DE69433665T2

DE69433665T2 - SPEZIFISCHE FUSIONSNUKLEINSÄUREN UND PROTEINE IN HUMANEN t(2;5)LYMPHOMEN, VERFAHREN ZU IHREM NACHWEIS UND IHRE VERWENDUNG

Info

Publication number: DE69433665T2
Application number: DE69433665T
Authority: DE
Inventors: W. Stephan MORRIS; Thomas A. LOOK
Original assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Current assignee: St Jude Childrens Research Hospital
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-05
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: US6174674B1; EP0731806A4; CA2177957A1; WO1995015331A1; EP0731806A1; US5770421A; DE69433665D1; AU679833B2; JPH09512161A; US5529925A; DE69433665T3; EP0731806B1; AU1511695A; US6451997B1; EP0731806B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Krebs-Diagnose und Therapie. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zum Nachweis und zur Behandlung menschlicher t(2;5) positiver Lymphome.
Großzell-Lymphome umfassen ungefähr ein Viertel aller Non-Hodgkin Lymphome bei Kindern und jungen Erwachsenen. Ungefähr ein Drittel dieser Tumore weisen eine chromosomale t(2;5)(p23;g35) Translokation auf (H. Stein und F. Dallenbach, in Neoplastic Hematophatology, D.M. Knowles, Ed. (Williams & Williams, Baltimore pp. 675–714 (1992)), die darauf schließen lässt, dass die Umlagerung zellulärer Proto-Onkogene auf diesen Chromosomen zur Lymphomagenese beiträgt. Lymphome mit der t(2;5) umfassen gewöhnlich Lymphknoten, Haut, Lunge, Weichgewebe, Knochen und den Gastrointestinal-Trakt und entstehen hauptsächlich aus aktivierten T-Lymphozyten (Y. Kaneko et al., Blood. 73:806 (1989); M.M. Le Beau et al., Leukemia 3:866 (1989); R. Rimokh et al., Br. J. Haematol. 71:31 (1989); D.Y. Mason et al., Br. J. Haematol. 74:161 (1990); M.A. Bitter Am. J. Surg. Phatol. 14:305 (1990); M.E. Kadin, J. Clin. Oncol. 9:533 (1991); J.P. Greer et al., J. Clin. Oncol. 9:539 (1991); V. Vecchi et al., Med. Pediatr. Oncol. 21:402 (1993)). Die malignen Zellen exprimieren IL-2 Rezeptoren und CD30 (Ki-1) Antigen, einen Rezeptor für ein neu beschriebenes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Ligand-Familie (H. Durkop et al., Cell 68:421 (1992); C.A. Smith et al., Cell 73:1349 (1993)). Durch die aktualisierte Kieler-Lymphom-Klassifizierung werden die meisten Tumore mit der t(2;5) als anaplastische Großzell Non-Hodgkin Lymphome klassifiziert (A.G. Stansfeld et al., Lancet 1:292 (1988)).
Chromsomale Abnormalitäten stehen häufig mit malignen Krankheiten in Verbindung. In mehreren Beispielen wurden spezifische chromosomale Translokationen charakterisiert, die Fusionsgene erzeugen, die Proteine mit onkogenen Eigenschaften kodieren (Sawyers et al., Cell 64:337–350 (1991)). Ein spezifische t(2;5) Translokation ist das Kennzeichen der menschlichen anaplastischen Großzell-Non-Hodgkin-Lymphome.
Hierin wird die Klonierung und Sequenzierung der menschlichen Nukleinsäuresequenzen offenbart, die in dem chromosomalen t(2;5)(p23;g35) Translokations-Ereignis umgelagert werden, das sich in menschlichen t(2;5) Lymphomen ereignet. Es wurde gefunden, dass bei der Umlagerung Sequenzen des nucleolaren Phosphoprotein Gens (das NPM Gen) auf Chromosom 5q35 zu denen einer zuvor nicht identifizierten Protein Tyrosinkinase Gens (im Folgenden das ALK Gen) auf Chromosom 2q23 verschiebt. Die Sequenzen des Fusionsgens und Fusionsproteins werden ebenfalls bekannt gegeben (im Folgenden jeweils das NPM/ALK Fusionsgen oder Fusionsprotein).
Unter Verwendung der Sequenzen des identifizierten NPM/ALK Fusionsgens stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung auf die Anwesenheit der Nukleinsäuresequenz in einer Probe bereit, die die NPM/ALK Fusionssequenz beinhaltet und die die Schritte umfasst von:

Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Nukleinsäure-Amplifikationsprimern, wobei der erste Nukleinsäure-Amplifikationsprimer in der Lage ist an die Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die NPM oder eine dazu komplementäre Sequenz kodiert, und ein zweiter Nukleinsäure-Amplifikationsprimer, der in der Lage ist an die Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die NPM oder eine dazu komplementäre Sequenz kodiert;
Amplifizieren der mit Primerunterstützung erhalten Sequenzen in einer Probe, die an die zwei Primer hybridisiert; und
Nachweisen der Anwesenheit der amplifizierten Nukleinsäuresequenz in der Probe, die die NPM/ALK Fusion enthält.

Die vorliegende Erfindung stellt alternative Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe bereit, die die NPM/ALK Fusion beinhaltet und die die Schritte umfasst von:

Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Nukleinsäuresonden, worin die erste Nukleinsäuresonde in der Lage ist an die NPM kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren und eine zweite Nukleinsäuresonde in der Lage ist an die ALK kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; und
Nachweisen der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in der Probe, die sowohl an die erste als auch die zweite Nukleinsäuresonde hybridisiert.

Alternativ kann eine einzelne Nukleinsäuresonde, die die Verbindungsstelle der NPM/ALK Fusion umfasst, anstelle der zwei verschiedenen Sonden verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin alternative Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit der NPM/ALK Fusion bereit, die auf Antikörper-Nachweis-Systemen beruhen. Da insbesondere eine NPM/ALK Fusion in t(2:5) Lymphom-Zellen exprimiert ist, können das Fusionsprotein identifizierende Antikörper zum Nachweis auf die Anwesenheit des NPM/ALK Fusionsproteins verwendet werden. Das NPM/ALK Fusionsprotein kann beispielsweise nachgewiesen werden durch:

Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Antikörpern, worin ein erster Antikörper in der Lage ist an NPM zu binden und ein zweiter Antikörper in der Lage ist an ALK zu binden; und
Nachweisen der Anwesenheit eines Proteins in der Probe, das sowohl an den ersten als auch den zweiten Antikörper bindet.

Außerdem kann aufgrund der Art des bei der NPM/ALK Fusion erzeugten Fusionsproteins ein einzelner selektiv das Fusionsprotein bindender Antikörper erzeugt und zur Identifizierung der NPM/ALK Fusion verwendet werden.
Die Erfindung stellt weiterhin Kits mit Unterteilungen zur Aufnahme von einem oder mehreren Behältern in strenger Eingrenzung bereit, die die bei den vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren benutzten Reagenzien beinhalten.
1 (Tafeln A–C): (A) Southernblot Analyse von DNAs einer karyotypisch normalen, Epstein-Barr-Virus-immortalisierten menschlichen Lymphozyten Zelllinie (Kontrolle, Spuren 1, 4 und 7) und die t(2;5)-positiven Zelllinien SU-DHL-1 (Spuren 2, 5 und 8) und SUP-M2 (Spuren 3, 6 und 9) mit der p16–3/1.35 Sonde. Pfeilspitzen zeigen umgelagerte Restriktionsfragmente an. (B) Northern Blot Analyse der RNAs aus t(2;5)-negativem B-Lymphoid- (NALM-6, Spur 2), T-Lymphoid- (MOLT4), Spur 1; CEM, Spur 3) und Rhabdomyosarcoma- (Rh30, Spur 7) transformierten Zelllinien und den t(2;5)-positiven Linien SU-DHL-1, SUP-M2 und UCONN-L2 (Spuren 4–6) mit einem 5' NPM cDNA Fragment (obere Tafel) und einem 3' Fragment der NPM-ALK cDNA (pS 1.2) (unter Tafel) (Die schwachen, ungefähr 4 kb Banden verdeutlichen in der t(2;5)-positiven Zelllinie RNAs, die mit pS1.2 repräsentierenden Kreuzhybridisierung dieser Probe mit der 28S ribosomalen RNA hybridisiert wurden; derartige Banden sind bei der Hybridisierung von poly (A)+ RNA nicht aufgetreten). Jede Proben-Spur, mit Ausnahme von Rh30 [8 μg poly (A+], wurde mit zwanzig Mikrogramm an Gesamt-RNA beladen. (C) Analyse der RNAs [2 μg poly (A)+ pro Spur; Clonetech, San Diego, CA] aus verschiedenen adulten und fötalen menschlichen Geweben mit einer 3' NPM-ALK cDNA Sonde (pS 1.2). Offene Kreise, 6.5 kb ALK Transkripte; geschlossene Kreise 8.0 kb Transkripte; offene Quadrate, 4.4 kB Transkripte; Pfeilspitzen, 6.0 kb Transkripte. Hybridisierungsergebnisse, die mit einer β-Actin cDNA Sonde erhalten wurden, werden in der unteren Tafel gezeigt. Die mit pS 1.2 hybridisierten Tafeln stellen eine 6-tägige autoradiographische Bestrahlung dar; die β-Actin Hybridisierungen wurden 4 Stunden bestrahlt.
2 (Tafeln A–C): Abgeleitete Aminosäuresequenz von (A) NPM-ALK und (B) dem unmittelbar angrenzenden Anteil von ALK an die Fusions-Verbindung und (C) Homologievergleich der katalytischen Domäne von ALK mit anderen Tyrosinkinasen der Insulinrezeptoren-Unterfamilie. In Tafel A zeigen ganze Kreise mögliche Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen an; gestrichelt-unterstrichene potentielle metallbinde Domänen; Pfeile Grenzen der katalytischen Domäne von ALK; Sternchen konservierte Reste der konservierten ATP Erkennungssequenz und den ATP-Binde-Lysinrest; durchgehend-unterstrichene für Tyrosinkinasen spezifische Konsensussequenzen. In Tafel B zeigt der Pfeil die Lage in normalem ALK an, an der sich die NPM-ALK Fusion ereignet; die Kästchen wahrscheinlich eine Transmembrandomäne umfassende Reste (Hydrophobizität größer als 1,5) an. In Tafel C sind die Aminosäurereste der Tyrosinkinase entlang katalytischer Domänen ausgerichtet (aligned), wobei die Lücken (gaps) durch Striche angezeigt werden. Schattierte Kästchen zeigen zu den Aminosäuren von ALK identische Reste in den verwandten Tyrosinkinasen an. Alle Sequenzen stellen menschliche Proteine dar, mit Ausnahme von Sevenless (Drosophila melanogaster Sevenless) (J.J. Krolewski et al., EMBO J. 10:2911 (1991); H. Toyoshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5404 (1993); D. Martin-Zanca et al., Natrue 319:743 (1986); H. Matsushime et al., Mol. Cell. Biol. 6:3000 (1986); J.M. Cehn at al., Oncogene. 6:257 (1991); K. Basler et al., Cell 54:299 (1988); D.D. Bowtell et al., Genes and Development 2:260 (1988); A. Ullrich et al. EMBO J. 5:2503 (1986); A. Ullrich et al., Nature 313:756 (1985); Y. Ebina et al., Cell 40:747 (1985)).
3 (Tafeln A–C): (A) Southernblot Analyse der NPM-ALK und NPM RNA-PCR Produkte. Gesamt-RNAs (1 μg) von t(2;5)-positiven Zelllinien (SU-DHL-I,SUP-M2 und UCONN-L2; Spuren 3–5) und diagnostische Proben (Pts. 1–4, Spuren 6–9) wurden analysiert; zusätzlich wurden RNAs aus den t(2;5)-negativen B- und T-Lymphoiden Leukämie-Zelllinien (jeweils NALM-6 und CEM; Spuren 1,2) und die Rh30 Rhabdomyosarcom-Zelllinie (Spur 10), die keine Translokation zeigt, allerdings gewöhnliches ALK exprimiert, als Negativkontrollen genauso wie ein Blank ohne RNA (Spur 11) hinzugenommen. (B) Nukleotidsequenz des NPM-ALK RNA-PCR-Produkts. Einfach-unterstrichene Sequenzhomologe (5' Ende) oder Komplementäre (3' Ende) zu den Amplifikationsprimern; doppelt-unterstrichene Sequenzhomologe zu dem als Sonde für die Southernhybridisierung verwendeten Nachweisoligonukleotid; vertikale Linie Fusionsverbindung zwischen NPM und ALK. (C) Schematische Darstellung der Proteine, die durch gewöhnliches NPM, dem NPM-ALK Fusionsgen und gewöhnlichem ALK kodiert werden. Pfeile zeigen die Lage der NPM-ALK Fusionsverbindung und der entsprechenden Lagen in NPM und ALK an; MB Metallbinde Domäne; AC saure Aminosäurecluster; N nukleare Lokalisierungssignale; Tm Lage der wahrscheinlichen Transmembrandomäne von gewöhnlichem ALK. NPM Phosphorylierungsstellen werden ebenso angezeigt (gefüllte Kreise Proteinkinase C; offener Kreis Nukleolar Typ II Kinase; Sternchen cdc2 Kinase). Die zwei Proteinkinase C Phosphorylisierungsstellen in dem NPM Aminoterminus sind nur mögliche Stellen; alle anderen Stellen wurden in-vitro oder in-vivo nachgewiesen (M. Peter et al., Cell 60:791 (1990); P.k. Chan et. Al., Biochem. J. 270:549 (1990); R. Beckmann et al., Eur. J. Biochem. 210:45 (1992)). Der nicht vollständig charakterisierte Anteil von ALK ist innerhalb gestrichelter Linien gezeigt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Identifizierung der Nukleinsäuresequnez, die aufgrund des mit dem menschlichen t(2;5) Lymphom (im Folgenden als NPM/ALK Fusionsgen) assoziierten Translokationsereignisses vorliegt, der Identifizierung eines neuen Protein Tyrosinkinasegens auf dem Chromosom 2p23 (im Folgenden das ALK Gen und Protein), der Identifizierung von mRNA, die eine Fusion zwischen dem Nukleolar en Phosphoprotein Gen (im Folgenden NPM) und dem in t(2;5) Lymphomzellen vorliegenden ALK Gen enthält und der Identifizierung eines offenen Leserasters innerhalb der NPM/ALK Fusions mRNA, die ein neues Fusions-Proteinprodukt kodiert (im Folgenden das NPM/ALK Fusionsprotein).
Auf diesen Beobachtungen beruhend stellt eine erfindungsgemäße Ausführungsform eine isolierte Nukleinsäuresequenz bereit, die ein partielles ALK Protein (Seq. ID. No. 1) kodiert, eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die das NPM/ALK Fusionsprotein (Seq. ID. No. 2) kodiert, ein isoliertes partielles ALK Protein (Seq. ID. No. 3) und ein isoliertes ALK/NPM Fusionsprotein (Seq. ID. No. 4).
Insbesondere wird die partielle Aminosäuresequenz des ALK Proteins in 2b und c (Seq. ID. No. 3) gezeigt, die ALK kodierende partielle Nukleinsäuresequenz wird in Seq. ID. No. 1 gezeigt, die Aminosäuresequenz des NPM/ALK Fusionsproteins wird in 2a (Seq. ID. No. 2) gezeigt, die Aminosäuresequenz der NPM/ALK Fusionsverbindung wird in 2a (Seq. ID. No. 7) gezeigt und die die NPM/ALK Fusionsverbindung kodierende Nukleinsäuresequenz wird in 3b (Seq. ID. No. 4) gezeigt. Ein die ALK cDNA enthaltender Klon wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der ATCC unter der Bezeichnung ATCC 69497 hinterlegt.
Durch das Einfügen irgendeiner erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Vektor, kann ein Fachmann ohne weiteres große Mengen der spezifischen Sequenz herstellen. Alternativ können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in einen Expressionsvektor eingefügt werden, um die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz herzustellen.
Es gibt zahlreiche verfügbare Wirt/Vektor Systeme zur Propagation von Nukleinsäuresequenzen und/oder zur Herstellung von exprimierten Proteinen. Diese beinhalten Plasmid- und virale-Vektoren und prokaryotische und eukaryotische Wirte, wobei sie allerdings nicht auf sie begrenzt sind. Ein Fachmann kann ohne weiteres irgendein Wirt/Vektor System anpassen, das in der Lage ist heterologe DNA zu propagieren oder zu exprimieren, um die erfindungsgemäßen Sequenzen herzustellen oder zu exprimieren.
In Beispiel 1 stellt die vorliegende Erfindung einen Beweis bereit, dass die die NPM/ALK Fusionssequenz enthaltende Nukleinsäuresequenzen in Patienten mit t(2;5) Lymphomen vorliegen. Auf dieser Beobachtung beruhend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für den Assay auf die Anwesenheit von NPM/ALK Fusion enthaltender Nukleinsäuresequenzen in der Probe und dadurch einen Assay für den Nachweis von t(2;5) Lymphomen bereit.
Ein Beispiel der erfindungsgemäßen Assayverfahren zur Verwendung beim Nachweis von NPM/ALK Fusionen beruhen auf der bevorzugten Amplifizierung von Sequenzen in einer Probe, die die NPM/ALK Fusionsprotein enthaltende Nukleinsäuresequenz kodiert.
Im Allgemeinen wird eine Amplifizierungsreaktion wie die Polymerase Kettenreaktion (PCR) verwendet, um entweder die NPM/ALK Fusionsprotein kodierende mRNA oder die genomische DNA zu amplifizieren, die die t(2;5) Translokation beinhaltet.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung unter Verwendung der Sequenzen des identifizierten Fusionsgen-Verfahrens zur Identifizierung der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe bereit, die die NPM/ALK Fusionssequenz beinhaltet, umfassend die Schritte von:

In Kontaktbringen einer Probe mit zwei Primer zur Nukleinsäureamplifizierung, wobei ein erster Primer zur Nukleinsäureamplifizierung, der in der Lage ist an die NPM kodierende Nukleinsäuresequenz oder an eine dazu komplementäre Sequenz zu hybridisieren und einen zweiten Primer zur Nukleinsäureamplifizierung, der in der Lage ist and die ALK kodierende Nukleinsäuresequenz oder eine dazu komplementäre Sequenz zu hybridisieren;
Amplifizieren der mit Primer versehenen Nukleinsäuresequenz in der Probe; und
Nachweis der Anwesenheit der amplifizierten Nukleinsäuresequenz in der Probe, die die NPM/ALK Fusionssequenz beinhaltet.

Wie hierin verwendet ist ein Amplifizierungsprimer irgendeine kurze DNA Sequenz, die an eine Zielsequenz hybridisieren kann und die Amplifizierung der Zielsequenz ermöglicht, falls sie mit den geeigneten Reagenzien unter der geeigneten Bedingung inkubiert wird. Siehe Beispielsweise Ausubel et al., Current Protocolls in Molecular Biology, Wiley Press (1993). Die Amplifizierung erfordert die Verwendung zweier Primer, die den zu amplifizierenden Bereich flankieren. Ein Primer hybridisiert an die Zielsequenz, wohingegen der andere Primer an eine zu der Zielsequenz komplementären Sequenz hybridisiert.
In der vorliegenden Erfindung stammt einer der Amplifizierungsprimer von der Sequenz des NPM Gens wohingegen der zweite Primer von der Sequenz des ALK Gens stammt. Irgendein Fragment der NPM oder ALK Gensequenzen kann verwendet werden, um die geeigneten Amplifizierungsprimer gleicher Länge wie die gewählten Fragmente der Sequenz zu erzeugen und in dem NPM/ALK Fusionsgen vorliegen. In Beispiel 1, Seq. ID No. 5 und die reverskomplementäre Sequenz von Seq. ID No. 6 wurden als Primer ausgewählt. Ein Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass andere Fragmente der NPM und ALK Gene als Primer verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten.
Die zu amplifizierende Zielsequenz kann entweder die das NPM/ALK Fusionsprotein kodierende mRNA oder die t(2;5) Translokation enthaltende genomische DNA sein. Ein Fachmann kann ohne weiteres dem Stand der Technik bekannte Techniken einsetzen, um eine das geeignete Zielmolekül enthaltende Probe vorzubereiten.
Wie hierin verwendet ist ein Amplifizierungsprimer in der Lage an eine Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, falls der Primer in der Lage ist Wasserstoffbrücken mit der Zielsequenz unter geeigneter Bedingung zu bilden. Im Allgemeinen ist die bevorzugte Bedingung dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Bedingung hoher Stringenz handelt. Ein Fachmann kann ohne weiteres die geeigneten Bedingungen bestimmen, wobei die folgenden Verfahren anderweitig beschrieben sind (PCR Protocols, Cold Spring HArbor Press (1991), Privitera et al., Blood 79:1781 (1992)).
Wie hierin verwendet bezieht sich Amplifizierung auf ein Verfahren zur Erzeugung mehrfacher Kopien einer Zielsequenz. Verschiedene Verfahren und Enzyme sind zum Erreichen dieses Ziels verfügbar. In der bevorzugten Ausführungsform wird Taq-1 Polymerase bei dem als PCR bekannten Verfahren verwendet, um die Zielsequenz (siehe Beispiel 1) zu amplifizieren. Allerdings kann ein Fachmann die Taq-1 Polymerase durch andere Enzyme ersetzen, soweit wie das Amplifizierungsziel erhalten wird.
Wie hierin verwendet bezieht sich das Nachweisen der amplifizierten Zielsequenz auf irgendein Verfahren, das eingesetzt werden kann, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäuresequenz einer gegebenen Größe oder besonderer Sequenz zu bestimmen. In einer Anwendung wird das Amplifizierungsprodukt einer Agarose- oder Acrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, um die verschiedenen Größen der Nukleinsäuren aufzulösen, die in der amplifizierten Probe vorliegen. Das resultierende Gel kann anschließend visuell unter Verwendung einer Nukleinsäure-Färbung, beispielsweise Ethidiumbromid, analysiert werden, um zu bestimmen, ob ein Nukleinsäure-Molekül von geeigneter Größe in der amplifizierten Probe vorliegt.
Alternativ kann eine nachweisbar markierte Sonde verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Probe die amplifizierte Sequenz (siebe Beispiel 1) enthält. Eine derartige Sonde kann gemäß der vorstehend beschriebenen Elektrophorese verwendet werden, oder kann in einem Dot-Blot oder in einem in situ Assay Verfahren verwendet werden. Die Erzeugung einer auf dem NPM/ALK Fusionsproteins beruhenden Nachweissonde wird nachstehend ausführlich beschrieben.
Zusätzlich zu den Verfahren, die von der Amplifizierung einer Zielsequenz abhängig sind, stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von die NPM/ALK Fusionen enthaltenden Nukleinsäuren bereit, die keine Sequenzamplifizierung benötigen. Insbesondere können die bekannten Verfahren von Southern und Northern Blot Hybridisierung verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Probe die NPM/ALK Nukleinsäure-Fusionssequenz beinhaltet (Sambrook et al., Molecular Cloning ed. Spring Harbor Press (1989)). Im Detail können derartige Fusionen nachgewiesen werden durch:

Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Nukleinsäuresonden, worin eine erst Nukleinsäuresonde in der Lage ist an die Alk kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren und eine zweite Nukleinsäuresonde in der Lage ist an die ALK kodierende Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren; und
Nachweisen der Anwesenheit einer Nukleinsäuresequenz in der Probe, die sowohl an die erste als auch die zweite Nukleinsäuresonde hybridisiert.

Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindungen beinhalten DNA genau so wie RNA Sonden, wobei derartige Sonden unter Verwendung von dem Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden (Sambrook et al., Molecular Cloning ed. Spring Harbor Press (1989)). Ein Fachmann kann derartige bekannte Techniken unter Verwendung der hierin beschriebenen Gensequenzen oder Fragmente davon als Sonden einsetzen.
In einer anderen Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird eine einzelne Nukleinsäuresonde, im Gegensatz zu zwei getrennten Sonden, die den Fusionsbereich der NPM/ALK Fusion umfasst, in dem Southern oder Northern Assay-System eingesetzt.
Eine derartiges Verfahren umfasst insbesondere die Schritte von:

In Kontaktbringen einer Probe mit einer einzelnen Nukleinsäuresonde, worin die Nukleinsäuresonde in der Lage ist and die Fusionsverbindung des NPM/ALK Fusionsgens zu hybridisieren; und
Nachweisen der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen in der Probe, die an die Nukleinsäuresonde hybridisiert.

Alternativ kann eine einzelne Sonde, die entweder auf der ALK, NPM oder NPM/ALK Fusionssequenz beruht, entworfen werden. Eine derartige Sonde wird zu einem Restriktionsenzymsfragment des NPM oder ALK korrespondieren, dessen Größe aufgrund der Umlagerung verändert ist (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, RFLP Analyse).
Irgendeines dem Stand der Technik bekanntes Verfahren kann zum Markieren der Sonden, die in vorstehenden Assay Verfahren verwendet wurden, genutzt werden. In der zwei Sonden Ausführungsform können die erste und die zweite Sonde mit verschiedenen Radioisotopen, Enzymen oder Chromophoren markiert werden. Bei Verwendung der verschien markierten Sonden kann die DNA Sequenz identifiziert werden, die eine oder beide Proben bindet. In einer anderen Anwendung können die erste und die zweite Sonde auf eine derarte Weise markiert werden, dass ein Signal hervorgerufen wird, falls die Sonden an das gleiche Nukleinsäurefragment hybridisieren. Ein derartiges Verfahren ist in U.S. Patent Nummer 4,820,630 beschrieben.
In einer Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird eine der Nukleinsäuresonden auf einem festen Träger immobilisiert. Beispiel von derartigen festen Träger beinhalten, sind allerdings nicht auf sie beschränkt, Kunststoffe wie Polycarbonat, komplexe Carbohydrate wie Agarose und Sepharose und Acrylharze wie Polyacrylamid- und Latex-Körner. Techniken zur Kopplung von Nukleinsäuresonden an derartige feste Träger sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Proben, die in den erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendet werden, beinhalten, sind aber nicht auf sie beschränkt, Zellen oder Gewebe, Protein, Membran, oder Nukleinsäure Extrakte der Zellen oder Gewebe und biologische Fluide wie Blut, Serum und Plasma. Die in dem vorstehend beschriebenen Verfahren verwendete Probe wird beruhend auf dem Assayformat, Beschaffenheit des Nachweisverfahrens und den Geweben, Zellen oder Extrakten, die als Probe verwendet werden, variieren. Verfahren zur Herstellung von Proteinextrakten, Mebranextrakten oder Nukleinsäureextrakten von Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt und können ohne weiters angepasst werden, um eine Probe zu erhalten, die auf das genutzte Verfahren abgestimmt ist.
Ein bevorzugter Proben-Typ, der in der vorliegenden Erfindung genutzt werden kann, stammt von isolierten Lymphomzellen. Solche Zellen können zur Herstellung eines geeigneten Extrakts verwendet werden, oder können bei auf in situ Analyse beruhenden Verfahren verwendet werden. Ein Beispiel einer in situ Analyse bezieht sich auf Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und wird detailliert in Beispiel 1 und von Selleri et al. PNAS 88:887–891 (1991) und Tkachuk et al., Science 250:559–562 (1990) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter Verfahren zum Nachweis von NPM/ALK Fusionen bereit, die von der Fähigkeit eines Antikörpers abhängen selektiv an ein spezifisches Antigen zu binden.
In einer Ausführungsform wird ein NPM/ALK Fusionsprotein durch Verwendung eines Antikörpersets nachgewiesen, wobei ein Set einen Antikörper umfasst, der in der Lage ist an das NPM Protein zu binden und das andere Set einen Antikörper umfasst, der in der Lage ist an das ALK Protein zu binden.
Insbesondere umfassen ein solches Verfahren die Schritte von:

In Kontaktbringen einer Probe mit zwei Antikörpern, wobei ein erster Antikörper in der Lage ist an NPM zu binden und ein zweiter Antikörper in der Lage ist an ALK zu binden; und
Nachweisen der Anwesenheit von Proteinen in der Probe, die sowohl an den ersten als auch den zweiten Antikörper bindet.

Die in den vorstehenden Verfahren verwendeten Antikörper können monoklonale oder polyklonale Antikörper, genauso wie Fragmente dieser Antikörper sein. Im Allgemeinen sind Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern im Stand der Technik gut bekannt (Campbell, A.M., "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology." Elsevier Science Publishers, Amsterdam, the Netherlands (1984); St. Groth et al., J. Immunol. Methods 35:1–21 (1980). Beispielsweise kann ein Antikörper, der in der Lage ist an das NPM oder ALK Protein zu binden, durch Immunsierung eines Tiers mit einem Polypeptid erzeugt werden, dessen Sequenz aus einem Bereich der NPM oder ALK Proteine erhalten wird, die in dem NPM/ALK Fusionsprotein vorliegen.
Irgendein Tier (maus, Hase, etc.) von dem es bekannt ist, dass es Antikörper herstellt, kann zur Herstellung von Antikörper mit der gewünschten Spezifität genützt werden. Verfahren zur Immunisierung sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche Verfahren beinhalten subkutane oder intraperitoneale Injektion des Polypeptids. Ein Fachmann wird erkennen, dass die Menge an für die Immunisierung verwendetem Polypeptid beruhend auf dem zu immunisierenden Tier, der Antigenizität des gewählten Polypeptids und der Injektionsstelle variieren wird. Das Polypeptid kann modifiziert oder in einem Adjuvans verabreicht werden, um die Peptid Antigenizität zu erhöhen. Verfahren zur Erhöhung der Antigenizität eines Polypeptids sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche Verfahren beinhalten das Koppeln des Antigens mit einem heterologen Protein (wie Globulin oder β-Galactosidase) oder durch das Einbeziehen eines Adjuvans während der Immunisierung.
Zur Erzeugung monoklonaler Antikörper werden Milzzellen von dem immunisierten Tier entfernt, mit Myelomazellen, wie SP2/0-Ag14 Myelomazellen, fusioniert und es wird ihnen gestattet zu monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomazellen zu werden.
Irgendeine der zahlreichen im Stand der Technik bekannten Verfahren kann zur Identifizierung der Hybridomazelle verwendet werden, die einen Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften herstellt. Diese beinhalten das Screening der Hybridomas mit einem ELISA Assay, Western Blot Analyse oder Radioimmunoassay (Lutz et al., Exp. Cell Res. 175:109–124 (1988)).
Die gewünschten Antikörper sekretierende Hybridomas werden kloniert und die Klasse und Unterklasse wird durch Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt (Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984)).
Für polyklonale Antikörper wird ein Antisera enthaltender Antikörper von dem immunisierten Tier isoliert und auf die Anwesenheit von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität unter Verwendung eines der vorstehend beschriebenen Verfahrens gescreent.
Bedingungen für die Inkubation eines Antikörpers mit einer Testprobe variieren. Inkubierungsbedinungen eines Antikörpers hängen von dem für den Assay verwendeten Format ab, der verwendeten Nachweisverfahren, der Beschaffenheit der Testprobe und dem Typ und der Beschaffenheit des in dem Assay verwendeten Antikörpers. Ein Fachmann wird erkennen, dass irgendeines der üblich verfügbaren immunologischen Assayformate (wie Radioimmunoassays, Enzymverknüpfte Immunosorbentassays, auf Diffusion basierendem Ouchterlony oder rocket Immunofluoreszenzassays) ohne weiteres angepasst werden kann, um die erfindungsgemäßen Antikörper zu verwenden. Beispiele für solche Assays können in Chard, T. " An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques" Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, G.R. et al., "Techniques in Immunocytochemistry, "Academic Press, Orlando, FL Vol. 1 (1982), Vol. 2 (1983), Vol. 3 (1985); Tijssen, P., "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985) gefunden werden.
In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens wird entweder der anti-NPM Antikörper oder der anti-ALK Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert. Beispiel von solchen festen Trägern beinhalten, sind allerdings nicht auf sie beschränkt, Kunststoffe wie Polycarbonat, komplexe Carbohydrate wie Agarose und Sepharose und Acrylharze wie Polyacrylamid- und Latex-Körner. Techniken zur Kopplung von Antikörpern an derartige feste Träger sind im Stand der Technik gut bekannt (Weir, D.M. et al., "Handbook of Experimental Immunology" eth Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986), Jacoby, W.D. at al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974).
Zusätzlich können einer oder mehrere der in den vorstehend beschriebenen Verfahren verwendeten Antikörper vor der Verwendung nachweisbar markiert werden. Antikörper können durch die Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarker (wie Biotin, Avidin, etc.), enzymatischer Marker (wie Meerrettich Peroxidase, alkalischer Phosphatase, etc.), fluoreszierender Marker (wie FITC oder Rhodamin, etc.), paramagnetischen Atomen, etc. nachweisbar markiert werden. Verfahren zur Durchführung einer derartigen Markierung sind im Stand der Technik gut bekannt, siehe beispielsweise Starnberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970), Bayer, E.A. et al., Meth. EEnzym. 62:308 (1979), Engval, E. et al., immunol. 109:129 (1972), Goding, J. W., J. Immunol. Meth. 13:215 (1976).
In einem anderen Beispiel der vorstehenden Verfahren werden die Antikörper derart markiert, dass ein Signal hervorgerufen wird, falls die beiden Antikörper an das gleiche Molekül binden. Ein solches System wird in U.S. Patent Nummer 4,663,278 beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform eines auf Antikörper beruhendem Nachweissystems, wird ein einzelner Antikörper eingesetzt, der in der Lage ist an ein Epitop zu binden, das an der Fusionsverbindung des NPM/ALK Fusionsproteins vorliegt, das allerdings nicht in den Nicht-Fusion NPM oder ALK Proteinen vorliegt. Die Fusionsverbindung des NPM/ALK Fusionsproteins wird in 3b beschrieben. Ein Fachmann kann ohne weiteres die Aminosäuresequenz der Fusionsverbindung einsetzen, um Peptidantigene zur Verwendung bei den vorstehend beschriebenen Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern zu erzeugen, Die in den vorstehend beschriebenen Assayverfahren verwendeten Werkstoffe (sowohl auf Nukleinsäure als auch auf Protein beruhend) sind für die Herstellung eines Kits ideal geeignet. Beispielswiese stellt die Erdfindung für die auf Amplifizierung beruhenden Nachweissysteme einen Kit mit Unterteilungen zur Aufnahme von einem oder mehreren Behältern in strenger Eingrenzung, bereit welcher umfasst:

(a) einen ersten Behälter, welcher einen oder mehrere erfindungsgemäße Amplifikationsprimer umfasst; und
(b) einen oder mehrere andere Behälter, welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: ein Probenreservoir, Amplifikationsreagenzien, Waschreagenzien und Nachweisreagenzien.

Für auf Antikörper beruhenden Nachweissysteme, stellt die vorliegende Erfindung einen Kit mit Unterteilungen zur Aufnahme von einem oder mehreren Behältern in strenger Eingrenzung, bereit welcher umfasst:

(a) einen ersten Behälter, welcher einen Antikörper umfasst, der in der Lage ist an NPM zu binden;
(b) einen zweiten Behälter, welcher einen Antikörper umfasst, der in der Lage ist an ALK zu binden; und
(c) einen oder mehrere Behälter, welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: Waschreagens und Reagenzien, welche die Anwesenheit von gebundenem Antikörper von dem ersten und zweiten Behälter nachweisen können.

Die Erfindung stellt weiter einen Kit mit Unterteilungen zur Aufnahme von einem oder mehreren Behältern in strenger Eingrenzung bereit, welcher umfasst:

(a) Einen ersten Behälter, der einen Antikörper umfasst der in der Lage ist an ein Epitop zu binden, das in der Fusionsbindung des NPM/ALK Fusionsproteins vorliegt und das in keinem der zwei nicht-Fusionsproteine vorliegt; und
(b) einen oder mehrere andere Behälter, welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: Waschreagens und Reagenzien, welche die Anwesenheit von gebundenem Antikörper von dem ersten Behälter nachweisen können.

Im Detail beinhaltet ein Kit mit Unterteilungen irgendeinen Kit in dem Reagenzien in verschiedenen Behältern enthalten sind. Solche Behälter beinhalten kleine Glasbehälter, Kunststoffbehälter oder Kunststoff- oder Papier-Streifen. Solche Behälter gestatten es effizient Reagenzien von einer Untereilung in eine andere Unterteilung derart zu übertragen, dass die Proben und Reagenzien nicht kreuz-kontaminiert werden und dass die die Agenzien oder Lösungen jeden Behälters auf eine quantitative Art von einem Behälter in einen anderen hinzugefügt werden können. Solche Behälter werden einen Behälter beinhalten, der die Testprobe aufnimmt, einen Behälter der die in dem Assay verwendeten Antikörper oder Sonden enthält, Waschreagenzien (wie Phosphat gepufferte Salzlösung, Tris-Puffer, etc.) enthaltende Behälter und Behälter, die die Reagenzien enthalten, die verwendet werden, um den gebundenen Antikörper oder die hybridisierte Sonde nachzuweisen.
Für Nukleinsäuresonden beinhalten Beispiele der Nachweisreagenzien, sind allerdings nicht auf radioaktivmarkierte Sonden beschränkt, enzymatisch markierte Sonden (wie Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase) und affinitätsmarkierte Sonden (Biotin, Avidin oder Streptavidin). Für Antikörper beinhalten Beispiele der Nachweisreagenzien, sind allerdings nicht auf sie beschränkt, markierte sekundäre Antikörper, oder alternativ falls der erste Antikörper markiert ist, die chromophoren, enzymatischen oder Antikörper bindenden Reagenzien, die in der Lage sind mit dem markierten Antikörper zu reagieren. Ein Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass die Antikörper- und Nukleinsäuresonden, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, ohne weiteres in eines der etablierten Kit-Formate aufgenommen werden kann, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet weiter Verfahren zum selektiven Abtöten von Zellen, die das NPM/ALK Fusionsprotein exprimieren. Eine solches Verfahren umfasst im Detail Das Inkontaktbringen einer das NPM/ALK Fusionsprotein exprimierenden Zelle mit einem Toxin dervatisierten Antikörper, worin der Antikörper in der Lage ist an das Fusionsprotein zu binden allerdings nicht in der Lage ist an das Nicht-fusions- NPM oder ALK Protein zu binden. Beispiele solcher Antikörper sind Toxin derivatisierte Antikörper, die an die Fusionsverbindung der Seq. ID No. 2 binden.
Wie hierin verwendet ist ein Antikörper "Toxin derviatisiert", falls der Antikörper kovalent an einen Toxin-Anteil gebunden ist. Verfahren zur Kopplung von solchen Anteilen an ein Molekül sind im Stand der Technik gut bekannt.
Das Binden eines Toxin derivatisierten Antikörpers an eine Zelle bringt den Toxin-Anteil in nächste Nähe Zelle und fördert dadurch den Zelltot. Durch Bereitstellen eines solchen Antikörpermoleküls für ein Säugetier, kann die das Fusionsprotein exprimierende Zelle bevorzugt abgetötet werden.
Irgendein geeigneter Toxin-Anteil kann eingesetzt werden, allerdings werden bevorzugt solche Toxine eingesetzt wie beispielsweise das Ricin Toxin, das Cholera Toxin, das Diphterie Toxin, radioistopische Toxine, oder Membrankanal-ausbildende Toxine.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können einem Säugetier intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral, lokalisiert oder parenteral verabreicht werden. Falls die Antikörper durch Injektion verabreicht werden, kann die Verabreichung durch kontinuierliche Injektionen, oder durch einfache oder mehrfache Injektionen erfolgen.
Es ist beabsichtigt die erfindungsgemäßen Antikörper dem Empfänger-Säugetier in einer "pharmazeutisch akzeptablen Form" in einer ausreichenden Menge um "therapeutisch wirksam" zu sein bereit zu stellen. Eine Menge ist therapeutisch wirksam, falls die Dosierung, der Verabreichungs-Weg, etc. des Agens ausreichend sind, um bevorzugt einen Anteil der das NPM/ALK Fusionsprotein exprimierenden Zellen abzutöten. Ein Antikörper ist in "pharmazeutisch wirksamer Form", falls seine Verabreichung durch einen Empfänger-Patienten vertragen wird. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß den Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Verbindungen formuliert werden, wobei diese Werkstoffe oder ihre funktionellen Derivative mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägervehikel kombiniert werden. Geeignet Vehikel und ihre Formulierung , einschließlich anderer menschlichen Proteine , beispielsweise menschliches Serum-Albumin werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (16th ed., Osol, A.,Ed., Mack, Easton PA (1980)) beschrieben. Um eine pharmazeutisch akzeptable Verbindung zu bilden, die zur wirksamen Verabreichung geeignet ist, werden solche Verbindungen eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Antikörpers zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger enthalten. Zusätzlich zu den Trägern können die erfindungsgemäßen Antikörper in humanisierter Form zur Verfügung gestellt werden.
Humanisierte Antikörper können beispielsweise durch Ersetzen eines immunogenen Anteils eines Antikörpers durch einen korrespondierenden, allerdings nicht-immunogenen Anteil hergestellt werden (beispielsweise chimäre Antikörper) (Robinson, R.R. et al., Internationales Patent PCT/US86/02269; Akira, K. et al., Europäische Patent Anmeldung 184,187; Taniguchi, M., Europäische Patent Anmeldung 171,496; Morrison, S.L. et al., Europäische Patent Anmeldung 173,494; Neuberger, M.S. et al., PCT Anmeldung WO 86/01533; Cabilly, S. et al., Europäische Patent Anmeldung 125,023; Better, M. et al., Science 240:1041–1043 (1988); Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439–3443 (1987); Liu, A.Y. et al., J. Immunol. 139:3521–3526 (1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218 (1987); Nishimura, Y. et al., Canc. Res. 47:999–1005 (1987); Wood, C.R. et al., Nature 314:446–449 (1985)); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553–1559 (1988).
Beim Bereitstellen eines Toxin dervatisierten Antikörpers für einen Patienten wird die Dosierung des Verabreichungs-Agens in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Alter des Patienten, Gewicht, Größe, Geschlecht, generelle medizinische Verfassung, seitheriger medizinischer Verlauf, etc. variieren. Im Allgemeinen ist es wünschenswert den Empfänger mit einer Dosierung des Antikörpers bereitzustellen, die in dem Bereich von ungefähr 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obgleich eine geringere oder höhere Dosierung verabreicht werden kann.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Verfahren zur Modulierung der Translation der RNA bereit gestellt, die das NPM/ALK Fusionsprotein in der Zelle kodiert. Insbesondere umfassen solche Verfahren das Einbringen einer DNA Sequenz, die in der Lage ist RNA zu transkribieren die komplementär zu der das NPM/ALK Fusionsprotein kodierenden mRNA ist, in eine Zelle. Durch das Einbringen einer solchen DNA Sequenz in eine Zelle wird antisense RNA hergestellt, die hybridisieren und die Translation des NPM/ALK Fusionsproteins blockieren wird. Antisense Klonierung wurde anderweitig detaillierter beschrieben durch Methis et al., Blood 82:1395–1401 (1993); Stein et al., Science 261:1004–1012 (1993); Mirabella et al., Anti-Cancer Drug Design 6:647–661 (1991); Rosenberg et al., Nature 313:703–706 (1985), Preiss et al., Nature 313:27–32(1985), Melton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:144–148 (1985) und Kim et al., Cell 42:129–139 (1985).
Transkription der eingebrachten DNA wird zu vielfachen Kopien der erzeugten antisense RNA führen. Durch Kontrolle des Transkriptionshöhe der antisense RNA und der Gewebe-Spezifität der Expression durch Promotor-Auswahl oder Gen-Targeting der antisense Expressionssequenz kann ein Fachmann die Translationshöhe des NPM/ALK Fusionsproteins in spezifischen Zellen in einem Patienten einstellen.
Die Expressionshöhe des NPM/ALK Fusionsproteins kann ebenso durch die Verwendung von Ribozym-Technologie gesteuert werden (sie beispielsweise Shore et al., Oncogen 8:3183-3188 (1993); Sarver et al., Science 247:1222–1225 (1990); und Cech, T., JAMA 260:303–3034 (1988). Im Detail können unter Verwendung bekannter Verfahren für die NPM/ALK Fusions-mRNA spezifische Ribozyme erzeugt werden und entweder für ein Zelle bereitgestellt werden oder in ihr exprimiert werden. Das Bereitstellen oder die Expression des Ribozyms führt zur Spaltung der die NPM/ALK Fusion kodierenden mRNA.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Verfahren für identifizierende Agenzien bereitgestellt, die in der Lage sind an das hierin beschriebene NPM/ALK Fusionsprotein zu binden.
Im Detail umfassen derartige Verfahren:

(a) In Kontaktbringen eines Agens mit dem NPM/ALK Fusionsprotein, oder einem Fragment davon; und
(b) Bestimmen, ob das Agens an das Fusionsprotein bindet.

Bei der Verwendung dieses Verfahrens kann ein Agens identifiziert werden, das zur Anpassung der Aktivität des NPM/ALK Fusionsproteins verwendet werden kann.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Verfahren für identifizierende Agenzien bereitgestellt, die in der Lage sind an die hierin beschriebene ALK Fusion zu binden.
Im Detail umfassen derartige Verfahren:

(a) In Kontaktbringen eines Agens mit dem ALK Protein, oder einem Fragment davon; und
(b) Bestimmen, ob das Agens an das ALK Protein bindet.

Bei der Verwendung dieses Verfahrens kann ein Agens identifiziert werden, das zur Anpassung der Aktivität des ALK Proteins verwendet werden kann.
Es gibt viele Variationen der vorstehenden Assays, die von einem Fachmann ohne Notwendigkeit zum übertriebenen Experimentieren verwendet werden können, um Agonisten, Antagonisten und Liganden von ALK zu isolieren. Beispielsweise kann ein Antikörper zur Kopräzipitation des ALK gebundenen Agens verwendet werden, um bei der Aufreinigung und Identifizierung zu unterstützen. Zusätzlich kann das ALK Protein, oder ein das aktive Zentrum enthaltendes Fragment verwendet werden, um eine Expressionsbibliothek auf Gene zu screenen, die ALK bindende Proteine kodieren. Weiterhin können Zellen, die ALK auf ihrer Oberfläche exprimieren, als eine Alternative zur Verwendung von isoliertem ALK Protein verwendet werden.
Die Agenzien zum Screening in dem vorstehenden Assay können Peptide, Carbohydrate, oder Vitaminderivate sein, sind allerdings nicht darauf beschränkt. Die Agenzien können unter Verwendung von Protein-Modelling-Techniken zufällig ausgewählt oder gescreent, oder rational ausgewählt oder konstruiert werden. Für das Zufalls-Screening werden Agenzien wie Peptide oder Carbohydrate zufällig ausgewählt und ein Assay auf ihre Fähigkeit an das pseudogene Peptid zu binden wird durchgeführt. Alternativ können Agenzien rational ausgewählt oder konstruiert werden. Wie hierin verwendet ist ein Agens "rational ausgewählt oder konstruiert", falls das Agens beruhend auf der Konfiguration des pseudogenen Peptids ausgewählt ist. Beispielsweise kann ein Fachmann ohne weiteres momentan verfügbare Verfahren zum Erzeugen von Peptiden anpassen, die in der Lage sind an eine spezifische Peptidsequenz zu binden, um rational konstruierte Antipeptid Peptide zu erzeugen, siehe beispielsweise Hurby et al., Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides", in Synthetic Peptides, A User's Guide, W.H. Freeman, NY, pp. 289–307 (1992), und Kaspczak et al., Biochemistry 28:9230–8 (1989).
Unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens stellt die vorliegende Erfindung Agenzien bereit, die in der Lage sind an das NPM/ALK Fusionsprotein zu binden, hergestellt durch die Schritte von:

(a) In Kontaktbringen des Agens mit dem NPM/ALK Fusionsprotein, oder einem Fragment davon; und
(b) Bestimmen, ob das Agens an das NPM/ALK Fusionsprotein bindet.
Unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens stellt die vorliegende Erfindung Agenzien bereit, die in der Lage sind an das ALK Protein zu binden, hergestellt durch die Schritte von:
(c) In Kontaktbringen des Agens mit dem ALK Protein, oder einem Fragment davon; und
(d) Bestimmen, ob das Agens an das ALK Protein bindet.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Erzeugen von transgenen Tieren bereit, die die NPM/ALK Genfusion und/oder das Alk Gen enthalten. Derartige Tiere sind als Tiermodelle für menschliche t(2;5) Lymphome und zum Studieren der ALK-Funktion und Aktivität nützlich.
Im Allgemeinen sind Verfahren zum Erzeugen von transgenen Tieren im Stand der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Grosveld et al., Transgenic Animals, Academic Press Ltd., San Diego, Ca (1992)). Unter Verwendung der hierin für die NPM/ALK Fusion oder das ALK Protein bekannt gegebenen Sequenzen kann ein Fachmann ohne weiteres ein transgenes Tier erzeugen, das das NPM/ALK Fusionsprotein und/oder das ALK Protein enthält und exprimiert. Transgene Tiere (wie Mäuse und Schweine), die die NPM/ALK Fusion exprimieren, können als Tiermodell für das menschliche t(2;5) Lymphom verwendet werden. Transgene Tiere, die das ALK Protein exprimieren, sind für das Studieren der ALK-Funktion und Aktivität nützlich.
Zusätzlich zu transgenen nicht-menschlichen Säugetieren, die geändert wurden, um das menschliche ALK Gen oder das NPM/ALK Fusionsgen zu enthalten, stellt die vorliegende Erfindung weiterhin nicht-menschliche transgene Säugetiere bereit, die geändert wurden, um die Expression des gewöhnlichen nicht-menschlichen Homologen des ALK Gens auszuschalten (knock-out). Insbesondere unter Verwendung von anderweitig beschriebenen Verfahren des Gen-Targeting kann ein Fachmann das erfindungsgemäße ALK Gen einsetzen, um ein homologes Gen in einem nicht-menschlichen Säugetier zu inaktivieren (auszuschalten) (Mansour et al., Nature 336:348–352 (1988)). Das "Ausschalt-" Verfahren wurde erfolgreich bei vielen Säugetier-Systemen eingesetzt, siehe beispielsweise Lui et al., Cell 75:59–72 (1993). Aufgrund des hohen Konservierungsgrads des ALK Gens, kann die menschliche ALK Sequenz in nicht-menschlichen Säugetieren bei den gewöhnlichen Ausschalt-Verfahren eingesetzt werden.
Durch das Allgemeine Beschreiben in der Erfindung werden die Agenzien und Verfahren für deren Erhalt ohne weiteres unter Bezug auf die nachstehenden Beispiele verstanden werden, die mittels Veranschaulichung bereit gestellt werden, wobei sie nicht beschränkend auf die vorliegende Erfindung sind, es sei denn es wurde spezifiziert.
Um durch t(2;5) umgelagerte Gene zu klonieren, wurde eine positionelle (positional) Strategie gewählt, die auf Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) beruht, um die Reihenfolge von bereichsmäßig abgeleiteten Cosmid-Klonen festzulegen. (Im Gegensatz zu der zu der Mehrheit von Leukämie- und Lymphom-verbundenen chromosomalen Translokationen, die auf molekularer Ebene charakterisiert wurden, beinhaltet die t (2;5) nicht Immunoglobulin oder T-Zellen Rezeptorgene, noch andere klonierte Gene, die vorherig an den Bruchpunkt-Bereichen lokalisiert wurden. Um dadurch den Bruchpunkt auf Chromosom 5 zu identifizieren, wurden mikropräparierte Klone aus den Banden 5q34–q35 isoliert und verwendet, um 39 Cosmidklone zu identifizieren (D. Salman et al., Nucleic Acids Res. 20:1401 (1992)), die anschließend relativ zu dem Bruchpunkt durch FISH Analyse der metaphasen Chromosomen der SUP-M2 und SU-DHL-1 t(2;5)-positiven Zelllinien [R. Morgan et al., Blood 73:2155 (1989] orientiert waren. Siebzehn Klone wurden in Bezug auf den Bruchpunkt centromer und 22 Klone wurden telomer kartografiert, wobei Klone dieser Gruppen durch Zweifarben Metaphasen FISH Analyse relativ zu einem anderen orientiert wurden. FISH wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt [S. Morris et al., Blood 78:2013 (1991); D. Saltman et al., Genomics 16:726 (1993)]. Der geschätzte genomische Abstand zwischen den zwei Cosmiden, die den Bruchpunkt am nächsten flankierten, bezeichnet als cos47C12 (centromer) und cos191E7 (telomer), betrug 280 kb durch interphasen FISH Analyse [J. Lawrence et al., Science 249:928 (1990); B. Trask et al., Am. J. Hum. Genet. 48:1 (1991)] in Zellen, die ein gewöhnliches Chromosom 5 beinhalten. Ungeachtet ihrer Nähre zu dem Chromosom 5 Bruchpunkt wiesen Sonden, die aus diesen Cosmiden hergestellt wurden, keine angeordneten Restriktionsfragmente durch Southern-Blot Analyse oder Pulsfeld Gelen nach, die aus DNA von t(2;5)-enthaltenden Zelllinien hergestellt wurden.
Bidirektionelle Chromosomen-Läufe (chromosome walks) wurde mit Cosmiden durchgeführt, ungefähr 290 kb entfernt, die den Bruchpunkt auf Chromsom 5 flankierten, wobei jeder Lauf einen Bereich von 150 kb umfasste. Unter Verwendung von Genom-Sonden von 70 kb des isolierten Telomer-Cosmids, wurden angeordnete Restriktionsfragment in DNAs von zwei die t(2;5) enthaltende Zelllinien nachgewiesen (1A). (Ungefähr 70 kB in Bezug auf den Bruchpunkt von dem telomer flankierenden Klon, wurden Chromosom 5-spezifische Sonden (p16–3/1.2S) und p21–3/3E) isoliert, die angeordnete Fragmente mit mehreren Enzymen bei der Southernblot Analyse von DNAs der t(2;5)-positiven Zelllinien identifizierten. Das Genom-Fragment p16–3/1.2S ist unmittelbar centromer an den Chromosom 5 Bruchpunkt lokalisiert, wobei p21–3/3E genau telomer an dem Bruch liegt. Beide Sonden identifizierten ein 1,6 kb Transkript bei der Northern Analyse von RNAs aus t(2;5)-positiven und negativen Zelllinien; zusätzlich hybridisierte p163/1.2S an ein 2,4 kb Transkript, das ausschließlich in t(2;5)-positiven RNAs gefunden wurde.)
Eine der Sonden (p21–3/3E) wurde an eine cDNA Bibliothek hybridisiert, die aus der polyadenylierten RNA der UOC-B1 pro-B Leukämie-Zelllinie hergestellt wurde, die kein t(2;5) aufweist. Mehrere cDNA Klone wurden isoliert, die an eine ubiquitär exprimierte 1,6 kb mRNA hybrisierten, die durch Sequenz-Analyse als Nucleophosmin kodieren vorhergesagt wurde (NPM; ebenfalls als B23 oder Numatrin bekannt) – ein hoch konserviertes nucleolares Phosphoprotein, das ribosomale Komponenten zwischen dem Nucleus und dem Cytoplasma bei den späteren Stufen der Ribosomen-Anlagerung transportiert (shuttle) (W.Y. Chan et al., Biochemistry 28:1033 (1989); R.A. Borer et al., Cell 56:379 (1989)). Das Sondieren von RNAs aus Zelllinien ohne t(2;5) unter Verwendung eines Subklones des 5' Endes der NPM cDNA identifizierte sowohl ein gewöhnliches NPM Transkript als auch ein 2,4 kB Transkript, das auf t(2;5)-positive Zelllinien beschränkt ist (1B, oben). Ein 3' nicht-translatierte Sequenzen enthaltender Subklon wies ausschließlich die gewöhnliche 1,6 NPM Transkript nach (nicht gezeigt).
Durch das Screening einer cDNA Bibliothek, die aus der mRNA der SU-DHL-1 t(2;5)-enthaltenden Ziellinie hergestellt wurde, wurden über 20 Klone isoliert, die an 5' allerdings nicht an 3' NPM Sonden hybridisierten. Sequenzen der 5' Enden der drei längsten Klone waren zu 5' NPM cDNA Sequenzen identisch, waren allerdings nach dem Codon für Val¹¹⁷ unterschiedlich. NPM Sequenzen 3' dieses Codons wurden durch 1223 Nukleotide ersetzt, was zu einem offenen Leseraster von 1575 Nukleotiden führte (2A). Eine Sonde aus dem 3' Ende der Fusions cDNA (pS1.2) identifizierte das gleiche 2,4 kb Transkript, das mit der 5' Sonde in RNAs von t(2;5)-positiven Zellen nachgewiesen wurde (1B, unten). Dieses Fragment war an die Bande p23 des Chromosoms 2 lokalisiert durch Hybridisierung an DNAs menschlicher x rodent somatischer Zellhybride und durch metaphasen FISH Analyse (nicht gezeigt) und zeigte an, dass die 2,4 kb RNA durch ein fusioniertes Gen kodiert wird, das durch t(2;5) erzeugt wurde.
Der 3' Anteil der chimären t(2;5) cDNA kodiert für die katalytische Domäne von Mitgliedern der Protein-Tyrosinkinase (PTK) Genfamilie charakteristische konservierte Reste (S.K. Hanks et al., Science 241:42 (1988); S.S. Taylor, et al., Annu. Rev. Cell Biol. 8:429 (1992)). (2, A und C). Der Vergleich dieser neu identifizierten anaplastischen Loymphomkinase (ALK) (NPM und ALK bezeichnen gebilligte HMG Gen-Symbole. (P. McAlpine, persönliche Mitteilung)) mit bekannten PTK Familienmitgliedern zeigte höchste Homologie zu Mitgliedern der Insulin Rezeptorkinase Subfamilie, beinhaltend die Leukozyten Tyrosinkinase (LTK; 64% Aminosäure Identität), TRKA (38%), ROS (37%) und seinem Drosophila Homologen Sevenless (35%), der β-Kette des Insulinrezeptors (IR; 36%) (J.J. Krolewski et al., EMBO J. 10:2911 (1991); H. Toyoshima et al., Nature 319:743 (1986); H. Matsushime et al., Mol. Cell. Biol. 6:3000 (1986); J.M. Chen et al., Oncogene. 6:257 (1991); K. Basler et al., Cell 54:299 (1988); D.D. Bowtell et al., Genes and Development 2:620 (1988); A. Ullrich et al., EMBO J. 5:2503 (1986); A. Ullrich et al., Nature 313:756 (1985); Y. Ebina et al., Cell 40:747 (1985)).
Die Struktur von gewöhnlichen ALK Proteinen wurde durch das Screening einer aus einer Rhabdomyosarom Zelllinie (Rh30) hergestellten cDNA Bibliothek unter Verwendung der pS1.2 ALK Sonde bestimmt. Analyse der Insertionen der zwei größten Klone, pRMS4 und pRMS17–2, zeigte 3' ALK Sequenzen identisch zu denen in der Fusionsgen cDNA und zeigte, dass keine Mutationen in dem Chimären Protein stattgefunden hatten. Sequenzen des ALK unmmittelbar aufwärts der NPM-ALK Verbindung kodierten 23 hydrophobe für eine Transmembrandomäne typische Aminosäuren (2B), während diejenigen der äußersten 5' Enden der ALK Klone zu 50% zu Sequenzen identisch waren, die Insulin-ähnliches-Wachstumsfaktor-Bindeprotein-1 kodieren (IBP-1) (IBP-1 ist ein 30 kDa sekretiertes Protein, das in menschlichem Plasma und in Fruchtwasser gefunden wird und das Insulin-ähnlichen-Wachstumsfaktor-1 (IGF1) mit höherer Affinität bindet [A. Brinkman et al., EMBO J. 7:2417 (1988); Y.L. Lee et al., Mol. Endocrinol. 2:404 (1988); M. Julkunen et al., FEBS Lett. 236:295 (1988)]). Diese Vergleiche zeigen, dass das gewöhnliche ALK Produkt ein membranumfassender Tyrosinkinase-Rezeptor ist. Insbesondere sind das Transmembran-Segment und die wahrscheinliche extrazelluläre Ligand-Binde-Domäne nicht in dem NPM-ALK Chimär-Protein enthalten.
ALK mRNAs von 6,5 kb und 8,0 kb wurden ohne weiteres in kleinen intestinalen und Rhabdomyosarcom Zelllinien identifiziert und wurden schwach in Gehirn (fötal und adult), Grimmdarm und Prostata (1, B [unten] und C) exprimiert. Reichliche Mengen von 4,4 kb und 6,0 kb mRNAs wurden im Testikel nachgewiesen, während Plazenta und fötale Leber jeweils ein einzelnes 6.0 kb Transkript exprimierten. Alle vier mRNAs wurden ebenso mit einer Sonde nachgewiesen, die ausschließlich 3' nicht-translatierte mRNAs enthielt, und daher darauf schließen lässt, dass sie unterschiedlich gesplicte ALK mRNAs darstellt und nicht Kreuz-Hybridisierte Transkripte von anderen PTK Genen. ALK Transkripte wurden nicht in gewöhnlicher Milz, Thymus, peripherem Blut, Leukozyten, B-lymphoblastoiden Zelllinien, Phytohämagglutin-stimulierten oder t(2;5)-negativen Leukämie/Lymphom Zelllinien von Myeloider oder T-Lymphoider Abstammung nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass sie in hämatopoietischen Zellen nicht gewöhnlich exprimiert werden.
FISH Kartografierung zeigte, dass NPM und ALK in centromerer oder telomerer Orientierung auf jeweils den Chromsomen 5 und 2 mit dem aus dem abgeleitetem 5 translokierten Chromosom erzeugten 2,4 kb Fusionstranskript transkribiert werden. Northern Blot Analyse erbrachte keinen Hinweis auf die Expression eines reziproken ALK-NPM Chimär-Transkripts, das aus dem abgeleiteten 2 Chromosom hätte erzeugt werden können.
Eine auf RNA beruhende Polymerase-Kettenreaktions-(RNA-PCR) Verfahren bestätigte die Spezifität der Fusionsverbindung in chimären Transkripten, die in t(2;5) aufnehmenden Lymphomen exprimiert wurden (3, A und B) (RNA-PCR wurde wie vorstehend beschrieben in E. Privitera et al., Blood 79:1781 (1992) durchgeführt. Reaktionen wurden gleichzeitig mit für das chimäre NPM-ALK Transkript (siehe 3B) spezifischen Oligonukleotidprimern und mit einem Primerpaar durchgeführt, das aus dem ubiquitär exprimierten NPM Gen als Kontrolle für die Reverse Transkription und Amplifikation stammte. Ein 3' NPM Primer (5'-GCTACCACCTCC AGGGGCAGA-3' (Seq. ID No. 8)) wurde mit dem in 3B gezeigten NPM Primer für die Kontroll-Amplifikationen verwendet; wobei das 185 bp NPM Produkt durch Hybridisierung mit einem endmarkiertem Oligonukleotid nachgewiesen wurde, das homolog zu gewöhnlichen NPM Sequenzen aus dem Bereich ist in dem sich die Fusionsverbindung ereignet (5'-AGCACTTAGTAGCTGTGGAGGAAG-3' (Seq. ID No. 9)). NPM-ALK Fusion RNA-PCR Produkte wurden mit einem endmarkiertem Oligonukleotid nachgewiesen, das die Fusionsverbindung umfasst (5'-AGCACTTAGTAGTGTACCGCCGGA-3') (Seq. ID No. 10). Stringente nach-Hybridisierungs-Waschschritte wurden bei 62°C in 2×SSC/0.1% SDS für sowohl die NPM-ALK als auch die NPM Nachweis-Oligonukleotide durchgeführt.
Umgekehrt wurden Fusions-Transkripte nicht in Zelllinien ohne das t(2;5) nachgewiesen, die verschiedene Rhabdomyosarcoma Linien enthielten, die ALK Transkripte exprimierten. NPM-ALK Verbindungssequenzen wurden in RNAs von allen sieben t(2;5)-positiven Proben gefunden, die die SU-DHL-1, SUP-M2 und UCONN-L2 Zelllinien und diagnostische Proben von vier Patienten mit anaplastischen Großzell-Lymphomen beinhalteten (Die Patientenproben (drei Lymphknotenbiopsien, eine pleurale Effusion) zeigten jeweils durch zytogenetische Analyse, das sie Lymphomzellen mit dem t(2;5) enthielten. Die Sequenz der RNA-PCR Produkte von Zellen der Patienten 2 und 4 wurde bestimmt und herausgefunden, dass sie identisch zu der aus der SU_DHL-1 Zelllinie erhaltenen cDNA Sequenz ist (3B). Eine schriftliche Bestätigung über die Information wurde von den Patienten oder ihren Eltern erhalten und die Untersuchungen wurden durch das klinische-Studien Review-Komitee des St. Jude Children's Research Hospital genehmigt).
Es scheint, dass die Bruchpunkte der 2;5 Translokation daher konsistent die gleichen Introns der NPM und ALK Gene beinhalten, was zu identischen Verbindungen in gesplicten mRNAs führt, die aus dem Fusionsgen entstanden sind. Aufgrund der Schwierigkeiten bei der zytogenen Analyse der Lymphom-Biopsieproben sollte der molekulare Nachweis der NPM-ALK Fusion mRNAs durch RNA-PCR die Identifizierung dieser Tumore bedeutend verbessern.
Die Häufigkeit der t(2;5) in anaplastischen Großzell-Lymphomen zeigt, dass das NPM-ALK Produkt eine wesentliche Rolle bei der Phatogenese dieser Neoplasmen ausübt. Das gewöhnliche NPM Protein ist ein nicht-ribosomales nucleolares Phosphoprotein, das an der Zusammenlagerung von präribosomalen Teilchen in kleine und große ribosomale Untereinheiten beteiligt ist (W.Y. Chan et al., Biochemistry 28:1033 (1989); R.A. Borer et al., Cell 56:379 (1989); M.S. Schmidt-Zachmann et al., EMBO J. 6:1881 (1987); M.S. Schmidt-Zachmann et al., Chromosoma. 96:417 (1988); D. Hernandez-Verdun, J. Cell. Sci. 99:465 (1991)). Es bindet kooperativ mit hoher Affinität an einzelsträngige Nukleinsäuren, ermöglicht RNA-Helix destabilisierende Aktivität und wird in Zusammenhang mit den meisten gereiften nucleolaren präribosomalen Ribonucleoproteinen gefunden (T.S. Dumbar et al., Biochemistry 28:9495 (1989)). Die relative Häufigkeit der NPM Transkripte und Protein wird durch den Zellzyklus reguliert. Das NPM Transkriptions- und Translations-Maximum liegt gerade vor dem Eintritt der Zellen in die S Phase mit einem Abfall zu der Basislinie gerade vor dem Beginn der G2 Phase (N. Feuerstein et al., J. Immunol. 139:1818 (1987); N. Feuerstein at al., J. Biol. Chem. 262:11389 (1987); N. Feuerstein et al., J. Biol. Chem. 263:10608 (1988); N. Feuerstein et al. J. Cell Biol. 107:1629 (1988); N. Feuerstein et al., Exp. Cell Res. 194:289 (1991)).
Sequenzen, die die meisten strukturellen Domänen des NPM kodieren, sind nicht in dem Fusionstranskript enthalten (W.Y. Chan et al., Biochemistry 28:1033 (1989); R.A. Borer et al., Cell 56:379 (1989); M. Peter et al. Cell 60:791 (1990); P.K. Chan et al., Biochem. J. 270:549 (1990); R. Beckmann et al., Eur. J. Biochem. 210:45(1992)) (3C). Wir postulieren, dass das NPM Gen einen aktiven Promotor zum Antrieb der Expression der ALK katalytischen Domäne in Lymphomazellen mit dem t(2;5) beiträgt. Diese Rolle des NPM würde entscheidend erscheinen , da der ALK Promotor für gewöhnlicht still in Lymphoiden Zellen vorliegt. Eine onkogene Rolle, falls es eine gibt, muss für die Amino-terminalen NPM kodierenden Sequenzen etabliert werden, die in NPM-ALK eingebracht sind und die möglichen Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen (Ser⁴³ und Thr⁷⁸) und ein mögliches C-X₅-H-X₄H Metallbindemotif (Reste 104–115) beinhalten.
Die Beteiligung von anomal aktivierten Rezeptor-Tyrosinkinasen an der malignen Transformation wurde gut erkannt (J. Schlessinger et al., Neuron 9:383 (1992); T. Pawson, Curr. Opin. Gen. Dev. 2:4 (1992)). Beispielsweise kann sich eine maligne Aktivierung des TRKA durch Genfusionen ähnlich zu NPM-ALK ereignen, wobei die extrazelluläre Domäne des Enzyms durch Aminosäuren ersetzt wird, die von anderen Genen, beinhaltend jene für Nicht-Muskel Tropomyosin und das ribosomale Protein L7a, kodiert werden D. Martin-Zanca et al., Nature 319:743 (1986); F. Coulier et al., Mol. Cell. Biol. 9:15 (1989); R. Oskam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2964 (1988); S.C. Kozma et al., EMBO J. 7:147 (1988); A. Ziemiecki et al., EMBO J. 9:191 (1990)). Eine konsistente Eigenschaft der onkogenen TRKA Fusionsproteine und ebenfalls der anderen Tyrosinkinase-Onkogene, beinhaltend BCR-ABL, EGFR, HER2/NEU und CSF-1R, ist, dass ein Großteil ihrer Wirksamkeit Mutationen oder Genfusionen zugeschrieben werden können, die zu einer konstitutiv aktiven katalytischen Domäne führen (j. Schlessinger et al., Neuron 9:383 (1992); T. Pawson, Curr. Opin. Gen. Dev. 2:4 (1992); D. Martin-Zanca et al., Nature 319:743, (1986); F. Coulier et al., Mol. Cell. Biol. 9:15 (1989); R. Oskam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2964 (1988); S.C. Kozma et al., EMBO J. 7:147 (1988); A. Ziemiecki et al., EMBO J. 9:191 (1990)). Daher würde man in NPM-ALK Fusionsproteinen vorhersagen, in denen die gekürzte ALK Kinase dereguliert ist und intrazelluläre Substrate phosphoryliert, um eine maligne Transformation auszulösen. Da anaplastische Großzell-Lymphome aus aktivierten T-Lymphozyten entstehen, die für Wachstum und Lebensfähigkeit von IL-2 abhängen (K.A. Smith, Science 240:1169 (1988)), kann NPM-ALK Substrate phosphorylieren, die als Antwort auf IL-2 Rezeptorübertragene Signale gewöhnlich phosphoryliert sind (E.M. Saltzman et al., J. Biol. Chem. 263:6956 (1988); D.K. Ferris et al., J. Immunol. 143:870 (1989); LD: Horak et al., Proc. Natl. Acad. U.S.A. 88:1996 (1991); M. Hatakeyama et al., Science 252:1523 (1991); N. Kobayashio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4201 (1993)), führen zu einer konstitutiven Aktivierung dieser Signalübertragungswege.
Unser Ergebnis steht in deutlichem Kontrast zu vorherigen molekulargenetischen Studien von T-Zell-Lymphomen und Leukämien, die in Zellen mit einem unreifen (thymischen) Immunphänotyp entstehen. Chromosomale Translokationen in lymphoblastischen T-Zell-Malignitäten beeinflussen ständig Verstärker (enhancers), die in dem TCR β-Ketten-Lokus auf Chromosom 7, Bande q34, oder dem α/δ Lokus auf Chromosom 14, Bande q11 enthalten sind (M.L. Cleary, Cell 66:619 (1991); T.H. Rabbitts, Cell 67:641 (1991)). In jedem Fall verursachen diese Verstärker, die in T-Zellen-Vorläufern hoch aktiv sind, eine deregulierte Expression von entwicklungsbedingt regulierten Transkriptionsfaktor-Genen (beispielsweise TAL/SCL, LYL 1, RHOMB/TTG und HOX 11), die auf den Bruchstellen auf den reziproken Chromosomen lokalisiert sind. Unsere Beobachtungen bei Großzell-Lymphomen lassen darauf schließen, dass die Wege, die zur malignen Transformation in reifen T-Lymphozyten führen, sich von jenen unterscheiden, die für den Differenzierungs-Stopp und das erhöhte Wachstum von thymischen Vorläufern verantwortlich sind.

Claims

Verfahren zum Nachweisen eines menschlichen t(2;5) Lymphoms, welches die Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen einer Nukleinsäure enthaltenden Probe mit mindestens einem ersten Amplifikationsprimer und einem zweiten Amplifikationsprimer, wobei der erste Amplifikationsprimer unter stringenten Bedingungen mit NPM-Sequenzen, die in der NPM/ALK-Fusion vorliegen, oder einer hierzu komplementären Sequenz hybridisieren kann, und der zweite Amplifikationsprimer unter stringenten Bedingungen mit ALK-Sequenzen, die in der NPM/ALK-Fusion vorliegen, oder einer hierzu komplementären Sequenz hybridisieren kann; (b) Amplifizieren der mit Primerunterstützung erhaltenen Sequenzen mit dem ersten oder zweiten Amplifikationsprimer in der Probe; (c) Nachweisen amplifizierter Sequenzen, welche die NPM/ALK-Fusion enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste oder zweite Amplifikationsprimer ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 5, der reverskomplementären Form zu SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, und der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 6.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Probe mRNA enthält.
Verfahren zum Identifizieren eines menschlichen t(2;5) Lymphoms, welches die Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen einer Probe mit zwei Antikörpern, wobei ein erster Antikörper an NPM binden kann, und ein zweiter Antikörper an ALK binden kann; und (b) Nachweisen der Gegenwart von Proteinen in der Probe, die sowohl an den ersten, als auch an den zweiten Antikörper binden; oder welches die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Antikörper, wobei der Antikörper an die Fusionsverbindung des NPM/ALK-Fusionsproteins binden kann, das in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 4 vorliegt, jedoch nicht mit dem Nicht-Fusions-NPM- oder ALK-Protein binden kann; und (ii) Nachweisen der Gegenwart von Proteinen in der Probe, die mit dem Antikörper binden.
Verfahren nach Schritt (i) und (ii) von Anspruch 4, wobei der Antikörper an ein Epitop binden kann, das in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 4 vorliegt.
Verfahren zum Nachweisen eines menschlichen t(2;5) Lymphoms, welches die Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens zwei Nukleinsäure-Sonden (DNA oder RNA), wobei eine erste Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen mit für NPM kodierenden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann, und eine zweite Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen mit für ALK kodierenden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren kann; und (b) Nachweisen der Gegenwart von Nukleinsäure (DNA oder RNA) – Sequenzen in der Probe, die unter stringenten Bedingungen sowohl mit der ersten, als auch der zweiten Nukleinsäuresonde hybridisieren. oder welches die Schritte umfasst: (i) Inkontaktbringen einer Probe mit mindestens einer Nukleinsäure (DNA oder RNA) – Sonde, wobei die Nukleinsäuresonde unter stringenten Bedingungen mit einer für die Fusionsverbindung des NPM/ALK-Fusionsproteins kodierenden Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann; und (ii) Nachweisen der Gegenwart von Nukleinsäuresequenzen (DNA oder RNA) in der Probe, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresonde hybridisieren.
Verfahren nach Schritt (i) und (ii) von Anspruch 6, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresonde die Nukleinsäuresequenzen von SEQ ID NO 2 oder ein Fragment hiervon umfasst.
Kit mit Unterteilungen zur Aufnahme von einem oder mehreren Behältern in strenger Eingrenzung, welcher umfasst: (a) einen ersten Behälter, welcher umfasst, mindestens einen ersten Amplifikationsprimer, der unter stringenten Bedingungen mit der für NPM kodierenden Nukleinsäuresequenz oder einer hierzu komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann; (b) einen zweiten Behälter, welcher umfasst, mindestens einen zweiten Amplifikationsprimer, der unter stringenten Bedingungen mit der für ALK kodierenden Nukleinsäuresequenz oder einer hierzu komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann; (c) einen oder mehrere Behälter, welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: Waschreagenzien, Amplifikationsreagenzien, und Reagenzien, welche die Gegenwart von amplifizierten Nukleinsäuresequenzen nachweisen können; oder welcher umfasst: (i) einen ersten Behälter, welcher umfasst, einen Antikörper, der an ein Epitop binden kann, das in der Fusionsverbindung des NPM/ALK-Fusionsproteins vorliegt, jedoch nicht im Nicht-Fusions-NPM- oder ALK-Protein vorliegt; und (ii) einen oder mehrere Behälter, welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: Waschreagens und Reagenzien, welche die Gegenwart von gebundenem Antikörper nachweisen können; oder welcher umfasst: (1) einen ersten Behälter, welcher umfasst, mindestens eine Nukleinsäuresonde, die unter stringenten Bedingungen mit einer für die Fusionsverbindung des NPM/ALK-Fusionsproteins kodierenden Nukleinsäuresequenz hybridisieren kann; und (2) einen oder mehrere Behälter, welche eines oder mehreres des Nachstehenden umfassen: Waschreagenzien und Reagenzien, welche die Gegenwart von gebundenen Nukleinsäuresonden des ersten Behälters nachweisen können.
Antikörper, der an ein Epitop binden kann, das in der Fusionsverbindung des NPM/ALK-Fusionsproteins vorliegt, jedoch nicht an ein Nicht-Fusions-NPM- oder ALK-Protein binden kann.
Antikörper nach Anspruch 9, wobei der Antikörper an ein Epitop binden kann, das in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO 4 vorliegt.
Antikörper, der an das ALK-Protein binden kann.
Isoliertes Peptid, dessen Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 3 (das partielle ALK-Protein), oder ein Fragment hiervon, und SEQ ID NO 4 (das NPM/ALK-Fusionsprotein), oder ein Fragment hiervon.
Isoliertes Fusionsprotein, welches umfasst, mindestens einen Abschnitt des NPM und ALK-Proteins.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül: (i) welches aufweist, die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO 1, oder ein Fragment hiervon mit der Nukleotidsequenz von 31 bis 2608 angrenzenden Basenpaaren von SEQ ID NO 1; (ii) welches aufweist, die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO 2, oder ein Fragment hiervon mit der Nukleotidsequenz von 31 bis 2440 angrenzenden Basenpaaren von SEQ ID NO 2; (iii) welches ein Polypeptid kodiert, das die Sequenz von SEQ ID NO 3 aufweist; oder (iv) welches ein Polypeptid kodiert, das die Sequenz von SEQ ID NO 4 aufweist.
Isoliertes, in Teil (ii) von Anspruch 14 beschriebenes Nukleinsäuremolekül, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül eine NPM/ALK-Fusionsverbindung umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 14, worin das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 9 und der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 10.
Amplifikationsprimer, der hybridisieren kann, mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Rearrangement bei dem t(2;5)(p23;g35) chromosomalen Translokationsereignis aufweist, das in einem menschlichen t(2;5) Lymphom auftritt, oder einer komplementären Sequenz hiervon.
Amplifikationsprimer nach Anspruch 17, worin der Amplifikationsprimer aus 18 bis 30 angrenzenden Nukleotiden von SEQ ID NO 1 oder aus 18 bis 30 angrenzenden Nukleotiden der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 1 besteht.
Amplifikationsprimer nach Anspruch 17, worin der Amplifikationsprimer eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 5 und der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 6.
Amplifikationsprimer, der hybridisieren kann, mit der Nukleinsäuresequenz, die das menschliche ALK-Gen auf dem Chromosom 2p23 kodiert, oder einer komplementären Sequenz hiervon.
Amplifikationsprimer nach Anspruch 20, worin der Amplifikationsprimer aus 18 bis 30 angrenzenden Nukleotiden von SEQ ID NO 2 oder aus 18 bis 30 angrenzenden Nukleotiden der revers-komplementären Form zu SEQ ID NO 2 besteht.
Vektorkonstrukt, welches einen Vektor umfasst, worin das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüchen 14 bis 16 inseriert worden ist. 23 Wirt, der mit dem Vektor-Konstrukt nach Anspruch 22 transformiert ist.
Antisense-mRNA-Sequenz, die mit einem NPM/ALK-Fusionsgen oder einem Fragment hiervon hybrisisieren kann.
Nicht-menschliches, transgenes Säugetier, das verändert wurde, um ein menschliches NPM/ALK-Fusionsprotein oder Fragment hiervon zu exprimieren.
Verfahren zum Identifizieren von Agenzien, die an das NPM/ALK-Fusionsprotein binden können, welches die Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen eines Agens mit dem NPM/ALK-Fusionsprotein; und (b) Bestimmen, ob das Agens mit dem ALK-Protein oder dem NPM/ALK-Fusionsprotein bindet.
Ribozym, welches die das ALK-Protein kodierende mRNA spalten kann oder die das NPM/ALK-Fusionsprotein kodierende mRNA spalten kann.