DE69433464T2 - Mit zellen beschichtete künstliche nieren betreffende vorrichtungen zum in vivo oder ex vivo gebrauch - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen, die aus einer Kombination aus biologischen und mechanischen Elementen gebildet sind – "bioartifizielle" Vorrichtungen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine bioartifizielle Niere, welche eine bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion umfaßt.
  • Hintergrund und Stand der Technik
  • Nierenversagen im Endstadium (ESRD) ist ein gewöhnliches klinisches Syndrom, was eine Abnahme der Nierenfunktion, entweder akut oder chronisch, beinhaltet. Die klinischen Manifestationen dieses Fehlzustandes stammen aus einem Absenken der glomerulären Filtrationsgeschwindigkeit und aus einer Unfähigkeit der Niere, die toxischen metabolischen Abfälle, die durch den Körper hergestellt werden, auszuscheiden. Die vollständige Behandlung von ESRD hängt von dem Ersatz der filtrativen, reabsorptiven, homöostatischen und endokrinen Funktionen der Niere als eine integrierte Organstruktur ab.
  • Die Ausscheidungsfunktion der Niere, die Bildung von Urin, beginnt in der Niere mit der Filtration des Blutes am Glomerulus, welcher ein Bündel von Kapillaren ist. Diese Kapillaren invaginieren eine umgebende Kapsel, genannt die Bowman-Kapsel, wo das Nierentubulisystem beginnt. Die Struktur des Glomerulus ist so entworfen, daß er eine effiziente Ultrafiltration des Blutes zur Verfügung stellt, um toxische Abfälle aus der Zirkulation zu entfernen und um wichtige Bestandteile innerhalb der systemischen Zirkulation, so wie Albumin, beizubehalten (Brenner and Humes, New Engl. J. Med. 297: 148–154, 1977; Brenner et al., New Engl. J. Med. 298: 826–833, 1978.
  • Die Regulationsfunktion der Niere, insbesondere hinsichtlich der Fluid- und Elektrolythomöostase, wird durch die tubulären Segmente zur Verfügung gestellt, die an dem Glomerulus anhaften. Es ist in den Nierentubuli, wo die Vorgänge der Osmose, Diffusion, ebenso wie der aktive Transport alle dazu beitragen, das glomeruläre Filtrat in Urin umzuwandeln. Das Ultrafiltrat strömt aus den Glomerulusbahnen aus und fließt entlang der Nierenbutuli, welche Fluid und lösliche Stoffe reabsorbieren, um schließlich die Ausscheidung von verschiedenen Mengen von löslichen Stoffen und Wasser im finalen Urin zu steuern. Die Funktionseinheit der Niere ist daher aus der Filtereinheit, dem Glomerulus, und der Regulationseinheit, den Tubuli, zusammengesetzt. Gemeinsam bilden sie den Basisbestandteil der Niere, genannt das Nephron.
  • Bis heute ist die einzige erfolgreiche Langzeit-ex-vivo-Ersatztherapie zur Unterstützung der Nierenfunktion die Hämodialyse und die chronische ambulante peritoneale Dialyse (CAPD) (Iglehart, N. Engl. J. Med. 328: 366–371, 1993; Excerpts from United States Renal Data System 1991 Annual Data Report, Am. J. Kidney Diseases 18(5) Supplement 2: 21–30, November, 1991). Die konvenionelle Hämodialyse zur ESRD ahmt zum Teil die Filtrationsfunktion der Niere durch Zirkulieren des Blutes des Patienten durch oder über eine Dialysatlösung nach, die physikalisch von dem Blut durch eine poröse oder permeable Wand oder Membran getrennt ist. Das Verfahren resultiert in der bevorzugten Diffusion kleiner Moleküle, so wie Harnstoff, aus dem Blutfluß in die Dialysatlösung. Beispiele einiger Hämodialysatoren und deren Funktion sind beschrieben in US-Patenten Nr. 3, 370, 710; 3, 373, 876; 3, 505, 686; 3, 704, 223; 3, 864, 259; 3,884,808; 4,176,069 und 4,354,933.
  • Auch wenn die Hämodialyse kleine Moleküle aus dem Blutfluß adäquat entfernt, wurde kein Verfahren etabliert, welches dafür sorgt, daß größere Moleküle selektiv entfernt oder behalten werden. Weiterhin müssen die Dialysatlösungen sorgfältig kontrolliert werden, um sicherzustellen, daß deren Konzentrationen von biologisch essentiellen Materialien (so wie anorganische Salze und Glucose) gut ausbalanciert sind, so daß diese Materialien, welche in dem Blut vorhanden sind, von dem Blut beibehalten werden. Es gibt einen starken Bedarf für eine Lösung für diese ernsthaften Nachteile.
  • Die Entwicklung von synthetischen Membranen mit hoher hydraulischer Permeabilität und mit Lösungmittelzurückhaltungseigenschaften in der bequemen Hohlfaserform hat die ESRD-Therapie unterstützt, basierend auf konvektiver Hämofiltration eher als auf diffusiver Hämodialyse (Cotton et al., J. Lab. Clin. Med. 85: 355–371, 1975; Henderson et al., J. Lab. Clin. Med. 85: 372–391, 1975). Die Entfernung von urämischen Toxinen durch das konvektive Verfahren hat verschiedene deutliche Vorteile gegenüber der Diffusion. Die Konvektion imitiert den glomerulären Prozeß der Toxinentfernung durch das Zur-Verfügung-Stellen von erhöhter Aufreinigung oder eines erhöhten Durchlaufs der gewünschten hochmolekulargewichtigen Moleküle und der Entfernung von allen nichtgewollten löslichen Stoffen (bis zu einem gewissen Motekulargewichts-Cutoff) mit derselben Geschwindigkeit.
  • Auch wenn die Dialyse die Prognose des Nierenversagens dramatisch verändert hat, ist es keine vollständige Ersatztherapie, da es nur die Filtrationsfunktion (normalerweise auf einer periodischen Basis) zur Verfügung stellt und nicht die homöostatischen, regulatorischen und endokrinen Funktionen der Niere ersetzt. Weiterhin, da die Dialyse auf eine nichtphysiologische Art und Weise funktioniert, haben Patienten mit ESRD, die der Dialyse unterzogen werden, weiterhin große medizinischen Probleme. Die gegenwärtige Anzahl von Patienten mit ESRD, die eine chronische Dialysetherapie in den USA erhalten, beträgt ungefähr 190.000, wobei die gegenwärtige Wachstumsrate der neuen Patienten bei 8–9% liegt. Eine Langzeitersatztherapie, welche alle der Funktionen der Niere ersetzt und welche weniger kostenaufwendig ist als die gegenwärtigen Dialysetherapien, ist erwünscht.
  • Beim Entwurf einer besseren Langzeitnierenersatztherapie, so wie einer implantierbaren bioartifiziellen Niere, müssen die essentiellen Filtrations- und Regulationsfunktionen des Nierengewebes entwickelt werden. Einiger Fortschritt in Richtung einer solchen Vorrichtung wurde klinisch durch die Verwendung von Polysulfonhohlfasern ex vivo erreicht, von welchen gezeigt wurde, daß sie die Ultrafiltrationsfunktion der Niere in Menschen für einige Wochen aufrechterhalten (Kramer et al., Klin. Wochenschr. 55: 1121–1122, 1977; Golper, T. A., Am. J. Kidney Diseases 6: 373–381, 1986). Die Limitationen einer solchen Vorrichtung beinhalten ein erhöhtes Auftreten von Blutungen an internen oder externen Orten des Patienten aufgrund der erforderlichen Antikoagulation, um die Durchlässigkeit der Hohlfaser zu erhalten, die Verringerung der Filtrationsgeschwindigkeit aufgrund der Proteinablagerung in der Faser im Laufe der Zeit und die große Menge an Flüssigkeit, die erforderlich ist, um das Ultrafiltrat zu ersetzen, welches aus dem Blutfluß durch die Filtrationsvorrichtung entfernt wird und auch nützliches biologisches Material enthält.
  • Die Verwendung von Endothelialzellen, die auf der Innenseite der Faserdurchläufe und der Filtrationsoberflächen angesiedelt wurden, wurde als ein Mittel vorgeschlagen, eine verbesserte Langzeitkompatibilität in vivo zu erzielen (Shepard et al., Surgery 99: 318–325, 1986; Kadletz et al., J. Thora c. Cardiovasc. Surg. 1988: 736–742, 1992; Schneider et al., Surgery 103: 456–462, 1988). In dieser Hinsicht wurde experimentell gezeigt, daß das Ansiedeln von Endothelialzellen auf kleinkalibervaskulären Prothesen die Langzeitplättchenablagerung, die Thrombusbildung und den Verlust der Transplantatdurchlässigkeit reduziert (Shepard et al., supra). Diese Konstrukte wurden lediglich als vaskuläre Leitungen und nicht als Filtrationsvorrichtungen verwendet.
  • Ein implantierbares epitheliales Zellsystem, abgeleitet aus Zellen, die als konfluente Monoschichten entlang der luminalen Oberfläche der impermeablen polymeren Hohlfasern wachsen gelassen werden, wurde ebenso beschrieben als ein erster Schritt für einen funktionalen Ersatz der Tubuli (Ip und Aebischer, Artificial Organs 13: 58–65, 1989). Kritisch für die Entwicklung von funktionalem Nierengewebe ist die Isolation und das Wachstum in vitro von spezifischen Zellen aus einer erwachsenen Niere, welche stammzellartige Charakteristika besitzen, so daß sie eine hohe Kapazität für. Selbsterneuerung und die Fähigkeit, unter definierten Bedingungen in spezialisierte Zellen mit der korrekten Struktur und den funktionalen Bestandteilen einer physiologischen Niere zu differenzieren, aufweisen (Hall und Watt, Development 106: 619–633, 1989; Potten und Loeffler, Development 110: 1001–1020, 1990; Garlick et al., J. Invest. Dermatol. 97(5): 824–829, 1991). Kürzlich wurde ein Verfahren, um proximale Nierentubulistamm- oder -progenitorzellen aus adulten Säuretierzellen zu isolieren und wachsen zu lassen, demonstriert (Humes und Cieslinski, Exp. Cell Res. 201: 8–15, 1992). Alternativ können proximale Nierentubulistamm- oder -progenitorzellen durch elektromagnetisches Zellsortieren (Whitesides et al., Trends in Biotechnology 1: 144–148, 1983; Padmanabhan et al., Analytical Biochem. 170: 341–348, 1988; Spangrude et al., Science 241: 58–62, 1988), oder durch Zellsortieren, basierend auf der Dichte der verschiedenen Zelloberflächenmembranproteine, so wie Integrine (siehe Jones et al., Cell 73: 713–724, 1993), isoliert werden.
  • Nicht Serum-enthaltende Wachstumsbedingungen wurden identifiziert, welche proximale Tubulizellen mit einer hohen Kapazität für die Selbsterneuerung und einer Fähigkeit, phänotypisch, kollektiv und individuell in proximale Tubulistrukturen in Collagengelen zu differenzieren, auswählen. Das genetische Markieren der Zellen mit einem rekombinanten Retrovirus, enthaltend das lac-Z-Gen, und Verdünnungsanalyse demonstrierten, daß in vitro-Tubuligenese aus der klonalen Ausdehnung einer einzelnen genetisch markierten Progenitorzelle auftrat. Daher befindet sich eine Population von proximalen Tubulizellen innerhalb der adulten Niere, welche in einem relativ ruhenden, langsam replikativen Stadium existiert, aber welche ein schnelles Potential, sich zu proliferieren, zu differenzieren und eine Musterbildung zu unterlaufen, beibehält, um das proximale Tubuliepithelium der Auskleidung der Niere nach schweren ischämischen oder toxischen Verletzungen zu regenerieren.
  • Ex vivo-Studien dieser proximalen Nierentubuli-Progenitorzellen haben demonstriert, daß die Wachstumsfaktoren, TGF-β und EGF, gemeinsam mit Retinolsäure die Differenzierung dieser Zellen in Nierentubuli fördern kann (Humes und Cieslinski, Exp. Cell Res. 201: 8–15, 1992). Daher scheint ein koordiniertes Zusammenspiel zwischen den Wachstumsfaktoren und den Retinoiden erforderlich zu sein, um Musterbildung und Morphogenese zu induzieren. Zusätzlich wurde unter Verwendung von Immunofluoreszenzmikroskopie ebenso demonstriert, daß Retinolsäure Laminin A- und B1-Kettenproduktion in diesen Zellen induziert und daß das aufgereinigte lösliche Laminin vollständig zum Ersatz für Retinolsäure bei der Nierentubuligenese eingesetzt werden kann (Humes und Cieslinski, supra). Retinolsäure, als ein Morphogen, scheint die Musterbildung und die Differenzierung durch Regulieren der Produktion eines extrazellulären Matrixmoleküls zu regulieren.
  • Es wurde demonstriert, daß die Epithelzellen der Nierentubuli die differenzierten Transportfunktionen der spezifischen Nephronsegmente, von denen sie abgeleitet wurden, beibehalten (Burg et al., Am. J. Physiology 242: C229–C233, 1982; Steele et al., Am. J. Physiology C136–C139, 1986; Amsler et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 456: 420–435; Husted et al., Am. J. Physiology 250: C214–C221, 1986; Bello-Reuss et al., Am. J. Physiology 252: F899–F909, 1987; Blackburn et al., Kidney International 33: 508–516, 1988).
  • Eine implantierbare bioartifizielle Nierenvorrichtung, welche die Nierenfunktion ersetzen kann und als ein Ergebnis daraus den Bedarf für eine langzeitige dialytische Therapie umgehen kann, würde im wesentlichen Patienten zugute kommen, die an ESRD leiden, durch Erhöhen der Lebenserwartung, Erhöhen der Mobilität und der Flexibilität, Erhöhen der Lebensqualität, Absenken des Infektionsrisikos und durch Reduktion der Therapiekosten.
  • Dokument WO 89/01967 offenbart eine Vorrichtung für die Blutaufreinigung mit immortalisierten Nierenzellen, welche keine differenzierte Funktion haben. Die offenbarten Zellen sind Epithelialzellen MDCK und LLC-PKI, erhalten von ATCC.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die anhängenden Ansprüche beschrieben.
  • Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bioartifizielle Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die die Nierenfunktion in Patienten mit akutem Nierenversagen oder mit dem Endstadium des chronischen Nierenversagens ersetzt. In besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beinhalten diese Vorrichtungen eine Filtrationsvorrichtung und eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion. Alle dieser Vorrichtungen, einzeln oder in Kombination, können ex vivo (angebracht an oder koordiniert mit dem Blutfluß des Körpers) verwendet werden oder können vollständig in vivo implantiert sein. Alternativ wird eine bioartifizielle Niere zur Verfügung gestellt, welche eine Filtrationsvorrichtung umfaßt, in Serie gefolgt durch oder verwendet parallel mit einer Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion.
  • Auf der Basis dieser Erkenntnisse und anderer Erkenntnisse, die hierunter beschrieben sind, stellt die vorliegende Erfindung (1) eine implantierbare bioartifizielle Filtrationsvorrichtung zur Verfügung, welche in vivo die Funktion des Glomerulus ausführt und (2) eine implantierbare bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion, welche in vivo die Funktion der Nierentubuli ausführt. Diese zwei Vorrichtungen können entweder unabhängig voneinander oder in Verbindung miteinander verwendet werden. Wenn sie in Verbindung miteinander verwendet werden, können die zwei Vorrichtungen unabhängig ex vivo oder in vivo verwendet werden.
  • Die bioartifiziellen Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung kombinieren Hohlfasertechnologie mit Nierenzellentechnologie. Poröse Hohlfasern sind Membranen, die den molekularen Austausch analog zu dem Austausch über Kapillarmembranen erlauben. Die Porengröße kann durch den Herstellungsprozeß gesteuert werden. Eine einzelne Hohlfaser oder ein Bündel davon kann innerhalb einer Schale oder einer Kassette angeordnet sein. Diese stellt zwei Räume zur Verfügung: einen luminalen Raum innerhalb der Hohlfaser und einen Raum, der die Hohlfaser umgibt, der aber innerhalb der Schale angeordnet ist. Abhängig vom Typ der Zellen, die innerhalb dieser Vorrichtungen wachsen gelassen werden, können verschiedene biologische Funktionen reproduziert werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1 enthält ein Phasenkontrastmikrograph von adulten proximalen Tubulizellen der Kaninchenniere, welche ex vivo in Primärkulturen mit EGF und RA (kein TGF-β) wachsen gelassen wurden. 1a illustriert Monoschichten von Zellen auf einem dreidimensionalen Collagengel. 1b illustriert Aggregate von Tubulizellen. 1c illustriert langverzweigte Tubulistrukturen.
  • 2a–b sind Schemata von zwei Ausführungsformen einer Filtrationsvorrichtung, bestehend aus einer einzelnen Hohlfaser.
  • 3a–b sind Photographien von zwei Ausführungsformen der Filtrationsvorrichtung, bestehend aus Bündeln von Hohlfasern.
  • 4 ist eine Lichtmikroskopieaufnahme einer Polysulfonhohlfaser, die intern mit einer Schicht von Collagen Typ I entlang deren innerer Oberfläche beschichtet ist.
  • 5 ist eine schematische Repräsentation einer vaskulären Infiltration eines Bündels aus Hohlfasern.
  • 6a–b sind schematische Darstellungen einer Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion, bestehend aus einer Hohlfaser, die intern bzw. extern mit differenzierten Tubulizellen der Niere bewachsen ist.
  • 7a ist eine Querschnittsphotographie der Hohlfaser, die intern mit Epithelialzellen bewachsen ist. 7b ist eine Elektronenmikroskopieaufnahme einer Polysulfonhohlfaser, die intern mit einer Schicht aus Laminin beschichtet ist und mit einer Schicht aus Tubulizellen der Niere mit differenzierter Morphologie entlang deren innerer Oberfläche bewachsen ist.
  • 8a–d sind schematische Darstellungen einer bioartifiziellen Niere, die eine Filtrationsvorrichtung umfaßt, gefolgt in Serie durch eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion. 8e ist eine schematische Darstellung einer bioartifiziellen Niere, die eine Filtrationsvorrichtung parallel mit einer Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion umfaßt.
  • 9 ist eine Proteinelektrophorese eines Kaninchenserums (oben), ein Filtrat aus der initialen Filtrationsvorrichtung (in der Mitte) und ein Filtrat aus der Filtrationsvorrichtung der zweiten Generation (unten).
  • 10 ist eine Formulierung eines Einzelhohlfaserperfusions-in vitro-Testsystems.
  • Bestes Verfahren zum Ausführen der Erfindung
  • Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, daß sich eine Zellpopulation in der adulten Niere befindet, welche die Kapazität, sich zu proliferieren und sich morphogen in Tubulistrukturen in vitro zu differenzieren, beibehalten hat. Diese Zellen behalten eine hohe Kapazität für die Selbsterneuerung und eine Fähigkeit, phänotypisch, gemeinsam und individuell, in proximale Tubulistrukturen zu differenzieren, bei. Die Erfinder haben nicht-Serum-enthaltende Wachstumsbedingungen identifiziert, die diese proximalen Tubulizellen auswählen. Die vorliegenden Erfinder hatten herausgefunden, daß die Wachstumsfaktoren TGF-β1 und EGF, oder alternativ TGF-β1 und TGF-α, gemeinsam mit einem Retinoid, Retinolsäure (RA), die Tubuligenese in proximalen Tubuliprogenitorzellen der Niere in Gewebekultur förderten. Die Erfinder haben nun herausgefunden, daß Tubuligenese in dreidimensionalen Collagengelen mit RA und EGF induziert werden kann.
  • Unter selektiven serumfreien Wachstumsbedingungen, welche den epidermalen Wachstumsfaktor und Retinolsäure enthielten, konnte eine Subpopulation aus proximalen Tubulizellen der Niere, isoliert aus adulter Kaninchenniere, in Zellkultur wachsen gelassen werden. Diese Zellen besitzen zwei wichtige Charakteristiken: (i) eine Fähigkeit, sich morphogen in Tubulistrukturen zu differenzieren, wenn sie in dreidimensionalen Collagengelen wachsen gelassen werden, und (ii) haben sie eine hohe Fähigkeit zur Selbsterneuerung. Zellinienanalyse mit einem rekombinanten Retrovirus hat demonstriert, daß in vitro-Tubuligenese aus klonaler Expansion aus einer einzelnen Zelle herrührte. Retinolsäure (RA) und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) wurden aus drei Gründen ausgewählt. Zunächst hatte vorherige Arbeit mit Hautkeritinozyten in Gewebekultur suggeriert, daß Zellen mit stammzellartigen Charakteristika in Zellkultur angereichert wurden, wenn sie unter Bedingungen mit induzierter verfrühter terminaler Differenzierung wachsen gelassen wurden (Rogers et al., J. Cell Biol. 110: 1767–1777, 1990; Parkinson et al., Carcinogenesis 3, 525–531, 1982). Zweitens wurde demonstriert, daß RA ein effektives Differenzierungsmittel bei embryonalen Stammzellen und bei proximalen Tubulizellen der Niere in Gewebekultur ist (Humes und Cieslinski, supra; Rogers et al., supra). Drittens ist EGF das am meisten potente Mitogen der proximalen Tubulizellen der Niere, das gegenwärtig beschrieben ist (Humes et al., Lab. Invest. 64: 538–545, 1991; Parkinson, supra). Daher würde die Kombination eines potenten Wachstumspromotors, EGF, und eines Differenzierungsmittels, RA, positiven Selektionsdruck für Zellen zur Verfügung stellen, welche eine hohe Kapazität für Replikation haben, und negativen Selektrionsdruck für Zellen zur Verfügung stellen, welche terminal differenzierend sind. Auch wenn die serielle Passage von proximalen Tubulizellen der Niere bisher schwierig zu erreichen war, haben diese Wachstumsbedingungen mit RA und EGF in einer Fähigkeit resultiert, diese Zellen für mehr als 20 serielle Passagen wachsen zu lassen. Die Verwendung von sowohl RA als auch von EGF war erforderlich für die konsistente Passage dieser Zellen. Die Fähigkeit dieser Tubulizellen der Niere, sich morphologisch zu differenzieren und Muster in tubuliartigen Strukturen zu bilden, kann durch Wachsenlassen von adulten proximalen Tubulizellen der Kaninchenniere in Primärkultur gefolgt von Wachstum unter Selektionsdruck mit RA und EGF für mehrere Passagen demonstriert werden. Tubulizellen der Niere, wachsen gelassen unter diesen Selektionsbedingungen, können dann dispergiert werden, um eine Einzelzellpräparation herzustellen, in dreidimensionalen Collagengelen suspendiert werden und in serumfreien, hormonal definierten Kulturmedien, angereichert mit RA und EGF, 7 bis 14 Tage lang wachsen gelassen werden (geeignete Verfahren sind beschrieben in Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3401–3405, 1979; Bennett, Nature 285: 657–659, 1980; Montesano et al., Cell 42: 469–477, 1985). Innerhalb mehrerer Tage bilden die Zellen, die unter diesen Bedingungen in Collagengelen wachsen gelassen wurden, luminale tubuläre Strukturen aus, wie gezeigt durch Phasenkontrastmikroskopie (1a–1c). Die progressive Passage von Zellen förderte ansteigend definierte tubuläre Strukturen. Semithinabschnitte der Collagenpräparation bestätigen die tubuläre Natur der Zellcluster. Zellaggregate innerhalb der Collagengelmonoschichten aus Zellen umgaben die zentralisierten Lumen in zylindrischen Anordnungen. Dünne Abschnitte demonstrieren, daß die Lumen durch polarisierte Epithelialzellen mit gut definierten Mikrovilli und mit engen Komplexen in Grenzzonen entlang der apischen Luminalgrenze umgeben sind. Eine Zellmonoschicht wächst ebenso entlang der Oberfläche des Collagengels. Diese Oberflächenzellen besitzen auf breiter Basis Mikrovilli, die in das Kulturmedium entlang der apischen Grenze hineinragen. Enge Komplexe in Grenzzonen sind ebenso zwischen diesen Oberflächenzellen in der Nähe der apischen Grenze vorhanden, die dem Kulturmedium ausgesetzt ist. Wenn entweder EGF, RA oder sowohl EGF als auch RA in Kombination aus dem Kulturmedium ausgelassen werden, bilden sich die Tubuliähnlichen Strukturen innerhalb des Collagengels nicht.
  • Daher müssen sowohl EGF als auch RA in dem Wachstumsmedium für proximale Tubulizellen der Niere vorhanden sein, damit sie ein Muster ausbilden und zu Tubuli innerhalb eines differenzierten polarisierten Epithelialzellphänotyps in vitro werden.
  • Daher haben die Erfinder ein koordiniertes Zusammenspiel zwischen Wachstumsfaktoren und Retinoiden definiert, welches die Musterbildung und die Morphogenese induziert; und dadurch erstmalig die verschiedenen induktiven Faktoren definiert, welche erforderlich sind, um vollständig differenzierte Nierentubuli zu produzieren und welche wichtig bei der Organogenese eines Säugetierorgans sein können.
  • Zusätzlich, unter Verwendung von Immunofluoreszenzmikroskopie, induzierte Retinolsäure die Herstellung von Laminin A und B1-Ketten in diesen Zellen. Dies demonstriert, daß die Substitution von aufgereinigtem löslichem Laminin für Retinolsäure ebenso die Nierentubuligenese induzieren kann. Daher können verschiedene unlösliche Faktoren, dessen Biosynthese von EGF, TGF-β1, TGF-α oder RA abhängt, als Morphogene agieren, um die Musterbildung und die Differenzierung zu fördern.
  • Weiterhin haben die vorliegenden Erfinder entdeckt, daß Endothelial- und Epithelialzellen in Gewebekultur wachsen gelassen, in das Lumen einer oder auf die äußere Oberfläche einer semipermeablen polymeren Hohlfaser gepflanzt und bis zur Durchgängigkeit wachsen gelassen werden können, um eine Monoschicht entlang der Oberfläche der Faser zur Verfügung zu stellen. Diese Fasern unterscheiden sich von früheren Berichten von zellbeschichten Leitungen sowohl in der Identität und der Funktion der Zellen als auch in der Durchlässigkeit der Leitungen.
  • Filtrationsvorrichtung
  • Die Filtrationsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Vorrichtung zum Aufreinigen von Blut und umfaßt geeigneterweise entweder eine einzelne semipermeable Hohlfaser oder eine Ansammlung von semipermeablen Hohlfasern, die entweder extern oder intern mit einer Schicht einer extrazellulären Matrix (ECM) beschichtet sind, auf welcher eine konfluente Monoschicht von Epithelial- und/oder Endothelialzellen wachsen gelassen wird. Alternativ können die Zellen oder die Matrix direkt in die oder auf die polymere Struktur der semipermeablen Hohlfaser während der Herstellung mit einbezogen werden (wie hiernach beschrieben).
  • Die Filtrationsvorrichtung der vorliegenden Erfindung fördert die Ultrafiltration des Bluts über einen konvektiven Transport von Wasser und von darin gelösten Stoffen aus dem Blut und über die Wand einer semipermeablen Hohlfaser mit hoher hydraulischer Permeabilität. Filtration des Bluts durch ein konvektives Verfahren hat verschiedene bestimmte Vorteile: Sie imitiert den glomerulären Prozeß der Toxinentfernung mit erhöhter Aufreinigung von hochmolekulargewichtigen löslichen Stoffen und entfernt alle löslichen Stoffe bis zu einer ausgewählten Molekulargewichtsgrenze mit derselben Geschwindigkeit. Konvektiver Transport tritt unabhängig von den bestehenden Konzentrationsgradienten auf und hängt im wesentlichen von dem hydraulischen Druckgradienten über die Membran ab.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung illustriert 2a eine Filtrationsvorrichtung, die eine einzelne Hohlfaser 10 in einer Kammer 11 umfaßt, die durch ein Gehäuse 12 definiert wird. Die Hohlfaser 10 ist intern mit verschiedenen extrazellulären Matrixbestandteilen 13a beschichtet, auf welchen eine konfluente Monoschicht, umfassend Endothelial- und/oder Epithelialzellen 13b, wachsen gelassen wird. Beide Enden der Hohlfaser 10 sind glatt abgeschnitten, um Zugang zu den internen Räumen der Hohlfaser zu erhalten. Die Hohlfaser 10 wird dann passend gegen Kopfteile 14 eingepaßt unter Verwendung von jeglichen bekannten Techniken, beispielsweise werden sie an beiden Enden mit Pottingmaterial eingepottet. Die Perfusionseinlaßkontaktstelle 15 und die Perfusionsauslaßkontaktstelle 16 werden mit den Kopfteilen 14 an gegenüberliegenden Enden verbunden. Das Gehäuse ist weiterhin mit einer Filtratauslaßkontaktstelle 17 ausgestattet.
  • Blut, das ungewünschte Verunreinigungen, so wie metabolische Abfallstoffe, enthält, fließt aus dem arteriellen Lumen des Patienten heraus und tritt in die Perfusionseinlaßkontaktstelle 15 ein, läuft entlang der Hohlfaser 10 und tritt aus der Perfusionsauslaßkontaktstelle 16 aus, wonach es in den vaskulären venösen Fluß reabsorbiert wird. Während Blut durch die Faser hindurchtritt, schreitet die Filtrierung durch die konfluente Monoschicht 13b, durch die extrazelluläre Matrix 13a und durch die Wand der Hohlfaser 10 in die Sammelkammer 11 fort. Das Filtrat tritt aus der Sammelkammer 11 durch die Filtratauslaßkontaktstelle 17 aus.
  • In einer bevorzugten Konfiguration dieser Ausführungsform umfaßt die Filtrationsvorrichtung eine Hohlfaser, welche intern mit einer konfluenten Monoschicht aus autologen Endothelialzellen beschichtet ist. Antikoagulantien werden geeigneterweise in das Blut innerhalb der Filtrationsvorrichtung eingeführt. Geeignete Antikoagulantien beinhalten potente Thrombininhibitoren, so wie Hirudin, Hiruloge und Fragmente davon, welche die Antikoagulansaktivität beibehalten. Bis heute gibt es etwa 12 Varianten des Hirudins, ebenso wie Hirudinfragmente und Hirulogverbindungen (Maraganore et al., J. Biol. Chem. 264; 8692–8698, 1989; Scharf et al., FEBS 255; 105–110, 1989; Maraganore et al., Biochemistry 29; 7095–7101, 1990). Geeignete Hirudinfragmente, die in dieser Ausführungsform nützlich sind, beinhalten Fragmente, welche den katalytischen Ort des Hirudins enthalten, welcher die Blutplättchenaggregation blockiert, ebenso wie den Fibrinogenbindeort, welcher die Aktivierung der Koagulation blockiert (Maraganore et al., 1989, supra; Maraganore et al., 1990, supra; Borbon et al., FEBS 294: 163–166, 1991).
  • Hirudin ist eine wirksame Antikoagulans aufgrund dessen potenter Thrombin-inhibierender Wirkung. Es ist eine Familie von Polypeptidkettenproteinen, enthaltend 64–66 Reste, die aus dem blutsaugenden Egel isoliert wurden, Hirudo medicinalis. Der anti-Thrombin-Aktivität des Hirudins liegt die Bildung eines festen Komplexes zwischen diesem Protein und dem Enzym zugrunde, welche die Thrombin-Aktivität mit einer Dissoziationskonstante von 20 fM inhibiert. Andere ähnliche Thrombin-Inhibitoren wurden aus anderen Egeln isoliert, der neueste war Haemidin aus dem indischen Egel, Haemadipsa sylvesfris (Strube et al., J. Biol. Chem. 268: 8590–8595, 1993). Die cDNAs sowohl von Hirudin als auch von Haemidin wurden erhalten, und die rekombinanten Proteine, die aus Expressionsvektoren hergestellt wurden, haben potente Antikoagulationseigenschaften in vitro und in vivo gezeigt (Maraganore et al., 1989, supra; Fenton, J., In Coagulation Disorders I 6: 1121–1129, 1992; Strube et al., supra; Kaiser, B., Seminars in Thrombosis and Hemostasis 17: 130–136, 1993).
  • Diese Antikoagulantien können geeigneterweise über exogene Verabreichung über eine subkutane Infusionskontaktstelle, die mit den internen Abschnitten der Hohlfaser in Kontakt steht, verabreicht werden. Alternativ können semipermeable Fasern intern mit einer Schicht von immobilisierten Antikoagulansverbindungen, vorzugsweise Peptiden, beschichtet sein. Diese Verbindungen können entweder auf das Polymer absorbiert oder kovalent an das Polymer unter Verwendung von konventionellen Techniken angehaftet werden (Andrade et al., Polymer Sci. 79: 1–63, 1986; Lin et al., Biomaterials 13: 905–913, 1992; Hubbel et al., Biotechnology 9: 568–572, 1991). Kovalent angehaftete Peptide können einer weiteren Funktion des Erhöhens der Adhäsion der Endothelialzellen an die semipermeable Faser dienen (Lin et al., supra; Hubbel et al., supra).
  • Alternativ können Endothelialzellen mit verschiedenen Genen transfiziert werden, welche für diese Verbindungen codieren (Flugelman et al., Circulation Research 70: 348–354, 1992; Dichek et al., Circulation 80: 1347–1353, 1989). In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Endothelialzellen, die die Faser intern beschichten, mit cDNA transfiziert, welche für Hirudin- oder Hirulogverbindungen codiert, und diese Verbindungen entweder auf der externen Oberfläche ihrer Membranen exprimieren oder diese Verbindungen ausscheiden. DNA aus synthetisierten Oligonukleotiden und aus Polymerasekettenreaktionstechniken können erhalten werden und codieren für diese Arten von Derivaten. Unter Verwendung dieser cDNA kann stabile Gentransfektion mit diesen Oligonukleotiden verwendet werden, um die lokale Produktion von Antikoagulantien entlang der Beschichtungsshicht des Endotheliums zu induzieren. Stabile Gentransfektion mit Vektoren, die diese Oligonukleotide enthalten, können mit konventionellen Verfahren erreicht werden (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausg., Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). DEAE-Dextrin kann verwendet werden, um die Transfektion der DNA, die für Hirudin codiert, zu verbessern, wie beschrieben durch (Dichek et al., Blood 77: 533–541, 1991; Jaklitsch et al., J. Cell Physiol. 154: 207–216, 1993). Vorzugsweise wird die Transfektion erreicht unter Verwendung von rekombinanten Retroviren. Um sicherzustellen, daß Hirudin, Hiruloge oder Hirudinfragmente aus der Zelle ausgeschieden werden, wird ein Signalpeptid, das für die Ausscheidung und Abspaltung des Membranbindepeptids geeignet ist, vorzugsweise in die Vektoren mit einbezogen. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann die Filtrationsvorrichtung sowohl nichttransduzierte als auch transfizierte Endothelialzellen enthalten.
  • Eine andere Ausführungsform der Filtrationsvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird in 2b dargestellt. Die Filtrationsvorrichtung umfaßt eine einzelne Hohlfaser 10, definiert durch extrazelluläres Matrixmaterial 13a. Ein Ende der Hohlfaser 10 wird flach abgeschnitten, so daß der resultierende Zugang zu dem Lumen der Hohlfaser mit der Filtratauslaßkontaktstelle 17 verbunden werden kann, die mit einem Kopfstück 14 in Verbindung steht. Das gegenüberliegende Ende der Hohlfaser 10 wird versiegelt.
  • Das Ultrafiltrat verläßt die arteriellen Kapillarlumina, die sich in der Nähe der Hohlfaser 10 befinden, tritt durch die Wand der Hohlfaser 10 in das Lumen der Hohlfaser 10 hindurch und tritt aus der Filtratauslaßkontaktstelle 17 aus.
  • Die Filtrationsvorrichtung besteht vorzugsweise aus einer großen Anzahl an Hohlfasern, die in einem Bündel angeordnet sind (3a–b). Diese Anordnung verbessert die erhältliche Oberfläche für das Kapillarinterface mit dem Hohlfaserbündel. In einer Ausführungsform (3a) sind die Hohlfasern 10 als eine zylindrische Anordnung mit jeglicher Anzahl von Hohlfasern angeordnet, ungefähr 100 bis 10.000 Hohlfasern, die irgendeine geeignete Länge haben, so wie von 1–100 cm in der Länge, und die an beiden Enden befestigt sind, z. B. gepottet mit Pottingmaterial. Das Fluid fließt aus dem Kapillarlumen durch die Hohlfaser 10 durch die Wände der Fasern in das Lumen der Hohlfasern und tritt aus er Filtratauslaßkontaktstelle 17 aus.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (3b) sind die Hohlfasern als ein Plättchen mit irgendeiner Anzahl von Hohlfasern mit derselben Länge angeordnet, ungefähr 100 bis 10.000 Hohlfasern, die irgendeine geeignete Länge haben, so wie von 1–100 cm in der Länge, und beispielsweise mit Pottingmaterial an beiden Enden befestigt sind. Ein Ende jeder Faser in dem Bündel ist versiegelt und das gegenüberliegende Ende ist mit der Filtratauslaßkontaktstelle verbunden. Das Ultrafiltrat verläßt die arteriellen Kapillarlumina, die in der Nähe der Hohlfaser 10 angeordnet sind, durch die Wand der Hohlfaser 10 in das Lumen der Hohlfaser 10 und tritt aus der Filtratauslaßkontaktstelle aus.
  • Geeignete semipermeable Hohlfasern, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können aus jeglichem bekannten biokompatiblen Polymer einschließlich CUPROPHANTM (eine durch den Cuprammoniumprozeß regenerierte Cellulose, erhältlich von Enka), HEMOPHANTM (ein modifiziertes CUPROPHAN mit verbesserter Biokompatibilität, erhältlich von Enka), CUPRAMMONIUM RAYONTM (eine Variation von CUPROPHAN, erhältlich von Asahi), BIOMEMBRANTM (CUPRAMMONIUM RAYON, erhältlich von Asahi), verseiftem Celluloseacetat (so wie Fasern, erhältlich von Teijin oder CD Medical), Celluloseacetat (so wie Fasern, erhältlich von Toyobo (Nipro)), Cellulose (so wie diejenigen, die durch das modifizierte Cupramoniumverfahren oder das Viskoseverfahren, erhältlich von Terumo bzw. Textikombinat (Pirna, GDR), regeneriert wurden), Polyacrylnitril (PAN), Polysulfon, Acrylcopolymeren (so wie Acrylnitril-NAmethallylsulfonat-Copolymeren, erhältlich von Hospal), Polycarbonatcopolymer (so wie GAMBRONTM, eine Faser, erhältlich von Gambro), Polymethylmethacrylat-Copolymeren (so wie Fasern, erhältlich von Toray) und Ethylenvinyl-Copolymer (so wie EVALTM, ein Ethylenvinylalkohol-Copolymer, erhältlich von Kuraray) bestehen. Vorzugsweise werden Polysulfonfasern verwendet. Andere geeignete biokompatible Fasern sind offenbart durch Salem und Mujais, In Dialysis Therapy, Kap. 5, 2. Ausg., Nissenson und Fine, Hrsg., Hanley & Belfus, Inc., Pennsylvania, 1993.
  • Die Hohlfasern müssen eine hohe hydraulische Konduktivität aufweisen, wie gemessen in Bezug auf den Ultrafiltrationskoeffizienten. Geeigneterweise ist der Ultrafiltrationskoeffizient größer als 20 ml/h, Torr, vorzugsweise 20–100 ml/h, Torr. Die Hohlfasern haben geeigneterweise ein Molekulargewichts-Cutoff oder eine Porengröße, welche kleiner oder gleich 60.000 g/mol ist.
  • Die interne und/oder externe Oberfläche der Hohlfaser wird vorbeschichtet mit geeigneten extrazellulären Matrix (ECM)-Bestandteilen, einschließlich Typ I-Collagen, Typ IV-Collagen, Laminin, MatrigelTM, Proteoglycan (so wie Heparinsulfat und Dermatansulfat), Fibronectin und Kombinationen daraus, um eine ECM-Schicht zu bilden. 4 ist eine lichtmikroskopische Aufnahme einer illustrativen Polysulfonhohlfaser, beschichtet mit einer Schicht aus Collagen Typ I entlang dessen innerer Oberfläche. In dieser Abbildung wird die Faser mit der äußeren Kontur der Hohlfaser gesehen, identifiziert durch eine irreguläre Linie oben. Die Collagenschicht ist am unteren Ende und färbt sich dunkler mit einer fibrillenartigen Erscheinung. Untersuchungen mit niedriger Auflösung (nicht gezeigt) zeigen eine glatte Schicht Collagen entlang des gesamten Umfangs der inneren Oberfläche der Hohlfaser.
  • Sobald eine ECM-Schicht auf der (den) Oberfläche(n) der Hohlfaser etabliert ist, wird diese Schicht dann mit Endothelialzellen bewachsen. Endothelialzellen gemäß der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von bekannten Techniken kultiviert werden. Geeignete Endothelialzellen sind autologe Zellen, die von dem Patienten isoliert wurden. Geerntete Zellen werden in jede der Hohlfasern, die innerhalb der Filtrationsvorrichtung angeordnet sind, eingepflanzt. Die Zellen werden dann auf der ECM-Schicht kultiviert, bis eine konfluente Monoschicht entlang des Inneren der Hohlfaser etabliert ist. Geeignete Kultivierungstechniken, die nützlich sind für das Einpflanzen dieser Zellen auf der Oberfläche der Faser, sind beschrieben durch Scott et al., J. Cell Sci. 105: 269–273, 1993; Schneider et al., Surgery 103: 456–462, 1988; Kadletz et al., J. Thoracic and Cardiovascular Surgery 104: 736–742, 1992; Shepard et al., Surgery 99: 318–326, 1986; und Demetriou et al., Science 23: 1190–1192, 1986.
  • Geeignetes Pottingmaterial, das für das Anhaften der semipermeablen Hohlfasern in die Kammer der Filtrationsvorrichtung geeignet ist, beinhaltet Polyurethan, Silikon oder irgendeine elastomere Substanz, die biokompatibel ist.
  • Die verbleibenden Elemente der Vorrichtung können aus jeglichem bekannten biokompatiblen Material oder aus jeglichen bekannten biokompatibelen Materialien hergestellt sein.
  • Die Filtrationsvorrichtung kann geeigneterweise entweder subkutan auf der Peritonealmembran oder innerhalb verschiedener Gewebe (so wie Muskel oder Niere) implantiert werden. Alternativ kann die Filtrationsvorrichtung außerhalb des Körpers angeordnet sein.
  • Ortsgerichtete Neovaskularisierung kann dann mit geeigneten angiogenen Faktoren und löslichen Faktoren gefördert werden (siehe 5). Die Angiogenese ist die Bildung von Blutgefäßen in situ und beinhaltet die ordentliche Migration, Proliferation und Differenzierung der vaskulären Zellen. Die Initiierung der Angiogenese durch direkte Formulierung der Endothelialzellproliferation liegt in der angenommenen Verantwortlichkeit der Polypeptidmitogene begründet: saurer Fibroblastenwachstumsfaktor, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, Fibroblastenwachtumsfaktor-5, Hepatozytenwachstumsfaktor und vaskulärer Endothelialwachstumsfaktor. Von diesen Polypeptiden wurde gezeigt, daß sie Mitogene für Endothelialzellen in vitro und für die Angiogenese in vivo sind (Thompson et al., Science 242: 1349, 1988).
  • Bei dieser Ausführungsform (entsprechend der hierin vorher diskutierten zweiten Ausführungsform) agieren die Hohlfasern als Sammelleitungen für Ultrafiltrat, produziert durch das neu gebildete Kapillarnetzwerk, induziert durch die angiogenen Faktoren. Diese Formulierung basiert auf der intrinsischen Eigenschaft, die inhärent in allen Kapillarbetten ist, um Ultrafiltrat zu produzieren. Dieses Filtrat oder Transudat wird sich eher in dem Hohlfasernetzwerk als an den physiologischen Orten, die aus dem Interstitialraum und den Lymphbahnen bestehen, sammeln. Der vektoriale Filtratfluß wird von der Kapillare durch das Interstitium in die Hohlfaser(n) sein, da der hydraulische Druckunterschied von dem Kapillarlumen zu der (den) Hohlfaser(n) größer sein wird als 20 mm Hg, wenn das Hohlfasersystem mit dessen externer Drainage und dem Sammelsystem verbunden ist. Lösliche und unlösliche Faktoren, ebenso wie die angiogenen Substanzen, können in das Gebiet eingeführt werden, das die Hohlfasern umgibt, um die Kapillardichte beizubehalten und zu erhöhen.
  • Geeignete angiogene Faktoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten: FGF-5, FGF-1, FGF-2, Hepatozytenwachstumsfaktor, vaskulären Endothelialwachstumsfaktor usw. Geeignete unlösliche Faktoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten: komplexe extrazelluläre Matrizes, so wie Collagengele oder MatrigelTM, oder auf gereinigte extrazelluläre Matrixmoleküle, einschließlich Laminin, Fibronectin, Collagen Typ I und IV usw.
  • Geeignete lösliche Faktoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten. Wachstumspromotoren, so wie Fibroblastenwachstumsfaktor, und Wachstumsinhibitoren, einschließlich TGF-β.
  • Die Quelle der oben identifizierten Faktoren kann entweder aus exogener Verabreichung vorliegen über eine subkutane Infusionskontaktstelle mit den internen Abschnitten der Hohlfasern verbunden sein.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden lebende Zellen in das Zentrum einer Hohlfaser, während sie gedreht wird, koextrudiert. Dieses Verfahren wurde beschrieben durch Aebischer et al. in Exp. Neurology 111: 269–275, 1991. Diese Technologie kann ebenso ausgeweitet werden, um eine Schicht von ECM-Komponenten in der inneren Oberfläche der Hohlfaser zu bilden oder um diese kovalent mit ihr zu verbrücken, während sie durch eine spinerette Anordnung gebildet wird. Die Zellen werden dann auf dieses Matrixmateral extrudiert (Aebischer et al., supra; Lin et al., Biomaterials 12: 905, 1992). Daher kann eine Massenbulkproduktion von Hohlfasern, die intern mit ECM-Bestandteilen und Zellen beschichtet sind, erreicht werden. Die Hohlfasern können dann gebündelt, gepottet und an beiden Enden abgeschnitten werden, dann in Plastik mit Einlaß- und Auslaßkontaktstellen umschlossen werden, die mit Kopfstücken verbunden sind, die an jedem der gepotteten Enden der Hohlfaserkassette angebracht sind. Diese Kassette kann dann in einem Bioreaktor für das Wachstum bis zur Konfluenz angeordnet werden.
  • Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion
  • Eine erste Ausführungsform der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine einzelne Hohlfaser, bepflanzt mit lebenden Tubulizellen der Niere auf dessen innerer Oberfläche. 6a illustriert eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion, umfassend eine Hohlfaser, welche intern mit verschiedenen extrazellulären Matrixbestandteilen 23a und einer konfluenten Monoschicht aus Tubulizellen der Niere 23b beschichtet ist. Die Hohlfaser 20 ist an beiden Enden mit Kopfstücken 24 verbunden, von denen das eine die Filtrateinlaßkontaktstelle 25 und das andere die Urinauslaßkontaktstelle 26 enthält.
  • Das Filtrat fließt aus der oben beschriebenen Filtrationsvorrichtung oder jeder anderen Filtrationsvorrichtung, die im Stand der Technik bekannt ist, in das Lumen der Hohlfaser 20 über die Filtrateinlaßkontaktstelle 25 und tritt über die Urinauslaßkontaktstelle 26 aus. Das Fluid wird aus dem Filtrat durch die konfluente Monoschicht 23b, enthaltend Tubulizellen der Niere, die vom Nierentubulistamm abgeleitet sind, oder Progenitorzellen reabsorbiert und wird durch die Hohlfaserwände transportiert und schließlich in die systemische Zirkulation reabsorbiert. Das verbleibende Fluid, welches nicht reabsorbiert wird, fließt aus dem Faserlumen heraus und tritt durch die Urinauslaßkontaktstelle 26 aus.
  • Eine zweite Ausführungsform der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine einzelne Hohlfaser, bepflanzt mit lebenden Tubulizellen der Niere auf deren äußerer Oberfläche. 6b illustriert eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion, umfassend eine Kammer 21, die durch ein Gehäuse 22 definiert ist. Eine einzelne Hohlfaser 20 wird extern mit verschiedenen extrazellulären Matrixbestandteilen 23a und mit einer konfluenten Monoschicht aus Tubulizellen der Niere 23b beschichtet. Die Hohlfaser 20 wird an beiden Enden der Kammer an Kopfstücke 24 angeschlossen, beispielsweise mit Pottingmaterial. Ein Ende der Hohlfaser 20 wird, versiegelt und das andere Ende wird glatt abgeschnitten, so daß der resultierende Zugang zu dem Lumen der Hohlfaser an die Reabsorbatauslaßkontaktstelle 27 angeschlossen werden kann. Das Gehäuse ist weiterhin mit einer Filtrateinlaßkontaktstelle 25 und einer Urinauslaßkontaktstelle 26 ausgerüstet.
  • Das Filtrat fließt aus der Filtrationsvorrichtung in die Filtrateinlaßkontaktstelle 25 und tritt durch die Urinauslaßkontaktstelle 26 aus. Einiges Fluid wird durch die Tubulizellen der Niere aus dem Filtrat innerhalb der konfluenten Monoschicht 23b reabsorbiert und wird in das Lumen der Hohlfaser transportiert. Reabsorbat fließt aus der Faser über die Reabsorbatauslaßkontaktstelle 27 aus und wird in die systemische Zirkulation übergeben.
  • Die Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion ist vorzugsweise aus einer großen Anzahl von Hohlfasern, die zusammengebündelt sind, zusammengesetzt. Diese Anordnung verbessert die Oberfläche, die für das Kapillarinterface mit dem Hohlfaserbündel erhältlich ist. In einer Ausführungsform sind die Hohlfasern intern mit einer konfluenten Monoschicht aus Tubulizellen der Niere beschichtet. Die Fasern sind als Plättchen mit irgendeiner Anzahl von Hohlfasern, ungefähr 100 bis 10.000 Hohlfasern, angeordnet, die irgendeine geeignete Länge haben, so wie von 1–2000 cm in der Länge, und an beiden Enden befestigt sind, z. B. gepottet mit Pottingmaterial. Ein Ende jeder Faser wird an eine Filtrateinlaßkontaktstelle angeschlossen und das gegenüberliegende Ende wird an eine Urinauslaßkontaktstelle angeschlossen.
  • Das Ultrafiltrat fließt in eine Filtrateinlaßkontaktstelle durch die Hohlfasern und über die Tubulizellen der Niere. Fluid, welches durch die Zellen reabsorbiert wird, tritt durch die semipermeablen Fasern in die umgebenden Gewebe aus. Ultrafiltrat, welches nicht absorbiert wird, tritt durch eine Urinauslaßkontaktstelle aus.
  • In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform werden die Hohlfasern extern mit einer konfluenten Monoschicht aus Nierentubulistammzellen beschichtet. Die Hohlfasern werden in einer zylindrischen Anordnung angeordnet mit irgendeiner Anzahl von Hohlfasern mit der gleichen Länge, ungefähr 100 bis 10.000 Hohlfasern, die irgendeine geeignete Länge haben, so wie von 1–2000 cm, und die vorzugsweise beispielsweise mit Pottingmaterial an beiden Enden befestigt sind. Ein Ende jeder Faser wird versiegelt und das andere Ende wird an eine Reabsorbatauslaßkontaktstelle angeschlossen. Die Fasern sind in einer Kammer angeordnet, die durch ein Gehäuse definiert wird, welches eine Blutfiltrateinlaßkontaktstelle und eine Urinauslaßkontaktstelle enthält.
  • Das Ultrafiltrat tritt in die Kammer durch die Blutfiltrateinlaßkontaktstelle ein und läuft über die Fasern, die mit Tubulizellen der Niere beschichtet sind. Fluid, welches durch die Zellen reabsorbiert wird, tritt durch die semipermeablen Fasern in die Lumina der Fasern ein und tritt durch die Reabsorbatauslaßkontaktstelle aus. Ultrafiltrat, welches nicht absorbiert wird, tritt durch die Urinauslaßkontaktstelle aus.
  • Geeignete Materialien, die zur Bildung der semipermeablen Hohlfasern in der Tubulibearbeitungseinheit gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind ähnlich zu denen, die oben für die Filtrationseinheit beschrieben wurden. Proximale Nierentubulireabsorption basiert auf aktivem Na+-Transport, welcher einen geringen Grad an luminaler Hypotonizität entwickelt, was in. einem transepithelialen osmotischen Gradienten resultiert, der die isotonische Fluidreabsorption treibt. Proximale Tubulireabsorption basiert auf einem Membransystem mit einer hochdiffusiven Wasserpermeabilität, niedriger Ultrafiltrationsgeschwindigkeit und einer Porengröße mit einem sehr niedrigen Molekulargewichts-Cutoff. Ein geeignetes Hohlfaserzellkulturmodul ist kommerziell erhältlich von Cellco (Germantown, MD) und umfaßt eine Hohlfaserkassette, die auf Cellulosemembranen mit hochdiffusiver Wasserdurchlässigkeit, geringem Ultrafiltrationskoeffizienten und einer Porengröße mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 4000 Dalton basiert. Alternativ können semipermeable Fasern mit Porengrößen, welche abgesenkt oder erhöht sind im Vergleich zu dieser Filtrationseinheit, verwendet werden. Bevorzugterweise ist die Porengröße (oder der Molekulargewichts-Cutoff) nicht größer als etwa 70.000 g/mol, eine Porengröße, welche verhindert, daß Antikörper in die Fasern eintreten. Der hydraulische Druck innerhalb der semipermeablen Fasern der Tubulibearbeitungseinheit ist geeigneterweise niedriger als der der Filtrationseinheit, vorzugsweise weniger als etwa 10 mm Hg. Der hydraulische Druck innerhalb der Tubulibearbeitungseinheit kann geeigneterweise duch Variieren der Länge, der Größe und des inneren Durchmessers der führenden Leitung gesteuert werden, welche die Filtrationseinheit mit der Tubulibearbeitungseinheit verbindet.
  • Die Hohlfasern, die bei der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion nützlich sind, werden mit Nierentubuliepithelialzellen bepflanzt. Zellen, die innerhalb der Hohlfaser gewachsen sind, sind vor dem Blutfluß durch die Undurchlässigkeit der immunologisch kompetenten Zellen durch die Hohlfaser immungeschützt. Abstoßung der transplantierten Zellen wird daher bei dieser Konfiguration nicht auftreten.
  • Epitheliale Nierenprogenitorzellen werden geeigneterweise erhalten und kultiviert unter Verwendung von konventionellen Techniken, wie beschrieben durch Humes et al., Exp. Cell Res. 201: 8–15; Taub et al., J. Biol. Chem., 254, 11440–11444; Taub et al., J. Cell Physiol., 106, 191–199; Taub et al., J. Supramol. Struct., 11, 207–216; Taub et al., J. Cell Physiol., 105, 369–378; Taub et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 3338–3342; Taub et al., Ann. New York Acad. Sci., 372, 406–421; Taub et al., J. Supramol. Struct., 15, 63–72; und Taub et al., J. Cell Physiol., 114, 153–161.
  • Kultivierte Zellen können auf Wasser und auf lösungsdurchlässige Membranen gepflanzt werden, die mit verschiedenen Biomatrixmaterialien vorbeschichtet sind, so daß die Expression von differenziertem vektorialem Transport, metabolischer und endokrinologischer Funktion erhalten wird. Immunschutz der kultivierten Progenitorzellen wird gleichzeitig mit einer langzeitfunktionalen Leistung erreicht, solange die Bedingungen die Tubulizellenlebensfähigkeit unterstützen. Kultivierte Zellen, die auf dem Inneren der Hohlfasern gepflanzt sind, werden durch die Hohlfaser immungeschützt. Kultivierte Zellen, die auf dem Äußeren der Hohlfaser gepflanzt sind, werden durch das Gehäuse der Vorrichtung immungeschützt. 7 ist eine lichtmikroskopische Aufnahme einer illustrativen Polysulfonhohlfaser, beschichtet mit einer Schicht aus Laminin und Nierenepithelialzellen entlang deren innerer Oberfläche. Bei dieser Figur wird die Faser mit der äußeren Kontur der Hohlfaser gesehen, die durch eine irreguläre Linie am oberen Ende identifiziert ist. Die Collagenschicht ist unten und färbt sich dunkler mit Fibrillarscheinung. Eine Untersuchung mit größerer Auflösungskraft demonstriert eine glatte Schicht aus Nierenepithelialzellen mit differenzierter Morphologie entlang des gesamten Umfangs der inneren Oberfläche der Hohlfaser.
  • Proximale Nierentubuliprogenitorzellen können induziert werden, um sich morphogen zu differenzieren, indem sie in homonal definierten Kulturen kultiviert werden, wie durch Humes und Cieslinski in Exp. Cell Res. 201: 8–15, 1992 beschrieben. Neue Daten zeigen, daß die Differenzierung von proximalen Nierentubuliprogenitorzellen mit EGF und RA in dreidimensionalen Collagengelen induziert werden kann.
  • Eine homonal definierte Nierenzellkultur wird behandelt mit epidermalem Wachstumsfaktor und all-trans-Retinolsäure. Diese Behandlung überführt eine konfluente Monoschicht aus proximalen Tubulizellen der Niere in Epithelialzellaggregate, die Lumen enthalten, an die Zellen mit einem differenzierten polarisierten Epithelialzellphänotyp angrenzen. Wenn die ECM-Schicht entweder abwesend oder nicht gut entwickelt ist, wird der transformierende Wachstumsfaktor β1 geeigneterweise zu der Kultur hinzugefügt, um die Tubulogenese zu unterstützen.
  • Wenn erforderlich, wird der transformierende Wachstumsfaktor β1 geeigneterweise verabreicht, um eine Konzentration von 0,1 ng/ml bis 1 mg/ml, epidermalen Wachstumsfaktor in einem Konzentrationsbereich von 0,1 nM bis 1 μM und all-trans-Retinolsäure in einem Konzentrationsbereich von 0,01 μM bis 100 μM zu erreichen.
  • Lösliche Faktoren können optional zu der Nierentubulistammzellkultur hinzugefügt werden. Bevorzugte lösliche Faktoren beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf fötales Kälberserum, Prostaglandine, Hydrocortisontriiodthyronin, Selen, Fibroblastenwachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor α, Hepatozytenwachstumsfaktor und Kombinationen daraus. Diese löslichen Faktoren werden vorzugsweise in den folgenden Konzentrationen hinzugefügt: fötales Kälberserum, 3–25% (v/v) des Wachstumsmediums; Prostaglandin E1, 1 bis 100 ng/ml; Triiodthyronin, 0,1 nM bis 1 μM; Selen, 0,001 bis 1,00 μM; Cholesterin, 1,0 nM bis 0,10 μM; Transferrin, 1 bis 50 μg/ml; transformierender Wachstumsfaktor α, 0,1 nM bis 1 μM; Inulin, 1 bis 50 μg/ml; Hydrocortison, 1 nm bis 1 μM; und Hepatozytenwachstumsfaktor, 0,1 ng/ml bis 100 ng/ml.
  • Unlösliche Faktoren können zusätzlich zu der Nierentubulistammzellkultur hinzugefügt werden. Diese unlöslichen Faktoren beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf eine Vielzahl von extrazellulären Matrixmolekülen wie Typ I-Collagen, Typ IV-Collagen, Laminin, Proteoglykane, Fibronectin und Kombinationen daraus. Diese unlöslichen Faktoren werden vorzugsweise in folgenden Konzentrationen hinzugegeben: Collagen, Typ I, 1 bis 5 mg/ml; Collagen, Typ IV, 0,01 bis 5 mg/ml; Laminin; 10 bis 1000 μg/ml; Heparinsulfat, 10 bis 1000 μg/ml; und Heparin, 10 bis 1000 μg/ml.
  • Geeignete Filtrationsgeschwindigkeiten in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können variiert werden abhängig von dem Bedarf des Patienten, befinden sich jedoch typischerweise zwischen 10 bis 15 ml/min Blut durch die Filtrations- und Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktionen im adulten Menschen. Diese Filtrationsgeschwindigkeit ist kompatibel mit dem Leben, wie gezeigt durch klinische Stadien der Niereninsuffizienz ohne dialytische Unterstützung. Diese Geschwindigkeit bildet 14–15 l Filtrat pro Tag. Die Reabsorptionsgeschwindigkeit der Tubulivorrichtung beträgt wenigstens 50% der Menge, welche präsentiert wird. Diese Geschwindigkeit kann angepaßt werden durch Erhöhen der Anzahl oder der Länge der Hohlfasern in der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion.
  • Die Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion wird geeigneterweise entweder subkutan oder innerhalb der peritonealen Höhle implantiert.
  • Bioartifizielle Niere
  • Vier Ausführungsformen der bioartifiziellen Niere gemäß der vorliegenden Erfindung sind in 8a–d abgebildet und umfassen eine wie oben beschriebene Filtrationsvorrichtung, gefolgt in Serie durch eine wie oben beschriebene Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion. Alternativ umfaßt die bioartifizielle Niere eine konventionelle Filtrationsvorrichtung, so wie eine Vorrichtung, welche eine konbinuierliche arteriovenöse Hämofiltration (CAVH) zur Verfügung stellt und welche auf konvektivem Transport basiert (Salem und Mujais, supra; Macias et al., Amer. J. Kidney Dis. XVIII: 451–458, 1991; "Clinical Dialysis", 1. Ausg., Appleton-Century-Crofts, East Norwalk, CT, 1984; "Dialysis Therapy", 2. Ausg. Hanley & Belfus, Inc., Pennsylvania, 1993), gefolgt in Serie durch eine Einheit mit Tubulifunktion, wie oben beschrieben. Das Filtrat, das in der Filtrationsvorrichtung gebildet wird, wird direkt in die Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion fließen, wo biologisch sinnvolle metabolische Substrate und anorganische Salze aus dem Filtrat entfernt und in die systemische Zirkulation reabsorbiert werden. Nachdem das Filtrat aus der Filtrationsvorrichtung durch die Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion prozessiert worden ist, kann das finale Fluid (Urin) aus der Tubulivorrichtung mit einer Schlauchleitung gesammelt werden, welche in den Harnleiter des Patienten eingefügt ist, um einen natürlichen Verlauf für die Urinexkretion aus dem Individuum beizubehalten. Alternativ kann Urin durch einen Katheter gesammelt werden.
  • Eine fünfte Ausführungsform der bioartifiziellen Niere gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 8e dargestellt und umfaßt eine einzelne Vorrichtung, zusammengesetzt aus einer Vielzahl von zwei Arten von semipermeablen Hohlfasern, die in einer zylindrischen Anordnung zusammengebündelt sind. Die Hohlfasern sind in einer Kammer 21 angeordnet, die durch das Gehäuse 22 definiert ist. Die Hohlfasern werden genau gegen die Kopfteile 24a und 24b unter Verwendung von bekannten Techniken eingepaßt, beispielsweise duch Potten von beiden Enden der Fasern mit Pottingmaterial. Die Perfusionseinlaßkontaktstelle 25 und die Perfusionsauslaßkontaktstelle 27 werden mit den Kopfteilen an gegenüberliegenden Enden verbunden. Das Gehäuse ist weiterhin mit einer Urinauslaßkontaktstelle 26 ausgestattet.
  • Der erste Typ der Hohlfaser 10 ist intern mit verschiedenen extrazellulären Matrixbestandteilen 13a und mit einer konfluenten Monoschicht aus Endothelial- und/oder Epithelialzellen 13b (vorzugsweise werden Endothelialzellen verwendet) beschichtet. Beide Enden dieser Art Hohlfaser werden flach abgeschnitten, um Zugang zu den Innenräumen der Hohlfaser zu erhalten. Ein Ende wird mit einer Perfusionseinlaßkontaktstelle 25 verbunden und das gegenüberliegende Ende wird, mit einer Perfusionsauslaßkontaktstelle 27 verbunden.
  • Die zweite Art Hohlfaser 28 wird extern mit verschiedenen extrazellulären Matrixbestandteilen 23a und einer konfluenten Monoschicht aus Tubulizellen der Niere 23b beschichtet. Ein Ende dieser Art Hohlfaser wird versiegelt 29, während das gegenüberliegende Ende glatt abgeschnitten wird, um Zugang zu den internen Räumen der Hohlfaser zu erhalten. Der resultierende Zugang zu dem Lumen der Hohlfaser wird mit der Perfusionsauslaßkontaktstelle 27 verbunden.
  • Blut, das nicht wünschenswerte Verunreinigungen enthält, so wie metabolische Abfallstoffe, welche aus dem arteriellen Lumen des Patienten ausfließen, tritt durch die erste Art von Hohlfasern in die Perfusionseinlaßkontaktstelle ein und tritt durch die Perfusionsauslaßkontaktstelle aus, wonach es in den vaskulären venösen Fluß reabsorbiert wird. Während Blut durch die erste Art von Faser hindurchtritt, diffundiert das Filtrat durch die konfluente Monoschicht und die Hohlfasern und sammelt sich in der Sammelkammer. Das Filtrat kann dann aktiv durch die Tubulizellen der Niere reabsorbiert werden, die auf der Oberfläche der zweiten Art von Hohlfasern angeordnet sind, welche sich in Kontakt mit dem Filtrat in der Kammer befinden. Filtrat, welches nicht reabsorbiert wird, tritt aus der Sammelkammer durch die Urinauslaßkontaktstelle aus.
  • Die Filtrationsvorrichtung wird geeigneterweise entweder subkutan oder in der Nähe der peritonealen Höhle implantiert. Das Filtrat, das durch diese Vorrichtung gebildet wird, fließt direkt in die Tubulivorrichtung, welche ebenso geeigneterweise entweder subkutan oder innerhalb der peritonealen Höhle implantiert wird. Vorzügsweise werden beide Vorrichtungen peritoneal implantiert. Diese Anordnung erlaubt es, daß das Filtrat in die internen Räume des Hohlfasernetzwerks eintritt, welche mit konfluenten Monoschichten aus Tubulizellen der Niere beschichtet sind. Das Reabsorbat tritt in die peritoneale Höhle aus und wird in die systemische Zirkulation reabsorbiert. Nachdem das finale Fluid, d. h. Urin, durch die Tubulivorrichtung prozessiert worden ist, wird es durch eine Schlauchleitung gesammelt, die in den Harnleiter eingeführt ist, um einen natürlichen Verlauf der Urinexkretion aus dem Individuum beizubehalten.
  • Nachdem diese Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann weiteres Verständnis durch Bezugnahme auf gewisse spezifische Beispiele erhalten werden, welche hiernach lediglich zum Zwecke der Illustration angegeben sind und welche nicht dafür vorgesehen sind, sich limitierend auszuwirken, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Tubulogenese aus isolierten Einzelzellen einer adulaten Säugetierniere
  • Zellkultur
  • Adulte proximale Tubulizellen der Kaninchenniere wurden als Primärkultur mit Techniken wachsen gelassen, die voher durch dieses Labor (7, 8) berichtet worden sind. Die Zellen wurden in 35 mm Corning-Kulturplatten mit serumfreiem hormonal definiertem Dulbeccomodifiziertem Eagle (DME) Ham's F-12-Medium (1 : 1, v/v), enthaltend L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin, Hydrocortison, Inulin, Transferrin, wachsen gelassen. Sobald sie konfluent waren, wurden die Kulturen für die Passage bearbeitet. Die Kulturen wurden mit 1,0 μM all-trans-Retinolsäure (erhältlich von Sigma) und 10 nM rekombinantem humanem epidermalem Wachstumsfaktor (erhältlich von Amgen) 24 Stunden vor der Passage behandelt. Die Zellplatten wurden mit Trypsin 4 Minuten bei 37°C behandelt, gefolgt durch 0,1% Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Die Zellen wurden dann entfernt und mit Zentrifugation pelletiert, zu welcher Zeit verschiedene Mengen Medium hinzugefügt wurden, um die entsprechende Verdünnung der Zellen herzustellen. Sobald sie passiert waren, wurden die Zellen in einem Medium wachsen gelassen, das epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und Retinolsäure (RA) bis zur Konfluenz enthielt. Auf diese Art und Weise konnten Zellen zu jedem Zeitpunkt nach der Passage entweder zum Dispergieren und zur Suspension in dreidimensionale Collagengele oder für die fortwährende Passage der Zellen geerntet werden.
  • Suspension der Zellen in Collagen
  • Collagen Typ I (VITROGEN 100TM, erhältlich von Celltrix Labs) wurde mit 10x phosphatgepuffertem Salin vermischt und der pH wurde auf 7,4 angepaßt. Zellen (5 × 105) wurden in 250 ×l Medium suspendiert und uniform in 750 ×l Collagen vor dem Gelieren dispergiert. Ein Aliquot der resultierenden Mischung (250 ×l) wurde in einem gekühlten Anocell-10-Zellkulturinsert angeordnet und bei 37°C ohne CO2 45–60 Minuten lang abstehen gelassen. Nach der Gelbildung wurde entsprechendes Kulturmedium hinzugefügt und die Zellen wurden 7–21 Tage lang kultiviert. Beste Ergebnisse traten bei der Verwendung von 1,8 mg Collagen/ml auf.
  • Rekombinanter Retrovirus
  • Ein hoher Titer, replikationsdefekter Retrovirus, wurde so konstruiert, daß er für das E. Coli lac-Z-Gen (β -Galactosidase) codiert, was dadurch einen bequemen Assay für den Provirus zu dessen Herkunftsanalyse zur Verfügung stellt. Eine detaillierte Beschreibung der Packaging-Zellinie AZ-5. Kurz wurde der retrovirale Vektor p-mLacZ in die ekotropische retrovirale Packaging-Zellinie ψ-cre transfiziert. 25 Klone wurden isoliert und hinsichtlich der Herstellung des p-mLacZ-Virus gescreent durch Detektieren der β-Galactosidase-Aktivität mit dem chromogenen Substrat 5-Brom-4-chlor-3-undolyl-β-D-galactosid (X-gal)-Farbe; der höchste Virus-produzierende zelline φ-Crip. Klone, die den amphotropen Virus produzierten, wurden isoliert, und der Klon mit dem höchsten Titer wurde ausgewählt (AZ-5). Der AZ-5-Virus hat einen Titer von 106 koloniebildenden Einheiten (CFUs)/ml und ist frei von replikationskompetentem Virus, wie bestimmt durch einen sensitiven Provirus-Rescueassay. Um den Virus zu ernten, wurden die AZ-5-Ze11en in 10 cm-Platten (5 × 105 Zellen pro Platte) ausgesät, in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum und Penicillin/Streptomycin. 24 Stunden nach dem Aussäen wurde das Medium ausgewechselt und nach weiteren 24 Stunden wurde der Virus-enthaltende Überstand geerntet und durch einen 0,45 μ-Filter filtriert. Proximale Tubulizellen der Niere wurden hergestellt nach Wachstum in Primärkultur und 2 oder 3 seriellen Passagen. Unter subkonfluenten Bedingungen wurden Tubulizellen der Niere unverdünnten oder verdünnten Stammlösungen mit rekombinantem Retrovirus 24 Stunden lang in der Gegenwart von Polybren (8 μg/ml) ausgesetzt. Nach der Transduktion wurde das Kulturmedium dann entfernt und mit serumfreiem, hormonal definiertem Kulturmedium, angereichert mit JRA und EGF, ersetzt. Die Zellen wurden dann bis zur Konfluenz wachsen gelassen, aus den Kulturplatten entfernt und in Collagengele 10–14 Tage lang suspendiert.
  • Histologisches Bearbeiten
  • Die Collagengelkulturen wurden in situ mit 2% Glutaraldehyd und Sorenson-Puffer (pH 7,2, 310 mOsm) fixiert. Halbdünne und dünne Abschnitte wurden hergestellt mit Standardtechniken, die durch dieses Labor angegeben sind. Dünne Abschnitte wurden mit einem Zeiss 9-S2-Elektronenmikroskop untersucht. Um Collagengele für das X-gal-Färben zu bearbeiten, wurden Gele in 0,5% Glutaraldehyld 2 Stunden lang fixiert, zweimal mit PBS, enthaltend 1 mM MgCl3, gewaschen und mit einer Lösung, die 1 mg/ml X-gal in PBS enthielt, 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Gele wurden dann zweimal mit PBS 10 Minuten gewaschen, gefolgt durch die Hinzufügung von 2% Glutaraldehyd 24 Stunden lang. Die Gele wurden in Paraffin eingebettet, in dünne Abschnitte geschnitten und für die Lichtmikroskopie bearbeitet.
  • Beispiel 2
  • Filtrationsprototyp, basierend auf gezielter Angiogenese
  • Die Filtrationsvorrichtung der ersten Generation wurde konstruiert unter Verwendung des kommerziell erhältlichen AMICONR-Diafilterminifilters, der gegenwärtig für kontinuierliche arteriovenöse Hämofiltration in klinischer Umgebung verwendet wird. Die Vorrichtung besteht aus Polysulfonfasern, die hohe Ultrafiltrationskoeffizienten besitzen (Siebkoeffizienten für Natrium, Vitamin B-12 und Inulin, größer als 0,95, mit einem Molekulargewichts-Cutoff von ungefähr 50.000 Molekulargewicht, so daß der Siebkoeffizient für Albumin ungefähr 0,2 beträgt). Die Polysulfonhohlfasern werden in Silikongummi des medizinischen Grades gepottet und in einem Acrylgehäuse beinhaltet, mit dem verschiedene Kontaktstellen verbunden sind.
  • Die Filtrationsvorrichtung wurde auf die folgende Art und Weise konstruiert. Das Plastikgehäuse der Kassette wurde entfernt und die Hohlfasern wurden umschlossen mit Collagen Typ I in einer Form, hergestellt aus einem kommerziell erhältlichen Gelatinderivat (GELFOAMR), um eine angemessene Kassettenarchitektur und verschiedenen Konzentrationen von angiogenen Wachstumsfaktoren (initial FGF-azidisch und FGF-basisch) beizubehalten. Nach der Sterilisation wurde die Bluteinlaßkontaktstelle abgedeckt, und dadurch wurde ein einzelner Kanal zur Verfügung gestellt, um angiogene Substanzen in und durch die Hohlfasern einzuflößen und um Filtrat, das aus den Neogefäßen transudiert, durch die extrazellulären Matrixbestandteile und in die semipermeablen Hohlfasern kursiert, zu sammeln.
  • Die Filtrationsvorrichtung wurde dann in ein adultes Kaninchen subkutan implantiert. Die einzelne Sammelkontaktstelle wurde mit einer Schlauchleitung verbunden, welche subkutan an eine Infusionskontaktstelle getunnelt wurde, die subkutan angeordnet ist. Tägliche Injektionen von FGF-Base (10 ng/ml) in 5 ml Aliquots wurden über die Infusionskontaktstelle 14 Tage lang verabreicht, zu welcher Zeit die Sammlung aus dem Drainageschlauch initiiert wurde. Zur Sammlung wurde das Tier in einem mild restriktiven Geschirr angeordnet, die Kontaktstelle wurde angezapft und an die Schlauchleitung angeschlossen, welche in ein Sammelgefäß führte. Während 4 Stunden wurden stündliche Fluidsammlungen gesammelt und das Fluid wurde dann hinsichtlich BUN-, Creatinin-, Elektrolyt- und Albumingehalt analysiert, um zu bestimmen, ob dessen Zusammensetzung ähnlich zu dem Ultrafiltrat des Blutes war. Spontaner Fluidfluß trat direkt nach der Anordnung des Sammelkatheters auf. Der Volumenfluß betrug 24 ml über die ersten vier Stunden der Sammlung. Aufgrund des großen Volumenverlustes, der während dieses Zeitintervalls auftritt, wurde die Sammlung nicht weiter fortgeführt, um eine Volumendepletion in diesem Tier zu verhindern. Fluid aus den letzten 60 Minuten des Fluidflusses wurde dann mit den folgenden Ergebnissen analysiert. Die Untersuchung des Elektrolytgehalts der Fluidsammlung der vierten Stunde ergab die folgenden Konzentrationen: Na = 138 mEq/L, K* = 4,0 mEq/L, CL = 107 mEq/L, Gesamt-CO2 = 17 mEq/L, Creatinin 0 1,1 g/dl, BUN 20 mg/dl und Glucose 41 mg/dl. Diese Werte sind identisch mit Plasmaspiegeln der normalen gesunden Kaninchen. Proteinelektrophorese des Fluids zeigte eine größenselektive Barrierefunktion, wie in 9b dargestellt.
  • Ein Vergleich der elektrophoretischen Profile der Proteine in dem gesammelten Fluid und im Serum demonstrierte die Gegenwart von Albumin und Transferrin, Proteine mit 50 bis 75.000 MW, aber keinerlei Proteine mit einem größerem Molekulargewicht waren in dem gesammelten Fluid. Diese Erkenntnis verursachte Sorgen, bis beobachtet wurde, daß die Sterilisation der Polysulfonhohlfasern mit Ethylenoxid die Porengröße der Fasern veränderte, was einen Albuminverlust während des in vitro-Testens erlaubte.
  • Dementsprechend wurde eine Filtrationsvorrichtung der zweiten Generation konstruiert, unter Verwendung von FRESENIUS F80TM-Polysulfonhohlfasern mit hohen hydraulischen Permeabilitätseigenschaften, aber mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 20.000 Dalton. Bei diesem Design wurden die Hohlfasern als eine Platte angeordnet mit ungefähr 100 Hohlfasern, die 10 cm in der Länge maßen und die an beiden Enden gepottet waren (3b). Ein Ende wurde dann glatt abgeschnitten, um Zugang zu den internen Räumen der Hohlfasern zu erlauben. Ein Kopfstück aus Silikonschlauch wurde konstruiert, um genau auf die abgeschnittene Oberfläche der gepotteten Hohlfasern zu passen, eine Ausgangskontaktstelle wurde mit dem Kopfstück verbunden und Plastikschläuche wurden von der Ausgangskontaktstelle mit einer Infusionskontaktstelle verbunden.
  • Wie vorher wurde nach zweiwöchiger FBF-basischer Verabreichung die Sammelkontaktstelle angezapft und ein spontaner Fluidfluß trat auf, und stündliche Fluidproben wurden 5 Stunden lang gesammelt. Die Gesamtfluidsammlung über 4 Stünden betrug 7 ml mit wenigstens 3 Sammlungen zwischen 1 und 1,4 ml pro Stunde. Der Lösungsmittelgehalt des gesammelten Fluids aus der finalen fünften Stunde betrug Na+ = 145 mEq/L, K+ = 4,4 mEq/L, LC = 108 mEq/L, Gesamt-CO2 = 17 mEq/L, Creatinin = 1,0 mg/dl, BUN = 17 mg/dl – Werte, die identisch mit simultanen. Kaninchenserumspiegeln waren. Der Proteingehalt des gesammelten Fluids betrug 200 mg/dl, welches nach Proteinelektrophorese aus lediglich Albumin mit keinem anderen größeren Proteinbestandteil bestand (9c). Von Wichtigkeit ist, daß die simultane Serumgesamtproteinkonzentration dieses Kaninchens 4,9 g/dl mit einem Albumingehalt von 3,4 g/dl betrug.
  • Beispiel 3
  • Gezielte Angiogenese der Filtrationsvorrichtung
  • Verschiedene Iterationen der Filtrationsvorrichtung sind vorstellbar, um deren Effizienz zu verbessern: Erhöhen der Dichte der Neogefäßbildung mit persistenter und kontinuierlicher Produktion von angiogenen Faktoren, verschiedene extrazelluläre Matrixbestandteile, welche die Fähigkeit besitzen, sowohl angiogene Faktoren zu binden als auch eine effizientere angiogene Morphogenese zu fördern, und Implantieren der Vorrichtung in unterschiedlichen Bereichen des Tieres, welche ebenso die Ultrafiltrationseigenschaften der Neogefäße verbessern können, da verschiedene Kapillarnetzwerke innerhalb des Körpers unterschiedliche Ultrafiltrationskoeffizienten aufweisen (die Niere größer als die peritoneale Höhle, größer als die Haut, größer als der Muskel). Vorläufige Arbeit mit der initialen Filtrationsvorrichtungsimplantation zeigte, daß, wenn die exogene Verabreichung von FGF-β zwei Wochen nicht fortgeführt wurde, die spontane Filtration aufgrund der Regression des kapillaren Innenwachstums um die Hohlfaservorrichtung stoppte. Dementsprechend wurde Arbeit dahingehend fortgeführt, daß ein Verfahren entwickelt wurde, um die kontinuierliche gezielte Angiogenese in dem Hohlfasernetzwerk mit Gentransfer zu fördern. Ein amphotroper replikationsdefekter rekombinanter Retrovirus wurde konstruiert unter Verwendung des retroviralen Vektors p-mLacZ, welcher eine gesamtlängencodierende Sequenz für den Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF)-5 und den retroviralen Packaging-Zellinien-φ-Crip enthält. FGF-5 wurde aus verschiedenen Gründen ausgewählt. Nicht wie FGF-azidisch und FGF-basisch hat FGF-5 einen hydrophoben N-Terminus in der vorhergesagten Proteinsequenz, so daß FGF-5 über den klassischen Sekretionsweg ausscheidbar ist. FGF-5 ist ebenso mitogen gegenüber Mesenchymalzellen und hat angiogenes Potential. Dementsprechend wurden unter Verwendung des konstruierten retroviralen Vektors, p-mFGF-5, proximale Tubuliprogenitorzellen der Kaninchenniere mit dem Vektor transduziert und in dreidimensionale Collagengele eingenistet, und es wurde ihnen erlaubt, in definiertem Medium 7 Tage zu wachsen. Nach diesem Zeitintervall wurden die Collagengele auf chorioalontischen Membranen (CAM) von 7–9 Tage alten Hühnchenembryos für zusätzliche 7 Tage transplantiert. Der CAM-Bioassay war ein klassisches System, um die angiogenen Antworten auf verschiedene Verbindungen und Zellen zu untersuchen und zu quantifizieren.
  • Die Transplantation von Tubulizellen der Niere, transduziert mit dem rekombinanten Retrovirus, der das FGF-5-Gen enthält, förderte das Kapillarwachstum in das Collagengel, das die transduzierten Zellen enthielt. Keine Angiogenese wurde in Collagengelen beobachtet, die nichttransduzierte Zellen enthielten.
  • Diese Daten erlaubten nun den Plan, schließlich glomeruläre Epithelialzellen der Kaninchenniere für die Transduktion mit p-mFGF-5 zu verwenden, was durch Aussäen und konfluentes Wachstum der transduzierten Zellen entlang der inneren Oberfläche der Hohlfasern eine kontinuierliche Freisetzung von FGF-5 erlaubte, um ein Kapillarnetzwerk um das Hohlfaserbündel zu fördern und zu erhalten. Glomeruläre Epithelialzellen wurden eher als proximale Tubuliepithelialzellen ausgewählt, da die Richtung des Fluidtransfers dieser prototyischen Vorrichtung vektoriell korrekt sein wird. Normaler, auf vektorieller Filtration basierender, Fluidtransfer in dem Nierenglomerulus tritt in vivo aus dem Kapillarlumen zwischen den Glomerularzellen und in den Sammel (Bowman)-Raum des Glomerulus auf. Die Verwendung von transduzierten glomerulären Epithelialzellen wird diesen physiologischen Weg aus Kapillarlumen, Interstitialraum, Hohlfasermembran, glomerulären Epithelialzellen und Hohlfasersammelraum nachahmen. Dieser Kontaktkomplex zwischen glomerulären Epithelialzellen ist durchlässig genug, um das Auftreten eines Fluidtransfers mit hoher hydraulischer Konvektivität zu erlauben. Im Gegensatz dazu würde die Verwendung von proximalen Tubulizellen der Niere mit ihren festen Kontaktkomplexen eine größere Barriere gegenüber dem konvektiven Fluidfluß zur Verfügung stellen und sollte bei dieser Formulierung daher nicht verwendet werden.
  • Beispiel 4
  • Gentransfer von Hirudin in Endothelialzellen des Kaninchens
  • Eine Gesamtlängen-cdNA, die für die Hirudinvariante HV-2 codiert (Johnson et al., Seminars in Thrombosis 15: 302–315, 1989) wurde konstruiert unter Verwendung von dualer asymmetrischer Polymerasekettenreaktion (PCR), in welcher vier benachbarte Oligonukleotide mit 76 bis 89 Basen in der Länge und mit kurzen Überlappungen von 14 Basen als Primer in einer PCR-Mischung verwendet wurden (Sandhu et al., Biotechniques 12: 14–16, 1992). Beim Konstruierten dieser cDNA wurde eine Signalsequenz für den von-Willebrand-Faktor (vWF) in Frame 5' für das Hirudin-Gen mit einbezogen, um eine Sekretion des Hirudins aus den transduzierten Zellen sicherzustellen; Sequenzen, die für das Protein codieren, wurden ausgewählt basierend auf optimaler Codonverwendung in Kaninchen und menschlichen genetischen Sequenzdaten (Wada et al., Nucleic Acids Research 19: 1981–1986, 1992), und entsprechende Restriktionsenzym-Schnittorte 5' und 3' zu der cDNA, die für das vWF-Signalpeptid und Hirudin HV-2 codiert, wurden für die Einfachheit des Transfers in den retroviralen Vektor eingeführt. Für die Sequenz der konstruierten cDNA wurde bestätigt, daß sie die gewünschte Sequenz durch bidirektionales Cloning unter Verwendung der Dideoxykettenterminierungsreaktion ist. Unter Verwendung des retoviralen Vektors pMFG, abgeleitet von dem Moloney murine leukemia-Tumorvirus (Dranoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6460–6464, 1988) und der Packaging-Zellinie (Danos, O. und R. C., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 6460–6464, 1988) φ-Crip wurde ein amphotroper, replikationsdefekter rekombinanter Retrovirus, enthaltend die erforderliche Genseqenz, konstruiert. Vorausgehende Arbeit unter Verwendung eines rekombinanten Retrovirus, konstruiert aus dem Vektor pMFG enthaltend das lac-Z-Gen, welches für β-Galactosidase codiert, und der φ-Crip-Zellinie demonstrierte bei einem nichtverdünnten Titer von 106 CFU/ml eine Transduktionseffizienz von über 30% in aortischen Endothelialzellen des Kaninchens in Gewebekultur, was dadurch suggerierte, daß der Gentransfer der erforderlichen cDNA in Endothelialzellen mit diesem rekombinanten Retrovirus nicht limitierend sein wird. Gegenwärtig werden Experimente ausgeführt, um die Effizienz dieses Hirudingentransfers in Endothelialzellen unter Verwendung dieses Retrovirus und die Wirksamkeit des Gentransfers durch Messung der ausgeschiedenen Hirudinaktivität in den Überstand der Gewebekultur zu beurteilen.
  • Beispiel 5
  • Filtrationsprototyp basierend auf Endothelialzellschichtung
  • Endothelialzellkulturen können mit gut etablierter Methodologie adaptiert werden. Clusterplattenvertiefungen mit 24 Vertiefungen, beschichtet mit Matrigel, können verwendet werden. Das Kaninchen kann anästhetisiert werden und dessen abdominale Höhle kann geöffnet werden. Eine Länge von 2 cm der abdominalen Aorta wird aus dem Kaninchen entfernt und dreimal in PBS, enthaltend 50 Einheiten/md Heparin, gewaschen. Das Gefäß kann vorsichtig bei Entfernung des Periadventitialfetts und des Bindegewebes gereinigt werden. Die Aorta kann dann in Ringe mit weniger als 2 mm Dicke geschnitten werden. Die aortischen Ringe können dann auf der Basis der Vertiefungen auf MatrigelTM angeordnet und mit gerade genügend Medium bedeckt werden, daß sie feucht gehalten werden. Ein geeignetes Medium ist RPMI-1640, 10% fötales Kälberserum und 50 μg/ml Endothelialzellwachstumszusatz (ECGS) mit entsprechenden Penicillin/Streptomycin-Hinzufügungen. Die Endothelialzellen wachsen als Monoschicht auf dem Matrigel, das sich von dem aortischen Ringexplantat erstreckt. Nach 4 bis 8 Tagen kann das Explantat entfernt werden und den Endothelialzellen kann es erlaubt werden, daß sie Konfluenz erreichen. Sobald Konfluenz erreicht ist, können die Endothelialzellen für die Passage durch Behandlung mit 2% Dispase in Calcium-Magnesium-freiem HBSS gesammelt werden. Um die Differenzierungscharakteristika beizubehalten, werden Endothelialzellen für nicht mehr als sechs kontinuierliche Passagen verwendet.
  • Die geernteten Zellen werden dann in eine einzelne Hohlfaser, die in einem Bioreaktor angeordnet ist, gesät. Die Hohlfaser wird entweder eine Polysulfonhohlfaser von AMICON® oder eine Polysulfonhohlfaser von FRESENIUS mit einem Ultrafiltrationskoeffizienten, der größer als 20 ml/h, Torr ist, und mit einem Molekulargewichts-Cutoff von ≤ 60.000 g/mol sein. Adaptationen an den Hohlfaserbioreaktor, der vorher detailliert ausgeführt wurde, werden erreicht durch Hinzufügen einer anpaßbaren Widerstandsklammer entlang der Perfusionsausgangsschlauchleitung, um den hydraulischen Druck innerhalb der Hohlfaser zu erhöhen. Proximal mit dieser anpaßbaren Klammer wird ein Druckmeßgerät zur Messung des hydraulischen Drucks innerhalb des Systems verbunden sein. Vorhergehende Berichte über das Bepflanzen von Hohlfasern mit permanenten Epithelialzellinien haben Konfluenz gezeigt, die innerhalb einiger Tage nach dem Einpflanzen erreicht wurde. Sobald Konfluenz erreicht wird, kann die hydraulische Permeabilität und der Albuminausschluß aus dem Filtrat mit radioaktiv markiertem Inulin und radioaktiv markiertem Albumin gemessen werden.
  • Bei konstanten Flußraten und mit Anpassungen der Widerstandsklammer wird ein inkrementeller Anstieg des Drucks innerhalb der Hohlfaser geplant. Nach jeder Anpassung wird in regelmäßigen Zeitabständen die gesammelte Inulin- und Albuminbewegung aus dem intraluminalen Abschnitt zum Badabschnitt gemessen, um die Durchlässigkeitseigenschaften der Endothelialzellbeschichteten Hohlfaser zu untersuchen. Sobald die Vorrichtung funktionell ist, werden geplante Experimente den Einfluß der verschiedenen ECM-Bestandteile auf die Permeabilitätsfunktion der Endothelialmonoschicht überprüfen. Die interne Oberfläche der Hohlfaser wird mit verschiedenen Typen von extrazellulären Matrixbestandteilen vorbeschichtet, einschließlich Collagen Typ I, Collagen Typ IV, Laminin und Matrigel. Jeder dieser Konfigurationen unter Verwendung von unterschiedlichen Matrixbestandteilen wird dann hinsichtlich dessen Inulin- und Albuminaufreinigungsfunktion unter Verwendung des Einzelhohlfaserbioreaktors getestet. Auf diese Art und Weise kann der Einfluß von verschiedenen extrazellulären Matrixbestandteilen auf die hydraulische Permeabilität, wie überpüft durch Inulinaufreinigung, und Albuminauschluß gemessen werden. Sowohl Scanning als auch Transmissionselektronenmikroskopie werden ebenso ausgeführt werden, um die Gegenwart von Fenestrationen entlang der einschichtigen Endothelialzellbeschichtung zu überprüfen.
  • Zusätzlich wird eine Filtrationsvorrichtung hergestellt, in welcher eine große Anzahl von gebündelten Hohlfasern, jede enthaltend konfluente Monoschichten aus Endothelialzellen, die auf dem entsprechenden extrazellulären Matrixmaterial gewachsen sind, um eine Vorrichtung zu etablieren, die groß genug ist für in vivo-Testen durch Verbinden der Filtrationsvorrichtung mit einem arteriovenösen System mit hohen Flußcharakteristika, um die Wirksamkeit der Filtrationsfunktion unter systemischem Druck zu bestimmen. Auch kann das Testen auf Blutgerinnung innerhalb dieser in vivo- ode ex vivo-Filtrationssysteme dann erreicht werden.
  • Beispiel 6
  • Prototyp für eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion
  • Die Entwicklung einer Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion hängt ab von der Zellkulturmethodologie für proximale Nierentubuliprogenitorzellen und der Erhältlichkeit, wie oben detailliert ausgeführt, eines Einzelhohlfaserbioreaktors für konfluentes Wachstum dieser Zellen entlang der inneren Oberfläche der Hohlfaser für funktionelles Testen des Transports. Die Methodologie, um wachstumsgemäß proximale Nierentubuliprogenitorzellen für adultes Säugetiergewebe auszuwählen, ist ausgeführt in WO 93/17690. Adulte proximale Tubulizellen der Niere werden in Primärkultur wachsen gelassen (Garlick et al., J. Invest. Dermatol. 262: F540–F545, 1992). Sobald sie konfluent sind, werden die Kulturen für die Passage durch Behandlung mit 1,0 μM all-trans-Retinolsäure und 10 nM epidermalem Wachstumsfaktor 24 Stunden vor der Passage bearbeitet. Die Zellplatten werden dann mit Trypsin vier Minuten lang bei 37°C behandelt, gefolgt durch 0,1% Sojabohnentrypsin-Inhibitor. Die Zellen werden dann entfernt und durch Zentrifugation pelletiert, zu welcher Zeit verschiedene Mediummengen hinzugefügt werden, um die entsprechende Verdünnung der Zellen herzustellen. Sobald sie passiert sind, werden die Zellen in einem Medium wachsen gelassen, das epidermalen Wachstumsfaktor und Retinolsäure enthält, bis zur Konfluenz. Auf diese Art und Weise können Zellen zu jedem Zeitpunkt nach der Passage entweder für kontinuierliche Passage oder zur Verwendung bei Einpflanzexperimenten geerntet werden. Bisherige Daten haben demonstriert, daß diese selektive Wachstumsbedingung nach seriellen Passagen zu einer angereicherten Population von Progenitorzellen der Niere mit zwei wichtigen Charakteristika führt: Einer Fähigkeit, sich morphogen in Tubulistrukturen zu differenzieren, wenn sie in dreidimensionalen Collagengelen wachsen gelassen werden, und einer hohen Kapazität für Selbsterneuerung mit Zellinienanalyse mit einem rekombinanten Retrovirus.
  • Bei Verwendung dieser Zellen in dem vorher detailliert ausgeführten Einzelhohlfaserbioreaktor wurde eine einzelne Hohlfaser mit verschiedenen Matrixbestandteilen, einschließlich Collagen Typ I, Collagen Typ IV, Laminin und Matrigel, beschichtet und dann mit proximalen Tubuliprogenitorzellen der Niere bepflanzt. Nach 5–7 Tagen des Wachstums in dem Bioreaktor wurde ein konfluentes Wachstum entlang der inneren Oberfläche mit Progenitorzellen der Niere erreicht. Ein in vitro-Testsystem (siehe 10) wurde etabliert durch Verbinden dieser Faser mit einem Harvard-Pumpe auf der Einlaßseite und mit einem Sammelgefaß auf der Auslaßseite. Unter Verwendung dieses Einzelpaßperfusionssystems können verschiedene Transportfunktionscharakteristika der differenzierten proximalen Tubulifunktion unter Verwendung von radioaktiv markierten Substanzen überprüft werden. Natrium- und Wassertransport können mit Inulin überprüft werden. Differenzierte Transportcharakteristika der Glucose und Aminosäurereabsorption können mit radioaktiv markierter Glucose und mit Alanin gemessen werden. Die Freisetzungsfähigkeiten für organische Säure der Monoschicht können mit para-Aminohippurat untersucht werden. Um diese Transportfunktionen zu testen, wird der Einzelpaßperfusionskreislauf mit verschiedenen Flußraten, geringer als 1 ml/h, verwendet werden. Radioaktiv markiertes Inulin mit einer Konzentration von 10 μCi/ml wird als Volumenmarker für Natrium- und Wasserreabsorption durch die durchschwemmte Hohlfaser verwendet werden, analog zu der Technik, die verwendet wurde für die Mikroperfusion von isolierten proximalen Tubulisegmenten, die klassisch in der Nephrologieliteratur beschrieben sind. (Burg et al., Am. J. Physiol. 210(6): 1293–1298, 1966; Tune und Burg, Am. J. Physiol. 221(2): 580–585, 1971; Rabito und Karish, J. Biol. Chem. 258(4): 2543–2547, 1983; Tune et al., Am. J. Physiol. 217(4): 1057–1063, 1969; Burg et al., Am. J. Physiol. 231(2): 627–637, 1976). Der Aminosäuretransport wird unter der Verwendung von radioaktiv markiertem Alanin mit einer Konzentration von 1 μCi/ml und mit einer Gesamtperfusatkonzentration des Alanins von 0,5 mM gemessen werden. Auf ähnliche Art und Weise wird der Glucosetransport unter Verwendung von 1 μCi/ml radioaktiv markierter Glucose bei einer Gesamtperfusatkonzentration von 5 mM Glucose gemessen werden. Die Spezifität des Glucosetransports wird durch die Hinzufügung von Phlorizin überprüft, einem spezifischen Glucosetransporterinhibitor, bei einer Konzentration von 1 × 10–5 M. Die para-Aminohippurat (PAH)-Ausscheidungsgeschwindigkeit der Tubuli kann durch Hinzufügen von 2,4 × 10–5 M PAH mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 200 μCi/mM in das Bad überprüft werden. Die Messung des radioaktiv markierten PAH in dem gesammelten Perfusat wird die Ausscheidung aus dem Bad in das Lumen entlang dieses Perfusionskreislaufs demonstrieren. Unter Verwendung dieses Einzelhohlfaserbioreaktors wird der Einfluß der ECM-Bestandteile auf die selektiven Transportcharakteristika der Monoschicht somit überprüft werden. Sobald das optimale Wachstum und die optimalen Matrixbedingungen für differenzierte Transportfunktion identifiziert ist/sind, können die Transportcharakteristika dieser epithelialen Monoschicht bezüglich deren Korrelation zu Tubulilänge und zu dem Durchmesser der Hohlfaser überprüft werden, um die wirksamste Konstruktion zu bestimmen, die für eine gebündelte Hohlfaservorrichtung für die Funktion in vivo erforderlich ist. Zusätzlich werden große Hohlfaserbündel in eine einzelne Vorrichtung mit einbezogen werden, um eine große wirksame und effiziente Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion zu konstruieren, welche in Serie mit einem der vorher detailliert ausgeführten Filtrationsprototypen angeordnet sein wird.
  • Beispiel 7
  • Funktioneller vektorieller Transport einer Hohlfaser, bepflanzt mit Tubulizellen der Niere
  • Seit eine kommerziell erhältliche Hohlfaserkassette für das Zellwachstum in Bioreaktoren erhältlich ist, wurde die Transportfunktion eher mit Bündeln aus Hohlfasern als mit einzelnen Hohlfasern getestet. In dieser Hinsicht haben kürzlich durchgeführte Experimente den funktionellen vektoriellen Transport einer Hohlfasereinheit, bepflanzt mit Tubulizellen der Niere, demonstriert. Eine Amicon VitafaserTM-Kassette wurde hergestellt durch Beschichten der inneren Oberfläche der Hohlfasern mit Laminin. Tubulizellen der Niere wurden mit einer Dichte von 105/ml in den Intrakapillarraum mit 4 Zellinfusionen gepflanzt, jeweils getrennt durch 30 Minuten und eine 90°-Rotation der Kassette. Die bepflanzte Kassette wurde mit dem Bioreaktorperfusionssystem, das in 3 dargestellt ist, verbunden, in welchem der Extrakapillarraum mit Kulturmedium gefüllt war, enthaltend EGF und RA, und ohne Perfusion abgedeckt, und der Intrakapillarraum wurde mit ähnlichem Medium mit einer Geschwindigkeit von 4–5 ml/h eingeschwemmt. Das Kulturmedium, sowohl intrakapillar als auch extrakapillar, wurde alle 2–3 Tage ausgetauscht, um adäquate metabolische Substrate für das Wachstum beizubehalten. Dieser Perfusionsschritt wurde gewählt, um einen geringfügig höheren intraluminalen hydraulischen Druck innerhalb der Hohlfasern verglichen mit dem extrakapillaren Raum sicherzustellen, um in vivo-Bedingungen zu simulieren und um die Zellanhaftung entlang der inneren Oberfläche der Hohlfasern zu fördern. Nach 7 Tagen des Wachstums wurde das Kulturmedium ausgewechselt, um EGF auszuschließen, um ruhige Bedingungen zu fördern. Für die gegenwärtige Studie wurde das extrakapillare Kulturmedium ausgewechselt, so daß es 4 g/dl Albumin enthält, um so einen Anstieg des onkotischen Drucks auf der Basaloberfläche der Tubulizellen der Niere zur Verfügung zu stellen, während das luminale Perfusionsmedium dessen relative freie Natur des Proteins beibehielt. In dem gerade abgeschlossenen initialen Experiment wurde intraluminale Perfusion in das Hohlfasersystem initiiert, während der Extrakapillarraum mit einem Sammelgefäß verbunden wurde, um Nettovolumenflußmessungen durchführen zu können. Es wurde gefunden, daß Nettovolumenfluß aufgrund der günstigen hydraulischen und onkotischen Druckunterschiede über das Beschichtungsepithelium aus den intratubulären in die extrakapillaren Räume auftritt. Mit einer Perfusionsgeschwindigkeit von 20 ml/h (ungefähr 10–15 nl/min/mm) variierte die Volumensammlung aus dem extrakapillaren Raum über 30 Minuten Sammelzeiten um 15–25% der Perfusionsgeschwindigkeit, was demonstriert, daß dieses Bioreaktorsystem in der Lage ist, den nettoreabsorptiven Fluß aus dem luminalen Raum in den extrakapillaren Raum in einer quantitativen Art und Weise zu messen. Wegen der hohen hydraulischen Konduktivität der Polysulfonfasern ist es gegenwärtig nicht klar, welcher Bestandteil des Reabsorbatflusses in dem transepithelialen hydraulischen Druckunterschieden begründet lag, im Gegensatz zu osmotischen oder onkotischen Druckunterschieden. Um den Einfluß des aktiven Na+-Transports zu bestimmen, welcher die osmotischen Druckunterschiede für Salz- und Wasserfluß über die epitheliale Monoschicht zur Verfügung stellt, wird die Auswirkung von Ouabain (0,1 mM) auf den Netzreabsorbatfluß in diesem System getestet.
  • Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben worden ist, ist es dem Fachmann klar, daß viele Veränderungen und Modifikationen an dieser Erfindung gemacht werden können, ohne von dem Umfang der Erfindung abzuweichen, wie er in den anhängenden Ansprüchen ausgeführt ist.

Claims (17)

  1. Eine bioartifizielle Einheit zur Ausübung der Tubulifunktion, geeignet zum Prozessieren eines Blutfiltrats, umfassend eine semipermeable hohle Faser (20), wobei sich die Faser in einer Fluidkommunikation mit einem Blutfiltrat-Einlaß (25) und einem Urin-Auslaß (26) befindet, durch die Tatsache gekennzeichnet, daß diese hohle Faser intern mit einer Schicht aus Nierentubuluszellen (23b) beschichtet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentubulusvorläuferzellen, Endothelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen, Epithelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen und Kombinationen daraus.
  2. Eine bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion, die geeignet dafür ist, Blutfiltrat zu prozessieren, umfassend eine semipermeable hohle Faser (20) in einer Kammer (21), definiert durch ein Gehäuse (22), wobei ein Ende der Faser versiegelt ist und das gegenüberliegende Ende dieser Faser sich in Fluidkommunikation mit einem Reabsorbat-Auslaß (27) befindet, und wobei das Gehäuse weiterhin ausgestattet ist mit einem Blutfiltrat-Einlaß (27) und einem Urin-Auslaß (26), durch die Tatsache gekennzeichnet, daß die Faser extern mit einer Schicht aus Nierentubuluszellen (23b) beschichtet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentubulusvorläuferzellen, Endothelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen, Epithelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen und Kombinationen daraus.
  3. Die bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die hohle Faser mit einer Zusammensetzung beschichtet ist, die die Nierentubuluszellen und wenigstens einen extrazellulären Matrixbestandteil (23a) umfaßt.
  4. Die bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 3. wobei der extrazelluläre Matrixbestandteil ein Glied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Typ-I-Kollagen, Typ-IV-Kollagen, Laminin, Matrigel, Proteoglykan, Fibronektin und Kombinationen daraus ist.
  5. Die bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Nierentubuluszellen in einer konfluenten Monoschicht angeordnet sind.
  6. Die bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die semipermeable hohle Faser gebildet wird aus einem biokompatiblen Polymer, vorzugsweise aus Polyacrylnitril, Zellulose, Polykarbonat, Polymethylmetacrylat, Polysulphon, Zelluloseazetat, Acrylcopolymer und Ethylenvinylcopolymer.
  7. Die bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1 oder 2, eine Vielzahl der beschichteten semipermeablen hohlen Fasern umfassend.
  8. Die bioartifizielle Tubulus-Verarbeitungsvorrichtung, geeignet zum Prozessieren von Blutfiltrat, umfassend eine Vielzahl semipermeabler hohler Fasern in einer Kammer, definiert durch ein Gehäuse, wobei gegenüberliegende Enden der Fasern mit einem Blutfiltrat-Einlaß und einem Perfusions-Auslaß verbunden sind, und wobei das Gehäuse weiterhin mit einem Urin-Auslaß ausgestattet ist, durch die Tatsache gekennzeichnet, daß die Fasern extern mit einer Schicht Nierentubuluszellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentubulusvorläuferzellen, Endothelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen, Epithelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen und Kombinationen daraus, beschichtet sind.
  9. Eine bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung, umfassend eine Filtrierungsvorrichtung und eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1, wobei die Filtrierungsvorrichtung eine semipermeable hohle Faser in einer Kammer, definiert durch ein Gehäuse, umfaßt, wobei die Faser intern mit einer Schicht Endothelialzellen, Epithelialzellen oder einer Mischung daraus beschichtet ist, wobei die hohle Faser sich in Fluidkommunikation mit einem Blut-Einlaß und -Auslaß befindet, und wobei das Gehäuse mit einem Blutfiltrat-Auslaß ausgestattet ist, wobei sich die Filtrierungsvorrichtung in Fluidkommunikation mit der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion befindet.
  10. Eine bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung, umfassend eine Filtrierungsvorrichtung und eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 2, wobei die Filtrierungsvorrichtung eine semipermeable hohle Faser in einer Kammer, definiert durch ein Gehäuse, umfaßt, wobei die Faser intern mit einer Schicht Endothelialzellen, Epithelialzellen oder einer Kombination daraus beschichtet ist, wobei sich die hohle Faser in Fluidkommunikation mit einem Blut-Einlaß und -Auslaß befindet, und wobei das Gehäuse mit einem Blutfiltrat-Auslaß ausgestattet ist, wobei sich die Filtrierungsvorrichtung in Fluidkommunikation mit der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion befindet.
  11. Die bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei die Filtrierungsvorrichtung und die Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion eine Vielzahl der semipermeablen hohlen Fasern umfaßt.
  12. Eine bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung, umfassend eine Filtrierungsvorrichtung und eine Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Filtrierungsvorrichtung eine semipermeable hohle Faser, eingebettet in einer extrazellulären Matrix, umfaßt, wobei sich die Faser in Fluidkommunikation mit einem Blutfiltrat-Auslaß befindet und an einem Ende versiegelt ist, und wobei die Filtrierungsvorrichtung sich in Fluidkommunikation mit der Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion befindet.
  13. Die bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung gemäß Anspruch 12, wobei die Filtrierungsvorrichtung und die Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion eine Vielzahl der semipermeablen hohlen Fasern umfassen.
  14. Eine bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung, umfassend in Fluidkommunikation miteinander (1) einen Hämodialysator und (2) eine bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 1.
  15. Eine bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung, umfassend in Fluidkommunikation miteinander (1) einen Hämodialysator und (2) eine bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion gemäß Anspruch 2.
  16. Eine bioartifizielle Vorrichtung zur Ausübung der Tubulifunktion, geeignet zum Prozessieren von Blutfiltrat, umfassend wenigstens eine semipermeable Membran in einer Kammer, definiert durch ein Gehäuse enthaltend: (1) einen Filtrat-Einlaß, der einen passierten Blutfiltrat-Fluß einspeist und sich in Fluidkommunikation mit der einen Oberfläche der Membran befindet und (ii) einen Urin-Auslaß zum Empfangen des Blutfiltrats, welches über die eine Oberfläche der Membran geflossen ist, und (iii) einen Reabsorbat-Auslaß in Fluidkommunikation mit Oberfläche gegenüber der zellbeschichteten Oberfläche der Membran, durch die Tatsache gekennzeichnet, daß die semipermeable Membran auf einer Oberfläche mit einer Schicht Nierentubuluszellen beschichtet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentubulusvorläuferzellen, Endothelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen, Epithelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen und Kombinationen daraus.
  17. Eine bioartifizielle Blutaufreinigungsvorrichtung, umfassend eine Vorrichtung, die eine Vielzahl der semipermeablen hohlen Fasern des ersten und zweiten Typs in einer Kammer umfaßt, definiert durch ein Gehäuse (22) mit einem Urin-Auslaß (26), durch die Tatsache gekennzeichnet, daß die erste Art dieser Fasern eine Filtrierungsfunktion zur Verfügung stellt und intern mit Endothelialzellen (13b) beschichtet ist und in Fluidkommunikation mit einem Blut-Einlaß (25) und -Auslaß (27) ist und durch die Tatsache, daß die zweite Art dieser Fasern eine Reabsorbtionsfunktion zur Verfügung stellt und extern mit einer Schicht Nierentubuluszellen (23b) beschichtet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nierentubulusvorläuferzellen, Endothelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen, Epithelialzellen, erhalten aus einer Kultur dieser Vorläuferzellen und Kombinationen daraus, und ein Ende versiegelt ist (29) und das gegenüberliegende Ende sich in Fluidkommunikation mit dem Perfusions-Auslaß (27) befindet.
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