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Um
vorzudringen und sich auszubreiten, müssen Krebszellen extrazelluläre Matrixproteine
abbauen. Dieser Abbau wird im Rahmen einer konzertierten Aktion
von verschiedenen Enzymen katalysiert, umfassend Proteasen und nichtproteolytische
Matrix-abbauende Enzyme beispielsweise Metalloproteasen wie interstitielle
Kollagenasen, Typ-IV-Kollagenasen und Stromelysine, Asparaginproteasen
wie etwa Kathepsin D, sowie andere abbauende Enzyme wie Heparinase
und Serinproteasen wie Plasmin (1, 73–76). Plasmin wird aus seinem
Vorläufer
Plasminogen durch zwei Aktivatoren gebildet, dem Plasminogenaktivator
vom Gewebetyp (tPA), der bei der Thrombolyse eine Rolle spielt,
und dem Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (uPA), der beim Gewebeumbau,
einschließlich
der Krebsinvasion, eine zentrale Rolle spielt. Die Aktivierung von
Plasminogen wird von zwei spezifischen Plasminogenaktivator-Inhibitoren
(PAI-1 und PAI-2) reguliert. Sowohl uPA als auch PAI-1 sind bei
verschiedenen Typen von Gewebekrebs vorhanden, und man fand kürzlich heraus, dass
hohe uPA- und PAI-1-Spiegel
in Brustkrebsgewebe mit einer schlechten Prognose einhergehen.
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Immunhistochemische
Studien und in situ Hybridisierungs-Studien haben gezeigt, dass
PAI-1 im Brust- und Darmkrebsgewebe vorwiegend in Stromazellen exprimiert
wird.
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Gemäß der Erfindung
wird in Erwägung
gezogen, dass der hohe PAI-1-Gehalt, den man in bösartigen Tumoren
bei Patienten mit schlechter Prognose fand, wie später ausführlich beschrieben
wird, an der Förderung
des Tumorwachstums, der Invasion und/oder Metastasenbildung beteiligt
ist, am wahrscheinlichsten um das stromale Element des Tumors vor
einem Abbau durch die Plasminogenaktivierung, zu der es während der Invasion
in der Mikroumgebung kommt, zu schützen. Diese Erfindung betrifft
die Unterdrückung
von Inhibitoren der Protease und/oder von anderen Matrix abbauenden
Enzymen, besonders die Unterdrückung
von Plasminogenaktivator-Inhibitoren
wie etwa PAI-1 in Krebsgewebe, was zu einer Hemmung des Wachstums
und/oder der Invasion und/oder der Tumormetastasierung beispielsweise
durch Selbstabbau des Tumorgewebes, Verschlechterung der Krebszellenmigration
und/oder Verschlechterung der Tumorangiogenese, führt.
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ALLGEMEINER
HINTERGRUND
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PLASMINOGENAKTIVATOR
VOM UROKINASE-TYP
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Die
Biochemie von uPA wurde zuvor besprochen (1). Es handelt sich um
eine Serinprotease, die als Pro-Enzym, pro-uPA, von ungefähr 50 kD
in Form eines glykosylierten, einkettigen Polypeptids synthetisiert wird,
das katalytisch praktisch inaktiv ist. Das menschliche uPA-Gen befindet
sich auf Chromosom 10 und wird in eine 2,5 kB lange mRNA transkribiert.
Pro-uPA wird in aktives uPA umgewandelt, das zwei Polypeptidketten (A
und B) enthält,
die durch eine Disulfidbrücke
zusammengehalten werden, wobei die A-Kette vom Aminoende von pro-uPA
und die B-Kette vom Carboxylende stammt. Die A-Kette besteht aus
zwei strukturellen Domänen,
einer Wachstumsfaktor-Domäne
mit Homologie zu EGF, und einer Kringle-Domäne (2). Die B-Kette ist homolog
zum katalytischen Teil anderer Serinproteasen, wie etwa Trypsin,
Chymotrypsin und Plasmin. Zweikettiges uPA kann durch die Metalloproteinase
Matrilysin (oder PUMP-1) (3), in eine katalytisch aktive Form von
uPA von 33 kD, bestehend aus der B-Kette und dem Carboxylende der
A-Kette (uPA von geringem Molekulargewicht), und in ein nicht-katalytisches
Fragment von 17 kD bestehend aus dem N-Ende der A-Kette, umgewandelt
werden.
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uPA
spaltet eine einzige Peptidbindung im Plasminogen und verwandelt
es dadurch in Plasmin, das ein großes Spektrum von Proteinen,
einschließlich
Fibronectin, Fibrin und Laminin (für einen Überblick siehe Litverz. (1))
abbaut. Zusätzlich
aktiviert Plasmin latente Formen einiger Metalloproteasen (4) und
beeinflusst verschiedene Wachstumsfaktor-Systeme, indem es z.B.
latentes TGF-β (5,6)
aktiviert sowie IGF-I aus seiner Proteinbindung (7) und bFGF von
der Oberfläche
einiger Zelltypen (8) dissoziiert.
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Viele
Cytokine und Hormone kontrollieren die Expression von uPA auf zellspezifische
Weise (siehe Literaturverzeichnis (9)).
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uPA
wird von vielen Zellkulturtypen mit neoplastischem Ursprung hergestellt.
Man hat herausgefunden, dass Explantate von Tumorgewebe mehr uPA
freigesetzt haben als das entsprechende normale Gewebe. uPA wurde
in Extrakten von Karzinomen der menschlichen Lunge, des Darms, des
Endometriums, der Brust, der Prostata und der Niere, in menschlichen
Melanomen, in Brusttumoren der Maus, im Lewis-Lungentumor der Maus
und bei Aszites (Bauchwassersucht) durch menschliche peritoneale
Karzinomatose, identifiziert. Eine immunohistologische Studie an
invasiv wachsenden und metastatischen Lewis-Lungenkarzinomen von Mäusen zeigte
die ständige
Anwesenheit von uPA, aber auch eine deutliche Heterogenität des uPA-Gehaltes in
verschiedenen Teilen der individuellen Tumore. In Gebieten mit invasivem
Wachstum und Abbau des umgebenden normalen Gewebes fand man einen
hohen uPA-Gehalt, während
andere Gebiete ohne nachweisbares uPA waren. Das uPA befand sich
im Zytoplasma der Tumorzellen und umgab die Tumorzellen extrazellulär.
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Der
Abbau des umgebenden Gewebes ist ein zentrales Kennzeichen für die Invasivität eines
bösartigen
Tumors. Das dauerhafte Vorhandensein von uPA in bösartigen
Tumoren und die Befunde, die darauf hindeuten, dass uPA beim Gewebeabbau
bei normalen physiologischen Ereignissen eine Rolle spielt, führten zu der
Annahme, dass uPA bei der Krebsentwicklung eine ähnliche Rolle spielt. Die Hypothese,
dass uPA bei der Gewebezerstörung
eine Rolle spielt, hat die Annahme zur Folge, dass Plasmin zusammen
mit anderen proteolytischen Enzymen die extrazelluläre Matrix
abbaut. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass die meisten
Komponenten der extrazellulären
Matrix von Plasmin abgebaut werden können. Dazu gehören Laminin,
Fibronektin, die Proteoglykane und möglicherweise einige Kollagentypen,
aber nicht alle. Zusätzlich
kann Plasmin latente Kollagenapen aktivieren, die ihrerseits die
anderen Kollagentypen abbauen können
(4).
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Viele
Forschergruppen sind der Ansicht, dass invasive Tumorzellen Matrixabbauende
Proteinasen absondern und dass das System zur Plasminogenaktivierung
eine der kritischen Kaskaden ist. Die Regulation der Proteolyse
kann auf verschiedenen Ebenen stattfinden, einschließlich Tumorzell- Wirtszell-Interaktionen und
durch vom Wirt oder von den Tumorzellen selbst produzierte Inhibitoren
der Protease. Die Expression der Matrix-abbauenden Enzyme ist nicht
spezifisch für
die Tumorzelle. Die aktiv eindringenden Tumorzellen können im
Vergleich zu ihren nicht-invasiven Gegenstücken.lediglich auf verschiedene
regulierende Signale antworten (10).
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Die
Annahme, dass das System zur Plasminogenaktivierung bei der Invasivität und Zerstörung von normalem
Gewebe während
des Wachstums bösartiger
Tumore durch einen Zusammenbruch der extrazellulären Matrix-Proteine eine Rolle
spielt, wird von vielfältigen
Befunden unterstützt.
Dazu gehören
eine enge Korrelation zwischen der Transformation der Zellen mit
onkogenen Viren und der Synthese von uPA, der Befund, dass uPA an
der Gewebezerstörung
bei vielen nicht-bösartigen
Leiden beteiligt ist, und die immunohistochemische Lokalisation
von uPA in Invasionsgebieten von Tumoren (siehe (1) für einen Überblick).
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Weitere
Unterstützung
erhielt diese Hypothese durch Studien mit anti-katalytischen Antikörpern gegen uPA
in Modell-Systemen für
die Invasion und Metastasierung.. Man fand heraus, dass derartige
Antikörper
die Metastasierung der Lunge bei einem menschlichen uPA-produzierenden
Tumor, HEp-3, der auf die chorioallantoide Membran von Hühnerembryonen
transplantiert wurde (11, 12), das Durchdringen amniotischer Membranen
durch B16 Melanomzellen (13), die Invasion der Basalmembran durch
einige menschliche und Maus-Zelllinien neoplastischen Ursprungs
(14) und die Bildung von Lungenmetastasen nach intravenöser Injektion
von B16 Melanomzellen in Mäuse
(15), verringern. Bei einigen dieser Studien (13, 14) schien eine
von Plasmin katalysierte Aktivierung der Prokollagenasen ein entscheidender
Teil der Wirkung der Plasminogenaktivierung zu sein.
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PLASMINOGENAKTIVATOR-REZEPTOR
VOM UROKIASE-TYP
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Ein
spezifischer Zelloberflächenrezeptor
für uPA
(uPAR) wurde zuerst durch eine sättigende
Bindung von uPA an Monozyten und Monozyten-ähnliche Zellen entdeckt (16)
und ist seitdem bei vielen Typen von kultivierten Krebszellen gefunden
worden (17). Menschliches uPAR ist ein hochglykosyliertes Protein
mit einer Polypeptidkette und einem Molekulargewicht von 55–60 kD (18).
Es wird von einer 1,4 kB mRNA translatiert (19), die von einem einzigen
Gen, das sich auf Chromosom 19 befindet, codiert wird. Es besteht
aus drei homologen Domänen.
Die Domäne
des Aminoendes (Domäne
1) enthält
die Ligand-bindende Region (20), die an die EGF-ähnliche
Domäne
im uPA-Molekül
bindet (21). uPAR wird am Carboxylende durch eine Glykosyl-Phosphatidylinositol-Einheit
an der Zelloberfläche
verankert (22). Eine mögliche
Funktion dieses Lipidankers ist die Erleichterung der Bewegung von
uPAR auf der Zellmembran. uPAR kann von uPA und Plasmin gespalten
werden, wobei Domäne
1 freigesetzt wird und die Domänen
2 und 3 auf der Zelloberfläche
zurückbleiben
(23).
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uPAR
bindet sowohl aktives uPA als auch pro-uPA mit einer hohen Affinität (Kd 10–9 – 10–11M
), die vom Zelltyp abhängt.
Pro-uPA kann aktiviert werden, wenn es an einen Rezeptor gebunden
ist und Rezeptor-gebundenes uPA ist katalytisch aktiv (17, 24).
Die Bindung von pro-uPA an uPAR und die gleichzeitige Bindung von
Plasminogen an die Zelloberfläche
steigert die Plasminbildung stark (24, 25) und die Oberflächen der
Zellen, die uPAR exprimieren, sind bevorzugte Bindungsstellen für die Plasminogenaktivierung
unter physiologischen Bedingungen (26).
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Die
Aktivierung des Rezeptor-gebundenen pro-uPA wird wirkungsvoll von
an der Oberfläche
gebundenem Plasmin katalysiert, was zu einer starken Amplifikation
der gesamten Plasminogenaktivierungsreaktion führt (24). Einige andere proteolytische
Enzyme, einschließlich
Plasmakallikrein (27) und Kathepsin B (28) können pro-uPA aktivieren. Die
physiologische Bedeutung dieser zuletzt genannten Enzyme bei der pro-uPA-Aktivierung
muss noch bestimmt werden und man weiß immer noch nicht, wie der
uPA-Pfad der Plasminogenaktivierung in vivo initiiert wird.
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Die
uPAR-Synthese wird von Cytokinen wie etwa TGF-β1, TGF-β2, EGF und durch den Tumor-Promotor
Phorbol-Myristat-Acetat reguliert. Diese Regulation ist in einigen
Fällen
bis zur Transkriptionsebene zurück
verfolgt worden, Veränderungen
in der Stabilität
der uPAR-mRNA spielen aber auch eine Rolle ((29, 30) und L. Lund,
persönliche
Mitteilung).
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PLASMINOGENAKTIVATOR-INHIBITOR
VOM TYP 1 UND 2
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Die
uPA-Aktivität
wird von zwei spezifischen Plasminogenaktivator-Inhibitoren, PAI-1
und PAI-2, kontrolliert (für
einen Überblick
siehe (31)). Diese Moleküle
sind Produkte verschiedener Gene, die sich auf den Chromosomen 7
beziehungsweise 18 befinden. Sie sind beide Glykoproteine mit einem
Molekulargewicht von ungefähr
50 kD und beide gehören
zur Familie der Serinprotease-Inhibitoren (Serpin). PAI-1 und PAI-2
unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit uPA und tPA zu
reagieren und auch hinsichtlich ihrer immunologischen Reaktionsfähigkeit.
PAI-1 inaktiviert sich selbst in eine latente Form, wird aber durch
Bindung an Vitronectin vor dieser Inaktivierung geschützt (32).
uPA und tPA werden auch von Protease-Nexin 1 gehemmt, das im Gegensatz
zu PAI-1 und PAI-2 auch andere Trypsin-ähnliche Proteasen, wie etwa
Plasmin und Thrombin, hemmt (33). Die Inhibitoren binden an die
katalytische B-Kette von aktivem uPA. Sie reagieren nicht mit pro-uPA.
PAI-1 hemmt Rezeptor-gebundenes uPA beinahe genauso effektiv wie
gelöstes
uPA (24). Einige Zelltypen nehmen Komplexe zwischen uPA und PAI-1
oder PAI-2 auf und bauen sie ab (34). In einigen Fällen scheint
diese Aufnahme von der Bindung an den uPA-Rezeptor abhängig zu
sein (35) und jüngste
Berichte deuten darauf hin, dass der α-2-Makroglobulin-Rezeptor bei
der Internalisation von uPA/PAI-1-Komplexen bei einigen Zelltypen
ebenfalls eine Rolle spielt (36). Sowohl die Expression von PAI-1 als auch diejenige
von PAI-2 wird von einer Vielzahl von Cytokinen, Wachstumsfaktoren
und Hormonen reguliert (31). Die Regulation der verschiedenen Komponenten
des uPA-Systems scheint voneinander unabhängig zu sein (9, 29–31).
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LOKALISATION
DES SYSTEMS ZUR PLASMINOGENAKTIVIERUNG DURCH DIE UROKINASE IN KREBSGEWEBE
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Studien über das
Vorkommen und die Lokalisation der verschiedenen Komponenten des
uPA-Systems haben gezeigt, dass sowohl uPA als auch uPAR bei den
meisten experimentellen und menschlichen Krebserkrankungen, die
bisher untersucht worden sind, an invasiven Brennpunkten exprimiert
werden. Diese Studien wurden sowohl mittels Immunhistochemie auf
Protein-Ebene als auch durch in situ Hybridisierung auf mRNA-Ebene
durchgeführt.
Aufgrund der starken Amplifkation der proteolytischen Aktivität, die für die Plasminogenaktivator-Kaskade
charakteristisch ist, liegen uPA und uPAR in Geweben in sehr geringer
Konzentration vor.
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Im
hochgradig invasiven Lewis Lungenkarzinom der Maus werden uPA-Protein
(37) und mRNA (70) an invasiven Brennpunkten ständig von den Krebszellen exprimiert,
und mit Hilfe einer kürzlich
isolierten cDNA für
Mäuse-uPAR
(38) fand man heraus, dass die uPAR-mRNA auch in diesem experimentellen
Karzinom durch die sich ausbreitenden Krebszellen exprimiert wird
(J. Eriksen, persönliche
Mitteilung). In den invasiven Gebieten des Lewis Lungenkarzinoms
findet man kein PAI-1-Protein, es wird aber von den Krebszellen
in nicht-invasiven Gebieten exprimiert, was darauf hindeutet, dass
dieser Inhibitor beim Schutz des Tumorgewebes gegen den proteolytischen
Abbau eine Rolle spielt (39).
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Es
ist ein interessanter Befund, dass Zellen des Lewis Lungenkarzinoms
bei der Migration in das umgebende normale Gewebe, ohne es dabei
abzubauen, oft sowohl uPA-mRNA als auch PAI-1-mRNA exprimieren (P.
Kristensen, persönliche
Mitteilung), was darauf hindeutet, dass die uPA-Aktivität, die von
PAI-1 reguliert wird, an der Migration von Krebszellen beteiligt
ist. Die deutliche Lokalisation von uPA, das man bei einigen Zellkulturtypen
bei Zell-Zell-Kontakten und lokalen Zellsubstratkontakten fand,
spricht ebenfalls für
eine Rolle von uPA und PAI-1 bei der Zellmigration. Diese Zellen
produzieren auch PAI-1, das dabei helfen kann die uPA-Aktivität zu regulieren,
die dadurch befähigt
wird, während
der Zellbewegung mit einem zielgerichteten Aufbrechen dieser Kontakte,
zu reagieren (72). Für
eine Beteiligung von uPA und PAI-1 an der Migration und Metastasierung
von Krebszellen spricht des weiteren der Befund, dass von 5 Melanom-Zelllinien
diese 2, die sowohl uPA, uPAR als auch PAI-1 produzierten, bei einem
Matrix-abbauenden Test in vitro am effektivsten waren und in vivo
bei nackten Mäusen
am häufigsten
Lungenmetastasen auslösten
(71).
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Von
den menschlichen Krebsformen wurden die Kolon-Adenokarzinome hinsichtlich
der Expression von Komponenten des Plasminogenaktivator-Systems
am intensivsten erforscht. Sowohl uPA als auch uPAR sind an den
invasiven Brennpunkten ständig
vorhanden, aber man findet uPA-Protein (40) und mRNA (41) nicht
in den Krebszellen, sondern in Fibroblasten-ähnlichen Stromazellen, die gegenüber von
den sich ausbreitenden Krebszellen liegen. uPAR- mRNA (41) und Protein
(C. Pyke, nicht veröffentlichte
Ergebnisse) befinden sich in Krebszellen und in den Tumor infiltrierenden
Makrophagen. Deshalb können
die bösartigen
Zellen und die Makrophagen bei dieser Krebsform vermutlich uPA,
das von den Fibroblastenähnlichen
Zellen freigesetzt wird, binden und benutzen. In Kolon-Adenokarzinomen
wird die mRNA von PAI-1 von Endothelzellen im Tumorstroma exprimiert
(42), während
im umgebenden normalen Gewebe keine PAI-1-Expression erfolgt, was
darauf hindeutet, dass PAI-1 auch bei dieser Krebsart beim Schutz
des Tumorgewebes vor Abbau, eine Rolle spielt. Eine andere mögliche Rolle
von PAI-1 ist die Beteiligung am Prozess der Tumor-Angiogenese (77).
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Beim
menschlichen Plattenepithelkarzinom der Haut werden sowohl uPA als
auch die mRNA von uPAR von den sich ausbreitenden Krebszellen exprimiert
(43, 44). Beim Mammadrüsenkarzinom
ist die Immunreaktivität
von uPAR in Makrophagen, die die invasiven Brennpunkte infiltrieren,
lokalisiert (45), während die
uPA-mRNA in den gegenüberliegenden
Fibroblasten-ähnlichen
Zellen, und in manchen Fällen
auch in den Krebszellen, gefunden wird (43, 46). PAI-1 wurde immunohistochemisch
in Endothelzellen, Krebszellen und in einigen nicht-bösartigen
Epithelzellen bei Brustkrebs, entdeckt (47).
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Somit
zeigen diese Untersuchungen, dass es eine ständige Expression von uPA und
uPAR an invasiven Brennpunkten und von PAI-1 in nicht-invasiven
Gebieten von bösartigen
Tumoren, sowie in Endothelzellen entlang der Tumorgefäße, gibt,
und dass einige der Komponenten des uPA-Systems während der
Krebsinvasion von den Stromazellen exprimiert werden.
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Kürzlich fand
man eine ähnliche
Expression von Stromazellen bei einigen Metalloproteasen, von denen
man annahm, dass sie an der Krebsinvasion beteiligt sind (48–52) und
man erkennt jetzt allmählich,
dass Stromazellen oft aktiv am invasiven Prozess beteiligt sind
(für einen
neuesten Überblick
siehe (53)).
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PROGNOSTISCHE BEDEUTUNG
VON uPA UND PAI-1 BEI BRUSTKREBS
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In
der ersten Studie, die den uPA-Gehalt von Brustkrebsgewebe mit der
Prognose für
die Patientin in Zusammenhang brachte (54), ermittelte man den uPA-Spiegel,
indem man die Enzymaktivität
in den Tumorextrakten testete und nachwies, dass mit einer hohen
Aktivität
ein signifikant kürzeres
beschwerdefreies Interval einherging. Nachfolgende Studien, die
den uPA-Gehalt mit ELISA ermittelten, zeigten, dass ein hohes Niveau
in der Immunoreaktivität
von uPA nicht nur mit einer kürzeren
rückfallfreien Überlebensrate,
sondern auch stark mit einer kurzen gesamten Überlebensrate zusammenhing
(55–58).
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Jänicke et
al., (56) fanden in einer Studie mit 115 Patienten bei einer mittleren
Beobachtungszeit von 12,5 Monaten heraus, dass Patienten mit hohen
uPA-Spiegeln eine
signifikant kürzere
beschwerdefreie Überlebensrate
bei einem relativen Risiko von 21,1 (95% Sicherheit Interval 2,6-174,6)
hatten. Diese Zuordnung war signifikant, sowohl bei Patientinnen
ohne Knoten als auch bei Patientinnen mit Knoten. In ähnlicher
Weise fanden Duffy et al., (55) eine signifikante Korrelation zwischen Überlebensrate
und uPA-Spiegel bei 166 Brustkrebspatientinnen, bei einem mittleren
Beobachtungszeitraum von 34 Monaten und einem relativen Risiko von 11,3
(95% Sicherheit Interval 1,22-99,0).
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Diese
beiden Studien wurden mit detergentienhaltigen Extrakten von Brustkrebsgewebe
durchgeführt. Diese
Extrakte enthalten mehr uPA als Extrakte, die man mit detergentienfreien
Puffern durchführt,
wie etwa denjenigen, die für
die routinemäßige Herstellung
von Cytosolen für
Steroidhormonrezeptoren verwendet werden (59). Mit Hilfe einer Kombination
aus einer polyklonalen Antikörperzubereitung
und drei monoklonalen Antikörpern
wurde ein ELISA entwickelt, der die Immunoreaktivität von uPA
in Cytosolen leicht erkennt. Obwohl die Cytosole nur etwa 12% der
optimal extrahierbaren uPA-Immunoreaktivität enthalten, gibt es eine enge
Korrelation zwischen dem uPA in den Cytosolen und der maximal extrahierbaren
Menge (59). Mit diesem uPA-ELISA wurde an gelagerten Cytosolen von
190 Patientinnen in der Prä-
und Postmenopause mit hohem Risiko, die von der Danish Breast Cancer
Cooperative Group protokolliert wurden und einen mittleren Beobachtungszeitraum
von 8,5 Jahren hatten, eine retrospektive Studie durchgeführt (58).
In dieser Studie war ein hoher uPA-Gehalt im Cytosol sowohl bei
Patientinnen in der Prä-
als auch in der Postmenopause signifikant mit einer kurzen Gesamtüberlebensrate
assoziiert, das relative Risiko lag bei 2,0 (95% Sicherheit Interval
1,1-3,7) bei Frauen in der Prämenopause.
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In
einer kürzlich
durchgeführten
Studie von Foekens et al (60) wurde uPA im Brustkrebscytosol von 671
Frauen ermittelt. Man fand heraus, dass uPA sowohl in der Gruppe
der Patientinnen ohne Knoten als auch in der Gruppe der Patientinnen
mit Knoten signifikant mit einer rückfallfreien Überlebensrate
und dem Tod assoziiert war.
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Somit
scheint ein hoher PAI-1-Spiegel in Brustkrebsgewebe, wie mit ELISA
bestimmt, mit einer schlechten Prognose verbunden zu sein (57, 58).
Jänicke
et al. (57) fanden in einer Studie mit 113 Patientinnen bei einer
mittleren Beobachtungszeit von 25 Monaten heraus, dass Patientinnen
mit einem hohen PAI-1-Spiegel in ihrem Primärtumor eine signifikant kürzere rückfallfreie Überlebensrate
hatten als Patientinnen mit niedrigem PAI-1-Spiegel, wobei das relative
Risiko bei 2,8 lag (95% Sicherheit Interval 0,98-8,3). In der dänischen Studie
mit 190 Brustkrebspatientinnen mit hohem Risiko (58), bestand eine
signifikante Korrelation zwischen einem hohen PAI-1-Spiegel in Cytosolextrakten
und einer kurzen Gesamtüberlebensrate
sowie einer kurzen rückfallfreien Überlebensrate,
sowohl bei Patientinnen in der Prä- als auch in der Postmenopause,
wobei das relative Risiko im Hinblick auf die Gesamtüberlebensrate
bei Frauen in der Postmenopause bei 2,9 lag (95% Sicherheit Interval
1,5-5,8).
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Zwischen
den uPA-, und den PAI-1-Spiegeln in Brustkrebsgewebe besteht eine
positive Korrelation (47, 57, 58), während die zwei Parameter in
den verschiedenen Studien nicht oder nur schwach mit dem Östrogen-
und dem Progesteronrezeptorspiegel assoziiert sind. In multivariablen
Analysen, die etablierte Prognoseparameter, wie etwa die Anzahl
tumorhaltiger Lymphknoten, Tumorgröße und Östrogen- und Progesteronrezeptorspiegel
umfassen, fand man heraus, dass es sich innerhalb der meisten untersuchten
Patientengruppen sowohl bei den uPA- als auch bei den PAI-1-Spiegeln
um unabhängige
und statistisch signifikante Prognoseparameter handelt (55, 57,
58). Somit scheint die Bestimmung der uPA- und PAI-1-Spiegel signifikante prognostische
Information zu derjenigen hinzuzufügen, die man durch die etablierten
Parameter erhielt. Es sollte beachtet werden, dass man diese Information,
zumindest bezogen auf den PAI-1-Spiegel, von Cytosolen erhalten
kann, die routinemäßig zur
Steroidhormonrezeptor-Analyse hergestellt werden.
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AUSFÜHRLICHE
BECHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Tatsache, dass ein hoher PAI-1-Spiegel im Tumorgewebe bei Brustkrebs
und auch beim Lungenadenokarzinom (siehe Beispiel 1) mit einer schlechten
Prognose verbunden ist, deutet darauf hin, dass PAI-1 Tumorwachstum,
-invasion und/oder – metastasierung
fördert.
Wie oben erläutert,
existieren einige Mechanismen, wie etwa der Schutz des Tumorgewebes
gegen den Abbau durch das uPA-System, die Teilnahme an der Migration
der Krebszellen, die Teilnahme an der Tumorangiogenese oder die
Störung
der Aktivierung/Inaktivierung von Wachstumsfaktoren, mit deren Hilfe
PAI-1 eine derartig fördernde
Rolle spielen könnte.
Es ist wahrscheinlich, dass einige Inhibitoren anderer extrazellulärer proteolytischer
Enzyme und anderer nicht-proteolytischer Matrix-abbauender Enzyme,
eine ähnliche
Rolle bei der Förderung
von Tumorwachstum, -invasion und/oder -metastasierung, spielen.
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Somit
betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die die
hemmende Aktivität
von PAI-1 in bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe unterdrückt,
zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung von Wachstum,
Invasion und/oder Metastasierung bösartiger Tumore in einem Patienten,
von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen
bösartigen
Tumor zu entwickeln oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat.
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Durch
die Verwendung der Erfindung wird der hemmende Effekt von PAI-1
im bösartigen
oder potentiell bösartigen
Tumorgewebe unterdrückt,
gehemmt oder neutralisiert, wodurch der Abbau des bösartigen
Tumorgewebes oder des potentiell bösartigen Tumorgewebes ermöglicht wird.
Mit dem Begriff "Unterdrückung" meint man, dass
die hemmende Aktivität
eines Inhibitors der Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms signifikant reduziert wird, beispielsweise mit einem Grad
von mindestens 25%, aber vorzugsweise mit einem höheren Grad
wie etwa 50%, 60%, 70% oder sogar mehr, wie etwa 75%, 80% 90% oder
95%. Der Grad der Hemmung von PAI-1 durch verschiedene Verbindungen
kann mit Hilfe geeigneter Hemmungstests ermittelt werden. Im vorliegenden
Zusammenhang sollte der Begriff "Verbindung" im weitesten Sinn
als eine Substanz verstanden werden, die aus zwei oder mehr Elementen
zusammengesetzt ist, so dass die Atome der Elemente fest miteinander
verbunden sind und in definierten Verhältnissen vorliegen, so dass
der Begriff sowohl herkömmliche
chemische Verbindungen als beispielsweise auch Antikörper einschließt. Beispiele
für solche
Tests, die man getrennt voneinander oder aufeinanderfolgend verwenden
kann, werden in den Beispielen 4, 5 und 6 unter Verwendung des Inhibitors
PAI-1 als Beispiel, beschrieben. Für den Fachmann wird es offensichtlich
möglich
sein, basierend auf den Lehren der Spezifikation, andere ähnliche Tests
zum Zweck der Überprüfung von
Verbindungen, die in der Lage sind, die hemmende Aktivität eines
Inhibitors der Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms zu unterdrücken,
zu entwickeln und zu verwenden.
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Somit
bezieht sich der oben erwähnte
Grad der Unterdrückung
auf in vitro-Tests, während
die Unterdrückung
in bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe stattfinden muß.
Es ist daher erforderlich, die Verbindungen, die sich bei in vitro-Tests
und/oder bei in vivo-Tierversuchssystemen als hemmend erwiesen haben,
auch in klinischen Studien zu testen, um zu ermitteln, ob eine bestimmte
Verbindung zur Verwendung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist,
wobei die Planung und Durchführung von
derartigen klinischen Studien dem Fachmann überlassen bleibt.
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Mit
dem Begriff "ein
Patient, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat,
einen bösartigen Tumor
zu entwickeln oder der einen bösartigen
Tumor entwickelt hat",
ist ein Mensch gemeint (oder ein Tier), von dem man mit Hilfe aller
Untersuchungsmethoden oder Tests, die der Medizin und der Chirurgie
zur Verfügung
stehen, ermittelt hat, dass er einen bösartigen Tumor entwickelt hat.
Mit dem Begriff "ein
hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen Tumors haben", ist beabsichtigt,
die Situation mit einzubeziehen, in der es nicht endgültig ermittelbar
ist, ob der Mensch oder das Tier einen bösartigen Tumor entwickelt hat,
man aber in Erwägung
ziehen muß,
dass er oder sie mit hoher Wahrscheinlichkeit einen bösartigen
Tumor entwickelt hat oder ihn in naher Zukunft, beispielsweise innerhalb der
kommenden Tage, Monate oder Jahre entwickeln wird. Eine derartige
Situation wird z.B. nach der Operation eines bösartigen Tumors entstehen,
wenn man nicht generell ausschließen kann, dass es bereits zur
Metastasierung gekommen ist, sowie bei bestimmten klinischen Situationen,
wenn einer oder eine Anzahl klinischer Labortests darauf hindeuten,
dass der Patient einen bösartigen
Tumor entwickelt hat, es jedoch nicht möglich ist, den Tumor zu lokalisieren
und auch in Situationen, bei denen der Patient eine Menge eines
Tumormackers, wie etwa eines Serum-Tumormarkers, besitzt, die ein hohes
Risiko anzeigt, oder ein Gen oder Genprodukt aufweist, das anzeigt,
dass der Patient ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln.
Beispiele für
solche Tumormarker sind im Fachgebiet gut bekannt.
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Der
Begriff "bösartiger
Tumor" oder "bösartiges Tumorgewebe" dient zur Bezeichnung
der bösartigen Tumorzellen
selbst, einschließlich
Mikrometastasen, sowie der extrazellulären Matrix und der Stromazellen des
bösartigen
Tumors, beispielsweise Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen,
Leukozyten etc.
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Der
Begriff "potentiell
bösartiges
Tumorgewebe" dient
zur Bezeichnung von Gewebe, das das Potential hat, sich zu einem
bösartigen
Tumor zu entwickeln; als ein Beispiel für potentiell bösartiges
Tumorgewebe kann das in situ Karzinom erwähnt werden.
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Der
Begriff "Matrix-abbauendes
Enzym" wie er hier
verwendet wird, bedeutet ein Enzym, das in der Lage ist, Bestandteile
der extrazellulären
Matrix, d.h. Proteine, abzubauen. Proteasen sind wichtige Matrix-abbauende
Enzyme und folglich ist das oben erwähnte Verfahren, worin die Protease-hemmende
Aktivität
eines Inhibitors der Protease unterdrückt wird, ein wichtiger Aspekt
der Erfindung. Dennoch spielen auch nicht-proteolytische Enzyme,
z.B. Enzyme zum Abbau der extrazellulären Proteoglykane, beim Matrixabbau
eine Rolle.
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Gemäß der Erfindung
ermöglicht
eine derartige Unterdrückung
der hemmenden Aktivität
von PAI-1 in bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe, dass PAI-1 direkt oder indirekt das bösartige
oder potentiell bösartige
Tumorgewebe abbaut; und/oder zu einer Störung des Prozesses der Tumor-Angiogenese, und/oder
zu einer Störung
der Migrationsfähigkeit
der bösartigen Tumorzellen
oder von anderen Zellen im Tumorstroma, und/oder zu einer Störung der
Wirkung von Wachstumsfaktoren führt.
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Mit
dem Begriff "Migrationsfähigkeit" wie er hier verwendet
wird, ist die Fähigkeit
von Tumorzellen in nicht-bösartiges
Gewebe einzudringen, gemeint. Somit bezieht sich der Begriff sowohl
auf die Invasivität
von Tumorzellen als auch auf ihre Fähigkeit zur Metastasenbildung.
Eine Störung
der Migrationsfähigkeit
wird daher zu einer Reduktion sowohl der Invasivität als auch
der Fähigkeit
zur Bildung von metastatischem Gewebe führen.
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Der
Patient kann ausschließlich
mit der Zusammensetzung, die unter Verwendung der Verbindung hergestellt
wurde, behandelt werden. In einigen Fällen wird der Patient jedoch
auch anderen Behandlungsformen unterworfen, beispielsweise einer
Operation, bei der das bösartige
Tumorgewebe entfernt wird. In derartigen Fällen kann man die Zusammensetzung
als Behandlung mit neuen Adjuvantien, als präoperative Behandlung, als Behandlung
mit Adjuvantien oder als jede mögliche
Art der Kombination dieser Behandlungen verwenden. Auch Kombinationen
aus zytotoxischen Arzneistoffen, endokriner Therapie und Bestrahlung
stellen mögliche
Behandlungsstrategien dar.
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Unter
gewissen Umständen
hat man noch nicht festgestellt, dass eine Person einen bösartigen
Tumor entwickelt hat, es wird jedoch als sehr wahrscheinlich angenommen,
dass er oder sie dabei ist, einen bösartigen Tumor zu entwickeln
oder einen bösartigen
Tumor entwickelt hat, aber man hat den Tumorort noch nicht festgestellt.
In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Patient um einen Patienten,
von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko zur Entwicklung
eines bösartigen
Tumors hat, dadurch dass er beispielsweise eine Menge eines Tumormarkers,
wie etwa eines Serum-Tumormarkers, besitzt, die ein hohes Risiko
anzeigt, oder dadurch dass er ein Gen oder Genprodukt aufweist,
das anzeigt, dass der Patient ein hohes Risiko hat, einen bösartigen
Tumor zu entwickeln.
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Bei
einigen bösartigen
Tumortypen, z.B. Brustkrebs, wie oben beschrieben, hat man festgestellt,
dass eine erhöhte
Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen
Matrix-abbauenden Enzyms, wobei es sich bei dem Inhibitor um PAI-1
handelt, ein Prognosefaktor ist, der für den Patienten mit dem fraglichen
Typ des bösartigen
Tumors eine schlechte Prognose anzeigt. Die "erhöhte
Konzentration" kann demnach
oberhalb eines festgelegten "Normalwertes" beispielsweise für eine Plasmaprobe
oder Gewebeprobe eines bestimmten Gewebes liegen, oder bei einem
bestimmten Tumor kann die Konzentration hoch sein, wenn man die
Werte der verschiedenen Tumore des gleichen Typs vergleicht (siehe
als ein Beispiel das Beispiel 1).
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Eine
sehr wichtige Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine erfindungsgemäße Verwendung,
wobei der Patient ein Patient ist, der im Tumorgewebe und/oder im
Plasma und/oder im Serum eine erhöhte Konzentration des Inhibitors
der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms
aufweist, wobei es sich bei dem Inhibitor um PAI-1 handelt. Die
erhöhte
Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen
Matrixabbauenden Enzyms im bösartigen
Tumorgewebe und/oder im Plasma wird prä- oder postoperativ festgestellt oder
sie könnte
basierend auf einer Plasmaprobe (mit oder ohne Operation) oder einer
Probe des bösartigen
Tumors, z.B. einer Biopsie, festgestellt werden.
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Diejenige
Ausführungsform
ist relevant, in der der Patient einen bösartigen Tumortyp hat, von
dem bereits festgestellt wurde, dass eine erhöhte Konzentration des Inhibitors
der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms,
wobei es sich bei dem Inhibitor um PAI-1 handelt, im bösartigen
Tumorgewebe und/oder im Plasma, mit einer schlechten Prognose verbunden
ist. Bei einigen bösartigen
Tumortypen weiß man
noch nicht, ob eine erhöhte
Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms ein Prognosefaktor ist, der für den fraglichen Typ des bösartigen
Tumors eine schlechte Prognose anzeigt. Man kann für einen
bösartigen
Tumortyp die prognostische Menge der erhöhten Konzentration des Inhibitors
der Protease des bösartigen
Tumorgewebes oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms
und/oder einer erhöhten
Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen
Matrix-abbauenden Enzyms im Plasma feststellen, indem man einen
spezifischen Test für
den Inhibitor der Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende
Enzym verwendet. Als ein Beispiel für die Feststellung einer solchen
prognostischen Menge für
einen bestimmten Krebstyp dient Beispiel 1, das sich unter Verwendung
eines PAI-1-ELISA auf Lungenkrebs bezieht.
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Anwendbar
ist auch ein Verfahren zur Feststellung des Prognosewertes, um aus
der Behandlung mit einer Verbindung, die die hemmende Aktivität eines
Inhibitors der Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms in bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe eines individuellen Patienten unterdrückt, einen
Nutzen zu ziehen, z.B. um die Wahrscheinlichkeit einer Antwort auf eine
Behandlung mit der Verbindung in einem individuellen Patienten vorherzusagen.
Beispiele für
Typen bösartiger
Tumore, für
die man das festgestellt hat, sind die Mammakarzinome, die urologischen
Karzinome, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, die gynäkologischen
Karzinome, z.B. Eierstockkrebs und Cervixkarzinom, die großzelligen
Lungentumore, Magen-Darm-Krebs, z.B. Kolon-Adenokarzinom und Magenkarzinomen, Gehirntumore,
Sarkome, hämatologische
Bösartigkeit,
z.B. Lymphome und Hautkrebs, z.B. Melanom und Plattenepithelkarzinom
der Haut. Im Schutzumfang der Erfindung sind auch alle anderen Krebstypen,
wie etwa Kopf und Nackenkrebs, für
die festgestellt wurde, dass eine erhöhte Konzentration des Inhibitors
der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms
ein Prognosefaktor ist oder einen Prognosewert hat.
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Im
Schutzumfang der Erfindung ist somit auch eine erfindungsgemäße Verwendung,
bei der festgestellt wurde, dass die erhöhte Konzentration des Inhibitors
der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms
ein Prognosefaktor ist, der die Wirksamkeit der Behandlung des fraglichen
Typs des bösartigen
Tumors mit dem Suppressor des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen
Matrixabbauenden Enzyms anzeigt. Ein Beispiel für einen Prognosetest zur Identifikation
von Patienten, die möglicherweise
von einer derartigen Behandlung profitieren werden, wird in Beispiel
2 mit dem bronchiogenen Adenokarzinom als Beispiel beschrieben. Ähnliche
Versuche können
mit anderen Tumortypen gemacht werden.
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Wie
man in Beispiel 2 sehen kann, wird in Erwägung gezogen, dass die Wirksamkeit
der Behandlung von Patienten, die an einer bösartigen Neoplasie, umfassend
die Hemmung eines Inhibitors der Protease, leiden, durch die Bestimmung
der Menge des Inhibitors der Protease im neoplastischen Gewebe oder
in den Proben, die man den Patienten entnommen hat (Plasma, Serum,
Urin etc.), a priori bewertet werden kann. Somit wird es möglich sein,
beispielsweise durch die Bestimmung des PAI-1-Spiegels im Tumorgewebe eines Patienten,
festzustellen, ob es medizinisch in jeder Hinsicht gerechtfertigt
ist, die Behandlung des Patienten mit der PAI-1-Hemmung zu beginnen.
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Bei
Verwendung der Zusammensetzung wird das oben definierte Tumorgewebe
abgebaut, während im
wesentlichen kein anderes Gewebe als das bösartige Tumorgewebe in einem
Ausmaß oder
Grad abgebaut wird, das/der inakzeptable Nebenwirkungen verursacht.
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PAI-1
wird von den bösartigen
Tumorzellen selbst, einschließlich
Mikrometastasen, ausgeschieden und/oder von den stromalen Komponenten
des bösartigen
Tumors, z.B. von Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen, Leukozyten
etc.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere verschiedene Verwendungen, in deren
Verlauf die Aktivität
von PAI-1 im Tumorgewebe gehemmt wird, indem man dem Patienten eine
Verbindung verabreicht, die die Plasminogen-Aktivator-hemmende Aktivität von PAI-1
unterdrückt.
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Wie
man in Beispiel 6 sehen kann, wurde eine derartige Verbindung identifiziert,
nämlich
der Antikörper
PAI-1-Klon 2 (WO 87/00549). In engen Ausführungsformen der Erfindung
handelt es sich bei diesem Antikörper,
aktiven Fragmenten davon und/oder immunologischen Äquivalenten
davon, um die dem Patienten verabreichte Verbindung. Die Erfindung
betrifft auch die Verwendung dieses Antikörpers zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Behandlung neoplastischer Bösartigkeiten.
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Die
Antikörper
können
als ganze Antikörper,
als Fragmente davon (z.B. FV, (FV)2, Fab,
Fab', F(ab)2), sowie als chimärische, humanisierte oder menschliche
Antikörper
verwendet werden, solange sie PAI-1 auf passende Art binden. Kurzkettige
Antikörperfragmente,
die nur die CDR-Regionen oder Teile davon enthalten, die die spezifische
Bindung an PAI-1 übertragen,
sind auch geeignet, besonders wenn es sich um einen markierten Antikörper handelt.
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Der
Begriff "aktives
Fragment" bedeutet
in diesem Zusammenhang ein bindendes Fragment des Moleküls, das
auch in der Lage ist, die gleichen biologischen Effekte am Zielmolekül hervorzurufen
wie der Antikörper
selbst, obwohl in manchen Fällen
erst bei höheren
Konzentrationen als der Antikörper.
Mit dem Begriff "immunologisches Äquivalent" ist eine Substanz
gemeint, die im wesentlichen die gleiche Bindungsspezifität aufweist
wie der Antikörper
und auf das Zielmolekül
im wesentlichen die gleichen Effekte ausübt, wie der Antikörper, obwohl
in manchen Fällen
erst bei höheren
Konzentrationen als der eigentliche Antikörper.
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Zur
Prävention
einer Immunantwort verwendet man bevorzugt Antikörper/Verbindungen, die den
Antikörpern
menschlichen Ursprungs so ähnlich
wie möglich
sind. Derartige Antikörper
sind, zum Beispiel, chimerische oder humanisierte (CDR-transplantierte)
Antikörper.
Gewöhnlich
werden derartige Antikörper
aus monoklonalen Nagetier-Antikörpern
hergestellt (siehe z.B. als Überblick:
Morrison (1992), Annu. Rev. Immunol. 10, 239–265; Winter und Milstein (1991),
Nature 349, 293–299).
In einer ausdrücklich
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung verwendet man Tumor-spezifische menschliche Antikörper für therapeutische Zwecke
(Borrebaeck et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3995–3999; Borrebaeck
(1988), Immunol. Today 9, 355–359).
Zusätzlich
wird es ausdrücklich
bevorzugt, menschliche Mabs über
Phagen-Display-Genbanken herzustellen, wie zum Beispiel bei Griffith
et al., EMBO J. 12 (1993) 725–734,
beschrieben.
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Auch
die Antikörper
von Schweinen wie in
US 4,132,768 offenbart,
erwiesen sich als nicht-immunogen oder nur sehr schwach immunogen
im Menschen.
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Die
bei der Therapie verwendeten Verbindungen können unter Verwndung von pharmazeutisch
bekannten Formen parenteral verabreicht werden, wie etwa intravasculär, subkutan
oder intramuskulär.
Die aktiven Arzneistoffkomponenten der vorliegenden Erfindung werden
in flüssiger
Form, als Puder oder in lyophilisierter Form verwendet und können mit
einem geeigneten Lösemittel
oder Trägerstoff,
wie etwa Wasser, Kochsalzlösung,
wässriger
Dextrose, wässrigem
Puffer und ähnlichem,
kombiniert werden. Konservierungsstoffe können ebenfalls hinzugefügt werden.
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Unabhängig von
der ausgewählten
Verabreichungsform, werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Verbindungen mit herkömmlichen
Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in pharmazeutisch verträglichen
Dosierungsformen formuliert. Die Verbindungen können auch mit Hilfe pharmakologisch verträglicher
Säure-
oder Basezusatzsalze formuliert werden. Außerdem können die Verbindungen oder
ihre Salze in einer geeigneten hydrierten Form verwendet werden.
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Unabhängig von
der ausgewählten
Verabreichungsform wird bei jeder Behandlung eine nicht-toxische,
aber therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer Verbindungen,
die in dieser Erfindung verwendet werden, eingesetzt. Das Dosierungsverfahren
zur Behandlung wird ausgewählt
in Übereinstimmung
mit einer Anzahl von Faktoren wozu der Typ, das Alter, das Gewicht,
das Geschlecht und die medizinischen Beschwerden des Patienten,
der Tumortyp, die Verabreichungsform und die jeweilige zur Behandlung
verwendete Verbindung, gehören.
Ein Facharzt kann die wirksame Menge des erforderlichen Arzneistoffes
unter Berücksichtigung
bekannter Antikörper-Therapieverfahren
leicht bestimmen und verschreiben. Indem er so vorgeht, könnte der
Arzt zuerst relativ niedrige Dosen einsetzen und die Dosis anschließend bis
zum Erreichen einer maximalen Antwort erhöhen.
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Die
oben beschriebene Verwendung umfasst auch eine, in deren Verlauf
die Verbindung eine Verbindung ist, die die Plasminogen-Aktivator-hemmenden
Aktivität
von PAI-1 unterdrückt,
indem die Bindung von PAI-1 an Vitronectin gehemmt wird und eine
Verwendung, in deren Verlauf die Verbindung eine Verbindung ist, die
zwar die Bindung von PAI-1 an uPA, nicht jedoch die Bindung von
uPA an uPAR hemmt. Ein Beispiel für eine geeignete Verbindung
ist eine Verbindung, die in der Lage ist, PAI-1 zu binden, die aber
nicht in der Lage ist, Plasminogen in Plasmin zu verwandeln, beispielsweise
eine nicht-katalytische Variante, ein Derivat oder ein Analog von
uPA. Ein anderes Beispiel für
eine geeignete Verbindung ist ein Antikörper, der in der Lage ist, an
PAI-1 zu binden und dadurch die Inaktivierung von uPA hemmt. Ein
drittes Beispiel ist eine Verbindung, die an die Protease bindet, beispielsweise
uPA, wodurch die Wirkung des Inhibitors verhindert, die Protease
aber nicht gehemmt wird. Eine derartige Verbindung kann ein Antikörper gegen
die Protease sein. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann
die Verbindung, die in der Lage ist, an einen Inhibitor der Protease zu
binden, einen zytotoxischen Wirkstoff haben, der an die Verbindung
gekoppelt ist.
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In
einer kürzlich
durchgeführten
in situ-Hybridisierungsstudie, fand man heraus, dass sich die mRNA von
PAI-1 in Endothelzellen des Tumorstromas von invasiven Brustdrüsenkarzinomen
befindet (C. Pyke, unveröffentlichte
Ergebnisse). Anschließende
Immunohistochemie bestätigte
die Lokalisation von PAI-1 in den Tumorgefäßen (C. Pyke, unveröffentlichte
Ergebnisse).
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Die
Verbindung eines hohen PAI-1-Spiegels mit einer schlechten Prognose
bei Brustkrebs kann mit den oben beschriebenen Befunden in Beziehung
gebracht werden, wonach die PAI-1-mRNA von Zellen im Tumorstroma
und nicht von Zellen im umgebenden normalen Gewebe exprimiert wird,
was darauf hindeutet, dass es eine Funktion von PAI-1 ist, das Tumorgewebe
gegen den proteolytischen Abbau, den der Tumor dem umgebenden normalen
Gewebe aufzwingt, zu schützen.
Somit kann die Hemmung von PAI-1 zu einem Abbau des Tumorstromas
einschließlich
der Tumorgefäße führen, und
dadurch die Tumorausdehnung hemmen.
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In
Beispiel 3 wird die in situ-Hybridisierung von PAI-1-mRNA und die
Immunofärbung
von PAI-1-Protein in menschlichem Lungenkrebs beschrieben. Mit anderen
Krebstypen, von denen man festgestellt hat, dass eine erhöhte Konzentration
von PAI-1 ein Prognosefaktor ist, können ähnliche Experimente durchgeführt werden.
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Um
die Inhibitoren der Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende
Enzym im Tumorgewebe zu neutralisieren, wäre es wünschenswert, eine lokale Therapie
anzuwenden, womit man die potentiellen Nebenwirkungen auf normales
Gewebe reduziert.
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Eine
wichtige Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Screeningverfahren zur Auswahl von Verbindungen,
die geeignet sind, zur Unterdrückung
der hemmenden Aktivität
eines Inhibitors einer bestimmten Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms, beispielsweise PAI-1 gegen uPA, wobei das Verfahren einen
oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:
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- 1) Ein Screening-Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der
hemmenden Aktivität
eines Inhibitors einer Protease oder eines nicht-proteolytischen
Matrix-abbauenden Enzyms bestimmt wird durch Zugabe der Verbindungen
zu einem System, das einen immobilisierten Inhibitor der Protease
oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und solubilisierte(s)
Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym umfasst,
wobei die/das an den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen
Matrixabbauenden Enzyms gebundene Protease oder nicht-proteolytische
Matrixabbauende Enzym durch das markierte Enzym oder mittels eines
markierten Antikörpers
gegen die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende
Enzym nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem
System, das immobilisierte Protease oder immobilisiertes nichtproteolytisches
Matrix-abbauendes Enzym und einen solubilisierten Inhibitor der
Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms
umfasst, wobei der an die Protease oder das nicht-proteolytische
Matrixabbauende Enzym gebundene Inhibitor der Protease oder des
nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms durch den markierten
Inhibitor oder mittels eines markierten Antikörpers gegen den Inhibitor der
Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms
nachgewiesen wird.
- 2) Ein Test, bei dem die mögliche
Unterdrückung
der hemmenden Aktivität
des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms in dem Tumorgewebe bestimmt wird durch Zugabe der Verbindung
zu einem System, das einen radioaktiv markierten Inhibitor der Protease
oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und Tumorzellen
umfasst, die die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende
Enzym exprimieren, und Nachweisen eines Inhibitors der Protease
oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, das an
die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym
bindet, durch Gammazählen
der Zellen.
- 3) Ein Screening-Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der
hemmenden Aktivität
eines Inhibitors der Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrixabbauenden
Enzyms durch die Verbindung unter Verwendung ganzer Zellen bestimmt
wird, an die die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende
Enzym an die Oberfläche,
beispielsweise durch einen Proteaserezeptor, wie uPA, an den uPA-Rezeptor
gebunden ist.
Der Test basiert auf dem Prinzip, das zur Bestimmung
der Hemmung von Rezeptor-gebundenem uPA durch Plasminogenaktivator-Inhibitoren
beschrieben wurde (61). Dieser Test basiert auf der Hemmung der Bildung
von Plasmin mit Hilfe des Plasmin-spezifischen fluorogenen Substrates
H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin
(Bachem). Der hemmende Effekt der Testverbindung gegen PAI-1 wird
dann durch einen Vergleich der Kurven der Plasminbildung, die man
mit den verschiedenen Konzentrationen der Verbindung erhielt, mit
den Kurven der Plasminbildung bei verschiedenen Konzentrationen
von PAI-1, bestimmt.
- 4) Verabreichung einer Verbindung, von der festgestellt wurde,
dass sie die hemmende Aktivität
eines Inhibitors einer Protease oder eines nichtproteolytischen
Matrix-abbauenden Enzyms im Tumorgewebe unterdrückt, an eine nackte Maus oder
eine nackte Ratte, die mit bösartigen
menschlichen Tumorzellen inokuliert wurde, die zur Invasion und/oder
Metastasierung in der Maus oder Ratte in Anwesenheit der Protease
oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und des
Inhibitors der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms in der Lage sind, und Auswählen einer Verbindung als eine
geeignete Verbindung, die das Wachstum und/oder die Invasion und/oder
die Metastasierung der bösartigen
menschlichen Tumorzellen in der Maus oder Ratte hemmt.
Die
Tumorzellen, die zu diesem Test gehören, können entweder Protease oder
nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym bilden, aber nicht
den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms, wobei der Inhibitor entweder von Mauszellen oder von anderen
menschlichen Zellen, mit denen die Maus inokuliert wird, geliefert
wird; Tumorzellen, die den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen
Matrix-abbauenden Enzyms bilden, wobei die Protease oder das nichtproteolytische
Matrix-abbauende Enzym von Mauszellen oder von menschlichen Zellen,
mit denen die Maus inokuliert wurde, geliefert wird; Tumorzellen,
die sowohl die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende
Enzym, als auch den Inhibitor der Protease oder des nichtproteolytischen
Matrix-abbauenden Enzyms bilden oder Tumorzellen, die keine dieser
Komponenten bilden, weder die Protease oder das nichtproteolytische
Matrix-abbauende Enzym, noch deren/dessen von Mauszellen oder inokulierten
menschlichen Zellen gelieferten Inhibitor.
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Eine
wichtige Ausführungsform
der Erfindung betrifft ein Verfahren mit PAI-1 als Inhibitor der
Protease, wie oben beschrieben.
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Es
versteht sich, dass Verbindungen, die mit den oben beschriebenen
Verfahren ausgewählt
wurden, wertvolle Verbindungen sowohl im Verfahren der Erfindung
zur Hemmung des bösartigen
Tumorwachstums, der Migration etc., als auch in den erfindungsgemäßen Verwendungen
sind. Eine solche Verbindung kann auch zur Herstellung von Arzneimitteln
wie unten erläutert,
verwendet werden.
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Zur
Erzeugung von Inhibitoren von PAI-1 kann alternativ auch ein Affinitäts-Screening der Aktivität von großen, hochgradig
verschiedenen Genbanken von Peptiden, die auf der Oberfläche von
filamentösen
Bakteriophagenpartikeln exprimiert werden, durchgeführt werden.
Diese kürzlich
entwickelte leistungsfähige
Technik (81–84)
basiert auf der Fähigkeit
filamentöser
Phagen, fremde Peptide auf ihren äußeren Oberflächen zu
zeigen und benutzt das spezifische Screening und die Affinitätsaufreinigung
von Bakteriophagen, um die Peptide, die Liganden für ein bestimmtes
Protein sind, darzustellen (85). Genbanken von filamentösen Bakteriophagen sind
zur Identifizierung von Peptiden, die an verschiedene Moleküle, wie
etwa Streptavidin (86), HLA-Klasse-II-Protein (87) und sogar an
ein Lectin (88) binden, erfolgreich verwendet worden.
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Die
Phagen-Display-Vektorensysteme pComb3 (89) und pComb8 (90), die
ursprünglich
zur Expression von Fab-Fragmenten entwickelt, aber ebenso erfolgreich zur
Expression von PAI-1 (91) sowie von einer α2MR/LRP-Zufallsfragment-Genbank
(92) verwendet wurden, führen
zu monovalentem beziehungsweise multivalentem Display. Von jetzt
an wird die Konstruktion von Peptid-Genbanken in beiden Phagen-Display-Vektoren
pComb3 und pComb8 die Isolation von Bakteriophagen, die Peptide
mit hoher beziehungsweise niedriger Bindungsneigung für PAI-1
enthalten, ermöglichen.
-
Folgende Schritte kann
man, kurz gefasst, verwenden:
-
Imobilisierung
von PAI-1 in Costar Mikrotitervertiefungen. Inkubation ("Panning") mit den oben erwähnten Phagen-Genbanken.
Nach dem Waschen werden die gebundenen Phagen mit Glycin-HCl (pH
2,2) eluiert und neutralisiert. Eluierte Phagen werden dann reamplifiziert.
Der Ablauf von Panning, Waschen, Elution und Amplifikation wird
insgesamt dreimal wiederholt. Isolation von DNA von Phagen, die
nach dem letzten Panning isoliert wurden und DNA "Peptid-Einschübe" der korrespondierenden
Phagen werden gemäß der Standard DNA-Sequenzierungsverfahren
sequenziert. Dann kann man synthetische Peptide herstellen und mit
einem in vtro-Test ihre Fähigkeit,
die PAI-1/uPA-Interaktion zu hemmen, überprüfen (siehe später). Übereinstimmende Peptidmuster,
die als Inhibitoren der PAI-1-Funktion identifiziert wurden, werden
auf jeder Seite zur Konstuktion von neuen Phagen-Display-Genbanken
verlängert
und das ganze dargestellte Verfahren wird zur Isolation von neuen
Peptiden mit höheren
Bindungsneigungen für
PAI-1 wiederholt werden (93).
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Die
Tumorzellen, die im oben erwähnten
Test eingesetzt werden, können
zwar uPA herstellen, aber nicht PAI-1, wobei PAI-1 von Mauszellen
oder menschlichen Zellen, womit man die Maus inokuliert hat, geliefert
wird; Tumorzellen, die PAI-1 bilden, wobei das uPA von Mauszellen
oder von menschlichen Zellen, womit man die Maus inokuliert hat,
geliefert wird; Tumorzellen, die sowohl uPA als auch PAI-1 bilden
oder Tumorzellen, die weder uPA noch PAI-1 bilden, wobei uPA und
PAI-1 von Mauszellen oder anderen inokulierten menschlichen Zellen
geliefert werden.
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In
einer wichtigen Ausführungsform
der Erfindung wird die Verbindung, die ein Suppressor von PAI-1 in
bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe
ist, als eine Verbindung verwendet, beispielsweise zur Verwendung
bei der Hemmung von bösartigem
Tumorwachstum, Invasion und/oder Metastasierung in einem Patienten,
von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen
bösartigen
Tumor zu entwickeln oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat,
wie etwa eine Verbindung, die es der Protease oder dem nichtproteolytischen
Matrix-abbauenden Enzym ermöglicht,
das bösartige
Tumorgewebe oder das potentiell bösartige Tumorgewebe durch die
Unterdrückung
der hemmenden Aktivität
von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe
oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe direkt oder indirekt abzubauen.
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Die
Erfindung betrifft vor allem eine Verbindung, die
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- 1) die hemmende Aktivität von PAI-1 unterdrückt, wie
durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das immobilisiertes
PAI-1 und solubilisierte Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym
umfasst, wobei die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende
Enzym die/das an PAI-1 gebunden ist, durch das markierte Enzym oder
mit Hilfe eines markierten Antikörpers,
der auf die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende
Enzym gerichtet ist, nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung
zu einem System umfassend immobilisierte Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes
Enzym und solubilisiertes PAI-1 gebunden an die Protease oder an
das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym, das durch markiertes
PAI-1 oder mit Hilfe eines markierten Antikörpers, der auf PAI-1 gerichtet
ist, nachgewiesen wird und/oder.
- 2) die hemmende Aktivität
von PAI-1 im Tumorgewebe unterdrückt,
wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das radioaktiv
markiertes PAI-1 und Tumorzellen, die die Protease oder das nicht-proteolytische
Matrixabbauende Enzym exprimieren, umfasst und Nachweis jeglicher
PAI-1-Bindung an
die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym
durch Gammazählen
der Zellen, und/oder
- 3) die hemmende Aktivität
von PAI-1 unterdrückt,
wie durch Verwendung ganzer Zellen bestimmt, an deren Oberfläche die
Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym beispielsweise
durch einen Rezeptor der Protease, wie etwa uPA an den uPA-Rezeptor,
gebunden ist, und/oder
- 4) das Wachstum und/oder die Invasion und/oder Metastasierung
menschlicher bösartiger
Tumorzellen in einer nackten Maus oder einer nackten Ratte hemmt,
wie bestimmt durch Verabreichung an die nackte Maus oder die nackte
Ratte, die mit menschlichen bösartigen
Tumorzellen inokuliert wurde, von denen bekannt ist, dass sie sich
in Gegenwart der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden
Enzyms und PAI-1 ausbreiten und/oder metastasieren und die in der
Lage sind, zur Invasion und/oder Metastasierung in der Maus, die
Verbindung, von der festgestellt wurde, dass sie die hemmende Aktivität von PAI-1
im Tumorgewebe unterdrückt.
-
Die
Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung, die die hemmende
Aktivität
von PAI-1 in bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe unterdrückt,
um eine Zusammensetzung herzustellen, die bösartiges Tumorwachstum, Invasion
und/oder Metastasierung in einem Patienten hemmt, von dem festgestellt
wurde, dass er ein hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen
Tumors hat oder der einen bösartigen
Tumor entwickelt hat.
-
Die
Erfindung betrifft vor allem die Verwendung wie oben beschrieben,
wobei die Verbindung
- 1) die uPA bindende Aktivität von PAI-1
hemmt, wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt,
das immobilisiertes PAI-1 und solubilisiertes uPA umfasst, wobei
das an PAI-1 gebundene uPA durch Markierung oder mittels eines markierten
anti-uPA-Antikörpers
nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem System,
das jmmobilisiertes uPA und solubilisiertes PAI-1 umfasst, wobei
das an uPA gebundene PAI-1 durch Markierung oder mittels eines markierten
anti-PAI-1-Antikörpers nachgewiesen
wird, und/oder
- 2) die Bindung von PAI-1 an uPA hemmt, wie durch Zugabe der
Verbindung zu einem System bestimmt, das radioaktiv markiertes PAI-1
oder ein Derivat davon und Zellen umfasst, bei denen uPA an der
Zelloberfläche
an uPA-Rezeptoren
gebunden ist, und Nachweisen von PAI-1 oder eines an uPA gebundenen
Derivates durch Gammazählen
der Zellen, und/oder
- 3) die hemmende Wirkung von PAI-1 auf uPA unterdrückt, wie
durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das PAI-1
und Zellen umfasst, an deren Zelloberfläche uPA an uPA-Rezeptoren gebunden ist,
und Nachweisen jeder Wirkung von PAI-1 entweder direkt durch ein
chromogenes uPA-Substrat
oder indirekt durch Zugabe von Plasminogen und Messung der Plasminbildung
unter Verwendung eines Plasmin-spezifischen Substrates wie des fluorogenen
Substrats H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin (Bachem); die
hemmende Wirkung der Testverbindung gegen PAI-1 in 3) wird dann
bestimmt durch Vergleichen der Kurven der Plasminbildung, die man
mit den verschiedenen Konzentrationen der Verbindung erhielt, mit
Kurven der Plasminbildung, die mit verschiedenen Konzentrationen
von hinzugefügtem
PAI-1 entstanden sind,
um eine Zusammensetzung zur Behandlung
eines Patienten herzustellen, von dem festgestellt wurde, dass er
ein hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen Tumors hat oder der
einen bösartigen
Tumor entwickelt hat, indem man die den Plasminogenaktivator hemmende
Aktivität
von PAI-1 in bösartigem
Tumorgewebe oder potentiell bösartigem
Tumorgewebe hemmt.
-
Eine
Ausführungsform
der Erfindung betrifft eine Verwendung, wobei die Verbindung zusätzlich
-
- 4) die Aktivität von PAI-1 in Tumorgewebe
hemmt, wie durch Zugabe der Verbindung zu den bösartigen Zellen oder anderen
Zellen in dem Tumorgewebe, die PAI-1 exprimieren, bestimmt und durch
die anschließende
Zugabe von uPA, gefolgt von einer Messung der uPA-Aktivität entweder
direkt durch ein chromogenes uPA-Substrat oder indirekt durch Zugabe
von Plasminogen und Messung der Plasminbildung und eine andere Ausführungsform
der Erfindung betrifft eine Verwendung, wobei die Verbindung zusätzlich
- 5) in der Lage ist, das Wachstum und/oder die Invasion und/oder
die Metastasierung von bösartigen menschlichen
Tumorzellen zu hemmen, wenn sie einer nackten Maus oder einer nackten
Ratte verabreicht wird, die mit den bösartigen menschlichen Tumorzellen
inokuliert wurde, von denen bekannt ist, dass sie sich in Anwesenheit
von uPA und PAI-1 ausbreiten und/oder metastasieren, und die zur
Invasion und/oder Metastasierung in der Maus fähig sind.
-
BEISPIELE
-
BEISPIEL 1
-
Prognostische
Bewertung von PAI-1 in bronchiogenen Adenokarzinomen.
-
Von
großzelligem
Lungenkrebs wurde berichtet, dass das Stadium der Erkrankung, einschließlich Tumorgröße und Lymphknotenbeteiligung,
innerhalb der spezifischen Stadien, zu den stärksten Prognosefaktoren zählt (62,
63). Obwohl Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom chirurgisch
radikal resektioniert wurden (Stadien I und II), ist die 5-Jahres-Überlebensrate
schlecht, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate
von 40% bei Stadium I und 10% bei Stadium II (64). Somit besteht
Bedarf für
ein Mittel zur Charakterisierung und Definition von Patienten mit
bronchiogenem Adenokarzinom und schlechter Prognose, um Untergruppen
radikal resektionierter Patienten für eine unterstützende Chemotherapie
auszuwählen.
Unseres Wissens nach wird derzeit kein derartiger prognostischer
Marker in der klinischen Praxis verwendet.
-
Wir
haben die prognostische Signifikanz von uPA-Niveau und PAI-1-Niveau,
die in Tumorextrakten von Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom
mit ELISA bestimmt wurden, retrospektiv untersucht. Die Studie umfasst
106 Patienten, die alle chirurgisch behandelt worden waren, wobei
81 % für
eine radikale Resektion bestimmt waren.
-
Dieses
Beispiel beschreibt einen Test zur Bestimmung von PAI-1 in Tumorextrakten
von bronchiogenen Adenokarzinomen.
-
MATERIAL und
VERFAHREN
-
Patienten
und Tumorextrakte
-
Gewebe
von Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom wurde bei –80°C aufbewahrt.
Tumorextrakte wurden mit einem Verfahren hergestellt, das ein Vorkühlen in
flüssigem
Stickstoff, eine mechanische Pulverisierung, die Extraktion mit
einem Puffer, bestehend aus 75 mM Kaliumazetat, 0,3 M NaCl, 0,1
M L-arginin, 10 mM EDTA und 0,25% Triton X-100 pH-Wert 4,2 umfasst,
mit anschließender
Zentrifugation bei 105.000 g für
1 Stunde. Überstand
und Pellet wurden bei –80°C separat
aufbewahrt.
-
Die
Patienten, von denen die Tumorgewebe stammten, wurden allle im Department
of Thoracic Surgery, Bispebjerg Hospital, chirurgisch behandelt.
Die Patienten hatten Stadium I bis III (New International Staging),
81 % waren radikal resektioniert worden (makroskopisch tumorfreier
und histopathologisch tumorfreier Resektionsschnitt), während der
Rest zum Zeitpunkt der Thorakotomie als inoperabel befunden wurde.
Die pathologische Diagnose wurde in allen Fällen unter Verwendung der WHO-Klassifikation vom
gleichen erfahrenen Lungen-Pathologen durchgeführt. Die Patienten wurden bis
zu einem Jahr nach der Resektion in der ambulanten Abteilung regelmäßig untersucht;
und falls sie immer noch rückfallfrei
waren, wurde keine weitere Kontrolle geplant. Die mittlere Beobachtungszeit
lag bei 15,6 Monaten (Spanne von 0-73,5 Monate). Die Überlebensdaten
wurden beim zentralen dänischen
Sterberegister erworben.
-
Die
Tumorextrakte stammten von 106 Lungenkrebspatienten. Mit den Extrakten
sämtlicher
Patienten wurden PAI-1-Analysen durchgeführt. 70% der Patienten (69
von 106) hatten das Krankheitsstadium I (T1NO und T2NO). Die histopathologische Tumorgröße, die
Anzahl der Tumor-positiven mediastinalen Lymphknoten, die pathologische
Diagnose, die chirurgische Radikalität, das Alter und die insgesamte Überlebensrate
waren von allen Patienten verfügbar.
-
PAI-1 ELISA
-
PAI-1
wurde mit Hilfe eines Sandwich-ELISA (18) mit monoklonalen Antikörpern die,
spezifisch binden und nachweisen, bestimmt. Als bindender Antikörper wurde
der monoklonale Antikörper
PAI-1 Klon 1 verwendet und als nachweisender Antikörper wurde
der monoklonale Antikörper
PAI-1 Klon 7 verwendet (PCT/DK86/00080, veröffentlicht als WO 87/00549).
Dieser Test erkennt sowohl latentes als auch aktives PAI-1 und zusätzlich wird
PAI-1 erkannt, das an uPA und tPA gebunden ist (unveröffentlichte
Ergebnisse, J. Grøndahl-Hansen).
PAI-1 wurde in Interimseinheiten unter Kalibrierung mit Standardzubereitungen
gemessen, die vom National Institute for Biological Standards and
Control, Herfordshire, UK., stammten. Die Intra- und Intervariationen
beider Tests lagen unter 11 %.
-
Der
Proteingehalt der Tumorextrakte wurde mit dem Bio-Rad-Protein-Assay
(Biorad, Richmond, CA) bestimmt.
-
Statistische
Verfahren
-
Zur
Verwaltung der Datenbasis und Veranschaulichung der Statistik, wurde
das SPSS-Programm (Inc. SPSS, Version 4.01, 1988) verwendet. Die
Analysen der Sterbetabellen der insgesamten Überlebensrate wurden mit dem
Produkt-Limit-Verfahren
(Kaplan-Meier) berechnet und zur Bestimmung der Gleichheit aller
Patientenschichten (3 Gruppen) wurde der Trendtest (Tarrone) verwendet.
Für Patienten
mit Stadium I (2 Gruppen) wurde der Log-Rank-Test verwendet. Zur
multivariablen Analyse der insgesamten Überlebensrate wurde unter Verwendung
des BMDP-Programms das Cox-Proportional-Hazards-Modell verwendet
(65).
-
ERGEBNISSE
-
Eigenschaften
der Patienten
-
PAI-1
wurde in den Überständen des
Tumorextraktes der bronchiogenen Adenokarzinome von chirurgisch
resektionierten Patienten gemessen. Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften
der Patienten. Die Patienten von denen das Gewebe stammte, wurden
für eine
radikale Chirurgie ausgewählt,
was dazu führte,
dass die meisten Patienten des vorliegenden Materials das Krankheitsstadium
I und II hatten (Stadium gemäß der New
International Staging Classification). 81 % der Patienten wurden
radikal resektioniert und bei keinem der Patienten wurden entfernte
Metastasen gefunden.
-
Tabelle
1 Charakterisierung:
106 Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom
-
Verteilung der PAI-1-Spiegel.
-
1 zeigt die Verteilung von
PAI-1 in den Tumorextrakten. Die Verteilung ist zu den niedrigeren
Werten hin verzerrt. Der Mittelwert von PAI-1 lag bei 0,86 Übergangseinheiten/mg
Protein (Bereich 0,00-10,53). Die abgeschnittenen Mengen der niedrigeren
und höheren
Quadraturen der Verteilung der PAI-1-Konzentrationen wurden identifiziert,
um die Patienten in Gruppen mit niedrigen, mittleren und hohen PAI-1-Spiegeln
einzuteilen. Bei PAI-1 lagen diese Mengen bei 0,40 InterimsU/mg
Protein und 2,20 InterimsU/mg Protein.
-
Zur
Feststellung der Signifikanz von PAI-1 bei Patienten mit einer lokalen
Krankheit, wurde die Patientengruppe mit Stadium I separat untersucht.
In dieser Gruppe wurde der Mittelwert von PAI-1 verwendet, um die
Patienten in Gruppen mit niedrigen und hohen Konzentrationen aufzuteilen;
dieser Wert lag bei 0,775 InterimsU/mg Protein (Bereich 0,00-6,99).
-
Prognostische Signifikanz
von PAI-1.
-
Bei
den 106 Patienten wurde die gesamte Überlebensrate von Patienten
mit niedrigen, mittleren und hohen PAI-1-Spiegeln verglichen. Wie
man in 2 sieht, war
die gesamte Überlebensrate
bei Patienten mit niedriger PAI-1-Konzentration signifikant besser
als bei Patienten mit mittlerer oder hoher Konzentration (P=0,017,
Tarone-Trendtest). Die prognostische Signifikanz von PAI-1 wurde
mit der univariablen Analyse untersucht. Man fand heraus, dass PAI-1
sich auf das Sterberisiko mit einem relativen Risiko von 1,6 für niedrig gegenüber mittel
und 2,4 für
niedrig gegenüber
hoch auswirkt (95% Sicherheit Interval 1,1-2,3 beziehungsweise 1,7-3,5).
-
Zusammenhang
von PAI-1 mit anderen prognostischen Variablen Der Zusammenhang
zwischen dem PAI-1-Spiegel im Tumor und anderen prognostischen Variablen
wurde mit dem X2-Test untersucht. Wie Tabelle 2
darstellt, gab es keinen signifikanten Zusammenhang zwischen PAI-1
und anderen Prognosefaktoren, wie etwa Alter, Krankheitsstadium,
Geschlecht, Tumorgröße oder
Anzahl der beteiligten Lymphknoten.
-
TABELLE 2
-
X
2-Test zum Zusammenhang zwischen PAI-1 in
den Tumorextrakten und anderen Variablen bei Patienten mit bronchiogenen
Adenokarzinomen.
Variable | Korrelation
mit PAI-1 |
| P-Wert |
Alter | 0.63 |
Geschlecht | 0,16 |
Stadium | 0,21 |
Radikalität | 0,20 |
Tumorgröße | 0,59 |
Lymphknoten | 0,22 |
-
Multivariable
Analyse
-
Um
die prognostische Signifikanz des PAI-1-Spiegels mit derjenigen
von anderen Parametern zu vergleichen, wurde mit den 104 Patienten,
für die
vollständige
Daten vorhanden waren, eine multivariable Analyse durchgeführt (Tabelle
3). Die Variablen wurden nacheinander einzeln aus dem Modell entfernt
und nur wieder einbezogen, wenn der P-Wert geringer als 0,05 war.
Auf diese Art blieben PAI-1 und das Stadium als die einzigen zwei
Parameter übrig.
Mit Hilfe dieser Analyse fand man heraus, dass der PAI-1-Spiegel
im Tumor eine statistisch signifikante, unabhängige Variable für die insgesamte Überlebensrate
war, bei einem relativen Risiko von 1,5 für niedrig gegenüber mittel
und 2,3 für
niedrig gegenüber
hoch (95% Sicherheit Interval 1,1-2,2 beziehungsweise 1,6-3,3).
-
TABELLE 3
-
Multivariable
Cox-Regressionsanalyse von 106 Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom
-
Prognostische
Signifikanz von Tumor-PAI-1 innerhalb der Patienten-Untergruppen
Innerhalb der Patienten mit Krankheitsstadium I wurde die insgesamte Überlebensrate
von Patienten mit Werten unterhalb der Medianwerte und denjenigen
mit Werten oberhalb verglichen. Wie in 3 gezeigt, gab es einen signifikanten Zusammenhang
zwischen PAI-1 und der insgesamten Überlebensrate (P=0,037).
-
DISKUSSION
-
Diese
retrospektive Studie mit 106 Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom,
Stadien I bis IIIb, deutet mit statistischer Signifikanz darauf
hin, dass mit hohen PAI-1-Spiegeln in Tumorextraktüberständen eine kurze
insgesamte Überlebensrate
verbunden ist. In einer multivariablen Analyse, die alle Patienten
und Faktoren wie Alter und Stadium umfasste, war das Tumor-PAI-1
ein signifikant unabhängiger
Prognosefaktor für die
insgesamte Überlebensrate.
-
Bei
Patienten mit lokalisierter Erkrankung (Stadien I und II) beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate 40% in der Untergruppe
mit Stadium I und 10% in der Untergruppe mit Stadium II (64). Die
Bestimmung des PAI-1-Spiegels kann ein hilfreicher prognostischer
Marker sein, um radikal resektionierte Patienten mit bronchiogenem
Adenokarzinom und schlechter Prognose für eine Behandlung mit Adjuvantien auszuwählen. Die vorliegende
Studie war begrenzt auf Adenokarzinome innerhalb der Gruppe des
großzelligen
Lungenkrebses (Non Small Cell Lung Cancer = NSCLC) mit einer relativ
geringen Anzahl von Patienten. Deshalb sollte man den prognostischen
Wert von PAI-1 mit mehr Material und innerhalb anderer Untergruppen
von NSCLC weiter evaluieren. Der prognostische Wert von PAI-1 könnte in ähnlicher
Weise auch bei anderen Krebsarten bewertet werden (78).
-
BEISPIEL 2
-
Prognosewert
von PAI-1-Messungen in bronchiogenen Adenokarzinomen.
-
Wie
in Beispiel 1 gezeigt, hat ein Teil der Lungenkrebspatienten in
ihren Tumoren hohe PAI-1-Spiegel, die eine schlechte Prognose vorhersagen.
Dementsprechend sind Patienten mit hohen PAI-1-Spiegeln Kandidaten
für eine
Behandlung, die darauf abzielt, die Bindung von PAI-1 an uPA zu
hemmen. Dieses Beispiel beschreibt einen Prognosetest zur Identifikation
von Patienten, die möglicherweise
von einer derartigen Behandlung profitieren werden.
-
MATERIAL UND
VERFAHREN
-
PATIENTEN.
-
Patienten
mit bronchiogenem Adenokarzinom Stadium I oder II, die für eine unterstützende Therapie nach
erfolgter radikaler Resektion ihrer Lungentumore überwiesen
wurden.
-
TUMOREXTRAKTION
-
Tumorgewebe
von den Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom wird bei –80°C aufbewahrt.
Die Tumorextrakte werden mit einem Verfahren hergestellt, das eine
Vorkühlung
des Gewebes in flüssigem
Stickstoff, mechanisches Pulverisieren, die Extraktion mit einem
Puffer, bestehend aus 75 mM Kaliumazetat, 0,3 M NaCl, 0,1 M L-Arginin,
10 mM EDTA und 0,25% Triton X-100 pH-Wert 4,2, umfasst, bei anschließender Zentrifugation
bei 105.000 g für
1 Stunde. Überstand
und Pellet werden bei –80°C getrennt
aufbewahrt.
-
PAI-1 ELISA.
-
PAI-1
wird mit Hilfe eines Sandwich-ELISA bestimmt (18) mit monoklonalen
Antikörpern,
die spezifisch binden und nachweisen. Als bindender Antikörper wird
der monoklonale Antikörper
PAI-1 Klon 1 und als nachweisender Antikörper wird der monoklonale Antikörper PAI-1
Klon 7 (WO 87/00549) verwendet. Dieser Test entdeckt sowohl latentes
als auch aktives PAI-1 und erkennt zusätzlich an uPA und an tPA gebundenes
PAI-1 (unveröffentlichte
Ergebnisse, J. Grondahl-Hansen). PAI-1 wird unter Kalibrierung mit Standardzubereitungen, die
vom National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire,
UK. stammen, in Interimseinheiten gemessen. Die Intra- und Intervariationen
für beide
Tests liegen unter 11 %.
-
Der
Proteingehalt der Tumorextrakte wird mit dem Bio-Rad-Protein-Assay
(Biorad, Richmond, CA) bestimmt.
-
BEHANDLUNG.
-
Alle
Patienten, die an dieser Studie teilnehmen, werden die Antiprotease-Inhibitor-Behandlung erhalten.
Die klinischen Reaktionen werden nach Standardverfahren (EORTC)
aufgezeichnet. Die Patienten werden je nach PAI-1-Tumorgehalt nachträglich geschichtet
(Patienten mit PAI-1-Spiegeln oberhalb gegenüber von Patienten unterhalb
dem bereits festgelegten Mittelwert von 0,775 InterimsU/mg Protein
(Beispiel 1)) und Anzahl und Dauer der objektiven Reaktionen werden
zwischen den zwei Patientengruppen verglichen.
-
BEISPIEL 3
-
IN SITU HYBRIDISIERUNG
VON PAI-1-mRNA UND IMMUNOFÄRBEN
VON PAI-1-PROTEIN
IN MENSCHLICHEM LUNGENKREBS
-
IMMUNOHISTOCHEMIE
-
Für die Immunohistochemie
wurden Cryostat-Schnitte von 24 Lungenkarzinom-Proben verwendet. Zu diesen gehörten 14
Fälle von
Plattenepithelzellkarzinom, 5 Fälle
von Adenokarzinomen, 3 Fälle
von gemischten Tumoren (Adenokarzinom und Plattenepithelzellkarzinom)
und 3 Fälle
von großzelligem
undifferenziertem Karzinom. Von 3 Patienten wurde gegenüberliegendes
normales Schleimhautgewebe, das während der Chirurgie resektioniert
worden war, entnommen. Für
die immunohistochemischen Färbungen
wurden monoklonale antihumane PAI-1-Antikörper (Klone 1 und 2) verwendet.
Ein irrelevanter monoklonaler Antikörper (m-anti-TNP) wurde als
negative Kontrolle verwendet. Von den zwei monoklonalen Antikörpern wurde
zuvor gezeigt, dass sie gegen zwei verschiedene Epitope auf PAI-1
gerichtet sind. 5 μm
Cryostat-Schnitte wurden einem herkömmlichen APAAP (Alkalin-Phosphatase-Anti-Alkalin-Phosphatase)-Verfahren
unterworfen, wie zuvor beschrieben (45).
-
IN SITU HYBRIDISIERUNG
-
10
der oben genannten Proben wurden mit einem zuvor ausführlich beschriebenen
Verfahren mit Hilfe der in situ Hybridisierung auf die Anwesenheit
von PAI-1-mRNA hin getestet (42). Kurz gefasst wurden 35-S-markierte
RNA-Proben, die von einem aus 504 Basenpaaren bestehenden PstI-PstI-Fragment
von menschlicher PAI-1-cDNA
transkribiert worden waren, zu deparaffinierten von Proteinase K
gespaltenen Sektionen hinzugefügt, über Nacht
bei 48°C
hybridisiert, dann RNAse-behandelt und in hochstringentem Puffer gewaschen,
bevor sie mit einer fotografischen Emulsion bedeckt wurden. Nach
10–14
Expositions-Tagen wurden die Diapositive entwickelt.
-
ERGEBNISSE
-
IMMUNOHISTOCHEMIE
-
In
sämtlichen
untersuchten Fällen
wurde bei den zwei Antikörpern
ein identisches Farbmuster gefunden. Der monoklonale anti-TNP-Antikörper ließ sich nicht
dauerhaft anfärben.
In sämtlichen
Proben konnte die Anwesenheit des PAI-1-Antigens überall in
den Stromateilen des Krebsgewebes demonstriert werden. Individuelle
Fibroblasten-ähnliche
Stromazellen waren oft stark positiv, aber entlang der Kollagenfibrillen
war die Färbung
oft deutlich diffus und netzartig. In 11 Fällen, die alle zum Plattenepitheltyp
gehörten,
war eine Anzahl von Tumorzellen auch PAI-1-positiv. Drei Proben von gegenüberliegendem
normalen Schleimhautgewebe zeigten keine PAI-1-Immunoreaktivität.
-
4 zeigt Immunofärbung von
PAI-1 in einer Probe von Lungenkrebsgewebe. Zu beachten ist das starke
Signal im Stromabereich.
-
IN SITU HYBRIDISIERUNG
-
Routinemäßig hergestellte,
in Paraffin eingebettete Proben von 10 der 24 Fälle wurden mit in situ Hybridisierung
auf die Anwesenheit von mRNA für
PAI-1 hin untersucht. Bei sämtlichen
Proben wurde für
PAI-1 ein Muster der Genexpression beobachtet, das den Mustern der
Immunofärbung
sehr ähnlich
war.
-
BEISPIEL 4
-
Screening-Schema
-
Das
folgende Beispiel beschreibt ein Beispiel für ein zusammengesetztes Screening-Schema, das verschiedene
aufeinanderfolgende Schritte umfasst und geschaffen wurde, um Verbindungen
zu identfizieren, die man verwenden kann, um die Interaktion zwischen
PAI-1 und uPA zu hemmen und die gleichzeitig als Arzneistoffe verwendet
werden, um den invasiven und metastatischen Prozess zu hemmen.
-
Das
anfängliche
Screening der Verbindungen wird beispielsweise mit Hilfe des unten
beschriebenen zusammengesetzten ELISA-Screening durchgeführt und
falls die Verbindung eine hemmende Wirkung aufweist, wird das weitere
Screening der Verbindungen unter Verwendung der nächsten Schritte
im Schema (Beispiele 5 und 6) durchgeführt.
-
Verbindungs-ELISA-Screening
zur Verwendung im Screening der Verbindungen, die in der Lage sind,
die PAI-1/uPA-Interaktion zu hemmen.
-
Ein
Sandwich-ELISA-Assay mit zwei Antikörpern wird zum Screening der
Verbindungen auf ihre Fähigkeit,
die Interaktion zwischen PAI-1 und uPA in Lösung zu hemmen, entwickelt.
Die Wirkung der Hemmung der Interaktion durch die zu überprüfende Verbindung
kann man bei verschiedener Konzentration testen. Im vorliegenden
Fall wird die Verbindung X getestet und die Wirkung von X auf die
Interaktion wird untersucht. So ist zum Beispiel X ist der monoklonale
Antikörper
von PAI-1, der die PAI-1-Inhibition von uPA hemmt (W/O 87/00549).
-
Materialien
-
- 1) 96-Loch-Platten (flache Unterseite bei hoher
Bindungskapazität,
NUNC).
- 2) Unmarkierter gereinigter monoklonale Antikörper von
PAI-1 z.B. Klon 1 (WO 87/00549).
- 3) Gereinigter anti-uPA-Klon 5 (66) markiert mit Biotin.
- 4) Meerettich-Peroxidase-konjugiertes (HRP) Avidin.
- 5) Affinitäts-gereinigtes
PAI-1 (SDS-aktiviert).
- 6) Rekombinantes uPA (aktiviert).
- 7) Verbindung X.
- 8) PBS-Puffer, pH 7,4 (PBS).
- 9) PBS + 0,1 % Tween 20, pH 7,4 (PBS/Tween).
- 10) Blockierender Puffer: 1 % Magenmilchpulver (SMP) in PBS.
- 11) Zitrat-Puffer: 0,1 M Zitronensäure, pH 5,0.
- 12) Substratlösung:
1,2-Phenylenediamin-dihydrochlorid (OPD) Tabletten in Zitratpuffer,
z.B. 3 OPD Tabletten in 15 ml Zitronensäure.
- 13) Stopp-Puffer: 1 M H2SO4.
-
Verfahren
-
- 1) Beschichten der Vertiefungen mit 100 μl PAI-1-Antikörper (20 μg/ml) gelöst in 0,1
M Na2CO3.
- 2) Über
Nacht bei 4°C
inkubieren.
- 3) 5X Waschen der Vertiefungen in PBS/Tween.
- 4) Blockieren der restlichen aktiven Bindungsorte in den Vertiefungen
mit 1 % SMP/PBS, 200 μl/Vertiefung, für mindestens
1 Stunde bei Zimmertemperatur. Leicht schütteln.
- 5) Waschen wie in Schritt 3).
- 6) Hinzufügen
von 100 μl
PAI-1 (20 ng/ml).
- 7) Unter leichtem Schütteln
für 1 Stunde
bei Zimmertemperatur inkubieren.
- 8) Waschen wie in Schritt 3).
- 9) Hinzufügen
eines Gemisches von 50 μl
PAI-1 (10 ng/ml) und 50 μl
eines blockierenden Puffers oder eines Gemisches von 50 μl uPA (10
ng/ml) und 50 μl
einer Reihenverdünnung
von X.
- 10) Inkubation wie in Schritt 7).
- 11) Waschen wie in Schritt 3).
- 12) Hinzufügen
von 100 μl
biotinyliertem anti-uPA-Klon 5 (2 μg/ml).
- 13) Inkubation wie in Schritt 7).
- 14) Waschen wie in Schritt 3).
- 15) Hinzufügen
von 100 μl
HRP-Avidin gelöst
1:5000 in SMP/PBS/Tween.
- 16) Inkubation wie in Schritt 7).
- 17) Waschen wie in Schritt 3).
- 18) 1 X Waschen in destilliertem Wasser.
- 19) Hinzufügen
von 100 μl
Substratlösung/Vertiefung.
- 20) Reaktionsstopp mit 100 μl
1 M H2So4/Verteifung,
wenn eine helle gelbe Farbe erscheint.
- 21) Lesen auf einem ELISA-Lesegerät mit 490 nm Filter mit 540
nm Filter als Hintergrundreferenz.
-
Der
oben beschriebene ELISA-Test kann auf ähnliche Weise mit einem uPA-Antikörper als
bindenden Antikörper
und einem biotinyliertem PAI-1-Antikörper oder Antikörpern als
nachweisendem(n) Antikörper(n) aufgebaut
werden.
-
Geeignete
Arzneistoffe zur Hemmung der PAI-1-Bindung an uPA können durch Überprüfen von
Arzneistoff-Genbanken, die natürlich
vorkommende Verbindungen, kleine Moleküle und Peptide enthalten, ermittelt
werden. Man kann auch das Zufalls-Peptid-Bakteriophagen-Display oder synthetische
Peptid-Genbanken verwenden.
-
Beispiel 5
-
Überprüfen von Verbindungen auf ihre
Fähigkeit,
die Bindung von PAI-1 an uPA auf der Zelloberfläche zu hemmen.
-
Die
Fähigkeit
einer Verbindung, die Bindung von PAI-1 an uPA zu hemmen, wird in
geeigneter Weise als ein Schritt des Schemas, das dazu dient, mögliche neue
Arzneistoffe zu identifizieren und charakterisieren, untersucht
werden. Indem man den monoklonalen PAI-1-Antikörper Klon 2 (WO 87/00549) durch
verschiedene Konzentrationen der zu testenden Verbindung ersetzt,
kann man die Fähigkeit
der Verbindung, die Bindung von PAI-1 an uPA zu hemmen und dadurch
die Inaktivierung von uPA an der Zelloberfläche zu verhindern, bewerten.
-
Der
Test basiert auf der Beschreibung zur Bestimmung der Hemmung von
Rezeptorgebundenem uPA durch die Inhibitoren des Plasminogenaktivators
(61). U937-Zellen (2 × 107/ ml) werden mit uPA (1,4 nM) inkubiert,
nachdem es in 0,05 M Glyzerin-HCl, 0,1 M NaCl, pH 3,0 gewaschen
wurde, um endogen gebundenes uPA zu entfernen. Die Zellen werden
dann zur Entfernung von überschüssigem uPA
gewaschen und bei 37°C in
10-mm Plastik-Fluorometer-Kuvetten in einer Endkonzentration von
1 × 106/ml, mit Plasminogen (20 μg/ml) und
dem Plasmin-spezifischen fluorogenen Substrat N-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin
(Bachem) in 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,4 inkubiert. PAI-1
wird in diese Inkubationen mit einer Konzentration von 1 μg/ml einbezogen,
nachdem es mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung
oder des Antikörpers prä-inkubiert
wurde. Die Zunahme der Fluoreszenz aufgrund der Hydrolyse des Substrates
wird 15 Minuten lang in 1-minütigen
Intervallen gemessen und die Plasminbildung wird anhand des Veränderungsgrades
der Intensität
der Fluoreszenz bestimmt. Dann wird der hemmende Effekt der Testverbindung
oder des Antikörpers gegen
PAI-1 durch Vergleich der Kurven der Plasminbildung, die man mit
verschiedenen Konzentrationen der Verbindung erhielt mit Kurven
der Plasminbildung, die man mit verschiedenen Konzentrationen von
PAI-1 (0, 0,25, 0,5, 0,75 und 1 μg/ml)
erhalten hat, bestimmt. Auf diese Art erhält man einen prozentualen hemmenden Effekt
für jede
gewählte
Konzentration der Verbindung.
-
Beispiel 6
-
Überprüfen der Verbindungen auf ihre
Fähigkeit,
den invasiven und metastatischen Prozess menschlicher Krebszellen
in nackten Mäusen
zu hemmen.
-
Der
letzte Schritt bei der Überprüfung der
Verbindungen, von denen in den oben beschriebenen vorhergegangenen
Schritten des Schemas des Verbindungs-Screenings gezeigt wurde, dass sie die
Interaktion zwischen PAI-1 und uPA hemmen, die dadurch potentielle
Verbindungen sind, um als Arzneistoffe zur Hemmung des Krebswachstums
verwendet zu werden, besteht darin, die hemmende Wirkung der Verbindung
sowohl auf das Wachstum als auch auf den invasiven und metastatischen
Prozess in vivo zu bewerten. Ein Maus-Modell, mit dem man den invasiven
und metastatischen Prozess menschlicher Krebszellen messen kann,
wurde entwickelt, um diese Wirkung zu bewerten (PCT/DK92/00306).
-
Dieses
Beispiel beschreibt eine experimentelle Studie, bei der neutralisierende
monoklonale PAI-1-Antikörper
als ein Mittel zur Hemmung der Metastasenbildung durch ein menschliches
Brustkrebs-Fremdtransplantat in nackten Mäusen verwendet werden.
-
Verfahren
-
Zelllinie
-
Die
menschliche Brustkrebs=Zelllinie MDA-MB-231 BAG wurde routinemäßig in DMEM
mit 5% fötalem
Kälberserum
vermehrt. Diese Zellen wurden mit dem lacZ-Gen transduziert wie zuvor beschrieben
(67). Die Zellen für
die Experimente mit den nackten Mäusen wurden anstelle von Enzymen
mit Hilfe eine Zellspachtels geerntet.
-
Retrovirale
Transduktion
-
Um
die metastatischen Tumore sichtbar zu machen, wird der im Test verwendete
menschliche Krebszelltyp durch Transduktion oder Transfektion der
Zellen mit einem lacZ-Gen markiert, wodurch die Zellen mit X-gal-Färbung sichtbar
gemacht werden können.
Diese Transduktion ist zuvor mit Hilfe von menschlichen MDA-MB-231
und menschlichen MDA-MB-435 Brustkrebszellen durchgeführt worden
(67). Das lacZ-Gen
codiert die β-D-Galaktosidase,
deren Aktivität
durch Färbung
mit dem chromogenen Substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid
(X-gal), die zu einer dunkelblauen Reaktion führt, festgestellt werden kann. Hierbei
können
auch mikroskopische metastatische Tumore entdeckt werden.
-
Die
Transduktion der ausgewählten
menschlichen Krebszellen kann wie in (67) beschrieben durchgeführt werden.
-
Mäuse
-
Es
wurden 6–8
Wochen alte, nackte weibliche nu/nu-META/BOM-Mäuse (Bomholtgaard, Dänemark) verwendet.
Die Mäuse
wurden in geschichteten flüssig
gereinigten Bänken
gehalten und sämtliche
verwendeten Geräte
wurden autoklaviert.
-
Antikörper
-
Die
monoklonalen PAI-1-Antikörper
Klon 2 (WO 87/00549), der den hemmenden Effekt von PAI-1 neutralisiert
(Rømer,
persönliche
Mitteilung), und Klon 3 (WO 87/00549), der die hemmende Aktivität von PAI-1 nicht
beeinflusst (Rømer,
persönliche
Mitteilung), wurden verwendet.
-
Pharmakokinetik
der Verbindung
-
Die
pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung oder des Antikörpers, die/der
zu überprüfen ist,
sollten geklärt
werden, um die Verbindung oder den Antikörper in der Maus in einer wirksamen
Konzentration zu verabreichen und zu erhalten.
-
Die
Verabreichung der Verbindung oder des Antikörpers, die/der zu überprüfen ist,
hängt von
der chemischen Natur der Verbindung oder des Antikörpers ab,
und kann durch interperitoneale Injektion oder subkutane Injektion,
durch orale Verabreichung oder durch lokale Applikation durchgeführt werden.
-
Deshalb
wurde den Mäusen
intraperitoneal eine einzelne Dosis entweder des monoklonalen PAI-1
Antikörpers
Klon 2 oder Klon 3 (WO 87/00549) injiziert und zu verschiedenen
Zeitpunkten nach dieser Injektion wurde den Mäusen Blut entnommen und das
Serum wurde auf den Gehalt an PAI-1-Antikörpern getestet. Des weiteren
wurde in dem Experiment mit den Tumor-tragenden Tieren von sämtlichen
anti-PAI-1-Antikörper-behandelten
Tieren durch eine wöchentliche
Blutentnahme aus der Schwanzvene Serum erhalten. Die Konzentration
der PAI-1-Antikörper wurde
mit einem ELISA analysiert.
-
Vorbehandlung
der Maus und transduzierte Krebszellen
-
Es
kann von Vorteil sein, die Maus mit der Verbindung oder dem Antikörper, die/der überprüft werden soll,
vorzubehandeln, bevor man die transduzierten Krebszellen injiziert,
um zufriedenstellende Konzentrationen der Verbindung oder des Antikörpers zu
erhalten. Des weiteren kann man die transduzierten Krebszellen, die
der Maus injiziert werden sollen, in einer Lösung präinkubieren, die die Verbindung
oder den Antikörper enthält, um einen
Kontakt zwischen den Zellen und der Verbindung oder dem Antikörper sicherzustellen.
Normalerweise sollten einige Experimente, bei denen diese Vorbehandlung
variiert oder ausgeschlossen wird, durchgeführt werden; um die Gesamtwirkung
der Verbindung oder des Antikörpers
zu klären
und abzusichern.
-
Daher
wurde subkutan in jede Flanke der Tiere eine Gesamtzahl von 2 × 106 MDA-MB-231
BAG Zellen inokuliert. Die Tumorzellen wurden immer unterhalb der
Thoraxwand plaziert. Einen Tag vor der Zellinokulation wurden 250 μg der Antikörper in
die Mäuse
injiziert. Basierend auf pharmakokinetischen Studien der verwendeten
Antikörper
(5A und 5B, die eine pharmakokinetische Untersuchung
des monoklonalen anti-PAI-1-Antikörpers Klon 2 beziehungsweise
Klon 3 zeigt, die mit 250 μg
Antikörper
am Tag 0 intraperitoneal in nackte Mäuse injiziert wurden), wurde wöchentlich
eine zweite Injektion von 250 μg
Antikörper
gegeben. Die Mäuse
wurden 6 Wochen nach der Zellinokulation getötet.
-
Messung des
Tumorwachstums
-
Das
Wachstum der Tumore sollte gemessen werden, um zu klären, ob
die getestete Verbindung das Tumorwachstum zusätzlich zu dem möglichen
Effekt auf den invasiven und metastatischen Prozess beeinflusst.
-
Daher
wurden die fremdtransplantierten Tumore zweimal wöchentlich
in zwei Dimensionen gemessen und Kurven des Tumorwachstums wurden
basierend auf einer transformierten Gompertz-Funktion erstellt.
-
Dauer des
Screening-Tests
-
Die
Dauer des Tests hängt
von der Art der Verbindung oder des Antikörpers ab und von der Wirkung der
Verbindung oder des Antikörpers
auf das Wachstum und den invasiven und metastatischen Prozess.
-
Untersuchung von fremdtransplantierten
menschlichen MDA-MB-231 BAG Tumoren für menschliches PAI-1
-
Die
fremdtransplantierten Tumore wurden chirurgisch aus den Tieren entfernt
und mittels Northern-Blotting auf die Anwesenheit von menschlicher
PAI-1-mRNA und mittels ELISA auf die Anwesenheit von menschlichem
PAI-1-Protein untersucht.
-
Untersuchung des fremdtransplantierten
MDA-MB-231 BAG Tumors auf Maus-PAI-1
-
Die
fremdtransplantierten Tumore wurden chirurgisch aus den Tieren entfernt
und durch in situ Hybridisierung mit einer Maus-spezifischen Sonde
auf Maus-PAI-1-mRNA
untersucht.
-
Bewertung
des invasiven und metastatischen Prozesses
-
Die
Wirkung der Verbindung oder des Antikörpers auf den invasiven und
metastatischen Prozess und auf das Tumorwachstum kann lokal und/oder
in den Lungen, den Lymphknoten und im interperitonealen Hohlraum
beurteilt werden, indem man den sehr deutlichen Unterschied zwischen
menschlichen Zellen und Mauszellen, der durch die Färbung möglich gemacht
wird, ausnutzt (67–69).
-
Dementsprechend
wurden bei der Autopsie von jedem Tier die Lungen entfernt und gemäß dem Verfahren
von Brünner
et al (67) mit X-gal bearbeitet. Zur Bestätigung der Anwesenheit menschlicher
Tumorzellmetastasen wurden blaue Bereiche verschiedener Lungen in
4% Formalin fixiert und für
die Routinehistologie vorbereitet. Wenn eine Lunge einen oder mehrere
blaue Bereiche aufwies, wurde dies als positiv für eine metastatische krankhafte
Veränderung
registriert. Wahlweise konnte ein ELISA für β-D-Galaktosidase, wie bei Fujiwara
et al beschrieben (79), als eine objektive Messung der metastatischen
Ausbreitung verwendet werden.
-
Ergebnisse
-
Ergebnisse der Untersuchung
der fremdtransplantierten Tumore
-
MDA-MB-231
BAG Tumore exprimierten überschüssige mRNA
und Protein für
menschliches PAI-1. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung konnte
gezeigt werden, dass der fremdtransplantierte Tumor in den Stromazellen
einschließlich
der Gefäße, die
die menschlichen Tumorzellen infiltrieren, Maus-PAI-1 exprimiert.
-
Pharmakokinetik
-
Die
Halbwertszeit von PAI-1-Antikörper
Klon 2 wurde auf ungefähr
4 Tage und diejenige von PAI-1-Klon 3 auf ungefähr 6 Tage geschätzt (5A und 5B).
-
Hemmung der
Metastasierung der Tumorzellen
-
Wie
man in Tabelle 4 sehen kann, hatten 9 von 10 unbehandelten Kontrolltieren
Lungenmetastasen. Die Injektion des Kontrollantikörpers PAI-1-Antikörper Klon
3 führte
zu einem geringfügigen
Rückgang
(6 von 10) der Anzahl der Tiere mit Lungenmetastasen, während die
Injektion von PAI-1-Antikörper
Klon 2 die Bildung von Lungenmetastasen signifikant aufhob, da nur
1 von 10 Mäusen
Lungenmetastasen hatte.
-
Die
metastatische Ausbreitung der menschlichen Krebszellen wurde durch
die Anwesenheit von Krebszellen in den blauen Punkten bestätigt, die
mit herkömmlichen
histologischen Untersuchungen bestimmt wurden.
-
In ähnlicher
Weise kann man mit diesem Model andere potentielle PAI-1-Inhibitoren
testen.
-
-
Wirkung der PAI-1-Antikörper auf
das Tumorwachstum
-
Die
Untersuchung der Wirkung der PAI-1-Antikörper auf das Tumorwachstum
zeigte, dass beide Antikörper
im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen eine geringfügige, aber
nicht signifikante Verzögerung des
Tumorwachstums auslösten
(6 zeigt die Kurven
des Bereichs des Tumorwachstums der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie
MDA-MB-231 BAG, die weiblichen nu/nu META/BOM-Mäusen am Tag 0 subkutan injiziert
wurde).
-
Nach
geeigneten toxikologischen Studien sollte eine aktive Verbindung
in Phase I- und
Phase II-Versuchen getestet werden.
-
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