DE69333675T2

DE69333675T2 - Enzymatische Verfahren zur Trennung von Enantiomerengemischen von Verbindungen, die als Zwischenprodukte zur Herstellung von Taxanen nützlich sind

Info

Publication number: DE69333675T2
Application number: DE69333675T
Authority: DE
Inventors: Ramesh N. Patel; Laszlo J. Szarka; Richard A. Partyka
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1992-01-15
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2013-01-16
Also published as: CA2434312A1; EP0552041B1; PT1001036E; DE69329304T2; ATE195973T1; EP0552041A2; JP3184350B2; US5567614A; ES2230790T3; ES2149800T3; EP0552041A3; HK1027130A1; DK0552041T3; US5811292A; EP1001036B1; DE69329304D1; DE69333675D1; EP1001036A3; CA2087359A1; GR3034942T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft enzymatische Verfahren zur Trennung von Enantiomerengemischen von Verbindungen, welche als Zwischenprodukte zur Herstellung von Taxanen, insbesondere Taxol und Taxolderivaten, nützlich sind, wobei letztere Verbindungen auf dem pharmazeutischen Gebiet Verwendung finden.
Hintergrund der Erfindung
Taxane sind Diterpenverbindungen, welche auf dem pharmazeutischen Gebiet Verwendung finden. Zum Beispiel wurde gefunden, dass Taxol, ein Taxan mit der Struktur:
wobei Ph Phenyl ist, Ac Acetyl ist und Bz Benzoyl ist, ein wirksames Antikrebsmittel ist, welches besonders bei der Behandlung von Eierstockkrebs nützlich ist.
Natürlich vorkommende Taxane wie Taxol können in Pflanzenmaterialien gefunden werden und wurden daraus isoliert. Solche Taxane können jedoch in Pflanzenmaterialien in relativ kleinen Mengen vorhanden sein, so dass im Falle von Taxol zum Beispiel eine große Anzahl der langsam wachsenden Eiben, welche eine Quelle für die Verbindung bilden, erforderlich sein kann. Auf dem Fachgebiet wurde deshalb die Suche nach synthetischen, einschließlich halbsynthetischen Wegen zur Herstellung von natürlich vorkommenden Taxanen wie Taxol sowie nach Wegen zur Herstellung von synthetischen, pharmazeutisch nützlichen Analoga davon fortgeführt.
Da die Stereochemie dieser Verbindungen ihre pharmazeutische Aktivität beeinflussen kann, werden insbesondere Verfahren gesucht, welche eine effiziente stereospezifische Herstellung der Zwischenprodukte sowie der Taxan-Endprodukte ermöglichen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt wirksame Verfahren zur Trennung von Enantiomerengemischen, bevorzugt von racemischen Gemischen von Verbindungen, welche als Zwischenprodukte zur Herstellung von Taxanen wie Taxol und folglich zur stereospezifischen Herstellung dieser Verbindungen nützlich sind, bereit.
Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Trennung eines Gemisches I, welches die Enantiomere Ia und Ib umfasst, bereit, wobei sowohl in Ia als auch in Ib R¹ in der cis-Stellung relativ zu R² steht oder wobei sowohl in Ia als auch in Ib R¹ in der trans-Stellung relativ zu R² steht:
wobei
R¹ Hydroxyl; Halogen; -O-C(O)-R⁴ ist, wobei R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Heterocyclo ist;
R² Aryl; Alkyl; Alkenyl; oder Alkinyl ist; und
R³ Wasserstoff; R⁴; -C(O)-OR⁴; oder -C(O)-R⁴ ist, wobei R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus den vorstehend für R⁴ genannten Resten;
umfassend den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I mit einem Enzym oder Mikroorganismus, welche zur Katalyse der stereoselektiven Umwandlung von einer der Verbindungen Ia oder Ib in eine Nichtenantiomerenform und zur Durchführung der Umwandlung fähig sind.
Beispielhafte Ausführungsformen für die vorstehend erwähnten stereoselektiven Umwandlungen schließen stereoselektive Hydrolyse, stereoselektive Veresterung, stereoselektive Umesterung und stereoselektive Dehalogenierung, insbesondere stereoselektive Hydrolyse oder Veresterung, ein.
Reste, wie Hydroxylgruppen, an den Verbindungen der Formeln I können gegebenenfalls zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Trennverfahren geschützt werden; solche Reste können gegebenenfalls darauffolgend entschützt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden weiter wie folgt beschrieben.
Cis-Enantiomere
Das folgende Paar von cis-Enantiomeren kann durch die erfindungsgemäßen enzymatischen Verfahren getrennt werden:
das heißt, Enantiomere Ia und Ib, wobei R¹ sowohl in Ia als auch in Ib in der cis-Stellung relativ zu R² steht.
Es ist bevorzugt, ein Gemisch von cis-Enantiomeren wie vorstehend beschrieben gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zu trennen.
Trans-Enantiomere
Das folgende Paar von trans-Enantiomeren kann durch die erfindungsgemäßen enzymatischen Verfahren getrennt werden:
das heißt, Enantiomere Ia und Ib, wobei R¹ sowohl in Ia als auch in Ib in der trans-Stellung relativ zu R² steht.
Bevorzugte Verfahren zur Trennung des Gemisches I
Das Gemisch I, welches ein Enantiomerengemisch von β-Laktamen Ia und Ib umfasst, wird bevorzugt durch stereoselektive Hydrolyse, Veresterung oder Dehalogenierung getrennt. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Trennung eines Gemisches I, umfassend die Enantiomere Ia(1) und Ib(1):
um ein Gemisch II, umfassend die Verbindungen IIa(1) und IIb(1) zu bilden:
wobei
R² Aryl; Alkyl; Alkenyl; oder Alkinyl ist; und
R³ Wasserstoff; R⁴; -C(O)-OR⁴; oder -C(O)-R⁴ ist, wobei R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Heterocyclo ist;
umfasst einen der folgenden Schritte (i), (ii) oder (iii):

(i) wobei R¹ -O-C(O)-R⁴ ist, wobei R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus den vorstehend für R⁴ genannten Gruppen; und ein Rest aus R^1a oder R^1b gleich R¹ ist und der andere aus R^1a oder R^1b Hydroxyl ist; den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I in Gegenwart von Wasser und/oder eines organischen Alkohols mit einem zur Katalyse der stereoselektiven Hydrolyse des Gemisches I fähigen Enzym oder Mikroorganismus, um das Gemisch II bereitzustellen; oder
(ii) wobei R¹ Hydroxyl ist; und ein Rest aus R^1a oder R^1b Hydroxyl ist und der andere aus R^1a oder R^1b gleich R⁴-C(O)-O- ist, wobei R⁴ unabhängig aus den vorstehend für R⁴ genannten Resten ausgewählt ist; den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I in Gegenwart einer Verbindung III: R⁴-C(O)-L (III)wobei R⁴ wie vorstehend für R^1a oder R^1b definiert ist und L eine Abgangsgruppe ist, mit einem zur Katalyse der stereoselektiven Veresterung des Gemisches I fähigen Enzym oder Mikroorganismus, um das Gemisch I bereitzustellen; oder
(iii) wobei R¹ ein Halogenatom ist; und ein Rest aus R^1a oder R^1b Halogen ist und der andere aus R^1a oder R^1b Hydroxyl ist; den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I in Gegenwart eines Hydroxidionendonors mit einem zur Katalyse der stereoselektiven Dehalogenierung des Gemisches I fähigen Enzym oder Mikroorganismus, um das Gemisch II bereitzustellen.

Die vorstehenden Verfahren können zur Trennung von anderen erfindungsgemäßen Enantiomerengemischen verwendet werden, obwohl die Trennung der vorstehenden cis-Enantiomere Ia(1) und Ib(1) bevorzugt ist.
Die so hergestellten Verbindungspaare, wie IIa(1) und IIb(1), sind nicht enantiomer und können folglich aufgetrennt werden, um optisch aktive, bevorzugt optisch reine Verbindungen zu erhalten. Eine optische Reinheit von höher als 99%, insbesondere 99,5% ist bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Verbindung des Gemisches I bereit, welche im Wesentlichen frei von anderen Isomeren ist, wobei die Verbindung durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden kann.
Definitionen
Der Ausdruck „stereoselektive Umwandlung" wie hier verwendet betrifft die bevorzugte Umsetzung eines Enantiomers relativ zu einem anderen, das heißt eine asymmetrische, enantioselektive Umsetzung. Ebenso betreffen die Ausdrücke „stereoselektive Hydrolyse", „stereoselektive Veresterung", „stereoselektive Dehalogenierung" und „stereoselektive Umesterung" die bevorzugte Hydrolyse, Veresterung, Dehalogenierung bzw. Umesterung eines Enantiomers relativ zu einem anderen.
Der Ausdruck „Gemisch", wie der Ausdruck hier in Bezug auf enantiomere Verbindungen verwendet wird, bezeichnet Gemische mit gleichen (racemischen) oder nicht gleichen Mengen an Enantiomeren.
Der Ausdruck „Trennung" wie hier verwendet bezeichnet eine teilweise sowie bevorzugt eine vollständige Trennung.
Der Ausdruck „Nichtenantiomerenform" wie hier verwendet bezeichnet die Struktur einer Verbindung, ursprünglich eine eines Enantiomerenpaares, bei welcher mindestens ein Rest modifiziert wurde, so dass die Verbindung nicht länger das Spiegelbild der anderen Verbindung des ursprünglichen Enantiomerenpaares ist.
Der Ausdruck „enzymatisches Verfahren" wie hier verwendet bezeichnet ein erfindungsgemäßes Verfahren, welches ein Enzym oder einen Mikroorganismus verwendet.
Die Ausdrücke „Alkyl", „Alkan" oder „Alk" wie hier alleine oder als Teil eines anderen Rests verwendet bezeichnen bevorzugt sowohl geradkettige als auch verzweigtkettige, gegebenenfalls substituierte Kohlenwasserstoffe, welche in der normalen Kette 1 bis 15 Kohlenstoffatome, bevorzugt 1 bis 6 Kohlenstoffatome, enthalten, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, t-Butyl, Isobutyl, Pentyl, Hexyl, Isohexyl, Heptyl, 4,4-Dimethylpentyl, Octyl, 2,2,4-Trimethylpentyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, die verschiedenen verzweigten Kettenisomere davon, und dergleichen. Beispielhafte Substituenten können einen oder mehrere aus den folgenden ausgewählte Reste einschließen: Halogen (insbesondere Chlor), Trihalomethyl, Alkoxy (zum Beispiel wobei zwei Alkoxysubstituenten ein Acetal bilden), Aryl wie unsubstituiertes Aryl, Alkylaryl oder Haloaryl, Cycloalkyl wie unsubstituiertes Cycloalkyl oder Alkylcycloalkyl, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy, Carboxyl, Alkyloxycarbonyl, Alkylamino, Alkylcarbonylamino, Amino, Arylcarbonylamino, Nitro, Cyano, Thiol oder Alkylthio. Besonders bevorzugte Alkylsubstituenten sind Hydroxylgruppen.
Der Ausdruck „Alkenyl" wie hier alleine oder als ein Teil eines anderen Rests verwendet bezeichnet bevorzugt solche gegebenenfalls substituierten Reste, wie vorstehend für Alkyl beschrieben, welche weiter mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthalten.
Der Ausdruck „Alkinyl" wie hier alleine oder als ein Teil eines anderen Rests verwendet bezeichnet bevorzugt solche gegebenenfalls substituierten Reste, wie vorstehend für Alkyl beschrieben, welche weiter mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthalten.
Der Ausdruck „Cycloalkyl" wie hier alleine oder als ein Teil eines anderen Rests verwendet bezeichnet bevorzugt gegebenenfalls substituierte gesättigte cyclische Kohlenwasserstoffreste, welche einen bis drei Ringe und 3 bis 12 Ringkohlenstoffatome, bevorzugt 3 bis 8 Ringkohlenstoffatome, umfassen, die Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cyclooctyl, Cyclodecyl, Cyclododecyl, und Adamantyl einschließen. Beispielhafte Substituenten schließen einen oder mehrere Alkylreste wie vorstehend beschrieben oder einen oder mehrere Reste, welche vorstehend als Alkylsubstituenten beschrieben sind, ein.
Der Ausdruck „Cycloalkenyl" wie hier alleine oder als ein Teil eines anderen Rests verwendet bezeichnet bevorzugt solche gegebenenfalls substituierten, wie für Cycloalkyl vorstehend beschriebenen Reste, welche weiter mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in dem Ringsystem enthalten.
Die Ausdrücke „Aryl" oder „Ar" wie hier verwendet bezeichnen bevorzugt monocyclische oder bicyclische substituierte oder unsubstituierte aromatische Reste, welche 6 bis 12 Kohlenstoffatome im Ringanteil enthalten, wie Phenyl, Biphenyl, Naphthyl, substituiertes Phenyl, substituiertes Biphenyl oder substituiertes Naphthyl. Beispielhafte Substituenten (bevorzugt drei oder weniger) schließen einen oder mehrere der folgenden Reste ein: Alkyl wie unsubstituiertes Alkyl, Haloalkyl, oder Cycloalkylalkyl, Halogen, Alkoxy wie unsubstituiertes Alkoxy oder Haloalkoxy, Hydroxy, Aryl wie Phenyl oder Halophenyl, Aryloxy wie Phenoxy, R⁴-Carbonyloxy, wobei R⁴ wie vorstehend definiert ist, wie Alkylcarbonyloxy oder Benzoyloxy, Alkyl, Cycloalkyl, Alkylamino, Dialkylamino, Amido wie Alkylcarbonylamino oder Arylcarbonylamino, Amino, Nitro, Cyano, Alkenyl, Thiol, R⁴-Carbonyl, wobei R⁴ wie vorstehend definiert ist, oder Methylendioxy, wobei die Methylengruppe mit 1 bis 2 Niederalkylresten, 1, 2 oder 3 Arylalkenylresten, und/oder 1, 2 oder 3 Alkylthioresten substituiert sein kann. Besonders bevorzugte Arylreste sind Phenyl und substituiertes Phenyl, insbesondere Phenyl, welches substituiert ist mit einem oder mehreren von Hydroxyl, Alkyl- und/oder Alkoxyresten wie p-Methoxyphenyl, o-Methoxyphenyl, p-Hydroxyphenyl, o-Hydroxyphenyl und m-Hydroxyphenyl.
Der Ausdruck „Halogen" oder „Halo" wie hier verwendet betrifft Chlor, Brom, Fluor und Iod, wobei Chlor oder Fluor bevorzugt sind.
Der Ausdruck „Heterocyclo" bezeichnet bevorzugt gegebenenfalls substituierte vollständig gesättigte oder ungesättigte, monocyclische oder bicyclische, aromatische oder nicht aromatische Kohlenwasserstoffreste mit 5 oder 6 Atomen in jedem Ring und mindestens einem Heteroatom in mindestens einem Ring. Der Heterocyclorest weist bevorzugt 1 oder 2 Sauerstoffatome, 1 oder 2 Schwefelatome, und/oder 1 bis 4 Stickstoffatome in dem Ring auf. Beispielhafte Substituenten schließen Halogen(e), 1, 2 oder 3 C_1-6-Alkoxyreste, 1, 2 oder 3 Hydroxygruppen, 1, 2 oder 3 Phenylgruppen, 1, 2 oder 3 Alkanoyloxyreste, 1, 2 oder 3 Benzoyloxyreste, 1, 2 oder 3 Halogenphenylreste, 1, 2 oder 3 Alkylreste wie 1, 2 oder 3 Aralkylreste, 1, 2 oder 3 Alkylaminoreste, 1, 2 oder 3 Alkanoylaminoreste, 1, 2 oder 3 Arylcarbonylaminoreste, 1, 2 oder 3 Aminoreste, 1, 2 oder 3 Nitrogruppen, 1, 2 oder 3 Cyanogruppen, und 1, 2 oder 3 Thiolgruppen ein. Beispielhafte Heterocycloreste sind 2- und 3-Thienyl, 2- und 3-Furyl, 2- und 3-Pyrrolyl, 2-, 3- und 4-Pyridyl, 2-, 4- und 5-Imidazolyl, 2- und 3-Pyrrolidinyl, 2-, 3- und 4-Piperidinyl, 2-, 3- und 4-Azepinyl, 4-, 5-, 6- und 7-Indolyl, 4-, 5-, 6- und 7-Isoindolyl, 5-, 6-, 7- und 8-Chinolinyl, 5-, 6-, 7- und 8-Isochinolinyl, 4-, 5-, 6- und 7-Benzothiazolyl, 4-, 5-, 6- und 7-Benzoxyazolyl, 4-, 5-, 6- und 7-Benzimidazolyl, 4-, 5-, 6- und 7-Benzoxadiazolyl, und 4-, 5-, 6- und 7-Benzofurazanyl.
Der Ausdruck „Hydroxyschutzgruppe" wie hier verwendet bezeichnet einen zum Schützen einer freien Hydroxylgruppe fähigen Rest, welcher folgend auf die Umsetzung, für welche das Schützen verwendet wird, ohne eine Störung des Rests des Moleküls entfernt werden kann. Eine Vielzahl von Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe und die Synthese davon können in „Protective Groups in Organic Synthesis" von T. W. Greene, John Wiley and Sons, 1981 oder Fiser und Fiser gefunden werden. Beispielhafte Hydroxylschutzgruppen schließen Methoxymethyl, 1-Ethoxyethyl, Benzyloxymethyl, (β-Trimethylsilylethoxy)methyl, Tetrahydropyranyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, t-Butyl(diphenyl)silyl, Trialkylsilyl, Trichlormethoxycarbonyl und 2,2,2-Trichlorethoxymethyl ein.
Ausgangsmaterialien
Ein Gemisch I-Ausgangsmaterial, welches die β-Laktamverbindungen Ia und Ib umfasst, kann durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie durch jene, welche in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 400 971 beschrieben sind. Zum Beispiel kann ein racemisches Gemisch von cis-β-Laktamverbindungen Ia und Ib hergestellt werden durch die Bildung eines Imins der Formel: R²-CH=N-R³ durch Umsetzung eines Aldehyds der Formel: R²-CHO wie Benzaldehyd, mit einem Aminderivat der Formel: H₂N-R³ wie p-Methoxyanilin.
Das so hergestellte Imin kann dann mit einem Acylchlorid der Formel: R¹-CH₂-C(O)-Cl wie α-Acetoxyacetylchlorid, umgesetzt werden, um ein racemisches Gemisch von cis-β-Laktamverbindungen der Formeln Ia und Ib herzustellen. Diese letztere Umsetzung kann in Gegenwart einer Base wie Triethylamin in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid bei einer Temperatur wie –20°C, gefolgt von Erwärmen auf 25°C durchgeführt werden.
Sollte ein unterschiedliches Laktamausgangsmaterial gewünscht sein, kann auf das vorstehende Verfahren seinerseits eine Modifizierung des gebildeten Laktams folgen. Zum Beispiel kann ein wie vorstehend hergestelltes cis-1-p-Methoxyphenyl-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-on Racemat in Acetonitril bei einer Temperatur wie –10°C bis –5°C mit einer Lösung von Cerammoniumnitrat in Wasser behandelt werden, wobei ein cis-3-Acetoxy-4-phenylazetidin-2-on Racemat erhalten wird. Die letztere Verbindung kann zum Beispiel weiter hydrolysiert werden, z. B. mit wässriger Kaliumhydroxid, wobei cis-3-Hydroxy-4-phenylazetidin-2-on erhalten wird.
Ein Gemisch IV-Ausgangsmaterial, welches einen Racemat der Verbindungen IVa und IVb umfasst, kann durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
Ausgangsgemische, welche nicht racemisch sind, können zum Beispiel durch Zugabe von einer der Verbindungen Ia oder Ib zu einem racemischen Gemisch I oder durch Zugabe von einer der Verbindungen IVa oder IVb zu einem racemischen Gemisch IV in nicht gleichen Anteilen erhalten werden.
Die Ausgangsgemische I oder IV können zum Beispiel die Diastereomere der Verbindungen Ia und Ib oder IVa und IVb enthalten, obwohl es bevorzugt ist, dass solche Verbindungen vor der Durchführung der erfindungsgemäßen enzymatischen Trennverfahren abgetrennt werden.
Bevorzugte Verbindungen
Cis-Verbindungen der Formel I weisen eine stereoisomere Konfiguration auf, welche bei Verbindungen bevorzugt ist, die als Zwischenprodukte bei der Herstellung von Taxanen wie Taxol verwendet werden. Verbindungen der Gemische I und II mit der gleichen absoluten Konfiguration entsprechend zu der einer Verbindung Ia, wobei R¹ Acetyloxy ist, R² Phenyl ist und R³ Wasserstoff ist in der 3R,4S-Konfiguration, sind besonders bevorzugt.
Die Trennung von β-Laktamen der Formel I ist bevorzugt.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen ist R¹ bevorzugt Alkanoyloxy, wie unsubstituiertes Alkanoyloxy (z. B. Acetyloxy) oder Chloralkanoyloxy (z. B. Chloracetyloxy), oder Hydroxy; R² ist bevorzugt Phenyl oder substituiertes Phenyl; und R³ ist bevorzugt Wasserstoff, Phenyl, substituiertes Phenyl wie Methoxyphenyl oder Hydroxyphenyl, Phenylcarbonyl, substituiertes Phenylcarbonyl, Alkylcarbonyl, Alkenylcarbonyl oder Alkoxycarbonyl wie t-Butoxycarbonyl. R⁶ kann Wasserstoff oder R⁴ sein, wobei Letzterer eine Estergruppe bildet. R⁶ ist bevorzugt Wasserstoff oder ein C_1-6-Alkyl wie Methyl.
Enzyme und Mikroorganismen
Das Enzym oder der Mikroorganismus, welche in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, kann jedwedes Enzym oder jedweder Mikroorganismus sein, welche die Fähigkeit zur Katalyse der stereoselektiven Umwandlungen wie hier beschrieben aufweisen. Verschiedene Enzyme, wie Esterasen, Lipasen und Proteasen, sind ungeachtet von Ursprung oder Reinheit zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Das Enzym kann zum Beispiel in der Form von Tier- oder Pflanzenenzymen oder Gemischen davon, Zellen von Mikroorganismen, zerkleinerten Zellen, Zellextrakten vorliegen oder es kann synthetischen Ursprungs sein.
Bezüglich der Verwendung von Mikroorganismen können die erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung eines jedweden mikrobiellen zellulären Materials mit der Fähigkeit zur Katalyse der stereoselektiven Umwandlungen wie hier beschrieben durchgeführt werden. Die Zellen können in der Form von intakten feuchten Zellen oder getrockneten Zellen wie gefriergetrockneten, sprühgetrockneten oder wärme-getrockneten Zellen verwendet werden. Zellen können auch in der Form von behandeltem Zellmaterial wie aufgebrochenen Zellen oder Zellextrakt verwendet werden. Die Zellen oder zellulären Materialien können im freien Zustand oder immobilisiert auf einem Träger wie durch physikalische Adsorption oder Einschluss verwendet werden.
Beispielhafte Gattungen von Mikroorganismen, welche als Quellen der Katalyse von Enzymen geeignet sind, schließen Mucor, Escherichia, Staphylococcus, Agrobacterium, Acinetobacter, Rhizopus, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Trichoderma, Candida, Rhodotorula, Torulopsis, Proteus, Bacillus, Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodococcus, Brevibacterium, Geotrichum, Enterobacter, Chromobacterium, Arthrobacter, Microbacterium, Mycobacterium, Saccharomyces, Penicillium, Methanobacterium, Botrytis, Chaetomium, Ophiobolus, Cladosporium und dergleichen ein. Die Verwendung von gentechnisch veränderten Wirtszellen wird auch in Betracht gezogen.
Spezielle Mikroorganismen, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Chromobacterium viscosum, Pseudomonas aeuriginosa wie ATCC 25619, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida wie ATCC 31303, Pseudomonas ovalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Alcaligenes faecalis, Streptomyces griseus, Pseudomonas cepacia, Candida rugosa wie ATCC 14830, Geotrichum candidum wie ATCC 32345, Streptomyces clavuligerus, Nocardia erthropolis, Nocardia asteraides, Mycobacterium phlei, Agrobacterium radiobacter, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae und dergleichen ein. Wenn die vorliegenden Verfahren durchgeführt werden, können zwei oder mehr sowie eine einzelne Mikrorganismenspezies verwendet werden.
Der Begriff „ATCC" wie hier verwendet betrifft die Zugangsnummer der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, die Hinterlegungsstelle der Organismen, auf die hier Bezug genommen wird.
Die erfindungsgemäßen Trennverfahren können folgend dem Wachstum des/der verwendeten Mikroorganismus/Mikroorganismen oder gleichzeitig damit durchgeführt werden, das heißt in letzterem Fall durch in situ Fermentation und Trennung. Das Wachstum der Mikroorganismen kann durch den Fachmann zum Beispiel durch die Verwendung eines passenden Mediums, welches Nährstoffe wie Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Spurenelemente enthält, erreicht werden.
Beispielhafte, kommerziell verfügbare Enzyme, welche zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, schließen Lipasen wie Amano PS-30 (Pseudomonas cepacia), Amano GC-20 (Geotrichum candidum), Amano APF (Aspergillus niger), Amano AK (Pseudomonas sp.), Pseudomonas fluorescens Lipase (Biocatalyst Ltd.), Amano Lipase P-30 (Pseudomonas sp.), Amano P (Pseudomonas fluorescens), Amano AY-30 (Candida cylindracea), Amano N (Rhizopus niveus), Amano R (Penicillium sp.), Amano FAP (Rhizopus oryzae), Amano AP-12 (Aspergillus niger), Amano MAP (Mucor meihei), Amano GC-4 (Geotrichum candidum), Sigma L-0382 und L-3126 (Bauchspeicheldrüse des Schweins), Sigma L-3001 (Weizenkeim), Sigma L-1754 (Candida cylindracea), Sigma L-0763 (Chromobacterium viscosum) und Amano K-30 (Aspergillus niger) ein. Zusätzlich schließen beispielhafte Enzyme, welche sich von Tiergewebe ableiten, Esterase aus Schweineleber, α-Chymotrypsin und Pancreatin aus der Bauchspeicheldrüse wie Lipase aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins (Sigma) ein. Wenn die vorliegenden Verfahren durchgeführt werden, können zwei oder mehr sowie ein einzelnes Enzym verwendet werden.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden weiter in den folgenden Reaktionsschemata beschrieben. Obwohl zur Klarheit diese Reaktionsschemata die Trennung von bestimmten cis-Enantiomerengemischen veranschaulichen, soll es als selbstverständlich angesehen werden, dass die Ausführungsformen wie beschrieben genauso für die Trennung von anderen erfindungsgemäßen Enantiomerengemischen gelten. Reaktionsschema I Trennung durch Veresterung
ein Rest von R^1a oder R^1b = OH; der andere
Gemische I können selektiv verestert werden, wie im vorstehenden Reaktionsschema I veranschaulicht wird.
(A) Acylierung
Gemisch I kann selektiv verestert werden, um Gemisch II zu bilden, und Gemisch IV kann selektiv verestert werden, um Gemisch V zu bilden, durch Verwendung eines Acylierungsmittels der Formel III: R⁴-C(O)-L (III).
In Formel III kann R⁴ ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Heterocyclorest sein. Bevorzugte Reste R⁴ in Formel III sind Alkylreste wie C_1-6-Alkylreste, insbesondere Methyl. L ist eine Abgangsgruppe, welche ersetzt werden kann, um eine Estergruppe zu bilden. Beispielhafte Reste L schließen Halogenatome, Hydroxyl, Alkoxy- oder Alkenyloxyreste ein. Bevorzugte Reste L sind Alkenyloxyreste, am stärksten bevorzugt C_1-6-Alkenyloxyreste wie CH₂=CH-O- und CH₂=C(CH₃)-O-. Jedwedes Acylierungsmittel der Formel III, welches eine Veresterung bewirkt, kann verwendet werden, wobei Isopropenylacetat und Vinylacetat besonders bevorzugt sind.
Um diese Verfahren durchzuführen, wird eine Verbindung III, VII oder VIII zu dem Reaktionsmedium gegeben. Bevorzugte Molverhältnisse von Verbindung III : Verbindungen des Gemisches I oder IV sind etwa 1 : 1 bis etwa 4 : 1; bevorzugte Molverhältnisse von Verbindung VII : Verbindungen des Gemisches IV sind etwa 1 : 1 bis etwa 4 : 1; und bevorzugte Molverhältnisse von Verbindung VIII : Verbindungen des Gemisches IV sind etwa 1 : 1 bis etwa 4 : 1.
Die bei diesen Verfahren verwendeten Enzyme oder Mikroorganismen sind Lipasen oder Esterasen oder Mikroorganismen, welche zur Herstellung dieser Enzyme fähig sind. Enzyme und Mikroorganismen, welche bei diesen Verfahren besonders bevorzugt sind, sind Lipase P-30 aus Pseudomonas sp., Lipase N aus Rhizopus niveus, Lipase APF aus Aspergillus niger, Lipase GC-20 aus Geotrichum candidum, Lipase AK aus Pseudomonas sp., Lipase AY-30 aus Candida sp. und Pseudomonas fluorescens Lipase.
Ein Enzym kann zum Beispiel in seinem freien Zustand oder in immobilisierter Form verwendet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist diejenige, wobei ein Enzym auf einem geeigneten Träger adsorbiert ist, z. B. auf Kieselgur (porösem Celite Hyflo Supercel), mikroporösem Polypropylen (Enka Accurel^® Polypropylenpulver) oder einem nichtionischen Polymeradsorptionsmittel wie Amberlite^® XAD-2 (Polystyrol) oder XAD-7 (Polyacrylat) von Rohm und Haas Co. Wenn er zur Immobilisierung eines Enzyms verwendet wird, kann ein Träger die Enzymteilchengröße kontrollieren und eine Aggregation der Enzymteilchen verhindern, wenn er in einem organischen Lösungsmittel verwendet wird. Eine Immobilisierung kann zum Beispiel durch Fällen einer wässrigen Lösung des Enzyms mit kaltem Aceton in Gegenwart des Celite Hyflo Supercel, gefolgt von Vakuumtrocknen erreicht werden oder im Falle eines nichtionischen Polymeradsorptionsmittels durch Inkubieren der Enzymlösungen mit Adsorptionsmittel auf einer Schüttelvorrichtung, Entfernen von überschüssiger Lösung und Trocknen der Harze, an welchen die Enzyme adsorbiert sind, unter Vakuum. Das Enzym wird bevorzugt zur Reaktionslösung gegeben, um Konzentrationen im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 mg Enzym pro ml Lösungsmittel zu erreichen. Obwohl es wünschenswert ist, die niedrigstmögliche Menge an Enzym zu verwenden, wird die erforderliche Menge an Enzym abhängig von der speziellen Aktivität des verwendeten Enzyms variieren.
Diese Verfahren können auch unter Verwendung von mikrobiellen Zellen durchgeführt werden, welche ein Enzym mit der Fähigkeit zur Katalyse der stereoselektiven Umwandlungen enthalten. Wenn ein Mikroorganismus zur Durchführung der Trennung verwendet wird, werden diese Verfahren praktischerweise durch Zugabe der Zellen und des Ausgangsmaterialenantiomerengemisches zu dem gewünschten Reaktionsmedium durchgeführt. Zellen können in der Form von intakten Zellen, getrockneten Zellen wie gefriergetrockneten, sprühgetrockneten oder wärme-getrockneten Zellen, immobilisierten Zellen oder Zellen, welche mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton oder Toluol behandelt wurden, verwendet werden. Zellen können auch in der Form von behandeltem Zellmaterial wie aufgebrochenen Zellen oder Zellextrakt verwendet werden. Zellextrakte, welche auf Celite^® oder Accurel^® Polypropylen wie früher beschrieben immobilisiert sind, können auch verwendet werden.
Eine Inkubation des Reaktionsmediums findet bevorzugt bei einer Temperatur zwischen etwa 4 und etwa 60°C statt und sie liegt am stärksten bevorzugt zwischen etwa 30 und 50°C. Die Reaktionszeit kann geeigneterweise abhängig von der verwendeten Menge an Enzym und seiner speziellen Aktivität variiert werden. Typische Reaktionszeiten bei 30°C für optische Reinheiten von 98 Prozent und darüber sind mindestens etwa 24 Stunden und können in einem Bereich von bis zu etwa 72 Stunden für größere Umwandlungen und höhere optische Reinheiten, z. B. für optische Reinheiten, die 99,5 Prozent übersteigen, liegen. Die Reaktionszeiten können durch eine Erhöhung der Reaktionstemperatur und/oder eine Erhöhung der Menge an Enzym, welche zu der Reaktionslösung gegeben wird, verringert werden. Reaktionsschema III Trennung durch Hydrolyse
ein Rest von
der andere Rest = OH
Wie aus Reaktionsschema II vorstehend ersichtlich ist, können durch die Verwendung von Wasser und/oder eines organischen Alkohols die Gemische I und IV selektiv hydrolysiert werden, um die Gemische II bzw. V zu bilden, und das Gemisch IV kann durch die Verwendung von Wasser selektiv hydrolysiert werden, um das Gemisch VI zu bilden. Die Reste R⁴, der bildende Teil von R¹ und R⁶ in den enantiomeren Ausgangsverbindungen sind bevorzugt Alkyl, am stärksten bevorzugt C_1-6Alkyl wie Methyl.
Eine Verbindung der Formel IX: R⁸-OH (IX)kann als der organische Alkohol verwendet werden, wobei R⁸ ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Heterocyclorest ist und R⁸ bevorzugt Alkyl wie Methyl ist. Die Verwendung des organischen Alkohols IX kann in der Bildung des Esternebenprodukts R⁴-C(O)-OR⁸ resultieren. Die Verwendung von Wasser als das Hydrolysemittel kann in der Bildung des Säurenebenprodukts R⁴-C(O)-OH resultieren. Zur Aufrechterhaltung eines stabilen pH-Werts während der Bildung dieser sauren Nebenprodukte kann eine Base wie ein Alkalimetallhydroxid zugegeben werden. Wenn ein organischer Alkohol IX verwendet wird, wird bevorzugt eine Menge zugegeben, welche ein Molverhältnis von Verbindung IX : Verbindungen der Gemische I oder IV von etwa 1 : 1 bis etwa 4 : 1 bereitstellt.
Diese Verfahren verwenden bevorzugt wasserlösliche Enzyme, welche zur Katalyse von stereoselektiver Hydrolyse fähig sind. Besonders geeignet zur Verwendung bei diesen Verfahren sind Lipasen und Esterasen sowie Pancreatin und α-Chymotrypsin. Sowohl die Roh- als auch die gereinigten Formen dieser Enzyme, in freier Form oder immobilisiert auf einem Träger, können verwendet werden. Besonders bevorzugt bei diesen Verfahren sind Lipase PS-30 aus Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia) (Amano Int'l) (bevorzugt frei oder immobilisiert auf einem Harz wie XAD-7-, XAD-2- oder Accurel^®-Harzen wie vorstehend beschrieben), Lipase P-30 (Amano) aus Pseudomonas sp., Lipase GC-20 Geotrichum candidum (Amano Int'l), Lipase N Rhizopus niveus (Amano Int'l), Lipase APF Aspergillus niger (Amano Int'l), Lipase AY-30 Candida sp. (Amano), Lipase AK Pseudomonas sp. (Amano Int'l), Pseudomonas fluorescens Lipase (Biocatalyst Ltd.) und Lipase der Bauchspeicheldrüse des Schweins (Sigma Chem).
Die vorstehenden Hydrolysen werden bevorzugt in einem wässrigen oder gepufferten wässrigen Medium oder in einem zweiphasigen Lösungsmittelsystem, welches eine organische Phase, die nicht mischbar mit Wasser ist, und eine wässrige Phase umfasst, durchgeführt. Die Verwendung eines Zweiphasenlösungsmittelsystems kann den Wirkungsgrad von solchen Verfahren steigern, wobei das Substratmaterial in Wasser unlöslich ist.
Lösungsmittel für die organische Phase eines zweiphasigen Lösungsmittelsystems können jedwedes organische Lösungsmittel sein, welches mit Wasser nicht mischbar ist, wie Toluol (welches bevorzugt ist), Cyclohexan, Xylol, Trichlortrifluorethan und dergleichen. Die wässrige Phase ist praktischerweise Wasser, bevorzugt deionisiertes Wasser, oder eine geeignete wässrige Pufferlösung, insbesondere eine Phosphatpufferlösung. Das zweiphasige Lösungsmittelsystem umfasst bevorzugt zwischen etwa 10 und 90 Volumenprozent organische Phase und zwischen etwa 90 und 10 Volumenprozent wässrige Phase und enthält am stärksten bevorzugt etwa 20 Volumenprozent organische Phase und etwa 80 Volumenprozent wässrige Phase.
Ein besonders bevorzugtes Reaktionssystem umfasst ein zweiphasiges Lösungsmittelsystem wie vorstehend beschrieben, eine Menge an enantiomerem Ausgangsmaterialgemisch von etwa 0,1 bis etwa 100 mg pro ml zweiphasigem Lösungsmittel, und ein oder mehrere Enzyme in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 100 mg Enzym pro mg zu hydrolysierendem Ausgangsmaterial.
Eine beispielhafte Ausführungsform eines solchen Verfahrens beginnt mit der Herstellung einer wässrigen Lösung des/der zu verwendenden Enzyms/Enzyme. Zum Beispiel kann/können das/die bevorzugte/bevorzugten Enzym/Enzyme zu einer geeigneten Menge an wässrigem Lösungsmittel, wie Phosphatpuffer oder dergleichen, gegeben werden. Dieses Gemisch wird bevorzugt auf einen pH-Wert von etwa 7,0 eingestellt und bei diesem gehalten, bevorzugt mit einem wässrigen Alkalimetallhydroxid, -carbonat oder -bicarbonat. Zentrifugation bei verringerten Temperaturen (z. B. 4°C) wird bevorzugt zur Bereitstellung des Enzym enthaltenden wässrigen Teils des zweiphasigen Lösungsmittelsystems verwendet. Danach wird eine Emulsion des enantiomeren Ausgangsmaterials in einem organischen Lösungsmittel und einem wässrigen Lösungsmittel gebildet und gekühlt. Die enantioselektive Hydrolyse kann durch Zugabe des Enzym enthaltenden wässrigen Lösungsmittels zu dieser Emulsion, bevorzugt während andauerndem Rühren und Kühlen durchgeführt werden.
Die Reaktionszeit kann von Enzym zu Enzym variieren, aber typische Reaktionszeiten sind etwa 24 bis 72 Stunden, abhängig von der Temperatur und der Enzymkonzentration. Temperaturen von etwa 4°C bis etwa 60°C werden bevorzugt verwendet. Reaktionsschema III Trennung durch Dehalogenierung
ein Rest von R^1a oder R^1b = X; der andere Rest = OH
Wie aus Reaktionsschema III vorstehend ersichtlich ist, können Gemische I selektiv dehalogeniert werden, um Gemische II zu bilden, wobei X ein Halogenatom bezeichnet.
Jedwede Verbindung, welche zur Durchführung dieser Umsetzungen fähig ist, kann als der Hydroxidionendonor verwendet werden. Beispielhaft sind solche Verbindungen ausgewählt aus Wasser, Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden wie Natrium- und Kaliumhydroxid, und Ammoniumhydroxiden wie quartären Ammoniumhydroxiden, zum Beispiel jenen der Formel (R⁹)₄NOH, wobei R⁹ ein Wasserstoff oder Alkyl ist, insbesondere Kaliumhydroxid und Wasser. Mengen des Hydroxidionendonors, welche zugegeben werden, sind bevorzugt jene, welche ein Molverhältnis von Hydroxidionendonor : enantiomerem Ausgangsmaterialgemisch I von etwa 1 : 1 bis etwa 4 : 1 bereitstellen.
Ein Reaktionsmedium, welches Wasser und ein organisches Lösungsmittel wie Toluol oder Hexan enthält, wird bevorzugt verwendet. Die enantiomeren Ausgangsmaterialien werden bevorzugt in einer Menge von etwa 1 mg bis etwa 100 mg pro ml Lösungsmittel verwendet.
Enzyme oder Mikroorganismen, welche bei der Dehalogenierungsreaktion verwendet werden, sind ausgewählt aus den Gattungen Pseudomonas, Trichoderma, Acinetobacter, Alcaligenes, Nocardia, Mycobacterium, Rhodococcus, Methanobacterium, Proteus, oder davon abgeleiteten Enzymen und sie werden bevorzugt in Mengen von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg Enzym pro mg zu dehalogenierendem Ausgangsmaterial verwendet.
Temperaturen von etwa 4°C bis etwa 50°C werden bevorzugt verwendet.
Auftrennung
Die Produkte der stereoselektiven Umwandlungen können durch bekannte Methodiken wie Extraktion, Destillation, Kristallisation, Säulenchromatographie, und dergleichen isoliert und gereinigt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Auftrennung des durch die erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Produktgemisches ist Aufteilen der ungewünschten und gewünschten Verbindungen des Produktgemisches zwischen zwei oder mehr nicht mischbaren Flüssigkeiten, in welchen diese Verbindungen unterschiedliche Löslichkeiten aufweisen. Die Verwendung von Wasser und einem nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ist bevorzugt.
Verwendbarkeit
Taxane sind Diterpenverbindungen, welche das Taxan-Kohlenstoffgerüst enthalten:
wobei das Gerüst eine ethylenische Ungesättigtheit in dem Ringsystem davon enthalten kann. Von besonderem Interesse sind Taxane mit dem vorstehenden Kohlenstoffgerüst, wobei die Positionen 11 und 12 durch eine Ethylenverknüpfung verbunden sind und die Position 13 eine Seitenkette enthält, wobei diese Taxane durch Taxol beispielhaft dargestellt werden. Pharmakologisch aktive Taxane, wie Taxol, können als Antitumormittel verwendet werden zur Behandlung von Patienten, welche an Krebs wie Eierstockkrebs, einem Melanom, Brust-, Kolon- oder Lungenkrebs, und Leukämie leiden.
Die getrennten Verbindungen, welche durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden, sind besonders als Zwischenprodukte bei der Bildung der vorstehend erwähnten Seitenkette an dem Taxangerüst nützlich. Das Anfügen einer solchen Seitenkette, in oder an ihr selbst, kann dem Taxanprodukt eine erhöhte oder stärker wünschenswerte pharmakologische Aktivität verleihen oder kann ein Taxanprodukt bilden, welches einfacher zu einem Taxan mit einer erhöhten oder stärker wünschenswerten pharmakologischen Aktivität als die Ausgangsverbindung umgewandelt wird.
Die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren getrennten Verbindungen können vor der Verwendung bei der Seitenkettenbildung modifiziert werden. Zum Beispiel können getrennte Verbindungen, welche eine Azidgruppe N₃ als den Rest W enthalten, mit einem Reduktionsmittel behandelt werden, wobei ein Aminrest gebildet wird, welcher substituiert sein kann.
Beispielhafte Verfahren zur Seitenkettenbildung und Taxanprodukte, welche unter Verwendung von solchen Verfahren gebildet werden können, schließen jene ein, welche in U.S. Patent Nr. 4,924,011, U.S. Patent Nr. 4,924,012, und der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 400 971 beschrieben sind.
Salze oder Solvate von Reaktanten oder Produkten können wie geeignet oder gewünscht in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet oder hergestellt werden.
Erfindungsgemäße Verfahren werden weiter durch die folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele sind nur zur Veranschaulichung und es ist nicht beabsichtigt, den Umfang der vorliegenden Patentansprüche einzuschränken.
Beispiel 1 Stereoselektive Hydrolyse von (±)-cis-3-Acetoxy-4-phenyl-2-azetidinon Substrat: die racemische Titelverbindung, das heißt
Produkt (+)-cis-3-Acetoxy-4-phenyl-2-azetidinon
(–)-cis-3-Hydroxy-4-phenyl-2-azetidinon
Ein Reaktionsgemisch in 1 l 25 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0 wurde hergestellt, welches 8 Gramm Substrat, 80 Gramm Lipase PS-30 aus Pseudomonas sp. (Amano International Co.) enthielt. Die Umsetzung wurde bei 30°C und Rühren mit 150 Umdrehungen pro Minute (UpM) durchgeführt. Während der Umsetzung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 5 N NaOH unter Verwendung eines Autrofiltrators bei 7,0 gehalten. Die Hydrolysereaktion wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie beobachtet. Periodisch wurden Proben (1 ml) genommen und mit 4 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde abgetrennt und zur Trockene eingedampft und durch HPLC wurden die Substrat- und Produktkonzentration und die optische Reinheit des Produkts analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Ein Gemisch II, wobei R² Phenyl ist, R³ Wasserstoff ist, R^1a Acetyloxy ist und R^1b Hydroxyl ist, wie jenes, welches vorstehend hergestellt wurde, kann durch Aufteilen aufgetrennt werden, da die Verbindung IIb eine größere Wasserlöslichkeit als die Verbindung IIa aufweist. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Abtrennung dieser Verbindungen von dem wässrigen Gemisch ist wie folgt: (1) Extraktion mit Ethylacetat; und (2) Abtrennung der organischen Schicht und Zugabe von Heptan dazu, um ein Gemisch von Ethylacetat : Heptan (1 : 1 bezogen auf das Volumen) zu bilden, gefolgt von zwei Waschvorgängen mit Wasser (1 : 1 bezogen auf das Volumen, jeweils H₂O : Ethylacetat/-Heptan). Die aus (2) erhaltenen organischen Schichten enthalten bevorzugt die Verbindung IIa und nichts von Verbindung IIb. Eine weitere Abtrennung dieser Verbindungen aus den wässrigen Schichten, welche noch kleine Mengen an Verbindung IIa enthalten können, kann durch zusätzliche Extraktionen mit Ethylacetat/Heptan, gefolgt von wässrigen (wie 5 bis 10% Gew./Gew. NaCl, wässrig oder nur Wasser) Waschflüssigkeiten erreicht werden.
Beispiel 2 Stereoselektive Hydrolyse von (±)-1-(4-Methoxyphenyl)-cis-3-acetoxy-4-phenyl-2-azetidinon Substrat: die racemische Titelverbindung, das heißt
Produkt
Ein Reaktionsgemisch in 1 l 25 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0 wurde hergestellt, welches 5 Gramm Substrat, 50 Gramm Lipase PS-30 aus Pseudomonas sp. (Amano International Co.) enthielt. Die Umsetzung wurde bei 30°C und Rühren mit 150 UpM durchgeführt. Während der Umsetzung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit 5 N NaOH unter Verwendung eines Autofiltrators bei 7,0 gehalten. Die Hydrolysereaktion wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie beobachtet. Periodisch wurden Proben (1 ml) genommen und mit 4 ml Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde abgetrennt und zur Trockene eingedampft und durch HPLC wurden die Substrat- und Produktkonzentration und die optische Reinheit des Produkts analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind wie in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Beispiel 3
Stereoselektive Hydrolyse von (±)-cis-3-Acetoxy-4-phenyl-2-azetidinon unter Verwendung von immobilisiertem Enzym
Das verwendete Substrat und das bereitgestellte Produkt waren jene von Beispiel 1 vorstehend.
Immobilisierung des Enzyms
Drei unterschiedliche Träger – XAD-7 (nichtionisches Polymeradsorptionsmittel Amberlite XAD-7, 20 bis 60 mesh Polyacrylatharz), XAD-2 (nichtionisches Polymeradsorptionsmittel Amberlite XAD, 20 bis 60 mesh Polystyrolharz) und Accurel PP (Polypropylenharz 200 bis 400 Mikron) – wurden für die Immobilisierungsverfahren verwendet.
Rohe Amano PS-30 Lipase (10 g) wurde in 25 ml destilliertem Wasser gelöst und bei 10.000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert, wobei ein klarer Überstand erhalten wurde. Der Träger (1,3 g) in einem Fläschchen mit 25 ml wurde fünf Mal mit Methanol gewaschen und zu einer Enzymlösung in einem Kolben gegeben und sanft auf einer Kreiselschüttelvorrichtung bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Adsorption von Enzym an dem Träger wurde periodisch durch einen Lipasetest (Sigma Olivenölemulsion als Substrat) und durch Protein, welches im Filtrat verblieb, untersucht. Es wurden Adsorptionswirkungsgrade von etwa 68%, 71% und 98% unter Verwendung von XAD-7-, XAD-2- bzw. Accurelharzen erhalten. Nach einer vollständigen Immobilisierung (20 bis 24 Stunden) wurde die Träger-Enzym-Aufschlämmung durch einen Milipore-Filter filtriert und der Träger wurde mit etwa 300 ml destilliertem Wasser gewaschen. Darauffolgend wurde der Träger, welcher die immobilisierte Lipase enthielt, in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur getrocknet.
Verwendung von immobilsiertem Enzym
Immobilisiertes Enzym wurde für die in Beispiel 1 beschriebene enzymatische Hydrolysereaktion bewertet. Reaktionsgemische wurden in Behältern mit 20 ml Volumen (18 ml 25 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,0 und 2 ml Toluol), welche 200 mg Substrat wie in Beispiel 1 beschrieben und 200 mg der vorstehend hergestellten immobilisierten Lipase PS-30 enthielten, hergestellt. Die Umsetzungen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Bewertung von immobilisiertem Enzym auf die stereoselektive Hydrolysereaktion
Beispiel 4
Stereoselektive Hydrolyse von (±)-cis-3-Acetoxy-4-phenyl-2-azetidinon: Variieren der verwendeten Lipase
Das verwendete Substrat und das bereitgestellte Produkt waren jene von Beispiel 1 vorstehend. Bei diesem Beispiel ließ man eine Anzahl von Umsetzungen ablaufen, bei welchen Lipasen aus unterschiedlichen Quellen verwendet wurden.
Bei jeder Umsetzung enthielt das Reaktionsgemisch in 20 ml 25 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0 1 Gramm Rohlipase und 50 mg Substrat. Die Umsetzungen wurden bei 25°C in einem Autofiltrator bei einem pH-Wert von 7,0 durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Beispiel 5 Stereoselektive Acetylierung (Veresterung) von (±)-cis-3-Hydroxy-4-phenyl-2-azetidinon Substrat: die racemische Titelverbindung, das heißt
Produkt (+)-cis-3-Acetoxy-4-phenyl-2-azetidinon
(–)-cis-3-Hydroxy-4-phenyl-2-azetidinon
Bei diesem Beispiel ließ man eine Anzahl von Umsetzungen ablaufen, bei welchen Lipasen aus unterschiedlichen Quellen verwendet wurden.
Bei jeder Umsetzung enthielt das Reaktionsgemisch in 25 ml Toluol 1 Gramm Rohlipase und 100 mg Substrat, 800 mg Isopropenylacetat und 0,05% Wasser. Die Umsetzungen wurden bei 30°C und 100 UpM auf einer Schüttelvorrichtung durchgeführt. Die Produkte und Substrate wurden durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5

Claims

Verfahren zur Trennung eines Gemisches I, umfassend die Enantiomere Ia(1) und Ib(1):
um ein Gemisch II, umfassend die Verbindungen IIa(1) und IIb(1) zu bilden:
oder zur Trennung eines Gemisches I, umfassend die Enantiomere Ia(2) und Ib(2):
um ein Gemisch II, umfassend die Verbindungen IIa(2) und IIb(2) zu bilden:
wobei R² Aryl; Alkyl; Alkenyl oder Alkinyl ist; und R³ Wasserstoff; R⁴; -C(O)-OR⁴; oder -C(O)-R⁴ ist, wobei R⁴ Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl oder Heterocyclo ist; wobei das Verfahren einen der folgenden Schritte (i), (ii) oder (iii) umfasst: (i) wobei R¹ -O-C(O)-R⁴ ist, wobei R⁴ unabhängig ausgewählt ist aus den vorstehend für R⁴ genannten Gruppen; und ein Rest aus R^1a oder R^1b gleich R¹ ist und der andere aus R^1a oder R^1b Hydroxyl ist; den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I in Gegenwart von Wasser und/oder eines organischen Alkohols mit einem zur Katalyse der stereoselektiven Hydrolyse des Gemisches I fähigen Enzym oder Mikroorganismus, um das Gemisch II bereitzustellen, wobei das Enzym oder der Mikroorganismus eine Lipase oder Esterase, oder ein zur Herstellung einer Lipase oder Esterase fähiger Mikroorganismus ist; (ii) wobei R¹ Hydroxyl ist; und ein Rest aus R^1a oder R^1b Hydroxyl ist und der andere aus R^1a oder R^1b gleich R⁴-C(O)-O- ist, wobei R⁴ unabhängig aus den vorstehend für R⁴ genannten Resten ausgewählt ist; den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I in Gegenwart einer Verbindung III: R⁴-C(O)-L (III)wobei R⁴ wie vorstehend für R^1a oder R^1b definiert ist und L eine Abgangsgruppe ist, mit einem zur Katalyse der stereoselektiven Veresterung des Gemisches I fähigen Enzym, um das Gemisch II bereitzustellen, wobei das Enzym oder der Mikroorganismus aus einer Lipase, einer Esterase, Pancreatin und α-Chymotrypsin ausgewählt ist; oder (iii) wobei R¹ ein Halogenatom ist; und ein Rest aus R^1a oder R^1b Halogen ist und der andere aus R^1a oder R^1b Hydroxyl ist; den Schritt des in Kontakt bringens des Gemisches I in Gegenwart eines Hydroxidionendonors mit einem zur Katalyse der stereoselektiven Dehalogenierung des Gemisches I fähigen Enzym oder Mikroorganismus, um das Gemisch II bereitzustellen, wobei das Enzym oder der Mikroorganismus ausgewählt ist aus den Gattungen Pseudomonas, Trichoderma, Acinetobacter, Alcaligenes, Nocardia, Mycobacterium, Rhodococcus, Methanobacterium, Proteus oder davon abgeleiteten Enzymen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei: das Enzym oder der Mikroorganismus für Schritt (i) ausgewählt ist aus Lipase P-30 aus Pseudomonas sp., Lipase N aus Rhizopus niveus, Lipase APF aus Aspergillus niger, Lipase GC-20 aus Geotrichum candidum, Lipase AK aus Pseudomonas sp., Lipase AY-30 aus Candida sp. und Pseudomonas fluorescens Lipase; und das Enzym oder der Mikroorganismus für Schritt (ii) ausgewählt ist aus Lipase PS-30 aus Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia), Lipase P-30 aus Pseudomonas sp., Lipase GC-20 Geotrichum candidum, Lipase N Rhizopus niveus, Lipase APF Aspergillus niger, Lipase AY-30 Candida sp., Lipase AK Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens Lipase und Lipase der Bauchspeicheldrüse des Schweins.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R¹ unsubstituiertes Alkanoyloxy oder Chloralkanoyloxy oder Hydroxy ist; R² Phenyl oder substituiertes Phenyl ist; und R³ Wasserstoff, Phenyl, substituiertes Phenyl, Phenylcarbonyl, substituiertes Phenylcarbonyl, Alkylcarbonyl, Alkenylcarbonyl oder Alkoxycarbonyl ist; R⁶ Wasserstoff oder R⁴ ist, wobei Letzterer eine Estergruppe bildet; R⁶ Wasserstoff oder C_1-6-Alkyl ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R⁴ ein C_1-6-Alkylrest ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei L ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, ein Alkoxy- oder Alkenoxyrest ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei sich das Enzym in seinem freien Zustand befindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Enzym in immobilisierter Form vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Enzym auf einen aus Kieselgur, mikroporösem Polypropylen oder einem nicht ionischen polymeren Adsorbtionsmittel ausgewählten Träger adsorbiert ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der organische Alkohol aus Schritt (i) die Formel IX: R⁸-OH (IX)aufweist, wobei R⁸ ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Cycloalkyl-, Cycloalkenyl- oder Heterocyclorest ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Hydroxidionendonor aus Schritt (iii) ausgewählt ist aus Wasser, Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxiden, quartären Ammoniumhydroxiden der Formel (R⁹)₄NOH, wobei R⁹ Wasserstoff oder Alkyl ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, Schritt (i), wobei R¹ -O-COCH₃ ist, R² Phenyl ist und R³ H ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, Schritt (i), wobei R¹ -O-COCH₃ ist, R² Phenyl ist und R³ 4-Methoxylphenyl ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, welches in Kontakt bringen des Enantiomerengemisches mit Lipase PS-30 aus Pseudomonas sp. umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, Schritt (ii), wobei R¹ OH ist, R² Phenyl ist und R³ H ist, und wobei die Verbindung der Formel III Isopropenylacetat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, welches in Kontakt bringen des Enantiomerengemisches mit einer Lipase, ausgewählt aus Lipase PS-30 aus Pseudomonas sp. (Pseudomonas cepacia), Lipase P-30 aus Pseudomonas sp., Lipase GC-20 Geotrichum candidum, Lipase N Rhizopus niveus und Lipase AY-30 Candida sp., umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Taxans, umfassend die Verwendung eines Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche.