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Die vorliegende Erfindung betrifft
Vakzine zur Vorbeugung oder Linderung von Krebs bei Menschen oder
Tieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung immunisierende
Zusammensetzungen, die Wachstumsfaktoren, für Wachstumsfaktoren spezifische
Antikörper
und Verfahren zur Verwendung derselben umfassen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Während
viele Krebsarten durch chemotherapeutische Mittel behandelbar sind,
ist eine beträchtliche
Anzahl von Krebsarten intrinsisch arzneimittelresistent und andere
erwerben während
oder nach einer Chemotherapie Resistenz. Krebs ist häufig gegenüber mehr
als einer Art von Arzneimittel resistent. Dieses Phänomen wird
Multidrug Resistance oder MDR genannt. Infolgedessen besteht ein
großer Bedarf
an Zusammensetzungen und Verfahren, die zusätzlich zu oder als Alternative
zu einer Chemotherapie zur Behandlung von Krebs verwendet werden können.
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Ein klinisches Hauptproblem von Krebs
ist Metastasierung. Zum Zeitpunkt, bei dem der Primärtumor identifiziert
und lokalisiert wird, sind Saatzellen bereits zu anderen Organen
im Körper
entwichen und gewandert oder metastasiert, wo sie Sekundärtumore
begründen.
Operative Verfahren sind selten ausreichend, um Krebs zu heilen,
da auch nach der Entfernung des Primärtumors viele Sekundärtumore überleben
und proliferieren. Infolgedessen besteht ein sofortiger und nachdrücklicher
Bedarf an Verfahren zur Auslöschung
von Sekundärtumoren,
die bereits bestehen.
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Krebszellen, die dem Primärtumor entweichen,
werden üblicherweise
im venösen
und lymphatischen Kreislauf befördert
bis sie sich in einem stromabwärtigen
Kapillarbett oder Lymphknoten festsetzen. Jedoch erfolgt bei nur
1 von 10000 Krebszellen, die dem Primärtumor entweichen, ein Überleben unter
Begründen
eines Sekundärtumors.
Erfolgreiche Krebszellen sind diejenigen, die eine zum Überleben
und Wachstum günstige
Umgebung finden. Die günstige
Umgebung beinhaltet Hormone und wachstumsfördernde Faktoren. Stimulierende
Faktoren beinhalten lokale Wachstumsfaktoren, vom Wirt produzierte
Hormone und autostimulierende Wachstumsfaktoren, die von den Tumorzellen
selbst produziert werden. Infolgedessen besteht ein sofortiger und nachdrücklicher
Bedarf an Verfahren, mit denen eine Verhinderung oder Inhibition
der Krebsmetastasierung und der Bildung von Sekundärtumoren
bewirkt werden kann.
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Ferner bestehen viele andere Hyperproliferations-Krankheiten.
Hyperproliferations-Krankheiten werden durch nicht-krebsartige (d.
h. nicht-neoplastische) Zellen, die als Antwort auf einen besonderen Wachstumsfaktor überproduziert
werden, verursacht. Beispiele für
solche Hyperproliferations-Krankheiten beinhalten Diabetes-Retinopathie, Psoriasis,
Endometriose, Leiden unter Degeneration der Macula und gutartige
Wachstumsstörungen,
wie Prostatavergrößerung und
Lipome.
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Es ist bekannt, dass durch Wachstumsfaktoren,
die entweder die Krebszelle selbst oder das normale Gewebe um die
Krebszellen beeinflussen und das Überleben der Krebszelle erleichtern
(d. h. Angiogenesefaktoren) viele neue Krebserkrankungen verursacht
und bestehende Krebserkrankungen und Hyperproliferations-Krankheiten
stimuliert werden. Es besteht eine direkte Korrelation zwischen
dem Spiegel von bestimmten Wachstumsfaktoren im Kreislauf und Krebsproliferation.
Ein potentielles Verfahren zur Behandlung wäre die Regelung des Spiegels
von Wachstumsfaktoren im Kreislauf in einem Patienten, um eine Auslösung oder
ein Wiederauftreten von Krebserkrankungen zu verhindern und bereits
bestehende Krebserkrankungen zu lindern oder zu beseitigen. Beispielsweise
offenbart die WO-A-8905631 eine Vakzin-Zusammensetzung zur Behandlung
von Krebs, die IL-2 oder ein anderes Lymphokin mit einer IL-2-ähnlichen
Wirkung, das auf der Oberfläche
eines Liposoms angebracht ist, umfasst. Daher werden Zusammensetzungen
benötigt, die
geeignete Wachstumsfaktoren aus dem Kreislauf entfernen oder die
wachstumsfördernde
Aktivität
von Wachstumsfaktoren inhibieren.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Im Allgemeinen beinhaltet die vorliegende Erfindung
Verfahren und Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder Behandlung von
Krebserkrankungen. Insbesondere beinhaltet die vorliegende Erfindung
immunisierende einen Wachstumsfaktor enthaltende Zusammensetzungen,
die die Herstellung von für
den Wachstumsfaktor spezifischen Antikörpern hervorrufen, wenn sie
einem Menschen oder Tier verabreicht werden.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Impfung eines Menschen
oder Tieres gegen Wachstumsfaktoren, die mit spezifischen Krebsarten
und Hyperproliferations-Krankheiten verbunden sind. Bestimmte Krebserkrankungen
sind nur mit einem Wachstumsfaktor verbunden und andere Krebserkrankungen werden
durch Wachstumsfaktoren gesteuert. Beispielsweise produzieren bestimmte
T-Zell-Lymphome
den Wachstumsfaktor IL-2, der die Proliferation durch autokrine
Wirkung stimuliert; andere Tumore produzieren Faktoren, die die
Angiogenese fördern und
durch Induktion einer Ge fäßbildung
im Gewebe am Ort von Metastasen das Wachstum von Metastasenkrebsläsionen stimulieren.
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Beispiele von Zusammensetzungen mit
einem Wachstumsfaktor beinhalten Liposome oder Vesikel, die Teile
eines Wachstumsfaktors, Fragmente eines Wachstumsfaktors, synthetische
Peptide bestimmter Epitope von Wachstumsfaktoren oder modifizierte
Fragmente eines Wachstumsfaktors auf ihren äußeren Oberflächen präsentiert
haben. Die im Vorhergehenden beschriebenen Zusammensetzungen sind
nützlich
als Vakzine zur Induktion einer Autoimmunität gegen Wachstumsfaktoren,
die sonst als "eigen" durch das Immunsystem
erkannt werden und nicht natürlicherweise
immunisierend wirken. Die erhaltenen zirkulierenden Antikörper binden
den Wachstumsfaktor und verhindern so die Initiation der Krebsproliferation,
verringern bestehenden Krebs oder hemmen die Ausbreitung von Krebs.
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Die vorliegende Erfindung beinhaltet
ebenso für
Wachstumsfaktoren spezifische Antikörper. Diese Antikörper werden
ausgehend von Menschen oder Tieren mit starken Immunsystemen hergestellt
und gereinigt und in Menschen oder Tieren mit schwachen oder nicht
funktionierenden Immunsystemen, die solche zirkulierende Antikörper benötigen, injiziert.
So werden gemäß der vorliegenden
Erfindung Krebserkrankungen entweder durch eine aktive Immunisierung
eines Individuums unter Verwendung von immunisierenden Wachstumsfaktor
enthaltenden Zusammensetzungen oder durch eine passive Immunisierung über eine
Verabreichung eines Antikörpers
oder einer Gruppe von Antikörpern,
der bzw. die spezifisch für
Wachstumsfaktor-Epitope ist bzw. sind gelindert oder gehemmt. Ferner
werden Patienten mit der Wachstumsfaktorzusammensetzung vor dem
Beginn oder dem Wiederauftreten nach einer Krebsbehandlung immunisiert.
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Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen
zur Linderung von Krebs bei einem Menschen oder Tier, der oder das
Krebs hat.
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Eine andere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen
zur Verhinderung des Auftretens oder einer Ausbreitung von Krebs.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen
zur Impfung eines Menschen oder Tiers gegen einen Wachstumsfaktor.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen
zur passiven Immunisierung eines Menschen oder Tiers gegen einen
Wachstumsfaktor.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Wachstumsfaktor enthaltenden
Zusammensetzungen, die immunisierend sind und eine Immunantwort
gegen einen Wachstumsfaktor bei Menschen oder Tieren hervorrufen.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Peptidfragmenten eines Wachstumsfaktors,
die mit immunisierenden Einheiten modifiziert sind, um eine Antwort
eines Individuums auf einen Wachstumsfaktor zu erhöhen, und Verfahren
zur Verwendung derselben.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Peptidfragmenten eines Wachstumsfaktors
und modifizierten Peptidfragmenten eines Wachstumsfaktors in Liposomen.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die ein
Peptidfragment eines Wachstumsfaktors enthalten, zusammen mit Adjuvantien,
um die Immunantwort zu stimulieren.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Anti-Wachstumsfaktor-Antikörpern, die
zur passiven Immunisierung eines Menschen oder Tiers gegen den Wachstumsfaktor
nützlich
sind.
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Diese und andere Aufgaben, Merkmale
und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht
der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsform
und der beigefügten
Ansprüche
offensichtlich.
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Detaillierte
Beschreibung der vorliegenden Erfindung
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Die vorliegende Erfindung umfasst
Verfahren und Zusammensetzungen zur Vorbeugung oder Linderung von
Krebs und Hyperproliferations-Erkrankungen bei einem Mensch oder
Tier. Die immunisierenden Wachstumsfaktor enthaltenden Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung beinhalten, aber sind nicht beschränkt auf,
Wachstumsfaktor enthaltende Träger,
wie Liposome und Vesikel, immunisierende Peptidfragmente eines Wachstumsfaktors, immunisierende
Peptidfragmente eines Wachstumsfaktors zusammen mit Adjuvantien,
modifizierten Peptidfragmenten eines Wachstumsfaktors, modifizierten
Peptidfragmente eines Wachstumsfaktors zusammen mit Adjuvantien,
Träger,
die Peptidfragmente eines Wachstumsfaktors enthalten, und Träger, die modifizierte
Peptidfragmente eines Wachstumsfaktors enthalten. Weiter beinhaltet
die vorliegende Erfindung Antikörper,
die gegen Wachstumsfaktoren gerichtet und spezifisch für diese
sind.
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Der hier verwendete Ausdruck "Wachstumsfaktor" betrifft polypeptidische
Wachstumsfaktoren und polypeptidische Angiogenesefaktoren und modifizierte
Derivate und Peptidfragmente derselben. Ein Wachstumsfaktor umfasst:
Fibroblasten-Wachstumsfaktor
(FGF);
vaskulärer
Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF, sonst als vaskulärer Permeabilitätsfaktor
bekannt).
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Der hier ebenso verwendete Ausdruck "immunisierend" betrifft Substanzen,
die die Produktion von gegen einen endogenen Wachstumsfaktor gerichteten
Antikörpern
in T-Zellen und anderen reaktiven Immunzellen hervorrufen oder erhöhen und
die an einer Immunantwort in Menschen oder Tieren beteiligt sind.
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Ein Individuum kann zirkulierende
gegen endogene Wachstumsfaktoren gerichtete Antikörper haben,
und dennoch tritt keine Immunantwort des Individuums gegen den Wachstumsfaktor
auf. Daher betrifft der hier verwendete Ausdruck "nichtimmunisierend" einen endogenen
Wachstumsfaktor in seinem nativen Zustand, der üblicherweise keine, oder nur
minimale Mengen von zirkulierenden Antikörpern, T-Zellen oder reaktiven
Immunzellen hervorruft und der normalerweise keine Immunantwort
in einem Individuum gegen sich selbst hervorruft. Eine Immunantwort
tritt auf, wenn ein Individuum ausreichend Antikörper, T-Zellen und andere reaktive
Immunzellen gegen verabreichte Wachstumsfaktorzusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung produziert, um die zu behandelnde Krebs-
oder Hyperproliferations-Erkrankung abzuschwächen oder zu lindern.
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Der hier verwendete Ausdruck "Träger" bedeutet eine Membranstruktur,
in die ein Wachstumsfaktor eingefügt werden kann, wodurch der
Wachstumsfaktor oder ein Teil des Wachstumsfaktors auf der äußeren Oberfläche des
Trägers
präsentiert
oder exponiert wird und damit die Wachstumsfaktor-Träger-Zusammen setzung
immunisierend gegen einen Wachstumsfaktor wird.
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Weiter betrifft der Ausdruck "eine effektive Menge" die Menge Wachstumsfaktor,
die bei Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier eine Immunantwort
hervorruft, Krebs vorbeugt, eine Linderung von Krebs bewirkt oder
die Ausbreitung und Proliferation von Krebs hemmt. Die effektive
Menge wird leicht durch einen Fachmann unter Befolgung von Standardverfahren
bestimmt.
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Beispielsweise werden immunisierende Wachstumsfaktorzusammensetzungen
parenteral oder oral in einem Bereich von etwa 1,0 μg–1,0 mg pro
Patient verabreicht, obwohl dieser Bereich nicht als beschränkend betrachtet
wird. Die tatsächlich
erforderliche Menge einer Wachstumsfaktorzusammensetzung zum Hervorrufen
einer Immunantwort wird für
jeden individuellen Patienten in Abhängigkeit von der Immunogenität der verabreichten
Wachstumsfaktorzusammensetzung und der Immunantwort des Individuums
unterschiedlich sein. Infolgedessen wird die spezifische, an ein
Individuum verabreichte Menge durch Routineexperimente und auf der
Basis des Ausbildungsstandes und der Erfahrung eines Fachmanns bestimmt.
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Die Wachstumsfaktor enthaltenden
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden zur Produktion
von Antikörpern,
die gegen Teile eines Wachstumsfaktors, die durch ihre Präsentation
im Träger
immunisierend werden, gerichtet sind, verwendet. Anti-Wachstumsfaktor-Antikörper werden
an Individuen verabreicht, um diese passiv gegen einen Wachstumsfaktor
zu immunisieren und dadurch das Auslösen von Krebswachstum zu verhindern,
bestehenden Krebs zu lindern oder die Proliferation von Krebs zu
hemmen.
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Insbesondere umfasst die vorliegende
Erfindung einen Wachstumsfaktor, der in Membranträger so insertiert
ist, dass Teile des Wachstumsfaktors auf der Trägeroberfläche präsentiert werden. Der Wachstumsfaktor
ist normalerweise nicht immunisierend, weil er vom Immunsystem als "selbst" erkannt wird. Jedoch
verändert
die Insertion von Teilen eines Wachstumsfaktors in die Oberfläche von
Liposomen die Präsentation
des Wachstumsfaktors für
das Immunsystem, wobei er immunisierend wird.
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Immunisierende Wachstumsfaktor enthaltende
Liposome können
durch Rekonstitution von Liposomen in der Gegenwart von einem gereinigten oder
einem teilweise gereinigten Wachstumsfaktor hergestellt werden.
Ferner können
Peptidfragmente von einem Wachstumsfaktor in Liposomen rekonstituiert
werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenso einen Wachstumsfaktor
und Peptidfragmente eines Wachstumsfaktors, die modifiziert wurden,
um ihre Antigenität
zu erhöhen.
Beispielsweise können immunisierende
Einheiten und Adjuvantien an den Wachstumsfaktor gebunden oder ihm
beigemischt werden. Beispiele für
immunisierende Einheiten und Adjuvantien umfassen, jedoch sind sie
nicht darauf beschränkt,
lipophile Muramyl-Dipeptid-Derivate, nichtionische Blockpolymere,
Aluminiumhydroxid- oder Aluminiumphosphat-Adjuvans und Gemische derselben.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
weiter Wachstumsfaktorfragmente, die mit hydrophoben Einheiten,
wie Palmitinsäure,
modifiziert wurden, was eine Insertion in die hydrophobe Lipiddoppelschicht eines
Trägers
vereinfacht. Hydrophobe Einheiten der vorliegenden Erfindung können Fettsäuren, Triglyceride
und Phospholipide sein, wobei das Fettsäure-Kohlenstoffgerüst mindestens
10 Kohlenstoffatome aufweist. Zweckmäßig sind lipophile Einheiten, die
Fettsäuren
mit einem Kohlenstoffgerüst
mit mindestens etwa 14 Kohlenstoffatomen und bis zu etwa 24 Koh lenstoffatomen
haben. Vorzügliche
hydrophobe Einheiten haben ein Kohlenstoffgerüst mit mindestens 14 Kohlenstoffatomen.
Beispiele für
hydrophobe Einheiten beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf,
Palmitinsäure,
Stearinsäure,
Myristinsäure,
Laurinsäure, Ölsäure, Linolsäure und
Linolensäure.
Die bevorzugte hydrophobe Einheit ist Palmitinsäure.
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Immunisierende Zusammensetzungen,
die einen Wachstumsfaktor, einen modifizierten Wachstumsfaktor und
Peptidfragmente derselben enthalten, werden einem Menschen oder
Tier verabreicht, um Immunität
gegen den Wachstumsfaktor zu erzeugen. Der immunisierte Mensch oder
das immunisierte Tier entwickelt zirkulierende Antikörper gegen
den Wachstumsfaktor, die an den Wachstumsfaktor binden, wobei seine
Fähigkeit
zur Stimulation von Krebszellproliferation verringert oder inaktiviert
wird.
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Liposome mit einem in die Membran
insertierten Wachstumsfaktor, sowie andere immunisierende, einen
Wachstumsfaktor enthaltende Zusammensetzungen, werden ebenso verwendet,
um eine Palette von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, die
spezifisch für
einen Wachstumsfaktor sind, zu produzieren. Verfahren zur Herstellung
von Antikörpern
sind einem Fachmann wohlbekannt. Anti-Wachstumsfaktor-Antikörper binden
den Wachstumsfaktor bei Verabreichung an Individuen, wodurch die
effektive Konzentration eines Wachstumsfaktors im Kreislauf reduziert
wird. Infolgedessen wird eine wachstumsfaktorabhängige Proliferation von Krebs verhindert,
verringert oder gehemmt.
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Die wachstumsfaktorenthaltenden Zusammensetzungen
und Anti-Wachstumsfaktor-Antikörper werden
einem Menschen oder Tier durch jedes geeignete Mittel, vorzugsweise
durch Injektion verabreicht. Beispielsweise wird ein in Liposomen
rekonstituierter Wachstumsfaktor durch subkutane Injektion verabreicht.
Die zirkulierenden Anti-Wachstumsfaktor-Antikörper binden an den Wachstumsfaktor
und verringern oder inaktivieren seine Fähigkeit zur Stimulation von
Krebszellproliferation, ganz gleich, ob sie innerlich produziert
werden oder von äußeren Quellen
zugeführt
werden.
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Liposome, die in den Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten jene, die
einem Fachmann bekannt sind. Beliebige Standardlipide, die zur Herstellung von
Liposomen verwendet werden können,
können verwendet
werden. Standardliposome mit Doppelschichten und mehreren Schichten
können
zur Herstellung von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Jedes einem Fachmann bekannte Verfahren zur Herstellung
von Liposomen kann verwendet werden, doch vorzugsweise werden Liposome
gemäß dem Verfahren
von Alving et al., Infect. Immun. 60: 2438–2444, 1992 hergestellt. Das
Liposom kann optional ein Adjuvans enthalten. Ein bevorzugtes Adjuvans
ist ein detoxifiziertes Lipid A, wie Monophosphoryl- oder Diphosphoryl-Lipid
A.
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Wenn die Vesikel Liposome sind, hat
der Wachstumsfaktor im Allgemeinen einen hydrophoben Schwanz, der
in die Liposommembran bei ihrer Bildung insertiert wird. Ferner
kann ein Wachstumsfaktor so modifiziert werden, dass er einen hydrophoben
Schwanz enthält,
so dass der Wachstumsfaktor in das Liposom insertiert werden kann.
Beispielsweise wird das Wachstumsfaktorgen mit einer Oligonucleotidsequenz,
die einen hydrophoben Schwanz codiert, fusioniert. Das modifizierte
Gen wird unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Verfahren in
ein Expressionssystem insertiert und in diesem exprimiert, wobei
ein Wachstumsfaktorfusionsprotein erhalten wird, das einen hydrophoben
Schwanz hat. Alternativ wird der Wachstumsfaktor auf der Oberfläche von
vorher gebildeten Liposomen durch chemische Bindung oder Elektroinsertion
exponiert.
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Wenn die Vesikel von einem Baculovirus
abgeleitete Vesikel sind, wird ein rekombinanter Wachstumsfaktor
auf der Membran der Insektenzelle als natürliche Folge der Prozessierung
durch die infizierte Insektenwirtszelle exprimiert. Wie bei der
oben beschriebenen Ausführungsform
mit einem Liposom kann ein Wachstumsfaktor so modifiziert werden, dass
das rekombinant exprimierte Protein einen hydrophoben Teil zur Erleichterung
der Insertion in die Vesikelmembran enthält.
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Die Erfindung wird durch die folgenden
Beispiele weiter erklärt,
die aber in keinster Weise so ausgelegt werden sollen, dass sie
den Umfang derselben beschränken.
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Beispiel I
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Konstruktion eines Wachstumsfaktor
enthaltenden rekombinanten Baculovirus
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Das Baculovirus-Expressionssystem
wird wie in N. R. Webb et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86, 7731–7735
beschrieben konstruiert. Ein rekombinantes Baculovirus, das cDNA,
die einen Wachstumsfaktor mit gesamter Länge unter transkriptioneller
Regulation des Polyhedronpromotors codiert, enthält, wird durch Co-Transfection
von rekombinanter pAc-Wachstumsfaktor-DNA mit Wildtyp Autographa
californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)-DNA mittels einer
Calciumphosphat-Präzipitation
hergestellt.
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Beispiel II
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Expression und Reinigung
eines Wachstumsfaktors
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Die okklusionsnegativen Viren aus
Beispiel I werden aus den Plaques gereinigt und in Spodoptera frugiperda
9 (Sf-9)-Zellen propagiert. Infizierte Sf9-Zellen werden in Monoschichten
oder Suspensionen wie in N. R. Webb et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86, 7731–7735
beschrieben propagiert. Kurz dargestellt, werden Sf9-Zellen bei
27°C in TNMFH-Medium,
wie es in M. D. Sommers und Smith, (1987) A Manual of Methods for
Baculovirus Expression Vectors and Insect Cell Culture Procedures
(Texas Agricultural Experiment Station, College Station, TX), Bull.
1555 beschrieben ist, mit Zusatz von 10% V/V hitzeinaktiviertem
fetalem Kälberserum kultiviert.
Extraktion und Reinigung des rekombinant exprimierten Wachstumsfaktors
wird mit Standardverfahren durchgeführt.
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Beispiel III
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Herstellung von Wachstumsfaktor
enthaltenden Liposomen
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Gereinigter Wachstumsfaktor wird
durch einem Fachmann bekannte Standardverfahren in Liposome elektroinsertiert
(Y. Mouneime et al., 1990, Biochem) oder in diesen rekonstituiert.
Ein Einbau von Wachstumsfaktoren oder Fraktionen derselben in Liposome
kann beinhalten:
- a) Rehydratation von lyophilisierten
Liposomen bekannter Lipidkomponenten in der Gegenwart einer wässrigen
Lösung
eines Wachstumsfaktors (oder von Wachstumsfaktorfragmenten) zur
Herstellung von einfach- oder mehrfachlamellaren Liposomen mit einem
im Lumen des Liposoms enthaltenen oder in der wässrigen Schicht zwischen den
Lipidmembranen der multilamellaren Vesikeln gefangenen Wachstumsfaktor;
- b) Elektroinsertion des Wachstumsfaktors oder von Fraktionen
desselben in rekonstituierte Liposome, wobei der Wachstumsfaktor
im Lumen oder zwischen den Lipidmembranen verbleibt;
- c) Rekonstitution von hergestellten Liposomen mit bekannter
Zusammensetzung mit lyophilisierten Fragmenten des Wachstumsfaktors,
wobei jedes Fragment einen hydrophoben Schwanz, der direkt in die
Liposomlipiddoppelschicht insertiert wird, enthält, so dass das Peptidfragment
auf der äußeren Oberfläche des
Liposoms exponiert ist; und
- d) jedes andere Verfahren zur Rekonstitution oder Kombination
aktiver Reagenzien, wodurch die Erzeugung einer gegen einen Wachstumsfaktor, Fraktionen
desselben oder synthetische Peptide, die die Zusammensetzung und
Aktivität
eines Wachstumsfaktors nachahmen, gerichteten Immunantwort (humoral
oder cellulär)
erhalten wird.
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Beispiel IV
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Herstellung von Wachstumsfaktor
enthaltende Baculovirus-Vesikeln
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Wachstumsfaktor enthaltende Vesikel
werden wie folgt hergestellt. Von einem Insekt abgeleitete Vesikel,
die einen rekombinanten Wachstumsfaktor in ihren Membranen enthalten,
werden unter Verwendung einer baculovirusinfizierten Insektenzelle erhalten.
Insbesondere werden Spodoptera frugiperda IPLB-Sf21-AE- Klonierungsisolat
9-Insektenzellen (bezeichnet als Sf9) mit einem rekombinanten Baculovirus,
der eine für
die Gesamtlänge
eines Wachstumsfaktors codierende cDNA enthält, kultiviert und infiziert,
wie es genauer in Webb et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 7731–35 (1989)
und in den US Patenten Nr. 4 745 051 und 4 879 236, beide von Smith
et al., beschrieben ist. Etwa 0,8 × 106 Sf9-Zellen
werden in ein 1-Liter-Spin-Gefäß, das Excell-Medium
(JRH Scientific, Woodland, CA 95695) enthält, gesät. Die Zellen werden bei 27°C, 50%ger
O2-Atmosphäre inkubiert.
Wenn die Zellen eine Dichte von 3,5 bis 4,0 Millionen Zellen/ml
erreichen, werden rekombinanten Wachstumsfaktor enthaltende Baculoviren
mit einer Multiplizität
von 400–600
Viren/Zelle dem Medium zugesetzt.
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Eine Vesikelproduktion beginnt ungefähr 24 Stunden
nach der Baculovirus-Infektion. Die Hauptvesikelbildung wird ungefähr 72 Stunden
nach der initialen Baculovirus-Infektion erreicht. Gefäßinhalte werden
gesammelt und bei etwa 1200 U/min zentrifugiert, um Zellen und Zellrückstände abzutrennen. Der Überstand,
der Vesikel enthält,
wird gesammelt und unter Verwendung von 50% Percoll, das 0,1 Mol Natriumbicarbonat,
pH 8,3 enthält,
30 Minuten bei 20.000 U/min mit einem Festwinkelrotor zentrifugiert. Die
Doppelbande unter einer Zwischenphase zwischen Percoll und Zellkulturmedium
wird gesammelt und die Suspension wird in einem Ausschwingrotor 30
min bei 20000 U/min zentrifugiert. Zwei Banden können oben und unten am Gradienten
mit Dichten von 1,05 g/ml für
Vesikel und 1,06 g/ml für
Baculovirus-Partikel beobachtet werden. Die Vesikel haben einen
Wachstumsfaktor auf ihren äußeren Oberflächen angeordnet
und können
zur Immunisierung verwendet werden. Die Vesikel werden dreimal mit
0,1 Mol Natriumbicarbonat, pH 8,3 durch Zentrifugation 20 min bei
20000 U/min und Resuspendieren in demselben Puffer gewaschen.
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Beispiel V
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Immunisierung mit Wachstumsfaktor
enthaltenden Zusammensetzungen
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Immunisierende Wachstumsfaktor enthaltende
Zusammensetzungen, entweder Liposome oder von Baculoviren abgeleitete
Vesikel, werden einem Menschen oder Tier mit einer Dosis von 1 – 1000 μg pro kg
Körpergewicht
injiziert. Titer von Antikörpern
gegen einen Wachstumsfaktor werden durch ELISA unter Verwendung
des rekombinanten Proteins und von Meerrettichperoxidasekonjugaten
mit anti-humanen oder anti-tierischen Immunoglobulinen von Ziege
oder andere serologische Verfahren (Sandwich-ELISA) oder Nachweise
biologischer Aktivität
(wie eine Neutralisierung von natürlichen oder synthetischen
Cytokinen oder Wachstumsfaktornachweise oder Kompetitionsnachweise),
die bereits bestehen oder spezifisch für individuelle Wachstumsfaktoren
entwickelt wurden, bestimmt. Auffrischinjektionen werden, wenn benötigt, verabreicht
um genügende
Spiegel von Schutzantikörpern
zur Verringerung oder Neutralisation der Aktivität von Wachstumsfaktoren in
vivo zu erreichen. Neutralisierende Titer und geeignete Antikörperisotypen
werden in Versuchstieren unter Exposition mit geeigneten Krebszellen
bestimmt.
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Beispiel VI
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Herstellung und Isolierung
von Anti-Wachstumsfaktor-Antikörpern
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Individuen mit starken Immunsystemen
werden wie in Beispiel V beschrieben immunisiert. Nachdem ein hoher
Titer von Anti-Wachstumsfaktor-Antikörper erreicht
wurde, wird die IgG-Fraktion
aus dem Blut isoliert und zur passiven Immunisierung eines Individuums
wie in Beispiel VII unten beschrieben verwendet.
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Beispiel VII
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Passive Immunisierung
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Anti-Wachstumsfaktor-Antikörper, die
aus den Arten isoliert wurden, die passiv zu immunisieren sind,
werden durch intravenöse
Injektion mit einer Dosismenge von ungefähr 0,5–50 mg pro kg Körpergewicht
verabreicht. Dosis und Häufigkeit
der Verabreichung werden in Versuchstieren, die verschiedenen Tumorarten
exponiert wurden, bestimmt und der spezifischen Tumorart und dem
bestimmten zu behandelnden Individuum angepasst. Wichtige Überlegungen
betreffen die Aggressivität
des Tumors, die Fähigkeit
zur metastatischen Ausbreitung, das Zielorgan für Metastasen, die Vaskularisierung/Zugänglichkeit
der Gewebe für
einen Antikörper
am Zielorgan und die Phase der Tumorentwicklung. Obwohl es wahr
sein mag, dass ein universell schützendes Standard-Schema entwickelt
werden kann, kann es auch sein, dass eine effektive Therapie nur
durch individuelle auf der Tumorart basierende Kriterien erreicht
werden kann.
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Obwohl diese Erfindung mit spezifischer
Genauigkeit unter Bezug auf die offenbarten Ausführungsformen beschrieben wurde,
ist klar, dass viele Variationen und Modifikationen innerhalb des
Umfangs der Erfindung, wie er in den angefügten Ansprüchen beschrieben ist, ausgeführt werden
können.