.
  13. Plasmid, enthaltend die Fusions-DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Fusions-DNA unter der Kontrolle einer Expressionskontrollsequenz steht und einen Promotor, eine Ribosomenbindungsstelle, einen Replikationsstartpunkt und einen fakultativen selektierbaren Marker umfasst, wobei die Kontrollsequenz in der Lage ist, die Expression des Fusionsproteins in einer ausgewählten Wirtszelle zu lenken.
  14. Wirtszelle, die mit einer DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 12 transformiert ist oder in deren Genom eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 12 integriert ist.
  15. E. coli-Wirtszelle, die mit einem Plasmid nach Anspruch 13 transformiert ist oder in deren Genom ein Plasmid nach Anspruch 13 integriert ist.
  16. Fusionsprotein, codiert durch die Fusions-DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder die Plasmid-DNA nach Anspruch 13.
  17. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins, umfassend: (a) Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 14 oder 15 in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen; (b) Freisetzen des dabei produzierten Fusionsproteins aus der Wirtszelle; (c) Spalten des ausgewählten heterologen Proteins vom Fusionsprotein; und (d) Isolieren des ausgewählten heterologen Proteins.
  18. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins, umfassend: (a) Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 14 oder 15 in einem Kulturmedium unter geeigneten Bedingungen; (b) Gewinnen des dabei produzierten Fusionsproteins aus dem Kulturmedium; (c) Spalten des ausgewählten heterologen Proteins vom Fusionsprotein; und (d) Isolieren des ausgewählten heterologen Proteins.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Gewinnungsschritt die Behandlung der transformierten und gezüchteten Wirtszelle mit einem osmotischen Schock umfasst, um das Fusionsprotein aus der Wirtszelle freizusetzen.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Gewinnungsschritt die Behandlung der transformierten und gezüchteten Wirtszelle durch Einfrieren und Auftauen umfasst, um das Fusionsprotein aus der Wirtszelle freizusetzen.
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