DE69432791T2 - Verfahren und massenspektrometer zur desorption und ionisierung von analyten - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Gerätschaft für die Desorption und Ionisation von Analyten zum Zweck der späteren wissenschaftlichen Analyse durch die Verfahren, wie beispielsweise Massenspektrometrie (MS) oder Biosensoren. Im Allgemeinen umfasst die Analyse durch Massenspektrometrie die Verdampfung und Ionisation einer kleinen Materialprobe mithilfe einer Hochenergiequelle wie z. B. einem Laser, einschließlich einem Laserstrahl. Das Material wird von der Oberfläche einer Sondenspitze mit dem Laserstrahl in die Gas- oder die Dampfphase verdampft und im Verlauf werden manche der einzelnen Moleküle durch Gewinnung eines Protons ionisiert. Die positiv geladenen, ionisierten Moleküle werden dann durch ein kurzes Hochenergiefeld beschleunigt und fliegen (driften) in eine Hochvakuumkammer, an deren entferntem Ende sie auf eine empfindliche Detektorfläche auftreffen. Da die Flugzeit eine Funktion der Masse des ionisierten Moleküls ist, kann die verstrichene Zeit zwischen Ionisation und Auftreffen verwendet werden, um die Masse des Moleküls zu bestimmen, die dann wiederum verwendet werden kann, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von bekannten Molekülen einer spezifischen Masse zu identifizieren.
  • Alle bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik, die Proteine oder andere große Biomoleküle auf einer Sondenspitze für die Laserdesorption/-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (Time-of-Flight Mass Spectrometn, TOF) präsentieren, beruhen auf der Herstellung einer kristallinen, festen Mischung des Proteins oder einem anderen Analytmolekül in einem großen molaren Überschuss eines sauren Matrixmaterials, das auf der bloßen Oberfläche einer metallischen Sondenspitze angebracht ist. (Die Probensondenspitze ist typischerweise metallisch und besteht entweder aus rostfreiem Edelstahl, aus vernickeltem Material oder aus Platin). Es wurde angenommen, dass das Einbetten des Analyten in eine solche Matrix erforderlich ist, um die Zerstörung des Analytmoleküls durch den Laserstrahl zu verhindern. Der Laserstrahl trifft auf die fest Mischung auf der Sondenspitze auf und seine Energie wird verwendet, um einen kleinen Anteil des Matrixmaterials zusammen mit etwas von dem eingebetteten Analytmolekül zu verdampfen. Ohne die Matrix werden die Analytmoleküle leicht von der Laserenergie fragmentiert, so dass die Masse und Identität des ursprünglichen Makromoleküls sehr schwierig oder gar nicht mehr zu bestimmen ist.
  • Dieses Verfahren aus dem Stand der Technik hat mehrere Einschränkungen, die seine Adaption an die automatisierte Proteinanalyse oder Analyse anderer makrobiologischer Moleküle verhindert hat. Erstens muss eine sehr ungereinigte Probe partiell fraktioniert werden (oder die Probe so weit wie möglich anderweitig gereinigt werden), um das Vorhandensein von zu viel externem Material in der kristallinen oder festen Matrix-Analyt-Mischung zu eliminieren. Das Vorhandensein großer Mengen an Bestandteilen kann das Ionensignal (entweder Desorption, Ionisation und/oder Nachweis) des gewünschten Analyten unterdrücken. Eine solche Aufreinigung ist zeitraubend, teuer, resultiert typischerwise in geringen Erträgen (oder vollständigem Verlust) des Analyten und wäre in einem automatischen Analysegerät sehr schwierig durchzuführen.
  • Während die Menge an Analytmaterial, das für die Analyse mit dem Verfahren aus dem Stand der Technik benötigt wird, nicht groß ist (typischerweise im Picomol-Bereich liegt), sind zweitens unter manchen Umständen, beispielsweise bei Tests mit pädiatrischen Patienten, Analytflüssigkeiten nur in extrem kleinen Volumina (Mikroliter) verfügbar und werden gegebenenfalls für die Durchführung mehrerer unterschiedlicher Analysen benötigt. Daher kann selbst die kleine Menge (d. h. Volumen), die für die Herstellung der kristallinen Analyt/Matrix-Mischung für eine einzige Analyse benötigt wird, signifikant sein. Außerdem wird nur ein winziger Anteil (einige Tausendstel oder weniger) an Analyt, der für die Herstellung der festen Analyt/Matrix-Mischung für die Verwendung auf der Sondenspitze verwendet wird, bei der Desorption oder Massenspektrometrieanalyse tatsächlich verbraucht. Alle Verbesserungen des Verfahrens aus dem Stand der Technik, die es ermöglichen, 1) viel weniger Analyt zu verwenden, 2) den Analyten oder mehrere Analyten auf der Sondenspitze oder -fläche an einer vorbestimmten Stelle zu lokalisieren, 3) wiederholte Analysen desselben Analytaliquots durchzuführen (z. B. vor und nach einer chemischen Reaktion oder mehreren chemischen Reaktionen und/oder einer enzymatischen Reaktion oder mehreren enzymatischen Reaktionen) und 4) den Test in einer quantitativeren Weise durchzuführen, wären in vielen medizinischen Bereichen höchst vorteilhaft.
  • Drittens ist das Analytprotein bzw. das andere Makromolekül, das zum Herstellen der festen Lösung von Analyt/Matrix für die Verwendung auf der Sondenspitze verwendet wird, nicht für etwaige spätere chemische Tests oder Verfahren geeignet, da es in das Matrixmaterial eingebunden (d. h. eingebettet) ist. Außerdem ist das gesamte, bis dato verwendete Matrixmaterial stark sauer, so dass es viele chemische Reaktionen, welche mit der Mischung versucht würden, um die Analytmoleküle für eine spätere Untersuchung zu modifizieren, gegenteilig beeinflussen würde. Alle Verbesserungen des Verfahrens, welche es ermöglichen würden, spätere chemische Modifikationen oder Reaktionen mit den Analytmolekülen durchzuführen, ohne sie aus der Matrix oder von der Sondenspitze zu entfernen, oder sie vollkommen ohne "Matrix" zu verwenden, wären für Wissenschaftler und Kliniker von enormem Vorteil.
  • Die ersten, erfolgreichen Messungen der molekularen Masse intakter Peptide und kleiner Proteine (nur bis zu etwa 15 kDa) durch eine Form von Massenspektrometrie erfolgten durch Bombardierung von Flächen mit Hochenergiepartikeln (Plasmadesorption und Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie); dieser Durchbruch erfolgte 1981 und 1982. Verbesserungen kamen 1985 und 1986, dennoch blieben Ertrag (Signalintensitäten), Sensitivität, Präzision und Massegenauigkeit relativ gering. Proteine mit höherer molekularer Masse (etwa 20 bis 25 kDa) wurden abgesehen von seltenen Gelegenheiten nicht beobachtet; nicht ein einziges Mal wurden Proteine beobachtet, die durchschnittliche Molekulargewichte (etwa 70 kDa) darstellten. Die Evaluierung der meisten Proteine durch Massenspektrometrie blieb daher undurchführbar.
  • 1988 verwendeten Hillenkamp und seine Mitarbeiter UV-Laser-Desorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie und entdeckten, dass Proteine mit relativ hoher molekularer Masse im intakten Zustand desorbiert werden konnten, wenn sie unter Vorhandensein eines sehr hohen molaren Überschusses einer sauren, UV-absorbierenden chemischen Matrix (Nikotinsäure) auf der Sondenspitze abgeschieden wurden. Diese neue Technik wird Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-lonisations(MALDI-)-Flugzeit-Massenspektrometrie genannt. Dabei gab es die Laser-Desorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie (ohne die chemische Matrix) bereits seit einiger Zeit, obgleich sie für die Bestimmung der Molekulargewichte großer intakter Biopolymere wie z. B. Proteine und Nukleinsäuren wenig oder gar nicht erfolgreich war, da diese Moleküle bei der Desorption fragmentiert (zerstört) wurden. Vor der Einführung einer chemischen Matrix war die Laser-Desorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie daher für den Nachweis spezifischer Veränderungen der Masse intakter Makromoleküle im Wesentlichen nutzlos. Es wird darauf hingewiesen, dass die zufällige Bildung von Matrixkristallen und der zufällige Einschluss von Analytmolekülen in der festen Lösung Stand der Technik sind.
  • Mit den Verfahren aus dem Stand der Technik ist eine Anzahl von Problemen und Einschränkungen verbunden. So wurde beispielsweise herausgefunden, dass es schwierig ist, Verunreinigungen, die in Analyt oder Matrix vorhanden sind, fortzuwaschen. Andere Probleme umfassen die Bildung von Analyt-Salzionen-Addukten, suboptimale Löslichkeit von Analyt in Matrix, unbekannte Lokalisation und Konzentration von Analytmolekülen in der festen Matrix, "Vergiftung" durch Signal-(molekulare Ionen-)Unterdrückung durch gleichzeitiges Vorhandensein von mehreren Bestandteilen und selektive Analytdesorption/-ionisation. Frühere Investigatoren, einschließlich Karas und Hillenkamp haben von einer Vielzahl von Techniken für den Analytnachweis mithilfe von Massenspektrometrie berichtet, aber diese Techniken leiden an inhärenten Einschränkungen der Sensitivität und Selektivität bei dem Nachweis von Analyten in undifferenzierten Proben mit geringem Volumen (Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometn Conference Report, S. 354–62 (1988); Karas und Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometn Conference Report, S. 416–17 (1988); Karas und Hillenkamp, Analytical Chemistn, 60: 2299 (1988); Karas et al., Biomed. Environ. Mass. Spectrum (in Druck).) Die Verwendung von Laserstrahlen in Flugzeit-Massenspektrometern ist beispielsweise in US-Patent Nr. 4,694,167; 4,686,366; 4,295,046 und 5,045,694 gezeigt.
  • Die erfolgreiche Volatilisierung von Biopolymeren mit hohem Molekulargewicht ohne Fragmentierung ermöglichte die massenspektrometrische Analyse einer großen Vielzahl von biologischen Makromolekülen. Was vielleicht noch wichtiger ist, es wurde dadurch veranschaulicht, dass es möglich ist, Massenspektrometrie kreativer anzuwenden, um die routinemäßig auftretenden Probleme in der biologischen Forschung zu lösen. Die jüngste Aufmerksamkeit richtete sich auf die Anwendung der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions-Ionisations(MALDI-)-Flugzeit (Time of Flight, TOF)-Massenspektrometrie (MS), überwiegend, weil sie schnell (Minuten) und empfindlich (es sind < pmol an Probe erforderlich) ist und es ermöglicht, komplexe Mischungen zu analysieren.
  • Obgleich die MALDI-TOF-MS auch weiterhin für die statische Bestimmung/Verifizierung der Masse einzelner Analyten dienlich ist, sind es vor allem im Falle von Biopolymeren häufig Unterschiede in der Masse, die die wichtigsten Informationen über unbekannte Strukturen geben. Die routinemäßige Nutzung der MALDI-TOF-MS-Technik in der Strukturbiologie ist daher leider durch Grenzen in Bezug auf die Probenvorbereitung und -präsentation (Deposition) auf einer inerten Sondenelementfläche eingeschränkt, insbesondere durch die Maßgabe, dass Analyte auf der Sondenoberfläche in einer frisch hergestellten Matrix kristalliner organischer Säure eingebettet (d. h. co-solidifiziert) werden. Die zufällige Analytverteilung in einem heterogenen Display einer Kristallmatrix auf der Sondenelementoberfläche erfordert die Ablagerung von weit mehr Analyt oder Probe, als für den Laser-Desorptionsvorgang, ja selbst für die Erhebung mehr als adäquater Massenspektren (z. B. mehrere Serien von jeweils 100 Schüssen) erforderlich ist. Der verbleibende Analytanteil wird in der Regel nicht für weitere Analysen oder nachfolgende Charakterisierungen wiedergewonnen. Obgleich typischerweise nur 1 bis 10 pmol (manchmal weniger) Analyt für die Ablagerung auf der Sondenoberfläche benötigt werden, wurde geschätzt, dass bei der Laserdesorption weniger als einige wenige Attomole verbraucht werden. Nur 1 Teil in 105 oder 106 des aufgetragenen Analyten ist daher erforderlich; der Rest geht verloren.
  • Ein weiterer wichtiger Verlust potenzieller Daten in Verbindung mit der Einbettung von Analyt in eine feste Matrix ist die Verringerung oder vollständige Eliminierung der Möglichkeit für die darauf folgende Durchführung chemischer und/oder enzymatischer Modifikationen des eingebetteten Analyten (z. B. Protein oder DNA), der auf der Sondenoberfläche verbleibt. Nur ein anderes Aliquot des Analyten oder die Möglichkeit, den eingebetteten Analyten matrixfrei wiederzugewinnen (schwierig, geringe Ausbeute) erlaubt, dass das, was wir heute als differenzielle Massenspektrometrie bezeichnen, durchgeführt wird, um strukturelle Daten zu gewinnen.
  • Außerdem war die Anwendung von MS in biologischen Gebieten eingeschränkt, wahrscheinlich durch die Tatsache, dass viele Biologen und Kliniker von der MS abgeschreckt werden und/oder in Bezug auf ihre Nützlichkeit skeptisch sind. Die MS gilt außerdem als unzugänglich oder zu teuer, besonders da die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in manchen Fällen, in denen MALDI angewandt werden würde, ein adäquater Ersatz ist (z. B. bei der Trennung von unverarbeiteten biologischen Flüssigkeiten). Zudem wurde MALDI in biologischen und klinischen Fachzeitschriften bisher selten erwähnt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, verbesserte Verfahren, Materialzusammensetzungen und Gerätschaft für die gekoppelte Adsorption, Desorption und Ionisation mehrerer oder ausgewählter Analyte in die Gas-(Dampf-)Phase bereit zu stellen.
  • Eine andere Aufgabe ist es, ein Verfahren und Gerät für den affinitätsgerichteten Nachweis von Analyten bereit zu stellen, einschließlich Desorption und Ionisation von Analyten, in dem der Analyt nicht in einer Matrixlösung oder in einer kristallinen Struktur verteilt ist, sondern in einer Position, in der er für eine breite Vielzahl von chemischen, physikalischen und biologischen Modifikations- oder Erkennungsreaktionen zugänglich und verfügbar ist, durch molekulare Erkennungsereignisse in, auf oder über einer angebrachten Oberfläche einer energieabsorbierenden Matrix präsentiert ist.
  • Eine andere Aufgabe ist es, ein solches Verfahren und Gerät bereit zu stellen, in dem das Analytmaterial chemisch gebunden oder physikalisch an ein Substrat angeheftet ist, das eine sondenspitzenprobenpräsentierende Oberfläche bildet.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, Mittel für die Modifikation von probenpräsentierenden Oberflächen mit energieabsorbierenden Molekülen bereit zu stellen, um die erfolgreiche Desorption von Analytmolekülen ohne die Zugabe von exogenen Matrixmolekülen, wie im Stand der Technik, zu ermöglichen.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, die geeignete Dichte von energieabsorbierenden Molekülen bereit zu stellen, die (kovalent oder nicht kovalent) in einer Vielzahl von Geometrien so gebunden sind, dass Einzelschichten und mehrere Schichten von angehefteten energieabsorbierenden Molekülen verwendet werden, um die Desorption von Analytmolekülen mit unterschiedlichen Massen zu ermöglichen.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, mehrere Kombinationen von Oberflächen mit energieabsorbierenden Molekülen, affinitätsgerichteten Analyt-Capture-Vorrichtungen, Fotoröhren, etc. bereit zu stellen.
  • Eine zusätzliche Aufgabe ist es, ein Verfahren und Gerätschaft bereit zu stellen, in dem das Substrat, das die Sondenspitze formt, oder eine andere probenpräsentierende Oberfläche mit einem Affinitätsreagens oder mehreren Affinitätsreagenzien (unterschiedliche Dichten und Amplifikationsgrade) für die selektive Bindung mit vorbestimmten Analyten oder Klassen von Analyten derivatisiert wird.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein solches System bereit zu stellen, in dem das Affinitätsreagens chemisch an den Zielanalyten oder die Klasse von Analyten gebunden oder biologisch angeheftet ist.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren und Gerätschaft für die Desorption und Ionisation von Analyten bereit zu stellen, in dem ungenutzte Anteile von den Analyten, die auf der präsentierenden Oberfläche enthalten sind, chemisch zugänglich bleiben, so dass eine Reihe von chemischen, enzymatischen oder physikalischen Behandlungen des Analyten durchgeführt werden kann, gefolgt von sequenziellen Analysen des modifizierten Analyten.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren und Gerätschaft für die kombinierten chemischen oder enzymatischen Modifikationen von Zielanalyten für den Zweck des Aufklärens der Primär-, Sekundär-, Tertiär- oder Quartärstruktur des Analyten und seiner Bestandteile bereit zu stellen.
  • Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren und Gerätschaft für die Desorption und Ionisation von Analytmaterialien bereit zu stellen, in denen Kationen, bei denen es sich nicht um Protonen (H+) handelt, für die Ionisation von Analytmakromolekülen verwendet werden.
  • Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Sonde bereit, die entnehmbar in ein Massenspektrometer eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyten gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyten von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist, wobei die Oberfläche mit einem Affinitätsreagens derivatisiert ist, welches den Analyten binden kann und aus Metallionen, Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen davon ausgewählt ist und wobei ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial auf der Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens vorgesehen ist.
  • Die probenpräsentierende Oberfläche kann ausgewählt sein aus Metall, das mit einem synthetischen Polymer, Glas, Keramik, synthetischen Polymeren und Biopolymeren beschichtet ist. Die probenpräsentierende Oberfläche kann daher Metall mit einer Beschichtung von quervernetztem Dextran oder Agarose, Nylon, Polyethylen oder Polystyrol sein.
  • Das Affinitätsreagens kann ein Antikörper, ein Lektin, ein Cu(II)-Ion oder ein Fe(III)-Ion sein. Der Analyt kann Biomoleküle umfassen und das Affinitätsreagens kann angepasst sein, um die Biomoleküle selektiv aus einer undifferenzierten biologischen Probe zu isolieren.
  • Auf der probenpräsentierenden Oberfläche können Affinitätsreagenzien, die in einer vorbestimmten Anordnung angeordnet sind, für die selektive Adsorption von unterschiedlichen Analyten vorgesehen sein. Auf der probenpräsentierenden Oberfläche kann in Verbindung mit dem Affinitätsreagens ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial vorgesehen sein. Das Matrixmaterial kann einen pH-Wert über 6,0 haben. Das Matrixmaterial kann Nikotin- oder Sinapinsäure sein. Eine erfindungsgemäße Sonde kann vorgesehen sein, bei der der Analyt an das Affinitätsreagens gebunden ist.
  • Die Erfindung sieht ferner ein Massenspektrometer zum Nachweis eines Analyten vor, umfassend:
    • (a) eine erfindungsgemäße Sonde, bei der der Analyt an das Affinitätsreagens gebunden ist;
    • (b) eine Energiequelle für das Lenken von Energie auf die probenpräsentierende Oberfläche der Sonde für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts und
    • (c) Mittel für das Nachweisen des desorbierten Analyts.
  • Ein solches Massenspektrometer kann des Weiteren umfassen:
    • – eine Spektrometerröhre;
    • – ein Vakuummittel für das Anlegen eines Vakuums im Inneren der Röhre;
    • – ein elektrisches Potenzialmittel in der Röhre für das Anlegen eines beschleunigten Potenzials an desorbierte Analytmoleküle; und
    • – eine durch das Affinitätsreagens gebundene Analytprobe auf der probenpräsentierenden Oberfläche der Sonde, wodurch zumindest ein Teil der in der Massenspektrometrieanalyse nicht aufgebrauchten Analytmoleküle für spätere chemische, biologische oder physikalische Analyseverfahren verfügbar bleibt;

    die Energiequelle Laserstrahlenmittel für das Erzeugen eines auf die Analytprobe gerichteten Laserstrahls für das Zukommenlassen ausreichender Energie zum Desorbieren und Ionisieren eines Teils der Analytmoleküle von der Analytprobe umfasst; und
    wobei das Nachweismittel zu dem Spektrometer gehörige Mittel für das Nachweisen der Auswirkung der beschleunigten ionisierten Analytmoleküle hierauf umfasst.
  • Die Erfindung sieht des Weiteren ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten vor, umfassend:
    • (a) Vorsehen eines Massenspektrometers der Erfindung;
    • (b) Desorbierten zumindest eines Teils des Analyten von der probenpräsentierenden Oberfläche der Sonde des Massenspektrometers, indem der Analyt der Energie der Energiequelle ausgesetzt wird, und
    • (c) Nachweisen des desorbierten Analyts mit dem Nachweismittel.
  • Das Verfahren kann nach dem Nachweisschritt (c) des Weiteren den Schritt des Ausführens eines chemischen oder biologischen Verfahrens an dem nicht desorbierten Teil des Analyten umfassen, um die Zusammensetzung des nicht desorbierten Teils des Analyten zu verändern; und wobei Schritte (b) und (c) bezüglich des veränderten Analyten wiederholt werden.
  • Das Nachweisverfahren der Erfindung kann deshalb umfassen:
    • (i) Vorsehen einer Sonde, die in ein Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbierten/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist;
    • (ii) Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit einem Affinitätsreagens, welches den Analyten binden kann und aus Metallionen Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben ausgewählt ist;
    • (iii) Aussetzen der derivatisierten, probenpräsentierenden Oberfläche gegenüber einer Quelle des Analyts, um den Analyten daran zu binden;
    • (iv) Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an der probenpräsentierenden Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
    • (v) Geben der derivatisierten, probetragenden Oberfläche mit den daran gebundenen Analytmolekülen in ein Ende eines Flugzeit-Massenspektrometers und Anlegen eines Vakuums und eines elektrischen Felds, um ein beschleunigtes Potenzial in dem Spektrometer zu bilden;
    • (vi) Beschießen mindestens eines Teils der an der derivatisierten, probenpräsentierenden Oberfläche in dem Spektrometer gebundenen Analytmoleküle mit einem oder mehreren Laserimpulsen, um Ionen der Analytmoleküle von der Sonde zu desorbieren;
    • (vii) Nachweisen der Masse der Ionen durch ihre Flugzeit in dem Massenspektrometer; und
    • (viii) Anzeigen der nachgewiesenen Masse.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor:
    • – ein Verfahren für das Herstellen einer Sonde der Erfindung, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Vorsehen einer Sonde, die in ein Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist;
    • (ii) Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit einem Affinitätsreagens, welches den Analyten binden kann und aus Metallionen Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben ausgewählt ist;
    • (iii) Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an der probenpräsentierenden Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
    • – ein Verfahren zum Einfangen eines Analyten auf einer Sonde für ein Massenspektrometer, wobei das Verfahren umfasst:
    • – Vorsehen einer Sonde, die in ein Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist, wobei die Oberfläche mit einem Affinitätsreagens derivatisiert wird, welches den Analyten binden kann und welches aus Metallionen, Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben ausgewählt ist;
    • – Aussetzen der probenpräsentierenden Oberfläche der Sonde gegenüber der den Analyten enthaltenden Probe; und
    • – Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an der probenpräsentierenden Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
    • – Verwendung einer Sonde der Erfindung in der Massenspektrometrie; und
    • – Verwendung einer Probe der Erfindung in einem Laserdesorptions/lonisations-Flugzeit-Massenspektrometer.
  • Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorzüge werden offenkundig und die Erfindung besser verständlich durch ein Lesen der folgenden Spezifikationen und durch Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die einen Teil davon bilden, worin die Beispiele der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zum Zweck der Offenbarung gegeben sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die zuvor erwähnten und weitere Aufgaben und Vorzüge der Erfindung werden aus den folgenden Spezifikationen und aus den beigefügten Zeichnungen offenkundig.
  • 1A (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum der drei Peptide (Metallbindungs-Domänen des menschlichen, histidinreichen Glykoproteins (GHHPH)2G (1206 Da), GHHPH)5G (2904 Da) und Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors (D473-L525) (6168,4 Da), desorbiert in Anwesenheit von neutralisierenden, energieabsorbierenden Molekülen (Sinapinsäure, pH 6,2). 1B (unteres Profil) zeigt die sequenzielle Metall-(Cu)-Bindung in situ der Peptide in Anwesenheit von neutralisierenden, energieabsorbierenden Molekülen.
  • 2A (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum des menschlichen Caseinphosphopeptids (5P, 2488 Da), desorbiert in Anwesenheit von neutralisierenden, energieabsorbierenden Molekülen (Sinapinsäure, pH 6,5). 2B (zweites Profil von oben) zeigt den sequenziellen 5-Minuten-Verdau in situ mit alkalischer Phosphatase zum Entfernen von Phosphatgruppen von dem Phosphopeptid. 2C (drittes Profil von oben) zeigt das Massenspektrum des Phosphopeptids nach weiterem Phosphataseverdau in situ in Anwesenheit von sauren, energieabsorbierenden Molekülen (2,5-Dihydroxybenzoesäure, pH 2), wie im Stand der Technik beschrieben.
  • 3 zeigt ein Verbundmassenspektrum des (GHHPH)5G-Peptids (2904 Da) vor (unteres Profil) und nach (oberes Profil) dem Verdau in situ durch Carboxypeptidase P in Anwesenheit von neutralisierenden, energieabsorbierenden Molekülen (Sinapinsäure, pH 6,2).
  • 4 zeigt ein matrixunterstütztes Laserdesorptions-Verbundmassenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert von festem Glas, polypropylenbeschichtetem, rostfreiem Edelstahl, polystyrolbeschichtetem, rostfreiem Edelstahl und festen Nylonsondenelementen.
  • SEAC
  • 5, Profil A, zeigt das Massenspektrum von Spermienaktivierungsfaktor (933 Da) und Neurotensin (1655 Da) (und ihrer zahlreichen Na-Addukte) in der Peptidlösung, nicht an der IDA-Cu(II)-Oberfläche adsorbiert. 5, Profil B, zeigt das Massenspektrum von Angiotensin 1 (1296,5 Da) plus Na-Addukt-Spitzen, die selektiv an der IDA-Cu(II)-Oberfläche adsorbiert wurden. 5, Profil C, und 6, Profil C, zeigen das Massenspektrum desselben Angiotensin 1, adsorbiert an IDA-Cu(II) nach dem Waschen mit Wasser. 6, Profil D, zeigt die sequenzielle Kupferbindung (1 und 2 Cu) in situ von aftinitätsadsorbiertem Angiotensin 1. 6, Profil E, zeigt den sequenziellen Trypsinverdau in situ des affinitätsadsorbierten Angiotensin 1.
  • 7 zeigt das Massenspektrum von Myoglobin (4 bis 8 fmol), affinitätsadsorbiert an die IDA-Cu(II)-Oberfläche.
  • 8 (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum von synthetischem Caseinpeptid (1934 Da) mit mehreren phosphonlierten Formen, affinitätsadsorbiert aus einer ungereinigten Mischung an eine TED-Fe(III)-Oberfläche. Nach sequenziellem Verdau in situ mit alkalischer Phosphatase bleibt nur die ursprüngliche, nicht phosphorylierte Form erhalten (unteres Profil).
  • 9, Profil A, zeigt das Massenspektrum von Gesamtproteinen in Kindernahrung. 9, Profil B, zeigt das Massenspektrum von Phosphopeptiden in Kindernahrung, affinitätsadsorbiert an eine TED-Fe(III)-Oberfläche. 9, Profil C, zeigt das Massenspektrum von Gesamtprotein in Magenaspirat eines frühgeborenen Kindes nach Füttern der Kindernahrung. 9, Profil D, zeigt das Massenspektrum von Phosphopeptiden in dem Magenaspirat, affinitätsadsorbiert an eine TED-Fe(III)-Oberfläche.
  • 10 zeigt die Verbundmassenspektren von menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein, adsorbiert an eine IDA-Cu(II)-Oberfläche vor und nach Verdau mit N-Glykanase. Die Massenverschiebung stellt das Entfernen von Kohlenhydrat von den jeweiligen Glykoproteinen dar. 10B zeigt das Verbundmassenspektrum von mit Trypsin verdauten Peptiden der deglykosylierten Proteine der beiden Arten (oberes Profil für menschliches Protein, zweites Profil von unten für bovines Protein) und die In-situ-Cu(II)-Bindung der mit Trypsin verdauten Peptide der beiden Arten (zweites Profil von oben für menschliches Protein, unteres Profil für bovines Protein; die Zahlen 1, 2 zeigen die Anzahl des gebundenen Kupfers an). 10C zeigt, dass ein solches Cu(II)-bindendes Peptid (unteres Profil) mindestens 4 His-Reste besitzt, die durch Diethylpyrocarbonat spezifisch modifiziert sind, um 4 N-Carbethoxyhistidyl-Addukte zu bilden (1–4, oberes Profil). 10D zeigt die partielle C-terminale Sequenz des größten Cu-bindenden Peptids in dem bovinen histidinreichen Glykoprotein.
  • 11 (unteres Profil) zeigt das Massenspektrum von Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin-Immunglobulin alleine (Kontrolle), affinitätsadsorbiert an eine paramagnetische Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Oberfläche. Das obere Profil zeigt das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin und Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin-Immunglobulinkomplex, affinitätsadsorbiert an eine paramagnetische Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Oberfläche.
  • 12 zeigt das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin, affinitätsadsorbiert aus Harn von Frühgeborenen an eine Anti-Human-Laktoferrin-Immunglobulin-Nylonoberfläche. 13 zeigt das äquivalente Massenspektrum von gesamtem Harn von Frühgeborenen mit 1 nmol/ml Laktoferrin.
  • 14 (unteres Profil) zeigt das Massenspektrum von reinem bovinen, histidinreichen Glykoprotein. Das obere Profil zeigt das Massenspektrum von bovinem, histidinreichem Glykoprotein und Fragmente, affinitätsadsorbiert aus bovinem Kolostrum an einer Anti-Bovines-Histidinreiches-Glykoprotein-Immunglobulin-Oberfläche.
  • 15 zeigt dies Verbundmassenspektren von Peptiden von follikelstimulierendem Hormon, erkannt von den unterschiedlichen Antikörpern gegen das follikelstimulierende Hormon.
  • 16 zeigt das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin, affinitätsadsorbiert an einem einzigen Kügelchen von Einzelstrang-DNA-Agarose, abgeschieden an einem Sondenelement mit einem Durchmesser von 0,5 mm.
  • 17 zeigt das Massenspektrum von menschlichem Laktoferrin, affinitätsadsorbiert aus dem Harn von Frühgeborenen an einer Einzelstrang-DNA-Oberfläche.
  • 18A zeigt das Verbundmassenspektrum der Gesamtproteine in menschlichem Duodenalaspirat (unteres Profil) und das Trypsin, aftinitätsadsorbiert aus dem Aspirat an eine Sojabohnentnpsininhibitoroberfläche (oberes Profil). 18B zeigt das Massenspektrum von Trypsin, aftinitätsadsorbiert aus 1 μl Aspirat an eine Sojabohnentrypsininhibitornylonoberfläche.
  • 19A zeigt das Massenspektrum von biotinyliertem Insulin, affinitätsadsorbiert aus menschlichem Harn an einer Streptavidinoberfläche. 19B zeigt das Massenspektrum von biotinyliertem Insulin, affinitätsadsorbiert aus menschlichem Plasma an einer Streptavidinoberfläche.
  • 20 (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum von menschlichem Albumin in menschlichem Serum. 20 (unteres Profil) zeigt das Massenspektrum von Serumalbumin, aftinitätsadsorbiert aus menschlichem Serum an einer Cibacron-Blau-Oberfläche.
  • SEND
  • 21 zeigt die Molekularstruktur von oberflächengebundenem Cinnamamid; R repräsentiert die Oberfläche plus Quervernetzer.
  • 22 (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert aus oberflächengebundenem Cinnamamid. 20B (unteres Profil) zeigt das Massenspektrum derselben Peptidmischungen mit freiem Cinnamamid.
  • 23 zeigt die Molekularstruktur von oberflächengebundenem Cinnamylbromid; R repräsentiert die Oberfläche plus Quervernetzer.
  • 24 (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert aus oberflächengebundenem Cinnamylbromid. 22B (unteres Profil) zeigt das Massenspektrum derselben Peptidmischungen mit freiem Cinnamylbromid.
  • 25 zeigt die Molekularstruktur von oberflächengebundener MAP-Dihydroxybenzoesäure; R repräsentiert die Oberfläche plus Quervernetzer.
  • 26 (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum von Peptidmischungen, desorbiert aus oberflächengebundenem MAP alleine. 26 (unteres Profil) zeigt das Massenspektrum derselben Peptidmischungen, desorbiert aus oberflächengebundener MAP-Dihydroxybenzoesäure.
  • 27A zeigt das Massenspektrum (1.200 – 50.000 m/z-Region) von Myoglobin, desorbiert von oberflächengebundener α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. 27B zeigt dasselbe Massenspektrum in einem niedrigen Massebereich (0–1.200 m/z).
  • 28 zeigt die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die über Glutaraldehydaktivierung an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden sind.
  • 29 zeigt die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die über Divinylsulfonaktivierung an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden sind.
  • 30 zeigt die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die über Dicyclohexylcarbodiimidaktivierung an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden sind.
  • 31 zeigt die Molekularstruktur von energieabsorbierenden Molekülen, die mit mehreren antigenen Peptiden über Dicyclohexylcarbodiimidaktivierung an Polyacrylamid oder Nylon oder acrylische Oberfläche gebunden sind.
  • 32 zeigt die Molekularstruktur von Thiosalicylsäure, gebunden an Iminodiacetat (IDA)-Cu(II)-Oberfläche.
  • 33 zeigt das Massenspektrum der Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors, desorbiert von Thiosalicylsäure-ID-Cu(II)-Oberfläche.
  • 34 zeigt die Molekularstruktur von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure, gebunden an DEAE-Oberfläche.
  • 35A zeigt das Massenspektrum der Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors, desorbiert von Sinapinsäure-DEAE-Oberfläche. 35B zeigt das Massenspektrum von Myoglobin, desorbiert von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure-DEAE-Oberfläche.
  • 36 zeigt die Molekularstruktur von ⧠-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure gebunden an Polystryroloberfläche.
  • SEPAR
  • 37 zeigt die Analyse der C-terminalen Sequenz von über photolytische Bindung oberflächenimmobilisierter histidinreicher Glykoprotein-Metallbindungsdomäne.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Einem Fachmann ist klar, dass unterschiedliche Substitutionen und Modifikationen der hierin offenbarten Erfindung gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
  • Die Entwicklung neuer MS-Sondenelementzusammensetzungen mit Oberflächen, die erlauben, dass das Sondenelement aktiv an dem Capture (Fangen) und Andocken spezieller Analyte teilnimmt, hat mehrere neue Möglichkeiten auf dem Gebiet, das heute als Affinitätsmassenspektrometrie (AMS) bezeichnet wird, definiert. Kurz erläutert, wurden mehrere Typen neuer MS-Sondenelemente gemäß dem "Surfaces enhanced for Affinity Capture"(SEAC)-Prinzip (Prinzip der zum Affinitäts-Capturing verstärkten Oberflächen) konzipiert. Solche SEAC-Sondenelemente werden auch in einer Veröffentlichung der Erfinder (Hutchens and Yip, Rapid Commun. Mass. Spectrom. 7: 576–580 (1993)) berichtet, welche nach dem vorliegenden US-Prioritätsdatum vom 28. Mai 1993 veröffentlicht wurde. SEAC-Sondenelemente wurden erfolgreich verwendet, um unterschiedliche Klassen von Biopolymeren, besonders Proteinen, zu erhalten und festzumachen, indem ausgewertet wurde, was über Proteinoberflächenstrukturen und biospezifische molekulare Erkennung bekannt ist.
  • Der Fortschritt in der strukturellen Biologie ist weiterhin durch die Unvermögen eingeschränkt, Sequenzinformation über Biopolymere in einer akzeptablen Geschwindigkeit oder einem akzeptablen Maß an Sensitivität zu erhalten. Durch Nutzung der Verfahren und Gerätschaft der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass AMS eine Möglichkeit für die Aufhebung dieser Einschränkung bietet. Da die immobilisierten Affinitäts-Capture-Vorrichtungen auf der MS-Sondenelementoberfläche (d. h. SEAC) den Ort und die Affinität (Spezifität) des Analyten für die Sondenoberfläche festlegen, ist der nachfolgende analytische AMS-Prozess aus mehreren Gründen viel effizienter. Zunächst einmal ist die Stelle, an der sich der Analyt auf der Sondenelementoberfläche befindet, vorbestimmt. Deshalb ist die nachfolgende Desorption nicht länger von einer zufälligen Suche auf dem Sondenoberflächenmatrixfeld mit dem einfallenden Laserstrahl abhängig. Zweitens ist die Sensitivität des Analytnachweises (und der dynamische Bereich) erhöht, da die häufig bei komplexen Mischungen beobachteten Effekte der Suppression der molekularen Ionisation ausgeschaltet sind. Drittens bleibt der festgemachte Analyt, der nicht von dem anfänglichen laserinduzierten Desorptionsprozess verbraucht wird, für nachfolgende Analysen verfügbar. Bei Verwendung einer exogenen Matrix zur Förderung der Analytdesorption kann diese in den meisten Fällen ohne Verlust des festgemachten Analyten entfernt werden. Der verbleibende Analyt kann dann direkt in situ (d. h. solange er sich noch auf dem Sondenelement befindet) chemisch und/oder enzymatisch modifiziert werden. Durch nochmalige MS-Analyse zur Bestimmung von Massenunterschieden werden spezielle Struktureinzelheiten aufgeklärt. Der gesamte Vorgang der Analyse/Modifikation kann viele Male wiederholt werden, um strukturelle Informationen zu erhalten, während nur sehr kleine Mengen an Analyt (manchmal nur einige Femtomole oder weniger) verbraucht werden. Die Demonstrationen der Proteinstrukturanalyse auf der Basis von AMS umfassten bisher die Analyse sowohl der N- als auch der C-terminalen Sequenz und die Verifizierung mehrerer Arten von sequenzspezifischen, posttranslationalen Modifikationen, einschließlich Phosphorylierung und Dephosphorylierung, Glykosylierung, Reaktivität von Cysteinresten, ortsspezifische chemische Modifikationen (z. B. Histidinreste) und Ligandenbindung.
  • Über die Bestimmungen von Biopolymersequenzen und der Aufklärung individueller Biopolymerstrukturen hinaus geht die Möglichkeit, die strukturellen Determinanten funktionaler supramolekularer Anordnungen zu verstehen. AMS präsentiert ferner die Möglichkeit zur Untersuchung der strukturellen Determinanten von Strukturen höherer Ordnung (z. B. der Quartärstruktur). Durch Anwendung der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass nichtkovalente molekulare Erkennungsereignisse, von denen manche nicht sofort durch die traditionelleren bioanalytischen Verfahren beobachtet werden (und häufig eine Störung der Gleichgewichtsbedingungen und strukturdissoziierende Bedingungen erfordern), mit makromolekularen Analyten, die direkt oder indirekt auf der Sondenelementoberfläche festgemacht sind, direkt durch Evaluierung der molekularen Assoziationen (d. h. Erkennung) untersucht werden können.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Analyt" auf jedes Atom und/oder Molekül; einschließlich ihrer Komplexe und Fragmentionen. Im Falle biologischer Makromoleküle einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: Protein, Peptide, DNA, RNA, Kohlenhydrate, Steroide und Lipide. Es wird darauf hingewiesen, dass die meisten wichtigen Biomoleküle, die hinsichtlich ihrer Beteiligung an der Struktur oder Regulierung von lebenswichtigen Abläufen untersucht werden, sehr groß sind (typischerweise mehrere tausend Mal größer als H2O).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "molekulare Ionen" auf Moleküle im geladenen oder ionisierten Zustand, typischerweise durch die Addition oder den Verlust eines Protons bzw. mehrerer Protonen (H+).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "molekulare Fragmentierung" bzw. "Fragmention" auf Abbauprodukte von Analytmolekülen, beispielsweise verursacht bei der laserinduzierten Desorption (besonders in Abwesenheit von zugegebener Matrix).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "feste Phase" auf den Zustand des Fest-Seins, beispielsweise auf der Sondenelementoberfläche.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Gasphase" bzw. "Dampfphase" auf Moleküle im gasförmigen Zustand (d. h. in vacuo für die Massenspektrometrie).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Analytdesorption/Ionisation" auf den Übergang von Analyten aus der festen Phase in die Gasphase als Ionen. Es wird darauf hingewiesen, dass die erfolgreiche Desorption/Ionisation großer, intakter molekularer Ionen durch Laserdesorption relativ neu ist (etwa 1988) – der große Durchbruch war die zufällige Entdeckung einer geeigneten Matrix (Nikotinsäure).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "molekulare Gasphaseionen" auf die Ionen, die in die Gasphase übertreten. Es wird darauf hingewiesen, dass große molekulare Ionen, wie z. B. Proteine (typische Masse = 60.000- bis 70.000-mal größer als die Masse eines einzelnen Protons) typischerweise nicht flüchtig sind (d. h., sie treten normalerweise nicht in die Gas- bzw. Dampfphase über). In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geschieht es jedoch trotzdem, dass große molekulare Ionen, wie z. B. Proteine, in die Gas- bzw., Dampfphase übertreten.
  • Wie hierin im Falle von MALDI verwendet, bezieht sich der Begriff "Matrix" auf ein Beliebiges aus mehreren kleinen, sauren, lichtabsorbierenden Chemikalien (z. B. Nikotin- oder Sinapinsäure), die in Lösung mit dem Analyten so gemischt werden, dass die kristallinen, in die Matrix eingebetteten Analytmoleküle nach dem Trocknen des Sondenelements erfolgreich desorbiert werden (durch Laserbestrahlung) und aus der festen Phase (Kristalle) in die gasförmige Phase bzw. Dampfphase ionisiert und als intakte molekulare Ionen beschleunigt werden. Damit das MALDI-Verfahren erfolgreich ist, wird der Analyt mit einer frisch hergestellten Lösung der chemischen Matrix gemischt (z. B. Matrix zu Analyt in einem Verhältnis von 10.000 : 1) und auf die inerte Sondenelementoberfläche gegeben, um unmittelbar vor der Massenspektrometrieanalyse an der Luft zu trocknen. Der vielfache molare Überschuss der Matrix, die in Konzentrationen in der Nähe des Sättigungsbereichs vorhanden ist, erleichtert die Kristallbildung und das Einschließen des Analyten.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "energieabsorbierende Moleküle (EAM)" auf ein Beliebiges aus mehreren kleinen, lichtabsorbierenden Chemikalien, die, wenn sie auf der Oberfläche eines Sondenelements präsentiert sind (wie im Falle von SEND), die reine Desorption von Molekülen aus der festen Phase (d. h. Oberfläche) in die gasförmige Phase bzw. Dampfphase zur nachfolgenden Beschleunigung als intakte molekulare Ionen ermöglichen. Der Begriff EAM ist bevorzugt, besonders bei Bezugnahme auf SEND. Es wird darauf hingewiesen, dass die Analytdesorption durch das SEND-Verfahren als Surface-Dependent-Process (oberflächenabhängiger Prozess) definiert ist (d. h. der unvermischte Analyt wird auf eine Oberfläche gegeben, die aus gebundenen EAM besteht). Im Gegensatz dazu herrscht derzeit die Meinung, dass MALDI die Analytdesorption durch einen Prozess von der Art eines Vulkanausbruchs ermöglicht, bei dem die gesamte Oberfläche in die Gasphase "geworfen" wird. Es wird des Weiteren darauf hingewiesen, dass manche EAM, wenn sie als freie Chemikalien zum Einbetten von Analytmolekülen wie für den MALDI-Prozess beschrieben verwendet werden, nicht funktionieren (d. h. sie fördern die molekulare Desorption nicht und sind daher keine geeigneten Matrixmoleküle).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Sondenelement" oder "probenpräsentierende Vorrichtung" auf ein Element mit den folgenden Eigenschaften: es ist inert (beispielsweise typischerweise rostfreier Edelstahl) und aktiv (Sondenelemente mit verstärkten Oberflächen (surfaces enhanced), um molekulare Capture-Vorrichtungen zu enthalten).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "MALDI" auf matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation.
  • Wie hierin verwendet, steht "TOF" für Time-of-Flight (Flugzeit).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "MS" auf Massenspektrometrie.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "MALDI-TOF MS" auf matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisations-Flugzeitspektrometrie.
  • Wie hierin verwendet, ist "ESI" eine Abkürzung für Elektrosprayionisation.
  • Wie hierin verwendet, wird "chemische Bindungen" einfach als ein Versuch zur Unterscheidung einer rationalen, bewussten und kundigen Manipulation bekannter Klassen von chemischen Wechselwirkungen der schlecht definierten Art einer allgemeinen Haftung verwendet, die beobachtet werden, wenn eine chemische Substanz (z. B. Matrix) auf eine andere Substanz (z. B. eine inerte Sondenelementoberfläche) platziert wird. Arten von definierten chemischen Bindungen umfassen elektrostatische oder ionische (+/–) Bindungen (z. B. zwischen einer positiv und einer negativ geladenen Gruppe auf einer Proteinoberfläche), kovalente Bindungen (sehr starke bzw. "permanente" Bindungen als Ergebnis einer echten gemeinsamen Nutzung von Elektronen), koordinative kovalente Bindungen (z. B. zwischen Elektronendonorgruppen in Proteinen und Übergangsmetallionen wie z. B. Kupfer oder Eisen) und hydrophobe Wechselwirkungen (wie z. B. zwischen ungeladenen Gruppen).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Elektronendonorgruppen" auf den Fall einer Biochemie, in dem Atome in Biomolekülen (z. B. N, S, 0) Elektronen an elektronenarme Gruppen (z. B. Kupferionen und andere Übergangsmetallionen) "spenden" bzw. sie mit ihnen teilen.
  • Es gibt eine allgemeine Kategorie von Sondenelementen (d. h. probenpräsentierende Mittel) unter den für die Laserdesorption/Ionisation verstärkten Oberflächen (Surfaces enhanced for Laser Desorption/Ionization bzw. SELDI), innerhalb derer es drei (3) gesonderte Unterkategorien gibt. Für die Reindesorption verstärkte Oberflächen (Surfaces enhanced for Neat Desorption bzw. SEND), bei denen die Sondenelementoberflächen (d. h. probenpräsentierende Mittel) konzipiert sind, um energieabsorbierende Moleküle (EAM) anstand einer "Matrix" zu enthalten, um Desorption/Ionisation von Analyten zu ermöglichen, die direkt (rein oder unvermischt) zu der Oberfläche gegeben werden. Es wird darauf hingewiesen, dass diese Kategorie 1 (SEND) alleine oder in Kombination mit den zum Affinitäts-Capture verstärkten Oberflächen (Surfaces enhanced for Affinity Capture bzw. SEAC) (Kategorie 2), welche gemäß der vorliegenden Erfindung sind, verwendet wird, bei denen die Sondenelementoberflächen (d. h. probenpräsentierende Mittel) konzipiert sind, um chemisch definierte und/oder biologisch definierte Vorrichtungen zum Affinity-Capture zu enthalten, um durch unterschiedliche Mechanismen (meistens nicht kovalent) entweder die spezifische oder die unspezifische Haftung oder Adsorption (so genanntes Andocken oder Festmachen) von Analyten an die Sondenoberfläche zu ermöglichen. Es wird darauf hingewiesen, dass Kategorie 2 (SEAC), welche gemäß der vorliegenden Erfindung ist, mit zugegebener Matrix verwendet wird. Die Kombination von SEND und SEAC stellt daher eigentlich eine Kategorie für sich alleine dar.
  • Kategorie 3 umfasst für photolabile Anheftung verstärkte Oberflächen (Surfaces enhanced for Photolabile Attachment bzw. SEPAR), bei denen die Sondenelementoberflächen (d. h. probenpräsentierende Mittel) konzipiert/modifiziert sind, um einen Typ bzw. mehrere Typen von chemisch definierten, quer vernetzten Molekülen zu enthalten, um als kovalente Andockvorrichtungen zu dienen. Diese photolabilen Anheftungsmoleküle (PAM) haben bivalente oder multivalente Eigenschaften, d. h. es wird zunächst eine Seite umgesetzt, um das PAM an die Sondenelementoberfläche des probenpräsentierenden Mittels permanent anzuheften, und dann ist die andere reaktive Seite (sind die anderen reaktiven Seiten) des PAM bereit, um mit dem Analyten umgesetzt zu werden, wenn der Analyt in Berührung mit der PAM-derivatisierten Sondenoberfläche kommt. Solche Oberflächen (d. h. probenpräsentierende Mittel) erlauben eine sehr starke (d. h. stabile, kovalente) Analytanheftungs- oder -adsorptionsprozesse (d. h. Andocken oder Festmachen), die kovalent aber auf Bestrahlung hin reversibel (d. h. photolabil) sind. Solche Oberflächen stellen Plattformen für die laserabhängige Desorption von Analyten dar, die in situ für den Zweck der Strukturaufklärung chemisch und/oder enzymatisch modifiziert werden sollen (d. h. direkt auf der Sondenspitze). Nur die bestrahlten Analyten auf der Sondenoberfläche (kleiner Prozentanteil der Gesamtmenge) werden desorbiert. Die übrigen festgemachten Analyte bleiben kovalent gebunden und werden ohne Verlust aufgrund einer unbeabsichtigten Abkopplung von der Oberfläche modifiziert. Es wird darauf hingewiesen, dass die SEPAR-Kategorie (Kategorie 3) durch Analytanheftungsprozesse gekennzeichnet ist, die auf Bestrahlung mit Licht hin reversibel sind. Die lichtabhängige Umkehrung der Analytoberflächenanheftungsbindung(en) erlaubt jedoch nicht unbedingt per se die Analytdesorption in die Gasphase. Mit anderen Worten sind die Moleküle, die für die photolabile Anheftung der Analyten an die Sondenoberfläche verantwortlich sind, nicht unbedingt dieselben wie die für SEND beschriebenen energieabsorbierenden Moleküle (EAM). Aber es gibt eine wichtige Ausnahme: Die vorliegende Offenbarung zeigt EAM/PAM-Hybridchemikalien, die in Bezug auf SEND und SEPAR zweifache Funktionalität haben. Das heißt, dass manche EAM-Moleküle, die derzeit für SEND verwendet werden, modifiziert werden können, um als Mediatoren für sowohl den SEND- als auch den SEPAR-Prozess zu wirken. Entsprechend sind einige Affinitäts-Capture/PAM-Hybridchemikalien vorgesehen, die in Bezug auf SEAC und SEPAR zweifache Funktionalität haben. Die vorliegende Offenbarung verwendet einige Affinitäts-Capture-Vorrichtungen, besonders solche, die biologisch definiert sind, die modifiziert sind, um als Mediatoren für sowohl den SEAC- als auch den SEPAR-Prozess zu wirken.
  • Die Offenbarung präsentiert ein probenpräsentierendes Mittel (d. h. eine Sondenelementoberfläche) mit oberflächenassoziierten (oder oberflächengebundenen) Molekülen, um das Anheften (Festmachen oder Verankern) und nachfolgende Ablösung von festgemachten Analytmolekülen in einer lichtabhängigen Weise zu fördern, wobei das Oberflächenmolekül (die Oberflächenmoleküle) von der Gruppe bestehend aus photoaktiven (photolabilen) Molekülen ausgewählt ist, die an der Bindung (Andocken, Festmachen oder Quervernetzung) der Analytmoleküle an das probenpräsentierende Mittel (durch kovalente Anheftungsmechanismen oder auf andere Art) teilnehmen. Des Weiteren wird ein probenpräsentierendes Mittel (bestehend aus einem oder mehreren der geeigneten Sondenelementmaterialien, beschrieben in den vorhergehenden Ansprüchen) präsentiert, in dem Analyt(en) an die Oberfläche des probenpräsentierenden Mittels durch eine oder mehrere photolabile Bindungen gebunden ist (sind), so dass ein einfallender Lichtimpuls (einfallende Lichtimpulse) (z. B. von einem oder mehreren Lasern) verwendet wird (werden), um die photolabile Bindung (die photolabilen Bindungen), die den Analyten (die Analyte) an der Sondenelementoberfläche festmachen, auf eine Art und Weise aufzubrechen, die mit der nachfolgenden Desorption des Analyten aus der stationären (festen) Phasenoberfläche der Sonde in die Gas- (Dampf-)Phase vereinbar ist.
  • Die chemische Spezifität (chemischen Spezifitäten), die die Art und Anzahl der Anheftungspunkte der photolabilen Moleküle zwischen dem SEPAR-probenpräsentierenden Mittel (d. h. der Sondenelementoberflache) und dem Analyten (z. B. Protein) festlegt (festlegen), kann (können) einen Beliebigen oder mehrere Beliebige aus unterschiedlichen Resten oder chemischen Strukturen in dem Analyten beinhalten (z. B. His-, Lys-, Arg-, Tyr-, Phe- und Cys-Reste im Falle von Proteinen und Peptiden). Mit anderen Worten kann das SEPAR- probenpräsentierende Mittel im Falle von Proteinen und Peptiden Sondenoberflächen umfassen, die mit mehreren unterschiedlichen Arten von photolabilen Anheftungsmolekülen modifiziert sind, um den Analyten (die Analyte) mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Arten von Anheftungspunkten festzumachen.
  • Die Wellenlänge des Lichts oder die Lichtintensität (oder der Einfallswinkel), die für das Aufbrechen der photolabilen Anheftung(en) zwischen dem Analyten und der Sondenelementoberfläche erforderlich sind, kann der Wellenlänge des Lichts oder der Lichtintensität (oder dem Einfallswinkel), die erforderlich sind, um die Desorption des Analyten aus der stationären Phase in die Gas- oder Dampfphase zu fördern, entsprechen oder sich davon unterscheiden.
  • Die photolabile Anheftung des (der) Analyten an die Sondenelementoberfläche (d. h. an das probenpräsentierende Mittel), insbesondere Biopolymere wie z. B. Peptide, Proteine, Ribonukleinsäure (RNS), Desoxyribonukleinsäure (DNS) und Kohlenhydrate (CHO), kann viele Anheftungspunkte zwischen der Sondenoberfläche und dem Analytmakromolekül umfassen. Ist das Biopolymer einmal über viele Anheftungspunkte angeheftet, können unterschiedliche Punkte des Gerüsts des Biopolymers durch chemische und/oder enzymatische Mittel absichtlich herausgeschnitten bzw. fragmentiert werden, so dass viele der resultierenden Fragmente nun gesonderte und distinkte Analyten sind, von denen jeder durch eine photolabile Bindung oder mehrere photolabile Bindungen an die Sondenoberfläche geheftet (festgemacht) ist, um parallel dazu für die gleichzeitige Massenanalyse mit einem Flugzeit-Massenanalysegerät in die Gasphase desorbiert zu werden. Dieser Vorgang erlaubt die Durchführung der Bestimmung der Sequenz von Biomolekülen (Protein, Peptide, RNA, DNA, Kohlenhydrate).
  • Wir hierin verwendet, bezieht sich "Affinität" auf physikalische und/oder chemische Anziehung zwischen zwei Molekülen. Sie wird typischerweise in Natur für Strukturzwecke oder die Regulierung von Bioaktivität (d. h. Informationsübertragung) verwendet. In der Regel ist die Affinität eines Biomoleküls für ein anderes Biomolekül ziemlich spezifisch. Sie wird im vorliegenden Fall verwendet, um ein Prinzip zu beschreiben, durch das molekulare Analyten von Interesse gefangen werden (Capture). Im Falle von SEAC sind Chemikalien oder Biomoleküle mit einer kennzeichnenden Affinität für den (die) Analyten an die Oberfläche des Sondenelements festgemacht (gebunden), um den gewünschten Analyten aktiv "herauszusuchen" und selektiv zu binden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "molekulare Erkennung" auf das Wechselwirkungsereignis zwischen zwei Molekülen mit einer natürlichen Affinität für einander.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "molekulares Capture bzw. Fangen" auf die Verwendung der festgemachten Biomoleküle, um andere Biomoleküle, zu denen eine spezifische Affinitätsbeziehung besteht, anzuziehen und festzumachen (zu fangen bzw. ein Capturing durchzuführen).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "passive Adsorption" auf den Vorgang des einfachen Platzierens des Analyten (z. B. mit Matrix).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "aktives Andocken" auf das absichtliche Fangen von Analytmolekülen an der Oberfläche eines aktiven Sondenelements wie im Falle von SEAC.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "stationäre Phase" dasselbe wie feste Phase. In dem vorliegenden Zusammenhang entweder die Sondenelementoberfläche selbst oder eine der "externen", besonderen SEND oder SEAC-Vorrichtungen, verwendet in Verbindung mit einer inerten Sondenelementoberfläche.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "aktiver Oberflächenbereich" auf den Bereich der Oberfläche, von dem angenommen oder bekannt ist, dass er an der gewünschten Reaktion bzw. an dem gewünschten Ereignis teilnimmt (z. B. EAM-Anheftung oder Affinitäts-Capture). Der aktive Oberflächenbereich kann wesentlich kleiner sein als der gesamte Oberflächenbereich (aufgrund physikalischer Effekte wie sterischer Behinderung können manche Bereiche des Gesamtbereichs nicht verfügbar oder nützlich sein).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Ligand" auf ein typischerweise relativ kleines Molekül (Köder), das an ein großes Biomolekül bindet (Fisch). Im vorliegenden Fall sind Liganden über einen Linkerarm (Angel) an die Sondenelementoberfläche angeheftet (chemisch gebunden). Dieser Vorgang erlaubt die Lokalisierung des biomolekularen Capture-Ereignisses auf der Oberfläche (stationäre oder feste Phase).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Affinitätsreagens" auf eine Analyt-Capture-Vorrichtung, viz., die Klasse von Molekülen (beide von Menschen gemacht, unnatürlich, natürlich und biologisch) und/oder Bestandteile, die die Fähigkeit haben, auf der präsentierenden Oberfläche zurückgehalten zu werden (durch kovalente Bindung, chemische Absorption, etc.), während gleichzeitig die Fähigkeit der Erkennung und der Bindung an einen Analyten erhalten bleibt.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Desorption" auf die Ablösung eines Analyten von der Oberfläche und/oder den Eintritt des Analyten in eine Gasphase.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Ionisation" auf den Vorgang des Erzeugens oder Zurückhaltens einer elektrischen Ladung gleich plus oder minus einer Elektroneneinheit oder mehrerer Elektroneneinheiten auf einem Analyten.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich "Addukt" auf das Erscheinen einer zusätzlichen Masse, die mit dem Analyt assoziiert ist und die in der Regel durch die direkte Reaktion von im Überschuss vorhandener Matrix (oder Abbauprodukte der Matrix) mit dem Analyten erzeugt wird.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "Adsorption" die chemische Bindung (kovalent und/oder nicht kovalent) der energieabsorbierenden Moleküle, des Affinitätsreagens (d. h. der Analyt-Capture-Vorrichtung) und/oder des Analyten an die Sonde (präsentierende Oberfläche).
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Gerätschaft zum Messen der Masse eines Analytmoleküls einer Analytprobe mittels Massenspektrometrie, wobei die Gerätschaft umfasst: eine Spektrometerröhre; ein Vakuummittel für das Anlegen eines Vakuums im Inneren der Röhre; ein elektrisches Potenzialmittel in der Röhre für das Anlegen eines beschleunigten Potenzials an desorbierte Analytmoleküle von der Analytprobe; probenpräsentierendes Mittel, das entnehmbar in der Spektrometerröhre angebracht ist, zum Präsentieren der Analytprobe in Assoziation mit dem oberflächenassoziierten Molekül zum Fördern der Desorption und Ionisation der Analytmoleküle, wobei das Oberflächenmolekül eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung (Affinitätsreagens) ist und eine desorptions-/ionisationsunterstützende Matrix in Assoziation mit dem Affinitätsreagens auf der Oberfläche vorgesehen ist; eine Analytprobe, die auf dem probenpräsentierenden Mittel in Assoziation mit den oberflächenassoziierten Molekülen vorgesehen ist; wobei mindestens ein Teil der Analytmoleküle, die in der Massenspektrometrieanalyse nicht verbraucht werden, für nachfolgende chemische, biologische oder physikalische analytische Verfahren zugänglich bleiben; Laserstrahlenmittel für das Erzeugen eines auf die Analytprobe gerichteten Laserstrahls für das Zukommenlassen ausreichender Energie zum Desorbieren und Ionisieren eines Teils der Analytmoleküle von der Analytprobe; und zur Spektrometerröhre gehörige Nachweismittel zum Nachweis der Wirkung von beschleunigten ionisierten Analytmolekülen darauf.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der Massenspektrometrie zum Messen der Masse eines Analytmoleküls, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Derivatisieren einer probenpräsentierenden Oberfläche auf einer Seite einer Sondenspitze mit einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung mit Mitteln zum Verbinden mit einem Analytmolekül; Aussetzen der derivatisierten, Sondenspitzenseite gegenüber einer Quelle des Analytmoleküls, um den Analyten daran zu binden; Geben der derivatisierten, Probenspitze mit den daran gebundenen Analytmolekülen in ein Ende eines Flugzeit-Massenspektrometers und Anlegen eines Vakuums und eines elektrischen Felds, um ein beschleunigtes Potenzial in dem Spektrometer zu bilden; beschießen mindestens eines Teils der an der derivatisierten Sondenspitzenseite in dem Spektrometer gebundenen Analytmoleküle mit einem oder mehreren Laserimpulsen, um Ionen der Analytmoleküle von der Spitze zu desorbieren; Nachweisen der Masse der Ionen durch ihre Flugzeit in dem Massenspektrometer und Anzeigen der nachgewiesenen Masse. In diesem Verfahren wird ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial auf die zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung gehörige Sondenspitzenseite aufgetragen. In einer bevorzugteren Ausführungsform umfasst das entsprechende Verfahren des Weiteren das Entfernen der Sondenspitze aus dem Massenspektrometer; das Durchführen eines chemischen oder biologischen Verfahrens mit dem Teil der nicht desorbierten Analytmoleküle, um die Zusammensetzung des Teils der nicht desorbierten Analytmoleküle zu verändern; Wiedereinführen der Sondenspitze mit darauf befindlichen veränderten Analytmolekülen; und Durchführen einer darauf folgenden Massenspektrometrieanalyse zum Nachweisen des Molekulargewichts der veränderten Analytmoleküle.
  • In einer weitere Ausführungsform ist die Affinitäts-Capture-Vorrichtung chemisch an die Seite der Sondenspitze gebunden, physikalisch an die Seite der Sondenspitze angeheftet, adaptiert, um an die Analytmoleküle zu binden, oder adaptiert, um biologisch an die Analytmoleküle zu haften. In einer weiteren Ausführungsform sind die Analytmoleküle Biomoleküle und das Affinitätsreagens ist adaptiert, um die Biomoleküle aus einer undifferenzierten biologischen Probe selektiv zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Matrixmaterialien in einem schwach sauren oder stark basischen pH-Bereich. In einer bevorzugteren Ausführungsform haben die Matrixmaterialien einen pH-Wert von über 6,0. Eine zusätzliche Ausführungsform präsentiert darüber hinaus die Seite der Sondenspitze gebildet aus einem elektrisch isolierenden Material.
  • In einer weitere Ausführungsform der Gerätschaft der vorliegenden Erfindung zum Ermöglichen einer Desorption und Ionisation von Analytmolekülen umfasst die Gerätschaft: eine probenpräsentierende Oberfläche und ein zur Oberfläche gehöriges Molekül, wobei das zur Oberfläche gehörige Molekül zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehörig ist und Mittel zum Verbinden mit den Analytmolekülen besitzt. Ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial ist auf der Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens vorgesehen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die probenpräsentierende Oberfläche die Oberfläche einer Sondenspitze für die Verwendung in einem Flugzeit-Massenspektrometrie-Analysegerät. Darüber hinaus präsentiert die bevorzugte Ausführungsform eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung, die chemisch an die probenpräsentierende Oberfläche gebunden ist, physikalisch an die probenpräsentierende Oberfläche angeheftet ist, chemisch an die Analytmoleküle gebunden ist oder adaptiert ist, um biologisch an die Analytmoleküle anzuheften. Des Weiteren präsentiert die bevorzugte Ausführungsform Analytmoleküle, die Biomoleküle sind, und die Affinitäts-Capture-Vorrichtung ist adaptiert, um die Biomoleküle aus einer undifferenzierten biologischen Probe selektiv zu isolieren.
  • Wie oben erwähnt, ist in der Gerätschaft ein Matrixmaterial auf der probenpräsentierenden Oberfläche abgeschieden, das zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (dem Affinitätsreagens) gehörig ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Matrixmaterial in einem schwach sauren oder stark basischen pH-Bereich. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform hat das Matrixmaterial einen pH-Wert von über 6,0. Zusätzlich beinhaltet eine bevorzugte Ausführungsform eine probenpräsentierende Oberfläche, die aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet ist.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Fangen von Analytmolekülen auf einer probenpräsentierenden Oberfläche und zum Desorbieren /Ionisieren der gefangenen Analytmoleküle von der probenpräsentierenden Oberfläche für die darauf folgende Analyse präsentiert, wobei das Verfahren umfasst: Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung, die Mittel zum Binden der Analytmoleküle aufweist; Aussetzen der derivatisierten probenpräsentierenden Oberfläche gegenüber einer die Analytmoleküle enthaltenden Probe; Fangen (Capturing) der Analytmoleküle auf der derivatisierten, probenpräsentierenden Oberfläche durch Mittel der Affinitäts-Capture-Vorrichtung; und Aussetzen der durch Mittel der Affinitäts-Capture-Vorrichtung an die derivatisierte, probenpräsentierende Oberfläche gebundenen Analytmoleküle gegenüber einer Energie- oder Lichtquelle, um mindestens einen Teil der Analytmoleküle von der Oberfläche zu desorbieren. Dieses Verfahren umfasst außerdem den Schritt des Abscheidens eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an die zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (dem Affinitätsreagens) gehörige, probenpräsentierende Oberfläche.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen einer Oberfläche zum Präsentieren von Analytmolekülen für die Analyse, wobei das Verfahren umfasst: Vorsehen eines Substrates auf der Oberfläche zum Tragen des Analyten; Derivatisieren des Substrats mit einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung mit Mitteln zum selektiven Binden des Analyten; Anbringen eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an die zu der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (dem Affinitätsreagens) gehörige, probenpräsentierende Oberfläche; und ein Mittel zum Nachweisen der Analytmoleküle, die an die Affinitäts-Capture-Vorrichtung gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein zusätzlicher Schritt des Auftragens eines Nachweismaterials auf die Oberfläche vorgesehen. In einer bevorzugteren Ausführungsform umfasst das Nachweismaterial eine fluoreszierende Art, eine enzymatische Art, eine radioaktive Art oder eine Licht emittierende Art.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Energiequelle einen Laser. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung verwendet und die Energiequelle umfasst eine Ionenquelle. Des Weiteren kann eine bevorzugte Ausführungsform einen Teil der Analytmoleküle umfassen, die nach dem Aussetzen gegenüber der Energiequelle an der probenpräsentierenden Oberfläche gebunden bleiben. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die zusätzlichen Schritte des Umwandelns mindestens eines Teils der Analytmoleküle, die auf der derivatisierten, probenpräsentierenden Oberfläche durch eine chemische, biologische oder physikalische Reaktion an modifizierte Analytmoleküle gebunden bleiben, wobei die Analytmoleküle mittels einer Affinitäts-Capture-Vorrichtung an der derivatisierten, probenpräsentierenden Oberfläche gebunden bleiben, und des Aussetzens der modifizierten Analytmoleküle gegenüber eine Energiequelle, um mindestens einen Teil der modifizierten Analytmoleküle von der Oberfläche zu desorbieren, enthalten.
  • In einem Beispiel, bei dem es sich nicht um eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt, ist eine Probensonde zum Fördern der Desorption von intakten Analyten in die Gasphase vorgesehen, umfassend: eine probenpräsentierende Oberfläche; und ein zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehöriges energieabsorbierendes Molekül, wobei die Probensonde die Desorption eines intakten Analytmoleküls fördert, das sich auf, über oder zwischen den energieabsorbierenden Molekülen befindet, wenn die Probensonde von einer Energiequelle getroffen wird. In einem weiteren Beispiel ist das energieabsorbierende Molekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cinnamamid, Cinnamylbromid, 2,5-Dihydroxybenzoesäure und α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. In einem Beispiel kann auch eine probenpräsentierende Oberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Keramik, TeflonTM-beschichtetem Magnetmaterial, organischen Polymeren und nativen Biopolymeren verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Probensonde zum Fördern der Desorption intakter Analyte in die Gasphase vorgesehen, umfassend: eine probenpräsentierende Oberfläche und eine zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehörige Affinitäts-Capture-Vorrichtung; wobei die Probensonde den Übergang eines intaktes Analytmoleküls in die Gasphase fördert, wenn die Probensonde von einer Energiequelle getroffen wird. Auf der Oberfläche ist in Assoziation mit der Affinitäts-Capture-Vorrichtung (Affinitätsreagens) ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial vorgesehen. Die Aftinitäts-Capture-Vorrichtung ist ausgewählt aus Metallionen, Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten und Kombinationen davon. Die Affinitäts-Capture-Vorrichtung kann ein Antikörper, Lektin, ein Cu(II)- oder eine Fe(III)-Ion sein. Es kann daher ein Immunglobulin sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die probenpräsentierende Oberfläche ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Keramik, TeflonTM-beschichteten magnetischen Materialien, organischen Polymeren und nativen Biopolymeren ausgewählt.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die Probensonde der Erfindung eine probenpräsentierende Oberfläche und:
    • – mindestens zwei verschiedene, zu der probenpräsentierenden Oberfläche gehörige Affinitäts-Capture-Vorrichtungen; wobei die Probensonde je nach der zu den Analytmolekülen gehörigen Affinitäts-Capture-Vorrichtung den Übergang eines Analytmoleküls in die Gasphase mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten fördert, wenn die Probensonde von einer Energiequelle getroffen wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Analyt selektiv aus der Mischung desorbiert, nachdem er von einer Energiequelle getroffen ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Affinitätsvorrichtungen in vorbestimmten Anordnungen angeordnet. In einer bevorzugteren Ausführungsform absorbieren die Anordnungen selektiv eine Vielzahl von unterschiedlichen Analyten.
  • In einer bevorzugteren Ausführungsform wird eine Gerätschaft der vorliegenden Erfindung verwendet, um einen Analyten zu quantifizieren, wobei die Position und Quantität von Affinitäts-Capture-Vorrichtungen die Quantität des absorbierten Analyten bestimmt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Bindung selektiv oder nicht selektiv sein.
  • In einer zusätzlichen Ausführungsform umfasst eine Probensonde zum Fördern der Desorption von intaktem Analyt in die Gasphase: eine probenpräsentierende Oberfläche; und ein oberflächenassoziiertes Molekül, wobei das oberflächenassoziierte Molekül sowohl als energieabsorbierendes Molekül als auch als Affinitäts-Capture-Vorrichtung fungieren kann.
  • Eine andere Ausführungsform zeigt ein Verfahren zum Bestimmen der Sequenz eines Biopolymers, umfassend die Schritte des: Bindens eines Biopolymeranalyten an eine Sondenspitze enthaltend eine probenpräsentierende Oberfläche mit einem oberflächenassoziierten Molekül, wobei das oberflächenassoziierte Molekül eine Affinitäts-Capture-Vorrichtung ist; Desorption des Biopolymeranalyten in der Massenspektrometrieanalyse, wobei mindestens ein Teil des Biopolymers nicht von der Sondenspitze desorbiert wird; Analysieren der Ergebnisse der Desorption; Modifizieren des Biopolymers, das noch immer an die Sondenspitze gebunden ist; und Wiederholen der Desorptions-, Analyse- und Modifikationsschritte, bis das Biopolymer sequenziert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Biopolymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein, RNA, DNA und Kohlenhydrat.
  • Die folgenden Beispiele beinhalten Beispiele, die spezifische Ausführungsformen beschreiben, welche die vorliegende Erfindung veranschaulichen und nicht dazu bestimmt sind, den Umfang der Erfindung, der durch die angehängten Ansprüche definiert ist, einzuschränken. Es werden auch andere Beispiele, die keine Ausführungsformen der Erfindung sind, gegeben.
  • Die Beispiele nutzen ein Flugzeit-Massenspektrometer mit einer Hochenergiequelle, wie beispielsweise einen Laserstrahl, um den Analyten von der Oberfläche einer Sondenspitze zu verdampfen. Bei dem Vorgang werden einige der Moleküle ionisiert. Die positiv geladenen Moleküle werden dann durch ein kurzes Hochspannungsfeld beschleunigt und gelangen in eine feldfreie Flugröhre. Am Ende der Flugröhre befindet sich ein empfindlicher Detektor, der jedes Mal, wenn ein molekulares Ion auf ihn auftrifft, ein Signal gibt. Ein Fachmann erkennt, dass andere Arten des Nachweises und der Ionisation ebenfalls verwendet werden können.
  • BEISPIEL 1
  • Energieabsorbierende Moleküle in wässriger, neutralisierter Form
  • Das im Stand der Technik für die matrixunterstützte Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie verwendete Matrixmaterial ist stark sauer. Eine der vorliegenden Entdeckungen ist, dass Analyte desorbiert werden, wenn sie mit neutralisierten, energieabsorbierenden Molekülen gemischt werden, die in vollkommen wässrigen Lösungsmitteln gelöst sind. Durch geeignete Neutralisation bei pH 6,0 oder darüber wird das Matrixmaterial weit gehend passiv gegenüber nachfolgende chemische oder enzymatische Reaktionen gemacht, die mit den auf der Sondenspitzenoberfläche präsentierten Analytmolekülen durchgeführt werden. Da bei jeder Desorption/Massenspektrometermessung nur ein kleiner Bruchteil der Analytmoleküle verwendet wird, sind die Proben auf der Sondenspitze für nachfolgende chemische oder enzymatische Modifikationen in situ verfügbar. Nach der Modifikation werden die Proben durch Massenspektrometrie analysiert. Eine Analyse auf derselben Sondenspitze liefert eine genauere Bestimmung des Moleküls und seiner Eigenschaften, einschließlich seiner Struktur.
  • Massenspektrometrie wird mit einem modifizierten Vestec Modell VT2000 oder einem MAS Linearflugzeit-Forschungsmassenspektrometer Modell SELDI durchgeführt, das einen frequenzverdreifachten, von einem gütegeschalteten, Neodym-Yttrium-Aluminium-Granat (Nd-YAG)-gepulsten Laser (355 nm, 5 ns-Puls) verwendet. Die durch die gepulste Laserbestrahlung desorbierten Ionen werden bis auf eine Energie von 30 keV beschleunigt und können einen 2 Meter langen, feldfreien Driftbereich entlang driften (aufrechterhalten bei 10–8 Torr). Die von einem 20-stufigen Elektronenvervielfacher mit diskreten Dynoden nachgewiesenen Ionensignale werden von einem schnellen Vorverstärker um einen Faktor 10 amplifiziert, bevor sie mithilfe eines 200 MS/s transienten Rekorders (LeCroy TR8828D, 8 Bit Y-Achsenauflösung) oder einem zur schnellen Signalmittelwertbildung fähigen Tektronix-Digitalisierer aufgezeichnet werden. Die Bestrahlung im letzteren Fall wird in Echtzeit angepasst, während der Vorgang auf einem Oszilloskop (Tektronix) überwacht wird, um ein optimales Ionensignal zu erhalten. Die Datenverringerung (Spitzencentroidberechnungen und Dauer bis zu der Masse-/Ladungsumkehrung) werden mit PC-Software durchgeführt. Ein VG TOFSpec Massenspektrometer, das einen Stickstofflaser nutzt, welcher einen gepulsten Laser mit 335 nm erzeugt, oder ein lineares LDI 1700 Massenspektrometer, das einen Stickstofflaser nutzt, welcher einen gepulsten Laser mit 335 nm erzeugt, können auch verwendet werden.
  • I. Spezifische Analyse
    • 1. Sinapinsäure (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) wird in einer Konzentration von 20 mg/ml (pH 3,88) in Wasser suspendiert und mit Triethylamin (Pierce, Rockford, IL) auf einen pH-Wert von 6,2 – 6,5 neutralisiert. Eine wässrige Mischung (1 μl) synthetischer Peptide, enthaltend menschliche, histidinreiche Glykoproteinmetallbindungsdomänen (GHHPH)2G (1206 1 Da), (GHHPH)5G (2904 Da) und die Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors (D473-L525) (6168,4 Da) werden mit 2 μl Sinapinsäure (20 mg/ml Wasser, pH 6,2) auf einer Sondenspitze gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von sieben Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) wird die Sonde entfernt, es werden 2 μl 20 mM Cu(SO)4 zugegeben und die Probe durch Massenspektrometrie erneut analysiert. 1A (oberes Profil) zeigt das Massenspektrum der drei Peptide, die in Anwesenheit neutralisierter, energieabsorbierender, Molekülen desorbiert wurden. 1 B (unteres Profil) zeigt die Metallbindung in situ der Peptide in Anwesenheit neutraler, energieabsorbierender Moleküle. Unter den vorliegenden experimentellen Bedingungen kann das (GHHPH)2G-Peptid mindestens 4 Cu(II) binden, das (GHHPH)5G-Peptid mindestens 5 Cu(II) binden und die Dimerisierungsdomäne mindestens 1 Cu(II) binden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit ⧠-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure (20 mg/ml Wasser), neutralisiert auf pH 6,5, erhalten.
    • 2. Ein Aliquot von 1 μl menschlichem β-Casein-Phosphopeptid (R1 – K18 + 5P) (2488 Da) wird mit 1 μl Sinapinsäure (20 mg/ml Wasser), neutralisiert auf pH 6,5, gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) wird die Sonde entfernt, das verbleibende, mit der neutralisierten Sinapinsäure vermischte Phosphopeptid wird direkt auf der Sondenspitze mit 0,5 μl alkalischer Phosphatase (Sigma) verdaut und bei 23°C 5 Min. inkubiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) wird die Sonde entfernt, und es wird durch Zugabe eines weiteren Aliquots von 0,5 μl alkalischer Phosphatase ein weiterer Verdau der verbleibenden Phosphopeptide durchgeführt und 5 Minuten lang bei 23°C inkubiert. Die Probe wird nochmals durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 2A (oberstes Profil) zeigt das Massenspektrum des Phosphopeptids, das in Anwesenheit neutralisierter energieabsorbierender Moleküle desorbiert wurde. 2B (zweites Profil von oben) zeigt den 5-minütigen Verdau in situ mit alkalischer Phosphatase, um Phosphatgruppen von dem Phosphopeptid zu entfernen. Die 0P-, 1P- und 3P-Spitzen stellen die Produkte nach dem Entfernen von respektive fünf, vier und zwei Phosphatgruppen von dem Phosphopeptid dar. 2C (drittes Profil von oben) zeigt, dass weiterer in situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase zu einer fast vollständigen Entfernung aller Phosphatgruppen von dem Phosphopeptid führen kann. Im Gegensatz dazu zeigt 2D (unteres Profil), dass in dem Kontrollexperiment, in dem der in-situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase (0,5 μl) in Anwesenheit von energieabsorbierenden Molekülen ohne vorherige Neutralisierung (z. B. Sinapinsäure bei einem pH-Wert von 3,88 oder Dihydroxybenzoesäure bei pH 2,07) durchgeführt wird, im Verlauf von 10 Minuten bei 23°C ein sehr eingeschränkter Verdau stattfand.
    • 3. Ein Aliquot von 1 μl (GHHPH)5G-Peptid (2904 Da) wird mit 2 μl Sinapinsäure (20 mg/ml Wasser) auf pH 6,2 neutralisiert und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) wurden die verbleibenden, mit neutralisierter Sinapinsäure gemischten Peptide direkt auf der Sondenspitze mit 1 μl Carboxypeptidase P (Boehringer Mannheim Corp, Indianapolis, IN) verdaut und bei 23°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Probe wird durch Massenspektrometrie analysiert. 3 zeigt ein Verbundmassenspektrum des Peptids vor (unteres Profil) und nach (oberes Profil) dem in situ-Verdau mit Carboxypeptidase P in Anwesenheit von neutralisierten energieabsorbierenden Molekülen. Die Verringerung der Masse stellt das Entfernen eines Gly-Restes vom C-Terminus des Peptids dar.
  • Diese Beispiele veranschaulichen, dass neutralisierte energieabsorbierende Moleküle in wässrigen Lösungen bei dem Erhalten der Struktur und der Funktion der Analyte biokompatibler sind, wenn sie in großem molarem Überschuss zugegeben werden. Ihre Anwesenheit führt nicht zu einer Interferenz mit sequenziellen chemischen oder enzymatischen Reaktionen in situ auf dem verbleibenden Analyten.
  • BEISPIEL 2
  • Nichtmetallische Sondenelemente (probenpräsentierende Oberflächen)
  • Es wurde herausgefunden, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Sondenelemente (Sondenspitzen oder probenpräsentierende Oberflächen) nicht aus Metall bestehen oder metallbeschichtet sein müssen, wie in der Verfahren im Stand der Technik beschrieben ist. Die probenpräsentierenden Oberflächen bestehen aus unterschiedlichen Materialien, einschließlich porösen oder nicht porösen Materialien, wobei die porösen Materialien schwammähnliche, polymere Bereiche mit großer Oberfläche für die optimierte Adsorption und Präsentation von Analyt vorsehen.
  • Polypropylen oder Polystyrol oder Polyethylen oder Polycarbonat werden in einer offenen Flamme geschmolzen und als dünne Schicht auf einem Sondenelement aus rostfreiem Edelstahl und einem Durchmesser und 2 mm abgeschieden, um es vollständig zu bedecken. Feste Glasstäbe oder feste Nylonfilamente (mit einem Durchmesser von bis zu 1,5 mm) oder Polyacrylamidstäbe werden in Abschnitte von 1 cm geschnitten und in den Träger der Sonde aus rostfreiem Edelstahl eingeführt. Es werden magnetische Rühren (1,5 × 8 mm), TeflonTM-beschichtet) in den Träger der Sonde aus rostfreiem Stahl eingeführt. Ein Aliquot von 1 μl Peptidmischung enthaltend (GHHPH)5G und Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors wird mit 2 μl Dihydroxybenzoesäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1 Trifluoressigsäure) auf jedem der Sondenelemente gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 4 zeigt, dass Analyte von mehreren Beispielen von isolierenden biokompatiblen Oberflächen desorbiert werden konnten.
  • Diese Oberflächen können derivatisiert werden (zu unterschiedlichen Dichten), um Affinitätsadsorptionsreagenzien (Aftinitäts-Capture-Vorrichtungen), energieabsorbierende Moleküle (gebundene "Matrix"-Moleküle) oder photolabile Anheftungsmoleküle über chemische Bindungen (kovalent oder nichtkovalent) zu binden. Die Geometrie der probenpräsentierenden Oberfläche ist unterschiedlich (d. h. Größe, Struktur, Flexibilität, Dicke, etc.), um dem Anspruch des Experimentes (des Tests) zu entsprechen (z. B. Einführen in einen lebenden Organismus durch Öffnungen von vorbestimmter Größe).
  • BEISPIEL 3
  • Affinitätsgerichtete Laserdesorption (oberflächenverstärktes Aftinitäts-Capture; surface enhanced affinity capture, SEAC, – die Erfindung)
  • Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von bestehenden und neuen Festphasenaffinitätsreagenzien, die konzipiert sind (1) zum Fangen (Capture, Adsorption) eines Analyten oder mehrerer Analyte, (2) zum Herstellen dieser gefangenen Analyte (z. B. Waschen mit Wasser oder anderen gepufferten oder nicht gepufferten Lösungen zum Entfernen von Verunreinigungen, wie z. B. Salze, und mehrere Zyklen des Waschens, beispielsweise mit einem polaren, organischen Lösungsmittel, detergenzlösenden Lösungsmittel, verdünnter Säure, verdünnter Base oder Harnstoff) und (3), was am wichtigsten ist, dem direkten Transfer dieser gefangenen und hergestellten Analyte auf die Sondenoberfläche für die nachfolgende Analytdesorption (für den Nachweis, die Quantifizierung und/oder Massenanalyse). Affinitäts-Capture-Vorrichtungen sind auf unterschiedlichen Materialien immobilisiert, einschließlich elektrisch isolierenden Materialien (porös und nicht porös), flexibel oder nicht steife Materialien, optisch transparente Materialien (z. B. Glas, einschließlich Glas mit unterschiedlicher Dichte, Dicke, Farbe und mit unterschiedlichem Brechungsindex) sowie weniger reaktive, biokompatiblere Materialien (z. B. Biopolymere wie beispielsweise Agarose, Dextran, Zellulose, Stärken, Peptide und Fragmente von Proteinen und von Nukleinsäuren). Die bevorzugte Sondenspitze, oder Probenoberfläche, für die selektive Adsorption/Präsentation der Probe für die Massenanalyse sind (1) rostfreier Edelstahl (oder anderes Metall), mit einem synthetischen Polymer(z. B. quervernetztes Dextran oder Agarose, Nylon, Polyethylen, Polystyrol)-Beschichtung, die zur kovalenten Anheftung von spezifischen Biomolekülen oder anderen nicht biologischen Affinitätsreagenzien geeignet ist, (2) Glas oder Keramik, und/oder (3) Plastik (synthetisches Polymer). Die an der selektiven Immobilisierung von Affinitätsreagenzien an diese Sondenoberflächen beteiligten, chemischen Strukturen umfassen die bekannten, unterschiedlichen sauerstoffabhängigen, kohlenstoffabhängigen, schwefelabhängigen und/oder stickstoffabhängigen Mittel der kovalenten oder nicht kovalenten Immobilisation.
  • I. Oberflächenimmobilisierte Metallionen als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
    • 1. Cu(II)-Ion wird cheliert durch Iminodiacetat (IDA)-Gruppe, kovalent angeheftet an entweder poröse Agarosekügelchen (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Ligandendichte 22–30 μmol/ml Gel) oder an feste Kieselgelkügelchen (Chelating TSK-SW, ToyoSoda, Japan), Ligandendichte 15–20 μmol/Gel). Eine Mischung synthetischer Peptide enthaltend Neurotensin (1655 Da), spermienaktivierendes Peptid (933 Da) und Angiotensin 1 (1296,5 Da) wird bei 23°C für 10 Minuten mit 50 μl Packungsvolumen von TSK-SW-IDA-Cu(II) bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) gemischt. Das Gel wird durch Zentrifugation von der übrigen Peptidlösung abgetrennt und wird dann mit 200 μl Natriumphosphat, Natriumchlorid-Puffer, pH 7,0, dreimal gewaschen, um unspezifisch gebundene Peptide zu entfernen. Schließlich wird das Gel in 50 μl Wasser suspendiert. Aliquots von 2 μl Gelsuspension und nicht adsorbierte Peptidlösung werden mit 1 μl Sinapinsäure (gelöst in Methanol) gemischt und auf eine Sondenspitze aus rostfreiem Edelstahl aufgetragen und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt. Ein Aliquot von 2 μl 20 mM CuSO4 wird zugegeben, dann mit 1 μl Sinapinsäure gemischt und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf weiteren Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt. Das verbleibende, an die IDA-Cu(II)-Kügelchen adsorbierte Peptid wird dann mit 1 μl Trypsin (Sigma) in 0,1 M Natriumbicarbonat, pH 8,0 bei 23°C 10 Minuten lang in einer feuchten Kammer verdaut. Die Gelkügelchen werden dann mit Wasser gewaschen, um Enzym und Salz zu entfernen, bevor 1 μl Sinapinsäure zugegeben und die Probe durch Laserdesorptions-Flugzeit- Massenspektrometrie analysiert wird. 5A zeigt die molekularen Ionen (und die vielfachen Na-Addukte) von spermienaktivierendem Faktor (933 Da) und Neurotensin (1655 Da) in der verbleibenden Peptidlösung, die nicht von dem IDA-Cu(II) adsorbiert wurde. Es gab keine signifikante Spitze, die Angiotensin 1 (1296,5 Da) entspricht. Das Massenspektrum in 5B zeigt die Peaks von Angiotensin 1 plus Na-Addukt, die selektiv auf dem IDA-Cu(II)-Gel adsorbiert wurden. Wird das IDA-Cu(II)-Gel noch zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen, zeigt das resultierende Massenspektrum nur das ursprüngliche Angiotensin I-Ion und keine anderen Adduktspitzen (5 und 6, Profil C). 6D zeigt die Kupferbindung (1 und 2 Cu) in situ durch das Angiotensinpeptid. 6E zeigt den Trypsinverdau in situ des Angiotensinpeptids an der einzigen Arg2-Position in der Sequenz. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass: a) Laserdesorption auf Analyt, der auf oberflächenimmobilisiertem Metallion affinitätsadsorbiert ist, erfolgreich durchgeführt wurde; b) die Oberfläche nach der Bindung mit unterschiedlichen Lösungsmitteln gewaschen wird, um alle verunreinigenden Verbindungen in der Probe zu entfernen und ein sehr sauberes Massenspektrum des Analyten zu ergeben; c) die Affinitäts-Capture-Vorrichtung nur den Analyten mit definierter Struktur auswählt (in diesem Fall wird Angiotensin 1 durch IDA-Cu(II) selektiv aus der Peptidmischung adsorbiert, da dieses Peptid eine freie N-terminale Aminosäure und zwei Histidinaminosäureresten in der Sequenz hat und beide Eigenschaften für eine starke Cu(II)-Bindung erforderlich sind); d) auf dem adsorbierten Analyten Struktur- und Funktionsanalysen durch sequenzielle, chemische oder enzymatische Modifikationen in situ mit minimalem Verlust in jeder Schritt der Reaktion und in jedem Waschschritt durchgeführt wurden; und e) ein Sondenelement mit oberflächengebundenem Substrat (z. B. Angiotensin 1) verwendet wird, um spezifische Enzymaktivität (z. B. Trypsin) in situ (z. B. im Magen-Darm-Trakt des menschlichen Körpers) zu überwachen.
    • 2. Eine Lösung von Pferdeherzmyoglobin (325 pmol, 16.952 Da) wird mit 50 μl TSK-SW-IDA-Cu(II) bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C für 10 Minuten gemischt. Das Gel wird durch Zentrifugation von der Lösung getrennt und dann zweimal mit 500 μl Puffer und zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen. Die Menge an verbleibendem Myoglobin in all diesen Lösungen wird dann spektrophotometrisch geschätzt, dann kann die an dem Gel adsorbierte Menge berechnet werden. Das Gel wird in 50 μl Wasser suspendiert und dann seriell in Wasser verdünnt. Ein Aliquot von 0,5 μl der verdünnten Gellösung wird dann mit 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 7 zeigt, dass mit einer berechneten Quantität von 4 bis 8 fmol abgeschieden auf der Sondenspitze ein nachweisbares Signal (Signal/Rauschen = 6, nach durchschnittlich 50 Laserschüssen) von Myoglobin erhalten wird. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass affinitätsadsorbierte Analyte auf einer Oberfläche viel einfacher zu übertragen sind und frei von jeglichem Verlust durch unspezifische Adsorption an Oberflächen des Behältnisses und von Transfervorrichtungen sind. Der adsorbierte Analyt wird auf vorbestimmten Bereichen (die noch kleiner sind als die Laserpunktgröße) auf der probenpräsentierenden Oberfläche in geringen (atto- bis femtomol) Quantitäten bei einer definierten Oberflächendichte oder lokalen Konzentration abgesondert, die für einen wirksamen Nachweis durch Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie erforderlich sind.
    • 3. Die menschlichen β-Casein-Peptide (E2-K18) sind auf einem Peptidsynthesizer Modell 430A von Applied Biosystems anhand des NMP-HOBt-Protokolls synthetisiert. Die zu phosphorylierenden Ser-Reste sind an die Peptidkette ohne Seitenketten-Schutzgruppen gekoppelt. Die ungeschützten Ser-Reste werden zunächst mit di-t-Butyl-N,N,-Diisopropylphosphoramidit phosphinyliert. Der Phosphitester wird dann mit t-Butylperoxid oxidiert, gewaschen und vom Harz abgespalten. Alle Seitenketten-Schutzgruppen werden mit 95%iger Trifluoressigsäure entfernt. Die ungereinigten Phosphopeptide werden mit Methyl-t-Butyläther extrahiert und getrocknet. Diese ungereinigte Präparation von synthetischen Phosphopeptiden wird in 50 mM MES, 0,15 M Natriumchlorid, pH 6,5, gelöst und mit 50 μl Tris (Carboxymethyl)-Ethylendiamin (TED)-Fe(III), immobilisiert an poröser Sepharose (synthetisiert wie beschrieben von Yip, T. -T. und Hutchens, T. W., Protein expression and Purification 2: 355–362 (1991), Ligandendichte 65 μmol/ml), bei 23°C 15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dann mit 500 μl desselben Puffers dreimal gewaschen und dann einmal mit 500 μl Wasser. Ein Aliquot von 1 μl Gel wird mit 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) auf der Sondenspitze gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt und die verbleibenden, an TED-Fe(III) adsorbierten Phosphopeptide direkt auf der Sondenspitze mit 1 μl alkalischer Phosphatase (Ammoniumsulfatsuspension, Sigma) in 50 mM HEPES pH 7,0 bei 23°C 10 Minuten lang in einer feuchten Kammer verdaut. Das Gel wird mit Wasser gewaschen, um Enzym und Salz zu entfernen. Es wird Sinapinsäure zugegeben und die Probe wird nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 8 (oberes Profil) zeigt die Verteilung von Caseinpeptid (1934 Da) mit mehreren phosphorylierten Formen. Nach dem in situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase bleiben nur die ursprünglichen, nicht phosphorylierten Formen übrig (unteres Profil). Die Beispiele veranschaulichen die Anwendung von SEAC für die Schnellüberwachung der Phosphoproteinsynthese in einer ungereinigten Mischung ohne vorherige Rufreinigung. Die Identität des Phosphopeptids wird sofort durch in situ-Verdau mit alkalischer Phosphatase bestätigt.
    • 4. Aliquots von 100 μl von Kindernahrung für Frühgeborene (SIMILAC, Meade Johnson) und der Mageninhalt von frühgeborenen Kindern, der 90 Minuten nach Fütterung der Kindernahrung aspiriert wurde, werden mit 50 μl TED-Fe(III)-Sepharose in 0,1 M MES, 0,15 M Natriumchlorid, pH 6,5 bei 23°C 15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird mit 500 μl desselben Puffers dreimal gewaschen und dann einmal mit 500 μl Wasser. Aliquots von 1 μl Gelsuspension oder Kindernahrung für Frühgeborene oder Magenaspirat werden mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 50% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) auf der Sondenspitze gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 9 zeigt, dass das Massenspektrum von Gesamtmagenaspirat (zweites Profil von oben) dem der Gesamtkindernahrung für Frühgeborene (unteres Profil) in der 1.000 – 15.000 Da-Region sehr ähnlich ist. Die Massenspektren von Analyten, die aus den beiden Proben selektiv an TED-Fe(III) adsorbiert wurden, sind allerdings sehr unterschiedlich, aufgrund des proteolytischen Verdaus von in der Kindernahrung vorhandenen Phosphoproteinen im Magen gibt es mehr Phosphopeptide mit niederem Molekulargewicht (d. h. gebunden an TED-Fe(III)) in dem Magenaspirat (oberes Profil) als in der Kindernahrung (zweites Profil von unten). Dieses Beispiel veranschaulicht, dass SEAC besonders nützlich ist für das Analysieren von spezifischen Analyten in biologischen Proben. Phosphopeptide sind in Anwesenheit anderer verunreinigender Bestandteile in einer komplexen Probe schwieriger nachzuweisert, da sie im positiven Ionenmodus schwächer ionisiert sind. Werden jedoch die Phosphopeptide selektiv adsorbiert und alle anderen Bestandteile aus der Probe entfernt, so tritt keine Signalunterdrückung auf.
    • 5. Aliquots von 200 μl von menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein werden mit 50 μl IDA-Cu(II)-Sepharose (Pharmacia) bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C 10 Minuten lang gemischt. Das Gel wird zweimal mit 500 μl Puffer und einmal mit 500 μl Wasser gewaschen. Aliquots von 1 μl Gel werden mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure durch Waschen mit Methanol entfernt. Die verbleibenden, an IDA-Cu(II)-Gel adsorbierte Glykoproteine werden mit N-Glykanase in 20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 3 M Harnstoff, pH 7,0 bei 37°C über Nacht in einer feuchten Kammer verdaut. Nach dem Waschen mit Wasser, um Enzym und Salz zu entfernen, werden 2 μl Sinapinsäure zugegeben und die Probe wird durch Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt. Es werden Aliquots von 2 μl Trypsin in 0,1 M Natriumbicarbonat zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach dem Waschen mit Wasser, um Enzym und Salz zu entfernen, wird Sinapinsäure zugegeben und die Probe wird durch Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt. Es werden Aliquots von 2 μl 20 mM CuSO4 zugegeben. Dies ist gefolgt von Zugabe von 2 μl Sinapinsäure und daraufhin von Analysieren durch Massenspektrometrie. Nach dem Erhalten von fünf Spektren (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum) an verschiedenen Stellen auf der Sondenspitze wird die Sinapinsäure mit Methanol entfernt. Es werden Aliquots von 2 μl Diethylpyrocarbonat (Sigma) in 5 mM HEPES, pH 6,5, zugegeben und bei 23°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach dem Waschen mit Wasser, um Chemikalien und Puffersalze zu entfernen, wird 2 μl Sinapinsäure zugegeben und die Probe durch Massenspektrometrie analysiert. Um eine partielle Sequenz der metallbindenden Peptide zu erhalten, anstatt die Histidinreste mit Diethylpyrocarbonat zu modifizieren, wird 1 μl Carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim) zu dem an der Oberfläche adsorbierten, tryptischen Verdau gegeben und bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer 5 Minuten lang inkubiert. Enzym und Salz werden mit Wasser weggewaschen, 1 μl Sinapinsäure zugegeben und durch Massenspektrometrie analysiert. 10A zeigt die Verbundmassenspektren von menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein adsorbiert an IDA-Cu(II)-Sepharose vor und nach Verdau mit N-Glykanase. Die Massenverschiebungen stellen die Entfernung von Kohlenhydrat von den entsprechenden Glykoproteinen dar. 10B zeigt die Verbundmassenspektren von trypsinverdauten Peptiden von den deglykosylierten Proteinen der beiden Arten (oberes Profil für menschliches Protein, zweites Profil von unten für bovines Protein) und die Cu(II)-Bindung in situ der trypsinverdauten Peptide der beiden Arten (zweites Profil von oben für menschliches Protein, unterstes Profil für bovines Protein, die Zahlen 1, 2 zeigen die Zahl des gebundenen Kupfers an). 10C zeigt, dass ein solches Cu(II)-bindendes Peptid (unteres Profil) mindestens 4 His-Reste hat, die durch Diethylpyrocarbonat spezifisch modifiziert sind, um 4-N-Carbethoxyhistidyladdukte (1–4, oberes Profil) zu bilden. 10D zeigt die partielle C-terminale Sequenz des hauptsächlichen Cu-bindenden Peptids in dem bovinen, histidinreichen Glykoprotein. Dieses Beispiel veranschaulicht die effektive Nutzung von SEAC, um die Struktur und Funktion von metallbindenden Domänen von Proteinen unterschiedlicher Arten zu untersuchen.
  • II. Oberflächenimmobilisierter Antikörper als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
    • 1. Polyklonaler Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin-Antikörper wird passend gegen gereinigtes menschliches Laktoferrin von Bethyl Laboratories (Montgomen, TX) erzeugt. Der Antikörper wird durch thiophile Adsorption und immobilisierte Laktoferrinsäulen affinitätsgereinigt. Schaf-Anti-Kaninchen-IgG, kovalent gebunden an Magnetkügelchen, stammen von Dynal AS, Oslo, Norwegen (superparamagnetische Polystyrenkügelchen mit einheitlich 2,8 um Durchmesser, Ligandendichte 10 μg Schaf-IgG pro mg Kügelchen).
  • Menschliches Laktoferrin (1 nmol, 59Fe-markiert, 81.100 Da) wird mit Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrinantikörper in 20 mM Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0 bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Danach werden 40 μl Schaf-Anti-Kaninchen-IgG auf Dynabeads (6–7 × 108 Kügelchen/ml) zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Kügelchen werden dreimal mit 500 μl Natriumphosphatpuffer und zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen. Die abschließende Menge an menschlichem Laktoferrin, das an den Komplex gebunden ist, wird auf 4 pmol geschätzt. Etwa ein Zehntel der Kügelchen wird auf eine TeflonTM-beschichtete, magnetische Sondenspitze übertragen, mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 11 zeigt die Anwesenheit von Laktoferrin (81.143 Da) in dem Komplex aus Antigen, primärem Antikörper und sekundärem Antikörper (oberes Profil), wobei die Kontrolle aus primärem Antikörper und sekundärem Antikörper (unteres Profil) nur das Kaninchenantikörpersignal (149.000 Da für einmal geladene und 74.500 Da für doppelt geladene) zeigt.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht, a) dass Laserdesorption erfolgreich auf einem Analyt durchgeführt wurde, der auf oberflächenimmobilisiertem Antikörper affinitätsadsorbiert ist (wenn das Analytsignal in einer Mischung eines Komplexes aus primärem Antikörper und Analyt eindeutig identifiziert wird, wird in diesem Verfahren des Identifizierens des Analyten jede Capture-Vorrichtung, z. B. oberflächenimmobilisierter sekundärer Antikörper, Protein A, Protein G, Streptavidin, des primären Antikörpers verwendet; b) das Prinzip der Proteinentdeckung über spezifische molekulare Erkennungsereignisse, wo einer der Analyten durch seine Assoziation mit dem primären Ziel des Capture nachgewiesen wird; und c) die Verwendung von magnetischer Oberfläche als effiziente Capture-Vorrichtung.
    • 2. Affinitätsgereinigtes Kaninchen-Anti-Human-Laktoferrin ist über Glutaraldehyd kovalent an die Spitze eines aktivierten Nylonsondenelements (Durchmesser 2 mm) gebunden. Dieses wird in 1 ml Harn eines frühgeborenen Kindes, pH 7,0, enthaltend 350 fmol menschliches Laktoferrin, untergetaucht und für 15 Stunden bei 4–8°C gerührt. Das Nylonsondenelement wird heraus genommen und dreimal mit 1 ml 20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 3 M Harnstoff, pH 7,0, und zweimal in 1 ml Wasser gewaschen.
  • Ein Aliquot von 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1 Trifluoressigsäure) wird zugegeben und die Probe durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 12 zeigt das molekulare Ion von menschlichem Laktoferrin (Signal/Rauschen = 2,5, durchschnittlich 25 Laserschüsse) im Massenspektrum. 13 zeigt das äquivalente Massenspektrum von komplettem Harn eines frühgeborenen Kindes enthaltend 1 nmol/ml Laktoferrin; die durch Anwesenheit anderer Bestandteile in der Harnprobe verursachte Signalunterdrückung ist so stark, dass selbst die Zugabe von einem mehrtausendfachen Überschuss über 350 fmol/ml Laktoferrin, wie für 12 beschrieben, nicht nachgewiesen werden kann.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung einer SEAC-Vorrichtung auf einer flachen Oberfläche (einer zweidimensionalen Konfiguration) eines flexiblen Sondenelements. Diese SEAC-Vorrichtung kann verwendet werden, um Zielanalytmaterialien aus undifferenzierten biologischen Proben, wie beispielsweise Blut, Tränen, Harn, Speichel, gastrointestinalen Flüssigkeiten, Spinatflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Knochenmark, Bakterien, Viren, Zellen in Kultur, Biopsiegewebe, Pflanzengewebe oder -flüssigkeiten, Insektengewebe oder -flüssigkeiten, etc., zu isolieren. Der spezifische Affinitätsadsorptionsschritt reinigte den Analyten von Verunreinigungen durch andere Bestandteile in einer komplexen Probe und überwand daher den Signalunterdrückungseffekt, besonders dann, wenn der Analyt in sehr geringer Konzentration (femtomol/ml) vorliegt.
    • 3. Weitere Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit durch die SEAC-Technik wird durch Amplifikation eines an den Analyten gebundenen Mackers erreicht. Eine Art, dies zu erreichen, ist durch Kombination von Enzymkatalyse und dem Streptavidin-Biotin-System. Nach dem Fangen (Capturing) winziger Mengen Laktoferrin auf einem Nylonsondenelement, wie in Beispiel 3.11.2. beschrieben, wird biotinylierten Anti-Laktoferrin-Antikörper oder biotinylierte, einzelsträngige DNA verwendet, um spezifisch an das Laktoferrin zu binden. Dann wird Streptavidin zugegeben, um spezifisch an den biotinylierten Marken zu binden. Schließlich wird biotinylierte alkalische Phosphatase zugegeben, um spezifisch an das Streptavidin zu binden. Da mehrere solcher biotinylierten alkalischen Phosphatase-Moleküle an ein Streptavidin binden können, gibt es eine primäre Amplifikationsstufe. Die zweite Amplifikationsstufe wird durch die Enzymkatalyse erreicht, in der das Enzym eine Umsatzzahl von 102–103 min–1 erreichen kann. Durch Verwendung eines phosphonlierten Substrates mit niedrigem Molekulargewicht wie z. B. ATP, NADPH oder ein Phosphopeptid kann ein Test der Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase leicht durchgeführt werden. Die Effizienz des Nachweises der Massenverschiebung eines Analyten mit niedrigem Molekulargewicht ist viel höher als die eines Glykoproteins mit 80 kDa.
    • 4. Die ultimative Verbesserung des Nachweises wird derzeit erreicht durch die auf dem Polymerasekettenreaktionsprinzip beruhenden Amplifikationen. Nach dem Fangen (Capturing) winziger Mengen Laktoferrin auf einem Nylonsondenelement, wie in Beispiel 3.11.2. beschrieben, wird biotinylierter Anti-Laktoferrin-Antikörper oder biotinylierte, einzelsträngige DNA verwendet, um spezifisch an das Laktoferrin zu binden. Dann wird Streptavidin zugegeben, um spezifisch an den biotinylierten Marken zu binden. Schließlich wird ein Stück biotinylierte, lineare DNA zugegeben, um an das Streptavidin zu binden. Diese gebundene DNA wird in einem Polymerasekettenreaktionsvorgang mit 30 Zyklen amplifiziert. Jeder Zyklus besteht aus einem 1-minütigen Denaturierungsschritt bei 94°C, einer 1-minütigen Anheftungsreaktion bei 58°C und einer 1-minütigen Primerverlängerungsreaktion bei 72°C. Diese Technik bietet Amplifikationsfaktoren im Bereich des 106-Fachen. Die amplifizierte DNA wird direkt durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie nachgewiesen, wobei 3-OH-Picolinsäure als die Matrix verwendet wird.
    • 5. Polyklonaler, gegen bovines histidinreiches Glykoprotein gerichteter Antikörper wird passend gegen gereinigtes bovines bovines histidinreiches Glykoprotein von Bethyl Laboratories (Montgomery, TX) erzeugt. Der Antikörper wird durch thiophile Adsorption und Säulen mit immobilisiertem bovinem histidinreichem Glykoprotein affinitätsgereinigt. Der gereinigte Antikörper wird auf AffiGel 10 gemäß den Anweisungen des Herstellers immobilisiert (BioRad Laboratories, Hercules, CA, Ligandendichte 15 μmol/ml Gel). Ein Aliquot von 200 μl bovinem Kolostrum wird mit 200 μl 20 nM Natriumphosphat, pH 7,0 verdünnt und mit 50 μl immobilisiertem Antikörper bei 23°C 30 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dreimal mit 500 μl 20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid, 3 M Harnstoff, pH 7,0, und zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen. Ein Aliquot von 1 μl des gewaschenen Gels wird mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) auf der Sondenspitze gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 14 zeigt das Verbundmassenspektrum von gereinigtem bovinem histidinreichem Glykoprotein (unteres Profil) und Proteine, die aus bovinem Kolostrum aftinitätsadsorbiert wurden (oberes Profil). Das Ergebnis zeigt das Vorhandensein von intaktem, histidinreichem Glykoprotein und seiner größten, proteolytischen Fragmente in bovinem Kolostrum an. Dieses Beispiel veranschaulicht die effektive Verwendung von SEAC als eine schnelle und einfache Technik zum Nachweisen und Charakterisieren neuer Proteine in einer kleinen Menge biologischer Flüssigkeit. Dieses Ergebnis unterstützt die anfänglichen Befunde, die mit der sehr arbeitsintensiven Technik des Immunblottens der Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten wurden.
    • 6. Antikörperepitopmapping wird mit der SEAC-Technik leicht erreicht. Drei unterschiedliche Quellen von Anti-Human-follikelstimulierendes-Hormon (ein polyklonaler Antikörper spezifisch gegen beta-FSH von Chemicon International, Temecula, CA, ein monoklonaler Antikörper spezifisch gegen Beta-3-Epitop von Serotec, Indianapolis, IN, ein monoklonaler Antikörper von Biodesign, Kennebunk, ME) werden auf AftiGel 10 entsprechend den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Diese immobilisierten Antikörper werden alle getestet, um das follikelstimulierende Hormon spezifisch zu binden, indem sie mit zwei unterschiedlichen Präparationen von follikelstimulierendem Hormon (eine halb reine Präparation von Chemicon und eine ungereinigte Präparation von Accurate Chemical and Scientific Corp.) inkubiert und dann in Anwesenheit von Sinapinsäure durch Massenspektrometrie analysiert wurden. Dann wurde die halb reine Präparation von menschlichem FSH (Chemicon) mit Trypsin verdaut und gesonderte Aliquots (7 μl) werden mit den immobilisierten Antikörpern (10 μl einer 1 : 1 Gelsuspension) in phosphatgepufferter Salzlösung bei 4°C 2 Stunden lang umgesetzt. Nach Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung und Wasser werden die adsorbierten Proteine in Anwesenheit von Sinapinsäure durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 15 zeigt die Verbundmassenspektren der Peptide von follikelstimulierendem Hormon, die von den unterschiedlichen Antikörpern erkannt wurden. Die beiden monoklonalen Antikörper erkannten eindeutig unterschiedliche Epitope, während die polyklonalen Antikörper viele Epitope erkannten, die bei denen, die von den beiden monoklonalen Antikörpern erkannt werden, häufig vorkommen.
  • III. Oberflächenimmobilisierte Nukleinsäure als die Aftinitäts-Capture-Vorrichtung
    • 1. Einzelsträngige DNA immobilisiert auf 4% Agarosekügelchen stammen von GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, Ligandendichte 0,5 – 1,0 mg DNA/ml Gel). Ein Aliquot von 125I-Humanlaktoferrin (äquivalent zu 49 nmol) wird mit 100 μl irrmobilisierter einzelsträngiger DNA in 20 mM HEPES, pH 7,0, bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gemischt. Das Gel wird fünfmal mit 500 μl HEPES-Puffer gewaschen und dann in einem gleichen Volumen Wasser suspendiert. Die Menge an pro Kügelchen gebundenem Laktoferrin wird auf 62 fmol geschätzt, indem die Radioaktivität bestimmt und die Anzahl von Kügelchen pro Einheitsvolumen gezählt wird. Eine unterschiedliche Anzahl von Kügelchen (zwischen 1 und 12) werden auf Sondenspitzen mit einem Durchmesser von 0,5 mm abgeschieden, mit 0,2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 16 zeigt das Massenspektrum von Laktoferrin, das auf einem einzelnen Kügelchen einzelsträngiger DNA-Agarose affinitätsadsorbiert wurde. Dies ist ein repräsentierendes Spektrum aus insgesamt fünf (durchschnittlich 100 Laserschüsse pro Spektrum), die von einem einzelnen Kügelchen erhalten wurden. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Laserdesorption erfolgreich auf einem auf oberflächenimmobilisiertem Biopolymer, wie z. B. Nukleinsäure, affinitätsadsorbiertem Analyten durchgeführt wurde. Die Spezifität der Wechselwirkung zwischen Humanlaktoferrin und DNA wurde dokumentiert und effektiv ausgenutzt, indem winzige Mengen von Laktoferrin aus Harn von frühgeborenen Kindern gefangen wurden. In diesem Fall erhöht die Kombination der Effizienz des Übertragens der Laktoferrin-Affinitäts-Capture-Vorrichtung mit der Empfindlichkeit der Laserdesorptions-Massenspektrometrie die Nachweisempfindlichkeit erheblich.
    • 2. Ein Aliquot von 1 ml Harn von frühgeborenen Kindern enthaltend 30 pmol 59Fe-Humanlaktoferrin wird mit 20 μl einzelsträngiger DNA-Agarose in 0,1 M HEPES, pH 7,4, bei 23°C 15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird zweimal mit 500 μl HEPES-Puffer und zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen. Das Gel wird in einem gleichen Volumen von Wasser suspendiert und 1 μl der Suspension (enthaltend nicht mehr als 350 fmol adsorbiertes Laktoferrin, wie bestimmt durch Radioaktivität) wird mit 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) auf einer Sondenspitze gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 17 zeigt das Massenspektrum von Laktoferrin, das mit oberflächenimmobilisierter DNA als der Affinitäts-Capture-Vorrichtung aus Harn extrahiert wurde.
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit und Empfindlichkeit des Nachweisens winziger Mengen von Analyt mit hohem Molekulargewicht in biologischer Flüssigkeit mit der DNA-Capture-Vorrichtung.
  • IV. Oberflächenimmobilisierte, unterschiedliche Biomoleküle als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung
    • 1. Sojabohnentrypsininhibitor (Sigma) wird auf AffiGel10 (BioRad) entsprechend den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Ein Aliquot von 100 μl menschlichem Duodenalaspirat wird mit 50 μl oberflächenimmobilisiertem Sojabohnentnpsininhibitor bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C 15 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dann dreimal mit 500 μl Phosphatpuffer und zweimal mit 500 μl Wasser gewaschen. Aliquots von 1 μl Gelsuspension oder ursprünglichem Duodenalaspirat werden mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 50% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 18A zeigt das Verbundmassenspektrum des gesamten Duodenalaspirats (unteres Profil) und der auf dem oberflächenimmobilisierten Sojabohnentnpsininhibitor adsorbierten Proteine (oberes Profil). Die Hauptspitze der durch Affinität gefangenen Probe repräsentiert Trypsin. Ähnliche Ergebnisse werden mit nur 1 μl Duodenalflüssigkeit erhalten, die a) auf der Spitze eines Nylonsondenelements, über Glutaraldehyd an Sojabohnentnpsininhibitor gekoppelt, und b) auf der Spitze eines acrylischen Sondenelements beschichtet mit Polyacrylamid über entweder Glutaraldehyd oder Divinylsulfon gekoppelt an Sojabohnentnpsininhibitor, abgeschieden wird (18B). Diese Ergebnisse zeigen a) die Eindeutigkeit beim Nachweisen und Charakterisieren eines spezifischen Analyten in biologischen Flüssigkeiten und b) die einfache Möglichkeit der Probengewinnung in situ durch Einführen eines flexiblen (z. B. aus Nylon bestehenden) Sondenelements durch ein Endoskop direkt in den menschlichen Körper (z. B. in den Dünndarm) für diagnostische Zwecke.
    • 2. An Dynabeads (superparamagnetische Polystyrenkügelchen mit einheitlich 2,8 μm Durchmesser) immobilisiertes Streptavidin stammt von Dynal, AS, Oslo, Norwegen. Aliquots von 150 μl menschlichem Plasma oder Harn enthaltend 18 pmol biotinyliertes Insulin (Sigma) werden mit 20 μl einer Suspension von Streptavidin-Dynabeads bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C 10 Minuten lang gemischt. Die Kügelchen werden dann dreimal mit 500 μl Puffer enthaltend 3 M Harnstoff und einmal mit 500 μl Wasser gewaschen. Aliquots von 0,5 μl der Kügelchensuspension werden mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 30% Methanol, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 19A zeigt das Massenspektrum von aus Harn affinitätsadsorbiertem, biotinyliertem Insulin. Die verschiedenen Spitzen repräsentieren Insulinderivate mit einer bis drei Biotingruppen. 19B zeigt das Massenspektrum von aus Plasma affinitätsadsorbiertem, biotinyliertem Insulin. Dieses Beispiel veranschaulicht, dass Laserdesorption auf einem über die Biotin-Streptavidin-Bindung adsorbierten Analyten durchgeführt wurde. Angesichts der festen Bindung zwischen Biotin und Avidin (Ka = 1015 M–1) dient dieses System als eine ideale SEAC-Vorrichtung für Proteine und Nukleinsäuren auf einer Sondenoberfläche, auf der sequenzielle chemische und enzymatische Modifikationen in situ durchgeführt werden.
    • 3. DNA-Bindungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors (84 Reste) wird in Bakterien exprimiert. Der Plasmidexpressionsvektor pT7ERDBD (J. Schwabe, MRC Laboraton of Molecular Biology, Cambridge, England) wird in BL21(DE3)plyS-E.coli-Zellen (Novagene) transformiert. Expression der DNA-Bindungsdomäne wird induziert durch 1 mM Isopropylthiogalaktosid (GIBCO BRL) und die Bakterien werden nach 3-stündiger Induktion geerntet. Ganze, induzierte Bakterien werden dann direkt durch matrixunterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert, um zu verifizieren, dass die DNA-Bindungsdomäne das hauptsächliche synthetisierte Peptid ist. Das Peptid wird durch Umkehrphasen-HPLC aus dem Bakterienlysat gereinigt und auf AffiGel 10 (BioRad) immobilisiert. Eine DNA-Sequenz mit 30 by enthaltend das Östrogen-Response-Element wird von Genosys (Houston, TX) synthetisiert. Die Wechselwirkung von oberflächenaffinitätsadsorbierten Apoformen, Zn- und Cu-gebundenen Formen der DNA-Bindungsdomäne mit sequenzspezifischer Nukleinsäure (Östrogen-Response-Element) werden auf Glassondenelementen unter Verwendung von 3-Hydroxypicolinsäure als die Matrix untersucht. Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von funktionellen Proteinoberflächendomänen als Capture-Vorrichtung für SEAC. Es kann der Effekt der Metallbindung auf Struktur und Funktion solcher Proteinoberflächendomänen untersucht werden.
    • 4. Es werden unterschiedliche Aliquots von an Oberflächen (z. B. Con-A-Sepharose, Weizenkeimlektin-Sepharose, Pharmacia) immobilisierten Lektinen verwendet, um die Glykopeptide in tryptischen Verdaus von menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein zu binden. Nach dem Waschen mit Puffern und Wasser, um ungebundene Peptide zu entfernen, wird in situ ein sequenzieller Enzymverdau mit FUCase 1, MANase 1, HEXase 1, NANase III und PNGase (Glyko, Inc., Novato, CA) durchgeführt. Die Proben werden mit Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert, um die Kohlenhydratzusammensetzung der Glykopeptide in den beiden Proteinen zu untersuchen. Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung der SEAC-Vorrichtung, um ein Glykopeptid festzumachen, dessen Kohlenhydratbestandteil dann in situ sequenziert werden kann.
  • V. Oberflächenimmobilisierter Farbstoff als die Affinitäts-Capture-Vorrichtung (nicht Endung)
  • Cibacron-Blau-3GA-Agarose (Typ 3000, 4% Agarosekügelchen, Ligandendichte 2–5 μmol/ml Gel) stammen von Sigma. Ein Aliquot von 200 μl menschlichem Plasma werden mit 50 μl oberflächenimmobilisiertem Cibacron-Blau bei pH 7,0 (20 mM Natriumphosphat, 0,5 M Natriumchlorid) bei 23°C 10 Minuten lang gemischt. Das Gel wird dann dreimal mit 500 μl Puffer und zweimal mit 500 μl Wasser gemischt. Ein Aliquot von 1 μl Gelsuspension wird mit 2 μl Sinapinsäure (gelöst in 50% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) gemischt und durch Laserdesorptions-Massenspektrometrie analysiert. 20 zeigt die selektive Adsorption von menschlichem Serumalbumin (doppelt geladenes Ion [M + 2H]2+, 32.000 m/z, einfach geladenes Ion [M + H]+, 64.000 m/z, Dimerion, 2[M + H]+, 128.000 m/z) aus der Serumprobe mit oberflächenimmobilisiertem Cibacron Blau (unteres Profil). Andere getestete, immobilisierte Farbstoffe umfassten Reactive Red 120-Agarose, Reactive Blue-Agarose, Reactive Green-Agarose, Reactive Yellow-Agarose (alle von Sigma) und jeder davon wählt andere Proteine aus menschlichem Plasma aus.
  • BEISPIEL 4
  • Oberflächenverstärkte Reindesorption (Surface Enhanced Neat Desorption. SEND) Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren für die Desorption und Ionisation von Analyten, in dem der Analyt nicht in einer kristallinen Matrixstruktur dispergiert ist, sondern innerhalb, auf oder über einer angebrachten Oberfläche von energieabsorbierenden Molekülen in einer Position präsentiert ist, wo er verfügbar und zugänglich ist für sehr unterschiedliche chemische, physikalische und biologische Modifikations- oder Erkennungsreaktionen. Die Oberfläche ist mit der angemessenen Dichte von energieabsorbierenden Molekülen derivatisiert, die (kovalent oder nicht kovalent) in unterschiedlichen Geometrien gebunden sind, so dass Einzelschichten und Mehrtachschichten von angebrachten energieabsorbierenden Molekülen verwendet werden, um die Desorption von Analytmolekülen unterschiedlicher Masse zu ermöglichen.
  • Die unten gezeigten Beispiele (Gruppe I–IV) zeigen kombiniertes SEND und SEAC, bei denen die adsorbierten (gebundenen) energieabsorbierenden Moleküle auch als Affinitätsadsorptionsreagenzien wirken, um das Fangen (Capture) von Analytmolekülen zu verstärken. Dennoch verwendet die vorliegende Erfindung nicht die Affinitätsreagenzien der Gruppe 1, III und IV. Nur die Beispiele der Gruppe II sind demnach gemäß der Erfindung.
  • 1. Energieabsorbierende, durch kovalente Bindung an die Oberfläche gebundene Moleküle
    • 1. Cinnamamid (Aldrich) (keine Matrix bei einer Laserwellenlänge von 355 nm nach dem Stand der Technik) wird in Isopropanol: 0,5 M Natriumcarbonat (3 : 1) gelöst und mit Sepharose, aktiviert mit Divinylsulfon (Fluka, Ronkonkoma, NY), bei 23°C 2 Stunden lang gemischt. Die überschüssigen, energieabsorbierenden Moleküle werden mit Isopropanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur ist in 21 präsentiert. Aliquots von 2 μl der gebundenen oder freien Moleküle werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors in 0,1% Trifluoressigsäure darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass Peptidionensignale nur auf der Oberfläche mit den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen werden (22, oberes Profil), die freien Moleküle sind nicht effektiv (22, unteres Profil).
    • 2. Cinnamylbromid (Aldrich) (keine Matrix bei einer Lasenivellenlänge von 355 nm nach dem Stand der Technik) wird in Isopropanol: 0,5 M Natriumcarbonat (3 : 1) gelöst und mit Sepharose, aktiviert mit Divinylsulfon (Fluka), bei 23°C 15 Stunden lang gemischt. Die überschüssigen, energieabsorbierenden Moleküle werden mit Isopropanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur ist in 23 präsentiert. Aliquots von 2 μl der gebundenen oder freien Moleküle werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl von Peptidmischungen in 0,1% Trifluoressigsäure darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass Peptidionensignale nur auf der Oberfläche mit den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen werden (24, oberes Profil), die freien Moleküle sind nicht effektiv (24, unteres Profil).
    • 3. Dihydroxybenzoesäure wird mit Dicyclohexylcarbodiimid aktiviert und mit Fmoc-MAP 8-Verzweigtkettenharz (Applied Biosystems, Forster City, CA) bei 23°C 15 Stunden lang gemischt. Die überschüssigen energieabsorbierenden Moleküle werden mit Methanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur ist in 25 präsentiert. Aliquots von 1 μl der MAP 8-Verzweigtkettenoberfläche mit und ohne gebundene energieabsorbierende Moleküle werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl an Peptidmischungen in 0,1% Trifluoressigsäure darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass Peptidionensignale nur auf der Oberfläche mit den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen werden (26, unteres Profil), die Kontrolloberfläche ohne jegliche energieabsorbierende Moleküle ist nicht effektiv (26, oberes Profil).
    • 4. α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure wird in Methanol gelöst und mit AffiGel 10 oder AffiGel 15 (BioRad) bei unterschiedlichen pH-Werten bei 23°C 2–24 Stunden lang gemischt. Die überschüssigen energieabsorbierenden Moleküle werden mit Methanol fortgewaschen. Aliquots von 2 μl der gebundenen Moleküle werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl von Peptidmischungen oder Myoglobin oder Trypsin oder Carboanhydrase darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass das Myoglobinionensignal nur auf der Oberfläche mit den gebundenen energieabsorbierenden Molekülen nachgewiesen wird ( 27A) und sehr wenige Signale von kontaminierenden Ionen mit geringer Masse vorhanden sind (27B).
    • 5. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und in die gewünschte Form einer Sondenspitze gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet, bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Die Spitze wird in eine Lösung aus 9% Glutaraldehyd/Puffer (Vol./Vol.) getaucht und bei 37°C 2 Stunden lang unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wird der Puffer verwendet, um überschüssiges Glutaraldehyd abzuwaschen. Die aktivierte Spitze wird zu einer gesättigten, gepufferten Lösung mit energieabsorbierenden Molekülen gegeben und bei 37°C (zirka) 24 Stunden lang (zirka) unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Es werden organische Lösungsmittel verwendet, um die energieabsorbierenden Moleküle in Situationen, in denen es erforderlich ist, zu lösen. Die Spitze wird mit Puffer gespült und in eine Lösung aus 9% Ethanolamin/Wasser (Vol./Vol.) gegeben und bei 25°C 30 Minuten lang unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Dann wird die Spitze mit Puffer gespült und zu einer Lösung aus 5 mg/ml Natriumcyanoborhydrid/Puffer gegeben und bei 25°C 30 Minuten lang inkubiert. Schließlich wird die Spitze gründlich mit Puffer gespült und bis zur Verwendung aufbewahrt. Dieselbe Reaktion wird auf Nylonspitzen ausgeführt, welche durch Hydrolyse mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall und dann gründlichem Spülen mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch auf Acrylspitzen durchgeführt, die durch siebentägiges Tränken in 20%igem NaOH täglich unter Ultraschall über 30–60 Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 28 gezeigt.
    • 6. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und in die gewünschte Form einer Sondenspitze gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet, bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Als Spülpuffer wird ein 0,5 M Natriumcarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 8,8 hergestellt. Dann wird die Spitze wird in eine Lösung aus Divinylsulfon (Fluka) und Puffer im Verhältnis von 10 : 1 getaucht und 24 Stunden lang inkubiert. Die Spitze wird mit Puffer gespült und in eine gepufferte Lösung mit energieabsorbierenden Molekülen bei einem pH-Wert von 8 gegeben, um 2 Stunden lang zu inkubieren. Dieselbe Reaktion wird auf Nylonspitzen durchgeführt, welche durch Hydrolyse mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall und dann gründlichem Spülen mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch auf Acrylspitzen durchgeführt, die durch siebentägiges Tränken in 20%igem NaOH täglich unter Ultraschall über 30–60 Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 29 gezeigt.
    • 7. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und in die gewünschte Form einer Sondenspitze gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet, bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Eine Lösung mit 100 mg/ml energieabsorbierenden Molekülen in Dichlormethan/NMP (im Verhältnis von 2 : 1) und eine 1 M Lösung aus Dicyclohexylcarbodiimid/NMP werden im Verhältnis von 1 : 2 (EAM : DCC) gemischt. Die EAM/DCC-Lösung wird dann bei 25°C 1 Stunde lang unter Rühren inkubiert. Nach der Inkubation wird ein weißer Niederschlag beobachtet. Der weiße Niederschlag wird in einen gesinterten Glasfilter gefiltert. Der Durchfluss sind die DCC-aktivierten EAM. Dann wird die Spitze in die Lösung mit DCC-aktivierten EAM gegeben und bei 25°C 2 Stunden lang (zirka) inkubiert. Die Spitze wird schließlich mit unterschiedlichen Lösungsmitteln wie z. B. Aceton, Dichlormethan, Methanol, NMP und Hexan gespült. Dieselbe Reaktion wird auf Nylonspitzen durchgeführt, welche durch Hydrolyse mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall und dann gründlichem Spülen mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch auf Acrylspitzen durchgeführt, die durch siebentägiges Tränken in 20%igem NaOH täglich unter Ultraschall über 30–60 Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 30 gezeigt.
    • 8. Es wird eine 40%ige Polyacrylamidlösung hergestellt und auf einer Sondenspitze in die gewünschte Form gegossen. Das Gel wird solange luftgetrocknet, bis keine merkliche Verringerung der Größe mehr beobachtet wird. Eine Lösung mit 100 mg/ml N-α-Fmoc-N-ε-Fmoc-L-Lysin in Dichlormethan/NMP (im Verhältnis von 2 : 1) und eine 1 M Lösung aus DCC/NMP werden im Verhältnis von 1 : 2 (Lysin : DCC) gemischt. Die Lysin/DCC-Lösung wird dann bei 25°C 1 Stunde lang unter Rühren inkubiert. Nach der Inkubation wird ein weißer Niederschlag beobachtet und mit einem gesinterten Glasfilter gefiltert. Der Durchfluss ist das DCC-aktivierte Lysin. Die Spitze wird in die Lösung mit DCC-aktivierten Lysin gegeben und bei 25°C 2 Stunden lang (zirka) inkubiert. Die Spitze wird dann in 5 ml Piperidin gelegt und bei 25°C 45 Minuten lang unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Das DCC-aktivierte Lysin wird wiederholt in aufeinander folgenden Zyklen mit der Spitze umgesetzt, bis die gewünschte Lysinverzweigung erreicht ist. Eine Lösung mit 100 mg/ml EAM in Dichlormethan/NMP (im Verhältnis von 2 : 1) und eine 1 M Lösung aus DCC/NMP werden im Verhältnis von 1 : 2 (EAM : DCC) gemischt. Die EAM/DCC-Lösung wird bei 25°C 1 Stunde lang unter Rühren inkubiert. Nach der Inkubation wird ein weißer Niederschlag beobachtet und mit einem gesinterten Glasfilter gefiltert. Der Durchfluss sind die DCC-aktivierten EAM. Die EAM enthalten eine funktionelle Säuregruppe, die mit dem DCC reagiert. Die Spitze wird in die Lösung mit DCC-aktivierten EAM gegeben und bei 25°C 2 Stunden lang (zirka) inkubiert. Die Spitze wird schließlich vor dem Gebrauch mit einem Überschuss an Dichlormethan, NMP und Methanol gespült. Dieselbe Reaktion wird auf Nylonspitzen durchgeführt, welche durch Hydrolyse mit 6 N HCl unter zweiminütigem Ultraschall und dann gründlichem Spülen mit Wasser und Puffer hergestellt sind. Dieselbe Reaktion wird auch auf Acrylspitzen durchgeführt, die durch siebentägiges Tränken in 20%igem NaOH täglich unter Ultraschall über 30–60 Minuten aktiviert und daraufhin gewaschen wurden. Die vorgeschlagene allgemeine Molekularstruktur der Oberfläche ist in 31 gezeigt.
  • II. Energieabsorbierende, durch koordinative, kovalente Bindung an die Oberfläche gebundene Moleküle
    • 1. Thiosalicylsäure (Aldrich) wird entweder in Wasser oder in 50% Methanol in Wasser oder in Methanol gelöst. Diese Lösungen werden entweder als solche verwendet, oder der pH-Wert der Lösungen wird mit 0,5 M Natriumbicarbonat oder Ammoniumhydroxid oder Triethylamin auf 6,5 eingestellt. Cu(II)-Ionen werden entweder mit Iminodiacetat (IDA) (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia) oder Tris(carboxymethyl)-Ethylendiamin (TED) (synthetisiert wie beschrieben von Yip und Hutchens, 1991), auf einer Geloberfläche immobilisiert, cheliert. Die Lösungen der energieabsorbierenden Moleküle werden entweder mit Wasser oder mit 50% Methanol in Wasser oder mit Methanol fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur der Oberfläche ist in 32 gezeigt. Aliquots von 1 μl der gebundenen energieabsorbierenden Moleküle werden auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird darauf 1 μl von Peptidmischungen oder Dimerisierungsdomäne des Östrogenrezeptors oder Myoglobin in 0,1% Trifluoressigsäure gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 33 zeigt ein repräsentatives Massenspektrum der von dieser Oberfläche desorbierten Dimerisierungsdomäne des Östrogenrezeptors.
    • 2. Auf Proben, die auf einer EAM-Oberfläche abgeschieden sind, können sofort sequenzielle in situ-Reaktionen durchgeführt werden. Thiosalicylsäurekoordinat, kovalent an IDA-Cu(II) auf einer Sondenoberfläche gebunden, wird wie in Abschnitt 2.1. beschrieben hergestellt. Ein Aliquot von 1 μl (GHHPH)5G-Peptid wird auf der Oberfläche abgeschieden und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 50 Laserschüsse pro Spektrum) wird die Probe entfernt. Ein Aliquot von 2 μl Carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim) wird direkt auf die Oberfläche gegeben und bei 37°C in einer feuchten Kammer 5 Minuten bis 1 Stunde lang inkubiert. Der Enzymverdau in situ wird durch 1 μl 0,1 Trifluoressigsäure beendet und die Probe nochmals durch Massenspektrometrie analysiert.
    • 3. Eine weitere Veranschaulichung einer sequenziellen in situ-Reaktion ist Trypsinverdau gefolgt von C-terminaler Sequenzierung. Thiosalicylsäurekoordinat, kovalent an IDA-Cu(II) auf einer Sondenoberfläche gebunden, wird wie in Abschnitt 2.1. beschrieben hergestellt. Ein Aliquot von 1 μl Östrogenrezeptordimerisierungsdomäne (6168,4 Da) wird auf der Oberfläche abgeschieden und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 20 Laserschüsse pro Spektrum) wird die Probe entfernt. Ein Aliquot von 2 μl Trypsin (Sigma) in 0,1 M Natriumbicarbonat wird auf die Oberfläche gegeben und bei 37°C 15 Minuten lang inkubiert. Der Enzymverdau in situ wird durch 1 μl 0,1% Trifluoressigsäure beendet und die Probe nochmals durch Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 20 Laserschüsse pro Spektrum) wird die Probe entfernt. Ein Aliquot von 2 μl Carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim) wird direkt auf die Oberfläche gegeben und bei 37°C in einer feuchten Kammer 1 Stunde lang inkubiert. Der Enzymverdau in situ wird durch 1 μl 0,1% Trifluoressigsäure beendet und die Probe nochmals durch Massenspektrometrie analysiert.
  • III. Energieabsorbierende, durch ionische Bindung an die Oberfläche gebundene Moleküle
  • Sinapinsäure oder α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure werden in Wasser suspendiert und der pH wird mit verdünntem Natriumhydroxid auf 6,6 eingestellt. Tentacle DEAE Fractogel (EM Separations, Gibbstown, NJ) wird mit 20 mM HEPES, pH 6,0, gewaschen und sauggetrocknet. Die Lösung aus energieabsorbierenden Molekülen wird bei 23°C 15 Stunden lang mit dem DEAE-Gel gemischt. Das Gel wird mit Wasser gewaschen, bis alle überschüssigen energieansorbierenden Moleküle entfernt waren. Die vorgeschlagene Molekularstruktur der Oberfläche ist gezeigt in 34. Ein Aliquot von 0,5 μl der gebundenen energieabsorbierenden Moleküle wird auf den Sondenspitzen abgeschieden, es wird 1 μl Östrogenrezeptordimerisierungsdomäne oder Myoglobin in 0,1% Trifluoressigsäure darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 35A und B zeigen die Massenspektren.
  • IV. Energieabsorbierende, über hydrophobe BindungeniVan-der-Waals-Bindungen an die Oberflächen gebundene Moleküle
    • 1. α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure wird in 50% Methanol in Wasser und Dimethylsulfoxid gewaschen. Dies wird mit aminomethyliertem Polystyrol bei 23°C 15 Stunden lang gewaschen. Die überschüssigen energieabsorbierenden Moleküle werden mit 50% Methanol in Wasser fortgewaschen. Die vorgeschlagene Molekularstruktur ist in 36 gezeigt. Ein Aliquot von 1 μl der gebundenen energieabsorbierenden Moleküle wird auf der Sondenspitze abgeschieden, es wird 1 μl Peptid darauf gegeben und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert.
  • BEISPIEL 5
  • Für die photolabile Anheftung und Freisetzung verstärkte Oberflächen (Surfaces enhanced for photolabile attachment and release, SEPAR)
  • Die lineare Anordnung einzelner Bausteine (Monomere), die die Struktur und Kennzeichen von Biopolymeren wie z. B. DNA, RNA und Protein definieren, sind häufig unbekannt, aber (als Ganzes oder in Teilen) mit einem Verfahren entschlüsselt oder sequenziert, das differenzielle Massebestimmungen von partiell verdauten (d. h. chemisch oder enzymatisch) Biopolymeranalyten durch Laserdesorptions/lonisations-Flugzeit-(time-of-flight, TOF) Massenspektrometrie (MS) analysiert.
  • Bekannte Biopolymere werden zunächst durch eine oder mehrere (viele), kovalente, photolytische (d. h. lichtempfindliche) Bindungen an die SELDI-Sondenelementoberfläche gekoppelt. Als Nächstes wird eine unterschiedliche Anzahl an einzelnen Einheiten (Monomere) in einer einzigen Reaktion durch enzymatische oder chemische Verfahren an den Enden des Biopolymers abgespalten (d. h. entfernt). Die auf der Sondenelementoberfläche verbleibenden Analyte bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher (Populationen) massedefinierter Biopolymere mit einer unterschiedlichen Anzahl fehlender Endmonomere. Ein kleiner aber ausreichender Anteil der modifizierten Biopolymere ist von der Sondenelementoberfläche durch Laserlicht abgekoppelt (Iosgelöst), d. h. durch Spaltung der photolytischen Bindungen mit UV-Licht zwischen 260 nm und 365 nm. Die abgekoppelten Biopolymere werden durch Flugzeit-Massenspektrometrie desorbiert/ionisiert.
  • I. Koppeln von Biopolymeren an die SELDI-Oberfläche
  • Es sind drei Bestandteile beteiligt: 1) eine Oberfläche, die aktiviert ist, um entweder mit Amin- oder Carboxylgruppen oder beiden zu reagieren; 2) photolytische Verbindung, typischerweise eine Azo-Verbindung der allgemeinen Formel R1-N=N-R2, z. B. 5-(4-Aminophenylazo)salicylsäure (Aldrich), Azodicarbonamid (Aldrich), oder es werden andere Mechanismen, die solche photolytischen Bindungen erzeugen, wie z. B. die aktiven, wasserstoffreaktiven chemischen Reaktionen mit Diazoniumverbindungen, verwendet; und 3) Biopolymer, z. B. Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate.
  • Eine photolytische Verbindung muss zunächst an die aktivierte Oberfläche angeheftet werden, z. B. Azodicarbonamid an aminreaktive Oberflächen, Aminophenylsalicylsäure an entweder amin- oder carboxylreaktive Oberflächen. Dann werden entweder die photolytische Verbindung oder das Biopolymer durch eine von vielen üblichen chemischen Reaktionen aktiviert, z. B. aminreaktive chemische Reaktionen-Cyanogenbromid, N-Hydroxysuccinimidester, FMP-Aktivierung, EDC-vermittelt, Divinylsulfon; hydroxylreaktive chemische Reaktionen – Epoxidaktivierung, Divinylsulfon; sulfhydrylreaktive chemische Reaktionen – Iodacetylaktivierung, Maleimid, Divinylsulfon, Epoxidaktivierung; carbonylreaktive chemische Reaktionen – Hydrazid, reduktive Aminierung; mit aktivem Wasserstoff reaktive chemische Reaktionen – Diazonium, das gleichzeitig auch eine photolytische Azobindung erzeugt. Schließlich wird das Biopolymer durch eine oder mehrere (viele) Bindungen an die photolytische Verbindung geheftet. Die überschüssigen Chemikalien werden mit wässrigen und organischen Lösungsmitteln, Lösungsmitteln mit hoher Ionenstärke und Lösungsmitteln mit niedrigem pH-Wert in zahlreichen Zyklen fortgewaschen.
  • II. Massenspektrometrieanalyse zum Verifizieren der strukturellen Unversehrtheit
  • UV-Laser von 260 bis 365 nm spalten die photolytische Bindung. Die abgekoppelten Biopolymere werden durch MALDI TOF desorbiert/ionisiert (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können.)
  • III. in situ-Sequenzierung eines Biopolymers
  • Dies wird erreicht durch alle wohlbekannten, enzymatischen oder chemischen sequenziellen Degradationsverfahren, z. B. N-terminale Sequenzierung von Proteinen mit Aminopeptidase, C-terminale Sequenzierung von Proteinen mit Carboxypeptidase, N-terminale Sequenzierung von Proteinen im Edman-Abbau; Sequenzierung von Nukleinsäuren mit Exonuklease, Sequenzierung von Nukleinsäuren mit dem Sangerschen Verfahren; Sequenzierung von Kohlenhydraten mit spezifischen Enzymen wie z. B. Neuraminidase, Mannase, Fucase, Galaktosidase, Glukosidase, O- oder N-Glykanase. Nach Waschen, um überschüssige Reagenzien und Reaktionsprodukte zu entfernen, werden die Analyten, die über viele photolytische Bindungen auf der Oberfläche festgebunden bleiben, bestehend aus einer Population von massedefinierten Biopolymeren mit einer unterschiedlichen Anzahl an fehlenden Endmonomeren, mit MALDI TOF analysiert (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können.)
  • Es folgt mehrfaches internes Sequenzieren mit enzymatischen oder chemischen Verfahren, z. B. Spaltung von Proteinen mit Endoprotease oder Cyanogenbromid gefolgt von sequenziellem Abbau der N- und/oder Cterminalen Spaltung von Nukleinsäuren mit Endonuklease gefolgt von sequenziellem Abbau mit Exonuklease oder einem chemischen Verfahren; Spaltung von Polysaccharidketten mit Endoglykosidase N oder Endoglykosidase F gefolgt von sequenzieller Spaltung mit spezifischen Enzymen. Nach Waschen, um überschüssige Reagenzien und Reaktionsprodukte zu entfernen, werden die Analyten, die auf der Oberfläche bleiben, bestehend aus zahlreichen Populationen von massedefinierten Biopolymeren mit einer unterschiedlichen Anzahl an fehlenden Endmonomeren, mit MALDI TOF analysiert (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können).
  • IV. Spezifische Beispiele der Sequenzierunq
  • Eine Demonstration dieses Prinzips wird durch die eigentliche Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Peptids mit 26 Resten gegeben:
    GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHG
  • Dieses Peptid (GHHPH)5 definiert die metallbindende Domäne in der intakten Sequenz des 80-kDa-Proteins, das als histidinreiches Glykoprotein (HGR) bekannt ist.
  • Glaskügelchen mit Arylamingruppen an der Oberfläche als Kopplungsliganden (Sigma) werden mit kaltem 0,3 M HCl gewaschen und darin suspendiert. Zu den Kügelchen wird eine wässrige Lösung mit 50 mg/ml NaNO2 im Verhältnis von 1 : 5 (Vol./Vol.)(NaNO2 : HCl) gegeben und bei 4°C 15 Minuten lang unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation werden die Kügelchen mit kaltem 0,3 M HCl und 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen. Das zu sequenzfierende Peptid wird zu den Kügelchen in Natriumphosphatpuffer bei pH 8,0 gegeben und 24 Stunden lang bei 4°C unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen mit gekoppelten Peptiden werden mit Natriumphosphatpuffer, Natriumphosphatpuffer mit einer hohen Salzkonzentration (z. B. 1,0 M), verdünnter Säure und organischem Lösungsmittel (z. B. Methanol) gewaschen, bis im Überstand durch MALDI TOF-Massenspektrometrie (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können) oder durch Absorption bei 220 nm kein Peptidsignal nachgewiesen wird. Ein Aliquot von 1 μl der Kügelchen wird dann auf der Sondenspitze abgeschieden, es wird 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 50 Methanol/0,1% Trifluoressigsäure) mit den Kügelchen gemischt und die Probe wurde durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Spektren (durchschnittlich 50 Laserschüsse pro Spektrum) werden die auf der Oberfläche verbleibenden Peptide mit Methanol von Sinapinsäure frei gewaschen und dann mit Carboxypeptidase Y (Boehringer Mannheim) bei 23°C in einer feuchten Kammer verdaut. Die verdauten Peptide werden dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 8,0, gewaschen. Ein Aliquot von 1 μl Sinapinsäure wird zu der Oberfläche gegeben und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Das Ergebnis der C-terminalen Sequenzanalyse der GHHPHG-Sequenz ist in 37 gezeigt. Es wird eine frei werdende Sequenz des Peptids beobachtet. Die Sequenz wird durch die Unterschiede in der Masse zwischen zwei Spitzen abgeleitet.
  • Das zweite Beispiel ist das simultane Sequenzieren von mehreren Peptiden, die durch photolytische Bindungen kovalent an eine Oberfläche gebunden sind. Dimerisierungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptors (6168,4 Da) wird über mehrere photolytische Bindungen an der Oberfläche festgemacht. Das Peptid hat drei Methioninreste in seiner Sequenz, die spezifisch durch Cyanogenbromid gespalten werden, um Peptide der Masse 2170,58 Da (D1-M18), 3118,77 Da (A19-M45), 535,62 Da (S46-M50) und 397,62 Da (E51-L53) zu erzeugen. Alle diese Peptide sind über die photolytischen Bindungen an die Oberfläche gebunden. Jedes von ihnen wird dann in situ mit Carboxypeptidase Y verdaut, um eine frei werdende Sequenz zu erzeugen, die vollständig von der anderen gelöst ist.
  • Ein anderer Ansatz zum Bestimmen der Proteinstruktur ist das gleichzeitige N-terminale Sequenzieren von vielen Peptiden, die durch tryptischen Verdau eines Proteins erzeugt werden, welches über viele photolytische Bindungen an eine Oberfläche gekoppelt ist. Insulin-B-Kette ist über viele photolytische Bindungen an der Oberfläche festgemacht. Das Peptid hat zwei Lysin-/Arginin-Reste in seiner Sequenz, die von Trypsin spezifisch gespalten werden, um Peptide der Masse 2585,9 Da (F1-R22) und 859,0 Da (G23-K29) zu erzeugen, von denen beide über photolytische Bindungen an die Oberfläche gebunden sind. Jedes von ihnen wird dann in situ entweder einem Aminopeptidaseverdau oder vielen Zyklen eines Edman-Abbaus unterzogen, um eine frei werdende Sequenz zu erzeugen, die vollständig von der anderen gelöst ist.
  • Koppeln und Sequenzieren von Nukleinsäuren wird mit einem ähnlichen Vorgang durchgeführt. Glaskügelchen mit Arylamingruppen an der Oberfläche als Kopplungsliganden (Sigma) werden mit kaltem 0,3 M HCl gewaschen und darin suspendiert. Zu den Kügelchen wird eine wässrige Lösung mit 50 mg/ml NaNO2 im Verhältnis von 1 : 5 (Vol./Vol.)(NaNO2 : HCl) gegeben und bei 4°C 15 Minuten lang unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation werden die Kügelchen mit kaltem 0,3 M HCl und 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen. Die zu sequenzfierende DNA (z. B. Östrogenrezeptor-responsives Element, ein Oligonukleotid mit 30 Basenpaaren) wird zu den Kügelchen in Natriumphosphatpufter bei pH 8,0 gegeben und 24 Stunden lang bei 4°C unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen mit gekoppelter DNA werden mit Natriumphosphatpuffer, Natriumphosphatpuffer mit hoher Salzkonzentration (z. B. 1,0 M), verdünnter Säure und organischem Lösungsmittel (z. B. Methanol) gewaschen, bis im Überstand durch MALDI TOF-Massenspektrometrie (ein Fachmann weiß, dass auch SEND, SEAC und SEPAR verwendet werden können) oder durch Absorption bei 260 nm kein DNA-Signal nachgewiesen wird. Ein Aliquot von 1 μl der Kügelchen wird dann auf der Sondenspitze abgeschieden, es wird 1 μl 3-Hydroxypicolinsäure (gelöst in 50% Methanol/0,1% Trifluoressigsäure) mit den Kügelchen gemischt und die Probe wird durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Massespektren (durchschnittlich 50 Laserschüsse pro Spektrum) wird die auf der Oberfläche verbleibende DNA mit Methanol von 3-Hydroxypicolinsäure frei gewaschen und dann mit Exonuklease (Boehringer Mannheim) bei 23°C in einer feuchten Kammer verdaut. Die verdaute DNA wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 8,0, gewaschen, um überschüssiges Reagens und Reaktionsprodukte zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl 3-Hydroxypicolinsäure wird zu der Oberfläche gegeben und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Es wird eine frei werdende Sequenz der DNA erzeugt. Die Sequenz wird durch die Unterschiede in der Masse zwischen zwei Spitzen abgeleitet.
  • Kohlenhydratketten werden mit Periodat oxidiert und aktiviert, um spezifisch an eine photolytische Verbindung auf einer Oberfläche gekoppelt zu werden. Es wird eine Sequenzierung des festgemachten Kohlenhydrats mit spezifischen Enzymen wie z. B. Neuraminidase, Fukase, Galaktosidase, Glukosidase, O- oder N-Glykanase durchgeführt und durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. 5-(4-Aminophenylazo)salicylsäure (Aldrich) wird an eine carboxylreaktive Oberfläche wie z. B. Arylamin auf Glaskügelchen mit kontrollierten Proben gekoppelt. Die Kohlenhydrathälften von menschlichem und bovinem histidinreichem Glykoprotein werden durch eine geringe Konzentration (0,2 M) von Natriummetaperiodat in Wasser bei 23°C 90 Minuten lang oxidiert. Die überschüssigen Reagenzien werden mit Wasser fortgewaschen. Die Proteine werden zu der auf Glaskügelchen mit kontrollierten Proben gekoppelten 5-(4-Aminophenylazo)salicylsäure in Phosphatpuffer, pH 8,0, gegeben. Dann wird Natriumcyanoborhydrid (0,6 mg/100 μl) zugegeben und in einem Abzug bei 23°C 18 Stunden lang gerührt. Es wird ausführlich mit Wasser, 1 M NaCl und dann wieder Wasser gewaschen, um überschüssige Reagenzien und nicht umgesetzte Proteine zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl der Kügelchen wird dann auf der Sondenspitze abgeschieden, 1 μl Sinapinsäure (gelöst in 50% Methanol/0,1% Trifluoressigsäure) mit den Kügelchen gemischt und die Probe durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Die verbleibenden, auf der Oberfläche gebundenen Proteine werden mit Methanol von Sinapinsäure frei gewaschen und mit 2 μl Trypsin in Phosphatpuffer pH 8,0 bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Oberfläche mit gebundenen Glykopeptiden wird gründlich mit phosphatgepufferter Salzlösung und Wasser gewaschen, um überschüssige Reagenzien und nicht umgesetzte Proteine zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl Sinapinsäure wird mit den Kügelchen gemischt und die Probe wird durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Nach dem Erhalten mehrerer Massespektren (durchschnittlich 50 Laserschüsse pro Spektrum) werden die auf der Sondenoberfläche verbleibenden Glykopeptide mit Methanol von Sinapinsäure frei gewaschen und nacheinander oder in Kombination mit N-Acetylneuraminidase (NANase III, Glyko, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0, 37°C 1 Stunde), Mannosidase (MANase 1, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,0, 37°C 18 Stunden), Fucosidase (FUCase, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 5,0, 37°C 18 Stunden), N-Acetylglukosaminidase (HEXase 1, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 5,0, 37°C 4 Stunden), O-Glykosidase (Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 5,0, 37°C 18 Stunden) oder N-Glykanase (PNGase F, Glyko, 50 mM Natriumphosphat, pH 8,6, 37°C 18 Stunden) verdaut. Die fragmentierten Glykopeptide auf der Oberfläche werden schließlich mit phosphatgepufferter Salzlösung und Wasser gewaschen, um die Reagenzien und Reaktionsprodukte zu entfernen. Ein Aliquot von 1 μl Sinapinsäure wird auf die Oberfläche gegeben und nochmals durch Laserdesorptions-Flugzeit-Massenspektrometrie analysiert. Es werden frei werdende Sequenzen der Glykopeptide beobachtet. Die Sequenzen werden durch die Unterschiede in der Masse zwischen zwei Spitzen abgeleitet.
  • Alle, in dieser Beschreibung enwähnten Patente und Veröffentlichungen sind für den Stand der Fachleute Indikativ, welche die Erfindung betrifft.
  • Ein Fachmann wird sofort anerkennen, dass die vorliegende Erfindung gut angepasst ist, um die Aufgaben durchzuführen und die erwähnten sowie die damit verbundenen Ergebnisse und Vorteile zu erhalten. Die hierin beschriebenen Oligonukleotide, Verbindungen, Verfahren, Vorgehensweisen und Techniken spiegeln derzeit die bevorzugten Ausführungsformen wieder, sollen beispielhaft sein und sollen nicht den Umfang einschränken. Fachleuten werden Veränderungen darin und andere Verwendungen offenkundig sein, die im Schutzumfang wie in den beigefügten Ansprüchen definiert enthalten sind.

Claims (29)

  1. Sonde, die in einen Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit einem Affinitätsreagens derivatisiert ist, welches den Analyt binden kann und aus Metallionen, Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben gewählt wird, und dass ein desorptions-/ionisationsunterstützendes Matrixmaterial an der Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens vorgesehen wird.
  2. Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die probenpräsentierende Oberfläche aus einem mit synthetischen Polymer, Glas, Keramik, synthetischen Polymeren und Biopolymeren beschichteten Metall gewählt wird.
  3. Sonde nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die probenpräsentierende Oberfläche ein Metall mit einer Beschichtung aus quervernetztem Dextran oder Agarose, Nylon, Polyethylen oder Polystyren ist.
  4. Sonde nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt Biomoleküle umfasst und das Affinitätsreagens für das selektive Isolieren der Biomoleküle von einer undifferenzierten biologischen Probe ausgelegt ist.
  5. Sonde nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsreagens ein Antikörper ist.
  6. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsreagens ein Lektin ist.
  7. Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsreagens ein Cu(II)-Ion oder ein Fe(III)-Ion ist.
  8. Sonde nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in einer vorbestimmten Anordnung angeordneten Affinitätsreagenzien an der probetragende Oberfläche für die selektive Adsorption unterschiedlicher Analyte vorgesehen sind.
  9. Sonde nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial einen pH-Wert von über 6,0 aufweist.
  10. Sonde nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial Nicotin- oder Sinapinsäure ist.
  11. Sonde nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt an das Affinitätsreagens gebunden wird.
  12. Massenspektrometer für das Nachweisen eines Analyts, welcher umfasst: (a) eine Sonde nach Anspruch 11; (b) eine Energiequelle für das Lenken von Energie auf die probenpräsentierende Oberfläche der Sonde für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts und (c) Mittel für das Nachweisen des desorbierten Analyts.
  13. Massenspektrometer nach Anspruch 12, welcher weiterhin umfasst: – eine Spektrometerröhre; – ein Vakuummittel für das Anlegen eines Vakuums im Inneren der Röhre; – ein elektrisches Potenzialmittel in der Röhre für das Anlegen eines beschleunigenden Potenzials an den desorbierten Analytmolekülen; und – eine durch das Affinitätsreagens gebundene Analytprobe an der probenpräsentierenden Oberfläche der Sonde, wodurch zumindest ein Teil der in der Massenspektrometrieanalyse nicht aufgezehrten Analytmoleküle für spätere chemische, biologische oder physikalische Analyseverfahren greifbar sind; dadurch gekennzeichnet, dass die Energiequelle Laserstrahlenmittel für das Erzeugen eines auf die Analytprobe gerichteten Laserstrahls für das Zukommenlassen hinreichender Energie zum Desorbieren und Ionisieren eines Teils der Analytmoleküle von der Analytprobe umfasst und dass das Nachweismittel zu dem Spektrometer gehörige Mittel für das Nachweisen der Auswirkung der beschleunigten ionisierten Analytmoleküle hierauf umfasst.
  14. Verfahren für das Nachweisen eines Analyts, welches umfasst: (a) Vorsehen eines Massenspektrometers nach Anspruch 12; (b) Desorbieren zumindest eines Teils des Analyts von der probenpräsentierenden Oberfläche der Sonde des Massenspektrometers, indem der Analyt der Energie der Energiequelle ausgesetzt wird, und (c) Nachweisen des desorbierten Analyts mit dem Nachweismittel.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, welches weiterhin nach dem Nachweisschritt (c) den Schritt des Ausführens eines chemischen oder biologischen Verfahrens an dem nicht desorbierten Teil des Analyts zum Ändern der Zusammensetzung des nicht desorbierten Teils des Analyts und das Wiederholen der Schritte (b) und (c) bezüglich des geänderten Analyts umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 14, welches umfasst: (i) Vorsehen einer Sonde, die in einen Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist; (ii) Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit einem Affinitätsreagens, welches den Analyt binden kann und aus Metallionen, Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben gewählt wird; (iii) Aussetzen der derivatvisierten probenpräsentierende Oberfläche gegenüber einer Quelle des Analyts, um den Analyt daran zu binden; (iv) Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an der probenpräsentierenden Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens; (v) Geben der derivatisierten probetragenden Oberfläche mit den daran gebundenen Analytmolekülen in ein Ende eines Flugzeit-Massenspektrometers und Anlegen eines Vakuums und eines elektrischen Felds, um ein beschleunigendes Potenzial in dem Spektrometer zu bilden; (vi) Beschießen mindestens eines Teils der an der derivatisierten probenpräsentierenden Oberfläche in dem Spektrometer gebundenen Analytmoleküle mit einem oder mehreren Laserimpulsen, um Ione der Analytmoleküle von der Sonde zu desorbieren; (vii) Nachweisen der Masse der Ione durch ihre Flugzeit in dem Massenspektrometer und (viii) Anzeigen der nachgewiesenen Masse.
  17. Verfahren für das Herstellen einer Sonde nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: (i) Vorsehen einer Sonde, die in einen Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist; (ii) Derivatisieren der probenpräsentierenden Oberfläche mit einem Affinitätsreagens, welches den Analyt binden kann und aus Metallionen, Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben gewählt wird; und (iii) Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an der probenpräsentierenden Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens.
  18. Verfahren für Einfangen eines Analyts an einer Sonde für einen Massenspektrometer, wobei das Verfahren umfasst: – Vorsehen einer Sonde, die in einen Massenspektrometer entnehmbar eingebracht werden kann, wobei die Sonde eine probenpräsentierende Oberfläche für das Präsentieren eines Analyts gegenüber einer Energiequelle, die eine für das Desorbieren/Ionisieren des Analyts von der Sonde für den Analytnachweis geeignete Energie abgibt, aufweist; dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit einem Affinitätsreagens derivatisiert wird, welches den Analyt binden kann und welches aus Metallionen, Nukleinsäuren, Peptiden, Kohlenhydraten, Proteinen und Kombinationen derselben gewählt wird; – Aussetzen der probenpräsentierenden Oberfläche der Sonde gegenüber den Analyt enthaltenden Probe; und – Abscheiden eines desorptions-/ionisationsunterstützenden Matrixmaterials an der probenpräsentierenden Oberfläche in Assoziation mit dem Affinitätsreagens;
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die probenpräsentierende Oberfläche aus einem mit synthetischen Polymer, Glas, Keramik, synthetischen Polymeren und Biopolymeren beschichteten Metall gewählt wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die probenpräsentierende Oberfläche ein Metall mit einer Beschichtung aus quervernetztem Dextran oder Agarose, Nylon, Polyethylen oder Polystyren ist.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt Biomoleküle umfasst und das Affinitätsreagens für das selektive Isolieren der Biomoleküle von einer undifferenzierten biologischen Probe ausgelegt ist.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsreagens ein Antikörper ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsreagens ein Lektin ist.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Affinitätsreagens ein Cu(II)-Ion oder ein Fe(III)-Ion ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die in einer vorbestimmten Anordnung angeordneten Affinitätsreagenzien an der probenpräsentierende Oberfläche für die selektive Adsorption unterschiedlicher Analyte vorgesehen sind.
  26. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das desorptions-/ionisationsunterstützende Matrixmaterial einen pH-Wert von über 6,0 aufweist.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Matrixmaterial Nicotin- oder Sinapinsäure ist.
  28. Verwendung einer Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Massenspektrometrie.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde in einem Laserdesorptions-/ionisations-Zeitflug-Massenspektrometer verwendet wird.
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