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Die Erfindung betrifft allgemein
die Herstellung von Fusionsproteinen in prokaryotischen und eukaryotischen
Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Expression von rekombinanten
Fusionssequenzen umfassend Thioredoxin oder Thioredoxin-ähnliche
Sequenzen fusioniert mit Sequenzen für ausgewählte heterologe Peptide oder
Proteine in Wirtszellen und die Verwendung derartiger Fusionsmoleküle zur Erhöhung der Produktion,
Aktivität,
Stabilität
oder Löslichkeit
von rekombinanten Proteinen und Peptiden.
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Hintergrund der Erfindung
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Viele Peptide und Proteine können rekombinant
in verschiedenen Expressionssystemen, z. B. verschiedenen Stämmen von
Bakterien-, Pilz-, Säuger-
oder Insektenzellen hergestellt werden. Sofern jedoch Bakterien
als Wirtszellen für
die heterologe Genexpression verwendet werden, treten häufig verschiedene
Probleme auf.
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Beispielsweise werden heterologe
Gene, die kleine Peptide exprimieren, in Bakterien oft schlecht
exprimiert. Auf Grund ihrer Größe können die
meisten kleinen Peptide keine stabilen löslichen Konformationen annehmen
und sind Gegenstand intrazellulärer
Degradation durch in der Wirtszelle vorhandene Proteasen und Peptidasen.
Diejenigen kleinen Peptide, welche bei direkter Expression in E.
coli oder anderen bakteriellen Wirten akkumulieren können, werden üblicherweise
in der unlöslichen
oder „Einschlusskörper-" Fraktion gefunden,
eine Gegebenheit, die sie nahezu wertlos für Screeningzwecke in biologischen
oder biochemischen Tests macht.
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Darüber hinaus stellen sich weitere
Probleme bei der Herstellung kleiner Peptide als Kandidaten für neue Arzneimittel
oder Enzyminhibitoren durch rekombinante Mittel, selbst wenn die
kleinen Peptide nicht in Einschlusskörpern produziert werden. Selbst
kleine lineare Peptide können
auf Grund ihrer Konformationsfreiheitsgrade eine enorm hohe Anzahl
möglicher
Strukturen annehmen. So kann ein kleines Peptid die „gewünschte" Aminosäuresequenz
aufweisen und trotzdem eine sehr niedrige Aktivität im Test
zeigen, da die „aktive" Peptidkonformation
lediglich eine von vielen in freier Lösung angenommenen alternativen
Strukturen ist. Dies stellt eine andere, in der rekombinanten Herstellung
kleiner heterologer Peptide für
die effektive Forschung und therapeutische Verwendung beobachtete
Schwierigkeit dar.
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Die Bildung von Einschlusskörpern wird
ebenfalls häufig
beobachtet, wenn die Gene für
heterologe Proteine in Bakterienzellen exprimiert werden. Diese
Einschlusskörper
erfordern üblicherweise
weitere Manipulationen, um die heterologen Proteine zu solubilisieren
und eine Rückfaltung
durchzuführen,
wobei die Bedingungen für
jeden Fall empirisch und mit Unsicherheiten behaftet ermittelt werden
müssen.
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Sofern diese zusätzlichen Verfahrensmaßnahmen
nicht erfolgreich sind, kann wenig bis kein biologisch aktives Protein
aus den Wirtszellen gewonnen werden. Darüber hinaus sind diese zusätzlichen
Verfahren oft technische schwierig und zu teuer für die praktische
Herstellung von rekombinanten Proteinen für therapeutische, diagnostische
oder andere Forschungszwecke.
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Um diese Probleme auszuräumen, sind
im Stand der Technik verschieden Peptide oder Proteine als Fusions- „Partner" mit einem gewünschten
heterologen Peptid oder Protein eingesetzt worden, um die rekombinante
Expression und/oder Sezernierung kleiner Peptide oder größerer Proteine
als Fusionsproteine in bakteriellen Expressionssystemen zu ermöglichen.
Solche Fusionspartner schließen
lacZ- und trpE- Fusionsproteine, Maltose-Bindungsprotein Fusionen und Glutathion-S-Transferase
Fusionsproteine ein (vgl. allgemein, „Current Protocols in Molecular
Biology", Band 2,
Sppl. 10, Hrsg. John Wiley and Sons, New York, NY, Seiten 16.4.1–16.8.1
(1990), und Smith et al., Gene 67 (1988), 31–40). US-A 4,801,536 beschreibt
die Fusion eines bakteriellen Flagellin-Proteins mit einem gewünschten
Protein, wodurch die Herstellung eines heterologen Gens als Fusionsprotein
in einer Bakterienzelle und seine Sezernierung daraus in das Kulturmedium
ermöglicht
wird. Die PCT Veröffentlichung
WO91/11454 beschreibt Fusionsproteine unter Verwendung von biotinyliertem
Renin als Fusionspartner. Das Renin wird an eine Aufreinigungssäule immobilisiert,
um die Abtrennung und Spaltung zu vereinfachen.
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Häufig
jedoch weisen Fusionen gewünschter
Peptide oder Proteine mit anderen Proteinen (d. h. als Fusionspartner)
am Amino- oder Carboxyterminus dieser Fusionspartner-Proteine andere
mögliche
Nachteile auf. Die Erfahrung mit E. coli hat gezeigt, dass ein wesentlicher Faktor
für den
Erhalt hoher Gen-Expressionswerte die Effizienz der Translationsinitiation
ist. Die Initiation der Translation in E. coli hängt in starkem Maße von der
Nukleotidsequenz ab, die das Methionin-Startkodon der gewünschten
heterologen Peptid- oder Proteinsequenz umgeben, obgleich die diesem
Phänomen
zu Grunde liegenden Regeln nicht klar sind. Aus diesem Grunde beeinflussen
Fusionen von Sequenzen am Aminoterminus vieler Fusionspartner-Proteine
die Expressionswerte auf nicht vorhersagbare Weise. Darüber hinaus
gibt es viele Amino- oder Carboxypeptidasen in E. coli, die amino-
oder carboxyterminale Peptidverlängerungen
an Fusionspartner-Proteinen abbauen, so dass eine Anzahl von bekannten
Fusionspartnern eine niedrige Erfolgsrate in der Herstellung von
stabilen Fusionsproteinen aufweist.
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Die Reinigung von Proteinen, die
vermittels rekombinanter Expressionssysteme hergestellt wurden, ist
oft eine ernste Herausforderung. Es existiert ein fortwährendes
Bedürfnis
nach neuen und einfacheren Verfahren zur Herstellung homogener Präparationen
an rekombinanten Proteinen. Dennoch weist eine Anzahl von gegenwärtig im
Stand der Technik verwendeten Fusionspartnern keine inhärenten Eigenschaften
auf, die das Reinigungsverfahren vereinfachen würden. Daher besteht im Bereich,
rekombinanter Expressionssyteme weiterhin ein Bedarf an neuen Zusammensetzungen
und Verfahren zur Herstellung und Reinigung von stabilen, löslichen
Peptiden und Proteinen zur Verwendung in der Forschung sowie in
diagnostischen und therapeutischen Anwendungen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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In einem Aspekt betrifft die Erfindung
eine Fusionssequenz umfassend eine Thioredoxin-ähnliche
Proteinsequenz, die mit einem ausgewählten heterologen Peptid oder
Protein fusioniert ist. Das Peptid oder Protein kann an den Aminoterminus
der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz, den Carboxyterminus der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz oder innerhalb
der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz (zum Beispiel innerhalb der das aktive Zentrum umfassenden
Schleife von Thioredoxin) angeheftet sein. Die erfindungsgemäße Fusionssequenz kann
gegebenenfalls ein Linkerpeptid zwischen der Thioredoxin-ähnlichen Sequenz und dem ausgewählten Peptid
oder Protein enthalten. Dieser Linker stellt, sofern erforderlich,
eine ausgewählte
Spaltstelle oder einen Bereich von Aminosäuren bereit, der sterische
Behinderungen zwischen dem Thioredoxin-ähnlichen Molekül und dem
ausgewählten
Peptid oder Protein vermeiden kann.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
Erfindung ein DNA-Molekül
bereit, das die vorstehend definierte Fusionssequenz zusammen mit
und unter der Kontrolle von einer Expressionskontrollsequenz kodiert,
die die Expression des Fusionsproteins in einer gewünschten
Wirtszelle steuern kann.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist eine Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz, umfassend eine Thioredoxin-ähnliche
DNA-Sequenz fusioniert mit einer DNA-Sequenz eines ausgewählten heterologen Peptids
oder Proteins transformiert ist oder diese in ihr Genom integriert
hat. Diese Fusionssequenz befindet sich vorzugsweise unter der Kontrolle
einer Expressionskontrollsequenz, welche die Expression eines Fusionsproteins
in der Zelle steuern kann.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
Erfindung ein neues Verfahren zur Erhöhung der Expression löslicher
rekombinanter Proteine bereit. Das Verfahren schließt die Züchtung der
vorstehend beschriebenen Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen
ein, wodurch das Fusionsprotein hergestellt wird.
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In einer Ausführungsform dieses Verfahrens
und falls das erhaltene Fusionsprotein ein zytoplasmatisches Protein
ist, kann die Zelle durch übliche
Mittel lysiert werden, um das lösliche
Fusionsprotein zu erhalten. Im Falle zytoplasmatischer Fusionsproteine
ist stärker
bevorzugt, dass das Verfahren die Freisetzung des Fusionsproteins
aus der Wirtszelle durch Anwendung osmotischen Schocks oder Einfrieren/Auftauen
der Zelle umfasst. In diesem Falle wird das Fusionsprotein selektiv
aus dem Zellinneren über
die Adhäsionszonen
freigesetzt, die zwischen den inneren und äußeren Membranen von E. coli
existieren. Das Fusionsprotein wird nachfolgend mittels üblicher
Mittel aufgereinigt.
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In einer anderen Ausführungsform
des Verfahrens und falls ein sekretorisches Signalpeptid im Fusionsprotein-Konstrukt
eingesetzt wird, kann das Fusionsprotein aus einem periplasmatischen
Extrakt oder aus dem Zellkultur-Medium gewonnen werden.
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Ein zusätzlicher Schritt in diesen
beiden Verfahren ist die Abspaltung des gewünschten Proteins von dem Thioredoxin-ähnlichen
Protein durch übliche
Mittel.
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Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden nach Betrachtung der nachfolgenden detaillierten
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen davon offensichtlich.
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Zusammenfassung der Figuren
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1 beschreibt
die DNA-Sequenz des Expressionsplasmids pALTRXA/EK/IL11Δ Pro-581 und die Aminosäure-Sequenz
für das
darin enthaltene Fusionsprotein, beschrieben in Beispiel 1.
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2 beschreibt
die DNA-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz
des Makrophagen-Hemmprotein-1α (MIP-1α) Proteins,
das in der Konstruktion eines in Beispiel 3 beschriebenen Thioredoxin
Fusionsproteins verwendet wurde.
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3 erläutert die
DNA-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz
des Knochen-Morphogen-Protein-2 (BMP-2)
Proteins, das in der Konstruktion eines in Beispiel 4 beschriebenen
Thioredoxin Fusionsproteins verwendet wurde.
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4 ist
eine schematische Darstellung, welche die Einfügung einer Spaltstelle für eine Enterokinase in
die das aktive Zentrum enthaltende Schleife von E. coli Thioredoxin
(trxA) erläutert,
beschrieben in Beispiel 5.
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5 ist
eine schematische Darstellung, welche die Einfügung von Zufallspeptiden in
die das aktive Zentrum enthaltende Schleife von E. coli Thioredoxin
(trxA) erläutert,
beschrieben in Beispiel 5.
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6 beschreibt
die DNA-Sequenz und die Aminosäure-Sequenz
des menschlichen Interleukin-6 (IL-6) Proteins, das in der Konstruktion
eines in Beispiel 6 beschriebenen Thioredoxin Fusionsproteins verwendet
wurde.
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7 beschreibt
die DNA-Sequenz des M-CSF Proteins, das in der Konstruktion eines
in Beispiel 7 beschriebenen Thioredoxin Fusionsproteins verwendet
wurde.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung erlaubt die Herstellung
großer
Mengen an heterologen Peptiden oder Proteinen in einer stabilen,
löslichen
Form in bestimmten Wirtszellen, die normalerweise beschränkte Mengen
derartiger Peptide oder Proteine exprimeren. Sie ermöglicht die
Freisetzung des Fusionsproteins aus den zur Herstellung verwendeten
Zellen ohne dass die Zellen lysiert werden müssen, wodurch der Aufreinigungsprozeß gestrafft
wird. Durch die Verwendung einer kleinen Peptidinsertion in einem
internem Bereich der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz (z. B. der das aktive Zentrum von Thioredoxin umfassenden
Schleife) stellt die Erfindung eine verwendbare Spaltstelle bereit,
die auf der Oberfläche
des Moleküls
zugänglich
ist. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine
ermöglichen
auch, dass die gewünschten
Peptide oder Proteine die gewünschte
Konformation einnehmen.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
ist die ein heterologes, zur Expression in einem rekombinanten System
ausgewähltes
Peptid oder Protein kodierende DNA-Sequenz mit einer Thioredoxin-ähnlichen DNA-Sequenz
für die
Expression in der Wirtszelle fusioniert. Eine Thioredoxin-ähnliche
DNA-Sequenz ist hier definiert als eine DNA-Sequenz, die ein Protein
oder ein Fragment eines Proteins kodiert, das durch eine Aminosäure-Sequenz
mit einer Homologie von mindestens 18% mit der Aminosäure-Sequenz
von E. coli Thioredoxin über
eine Länge
der Aminosäure-Sequenz
von mindestens 80 Aminosäuren
gekennzeichnet ist. In einer anderen Ausführungsform ist eine Thioredoxin
DNA-Sequenz definiert als eine DNA-Sequenz, die ein Protein oder
Proteinfragment kodiert, das durch eine Kristallstruktur gekennzeichnet
ist, die im wesentlichen gleich mit der von menschlichem oder E.
coli Thioredoxin ist. Die DNA-Sequenz von Glutaredoxin ist eine
derartige Sequenz. Die Aminosäure-Sequenz
von E. coli Thioredoxin ist beschrieben in H. Eklund et al., EMBO
J. 3 (1984), 1443–1449.
Die dreidimensionale Struktur von E. coli Thioredoxin ist in 2 von A. Holmgren, J. Biol.
Chem. 264 (1989), 13963–13966
dargestellt. 1 unterhalb der Nukleotide
2242–2568
enthält
eine DNA-Sequenz, die das E. coli Thioredoxin-Protein kodiert (Lim
et al., J. Bacteriol. 163 (1985), 311–316) Die drei letztgenannten Publikationen
sind hier zur Bereitstellung von Information über Thioredoxin eingeführt, die
dem Fachmann bekannt ist.
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Als das wichtigste Beispiel eines
Thioredoxin-ähnlichen
Proteins, das in dieser Erfindung eingesetzt werden kann, weist
das E. coli Thioredoxin die folgenden Eigenschaften auf. E. coli
Thioredoxin ist ein kleines Protein mit lediglich 11,7 kD und kann
auf hoher Ebene exprimiert werden (>10%, entsprechend einer Konzentration
von 15 μM,
wenn Zellen bei 10 A550/ml lysiert werden).
Die kleine Größe und die
Fähigkeit
zur hohen Expression des Proteins tragen zu einer hohen intrazellulären Konzentration
bei. E. coli Thioredoxin ist ferner durch eine sehr stabile, feste
Struktur gekennzeichnet, welche die durch die Fusion mit dem gewünschten
Peptid oder Protein verursachten Effekte auf die Stabilität der Gesamtstruktur
minimieren kann.
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Die dreidimensional Struktur von
E. coli Thioredoxin ist bekannt. Es enthält mehrere Schleifen an der Oberfläche, einschließlich einer
einzigartigen Schleife mit dem aktiven Zentrum zwischen den Resten
Cys33 und Cys36,
die aus dem Körper
des Proteins herausragt. Die Schleife mit dem aktiven Zentrum ist
eine identifizierbare, zugängliche
Schleifenregion an der Oberfläche
und ist nicht in irgendwelche Interaktionen mit dem übrigen Protein
involviert, die zur Stabilität
der Gesamtstruktur beitragen. Sie ist daher ein guter Kandidat als eine
Stelle für
Peptidinsertionen. Sowohl die Amino- wie auch die Carboxytermini
von E. coli Thioredoxin befinden sich auf der Oberfläche des
Proteins und sind für
Fusionen gut zugänglich.
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E. coli Thioredoxin ist ferner stabil
gegenüber
Proteasen. E. coli Thioredoxin kann somit wünschenswert zur Verwendung
in E. coli Expressionssystemen sein, da es als ein E. coli Protein
durch Stabilität
gegenüber
E. coli Proteasen gekennzeichnet ist. E. coli Thioredoxin ist außerdem stabil
gegenüber
Hitze bis zu 80°C und
gegenüber
niedrigen pH-Werten.
Andere durch Thioredoxin-ähnliche
DNA-Sequenzen kodierte Thioredoxin-ähnliche
Proteine, die nützlich
im Zusammenhang mit dieser Erfindung sind, können die homologen Aminosäure-Sequenzen
sowie ähnliche
physikalische und strukturelle Eigenschaften teilen. Daher können erfindungsgemäß anstelle
von E. coli Thioredoxin DNA-Sequenzen eingesetzt werden, die andere
Thioredoxin-ähnliche
Proteine kodieren. Beispielsweise können die Thioredoxin aus anderen
Arten, z. B. menschliches Thioredoxin, kodierenden DNA-Sequenzen
in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren eingesetzt werden. Sowohl die Primärsequenz als auch die durch
Computer vorhergesagte Sekundärstruktur ist
bei menschlichem und E. coli Thioredoxin sehr ähnlich. Menschliches Thioredoxin
trägt ferner
dieselbe Schleife mit dem aktiven Zentrum, wie sie im E. coli Protein
gefunden wird. Insertionen in die Schleife mit dem aktiven Zentrum
von menschlichem Thioredoxin wie auch an die Amino- und Carboxytermini
werden daher gegebenenfalls genauso toleriert wie jene in E. coli
Thioredoxin.
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Andere Thioredoxin-ähnliche
Sequenzen, die in dieser Erfindung eingesetzt werden können, schließen die
vollständigen
Proteine oder Teile der Proteine Glutaredoxin und Homologe davon
aus verschiedenen Arten ein (A. Holmgren, vorstehend zitiert). Obwohl
E. coli Glutaredoxin und E. coli Thioredoxin eine Aminosäure-Homologie
von weniger als 20% aufweisen, zeigen die beiden Proteine Ähnlichkeiten
in Konformation und Funktion (Eklund et al., EMBO J. 3 (1984), 1443–1449).
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Die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz,
welche das Protein Disulfid-Isomerase (PDI) kodiert und Homologe
davon aus verschiedenen Arten (J. E. Edman et al., Nature 317 (1985),
267–270)
kann ebenfalls als eine Thioredoxin-ähnliche DNA-Sequenz eingesetzt
werden, da eine wiederholt auftretende Domäne von PDI eine Homologie von >18% mit E. coli Thioredoxin
aufweist. Die beiden letztgenannten Publikationen sind hier inkorporiert,
um Informationen über
Glutaredoxin und PDI bereit zu stellen, die dem Fachmann bekannt und
verfügbar
sind.
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Auf der Basis der Aminosäure-Sequenz-Homologie
mit E. coli Thioredoxin kann in gleicher Weise die Phosphoinositid-spezifische
Phospholipase C (PI-PLC), Fragmente davon und Homologe davon aus
verschiedenen Arten (C. F. Bennett et al., Nature 334 (1988), 268–270) kodierende
DNA-Sequenz erfindungsgemäß als Thioredoxin-ähnliche
Sequenz eingesetzt werden. Die gesamte oder ein Teil der DNA-Sequenz,
welche ein Protein des endoplasmatischen Retikulums kodiert, beispielsweise
Erp72 oder Homologe davon aus verschiedenen Arten sind ebenso für die Zwecke
dieser Erfindung als Thioredoxin-ähnliche Sequenzen eingeschlossen
(R. A. Mazzarella et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 1094-1101).
Eine weitere Thioredoxin-ähnliche
Sequenz ist eine DNA-Sequenz,
die den gesamten oder einen Teil eines adulten T-Zell-Leukämie abgeleiteten Faktors)
(ADF) oder Homologe davon aus anderen Arten kodiert (N. Wakasugi
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 8282–8286) und
zwar auf der Basis der Homologie der Aminosäure-Sequenz mit E. coli Thioredoxin.
Die drei letztgenannten Publikationen sind hier inkorporiert, um
Informationen über
PI-PLC, Erp72 und ADF bereit zu stellen, die dem Fachmann bekannt
und verfügbar
sind.
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Aus der vorstehend verwendeten Definition
für eine
Thioredoxin-ähnliche
DNA-Sequenz wird erwartet, dass andere, vorstehend nicht gesondert
identifizierte Sequenzen oder bislang noch nicht identifizierte
oder publizierte Sequenzen auf der Grundlage ihrer Aminosäure-Sequenz-Ähnlichkeiten
mit E. coli Thioredoxin und charakteristischen Ähnlichkeiten in der kristallinen
Struktur mit E. coli Thioredoxin und den anderen Thioredoxin-ähnlichen
Proteinen als Thioredoxin-ähnliche
Sequenzen eingesetzt werden können.
Auf der Basis der vorstehenden Definition sollte ein Fachmann ohne
unzumutbaren experimentellen Aufwand in der Lage sein, eine Thioredoxin-ähnliche
DNA-Sequenz zur erfindungsgemäßen Verwendung
auszuwählen
und zu identifizieren oder, falls erwünscht, zu modifizieren. Beispielsweise
stellen in Bereichen von nativem Thioredoxin oder von nativen Thioredoxin-ähnlichen
Sequenzen eingeführte
einfache Punktmutationen, die die Struktur des so erhaltenen Moleküls nicht
beeinflussen, alternative Thioredoxin-ähnliche Sequenzen dar. Das
gleiche gilt für allele
Varianten von nativem Thioredoxin oder von nativen Thioredoxin-ähnlichen
Sequenzen.
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DNA-Sequenzen, die entweder unter
stringenten oder milden Hybridisierungsbedingungen an die Sequenz
für E.
coli Thioredoxin oder ihre strukturellen Homologen hybridisieren,
kodieren ebenfalls Thioredoxin-ähnliche
Proteine für
die erfindungsgemäße Verwendung.
Stringente Hybridisierung ist hier definiert als Hybridisierung
in 4XSSC bei 65°C,
gefolgt von Waschen in 0,1XSSC bei 65°C für eine Stunde. In einer anderen
Ausführungsform
ist stringente Hybridisierung definiert als Hybridisierung in 50%
Formamid, 4XSSC bei 42° C.
Nicht-stringente Hybridisierung ist hier definiert als Hybridisierung
in 4XSSC bei 50°C
oder Hybridisierung in 30–40%
Formamid bei 42°C.
Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung von all diesen Thioredoxin-ähnlichen
Sequenzen von dieser Erfindung umfasst ist.
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Die Konstruktion einer erfindungsgemäßen Fusionssequenz,
die die DNA-Sequenz eines ausgewählten
Peptids oder Proteins und die DNA-Sequenz einer Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz umfasst, setzt übliche Genmanipulationstechniken
ein (vgl. Sambrook et al., „Molecular
Cloning, A Laboratory Manual",
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)).
Fusionssequenzen können
auf verschiedene Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die
ausgewählten
heterologen Proteine mit dem Aminoterminus des Thioredoxin-ähnlichen
Moleküls
fusioniert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die ausgewählte Protein-Sequenz
mit dem Carboxyterminus des Thioredoxin-ähnlichen Moleküls fusioniert
werden. Kurze Peptidsequenzen können
ebenfalls an die vorstehend genannten Positionen der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz angeheftet werden, wodurch sie in einer strukturell nicht
erzwungenen Weise hergestellt werden.
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Diese Fusion eines gewünschten
heterologen Peptids oder Proteins mit dem Thioredoxin-ähnlichen Protein erhöht die Stabilität des Peptids
oder Proteins. Entweder am Amino- oder am Carboxyterminus wird das
gewünschte
heterologe Peptid oder Protein derart fusioniert, dass die Fusion
die native Struktur beider Protein nicht destabilisiert. Darüber hinaus
verbessert die Fusion mit dem löslichen
Thioredoxin-ähnlichen
Protein die Löslichkeit
des ausgewählten
heterologen Peptids oder Proteins.
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Es kann aus einer Reihe von Gründen heraus
bevorzugt sein, dass Peptide mit der das aktive Zentrum tragenden
Schleife des Thioredoxin-ähnlichen
Moleküls
fusioniert werden. Die die das aktive Zentrum tragende Schleife
umgebende Oberfläche
hat sich im Einklang mit der Hauptfunktion des Proteins als einer
nicht spezifischen Protein-Disulfid-Oxidoreduktase entwickelt, wodurch eine
Interaktion mit einer großen
Vielfalt von Proteinoberflächen
möglich
ist. Der Bereich der das aktive Zentrum tragenden Schleife befindet
sich zwischen Segmenten stark ausgeprägter Sekundärstrukturen und bietet viele
Vorteile für
Peptidfusionen. Ein kleines Peptid, das in die das aktive Zentrum
tragende Schleife eines Theoredoxin-ähnlichen Proteins eingefügt wurde,
ist in einem Bereich des Proteins vorhanden, der nicht in die Aufrechterhaltung
der tertiären
Struktur eingebunden ist. Daher sollte die Struktur eines derartigen
Fusionsproteins stabil sein. Frühere
Arbeiten haben gezeigt, dass E. coli Thioredoxin an einer Position
nahe der das aktive Zentrum tragenden Schleife in zwei Fragmente
gespalten werden kann und die das Protein stabilisierenden tertiären Interaktionen
dennoch verbleiben.
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Die das aktive Zentrum tragende Schleife
von E. coli Thioredoxin weist die Sequenz NH2...Cys33-Gly-Pro-Cys36...COOH
auf. Die Fusion eines ausgewählten
Peptids mit einem Thioredoxin-ähnlichen
Protein im Bereich der aktiven Schleife des Proteins bindet das
Peptid an beiden Enden, reduziert die Konformationsfreiheitsgrade
des Peptids und vermindert folgerichtig die Anzahl von vom Peptid
eingenommenen alternativen Strukturen. Das eingefügte Peptid
ist an beiden Enden an Cysteinreste gebunden, die miteinander eine
Disulfidbrücke
bilden können,
wie sie es in nativem Thioredoxin tun, wodurch die Konformationsfreiheit
des eingefügten
Peptids weiter eingeschränkt
wird.
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Darüber hinaus lokalisiert diese
Erfindung das Peptid an die Oberfläche des Thioredoxin-ähnlichen Proteins. Somit stellt
die Erfindung einen besonderen Vorteil für die Verwendung der Peptide
beim Screenen auf biologisch aktive Peptid-Konformationen und andere
Tests durch Präsentation
von in die das aktive Zentrum tragende Schleife eingefügten Peptiden
in diesem strukturellen Kontext bereit.
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Darüber hinaus schützt die
Fusion des Peptids mit der Schleife dieses vor den Aktivitäten von
E. coli Amino- und Carboxypeptidasen. Weiterhin gibt es bereits
eine Spaltstelle für
die Restriktionsendonuklease RsrII in dem Bereich der E. coli Thioredoxin
DNA-Sequenz, die den Schleifenbereich kodiert und zwar genau an der
richtigen Stelle für
eine Peptidfusion (vgl. 4).
RsrII erkennt die DNA-Sequenz CGG(A/T)CCG und hinterlässt ein
3 Nukleotide langes 5'-überstehendes
Ende. DNAs, die die komplementären überstehenden
Enden tragen, werden sich daher an dieser Stelle in lediglich einer
Orientierung einfügen.
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Eine Fusionssequenz einer Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz und einer gewünschten
Protein- oder Peptidsequenz gemäß dieser
Erfindung kann gegebenenfalls ein Linkerpeptid, eingefügt zwischen
der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz und dem ausgewählten
heterologen Peptid oder Protein enthalten. Diese Linkersequenz kann,
falls gewünscht,
ein Polypeptid kodieren, das durch übliche chemische oder enzymatische
Verfahren selektiv spaltbar oder verdaubar ist. Beispielsweise kann
die ausgewählte
Spaltstelle eine enzymatische Spaltstelle sein. Beispiele für enzymatische
Spaltstellen schließen
Stellen für
die Spaltung mit einem proteolytischen Enzym wie Enterokinase, Faktor
Xa, Trypsin, Collagenase und Thrombin ein. In einer anderen Ausführungsform
kann die Spaltstelle in dem Linker eine Stelle sein, die nach Kontakt
mit einer ausgewählten Chemikalie,
z. B. Bromcyan, Hydroxylamin oder niedrigem pH-Wert gespalten werden
kann.
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Die Spaltung an der ausgewählten Spaltstelle
ermöglicht.
die Abtrennung des heterologen Proteins oder Peptids aus dem Thioredoxin
Fusionsprotein, wodurch das reife heterologe Peptid oder Protein
erhalten wird. Das reife Peptid oder Protein kann dann in aufgereinigter
Form erhalten werden, frei von jeglichem Polypeptidfragment des
Thioredoxin-ähnlichen
Proteins, mit dem es zuvor verknüpft
war. Die Spaltstelle, sofern in einen für die erfindungsgemäßen Fusionssequenzen
nützlichen
Linker eingefügt,
schränken
diese Erfindung nicht ein. Jede gewünschte Spaltstelle, von denen
viele im Stand der Technik bekannt sind, kann für diesen Zweck eingesetzt werden.
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Die gegebenenfalls vorhandene Linkersequenz
der erfindungsgemäßen Fusionssequenz
kann einen anderen Zweck als die Bereitstellung einer Spaltstelle
erfüllen.
Der Linker kann ebenso eine einfache Aminosäure-Sequenz mit ausreichender
Länge sein,
die eine sterische Behinderung zwischen dem Thioredoxin-ähnlichen
Molekül
und dem ausgewählten
heterologen Peptid oder Protein vermeidet.
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Ob eine solche Linkersequenz notwendig
ist oder nicht, wird von den strukturellen Eigenschaften des ausgewählten heterologen
Peptids oder Proteins abhängen
und davon, ob das erhaltene Fusionsprotein ohne Spaltung nützlich ist.
Sofern beispielsweise die Thioredoxin-ähnliche Sequenz eine menschliche
Sequenz ist, kann das Fusionsprotein selbst als Therapeutikum verwendbar
sein und zwar ohne die Abspaltung des ausgewählten Proteins oder Peptids
davon. In einer anderen Ausführungsform
und in Fällen,
in denen die reife Protein-Sequenz auf natürliche Weise gespalten werden
kann, wird gegebenenfalls kein Linker benötigt.
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Daher enthält die erfindungsgemäße Fusionssequenz
in einer Ausführungsform
eine Thioredoxin-ähnliche
Sequenz, die an ihrem Amino- oder Carboxyterminus direkt mit der
Sequenz des ausgewählten Peptids
oder Proteins verknüpft
ist. Das so erhaltene Fusionsprotein ist somit ein lösliches
zytoplasmatisches Fusionsprotein. In einer anderen Ausführungsform
umfasst die Fusionssequenz darüber
hinaus eine Linkersequenz, die zwischen die Thioredoxin-ähnliche
Sequenz und die Sequenz des ausgewählten Peptids oder Proteins
gesetzt wurde. Dieses Fusionsprotein wird ebenfalls als ein lösliches zytoplasmatisches
Protein hergestellt. In Fällen,
in denen die ausgewählte
Peptidsequenz in den Bereich der das aktive Zentrum tragenden Schleife
oder an anderer Stelle innerhalb der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz eingefügt
ist, wird in gleicher Weise ein zytoplasmatisches Fusionsprotein
hergestellt.
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Das zytoplasmatische Fusionsprotein
kann auf übliche
Weise aufgereinigt werden. Als ein neuer Gesichtspunkt der vorliegenden
Erfindung können
vorzugsweise verschiedene erfindungsgemäße Thioredoxin Fusionsproteine
unter Ausnutzung einer ungewöhnlichen
Eigenschaft von Thioredoxin aufgereinigt werden. Das Zytoplasma
von E. coli ist durch eine zwei Membranen, eine innere und eine äußere, umfassende
zelluläre Umhüllung wirksam
von dem äußeren Medium
abgetrennt. Die Membranen sind durch den periplasmatischen Raum
voneinander getrennt, in dem sich eine steife Peptidoglykan-Zellwand befindet.
Die Peptidoglykan-Zellwand trägt
sowohl zur Form als auch zur Festigkeit der Zelle bei. An bestimmten
Stellen in der Zellumhüllung gibt
es „Lücken" (in verschiedener
Weise Bayer-Flecken („Bayer
patches"), Bayer-Verbindung
(„Bayer
junctions") oder
Adhäsionsstellen
genannt) in der Peptidoglykan-Zellwand, wo die inneren und äußeren Membranen
sich offenbar treffen und möglicherweise
miteinander fusionieren. Vgl. M. E. Bayer, J. Bacteriol. 93 (1967), 1104–1112 und
J. Gen. Microbiol. 53 (1968), 395–404. Der größte Teil
des zellulären
Thioredoxins befindet sich lose assoziiert mit der inneren Oberfläche der
Membran an diesen Adhäsionsstellen
und kann in quantitativer Weise durch einen plötzlichen osmotischen Schock
oder durch ein einfaches Einfrier-/Auftau-Verfahren durch diese
Adhäsionsstellen
hindurch aus der Zelle ausgeschleust werden. Vgl. C. A. Lunn und
V. P. Pigiet, J. Biol. Chem. 257 (1982), 11424– 11430 und in „Thioredoxin
and Glutaredoxin Systems: Structure and Function" (1986), 165–176, Hrsg. A. Holmgren et
al., Raven Press, New York. In geringerem Ausmaß kann etwas EF-Tu (Elongationsfaktor-Tu)
auf die gleiche Weise ausgeschleust werden (Jacobsen et al., Biochemistry
15 (1976), 2297–2302).
Mit Ausnahme des periplasmatischen Inhalts kann die große Mehrheit
der E. coli Proteine durch diese Behandlungen jedoch nicht aus der
Zelle freigesetzt werden.
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Obgleich es Berichte gibt, nach denen
eine begrenzte Anzahl von im Zytoplasma von E. coli produzierten
heterologen Proteinen durch osmotischen Schock freigesetzt wurde
(Denefle et al., Gene 85 (1989), 499–510; Joseph-Liauzun et al.,
Gene 86 (1990), 291–295;
Rosenwasser et al., J. Biol. Chem. 265 (1990), 13066–13073),
ist die Fähigkeit,
freigesetzt zu werden, eine seltene und erwünschte Eigenschaft, die von
der Mehrheit der heterologen Proteine nicht geteilt wird. Die Fusion
eines heterologen Proteins mit Thioredoxin, wie in der vorliegenden
Erfindung beschrieben, erhöht
nicht nur seine Expression, Löslichkeit
und Stabilität, wie
vorstehend dargestellt, sondern kann auch für seine Freisetzung aus der
Zelle durch osmotischen Schock oder Einfrier-/Auftau-Behandlungen
sorgen, wodurch seine Aufreinigung stark vereinfacht wird. Der Theoredoxin
Bestandteil des Fusionsproteins lenkt das Fusionsprotein in einigen
Fällen,
z. B. bei MIP, zu den Adhäsionsstellen,
von denen aus es durch diese Behandlungen nach außen freigesetzt
werden kann.
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In einer weiteren Ausführungsform
kann die vorliegende Erfindung einen anderen Bestandteil einsetzen,
nämlich
eine sekretorische Signalsequenz, von denen viele im Stand der Technik
bekannt sind, z. B. die Signalsequenzen von phoA, MBP, β-Lactamase
und die im selben Leseraster funktionell mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein
verknüpft
ist, wodurch die Expression und Sezernierung des reifen Fusionsproteins in
den bakteriellen periplasmatischen Raum oder das Kulturmedium ermöglicht wird.
Die Signalsequenz kann an den Aminoterminus des Thioredoxin-ähnlichen
Moleküls
geheftet sein, wenn die ausgewählte
Peptid- oder Proteinsequenz an den Carboxyterminus angeheftet oder
mit einer internen Stelle innerhalb der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz verknüpft
ist. Ein fakultativer Linker kann ebenfalls vorhanden sein, wenn
das Peptid oder Protein mit dem Carboxyterminus fusioniert ist.
Es wird erwartet, dass dieses Fusionssequenz-Konstrukt als sezerniertes
Fusionsprotein und nicht als zytoplasmatisches Fusionsprotein exprimiert
wird, wenn es in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird. Es
sollten jedoch Stabilität,
Löslichkeit
und hohe Expression die mit jeder dieser alternativen Ausführungsformen
hergestellten Fusionsproteine kennzeichnen.
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Diese Erfindung ist nicht eine bestimmte
Art von heterologem Peptid oder Protein beschränkt. Eine große Vielfalt
von heterologen Genen oder Genfragmenten können für die Bildung der erfindungsgemäßen Fusionssequenzen
eingesetzt werden. Während
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren besonders nützlich
für Peptide
oder Proteine sind, die nicht exprimiert, in Einschlusskörpern exprimiert
oder in Bakterien- und Hefewirten in sehr kleinen Mengen exprimiert
werden, können
die heterologen Peptide oder Proteine jedes Peptid oder Protein
einschließen,
das für
die menschliche oder veterinäre
Therapie, Diagnose oder Anwendungen in der Forschung nützlich ist
und zwar in jedem Expressionssystem. Zum Beispiel können Hormone,
Zytokine, Wachstums- oder Hemmfaktoren, Enzyme, modifizierte oder
vollständig
synthetische Proteine oder Peptide erfindungsgemäß in bakteriellen, Hefe-, Säuger- oder
anderen eukaryotischen Zellen und Expressionssytemen produziert
werden, die dafür
geeignet sind.
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In den nachstehenden und diese Erfindung
erläuternden
Beispielen schließen
die durch diese Erfindung exprimierten Proteine IL-11, MIP-1α, IL-6, M-CSF,
einen Knochen induzierenden Faktor mit der Bezeichnung BMP-2 und
eine Auswahl an kleinen Peptiden mit zufällig gewählter Sequenz ein. Diese Proteine
umfassen Beispiele von Proteinen, die in E. coli instabil sind oder
in Einschlusskörpern
gefunden werden, wenn sie ohne einen Thioredoxin Fusionspartner
exprimiert werden.
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Eine Vielzahl von DNA-Molekülen kann
zur erfindungsgemäßen Expression
des heterologen Peptids oder Proteins konstruiert werden, die die
vorstehend beschriebenen Fusionssequenzen inkorporieren. Eine gewünschte DNA-Sequenz
gemäß dieser
Erfindung umfasst mindestens eine wie vorstehend beschriebene Fusionssequenz
zusammen mit und unter der Kontrolle von einer Expressionskontroll-Sequenz,
welche die Expression des Fusionsproteins in einer gewünschten
Wirtszelle steuern kann. Wenn die Wirtszelle beispielsweise ein
E. coli Stamm ist, enthält
das DNA-Molekül
wünschenswerterweise
einen Promotor, der in E. coli funktioniert, eine Ribosomen-Bindungsstelle
und gegebenenfalls ein selektierbares Marker-Gen wie auch einen
Replikationsursprung, falls das DNA-Molekül extrachromosomaler Natur
ist. Zahlreiche bakterielle Expressionsvektoren, die diese Bestandteile
enthalten, sind im Stand der Technik für die bakterielle Expression
bekannt und können
auf einfache Weise durch übliche
molekularbiologische Techniken konstruiert werden. Gleichermaßen können bekannte
Hefe- und Säugerzell-Vektoren
und Vektorbestandteile verwendet werden, wenn die Wirtszelle eine
Hefezelle oder eine Säugerzelle
ist.
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Die die Fusionssequenzen enthaltenden
DNA-Moleküle
können
weiter modifiziert werden, um verschiedene Kodons zu enthalten,
um die Expression in der ausgewählten
Wirtszelle zu optimieren, wie im Stand der Technik bekannt ist.
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Diese DNA-Moleküle können zusätzlich multiple Kopien der
Thioredoxin-ähnlichen
DNA-Sequenz enthalten, wobei das heterologe Protein lediglich mit
einer dieser DNA-Sequenzen
verknüpft
ist oder wobei das heterologe Protein mit allen Kopien der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz fusioniert ist. Es sollte auch möglich sein, eine Thioredoxin-ähnliche/heterologes
Peptid oder Protein kodierende Fusionssequenz in das Chromosom eines
ausgewählten
Wirts zu integrieren, entweder um eine native Thioredoxin-ähnliche
Sequenz zu ersetzen oder um sie zu duplizieren.
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Für
die vorliegende Erfindung geeignete Wirtszellen sind vorzugsweise
bakterielle Zellen. Beispielsweise sind die verschiedenen Stämme von
E. coli (z. B. HB101, W3110 und in den nachfolgenden Beispielen eingesetzte
Stämme)
als Wirtszellen im Bereich der Biotechnologie gut bekannt. Der E.
coli Stamm GI724, der in den nachfolgenden Beispielen eingesetzt
wurde, wurde bei einer US Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, wie nachfolgend
im Detail beschrieben hinterlegt. Verschiedene Stämme von
B. subtilis, Pseudomonas und anderen Bakterien können auch in diesem Verfahren
eingesetzt werden. Viele dem Fachmann bekannte Hefestämme und
andere eukaryotische Zellen können
als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide ebenfalls nützlich sein.
In gleicher Weise können
bekannte Säugerzellen
für die
Expression dieser Fusionsproteine eingesetzt werden.
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Um das erfindungsgemäße Fusionsprotein
herzustellen, ist die Wirtszelle entweder mit einem DNA-Molekül transformiert,
die eine Thioredoxin-ähnliche
DNA-Sequenz fusioniert mit der DNA-Sequenz eines ausgewählten heterologen
Peptids oder Proteins umfasst, vorzugsweise unter der Kontrolle
einer Expressionskontroll-Sequenz, die die Expression eines Fusionsproteins
steuern kann oder hat die Wirtszelle ein derartiges DNA-Molekül in ihr
Genom integriert. Die Wirtszelle wird sodann unter bekannten Bedingungen
gezüchtet,
die für
die Produktion von Fusionsproteinen geeignet sind. Falls das Fusionsprotein
im Zytoplasma der Zelle akkumuliert, kann es durch übliche bakterielle
Zelllyse-Techniken freigesetzt und mittels üblicher Verfahren einschließlich selektiver
Fällungen,
Solubilisierungen und Säulen-chromatographischer
Verfahren gereinigt werden. In einer anderen Ausführungsform
kann eine selektive Freisetzung aus der Zelle für zytoplasmatische Thioredoxin
Fusionsproteine durch osmotischen Schock oder Gefrier-/Auftau-Verfahren
erreicht werden. Obwohl eine abschließende Aufreinigung für die meisten
Zwecke immer noch erforderlich ist, ist die anfängliche Reinheit von Fusionsproteinen
in Präparationen,
die mit diesen Verfahren erhalten werden, höher als die, die mit üblichen
Lysaten ganzer Zellen erhalten werden. Dadurch wird die Anzahl der
für den
Erhalt der Homogenität
erforderlichen nachfolgenden Reinigungsschritte reduziert. In einem
typischen Verfahren unter Verwendung von osmotischem Schock werden
die das Fusionsprotein enthaltenden gepackten Zellen auf Eis in
einem EDTA enthaltenden Puffer mit hoher Osmolarität, die üblicherweise
auf der Zugabe eines gelösten Stoffes,
z. B. 20 Gew.-% Sucrose, beruht, und der die zytoplasmatische Membran
nicht einfach durchqueren kann, resuspendiert. Während der kurzen Inkubation
auf Eis plasmolysieren die Zellen, da Wasser das Zytoplasma gemäß dem abfallenden
osmotischen Gradienten verlässt.
Die Zellen werden anschließend
in einen Puffer mit niedriger Osmolarität übertragen und während des
osmotischen Reequilibriums werden sowohl der Inhalt des Periplasmas
als auch die an den Bayer-Flecken lokalisierten Proteine ausgeschleust.
Eine einfache Zentrifugation nach dieser Freisetzung entfernt den
Großteil
der bakteriellen zellulären
Kontaminanten aus den Fusionsprotein Präparaten. In einer anderen Ausführungsform
werden in einem Einfrier-/Auftau-Verfahren die das Fusionsprotein
enthaltenden gepackten Zellen zunächst in einem EDTA enthaltenden
Puffer resuspendiert und dann eingefroren. Die Freisetzung des Fusionsproteins
wird nachfolgend durch Auftauen der gefrorenen Zellen erreicht.
Wie vorstehend beschrieben, kann der Großteil der Kontaminanten durch
einen Zentrifugationsschritt entfernt werden.
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Diese Behandlungen setzen typischerweise
mindestens 30% der Fusionsproteine frei, ohne dass die Zellkulturen
lysiert werden. Der Erfolg dieser Verfahren bei der Freisetzung
signifikanter Mengen einer großen Vielzahl
von Thioredoxin Fusionsproteinen ist überraschend, da diese Techniken üblicherweise
bei einem großen
Bereich von Proteinen nicht zum Erfolg führen. Die Möglichkeit, diese Fusionsproteine
durch solche, bedeutend einfachere und im Vergleich zu bei anderen
Fusionsprotein-Systemen notwendigen Aufreinigungsverfahren kostengünstigere
Behandlungen wesentlich aufzureinigen, kann für die erfindungsgemäßen Fusionsproteine
einen bedeutsamen Vorteil gegenüber
anderen Systemen darstellen, die zur Herstellung von Proteinen in
E. coli verwendet werden.
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Das so erhaltene Fusionsprotein ist
stabil und löslich,
wobei das heterologe Peptid oder Protein oft seine biologische Aktivität beibehält. Wie
vorstehend diskutiert, kann das heterologe Peptid oder Protein bei
Bedarf durch Spaltung von dem Thioredoxin-ähnlichen Protein abgetrennt
werden.
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In den spezifischen und erläuternden
Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren wurde das Thioredoxin-Gen (trxA) aus E. coli kloniert
und in ein E. coli Expressionssystem eingefügt. Es wurde ein Expressionsplasmid
pALtrxA-781 konstruiert. Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 enthält modifiziertes
IL-11 verknüpft
mit der Thioredoxin Sequenz und ist in Beispiel 1 und in 1 beschrieben. Eine modifizierte Version
dieses Plasmids, die eine andere Ribosomen-Bindungsstelle enthält, wurde
in den anderen Beispielen eingesetzt und ist spezifisch in Beispiel
3 dargestellt. In dieser Erfindung können andere übliche Vektoren eingesetzt
werden. Die Erfindung ist nicht auf die in diesen Beispielen beschriebenen
Plasmide beschränkt.
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Das Plasmid pALtrxA-781 (ohne das
modifizierte IL-11) steuert im E. coli Wirtsstamm GI724 die Ansammlung
von >10% des gesamten
zellulären
Proteins als Thioredoxin. Die Beispiele 2 bis 6 beschreiben die Verwendung
dieses Plasmids in der Bildung und Expression von Thioredoxin Fusionsproteinen
mit den Polypeptiden BMP-2, IL-6 und MIP-1α.
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Als ein Beispiel der Expression kleiner
Peptide, die in die Schleife mit dem aktiven Zentrum eingefügt wurden,
wurde ein Derivat von pALtrxA-781 konstruiert, in das eine 13 Aminosäuren lange
Linkerpeptid-Sequenz, die eine Spaltstelle für die spezifische Protease
Enterokinase (Leipnieks und Light, J. Biol. Chem. 254 (1979), 1077–1083) enthält, in die
Schleife von Thioredoxin mit dem aktiven Zentrum eingefügt wurde.
Dieses Plasmid (pALtrxA-EK) steuert die Ansammlung von >10% des gesamten zellulären Proteins
als das Fusionsprotein. Das Fusionsprotein ist vollständig löslich, was
darauf hinweist, dass es vermutlich eine „native" tertiäre Struktur angenommen hat.
Es ist bei verlängerten
Inkubationen bei 80°C
ebenso stabil wie Wildtyp Thioredoxin, was nahe legt, dass die stabile
tertiäre
Struktur von Thioredoxin durch die Insertion in die Schleife mit
dem aktiven Zentrum nicht beeinträchtigt wurde. Das Fusionsprotein
wird im Gegensatz zu Thioredoxin durch Enterokinase spezifisch gespalten,
was darauf hindeutet, dass das in die Schleife mit dem aktiven Zentrum
eingefügte
Peptid sich auf der Oberfläche
des Fusionsproteins befindet.
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Wie genauer in dem nachfolgenden
Beispiel 5 beschrieben, wurden kleine Peptide in die Schleife von Thioredoxin
mit dem aktiven Zentrum eingefügt.
Die eingefügten
Peptide wiesen eine Länge
von 14 Aminosäuren
auf und waren von rein zufälliger
Zusammensetzung. Hierdurch wurde das System auf seine Fähigkeit hin
getestet, hydrophobe, hydrophile und neutrale Sequenzen zu verarbeiten.
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Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen
ermöglichen
die Herstellung von in der Forschung sowie in diagnostischen und
therapeutischen Bereichen nützlichen
Proteinen und Peptiden. Die Herstellung von Fusionsproteinen gemäß dieser
Erfindung weist eine Reihe von Vorteilen auf. Ein Beispiel dafür ist, dass
die Herstellung eines ausgewählten
Proteins durch die vorliegende Erfindung über eine carboxyterminale Fusion
mit E. coli Thioredoxin oder mit einem anderen Thioredoxin-ähnlichen
Protein die Vermeidung von Problemen mit der Initiation der Translation
ermöglicht,
die oft in der Herstellung von eukaryotischen Proteinen in E. coli
vorgefunden werden. Darüber
hinaus fehlt das üblicherweise
am N-Terminus des heterologen Proteins verbleibende Initiations-Methionin und muß somit
nicht entfernt werden, falls das heterologe Protein über eine
carboxyterminale Fusion mit Thioredoxin hergestellt wird.
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Die Herstellung der Fusionsproteine
gemäß dieser
Erfindung verbessert die Löslichkeit
der gewünschten
heterologen Proteine und erhöht
ihre Stabilität
in dem Expressionssystem gegenüber
Proteasen in verlässlicher
Weise. Die Erfindung ermöglicht
ferner die Expression von bestimmten gewünschten therapeutischen Proteinen,
z. B. IL-11, auf hoher Ebene, die ansonsten auf niedriger Ebene
in bakteriellen Wirtszellen hergestellt werden. Diese Erfindung
kann dem Fusionsprotein ferner Hitzestabilität verleihen, insbesondere falls
das heterologe Protein selbst hitzestabil ist. Da Thioredoxin und
vermutlich sämtliche
Thioredoxin-ähnlichen
Proteine hitzestabil bis 80°C
sind, kann die vorliegende Erfindung die Verwendung einer einfachen
Hitzebehandlung als einen ersten wirkungsvollen Reinigungsschritt
für einige
Thioredoxin Fusionsproteine ermöglichen.
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Zusätzlich zu der Bereitstellung
von großen
Mengen des ausgewählten
heterologen Proteins oder Peptids nach Abspaltung von dem Fusionsprotein
für therapeutische
oder andere Zwecke können
die erfindungsgemäßen Fusionsproteine
oder Fusionspeptide selbst nützlich
als Therapeutika sein. Darüber
hinaus können
die Thioredoxin-ähnlichen
Fusionsproteine einen Träger
für die
Verabreichung von biologisch aktiven Peptiden bereitstellen. Beispielsweise
wäre menschliches
Thioredoxin im Menschen nicht antigen. Daher kann ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein
mit menschlichem Thioredoxin als Träger zur Verabreichung des damit fusionierten
biologisch aktiven Peptids beim Menschen nützlich sein. Menschliche Thioredoxin
Fusionsproteine können
in intrazellulären
E. coli Expressionssystemen hergestellt werden, da menschliches
Thioredoxin ein intrazelluläres
Protein ist. Somit stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Verabreichung
von biologisch aktiven Peptiden oder Proteinen in Form eines Fusionsproteins
mit einem verträglichen
Thioredoxin-ähnlichen Protein
an einen Patienten bereit.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ferner Verfahren und Reagenzien bereit, um Bibliotheken von Zufallspeptiden
auf ihre potentiellen Enzym-inhibitorischen Aktivitäten sowie
ihre Aktivitäten
als Hormon-/Wachstumsfaktor-Agonisten und Hormon-/Wachstumsfaktor-Antagonisten zu screenen.
Ferner bereit gestellt werden Verfahren und Reagenzien für die Kartierung
bekannter Protein-Sequenzen auf Bereiche von potentiellen Interesse, einschließlich Rezeptor-Bindungsstellen,
Substrat-Bindungsstellen, Phosphorylierungs-/Modifizierungsstellen, Protease-Spaltstellen
und Epitopen.
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Bakterielle Kolonien, die Thioredoxin-ähnliche/Zufallspeptid
Fusionsproteine exprimieren, können
unter Verwendung radiomarkierter Proteine wie Hormonen oder Wachtstumsfaktoren
als Sonden gescreent werden. In dieser Art von Test identifizierte
positive Klone würden
Moleküle
identifizieren, die Rezeptor-Bindungsstellen nachahmen und zum Design
von Stoffen mit therapeutischen Verwendungen führen. Bakterielle Kolonien,
die Fusionsproteine aus Thioredoxin-ähnlichen Proteinen und Zufallspeptiden
exprimieren, können
auch unter Verwendung von Antikörpern
gescreent werden, die gegen native, aktive Hormone oder Wachstumsfaktoren
gewonnen wurden. In dieser Art von Test identifizierte positive
Klone könnten
Moleküle
darstellen, die Oberflächenepitope
auf dem Originalantigen nachahmen. Wenn derartige Oberflächenepitope
für die
Rezeptorbindung verantwortlich sind, würden die „positiven" Fusionsproteine biologische Aktivität aufweisen.
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Die erfindungsgemäßen Thioredoxin-ähnlichen
Fusionsproteine oder Fusionspeptide können auch zur Entwicklung monoklonaler
oder polyklonaler Antikörper
oder rekombinanter oder chimärer
Antikörper
eingesetzt werden, die nach bekannten Verfahren für diagnostische,
Reinigungs- oder therapeutische Zwecke hergestellt werden. Untersuchungen
mit Thioredoxin-ähnlichen
Molekülen
deuten auf eine mögliche
B Zell-/ T Zell-Wachstumsfaktor-Aktivität hin (N. Wakasuki et al.,
vorstehend zitiert), die Immunantworten verstärken könnten. Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine
oder – peptide
können
als Antigene eingesetzt werden, um gewünschte Antikörper zu
erzeugen, die ihrerseits nach bekannten Verfahren weiter manipuliert
werden können,
um monolonale oder rekombinante Antikörper zu erhalten.
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In einer anderen Ausführungsform
können
gegen Thioredoxin-ähnliche
Sequenzen erzeugte Antikörper
auch in der Reinigung vieler verschiedener Thioredoxin Fusionsproteine
nützlich
sein.
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Die nachfolgenden Beispiele erläutern Ausführungsformen
der Erfindung, sollen den Schutzbereich der Offenbarung jedoch nicht
einschränken.
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Beispiel 1 – Thioredoxin-
IL-11 Fusionsmolekül
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Ein erfindungsgemäßes Thioredoxin-ähnliches
Fusionsmolekül
wurde unter Verwendung von E. coli Thioredoxin als der Thioredoxin-ähnlichen
Sequenz und rekombinantem IL-11 als dem ausgewählten heterologen Protein hergestellt:
Die DNA- und Aminosäuresequenz
von IL-11 wurde publiziert. Vgl. Paul et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87 (1990), 7512– 7516
und die PCT Veröffentlichung
WO91/0749, publiziert am 30. Mai 1991. IL-11 DNA kann durch Klonierung
auf der Basis seiner publizierten Sequenz erhalten werden. Das E. coli
Thioredoxin- (trxA) Gen wurde auf der Grundlage seiner publizierten
Sequenz kloniert und zur Herstellung verschiedener. verwandter E.
coli Expressionsplasmide eingesetzt. Dabei wurden übliche DNA-Manipulationsverfahren
eingesetzt, die ausführlich
in Sambrook, Fritsch und Maniatis, „Molecular Cloning, A Laboratory
Manual", 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) dargestellt
sind. Ein erstes Expressionsplasmid pALTRxa-781 wurde hergestellt,
das das E. coli trxA-Gen enthielt, das nicht mit einer anderen Sequenz
fusioniert war. Dieses Plasmid enthielt weiterhin Sequenzen, die
nachstehend im Detail für
das verwandte IL-11 Fusionsplasmid beschrieben sind. Dieses erste
Plasmid, das die Ansammlung von >10%
Thioredoxin vom gesamten zellulären
Protein in einem E. coli Wirtsstamm GI724 steuert, wurde weiter,
wie nachstehend beschrieben, zur Konstruktion einer trxA/IL-11 Fusionssequenz
manipuliert. Die Gesamtsequenz des verwandten Plasmid-Expressionsvektors
pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 ist in 1 dargestellt und enthält die nachfolgend dargestellten
wesentlichen Eigenschaften:
Die Nukleotide 1-2060 enthalten
DNA-Sequenzen, die aus dem Plasmid pUC-18 (Norrander et al., Gene
26 (1983), 101–106)
stammen und schließen
das Gen für β-Lactamase, das in
E. coli Wirtsstämmen
Resistenz gegenüber
dem Antibiotikum Ampicillin vermittelt sowie einen von colE1 abgeleiteten
Replikationsursprung ein. Die Nukleotide 2061–2221 enthalten DNA-Sequenzen
für den
wichtigen linkswärtigen
Promotor (pL) des Bakteriophagen λ (Sauger
et al., J. Mol. Biol. 162 (1982), 729–773) einschließlich dreier
Operator-Sequenzen, OL1, OL2
und OL3. Die Operatoren stellen die Bindungsstellen
für das λ cI Repressorprotein
dar, dessen intrazelluläre
Mengen die Initiation der Transkription von pL quantitativ kontollieren.
Die Nukleotide 2222–2241
enthalten eine starke Ribosomen-Bindungsstelle, die aus der des
Gens 10 des Bakteriophagen T7 abgeleitet ist (Dunn und Studier,
J. Mol. Biol. 166 (1983), 477–535).
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Die Nukleotide 2242–2568 enthalten
eine DNA-Sequenz, die das E. coli Thioredoxin Protein kodiert (Lim
et al., J. Bacteriol. 163 (1985), 311–316). Am Ende der Thioredoxin
kodierenden Sequenz in diesem Plasmid gibt es kein Translationsterminations-Kodon.
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Die Nukleitide 2569–2583 enthalten
eine DNA-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz
für ein
kurzes, hydrophiles, flexibles Spacerpeptid „-GSGSG--„ kodiert. Die Nukleotide
2584-2598 stellen eine DNA-Sequenz bereit, die die Aminosäure-Sequenz
für die
Erkennungssequenz für
die Spaltung mit Enterokinase (EC 3.4.4.8), „--DDDDK--„ (Maroux et al., J. Biol.
Chem. 246 (1971), 5031–5039)
kodiert.
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Die Nukleotide 2599–3132 enthalten
eine DNA-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz
einer modifizierten Form von reifem menschlichem IL-11 (Paul et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 7512–7516) kodiert, in der der
N-terminale Prolylrest deletiert ist, der normalerweise im natürlichen
Protein gefunden wird. Die Sequenz enthält ein Translationsterminations-Kodon
am 3'-Ende der IL-11
Sequenz.
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Die Nukleotide 3133–3159 stellen
eine „Linker" DNA-Sequenz bereit,
die Spaltstellen für
Restriktionsendonukleasen enthält.
Die Nukleotide 3160-3232 stellen eine Translationsterminations-Sequenz
bereit, die auf der Grundlage derjenigen des E. coli aspA-Gens beruht
(Takagi et al, Nucl. Acids Res. 13 (1985), 2063–2074). Die Nukleotide 3233–3632 sind
aus pUC-18 stammende DNA-Sequenzen.
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Wie nachstehend in Beispiel 2 dargestellt,
kann (lieser Plasmidvektor die Produktion großer Mengen (etwa 10% des gesamten
zellulären
Proteins) eines Thioredoxin-IL-11 Fusionsproteins steuern, wenn
die Züchtung
unter geeigneten Bedingungen in einem geeigneten E. coli Wirtsstamm
erfolgt. Im Gegensatz dazu akkumulierte IL-11 nur zu 0,2% des gesamten
zellulären
Proteins, wenn es in einem analogen Wirt/Vektor System exprimiert
wurde und nicht mit Thioredoxin fusioniert war.
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Beispiel 2 – Expression
eines Fusionsproteins
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Unter Verwendung des in Beispiel
1 konstruierten Plasmids wurde ein Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein
gemäß den nachfolgend
dargestellten Versuchsanleitungen hergestellt. pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581
wurde nach dem Verfahren von Dagert und Ehrlich, Gene 6 (1979),
23, in den E. coli Wirtsstamm GI724 (F-, lacIq, lacPL8, ampC::λ cI+) transformiert. Der nicht transformierte
Wirtsstamm E. coli GI724 wurde am 31. Januar 1991 bei der American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland
unter der ATCC Hinterlegungsnummer 55151 für Patentzwecke gemäß geltenden
Gesetzen und Bestimmungen hinterlegt. Transformanten wurden auf
1,5 Gew.-% Agarplatten enthaltend IMC Medium selektioniert, das
aus M9 Medium (Miller, „Experiments
in Molecular Genetics",
Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972) ), supplementiert
mit 0,5 Gew.-% Sukrose, 0,2 Gew.-% Casaminosäuren und 100 μg/ml Ampicillin
zusammengesetzt ist.
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GI724 enthält eine Kopie des Wildtyp λ cI Repressor-Gens,
das im ampC-Lokus stabil in das Chromosom integriert ist und dort
unter die Transkriptionskontrolle von Salmonella typhimurium trp-Promotor-/Operatorsequenzen
gestellt wurde. In GI724 wird das λ cI Protein nur bei Wachstum
in Tryptophan-freiem Medien synthetisiert, wie Minimalmedien oder
einem Minimalmedium, das durch Casaminosäuren ergänzt ist, wie das vorstehend
beschriebene IMC. Die Zugabe von Tryptophan zu einer Kultur von
GI724 wird den trp-Promotor unterdrücken und
die Synthese von λ cI
beenden, wodurch allmählich
die Induktion der Transkription von pL-Promotoren bewirkt wird,
sofern diese in der Zelle vorhanden sind.
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GI724, transformiert mit pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581,
wurde bei 37°C
in IMC Medium bis zu einer A550 von 0,5
gezüchtet.
Tryptophan wurde bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben
und die Kultur weitere 4 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit akkumulierte
Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein auf einen Wert von etwa 10 % des
gesamten zellulären
Proteins.
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Das gesamte Fusionsprotein befand
sich in der löslichen
zellulären
Fraktion und wurde, wie nachfolgend beschrieben, aufgereinigt. Die
Zellen wurden in einer French-press-Zelle bei 20.000 psi in 50 mM
HEPES, pH 8,0, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid lysiert. Das Lysat
wurde durch Zentrifugation bei 15.000 × g 30 Minuten geklärt und der Überstand
auf eine QAE-Toyopearl Säule
geladen. Die Durchfluß-Fraktionen
wurden verworfen und das Fusionsprotein mit 50 mM HEPES, pH 8,0,
100 mM NaCl eluiert. Das Eluat wurde auf 2 M NaCl eingestellt und
auf eine Phenyl-Toyopearl Säule
geladen. Die Durchfluß-Fraktionen wurden
wiederum verworfen und das Fusionsprotein mit 50 mM HEPES, pH 8,0,
0,5 M NaCl eluiert.
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Das Fusionsprotein wurde anschließend gegen
25 mM HEPES, pH 8,0 dialysiert und war in diesem Stadium >80% rein. Gemessen
in einem T1165 Bioassay (Paul et al., vorstehend zitiert), zeigte
das aufgereinigte Thioredoxin-IL-11 Protein eine Aktivität von 8 × 105 Einheiten/mg. Dieser Wert stimmt auf molarer
Basis sehr gut mit der Aktivität
von 2 × 106 Einheiten/mg überein, die bei aus COS Zellen
stammendem und bis zur Homogenität
aufgereinigtem IL-11 in demselben Test gemessen wurde. Ein Milligramm
des Fusionsproteins wurde anschließend 20 Stunden bei 37°C mit 1.000
Einheiten Rinder-Enterokinase
(Leipnieks und Light, J. Biol. Chem. 254 (1979), 1677–1683) in
1 ml 10 mM Tris-Cl(pH 8,0)/10 mM CaCl2 gespalten.
Aus den Reaktionsprodukten wurde IL-11 durch Passagieren über eine
QAE-Toyopearl Säule
in 25 mM HEPES, pH 8,0 gewonnen, wobei homogenes IL-11 in den Durchfluß-Fraktionen
gefunden wurde. Nicht gespaltenes Fusionsprotein, Thioredoxin und
Enterokinase blieben an die Säule
gebunden.
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Das auf diese Weise hergestellte
IL-11 wies in dem T1165 Test eine biologische Aktivität von 2 × 106 Einheiten/mg auf. Seine physikalischen
und chemischen Eigenschaften wurden, wie nachstehend aufgeführt, ermittelt:
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(1) Molekulargewicht
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Es wurde ermittelt, dass das Molekulargewicht
von IL-11, gemessen durch 10% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen
(Tricin-System) gemäß den Verfahren
nach Schagger et al., Anal. Biochem. 166 (1987), 368–379, etwa
21 kD betrug. Der Stoff lief als einzelne Bande.
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(2) Endotoxin-Gehalt
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Der Endotoxin-Gehalt des IL-11 betrug
weniger als 0,1 ng pro Milliliter IL-11 im LAL („Limulus Amebocyten Lysat", Pyrotel, erhältlich über Associates
of Cape Cod, Inc., Woods Hole, Massachusetts, USA) Test, der gemäß den Vorschriften
des Herstellers durchgeführt
wurde.
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(3) Isoelektrischer Punkt
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Der theoretische isoelektrische Punkt
von IL-11 beträgt
pH 11,70. Wie durch isoelektrische Polyacrylamidgel-Fokussierung
unter Verwendung einer LKB „Ampholine
PAGplate" mit einem
pH-Bereich von 3,5 bis 9,5 gemessen wurde, lief das IL-11 bei einem
höheren
Wert als 9,5. Eine genaue Messung konnte nicht durchgeführt werden,
da IL-11 ein zu basisches Protein für die verfügbaren verlässlichen Gele ist.
-
(4) Fluoreszenz-Absorptionsspektrum
-
Das Fluoreszenz-Absorptionsspektrum
von IL-11, gemessen in einer 0,1%igen wässrigen Lösung in einer 1 cm Quarzküvette zeigte
ein Emissionsmaximum bei 335–337
nm.
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(5) UV-Absorption
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Die UV-Absorption des IL-11 in einer
0,1%-igen wässrigen
Lösung
in einer 1 cm Quarzküvette
zeigte ein Absorptionsmaximum bei 278–280 nm.
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(6) Aminosäure-Zusammensetzung
-
Die theoretische Aminosäure-Zusammensetzung
von IL-11, basierend auf seiner Aminosäure-Sequenz ist wie folgt:
-
Eine Probe an homogenem IL-11 wurde,
wie nachfolgend beschrieben, einer Gasphasen-Hydrolyse unterworfen:
6 N HCl
und 2 N Phenol Reagenzien wurden einem Hydrolysegefäß zugegeben,
in das 45 μl
von 1 : 10 verdünntem
(Gew./H2O) IL-11, konzentriert zur Trockne,
enthaltende Röhrchen
eingesetzt waren. Die Proben wurden unter Vakuum versiegelt und
36 Stunden bei 110°C
hydrolysiert. Nach der Hydrolyse wurden die Proben getrocknet und
in 500 μl
Na-S Proben-Verdünnungspuffer
resuspendiert. Die Aminosäure-Analyse
wurde mit einem automatischen Beckman 7300 Aminosäure-Analysegerät durchgeführt. Für die Auftrennung
der Aminosäuren
nach der Derivatisierung mit Ninhydrin, die nach der Säulenauftrennung
stattfand, wurde eine Kationen-Austauschersäule verwendet. Primäre Aminosäuren wurden
bei 570 nm und sekundäre
Aminosäuren
bei 440 nm nachgewiesen. Für
jede der Aminosäuren
wurden acht Punkt-Eichungskurven erstellt.
-
Da bestimmte Aminosäure üblicherweise
nicht wieder gewonnen werden, sind nachfolgend lediglich die Ergebnisse
für 5 Aminosäuren dargestellt.
Da die Hydrolyse ohne Entsalzung des Proteins durchgeführt wurde,
wurde für
die meisten Aminosäuren
eine Rückgewinnung
von 100% erreicht.
-
Die relative Rückgewinnung jedes einzelnen
Aminosäurerestes
pro Molekül
an rekombinantem IL-11 wurde durch Normalisierung GLX = 10 bestimmt
(die auf der Grundlage der cDNA-Sequenz voraus gesagte Anzahl von
Glutamin- und Glutaminsäureresten
in IL-11). Der für
die Rückgewinnung
von GLX in Picomol erhaltene Wert wurde durch 10 dividiert, um den
GLX-Quotienten zu erhalten. Wenn man den für die Rückgewinnung jeder Aminosäure in Picomol
erhaltenen Wert durch den GLX-Quotienten
für diese
Probe dividiert, so erhält
man eine Zahl, die die relative Rückgewinnung jeder Aminosäure in der
Probe wiederspiegelt, normalisiert gegen die quantitative Rückgewinnung
von GLX-Resten. Der Korrelationskoeffizient, mit dem die erwarteten
mit den beobachteten durchschnittlichen Anzahlen an Resten jeder
Aminosäure
verglichen werden, ist größer als
0,985. Dies deutet darauf hin, dass die für jede Aminosäure beobachtete
Anzahl von Resten mit der voraus gesagten Sequenz gut übereinstimmt.
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(7) Aminoterminale Sequenzierung
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IL-11 (gepuffert in 95%-igem Acetonitril
TFE („TFA")) wurde unter Verwendung
eines ABI 471A Protein-Sequenziergerätes (ABI, Inc.) gemäß den Anweisungen
des Herstellers sequenziert. Die Sequenzierung des Aminoterminus
bestätigte,
dass das aus dem Thioredoxin Fusionsprotein hergestellte IL-11 die
richtige IL-11 Aminosäure-Sequenz
und lediglich einen beobachteten Aminoterminus enthielt.
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(8) Peptid-Kartierung
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Das IL-11 wurde mit Endoproteinase
Asp-N (Boehringer Mannheim) (1 : 500 Verhältnis von Asp-N zu IL-11) in
10 mM Tris, pH 8, 1 M Harnstoff und 2 mM 4-Aminobenzamidindihydrochlorid
(PABA) 4 Stunden bei 37°C
gespalten. Mit der Probe wurde anschließend eine HPLC auf einer C4
Vydac-Säule
durchgeführt,
wobei ein A-Puffer aus 50 mM NaHPO4, pH
4,3, in dH2O, und ein B-Puffer aus 100%
Isopropanol mit einem Gradienten bei 1 ml/Min. von 100% A zu 25%
A und 75% B (Wechsel 1%/Minute) eingesetzt wurden. Die eluierten Peptidfragmente
wurden dann mittels eines ABI 471A Protein-Sequenziergerätes (ABI, Inc.) gemäß den Anleitungen
des Herstellers sequenziert. Die Peptid-Kartierung bestätigte, dass
das aus dem Thioredoxin Fusionsprotein hergestellte IL-11 die richtigen
N-terminalen und C-terminalen IL-11 Sequenzen enthielt.
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(9) Löslichkeit
-
Das IL-11 Protein wurde in den nachfolgend
aufgeführten
Substanzen auf seine Löslichkeit
getestet, wobei die folgenden Ergebnisse erzielt wurden:
Wasser | sehr
gute Löslichkeit |
Ethylalkohol | sehr
gute Löslichkeit |
Aceton | sehr
gute Löslichkeit |
1 M
Natriumchlorid | sehr
gute Löslichkeit |
10%
Sukrose | sehr
gute Löslichkeit |
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(10) Zucker-Zusammensetzung
und Gehalt an Protein/Polysaccharid in %
-
Das Fehlen von an das Polypeptid-Rückrad des
IL-11 Proteins angehefteten Zuckerresten wird durch seine Aminosäure-Sequenz
angezeigt, die keine der üblichen
Anheftungsstellen für
Zucker aufweist.
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Beispiel 3 – Thioredoxin-MIP
Fusionsmolekül
-
Das menschliche Makrophagen-Hemmprotein-1α (MIP-1α) wurde als
ein Thioredoxin Fusionsprotein in E. coli auf hoher Ebene exprimiert.
Dazu wurde ein Expressionsvektor ähnlich dem vorstehend in Beispiel
1 beschriebenen Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581
verwendet, der jedoch in der nachfolgend beschriebenen Weise modifiziert
wurde, um die Ribosomen-Bindungsstelle des Bakteriophagen T7 durch
die von λ CII
zu ersetzen. In dem Plasmid nach Beispiel 1 wurden die Nukleotide
2222 und 2241 nach konventionellen Verfahren ersetzt. Eine Nukleotid-Sequenz,
gebildet durch die Nukleotide 35566 bis 35472 und 38137 bis 38361
des Bakteriophagen lambda, wie in Sanger et al. (1982), vorstehend
zitiert, beschrieben, wurde anstelle dieser Nukleotide eingefügt. Um ein
Thioredoxin-MIP-1α Fusionsprotein
zu exprimieren, wurde in dem derart veränderten Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581
die menschliches IL-11 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide 2599–3132) durch
die in 2 gezeigte 213
Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die reifes menschliches MIP-1α voller Länge (Nakao
et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990), 3646–3658) kodiert.
-
Der Wirtsstamm und das für die Herstellung
des Thioredoxin-MIP-1α Fusionsproteins
verwendete Expressionsprotokoll entsprechen der Darstellung in Beispiel
1. Wie mit dem Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein beobachtet wurde,
wurde das gesamte Thioredoxin-MIP-1α Fusionsprotein
in der löslichen
zellulären
Fraktion gefunden und stellte bis zu 20% des gesamten Proteins dar.
-
Zellen wurden, wie in Beispiel 1
beschrieben, lysiert, wodurch eine Protein-Konzentration von 10 mg/ml
im Rohlysat erhalten wurde. Anschließend wurde dieses Lysat 10
Min. auf 80° C
erhitzt, wodurch die Mehrzahl der kontaminierenden E. coli Proteine
ausgefällt
wurde, und durch Zentrifugation für 60 Min. bei 130.000 × g geklärt. Der
Niederschlag wurde entfernt und der Überstand auf eine Mono Q-Säule geladen.
Das Fusionsprotein eluierte bei etwa 0,5 M NaCl von dieser Säule und
war in diesem Stadium zu >80%
rein. Nach einer Dialyse zur Entfernung von Salz konnte das Fsuionsprotein
durch Behandlung mit Enterokinase, wie in Beispiel 1 beschrieben
gespalten werden, wodurch MIP-1α freigesetzt
wurde.
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Beispiel 4 – Thioredoxin-BMP-2
Fusionsmolekül
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Menschliches Knochen-Morphogen-Protein-2
(BMP-2) wurde auf hoher Ebene als ein Thioredoxin Fusionsprotein
in E. coli exprimiert, wobei der in Beispiel 3 beschriebene modifizierte
Expressionsvektor verwendet wurde. In dem modifizierten Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581
wurde die menschliches IL-11 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide
2599–3132)
durch die in 3 gezeigte
345 Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die reifes menschliches
BMP-2 voller Länge
(Wozney et al., Science 242 (1989), 1528–1534) kodiert.
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In diesem Fall trat das Thioredoxin-BMP-2
Fusionsprotein in der unlöslichen
zellulären
Fraktion auf, wenn der den Expressionsvektor enthaltende Stamm GI724
in einem Tryptophan enthaltenden Medium bei 37°C gezüchtet wurde. Wenn die Temperatur
des Wuchsmediums jedoch auf 20°C
erniedrigt wurde, wurde das Fusionsprotein in der löslichen
zellulären
Fraktion gefunden.
-
Beispiel 5 – Fusionsmoleküle aus Thioredoxin
und kleinem Peptid
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Natives E. coli Thioredoxin wurde
in E. coli auf hoher Ebene unter Verwendung des Stammes GI724 exprimiert,
der denselben, in Beispiel 3 beschriebenen Plasmid-Expressionsvektor
enthielt, aus dem die Nukleotide 2569–3129 deletiert worden waren.
Dabei wurde dasselbe Wachstums- und Induktionsprotokoll, wie in Beispiel
1 dargestellt verwendet. Unter diesen Bedingungen akkumulierte Thioredoxin
zu etwa 10% des gesamten Proteins, das vollständig in der löslichen
zellulären
Fraktion gefunden wurde.
-
4 stellt
die Insertion von 13, eine Spaltstelle für eins Enterokinase darstellenden
Aminosäure-Resten
in die Schleife mit dem aktiven Zentrum von Thioredoxin dar und
zwar zwischen die Reste G34 und P35 der Thioredoxin Protein-Sequenz. Das diese
interne Enterokinase-Spaltstelle enthaltende Fusionsprotein wurde in
Mengen exprimiert, die denen nativen Thioredoxins entsprachen. Es
wurde durch Behandlung mit Enterokinase gespalten, wie vorstehend
in Beispiel 1 beschrieben. Das Fusionsprotein war gegenüber Hitzebehandlung
ebenso stabil wie natives Thioredoxin. Es war resistent bei einer
10-minütigen Inkubation
bei 80°C,
wie in Beispiel 4 beschrieben.
-
Nachstehend sind zwölf weitere
Peptid-Insertionen aufgeführt,
die auch in der Schleife mit dem aktiven Zentrum von Thioredoxin
zwischen den Resten G
34 und P
35 durchgeführt wurden.
Die Sequenzen weisen in der Länge
jeweils 14 Aminosäure-Reste
auf und sind zufällig
zusammengesetzt. Jedes dieser Thioredoxin Fusionsproteine mit diesen
auf dem Zufallsprinzip beruhenden Insertionen wurde in Mengen hergestellt,
die mit denen von nativem Thioredoxin vergleichbar waren. Sie wurden
alle in der löslichen
zellulären
Fraktion gefunden. Diese Peptide schließen die folgenden Sequenzen
ein:
-
Die eingefügten Sequenzen umfassten Beispiele,
die sowohl hydrophob als auch hydrophil waren sowie Beispiele, die
Cystein-Reste enthielten. Es hat den Anschein, dass die Schleife
mit dem aktiven Zentrum von Thioredoxin eine große Vielfalt von Peptid-Insertionen tolerieren
kann und so lösliche
Fusionsproteine erhalten werden. Zur Reinigung dieser Scheifen- „Insertionen" können Standardverfahren
eingesetzt werden.
-
Beispiel 6 – Menschliches
Interleukin-6
-
Menschliches Interleukin-6 (IL-6)
wurde auf hoher Ebene als ein Thioredoxin Fusionsprotein in E. coli exprimiert,
wobei ein ähnlicher
Vektor wie der vorstehend in Beispiel 3 beschriebene modifizierte
Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 eingesetzt wurde.
Um ein Thioredoxin-IL-6 Fusionsprotein zu exprimieren, wurde in dem
veränderten
Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 die menschliches
IL-11 kodierende DNA-Sequenz (Nukleotide 2599–3132) durch die in 6 gezeigte 561 Nukleotide
lange DNA-Sequenz ersetzt, die reifes menschliches IL-6 voller Länge (Hirano
et al., Nature 324 (1986), 73–76)
kodiert. Der Wirtsstamm und das für die Herstellung des Thioredoxin-IL-6
Fusionsproteins verwendete Expressionsprotokoll entsprechen der
Darstellung in Beispiel 1.
-
Wenn das Fusionsprotein bei 37°C synthetisiert
wurde, wurden etwa 50% davon in der „Einschlusskörper-" oder unlöslichen
Fraktion gefunden. Sofern die bei der Synthese eingesetzte Temperatur
auf 25°C
erniedrigt wurde, wurde jedoch das gesamte Thioredoxin-IL-6 Fusionsprotein,
das bis zu 10% des gesamten zellulären Proteins darstellte, in
der löslichen
Fraktion vorgefunden.
-
Beispiel 7 – Menschlicher
Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor
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Menschlicher Makrophagen Kolonie-stimulierender
Faktor (M-CSF) wurde auf hoher Ebene als ein Thioredoxin Fusionsprotein
in E. coli exprimiert, wobei der modifizierte Expressionsvektor ähnlich dem
vorstehend in Beispiel 3 beschriebenen Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581
eingesetzt wurde.
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Die menschliches IL-11 in dem modifizierten
Vektor pALtrxA/EK/IL11Δ Pro-581 kodierende DNA-Sequenz
(Nukleotide 2599–3135)
wurde durch die 669 Nukleotide lange DNA-Sequenz ersetzt, die in 7 gezeigt ist und die ersten
223 Aminosäuren
von reifem menschlichem M-CSFβ kodiert
(G. G: Wong et al., Science 235 (1987), 1504–1508). Der Wirtsstamm und
das für
die Herstellung des Thioredoxin-M-CSF Fusionsproteins verwendete
Expressionsprotokoll entsprechen der Darstellung in Beispiel 2,
oben.
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Wie mit dem Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein
beobachtet wurde, wurde das gesamte Thioredoxin-M-CSF Fusionsprotein
in der löslichen
zellulären
Fraktion vorgefunden und stellte bis zu 10% des gesamten Proteins
dar.
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Beispiel 8 – Freisetzung
des Fusionsproteins durch osmotischen Schock oder Einfrieren/Auftauen
-
Um zu bestimmen, ob die erfindungsgemäßen Fusionen
der heterologen Proteine mit Thioredoxin die Zielführung auf
die Adhäsionsstellen
der Wirtszelle ermöglichen
und die Freisetzung der Fusionsproteine aus der Zelle erlauben,
wurden die Zellen einfachem osmotischem Schock und Einfrier-/Auftau-Verfahren
unterworfen.
-
Zellen, die Wildtyp E. coli Thioredoxin,
menschliches Thioredoxin, das E. coli Thioredoxin-MIP-1α Fusionsprotein
oder das E. coli Thioredoxin-IL-11 Fusionsprotein überproduzierten,
wurden in den nachstehend beschriebenen Verfahren verwendet.
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Für
die Behandlung mit osmotischem Schock wurden die Zellen bei 2 A550/ml in 20 mM Tris-Cl, pH 8,0/2,5 mM EDTA/20
Gew.-% Sukrose resuspendiert und 10 Minuten kalt auf Eis gehalten.
Die Zellen wurden anschließend
durch Zentrifugation pelletiert (12.000 × g, 30 Sekunden) und vorsichtig
in demselben Puffer, wie vorstehend beschrieben, jedoch ohne Sukrose
resuspendiert. Nach einer zusätzlichen
10-minütigen
Verweildauer auf Eis, die zur osmotischen Freisetzung der Proteine
diente, wurden die Zellen durch Zentrifugieren (12.000 × g, 2 Minuten)
noch einmal pelletiert und der Überstand
(durch den Schock freigesetzte Proteine; „shockate") auf seinen Proteingehalt hin untersucht.
Wildtyp E. coli Thioredoxin und menschliches Thioredoxin wurden
quantitativ freigesetzt, wobei durch den Schock freigesetzte Protein-Präparate erhalten
wurden, die zu >80%
aus reinem Thioredoxin bestanden. Wichtiger war, dass >80% der Thioredoxin-MIP-1α- und >50% der Thioredoxin-IL-11
Fusionsproteine durch diese osmotische Behandlung freigesetzt wurden.
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Ein einfaches Einfrier-/Auftau-Verfahren
lieferte ähnliche
Ergebnisse. Thioredoxin Fusionsproteine wurden selektiv freigesetzt,
während
die meisten anderen zellulären
Proteine in der Zelle verblieben. Ein typisches Einfrier-/Auftau-Verfahren
erfordert die Resuspendierung der Zellen bei 2 A550/ml
in 20 mM Tris-Cl, pH 8,0/2,5 mM EDTA und das rasche Einfrieren der
Suspension in Trockeneis oder flüssigem
Stickstoff. Die gefrorene Suspension wird dann langsam aufgetaut,
bevor die Zellen abzentrifugiert werden (12.000 × g, 2 Minuten) und der Überstand
auf Protein hin untersucht wird.
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Obwohl die so erhaltenen, durch den
Schock freigesetzten Proteine („shockate") gegebenenfalls eine weitere Aufreinigung
erfordern, sind die zunächst
durch den Schock freigesetzten Proteine durch das Fehlen von Nukleinsäure-Kontaminanten
gekennzeichnet. Verglichen mit einem Ausgangslysat ist die Reinheit
der durch Schock freigesetzten Proteine („shockate") wesentlich höher und erfordert nicht das
aufwendige Entfernen von DNA aus bakteriellen Lysaten.
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Somit kann dieser Freisetzungsschritt
den in Beispiel 2 beschriebenen Lyseschritt ersetzen. Der nach der
Zentrifugation erhaltene Überstand
wird dann weiter in der in dem Beispiel beschriebenen Weise aufgereinigt.
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Zahlreiche Modifikationen und Variationen
der vorliegenden Erfindung sind in der verstehend dargestellten
Beschreibung eingeschlossen und werden für den Fachmann als offensichtlich
angesehen. Derartige Modifikationen und Variationen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren sollen vom Schutzbereich der anhängigen Ansprüche eingeschlossen
sein.