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Die
Erfindung betrifft Verfahren zum Isolieren neuer Proteine. Diese
Erfindung betrifft auch Krebsdiagnosemittel und -therapeutika.
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In
den meisten eukaryotischen Zellen wird der Zellzyklus durch Kontrollen
gesteuert, die während
G1 und G2 ausgeübt
werden. Während
G2 entscheiden sich die Zellen, ob sie als Antwort auf relativ wenig
beschriebene intrazelluläre
Signale, wie z.B. jene, die die Beendigung der DNA-Synthese anzeigen
(Nurse, Nature 344: 503–508,
1990; Enoch und Nurse, Cell 65: 921–923, 1991), in M eintreten.
Während
G1 treten die Zellen entweder in S ein oder ziehen sich aus dem
Zellzyklus zurück
und treten in einen sich nicht teilenden Zustand ein, der als G0
bekannt ist (Pardee, Science 246: 603–608, 1989). Während die
Kontrollmechanismen für
diese Entscheidungen bisher noch nicht gut verstanden sind, ist
ihre Funktion eindeutig zentral für die Prozesse einer normalen
Metazoenentwicklung und für
die Karzinogenese.
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In
der Hefe, und wahrscheinlich in allen Eukaryoten, hängen die
G1/S- und G2/M-Übergänge von
einer Familie von ~34 kd Proteinkinasen, den Cdc2-Proteinen, ab, die
von den cdc2+- (in S. pombe) und CDC28-(in S.
cerevisiae) -Genen kodiert werden. Proteine aus der Cdc2-Familie
aus Säugerzellen
wurden ebenfalls identifiziert. Einige, einschließlich Cdc2
(Lee und Nurse, Nature 327: 31–35,
1987), Cdk2 (Elledge und Spotswood, EMBO J. 10: 2653–2659, 1991;
Tsai et al., Nature 353: 174–177,
1991) und Cdk3 (Meyerson et al., EMBO J. 11: 2909–2917, 1992)
können
eine cdc28' S. cerevisiae
für Wachstum
komplementieren.
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Die
Aktivität
der Cdc2-Proteine am G2/M-Übergangspunkt
wird auf zwei Arten reguliert: positiv durch die Assoziation mit
Cycline genannten regulatorischen Proteinen und negativ durch die
Phosphorylierung eines Tyrosins in der Nähe ihrer ATP-Bindungsstelle.
Mindestens einer dieser regulatorischen Mechanismen ist während G1
wirksam (siehe 1A). Zu dieser Zeit wird die
Cdc2-Proteinaktivität durch
fakultative Assoziation mit verschiedenen G1-spezifischen Cyclinen
reguliert. In S. cerevisiae wurden in genetischen Screens mindestens
fünf putative
G1-Cycline identifizierte, einschließlich den Produkten der CLN1-,
CLN2-, CLN3-, HSC26- und CLB5-Gene (Cross, Mol. Cell. Biol. 8: 4675–4684, 1988;
Nash et al., EMBO J. 7: 4335–4346, 1988;
Hadwiger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 6255–6259, 1989;
und Ogas et al., Cell 66: 1015–1026, 1991).
Die CLN1-, CLN2- und CLN3-Proteine (hier Cln1, Cln2 und Cln3 genannt)
sind jedes für
sich einzelen ausreichend, einer Zelle zu erlauben, den G1-zu-S-Übergang
zu vollziehen (Richardson et al., Cell 59: 1127–1133, 1989), und mindestens
eines von ihnen (Cln2) assoziiert mit Cdc28 zu einem Komplex, der
als eine Proteinkinase aktiv ist (Wittenberg et al., Cell 62: 225–237, 1990).
Kürzlich
wurden putative G1-Cycline in Säugerzellen
identifiziert: Cyclin C, Cyclin D (drei Formen) und Cyclin E (Koff
et al., Cell 66: 1217–1228,
1991; Xiong et al., Cell 65: 691–699, 1991). Jedes dieser drei
Säugercycline
komplementiert eine in Cln1, Cln2 und Cln3 defiziente Hefe und jedes
ist während
G1 exprimiert.
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In
S. cerevisiae ist die Synthese und in einigen Fällen die Aktivität der G1-Cycline unter der
Kontrolle eines Netzwerks von Genen, die helfen, Veränderungen
in der extrazellulären
Umgebung an G1-regulatorische Entscheidungen zu koppeln (1A).
Zum Beispiel regulieren die SWI4- und SWI6-Genprodukte die CLN1-
und CLN2-Transkription positiv und können auch die Aktivität von Cln3
positiv modulieren (Nasmyth und Dirick, Cell 66: 995–1013, 1991),
das FAR1-Produkt reguliert sowohl die CLN2-Transkription als auch
die Aktivität
seines Produktes negativ (Chang und Herskowitz, Cell 62: 999–1011, 1990)
und das FUS3-Produkt reguliert die Cln3-Aktivität negativ (Elion et al., Cell
60: 649–664,
1990).
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Eine
Reihe von Hinweisen legt die Vermutung nahe, dass der G1-zu-S-Übergang
bei Säugern
von ähnlichen
Mechanismen reguliert wird: Regulatorische Moleküle (Cdc2-Kinasen und Cycline),
die ähnlich
zu den in Hefe gefundenen sind, wurden in Säuger-G1 beobachtet und wie
S. cerevisiae-Zellen, so stoppen Säugerzellen in G1 bei Nahrungsentzug
und als Antwort auf bestimmte negative regulatorische Signale, einschließlich Kontakt
mit anderen Zellen oder Behandlung mit negativen Wachstumsfaktoren
(z.B. TGF-β) (1B).
Allerdings legen einige Überlegungen
die Vermutung nahe, dass die G1-regulatorische Maschinerie höherer Eukaryoten
wahrscheinlich komplexer ist als die der Hefe. Erstens scheinen
in Säugerzellen
mehr Proteine in diesen Prozess involviert zu sein. Mindestens zehn
verschiedene Proteine der Cdc2-Familie und verwandte Proteinkinasen
(siehe Meyerson et al., EMBO J. 11: 2909–2917, 1992) und mindestens
drei unterschiedliche Klassen von putativen G1-Cyclinen (Koff et
al., Cell 66: 1217–1228,
1991; Matsushime et al., Cell 65: 701–713, 1991; Motokura et al.,
Nature 339: 512–518,
1991; Xiong et al., Cell 65: 691–699, 1991) wurden identifiziert.
Zum zweiten hängt
die Proliferation der meisten Säugerzellen
im Gegensatz zur Hefe von extrazellulären Proteinfaktoren (insbesondere
positiven Wachstums-regulatorischen Proteinen) ab, deren Entzug zu
einem G1-Arrest führt.
Drittens kann der Arrest vieler Zelltypen während G1 zu einem Zustand,
G0, fortschreiten, der möglicherweise
keiner Phase des Hefezellzyklus genau gleicht.
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Da
die Proteine, die in die Kontrolle normaler Zellteilungsentscheidungen
in Säugern
(z.B. Menschen) involviert sind, wahrscheinlich auch eine Schlüsselfunktion
in malignem Zellwachstum haben, erleichtert die Identifikation und
Isolation solcher Proteine die Entwicklung von sowohl brauchbaren Krebsdiagnostika
als auch Antikrebstherapeutika. "The
Journal of NIH Research" (1991,
Bd. 3: 44–46)
offenbart ein "Two-Hybrid"-System zum Nachweisen
von Protein-Protein-Interaktionen in vivo, das ein "Köder"-Hybridgen und ein "Beute"-Hybridgen umfasst. Das "Beute"-Protein enthält eine
starke transkriptionale Aktivierungsdomäne, d.h. die Aktivierungsdomäne von GAL4
oder VP16. Wir beschreiben jetzt (i) ein neues System zum Identifizieren von
Proteinen, die während
einer gewissen Zeit während
ihrer Existenz an bestimmten Protein-Protein-Interaktionen teilnehmen;
(ii) die Verwendung dieses Systems zum Identifizieren interagierender
Proteine, die Schlüsselregulatoren
der Zellteilung von Säugern
sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Im
Allgemeinen bietet die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen, ob
ein erstens Protein in der Lage ist, mit einem zweiten Protein physikalisch
zu interagieren, (d.h. direkt oder indirekt). Das Verfahren bezieht ein:
(a) Bereitstellen einer Wirtszelle, die (i) ein Reportergen, das
funktionsfähig
mit einer Proteinbindungsstelle verknüpft ist; (ii) ein erstes Fusionsgen,
das ein erstes Fusionsprotein exprimiert, wobei das erste Fusionsprotein
ein erstes Protein enthält,
das kovalent an eine Bindungskomponente gebunden ist, die in der
Lage ist, spezifisch an die Proteinbindungsstelle zu binden und
(iii) ein zweites Fusionsgen, das ein zweites Fusionsprotein exprimiert,
wobei das zweite Fusionsprotein ein zweites Protein enthält, das
kovalent an eine schwache Genaktivierende Komponente gebunden ist,
die ein geringeres Aktivierungspotential als die GAL4-Aktivierungsregion
II aufweist, enthält;
und (b) Messen der Expression des Reportergens als Maß für die Interaktion zwischen
den ersten und zweiten Proteinen. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das Verfahren zusätzlich
das Isolieren des Gens, das das zweite Protein kodiert.
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Die
schwache Gen-aktivierende Komponente weist ein geringeres Aktivierungspotential
als die GAL4-Aktivierungsregion II auf und ist vorzugsweise die
Gen-aktivierende Komponente von B42 oder eine Genaktivierende Komponente
mit geringerem Aktivierungspotential; die Wirtszelle ist eine Hefezelle;
das Reportergen schließt
das LEU2-Gen oder das lacZ-Gen ein; die Wirtszelle enthält zusätzlich ein
zweites Reportergen, das funktionsfähig mit der Proteinbindungsstelle
verknüpft
ist, z.B. schließt
die Wirtszelle sowohl ein LEU2-Reportergen als auch ein lacZ-Reportergen
ein; die Proteinbindungsstelle ist eine LexA-Bindungsstelle und
die Bindungskomponente schließt
eine LexA-DNA-Bindungsdomäne ein;
das zweite Protein ist ein Protein, das in die Kontrolle der eukaryontischen
Zellteilung einbezogen ist, z.B. ein Cdc2-Zellteilungskontrollprotein.
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Mit „Reportergen", wie es hierin verwendet
wird, ist ein Gen gemeint, dessen Expression untersucht werden kann;
solche Gene schließen
ohne Einschränkung
ein lacZ, Aminosäurebiosynthesegene,
z.B. die Hefe LEU2-, HIS3-, LYS2- oder URA3-Gene, Nukleinsäurebiosynthesegene,
das Säugerchloramphenicoltransacetylase(CAT)-Gen
oder irgendein Oberflächenantigen-Gen,
für das
spezifische Antikörper
verfügbar sind.
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Mit „funktionsfähig verknüpft" ist ein Gen und
(eine) regulatorische Sequenz(en) gemeint, die in einer solchen
Weise verknüpft
sind, dass die Genexpression ermöglicht
ist, wenn geeignete Moleküle
(z.B. transkriptionale Aktivatorproteine oder Proteine, die transkriptionalen
Aktivierungsdomänen
einschließen)
an die regulatorische(n) Sequenz(en) gebunden sind.
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Mit
einer „Bindungskomponente" ist ein Stück von Aminosäuren gemeint,
das in der Lage ist, eine spezifische Polypeptidbindung an eine
bestimmte DNA-Sequenz
(d.h. eine "-Proteinbindungsstelle") zu steuern.
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Mit
einer „schwachen
Genaktivierungskomponente" ist
ein Stück
von Aminosäuren
gemeint, das in der Lage ist, eine schwache Expressions eines Gens,
an dessen Kontrollregion es gebunden ist, zu induzieren. „Schwach", wie es hierin verwendet
wird, meint ein Aktivitätsniveau
unter dem, das mit der GAL4-Aktivierungsregion
II (Ma und Ptashne, Cell 48: 847, 1987) bewirkt wird und ist vorzugsweise
auf oder unter dem Aktivierungsniveau, das durch die B42-Aktivierungsdomäne von Ma
und Ptashne (Cell 51: 113, 1987) bewirkt wird. Die Expressionsniveaus
können
gemessen werden, indem irgendein abwärts gelegenes Reportergensystem verwendet
wird und in Parallelversuchen das durch das GAL4-Region-II-Polypeptid
stimulierte Expressionsniveau mit dem Expressionsniveau, das durch
das zu testende Polypeptid stimuliert wurde, verglichen wird.
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Mit „im Wesentlichen
rein" ist eine Zubereitung
gemeint, die mindestens 60 Gew.-% (Trockengewicht) der Verbindung
des Interesses, z.B. ein Cdi1-Polypeptid,
enthält.
Vorzugsweise ist die Zubereitung zu mindestens 75%, mehr bevorzugt
mindestens 90% und am meisten bevorzugt mindestens 99% des Gewichts
die Verbindung des Interesses. Die Reinheit kann durch jedes geeignete
Verfahren gemessen werden, z.B. Säulenchromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese
oder HPLC-Analyse.
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Mit „gereinigter
DNA" ist DNA gemeint,
die nicht unmittelbar an die beiden kodierenden Sequenzen angrenzend
ist, an welche sie in dem natürlich
vorkommenden Genom des Organismus, aus dem sie stammt, angrenzt
(eines an dem 5'-Ende
und eines an dem 3'-Ende).
Der Ausdruck schließt
daher zum Beispiel ein eine rekombinante DNA, die in einen Vektor;
in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus; oder in die genomische
DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten aufgenommen ist oder die als
ein separates Molekül
unabhängig
von anderen Sequenzen existiert (z.B. eine cDNA oder ein genomi sches
DNA-Fragment, hergestellt durch PCR oder Restriktionsendonukleasebehandlung).
Er schließt
auch eine rekombinante DNA ein, die Teil eines Hybridgens ist, das
eine zusätzliche
Polypeptidsequenz kodiert.
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Mit „im Wesentlichen
identisch" ist eine
Aminosäuresequenz
gemeint, die nur durch konservative Aminosäureaustausche, zum Beispiel
Substitutionen einer Aminosäure
mit einer anderen der gleichen Klasse (z.B. Valin für Glycin,
Arginin für
Lysin, usw.) oder durch ein oder mehrere nicht konservative Substitutionen, Deletionen
oder Insertionen, die sich an Positionen der Aminosäuresequenz
befinden, die nicht die Funktion des Proteins zerstören (getestet,
z.B. wie hierin beschrieben). Eine „im Wesentlichen identische" Nukleinsäuresequenz
kodiert für
eine im Wesentlichen identische Aminosäuresequenz, wie sie oben definiert
wurde.
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Mit
einer „transformierten
Zelle" ist eine
Zelle gemeint, in welche (oder in deren Vorfahr) durch Mittel der
rekombinanten DNA-Technik ein DNA-Molekül eingeführt wurde, das für ein (wie
hierin verwendetes) Cdi1-Polypeptid kodiert.
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Mit "-Positioniert zur
Expression" ist
gemeint, dass das DNA-Molekül
angrenzend an eine DNA-Sequenz positioniert ist, die die Transkription
und Translation der Sequenz steuert (d.h., die Produktion von z.B. einem
Cdi1-Polypeptid
erleichtert).
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Mit
einem „gereinigten
Antikörper" ist ein Antikörper gemeint,
der mindestens 60 Gew.-% frei von Proteinen und natürlich auftretenden
organischen Molekülen
ist, mit denen er natürlicherweise
assoziiert ist. Vorzugsweise besteht die Zubereitung zu mindestens
75%, mehr bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt 99%
des Gewichts aus Antikörper,
z.B. dem Cdi1-spezifischen Antikörper.
Ein gereinigter Cdi1-Antikörper
kann zum Beispiel durch Affinitätschromatographie unter
Verwendung rekombinant hergestellter Cdi1-Polypeptide und Standardtechniken
erhalten werden.
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Mit „spezifisch
binden" ist ein
Antikörper
gemeint, der das Cdi1-Polypeptid erkennt und bindet, aber im Wesentlichen
keine anderen Moleküle
in der Probe, z.B. einer biologischen Probe, die natürlicherweise
ein Cdi1-Polypeptid umfasst, erkennt und bindet.
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Mit
einer „malignen
Zelle" ist eine
Zelle gemeint, die keiner normalen Zellteilungskontrolle unterliegt. Eingeschlossen
in diese Definition sind transformierte und immortalisierte Zellen.
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Das
hierin beschriebene "Interaction-Trap-System" stellt gegenüber den
konventionelleren Verfahren zum Isolieren interagierender Proteine
oder Gene, die interagierende Proteine kodieren, Vorteile bereit.
Am bemerkenswertesten ist, dass das System des Anmelders ein schnelles
und kostengünstiges
Verfahren mit sehr allgemeiner Verwendbarkeit zum Identifizieren
und Reinigen von Genen, die eine große Bandbreite verwendbarer
Proteine kodieren, auf Grundlage der physikalischen Interaktionen
des Proteins mit einem Polypeptid bekannter diagnostischer oder
therapeutischer Verwendbarkeit zur Verfügung stellt. Diese allgemeine
Verwendbarkeit beruht zum Teil auf der Tatsache, dass die Komponenten
des Systems leicht modifiziert werden können, um den Nachweis der Proteininteraktion
stark variierender Affinität
zu erleichtern (z.B. durch Verwenden von Reportergenen, die quantitativ
in ihrer Empfindlichkeit für
eine Proteininteraktion unterschiedlich sind). Die induzierbare
Natur des zur Expression der interagierenden Proteine verwendeten
Promotors erhöht
auch den Umfang der Interaktionskandidaten, die nachgewiesen werden
können,
da sogar Proteine, deren chronische Expression für die Wirtszelle toxisch ist,
einfach isoliert werden können,
indem ein kurzer "Burst" der Expression des
Proteins induziert wird und es auf seine Fähigkeit getestet wird, zu interagieren
und die Expression eines β-Galactosidase-Reportergens
zu stimulieren.
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Darüber hinaus
vermeidet der Nachweis von interagierenden Proteinen durch die Verwendung
eines schwachen Gen-Aktivierungsdomänen-Tags die Beschränkung auf
den Pool verfügbarer
interagierender Kandidatenproteine, die kennzeichnenderweise mit
einer stärkeren
Aktivierungsdomäne
(wie z.B. GAL4 oder VP16) verbunden sind; obwohl der Mechanismus
unklar ist, resultiert eine solche Beschränkung offensichtlich aus den
niederen bis moderaten Spiegeln an Wirtszelltoxizität, die durch
die starke Aktivierungsdomäne
vermittelt wird.
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Andere
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung hiervon und aus den Ansprüchen offensichtlich werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Zeichnungen werden zuerst kurz beschrieben.
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1 veranschaulicht Zellzykluskontrollsysteme. 1A veranschaulicht
die G1-Kontrolle in Hefe. 1B veranschaulicht
die Zellzykluskontrolle in Hefe und Säugern.
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2A-Cstellt
ein "Interaction-Trap"-System gemäß der Erfindung
dar.
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3A ist
eine Darstellung eines "Köder"-Proteins, das in
der Erfindung verwendbar ist; die Zahlen stellen die Aminosäuren dar. 3B ist
eine Darstellung von Reportergenen, die in der Erfindung verwendbar sind. 3C ist
eine Darstellung eines Bibliotheksexpressionsplasmids, das in der
Erfindung verwendbar ist, und der N-terminalen Aminosäuresequenz
eines beispielhaften "Beute"-Proteins gemäß der Erfindung.
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4 stellt
Hefetests dar, die die Spezifität
der Cdi1/Cdc2-Interaktion zeigen.
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5 zeigt
die Ergebnisse eines Immunpräzipitationsexperiments,
das zeigt, dass Cdi1 mit Cdc2 physikalisch interagiert.
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6 zeigt
einen Sequenzvergleich von Cdc2-Proteinen und FUS3. Dargestellt
ist ein Sequenzvergleich der hierin verwendeten Köderproteine.
Die Aminosäuren
sind wie im humanen Cdc2 nummeriert. Die Abkürzungen sind wie folgt: HsCdc2,
humanes Cdc2; HsCdk2, humanes Cdk2; ScCdc28, S. cerevisiae Cdc28; DmCdc2
und DmCdc2c, die zwei Drosophila Cdc2-Isolate; und ScFus3, S. cerevisiae
FUS3. Die in Fettschrift gezeigten Reste sind innerhalb der Mitglieder
der Cdc2-Familie konserviert; die Reste, die in Fus3 vorhanden sind,
sind ebenfalls fett gezeigt. Die Sterne indizieren potenzielle Cdi1-Kontaktpunkte,
d.h. Aminosäuren,
die in humanem Cdc2, Cdk2, S. cerevisiae Cdc28 und Drosophila Cdc2
konserviert sind, aber in Drosophila Cdc2c und in Fus3 unterschiedlich
sind.
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Es
folgt nun eine Beschreibung eines Beispiels eines „Interaction-Trap"-Systems und seiner
Verwendung zur Isolierung eines bestimmten Zellteilungsproteins.
Dieses Beispiel wurde konzipiert, um die Beschreibung zu illustrieren,
aber nicht einzuschränken.
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Ausführliche
Beschreibung
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Die
Anmelder entwickelten ein in vivo-"Interaction-Trap"-System für die Isolierung von Genen,
die Proteine kodieren, die physikalisch mit einem zweiten Protein
bekannter diagnostischer oder therapeutischer Verwendbarkeit interagieren.
Das System bezieht einen eukaryontischen Wirtsstamm (z.B. einen
Hefestamm) ein, der technisch so verändert ist, dass das Protein
des therapeutischen oder diagnostischen Interesses als ein Fusionsprotein
exprimiert wird, das kovalent an eine bekannte DNA-Bindungsdomäne gebunden
ist; dieses Protein wird als ein "Köder"-Protein bezeichnet,
da sein Zweck in dem System darin besteht, verwendbare, aber bisher
unbekannte oder uncharakterisierte, interagierende Polypeptide (die
mit "Beute" bezeichnet werden;
siehe unten) zu "fangen". Der eukaryontische
Wirtsstamm enthält
auch ein oder mehrere "Reportergene", d.h. Gene, deren
Transkription in Antwort auf eine Köder-Beute-Interaktion nachgewiesen wird. Köder-Proteine
binden über
ihre DNA-Bindungsdomäne an ihre
spezifische DNA-Stelle stromabwärts
eines Reportergens; die Reportertranskription wird allerdings nicht
stimuliert, da dem Köderprotein
seine eigene Aktivierungsdomäne
fehlt.
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Um
Gene zu isolieren, die neue interagierende Proteine kodieren, werden
Zellen dieses Stamms (die ein Reportergen enthalten und ein Köderprotein
exprimieren) mit einzelnen Mitgliedern einer DNA-(z.B. einer cDNA-)-Expressionsbibliothek
transformiert; jedes Mitglied der Bibliothek steuert die Synthese
eines Kandidaten für
interagierende Proteine, der an ein schwaches und unveränderliches
Gen-Aktivierungsdomänen-Tag fusioniert
ist. Solche von einer Bibliothek kodierten Proteine, die physikalisch
mit dem Promotor-gebundenen Köderprotein
interagieren, werden als "Beute"-Protein bezeichnet.
Solche gebundenen Beuteproteine aktivieren (über ihr Aktivierungsdomänen-Tag)
die Transkription des stromabwärts
gelegenen Reportergens nachweisbar und stellen einen fertigen Test
zur Identifizierung bestimmter Zellen, die einen DNA-Klon beherbergen, der
ein interagierendes Protein von Interesse kodiert, bereit.
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Ein
Beispiel eines solchen "Interaction-Trap"-Systems ist in 2 gezeigt. 2A zeigt
einen Hefestamm, der zwei Reportergene LexAop-LEU2 und LexAop-lacZ,
und ein konstitutiv exprimiertes Köderprotein, LexACdc2, enthält. Die
Synthese von Beuteprotein wird durch Wachsenlassen der Hefe in Gegenwart
von Galactose induziert. 2B zeigt,
dass die Reportergene nicht transkribiert werden, wenn das Beuteprotein nicht
mit dem transkriptionell inerten LexA-Fusionsköderprotein interagiert; die
Zelle kann in einer Kolonie auf LEU–-Medium nicht wachsen
und ist auf Xgal-Medium weiß,
da sie keine β-Galactosidase-Aktivität besitzt. 2C zeigt,
dass beide Reportergene aktiv sind, wenn das Beuteprotein mit dem
Köder interagiert;
die Zelle bildet auf LEU–-Medium eine Kolonie und Zellen in dieser
Kolonie besitzen β-Galactosidase-Aktivität und sind auf
Xgal-Medium blau.
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Wie
hierin beschrieben, wurde bei der Entwicklung des "Interaction-Trap"-Systems das in 2 in
einem Diagramm gezeigt ist, sorgfältig auf die drei Klassen von
Bestandteilen acht gegeben: (i) die Verwendung von Köderproteinen,
die eine Stellen-spezifische DIVA-Bindungsdomäne enthielten, von der bekannt
war, dass sie transkriptionell inert ist; (ii) die Verwendung von
Reportergenen, die im Wesentlichen keine basale Transkription besaßen und
die von dem Köderprotein
gebunden wurden; und (iii) die Verwendung von Beuteproteinen, die
von einer Bibliothek kodiert wurden und von denen alle als Chimären exprimiert
wurden, deren Aminotermini die gleiche schwache Aktivierungsdomäne und vorzugsweise
andere verwendbare Komponenten, wie z.B. Kernlokalisierungssignale,
enthielten. Jeder Bestandteil des Systems wird nun im Einzelnen
beschrieben.
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Köderproteine
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Der
Selektionswirtsstamm, der in 2 dargestellt
ist, enthält
einen Cdc2-Köder
und eine DNA-Bindungskomponente, die von dem bakteriellen LexA-Protein
stammt (siehe 3A). Die Verwendung einer LexA-Bindungsdomäne hat bestimmte
Vorteile. Z.B. enthält
in der Hefe die LexA-Komponente keine Aktivierungsfunktion und besitzt
keine bekannte Wirkung auf die Transkription von Hefegenen (Brent
und Ptashne, Nature 312: 612–615,
1984; Brent und Ptashne, Cell 43: 729–736, 1985). Zusätzlich erlaubt
die Verwendung von LexA anstelle der GAL4-DNA-Bindungsdomäne eine
bedingte Expression von Beuteproteinen in Antwort auf Galactoseinduktion;
dies erleichtert den Nachweis von Beuteproteinen, die für die Wirtszellen
toxisch sein könnten,
wenn sie kontinuierlich exprimiert werden. Schließlich erlaubt
es die Verwendung von LexA das Wissen hinsichtlich der Interaktion
zwischen LexA und der LexA-Bindungsstelle
(d.h. dem LexA-Operator) für
den Zweck der Optimierung der Operatorbelegung auszunutzen.
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Das
in 3A dargestellte Köderprotein schließt auch
eine LexA-Dimerisierungsdomäne ein;
diese optionale Domäne
erleichtert eine effektive LexA-Dimer-Bildung. Da LexA seine DNA-Bindungsstelle
als ein Dimer bindet, optimiert der Einschluss dieser Domäne in das
Köderprotein
die Wirksamkeit der Operatorbelegung (Golemis und Brent, Mol. Cell
Biol. 12: 3006–3014,
1992).
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LexA
stellt eine bevorzugte erfindungsgemäße DNA-Bindungsdomäne dar.
Allerdings kann jede andere transkriptionell inerte oder im Wesentlichen
transkriptionell inerte DNA-Bindungsdomäne in dem "Interaction-Trap"-System verwendet werden; solche DNA-Bindungsdomänen sind
gut bekannt und schließen
die DNA-Bindungsteile der Proteine ACE1 (CUP1), lambda cI, Lac-Repressor, jun fos
oder GCN4 ein. Aus den oben beschriebenen Gründen stellt die GAL4-DNA-Bindungsdomäne eine
geringfügig
weniger bevorzugte DNA-Bindungsdomäne für Köderproteine
dar.
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Als
Köderproteine
kann auch jedes Protein bekannter oder vermuteter diagnostischer
oder therapeutischer Wichtigkeit ausgewählt werden. Bevorzugte Köderproteine
schließen
Oncoproteine (wie z.B. myc, insbesondere der C-Terminus von myc, ras, src, fos und
insbesondere die oligomeren Interaktionsdomänen von fos) oder jedes andere
Protein ein, das in die Zellzyklusregulation einbezogen ist (wie
z.B. Kinasen, Phosphatasen, die cytoplasmatischen Teile Membran-gebundener
Rezeptoren und andere Cdc2-Familienmitglieder). Auf
jeden Fall würde
das Protein von diagnostischer oder therapeutischer Wichtigkeit
an eine bekannte DNA-Bindungsdomäne,
wie allgemein für
LexA-Cdc2 beschrieben, fusioniert werden.
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Reporter
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Wie
in 3B gezeigt, enthält ein Wirtsstamm gemäß der Erfindung
zwei verschiedene Reportergene, das LEU2-Gen und das LacZ-Gen, wobei
jedes eine stromaufwärts
gelegene Bindungsstelle für
das Köderprotein
trägt.
Die Reportergene, die in 3B gezeigt
sind, schließen
jeweils als eine stromaufwärts
gelegene Bindungsstelle einen oder mehrere LexA-Operator(en) an
der Stelle ihrer nativen "Upstream
Activation Sequences" (UASs)
ein. Diese Reportergene können
in das Chromosom integriert sein oder können auf autonom replizierenden
Plasmiden (z.B. Hefe 2 μ-Plasmiden)
getragen werden.
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Eine
Kombination zweier solcher Reporter ist in der Erfindung aus einer
Reihe von Gründen
bevorzugt. Erstens erlaubt es die LexAop-LEU2-Konstruktion, Zellen,
die interagierende Proteine enthalten, sich selbst durch Wachstum
auf Medium, dem Leucin fehlt, zu selektionieren, was die Untersuchung
einer großen Anzahl potentieller
Interaktor-Protein-enthaltender Zellen erleichtert. Zweitens erlaubt
es der LexAop-LacZ-Reporter, LEU+-Zellen
schnell zu screenen, um eine Interaktion zu bestätigen. Und drittens stellt
der LexAop-LEU2-Reporter neben anderen technischen Überlegungen
(siehe unten) eine extrem empfindliche erste Selektion bereit, wohingegen
der LexAop-lacZ-Reporter es erlaubt, zwischen Proteinen verschiedener
Interaktionsaffinitäten
zu unterscheiden.
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Obwohl
die hierin beschriebenen Reportergene eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung darstellen, können
andere äquivalente
Gene, deren Expression durch den Stand der Technik nachgewiesen
oder getestet werden kann, auch in Verbindung mit oder anstelle
von den LEU2- und LacZ-Genen eingesetzt werden. Beispiele anderer
verwendbarer Gene, deren Expression nachgewiesen werden kann, schließen Aminosäure- und
Nukleinsäure-Biosynthesegene
(wie z.B. HIS3, URA3 und LYS2 aus Hefe) GAL1, E. coli galK (das das
GAL1-Gen aus Hefe komplementiert) und die Reportergene höherer Zellen
CAT, GUS und jedes beliebige Gen, das ein Zelloberflächenantigen
kodiert, für
das Antikörper
vorhanden sind (z.B. CD4), ein.
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Beuteproteine
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In
der hierin beschriebenen Selektion wurde ein viertes DNA-Konstrukt
verwendet, das eine Reihe von Kandidaten interagierender Proteine
kodiert, wobei jedes an eine schwache Aktivierungsdomäne fusioniert war
(d.h. Beuteproteine). Ein solches Beuteproteinkonstrukt ist in 3C gezeigt;
dieses Plasmid kodiert ein Beutefusionsprotein, das eine unveränderliche
N-terminale Komponente einschließt. Diese Komponente trägt vom Amino-
zum Carboxy-Terminus ein ATG zur Proteinexpression, eine optionale
Kernlokalisierungssequenz, eine schwache Aktivierungsdomäne (d.h.
die B42-Aktivierungsdomäne
von Ma und Ptashne; Cell 51: 113, 1987) und ggf. ein Epitop-Tag
zum schnellen immunologischen Nachweis der Fusionsproteinsynthese. Wie
hierin beschrieben wurde eine HeLa-cDNA-Bibliothek konstruiert und
zufällige
Bibliothekssequenzen wurden stromabwärts dieses N-terminalen Fragments
insertiert, um Fusionsgene herzustellen, die Beuteproteine kodieren.
-
Andere
als die hierin beschriebenen Beuteproteine sind auch in der Erfindung
verwendbar. Z.B. können
cDNAs aus jeder mRNA-Population konstruiert und in einen entsprechenden
Expressionsvektor insertiert werden. Eine solche Bibliothek der
Wahl kann de novo unter Verwendung kommerziell erhältlicher
Kits (z.B. von Stratagene, La Jolla, CA) oder unter Verwendung gut
etablierter präparativer
Vorgehensweisen (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology,
New York, John Wiley & Sons,
1987) hergestellt werden. Alternativ sind eine Reihe von cDNA-Bibliotheken
(aus einer Anzahl verschiedener Organismen) öffentlich und kommerziell erhältlich;
Quellen von Bibliotheken schließen
z.B. Clontech (Palo Alto, CA) und Stratagene (La Jolla, CA) ein. Es
wird auch festgestellt, dass Beuteproteine keine natürlich vorkommenden
Volllängenpolypeptide
sein müssen.
Z.B. kann ein Beuteprotein von einer synthetischen Sequenz kodiert
werden oder kann das Produkt eines zufällig gebildeten offenen Leserahmens
oder eines Teils hiervon sein. In einem besonderen Beispiel schließt das Beuteprotein
nur eine Interaktionsdomäne
ein; eine solche Domäne
kann als ein Therapeutikum zur Veränderung der Köderproteinaktivität verwendbar
sein.
-
In ähnlicher
Weise können
andere schwache Aktivierungsdomänen
den B42-Teil des Beutemoleküls ersetzen.
Solche Aktivierungsdomänen
müssen
schwächer
als die GAL4-Aktivierungsregion II-Komponente sein und sollten vorzugsweise
nicht stärker
als B42 sein (gemessen z.B. durch einen Vergleich mit der GAL4-Aktivierungsregion
II oder B42 in parallelen β-Galactosidase-Tests
unter Verwendung von LacZ-Reportergenen); eine solche Domäne kann
allerdings schwächer
als B42 sein. Insbesondere die außerordentliche Empfindlichkeit
des LEU2-Selektionsschemas (oben beschrieben) erlaubt es, sogar
extrem schwache Aktivierungsdomänen
in der Erfindung einzusetzen. Beispiele anderer verwendbarer schwacher
Aktivierungsdomänen
schließen
B17, B112 und die amphipathischen Helix-(AH)-Domänen, die bei Ma und Ptashne
(Cell 51: 113, 1987), Rudent et al. (Nature 350: 426–430, 1991)
und Gininger und Ptashne (Nature 330: 670, 1987) beschrieben sind,
ein.
-
Schließlich können die
Beuteproteine, falls gewünscht,
andere optionale Kernlokalisierungssequenzen (z.B. jene, die von
den GAL4- oder MATα2-Genen
stammen) oder andere optionale Epitop-Tags (z.B. Teile des c-myc-Proteins
oder das von Immunex erhältliche
Flag-Epitop) einschließen.
Diese Sequenzen optimieren die Wirksamkeit des Systems, aber sie
sind für
seine Funktion nicht absolut notwendig. Insbesondere die Kernlokalisierungssequenz
optimiert die Wirksamkeit, mit der Beutemoleküle das/die im Kern lokalisierte(n)
Reportergenkonstrukt(e) erreichen, wodurch ihre wirksame Konzentration
erhöht
wird und es einem ermöglicht
wird, schwächere
Proteininteraktionen nachzuweisen; und das Epitop-Tag ermöglicht lediglich
einen einfachen Immunotest für
Fusionsproteinexpression.
-
Der
Fachmann wird auch erkennen, dass die oben beschriebenen Reportergen-,
DNA-Bindungsdomänen-
und Genaktivierungsdomänen-Komponenten
aus jeder geeigneten eukaryontischen oder prokaryontischen Quelle
stammen können,
einschließlich
sowohl Hefe, Säugerzellen
und prokaryontischen Zellgenomen oder cDNAs als auch künstlichen
Sequenzen. Darüber
hinaus können
auch andere Wirtsorganismen, wie z.B. Säugerzellen eingesetzt werden,
obwohl Hefe einen bevorzugten Wirtsorganismus für das "Interaction-Trap"-System (auf Grund der einfachen Handhabung
bei Vermehrung, genetischer Manipulation und Screening im großen Maßstab) darstellt.
Wenn ein Säugersystem
gewählt
wird, ist ein bevorzugtes Reportergen das empfindliche und leicht
zu testende CAT-Gen; verwendbare DNA-Bindungsdomänen und Genaktivierungsdomänen können aus
den oben beschriebenen gewählt
werden (z.B. die LexA-DNA-Bindungsdomäne und die B42- oder B112-Aktivierungsdomänen).
-
Der
allgemeine Typ des "Interaction-Trap"-Systems, das hierin
beschrieben ist, hat eine Reihe von Vorteilen. Z.B. kann das System
verwendet werden, um Köder-Beute-Interaktionen
unterschiedlicher Affinitäten
nachzuweisen. Dies kann durchgeführt
werden, z.B. indem Reportergene, die sich hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit
gegenüber
einer Interaktion mit einem Bibliotheksprotein quantitativ unterscheiden,
verwendet werden. Insbesondere beträgt die Gleichgewichts-Kd, mit
der ein Protein, das von einer Bibliothek kodiert ist, mit dem Köderprotein
interagieren muss, um den LexAop-LEU2-Reporter zu aktivieren, wahrscheinlich ≤ 10–6 M. Dieser
Wert ist eindeutig ausreichend, um Proteininteraktionen nachzuweisen,
die schwächer
oder kurzlebiger sind, als jene, die z.B. durch typische physikalische
Verfahren nachgewiesen werden. Die LacZ-Reporter sind weniger empfindlich, was
eine Selektion verschiedener Beuteproteine unter Verwendung von
Reportern mit/in einer geeigneten Zahl, Affinität und Position von LexA-Operatoren
erlaubt; insbesondere wird die Empfindlichkeit des LacZ-Reportergens
entweder durch Erhöhen
der Anzahl der stromabwärts
gelegenen LexA-Operatoren, Verwenden von LexA-Operatoren, die eine
erhöhte
Affinität
für LexA-Bindungsdimere
besitzen und/oder Absenken der Entfernung zwischen dem LexA-Operator
und dem stromabwärts
gelegenen Reportergenpromotor erhöht. Diese Fähigkeit zur Manipulation der
Empfindlichkeit des Systems stellt ein Mittel zur Kontrolle der
Stärke
der nachgewiesenen Interaktion dar und erhöht so die Bandbreite der Proteine,
die isoliert werden können.
-
Das
System besitzt mindestens drei weitere Vorteile. Erstens ist die
Aktivierungsregion auf den Proteinen, die von der Bibliothek kodiert
werden, relativ schwach, um Einschränkungen des Spektrums von nachgewiesenen
Bibliotheksproteinen zu vermeiden; solche Einschränkungen
sind üblich,
wenn eine starke, halbtoxische Aktivierungsdomäne, wie z.B. die von GAL4 oder
VP16 verwendet wird (Gill und Ptashne, Nature 334: 721–724, 1988;
Triezenberg et al., Genes Dev. 2: 730–742, 1988; Berger et al.,
Cell 70: 251–265,
1992). Zweitens erlaubt die Verwendung von LexA zur Bindung des
Köders
an die DNA die Verwendung von GAL4+-Hefewirten
und die Verwendung des GAL1-Promotors, um eine bedingte Expression
des Bibliotheksproteins zu bewirken. Im Gegenzug erlaubt dies, die
LEU- oder LacZ-Phänotypen
bedingungslos der Expression des Bibliotheksproteins zuzuschreiben
und minimiert die Anzahl von falsch positiven Ergebnissen; es gestattet
auch die bedingte Expression und Selektion von Interaktorproteinen,
die für
die Wirtszelle toxisch sind, wenn sie kontinuierlich hergestellt
werden. Und drittens garantiert das Positionieren der Aktivierungsdomäne am Amino-Terminus
anstelle des Carboxy-Terminus des Fusionsproteins, dass der Aktivierungsdomänenteil
des Proteins im Rahmen translatiert werden wird und daher, dass
eines von drei Fusionsgenen ein Kandidatenaktivierungsdomänen-Interaktorprotein
mit Tag kodieren wird.
-
Ein
besonderes "Interaction-Trap"-System wird nun
beschrieben. Die Verwendung dieses Systems zur Isolierung eines
Proteins (bezeichnet mit Cdi1), das physikalisch mit einem bekannten
Kontrollprotein der Zellteilung (bezeichnet mit Cdc2) interagiert,
ist auch dargestellt.
-
Isolation und Charakterisierung
von Cdi1
-
Isolation der Cdil-cDNA
-
Um
Proteine zu isolieren, die mit dem Zellteilungskontrollprotein Cdc2
interagieren, wurde der Hefestamm EGY48/p1840 verwendet. Dieser
Stamm enthält
sowohl den LexAop-LEU2- als auch den LexAop-lacZ-Reporter, wie auch
ein Plasmid, das die Synthese eines LexA-Cdc2-Köderproteins steuert (siehe
unten). Der LexAop-LEU2-Reporter ersetzte das chromosomale LEU2-Gen.
Dieser Reporter trug 3 Kopien des Hochaffinitäts-colE1-Doppel-LexA-Operators
(Ebina et al., J. Biol. Chem. 258: 13258–13261, 1983) 40 Nukleotide
aufwärts
des Haupt-Leu2-Transkriptionsstartpunkts. Der LexAop-lacZ-Reporter
(p1840) wurde von einem URA3+ 2 μ Plasmid
getragen. Dieser Reporter trug einen einzelnen LexA-Operator 167
Nukleotide aufwärts
des Haupt-GAL1-Transkriptionsstartpunkts.
-
Eine
HeLa cDNA-Interaktionsbibliothek (unten beschrieben) wurde ebenfalls
in diesen Stamm unter Verwendung des in 3C dargestellten
Plasmids (genannt pJG4-5) eingeführt;
dieser Bibliotheksvektor wurde entworfen, um die bedingte Expression
von Proteinen unter der Kontrolle eines Derivats des GAL1-Promotors
zu steuern. Dieses Plasmid trug einen 2 μ-Replikator und einen TRP1+ selektierbaren Marker. Die cDNA wurde an
EcoR1-XhoI-Fragmenten in dieses Plasmid insertiert. Abwärts der
XhoI-Schnittstelle enthielt pJG4-5 den ADH1-Transkriptionsterminator. Die Sequenz
einer unveränderlichen
107 Aminosäuren-Komponente, die von
dem Plasmid kodiert und an den N-Terminus aller Bibliotheksproteine
fusioniert war, ist unterhalb der Plasmidkarte der 3C gezeigt.
Diese Komponente trägt
von Amino- nach Carboxy-terminal ein ATG, die SV40 T Kernlokalisierungssequenz
(Kalderon et al., Cell 39: 499–509,
1984), die B42-Transkriptionsaktivierungsdomäne (Ma und Ptashne, Cell 51:
113–119,
1987; Ruden et al., Nature 350: 426–430, 1991) und der 12CA5 Epitop-Tag
des Influenzavirus Hämagglutininproteins
(Green et al., Cell 28: 477–487,
1982).
-
Nach
der Einführung
des Beute-kodierenden Plasmids in EGY48/p1840 wurden über eine
Million Transformanten isoliert, von denen 3–4 × 105 Fusionsproteine
exprimierten (siehe Versuchsdurchführungen unten). Die Kolonien
wurden gepoolt, verdünnt
und für
fünf Stunden
in flüssigem
Medium in Gegenwart von Galactose wachsen gelassen, um die Synthese
von bibliothekskodierte Proteinen zu induzieren. Der Pool wurde
dann wieder so verdünnt,
dass jede Originaltransformante circa 20 Mal vertreten war, und
auf Galactose enthaltendem Medium ohne Leucin ausplattiert. Aus
circa 2 × 107 Zellen wurden 412 LEU2+-Kolonien
isoliert. 55 dieser Kolonien waren auf Galactose Xgal-Medium blau, vermutlich
auf Grund der geringen Sensitivität des lacZ-Reporters. In allen
Zellen, in denen beide Reporter aktiv waren, waren beide Phänotypen
Galactose-abhängig,
was bestätigte,
dass sie das bibliothekskodierte Protein benötigten. Die Bibliotheksplasmide
wurden aus diesen Zellen befreit, einer der drei Klassen durch Restriktionsmapping
zugewiesen und die Plasmide jeder Klasse identifiziert, die das
längste
cDNA-Insert enthielten. Die Synthese eines Fusionsproteins durch
das Plasmid wurde in jedem Fall durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung
von Anti-Epitop-Antiserum verifiziert.
-
Weitere
Analysen durch detailliertes Mapping und partielles DNA-Sequenzieren
zeigten, dass zwei der wieder gewonnenen cDNA-Klassen identisch
mit den zuvor identifizierten Genen waren, die für CKS1hs und CKS2hs kodierten
(Richardson et al., Genes Dev. 4: 1332–1344, 1990), den humanen Homologen
des S. pombe suc1+-Produkts. Das Sequenzieren
der dritten Restriktionskartenklasse zeigte, dass es sich um ein
zuvor nicht identifiziertes Gen handelte. Dieses Gen wurde CDI1,
für Cdc2
Interactor 1, genannt; sein Proteinprodukt wurde Cdi1 genannt.
-
Das
CDI1-Gen wurde in eine Reihe von EGY48-abgeleiteten Stämmen (d.h.
EGY48/1840 enthaltend verschiedene LexA-Fusionsköder) eingeführt, um die Reproduzierbarkeit
und Spezifität
der Interaktion zwischen Cdc2 und Cdi1 zu testen. Zellen aus 8 einzelnen,
transformierten Zellen, die Cdi1 plus einen gegebenen Köder (horizontale
Streifen) oder den gleichen Köder
plus den Bibliotheksvektor als eine Kontrolle (angrenzende vertikale
Streifen) enthielten, wurden mit Zahnstochern auf jeder von drei
Platten ausgestrichen (4). Die Platten, gezeigt in 4,
enthielten eine „Kontroll"-Platte, eine Ura– Trp– His– Glucoseplatte,
die auf die Gegenwart des Köderplasmids,
den LexAop-lacZ-Reporter,
und das Cdi1-Expressionsplasmid selektionierte; eine „Glucose"-Platte, eine Ura– Trp– His– Leu– Glucoseplatte,
die zusätzlich
auf die Aktivierung des LexAop-LEU2-Reporters selektionierte; und
eine „Galactose"-Platte, eine Ura– Trp– His– Leu– Galactoseplatte,
die auf die Aktivierung des LexAop-LEU2-Reporters selektionierte und die Expression
von Cdi1 induzierte. Die in diesem Test verwendeten Köder schließen ein:
(1) LexA-Cdc2, (2) LexA-Bicoid, (3) LexA-Max, (4) LexA-Cln3, (5)
LexA-Fus3 und (6) LexA-cMyc-Cterm (4).
-
Wie
durch die LEU2- und lacZ-Transkiptionsphänotypen beurteilt, interagierte
Cdi1 spezifisch mit LexA-Cdc2 und nicht mit LexA-cMyc-Cterm, LexA-Max,
LexA-Bicoid, LexA-Cln3 oder LexA-Fus2 (4). Cdi1 interagierte
auch mit anderen Proteinen der Cdc2-Familie, einschließlich LexA-Cdc28,
wie unten diskutiert. Die Anmelder bemerken auch, dass der LexA-Cln3-Köder auf
Glucose den LexAop-LEU2-Reporter schwach aktivierte, dass aber auf
Galactose die Unterlegenheit der Kohlenstoffquelle und die erniedrigte
Köderexpression durch
den ADH1-Promoter diesen Hintergrund eliminierte.
-
Die
Spezifität
der Cdi1/Cdc2-Interaktion wurde dann durch physikalische Kriterien,
insbesondere durch Immunpräzipitationsexperimente
bestätigt.
Extrakte wurden aus EGY48-Zellen hergestellt, die ein Bibliotheksplasmid
enthielten, das die Synthese von mit Tag versehenem Cdi1 steuerte
und das auch entweder einen LexA-Cdc2- oder einen LexA-Bicoid-Köder enthielt.
-
Insbesondere
wurden 100 ml der Zellen in Glucose- oder Galactosemedium (in welchem
die Cdi1-Expression induziert wurde) bis zu einer OD600 von
0,6–0,8 wachsen
gelassen, durch Zentrifugation pelletiert und in 500 μl RIPA resuspendiert,
durch Schlagen mit Glaskügelchen
jeweils fünf
Mal für
zwei Minuten lysiert und zwei Mal für fünf Minuten in einer Mikrofuge
(10,000 × G)
bei 4°C
herunter zentrifugiert, um die Kügelchen
und die Zelldebris zu entfernen. 5 μl dieses Überstands wurden als eine Kontrolle
abgenommen und 15 μl
des Kaninchen-anti-LexA-Antiserums wurden zu dem Rest hinzugegeben,
der bei 4°C
für vier
Stunden auf einer rotierenden Plattform inkubiert wurde. Die LexA
enthaltenden Proteine wurden zuerst aus diesem Rest mit 50 μl Staph A-beschichteten Sepharosekügelchen
(Pharmacia, Piscataway, NJ), wie in Wittenberg und Reed beschrieben
(Cell 54: 1061–1072,
1988) präzipitiert.
Das vollständige
Pellet wurde dann in Laemmli-Probenpuffer gelöst, über ein 12,5% Proteingel (SDS/PAGE)
laufen gelassen und auf Nitrocellulose geblottet. Mit Tag versehenen
Cdi1-Fusionsproteine wurden durch Western-Analyse der geblotteten
Proteine mit dem 12CA5-monoklonalen Antihämagglutinin-Antikörper im
Wesentlichen wie in Samson et al. beschrieben (Cell 57: 1045–1052, 1989)
identifiziert.
-
Die
Ergebnisse sind in 5 gezeigt; die Spuren sind wie
folgt: (1) Galactosemedium, LexA-Bicoid-Köder, Immunpräzipitation;
(2) Glucosemedium, LexA-Bicoid-Köder,
Immunpräzipitation;
(3) Galactosemedium, LexA-Bicoid-Köder, Zellextrakt;
(4) Glucosemedium, LexA-Bicoid-Köder,
Zellextrakt; (5) Galactosemedium, LexA-Cdc2-Köder, Immunpräzipitation;
(6) Glucosemedium, LexA-Cdc2-Köder,
Immunpräzipitation;
(7) Galactosemedium, LexA-Cdc2-Köder, Zellextrakt;
und (8) Glucosemedium, LexA-Cdc2-Köder, Zellextrakt. Wie in 5 gezeigt,
präzipitierte
das Anti-LexA-Antiserum Cdi1 aus einem Hefeextrakt, der LexA-Cdc2
und Cdi1 enthielt, aber nicht aus einem, der LexA-Bicoid und Cdi1 enthielt,
was bestätigte,
dass Cdi1 physikalisch nur mit dem Cdc2 enthaltenden Köderprotein
interagierte.
-
Cdc2-Cdi1-Interaktion
-
Um
die Determinanten von Cdc2, die von Cdi1 erkannt werden, zu identifizieren,
wurde Cdi1 auf seine Fähigkeit
getestet, mit einer Reihe von verschiedenen Köderproteinen zu interagieren,
einschließlich Cdc2-Proteinen
aus Hefe, Menschen und Fliegen, wie auch der Hefe Fus3-Proteinkinase
(einer Proteinkinase der ERK-Klasse, die Cln3 negativ reguliert
und die im Hinblick auf Sequenzkriterien weniger verwandt mit den Cdc2-Proteinen
ist als jene Proteine untereinander) (Elion et al., Cell 60: 649–664, 1990).
-
Um
diese Experimente durchzuführen,
wurde EGY48/JK103 (unten beschrieben) enthaltend ein Plasmid, das
die Galactose-induzierbare Synthese des mit Tag versehenen Cdi1
steuerte, mit einer Reihe von verschiedenen transkriptional inerten
Köderproteinen
der LexA-Cdc2-Familie transformiert. Fünf individuelle Transformanten
für jeden
Köder wurden
bis zu OD
600 = 0,5–1,0 in Minimalmedium, das
2% Galactose, aber kein Uracil, Histidin und Tryptophan enthielt,
wachsen gelassen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt und sind
in β-Galactosidase-Einheiten
angegeben; die Variation zwischen den individuellen Transformanten
lag bei weniger als 20%. TABELLE
1
| Köder | β-Galactosidase-Aktivität |
| LexA-Cdc2
(Hs) | 1580 |
| LexA-Cdk2
(Hs) | 440 |
| LexA-Cdc28
(Sc) | 480 |
| LexA-Cdc2
(Dm) | 40 |
| LexA-Cdc2c
(Dm) | > 2 |
| LexA-Fus3
(Sc) | > 2 |
-
Wie
in Tabelle 1 gezeigt, stimulierte das mit Tag versehene Cdi1 die
Transkription dieser Köder
auf unterschiedliche Niveaus; sie wurde stark in Stämmen aktiviert,
die den humanen Cdc2-Köder
enthielten, gegen den es selektioniert war, weniger stark in Stämmen, die
S. cerevisiae Cdc28- oder humane Cdk2-Köder enthielten, und nur schwach
in Stämmen,
die DmCdc2-Köder, einen
der zwei Drosophila Cdc2-Homologe (Jimenez et al., EMBO J. 9: 3565–3571, 1990;
Lehner und O'Farrell,
EMBO J. 9: 3573–3581,
1990) enthielten. In Stämmen,
die den DMCdc2c-Köder
oder Fus3 enthielten, aktivierte Cdi1 überhaupt nicht. Da die Köder in dieser
Reihe sequenzverwandt waren, aus dem gleichen Vektor hergestellt
waren, von einer Message translatiert waren, die die gleiche 5'-untranslatierte
Sequenz und die gleiche LexA-kodierende Sequenz besaß, und in
Hefe in der gleichen Menge exprimiert waren, spiegelten die Unterschiede
in der Transkription zwischen den Köderstämmen sehr wahrscheinlich die
Unterschiede in der Interaktion mit dem mit Tag versehenen Cdi1
wider.
-
Um
die Reste auf den Cdc2-Proteinen zu identifizieren, die Cdi1 erkennen
könnten,
wurden die Transkriptionsinteraktionsdaten mit den Sequenzen der
Köder verglichen.
Eine Aufstellung der Ködersequenzen wurde
auf Reste untersucht, die in den Proteinen konserviert waren, mit
denen Cdi1 interagierte, aber die in den Proteinen anders waren,
die Cdi1 nicht kontaktierte. Durch die Verwendung dieses Kriteriums
wurden 7 Reste identifiziert, die durch Sterne in 6 angegeben
sind. Von diesen Resten wurden zwei, Glu 57 und Gly 154 (in humanem
Cdc2) in den nicht-interagierenden Ködern in Aminosäuren unterschiedlichen
chemischen Typs abgeändert.
In DmCdc2c ist Rest 57 von Glu zu Asn und Rest 154 von Gly zu Asn
verändert;
in Fus3 sind diese Reste zu His und Asp verändert. In humanem Cdc2 grenzen
diese beiden Reste an Bereiche des Moleküls, die für die Interaktion mit Cyclinen
notwendig sind (Ducommun et al., Mol. Cell. Biol. 11: 6177–6184, 1991).
Die Projektion der humanen Cdc2- Primärsequenz
auf die Kristallstruktur, die von Knighton et al. für die bovine
cAMP-abhängige
Proteinkinase (Science 153: 407–413,
1991) aufgelöst
wurde, legt nahe, dass die Reste 57 und 154 tatsächlich wahrscheinlich nahe
an diesen Cyclin-Kontaktpunkten in dem gefalteten Protein sind.
-
Versuchsdurchführungen
-
Bakterien und Hefe
-
sDie
Manipulation von Bakterienstämmen
und von DNAs erfolgte durch Standardverfahren (siehe z.B. Ausubel
et al., Current Protocols in Molecular Biolo, New York, John Wiley & Sons, 1987; und
Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), soweit nicht anders
angegeben. E. coli „Sure" mcrA Δ (mrr, hsdRMS
mcrBC) endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5(kanR) uνrC/F' [proAB, lacIqZΔMI5]::Tn10(tetR)
Strategene Inc., LaJolla, CA) und KC8 (pyrF::Tn5 hsdR leuB600 trpC9830
lacΔ74 strA
galK hisB436) wurden durchgehend als bakterielle Wirte verwendet.
-
Köder
-
Um
die Operatorbesetzung zu optimieren, wurden Köder konstitutiv unter der Kontrolle
des ADH1-Promotors (Ammerer, Meth. Enzym. 101: 192–210, 1983)
hergestellt und enthielten die LexA C-terminale Oligomerisationsregion,
die zur Operatorbesetzung durch LexA-enthaltende Proteine beiträgt, vielleicht
weil es bei dem präzisen
Anlagern der LexA-Aminotermini angrenzender Operator-Halbbindungsstellen
hilft (Golemis und Brent, Mol. Cell. Biol. 12: 3006–3014, 1992).
Es ist wert zu bemerken, dass alle LexA-Köderproteine, die bisher untersucht
wurden, in den Hefekern in Konzentrationen eintreten, die ausreichen
eine Operatorbindung zu ermöglichen,
auch wenn LexA-Derivate nicht spezifisch im Kern lokalisiert sind,
außer
wenn sie andere Kernlokalisierungssignale enthalten (siehe z.B.
Silver et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4763–4766, 1986).
-
pL202pl
ist beschrieben worden (Ruden et al., Nature 350: 426–430, 1991).
Dieses Plasmid, ein naher Verwandter von pMA424 und pSH2-1 (Ma und
Ptashne, Cell 51: 113–119,
1987; Hanes und Brent, Cell 57: 1275–1283, 1989) trägt den HIS3+-Marker
und den 2 μ Replikator
und steuert in Hefe die Synthese von Fusionsproteinen, die das Wildtyp-LexA-Protein
an ihrem Aminoterminus tragen. Die in dieser Studie verwendeten Köder wurden
wie folgt hergestellt: humanes Cdc2-(Lee und Nurse, Nature 327:
31–35,
1987), Cdk2-(Tsai et al., Nature 353: 174–177, 1991) und die S. cerevisiae
CDC28-Gene (Lorincz und Reed, Nature 307: 183–185, 1984) wurden mittels
PCR unter Verwendung von Vent-Polymerase
(New England Biolabs, Beverley, MA) amplifiziert und in pL202pl
als EcoRI-BamHI-Fragmente kloniert. Diese Proteine enthielten zwei
Aminosäuren
(glu phe), die zwischen die letzte Aminosäure von LexA und den Köderproteinen
insertiert wurden. Die Drosophila Cdc2-Köder (Jimenez et al., EMBO J.
9: 3565–3571,
1990; Lehner und O'Farrell,
EMBO J. 9: 3573–3581, 1990)
wurden als BamHI-SalI-Fragmente nach PCR-Amplifikation kloniert.
LexA-Fus3 (Elion, Cell 60: 649–664,
1990) und LexA-Cln3 (Cross, Mol. Cell. Biol. 8: 4675–4684, 1988,
Nash et al., EMBO J. 7: 4335–4346,
1988) wurden in ähnlicher
Weise hergestellt, außer
dass sie als BamHI-Fragmente kloniert wurden. Diese Plasmide enthielten
fünf Aminosäuren (glu
phe pro gly ile) (SEQ ID NR: 2), die zwischen LexA und den Ködern insertiert
waren. Alle diese Fusionen enthielten die gesamte kodierende Region
von der zweiten Aminosäure
bis zum Stoppkodon. LexA-cMyc-Cterm enthielt die carboxy-terminalen
176 Aminosäuren
des humanen cMyc und LexA-Max enthielt die gesamte humane Max-kodierende
Sequenz. LexA-Bicoid (Aminosäure
2–160)
wurde bereits beschrieben (Golemis und Brent, Mol. Cell. Biol. 12:
3006–3014,
1992).
-
Reporter
-
In
der „Interaction-Trap" ersetzte ein Reporter,
die LexAop-LEU2-Konstruktion, das chromosomale Leu2-Gen der Hefe.
Der andere Reporter, eines einer Reihe von LexAop-GAL1-lacZ-Genen
(Brent und Ptashne, Cell 43: 729–736, 1985; Kamens et al.,
Mol. Cell. Biol. 10: 2840–2847,
1990) wurde auf einem 2 μ-Plasmid getragen.
Die Reporter wurden so gestaltet, dass ihre basale Transkription
extrem niedrig war, wahrscheinlich sowohl auf Grund des Entfernens
der Gesamtheit der UAS aus beiden Reportern als auch auf Grund der
Tatsache (deren Ursache unbekannt ist), dass in Promotoren eingeführte LexA-Operatoren
dazu tendieren, die Transkription zu erniedrigen (Brent und Ptashne,
Nature 312: 612–615,
1984; Lech, Gene activation by DNA-bound Fos and Myc proteins. Doktorarbeit,
Harvard University, 1990). Die Reporter wurden so ausgewählt, dass
sie sich in ihrer Antwort auf die Aktivierung durch LexA-Fusionsproteine
unterscheiden. In dieser Studie enthielt der LEU2-Reporter drei
Kopien der Hochaffinitäts-LexA-Bindungsstelle, die
aufwärts
von E. coli colE1 (Ebina et al., J. Biol. Chem. 258: 13258–13261,
1983; Kamens et al., Mol. Cell. Biol. 10: 2840–2847, 1990) gefunden wurde
und daher wahrscheinlich insgesamt 6 Dimere des Köders bindet.
Im Gegensatz dazu enthielt das lacZ-Gen, das in dem Primärscreen
eingesetzt wurde, einen einzigen, Konsensus-Operator niederer Affinität (Brent
und Ptashne, Nature 312: 612–615,
1984), welcher ein einzelnes Dimer des Köders bindet. Die LexA-Operatoren
in dem LEU2-Reporter waren näher
an dem Transkriptionsstartpunkt, als sie es in dem lacZ-Reporter
waren. Diese Unterschiede in der Zahl, der Affinität und der
Position der Operatoren trugen insgesamt dazu bei, das LEU2-Gen
als Indikator sensitiver zu machen als das lacZ-Gen, eine Eigenschaft,
die für
dieses Verfahren nützlich
ist.
-
p1840
und pJK103 wurden bereits beschrieben (Brent und Ptashne, Cell 43:
729–736,
1985, Kamens et al., Mol. Cell. Biol. 10: 2840–2847, 1990). pHR33 (Ellerstrom
et al., Plant Mol. Biol. 18: 557–566, 1992) wurde mit HindIII geschnitten
und ein ~1166bp-Fragment, das das URA3
+-Gen
aus yEP24M13-2, ein Derivat von yEP24, enthielt, wurde darin eingeführt, um
pLEU2-0 zu schaffen. Dieses Plasmid enthält eine BglII-Schnittstelle
87 Nukleotide aufwärts
des LEU2-Haupttranskriptionsstartpunkts. pLEU2-0 wurde mit BglII
geschnitten und ein 42bp Doppelstrang-Oligomer mit BglII-Enden
das die überlappenden
LexA-Operatoren enthielt, die aufwärts des Colecin E1-Gens gefunden wurden
(Ebina et al., J. Biol. Chem. 258: 13258–13261, 1983), und das wahrscheinlich
2 LexA-Dimere bindet, darin eingeführt. Ein Plasmid, pLEU2-LexAop6, das drei
Kopien dieses Oligomers enthielt, wurde ausgesucht; es bindet wahrscheinlich
6 Dimere der LexA-Fusionsproteine.
-
Selektionsstämme
-
EGY12
(MATα trp1
ura2 LEU2::pLEU2-0 (ΔUASLEU2))
und EGY38 (wie oben, aber ::pLEU2-LexAop6) wurden wie folgt konstruiert.
pLEU2-0 und pLEU2-LexAop6
wurden durch Verdau mit ClaI innerhalb des LEU2-Gens linearisiert
und die DNA dann in U457 (MATα SUP53-a
ade2-1 can1-100 ura3-52 trp1-1 [phi+]) durch Lithiumacetat-Transformation
(Ito et al., J. Bacter. 153: 163–168, 1983) eingeführt; die ura+-Kolonien, die vermutlich die in LEU2 integrierte
Plasmid-DNA enthielten, wurden ausgewählt. Einige dieser Transformanten
wurden in YPD wachsen gelassen. Ura–-Zellen
wurden durch Ausplattieren dieser Kulturen auf einem Medium, das
5-FOA enthielt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology
New York, John Wiley & Sons,
1987), ausgewählt.
Beide Plasmide trugen ein TY1-Element. Für jede Integration waren einige
der ura3–-Revertanten
auch trp1–,
was vermuten lässt,
dass der URA3+-Marker in einem homologen Rekombinationsereignis
deletiert wurde, das die TY1-Sequenzen auf den LEU2-Plasmiden und
dem chromosomalen TY1-Element aufwärts von SUP53-a (Oliver et
al., Nature 357: 38–46,
1992) einbezog. Trp–-Kolonien einer jeden Integration, EGY12
(keine LexA-Operatoren) und EGY38 (6 Operatoren) wurden aufbewahrt.
Diese wurden mit GG100-14D (MATα his3
trp1 pho5) gepaart. Die resultierenden Diploide ließ man sporulieren und
eine Anzahl von zufälligen
(MATα leu2-
ura3- trp1- his3- GAL+) Sporenprodukten wurde gewonnen. EGY40 und
EGY48 sind Produkte dieser Kreuzung; EGY40 besitzt keine LexA-Operatoren,
EGY48 besitzt 6. Um die Köderstämme herzustellen,
wurde EGY48 mit p1840 oder pJK103 und mit den verschiedenen Köderplasmiden
transformiert. Die Doppeltransformanten wurden auf Glucose Ura– His–-Platten
selektioniert und die Expression der Köderproteine durch Western-Blotting
unter Verwendung eines Anti-LexA-Antikörpers und Standardtechniken
bestätigt.
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Bibliotheks-("Beute")-pressionsvektoren
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Bibliothekskodierte
Proteine wurden durch pJG4-5 exprimiert, einem Mitglied einer Reihe
von Expressionsplasmiden, die entwickelt wurden, um in der „Interaction-Trap" verwendet zu werden
und um die Analyse von isolierten Proteinen zu erleichtern. Diese
Plasmide tragen alle den 2 μ-Replikator,
um eine hohe Kopienanzahl in Hefe sicherzustellen, und den TRP1-Marker.
pJG4-5 wurde entwickelt, um die folgenden Eigenschaften aufzuweisen:
einen Galactoseinduzierbaren Promotor, um eine bedingte Expression
der Bibliotheksproteine zu erlauben, ein Epitop-Tag, um deren Detektion
zu erleichtern, ein Kernlokalisierungssignal, um ihr intranukleare
Konzentration zu maximieren, um die Sensitivität der Selektion zu erhöhen, und
eine schwache „acid blob"-Aktivierungsdomäne (Ma und Ptashne, Cell 51:
113–119,
1987). Diese Domäne
wurde aus zwei Gründen ausgewählt: weil
ihre Aktivität
nicht Gegenstand bekannter Regulation durch Hefeproteine ist, wie
es bei der Haupt-GAL4-Aktivierungsdomäne ist,
und, noch wichtiger, weil sie ein schwacher Aktivator ist, der wahrscheinlich
die Toxizität,
die sehr wahrscheinlich die Zahl oder Art der gefundenen interagierenden
Proteine begrenzt, auf Grund von Squelching oder anderen Mechanismen
(Gill und Ptashne, Nature 334: 721–724, 1988, Berger et al.,
Cell 70: 251–265,
1992) verhindert.
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pJG4-5
wurde wie folgt konstruiert. Eine „Expressionskassette" enthaltend den GAL1-Promotor
und den ADH1-Terminator und ein 345 nt-Insert, das eine 107 Aminosäurenkomponente
kodierte, wurde in pJG4-0 insertiert, einem Plasmid, das das TRP1-Gen,
den 2 μ-Replikator,
den pUC13-Replikationsursprung und das Ampicillinresistenzgen trägt. Die
pJG4-5 Expressionscassette steuerte die Synthese von Fusionsproteinen, von
denen jedes am Aminoterminus, von Aminonach Carboxy-terminal, ein
ATG, eine SV40 Kernlokalisierungssequenz (PPKKKRKVA) (SEQ ID NR:
5) (Kalderon et al., Cell 39: 499–509, 1984), die transkriptionale B42-„acid blob" Aktivierungsdomäne (Ma und
Ptashne, Cell 51: 113–119,
1987) und das HA1-Epitop-Tag (YPYDVPDYA) (SEQ ID NR: 6) (Green et
al., Cell 28: 477–487,
1980) (3C) trug. Zusätzlich zu
diesem Plasmid wurden in diesem Experiment zwei Cdi1-Expressionsplasmide
verwendet. EcoR1-XhoI Cdi1-enthaltende Fragmente wurden in pJG4-4
eingeführt,
um das Plasmid pJG4-4Cdi1 herzustellen; Cdi1 wurde von diesem Plasmid
als ein natives, nicht fusioniertes Protein unter der Kontrolle
des GAL1-Promotors
transkribiert. EcoRI-XhoI Cdi1-enthaltende Fragmente wurden auch
in pJG4-6 eingeführt,
um das Plasmid pJG4-6Cdi1 herzustellen; in diesem Fall wurde Cdi1
als eine in frame-Fusion enthaltend an seinem Aminoterminus ein ATG-Startkodon
und das Hämagglutinin-Epitop-Tag
exprimiert.
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Bibliothekskonstruktion
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Die
mit Aktivierungs-Tag versehene cDNA-Expressionsbibliothek für die Hefe
wurde aus RNA hergestellt, die aus in Gegenwart von Serum gewachsenen
proliferierenden HeLa-Zellen isoliert wurde, die auf Platten bis
zu 70%-iger Konfluenz wachsen gelassen wurden. Die Gesamt-RNA wurde
wie bei Chomczynski und Sacchi (Anal. Biochem. 162: 156–159, 1987)
beschrieben extrahiert und polyA
+ mRNA wurde
auf einer OligodT-Zellulosesäule
gereinigt. Die cDNA-Synthese wurde gemäß Gubler und Hoffman (Gene
25: 263–269, 1983),
modifiziert nach Huse und Hansen (Strategies 1: 1–3, 1988)
unter Verwendung eines Linkerprimers durchgeführt, der von 5' nach 3' einen 18 nt polydT-Teil,
eine XhoI-Schnittstelle und eine 25 nt lange GA-reiche Sequenz enthielt,
um die XhoI-Schnittstelle zu schützen.
Um jedwelche internen XhoI-Schnittstellen
zu schützen,
wurde der erste Strang in Gegenwart von 5'-Methyl-CTP (anstelle von CTP) mit einer RNAseH
defizienten Version der Moloney-Virus-reversen-Transkriptase
(Superscript, BRL, Grand Island, NY) synthetisiert. Für die Synthese
des zweiten Strangs wurde das mRNA/cDNA-Hybrid mit RNAseH und E.
coli DNA-Polymerase I behandelt und die resultierenden Enden wurden
durch sequenzielle Behandlung mit Klenow, Mungbohnen-Exonuklease
und Klenow stumpfendig gemacht, woraufhin EcoRI-Adaptoren:
ligiert wurden und die cDNA
wurde mit XhoI verdaut wurde. Diese DNA wurde weiter über eine
Sephacryl S-400 Zentrifugations-Säule gereinigt, um überschüssige Adaptersequenzen
zu entfernen, und auf einem 5–20%
KoAc-Gradienten
fraktioniert. Die Fraktionen, die > 700
bp cDNAs enthielten, wurden gesammelt und circa 1/5 der cDNA in
EcoRI- und XhoI-verdautes pJG4-5 ligiert. Dieses Ligationsgemisch
wurde in E. coli SURE-Zellen durch Elektroporation (Gene-Pulser,
Bio-Rad, Hercules, CA) gemäß den Angaben
des Herstellers eingeführt.
9,6 × 10
6 primäre
Transformanten wurden durch Abkratzen von LB Ampicillin-Platten
gesammelt. Die Kolonien wurden gepoolt und in 6 Liter LB-Medium über Nacht
(ungefähr
drei Generationen) wachsen gelassen und die Plasmid-DNA aufeinander
folgend durch Standardtechniken über
zwei CsCl-Gradienten
gereinigt. Der Verdau der Transformanten der einzelnen Bibliotheksmitglieder
mit EcoR1 und XhoI ergab, dass > 90%
der Bibliotheksmitglieder ein cDNA-Insert enthielten, dessen typische
Größe zwischen
1 kb–2
kb betrug. Western Blots der einzelnen Hefetransformanten unter
Verwendung des Anti-Hämagglutinin-monoklonalen Antikörpers ließen vermuten,
dass zwischen 1/4 und 1/3 der Mitglieder Fusionsproteine exprimierte.
-
Selektion der Cdc2-Interaktoren
-
Die
Transformation des oben beschriebenen Stammes mit der Bibliothek
wurde gemäß den von
Ito et al. (J. Bacter. 153: 163–168,
1983) beschriebenen Verfahrensschritten durchgeführt, außer dass die Zellen bis zu
einer höheren
OD, wie in Schiest1 und Gietz beschrieben (Curr. Genet. 16: 339–346, 1989),
wachsen gelassen wurden und einzelsträngige Träger-DNA in das Transformationsgemisch
eingeschlossen wurde, wie ebenfalls in Schiest1 und Gietz (Curr.
Genet. 16: 339–346,
1989) beschrieben. Diese Verfahrensschritte ergaben 1,2 × 106 primäre
Bibliothekstransformanten (104 Bibliothekstransformanten/μg DNA). Die
Transformanten wurden auf Glucose Ura– His– Trp–-Platten
selektioniert, abgekratzt und in ungefähr 20 ml 65% Glycerin, 10 mM
Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 suspendiert
und in 1 ml Aliquots bei –80°C gelagert.
Die Plattierungseffizienz wurde auf Galactose Ura– His
Trp– nach
Wachsen von 50 μl
einer Zellsuspension in 5 ml YP in Gegenwart von 2% Galactose bestimmt.
Zum Screenen der Bibliothek wurden ungefähr 20 Kolonien-bildende Einheiten auf
diesem Medium/Originaltransformant (circa 2 × 107 Zellen)
auf 4 Standard-Galactose
Ura– His– Trp– Leu– 10
cm-Rundplatten nach der YP/Galactose-Induktion wie oben beschrieben ausplattiert.
-
412
Leu+ Kolonien erschienen nach einer 4-tägigen Inkubation
bei 30°C.
Diese Kolonien wurden auf Glucose Ura– His– Trp–-Masterplatten
gesammelt und auf Glucose Ura– His– Trp– Leu–-,
Galactose Ura– His– Trp– Leu–-,
Glucose Xgal Ura– His– Trp–-
und Galactose Xgal Ura– His Trp–-Platten
noch einmal getestet. 55 dieser Kolonien zeigten ein Galactose-abhängiges Wachstum
auf den leu–-Medien und
eine Galactose-abhängige blaue
Farbe auf dem Xgal-Medium und wurden weiter analysiert.
-
Plasmid-DNAs
aus diesen Kolonien wurden wie beschrieben aufbewahrt (Hoffman und
Winstson, Gene 57: 267–272,
1987), in den Bakterienstamm KC8 eingeführt und die Transformanten
wurden auf Trp–-Ampicillinplatten gesammelt.
Die Plasmid-DNAs wurden analysiert und anhand des Musters der Restriktionsfragmente
kategorisiert, das sie auf 1,8% Agarose 1/2 × TBE-Gelen nach dreifacher
Verdauung mit EcoRI und XhoI und entweder AluI oder HaeIII abgaben.
Charakteristische Plasmide aus verschiedenen Restriktionskartenklassen
dieser cDNAs wurden in Derivate von EGY48 retransformiert, die eine
Reihe verschiedener LexA-Fusionsproteine exprimierten. Die Plasmide,
die cDNAs trugen, deren kodierte Proteine mit dem LexA-Cdc2-Köder, aber
nicht mit anderen LexA-Fusionsproteinen, einschließlich LexA-Bicoid,
LexA-Fus3, LexA-Cln3,
LexA-cMyc-Cterm und LexA-Max interagierten, wurden weiter charakterisiert.
-
Mikroskopie
-
5
ml Kulturen von Hefezellen wurden in dem geeigneten kompletten Minimalmedium
bis zu einer OD600 = 0,8–1 wachsen gelassen und mit
einem kurzen Stoß Ultraschall-behandelt,
um die Klumpen zu sprengen (Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, New York, John Wiley & Sons, 1987). Die Zellen wurden durch
Zentrifugation gesammelt, in 1 ml TE gewaschen, in 1 ml 70% Ethanol
resuspendiert und für
1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt, um sie zu fixieren,
dann gesammelt und in TE resuspendiert. Die fixierten Zellen wurden
entweder direkt bei 1000-facher Vergrößerung mit einem Zeiss-Axioscope-Mikroskop
mit Nomarski-Optik oder durch Fluoreszenz nach Färbung mit 2,5 μg/ml DAPI,
wie in Silver et al. beschrieben (Mol. Cell. Biol. 6: 4763–4766, 1986),
untersucht.
-
FACS-Analyse
-
Hefezellen
wurden wachsen gelassen und wie oben beschrieben fixiert und für die FACS-Analyse
des DNA-Gehalts im Wesentlichen wie in Lew et al. (Cell 63: 317–328, 1992)
vorbereitet. Nach Fixierung wurden die Zellen gesammelt und drei
Mal in 0,8 ml 50 mM Tris/HCl pH 8,0 gewaschen und dann wurden 200 μl 2 mg/ml
RNaseA zugefügt
und bei 37°C
unter kontinuierlichem Schütteln
für 5 Stunden
inkubiert. Die Zellen wurden pellettiert, in 0,5 ml 5 mg/ml Pepsin
(frisch gelöst
in 55 mM HCl) resuspendiert und in einem 37°C Wasserbad für 30 Minuten
inkubiert. Die Zellen wurden herunterzentrifugiert, mit 1 ml 200
mM Tris/HCl pH 7,5, 211 mM NaCl, 78 mM MgCl2 gewaschen
und in dem gleichen Puffer resuspendiert. 55 μl 500 μg/ml Propidiumjodids wurden
dann zugefügt
und die Zellen über
Nacht bei 4°C
gefärbt.
Typischerweise wurden 10.000–20.000 Ereignisse
abgelesen und in einem Becton Dickinson Fluoreszenz-aktivierten
Zellsortierer (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) mit einem CellFIT
Zellzyklusanalyseprogramm Version 2.01.2. analysiert.
-
Für die FACS-Analyse
des DNA-Gehalts wurden die HeLa-Zellen auf Platten wachsen gelassen
und entweder mit pBNCdi1, einer DNA-Kopie eines retroviralen Klonierungsvektors
(Morgenstern und Land, Nucl. Acids. Res. 18: 3587–3596, 1990),
der die Expression von nativem Cdi1 unter der Kontrolle des MoMuLV-Promotors
steuert, oder mit dem Vektor alleine transfiziert (Ausubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley & Sons, 1987).
Klone der transfizierten Zellen wurden durch Wachstum in Medium
selektioniert, das 400 μg/ml
G418 enthielt; die Cdi1-Expression erniedrigte nicht die Anzahl
der gewonnenen G418-resistenten Zellen. Einzelne Klone jeder Transfektion
(circa 20) wurden aufbewahrt und auf Platten in DMEM + 10% Kälberserum
wachsen gelassen, unter Verwendung von 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA
gesammelt und ein Mal mit 1 × PBS
gewaschen. Die Zellen von vier Klonen, die von der Cdi1-Transfektion
stammten, und die von vier Kontrolltransfektionen wurden in 225 μl 30 μg/ml Trypsin,
das in 3,4 mM Citrat, 0,1% NP40, 1,5 mM Spermin und 0,5 mM Tris
gelöst
war, suspendiert und auf einem Rotator für 10 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert. 188 μl
des 0,5 mg/ml Trypsininhibitors und 0,1 mg/ml RNAseA wurden dann
zugefügt
und die Suspension gevortext. Nach Zugabe von 188 μl 0,4 mg/ml
Propidiumjodid und 1 mg/ml Spermin wurden die Proben für 30 Minuten
bei 4°C
inkubiert. Die FACS-Analyse
wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
