DE69433685T2 - Unterdrückung von inhibitoren - Google Patents

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Description

  • Um vorzudringen und sich auszubreiten, müssen Krebszellen extrazelluläre Matrixproteine abbauen. Dieser Abbau wird im Rahmen einer konzertierten Aktion von verschiedenen Enzymen katalysiert, umfassend Proteasen und nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzyme beispielsweise Metalloproteasen wie interstitielle Kollagenasen, Typ-IV-Kollagenasen und Stromelysine, Asparaginproteasen wie etwa Kathepsin D, sowie andere abbauende Enzyme wie Heparinase und Serinproteasen wie Plasmin (1, 73–76). Plasmin wird aus seinem Vorläufer Plasminogen durch zwei Aktivatoren gebildet, dem Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (tPA), der bei der Thrombolyse eine Rolle spielt, und dem Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (uPA), der beim Gewebeumbau, einschließlich der Krebsinvasion, eine zentrale Rolle spielt. Die Aktivierung von Plasminogen wird von zwei spezifischen Plasminogenaktivator-Inhibitoren (PAI-1 und PAI-2) reguliert. Sowohl uPA als auch PAI-1 sind bei verschiedenen Typen von Gewebekrebs vorhanden, und man fand kürzlich heraus, dass hohe uPA- und PAI-1-Spiegel in Brustkrebsgewebe mit einer schlechten Prognose einhergehen.
  • Immunhistochemische Studien und in situ Hybridisierungs-Studien haben gezeigt, dass PAI-1 im Brust- und Darmkrebsgewebe vorwiegend in Stromazellen exprimiert wird.
  • Gemäß der Erfindung wird in Erwägung gezogen, dass der hohe PAI-1-Gehalt, den man in bösartigen Tumoren bei Patienten mit schlechter Prognose fand, wie später ausführlich beschrieben wird, an der Förderung des Tumorwachstums, der Invasion und/oder Metastasenbildung beteiligt ist, am wahrscheinlichsten um das stromale Element des Tumors vor einem Abbau durch die Plasminogenaktivierung, zu der es während der Invasion in der Mikroumgebung kommt, zu schützen. Diese Erfindung betrifft die Unterdrückung von Inhibitoren der Protease und/oder von anderen Matrix abbauenden Enzymen, besonders die Unterdrückung von Plasminogenaktivator-Inhibitoren wie etwa PAI-1 in Krebsgewebe, was zu einer Hemmung des Wachstums und/oder der Invasion und/oder der Tumormetastasierung beispielsweise durch Selbstabbau des Tumorgewebes, Verschlechterung der Krebszellenmigration und/oder Verschlechterung der Tumorangiogenese, führt.
  • ALLGEMEINER HINTERGRUND
  • PLASMINOGENAKTIVATOR VOM UROKINASE-TYP
  • Die Biochemie von uPA wurde zuvor besprochen (1). Es handelt sich um eine Serinprotease, die als Pro-Enzym, pro-uPA, von ungefähr 50 kD in Form eines glykosylierten, einkettigen Polypeptids synthetisiert wird, das katalytisch praktisch inaktiv ist. Das menschliche uPA-Gen befindet sich auf Chromosom 10 und wird in eine 2,5 kB lange mRNA transkribiert. Pro-uPA wird in aktives uPA umgewandelt, das zwei Polypeptidketten (A und B) enthält, die durch eine Disulfidbrücke zusammengehalten werden, wobei die A-Kette vom Aminoende von pro-uPA und die B-Kette vom Carboxylende stammt. Die A-Kette besteht aus zwei strukturellen Domänen, einer Wachstumsfaktor-Domäne mit Homologie zu EGF, und einer Kringle-Domäne (2). Die B-Kette ist homolog zum katalytischen Teil anderer Serinproteasen, wie etwa Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin. Zweikettiges uPA kann durch die Metalloproteinase Matrilysin (oder PUMP-1) (3), in eine katalytisch aktive Form von uPA von 33 kD, bestehend aus der B-Kette und dem Carboxylende der A-Kette (uPA von geringem Molekulargewicht), und in ein nicht-katalytisches Fragment von 17 kD bestehend aus dem N-Ende der A-Kette, umgewandelt werden.
  • uPA spaltet eine einzige Peptidbindung im Plasminogen und verwandelt es dadurch in Plasmin, das ein großes Spektrum von Proteinen, einschließlich Fibronectin, Fibrin und Laminin (für einen Überblick siehe Litverz. (1)) abbaut. Zusätzlich aktiviert Plasmin latente Formen einiger Metalloproteasen (4) und beeinflusst verschiedene Wachstumsfaktor-Systeme, indem es z.B. latentes TGF-β (5,6) aktiviert sowie IGF-I aus seiner Proteinbindung (7) und bFGF von der Oberfläche einiger Zelltypen (8) dissoziiert.
  • Viele Cytokine und Hormone kontrollieren die Expression von uPA auf zellspezifische Weise (siehe Literaturverzeichnis (9)).
  • uPA wird von vielen Zellkulturtypen mit neoplastischem Ursprung hergestellt. Man hat herausgefunden, dass Explantate von Tumorgewebe mehr uPA freigesetzt haben als das entsprechende normale Gewebe. uPA wurde in Extrakten von Karzinomen der menschlichen Lunge, des Darms, des Endometriums, der Brust, der Prostata und der Niere, in menschlichen Melanomen, in Brusttumoren der Maus, im Lewis-Lungentumor der Maus und bei Aszites (Bauchwassersucht) durch menschliche peritoneale Karzinomatose, identifiziert. Eine immunohistologische Studie an invasiv wachsenden und metastatischen Lewis-Lungenkarzinomen von Mäusen zeigte die ständige Anwesenheit von uPA, aber auch eine deutliche Heterogenität des uPA-Gehaltes in verschiedenen Teilen der individuellen Tumore. In Gebieten mit invasivem Wachstum und Abbau des umgebenden normalen Gewebes fand man einen hohen uPA-Gehalt, während andere Gebiete ohne nachweisbares uPA waren. Das uPA befand sich im Zytoplasma der Tumorzellen und umgab die Tumorzellen extrazellulär.
  • Der Abbau des umgebenden Gewebes ist ein zentrales Kennzeichen für die Invasivität eines bösartigen Tumors. Das dauerhafte Vorhandensein von uPA in bösartigen Tumoren und die Befunde, die darauf hindeuten, dass uPA beim Gewebeabbau bei normalen physiologischen Ereignissen eine Rolle spielt, führten zu der Annahme, dass uPA bei der Krebsentwicklung eine ähnliche Rolle spielt. Die Hypothese, dass uPA bei der Gewebezerstörung eine Rolle spielt, hat die Annahme zur Folge, dass Plasmin zusammen mit anderen proteolytischen Enzymen die extrazelluläre Matrix abbaut. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass die meisten Komponenten der extrazellulären Matrix von Plasmin abgebaut werden können. Dazu gehören Laminin, Fibronektin, die Proteoglykane und möglicherweise einige Kollagentypen, aber nicht alle. Zusätzlich kann Plasmin latente Kollagenapen aktivieren, die ihrerseits die anderen Kollagentypen abbauen können (4).
  • Viele Forschergruppen sind der Ansicht, dass invasive Tumorzellen Matrixabbauende Proteinasen absondern und dass das System zur Plasminogenaktivierung eine der kritischen Kaskaden ist. Die Regulation der Proteolyse kann auf verschiedenen Ebenen stattfinden, einschließlich Tumorzell- Wirtszell-Interaktionen und durch vom Wirt oder von den Tumorzellen selbst produzierte Inhibitoren der Protease. Die Expression der Matrix-abbauenden Enzyme ist nicht spezifisch für die Tumorzelle. Die aktiv eindringenden Tumorzellen können im Vergleich zu ihren nicht-invasiven Gegenstücken.lediglich auf verschiedene regulierende Signale antworten (10).
  • Die Annahme, dass das System zur Plasminogenaktivierung bei der Invasivität und Zerstörung von normalem Gewebe während des Wachstums bösartiger Tumore durch einen Zusammenbruch der extrazellulären Matrix-Proteine eine Rolle spielt, wird von vielfältigen Befunden unterstützt. Dazu gehören eine enge Korrelation zwischen der Transformation der Zellen mit onkogenen Viren und der Synthese von uPA, der Befund, dass uPA an der Gewebezerstörung bei vielen nicht-bösartigen Leiden beteiligt ist, und die immunohistochemische Lokalisation von uPA in Invasionsgebieten von Tumoren (siehe (1) für einen Überblick).
  • Weitere Unterstützung erhielt diese Hypothese durch Studien mit anti-katalytischen Antikörpern gegen uPA in Modell-Systemen für die Invasion und Metastasierung.. Man fand heraus, dass derartige Antikörper die Metastasierung der Lunge bei einem menschlichen uPA-produzierenden Tumor, HEp-3, der auf die chorioallantoide Membran von Hühnerembryonen transplantiert wurde (11, 12), das Durchdringen amniotischer Membranen durch B16 Melanomzellen (13), die Invasion der Basalmembran durch einige menschliche und Maus-Zelllinien neoplastischen Ursprungs (14) und die Bildung von Lungenmetastasen nach intravenöser Injektion von B16 Melanomzellen in Mäuse (15), verringern. Bei einigen dieser Studien (13, 14) schien eine von Plasmin katalysierte Aktivierung der Prokollagenasen ein entscheidender Teil der Wirkung der Plasminogenaktivierung zu sein.
  • PLASMINOGENAKTIVATOR-REZEPTOR VOM UROKIASE-TYP
  • Ein spezifischer Zelloberflächenrezeptor für uPA (uPAR) wurde zuerst durch eine sättigende Bindung von uPA an Monozyten und Monozyten-ähnliche Zellen entdeckt (16) und ist seitdem bei vielen Typen von kultivierten Krebszellen gefunden worden (17). Menschliches uPAR ist ein hochglykosyliertes Protein mit einer Polypeptidkette und einem Molekulargewicht von 55–60 kD (18). Es wird von einer 1,4 kB mRNA translatiert (19), die von einem einzigen Gen, das sich auf Chromosom 19 befindet, codiert wird. Es besteht aus drei homologen Domänen. Die Domäne des Aminoendes (Domäne 1) enthält die Ligand-bindende Region (20), die an die EGF-ähnliche Domäne im uPA-Molekül bindet (21). uPAR wird am Carboxylende durch eine Glykosyl-Phosphatidylinositol-Einheit an der Zelloberfläche verankert (22). Eine mögliche Funktion dieses Lipidankers ist die Erleichterung der Bewegung von uPAR auf der Zellmembran. uPAR kann von uPA und Plasmin gespalten werden, wobei Domäne 1 freigesetzt wird und die Domänen 2 und 3 auf der Zelloberfläche zurückbleiben (23).
  • uPAR bindet sowohl aktives uPA als auch pro-uPA mit einer hohen Affinität (Kd 10–9 – 10–11M ), die vom Zelltyp abhängt. Pro-uPA kann aktiviert werden, wenn es an einen Rezeptor gebunden ist und Rezeptor-gebundenes uPA ist katalytisch aktiv (17, 24). Die Bindung von pro-uPA an uPAR und die gleichzeitige Bindung von Plasminogen an die Zelloberfläche steigert die Plasminbildung stark (24, 25) und die Oberflächen der Zellen, die uPAR exprimieren, sind bevorzugte Bindungsstellen für die Plasminogenaktivierung unter physiologischen Bedingungen (26).
  • Die Aktivierung des Rezeptor-gebundenen pro-uPA wird wirkungsvoll von an der Oberfläche gebundenem Plasmin katalysiert, was zu einer starken Amplifikation der gesamten Plasminogenaktivierungsreaktion führt (24). Einige andere proteolytische Enzyme, einschließlich Plasmakallikrein (27) und Kathepsin B (28) können pro-uPA aktivieren. Die physiologische Bedeutung dieser zuletzt genannten Enzyme bei der pro-uPA-Aktivierung muss noch bestimmt werden und man weiß immer noch nicht, wie der uPA-Pfad der Plasminogenaktivierung in vivo initiiert wird.
  • Die uPAR-Synthese wird von Cytokinen wie etwa TGF-β1, TGF-β2, EGF und durch den Tumor-Promotor Phorbol-Myristat-Acetat reguliert. Diese Regulation ist in einigen Fällen bis zur Transkriptionsebene zurück verfolgt worden, Veränderungen in der Stabilität der uPAR-mRNA spielen aber auch eine Rolle ((29, 30) und L. Lund, persönliche Mitteilung).
  • PLASMINOGENAKTIVATOR-INHIBITOR VOM TYP 1 UND 2
  • Die uPA-Aktivität wird von zwei spezifischen Plasminogenaktivator-Inhibitoren, PAI-1 und PAI-2, kontrolliert (für einen Überblick siehe (31)). Diese Moleküle sind Produkte verschiedener Gene, die sich auf den Chromosomen 7 beziehungsweise 18 befinden. Sie sind beide Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50 kD und beide gehören zur Familie der Serinprotease-Inhibitoren (Serpin). PAI-1 und PAI-2 unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit uPA und tPA zu reagieren und auch hinsichtlich ihrer immunologischen Reaktionsfähigkeit. PAI-1 inaktiviert sich selbst in eine latente Form, wird aber durch Bindung an Vitronectin vor dieser Inaktivierung geschützt (32). uPA und tPA werden auch von Protease-Nexin 1 gehemmt, das im Gegensatz zu PAI-1 und PAI-2 auch andere Trypsin-ähnliche Proteasen, wie etwa Plasmin und Thrombin, hemmt (33). Die Inhibitoren binden an die katalytische B-Kette von aktivem uPA. Sie reagieren nicht mit pro-uPA. PAI-1 hemmt Rezeptor-gebundenes uPA beinahe genauso effektiv wie gelöstes uPA (24). Einige Zelltypen nehmen Komplexe zwischen uPA und PAI-1 oder PAI-2 auf und bauen sie ab (34). In einigen Fällen scheint diese Aufnahme von der Bindung an den uPA-Rezeptor abhängig zu sein (35) und jüngste Berichte deuten darauf hin, dass der α-2-Makroglobulin-Rezeptor bei der Internalisation von uPA/PAI-1-Komplexen bei einigen Zelltypen ebenfalls eine Rolle spielt (36). Sowohl die Expression von PAI-1 als auch diejenige von PAI-2 wird von einer Vielzahl von Cytokinen, Wachstumsfaktoren und Hormonen reguliert (31). Die Regulation der verschiedenen Komponenten des uPA-Systems scheint voneinander unabhängig zu sein (9, 29–31).
  • LOKALISATION DES SYSTEMS ZUR PLASMINOGENAKTIVIERUNG DURCH DIE UROKINASE IN KREBSGEWEBE
  • Studien über das Vorkommen und die Lokalisation der verschiedenen Komponenten des uPA-Systems haben gezeigt, dass sowohl uPA als auch uPAR bei den meisten experimentellen und menschlichen Krebserkrankungen, die bisher untersucht worden sind, an invasiven Brennpunkten exprimiert werden. Diese Studien wurden sowohl mittels Immunhistochemie auf Protein-Ebene als auch durch in situ Hybridisierung auf mRNA-Ebene durchgeführt. Aufgrund der starken Amplifkation der proteolytischen Aktivität, die für die Plasminogenaktivator-Kaskade charakteristisch ist, liegen uPA und uPAR in Geweben in sehr geringer Konzentration vor.
  • Im hochgradig invasiven Lewis Lungenkarzinom der Maus werden uPA-Protein (37) und mRNA (70) an invasiven Brennpunkten ständig von den Krebszellen exprimiert, und mit Hilfe einer kürzlich isolierten cDNA für Mäuse-uPAR (38) fand man heraus, dass die uPAR-mRNA auch in diesem experimentellen Karzinom durch die sich ausbreitenden Krebszellen exprimiert wird (J. Eriksen, persönliche Mitteilung). In den invasiven Gebieten des Lewis Lungenkarzinoms findet man kein PAI-1-Protein, es wird aber von den Krebszellen in nicht-invasiven Gebieten exprimiert, was darauf hindeutet, dass dieser Inhibitor beim Schutz des Tumorgewebes gegen den proteolytischen Abbau eine Rolle spielt (39).
  • Es ist ein interessanter Befund, dass Zellen des Lewis Lungenkarzinoms bei der Migration in das umgebende normale Gewebe, ohne es dabei abzubauen, oft sowohl uPA-mRNA als auch PAI-1-mRNA exprimieren (P. Kristensen, persönliche Mitteilung), was darauf hindeutet, dass die uPA-Aktivität, die von PAI-1 reguliert wird, an der Migration von Krebszellen beteiligt ist. Die deutliche Lokalisation von uPA, das man bei einigen Zellkulturtypen bei Zell-Zell-Kontakten und lokalen Zellsubstratkontakten fand, spricht ebenfalls für eine Rolle von uPA und PAI-1 bei der Zellmigration. Diese Zellen produzieren auch PAI-1, das dabei helfen kann die uPA-Aktivität zu regulieren, die dadurch befähigt wird, während der Zellbewegung mit einem zielgerichteten Aufbrechen dieser Kontakte, zu reagieren (72). Für eine Beteiligung von uPA und PAI-1 an der Migration und Metastasierung von Krebszellen spricht des weiteren der Befund, dass von 5 Melanom-Zelllinien diese 2, die sowohl uPA, uPAR als auch PAI-1 produzierten, bei einem Matrix-abbauenden Test in vitro am effektivsten waren und in vivo bei nackten Mäusen am häufigsten Lungenmetastasen auslösten (71).
  • Von den menschlichen Krebsformen wurden die Kolon-Adenokarzinome hinsichtlich der Expression von Komponenten des Plasminogenaktivator-Systems am intensivsten erforscht. Sowohl uPA als auch uPAR sind an den invasiven Brennpunkten ständig vorhanden, aber man findet uPA-Protein (40) und mRNA (41) nicht in den Krebszellen, sondern in Fibroblasten-ähnlichen Stromazellen, die gegenüber von den sich ausbreitenden Krebszellen liegen. uPAR- mRNA (41) und Protein (C. Pyke, nicht veröffentlichte Ergebnisse) befinden sich in Krebszellen und in den Tumor infiltrierenden Makrophagen. Deshalb können die bösartigen Zellen und die Makrophagen bei dieser Krebsform vermutlich uPA, das von den Fibroblastenähnlichen Zellen freigesetzt wird, binden und benutzen. In Kolon-Adenokarzinomen wird die mRNA von PAI-1 von Endothelzellen im Tumorstroma exprimiert (42), während im umgebenden normalen Gewebe keine PAI-1-Expression erfolgt, was darauf hindeutet, dass PAI-1 auch bei dieser Krebsart beim Schutz des Tumorgewebes vor Abbau, eine Rolle spielt. Eine andere mögliche Rolle von PAI-1 ist die Beteiligung am Prozess der Tumor-Angiogenese (77).
  • Beim menschlichen Plattenepithelkarzinom der Haut werden sowohl uPA als auch die mRNA von uPAR von den sich ausbreitenden Krebszellen exprimiert (43, 44). Beim Mammadrüsenkarzinom ist die Immunreaktivität von uPAR in Makrophagen, die die invasiven Brennpunkte infiltrieren, lokalisiert (45), während die uPA-mRNA in den gegenüberliegenden Fibroblasten-ähnlichen Zellen, und in manchen Fällen auch in den Krebszellen, gefunden wird (43, 46). PAI-1 wurde immunohistochemisch in Endothelzellen, Krebszellen und in einigen nicht-bösartigen Epithelzellen bei Brustkrebs, entdeckt (47).
  • Somit zeigen diese Untersuchungen, dass es eine ständige Expression von uPA und uPAR an invasiven Brennpunkten und von PAI-1 in nicht-invasiven Gebieten von bösartigen Tumoren, sowie in Endothelzellen entlang der Tumorgefäße, gibt, und dass einige der Komponenten des uPA-Systems während der Krebsinvasion von den Stromazellen exprimiert werden.
  • Kürzlich fand man eine ähnliche Expression von Stromazellen bei einigen Metalloproteasen, von denen man annahm, dass sie an der Krebsinvasion beteiligt sind (48–52) und man erkennt jetzt allmählich, dass Stromazellen oft aktiv am invasiven Prozess beteiligt sind (für einen neuesten Überblick siehe (53)).
  • PROGNOSTISCHE BEDEUTUNG VON uPA UND PAI-1 BEI BRUSTKREBS
  • In der ersten Studie, die den uPA-Gehalt von Brustkrebsgewebe mit der Prognose für die Patientin in Zusammenhang brachte (54), ermittelte man den uPA-Spiegel, indem man die Enzymaktivität in den Tumorextrakten testete und nachwies, dass mit einer hohen Aktivität ein signifikant kürzeres beschwerdefreies Interval einherging. Nachfolgende Studien, die den uPA-Gehalt mit ELISA ermittelten, zeigten, dass ein hohes Niveau in der Immunoreaktivität von uPA nicht nur mit einer kürzeren rückfallfreien Überlebensrate, sondern auch stark mit einer kurzen gesamten Überlebensrate zusammenhing (55–58).
  • Jänicke et al., (56) fanden in einer Studie mit 115 Patienten bei einer mittleren Beobachtungszeit von 12,5 Monaten heraus, dass Patienten mit hohen uPA-Spiegeln eine signifikant kürzere beschwerdefreie Überlebensrate bei einem relativen Risiko von 21,1 (95% Sicherheit Interval 2,6-174,6) hatten. Diese Zuordnung war signifikant, sowohl bei Patientinnen ohne Knoten als auch bei Patientinnen mit Knoten. In ähnlicher Weise fanden Duffy et al., (55) eine signifikante Korrelation zwischen Überlebensrate und uPA-Spiegel bei 166 Brustkrebspatientinnen, bei einem mittleren Beobachtungszeitraum von 34 Monaten und einem relativen Risiko von 11,3 (95% Sicherheit Interval 1,22-99,0).
  • Diese beiden Studien wurden mit detergentienhaltigen Extrakten von Brustkrebsgewebe durchgeführt. Diese Extrakte enthalten mehr uPA als Extrakte, die man mit detergentienfreien Puffern durchführt, wie etwa denjenigen, die für die routinemäßige Herstellung von Cytosolen für Steroidhormonrezeptoren verwendet werden (59). Mit Hilfe einer Kombination aus einer polyklonalen Antikörperzubereitung und drei monoklonalen Antikörpern wurde ein ELISA entwickelt, der die Immunoreaktivität von uPA in Cytosolen leicht erkennt. Obwohl die Cytosole nur etwa 12% der optimal extrahierbaren uPA-Immunoreaktivität enthalten, gibt es eine enge Korrelation zwischen dem uPA in den Cytosolen und der maximal extrahierbaren Menge (59). Mit diesem uPA-ELISA wurde an gelagerten Cytosolen von 190 Patientinnen in der Prä- und Postmenopause mit hohem Risiko, die von der Danish Breast Cancer Cooperative Group protokolliert wurden und einen mittleren Beobachtungszeitraum von 8,5 Jahren hatten, eine retrospektive Studie durchgeführt (58). In dieser Studie war ein hoher uPA-Gehalt im Cytosol sowohl bei Patientinnen in der Prä- als auch in der Postmenopause signifikant mit einer kurzen Gesamtüberlebensrate assoziiert, das relative Risiko lag bei 2,0 (95% Sicherheit Interval 1,1-3,7) bei Frauen in der Prämenopause.
  • In einer kürzlich durchgeführten Studie von Foekens et al (60) wurde uPA im Brustkrebscytosol von 671 Frauen ermittelt. Man fand heraus, dass uPA sowohl in der Gruppe der Patientinnen ohne Knoten als auch in der Gruppe der Patientinnen mit Knoten signifikant mit einer rückfallfreien Überlebensrate und dem Tod assoziiert war.
  • Somit scheint ein hoher PAI-1-Spiegel in Brustkrebsgewebe, wie mit ELISA bestimmt, mit einer schlechten Prognose verbunden zu sein (57, 58). Jänicke et al. (57) fanden in einer Studie mit 113 Patientinnen bei einer mittleren Beobachtungszeit von 25 Monaten heraus, dass Patientinnen mit einem hohen PAI-1-Spiegel in ihrem Primärtumor eine signifikant kürzere rückfallfreie Überlebensrate hatten als Patientinnen mit niedrigem PAI-1-Spiegel, wobei das relative Risiko bei 2,8 lag (95% Sicherheit Interval 0,98-8,3). In der dänischen Studie mit 190 Brustkrebspatientinnen mit hohem Risiko (58), bestand eine signifikante Korrelation zwischen einem hohen PAI-1-Spiegel in Cytosolextrakten und einer kurzen Gesamtüberlebensrate sowie einer kurzen rückfallfreien Überlebensrate, sowohl bei Patientinnen in der Prä- als auch in der Postmenopause, wobei das relative Risiko im Hinblick auf die Gesamtüberlebensrate bei Frauen in der Postmenopause bei 2,9 lag (95% Sicherheit Interval 1,5-5,8).
  • Zwischen den uPA-, und den PAI-1-Spiegeln in Brustkrebsgewebe besteht eine positive Korrelation (47, 57, 58), während die zwei Parameter in den verschiedenen Studien nicht oder nur schwach mit dem Östrogen- und dem Progesteronrezeptorspiegel assoziiert sind. In multivariablen Analysen, die etablierte Prognoseparameter, wie etwa die Anzahl tumorhaltiger Lymphknoten, Tumorgröße und Östrogen- und Progesteronrezeptorspiegel umfassen, fand man heraus, dass es sich innerhalb der meisten untersuchten Patientengruppen sowohl bei den uPA- als auch bei den PAI-1-Spiegeln um unabhängige und statistisch signifikante Prognoseparameter handelt (55, 57, 58). Somit scheint die Bestimmung der uPA- und PAI-1-Spiegel signifikante prognostische Information zu derjenigen hinzuzufügen, die man durch die etablierten Parameter erhielt. Es sollte beachtet werden, dass man diese Information, zumindest bezogen auf den PAI-1-Spiegel, von Cytosolen erhalten kann, die routinemäßig zur Steroidhormonrezeptor-Analyse hergestellt werden.
  • AUSFÜHRLICHE BECHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Tatsache, dass ein hoher PAI-1-Spiegel im Tumorgewebe bei Brustkrebs und auch beim Lungenadenokarzinom (siehe Beispiel 1) mit einer schlechten Prognose verbunden ist, deutet darauf hin, dass PAI-1 Tumorwachstum, -invasion und/oder – metastasierung fördert. Wie oben erläutert, existieren einige Mechanismen, wie etwa der Schutz des Tumorgewebes gegen den Abbau durch das uPA-System, die Teilnahme an der Migration der Krebszellen, die Teilnahme an der Tumorangiogenese oder die Störung der Aktivierung/Inaktivierung von Wachstumsfaktoren, mit deren Hilfe PAI-1 eine derartig fördernde Rolle spielen könnte. Es ist wahrscheinlich, dass einige Inhibitoren anderer extrazellulärer proteolytischer Enzyme und anderer nicht-proteolytischer Matrix-abbauender Enzyme, eine ähnliche Rolle bei der Förderung von Tumorwachstum, -invasion und/oder -metastasierung, spielen.
  • Somit betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die die hemmende Aktivität von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe unterdrückt, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung von Wachstum, Invasion und/oder Metastasierung bösartiger Tumore in einem Patienten, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat.
  • Durch die Verwendung der Erfindung wird der hemmende Effekt von PAI-1 im bösartigen oder potentiell bösartigen Tumorgewebe unterdrückt, gehemmt oder neutralisiert, wodurch der Abbau des bösartigen Tumorgewebes oder des potentiell bösartigen Tumorgewebes ermöglicht wird. Mit dem Begriff "Unterdrückung" meint man, dass die hemmende Aktivität eines Inhibitors der Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms signifikant reduziert wird, beispielsweise mit einem Grad von mindestens 25%, aber vorzugsweise mit einem höheren Grad wie etwa 50%, 60%, 70% oder sogar mehr, wie etwa 75%, 80% 90% oder 95%. Der Grad der Hemmung von PAI-1 durch verschiedene Verbindungen kann mit Hilfe geeigneter Hemmungstests ermittelt werden. Im vorliegenden Zusammenhang sollte der Begriff "Verbindung" im weitesten Sinn als eine Substanz verstanden werden, die aus zwei oder mehr Elementen zusammengesetzt ist, so dass die Atome der Elemente fest miteinander verbunden sind und in definierten Verhältnissen vorliegen, so dass der Begriff sowohl herkömmliche chemische Verbindungen als beispielsweise auch Antikörper einschließt. Beispiele für solche Tests, die man getrennt voneinander oder aufeinanderfolgend verwenden kann, werden in den Beispielen 4, 5 und 6 unter Verwendung des Inhibitors PAI-1 als Beispiel, beschrieben. Für den Fachmann wird es offensichtlich möglich sein, basierend auf den Lehren der Spezifikation, andere ähnliche Tests zum Zweck der Überprüfung von Verbindungen, die in der Lage sind, die hemmende Aktivität eines Inhibitors der Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms zu unterdrücken, zu entwickeln und zu verwenden.
  • Somit bezieht sich der oben erwähnte Grad der Unterdrückung auf in vitro-Tests, während die Unterdrückung in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe stattfinden muß. Es ist daher erforderlich, die Verbindungen, die sich bei in vitro-Tests und/oder bei in vivo-Tierversuchssystemen als hemmend erwiesen haben, auch in klinischen Studien zu testen, um zu ermitteln, ob eine bestimmte Verbindung zur Verwendung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, wobei die Planung und Durchführung von derartigen klinischen Studien dem Fachmann überlassen bleibt.
  • Mit dem Begriff "ein Patient, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat", ist ein Mensch gemeint (oder ein Tier), von dem man mit Hilfe aller Untersuchungsmethoden oder Tests, die der Medizin und der Chirurgie zur Verfügung stehen, ermittelt hat, dass er einen bösartigen Tumor entwickelt hat. Mit dem Begriff "ein hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen Tumors haben", ist beabsichtigt, die Situation mit einzubeziehen, in der es nicht endgültig ermittelbar ist, ob der Mensch oder das Tier einen bösartigen Tumor entwickelt hat, man aber in Erwägung ziehen muß, dass er oder sie mit hoher Wahrscheinlichkeit einen bösartigen Tumor entwickelt hat oder ihn in naher Zukunft, beispielsweise innerhalb der kommenden Tage, Monate oder Jahre entwickeln wird. Eine derartige Situation wird z.B. nach der Operation eines bösartigen Tumors entstehen, wenn man nicht generell ausschließen kann, dass es bereits zur Metastasierung gekommen ist, sowie bei bestimmten klinischen Situationen, wenn einer oder eine Anzahl klinischer Labortests darauf hindeuten, dass der Patient einen bösartigen Tumor entwickelt hat, es jedoch nicht möglich ist, den Tumor zu lokalisieren und auch in Situationen, bei denen der Patient eine Menge eines Tumormackers, wie etwa eines Serum-Tumormarkers, besitzt, die ein hohes Risiko anzeigt, oder ein Gen oder Genprodukt aufweist, das anzeigt, dass der Patient ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln. Beispiele für solche Tumormarker sind im Fachgebiet gut bekannt.
  • Der Begriff "bösartiger Tumor" oder "bösartiges Tumorgewebe" dient zur Bezeichnung der bösartigen Tumorzellen selbst, einschließlich Mikrometastasen, sowie der extrazellulären Matrix und der Stromazellen des bösartigen Tumors, beispielsweise Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen, Leukozyten etc.
  • Der Begriff "potentiell bösartiges Tumorgewebe" dient zur Bezeichnung von Gewebe, das das Potential hat, sich zu einem bösartigen Tumor zu entwickeln; als ein Beispiel für potentiell bösartiges Tumorgewebe kann das in situ Karzinom erwähnt werden.
  • Der Begriff "Matrix-abbauendes Enzym" wie er hier verwendet wird, bedeutet ein Enzym, das in der Lage ist, Bestandteile der extrazellulären Matrix, d.h. Proteine, abzubauen. Proteasen sind wichtige Matrix-abbauende Enzyme und folglich ist das oben erwähnte Verfahren, worin die Protease-hemmende Aktivität eines Inhibitors der Protease unterdrückt wird, ein wichtiger Aspekt der Erfindung. Dennoch spielen auch nicht-proteolytische Enzyme, z.B. Enzyme zum Abbau der extrazellulären Proteoglykane, beim Matrixabbau eine Rolle.
  • Gemäß der Erfindung ermöglicht eine derartige Unterdrückung der hemmenden Aktivität von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe, dass PAI-1 direkt oder indirekt das bösartige oder potentiell bösartige Tumorgewebe abbaut; und/oder zu einer Störung des Prozesses der Tumor-Angiogenese, und/oder zu einer Störung der Migrationsfähigkeit der bösartigen Tumorzellen oder von anderen Zellen im Tumorstroma, und/oder zu einer Störung der Wirkung von Wachstumsfaktoren führt.
  • Mit dem Begriff "Migrationsfähigkeit" wie er hier verwendet wird, ist die Fähigkeit von Tumorzellen in nicht-bösartiges Gewebe einzudringen, gemeint. Somit bezieht sich der Begriff sowohl auf die Invasivität von Tumorzellen als auch auf ihre Fähigkeit zur Metastasenbildung. Eine Störung der Migrationsfähigkeit wird daher zu einer Reduktion sowohl der Invasivität als auch der Fähigkeit zur Bildung von metastatischem Gewebe führen.
  • Der Patient kann ausschließlich mit der Zusammensetzung, die unter Verwendung der Verbindung hergestellt wurde, behandelt werden. In einigen Fällen wird der Patient jedoch auch anderen Behandlungsformen unterworfen, beispielsweise einer Operation, bei der das bösartige Tumorgewebe entfernt wird. In derartigen Fällen kann man die Zusammensetzung als Behandlung mit neuen Adjuvantien, als präoperative Behandlung, als Behandlung mit Adjuvantien oder als jede mögliche Art der Kombination dieser Behandlungen verwenden. Auch Kombinationen aus zytotoxischen Arzneistoffen, endokriner Therapie und Bestrahlung stellen mögliche Behandlungsstrategien dar.
  • Unter gewissen Umständen hat man noch nicht festgestellt, dass eine Person einen bösartigen Tumor entwickelt hat, es wird jedoch als sehr wahrscheinlich angenommen, dass er oder sie dabei ist, einen bösartigen Tumor zu entwickeln oder einen bösartigen Tumor entwickelt hat, aber man hat den Tumorort noch nicht festgestellt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Patient um einen Patienten, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen Tumors hat, dadurch dass er beispielsweise eine Menge eines Tumormarkers, wie etwa eines Serum-Tumormarkers, besitzt, die ein hohes Risiko anzeigt, oder dadurch dass er ein Gen oder Genprodukt aufweist, das anzeigt, dass der Patient ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln.
  • Bei einigen bösartigen Tumortypen, z.B. Brustkrebs, wie oben beschrieben, hat man festgestellt, dass eine erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, wobei es sich bei dem Inhibitor um PAI-1 handelt, ein Prognosefaktor ist, der für den Patienten mit dem fraglichen Typ des bösartigen Tumors eine schlechte Prognose anzeigt. Die "erhöhte Konzentration" kann demnach oberhalb eines festgelegten "Normalwertes" beispielsweise für eine Plasmaprobe oder Gewebeprobe eines bestimmten Gewebes liegen, oder bei einem bestimmten Tumor kann die Konzentration hoch sein, wenn man die Werte der verschiedenen Tumore des gleichen Typs vergleicht (siehe als ein Beispiel das Beispiel 1).
  • Eine sehr wichtige Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft somit eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei der Patient ein Patient ist, der im Tumorgewebe und/oder im Plasma und/oder im Serum eine erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms aufweist, wobei es sich bei dem Inhibitor um PAI-1 handelt. Die erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms im bösartigen Tumorgewebe und/oder im Plasma wird prä- oder postoperativ festgestellt oder sie könnte basierend auf einer Plasmaprobe (mit oder ohne Operation) oder einer Probe des bösartigen Tumors, z.B. einer Biopsie, festgestellt werden.
  • Diejenige Ausführungsform ist relevant, in der der Patient einen bösartigen Tumortyp hat, von dem bereits festgestellt wurde, dass eine erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, wobei es sich bei dem Inhibitor um PAI-1 handelt, im bösartigen Tumorgewebe und/oder im Plasma, mit einer schlechten Prognose verbunden ist. Bei einigen bösartigen Tumortypen weiß man noch nicht, ob eine erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms ein Prognosefaktor ist, der für den fraglichen Typ des bösartigen Tumors eine schlechte Prognose anzeigt. Man kann für einen bösartigen Tumortyp die prognostische Menge der erhöhten Konzentration des Inhibitors der Protease des bösartigen Tumorgewebes oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und/oder einer erhöhten Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms im Plasma feststellen, indem man einen spezifischen Test für den Inhibitor der Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym verwendet. Als ein Beispiel für die Feststellung einer solchen prognostischen Menge für einen bestimmten Krebstyp dient Beispiel 1, das sich unter Verwendung eines PAI-1-ELISA auf Lungenkrebs bezieht.
  • Anwendbar ist auch ein Verfahren zur Feststellung des Prognosewertes, um aus der Behandlung mit einer Verbindung, die die hemmende Aktivität eines Inhibitors der Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe eines individuellen Patienten unterdrückt, einen Nutzen zu ziehen, z.B. um die Wahrscheinlichkeit einer Antwort auf eine Behandlung mit der Verbindung in einem individuellen Patienten vorherzusagen. Beispiele für Typen bösartiger Tumore, für die man das festgestellt hat, sind die Mammakarzinome, die urologischen Karzinome, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, die gynäkologischen Karzinome, z.B. Eierstockkrebs und Cervixkarzinom, die großzelligen Lungentumore, Magen-Darm-Krebs, z.B. Kolon-Adenokarzinom und Magenkarzinomen, Gehirntumore, Sarkome, hämatologische Bösartigkeit, z.B. Lymphome und Hautkrebs, z.B. Melanom und Plattenepithelkarzinom der Haut. Im Schutzumfang der Erfindung sind auch alle anderen Krebstypen, wie etwa Kopf und Nackenkrebs, für die festgestellt wurde, dass eine erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms ein Prognosefaktor ist oder einen Prognosewert hat.
  • Im Schutzumfang der Erfindung ist somit auch eine erfindungsgemäße Verwendung, bei der festgestellt wurde, dass die erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms ein Prognosefaktor ist, der die Wirksamkeit der Behandlung des fraglichen Typs des bösartigen Tumors mit dem Suppressor des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms anzeigt. Ein Beispiel für einen Prognosetest zur Identifikation von Patienten, die möglicherweise von einer derartigen Behandlung profitieren werden, wird in Beispiel 2 mit dem bronchiogenen Adenokarzinom als Beispiel beschrieben. Ähnliche Versuche können mit anderen Tumortypen gemacht werden.
  • Wie man in Beispiel 2 sehen kann, wird in Erwägung gezogen, dass die Wirksamkeit der Behandlung von Patienten, die an einer bösartigen Neoplasie, umfassend die Hemmung eines Inhibitors der Protease, leiden, durch die Bestimmung der Menge des Inhibitors der Protease im neoplastischen Gewebe oder in den Proben, die man den Patienten entnommen hat (Plasma, Serum, Urin etc.), a priori bewertet werden kann. Somit wird es möglich sein, beispielsweise durch die Bestimmung des PAI-1-Spiegels im Tumorgewebe eines Patienten, festzustellen, ob es medizinisch in jeder Hinsicht gerechtfertigt ist, die Behandlung des Patienten mit der PAI-1-Hemmung zu beginnen.
  • Bei Verwendung der Zusammensetzung wird das oben definierte Tumorgewebe abgebaut, während im wesentlichen kein anderes Gewebe als das bösartige Tumorgewebe in einem Ausmaß oder Grad abgebaut wird, das/der inakzeptable Nebenwirkungen verursacht.
  • PAI-1 wird von den bösartigen Tumorzellen selbst, einschließlich Mikrometastasen, ausgeschieden und/oder von den stromalen Komponenten des bösartigen Tumors, z.B. von Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen, Leukozyten etc.
  • Die Erfindung betrifft insbesondere verschiedene Verwendungen, in deren Verlauf die Aktivität von PAI-1 im Tumorgewebe gehemmt wird, indem man dem Patienten eine Verbindung verabreicht, die die Plasminogen-Aktivator-hemmende Aktivität von PAI-1 unterdrückt.
  • Wie man in Beispiel 6 sehen kann, wurde eine derartige Verbindung identifiziert, nämlich der Antikörper PAI-1-Klon 2 (WO 87/00549). In engen Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei diesem Antikörper, aktiven Fragmenten davon und/oder immunologischen Äquivalenten davon, um die dem Patienten verabreichte Verbindung. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieses Antikörpers zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung neoplastischer Bösartigkeiten.
  • Die Antikörper können als ganze Antikörper, als Fragmente davon (z.B. FV, (FV)2, Fab, Fab', F(ab)2), sowie als chimärische, humanisierte oder menschliche Antikörper verwendet werden, solange sie PAI-1 auf passende Art binden. Kurzkettige Antikörperfragmente, die nur die CDR-Regionen oder Teile davon enthalten, die die spezifische Bindung an PAI-1 übertragen, sind auch geeignet, besonders wenn es sich um einen markierten Antikörper handelt.
  • Der Begriff "aktives Fragment" bedeutet in diesem Zusammenhang ein bindendes Fragment des Moleküls, das auch in der Lage ist, die gleichen biologischen Effekte am Zielmolekül hervorzurufen wie der Antikörper selbst, obwohl in manchen Fällen erst bei höheren Konzentrationen als der Antikörper. Mit dem Begriff "immunologisches Äquivalent" ist eine Substanz gemeint, die im wesentlichen die gleiche Bindungsspezifität aufweist wie der Antikörper und auf das Zielmolekül im wesentlichen die gleichen Effekte ausübt, wie der Antikörper, obwohl in manchen Fällen erst bei höheren Konzentrationen als der eigentliche Antikörper.
  • Zur Prävention einer Immunantwort verwendet man bevorzugt Antikörper/Verbindungen, die den Antikörpern menschlichen Ursprungs so ähnlich wie möglich sind. Derartige Antikörper sind, zum Beispiel, chimerische oder humanisierte (CDR-transplantierte) Antikörper. Gewöhnlich werden derartige Antikörper aus monoklonalen Nagetier-Antikörpern hergestellt (siehe z.B. als Überblick: Morrison (1992), Annu. Rev. Immunol. 10, 239–265; Winter und Milstein (1991), Nature 349, 293–299). In einer ausdrücklich bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man Tumor-spezifische menschliche Antikörper für therapeutische Zwecke (Borrebaeck et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3995–3999; Borrebaeck (1988), Immunol. Today 9, 355–359). Zusätzlich wird es ausdrücklich bevorzugt, menschliche Mabs über Phagen-Display-Genbanken herzustellen, wie zum Beispiel bei Griffith et al., EMBO J. 12 (1993) 725–734, beschrieben.
  • Auch die Antikörper von Schweinen wie in US 4,132,768 offenbart, erwiesen sich als nicht-immunogen oder nur sehr schwach immunogen im Menschen.
  • Die bei der Therapie verwendeten Verbindungen können unter Verwndung von pharmazeutisch bekannten Formen parenteral verabreicht werden, wie etwa intravasculär, subkutan oder intramuskulär. Die aktiven Arzneistoffkomponenten der vorliegenden Erfindung werden in flüssiger Form, als Puder oder in lyophilisierter Form verwendet und können mit einem geeigneten Lösemittel oder Trägerstoff, wie etwa Wasser, Kochsalzlösung, wässriger Dextrose, wässrigem Puffer und ähnlichem, kombiniert werden. Konservierungsstoffe können ebenfalls hinzugefügt werden.
  • Unabhängig von der ausgewählten Verabreichungsform, werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen mit herkömmlichen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, in pharmazeutisch verträglichen Dosierungsformen formuliert. Die Verbindungen können auch mit Hilfe pharmakologisch verträglicher Säure- oder Basezusatzsalze formuliert werden. Außerdem können die Verbindungen oder ihre Salze in einer geeigneten hydrierten Form verwendet werden.
  • Unabhängig von der ausgewählten Verabreichungsform wird bei jeder Behandlung eine nicht-toxische, aber therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer Verbindungen, die in dieser Erfindung verwendet werden, eingesetzt. Das Dosierungsverfahren zur Behandlung wird ausgewählt in Übereinstimmung mit einer Anzahl von Faktoren wozu der Typ, das Alter, das Gewicht, das Geschlecht und die medizinischen Beschwerden des Patienten, der Tumortyp, die Verabreichungsform und die jeweilige zur Behandlung verwendete Verbindung, gehören. Ein Facharzt kann die wirksame Menge des erforderlichen Arzneistoffes unter Berücksichtigung bekannter Antikörper-Therapieverfahren leicht bestimmen und verschreiben. Indem er so vorgeht, könnte der Arzt zuerst relativ niedrige Dosen einsetzen und die Dosis anschließend bis zum Erreichen einer maximalen Antwort erhöhen.
  • Die oben beschriebene Verwendung umfasst auch eine, in deren Verlauf die Verbindung eine Verbindung ist, die die Plasminogen-Aktivator-hemmenden Aktivität von PAI-1 unterdrückt, indem die Bindung von PAI-1 an Vitronectin gehemmt wird und eine Verwendung, in deren Verlauf die Verbindung eine Verbindung ist, die zwar die Bindung von PAI-1 an uPA, nicht jedoch die Bindung von uPA an uPAR hemmt. Ein Beispiel für eine geeignete Verbindung ist eine Verbindung, die in der Lage ist, PAI-1 zu binden, die aber nicht in der Lage ist, Plasminogen in Plasmin zu verwandeln, beispielsweise eine nicht-katalytische Variante, ein Derivat oder ein Analog von uPA. Ein anderes Beispiel für eine geeignete Verbindung ist ein Antikörper, der in der Lage ist, an PAI-1 zu binden und dadurch die Inaktivierung von uPA hemmt. Ein drittes Beispiel ist eine Verbindung, die an die Protease bindet, beispielsweise uPA, wodurch die Wirkung des Inhibitors verhindert, die Protease aber nicht gehemmt wird. Eine derartige Verbindung kann ein Antikörper gegen die Protease sein. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann die Verbindung, die in der Lage ist, an einen Inhibitor der Protease zu binden, einen zytotoxischen Wirkstoff haben, der an die Verbindung gekoppelt ist.
  • In einer kürzlich durchgeführten in situ-Hybridisierungsstudie, fand man heraus, dass sich die mRNA von PAI-1 in Endothelzellen des Tumorstromas von invasiven Brustdrüsenkarzinomen befindet (C. Pyke, unveröffentlichte Ergebnisse). Anschließende Immunohistochemie bestätigte die Lokalisation von PAI-1 in den Tumorgefäßen (C. Pyke, unveröffentlichte Ergebnisse).
  • Die Verbindung eines hohen PAI-1-Spiegels mit einer schlechten Prognose bei Brustkrebs kann mit den oben beschriebenen Befunden in Beziehung gebracht werden, wonach die PAI-1-mRNA von Zellen im Tumorstroma und nicht von Zellen im umgebenden normalen Gewebe exprimiert wird, was darauf hindeutet, dass es eine Funktion von PAI-1 ist, das Tumorgewebe gegen den proteolytischen Abbau, den der Tumor dem umgebenden normalen Gewebe aufzwingt, zu schützen. Somit kann die Hemmung von PAI-1 zu einem Abbau des Tumorstromas einschließlich der Tumorgefäße führen, und dadurch die Tumorausdehnung hemmen.
  • In Beispiel 3 wird die in situ-Hybridisierung von PAI-1-mRNA und die Immunofärbung von PAI-1-Protein in menschlichem Lungenkrebs beschrieben. Mit anderen Krebstypen, von denen man festgestellt hat, dass eine erhöhte Konzentration von PAI-1 ein Prognosefaktor ist, können ähnliche Experimente durchgeführt werden.
  • Um die Inhibitoren der Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym im Tumorgewebe zu neutralisieren, wäre es wünschenswert, eine lokale Therapie anzuwenden, womit man die potentiellen Nebenwirkungen auf normales Gewebe reduziert.
  • Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Screeningverfahren zur Auswahl von Verbindungen, die geeignet sind, zur Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors einer bestimmten Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, beispielsweise PAI-1 gegen uPA, wobei das Verfahren einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst:
    • 1) Ein Screening-Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms bestimmt wird durch Zugabe der Verbindungen zu einem System, das einen immobilisierten Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und solubilisierte(s) Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym umfasst, wobei die/das an den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms gebundene Protease oder nicht-proteolytische Matrixabbauende Enzym durch das markierte Enzym oder mittels eines markierten Antikörpers gegen die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende Enzym nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das immobilisierte Protease oder immobilisiertes nichtproteolytisches Matrix-abbauendes Enzym und einen solubilisierten Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms umfasst, wobei der an die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende Enzym gebundene Inhibitor der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms durch den markierten Inhibitor oder mittels eines markierten Antikörpers gegen den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms nachgewiesen wird.
    • 2) Ein Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der hemmenden Aktivität des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in dem Tumorgewebe bestimmt wird durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das einen radioaktiv markierten Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und Tumorzellen umfasst, die die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym exprimieren, und Nachweisen eines Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, das an die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym bindet, durch Gammazählen der Zellen.
    • 3) Ein Screening-Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors der Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms durch die Verbindung unter Verwendung ganzer Zellen bestimmt wird, an die die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende Enzym an die Oberfläche, beispielsweise durch einen Proteaserezeptor, wie uPA, an den uPA-Rezeptor gebunden ist. Der Test basiert auf dem Prinzip, das zur Bestimmung der Hemmung von Rezeptor-gebundenem uPA durch Plasminogenaktivator-Inhibitoren beschrieben wurde (61). Dieser Test basiert auf der Hemmung der Bildung von Plasmin mit Hilfe des Plasmin-spezifischen fluorogenen Substrates H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin (Bachem). Der hemmende Effekt der Testverbindung gegen PAI-1 wird dann durch einen Vergleich der Kurven der Plasminbildung, die man mit den verschiedenen Konzentrationen der Verbindung erhielt, mit den Kurven der Plasminbildung bei verschiedenen Konzentrationen von PAI-1, bestimmt.
    • 4) Verabreichung einer Verbindung, von der festgestellt wurde, dass sie die hemmende Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms im Tumorgewebe unterdrückt, an eine nackte Maus oder eine nackte Ratte, die mit bösartigen menschlichen Tumorzellen inokuliert wurde, die zur Invasion und/oder Metastasierung in der Maus oder Ratte in Anwesenheit der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und des Inhibitors der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in der Lage sind, und Auswählen einer Verbindung als eine geeignete Verbindung, die das Wachstum und/oder die Invasion und/oder die Metastasierung der bösartigen menschlichen Tumorzellen in der Maus oder Ratte hemmt. Die Tumorzellen, die zu diesem Test gehören, können entweder Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym bilden, aber nicht den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, wobei der Inhibitor entweder von Mauszellen oder von anderen menschlichen Zellen, mit denen die Maus inokuliert wird, geliefert wird; Tumorzellen, die den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms bilden, wobei die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym von Mauszellen oder von menschlichen Zellen, mit denen die Maus inokuliert wurde, geliefert wird; Tumorzellen, die sowohl die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende Enzym, als auch den Inhibitor der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms bilden oder Tumorzellen, die keine dieser Komponenten bilden, weder die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym, noch deren/dessen von Mauszellen oder inokulierten menschlichen Zellen gelieferten Inhibitor.
  • Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren mit PAI-1 als Inhibitor der Protease, wie oben beschrieben.
  • Es versteht sich, dass Verbindungen, die mit den oben beschriebenen Verfahren ausgewählt wurden, wertvolle Verbindungen sowohl im Verfahren der Erfindung zur Hemmung des bösartigen Tumorwachstums, der Migration etc., als auch in den erfindungsgemäßen Verwendungen sind. Eine solche Verbindung kann auch zur Herstellung von Arzneimitteln wie unten erläutert, verwendet werden.
  • Zur Erzeugung von Inhibitoren von PAI-1 kann alternativ auch ein Affinitäts-Screening der Aktivität von großen, hochgradig verschiedenen Genbanken von Peptiden, die auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagenpartikeln exprimiert werden, durchgeführt werden. Diese kürzlich entwickelte leistungsfähige Technik (81–84) basiert auf der Fähigkeit filamentöser Phagen, fremde Peptide auf ihren äußeren Oberflächen zu zeigen und benutzt das spezifische Screening und die Affinitätsaufreinigung von Bakteriophagen, um die Peptide, die Liganden für ein bestimmtes Protein sind, darzustellen (85). Genbanken von filamentösen Bakteriophagen sind zur Identifizierung von Peptiden, die an verschiedene Moleküle, wie etwa Streptavidin (86), HLA-Klasse-II-Protein (87) und sogar an ein Lectin (88) binden, erfolgreich verwendet worden.
  • Die Phagen-Display-Vektorensysteme pComb3 (89) und pComb8 (90), die ursprünglich zur Expression von Fab-Fragmenten entwickelt, aber ebenso erfolgreich zur Expression von PAI-1 (91) sowie von einer α2MR/LRP-Zufallsfragment-Genbank (92) verwendet wurden, führen zu monovalentem beziehungsweise multivalentem Display. Von jetzt an wird die Konstruktion von Peptid-Genbanken in beiden Phagen-Display-Vektoren pComb3 und pComb8 die Isolation von Bakteriophagen, die Peptide mit hoher beziehungsweise niedriger Bindungsneigung für PAI-1 enthalten, ermöglichen.
  • Folgende Schritte kann man, kurz gefasst, verwenden:
  • Imobilisierung von PAI-1 in Costar Mikrotitervertiefungen. Inkubation ("Panning") mit den oben erwähnten Phagen-Genbanken. Nach dem Waschen werden die gebundenen Phagen mit Glycin-HCl (pH 2,2) eluiert und neutralisiert. Eluierte Phagen werden dann reamplifiziert. Der Ablauf von Panning, Waschen, Elution und Amplifikation wird insgesamt dreimal wiederholt. Isolation von DNA von Phagen, die nach dem letzten Panning isoliert wurden und DNA "Peptid-Einschübe" der korrespondierenden Phagen werden gemäß der Standard DNA-Sequenzierungsverfahren sequenziert. Dann kann man synthetische Peptide herstellen und mit einem in vtro-Test ihre Fähigkeit, die PAI-1/uPA-Interaktion zu hemmen, überprüfen (siehe später). Übereinstimmende Peptidmuster, die als Inhibitoren der PAI-1-Funktion identifiziert wurden, werden auf jeder Seite zur Konstuktion von neuen Phagen-Display-Genbanken verlängert und das ganze dargestellte Verfahren wird zur Isolation von neuen Peptiden mit höheren Bindungsneigungen für PAI-1 wiederholt werden (93).
  • Die Tumorzellen, die im oben erwähnten Test eingesetzt werden, können zwar uPA herstellen, aber nicht PAI-1, wobei PAI-1 von Mauszellen oder menschlichen Zellen, womit man die Maus inokuliert hat, geliefert wird; Tumorzellen, die PAI-1 bilden, wobei das uPA von Mauszellen oder von menschlichen Zellen, womit man die Maus inokuliert hat, geliefert wird; Tumorzellen, die sowohl uPA als auch PAI-1 bilden oder Tumorzellen, die weder uPA noch PAI-1 bilden, wobei uPA und PAI-1 von Mauszellen oder anderen inokulierten menschlichen Zellen geliefert werden.
  • In einer wichtigen Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung, die ein Suppressor von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe ist, als eine Verbindung verwendet, beispielsweise zur Verwendung bei der Hemmung von bösartigem Tumorwachstum, Invasion und/oder Metastasierung in einem Patienten, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat, wie etwa eine Verbindung, die es der Protease oder dem nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzym ermöglicht, das bösartige Tumorgewebe oder das potentiell bösartige Tumorgewebe durch die Unterdrückung der hemmenden Aktivität von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe direkt oder indirekt abzubauen.
  • Die Erfindung betrifft vor allem eine Verbindung, die
    • 1) die hemmende Aktivität von PAI-1 unterdrückt, wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das immobilisiertes PAI-1 und solubilisierte Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym umfasst, wobei die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym die/das an PAI-1 gebunden ist, durch das markierte Enzym oder mit Hilfe eines markierten Antikörpers, der auf die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym gerichtet ist, nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem System umfassend immobilisierte Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym und solubilisiertes PAI-1 gebunden an die Protease oder an das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym, das durch markiertes PAI-1 oder mit Hilfe eines markierten Antikörpers, der auf PAI-1 gerichtet ist, nachgewiesen wird und/oder.
    • 2) die hemmende Aktivität von PAI-1 im Tumorgewebe unterdrückt, wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das radioaktiv markiertes PAI-1 und Tumorzellen, die die Protease oder das nicht-proteolytische Matrixabbauende Enzym exprimieren, umfasst und Nachweis jeglicher PAI-1-Bindung an die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym durch Gammazählen der Zellen, und/oder
    • 3) die hemmende Aktivität von PAI-1 unterdrückt, wie durch Verwendung ganzer Zellen bestimmt, an deren Oberfläche die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym beispielsweise durch einen Rezeptor der Protease, wie etwa uPA an den uPA-Rezeptor, gebunden ist, und/oder
    • 4) das Wachstum und/oder die Invasion und/oder Metastasierung menschlicher bösartiger Tumorzellen in einer nackten Maus oder einer nackten Ratte hemmt, wie bestimmt durch Verabreichung an die nackte Maus oder die nackte Ratte, die mit menschlichen bösartigen Tumorzellen inokuliert wurde, von denen bekannt ist, dass sie sich in Gegenwart der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und PAI-1 ausbreiten und/oder metastasieren und die in der Lage sind, zur Invasion und/oder Metastasierung in der Maus, die Verbindung, von der festgestellt wurde, dass sie die hemmende Aktivität von PAI-1 im Tumorgewebe unterdrückt.
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung, die die hemmende Aktivität von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe unterdrückt, um eine Zusammensetzung herzustellen, die bösartiges Tumorwachstum, Invasion und/oder Metastasierung in einem Patienten hemmt, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen Tumors hat oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat.
  • Die Erfindung betrifft vor allem die Verwendung wie oben beschrieben, wobei die Verbindung
    • 1) die uPA bindende Aktivität von PAI-1 hemmt, wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das immobilisiertes PAI-1 und solubilisiertes uPA umfasst, wobei das an PAI-1 gebundene uPA durch Markierung oder mittels eines markierten anti-uPA-Antikörpers nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das jmmobilisiertes uPA und solubilisiertes PAI-1 umfasst, wobei das an uPA gebundene PAI-1 durch Markierung oder mittels eines markierten anti-PAI-1-Antikörpers nachgewiesen wird, und/oder
    • 2) die Bindung von PAI-1 an uPA hemmt, wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das radioaktiv markiertes PAI-1 oder ein Derivat davon und Zellen umfasst, bei denen uPA an der Zelloberfläche an uPA-Rezeptoren gebunden ist, und Nachweisen von PAI-1 oder eines an uPA gebundenen Derivates durch Gammazählen der Zellen, und/oder
    • 3) die hemmende Wirkung von PAI-1 auf uPA unterdrückt, wie durch Zugabe der Verbindung zu einem System bestimmt, das PAI-1 und Zellen umfasst, an deren Zelloberfläche uPA an uPA-Rezeptoren gebunden ist, und Nachweisen jeder Wirkung von PAI-1 entweder direkt durch ein chromogenes uPA-Substrat oder indirekt durch Zugabe von Plasminogen und Messung der Plasminbildung unter Verwendung eines Plasmin-spezifischen Substrates wie des fluorogenen Substrats H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin (Bachem); die hemmende Wirkung der Testverbindung gegen PAI-1 in 3) wird dann bestimmt durch Vergleichen der Kurven der Plasminbildung, die man mit den verschiedenen Konzentrationen der Verbindung erhielt, mit Kurven der Plasminbildung, die mit verschiedenen Konzentrationen von hinzugefügtem PAI-1 entstanden sind,
    um eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Patienten herzustellen, von dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko zur Entwicklung eines bösartigen Tumors hat oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat, indem man die den Plasminogenaktivator hemmende Aktivität von PAI-1 in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe hemmt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Verwendung, wobei die Verbindung zusätzlich
    • 4) die Aktivität von PAI-1 in Tumorgewebe hemmt, wie durch Zugabe der Verbindung zu den bösartigen Zellen oder anderen Zellen in dem Tumorgewebe, die PAI-1 exprimieren, bestimmt und durch die anschließende Zugabe von uPA, gefolgt von einer Messung der uPA-Aktivität entweder direkt durch ein chromogenes uPA-Substrat oder indirekt durch Zugabe von Plasminogen und Messung der Plasminbildung und eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Verwendung, wobei die Verbindung zusätzlich
    • 5) in der Lage ist, das Wachstum und/oder die Invasion und/oder die Metastasierung von bösartigen menschlichen Tumorzellen zu hemmen, wenn sie einer nackten Maus oder einer nackten Ratte verabreicht wird, die mit den bösartigen menschlichen Tumorzellen inokuliert wurde, von denen bekannt ist, dass sie sich in Anwesenheit von uPA und PAI-1 ausbreiten und/oder metastasieren, und die zur Invasion und/oder Metastasierung in der Maus fähig sind.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Prognostische Bewertung von PAI-1 in bronchiogenen Adenokarzinomen.
  • Von großzelligem Lungenkrebs wurde berichtet, dass das Stadium der Erkrankung, einschließlich Tumorgröße und Lymphknotenbeteiligung, innerhalb der spezifischen Stadien, zu den stärksten Prognosefaktoren zählt (62, 63). Obwohl Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom chirurgisch radikal resektioniert wurden (Stadien I und II), ist die 5-Jahres-Überlebensrate schlecht, mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 40% bei Stadium I und 10% bei Stadium II (64). Somit besteht Bedarf für ein Mittel zur Charakterisierung und Definition von Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom und schlechter Prognose, um Untergruppen radikal resektionierter Patienten für eine unterstützende Chemotherapie auszuwählen. Unseres Wissens nach wird derzeit kein derartiger prognostischer Marker in der klinischen Praxis verwendet.
  • Wir haben die prognostische Signifikanz von uPA-Niveau und PAI-1-Niveau, die in Tumorextrakten von Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom mit ELISA bestimmt wurden, retrospektiv untersucht. Die Studie umfasst 106 Patienten, die alle chirurgisch behandelt worden waren, wobei 81 % für eine radikale Resektion bestimmt waren.
  • Dieses Beispiel beschreibt einen Test zur Bestimmung von PAI-1 in Tumorextrakten von bronchiogenen Adenokarzinomen.
  • MATERIAL und VERFAHREN
  • Patienten und Tumorextrakte
  • Gewebe von Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom wurde bei –80°C aufbewahrt. Tumorextrakte wurden mit einem Verfahren hergestellt, das ein Vorkühlen in flüssigem Stickstoff, eine mechanische Pulverisierung, die Extraktion mit einem Puffer, bestehend aus 75 mM Kaliumazetat, 0,3 M NaCl, 0,1 M L-arginin, 10 mM EDTA und 0,25% Triton X-100 pH-Wert 4,2 umfasst, mit anschließender Zentrifugation bei 105.000 g für 1 Stunde. Überstand und Pellet wurden bei –80°C separat aufbewahrt.
  • Die Patienten, von denen die Tumorgewebe stammten, wurden allle im Department of Thoracic Surgery, Bispebjerg Hospital, chirurgisch behandelt. Die Patienten hatten Stadium I bis III (New International Staging), 81 % waren radikal resektioniert worden (makroskopisch tumorfreier und histopathologisch tumorfreier Resektionsschnitt), während der Rest zum Zeitpunkt der Thorakotomie als inoperabel befunden wurde. Die pathologische Diagnose wurde in allen Fällen unter Verwendung der WHO-Klassifikation vom gleichen erfahrenen Lungen-Pathologen durchgeführt. Die Patienten wurden bis zu einem Jahr nach der Resektion in der ambulanten Abteilung regelmäßig untersucht; und falls sie immer noch rückfallfrei waren, wurde keine weitere Kontrolle geplant. Die mittlere Beobachtungszeit lag bei 15,6 Monaten (Spanne von 0-73,5 Monate). Die Überlebensdaten wurden beim zentralen dänischen Sterberegister erworben.
  • Die Tumorextrakte stammten von 106 Lungenkrebspatienten. Mit den Extrakten sämtlicher Patienten wurden PAI-1-Analysen durchgeführt. 70% der Patienten (69 von 106) hatten das Krankheitsstadium I (T1NO und T2NO). Die histopathologische Tumorgröße, die Anzahl der Tumor-positiven mediastinalen Lymphknoten, die pathologische Diagnose, die chirurgische Radikalität, das Alter und die insgesamte Überlebensrate waren von allen Patienten verfügbar.
  • PAI-1 ELISA
  • PAI-1 wurde mit Hilfe eines Sandwich-ELISA (18) mit monoklonalen Antikörpern die, spezifisch binden und nachweisen, bestimmt. Als bindender Antikörper wurde der monoklonale Antikörper PAI-1 Klon 1 verwendet und als nachweisender Antikörper wurde der monoklonale Antikörper PAI-1 Klon 7 verwendet (PCT/DK86/00080, veröffentlicht als WO 87/00549). Dieser Test erkennt sowohl latentes als auch aktives PAI-1 und zusätzlich wird PAI-1 erkannt, das an uPA und tPA gebunden ist (unveröffentlichte Ergebnisse, J. Grøndahl-Hansen). PAI-1 wurde in Interimseinheiten unter Kalibrierung mit Standardzubereitungen gemessen, die vom National Institute for Biological Standards and Control, Herfordshire, UK., stammten. Die Intra- und Intervariationen beider Tests lagen unter 11 %.
  • Der Proteingehalt der Tumorextrakte wurde mit dem Bio-Rad-Protein-Assay (Biorad, Richmond, CA) bestimmt.
  • Statistische Verfahren
  • Zur Verwaltung der Datenbasis und Veranschaulichung der Statistik, wurde das SPSS-Programm (Inc. SPSS, Version 4.01, 1988) verwendet. Die Analysen der Sterbetabellen der insgesamten Überlebensrate wurden mit dem Produkt-Limit-Verfahren (Kaplan-Meier) berechnet und zur Bestimmung der Gleichheit aller Patientenschichten (3 Gruppen) wurde der Trendtest (Tarrone) verwendet. Für Patienten mit Stadium I (2 Gruppen) wurde der Log-Rank-Test verwendet. Zur multivariablen Analyse der insgesamten Überlebensrate wurde unter Verwendung des BMDP-Programms das Cox-Proportional-Hazards-Modell verwendet (65).
  • ERGEBNISSE
  • Eigenschaften der Patienten
  • PAI-1 wurde in den Überständen des Tumorextraktes der bronchiogenen Adenokarzinome von chirurgisch resektionierten Patienten gemessen. Tabelle 1 zeigt die Eigenschaften der Patienten. Die Patienten von denen das Gewebe stammte, wurden für eine radikale Chirurgie ausgewählt, was dazu führte, dass die meisten Patienten des vorliegenden Materials das Krankheitsstadium I und II hatten (Stadium gemäß der New International Staging Classification). 81 % der Patienten wurden radikal resektioniert und bei keinem der Patienten wurden entfernte Metastasen gefunden.
  • Tabelle 1 Charakterisierung: 106 Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom
    Figure 00310001
  • Verteilung der PAI-1-Spiegel.
  • 1 zeigt die Verteilung von PAI-1 in den Tumorextrakten. Die Verteilung ist zu den niedrigeren Werten hin verzerrt. Der Mittelwert von PAI-1 lag bei 0,86 Übergangseinheiten/mg Protein (Bereich 0,00-10,53). Die abgeschnittenen Mengen der niedrigeren und höheren Quadraturen der Verteilung der PAI-1-Konzentrationen wurden identifiziert, um die Patienten in Gruppen mit niedrigen, mittleren und hohen PAI-1-Spiegeln einzuteilen. Bei PAI-1 lagen diese Mengen bei 0,40 InterimsU/mg Protein und 2,20 InterimsU/mg Protein.
  • Zur Feststellung der Signifikanz von PAI-1 bei Patienten mit einer lokalen Krankheit, wurde die Patientengruppe mit Stadium I separat untersucht. In dieser Gruppe wurde der Mittelwert von PAI-1 verwendet, um die Patienten in Gruppen mit niedrigen und hohen Konzentrationen aufzuteilen; dieser Wert lag bei 0,775 InterimsU/mg Protein (Bereich 0,00-6,99).
  • Prognostische Signifikanz von PAI-1.
  • Bei den 106 Patienten wurde die gesamte Überlebensrate von Patienten mit niedrigen, mittleren und hohen PAI-1-Spiegeln verglichen. Wie man in 2 sieht, war die gesamte Überlebensrate bei Patienten mit niedriger PAI-1-Konzentration signifikant besser als bei Patienten mit mittlerer oder hoher Konzentration (P=0,017, Tarone-Trendtest). Die prognostische Signifikanz von PAI-1 wurde mit der univariablen Analyse untersucht. Man fand heraus, dass PAI-1 sich auf das Sterberisiko mit einem relativen Risiko von 1,6 für niedrig gegenüber mittel und 2,4 für niedrig gegenüber hoch auswirkt (95% Sicherheit Interval 1,1-2,3 beziehungsweise 1,7-3,5).
  • Zusammenhang von PAI-1 mit anderen prognostischen Variablen Der Zusammenhang zwischen dem PAI-1-Spiegel im Tumor und anderen prognostischen Variablen wurde mit dem X2-Test untersucht. Wie Tabelle 2 darstellt, gab es keinen signifikanten Zusammenhang zwischen PAI-1 und anderen Prognosefaktoren, wie etwa Alter, Krankheitsstadium, Geschlecht, Tumorgröße oder Anzahl der beteiligten Lymphknoten.
  • TABELLE 2
  • X2-Test zum Zusammenhang zwischen PAI-1 in den Tumorextrakten und anderen Variablen bei Patienten mit bronchiogenen Adenokarzinomen.
    Variable Korrelation mit PAI-1
    P-Wert
    Alter 0.63
    Geschlecht 0,16
    Stadium 0,21
    Radikalität 0,20
    Tumorgröße 0,59
    Lymphknoten 0,22
  • Multivariable Analyse
  • Um die prognostische Signifikanz des PAI-1-Spiegels mit derjenigen von anderen Parametern zu vergleichen, wurde mit den 104 Patienten, für die vollständige Daten vorhanden waren, eine multivariable Analyse durchgeführt (Tabelle 3). Die Variablen wurden nacheinander einzeln aus dem Modell entfernt und nur wieder einbezogen, wenn der P-Wert geringer als 0,05 war. Auf diese Art blieben PAI-1 und das Stadium als die einzigen zwei Parameter übrig. Mit Hilfe dieser Analyse fand man heraus, dass der PAI-1-Spiegel im Tumor eine statistisch signifikante, unabhängige Variable für die insgesamte Überlebensrate war, bei einem relativen Risiko von 1,5 für niedrig gegenüber mittel und 2,3 für niedrig gegenüber hoch (95% Sicherheit Interval 1,1-2,2 beziehungsweise 1,6-3,3).
  • TABELLE 3
  • Multivariable Cox-Regressionsanalyse von 106 Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom
    Figure 00340001
  • Prognostische Signifikanz von Tumor-PAI-1 innerhalb der Patienten-Untergruppen Innerhalb der Patienten mit Krankheitsstadium I wurde die insgesamte Überlebensrate von Patienten mit Werten unterhalb der Medianwerte und denjenigen mit Werten oberhalb verglichen. Wie in 3 gezeigt, gab es einen signifikanten Zusammenhang zwischen PAI-1 und der insgesamten Überlebensrate (P=0,037).
  • DISKUSSION
  • Diese retrospektive Studie mit 106 Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom, Stadien I bis IIIb, deutet mit statistischer Signifikanz darauf hin, dass mit hohen PAI-1-Spiegeln in Tumorextraktüberständen eine kurze insgesamte Überlebensrate verbunden ist. In einer multivariablen Analyse, die alle Patienten und Faktoren wie Alter und Stadium umfasste, war das Tumor-PAI-1 ein signifikant unabhängiger Prognosefaktor für die insgesamte Überlebensrate.
  • Bei Patienten mit lokalisierter Erkrankung (Stadien I und II) beträgt die 5-Jahres-Überlebensrate 40% in der Untergruppe mit Stadium I und 10% in der Untergruppe mit Stadium II (64). Die Bestimmung des PAI-1-Spiegels kann ein hilfreicher prognostischer Marker sein, um radikal resektionierte Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom und schlechter Prognose für eine Behandlung mit Adjuvantien auszuwählen. Die vorliegende Studie war begrenzt auf Adenokarzinome innerhalb der Gruppe des großzelligen Lungenkrebses (Non Small Cell Lung Cancer = NSCLC) mit einer relativ geringen Anzahl von Patienten. Deshalb sollte man den prognostischen Wert von PAI-1 mit mehr Material und innerhalb anderer Untergruppen von NSCLC weiter evaluieren. Der prognostische Wert von PAI-1 könnte in ähnlicher Weise auch bei anderen Krebsarten bewertet werden (78).
  • BEISPIEL 2
  • Prognosewert von PAI-1-Messungen in bronchiogenen Adenokarzinomen.
  • Wie in Beispiel 1 gezeigt, hat ein Teil der Lungenkrebspatienten in ihren Tumoren hohe PAI-1-Spiegel, die eine schlechte Prognose vorhersagen. Dementsprechend sind Patienten mit hohen PAI-1-Spiegeln Kandidaten für eine Behandlung, die darauf abzielt, die Bindung von PAI-1 an uPA zu hemmen. Dieses Beispiel beschreibt einen Prognosetest zur Identifikation von Patienten, die möglicherweise von einer derartigen Behandlung profitieren werden.
  • MATERIAL UND VERFAHREN
  • PATIENTEN.
  • Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom Stadium I oder II, die für eine unterstützende Therapie nach erfolgter radikaler Resektion ihrer Lungentumore überwiesen wurden.
  • TUMOREXTRAKTION
  • Tumorgewebe von den Patienten mit bronchiogenem Adenokarzinom wird bei –80°C aufbewahrt. Die Tumorextrakte werden mit einem Verfahren hergestellt, das eine Vorkühlung des Gewebes in flüssigem Stickstoff, mechanisches Pulverisieren, die Extraktion mit einem Puffer, bestehend aus 75 mM Kaliumazetat, 0,3 M NaCl, 0,1 M L-Arginin, 10 mM EDTA und 0,25% Triton X-100 pH-Wert 4,2, umfasst, bei anschließender Zentrifugation bei 105.000 g für 1 Stunde. Überstand und Pellet werden bei –80°C getrennt aufbewahrt.
  • PAI-1 ELISA.
  • PAI-1 wird mit Hilfe eines Sandwich-ELISA bestimmt (18) mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch binden und nachweisen. Als bindender Antikörper wird der monoklonale Antikörper PAI-1 Klon 1 und als nachweisender Antikörper wird der monoklonale Antikörper PAI-1 Klon 7 (WO 87/00549) verwendet. Dieser Test entdeckt sowohl latentes als auch aktives PAI-1 und erkennt zusätzlich an uPA und an tPA gebundenes PAI-1 (unveröffentlichte Ergebnisse, J. Grondahl-Hansen). PAI-1 wird unter Kalibrierung mit Standardzubereitungen, die vom National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, UK. stammen, in Interimseinheiten gemessen. Die Intra- und Intervariationen für beide Tests liegen unter 11 %.
  • Der Proteingehalt der Tumorextrakte wird mit dem Bio-Rad-Protein-Assay (Biorad, Richmond, CA) bestimmt.
  • BEHANDLUNG.
  • Alle Patienten, die an dieser Studie teilnehmen, werden die Antiprotease-Inhibitor-Behandlung erhalten. Die klinischen Reaktionen werden nach Standardverfahren (EORTC) aufgezeichnet. Die Patienten werden je nach PAI-1-Tumorgehalt nachträglich geschichtet (Patienten mit PAI-1-Spiegeln oberhalb gegenüber von Patienten unterhalb dem bereits festgelegten Mittelwert von 0,775 InterimsU/mg Protein (Beispiel 1)) und Anzahl und Dauer der objektiven Reaktionen werden zwischen den zwei Patientengruppen verglichen.
  • BEISPIEL 3
  • IN SITU HYBRIDISIERUNG VON PAI-1-mRNA UND IMMUNOFÄRBEN VON PAI-1-PROTEIN IN MENSCHLICHEM LUNGENKREBS
  • IMMUNOHISTOCHEMIE
  • Für die Immunohistochemie wurden Cryostat-Schnitte von 24 Lungenkarzinom-Proben verwendet. Zu diesen gehörten 14 Fälle von Plattenepithelzellkarzinom, 5 Fälle von Adenokarzinomen, 3 Fälle von gemischten Tumoren (Adenokarzinom und Plattenepithelzellkarzinom) und 3 Fälle von großzelligem undifferenziertem Karzinom. Von 3 Patienten wurde gegenüberliegendes normales Schleimhautgewebe, das während der Chirurgie resektioniert worden war, entnommen. Für die immunohistochemischen Färbungen wurden monoklonale antihumane PAI-1-Antikörper (Klone 1 und 2) verwendet. Ein irrelevanter monoklonaler Antikörper (m-anti-TNP) wurde als negative Kontrolle verwendet. Von den zwei monoklonalen Antikörpern wurde zuvor gezeigt, dass sie gegen zwei verschiedene Epitope auf PAI-1 gerichtet sind. 5 μm Cryostat-Schnitte wurden einem herkömmlichen APAAP (Alkalin-Phosphatase-Anti-Alkalin-Phosphatase)-Verfahren unterworfen, wie zuvor beschrieben (45).
  • IN SITU HYBRIDISIERUNG
  • 10 der oben genannten Proben wurden mit einem zuvor ausführlich beschriebenen Verfahren mit Hilfe der in situ Hybridisierung auf die Anwesenheit von PAI-1-mRNA hin getestet (42). Kurz gefasst wurden 35-S-markierte RNA-Proben, die von einem aus 504 Basenpaaren bestehenden PstI-PstI-Fragment von menschlicher PAI-1-cDNA transkribiert worden waren, zu deparaffinierten von Proteinase K gespaltenen Sektionen hinzugefügt, über Nacht bei 48°C hybridisiert, dann RNAse-behandelt und in hochstringentem Puffer gewaschen, bevor sie mit einer fotografischen Emulsion bedeckt wurden. Nach 10–14 Expositions-Tagen wurden die Diapositive entwickelt.
  • ERGEBNISSE
  • IMMUNOHISTOCHEMIE
  • In sämtlichen untersuchten Fällen wurde bei den zwei Antikörpern ein identisches Farbmuster gefunden. Der monoklonale anti-TNP-Antikörper ließ sich nicht dauerhaft anfärben. In sämtlichen Proben konnte die Anwesenheit des PAI-1-Antigens überall in den Stromateilen des Krebsgewebes demonstriert werden. Individuelle Fibroblasten-ähnliche Stromazellen waren oft stark positiv, aber entlang der Kollagenfibrillen war die Färbung oft deutlich diffus und netzartig. In 11 Fällen, die alle zum Plattenepitheltyp gehörten, war eine Anzahl von Tumorzellen auch PAI-1-positiv. Drei Proben von gegenüberliegendem normalen Schleimhautgewebe zeigten keine PAI-1-Immunoreaktivität.
  • 4 zeigt Immunofärbung von PAI-1 in einer Probe von Lungenkrebsgewebe. Zu beachten ist das starke Signal im Stromabereich.
  • IN SITU HYBRIDISIERUNG
  • Routinemäßig hergestellte, in Paraffin eingebettete Proben von 10 der 24 Fälle wurden mit in situ Hybridisierung auf die Anwesenheit von mRNA für PAI-1 hin untersucht. Bei sämtlichen Proben wurde für PAI-1 ein Muster der Genexpression beobachtet, das den Mustern der Immunofärbung sehr ähnlich war.
  • BEISPIEL 4
  • Screening-Schema
  • Das folgende Beispiel beschreibt ein Beispiel für ein zusammengesetztes Screening-Schema, das verschiedene aufeinanderfolgende Schritte umfasst und geschaffen wurde, um Verbindungen zu identfizieren, die man verwenden kann, um die Interaktion zwischen PAI-1 und uPA zu hemmen und die gleichzeitig als Arzneistoffe verwendet werden, um den invasiven und metastatischen Prozess zu hemmen.
  • Das anfängliche Screening der Verbindungen wird beispielsweise mit Hilfe des unten beschriebenen zusammengesetzten ELISA-Screening durchgeführt und falls die Verbindung eine hemmende Wirkung aufweist, wird das weitere Screening der Verbindungen unter Verwendung der nächsten Schritte im Schema (Beispiele 5 und 6) durchgeführt.
  • Verbindungs-ELISA-Screening zur Verwendung im Screening der Verbindungen, die in der Lage sind, die PAI-1/uPA-Interaktion zu hemmen.
  • Ein Sandwich-ELISA-Assay mit zwei Antikörpern wird zum Screening der Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Interaktion zwischen PAI-1 und uPA in Lösung zu hemmen, entwickelt. Die Wirkung der Hemmung der Interaktion durch die zu überprüfende Verbindung kann man bei verschiedener Konzentration testen. Im vorliegenden Fall wird die Verbindung X getestet und die Wirkung von X auf die Interaktion wird untersucht. So ist zum Beispiel X ist der monoklonale Antikörper von PAI-1, der die PAI-1-Inhibition von uPA hemmt (W/O 87/00549).
  • Materialien
    • 1) 96-Loch-Platten (flache Unterseite bei hoher Bindungskapazität, NUNC).
    • 2) Unmarkierter gereinigter monoklonale Antikörper von PAI-1 z.B. Klon 1 (WO 87/00549).
    • 3) Gereinigter anti-uPA-Klon 5 (66) markiert mit Biotin.
    • 4) Meerettich-Peroxidase-konjugiertes (HRP) Avidin.
    • 5) Affinitäts-gereinigtes PAI-1 (SDS-aktiviert).
    • 6) Rekombinantes uPA (aktiviert).
    • 7) Verbindung X.
    • 8) PBS-Puffer, pH 7,4 (PBS).
    • 9) PBS + 0,1 % Tween 20, pH 7,4 (PBS/Tween).
    • 10) Blockierender Puffer: 1 % Magenmilchpulver (SMP) in PBS.
    • 11) Zitrat-Puffer: 0,1 M Zitronensäure, pH 5,0.
    • 12) Substratlösung: 1,2-Phenylenediamin-dihydrochlorid (OPD) Tabletten in Zitratpuffer, z.B. 3 OPD Tabletten in 15 ml Zitronensäure.
    • 13) Stopp-Puffer: 1 M H2SO4.
  • Verfahren
    • 1) Beschichten der Vertiefungen mit 100 μl PAI-1-Antikörper (20 μg/ml) gelöst in 0,1 M Na2CO3.
    • 2) Über Nacht bei 4°C inkubieren.
    • 3) 5X Waschen der Vertiefungen in PBS/Tween.
    • 4) Blockieren der restlichen aktiven Bindungsorte in den Vertiefungen mit 1 % SMP/PBS, 200 μl/Vertiefung, für mindestens 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Leicht schütteln.
    • 5) Waschen wie in Schritt 3).
    • 6) Hinzufügen von 100 μl PAI-1 (20 ng/ml).
    • 7) Unter leichtem Schütteln für 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubieren.
    • 8) Waschen wie in Schritt 3).
    • 9) Hinzufügen eines Gemisches von 50 μl PAI-1 (10 ng/ml) und 50 μl eines blockierenden Puffers oder eines Gemisches von 50 μl uPA (10 ng/ml) und 50 μl einer Reihenverdünnung von X.
    • 10) Inkubation wie in Schritt 7).
    • 11) Waschen wie in Schritt 3).
    • 12) Hinzufügen von 100 μl biotinyliertem anti-uPA-Klon 5 (2 μg/ml).
    • 13) Inkubation wie in Schritt 7).
    • 14) Waschen wie in Schritt 3).
    • 15) Hinzufügen von 100 μl HRP-Avidin gelöst 1:5000 in SMP/PBS/Tween.
    • 16) Inkubation wie in Schritt 7).
    • 17) Waschen wie in Schritt 3).
    • 18) 1 X Waschen in destilliertem Wasser.
    • 19) Hinzufügen von 100 μl Substratlösung/Vertiefung.
    • 20) Reaktionsstopp mit 100 μl 1 M H2So4/Verteifung, wenn eine helle gelbe Farbe erscheint.
    • 21) Lesen auf einem ELISA-Lesegerät mit 490 nm Filter mit 540 nm Filter als Hintergrundreferenz.
  • Der oben beschriebene ELISA-Test kann auf ähnliche Weise mit einem uPA-Antikörper als bindenden Antikörper und einem biotinyliertem PAI-1-Antikörper oder Antikörpern als nachweisendem(n) Antikörper(n) aufgebaut werden.
  • Geeignete Arzneistoffe zur Hemmung der PAI-1-Bindung an uPA können durch Überprüfen von Arzneistoff-Genbanken, die natürlich vorkommende Verbindungen, kleine Moleküle und Peptide enthalten, ermittelt werden. Man kann auch das Zufalls-Peptid-Bakteriophagen-Display oder synthetische Peptid-Genbanken verwenden.
  • Beispiel 5
  • Überprüfen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Bindung von PAI-1 an uPA auf der Zelloberfläche zu hemmen.
  • Die Fähigkeit einer Verbindung, die Bindung von PAI-1 an uPA zu hemmen, wird in geeigneter Weise als ein Schritt des Schemas, das dazu dient, mögliche neue Arzneistoffe zu identifizieren und charakterisieren, untersucht werden. Indem man den monoklonalen PAI-1-Antikörper Klon 2 (WO 87/00549) durch verschiedene Konzentrationen der zu testenden Verbindung ersetzt, kann man die Fähigkeit der Verbindung, die Bindung von PAI-1 an uPA zu hemmen und dadurch die Inaktivierung von uPA an der Zelloberfläche zu verhindern, bewerten.
  • Der Test basiert auf der Beschreibung zur Bestimmung der Hemmung von Rezeptorgebundenem uPA durch die Inhibitoren des Plasminogenaktivators (61). U937-Zellen (2 × 107/ ml) werden mit uPA (1,4 nM) inkubiert, nachdem es in 0,05 M Glyzerin-HCl, 0,1 M NaCl, pH 3,0 gewaschen wurde, um endogen gebundenes uPA zu entfernen. Die Zellen werden dann zur Entfernung von überschüssigem uPA gewaschen und bei 37°C in 10-mm Plastik-Fluorometer-Kuvetten in einer Endkonzentration von 1 × 106/ml, mit Plasminogen (20 μg/ml) und dem Plasmin-spezifischen fluorogenen Substrat N-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin (Bachem) in 0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7,4 inkubiert. PAI-1 wird in diese Inkubationen mit einer Konzentration von 1 μg/ml einbezogen, nachdem es mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung oder des Antikörpers prä-inkubiert wurde. Die Zunahme der Fluoreszenz aufgrund der Hydrolyse des Substrates wird 15 Minuten lang in 1-minütigen Intervallen gemessen und die Plasminbildung wird anhand des Veränderungsgrades der Intensität der Fluoreszenz bestimmt. Dann wird der hemmende Effekt der Testverbindung oder des Antikörpers gegen PAI-1 durch Vergleich der Kurven der Plasminbildung, die man mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung erhielt mit Kurven der Plasminbildung, die man mit verschiedenen Konzentrationen von PAI-1 (0, 0,25, 0,5, 0,75 und 1 μg/ml) erhalten hat, bestimmt. Auf diese Art erhält man einen prozentualen hemmenden Effekt für jede gewählte Konzentration der Verbindung.
  • Beispiel 6
  • Überprüfen der Verbindungen auf ihre Fähigkeit, den invasiven und metastatischen Prozess menschlicher Krebszellen in nackten Mäusen zu hemmen.
  • Der letzte Schritt bei der Überprüfung der Verbindungen, von denen in den oben beschriebenen vorhergegangenen Schritten des Schemas des Verbindungs-Screenings gezeigt wurde, dass sie die Interaktion zwischen PAI-1 und uPA hemmen, die dadurch potentielle Verbindungen sind, um als Arzneistoffe zur Hemmung des Krebswachstums verwendet zu werden, besteht darin, die hemmende Wirkung der Verbindung sowohl auf das Wachstum als auch auf den invasiven und metastatischen Prozess in vivo zu bewerten. Ein Maus-Modell, mit dem man den invasiven und metastatischen Prozess menschlicher Krebszellen messen kann, wurde entwickelt, um diese Wirkung zu bewerten (PCT/DK92/00306).
  • Dieses Beispiel beschreibt eine experimentelle Studie, bei der neutralisierende monoklonale PAI-1-Antikörper als ein Mittel zur Hemmung der Metastasenbildung durch ein menschliches Brustkrebs-Fremdtransplantat in nackten Mäusen verwendet werden.
  • Verfahren
  • Zelllinie
  • Die menschliche Brustkrebs=Zelllinie MDA-MB-231 BAG wurde routinemäßig in DMEM mit 5% fötalem Kälberserum vermehrt. Diese Zellen wurden mit dem lacZ-Gen transduziert wie zuvor beschrieben (67). Die Zellen für die Experimente mit den nackten Mäusen wurden anstelle von Enzymen mit Hilfe eine Zellspachtels geerntet.
  • Retrovirale Transduktion
  • Um die metastatischen Tumore sichtbar zu machen, wird der im Test verwendete menschliche Krebszelltyp durch Transduktion oder Transfektion der Zellen mit einem lacZ-Gen markiert, wodurch die Zellen mit X-gal-Färbung sichtbar gemacht werden können. Diese Transduktion ist zuvor mit Hilfe von menschlichen MDA-MB-231 und menschlichen MDA-MB-435 Brustkrebszellen durchgeführt worden (67). Das lacZ-Gen codiert die β-D-Galaktosidase, deren Aktivität durch Färbung mit dem chromogenen Substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal), die zu einer dunkelblauen Reaktion führt, festgestellt werden kann. Hierbei können auch mikroskopische metastatische Tumore entdeckt werden.
  • Die Transduktion der ausgewählten menschlichen Krebszellen kann wie in (67) beschrieben durchgeführt werden.
  • Mäuse
  • Es wurden 6–8 Wochen alte, nackte weibliche nu/nu-META/BOM-Mäuse (Bomholtgaard, Dänemark) verwendet. Die Mäuse wurden in geschichteten flüssig gereinigten Bänken gehalten und sämtliche verwendeten Geräte wurden autoklaviert.
  • Antikörper
  • Die monoklonalen PAI-1-Antikörper Klon 2 (WO 87/00549), der den hemmenden Effekt von PAI-1 neutralisiert (Rømer, persönliche Mitteilung), und Klon 3 (WO 87/00549), der die hemmende Aktivität von PAI-1 nicht beeinflusst (Rømer, persönliche Mitteilung), wurden verwendet.
  • Pharmakokinetik der Verbindung
  • Die pharmakokinetischen Eigenschaften der Verbindung oder des Antikörpers, die/der zu überprüfen ist, sollten geklärt werden, um die Verbindung oder den Antikörper in der Maus in einer wirksamen Konzentration zu verabreichen und zu erhalten.
  • Die Verabreichung der Verbindung oder des Antikörpers, die/der zu überprüfen ist, hängt von der chemischen Natur der Verbindung oder des Antikörpers ab, und kann durch interperitoneale Injektion oder subkutane Injektion, durch orale Verabreichung oder durch lokale Applikation durchgeführt werden.
  • Deshalb wurde den Mäusen intraperitoneal eine einzelne Dosis entweder des monoklonalen PAI-1 Antikörpers Klon 2 oder Klon 3 (WO 87/00549) injiziert und zu verschiedenen Zeitpunkten nach dieser Injektion wurde den Mäusen Blut entnommen und das Serum wurde auf den Gehalt an PAI-1-Antikörpern getestet. Des weiteren wurde in dem Experiment mit den Tumor-tragenden Tieren von sämtlichen anti-PAI-1-Antikörper-behandelten Tieren durch eine wöchentliche Blutentnahme aus der Schwanzvene Serum erhalten. Die Konzentration der PAI-1-Antikörper wurde mit einem ELISA analysiert.
  • Vorbehandlung der Maus und transduzierte Krebszellen
  • Es kann von Vorteil sein, die Maus mit der Verbindung oder dem Antikörper, die/der überprüft werden soll, vorzubehandeln, bevor man die transduzierten Krebszellen injiziert, um zufriedenstellende Konzentrationen der Verbindung oder des Antikörpers zu erhalten. Des weiteren kann man die transduzierten Krebszellen, die der Maus injiziert werden sollen, in einer Lösung präinkubieren, die die Verbindung oder den Antikörper enthält, um einen Kontakt zwischen den Zellen und der Verbindung oder dem Antikörper sicherzustellen. Normalerweise sollten einige Experimente, bei denen diese Vorbehandlung variiert oder ausgeschlossen wird, durchgeführt werden; um die Gesamtwirkung der Verbindung oder des Antikörpers zu klären und abzusichern.
  • Daher wurde subkutan in jede Flanke der Tiere eine Gesamtzahl von 2 × 106 MDA-MB-231 BAG Zellen inokuliert. Die Tumorzellen wurden immer unterhalb der Thoraxwand plaziert. Einen Tag vor der Zellinokulation wurden 250 μg der Antikörper in die Mäuse injiziert. Basierend auf pharmakokinetischen Studien der verwendeten Antikörper (5A und 5B, die eine pharmakokinetische Untersuchung des monoklonalen anti-PAI-1-Antikörpers Klon 2 beziehungsweise Klon 3 zeigt, die mit 250 μg Antikörper am Tag 0 intraperitoneal in nackte Mäuse injiziert wurden), wurde wöchentlich eine zweite Injektion von 250 μg Antikörper gegeben. Die Mäuse wurden 6 Wochen nach der Zellinokulation getötet.
  • Messung des Tumorwachstums
  • Das Wachstum der Tumore sollte gemessen werden, um zu klären, ob die getestete Verbindung das Tumorwachstum zusätzlich zu dem möglichen Effekt auf den invasiven und metastatischen Prozess beeinflusst.
  • Daher wurden die fremdtransplantierten Tumore zweimal wöchentlich in zwei Dimensionen gemessen und Kurven des Tumorwachstums wurden basierend auf einer transformierten Gompertz-Funktion erstellt.
  • Dauer des Screening-Tests
  • Die Dauer des Tests hängt von der Art der Verbindung oder des Antikörpers ab und von der Wirkung der Verbindung oder des Antikörpers auf das Wachstum und den invasiven und metastatischen Prozess.
  • Untersuchung von fremdtransplantierten menschlichen MDA-MB-231 BAG Tumoren für menschliches PAI-1
  • Die fremdtransplantierten Tumore wurden chirurgisch aus den Tieren entfernt und mittels Northern-Blotting auf die Anwesenheit von menschlicher PAI-1-mRNA und mittels ELISA auf die Anwesenheit von menschlichem PAI-1-Protein untersucht.
  • Untersuchung des fremdtransplantierten MDA-MB-231 BAG Tumors auf Maus-PAI-1
  • Die fremdtransplantierten Tumore wurden chirurgisch aus den Tieren entfernt und durch in situ Hybridisierung mit einer Maus-spezifischen Sonde auf Maus-PAI-1-mRNA untersucht.
  • Bewertung des invasiven und metastatischen Prozesses
  • Die Wirkung der Verbindung oder des Antikörpers auf den invasiven und metastatischen Prozess und auf das Tumorwachstum kann lokal und/oder in den Lungen, den Lymphknoten und im interperitonealen Hohlraum beurteilt werden, indem man den sehr deutlichen Unterschied zwischen menschlichen Zellen und Mauszellen, der durch die Färbung möglich gemacht wird, ausnutzt (67–69).
  • Dementsprechend wurden bei der Autopsie von jedem Tier die Lungen entfernt und gemäß dem Verfahren von Brünner et al (67) mit X-gal bearbeitet. Zur Bestätigung der Anwesenheit menschlicher Tumorzellmetastasen wurden blaue Bereiche verschiedener Lungen in 4% Formalin fixiert und für die Routinehistologie vorbereitet. Wenn eine Lunge einen oder mehrere blaue Bereiche aufwies, wurde dies als positiv für eine metastatische krankhafte Veränderung registriert. Wahlweise konnte ein ELISA für β-D-Galaktosidase, wie bei Fujiwara et al beschrieben (79), als eine objektive Messung der metastatischen Ausbreitung verwendet werden.
  • Ergebnisse
  • Ergebnisse der Untersuchung der fremdtransplantierten Tumore
  • MDA-MB-231 BAG Tumore exprimierten überschüssige mRNA und Protein für menschliches PAI-1. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass der fremdtransplantierte Tumor in den Stromazellen einschließlich der Gefäße, die die menschlichen Tumorzellen infiltrieren, Maus-PAI-1 exprimiert.
  • Pharmakokinetik
  • Die Halbwertszeit von PAI-1-Antikörper Klon 2 wurde auf ungefähr 4 Tage und diejenige von PAI-1-Klon 3 auf ungefähr 6 Tage geschätzt (5A und 5B).
  • Hemmung der Metastasierung der Tumorzellen
  • Wie man in Tabelle 4 sehen kann, hatten 9 von 10 unbehandelten Kontrolltieren Lungenmetastasen. Die Injektion des Kontrollantikörpers PAI-1-Antikörper Klon 3 führte zu einem geringfügigen Rückgang (6 von 10) der Anzahl der Tiere mit Lungenmetastasen, während die Injektion von PAI-1-Antikörper Klon 2 die Bildung von Lungenmetastasen signifikant aufhob, da nur 1 von 10 Mäusen Lungenmetastasen hatte.
  • Die metastatische Ausbreitung der menschlichen Krebszellen wurde durch die Anwesenheit von Krebszellen in den blauen Punkten bestätigt, die mit herkömmlichen histologischen Untersuchungen bestimmt wurden.
  • In ähnlicher Weise kann man mit diesem Model andere potentielle PAI-1-Inhibitoren testen.
  • Tabelle 4
    Figure 00470001
  • Wirkung der PAI-1-Antikörper auf das Tumorwachstum
  • Die Untersuchung der Wirkung der PAI-1-Antikörper auf das Tumorwachstum zeigte, dass beide Antikörper im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen eine geringfügige, aber nicht signifikante Verzögerung des Tumorwachstums auslösten (6 zeigt die Kurven des Bereichs des Tumorwachstums der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB-231 BAG, die weiblichen nu/nu META/BOM-Mäusen am Tag 0 subkutan injiziert wurde).
  • Nach geeigneten toxikologischen Studien sollte eine aktive Verbindung in Phase I- und Phase II-Versuchen getestet werden.
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Claims (23)

  1. Verwendung einer Verbindung, die die hemmende Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe unterdrückt, wobei der Inhibitor ein Plasminogenaktivator-Inhibitor I (PAI-1) ist, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung des Wachstums, der Invasion und/oder Metastasierung eines bösartigen Tumors in einem Patienten, bei dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln, oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym direkt oder indirekt das bösartige Tumorgewebe oder das potentiell bösartige Tumorgewebe abbaut.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe den Prozess der Tumorangiogenese beeinträchtigt.
  4. Verwendung nach einem Ansprüche 1 bis 3, wobei die Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe die Migrationsfähigkeit von bösartigen Tumorzellen oder anderen Zellen in dem Tumorstroma beeinträchtigt.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Patient ein Patient ist, bei dem ein Karzinom in situ festgestellt wurde.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zusammensetzung präoperativ verwendet werden soll.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zusammensetzung als Neoadjuvans und/oder als Hilfsstoff nach Entfernung des bösartigen Tumorgewebes durch einen chirurgischen Eingriff verwendet werden soll.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Patient ein Patient ist, bei dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln, dadurch dass er eine Menge eines Tumormarkers wie eines Serum-/Plasmatumormarkers besitzt, die ein hohes Risiko anzeigt, oder dadurch dass er ein Gen oder Genprodukt aufweist, das anzeigt, dass der Patient ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln, wobei der bösartige Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mammakarzinomen, urologischen Karzinomen, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, gynäkologischen Karzinomen, z.B. Eierstockkrebs und Cervixkarzinom, nicht-kleinzelligen Lungentumoren, Magen-Darm-Krebs, z.B. Kolon-Adenokarzinom und Magenkarzinomen, Gehirntumoren, Sarkomen, hämatologischer Bösartigkeit, z.B. Lymphomen und Hautkrebs, z.B. Melanom und Plattenepithelzellkarzinom der Haut.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Patient ein Patient ist, der eine erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in dem bösartigen Tumorgewebe und/oder im Plasma und/oder Serum aufweist, wobei der bösartige Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mammakarzinomen, urologischen Karzinomen, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, gynäkologischen Karzinomen, z.B. Eierstockkrebs und Cervixkarzinom, nicht kleinzelligen Lungentumoren, Magen-Darm-Krebs, z.B. Kolon-Adenokarzinom und Magenkarzinomen, Gehirntumoren, Sarkomen, hämatologischer Bösartigkeit, z.B. Lymphomen und Hautkrebs, z.B. Melanom und Plattenepithelzellkarzinom der Haut.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei festgestellt wurde, dass die erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms ein Prognosefaktor ist, der für den Patienten mit dem fraglichen Typ des bösartigen Tumors eine schlechte Prognose anzeigt, wobei der bösartige Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mammakarzinomen, urologischen Karzinomen, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, gynäkologischen Karzinomen, z.B. Eierstockkrebs und Cervixkarzinom, nicht-kleinzelligen Lungentumoren, Magen-Darm-Krebs, z.B. Kolon-Adenokarzinom und Magenkarzinomen, Gehirntumoren, Sarkomen, hämatologischer Bösartigkeit, z.B. Lymphomen und Hautkrebs, z.B. Melanom und Plattenepithelzellkarzinom der Haut.
  11. Verwendung nach Anspruch 9, wobei festgestellt wurde, dass die erhöhte Konzentration des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms ein Prognosefaktor ist, der die Wirksamkeit der Behandlung des Typs des fraglichen bösartigen Tumors durch Unterdrücken des Inhibitors anzeigt, wobei der bösartige Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mammakarzinomen, urologischen Karzinomen, z.B. Prostatakarzinom und Blasenkarzinom, gynäkologischen Karzinomen, z.B. Eierstockkrebs und Cervixkarzinom, nicht-kleinzelligen Lungentumoren, Magen-Darm-Krebs, z.B. Kolon-Adenokarzinom und Magenkarzinomen, Gehirntumoren, Sarkomen, hämatologischer Bösartigkeit, z.B. Lymphomen und Hautkrebs, z.B. Melanom und Plattenepithelzellkarzinom der Haut.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei das abgebaute bösartige Gewebe, einschließlich Mikrometastasen, aus den bösartigen Tumorzellen selbst, der extrazellulären Matrix und/oder den Stromazellen des bösartigen Tumors, beispielsweise Endothelzellen, Fibroblasten, Makrophagen, Leukocyten besteht; und wobei im Wesentlichen kein anderes Gewebe als das bösartige Tumorgewebe in einem Ausmaß oder Grad abgebaut wird, das/der inakzeptable toxische Nebenwirkungen verursacht.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung eine Verbindung ist, die die Plasminogenaktivator hemmende Aktivität von PAI-1 durch Hemmen der Bindung von PAI-1 an Vitronektin unterdrückt.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung eine Verbindung ist, die die Wirkung von PAI-1 auf uPA aber nicht die Bindung von uPA an uPAR hemmt.
  15. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verbindung eine Verbindung ist, die 1) die uPA bindende Aktivität von PAI-1, wie bestimmt, hemmt durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das immobilisierten PAI-1 und solubilisierten uPA umfasst, wobei der an PAI-1 gebundene uPA durch Markierung oder mittels eines markierten anti-uPA-Antikörpers nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das immobilisierten uPA und solubilisierten PAI-1 umfasst, wobei der an uPA gebundene PAI-1 durch Markierung oder mittels eines markierten anti-PAI-1-Antikörpers nachgewiesen wird, und/oder 2) die Bindung von PAI-1 an uPA, wie bestimmt, hemmt durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das radioaktiv markiertes PAI-1 oder ein Derivat davon und Zellen umfasst, bei denen uPA an der Zelloberfläche an uPA-Rezeptoren gebunden ist, und Nachweisen von PAI-1 oder eines an uPA gebundenen Derivates durch Gammazählen der Zellen, und/oder 3) die hemmende Wirkung von PAI-1 auf uPA, wie bestimmt, unterdrückt durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das PAI-1 und Zellen umfasst, bei denen uPA an der Zelloberfläche an uPA-Rezeptoren gebunden ist, und Nachweisen einer Wirkung von PAI-1 entweder direkt durch ein chromogenes uPA-Substrat oder indirekt durch Zugabe von Plasminogen und Messen der Bildung von Plasmin unter Verwendung eines Plasmin-spezifischen Substrates wie des fluorogenen Substrats H-D-Val-Leu-Lys-7-amido-4-methylcumarin.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Verbindung zusätzlich 4) die Aktivität von PAI-1 in Tumorgeweben, wie bestimmt, hemmt durch Zugabe der Verbindung zu den bösartigen Zellen oder anderen Zellen in dem Tumorgewebe, die PAI-1 exprimieren, und durch die anschließende Zugabe von uPA, gefolgt vom Messen der uPA-Aktivität entweder direkt durch ein chromogenes uPA-Substrat oder indirekt durch Zugabe von Plasminogen und Messen der Bildung von Plasmin.
  17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Verbindung zusätzlich 5) das Wachstum und/oder die Invasion und/oder die Metastasierung von bösartigen menschlichen Tumorzellen hemmt, wenn sie einer nackten Maus oder einer nackten Ratte verabreicht wird, die mit den bösartigen menschlichen Tumorzellen inokuliert wurde, von denen bekannt ist, dass sie sich in Anwesenheit von uPA und PAI-1 ausbreiten und/oder metastasieren, und die zur Invasion und/oder Metastasierung in der Maus fähig sind.
  18. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Verbindung eine Verbindung ist, die an PAI-1 bindet und Plasminogen nicht in Plasmin umwandelt.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Verbindung ein Derivat oder eine Variante von uPA oder Pro-uPA ist.
  20. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Verbindung ein Antikörper ist, der an PAI-1 binden kann.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei an die Verbindung, die an PAI-1 binden kann, ein cytotoxischer Wirkstoff gekoppelt ist.
  22. Verfahren für das Auswählen einer Verbindung zur Verwendung in der Herstellung einer Zusammensetzung zum Hemmen des Wachstums, der Invasion und/oder Metastasierung eines bösartigen Tumors in einem Patienten, bei dem festgestellt wurde, dass er ein hohes Risiko hat, einen bösartigen Tumor zu entwickeln, oder der einen bösartigen Tumor entwickelt hat, wobei die Verbindung die hemmende Wirkung eines Inhibitors einer Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in bösartigem Tumorgewebe oder potentiell bösartigem Tumorgewebe unterdrücken kann, wobei das Verfahren einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst: 1) Screening-Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms bestimmt wird durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das einen immobilisierten Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und solubilisierte(s) Protease oder nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym umfasst, wobei die/das an den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms gebundene Protease oder nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym durch das markierte Enzym oder mittels eines markierten Antikörpers gegen die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym nachgewiesen wird, oder durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das immobilisierte Protease oder immobilisiertes nicht-proteolytisches Matrix-abbauendes Enzym und einen solubilisierten Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms umfasst, wobei der an die Protease oder das nicht proteolytische Matrix-abbauende Enzym gebundene Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms durch den markierten Inhibitor oder mittels eines markierten Antikörpers gegen den Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix abbauenden Enzyms nachgewiesen wird, 2) Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der hemmenden Aktivität des Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in dem Tumorgewebe bestimmt wird durch Zugabe der Verbindung zu einem System, das einen radioaktiv markierten Inhibitor der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms und Tumorzellen umfasst, die die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym exprimieren, und Nachweisen eines Inhibitors der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms, das an die Protease oder das nicht-proteolytische Matrix-abbauende Enzym bindet, durch Gammazählen der Zellen, 3) Screening-Test, bei dem die mögliche Unterdrückung der hemmenden Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nicht-proteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms durch die Verbindung unter Verwendung ganzer Zellen bestimmt wird, an die die Protease oder das nichtproteolytische Matrix-abbauende Enzym an die Oberfläche beispielsweise durch einen Proteaserezeptor wie uPA an den uPA-Rezeptor gebunden ist, 4) einen Schritt, wobei eine Verbindung, von der festgestellt wurde, dass sie die hemmende Aktivität eines Inhibitors einer Protease oder eines nichtproteolytischen Matrix-abbauenden Enzyms in dem Tumorgewebe unterdrückt, an eine nackte Maus oder eine nackte Ratte verabreicht wurde, die mit bösartigen menschlichen Tumorzellen inokuliert wurde, die zur Invasion und/oder Metastasierung in der Maus oder Ratte in Anwesenheit der Protease oder des nicht-proteolytischen Matrixabbauenden Enzyms und des Inhibitors der Protease oder des nichtproteolytischen Matrix abbauenden Enzyms in der Lage sind, und Auswählen einer Verbindung als geeignete Verbindung, die das Wachstum und/oder die Invasion und/oder Metastasierung von bösartigen menschlichen Tumorzellen in der Maus oder der Ratte hemmt.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Inhibitor der Protease PAI-1 ist.
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