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Hintergrund
der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft Verfahren
zur DNA-Sequenzierung, in welchen ein markiertes Nukleotid in ein sich
verlängerndes
DNA-Molekül
während
eines Ketten-Terminations- bzw. Abbruch-Sequenzier-Verfahrens inkorporiert
wird.
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Die Sequenz der Nukleotidbasen in
einem DNA-Molekül
kann auf eine Vielzahl von Arten bestimmt werden. Das Kettenabbruchverfahren
schließt
im allgemeinen die Synthese von DNA, komplementär zu dem Matrizen-Strang, welcher
sequenziert werden soll, ein, durch das Verlängern eines Primers, welcher
in der Lage ist, an einen Anteil dieses Matrizen-Stranges zu hybridisieren, mit einer
DNA-Polymerase. Während
der Synthesereaktion werden Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs)
inkorporiert, um ein DNA-Fragment zu bilden, bis ein kettenterminierendes
bzw. -abbrechendes Mittel, zum Beispiel ein Didesoxynukleotidtriphosphat (ddNTP)
inkorporiert wird. Das Inkorporieren eines ddNTPs verhindert eine
weitere DNA-Synthese (ein Verfahren, das als Kettentermination bzw:
Kettenabbruch bezeichnet wird). Die Größe eines jeden synthetisierten DNA-Fragmentes
in diesem Verfahren wird dann durch eine Gelelektrophorese bestimmt
und diese Information wird verwendet, um die Sequenz von Nukleotiden
in der ursprünglichen
DNA-Matrize zu bestimmen. Es beschreiben zum Beispiel Tabor und
Richardson USP 4 795 699 ein Sequenzierungsverfahren in zwei Schritten, in
welchem ein unmarkierter Primer in einem Markierungsschritt markiert
wird und dann in der Anwesenheit von dNTPs im Überschuß und einem ddNTP in einem
Kettenabbruchschritt verlängert
wird. In dem Markierungsschritt wird eine niedrige Konzentration
von dNTPs bereitgestellt (von denen eines markiert ist), um eine kleine
Menge an Primerverlängerung
zu gestatten
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In dem Didesoxysequenzierungsverfahren
kann der Primer markiert sein, zum Beispiel mit 32P
durch ein Verfahren unter Verwendung einer Polynukleotidkinase.
Eine solche Markierung gestattet den Nachweis von verlängerten
Primern nach einer Gelelektrophorese durch eine Autoradiographie
des resultierenden Gels. Alternativ kann ein markiertes dNTP inkorporiert
werden während
des Verfahrens der DNA-Synthese, und das Vorhandensein von solchen
markierten dNTPs wird durch eine Autoradiographie oder durch andere
Mittel nachgewiesen. Zu diesem Zweck kann das dNTP entweder radioaktiv
mit 32P oder 35S
markiert sein. In einem anderen Verfahren kann der Primer mit einer
oder mehreren fluoreszenten Einheiten für den Nachweis durch Fluoreszenz
markiert sein. In noch einem anderen Verfahren kann das ddNTP markiert
sein, zum Beispiel mit einer Fluoreszenzmarkierung.
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Beispiele für diese Verfahren werden bereitgestellt
in den folgenden Publikationen:
Murray, 17 Nucleic Acid Research,
8889, 1989, beschreibt die Verwendung eines 32Pmarkierten
Primers. Der Primer wurde markiert unter Verwendung einer Polynukleotidkinase
und gamma-32P-ATP.
Higuchi und Ochman,
17 Nucleic Acid Research 5865, 1989, beschreiben die Verwendung
eines Kinase-markierten Primers für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten,
hergestellt durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR). Die PCR ist
ein Verfahren zur Amplifikation einer gewünschten Nukleinsäure durch
die Verwendung von zwei Primern, welche durch eine DNA-Polymerase
verlängert
werden, um ein Paar von DNA-Fragmenten, komplementär zu der
gewünschten
Nukleinsäure,
herzustellen. Diese Fragmente hybridisieren dann, um die gewünschte DNA
bereit zu stellen. Dieses Verfahren wird 15–30 Mal wiederholt. Falls eine
temperaturstabile DNA-Polymerase verwendet wird, wird das Verfahren
am besten zyklisch durchgeführt
durch das Halten der Temperatur der Reaktion alternativ bei einer
Temperatur, welche für
die Primerverlängerung
geeignet ist (70°–75°C) und dann
bei einer Temperatur, welche für
eine Denaturierung geeignet ist (90°–100°C), um die DNA-Fragmente zu
trennen und für
eine Matrize für
den nächsten
Zyklus zu sorgen, und dann bei einer Temperatur, welche geeignet
ist für
ein Annealen bzw. Anlagern (42–55°C), um die
Primer an die Matrize zu binden.
Straus und Zagursky 10, BioTechniques
376, 1991, beschreiben die Verwendung von α-32P-dATP
in einer Sequenzierungsreaktion. Smith et al:, 9 BioTechniques 52,
1990, und Adams-Blakesley 13 Focus 56, 1991, beschreiben die Sequenzierung
von PCR-Produkten unter Verwendung eines markierten Primers.
Khrishnan
et al., 19 Nucleic Acid Research 1153, 1991, beschreiben die Verwendung
eines markierten Primers für
die Sequenzierung von Lambda-DNA. Das Verfahren des Kettenabbruchs
wird mehrere Male wiederholt (oder zyklisch durchgeführt), um
die Herstellung einer großen
Anzahl von Produkten zu gestatten. Diese zyklische Durchführung ist einer
PCR ähnlich,
da man die Reaktion bei 42°C
bis 55°C
voranschreiten läßt, dann wird
sie bei 95°C
gestoppt und wiederum bei 42°C
bis 55°C
gestartet (das Verfahren wird thermischzyklische bzw. Thermalzyklus-Sequenzierung
(thermal cycle sequenzing)) genannt. Kein neues Reagenz muß zugegeben
werden, wenn das Verfahren einmal gestartet ist. Die zyklische Durchführung stellt
sicher, daß eine
große Anzahl
des markierten Primers in den Schritten des Kettenabbruchs verlängert wird.
Spurgeon
and Burke, Abstract 125, Human Genome II, 22. Oktober 1990, beschreiben
die Verwendung einer modifizierten Taq-DNA-Polymerase für eine thermisch
zyklische Sequenzierung in welcher ein endmarkierter Primer oder
ein unmarkierter Primer verwendet wird. Fluoreszenz-markierte ddNTPs
und radioaktive Markierungsverfahren wurden ebenfalls verwendet.
Mead
et al., Abstract Nr. 99, Human Genome II, 22. Oktober 1990 beschreiben
die Sequenzierung von Lambda-DNA in einer auf der Polymerasekettenreaktion
basierenden Reaktion, unter Verwendung von Radioisotopen und Fluoreszenzmarkierungen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Diese Erfindung stellt ein neuartiges
DNA-Sequenzierungsverfahren vor, in welchem ein unmarkierter Primer
in einer Markierungsreaktion verlängert wird, durchgeführt auf
eine zyklische Weise. Solch ein Verfahren ist vorteilhaft gegenüber der
früheren
Verwendung von 32P-endmarkierten Primern
(hergestellt unter Verwendung von Polynukleotidkinase und γ-32P-ATP)
da keine zusätzlichen
Reagenzien (z. B. Polynukleotidkinase und γ-32P-ATP)
erforderlich sind, gegenüber
den gewöhnlichen
Sequenzierungsreagenzien, das Verfahren der Herstellung von markierten
Primern nicht erforderlich ist, und da der verwendete Apparat in
dem Verfahren identisch mit demjenigen ist, welcher für das thermisch
zyklische Sequenzieren verwendet wird, können die beiden Verfahren in
bequemer Weise gemeinsam verwendet werden. Dieses Verfahren erlaubt
die Verwendung von Markierungen, welche sonst nicht verwendbar sind
mit einer Polynukleotidkinase, wie α-35S-dNTPs, fluoreszenten
Nukleotiden und Nukleotiden, welche mit anderen nützlichen
Einheiten wie Biotip markiert sind.
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Die kritische Eigenschaft der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem markierten Nukleotid
in einem zyklisch durchgeführten
Markierungsschritt. Diesem folgt im allgemeinen ein zyklischer Terminations-
bzw. Abbruchschritt. Das wiederholte zyklische Durchführen einer
geprimten DNA-Synthese resultiert in der Herstellung von viel mehr
neu synthetisierten Molekülen
an DNA als Molekülen
der Matrizen-DNA, welche für
die Sequenzierung verwendet wird. Daher ist, während eine Sequenzierung unter Verwendung
herkömmlicher
Mengen an Matrize (0,5 bis 1,0 pMol) dann möglich ist, wenn nur eine einzige
Runde replikativer Synthese durchgeführt wird, eine Sequenzierung
unter Verwendung von weniger Matrizen-DNA (z. B. 0,05 pMol) ohne
einen zyklischen Schritt schwierig. Wiederholtes zyklisches Durchführen des
Markierungsschrittes unter Verwendung beschränkter Mengen an Matrize erhöht die Menge
an Produkt auf ein Niveau, welches hinreichend für normale Nachweisverfahren
ist, wie eine Autoradiographie mit einer Exposition über Nacht.
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In dem Verfahren sind höchstens
drei von den vier erforderlichen dNTPs für eine Sequenzierungsreaktion
in dem Markierungsschritt vorhanden, wobei eines oder mehrere von
ihnen markiert ist, bzw. sind. Dies markiert in einer wirksamen
Weise den Primer und beschränkt
die Verlängerung
auf eine bekannte Länge
(d. h. auf eine Länge,
wo das fehlende dNTP für
eine weitere Synthese erforderlich ist). In dem Verfahren wird die Reaktion
zyklisch durchgeführt
zwischen einer Temperatur, welche für eine Kettenverlängerung
geeignet ist und einer, welche für
eine Denaturierung des verlängerten
Primers und der Matrizenmoleküle
geeignet ist, im allgemeinen 10–100
mal während
einer Periode von einer Stunde und eineinhalb Stunden bis zu sechs
Stunden. Nach diesem Markierungsschritt wird die Reaktion im allgemeinen
in vier Teile geteilt, und eine geeignete Mischung für den Kettenabbruch
einschließlich
des fehlenden dNTP wird zu der Reaktionsmischung hinzugefügt und zwischen
10 und 200 Mal bei geeigneten Temperaturen für die Primerverlängerung
und die Denaturierung zyklisch durchgeführt. Keine zusätzliche
DNA-Polymerase ist in diesem Schritt erforderlich, und die Reaktion
kann in 1,5 bis 16 Stunden vollständig durchgeführt werden.
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Das Verfahren dieser Erfindung gestattet
eine Sequenzierung von so wenig wie 0,01 Mikrogramm (0,005 pMol)
von M13-DNA mit einer Exposition von 18 bis zu 36 Stunden für radioaktiv
markiertes (35S) Material. Für doppelsträngige Plasmide
kann die Sequenzinformation aus so wenig wie 0,03 μg (0,015
pMol) ohne eine vorausgehende Denaturierung der Plasmid-DNA mit
Alkali erhalten werden. Zusätzlich
können.
verläßliche Sequenzdaten
in direkter Weise aus einem einzelnen Plaque von M 13 erhalten werden,
ohne weiteres Wachstum des Phagen durch einfaches Picken des Plaques
in ein Reaktionsgefäß und das
Zugeben der geeigneten Reagenzien. Zusätzlich können Sequenzen aus einzelnen
Kolonien von Bakterien, welche Plasmide mit dem fl-Replikationsursprung
(Origin) enthalten, erhalten werden (z. B. pTZ18R oder pUC118) mit
einem Helferphagen (M13 KO7) oder selbst aus Plasmiden ohne einen
Helferphagen.
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Weil die Erfindung die Sequenzierung
von kleinen Mengen an Matrize gestattet, ist die Notwendigkeit, Klone
wachsen zu lassen und DNA aus ihnen aufzureinigen, nicht notwendig,
und die Möglichkeit,
Verunreinigungen in die Sequenzierungsreaktion gemeinsam mit der Matrizen-DNA
hinein zu bringen, ist daher verringert. Zusätzlich gibt es, weil die DNA
in einer effektiven Weise durch dieses Verfahren endmarkiert wird,
wenig systematische Variation in der Intensität der Banden und keine Tendenz,
daß die
Sequenzen am Boden bzw. am unteren Ende eines Autoradiogramms eines
Sequenzierungsgels blasser werden.
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Darüber hinaus gestattet die Erfindung
die Sequenzierung von Plasmid- und anderen doppelsträngigen DNA-Matrizen
ohne eine vorausgehende Denaturierung unter Verwendung von Alkali.
Diese Denaturierungsverfahren sind mühsam, erfordern eine Stunde
oder mehr einer fachgerechten Manipulation zur Denaturierung und
eine nachfolgende Präzipitation.
Daher gestattet die Erfindung die Sequenzierung von DNA unter Verwendung
eines bestehenden Apparates mit geringen Modifikationen zu dem Verfahren,
welches notwendig ist, um die beanspruchte DNA-Sequenzierungsreaktion
durchzuführen.
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Daher stellt in einem ersten Aspekt
die Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA vor, welches
die folgenden Schritte einschließt: Das Bereitstellen eines
Polynukleotidprimers, komplementär
zu einem Bereich der DNA, das Bereitstellen der DNA, die sequenziert
werden soll, und das In-Kontakt-Bringen des Primers und der DNA
mit einander in Gegenwart einer DNA-Polymerase und zwischen 1 und
3 dNTPs, wobei mindestens eines dieser dNTPs markiert ist. Der Primer
und die DNA werden unter Bedingungen mit einander in Kontakt gebracht,
welche die Verlängerung
des Primers durch Anfügen
von einem oder mehreren der dNTPs an das 3'-Ende des Primers gestatten,
um einen verlängerten
Primer zu bilden. Der Primer und die DNA werden dann dissoziiert
oder getrennt, im allgemeinen durch Erwärmen, und die Kontaktierungs-
und Trennschritte werden mehrere Male wiederholt (gewöhnlich 10
bis 200 Mal). Schließlich
wird der verlängerte
Primer mit der DNA in Gegenwart einer DNA-Polymerase in Kontakt
gebracht (welche im allgemeinen dieselbe Polymerase ist wie die
in dem anfänglichen
Markierungsschritt verwendete), allen vier dNTPs und einem Kettenterminationsmittel
bzw. einem Kettenabbruchmittel.
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In bevorzugten Ausführungsformen
ist die DNA-Polymerase Taq-DNA-Polymerase (z. B. eine Form der Taq-Polymerase,
welcher eine 5'-3'-Exonukleaseaktivtität fehlt), eine niedrige Exonukleaseform
von T7-DNA-Polymerase (siehe Tabor und Richardson USP Nr. 4 795
699) Klenow, AMV-reverse Transkriptase, Bst-, Tth- oder Vent-DNA-Polymerase
oder exofreie Formen solcher Polymerasen; das dNTP ist mit 35S oder einer fluoreszenten, chemiluminiszenten
oder anderen Markierung (z. B. welche nachweisbar ist als ein Ligand für einen
indirekten Enzym-verknüpften
Assay, z. B. Biotin) markiert; und auf den letzten Kontaktierungsschritt in
Gegenwart eines Kettenterminationsmittels folgt ein Trennschritt,
durch welchen der verlängerte
Primer von der DNA getrennt wird und diese zwei Schritte werden
mehrfach wiederholt (z. B. zwischen 30 und 200 Mal) bis etwa 0,1
bis 1,0 pMol (bevorzugtermaßen
0,5 pMol) von markiertem, verlängertem
Primer, welcher durch ein Didesoxynukleotid an seinem 3'-Ende terminiert
ist, hergestellt wurde.
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In anderen bevorzugten Ausführungsformen
wird das Verfahren verwendet zur Sequenzierung von:
gereinigter
M13-DNA (einzelsträngig,
ss),
gereinigter Plasmid-DNA (doppelsträngig, ds),
gereinigter
Lambda-DNA (ds),
M13-DNA von einem Plaque oder aus Flüssigkultur
(ss),
Plasmid-DNA von einer Kolonie oder aus Flüssigkultur
(ds),
Plasmid-mit-fl-ori, bevorzugtermaßen infiziert mit einem Helferphagen
aus einer Kolonie (ss),
PCR-Produkt, z. B. Gel-gereinigt (ds);
PCR-Produkt
behandelt mit w/ExoI und Alk. Phos. (ds),
Asymmetrischem PCR-Produkt,
behandelt mit Alk. Phos. (ss), gereinigter Cosmid-DNA, und
DNA
aus anderen Quellen z. B. Hefe oder bakterieller genomischer DNA
oder anderer Phagen-DNAs.
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Andere Eigenschaften und Vorteile
der Erfindung werden offensichtlich aus der folgenden Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
davon und aus den Ansprüchen.
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Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
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Die Zeichnungen werden zuerst kurzbeschrieben.
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Zeichnungen
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1 ist
eine Darstellung eines DNA-Sequenzierungsverfahrens dieser Erfindung
als Diagramm ,
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2-7 sind Kopien von Autroradiogrammen, welche
aus DNA-Sequenzierungsexperimenten erhalten wurden, unter Verwendung
einer Vielfalt von Bedingungen, die nachstehend beschrieben werden,
und
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8 ist
ein Graph von Daten aus einem Applied Biosystems Instrument, welcher
die Ergebnisse eines Sequenzierungsexperimentes zeigt.
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Es folgen Beispiele von Methoden
der Erfindung. Diese Beispiele sind nicht beschränkend in der Erfindung und
Fachleute werden erkennen, daß in
den Reaktionen verwendete Bestandteile leicht mit äquivalenten
Reagenzien, welche im Fachbereich bekannt sind, substituiert werden
können.
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Methoden
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Unter Bezug auf die 1, besteht der erste Schritt in dem Verfahren
darin, die Sequenz der Matrize zu untersuchen (gewöhnlicherweise
Vektorsequenz) und eine Kombination von Primer und Markierungsnukleotiden
auszuwählen.
Der Primer wird nach Standardkriterien ausgewählt, welche im Fachbereich
gut bekannt sind, um die DNA-Synthese nahe an der Sequenz, die von
Interesse ist, zu primen. Der Primer ist typischerweise ein synthetisches
Oligonukleotid von 16 bis 25 Nukleotidbasen Länge.
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Eine Mischung von drei Nukleotiden
(von den möglichen
vier: dATP, dCTP, dGTP und dTTP) wird wie folgt ausgewählt: der
erste Platz, an dem dAMP stromabwärts von dem 3'-Ende des Primers
inkorporiert wird, wird lokalisiert. In einer ähnlichen Weise werden die ersten
Stellen für
die Inkorporation von dGMP, dCMP und dTTP gefunden. Eine von diesen
Stellen wird weiter von dem Primer entfernt sein als alle anderen.
Das Nukleotid, welches an dieser Stelle erforderlich ist, wird während der
Markierungsphase des Protokolls ausgelassen (dCTP in der 1). Eines oder mehrere der
restlichen Nukleotide muß markiert
sein (z. B. α32P, α-35S oder ein fluoreszentes Molekül). Eine
Kombination wird so ausgewählt,
daß ,
mindestens zwei markierte Nukleotide vor einer Termination an dem
Punkt inkorporiert werden, wo das fehlende Nukleotid die Verlängerung terminiert.
In der 1 werden vier
dAMP-Nukleotide inkorporiert vor der ersten Stelle, an der dCMP
erforderlich wäre.
Daher ist ein markiertes dATP in diesem Beispiel eine gute Wahl.
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Eine geeignete Kombination von Primer
und Nukleotidmischung kann gewöhnlich
ohne Schwierigkeiten gefunden werden, Vektoren können jedoch in einer spezifischen
Weise für
eine optimale Markierung von Sequenzen konstruiert werden. Falls
notwendig kann die Wahl, welches dNTP der Markierungsmischung auszulassen
ist, empirisch durch das Lauferlassen von Testmarkierungen bestimmt
werden.
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Beispiel 1: Sequenzierung
mit gereinigter M13-DNA oder gereinigter Plasmid-DNA
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Die folgenden Bestandteile wurden
zu einem Mikrozentrifugenreaktionsgefäß (0,4 ml) zugegeben, welches
in einer Thermocycler-Maschine. (z. B. Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler)
eingefügt
war: 0,005 pMol oder mehr M13-DNA (z. B M13mp18, 0,01 μg) oder 0,03 μg doppelsträngige Plasmid-DNA
(z. B. pUC19), 2 μl ΔTAQ-Reaktionspuffer
(United States Chemical Corporation, Cleveland, Ohio, 260 mM Tris-HCl
pH 9,5, 65 mM MgCl2), 1 μl 3,0 μM dGTP, 1 μl 3,0 μM dTTP, 0,5 μl (5 μCi) von [α-35S]-dATP
(etwa 1200 Ci/mMol), 1 μl -40-Primer
(0,5 μM,
0,5 pMol/μl,
5'GTTTTCCCAGTCACGAC-3'),
2 μl ΔTAQ-DNA-Polymerase, 32 U/μl (von United
States Biochemical Corporation, Cleveland, OH, in 20 mM Tris (pH
8,5), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5% TWEEN-20
und 50% Glycerol, achtfach verdünnt
in Verdünnungspuffer
(10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5% TWEEN-20, 0,5%
NP-40)), und Wasser zu einem Gesamtvolumen von 17,5 μl.
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Diese Bestandteile wurden gemischt
und mit 10 μ1
leichtem Mineralöl. überschichtet
(United States Biochemical Corporation). Das Reaktionsgefäß wurde
in den Thermocycler plaziert und 30 bis 100 Zyklen (mehr als 60
Zyklen sind nicht notwendig) von 45°C während 1 Minute bis 70°C während 0,5
Minuten durchgeführt
(die Temperaturen können
zyklisch von 55°C
bis zu 70°C,
falls gewünscht,
durchgefürt
werden, oder selbst eine konstante Temperatur von etwa 62°C kann aufrechterhalten
werden (abhängig
von der Schmelztemperatur des Primers und der Matrize, die sequenziert
werden soll). Eine solche isotherme Markierung ist möglich, dauert
aber ebenso lange, um vollständig
durchgeführt
zu sein (etwa 4–6
Stunden) wie bei zyklisch durchgeführten Temperaturen). Die Temperaturen
können
eingestellt werden, falls die Schmelztemperatur des Primers/ der
Matrize in einer signifikanten Weise höher oder niedriger ist, aber
diese Temperaturen funktionieren für die meisten Primer/Matrizen
gut. Eine Temperatur von 95°C
kann anstelle von 70°C
mit äquivalenten Ergebnissen
verwendet werden. Dieser Schritt kann in etwa 3 Minuten pro Zyklus
durchgeführt
werden.
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Vier Reaktionsgefäße, wurden als A, C, G und
T markiert, und mit 4μl
der entsprechenden ΔTAQ-Terminationsmischung
gefüllt:
ddA-Terminationsmischung (jeweils 15 μM von dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
300 μM ddATP),
ddT-Terminationsmischung (jeweils 15 μM von. dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
450 μM ddTTP),
ddC-Terminationsinischung (jeweils 15 μM von dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
225 μM ddCTP),
ddG-Terminationsmischung (jeweils 15 μm von dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
22,5 μM
ddGTP) (United States Biochemical Corporation, Cleveland OH). Kein
zusätzliches
Enzym wird zu den Terminationsreaktionsgefäßen hinzu gegeben. Das eingebrachte
Enzym aus dem vorhergehenden Schritt ist ausreichend.
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Die zyklisch durchgeführte Markierungsreaktion
wurde gleichmäßig unter
den vier Terminationsreaktionsgefäßen aufgeteilt (4 μl für jedes
Terminationsrekationsgefäß) und mit
10 μl leichtem
Mineralöl überschichtet.
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Die vier Reaktionsgefäße wurden
in den Thermocycler plaziert und 30 – 200 Zyklen (mehr als 60 Zyklen
sind nicht notwendig) wurden von 95°C während 15 Sekunden, 55°C während 30
Sekunden und 72°C während 120
Sekunden durchgeführt.
Dieser Schritt wurde bequemerweise über Nacht vollständig durchgeführt. Andere
Zeiten und Temperaturen sind ebenfalls wirksam.
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Sechs μl der Reaktionsmischung wurden
entfernt (unter Vermeidung von Öl),
3 μl Stoplösung (95% Formamid,
20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylencyanol FF) wurden hinzu
gegeben und kurz auf 70°C
bis 80°C
direkt vor dem Laden auf ein Sequenzierungsgel erwärmt. Autoradiogramme
erforderten eine 18 bis 36 Stunden dauernde Exposition unter Verwendung
von Kodak XAR-5 Film.
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Unter Bezug auf die 2 wurde
die angegebene Menge gereinigter M13mp18-DNA (0,001 bis 0,1 μg jeweils
in den Spuren E-A) sequenziert unter Verwendung des –40-Primers
und der Nukleotide, wie vorausstehend beschrieben. Der Markierungsschritt
wurde zyklisch 30 Mal durchgeführt
(45°C bis
95°C) und
der Terminationsschritt wurde 35 Mal zyklisch durchgeführt (95°C, 55°C und 72°C). Das Ergebnis
in der Spur F ist ein Beispiel, in welchem alle vier dNTPs während des
zyklisch durchgeführten
Markierungsschrittes vorhanden waren (jeweils 3 pMol).
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Wenn das vorausstehende Markierungsverfahren
ohne eine zyklische Durchführung
durchgeführt
wird (unter Verwendung des Standardprotokolls für den TAQuence Sequenzierungs-Kit,
United States Biochemical Corporation), ergeben 0,1 μg M 13mp
18 Matrizen-DNA
ein Autoradiogramm, in dem die Banden, welche die ersten 200 Basen
von dem Primer repräsentieren,
abwesend sind. Die Verwendung von weniger DNA ergibt eine noch blassere
Sequenz.
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Beispiel 2: Direkte Sequenzierung
eines M13 Plaques
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Ein M13 Plaque (M13mp18) wurde von
einer 18–36
Stunden lang inkubierten Platte unter Verwendung einer Pipettenspitze
mit einer großen Öffnung gepickt.
Mehr Phage kann erhalten werden durch die Verwendung einer Spitze,
wobei die Spitze zurückgeschnitten
ist, um die Öffnung
auf etwa 1,5 mm Durchmesser zu weiten. Eine kleine Menge von Softagar
hängt.
der Spitze an. Der Softagar wurde gut gemischt (durch wiederholtes
Aufsaugen und Ausstoßen
der Flüssigkeit
in der Pipette) mit 2 μl
des Reaktionspuffers und 10 μl
Wasser. Das Reaktionsgefäß wurde
verschlossen und 10 Minuten lang bei 95° bis 100°C erwärmt und schnell zentrifugiert,
um jedwede Kondensation zu sammeln. 12 μl wurden dann schnell (so daß sich der
Agar nicht verfestigt) für
die Sequenzierung entfernt. Das in dem Beispiel I vorgestellte Verfahren
wurde dann für
die Sequenzierung verwendet.
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Unter Bezug auf die 4 ist die DNA-Sequenz aus einem einzelnen
Plaque von M13mp18, gepickt aus einem Rasen von JM101 gezeigt. Die
DNA wurde aus dem Plaque extrahiert durch das Erwärmen in
Sequenzierungspuffer bei 95°C
bis 100°C
während
10 Minuten. Die DNA wurde sequenziert unter Verwendung des –40 Primers
und der Nukleotide wie vorausstehend beschrieben. Der Markierungsschritt
wurde 99 Mal zyklisch durchgeführt
(45°C bis
95°C) und
der Terminationsschritt wurde 198 Mal zyklisch durchgeführt (95°C, 55°C und 72°C).
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Beispiel 3: Direkte Sequenzierung
einer ein Plasmid enthaltenden Kolonie
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Eine Kolonie, welche einen Klonierungsvektor
enthält
(z.B. pUC19) wird aus einer 36 Sunden lang inkubierten Platte (L
Brühe)
unter Verwendung eines sterilen Drahtes oder einer Schlinge gepickt,
in 2 μl
Reaktionspuffer und 10 μl
Wasser suspendiert und gemischt. Die Kolonie wurde bei 95°C bis 100°C 20 Minuten
lang erwärmt,
kurz zentrifugiert, um den Abfall bzw. Debris zu sedimentieren und
12 μl der
Flüssigkeit
wurden für die
Sequenzierung entfernt. Das in dem Beispiel 1 vorgestellte Verfahren
wurde dann fir die Sequenzierung verwendet.
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Unter Bezug auf 3 sind
die Ergebnisse der zyklisch durchgeführten Markierungssequenzierung von
Plasmid(pUC19)-DNA gezeigt. Die angegebene Menge von gereinigter
pUC19-DNA (0,01–3 μg) wurde sequenziert
unter Verwendung des –40
Primers und von Nukleotiden, wie vorausstehend beschrieben: Der Markierungsschritt
wurde 85 Mal zyklisch durchgeführt
(45°C bis
95°C) und
der Terminationsschritt wurde 198 Mal zyklisch durchgefihrt (95°C, 55°C und 72°C).
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Beispiel 4: Direkte Sequenzierung
einer ein Plasmid enthaltenden und mit einem Helferphagen infizierten
Kolonie
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Die Infektion einer Zelle, welche
ein Plasmid mit dem fl-Ursprung (origin) enthält, mit einem Helferphagen
resultiert in der Produktion großer Mengen von phagenartigen
Partikeln, welche einen Strang der Plasmid-DNA enthalten. (Der hergestellte
Strang wird durch die Orientierung des fl-Ursprungs bestimmt). Diese werden
aus der Zelle sezerniert.
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Helferphagenpartikel werden ebenfalls
in einer geringeren Menge hergestellt (aufgrund einer Veränderung
in dem Ursprung des Helferphagen) aber diese werden nicht mit dem
verwendeten Primer sequenziert. Daher ist, wenn eine Kolonie mit
einem Helferphagen infiziert ist, mehr Plasmid-DNA (aber nur ein
Strang) fir die Sequenzierung verfügbar. Die Plasmid-Sequenzierung
aus einer einzelnen Kolonie ist gering, möglicherweise weil es schwer
ist, ausreichende Matrizen-DNA routinemäßig zu erhalten. Eine Infektion
mit einem Helferphagen erzeugt mehr Matrize, was das Sequenzieren
möglich
macht.
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Der Wirtsstamm JM101 wurde mit einem
Plasmid-Vektor (pTZ18U, Mead et al., 13 Nucleic Acid Research 1103,
1985) transformiert, welcher den Replikationsursprung von dem Bakteriophagen
f1 enthält.
Nach einer Inkubation der kompetenten Zellen mit dem Plasmid bei
0°C (45
Minuten) und 42°C
(2 Minuten) wurden die Zellen in L Brühe verdünnt und bei 37°C 30 Minuten
lang inkubiert. Der M13 Helferphage M13KO7 (Vierra und Messing,
153 Meth. Enz. 3, 1987; 10 μl
von 1010 pfu/ml (bzw. Plaque forming Units
bzw. Plaque bildenden Einheiten/ml) wurden zugegeben, und die Inkubation
wurde bei 37°C
20 Minuten lang fortgesetzt. Die Transformanten wurden dann auf
Medium, welches Ampicillin und Kanamycin enthielt, ausplattiert.
Nach einer Inkubation während
18–36
Stunden wurde eine einzelne Kolonie gepickt.
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Eine Kolonie von einer 18–36 Stunden
lang inkubierten Platte wurde gepickt unter Verwendung eines sterilen
Drahtes oder einer Schlinge, in 2 μl Reaktionspuffer suspendiert
und 10 μl
Wasser und gut gemischt. Die Mischung wurde bei 95°C bis 100°C 20 min
lang erwärmt.
Alternativ wurde sie bei 37°C
30 Minuten lang erwärmt,
kurz zentrifugiert und der Überstand
bei 95°C
bis 100°C
10 Minuten lang inkubiert. Der Überstand wurde
dann kurz zentrifugiert, um den Abfall zu sedimentieren und 12 μl wurden
fir die Sequenzierung wie vorausstehend entfernt.
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Unter Bezug auf die 5 ist die DNA-Sequenz aus einer einzelnen
Kolonie von pTZ18U enthaltenden, mit M13KO7 infizierten 7M101 gezeigt.
Die DNA wurde aus der Kolonie extrahiert durch das Erwärmen in
Sequenzierungspuffer bei 95°C
bis 100°C
während
10 Minuten. Die DNA wurde sequenziert unter Verwendung des –40 Primers
und der Nukleotide wie vorausstehend beschrieben. Der Markierungsschritt
wurde 99 Mal zyklisch durchgeführt
(45°C bis
95°C) und
der Terminationsschritt wurde 198 Mal zyklisch durchgeführt (95°C, 55°C und 72°C).
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Beispiel 5: Sequenzierung
von DNA extrahiert aus dem Bakteriophagen Lambda
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Gereinigte DNA aus dem Bakteriophagen
Lambda (1 μg
in 5 μl
H2O) wurde mit 1 μl (0,5 pMol) Primer gemischt
(SEQ.ID Nr. 1:5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC, den Basen 7630–7606 in
dem Bakteriophagen Lambda entsprechend), 2 μl ΔTAQ-Puffer, 1 μl 3 μM dGTP, 1 μl 3 μM dTTP, 0,5 μl α-35S-dCTP (1200 Ci/mMol, 10 μCi/μl) und mit
verdünnter ΔTAQ-DNA-Polymerase
(2μl 4 U/μl) und 5 μl H2O für
ein Gesamtvolumen von 17,5 μl.
Diese Mischung wurde in den DNA Thermal Cycler bei 50°C 60 Sekunden
lang inkubiert, dann 90°C
während
30 Sekunden während
99 Zyklen. Unter Verwendung dieser Mischung von Nukleotiden wurde
der Primer 7 Basen mit der Sequenz (SEQ ID. Nr. 2: TCCCGTT, wobei
die Cs markiert waren) verlängert.
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Die Mischung wurde dann in vier Teile
geteilt, wobei ein Teil mit 4 μl
ddGTP Terminationsmischung kombiniert wurde (jeweils 15 μM von dATP,
dCTP, dGTP, dTTP; 33,5 μM
ddGTP), ein zweiter mit 4 μl
ddATP Terminationsmischung (jeweils 15 μM von dATP, dCTP, dGTP, dTTP;
300 μM ddATP),
der dritte mit 4 μl
ddTTP Terminationsmischung (jeweils 15 μM von dATP, dCTP, dGTP, dTTP;
450 μM ddTTP)
und der vierte mit 4 μl ddCTP
Terminationsmischung (jeweils 15 μM
von dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 225 μM
ddCTP). Die Mischungen wurden mit 10 μl Mineralöl überschichtet und die Reaktionsgefäße wurden
verschlossen. Diese vier Reaktionsgefäße wurden dann in den Thermal
Cycler plaziert und 198 Zyklen bei 95°C ,15 Sekunden lang, 55°C, 30 Sekunden
lang und 72°C
120 Sekunden lang unterzogen.
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Nach der Vervollständigung
der Zyklen über
Nacht, wurden 6 μl
der wäßrigen Phase
aus jedem Reaktonsgefäß entfernt
und 3 μl
Stoplösung
(95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylencyanol
FF) zugegeben. Die Mischungen wurden auf 75°C 2 Minuten lang erwärmt und
dann auf einem Sequenzierungsgel aufgetragen. Die Sequenzierung
erforderte nur 1 bis 2 μg
(0,03–0,05
pMol).
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Unter Bezug auf die 6,
ist die Sequenz von DNA aus Bakteriophagen Lambda-DNA unter Verwendung
eines zyklisch dwchgeführten
Markierungsschrittprotokolls gezeigt. 0,5 bis 5 μg Lambda-DNA wurden verwendet,
wie in der Figur angegeben. Das gezeigte Autoradiogramm ist das
Ergebnis einer Exposition von 60 Stunden.
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Beispiel 6: Sequenzierung
von DNA hergestellt durch eine Polymerasekettenreaktion
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Nach einer vollständigen Durchführung einer
Polymerasekettenreaktion enthält
die Reaktionsmischung immer noch Primer im Überschuß, dNTPs und unspezifisch amplifizierte einzelsträngige DNAs.
Diese werden typischerweise von dem gewünschten doppelsträngigen Produkt
durch eine Präzipitation,
eine Gelreinigung oder andere physikalische Methoden entfernt. Diese
Verfahren sind gewöhnlich
zeitaufwendigund erfordern manuelle Manipulationen für die Zentrifugationen
oder Gelelektrophorese. Ich habe gefunden, daß die nicht wünschenswerte
einzelsträngige
DNA und die Primer entfernt werden können durch eine kurze Inkubation
mit Exonuklease I. In einer ähnlichen
Weise können
die dNTPs im Überschuß (welche
mit dem Markierungsanteil des Sequenzierungsverfahrens interferieren
würden)
entfernt werden durch eine gleichzeitige Behandlung mit allcalischer
Phosphatase. Beide Enzyme können
durch ein kurzes Erwärmen
inaktiviert werden. Anschließend
kann das PCR-Produkt sequenziert werden unter Verwendung der in
dem Beispiel 1 vorgestellten Verfahren.
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In spezifischer Weise wurde eine
PCR durchgeführt
wie vorgestellt in dem Perkin-Elmer
Cetus GENEAMP Kit unter Verwendung von 200 μM dNTPs, 100 pMol von jedem
Primer, 1 ng Matrizen-DNA und Puffer in einem Gesamtvolumen von
100 μl.
Die Matrizen-DNA
war pT7L-21 (ein Klon eines modifizierten Tetrahymena Ribozyms in
pUC 18; Zaug et al., 27 Biochemistry 8924-8931, 1988) und die Primer
waren –40
Universalsequenzierungsprimer (SEQ. ID. Nr. 3: 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC)
und der reverse Sequenzierungsprimer (SEQ. ID. Nr. 4: 5'TTCACACAGGAAACAG).
Diese Primer ergeben ein Produkt von 518 Nukleotiden Länge. Die
Polymerasekettenreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 30
Zyklen bei 94°C
während
1 Minute, 37°C
während
1 Minute und 72°C
während
2 Minuten.
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Ein Aliquot (10 μl) der PCR-Mischung wurde entfernt.
Exonuklease I (USB Produkt Nr. 70013; 1 μl von 10 U/μl) und alkalische Phosphatase
aus Garnelen (USB Produkt Nr. 70092; 1 μl von 1U/μl) wurden zugegeben. Diese Mischung
wurde bei 37°C
15 Minuten lang . inkubiert, gefolgt von einer Hitzeinaktivierung
bei 70°C während 15
Minuten. Diese Mischung wurde auf 200 bis 2000 μl mit TE-Puffer verdünnt (10
mM Tris-HCl, pH 7,5 ,1 mM EDTA) und 10 μl wurden für eine Zyklussequenzierung
gemäß dem Verfahren
von Beispiel 1 unter Verwendung des –40-Primers verwendet. Kontrollexperimente,
in welchen die Behandlungen mit entweder Exonuklease I oder mit
allcalischer Phosphatase aus Garnelen ausgelassen wurde, versagten
dabei, für
gute Sequenzdaten zu sorgen.
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Unter Bezug auf die 7 ist
die DNA-Sequenz eines Produktes einer Polymerasekettenreaktion unter
Verwendung eines zyklisch durchgeführten Makierungsschrittprotokolls
gezeigt. Der Markierungsschritt wurde 65 Mal zyklisch dürchgeführt (45°C bis 70°C) und der
Terminationsschritt wurde 198 Ma1 zyklisch durchgeführt (95°C, 55°C und 72°C). Aliquots
der PCR-Reaktionsmischung wurden mit der Exonuklease I behandelt
(Spuren A und C) und/oder mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen
(Spuren B und C), wie vorausstehend beschrieben oder nicht behandelt
(Spur D). Die Enzyme wurden dann hitzeinaktiviert und die DNA zwanzigfach
verdünnt.
Dies wurde als Matrize (10 μl)
unter Verwendung von –40-Primer und Nukleotiden,
wie vorausstehend beschrieben, verwendet. Eine Vorbehandlung sowohl
mit der Exonuklease als auch mit der alkalischen Phosphatase ergibt
die beste Sequenz (C)
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Beispiel 7: Zyklussequenzierung
mit Fluoreszein-markiertem dUTP und Fluoreszenznachweis
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In diesem Beispiel wird die radioaktive
Markierung durch ein nichtradioaktives Fluoreszein-Markiertes Nukleotid
(Fluoreszein-dUTP), Boehringer Mannheim Biochemicals) ersetzt. Zyklussequenzen
ließ man
entweder unter Verwendung einzelsträngiger M13-DNA oder doppelsträngiger pUC18-Plasmid-DNA
als Matrize laufen. Den zyklisch durchgeführten Markierungsschritt ließ man unter
Verwendung des Universal (–40)
Sequenzierungsprimers in Gegenwart von dATP, dGTP und Fluoreszein-dUTP
laufen. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem Sequenzierungs-Elektrophoresegel,
montiert in einem ABI Modell 373A DNA-Sequenzierungsinstrument, angewendet,
welches Sequenzierungsprodukte durch Fluoreszenz nachweist.
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Für
den zyklisch durchgeführten
Markierungsschritt wurden 0,05 pMol (oder mehr) M13-DNA (0,125 μg) oder 36 μg doppelsträngige Plasmid-DNA
(pUC18), 2 μl ΔTaq Reaktionspuffer
(260 mM Tris-HCL, (pH 9,5), 65 mM MgCl2),
3 μl Fluoreszein-dUTP-Markierungsmischung
(10 μM Fluoreszein-dUTP,
1 μM dGTP,
1μM dATP)
1 μl „-40"-Primer (0,5 μM, 0,5 pMol/μl 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'),
2 μl ΔTaq-DNA-Polymerase
(8 U/μl)
(in 10 mM Tris-HCl, pH8,0, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5% TWEEN-20,
0,5% NP-40) und Wasser in einem Gesamtvolumen von 18 μl in einem
0,5 ml Reaktionsgefäß fir die
Mikrozentrifuge kombiniert, gut gemischt und mit 15 μl leichtem
Mineralöl überschichtet.
Das Reaktionsgefäß wurde
in den Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Co.) plaziert und 30 bis
50 Zyklen von 95°C
während
15 Sekunden und 60°C
während
30 Sekunden unterzogen.
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Diese Kombination von Bestandteilen
der Markierungsreaktion gestattete die Inkorporierung eines Maximums
von 3 Fluoreszein-dUTP-Molekülen
pro angelagertem Primer, da dCTP in der Polymerisierungsmischung,
wie nachstehend erläutert
fehlte.
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Vor dem Markierungsschritt
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Nach dem Markierungsschritt
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Auf die Markierungszyklen folgend
wurden vier Reaktionsgefäße mit A,
C, T und G markiert und mit 4 μl
der entsprechenden ΔTaq-Terminationsmischung
gefüllt.
Dann wurde die zyklisch durchgeführte
Markierungsreaktion in gleicher Weise unter den vier Terminationsreaktionsgefäßen aufgeteilt
(3,5 μl
zu jedem Terminationsreaktionsgefäß) und mit 15 μl von leichtem
Mineralöl überschichtet.
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Die vier Reaktionsgefäße wurden
in den Thermocycler plaziert und 30 bis 50 Zyklen wurden von 95°C während 30
Sekunden, 60°C
während
60 Sekunden und 72°C
während
60 Sekunden dürchgeführt. Die
Reaktionen wurden durch die Zugabe von 4 μl Stop-Lösung (95% Formamid, 20 mM EDTA)
zu den Terminationsreaktionen bereits unter Mineralöl gestoppt.
Diese Proben wurde kurz bei 75°C
bis 80°C
erwärmt
direkt vor dem Laden auf ein Sequenzierungsgel. Die Proben (5 μl) wurden
in vier neben einander liegende Spuren geladen (entsprechend einer
der vier Terminationsreaktionen ddA, ddC, ddG und ddT) auf einem
Sequenzierungsgel mit 6% Polyacrylamid und 7M Harnstoff. Die Elektrophorese
der Sequenzierungsreaktionsprodukte wurde durchgeführt unter
Verwendung des Applied Biosystems 373A DNA-Sequenzierungsinstrumentes über Nacht
während
16 Stunden und 35 Watt konstanter Energie. Ein hochsensitiver Fluorezenzdetektor,
welcher nahe am Boden bzw. unteren Ende des Gels plaziert ist, weist
die fluoreszierenden Banden von DNA, während sie durch die Elektrophorese
vorbeilaufen, nach. Die Fluoreszenzintensität aus jeder Spur wurde gesammelt unter
Verwendung der begleitenden ABI Computer-Software unter Verwendung
des Filterkanals, welcher für den
Nachweis von Fluoreszein optimal war. Diese Software wurde ebenfalls
verwendet, um die Daten zu normalisieren, indem man die Abweichung
von der Grundlinie (baseline drift) abzog.
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Die 8 zeigt
die Ergebnisse der Sequenzierung von M13mp18-DNA, indem sie die
Ergebnisse zeigt, welche den Bereich von 175 bis 217 Basen von 5'-Ende
des Primers abdecken. In dem Panel A sind die Rohdaten von vier
nebeneinander liegenden Spuren gezeigt: eine ddG-Reaktion, eine
ddC-Reaktion, eine ddA-Reaktion und eine ddT-Reaktion. Das untere
Panel B zeigt dieselben Ergebnisse nach einer Softwareanalyse, welche
die Hintergrundabweichung entfernt und die durchschnittlichen Spitzenhöhen normalisiert.
Die bekannte Sequenz der Matrizen-DNA in diesem Bereich ist oberhalb
der Spitzen gezeigt. Ein manueller Vergleich des Graphen und der
Sequenz zeigt an, daß das
Verfahren die Sequenz in korrekter Weise zeigte, von allen außer ein
oder zwei der Basen dieses Bereichs.
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Beispiel 8: Sequenzierung
asymmetrischer PCR-Produkte durch eine Vorbehandlung mit alkalischer
Phosphatase:
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Normalerweise wird die Polymerasekettenreaktion
(PCR) mit gleichen Konzentrationen von zwei Primern durchgeführt, was
zur geometrischen Amplifizierung der Sequenz zwischen ihren Anlagerungsstellen (annealing
sites) führt.
Im Prinzip kann jeder Zyklus die Menge von Produkt-DNA in der Reaktionsmischung verdoppeln.
Die Produkte solcher "symmetrischen" PCR-Reaktionen sind lineare
doppelsträngige
DNA-Moleküle.
Manchmal werden Primer zu den Amplifizierungsreaktionen in ungleichen
Konzentrationen zugegeben, mit einem Konzentrationsverhältnis von
10 : 1 bis zu 500 : 1. Solche „asymmetrischen"
PCR-Reaktionen laufen in einer normalen Weise während der ersten paar wenigen
Zyklen ab, indem sie eine in geometrischer Weise ansteigende Menge
an DNA-Produkt erzeugen.
Schließlich
ist der Vorrat des Primers mit der niedrigeren Konzentration erschöpft. Ab
diesem Punkt haben Amplifizierungszyklen nur einen einzigen Primer
zur Verfügung, so
erzeugen sie nur einen Strang von DNA-Produkt. Die Konzentration
dieses einzelsträngigen
Produktes steigt in linearer Weise mit zusätzlichen Zyklen an. Daher bestehen
die Reaktionsprodukte aus einer relativ kleinen Menge doppelsträngiger linearer
DNA und einer größeren Konzentration
einzelsträngiger
linearer DNA. Diese einzelsträngige
DNA kann als eine Matrize für
eine DNA-Sequenzierung verwendet werden.
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Gyllensten und Erlich,85 Proc. Natl.
Acad. Sci USA 7652 (1988), beschreiben ein Verfahren zur Sequenzierung
der einzelsträngigen
Produkte von einer asymmetrischen PCR. Das Verfahren erfordert die
Verwendung eines Ultrafilters in einer Zentrifuge, gefolgt von Trocknen
der konzentrierten DNA. Dieses Verfahren dauert mehrere Stunden
zur voll-ständigen Durchführung und
die Verwendung des Filters macht es teuer. Andere (Brow, S. 189
in „PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press
1990) haben die Verwendung von einer Alkoholpräzipitation beschrieben, um
die DNA vor dem Sequenzieren zu reinigen. Wiederum dauert dieses
Verfahren einige Stunden zur vollständigen Durchführung. Sie
schlagen eine Alternative vor, welche keine DNA-Reinigung erfordert,
aber welche die Verwendung von markiertem Primer erfordert und verminderte
Konzentrationen – von
dNTPs in dem PCR-Verfahren. Das Markieren des Primers ist ein zusätzlicher
zeitaufwendiger und teuerer Schritt, insbesondere falls man nur
einige wenige Sequenzen laufen läßt.
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Die Reinigung oder andere Schritte
ist bzw. sind notwendig, da die dNTPs, welche für die PCR verwendet werden,
mit dem Sequenzierungsverfahren interferieren. Der Anmelder hat
gefunden, daß diese
dNTPs weitaus schneller entfernt werden können auf eine einfache und
kostengünstige
Weise durch die Zugabe einer kleinen Menge von hitzelabiler allcalischer
Phosphatase. Bevorzugte alkalische Phosphatasen schließen die
allcalische Phosphatase aus Garnelen ein (United States Biochemical
Corporation) und alkalische Phosphatase aus Kälberdarm, welche einer Erwärmung auf
60°C bis
70°C gegenüber sensibel
sind.
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Die PCR wurde in einem Volumen von
100 μl durchgeführt unter
Verwendung von 50 pMol eines Primers und 1 pMol des zweiten Primers
(50 : 1 Primerverhältnis)
in dem Puffer, welcher in. dem GeneAmp Kit (Perkin-Elmer Cetus Corp.)
geliefert wird, mit 2,5 Einheiten von AmpliTaq Taq-DNA-Polymerase.
Die dNTPs wurden in einer Konzentration von 0,2 mM zugegeben. Die
Matrize wurde durch einen einzelnen Plaque von M13, welcher eine
Insertion von etwa 1 Kb Größe enthielt,
geliefert. Der Phage wurde aus dem Plaque in 100 μl von 10
mM Tris-HCl pH7,5, 1mM EDTA eluiert und 5 μl wurden in der PCR verwendet.
Das Reaktionsgefäß wurde
in den Thermocycler plaziert und 50 Zyklen von 95°C während 1
Minute, 55°C
während
1 Minute und 72°C
während
2 Minuten unterzogen.
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Auf die Amplifizerung folgend wurde
ein Aliquot (10 μl)
entfernt und 2 Einheiten von alkalischer Phosphatase wurde zugegeben.
Diese Mischung wurde bei 37°C
während
10 Minuten inkubiert und dann wurde die Phosphatase durch eine Inkubation
bei 70°C
während
10 Minuten inaktiviert.
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Auf diese Behandlung folgend wurde
ein Aliquot von 7 μl
entfernt und sequenziert unter Verwendung der normalen Verfahren
für den
Sequenaee Version 2.0 DNA-Sequenzierungs Kit (United States Biochemical Corporation).
Die Sequenzen waren von einer ausgezeichneten Qualität bei der
Vorbehandlung mit der alkalischen Phosphatase aber nicht verwendbar
ohne die alkalische Phosphatase. Dieses Verfahren wird schnell vollständig durchgeführt, wobei
es nur einfache Pipettierschritte erfordert, welche leicht durch
automatisierte Roboter durchgeführt
werden können.
Die Reagenzien sind leicht verfügbar
und kostengünstig.
In einer ähnlichen
Weise wurden Sequenzen von einer hohen Qualität unter Verwendung von amplifizierter
menschlicher genomischer DNA unter Verwendung verschiedener Primer
erhalten.
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Andere Ausführungsformen liegen innerhalb
der folgenden Ansprüche.
