DE69433723T2

DE69433723T2 - Verfahren für die in-vivo-verabreichung von biologischen substanzen und hierfür verwendbare zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69433723T2
Application number: DE69433723T
Authority: DE
Inventors: Mark W. Grinstaff; Patrick Soon-Shiong; Michael Wong; Paul A. Sandford; Kenneth S. Suslick; Neil P. Desai
Original assignee: American Bioscience Inc
Current assignee: Abraxis Bioscience LLC
Priority date: 1993-02-22
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 2005-02-24
Anticipated expiration: 2014-02-23
Also published as: JPH08507075A; US5639473A; EP0693924A4; HK1097449A1; NO314017B1; ATE264671T1; DE69433723D1; CA2155947C; NO953278L; CN1245156C; CA2155947A1; US5635207A; ES2219646T3; BR9405798A; EP0693924B2; EP0693924B1; WO1994018954A1; AU6249094A; PT693924E; NO953278D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die In-vivo-Verabreichung von biologischen Substanzen. Gemäß einem Aspekt ist die biologische Substanz verbunden mit einer polymeren Hülle, die aus einem biokompatiblen Material zubereitet ist. Die biologische Substanz kann mit der polymeren Hülle selbst verbunden sein, und/oder die in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel suspendierte/dispergierte biologische Substanz kann von der polymeren Hülle umschlossen sein. Gemäß einem anderen Aspekt wird die mit der polymeren Hülle verbundene biologische Substanz einem Patienten verabreicht, wahlweise in einer geeigneten biokompatiblen Flüssigkeit dispergiert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Im Blut vorhandene Mikropartikel und Fremdkörper werden im Allgemeinen von den "Blut-Filtrierorganen", nämlich der Milz, den Lungen und der Leber, aus dem Kreislauf entfernt. Das im normalen Gesamtblut enthaltene partikuläre Material umfasst rote Blutzellen (typischerweise mit einem Durchmesser von 8 μm), weiße Blutzellen (typischerweise mit einem Durchmesser von 6–8 μm) und Plättchen (typischerweise mit einem Durchmesser von 1–3 μm). Die Mikrozirkulation in den meisten Organen und Geweben erlaubt die freie Passage dieser Blutzellen. Wenn Mikrothromben (Blutgerinsel) von Abmessungen größer als 10–15 μm im Kreislauf vorhanden sind, hat dies das Risiko von Infarkt oder Verstopfung der Kapillargefäße zur Folge, was zu Ischämie oder Sauerstoffentzug und möglichem Absterben von Gewebe führt. Daher muss die Injektion von Partikeln mit einem Durchmesser von mehr als 10–15 μm in den Kreislauf verhindert werden. Eine Suspension von Partikeln mit weniger als 7–8 μm ist jedoch verhältnismäßig sicher und wurde zur Zuführung von pharmakologisch wirksamen Mitteln in Form von Liposomen und Emulsionen, Nahrungsmitteln und Kontrastmitteln für bildgebende Anwendungen verwendet.
Die Größe von Partikeln und ihre Art der Zuführung bestimmt ihr biologisches Verhalten. Strand et al. [in Microspheres-Biomedical Applications, Hrsg. A. Rembaum, S. 193–227, CRC Press (1988)] haben das Schicksal von Partikeln als von ihrer Größe abhängig beschrieben. Partikel im Größenordnungsbereich von wenigen Nanometern (nm) bis 100 nm dringen nach interstitieller Injektion in die lymphatischen Kapillaren ein, und eine Phagozytose kann innerhalb der Lymphknoten stattfinden. Nach intravenöser/intraarterieller Injektion werden Partikel, die kleiner als ungefähr 2 um sind, schnell aus dem Blutstrom durch das retikuloendotheliale System (RES) entfernt, auch bekannt als das mononukleäre Phagozyten-System (MPS). Partikel, die größer als ungefähr 7 μm sind, werden nach intravenöser Injektion, in den Lungen-Kapillaren eingeschlossen. Nach intraarterieller Injektion werden Partikel in dem ersten Kapillarbett, das sie erreichen, eingeschlossen. Inhalierte Partikel werden von den alveolären Makrophagen eingeschlossen.
Wasserunlösliche oder schlecht wasserlösliche und für die sauren Umgebungen im Magen empfindliche Pharmazeutika können nicht konventionell (z.B. durch intravenöse Injektion oder orale Eingabe) verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung solcher Pharmazeutika wurde erreicht durch Emulgieren von in Öl löslich gemachtem Arzneimittel mit einer wässrigen Flüssigkeit (wie normale Salzlösung) bei Vorhandensein von oberflächenaktiven Substanzen oder Emulsions-Stabilisatoren, um stabile Mikro-Emulsionen herzustellen. Diese Emulsionen können intravenös injiziert werden, vorausgesetzt, die Komponenten der Emulsion sind pharmakologisch wirkungslos. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent Nr. 4,073,943 die Verabreichung von wasserunlöslichen, pharmakologisch wirksamen, in Ölen gelösten und mit Wasser emulgierten Mitteln bei Vorhandensein von oberflächenaktiven Substanzen, wie Ei-Phosphatiden, Pluronics (Copolymere von Polypropylenglykol und Polyethylenglykol), Polyglycerololeat usw. Die internationale PCT-Veröffentlichung WO 85/00011 beschreibt pharmazeutische Mikrotröpfchen eines mit einem Phospholipid, wie Dimyristoyl-Phosphatidylcholin überzogenen Anästhetikums, das geeignete Abmessungen zur intradermalen oder intravenösen Injektion hat.
Über Protein-Mikrokugeln ist in der Literatur als Träger von pharmakologischen oder diagnostischen Mitteln berichtet worden. Mikrokugeln aus Albumin sind sowohl durch Denaturation mittels Hitze als auch durch chemische Vernetzung hergestellt worden. Mittels Hitze denaturierte Mikrokugeln werden aus einer emulgierten Mischung (z.B. Albumin, das einzuschließende Mittel, und ein geeignetes Öl) bei Temperaturen zwischen 100°C und 150°C hergestellt. Die Mikrokugeln werden dann mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen und gelagert. Leucuta et al. [International Journal of Pharmaceutics Bd. 41: 213–217 (1988)] beschreiben das Verfahren der Herstellung von mittels Hitze denaturierten Mikrokugeln.
Das Verfahren zur Herstellung chemisch vernetzter Mikrokugeln schließt die Behandlung der Emulsion mit Glutaraldehyd ein, um das Protein zu vernetzen, gefolgt von Waschen und Lagern. Lee et al. [Science Bd. 213: 233–235 (1981)] und das US-Patent Nr. 4,671,954 lehren dieses Herstellungsverfahren.
Die obigen Arbeitsverfahren zur Herstellung von Protein-Mikrokugeln als Träger von pharmakologisch aktiven Mitteln sind ungeeignet für den Einschluss von wasserunlöslichen Mitteln, obwohl sie geeignet sind zur Zufuhr von wasserlöslichen Mitteln. Diese Einschränkung wohnt dem Herstellungsverfahren inne, das auf der Vernetzung oder Hitze-Denaturation der Proteinkomponente in der wässrigen Phase einer Wasser-in-Öl-Emulsion beruht. Jedes wasserlösliche Mittel, das in der Protein enthaltenden wässrigen Phase gelöst ist, kann in der entstehenden vernetzten oder mittels Hitze denaturierten Proteinmatrix eingeschlossen sein, aber ein kaum wasserlösliches oder kaum öllösliches Mittel kann nicht in eine mittels dieser Verfahren hergestellte Proteinmatrix eingeschlossen werden.
Somit stellt die mangelhafte Wasserlöslichkeit vieler biologischer Substanzen ein Problem für die Verabreichung an Menschen dar. Tatsächlich kann die Zufuhr von schon an sich unlöslichen oder kaum in wässrigem Medium löslichen pharmakologisch wirksamen Mitteln stark beeinträchtigt werden, falls die orale Zufuhr nicht wirksam ist. Dementsprechend bedürfen derzeit angewandte Rezepturen zur Zufuhr von pharmakologisch wirksamen Mitteln, die schon an sich unlöslich oder kaum in wässrigem Medium löslich sind, der Zugabe von Mitteln, um die pharmakologisch wirksamen Mittel löslich zu machen. Häufig werden allerdings schwerwiegende allergische Reaktionen von den Mitteln (z.B. Emulgatoren) verursacht, die verwendet werden, um die pharmakologisch wirksamen Mittel löslich zu machen. Somit erfordert ein übliches Applikationsregime die Behandlung des Patienten mit Antihistaminika und Steroiden, bevor das pharmakologisch wirksame Mittel injiziert wird, um die allergischen Nebenwirkungen der angewandten Mittel zu vermindern und die Arzneimittelzufuhr zu unterstützen.
In dem Bemühen, die Wasserlöslichkeit von Arzneimitteln zu verbessern, die in wässrigem Medium an sich unlöslich oder kaum löslich sind, haben etliche Forscher die Struktur von Arzneimitteln mit funktionellen Gruppen, die eine verbesserte Wasserlöslichkeit verleihen, chemisch verändert. Unter den im Stand der Technik beschriebenen chemischen Modifikationen befinden sich die Herstellung von sulfurierten Derivaten [Kingston et al., US-Patent 5,059,699 (1991)] und Aminosäureester [Mathew et al., J. Med. Chem. Bd. 35: 145–151 (1992)], die eine signifikante biologische Wirksamkeit zeigen. Modifikationen, um wasserlösliche Derivate zu erzeugen, erleichtern die intravenöse Gabe von Arzneimitteln, die an sich unlöslich oder kaum löslich sind, in wässrigem Medium (gelöst in einem unschädlichen Träger, wie normale Salzlösung). Solche Modifikationen kommen jedoch zu den Herstellungskosten der Arzneimittel hinzu, können unerwünschte Nebenwirkungen und/oder allergische Reaktionen hervorrufen und/oder können die Wirksamkeit des Arzneimittels herabsetzen.
Zusätzliche biologische Substanzen, die meist in einem wässrigen Medium an sich unlöslich oder kaum löslich sind und für die es wünschenswert wäre, sie in einem unschädlichen Träger, wie normaler Salzlösung, gelöst zu verabreichen, während sie einem Minimum an unerwünschten Nebenwirkungen und/oder allergischen Reaktionen Vorschub leisten, sind Diagnosemittel, wie z.B. Kontrastmittel. Kontrastmittel sind erwünscht bei radiologischer Bildgebung, da sie die Sichtbarmachung von Organen (d.h. ihre Lage, Größe und räumliche Anordnung) und anderen Zellstrukturen vor dem umgebenden Medium verbessern. Die Weichteile zum Beispiel haben eine ähnliche Zellzusammensetzung (d.h. sie bestehen vorwiegend aus Wasser), wenn sie auch bemerkenswert unterschiedliche biologische Funktionen haben (z.B. Leber und Bauchspeicheldrüse).
Das Verfahren der Magnet-Resonanz-Darstellung (MRI) oder Kernspinresonanz-(NMR-) Darstellung beruht auf dem Nachweis bestimmter Atomkerne bei einer angelegten Magnetfeldstärke unter Anwendung von Radiofrequenzstrahlung. In einiger Hinsicht ist es ähnlich der Röntgen-Computertomographie (CT), dahingehend, dass es (in manchen Fällen) Querschnittsabbildungen von Organen liefern kann mit einer möglicherweise ausgezeichneten Weichteilauflösung. In seiner gegenwärtigen Nutzung erstellen die Bilder eine Verteilungskarte von Protonen in Organen und Geweben. Jedoch verwendet MRI, anders als eine Röntgen-Computertomographie, keine ionisierende Strahlung. MRI ist daher ein sicheres, nichtinvasives Verfahren zur medizinischen Bildgebung.
Obwohl das NMR-Phänomen im Jahr 1954 entdeckt wurde, hat es in der medizinischen Diagnostik dennoch erst kürzlich als Mittel zur Kartierung innerer Strukturen Verwendung gefunden. Das Verfahren wurde zuerst von Lauterbur entwickelt [Nature 242: 190–191 (1973)].
Es ist wohl bekannt, dass sich Kerne mit dem passenden Kernspin in Richtung des angelegten Magnetfeldes ausrichten. Der Kernspin kann in jeder von zwei verschiedenen Arten ausgerichtet werden: mit oder gegen das äußere Magnetfeld. Die Ausrichtung mit dem Feld ist stabiler; wohingegen Energie absorbiert werden muss, um sich im weniger stabilen Zustand auszurichten (d.h. gegen das angelegte Feld). Falls es sich um Protonen handelt, präzedieren oder resonieren diese Kerne bei einer Frequenz von 42,6 MHz bei Vorhandensein eines Magnetfeldes von 1 Tesla (1 Tesla = 10° Gauß). Bei dieser Frequenz erregt ein Hochfrequenz-(HF-)Strahlungsimpuls die Kerne und ändert ihre Spin-Orientierung, damit sie sich gegen das angelegte Magnetfeld ausrichten. Nach dem HF-Impuls entspannen die erregten Kerne oder kehren zum Äquilibrium oder der Ausrichtung mit dem Magnetfeld zurück. Die Abnahme des Relaxationssignals kann unter Verwendung von zwei Relaxationstermen beschrieben werden. T₁, die Spin-Gitter-Relaxationszeit oder Longitudinalrelaxationszeit, ist die Zeit, die von den Kernen benötigt wird, um zum Äquilibrium entlang der Richtung des von außen angelegten Magnetfeldes zurückzukehren. Die zweite, T₂ oder Spin-Spin-Relaxationszeit, ist mit dem Verschieben der anfänglich kohärenten Präzession der einzelnen Protonen-Spins verbunden. Die Relaxationszeiten für verschiedene Flüssigkeiten, Organe und Gewebe in unterschiedlichen Arten von Säugetieren sind sehr gut dokumentiert.
Ein Vorteil der MRI ist, dass unterschiedliche Abtastebenen und Schnittdicken ohne Verluste bei der Auflösung ausgewählt werden können. Dies erlaubt, dass qualitativ hochwertige transversale, koronale und sagittale Bilder direkt gewonnen werden. Das Fehlen jeglicher mechanischer beweglicher Teile in der MRI-Ausrüstung fördert einen hohen Zuverlässigkeitsgrad. Es wird allgemein angenommen, dass die MRI bei der selektiven Untersuchung von Geweben ein höheres Potential hat als die Röntgen-Computertomographie (CT). In der CT bestimmen allein die Koeffizienten der Röntgenstrahlenabschwächung die Bildschärfe, während mindestens drei separate Variablen (T₁, T₂ und die Kernspin-Dichte) am Magnetresonanzbild mitwirken.
Aufgrund feiner physio-chemischer Unterschiede zwischen Organen und Geweben kann die MRI Gewebetypen unterscheiden und Erkrankungen wahrnehmen, die möglicherweise von Röntgenstrahlen oder der CT nicht wahrgenommen werden können. Im Vergleich sind CT und Röntgenstrahlen nur empfindlich für Unterschiede der Elektronendichte in Geweben und Organen. Die mittels MRI-Verfahren erhältlichen Bilder können einen Arzt auch in die Lage versetzen, wegen ihrer besseren räumlichen Auflösung Strukturen wahrzunehmen, die kleiner sind als die mittels CT wahrgenommenen. Zusätzlich kann jede Bildabtastebene, einschließlich transversal, koronal und sagittal, unter Verwendung von MRI-Verfahren leicht erhalten werden.
Derzeit wird MRI breit genutzt zur Unterstützung bei der Diagnose vieler medizinischer Störungen. Beispiele schließen ein: Gelenkschäden, Knochenmarksstörungen, Tumoren der Weichteile, Mediastinalinvasion, Lymphadenopathie, kavernöses Hämangiom, Hämochromatose, Zirrhose, Nierenzellkarzinom, uterines Leiomyom, Adenomyose, Endometriose, Mammakarzinome, Stenose, koronare Arterienerkrankung, Aortendissektion, lipomatöse Hypertrophie, Vorhofseptum, konstriktive Perikarditis, und dergleichen [siehe z.B. Edelman & Warach, Medical Progress 328: 708–716 (1993); Edelman & Warach, New England J. of Medicine 328: 785–791 (1993)].
Routinemäßig angewandte Magnet-Resonanz-Bilder basieren derzeit auf Protonen-Signalen, die aus den Wassermolekülen innerhalb der Zellen hervorgehen. Folglich ist es oft schwierig, die Bilder zu entziffern und einzelne Organe und Zellstrukturen zu unterscheiden. Es gibt zwei mögliche Mittel, um Protonensignale besser zu unterscheiden. Das erste schließt die Verwendung eines Kontrastmittels ein, das T₁ oder T₂ der Wassermoleküle in einem Bereich im Vergleich zu einem anderen verändert. Zum Beispiel verkürzt Gadolinium-Diethylentriaminpenta-Essigsäure (Gd-DTPA) die Protonen-T₁-Relaxationszeit der sich in der Nähe dazu befindlichen Wassermoleküle, wodurch die gewonnenen Bilder verbessert werden.
Der zweite Weg zur Unterscheidung einzelner Organe und zellulärer Strukturen ist, einen anderen Kern für die Bildgebung einzuführen (d.h. ein bildgebendes Mittel). Bei der Anwendung dieser zweiten Vorgehensweise kann die Bildgebung nur dort stattfinden, wo das Kontrastmittel verabreicht wurde. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist die Tatsache, dass die Bildgebung ohne Beeinträchtigung durch das umgebende Wasser erreicht wird. Geeignete Kontrastmittel müssen biokompatibel sein (d.h. nicht toxisch, chemisch stabil, nicht mit Geweben reagierend) und von begrenzter Lebensdauer vor Ausscheidung aus dem Körper.
Obwohl Wasserstoff typischerweise als Grundlage für die MRI-Abtastung ausgewählt worden ist (wegen seiner Häufigkeit im Körper), kann dies wegen fehlendem Kontrast schwach dargestellte Bereiche zur Folge haben. Folglich kann daher die Verwendung anderer aktiver MRI-Nuklei (wie z.B. Fluor) vorteilhaft sein. Die Verwendung bestimmter Perfluorkohlenstoffe in verschiedenen diagnostischen Bildgebungstechnologien, wie Ultraschall, Magnet-Resonanz, Radiographie und Computertomografie ist in einem Artikel von Mattery [siehe SPIE, 626, XIV/PACS IV, 18–23 (1986)] beschrieben worden. Die Verwendung von Fluor ist vorteilhaft, da Fluor nicht natürlicherweise im Körper gefunden wird.
Vorschläge des Standes der Technik von Fluor enthaltenden Verbindungen, die für die Magnet-Resonanz-Bildgebung für medizinische Diagnosezwecke nützlich sind, sind begrenzt auf eine ausgewählte Gruppe von Fluor enthaltenden Molekülen, die wasserlöslich sind oder Emulsionen bilden können. Dementsprechend leidet die Verwendung von Fluorkohlenstoff-Emulsionen wasserlöslicher Fluorkohlenstoffe des Standes der Technik unter zahlreichen Nachteilen, z. B.:

1) Verwendung instabiler Emulsionen,
2) Fehlen von Organspezifität und Ausrichtung auf das Organ,
3) Potential zur Induktion allergischer Reaktionen aufgrund der Verwendung von Emulgatoren und oberflächenaktiven Substanzen (z. B. Ei-Phosphatide und Eidotter- Lecithin),
4) begrenzte Lieferkapazitäten, und
5) wasserlösliche Fluorkohlenstoffe werden nach der intravenösen Injektion schnell in Blut verdünnt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen die bei der In-vivo-Verabreichung von biologischen Substanzen nützlich sind, in Form von Mikropartikeln zur Verfügung gestellt, die zur parenteralen Applikation in wässriger Suspension geeignet sind. Zusammensetzungen der Erfindung umfassen biologische Substanzen (als Feststoff oder Flüssigkeit) in Verbindung mit einer polymeren Hülle. Die polymere Hülle ist ein biokompatibles Material, vernetzt durch das Vorhandensein von Disulfidbindungen. Die Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung zur Verabreichung von biologischen Substanzen beseitigt die Notwendigkeit der Anwendung biologischer Substanzen in einer Emulsion, die z.B. Ethanol und polyethoxyliertes Rizinusöl, verdünnt in normaler Salzlösung enthält (siehe zum Beispiel Norton et al., in Abstracts of the 2nd National Cancer Institute Workshop on Taxol & Taxus, September 23–24, 1992). Ein Nachteil solcher bekannter Verbindungen ist ihre Neigung, allergische Nebenwirkungen hervorzurufen.
Entsprechend einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Einschluss von biologischen Substanzen in eine polymere Hülle zur Verfügung gestellt. Noch weiters entsprechend der vorliegenden Erfindung werden Mittel zur Gewinnung von lokalen Sauerstoff- und Temperaturdaten sowie zur Gewinnung von Fluor-Magnetresonanz-Bildern von Körperorganen und -geweben zur Verfügung gestellt.
Die Verabreichung von biologischen Substanzen in Form einer Mikropartikel-Suspension erlaubt einen gewissen Grad der erzielten Wirkstofffreisetzung an Organen, wie Leber, Lungen, Milz, Lymphkreislauf und dergleichen, durch Verwendung von Partikeln verschiedener Größe und durch Verabreichung auf unterschiedlichen Wegen. Das Verfahren der Erfindung zur Verabreichung erlaubt ferner die Verabreichung von biologischen Substanzen, wie im Wesentlichen wasserunlösliche pharmakologisch wirksame Mittel, die ein viel geringeres Flüssigkeitsvolumen verwenden und eine beträchtlich verminderte Verabreichungszeit benötigen, verglichen mit den Verabreichungsvolumina und -zeiten, die von Verabreichungssystemen im Stand der Technik benötigt werden (z.B. werden intravenöse Infusionen von ungefähr ein bis zwei Litern Flüssigkeit über einen Zeitraum von 24 Stunden benötigt, um eine typische Human-Dosis von 200–400 mg Taxol zu verabreichen).
Zum Beispiel kann eine Lösung von polymeren Hüllen der Erfindung intravenös verabreicht werden, was eine Bildgebung vaskularisierter Organe (z.B. Leber, Milz, Lymphsystem und Lunge) und des Knochenmarks ermöglicht. Die Organ-Zielspezifität wird erreicht als ein Ergebnis der Aufnahme der Organofluor enthaltenden polymeren Hüllen im Mikrometergrößenbereich durch das retikuloendotheliale System (RES) (auch bekannt als das mononukleäre Phagozyten-(MNP-) System). Organe wie die Leber und die Milz spielen eine wichtige Rolle bei der Entfernung von fremden Spezies (z.B. Feststoffteilchen) aus dem Blutstrom, und auf sie wird daher oft verwiesen als die "Blut-Filtrier-Organe". Diese Organe bilden den Hauptteil des RES. Zusätzlich enthalten Lymphknoten innerhalb des Lymphkreislaufs Zellen des RES. Folglich ist die Bildgebung des Lymphsystems möglich, indem Organofluor enthaltende polymere Hüllen im Mikrometergrößenbereich der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Indem sie oral oder als Suppositorium gegeben werden, kann die Bildgebung des Magens oder Gastrointestinaltraktes durchgeführt werden. Solche Lösungen können auch in den nicht-vaskulären Raum injiziert werden, wie die Zerebrospinalhöhle, was die Bildgebung auch dieses Raums erlaubt.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile des Standes der Technik, indem sie zur Verfügung stellt:

1) injizierbare Suspensionen von biologische Substanzen enthaltenden polymeren Hüllen,
2) biologische Substanzen in einer Form mit verbesserter Stabilität im Vergleich zu einfachen Emulsionen,
3) Organ-Zielspezifität (z.B. Leber, Milz, Lunge und dergleichen) aufgrund der Aufnahme der polymeren Hüllen der Erfindung durch das RES oder MNP-System,
4) emulgatorfreies System, wodurch Mittel vermieden werden, die möglicherweise allergische Reaktionen verursachen können, und
5) die Fähigkeit, relativ geringe Dosen von biologischen Substanzen zu injizieren und immer noch eine gute Reaktion zu erzielen, da die biologische Substanzen enthaltenden polymeren Hüllen der Erfindung auf ein bestimmtes Organ gerichtet werden können.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine schematische Darstellung einer polymeren Hülle, hergestellt entsprechend der vorliegenden Erfindung. In der Zeichnung bezieht sich A auf die unlösliche, über Disulfidbrücken vernetzte polymere Hülle, B bezieht sich auf das Innere der polymeren Hülle, das gelösten Sauerstoff enthaltenden Fluorkohlenstoff, ein biokompatibles Öl mit darin gelöster biologischer Substanz, eine in einem wässrigen Medium gelöste biologische Substanz enthaltende Wasser-in-Öl-Emulsion, eine Suspension aus in einer Flüssigkeit dispergierten Feststoffteilchen und dergleichen enthalten kann, C bezeichnet die Dicke der polymeren Hülle, typischerweise ungefähr 5–50 Nanometer, und D bezieht sich auf den Durchmesser der polymeren Hülle, typischerweise in einem Bereich von ungefähr 0,1 bis zu 20 μm.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen zur In-vivo-Verabreichung einer biologischen Substanz zur Verfügung gestellt,

– wobei die biologische Substanz ausgewählt ist aus:
– einem Feststoff, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist,
– einer Flüssigkeit, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, oder
– Kombinationen der beiden,
– wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 um ist,
– wobei die polymere Hülle ein biokompatibles Material umfasst, das im Wesentlichen durch Disulfidbindungen vernetzt ist, und
– wobei die polymere Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das Mittel wahlweise mit der polymeren Hülle durch eine optionale kovalente Bindung verbunden ist,
– wobei das Äußere der polymeren Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das Mittel mit der polymeren Hülle durch eine optionale kovalente Bindung verbunden ist.

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "In-vivo-Verabreichung" auf die Verabreichung einer biologischen Substanz auf solchen Verabreichungswegen wie oral, intravenös, subkutan, intraperitoneal, intrathekal, intramuskulär, intrakraniell, durch Inhalation, topisch, transdermal, mittels Suppositorium (rektal), mittels Pessar (vaginal) und dergleichen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "biologische Substanz" auf pharmazeutisch wirksame Mittel (wie z.B. analgetische Mittel, Betäubungsmittel, Antiasthmatika, Antibiotika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antimykotika, Blutdruck senkende Mittel, entzündungshemmende Mittel, antineoplastische Mittel, anxiolytische Mittel, enzymatisch aktive Mittel, Nukleinsäurekonstrukte, immunstimulierende Mittel, immunsuppressive Mittel, physiologisch aktive Gase, Vakzine und dergleichen), Diagnosemittel (wie Ultraschall-Kontrastmittel, Radiokontrastmittel oder Magnetkontrastmittel), Mittel mit Ernährungswert und dergleichen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "μm" auf eine Maßeinheit von einem Tausendstel eines Millimeters.
Eine Anzahl von biokompatiblen Materialien kann in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung zur Bildung einer polymeren Hülle verwendet werden. Wie hier verwendet, beschreibt der Begriff "biokompatibel" eine Substanz, die das biologische System, in das sie eingeführt wird, nicht nennenswert verändert oder in irgendwie nachteiliger Weise beeinträchtigt. Es kann im Wesentlichen jedes Material, ob natürlich oder synthetisch, das Sulfhydrylgruppen oder Disulfidbindungen in seiner Struktur enthält, zur Herstellung einer mit Disulfid vernetzten Hülle verwendet werden. Die Sulfhydrylgruppen oder Disulfidbindungen können bereits vorher innerhalb der Struktur des biokompatiblen Materials vorhanden sein, oder sie können durch eine geeignete chemische Modifikation eingeführt werden. Zum Beispiel sind natürlich vorkommende biokompatible Materialien, wie Proteine, Polypeptide, Oligopeptide, Polynukleotide, Polysaccharide (z.B. Stärke, Cellulose, Dextrane, Alginate, Chitosan, Pektin, Hyaluronsäure und dergleichen), Lipide usw., Kandidaten für solch eine Modifikation. Andere Bindungen, wie Ester, Amide, Ether und dergleichen, können ebenfalls während des Ultraschall-Beschallungsschrittes gebildet werden (solange die notwendigen funktionellen Gruppen auf dem Ausgangsmaterial vorhanden sind).
Als Beispiele für geeignete biokompatible Materialien können natürlich vorkommende oder synthetische Proteine verwendet werden, solange solche Proteine genügend Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen haben, so dass Vernetzung (durch Disulfidbindungsbildung zum Beispiel, als ein Oxidationsergebnis während Ultraschall-Beschallung) stattfinden kann. Beispiele geeigneter Proteine schließen Albumin (das 35 Cystein-Reste enthält), Insulin (das 6 Cysteine enthält), Hämoglobin (das 6 Cystein-Reste je α₂β₂ -Einheit enthält), Lysozym (das 8 Cystein-Reste enthält), Immunglobuline, α-2-Makroglobulin, Fibronektin, Vitronektin, Fibrinogen und dergleichen, wie auch Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein.
Ein derzeit bevorzugtes Protein zur Verwendung bei der Bildung einer polymeren Hülle ist Albumin. Ein weiteres derzeit bevorzugtes Protein zur Verwendung bei der Bildung einer polymeren Hülle ist Hämoglobin. Noch ein weiteres derzeit bevorzugtes Protein zur Verwendung bei der Bildung einer polymeren Hülle ist eine Kombination von Albumin und Hämoglobin. Wahlweise könnten Proteine, wie α-2-Makroglobulin, ein bekanntes Opsonin, verwendet werden, um die Aufnahme von durch die Hülle eingeschlossenen Partikeln der biologischen Substanz durch makrophagenähnliche Zellen zu verbessern oder um die Aufnahme von durch die Hülle eingeschlossenen Partikeln in Leber und Milz zu verbessern. Andere funktionelle Proteine, wie Antikörper oder Enzyme, die das Richten der biologischen Substanz auf eine gewünschte Stelle erleichtern könnten, können ebenfalls bei der Bildung der polymeren Hülle verwendet werden.
Ähnlich sind synthetische Polypeptide, die Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen enthalten, ebenfalls gute Kandidaten zur Bildung von Partikeln, die eine polymere Hülle haben. Zusätzlich sind Polyalkylenglykole (z.B. lineare oder verzweigte Kette), Polyvinylalkohol, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidinon und dergleichen gute Kandidaten für die chemische Modifikation (um Sulfhydryl- und/oder Disulfidbindungen einzuführen) und Hüllenbildung (indem sie deren Vernetzung verursachen).
Bei der Zubereitung der Zusammensetzungen der Erfindung verwendet man ein nichtwässriges Dispergierungsmittel, um eine biologische Substanz zu suspendieren oder zu lösen. Dispergierungsmittel, die zur Verwendung in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung gedacht sind, schließen jede beliebige Flüssigkeit ein, die eine biologische Substanz suspendieren oder lösen kann, jedoch weder mit dem zur Herstellung der Hülle verwendeten Polymer noch mit der biologischen Substanz selbst reagiert. Beispiele schließen pflanzliche Öle (z.B. Sojaöl, Mineralöl, Maiskeimöl, Rapssamenöl, Kokosöl, Olivenöl, Safloröl, Baumwollsamenöl und dergleichen), aliphatische, cykloaliphatische oder aromatische Kohlenwasserstofte, die 4–30 Kohlenstoffatome haben (z.B. n-Dodekan, n-Dekan, n-Hexan, Cyklohexan, Toluen, Benzol und dergleichen), aliphatische oder aromatische Alkohole mit 1–30 Kohlenstoffatomen (z.B. Oktanol und dergleichen), aliphatische oder aromatische Ester mit 2–30 Kohlenstoffatomen (z.B. Ethylcaprylat (Oktanoat) und dergleichen), Alkyl, Aryl oder cyklische Ether mit 2–30 Kohlenstoffatomen (z.B. Diethylether, Tetrahydrofuran und dergleichen), Alkyl- oder Arylhalide mit 1–30 Kohlenstoffatomen (und wahlweise mehr als einem Halogensubstituenten, z.B. CH₃Cl, CH₂Cl₂, CH₂Cl-CH₂Cl und dergleichen), Ketone mit 3–30 Kohlenstoffatomen (z.B. Aceton, Methylethylketon und dergleichen), Polyalkylenglykole (z.B. Polyethylenglykol und dergleichen) oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein.
Besonders bevorzugte Kombinationen von Dispergierungsmitteln enthalten flüchtige Flüssigkeiten, wie Dichlormethan, Ethylacetat, Benzen und dergleichen (d.h. Lösungsmittel, die einen hohen Grad an Löslichkeit für das pharmakologisch wirksame Mittel haben und die in dem anderen verwendeten Dispergierungsmittel löslich sind) zusammen mit einem weniger flüchtigen Dispergierungsmittel. Wenn sie zu dem anderen Dispergierungsmittel hinzugefügt werden, helfen diese flüchtigen Additive, die Löslichkeit des pharmakologisch wirksamen Mittels in dem Dispergierungsmittel voranzutreiben. Dies ist wünschenswert, da dieser Schritt üblicherweise zeitraubend ist. Nach der Auflösung kann die flüchtige Komponente durch Verdampfung (wahlweise unter Vakuum) entfernt werden.
Partikel von biologischen Substanzen, die im Wesentlichen vollkommen in einer polymeren Hülle enthalten oder mit ihr verbunden sind, die wie hier beschrieben zubereitet wurden, werden als eine Suspension in einem biokompatiblen Medium verabreicht. Dieses Medium kann ausgewählt werden aus Wasser, gepufferten wässrigen Medien, Salzlösung, gepufferter Salzlösung, wahlweise gepufferten Lösungen aus Aminosäuren, wahlweise gepufferten Lösungen aus Proteinen, wahlweise gepufferten Lösungen aus Zuckern, wahlweise gepufferten Lösungen aus Kohlenhydraten, wahlweise gepufferten Lösungen aus Vitaminen, wahlweise gepufferten Lösungen aus synthetischen Polymeren, Lipid enthaltenden Emulsionen und dergleichen.
Entsprechend einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Zubereitung einer biologischen Substanz zur In-vivo-Verabreichung zur Verfügung gestellt, das das Aussetzen des Mediums, das biokompatibles Material enthält, das durch Disulfidbindungen vernetzt werden kann, und der biologischen Substanz an Ultraschall-Bedingungen hoher Intensität für eine Zeit, die ausreicht, dieses biokompatible Material durch im Wesentlichen Disulfidbindungen zu vernetzen, umfasst;

– wobei diese biologische Substanz im Wesentlichen vollkommen in einer polymeren Hülle enthalten ist,
– wobei die größte Querschnittsabmessung dieser Hülle nicht größer als 10 μm ist, und
– wobei die biologische Substanz ein Feststoff oder eine Flüssigkeit ist, die in einem nicht wässrigen, biokompatiblen Dispergierungsmittel gelöst ist.

Somit werden entsprechend der vorliegenden Erfindung in polymeren Hüllen enthaltene biologische Substanzen synthetisiert, indem hochintensiver Ultraschall angewandt wird. Zwei nicht lineare akustische Prozesse werden in die Bildung stabiler polymerer Hüllen (d.h. akustische Emulgierung und Kavitation) einbezogen. Zunächst dispergiert die akustische Emulgierung die biologische Substanz in die wässrige Proteinlösung. Die gebildete Dispersion wird dann chemisch vernetzt und stabilisiert durch die Bildung von Disulfidbindungen. Die Disulfidbindungen werden gebildet von den Cystein-Resten (in dem Falle, wo das Polymer ein Protein wie Albumin ist), die oxidiert werden durch Superoxid, das durch akustische Kavitation erzeugt wurde.
Die sich ergebende Suspension wird wahlweise durch Centriconfilter gefiltert (100 kDa Rückhaltevermögen), und die gefilterten Konstrukte oder Mikroblasen werden erneut in normaler Salzlösung oder geeignetem Puffer suspendiert. 1 zeigt ein Schema solch eines Konstruktes. Der durchschnittliche Durchmesser dieser Konstrukte ist ungefähr 2 μm. Von der Partikelgrößenverteilung, wie mit einem Elzone-Partikelzähler festgestellt, wird gesehen, dass sie recht eng ist (eine Gauß-Verteilung mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 3 μm wird typischerweise beobachtet). Der Größenbereich von mittels dieser Technik erhaltenen Partikeln liegt zwischen 0,1 μm bis 20 μm. Ein bevorzugter Größenbereich ist 0,5 bis 10 μm, und der bevorzugteste Größenbereich ist 1 bis 5 μm. Diese Größe ist ideal geeignet für medizinische Anwendungen, da intravenöse oder intraarterielle Injektionen ohne das Risiko der Blockierung kleiner Blutgefäße und nachfolgender Gewebeschädigung (Ischämie infolge von Sauerstoffentzug) durchgeführt werden können. Zum Vergleich: normale rote Blutzellen haben einen Durchmesser von ungefähr 8 μm.
Ein nicht naheliegendes Merkmal des oben beschriebenen Prozesses liegt in der Wahl des Dispergierungsmittels, insbesondere hinsichtlich der Polarität des Dispergierungsmittels. Die Bildung einer Hülle um die Partikel der biologischen Substanz ist verbunden mit einer Neuorientierung des biokompatiblen Materials an der Grenzfläche zwischen der wässrigen und der nichtwässrigen Phase dergestalt, dass die hydrophilen Bereiche in dem biokompatiblen Material der wässrigen Phase ausgesetzt werden, während die hydrophoben Bereiche in dem biokompatiblen Material in Richtung der nichtwässrigen Phase orientiert werden. Falls das biokompatible Material ein Protein ist, muss dem Polymer zur Durchführung der Entfaltung oder Änderung der Konformation Energie zugeführt werden. Die freie Energie der Grenzfläche (Grenzflächen-Spannung) zwischen den beiden flüssigen Phasen (d.h. wässrig und nichtwässrig) trägt zu den Änderungen in der Proteinkonformation an dieser Grenzfläche bei. Thermische Energie trägt ebenfalls zu dem Energie-Pool bei, der zur Entfaltung und/oder Änderung der Proteinkonformation benötigt wird.
Die Zufuhr thermischer Energie ist eine Funktion solcher Variablen wie die Schallleistung, die angewandt wird bei dem Ultraschallbeschallungsvorgang hoher Intensität, die Zeit der Ultraschallbeschallung hoher Intensität, die Art des der Ultraschallbeschallung mit hoher Intensität ausgesetzten Materials, das Volumen des Materials, das der Ultraschallbeschallung mit hoher Intensität ausgesetzt wird und dergleichen. Die Schallleistung von Ultraschallbeschallungsvorgängen hoher Intensität kann stark variieren; typischerweise fällt sie in den Bereich von ungefähr 1 bis zu 1000 Watt/cm², wobei eine Schallleistung im Bereich von ungefähr 50 bis zu 200 Watt/cm² derzeit ein bevorzugter Bereich ist. Ähnlich kann die Zeit der Aussetzung an Ultraschallbeschallung hoher Intensität stark variieren; typischerweise fällt sie in den Bereich von wenigen Sekunden bis zu ungefähr 5 Minuten. Vorzugsweise wird die Zeit des Aussetzens an Ultraschallbeschallung hoher Intensität in den Bereich von ungefähr 15 bis zu 60 Sekunden fallen. Fachleute erkennen, dass je höher die angewandte Schallleistung ist, umso weniger Zeit des Aussetzens an Ultraschallbeschallung hoher Intensität benötigt wird, und umgekehrt.
Die freie Energie an der Grenzfläche ist direkt proportional zur Polaritätsdifferenz zwischen den zwei Flüssigkeiten. Somit ist bei einer gegebenen Arbeitstemperatur eine minimale freie Energie an der Grenzfläche zwischen den zwei Flüssigkeiten notwendig, um die gewünschte polymere Hülle zu bilden. Somit sind, falls eine homologe Serie von Dispergierungsmitteln mit gradueller Änderung der Polarität genommen wird, zum Beispiel Ethylester von Alkansäuren, höhere Homologa zunehmend apolar, d.h., die Grenzflächenspannung zwischen diesen Dispergierungsmitteln und Wasser steigt, wie die Anzahl der Kohlenstoffatome im Ester ansteigt. Somit ward gefunden, dass, obwohl Ethylacetat wasserunmischbar ist (d.h. ein Ester einer Säure mit 2 Kohlenstoffen), dieses Dispergierungsmittel allein bei Raumtemperatur (∼20 °C) keine signifikante Ausbeute an mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln ergeben wird. Im Gegensatz dazu ergibt ein höherer Ester wie Ethyloctanoat (Ester einer Säure mit 8 Kohlenstoffen) mit polymeren Hüllen beschichte Partikel in hoher Ausbeute. Tatsächlich ergibt Ethylheptanoat (Ester einer 7-Carbonsäure) eine mäßige Ausbeute, während die niedrigeren Ester (Ester von Säuren mit 3, 4, 5 oder 6 Kohlenstoffen) eine geringe Ausbeute ergeben. Somit kann man bei einer gegebenen Temperatur einen Zustand einer Minimum-Grenzflächenspannung zwischen wässrigem und Dispergierungsmittel festlegen, die zur Bildung großer Ausbeuten von mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln benötigt wird.
Die Temperatur ist eine andere Variable, die manipuliert werden kann, um die Ausbeute von mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln zu beeinflussen. Im Allgemeinen nimmt die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit mit zunehmender Temperatur ab. Die Rate der Veränderung der Oberflächenspannung mit der Temperatur ist bei verschiedenen Flüssigkeiten oft unterschiedlich. Somit kann zum Beispiel die Grenzflächenspannung (Δγ) zwischen zwei Flüssigkeiten Δγ, bei Temperatur T₁ sein, und Δγ₂ bei Temperatur T₂. Falls Δγ₁ bei T₁ nahe dem zur Bildung von polymeren Hüllen der vorliegenden Erfindung benötigten Minimum ist, und falls Δγ₂ (bei Temp. T₂) größer ist als Δγ₁, dann wird eine Temperaturänderung von T₁ zu T₂ die Ausbeute von polymeren Hüllen erhöhen. Dies ist tatsächlich im Falle von Ethylheptanoat beobachtet worden, das eine mäßige Ausbeute bei 20 °C ergibt, jedoch eine hohe Ausbeute bei 10 °C.
Die Temperatur beeinflusst auch den Dampfdruck der verwendeten Flüssigkeiten. Je niedriger die Temperatur, umso niedriger ist der Gesamtdampfdruck. Je niedriger der Gesamtdampfdruck, umso besser funktioniert das Zusammenbrechen der Kavitationsblase. Ein besser funktionierendes Zusammenbrechen der Ultraschallbeschallungsblase korreliert mit einer erhöhten Rate der Peroxid-(HO₂)-Bildung. Eine erhöhte Rate der Peroxid-Bildung führt zu erhöhten Ausbeuten an polymeren Hüllen bei niedrigeren Temperaturen. Als eine gegengleiche Betrachtung erhöht sich jedoch die Reaktionsrate für die Oxidation der Sulfhydrylgruppen (d.h. um Disulfidbindungen zu bilden) durch Peroxid-Ionen mit ansteigender Temperatur. Somit besteht für eine gegebene Flüssigkeit, die Ultraschallbeschallungs-Bedingungen ausgesetzt wird, ein ziemlich enger Bereich von optimalen Betriebstemperaturen, innerhalb derer eine hohe Ausbeute an polymeren Hüllen erzielt wird.
Somit diktiert eine Kombination von zwei Effekten, d.h. die Änderung der Oberflächenspannung mit der Temperatur (die die Entfaltung und/oder Konformationsänderungen des Polymers direkt beeinflusst) und die Änderung in der Reaktionsausbeute (wobei die Reaktion die Vernetzung des Polymers über die Bildung von Disulfidbindungen ist) mit der Temperatur, die Gesamtumsetzung oder -ausbeute von mit polymeren Hüllen überzogenen Partikeln. Geeignete Temperaturen für die Herstellung von polymeren Hüllen der Erfindung fallen in den Bereich von ungefähr 0–80 °C.
Der oben beschriebene Ultraschallbeschallungsprozess kann beeinflusst werden, um mit polymeren Hüllen überzogene Partikel herzustellen, die eine biologische Substanz enthalten und einen Bereich an Größen haben. Derzeit bevorzugte Partikelradien fallen in den Bereich von ungefähr 0,1 bis zu ungefähr 5 um. Eine enge Größenverteilung in diesem Bereich ist besonders geeignet zur intravenösen Verabreichung der biologischen Substanz. Die mit der polymeren Hülle überzogenen Partikel werden dann vorzugsweise in einem biokompatiblen Medium suspendiert (wie hier beschrieben), bevor sie mit geeigneten Mitteln verabreicht werden.
Zusätzlich kann die polymere Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert werden, wobei das Mittel durch eine optionale kovalente Bindung mit der polymeren Hülle verbunden ist. Für solche Verbindungen in Betracht kommende kovalente Bindungen schließen Ester, Ether, Urethan, Diester, Amid, sekundäre und tertiäre Amine, Phosphatester, Sulfatester und ähnliche Bindungen ein. Geeignete Mittel, die für diese optionale Modifikation der polymeren Hülle ins Auge gefasst werden, schließen synthetische Polymere (Polyalkylenglykole (z.B. lineares oder verzweigtes Polyethylenglykol), Polyvinylalkohol, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidinon und dergleichen), Phospholipide (wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (P1), Sphingomyelin und dergleichen), Proteine (wie Enzyme, Antikörper und dergleichen), Polysaccharide (wie Stärke, Cellulose, Dextrane, Alginate, Chitosan, Pektin, Hyaluronsäure und dergleichen), chemische Modifikationen (wie Pyridoxal-5'-Phosphat, Derivate von Pyridoxal, Dialdehyde, Diaspirinester und dergleichen) oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein.
Variationen des Hauptthemas von gelöster biologischer Substanz, die in einer polymeren Hülle eingeschlossen ist, sind möglich. Eine Suspension von feinen Partikeln der biologischen Substanz in einem biokompatiblen Dispergierungsmittel könnte verwendet werden (anstelle eines biokompatiblen Dispergierungsmittels, das die gelöste biologische Substanz enthält), um eine polymere Hülle herzustellen, die in einem Dispergierungsmittel suspendierte Partikel der biologischen Substanz enthält. In anderen Worten, die polymere Hülle könnte eine gesättigte Lösung einer biologischen Substanz in einem Dispergierungsmittel enthalten. Eine andere Variante ist eine polymere Hülle, die einen festen Kern einer biologischen Substanz enthält, der hergestellt wird durch anfängliches Lösen der biologischen Substanz in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel (z.B. Benzol), Bilden der polymeren Hülle und Verdampfen des flüchtigen Lösungsmittels unter Vakuum, z.B. in einem Rotationsverdampfer, oder Gefriertrocknen der gesamten Suspension. Dies mündet in eine Struktur, die einen festen Kern der biologischen Substanz hat, die umgeben wird von einem Polymermantel. Dieses letztere Verfahren ist besonders vorteilhaft, um hohe Dosen einer biologischen Substanz in einem verhältnismäßig kleinen Volumen zuzuführen. In einigen Fällen könnte das biokompatible Material, das die Hülle um den Kern bildet, selbst ein Therapeutikum oder Diagnosemittel sein, z.B. im Falle von Insulin, das als Teil einer polymeren Hülle verabreicht werden könnte, die im oben beschriebenen Ultraschallbeschallungsvorgang gebildet wurde. In anderen Fällen könnte das die Hülle bildende Polymer an der Verabreichung einer biologischen Substanz teilhaben, z.B. im Falle von Hämoglobin, das als Teil einer polymeren Hülle zugeführt werden könnte, die im oben beschriebenen Ultraschallbeschallungsvorgang gebildet wurde, wodurch ein Blutersatz zur Verfügung gestellt wird, der eine hohe Sauerstoffbindungskapazität hat.
Variationen der polymeren Hülle sind ebenfalls möglich. Zum Beispiel könnte eine kleine Menge von PEG, das Sulfhydrylgruppen enthält, in dem Polymer eingeschlossen werden. Das PEG wird, wenn es der Ultraschallbeschallung ausgesetzt wird, in dem Polymer vernetzt und bildet einen Bestandteil der polymeren Hülle. Wahlweise kann das PEG nach der Bereitung der Hülle an die polymere Hülle gekoppelt werden (anstatt als Teil in das Medium integriert zu werden, aus dem die Hülle hergestellt wird).
PEG ist bekannt für sein nichtadhäsives Wesen und wurde an Proteine und Enzyme angeheftet, um deren Zirkulationszeit in vivo zu erhöhen [Abuchowski et al., J. Biol. Chem. Bd. 252: 3578 (1977)]. PEG wurde ebenfalls an Phospholipide angeheftet, welche die Lipiddoppelschicht in Liposomen bilden, um ihre Aufnahme zu vermindern und die Lebensdauer in vivo zu verlängern (Klibanov et al., FEBS Letters Bd. 268:235 (1990)]. Somit verändert der Einbau des PEG in die Wände von vernetzten Proteinhüllen deren Zirkulationszeit im Blut. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um höhere Spiegel der biologischen Substanz im Blut und längere Freisetzungszeiten für die biologische Substanz zu erreichen.
Nützlich für die Modifikation der polymeren Hülle sind elektrophile PEG-Derivate, einschließlich PEG-Imidazole, Succinimidylsuccinate, Nitrophenylcarbonate, Tresylate und dergleichen; nukleophile PEG-Derivate, einschließlich PEG-Amine, Aminosäureester, Hydrazide, Thiole und dergleichen. Es wird erwartet, dass die PEG-modifizierte polymere Hülle längere Zeit im Kreislauf erhalten bleibt als ihre nicht modifizierten Gegenstücke. Die Modifikation der polymeren Hülle mit PEG kann vor der Bildung der Hülle vorgenommen werden oder nach deren Bildung. Die derzeit bevorzugte Technik ist, die polymere Hülle nach deren Bildung zu modifizieren. Andere Polymere, einschließlich Dextran, Alginate, Hydroxyethyl-Stärke und dergleichen, können bei der Modifikation der polymeren Hülle verwendet werden.
Weiterhin sind etliche Variationen möglich. Zum Beispiel kann das Dispergierungsmittel innerhalb der polymeren Hülle variiert werden, eine große Vielfalt von biologischen Substanzen kann verwendet werden, und ein weiterer Bereich an Proteinen, wie auch andere natürliche und synthetische Polymere, kann bei der Bildung der Wände der polymeren Hülle verwendet werden. Anwendungen können auch ziemlich breit variieren. Anders als biomedizinische Anwendungen, wie die Verabreichung von Arzneimitteln, Diagnosemitteln (in Bildgebungsanwendungen), künstliches Blut (sonochemisch vernetztes Hämoglobin) und parenterale Nahrungsmittel, können die polymeren Hüllenstrukturen der Erfindung in kosmetische Anwendungen eingebracht werden, wie Hautcremes oder Haarpfiegeprodukte, in Parfümanwendungen, in druckempfindlichen Tinten, Pestiziden und dergleichen.
Entsprechend einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung werden polymere Hüllen, zubereitet wie oben beschrieben, für die In-vivo-Verabreichung von biologischen Substanzen, wie pharmazeutisch wirksame Mittel, Diagnosemittel oder Mittel mit Ernährungswert, verwendet. Beispiele von pharmakologisch wirksamen Mitteln, für die praktische Verwendung der vorliegenden Erfindung vorgesehen, sind u. a. analgetische Mittel (z.B. Acetominophen, Aspirin, Ibuprofen, Morphin und deren Derivate und dergleichen), Antiasthmatika (z.B. Azelastin, Ketotifen, Traxanox und dergleichen), Antibiotika (z.B. Neomycin, Streptomycin, Chloramphenicol, Cephalosporin, Ampicillin, Penicillin, Tetracyclin und dergleichen), Antidepressiva (z.B. Nefopam, Oxypertin, Imipramin, Trazadon und dergleichen), Antidiabetika (z.B. Biguanidine, Hormone, Sulfonylurea-Derivate und dergleichen), Antimykotika (z.B. Amphotericin B, Nystatin, Candicidin und dergleichen), Blutdruck senkende Mittel (z.B. Propanolol, Propafenon, Oxyprenolol, Nifedipin, Reserpin und dergleichen), steroidale entzündungshemmende Mittel (z.B. Cortison, Hydrocortison, Dexamethason, Prednisolon, Prednison, Fluazacort und dergleichen), nichtsteroidale entzündungshemmende Mittel (z.B. Indomethacin, Ibuprofen, Ramifenizon, Piroxicam und dergleichen), antineoplastische Mittel (z.B. Adriamycin, Cyclophosphamid, Actinomycin, Bleomycin, Duanorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Mitomycin, Methotrexat, Fluorouracil, Carboplatin, Carmustin (BCNU), Cispiatin, Etoposid, Interferone, Phenesterin, Paclitaxel (wie hier angewandt, soll der Begriff "Paclitaxel" Paclitaxel-Analoga und Wirkstoffpräkursoren, Taxane und andere Paclitaxel-ähnliche Arzneimittel einschließen, z.B. Taxoter und dergleichen), Camptothecin und dessen Derivate (dessen Verbindungen vielversprechend in der Behandlung von Dickdarmkrebs sind), Vinblastin, Vincristin, wie auch hormonelle antineoplastische Mittel, wie Östrogen, Progestogene, Tamoxifen und dergleichen), anxiolytische Mittel (z.B. Dantrolen, Diazepam und dergleichen), enzymatisch wirksame Mittel (z.B. DNase, Ribozyme und dergleichen), Nukleinsäure-Konstrukte (z.B. die codierende Sequenz von IGF-1, die codierende Sequenz von Faktor VIII, die codierende Sequenz von Faktor IX, Antisense-Nukleotidsequenzen und dergleichen), immunstimulierende Mittel (d.h. Interleukine, Interferone, Vakzine und dergleichen), immunsuppressive Mittel (z.B. Cyclosporin (CsA), Azathioprin, Mizorobin, FK506, Prednison und dergleichen), wie auch andere pharmakologisch aktive Mittel, wie Cimetidin, Mitotan, Visadin, Halonitrosoharnstoffe, Anthracycline, Ellipticin, Benzocain, Barbiturate und dergleichen.
Beispiele für Diagnosemittel, die zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung gedacht sind, schließen Ultraschall-Kontrastmittel, Radiokontrastmittel (z.B. Iod-Octane, Halocarbone, Renografin und dergleichen), Magnetkontrastmittel (z.B. Fluorkohlenstoffe, lipidlösliche paramagnetische Verbindungen, GdDTPA, wässrige paramagnetische Verbindungen und dergleichen), wie auch andere Mittel ein.
Beispiele für Mittel mit Ernährungswert, die zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung gedacht sind, schließen Aminosäuren, Zucker, Proteine, Kohlenhydrate, fettlösliche Vitamine (z.B. Vitamin A, D, E, K und dergleichen) oder Fett oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ein.
Schlüsselunterschiede zwischen der biologische Substanzen enthaltenden polymeren Hülle der Erfindung und Protein-Mikrokugeln des Standes der Technik liegen in der Art der Bildung und dem Endzustand des Proteins nach der Bildung der polymeren Hülle und in seiner Fähigkeit, kaum wasserlösliche oder im Wesentlichen wasserunlösliche Mittel zu tragen. Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist das Polymer (z.B. ein Protein} selektiv chemisch vernetzt durch die Bildung von Disulfidbindungen, z.B. durch die Aminosäure Cystein, die in der natürlichen Struktur einer Anzahl von Proteinen vorkommt. Ein Ultraschallbeschallungsvorgang wird angewandt, um ein Dispergierungsmittel, das eine gelöste und suspendierte biologische Substanz enthält, in einer wässrigen Lösung eines biokompatiblen Materials, das Sulfhydryl- oder Disulfidgruppen (z.B. Albumin) trägt, zu dispergieren, wobei eine Hülle aus vernetztem Polymer um winzige Tröpfchen eines nichtwässrigen Mediums herum gebildet wird. Der Ultraschallbeschallungsvorgang ruft eine Kavitation in der Flüssigkeit hervor, die eine enorme lokale Erhitzung verursacht, und mündet in der Bildung von Peroxid-Ionen, die das Polymer durch Oxidation der Sulfhydryl-Reste vernetzen (und/oder durch Unterbrechen von bestehenden Disulfidbindungen), um neue vernetzte Disulfidbindungen zu bilden.
Im Gegensatz zum Verfahren der Erfindung ist das Verfahren der Glutaraldehyd-Vernetzung im Stand der Technik nicht spezifisch und eigentlich wirksam mit jeder beliebigen nukleophilen Gruppe, die in der Proteinstruktur vorhanden ist (z.B. Amine, Sulfhydryle und Hydroxyle). Hitze-Denaturierung, wie durch den Stand der Technik gelehrt, verändert die Proteinstruktur signifikant und irreversibel. Im Gegensatz dazu ist die Disulfid-Bildung, die mit der vorliegenden Erfindung erwogen wird, sehr spezifisch und verändert das Protein nicht wesentlich. Ferner unterscheiden sich Partikel und Tröpfchen einer biologischen Substanz, die innerhalb einer polymeren Hülle enthalten sind, von vernetzten oder durch Hitze denaturierten Protein-Mikrokugeln des Standes der Technik, weil die mit dem Verfahren der Erfindung erzeugte polymere Hülle verhältnismäßig dünn ist im Vergleich zu dem Durchmesser der überzogenen Partikel. Es wurde festgestellt (durch Transmissions-Elektronenmikroskopie), dass die "Hüllendicke" des Polymerüberzuges für ein überzogenes Partikel mit einem Durchmesser von 1 μm (1000 Nanometer) ungefähr 25 nm beträgt. Im Gegensatz dazu haben Mikrokugeln des Standes der Technik keine Proteinhüllen, sondern haben eher Protein, das durch das Volumen der Mikrokugel dispergiert ist.
Die polymere Hülle, die feste oder flüssige Kerne von biologischer Substanz enthält, erlaubt die Verabreichung hoher Dosen der biologischen Substanz in verhältnismäßig geringen Volumina. Dies minimiert die Belastung des Patienten beim Erhalten großer Mengen von Flüssigkeit und minimiert den Krankenhausaufenthalt. Zusätzlich sind die Wände der polymeren Hülle im Allgemeinen in vivo durch proteolytische Enzyme vollständig abbaubar (z.B. wenn das Polymer ein Protein ist), was in dem Fehlen von Nebenwirkungen seitens des Zufuhrsystems resultiert, wie es bei derzeitigen Formulierungen häufig der Fall ist.
Entsprechend diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind Tröpfchen oder Partikel einer biologischen Substanz innerhalb einer Hülle enthalten und haben einen Querschnittsdurchmesser von nicht mehr als ungefähr 10 μm. Ein Querschnittsdurchmesser von weniger als 5 μm ist bevorzugter, während ein Querschnittsdurchmesser von ungefähr 2 μm derzeit der bevorzugteste für den intravenösen Applikationsweg ist.
Entsprechend einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass polymere Hüllen, wie hier beschrieben, wenn sie aus Hämoglobin hergestellt sind, eine überraschend hohe Sauerstoffbindungsfähigkeit haben und daher als Blutersatz nützlich sind. Hämoglobin (Lehnfinger, in Biochemistry, Worth Publishers, Inc., New York, S. 145–149, 1975) ist ein Protein mit einem MW von 64.500, das aus einem Tetramer besteht (zwei α- und zwei β-Ketten). Jede α- und -Kette bindet einen Häm-Rest in einer nicht kovalenten Bindung. Die α- und β-Keten werden auch zusammengehalten von nichtkovalenten Bindungen, die aus Wasserstoff-Bindungen und van-der-Waals-Kräften resultieren. Die vier Häm-Gruppen, eine in jeder Untereinheit, sind fähig, vier Sauerstoff-Moleküle zu binden. Diese flachen Häm-Gruppen enthalten ein Eisenatom, das sich in einer rechtwinklig planaren Koordination befindet. Die vier Häme sind im intakten Molekül verhältnismäßig weit voneinander entfernt.
Die Wechselwirkung oder Kooperation von Häm-Einheiten beim Binden von Sauerstoff erhöht die Sauerstoffbindungskapazität jeder Häm-Einheit innerhalb des tetrameren Hämoglobin-Moleküls. Im Allgemeinen würde erwartet werden, dass eine einzelne isolierte Häm-Einheit nur ein einziges Sauerstoff-Molekül bindet. Jedoch kooperieren benachbarte Häm-Einheiten innerhalb des Hämoglobin-Moleküls, um den gebundenen Sauerstoff je Häm-Einheit zu erhöhen. Diese Kooperationsfähigkeit wird in Form eines "Hill-Koeffizienten" beschrieben, dessen Wert die Anzahl interagierender Sauerstoffbindungsstellen widerspiegelt. Im Falle von natürlichem Hämoglobin beträgt der Hill-Koeffizient ungefähr 2,8.
Lösliches Hämoglobin macht ungefähr 90 % des gesamten Proteins in roten Blutzellen aus. 100 ml des Gesamtblutes sind aufgrund der Bindungsfähigkeit von Hämoglobin fähig, annähernd 21 ml gasförmigen Sauerstoffs zu absorbieren. Ähnlich wichtig für die Bindung von Sauerstoff ist die Tatsache, dass Hämoglobin ebenso wirkungsvoll ist bei der Freigabe gebundenen Sauerstoffs an Gewebe. Die Fähigkeit von Hämoglobin, Sauerstoff zu binden und abzugeben, wird oft quantitativ als P₅₀ (oder P_1/2) ausgedrückt. Zum Beispiel ist der P₅₀-Wert für das gesamte Blut, d.h. der Partialdruck des Sauerstoffs, der in einer Hämoglobinsättigung von fünfzig Prozent mündet, ungefähr 28 mm Hg.
Das Verhältnis zwischen Sauerstoffpartialdruck und prozentualer Sättigung von Hämoglobin kann als eine S-Kurve dargestellt werden, deren Lage durch den pH-Wert beeinflusst wird (der Bohr-Effekt). Je höher der pH-Wert der Hämoglobin-Lösung bei einem gegebenen Sauerstoffpartialdruck ist, umso höher ist die prozentuale Sättigung mit Sauerstoff und umso niedriger der P₅₀; die Sauerstoff-Sättigungskurve wird zur linken Seite auf der Abszisse verschoben. Umgekehrt, je niedriger der pH-Wert der Hämaglobin-Lösung ist, umso niedriger ist die prozentuale Sättigung mit Sauerstoff und umso höher ist der P₅₀; die Sauerstoff-Sättigungskurve wird zur rechten Seite auf der Abszisse verschoben. Wenn sich Hämoglobin vom verhältnismäßig alkalischen pH-Wert der Lungen zum relativ sauren pH-Wert sauerstoffarmer Gewebe bewegt (wobei durch anaerobe Atmung Milchsäure erzeugt wird), werden die Hämoglobin-Moleküle demzufolge eine Neigung haben, ihre Sauerstoff-Ladung abzugeben. Somit ändert sich im Allgemeinen die Affinität des Hämoglobins zu Sauerstoff in der entgegensetzten Richtung wie der P₅₀ des Hämoglobins.
Modifikationen des Hämoglobin-Moleküls oder seiner Konformation können mit Änderungen der Sauerstoftbindungsaffinität verbunden sein. Zum Beispiel lockert die Assoziation mit 2,3-Diphosphoglycerat (2,3-DPG, wie es innerhalb des RBC vorkommt) die Assoziation zwischen Sauerstoff und Hämoglobin, was die Abgabe von Sauerstoff an Gewebe erleichtert; Serumspiegel von 2,3-DPG steigen unter physiologischen Bedingungen, in denen eine erhöhte Zufuhr von Sauerstoff wünschenswert ist, zum Beispiel in großen Höhen und während der Schwangerschaft. Die Oxidation des Eisen-Ions in der prosthetischen Gruppe des Häm von Fe(II) zu Fe(III) resultiert in der Bildung von Methämoglobin (met-Hb), das Wasser fest bindet, so dass es die Sauerstoffübertragung ausschließt. Diese Oxidation oder 'Autooxidation' ist ein fortwährender Vorgang in vivo, welcher mittels eines Systems aus Redoxenzymen innerhalb der roten Blutzelle in Schach gehalten wird.
Hämoglobin, das Protein für Sauerstoff-Transport und -Zufuhr, kann von den Membranen der Wand roter Blutzellen oder dem Stroma (das Stroma enthält die spezifischen Antigene, die die Blutgruppe festlegen) sowie von anderen Zell- und Plasmakomponenten getrennt werden. Falls eine solche Trennung und Isolation durchgeführt wird, enthält das stromafreie Hämoglobin keine Antigen-Materialien; somit sind Blutgruppenbestimmung und -anpassung nicht mehr notwendig.
Von stromafreiem Hämoglobin (SFH), das aus der Mikroumgebung der roten Blutzellen gewonnen wurde, wurde gefunden, dass es eine Neigung hat, Sauerstoff zu fest (ein niedriger P₅₀) zu binden und auch, dass es eine kurze Zirkulationshalbwertszeit nach der Transfusion hat. Der niedrige P₅₀, der die Linksverschiebung in der Hämoglobin-Sauerstoff-Bindungskurve widerspiegelt, war teilweise eine Folge des Aussetzens von stromafreiem Hämoglobin an einen höheren pH-Wert im Plasma (7,4) als jener, der im Erythrozyt erfahrungsgemäß vorhanden ist (7,2); ferner wurde die natürliche Assoziation zwischen Hämoglobin und 2,3-Diphosphoglycerat zerstört, als Hämoglobin aus der roten Zelle entfernt wurde, was eine weitere Reduzierung des P₅₀ zur Folge hatte. Hinsichtlich der Clearance aus der Zirkulation wird beobachtet, dass stromafreies Hämoglobin durch die Nieren schnell ausgeschieden wird, mit einer Tranfusionshalbwertszeit von (t_1/2) von lediglich ungefähr 100 Minuten. Der Hill-Koeffizient für SFH liegt im Bereich von 2,3–2,8.
Chemisch veränderte Hämoglobine, die einige der Mängel von stromafreiem Hämoglobin angehen, wurden erforscht. Im Stand der Technik beschriebene Modifikationen umfassen verschiedene Mittel zur intramolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin; Mittel zur intermolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin mit Mitteln niedrigen Molekulargewichts; Mittel zur intra- und intermolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin mit Mitteln niedrigen Molekulargewichts; und Mittel zur Kopplung stromafreien Hämoglobins an andere Polymere.
Verfahren zur intramolekularen Vernetzung von stromafreiem Hämoglobin sind im Stand der Technik bekannt; siehe zum Beispiel US-Patent Nummern 4,584,130, 4,598,064 und 4,600,531. Diese Behandlung modifiziert stromafreies Hämoglobin durch kovalentes Verbinden der Lysin-99-Reste auf den Alpha-Ketten des Proteins über eine Fumarat-Brücke. Als eine Folge dieser intramolekularen Vernetzung hat mit Diaspirin vernetztes Hämoglobin eine Sauerstoff-Affinität, die mit jener von Blut äquivalent ist. Ferner kann mit Diaspirin vernetztes Hämoglobin (Molekulargewicht 64.500) nicht mehr in Dimere zerfallen (Molekulargewicht 32.250). Infolgedessen beträgt die Retentionszeit von mit Diaspirin alpha-alpha-vernetztem Hämoglobin vier bis acht Stunden (was das Zwei- bis Vierfache der von stromafreiem Hämoglobin ist). Jedoch ist dies nicht eine ausreichend lange Zeit zur Nutzung bei der Behandlung akuter Hämorrhagie, da ein Sauerstoffträger benötigt wird, der Sauerstoff einige Tage lang tragen kann, wenn der Patient eine beträchtliche Menge Blut verloren hat. Der P₅₀ von mit Diaspirin vernetztem Hämoglobin befindet sich im physiologischen Bereich (24–28 mm Hg), ebenso wie der Hill-Koeffizient (2,5–2,8).
Unter Verwendung von Vernetzungsmitteln mit niedrigen Molekulargewichten wurden Hämoglobin-Moleküle auch intermolekular miteinander vernetzt. Zum Beispiel ist im US-Patent Nr. 4,336,248 die Kopplung von Hämoglobin-Molekülen aneinander und/oder an Serum-Proteine und Gelatine-Derivate unter Verwendung von Dialdehyden, am besten gefolgt von der Zugabe von Pyridoxalphosphat, beschrieben. Die Vernetzung mit einem bifunktionalen oder polyfunktionalen Vernetzungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht wurde in den US-Patenten 4,001,401, 4,001,200, 4,053,590 und 4,061,736 beschrieben. Die Produkte der intermolekularen Hämoglobin-Vernetzung sind oft nicht einzeln lösliche Tetramere, sondern vielfache Tetramere aus kovalent verbundenem Hämoglobin, um lösliche Oligomere zu bilden. Typischerweise haben Produkte solcher intermolekularen Vernetzung sauerstofftragende und -zuführende Eigenschaften, die nicht mit Blut äquivalent sind (ein P₅₀ von 18–23 für mit Glutaraldehyd polymerisiertem Hämoglobin, im Vergleich zu einem P₅₀ von 28 für Gesamtblut und Hill-Koeffizienten im Bereich von 1,8–2,8). Ferner sind Produkte aus intermolekularer Vernetzung durch Glutaraldehyd im Stand der Technik bekannt dafür, dass sie antigen sind [siehe D.H. Marks et al., in Military Med. 152: 473 (1987)].
Im Allgemeinen vermindert die intramolekulare und intermolekulare Vernetzung von Hämoglobin einige der renalen Toxizitätsprobleme, die sich aus der Dissoziation unmodifizierten Hämoglobins in αβ-Dimere ergeben. Jedoch wird der kolloidale osmotische Druck (COP), der von löslichem Hämoglobin ausgeübt wird, durch intramolekulare Vernetzung nicht signifikant vermindert. Dies begrenzt daher den Dosierungsspiegel von für die Applikation geeignetem löslichem Hämoglobin-Blutersatz. Im Allgemeinen bewirkt ein Anstieg des COP eine Abnahme des hydrostatischen Drucks und eine begleitende Abnahme der glomerulären Filtrationsrate, was zur Oligurie und, in schwerwiegenden Fällen, zur Anurie führt. Die im Stand der Technik beschriebene Applikation von löslichen Hämoglobinen mündete in Bradykardie, einem Ansteigen des Blutdrucks und einem Abfallen der Kreatininclearance. Vasokonstriktion und Tubulusverstopfung wurden als der Grund der renalen Wirkung vermutet, die alle mit der Verwendung von löslichen Hämoglobinen als Blutersatz im Zusammenhang stehen. Eine hoch polymerisierte Form von Hämoglobin, wie sie gemäß der Beschreibung hier hergestellt werden kann, kann diese Probleme mildern, wenn sie als Blutersatz verwendet wird.
Hoch fluorierte Verbindungen, und insbesondere Perfluorkohlenstoff-Verbindungen, wurden ebenfalls aufgrund ihrer hohen Löslichkeiten für Sauerstoff als Ersatz für rote Blutzellen in Erwägung gezogen. Unter den hoch fluorierten Verbindungen, die für solche Anwendungen nützlich sind, befinden sich die Perfluorkohlenstoffe, z.B. Perfluordecalin, Perfluorindan, Perfluormethyladamantan, Perfluortripropylamin, Perfluortributylamin, Perfluoroctylbromid und dergleichen. Zur intravenösen Verwendung müssen diese Fluorkohlenstoffe, da sie wasserunvermischbar sind, als injizierbare Emulsionen dispergiert werden. Typischerweise in diesen Anwendungen verwendete Emulgatoren sind Eigelb-Lecithin und Ei-Phosphatide, welche beide das Potential haben, allergische Reaktionen herbeizuführen. Siehe zum Beispiel PCT 92/06517, die eine Emulsion beschreibt, die eine Fluorchemikalie und Phospholipide, wie Lysophosphatidylcholin und Lyophosphatidylethanolamin als oberflächenaktive Substanzen enthält, oder PCT 93/11868, die eine Emulsion mit Eigelb-Lecithin beschreibt als einen Emulgator, der hoch fluorierte, mit Chlor substituierte, azyklische organische Verbindungen als Sauerstoffträger enthält.
Fluosol-DA (Alpha-Therapeutika), eine Emulsion aus Perfluordecalin und Perfluortripropylamin, ist das einzige von der US-Behörde FDA zugelassene Produkt zur Verwendung bei der Prävention von vorübergehender Ischämie bei der Ballon-Koronar-Angioplastie. Ein weiteres Fluorkohlenstoff-Produkt, Oxygent (Alliance Pharmaceuticals) oder Perfluoroctylbromid, hat die Zulassung als ein orales Bildgebungsmittel. Zur Übersicht über Perfluorverbindungen als Blutersatzstoffe, siehe Riess et al. in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37: 621–634 (1978).
Im Gegensatz dazu sind aus Hämoglobin hergestellte polymere Hüllen, wie hier beschrieben, "riesige" makroskopische Moleküle (aufgrund extensiver Polymerisation oder Vernetzung einer großen Anzahl von Hämoglobin-Tetramer-Molekülen), die aufgrund ihrer großen Größe in wässrigem Medium unlöslich sind. Die Polymerisation geschieht als ein Ergebnis der Vernetzung der Sulfhydrylgruppen an den Cysteinresten des Proteins während des Ultraschallbeschallungsvorganges. Eine polymere Hülle, die entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, umfasst typischerweise mindestens 10⁴ vernetzte Polymer-Moleküle und kann so viele wie 10¹² Hämoglobintetramere haben, die in einem einzigen makroskopischen Hämoglobin-"Megamer" vernetzt sind. Es wurde unerwarteterweise herausgefunden, dass Sauerstoff reversibel an diese unlöslichen Konstrukte binden kann, mit Affinitäten, die sich in einem nützlichen Bereich für einen Ersatz von roten Blutzellen (RBC) befinden, d.h. ein P₅₀ zwischen ungefähr 10 mm Hg bis ungefähr 50 mm Hg.
Aufgrund ihrer vernetzten Eigenschaft und Größe ist es wahrscheinlich, dass die unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung eine In-vivo-Zirkulationszeit haben, die beträchtlich länger ist als Ersatzstoffe für rote Blutzellen (RBC) des Standes der Technik. Ferner ist es nicht wahrscheinlich, dass sie wegen ihrer großen Molekular-(makroskopischen)-Größe die renalen Vergiftungsprobleme hervorrufen, die mit den konventionellen tetrameren oder oligomeren löslichen Formen von Hämoglobin üblich sind, die im Stand der Technik beschrieben sind.
Die verborgene zelluläre Natur der unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung macht sie geeignet, Sauerstoff auf eine physiologische Weise zu transportieren, nicht unähnlich roten Blutzellen in vivo. Wegen der "megameren" Natur der unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte dieser Erfindung werden sie einen kolloidosmotischen Druck oder onkotischen Druck haben, der vernachlässigbar ist, verglichen mit einer äquivalenten Menge (hinsichtlich der Sauerstoff-Transport-Kapazität) an löslichem Hämoglobin jedes Standes der Technik. Dies würde die intravenöse Infusion hoher Konzentrationen von Hämoglobin-Konstrukten der Erfindung erlauben, während lösliches Hämoglobin des Standes der Technik mit einer maximalen Konzentration von lediglich 6–8 g/dl infundiert werden darf, wegen der Sorge um schwerwiegenden Wasserverlust aus Geweben, die den vaskulären Raum umgeben, aufgrund der osmotischen Gradienten.
Die Zusammensetzung der Erfindung hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber verkapselten Hämoglobin-Zusammensetzungen des Standes der Technik. Liposomale Hämoglobin-Formulierungen des Standes der Technik umfassen lösliches Hämoglobin innerhalb einer äußeren Lipidschicht. In Liposomen verkapselte Hämoglobin-Zusammensetzungen des Standes der Technik leiden unter etlichen Nachteilen, die durch die vorliegende Erfindung beseitigt werden. Die Leckage löslichen Hämoglobins aus liposomalen Zusammensetzungen kann möglicherweise Nephrotoxizität verursachen. Die unlöslichen Konstrukte der vorliegenden Erfindung werden kein lösliches Hämoglobin verlieren aufgrund ihrer extensiv vernetzten Natur. Die Aggregation von Liposomen ist bekannt dafür, dass sie das Komplementprotein C3a aktiviert. Diese Aggregation ist unwahrscheinlich im Falle von unlöslichen Konstrukten wegen ihrer Größe, die beträchtlich größer ist als der liposomale Größenbereich.
Die Zusammensetzung von unlöslichem vernetztem Hämoglobin gemäß der Erfindung verhindert mit löslichen Hämoglobin-Zusammensetzungen des Standes der Technik verbundene Toxizität. Die Nephrotoxizität oder renale Toxizität von Hämoglobin hängt hauptsächlich mit der Clearance von löslichem dimerem, tetramerem oder oligomerem Hämoglobin aus dem Kreislauf zusammen. Das Hämoglobin dieser Erfindung, das extensiv vernetzt oder'megamer' ist, kann nicht von der Niere ausgeschieden werden, und es ist unwahrscheinlich, das es nephrotoxisch ist. Die unlöslichen Konstrukte dieser Erfindung können nicht von der Niere ausgeschieden werden und umgehen daher dieses Problem. Ein weiterer Vorteil der extensiv vernetzten Hämoglobin-Konstrukte dieser Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ist das erhöhte intravaskuläre Fortbestehen aufgrund der unlöslichen Form.
Die Morphologie des unlöslichen Hämoglobin-Konstruktes (IHC) wurde unter Verwendung von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestimmt. Um die mikroskopische TEM-Aufnahme eines Querschnitts eines Rinder-IHC zu erhalten, wurde das IHC mit Glutaraldehyd fixiert, mit Osmiumtetroxid und Kalium-Eisencyanat gefärbt (um Kontrast in Bereichen mit hoher Protein-Konzentration bereitzustellen), in ein Harz mit niedriger Viskosität eingebettet und Ultramikrotomschnitte hergestellt (Schnittdicke ∽75 nm). Da eine gewisse Schrumpfung im Gesamtdurchmesser und ein gewisses Verwinden der Form des IHC während dieses Vorgehens erwartet wurden, wird der wahre Durchmesser des IHC am besten durch die Partikelgrößenverteilung (3 μm; Standardabweichung 1) der Lösung dargestellt, eher als durch direkte Messungen an der mikroskopischen TEM-Aufnahme. Ein näherer Blick auf die mikroskopische TEM-Aufnahme zeigt drei unterscheidbare Regionen: eine helle Zentralregion; eine dunkle, dünne Schicht über dem Partikel; und eine lose angefügte, diffuse, fleckig-graue Region, verbunden mit der äußeren Oberfläche des Partikels. Die dunkle, dünne Schicht ist die IHC-Hülle. Sie enthält eine hohe Proteindichte und entwickelt während des Färbungsverfahrens den stärksten Kontrast. Das lose angefügte, graue Material scheint natürliches Protein zu sein, das während des Fixierungsschrittes bei der Probenpräparation an der IHC-Hülle haftet. Anfängliche Messungen von dieser und vielen anderen mikroskopischen Aufnahmen zeigen, dass die Hüllendicke des Rinder-Hämoglobin-IHC ungefähr 25–35 nm ist. Hämoglobin ist ein grobkugelförmiges Protein (L. Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman, New York, 1988) mit einem Durchmesser von 5,5 nm. Folglich ist die Proteinhülle des IHC annähernd 4 bis 20 Hämoglobin-Moleküle (Tetramere) dick. Somit würde eine Blase mit einem Durchmesser von 3,0 μm ungefähr 10⁴ bis 10¹² Hämoglobin-Moleküle enthalten.
Die Untersuchung von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten (IHC) der vorliegenden Erfindung (Mikroblasen oder Mikrokugeln) durch Zirkulardichroismus zeigte, dass der Gehalt an Alpha-Helices und Beta-Faltblättern in dem IHC sich nicht signifikant von dem des gereinigten stromafreien Hämoglobins (SFH) unterschied. Diese Beobachtung ist von Bedeutung, da sie zeigt, dass das Vernetzungsverfahren und die Bildung von unlöslichem Hämoglobin nicht eine Denaturierung (d.h. die Veränderung der Tertiär- und Quartärstruktur) des Proteins verursacht. Diese Beobachtung wird selbstverständlich erhärtet durch funktionelle Daten, die die Beibehaltung der reversiblen Sauerstoffbindung und das Zusammenwirken zwischen sauerstoffbindenden Hämeeinheiten nach dem synthetischen Schritt zeigen.
Ein Rinder- und ein menschliches Hämoglobin-IHC wurden synthetisiert, wie im Beispiel 14 beschrieben. Wie von Fachkundigen anerkannt wird, kann das verwendete Hämoglobin aus jeder Wirbeltier-, Wirbellosen- oder eukaryotischen Quelle gewonnen werden oder kann das Produkt genetischer Manipulation von Wirbeltier- Wirbellosen- oder eukaryotischen Zellen sein. Tabelle 1 gibt eine Zusammenfassung der derzeitigen Ergebnisse.
Tabelle 1 Zusammenfassung von n_max- und P₅₀-Werten von beschallten Hb-Mikroblasen und unbeschalltem BHb bei unterschiedlichen Phosphatkonzentrationen
Anmerkung: Die Hill-Koeffizienten (n) für BHb-Mikroblasen sind berechnet aus der Formel:
wobei Y die mit Sauerstoff angereicherte Fraktion ist und
Sauerstoffdruck ist.
Für die Mikroblasen wurde jeder Δlog (Y/1-Y)-Term über fünf aufeinenderfolgende Punkte Bemittelt.
Alle Bindungsversuche wurden bei 25 °C in Tris-Puffer (pH 7,4) durchgeführt. Die IHC behalten ihre Fähigkeit bei, Sauerstoff reversibel zu binden, wie durch UV-Sichtbar-Spektren des IHC dargestellt, was das Vorhandensein von Met-Fe(III)-, Oxy-Fe(II)- und Desoxy-Fe(II)-Formen anzeigt. Das IHC kann ohne nennenswerten Abbau in mehr als zehn Zyklen zwischen den Desoxy- und Oxy-Zuständen im Kreislauf geführt werden. Dies ist wichtig, weil es zeigt, dass die Umwelt, die die aktive Häm-Stelle umgibt, während des Vorgangs der Herstellung des IHC-rote-Blutzellen-Ersatzes nicht nennenswert verändert wurde.
Diese Sauerstoftbindungsdaten lassen den Schluss zu, dass das IHC im Wesentlichen nicht denaturiertes Hämoglobin umfasst. Falls es denaturiert worden wäre, würde keine physiologische (oder eine geringere) Reaktivität beobachtet werden.
Von allosterischen Effektoren von natürlichem Hämoglobin, wie Inositolhexaphosphat (IMP) und 2,3-Biphosphoglycerat (2,3-BPG) wurde gezeigt, dass sie sowohl den P₅₀ erhöhten (d.h. niedrigere Sauerstoffaffinität) als auch die Kooperativität verbesserten. Dieselben Auswirkungen sind im IHC zu sehen. Obwohl die P₅₀-Werte um denselben Betrag erhöht sind, zeigt sich ein dramatischerer Effekt in der Kooperativität des IHC. Der n_max stieg dramatisch über den von natürlichem Hämoglobin bei Vorhandensein von 1,7 mM IHP (17,6 vs. 2,8) und 2,3-BPG (14 vs. 2,8) (siehe Tabelle 1).
Diese unerwartet hohe Zunahme der Kooperativität ist offensichtlich auf die kovalente Bindung zwischen Hämoglobin-Tetrameren innerhalb der IHC-Hülle zurückzuführen. Der Hill-Koeffizient kann nicht höher sein als die Anzahl von wechselseitig wirkenden Bindungsstellen. Die Werte von ungefähr 2,8 in natürlichem Hämoglobin spiegeln die Kooperativität in einem Tetramer wider. Jedoch findet in der IHC-Hülle eine Kommunikation zwischen etlichen der vernetzten Tetramere (aus der Bildung von Disulfidbindungen) nach der Bindung des Sauerstoffs statt. Die Wechselwirkungen mit den nächsten Nachbar-Tetrameren scheinen die stärksten zu sein; jedoch können zusätzliche schwächere Wechselwirkungen zwischen weiter entfernten Tetrameren bestehen. Im Wesentlichen ist der hohe n_max ein Anzeichen dafür, dass multiple Tetramere nach dem Binden von Sauerstoff innerhalb der IHC-Hülle beim Übergang vom Desoxy-T- zum Oxy-R-Zustand zusammenarbeiten. Wiederum offenbaren mikroskopische TEM-Aufnahmen von Hämoglobin-IHC eine Hüllendicke von ungefähr sechs Hämoglobin-Tetrameren. Eine Blase mit einem Durchmesser von 3,0 μm würde ungefähr 10⁴ bis 10¹² Hämoglobin-Moleküle enthalten.
Die Stabilität nach der Lagerung des IHC wurde durch zahlreiche Partikelzählungen an verschiedenen Zeitpunkten nach der Zubereitung gezählt. Die IHC wurden in steriler Salzlösung bei 4 °C für bis zu 6 Monate gelagert. Nach 3 Monaten hatte die Konzentration des IHC um ungefähr 10 % abgenommen, während die Konzentration nach 6 Monaten um ungefähr 25 – 30 % gefallen war.
Die Auto-Oxidationsrate des IHC (von Oxy-Fe(II) zu Met-Fe(III)) wurde als höher denn 60 Stunden, 96 Stunden und 25 Tage bei 37 °C, 25 °C bzw. 4 °C bestimmt. Keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen wurden getroffen, um eine Inertatmosphäre aufrechtzuerhalten, als diese Ergebnisse gewonnen wurden. Der Stand der Technik zeigt klar den Nutzen, eine Inertatmosphäre, wie Stickstoff, aufrechtzuerhalten, um die Auto-Oxidationsrate des Hämoglobins zu reduzieren. Eine Lagerung unter solchen Bedingungen ließe erwarten, dass der Anteil des über einen längeren Zeitraum beibehaltenen Fe(II)-Hämoglobins stark ansteigen würde.
Zusätzlich kann die Auto-Oxidation durch Lagerung der IHC-Suspension mit dem oben beschriebenen Reduktionssystem von Hyashi et al. verhindert werden.
Die Pasteurisierung wurde untersucht als ein Verfahren der Sterilisation der IHC-Suspensionen im Endstadium. Zahlreiche unterschiedliche Pasteurisierungsbedingungen wurden angewandt. Partikelzählungen wurden nach jeder Bedingung angewandt, um jegliche schädlichen Auswirkungen der Temperatur auf das IHC festzustellen.

Bedingung 1: Die Temperatur der IHC-Suspension wurde in 8 Minuten von 25 – 62,8 °C rampenförmig erhöht und 30 Minuten lang bei dieser Temperatur gehalten. Partikelzählungen zeigten einen Abbau von weniger als 20 %.
Bedingung 2: Die Temperatur der IHC-Suspension wurde in 10 Minuten von 25 – 71,7 °C rampenförmig erhöht und 15 Sekunden lang bei dieser Temperatur gehalten. Partikelzählungen zeigten einen Abbau von weniger als 20 %.
Bedingung 3: Die Temperatur der IHC-Suspension wurde in 12 Minuten von 25 – 89,5 °C rampenförmig erhöht und 2 Sekunden lang bei dieser Temperatur gehalten. Partikelzählungen zeigten einen schwerwiegenden Abbau von mehr als 70 %.

Somit wurden die Bedingungen 1 und 2 als für Pasteurisierungsmethoden geeignet befunden. Gamma-Strahlung als eine Sterilisationsmodalität im letzten Stadium ist ebenfalls geeignet.
Die Sauerstoff-Affinität (oder P₅₀) des IHC kann durch chemische Modifizierung des Hämoglobins mit bekannten allosterischen Effektoren verändert werden. Im Allgemeinen begrenzt die Modifizierung des Hämoglobins den Übergang zwischen den zwei Oxy- und Desoxy-Konformationen; somit wird die Oxidationsfunktion fast immer auf irgendeine Weise verändert. Falls Hämoglobin zum Beispiel in der Oxy-Form modifiziert wird, wird üblicherweise eine hohe Sauerstoff-Affinität bevorzugt, während das umgekehrte der Fall ist, wenn die Modifizierung im Desoxy-Zustand durchgeführt wird. Derivate von Pyridoxal sind nützliche Modifikatoren, da dieses Molekül den natürlichen allosterischen Effektor 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) nachahmt. Sie binden an die endständigen Aminoguppen des Hämoglobins. Zum Beispiel kann das Hämoglobin mit Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP) zur Reaktion gebracht werden, das die natürliche Interaktion von 2,3-DPG nachahmt, um den P₅₀ zu erhöhen. Andere Pyridoxal-Derivate, wie 2-Nor-2-formyl-PLP, ein bifunktionales Mittel, das die Hämoglobin-β-Ketten koppelt, oder Bispyridoxaltetraphosphat sind nützliche Modifikatoren. Andere Vernetzer, wie Acyl-tris(natriummethylphosphate), können ebenfalls verwendet werden, um die β-Ketten zu vernetzen.
Aldehyd-Modifikatoren können ebenfalls verwendet werden. Zum Beispiel ist Glutaraldehyd nützlich bei der Polymerisation von Hämoglobin und kann in Verbindung mit PLP verwendet werden.
Diaspirinester wie 3,5-Bis(dibromsalicyl)fumarat und das entsprechende Monoaspirin sind nützliche allosterische Modifikatoren. Das Aspirin bindet zwischen den α-Ketten des Hämoglobins und dem monofunktionellen Reagens an ein inneres Lysin. Beide erhöhen den P₅₀ von Hämoglobin.
Somit können Konstrukte mit niedriger Affinität oder hoher Affinität hergestellt werden zur Applizierung in anderen Situationen als bei Traumata und akutem Blutverlust, wie in Situationen, in denen lokale Zufuhr von Sauerstoff notwendig und wohltuend ist.
Ein Konstrukt mit niedriger Affinität, d.h. eines mit einem hohen P₅₀ (>28 mm Hg), das mittels des obigen Verfahrens hergestellt wurde, bringt Nutzen bei der Verwendung von Sauerstoff als ein Adjuvans bei der Behandlung von Tumoren durch Strahlung oder Chemotherapie. Solche Konstrukte werden außerhalb des Körpers bis zur maximalen Sauerstoffkapazität beladen und dann in den Kreislauf des Tumors verabreicht. Dies erlaubt, dass eine große Menge Sauerstoff an den Tumor abgegeben wird. Aktivierter Sauerstoff, der unter Strahlung oder Chemotherapie hergestellt wird, resultiert in einer höheren zytotoxischen Aktivität im Tumorbereich.
Ein Konstrukt mit hoher Affinität (P₅₀ < 28 mm Hg) hat Nutzen bei der 'ischämischen Sauerstoffzufuhr'. Ischämie oder Sauerstoffmangel von Gewebe kann in einer Anzahl von pathologischen Bedingungen vorkommen, z.B. Schlaganfall, Myokardinfarkt und dergleichen. Die bevorzugte Freisetzung von Sauerstoff in solchen Bereichen würde helfen, dauerhafte Gewebeschäden zu minimieren. Ein Sauerstoffträger oder RBC-Ersatz mit einer Sauerstoff-Affinität ähnlich der von Gesamtblut wird Sauerstoff nicht bevorzugt in einem solchen Bereich freisetzen. Jedoch wird einer mit einer hohen Sauerstoff-Affinität (d.h. ein niedriger P₅₀, verglichen mit dem Gesamtblut) seinen Sauerstoff bevorzugt an einer solchen ischämischen Stelle freisetzen, aufgrund des hohen Sauerstoff-Gradienten zwischen dem Blut und dem Gewebe, während er den größten Teil seines Sauerstoffs unter Bedingungen von normal anzutreffenden Sauerstoff-Gradienten zurückhält. Die Affinitäten von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten der vorliegenden Erfindung können für solche Anwendungen einfach durch Änderung der Vernetzungsnatur auf einen geeigneten (P₅₀)-Wert manipuliert werden, indem ein geeignetes natürliches Hämoglobin mit der gewünschten Affinität verwendet wird, oder durch Verwendung eines gentechnisch hergestellten Hämoglobins mit geeigneter Affinität.
Die unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung können einkapseln und dadurch als wirksame Träger von pharmakologischen Mitteln, wie Sauerstoffträger (z.B. Fluorkohlenstoffe), Arzneimittel, Diagnosemittel und dergleichen wirken. Die eingekapselten Fluorkohlenstoffe (FC) sind wirkungsvolle Sauerstoffträger, die gelösten Sauerstoff in einer linearen Beziehung zum Partialdruck des Sauerstoffs transportieren und freisetzen, während die Hämoglobinhülle des IHC gebundenen Sauerstoff in einer S-förmigen Beziehung zum Sauerstoffdruck transportiert und freisetzt. Diese einzigartige Kombination von Hämoglobin und Fluorkohlenstoff innerhalb derselben Formulierung erlaubt einen maximalen Transport und eine maximale Freisetzung von Sauerstoff in vivo.
Die Fähigkeit, Hämoglobin (Hb) und Fluorkohlenstoff (FC) gleichzeitig zuzuführen, wurde im früheren Stand der Technik nicht offenbart. Eingekapselter Fluorkohlenstoff innerhalb des Kerns der Hämoglobinhülle ist fähig, als Sauerstoffspeicher zu wirken. Diese Kombination erlaubt die Zufuhr von Sauerstoff, der an den Träger in einem S-förmigen Verhältnis mit Druck (d.h. für das Hämoglobin) wie auch in einem linearen Verhältnis zum Druck (d.h. für den Fluorkohlenstoff) gebunden ist. Diese Kombination erlaubt die "Hintergrund"-Freisetzung von Sauerstoff in einer linearen Art (von Fluorkohlenstoff) hinsichtlich des Gewebe-pO₂ und der 'Bolus'-Freisetzung von Sauerstoff in einer S-förmigen Art (von Hämoglobin) hinsichtlich des Gewebe-pO₂. Dies erlaubt eine effizientere Sauerstoffzufuhr, insbesondere in Fällen, in denen große Mengen Sauerstoff in kurzen Zeiträumen zugeführt werden müssen, z.B. bei der Gewebsischämie oder Tumortherapie.
Die Hb/FC-Kombination hat den zusätzlichen Vorteil der externen Überwachung hinsichtlich der Platzierung der intravaskulär verabreichten Dosis. Da der ¹⁹F-Nukleus leicht mittels Magnet-Resonanz-Bildgebung (MRI) dargestellt werden kann, ist es möglich, die Akkumulation der verabreichten Suspension innerhalb des Gefäßsystems und des Gewebes zu verfolgen. Dies hat große Vorteile bei der Tumorbehandlung, wo Sauerstoff als ein Adjuvans zur Strahlungs- oder Chemotherapie verwendet wird, um genau die Zufuhr der Sauerstoff führenden Hämoglobin/FC-Suspension zu der gewünschten Stelle zu beobachten.
Eine Anzahl von Fluorkohlenstoffen (FCs) ist für die Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet, wie im einzelnen nachfolgend beschrieben wird.
Ferner können Proteine, die keine Sauerstoff-Bindefähigkeiten haben, die jedoch vernetzbare Cystein-Reste oder Sulfhydrylgruppen (natürliche oder künstlich eingeführte) haben, verwendet werden, biokompatible Fluorkohlenstoffe mit geeigneten Sauerstoff- Affinitäten zur Verwendung als Blutersatz einzukapseln. Als ein Beispiel kann Albumin verwendet werden, um Perffuordecalin oder Perfluortripropylamin zur Verwendung als Blutersatz einzukapseln.
Etliche Arzneimittel sind Kandidaten zur Einkapselung in Hämoglobin-Mikrokugeln der vorliegenden Erfindung. Etliche chemotherapeutische Mittel erfordern das Vorhandensein von Sauerstoff zur maximalen Tumorzytotoxizität. Die Verabreichung solcher Arzneimittel innerhalb Konstrukten eines Sauerstoffträgers, wie Hämoglobin, verbindet wirkungsvoll die wesentlichen Komponenten der Zytotoxizität in einer einzigen Verpackung. Etliche nützliche zytotoxische Arzneimittel sind öllöslich. Diese Arzneimittel können in einem Fluorkohlenstoff oder anderem biokompatiblen Öl wie Sojaöl, Safloröl, Kokosöl, Olivenöl, Baumwollsamenöl und dergleichen gelöst werden. Die Öl/Arzneimittel-Lösung wird einer Ultraschallbeschallung mit einer Hämoglobinlösung ausgesetzt, um Mikrokugeln von Öl/Arzneimittel innerhalb einer Hülle von vernetztem unlöslichem Hämoglobin herzustellen. Die Suspension kann vor der intravaskulären Verabreichung mit Sauerstoff angereichert werden. Öllösliche zytotoxische Arzneimittel enthalten Cyclophosphamid, BCNU, Melphalan, Mitomycine, Taxol und Derivate, Taxoter und Derivate, Camptothecin, Adriamycin, Etoposid, Tamoxifen, Vinblastin, Vincristin und dergleichen; nichtsteroidale Entzündungshemmer, wie Ibuprofen, Aspirin, Piroxicam, Cimetidin und dergleichen; Steroide, wie Östrogen, Prednisolon, Cortison, Hydrocortison, Diflorason und dergleichen; Arzneimittel, wie Phenesterin, Mitotan, Visadin, Halonitrosoharnstoffe, Anthrocycline, Ellipticin, Diazepam und dergleichen; immunsuppressive Mittel, wie Cyclosporin, Azathioprin, FK506 und dergleichen.
Wasserlösliche Arzneimittel können auch durch ein Verfahren der Doppel-Emulsion innerhalb der IHC-Hülle eingekapselt werden. Zunächst wird eine wässrige Arzneimittel-Lösung mit einem biokompatiblen Öl emulgiert, um eine Wasser-in-Öl(W/O-)Emulsion zu erhalten. Die W/O-Emulsion wird als eine Öl-Phase behandelt und, wie oben, einer Ultraschallbeschallung mit einer wässrigen Hämoglobin-Lösung unterzogen, um IHC herzustellen, das innerhalb ihrer Hülle eine Mikro-Emulsion des gewünschten wasserlöslichen Arzneimittels enthält. Emulgatoren, die zur Verwendung in diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, enthalten die Pluronics (Blockcopolymere aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), Phospholipide aus Eigelb gewonnen (z.B. Ei-Phosphatide, Eigelblecithin und dergleichen); Fettsäureester (z.B. Glycerolmono- und -distearat, Glycerolmono- und -dipalmitat und dergleichen}. Wasserlösliche Arzneimittel, die zur Verwendung in diesem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, enthalten antineoplastische Arzneimittel, wie Actinomycin, Bleomycin, Cyclophosphamid, Duanorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Fluorouracil, Carboplatin, Cisplatin, Interferone, Interleukine, Methotrexat, Mitomycine, Tamoxifen, Östrogene, Progestogene und dergleichen.
Das Doppel-Emulsionsverfahren ist ebenfalls zur Verabreichung von anderem wasserlöslichen Material mit therapeutischem, diagnostischem oder Ernährungswert geeignet. Zum Beispiel kann der Hämoglobingehalt des IHC durch Einkapselung einer Hämoglobin-Mikro-Emulsion in das IHC erhöht werden.
Um das IHC den roten Blutzellen ähnlicher zu machen, kann eine Phospholipid-Doppelschicht um die vernetzten Hämoglobin-Mikroblasen gebildet werden. Solch eine Doppelschicht resultiert in der Bildung eines echten "Erythrozyten-Analogons" und kann in einem zweistufigen Vorgang geschaffen werden. Beladene Phospholipide oder Lipide, die bei der Bildung dieser Doppelschicht verwendet werden, schließen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylglycerol, Sphingomyelin, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure, Sarcosinate (Sarcosinamide), Betaine, monomere und dimere Alkyde und dergleichen ein. Nichtionische Lipide können ebenfalls in dieser Erfindung verwendet werden, einschließlich Polyethylenfettsäureester, Diethanolamide, langkettige Acylhexosamide, langkettige Acylaminosäureamide, langkettige Aminosäureamine, Polyoxyethylensorbitanester, Polyoxyglycerol-mono- und -diester, Glycerol-mono- und -distearat, Glycerol-mono- und -dioleat, Glycerol-mono- und -dipalmitat und dergleichen enthalten.
Eine weitere Variation dieses Verfahrens besteht darin, photopolymerisierbare Lipide oder Lipide zu verwenden, die laicht durch eine chemische Reaktion vernetzt werden können, um einen stabileren Lipid-"Membran"-Mantel zur Verfügung zu stellen. Photopolymerisierbare Lipide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen mit Acrylat oder Methacrylat substituierte Lipide (wie Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidsäure, Dipalmitoylphosphatidsäure und dergleichen); Lipide mit natürlicher polymerisierbarer Ungesättigtheit (wie ungesättigte Phosphatidylcholine mit Diacetylengruppen oder konjugierten Diengruppen und dergleichen) usw. ein. Lipide, die leicht mittels eines Thiol-Disulfid-Austausches eine Vernetzung durchmachen können, sind ebenfalls gute Kandidaten zur Bildung eines stabilen Lipid-Mantels für das IHC. Beispiele solcher Lipide schließen Derivate von Phosphatidylcholinen ein, die mit Liponsäure und ähnlichen verestert sind.
Durch Ultraschallbeschallung synthetisierte IHC können als eine Suspension in einem biokompatiblen Medium verabreicht werden, wie oben beschrieben, wie auch andere Mittel mit Ernähungswert.
Bevorzugte Wege zur In-vivo-Verabreichung sind der intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, subkutane, intraperitoneale, orale, durch Inhalation, topische, transdermale, als Suppositorium, als Pessar und dergleichen.
Zusammenfassend haben die unlöslichen Hämoglobin-Konstrukte der vorliegenden Erfindung zahlreiche Vorteile gegenüber dem löslichen Hämoglobin des Standes der Technik, dem eingekapselten löslichen Hämoglobin des Standes der Technik sowie den Fluorkohlenstoff-Blutersatzstoffen oder Sauerstoffträgern des Standes der Technik. Diese Vorteile schließen ein:

– höhere Sauerstoff-Kapazität;
– variable Sauerstoff-Affinität;
– unlösliches 'megameres' Hämoglobin, von dem erwartet wird, länger im Kreislauf zu überdauern als tetrameres oder oligomeres lösliches Hämoglobin des Standes der Technik;
– niedrigere Möglichkeit der Nierenvergiftung aufgrund der großen Molekülgröße;
– geringere Wahrscheinlichkeit, dass Hämoglobin leckt, als im Falle von in Liposomen eingekapseltem Hämoglobin;
– infolge der viel größeren Größe als Liposomen ist die Bildung von Aggregaten, die Komplementproteine stimulieren, unwahrscheinlich;
– verhält sich mehr wie RBC aufgrund der verborgenen "Zell"-Natur, verglichen mit löslichem Hämoglobin des Standes der Technik;
– kann einen Vorrat ungebundenen Sauerstoffs neben Sauerstoff, der an Hämoglobin gebunden ist, tragen;
– kann als Fluorkohlenstoff-(FC-)Träger verwendet werden, ohne möglicherweise allergische und toxische Emulgatoren;
– vernetztes Hämoglobin in Hb/FC-Konstrukten sorgt für verbesserte Stabilität gegenüber den emulgierten Systemen des Standes der Technik, die Ei-Phosphatide und/oder andere synthetische oberflächenaktive Substanzen verwenden;
– Sauerstoff-Freisetzungsprofile aus dem Hb/FC sind eine Kombination von S-förmig und linear im Verhältnis zum Gewebe-pO₂;
– Hb/FC-Konstrukte können in vivo nachgewiesen und überwacht werden durch ¹⁹F-MRI;
– Hämoglobin- oder Hb/FC-Konstrukte können zusätzlich zum Befördern von Sauerstoff als Arzneimittel-Träger verwendet werden;
– eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann bei dem Hämoglobin-Konstrukt Anwendung finden, um es physiologischer erscheinen zu lassen;
– das Hämoglobin-Konstrukt kann mit Polymeren, wie PEG, modifiziert werden, um die intravaskuläre Verweildauer weiter zu erhöhen.

Entsprechend noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass Organofluor enthaltende Verbindungen, die im Allgemeinen wasserabweisend, mit Wasser unmischbar und folglich schwierig zu verabreichen sind, zur Erleichterung der Verabreichung in polymere Hüllen eingeschlossen werden können (wie oben beschrieben). Organofluor enthaltende Verbindungen, in polymeren Hüllen eingeschlossen, sind fertig verwendbar und biokompatibel. Die Partikelgröße von polymeren Hüllen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, haben einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 2 m, was ideal für medizinische Anwendungen ist, da intravenöse oder intraarterielle Injektionen ohne die Gefahr der Blockierung kleiner Blutgefäße und nachfolgender Gewebeschäden (z.B. verursacht durch Ischämie infolge von Sauerstoff-Verlust) ausgeführt werden können. Zum Vergleich: rote Blutzellen haben einen Durchmesser von ungefähr 8 um (somit sollte injizierbares Biomaterial kleiner als 8–10 μm im Durchmesser sein, um Blockierungen der Blutgefäße vorzubeugen).
Natürlich vorkommende Fluor-Atome (¹⁹F) geben ein deutliches magnetisches Kernresonanzsignal und können somit als Kontrastmittel oder "Sonden" bei der MRI fungieren. Die besonderen Vorteile der Verwendung von ¹⁹F schließen ein:

1) eine extrem niedrige natürliche Konzentration im Körper (Fluor kommt nicht natürlich im Körper vor),
2) eine hohe magnetische Kernresonanzempfindlichkeit,
3) ein magnetgyrisches Verhältnis nahe dem von ¹H, wodurch folglich die Durchführung der ¹⁹F-Magnet-Resonanz-Bildgebung mit nur gerinfügigen Modifizierungen von vorhandenen MRI-Anlagen ermöglicht wird, und
4) geringe Toxizität der meisten Organofluor enthaltenden Verbindungen.

Im Allgemeinen sind Fluorkohlenstoffe nicht toxisch und biokompatibel. Fluorkohlenstoffe sind stabil und reaktionsträge und neigen folglich aufgrund ihrer starken Kohlenstoff-Fluor-Bindungen (ungefähr 130 kcal/mol) nicht dazu, metabolisiert zu werden. Zum Vergleich: Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen (ungefähr 100 kcal/mol) sind schwächer und sehr viel reaktiver. Die FDA hat zwei Fluorkohlenstoffe, Perfluorotripropylamin und Perfluordecalin, für den medizinischen Gebrauch als Blutersatzstoffe unter dem Handelsnamen Fluosol DA zugelassen.
Eine Anzahl unterschiedlicher Fluorkohlenstoffe kann in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können Verbindungen, die die folgenden generischen Formeln erfüllen, in polymere Hüllen eingeschlossen werden, indem das Verfahren der Erfindung, wie hier beschrieben, angewandt wird:

(a) C_xF_2x+y-zA_z, wobei:
x = 1 – 30, vorzugsweise 5 – 15,
y = 2; oder 0 oder –2, wenn x ≥ 2; oder –4 wenn x ≥ 4,
z = jede ganze Zahl von 0 bis (2x+y-1), und
-CN,A ausgewählt ist aus N, anderen Halogenen als F, -OR, wobei R = H, Alkyl, Fluoroalkenyl, Alkynyl, Fluoroalkynyl,Fluoroalkyl, Alkenyl, Aryl, Fluoroaryl, Alkanoyl, Fluoroalkanoyl, Alkenoyl, Fluoroalkenoyl, Alkynoyl, Fluoroalkynoyl,

x, z, A und R wie oben definiert sind,
y'= +1; oder –1 oder –3, wenn x ≥ 2; oder –5 wenn x ≥ 4,
J = O, S, N, P, Al oder Si,
a = 1, 2, 3 oder 4, und
b = 2 für ein zweiwertiges J oder
3 für ein dreiwertiges J,
4 für ein vierwertiges J,
(c) A'-[(CF₂)_x-O]_c-A", wobei:
x wie oben definiert ist,
A' ausgewählt ist aus N, Halogenen, -CN, -OR, wobei R = H, Alkyl, Fluoroalkyl, Alkenyl, Fluoroalkenyl, Alkynyl, Fluoroalkynyl, Aryl, Fluoroaryl, Alkanoyl, Fluoroalkanoyl, Alkenoyl, Fluoroalkenoyl, Alkynoyl, Fluoroalkynoyl,
A" ausgewählt ist aus H oder R, wobei R wie oben definiert ist,
c = 1 – 200, vorzugsweise 2–50, oder

wobei:
x wie oben definiert ist, und
c' = 2 – 20, vorzugsweise 2–8,
wie auch Mischungen von beliebigen zwei oder mehr davon.

Innerhalb der obigen generischen Formeln sind Verbindungen enthalten, die allgemeine Formeln haben, wie:

C_xF_2x, wie zum Beispiel Perfluor-1-hexen (C₆F₁₂), Perfluor-2-hexen (C₆F₁₂), Perfluor-3-hexen (C₆F₁₂) und dergleichen,
Cyclo-C_xF_2x, wie zum Beispiel Perfluorocyclohexan (C₆F₁₂), Perfluorocyclooctan (C₈F₁₆) und dergleichen,
C_xF_2x-2,wie zum Beispiel Perfluor-1-hexyn (C₆F₁₀), Perfluor-2-hexyn (C₆F₁₀), Perfluor-3-hexyn (C₆F₁₀) und dergleichen,
Bicyclo-C_xF_2x-2, wie zum Beispiel Pertluordecalin (C₁₀F₁₈) und dergleichen,
C_xF_2x+2, wie zum Beispiel Perfluorhexan (C₆F₁₄), Perfluoroctan (C₈F₁₈), Perfluornonan (C₉F₂₀), Perfluordecan (C₁₀F₂₂), Perfluordodecan (C₁₂F₂₆) und dergleichen,
C_xF_2x-4, wie zum Beispiel Perfluor-2,4-hexadien und dergleichen,
C_xF_2x+1A, wie zum Beispiel Perfluortripropylamin ((C₃F₇)₃N], Perfluortributylamin ((C₄F₉)₃N], Perfluor-terf-tributylamin und dergleichen,
C_xF_2x-2A₂, wie zum Beispiel, C₁₀F₁₈H₂ und dergleichen,
Perfluorindan,sowie solche hoch fluorierten Verbindungen, wie Perfluormethyladamantan, Perfluoroctylbromid, Perfluordimethylcyclooctan, Perfluorcyclooctylbromid, Perfluor-Kronenether und dergleichen.

Neben linearen, solchen mit verzweigter Kette und zyklischen Fluor enthaltenden Verbindungen, wie oben angegeben, sind auch fluorierte Kronenether (wie zum Beispiel Perfluor-12-Kronen-4, Perfluor-15-Kronen-5, Perfluor-18-Kronen-6 und dergleichen) zur Verwendung in der Anwendung der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Um gute Magnetresonanz-Bilder mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zu bekommen, ist es vorteilhaft, eine große Anzahl äquivalenter Fluore zu haben. Wie hier angewandt, bezieht sich der Begriff "äquivalente Fluore" auf solche Fluor-Substituenten einer Fluor enthaltenden Verbindung, die in einer vorwiegend ähnlichen Mikro-Umgebung vorkommen (d.h. vorwiegend ähnlicher magnetischer Umgebung). Äquivalente Fluore werden ein Bildgebungssignal erzeugen. Eine große Anzahl äquivalenter Fluore werden ein starkes Signal ergeben, unvermindert durch konkurrierende Signale von "nicht-äquivalenten" Fluoren.
Wie hier angewandt, bezieht sich der Begriff "nicht-äquivalente Fluore" auf solche Fluor-Substituenten einer Fluor enthaltenden Verbindung, die in einer vorwiegend unähnlichen Mikro-Umgebung (d.h. vorwiegend unähnlicher magnetischer Umgebung) vorkommen, im Vergleich zu anderen Fluor-Substituenten derselben Fluor enthaltenden Verbindung. Somit werden, im Gegensatz zu äquivalenten Fluoren, nicht-äquivalente Fluore aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Verschiebungen multiple Signale ergeben. Somit sind solche Verbindungen nicht ideal für eine maximale Bildgebung, während Zusammensetzungen mit einer großen Zahl von nicht-äquivalenten Fluoren für eine MRI-Anwendung zufriedenstellend sind.
Von besonderem Interesse für die Anwendung zur vaskulären Bildgebung sind Fluorkohlenstoff enthaltende polymere Hüllen, die verlängerte Zirkulationszeiten haben. Derzeit angewandte Angiographie-Techniken verwenden Röntgen-Kontrastmittel und sind invasive Verfahren. Das Potential von ¹H-MRI wurde kürzlich für Angiographie-Anwendungen gezeigt [Edelman & Warach, New England J. of Medicine 328: 785–791 (1993)]. Ähnlich ist ¹⁹F-MRI mit einer Anzahl von Vorteilen für die Angiographie nützlich, wie die Fähigkeit, hohen Kontrast hinsichtlich des umgebenden Gewebes zu erzielen (das überhaupt kein natürliches Fluor enthält). Beispiele von Anwendungen solcher Methodik schließen die Diagnose und Identifikation von intrakranialen Aneurysmen, arteriovenösen Missbildungen, Okklusionen der oberen Vena cava, der unteren Vena cava, der Pfortader, der Beckenvene, der Nierenvene, der Nieren-Mesenterialarterie, der peripheren Mesenterialarterie und dergleichen ein.
Fluor enthaltende Verbindungen, die in polymeren Hüllen entsprechend der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind, können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, z.B. um Magnetresonanz-Bilder von unterschiedlichen Organen und/oder Geweben zu erhalten, um Sauerstoff-Profile in Organen und/oder Geweben zu erhalten, und ebenfalls um die lokale Temperatur zu messen. Kontrastmittel gemäß der Erfindung beschränken sich nicht auf die Verwendung in MRI-Anwendungen, sondern können ebenfalls für solche Anwendungen wie Sonographie und Radiologie verwendet werden. Das andere Isotop von Fluor, ¹⁸F, kann als ein Positronen-Emissions-Tomographie-(PET-)Kontrastmittel verwendet werden. Somit können mit einem Fluor enthaltenden Kontrastmittel sowohl PET-, als auch MRI-Diagnosen durchgeführt werden. Der Einschluss anderer bildgebender Mittel, wie Technetium- und Thallium-Verbindungen, die in Radiokontrastmitteln verwendet werden, ist auch möglich. Zwei Beispiele solcher Kontrastmittel enthalten Neurolyt und Kardiolyt.
Die Verwendung von Zusammensetzungen gemäß der Erfindung zum Sauerstoffnachweis beruht auf den dramatischen Änderungen in der NMR-Relaxationsrate von ¹⁹F bei Vorhandensein einer paramagnetischen Spezies wie Sauerstoff. Da Sauerstoff paramagnetisch ist, wird er mit dem Fluorkern in Wechselwirkung treten, indem er die Relaxationsrate von ¹⁹F von dem angeregten Zustand in den normalen Zustand erhöht. Durch Überwachen dieser Änderung der Relaxationsrate ist es möglich, die Sauerstoffkonzentration in einem umschriebenen Bereich (durch Kalibrieren des MRI-Signals zu einer bekannten Sauerstoffkonzentration) zu bestimmen.
Die Neuheit dieses Systems liegt zum Beispiel:

1) in der Anwendung des MRI zur Gewinnung von Sauerstoff-Informationen,
2) in der Anwendung des paramagnetischen Einflusses des Sauerstoffes auf das ¹⁹F-MRI-(NMR)-Signal,
3) in der Verwendung von polymeren Hüllen zur Schaffung einer konstanten und schützenden Umgebung, die auch für Sauerstoff durchlässig ist und dergleichen.

Durch die Verwendung von Fluor enthaltenden Verbindungen, die Feststoffe sind, welche einen Phasenübergang über physiologische Temperaturbereiche durchlaufen (z.B. Verbindungen mit hohem Molekulargewicht oder Kombinationen Fluor enthaltender Verbindungen), kann MRI ebenfalls zur Messung der lokalen Temperatur angewandt werden. Relaxationszeiten sind in Feststoffen sehr viel länger als in Flüssigkeiten; somit werden Relaxationszeiten dramatisch abnehmen, sobald die Übergangstemperatur (d.h. vom Feststoff zur Flüssigkeit) erreicht ist. Dramatische Veränderungen werden im NMR-Spektrum während des Phasenübergangs vom Feststoff zur Flüssigkeit beobachtet. Die Form des MRI-Signals für eine gegebene Fluor enthaltende Verbindung kann zu einer bekannten Temperatur kalibriert werden. Durch Verwendung einer Fluor enthaltenden Verbindung mit hohem Molekulargewicht in der polymeren Hülle (d.h. einer Fluor enthaltenden Verbindung, die einen Schmelzpunkt von ≥15 °C hat) oder durch Verwendung einer Kombination einer Fluor enthaltenden Verbindung mit einer nicht fluorierten Verbindung in der polymeren Hülle können die Bestandteile des Inneren der polymeren Hülle so ausgewählt werden, dass ein gewünschter Temperaturbereich für den sich ereignenden Phasenübergang (typischerweise im Bereich von ungefähr 22 – 55 °C) zur Verfügung gestellt wird. Die Fluorkohlenstoffe innerhalb der Hülle werden über den gewünschten Temperaturbereich einen Phasenübergang vom festen zum flüssigen Zustand durchlaufen, wobei die beobachteten Relaxationsraten wesentlich verändert werden, und erlauben somit die Temperaturbestimmung in vivo. Informationen zur lokalen Temperatur wären zum Beispiel besonders nützlich bei der Überwachung von Krebspatienten während der Hyperthermie-Behandlung von Krebs oder beim Nachweis von Krebszellen (Krebszellen sind kälter als normale Zellen).
Die verwendete Fluor enthaltende Zusammensetzung wird den Temperaturbereich des Phasenübergangs bestimmen. Somit kann diese Technik über einen breiten Temperaturbereich angewandt werden, indem einfach die Aufmachungsform der Fluor enthaltenden Zusammensetzung verändert wird. Zum Beispiel wird reines Perfluordodecan (C₁₂F₂₆), das in einer polymeren Hülle eingeschlossen ist, am Schmelzpunkt des Fluorkohlenstoffs (75 °C) einen Phasenübergang vom festen zum flüssigen Zustand durchlaufen. Jedoch wäre dieser Übergang scharf und lediglich eine geringe Menge an Temperaturinformationen würde gewonnen. Um bessere Informationen zu gewinnen, kann der Schmelzpunkt der Fluot enthaltenden Zusammensetzung über einen breiteren Bereich gestreut werden, zum Beispiel durch einfaches Hinzufügen eines weiteren Bestandteils zur reinen Fluor enthaltenden Zusammensetzung. Es ist in der Wissenschaft allgemein bekannt, dass eine Mischung einen niedrigeren und breiteren Schmelzpunktbereich haben wird als die entsprechenden reinen Bestandteile. Entsprechend wird zum Beispiel durch Formulieren von Perfluordodecan mit einem Fluorkohlenstoff mit niedrigerem Molekulargewicht der Schmelzpunktbereich der eingekapselten Verbindung erweitert. Ähnlich wird eine Mischung einer Fluor enthaltenden Verbindung (z.B. Perfluordodecan) mit einem Alkan (z.B. Pentan) zum Beispiel den Schmelzpunktbereich der eingeschlossenen Verbindung erweitern.
Ferner können chemisch modifizierte langkettige Fettsäuren (z.B. Heptadecanosäure [C₁₇H₃₄O₂], Nonadecanosäure [C₁₉H₃₈O₂] und dergleichen), Alkohole (z.B. Nonadecanol [C₁₉H₄₀O], Docosanol [C₂₂H₄₆O] und dergleichen), denen Fluore chemisch hinzugefügt werden können, ebenfalls in der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel wird eine Dehydrations-Kopplungsreaktion zwischen Perfluor-terf-butanol (t-C₄F₉; PCR CHEMICALS) mit einer beliebigen der oben beschriebenen reaktiven Sauerstoff enthaltenden Verbindung ein Molekül herstellen, das einen Phasenübergang vom festen zum flüssigen Zustand durchläuft, und eines, das neun äquivalente Fluore enthält. Ähnlich wird zum Beispiel eine Mischung einer fluorierten Fettsäure mit Cholesterol den Schmelzpunktbereich erweitern, verglichen mit der reinen fluorierten Fettsäure, wodurch Messungen der lokalen Temperatur ermöglicht werden.
Die Neuheit dieses Temperatur-Nachweissystems liegt zum Beispiel:

1) in der Verwendung des MRI zur Gewinnung von räumlich aufgelösten Temperaturinformationen,
2) in der Verwendung der Temperaturabhängigkeit des MRI-(NMR-)Signals,
3) in der Verwendung einer Fluorkohlenstoff enthaltenden Zusammensetzung, die einen Phasenübergang vom festen zum flüssigen Zustand in dem gewünschten Temperaturbereich durchläuft,
4) in der Verwendung der polymeren Hülle, um eine konstante und schützende Umgebung für das Medium zur Verfügung zu stellen, und
5) um Temperaturinformationen gleichzeitig mit morphologischen Informationen zu gewinnen.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung sind Partikel der Fluor enthaltenden Zusammensetzung innerhalb einer Hülle enthalten, die einen Querschnitts-Durchmesser von nicht größer als ungefähr 10 μm hat (wie hierin angewandt, bezieht sich der Begriff "Mikrometer, μm" auf eine Maßeinheit von einem Tausendstel Millimeter). Ein Querschnitts-Durchmesser von weniger als 5 μm wird noch mehr bevorzugt, während ein Querschnitts-Durchmesser von weniger als 1 μm derzeit der bevorzugteste für den intravenösen Applikationsweg ist.
Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung können auf verschiedene Arten in den Körperraum eingeführt werden, abhängig von den Erfordernissen der Bildgebung. Zum Beispiel können wässrige flüssige Suspensionen durch orale Einnahme oder als Suppositorium in den Gastrointestinaltrakt eingeführt werden (z.B. zur Gewinnung von Bildern des Magens und Gastrointestinaltraktes), mit einer Spritze in nicht-vaskuläre Räume, wie den zerebrospinalen Raum, eingeführt werden, oder in das vaskuläre System allgemein oder in die Gefäße eines bestimmten Organs, wie die Coronar-Arterie, injiziert werden. Ferner können Kontrastmittel der Erfindung ebenfalls in andere Körperräume injiziert werden, wie vordere oder hintere Augenräume, das Ohr, die Harnblase (z.B. durch die Harnröhre), die Peritonealhöhlen, den Harnleiter, die Harnröhre, das Nierenbecken, Gelenkräume des Knochens, Lymphgefäße, die Subarachnoidalräume, die ventrikulären Räume und dergleichen.
Die polymere Hülle, die feste oder flüssige Kerne an Fluor enthaltenden Zusammensetzungen enthält, erlaubt die gerichtete Zufuhr hoher Dosen des Mittels aus Fluor enthaltenden Zusammensetzungen in verhältnismäßig kleinen Volumina. Dies minimiert die Beschwerden des Patienten beim Empfang großer Flüssigkeitsmengen.
Entsprechend einem anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Ansatz für das Problem der Verabreichung von im Wesentlichen wasserunlöslichen Arzneimitteln, wie Taxol, bereitgestellt, der in der Literatur nicht beschrieben ist. So wurde entdeckt, dass die Zufuhr solcher Arzneimittel als eine wässrige Suspension von Partikeln in Makrometergröße durchgeführt werden kann oder als eine wässrige Suspension, die entweder Partikel eines solchen Arzneimittels enthält oder des Arzneimittels, das in einer biokompatiblen nichtwässrigen Flüssigkeit gelöst ist. Dieser Ansatz würde die Zufuhr solcher Arzneimittel in verhältnismäßig hohen Konzentrationen erleichtern und dadurch die Anwendung von Emulgatoren mit ihren begleitenden toxischen Nebenwirkungen erübrigen.
Entsprechend noch einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird die oben beschriebene Darreichungsform erleichtert durch neue arzneimittelhaltige Zusammensetzungen, wobei im Wesentlichen das wasserunlösliche Arzneimittel, wie Paclitaxel, in einer biokompatiblen Flüssigkeit suspendiert ist, und worin die resultierende Suspension Partikel eines solchen Arzneimittels (z.B. Paclitaxel) mit einer Querschnittsabmessung von nicht größer als ungefähr 10 μm enthält. Die angestrebte Partikelgröße von weniger als ungefähr 10 μm kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z.B. durch Mahlen, Sprühtrocknen, Ausfällung, Ultraschallbeschallung und dergleichen.
Aufgrund der Kristallgröße der konventionell hergestellten, im Wesentlichen wasserunlöslichen Arzneimittel, wie Paclitaxel, das größer als 20 μm ist, wurden feste Partikel solcher Arzneimittel (z.B. Paclitaxel) nicht in Form einer Suspension in einem Vehikel wie normale Salzlösung hergestellt. Die vorliegende Erfindung offenbart jedoch die Zufuhr einer Partikelsuspension von im Wesentlichen wasserunlöslichen Arzneimitteln (wie Paclitaxel, gemahlen zu einer Größe von weniger als ungefähr 10 μm, vorzugsweise weniger als ungefähr 5 μm und am bevorzugtesten weniger als ungefähr 1 μm, was die intravenöse Verabreichung in Form einer Suspension ohne das Risiko von Verstopfung in der Mikrozirkulation von Organen und Geweben erlaubt.
Aufgrund der mikropartikulären Natur des zugeführten Arzneimittels wird der größte Teil davon durch Organe mit retikuloendothelialen Systemen, wie die Milz, Leber und Lungen, aus dem Kreislauf entfernt. Dies erlaubt pharmakologisch wirksame Mittel in partikulärer Form, um auf solche Bereiche im Körper gerichtet zu werden.
Die biokompatiblen Flüssigkeiten, vorgesehen zur Anwendung in diesem Ausführungsbeispiel, sind die gleichen wie die oben beschriebenen. Zusätzlich können parenterale Nahrungsmittel, wie Intralipid (Handelsname für eine im Handel erhältliche Fett-Emulsion, angewendet als ein parenterales Nahrungsmittel; erhältlich von Kabi Vitrum, Inc., Clayton, North Carolina), Nutralipid (Handelsname für eine im Handel erhältliche Fett-Emulsion, angewendet als ein parenterales Nahrungsmittel; erhältlich von McGaw, Irvine, Kalifornien), Liposyn III (Handelsname für eine im Handel erhältliche Fett-Emulsion, angewendet als ein parenterales Nahrungsmittel (enthält 20 % Sojaöl, 1,2 % Ei-Phosphatide und 2,5 % Glycerin); erhältlich von Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois) und dergleichen als Träger von Arzneimittelpartikeln verwendet werden. Alternativ kann, falls die biokompatible Flüssigkeit ein Arzneimittel lösendes Material enthält, wie Sojaöl (z.B. wie im Fall von Intralipid), das Arzneimittel teilweise oder vollständig innerhalb der Trägerflüssigkeit gelöst werden, was seine Verabreichung unterstützt. Ein Beispiel für solch einen Fall ist die Verabreichung von Taxol in Intralipid als Träger. Derzeit bevorzugte biokompatible Flüssigkeiten zur Anwendung in diesem Ausführungsbeispiel sind parenterale Nahrungsmittel, wie jene oben beschriebenen.
Entsprechend noch einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird für die In-vivo-Verabreichung von Paclitaxel eine Zusammensetzung bereitgestellt, worin Paclitaxel in einem parenteralen Nahrungsmittel gelöst ist.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele detaillierter beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung der Öl enthaltenden Proteinhülle
Drei Milliliter einer 5%igen USP-(United States Pharmacopoeia)-Humanserumalbumin-Lösung (Alpha Therapeutic Corporation) wurden in ein zylindrisches Gefäß gegeben, das an eine Beschallungssonde (Heat Systems, Modell XL2020) angeschlossen werden konnte. Die Albuminlösung wurde mit 6,5 ml Sojabohnenöl mit USP-Qualität (Sojaöl) überschichtet. Die Spitze der Beschallungssonde wurde an die Grenzfläche zwischen den beiden Lösungen angelegt, und die Anordnung wurde auf 20 °C in einem Kühlungsbad gehalten. Dem System wurde ermöglicht zu äquilibrieren, und das Beschallungsgerät wurde für 30 Sekunden eingeschaltet. Es fand ein kräftiges Mischen statt, und eine weiße, milchige Suspension wurde gewonnen. Die Suspension wurde im Verhältnis 1:5 mit normaler Salzlösung verdünnt. Ein Partikelzählgerät (Particle Data Systems, Elzone, Modell 280 PC) wurde verwendet, um die Größenverteilung und Konzentration von Öl enthaltenden Proteinhüllen zu bestimmen. Die resultierenden Proteinhüllen wurden auf eine maximale Querschnittsabmessung von ungefähr 1,35 ± 0,73 μm bestimmt, und die Gesamtkonzentration wurde bestimmt auf ∼10⁹ Hüllen/ml in der Originalsuspension.
Zur Kontrolle: die obigen Bestandteile ohne Protein bildeten keine stabile Mikro-Emulsion, als sie der Ultraschallbeschallung unterzogen wurden. Dieses Ergebnis legt den Schluss nahe, dass das Protein zur Bildung von Mikrokugeln notwendig ist. Dies wurde mittels rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme- und Elektronenbeugungsaufnahmestudien, wie unten beschrieben, bestätigt.
Beispiel 2
Parameter, die die Bildung der polymeren Hülle beeinflussen
Etliche Variable, wie Protein-Konzentration, Temperatur, Beschallungszeit, Konzentration des pharmakologisch wirksamen Mittels und akustische Intensität wurden getestet, um die Bildung der polymeren Hülle zu optimieren. Diese Parameter wurden für vernetzte Rinderserumalbuminhüllen bestimmt, die Toluol enthielten.
Polymere Hüllen, die aus Lösungen hergestellt wurden, die Proteinkonzentrationen von 1 %, 2,5 %, 5 % und 10 % enthielten, wurden mit einem Partikelzählgerät gezählt, um eine Veränderung in der Größe und Anzahl der hergestellten polymeren Hüllen zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die Größe der polymeren Hüllen nicht stark in Abhängigkeit zur Proteinkonzentration schwankte, jedoch nahm die Anzahl der polymeren Hüllen je Milliliter der gebildeten "milchigen Suspension" mit der Zunahme der Proteinkonzentration auf bis 5 % zu. Oberhalb dieser Konzentration wurde keine signifikante Änderung der Anzahl der polymeren Hüllen beobachtet.
Es wurde festgestellt, dass die Anfangstemperaturen der Gefäße wichtig für die optimale Herstellung von polymeren Hüllen war. Typischerweise wurden die Eingangsgefäßtemperaturen zwischen 0 °C und 45 °C gehalten. Die Wasser-Öl-Grenzflächenspannung der für die Bildung der polymeren Hülle verwendeten Öle war ein wichtiger Parameter, der ebenfalls als eine Funktion der Temperatur schwankte. Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des pharmakologisch wirksamen Mittels den Ertrag an Proteinhüllen nicht entscheidend beeinflusst. Es ist verhältnismäßig unwichtig, ob das pharmakologisch wirksame Mittel im gelösten Zustand oder im Dispergierungsmittel suspendiert eingebaut wird.
Die Beschallungszeit war ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Anzahl an hergestellten polymeren Hüllen je Milliliter. Es wurde festgestellt, dass eine längere Beschallungszeit als drei Minuten eine Abnahme der Gesamtzahl der polymeren Hüllen bewirkte, was eine mögliche Zerstörung von polymeren Hüllen wegen übermäßiger Beschallung anzeigt. Es wurde festgestellt, dass Beschallungszeiten von weniger als drei Minuten angemessene Mengen an polymeren Hüllen herstellen.
Entsprechend dem Nomogramm, das vom Hersteller des Beschallungsgerätes zur Verfügung gestellt wurde, ist die Nennschallleistung des hier verwendeten Beschallungsgerätes ungefähr 150 Watt/cm². Drei Leistungseinstellungen in der Reihenfolge steigender Leistung wurden angewandt, und es wurde festgestellt, dass die größte Anzahl an polymeren Hüllen bei der höchsten Leistungseinstellung hergestellt wurde.
Beispiel 3
Herstellung von polymeren Hüllen. die gelöstes Taxol enthalten
Taxol wurde in Sojaöl mit USP-Qualität auf eine Konzentration von 2 mg/ml gelöst. 3 ml einer 5%igen USP-Humanserumalbuminlösung wurden in ein zylindrisches Gefäß gegeben, das an eine Beschallungssonde angeschlossen werden konnte. Die Albuminlösung wurde mit 6,5 ml der Sojaöl/Taxollösung überschichtet. Die Spitze der Sonde des Beschallungsgerätes wurde an die Grenzfläche zwischen den zwei Lösungen angelegt, und die Anordnung wurde im Äquilibrium gehalten und das Beschallungsgerät für 30 Sekunden eingeschaltet. Starkes Mischen fand statt, und eine stabile, weiße, milchige Suspension wurde erhalten, die polymere Hüllen mit Proteinwänden enthielt, die die Öl/Taxol-Lösung einschlossen.
Um eine höhere Beladung mit Arzneimittel in die vernetzte Proteinhülle zu erhalten, kann ein wechselseitiges Lösungsmittel für das Öl und das Arzneimittel (in dem das Arzneimittel eine beträchtlich höhere Löslichkeit hat) mit dem Öl gemischt werden. Vorausgesetzt, dass dieses Lösungsmittel verhältnismäßig ungiftig ist (z.B. Ethylacetat), kann es gemeinsam mit dem ursprünglichen Träger injiziert werden. Andernfalls kann es durch Verdampfen der Flüssigkeit unter Vakuum im Anschluss an die Herstellung der polymeren Hüllen entfernt werden.
Beispiel 4
Stabilität der polymeren Hüllen
Suspensionen von polymeren Hüllen mit einer bekannten Konzentration wurden bei drei verschiedenen Temperaturen (d.h. 4 °C, 25 °C und 38 °C) auf Stabilität untersucht. Die Stabilität wurde durch Änderung der Partikelzählungen über die Zeit gemessen. Vernetzte Protein-(Albumin-)Hüllen, die Sojabohnenöl (SBO) enthalten, wurden wie oben beschrieben hergestellt (siehe Beispiel 1), in Salzlösung auf eine Ölendkonzentration von 20 % verdünnt und bei den obigen Temperaturen gelagert. Partikelzählungen (Elzone), die für jede der Proben als eine Funktion der Zeit gewonnen wurden, sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2
Wie durch die obigen Daten gezeigt, bleibt die Konzentration der gezählten Partikel (d.h. polymeren Hüllen) über die Dauer des Experiments ziemlich konstant. Der Bereich ist ziemlich konstant und verbleibt zwischen ungefähr 7-9·10¹⁰/ml, was eine gute Stabilität der polymeren Hüllen unter einer Vielfalt von Temperaturbedingungen über beinahe vier Wochen anzeigt.
Beispiel 5
In-vivo-Bioverteilung – Vernetzte Proteinhüllen, die ein Fluorophor enthalten
Um die Aufnahme und Bioverteilung einer Flüssigkeit, die in Protein-Polymerhüllen eingeschlossen ist, nach der intravenösen Injektion zu bestimmen, wurde ein Fluoreszenzfarbstoff (Rubren, erhäftlich bei Aldrich) innerhalb einer Humanserumalbumin-(HSA)-Protein-Polymerhülle eingeschlossen und als Marker verwendet. Somit wurde Rubren in Toluol gelöst, und vernetzte Albuminhüllen, die Toluol/Rubren enthielten, wurden wie oben beschrieben durch Ultraschallbeschallung hergestellt. Die entstandene milchige Suspension wurde fünfmal in normaler Salzlösung verdünnt. Zwei Milliliter der verdünnten Suspension wurden dann während einer Zeitspanne von 10 Minuten in die Schwanzvene einer Ratte injiziert. Ein Tier wurde eine Stunde nach der Injektion und ein anderes 24 Stunden nach der Injektion geopfert.
100 μm gefrorene Abschnitte von Lunge, Leber, Niere, Milz und Knochenmark wurden unter einem Fluoresenzmikroskop auf das Vorhandensein von in der Polymerhülle eingeschlossenem Fluoreszenzfarbstoff oder freigesetztem Farbstoff untersucht. Nach einer Stunde schien die Mehrzahl der polymeren Hüllen intakt zu sein (d.h. erschienen als hell fluoreszierende Partikel von ungefähr 1 um Durchmesser) und befand sich in den Lungen und der Leber. Nach 24 Stunden wurde der Farbstoff in Leber, Lungen, Milz und Knochenmark beobachtet. Eine allgemeine Färbung des Gewebes wurde ebenfalls beobachtet, was anzeigte, dass die Hüllenwand der Polymerhüllen verdaut worden war und der Farbstoff aus dem Inneren freigesetzt worden war. Dieses Ergebnis entsprach den Erwartungen und zeigt die mögliche Verwendung der Verbindungen der Erfindung für eine verzögerte oder kontrollierte Freisetzung eines eingeschlossen pharmazeutischen Mittels, wie Taxol.
Beispiel 6
Toxizität von polymeren Hüllen, die Sojabohnenöl (SBO) enthalten
Polymere Hüllen, die Sojaöl enthalten, wurden zubereitet wie in Beispiel 1 beschrieben. Die entstandene Suspension wurde in normaler Salzlösung verdünnt, um zwei unterschiedliche Lösungen herzustellen, eine mit 20 % SBO und die andere mit 30 % SBO.
Intralipid, ein im Handel erhältliches TPN-Mittel, enthält 20 % SBO. Die LD₅₀ von Intralipid in Mäusen beträgt 120 ml/kg oder ungefähr 4 ml für eine Maus mit 30 g, wenn sie mit 1 cm³/mm injiziert wird.
Zwei Gruppen von Mäusen (drei Mäuse in jeder Gruppe; jede Maus mit einem Gewicht von ungefähr 30 g) wurden mit der SBO enthaltenden Zusammensetzung der Erfindung wie folgt behandelt. Jeder Maus wurden 4 ml der vorbereiteten Suspension SBO enthaltender polymerer Hüllen injiziert. Jedes Mitglied der einen Gruppe erhielt die 20 % SBO enthaltende Suspension, während jedes Mitglied der anderen Gruppe die 30 % SBO enthaltende Suspension erhielt.
Alle drei Mäuse in der Gruppe, die die 20 % SBO enthaltende Suspension erhielt, überlebten eine solche Behandlung und zeigten bei Beobachtung eine Woche nach der SBO- Behandlung keine starke Toxizität in irgendeinem Gewebe oder Organ. Lediglich eine der drei Mäuse der Gruppe, die die 30 % SBO enthaltende Suspension erhielt, starb nach der Injektion. Diese Ergebnisse belegen klar, dass Öl, das in polymeren Hüllen entsprechend der vorliegenden Erfindung enthalten ist, nicht toxisch ist bei seiner LD₅₀-Dosis, verglichen mit einer im Handel erhältlichen SBO-Zubereitung (Intralipid). Diese Wirkung kann der langsamen Freisetzung (d.h. kontrollierte Rate bei der Bioverfügbarwerdung) des Öls aus dem Inneren der polymeren Hülle zugerechnet werden. Solch eine langsame Freisetzung verhindert das Erreichen einer tödlichen Dosis Öl, im Gegensatz zu den hohen Öl-Dosierungen, die mit handelsüblichen Emulsionen erzielt werden.
Beispiel 7
In-vivo-Bioverfügbarkeit von Sojaöl, das aus polymeren Hüllen freigesetzt wurde
Ein Versuch wurde durchgeführt, um die langsame oder verzögerte Freisetzung von in einer polymeren Hülle eingeschlossenem Material nach der Injektion einer Suspension von polymeren Hüllen in den Blutkreislauf von Ratten zu bestimmen. Vernetzte Protein(Albumin)-ummantelte polymere Hüllen, die Sojabohnenöl (SBO) enthielten, wurden durch Beschallung, wie oben beschrieben, zubereitet. Die sich ergebende Suspension aus Öl enthaltenden polymeren Hüllen wurde in Salzlösung auf eine Endsuspension verdünnt, die 20 % Öl enthielt. Fünf Milliliter dieser Suspension wurden über einen Zeitraum von 10 Minuten in die kanülierte äußere Drosselvene von Ratten injiziert. Diesen Ratten wurde zu etlichen Zeitpunkten im Anschluss an die Injektion Blut entnommen und der Spiegel von Triglyceriden (Sojaöl ist überwiegend Triglycerid) im Blut durch Routine-Analysen bestimmt.
Fünf Milliliter einer im Handel erhältlichen Fett-Emulsion (Intralipid, ein wässriges parenterales Nahrungsmittel, das 20 % Sojaöl, 1,2 % Eigelb-Phospholipide und 2,25 % Glycerin enthält) wurden als Kontrolle verwendet. Die Kontrolle verwendet Ei-Phosphatid als Emulgator zur Stabilisierung der Emulsion. Ein Vergleich von Serumspiegeln der Triglyceride in den zwei Fällen würde einen direkten Vergleich der Bioverfügbarkeit des Öls als eine Funktion der Zeit geben. Zusätzlich zur Suspension von 20 % Öl enthaltenden Polymerhüllen wurden 5 ml einer Probe von Öl enthaltenden polymeren Hüllen in Salzlösung mit einer Endkonzentration von 30 % Öl injiziert. In jeder der drei Gruppen wurden zwei Ratten verwendet. Die Blutspiegel an Triglyceriden jedes Falles sind in Tabelle 3 aufgezeigt, angegeben in Einheiten von mg/dl.
Tabelle 3
Blutspiegel vor Injektion werden in der mit "Vorher" bezeichneten Spalte angegeben. Es ist deutlich, dass sehr hohe Triglycerid-Spiegel im Anschluss an die Injektion bei der Intralipid-Kontrolle zu sehen sind. Es ist dann ersichtlich, dass die Triglycerid-Spiegel ungefähr 24 Stunden benötigen, um bis auf den Spiegel vor der Injektion abzufallen. Somit ist ersichtlich, dass das Öl unverzüglich im Anschluss an die Injektion für den Stoffwechsel zur Verfügung steht.
Die Suspension von Öl enthaltenden polymeren Hüllen, die die gleiche Menge an Gesamtöl wie Intralipid (20 %) enthält, zeigt eine dramatisch andere Verfügbarkeit von nachweisbarem Triglycerid im Serum. Der Spiegel steigt auf ungefähr das Zweifache seines Normalwertes an und wird bei diesem Spiegel für viele Stunden gehalten, was eine langsame oder verzögerte Freisetzung von Triglycerid in das Blut bei recht nahe an die Norm reichenden Spiegeln zeigt. Die Gruppe, die Öl enthaltende Polymerhüllen mit 30 % Öl erhielt, zeigt einen höheren Triglycerid-Spiegel (einhergehend mit der höheren verabreichten Dosis), der innerhalb von 48 Stunden auf den Normalstand fällt. Wiederum steigen die Blutspiegel an Triglycerid in dieser Gruppe nicht astronomisch, verglichen mit der Kontrollgruppe, die Intralipid erhielt. Dies wiederum zeigt die langsame und anhaltende Verfügbarkeit des Öls der Zusammensetzung gemäß der Erfindung, was die Vorteile hat, gefährlich hohe Blutspiegel von Material, das in den polymeren Hüllen enthalten ist, zu vermeiden, sowie die Verfügbarkeit über einen ausgedehnten Zeitraum bei annehmbaren Spiegeln. Klar ist, dass in polymeren Hüllen der vorliegenden Erfindung zugeführte Arzneimittel diese gleichen Vorteile erreichen würden.
Solch ein System von Sojaöl enthaltenden polymeren Hüllen könnte in einer wässrigen Lösung aus Aminosäuren, essentiellen Elektrolyten, Vitaminen und Zuckern suspendiert werden, um ein Mittel für die total parenterale Ernährung (TPN) zu bilden. Solch eine TPN kann aus derzeit verfügbaren Fett-Emulsionen (z.B. Intralipid) wegen der Instabilität der Emulsion bei Vorhandensein von Elektrolyten nicht formuliert werden.
Beispiel 8
Zubereitung vernetzter proteinummantelter Polvmerhüllen, die einen festen Kern eines pharmazeutisch wirksamen Mittels enthalten
Ein weiteres Verfahren zur Verabreichung eines kaum wasserlöslichen Arzneimittels wie Taxol innerhalb einer polymeren Hülle ist die Herstellung einer Hülle aus polymerem Material um einen festen Arzneimittelkern. Solch ein "proteinummanteltes" Arzneimittel-Partikel kann wie folgt gewonnen werden. Das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren wird unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wiederholt, um Taxol in einer verhältnismäßig hohen Konzentration zu lösen. Üblicherweise verwendete Lösungsmittel sind organische Verbindungen, wie Benzol, Toluol, Hexan, Ethylether und dergleichen. Polymere Hüllen werden wie in Beispiel 3 hergestellt. Fünf Milliliter der milchigen Polymerhüllen-Suspension, die gelöstes Taxol enthalten, werden auf 10 ml in normaler Salzlösung verdünnt. Diese Suspension wird in einen Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur gegeben, und die flüchtige organische Verbindung wird durch Vakuum entfernt. Nach ungefähr 2 Stunden im Rotationsverdampfer werden diese Polymerhüllen unter einem Mikroskop geprüft, um undurchsichtige Kerne zu zeigen, was die Entfernung von im Wesentlichen dem gesamten organischen Lösungsmittel und das Vorhandensein festen Taxols innerhalb einer Proteinhülle anzeigt.
Alternativ werden die Polymerhüllen mit Kernen aus organisches Lösungsmittel enthaltendem gelöstem Arzneimittel gefriergetrocknet, um ein trockenes, krümeliges Pulver zu erhalten, das in Salzlösung (oder anderer geeigneter Flüssigkeit) zum Zeitpunkt des Gebrauchs resuspendiert werden kann. Im Falle anderer Arzneimittel, die bei Raumtemperatur nicht im festen Zustand sein könnten, wird eine Polymerhülle mit einem flüssigen Kern gewonnen. Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung einer vernetzten proteinummantelten Hülle, die ein unverdünntes Arzneimittel enthält. Die Analyse der Partikelgröße zeigt, dass diese polymeren Hüllen kleiner sind als jene, die Öl enthalten. Obwohl das derzeit bevorzugte Protein für die Verwendung in der Herstellung der polymeren Hülle Albumin ist, können andere Proteine, wie α-2-Makroglobulin, ein bekanntes Opsonin, verwendet werden, um die Aufnahme der polymeren Hüllen durch makrophagenähnliche Zellen zu verbessern. Alternativ dazu könnte ein PEG-Sulfhydryl (unten beschrieben) während der Bildung der polymeren Hülle hinzugefügt werden, um eine polymere Hülle mit erhöhter Zirkulationszeit in vivo herzustellen.
Beispiel 9
In-vivo-Zirkulation und Freisetzungskinetik der Polymerhüllen
Polymerhüllen mit festem Kern, die Taxol enthalten, wurden wie oben beschrieben bereitet (siehe z.B. Beispiel 3) und in normaler Salzlösung suspendiert. Die Taxol-Konzentration in der Suspension wurde wie folgt mittels HPLC gemessen. Zunächst wurde das Taxol in der Polymerhülle durch Zugabe von 0,1 M Mercaptoethanol freigesetzt (was den Austausch von Protein-Disulfid-Vernetzungen sowie das Zusammenbrechen der Vernetzung der Polymerhülle zur Folge hatte), dann wurde das freigesetzte Taxol mit Acetonitril aus der Suspension extrahiert. Die sich ergebende Mischung wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in Methanol gelöst und auf eine HPLC-Säule injiziert, um die Konzentration von Taxol in der Suspension zu bestimmen. Die Taxol-Konzentration wurde als ungefähr 1,6 mg/ml festgestellt.
Ratten wurden durch einen Jugulärkatheter 2 ml dieser Suspension injiziert. Das Tier wurde nach zwei Stunden geopfert und die Menge an in der Leber vorhandenem Taxol durch ein HPLC bestimmt. Dies erforderte die Homogenisation der Leber, gefolgt von der Extraktion mit Acetonitril und Lyophilisierung des Überstandes im Anschluss an die Zentrifugierung. Das Lyophilisat wurde in Methanol gelöst und auf eine HPLC-Säule injiziert. Ungefähr 15 % der verabreichten Taxol-Dosis wurden nach zwei Stunden von der Leber wiedergewonnen, was eine signifikante Dosierung an die Leber zeigt. Dieses Ergebnis stimmt mit der bekannten Funktion des retikuloendothelialen Systems der Leber hinsichtlich der Entfernung kleiner Partikel aus dem Blut überein.
Beispiel 10
Herstellung von vernetzten PEG-ummantelten polymeren Hüllen
Als eine Alternative zur Verwendung von Thiol (Sulfhydryl) enthaltenden Proteinen bei der Bildung von oder als Additiv zu polymeren Hüllen der Erfindung wurde ein Thiol enthaltendes PEG hergestellt. PEG ist bekannt als nicht toxisch, nichtentflammbar, nichthaftend an Zellen und im Allgemeinen biologisch inert. Es wurde an Proteine gebunden, um deren Antigenität zu reduzieren, und an Liposome bildende Lipide, um deren Zirkulationszeit in vivo zu erhöhen. Somit würde erwartet, dass der Einbau von PEG in eine vorwiegend aus Proteinen bestehende Hülle sowohl die Zirkulationszeit als auch die Stabilität der polymeren Hülle erhöht. Durch Variieren der Konzentration von PEG-Thiol, das der 5%igen Albuminlösung hinzugefügt wurde, war es möglich, polymere Hüllen mit variierenden Stabilitäten in vivo zu gewinnen. PEG-Thiol wurde durch Arbeitsverfahren hergestellt, die in der Literatur zugänglich sind (wie das Verfahren von Harris und Herati, wie beschrieben in Polymer Preprints vol. 32: 154–155 (1991)).
PEG-Thiol mit einem Molekulargewicht von 2000 g/mol wurde auf eine Konzentration von 1 % (0,1 g wurden 10 ml hinzugefügt) in einer 5%igen Albuminlösung gelöst. Diese Protein/PEG-Lösung wurde mit Öl überschichtet, wie in Beispiel 1 beschrieben, und beschallt, um Öl enthaltende polymere Hüllen mit Wänden, die vernetztes Protein und PEG enthalten, herzustellen. Diese polymeren Hüllen wurden auf Stabilität geprüft, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Andere synthetische wasserlösliche Polymere, die mit Thiol-Gruppen modifiziert werden können und anstelle von PEG verwendet werden könnten, schließen zum Beispiel Polyvinylalkohol, Polyhydroxyethylmethacrylat, Polyacrylsäure, Polyethyloxazolin, Polyacrylamid, Polyvinylpyrrolidinon, Polysaccharide (wie Chitosan, Alginate, Hyaluronsäure, Dextrane, Stärke, Pektin und dergleichen) und dergleichen ein.
Zum Beispiel wurden Fluorkohlenstoff enthaltende Proteinhüllen, die verlängerte Zirkulationszeiten in vivo haben, als besonders vorteilhaft zur Bildgebung des Gefäßsystems erkannt. Diese Hüllen verblieben für verlängerte Zeiträume innerhalb der Zirkulation, im Verhältnis zu Hüllen, die kein PEG in den Hüllenwänden enthielten. Dies erlaubte zum Beispiel die Sichtbarmachung der kardialen Zirkulation und stellte ein nicht invasives Mittel zur Beurteilung der Coronar-Zirkulation zur Verfügung, anstatt konventionelle invasive Verfahren, wie Angiographie, zu verwenden.
Beispiel 11
Das Ausrichten immunsuppressiver Mittel auf transplantierte Organe unter Verwendung der intravenösen Zufuhr von polymeren Hüllen, die solche Mittel enthalten
Immunsuppressive Mittel werden ausgedehnt verwendet nach Organtransplantationen zur Vorbeugung von Abstoßungsvorfällen. Insbesondere verlängert Cyclosporin, ein hochwirksames immunsuppressives Mittel, das Überleben von allogenen Transplantaten, einbegriffen Haut, Herz, Niere, Bauchspeicheldrüse, Knochenmark, Dünndarm und Lunge, in Tieren. Von Cyclosporin wurde gezeigt, dass es eine gewisse humorale Immunität und in noch größerem Maße zellvermittelte Reaktionen, wie die Abstoßung allogener Transplantate, verzögerte Überempfindlichkeit, experimentelle allergische Encephalomyelitis, Freund's-Adjuvans-Arthritis und Graft-versus-Host-Krankheit bei vielen Tierarten hinsichtlich einer Vielzahl von Organen unterdrückt. Erfolgreiche allogene Nieren-, Leber- und Herz-Transplantate wurden unter Verwendung von Cyclosporin an Menschen durchgeführt.
Cyclosporin wird derzeit oral verabreicht, entweder als Kapseln, die eine Lösung von Cyclosporin in Alkohol und Öle, wie Maisöl, polyoxyethylierte Glyceride und dergleichen enthalten, oder als eine Lösung in Olivenöl, polyoxyethylierten Glyceriden und dergleichen. Es wird auch durch intravenöse Injektion verabreicht, wobei es in einer Lösung aus Ethanol (ungefähr 30 %) und Cremaphor (polyoxyethyliertes Rizinusöl) gelöst ist, die vor der Injektion in normaler Salzlösung oder 5 % Dextrose im Verhältnis 1:20 bis 1:100 verdünnt werden muss. Verglichen mit einer intravenösen (i.v.) Infusion beträgt die absolute Bioverfügbarkeit der oralen Lösung ungefähr 30 % (Sandoz Pharmaceutical Corporation, Publication SDI-Z10 (A4), 1990). Im Allgemeinen leidet die i.v.-Verabreichung von Cyclosporin unter ähnlichen Schwierigkeiten wie die derzeit praktizierte i.v.-Verabreichung von Taxol, d.h. anaphylaktischen und allergischen Reaktionen, von denen angenommen wird, dass sie auf das Cremaphor, das Transportmittel, das für die i.v.-Formulierung verwendet wird, zurückzuführen sind. Ferner verhindert die intravenöse Zufuhr von Arzneimitteln (z.B. Cyclosporik), eingekapselt wie hierin beschrieben, gefährliche Spitzen-Blutspiegel unmittelbar nach der Arzneimittelgabe. Zum Beispiel zeigte ein Vergleich von derzeit erhältlichen Formulierungen für Cyclosporin mit der oben beschriebenen eingekapselten Form des Cyclosporins eine fünffache Abnahme der Spitzen-Blutspiegel von Cyclosporin unmittelbar nach der Injektion.
Um Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Cremaphor zu vermeiden, kann Cyclosporin, das in Polymerhüllen, wie oben beschrieben, enthalten ist, durch i.v.-Injektion verabreicht werden. Es kann in einem biokompatiblen Öl oder einer Reihe anderer Lösungsmittel gelöst werden, woraufhin es durch Beschallung in polymere Hüllen dispergiert werden kann, wie oben beschrieben. Zusätzlich hat die Verabreichung von Cyclosporin (oder anderer immunsuppressiver Mittel) in polymeren Hüllen den Vorteil des lokalen Targetings wegen der Aufnahme des injizierten Materials in die Leber durch das RES-System. Dies kann bis zu einem gewissen Ausmaß systemische Toxizität verhindern und wirkungsvolle Dosierungen aufgrund des lokalen Targetings reduzieren. Die Wirksamkeit der Verabreichung und des Targetings des in den Polymerhüllen enthaltenen Taxols an die Leber nach der intravenösen Injektion ist in Beispiel 9 gezeigt. Ein ähnliches Ergebnis würde erwartet hinsichtlich der Verabreichung von Cyclosporin (oder anderer mutmaßlich immunsuppressiver Mittel) entsprechend der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 12
Antikörper-Targeting von polymeren Hüllen
Die Natur der polymeren Hüllen der Erfindung erlaubt das Anheften monoklonaler oder polyklonaler Antikörper an die polymere Hülle oder den Einbau von Antikörpern in die Polymerhülle. Antikörper können in die polymere Hülle eingebaut werden, wenn die polymere Mikrokapsel-Hülle gebildet wird, oder Antikörper können an die polymere Mikrokapsel-Hülle nach deren Herstellung angeheftet werden. Standard-Protein-Immobilisierungsverfahren können für diesen Zweck angewandt werden. Zum Beispiel steht mit Protein-Mikrokapseln, die aus einem Protein, wie Albumin, hergestellt werden, eine große Zahl von Aminogruppen auf den Albumin-Lysin-Resten für das Anhängen von geeignet modifizierten Antikörpern zur Verfügung. Als ein Beispiel können Anti-Tumormittel einem Tumor zugeführt werden durch Einschluss von Antikörpern gegen den Tumor in die polymere Hülle, während sie gebildet wird, oder es können Antikörper gegen den Tumor an die polymere Mikrokapselhülle nach deren Herstellung angehängt werden. Als ein weiteres Beispiel können Genprodukte speziellen Zellen zugeführt werden (z.B. Hepatozyten oder bestimmten Stammzellen im Knochenmark) durch Einbau von Antikörpern gegen Rezeptoren auf den Zielzellen in die Polymerhülle, während sie gebildet wird, oder Antikörper gegen Rezeptoren auf den Zielzellen können an die polymere Mikrokapselhülle nach deren Herstellung angehängt werden. Zusätzlich können monoklonale Antikörper gegen Kernrezeptoren verwendet werden, um das eingekapselte Produkt zielgenau auf den Nukleus bestimmter Zelltypen zu richten.
Beispiel 13
Polymere Hüllen als Träger für Polynukleotidkonstrukte, Enzyme und Vakzine
Indem Gentherapie breiter als eine durchführbare therapeutische Option akzeptiert wird (derzeit wurden mehr als 40 Vorschläge zum menschlichen Gen-Transfer von NIH und/oder FDA-Prüfungsausschüssen angenommen), ist eine der zu überwindenden Barrieren bei der Einführung dieses therapeutischen Ansatzes die Abneigung, virale Vektoren für den Einbau genetischen Materials in das Genom einer menschlichen Zelle zu verwenden. Viren sind schon an sich toxisch. Somit sind die Risiken, die die Verwendung viraler Vektoren in der Gentherapie mit sich bringt, insbesondere für die Behandlung von nicht lebensbedrohlichen, nicht erblich bedingten Krankheiten inakzeptabel. Leider werden Plasmide, die ohne Verwendung eines viralen Vektors übertragen werden, üblicherweise nicht in das Genom der Zielzelle eingebaut. Ferner haben solche Plasmide, wie konventionelle Arzneimittel, eine begrenzte Halbwertszeit im Körper. Somit war eine generelle Begrenzung der Einführung einer Gentherapie (wie auch Antisense-Therapie, die eine Umkehrform der Gentherapie ist, bei der eine Nukleinsäure oder ein Oligonukleotid eingeführt wird, um eine Genexpression zu hemmen) die Unmöglichkeit, Nukleinsäuren oder Oligonukleotide wirksam zuzuführen, die zu groß sind, um die Zellmembran zu durchdringen.
Die Einkapselung von DNA, RNA, Plasmiden, Oligonukleotiden, Enzymen und dergleichen in Protein-Mikrokapselhüllen, wie hierin beschrieben, kann ihre gezielte Zufuhr an die Leber, die Lunge, die Milz, die Lymphe und das Knochenmark erleichtern. Somit können solche biologischen Mittel entsprechend der vorliegenden Erfindung intrazellulären Orten zugeführt werden, ohne die begleitende Gefahr, die mit der Verwendung viraler Vektoren verbunden ist. Diese Art der Formulierung erleichtert die nicht-spezifische Aufnahme oder Endozytose der polymeren Hüllen direkt aus dem Blutstrom in die Zellen des RES, in Muskelzellen durch intramuskuläre Injektion, oder durch direkte Injektion in Tumoren. Ferner können monoklonale Antikörper gegen Kernrezeptoren verwendet werden, um das eingekapselte Produkt auf den Nukleus bestimmter Zelltypen zu richten.
Krankheiten, die von solchen Konstrukten zum Ziel genommen werden können, schließen Diabetes, Hepatitis, Hämophilie, zystische Fibrose, multiple Sklerose, Krebserkrankungen im Allgemeinen, Grippe, AIDS und dergleichen ein. Zum Beispiel kann das Gen des Insulin-like-Growthfaktors (IGF-1) in Protein-Mikrokapselhüllen eingekapselt werden zur Verabreichung bei der Behandlung von diabetischer peripherer Neuropathie und Kachexie. Die Gene, die Faktor IX und Faktor VIII kodieren (nützlich für die Behandlung der Hämophilie), können auf die Leber gerichtet werden durch Einkapselung in Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung. Ähnlich kann das Gen des Low-Density-Lipoprotein-(LDL-) Rezeptors auf die Leber gerichtet werden zur Behandlung der Atherosklerose durch Einkapselung in Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung.
Andere Gene, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind Gene, die die Immunantwort gegen Kebszellen restimulieren. Zum Beispiel können Antigene, wie der HLA-B7, kodiert durch eine in einem Plasmid enthaltene DNA, in eine Protein-Mikrokapselhülle der vorliegenden Erfindung eingebaut werden zur Injektion direkt in einen Tumor (wie einen Hautkrebs). Einmal im Tumor, wird das Antigen für den Tumor spezifische Zellen rekrutieren, die den Spiegel von Zytokinen (z.B. IL-2) anheben, die den Tumor zum Ziel für einen Angriff des Immunsystems machen.
Als ein weiteres Beispiel sind Plasmide, die Teile des adeno-assoziierten Virusgenoms enthalten, zur Einkapselung in Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung vorgesehen. Zusätzlich können Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um therapeutische Gene zu CD8+ T-Zellen zu bringen für eine ergriffene Immuntherapie gegen eine Vielzahl von Tumoren und Infektionskrankheiten.
Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung können ebenso verwendet werden als ein Verabreichungssystem im Kampf gegen Infektionskrankheiten über die gezielte Zufuhr eines Antisense-Nukleotids, zum Beispiel gegen das Hepatitis-B-Virus. Ein Beispiel solch eines Antisense-Oligonukleotids ist ein 21-mer Phosphorothioat gegen das Polyadenylierungssignal des Hepatitis-B-Virus.
Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung können auch zur Verabreichung des Zystische-Fibrose-Transmembran-Regulator-(CFTR-)Gens verwendet werden. Menschen, denen dieses Gen fehlt, entwickeln zystische Fibrose, die durch Zerstäuben von Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung, die das CFTR-Gen enthalten, und direkte Inhalation in die Lungen behandelt werden kann.
Enzyme können unter Verwendung der Protein-Mikrokapselhüllen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verabreicht werden. Zum Beispiel kann das Enzym DNase eingekapselt und den Lungen zugeführt werden. Ähnlich können Ribozyme eingekapselt werden und auf Virus-Hüllproteine oder virusinfizierte Zellen gerichtet werden, indem geeignete Antikörper an das Äußere der polymeren Hülle angeheftet werden. Impfstoffe können ebenso in polymere Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung eingekapselt werden und zur subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Verabreichung verwendet werden.
Beispiel 14
Herstellung von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten (IHC) zur Verwendung als Ersatzstoff für rote Blutzellen
Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml 5% w/v Hämoglobin (menschliches oder vom Rind) zu einer Reaktionszelle hinzugefügt, die an das Ultraschallhorn angeschlossen war (Hegt Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung). Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad getaucht, dessen Temperatur auf 55 °C eingestellt war. Reaktionen, die bei 55 °C durchgeführt wurden, schienen optimal, jedoch kann das Produkt in einem breiten Temperaturbereich (0 bis 80 °C) synthetisiert werden. Der pH-Wert betrug 6,8. Die Temperaturkontrolle ist notwendig für hohe Materialerträge, und die optimale Temperatur hängt von der spezifischen Konfiguration des Experiments ab. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm². Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. Erträge bei kürzeren oder längeren Reaktionszeiten erscheinen geringer. Für das Rinder-Hämoglobin wurde eine 2,5%ige w/v-Lösung durch eine Sephadex-G-25-Gel-Permeationssäule geschleust, um sämtliche Anionen, wie Phosphate, zu entfernen. In einer typischen Synthese von menschlichem Hämoglobin-IHC wurde das Ultraschallhorn an der Luft-Wassergrenzfläche positioniert. Die hergestellte homogene Suspension enthält proteinhaltige rote Blutzellen. Die wässrige Suspension kann dann in einem sterilen Behälter bei 4 °C gelagert werden.
Eine typische Reaktion ergibt eine Lösung, die ungefähr 3 × 10⁸ IHC-Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Dieses synthetische Verfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen.
Nach der Synthese verbleiben die IHC als eine Suspension in der natürlichen Proteinlösung. Um das IHC von dem nicht umgesetzten Protein zu trennen, wurden etliche Verfahren angewandt: Filtration, Zentrifugieren und Dialyse. Das erste Verfahren schloss das Filtern der Mischung durch einen Anotop-Spritzenfilter mit 0,2 μm Durchmesser Porengröße (Whatman, Inc.) ein. Der Filter wurde mit etlichen Volumen Wasser gewaschen, bis das Filtrat sehr wenig oder kein Protein enthielt (wie mittels UV-VIS-Spektroskopie festgestellt). Die IHC wurden aus dem Filter "rückgewaschen" und in einem äquivalenten Volumen Salzlösung resuspendiert. Das zweite Reinigungsverfahren bezog die Verwendung eines Centricon-Zentrifugenfilters mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 100 Kilodalton (kD) ein. Der Zentrifugenfilter ist ein Zentrifugenröhrchen, das durch eine Filtermembran in der Mitte abgetrennt ist. Das Zentrifugieren der IHC-Lösung bei 1000 G für die Dauer von 5 Minuten ermöglichte, dass das meiste des nicht umgesetzten Hämoglobins (64,5 kD) die Membran passieren konnte. Schließlich wurde auch Dialyse mit einer Membran für hohes Molekulargewicht (300 kD) verwendet, um das IHC zu reinigen. Jedoch benötigte dieses Verfahren ungefähr zwei Dialyse-Tage. Das bevorzugte Verfahren zur Reinigung des IHC ist das der Centricon-Zentrifugation.
Beispiel 15
Herstellung eines unlöslichen Hämoglobin/Albumin-Konstrukts (IHAC) als Ersatz für rote Blutzellen
Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml 5%iges w/v-Hämoglobin und Albumin (menschliches oder vom Rind; das Hämoglobin/Albumin-Verhältnis schwankte von 0,5 bis 2) in eine Reagenzzelle gegeben, die an ein Ultraschallhorn angeschlossen war (Hegt Systems XL2020, 20 KHz, 400 W Maximalleistung). Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 55 °C eingestellten Temperatur getaucht. Reaktionen, die bei 55 °C durchgeführt wurden, erschienen optimal, jedoch kann das Produkt in einem breiten Temperaturbereich synthetisiert werden (0 bis 80 °C). Der pH-Wert betrug 6,8. Die Temperaturkontrolle ist notwendig für hohe Materialerträge, und die optimale Temperatur hängt von der spezifischen Konfiguration des Experiments ab. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm². Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. Erträge bei kürzeren oder längeren Reaktionszeiten erschienen geringer. Die hergestellte homogene Suspension enthält den proteinhaltigen Ersatzstoff für rote Blutzellen. Die wässrige Suspension wurde gefiltert, gewaschen, in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert und in einem sterilen Behälter bei 4 °C gelagert.
Wiederum, wie oben beschrieben, ergibt eine typische Reaktion eine Lösung, die grob geschätzt 10⁸ Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Dieses Syntheseverfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen.
Als Alternative kann ein Durchfluss-System verwendet werden, das die kontinuierliche Bearbeitung des IHC ermöglicht. Solch ein System besteht aus peristaltisch arbeitenden Pumpen, die kontinuierlich Ströme aus Hämoglobin und wahlweise einem biokompatiblen Öl oder Fluorkohlenstoff in ein Reagenzgefäß mit einer Beschallungssonde pumpen. Eine geeignete Verweildauer wird im Gefäß beibehalten und das IHC durch Überlauf vom Gefäß in einen Rückgewinnungstank wiedergewonnen. Die nicht umgesetzte Hämoglobinlösung wird in das Reagenzgefäß zurückgeführt.
Beispiel 16
Herstellung unlöslicher Hämoglobin-Konstrukte, die eingekapselte Fluorkohlenstoffe enthalten
Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml 5%iges w/v-Hämoglobin (menschliches oder vom Rind) in eine Reagenzzelle gegeben, die an das Ultraschallhorn (Heat Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung) angeschlossen wurde. 3,5 ml eines Fluorkohlenstoffes, Perfluordecalin, wurden zu dem Reagenzgefäß hinzugefügt. Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 20 °C eingestellten Temperatur getaucht. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 6,8. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm². Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. Die hergestellte homogene Suspension enthält die Mikrokapseln oder Mikrokugeln von vernetzten unlöslichen Hämoglobinhüllen mit eingekapseltem Perfluordecalin im Innern. Die milchige Suspension wird, wie oben, gefiltert, gewaschen, in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert und in einem sterilen Behälter bei 4 °C gelagert.
Wiederum, wie oben beschrieben, ergibt eine typische Reaktion eine Lösung, die grob 10⁸ Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Dieses Syntheseverfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen.
Beispiel 17
Herstellung von unlöslichen Albumin-Konstrukten die eingekapselte Fluorkohlenstoffe enthalten
Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml 5%iges w/v-Albumin (menschliches oder vom Rind) in eine Reaktionszelle gegeben, die an das Ultraschallhorn angeschlossen war (Heat Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung). 3,5 ml eines Fluorkohlenstoffes, Perfluordecalin (oder Perfluortripropylamin), wurden in das Reagenzgefäß gegeben. Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 20 °C eingestellten Temperatur getaucht. Der pH-Wert der wässrigen Phase betrug 6,8. Die Ultraschallquelle schaltete sich bei einer Leistungseinstellung von 7 ein. Das Nomogramm des Herstellers empfahl eine Ausgangsleistung von ungefähr 150 W/cm². Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. Die hergestellte homogene Suspension enthält die Mikrokapseln oder Mikrokugeln von vernetzten unlöslichen Albuminhüllen mit eingekapseltem Perfluordecalin (oder Perfluortripropylamin) im Innern. Die milchige Suspension wird gefiltert, gewaschen, wie oben in steriler, gepufferter Salzlösung resuspendiert und in einem sterilen Behälter bei 4 °C gelagert.
Wiederum, wie oben beschrieben, ergibt die typische Reaktion eine Lösung, die grob 10⁸ Hüllen je Milliliter enthält mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 3 μm und einer Standardabweichung von 1 μm. Dieses Synthesevertahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen.
Beispiel 18
Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte, zusätzlich mit allosterischen Modifikatoren modifiziert, wie Pyridoxal-5'-phosghat (PLP)
Um Hämoglobin-Konstrukte mit variablen Affinitäten zu Sauerstoff (d.h. variable P₅₀) zu erhalten, wurden die IHC weiter mit PLP zur Reaktion gebracht, einem bekannten allosterischen Modulator. Einer Suspension von IHC (gewonnen, wie in Beispiel 14) in Trispuffer wurde bei 10 °C unter Stickstoff der Sauerstoff entzogen. 10 ml der reduzierten IHC-Suspension wurden in jedes von sechs getrennten Reagenzgefäßen gegeben. Unterschiedliche molare PLP/Hb-Verhältnisse wurden in jedes der Gefäße hinzugefügt. Sie betrugen 0,1/3,0, 0,75/3,0, 1,5/3,0, 3,0/3,0, 4,2/3,0, 6,0/3,0. Nach 30 Minuten wurde ein zehnfacher Natriumborhydrid-Überschuss hinzugefügt und es wurde ermöglicht, die Schiffsche Base für die Dauer von weiteren 30 Minuten zu reduzieren. Die Suspension wurde dann durch Zentrifugieren gefiltert, dreimal mit gepufferter Salzlösung rückgespült, in gepufferter Salzlösung resuspendiert und bei 4 °C gelagert. Diese Modifizierung hat die endständigen Aminogruppen der b-Globinkette in Desoxy-Hämoglobin zum Ziel. In dieser Hinsicht ahmt die Modifizierung stark die Wirkung von 2,3-DPG (der am Lysin-EF6(82)b bindet) bei der Stabilisierung der Desoxykonformation nach.
Die sechs verschiedenen Grade der Modifizierung werden zu IHC mit ansteigenden P₅₀-Werten führen (abnehmende Sauerstoff-Affinitäten) mit steigendem Grad der PLP-Substitution.
Beispiel 19
Unlösliche Konstrukte mit vernetzten Hüllen aus Hämoglobin und Polyethylenglykol
Polyethylenglykol (PEG) ist bekannt als nicht toxisch, nichtentflammbar, nichthaftend an Zellen und im Allgemeinen biologisch inert. Proteine, die an PEG angehängt worden sind, wurden als weniger antigen befunden. Es wurde beobachtet, dass bei Liposomen die Zirkulation nach Bindung/Einschluss von PEG erhöht war. Somit wird damit gerechnet, dass der Einbau von PEG in die RBC die Zirkulationszeit erhöht. Durch Variieren der Konzentration von PEG-Thiol, das dem Protein (z.B. Hämoglobin) hinzugefügt wurde, war es möglich, PEG-Hämoglobin-RBC herzustellen, das variierende Stabilitäten aufwies. Das PEG-Thiol wurde durch Verfahren, wie in der Literatur beschrieben (wie Harris and Heart, Polymer Preprints 32: 154 (1991), hergestellt.
PEG-Thiol mit einem Molekulargewicht von 2000 g/mol wurde auf eine Konzentration von 1 % (0,1 g auf 10 ml) in einer 5%igen Hämoglobin-Lösung gelöst. Die Protein-PEG-Lösung wurde beschallt, um proteinhaltigen Ersatz für rote Blutzellen, wie in Beispiel 14 beschrieben, zu bilden.
Beispiel 20
Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte mit Polyethylenglykol der kovalent an das Hüllenäußere angeheftet ist
Die IHC wurden, wie in Beispiel 14 beschrieben, hergestellt. Polyethylenglykol mit einem MW von 10.000 (PEG 10k) wurde mit 1,1'-Carbonyldiimidazol CDI entsprechend Verfahren, die in der Literatur zugänglich sind (Beauchamp et al. Analytical Biochemistry 131: 25–33, 1983), zur Reaktion gebracht. Die IHC wurden in 50 mM Borat-Puffer pH 8,0 suspendiert und PEG-CDI (2facher molarer Überschuss, bezogen auf Gesamt-Nämoglobinlysine) wurde hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für die Dauer von 6 Stunden gerührt. Die entstandenen PEG-IHC wurden dann durch Filtration getrennt, in Salzlösung gewaschen und in steriler gepufferter Salzlösung resuspendiert.
Beispiel 21
Parameter. die die Bildung von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten beeinflussen
Etliche Variable, wie Proteinkonzentration, Temperatur, Beschallungszeit, akustische Stärke, pH-Wert, wurden untersucht, um die Bildung der IHC zu optimieren.
Diese Materialien wurden aus 1%-, 2,5%-, 5%- und 10%-Hämoglobin-Lösungen hergestellt.
Sie wurden ebenfalls aus gemischter Protein-Lösung hergestellt, wie Hämoglobin und Humanserumalbumin, mit Konzentrationen, die wiederum zwischen 1 bis 10 % lagen. Die Größe und Konzentrationen wurden mittels eines Partikelzählgeräts bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die Größe nicht signifikant mit der Anfangs-Proteinkonzentration variierte. Die zubereitete Anzahl stieg mit steigender Anfangs-Proteinkonzentration bis zu ungefähr 5 %. Keine signifikante Veränderung der Anzahl wurde oberhalb dieser Konzentration beobachtet.
Die anfängliche Gefäßtemperatur wurde als wichtig für die optimale Herstellung der IHC festgestellt. Typischerweise wurden die anfänglichen Reaktionstemperaturen zwischen 0 und 80 °C gehalten. Die optimale Starttemperatur war grob 70 °C.
Die Beschallungsdauer war ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der Anzahl der je Milliliter hergestellten IHC. Es wurde festgestellt, dass eine Beschallungsdauer von grob 30 Sekunden gut war, um eine hohe Konzentration der IHC zu synthetisieren. Längere oder kürzere Beschallungszeiten ergaben weniger, aber immer noch eine angemessene Anzahl an IHC.
Entsprechend dem Nomogramm, bereitgestellt vom Hersteller des Beschallungsgerätes, ist die Nennschallleistung des Beschallungsgerätes, das bei diesen Experimenten verwendet wurde, ungefähr 150 Watt/cm². Bei anderen Leistungseinstellungen wurde ebenfalls festgestellt, dass eine große Anzahl an IHC hergestellt wurde.
Beispiel 22
Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte als Arzneimittelträger von öllöslichen Arzneimitteln
Die zytotoxischen Wirkungen etlicher antineoplastischer Arzneimittel sind bei Vorhandensein von Sauerstoff stark verbessert. Es ist daher erstrebenswert, ein Arzneimittel einer Tumorstelle zuzuführen, während die Sauerstoff-Konzentration in diesem Bereich erhöht wird. Die Hämoglobin-Mikrokugeln der vorliegenden Erfindung sorgen für diese Fähigkeit. Das obige Beispiel 16 beschreibt die Einkapselung einer Fluorkohlenstoff-Flüssigkeit in eine Hülle aus unlöslichem Hämoglobin. Zytotoxische Arzneimittel, wie Cyclophosphamid, BCNU, Melphalan, Taxol, Camptothecin, Adriamycin, Etoposid und dergleichen, können im Fluorkohlenstoff oder einem anderen geeigneten Öl, wie Sojaöl, gelöst und in das Hämoglobin-Konstrukt eingekapselt werden.
Taxol wurde in Sojabohnenöl (SBO) auf eine Konzentration von 5 mg/ml gelöst. 3,5 ml einer 5%igen Hämoglobin-Lösung wurden in ein Reagenzgefäß gegeben, und 3,5 ml des SBO/Taxol wurde zu dem Gefäß hinzugefügt. Die Zwei-Phasen-Mischung wurde beschallt, wie in Beispiel 16 beschrieben, um vernetzte unlösliche Hämoglobinhüllen, die SBO/Taxol enthielten, zu gewinnen.
Beispiel 23
Polvmerhüllen als Arzneimittelträger von wasserlöslichen Arzneimitteln
Etliche wasserlösliche Arzneimittel sind Kandidaten zur Einkapselung in Polymerhüllen. Als ein Beispiel wurde Methotrexat in Wasser auf eine Konzentration von 5mg/ml gelöst. Ein Milliliter dieser wässrigen Lösung wurde mit 4 ml Sojaöl emulgiert unter Verwendung von Pluronic-65 (Block-Copolymer aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), um eine stabile Wasser-in-Öl-(W/O-)Mikro-Emulsion zu bilden. 3,5 ml einer 5%igen Hämoglobin-Lösung wurden mit 3,5 ml dieser W/O-Mikro-Emulsion überschichtet und für die Dauer von 30 Sekunden beschallt, um unlösliche Hämoglobin-Konstrukte zu erhalten, die eine eingekapselte Mikro-Emulsion mit Methotrexat enthalten.
Beispiel 24
Polvmerhüllen als Proteinträger
Etliche Proteine sind Kandidaten zur Einkapselung in Polymerhüllen, z.B. Hämoglobin, Albumin und dergleichen. Zum Beispiel könnte als ein Verfahren zur Erhöhung des Hämoglobingehalts der IHC das Hämoglobin in das IHC eingekapselt werden, anstatt des wasserlöslichen Arzneimittels in Beispiel 23. Hämoglobin wurde zu einer Konzentration von 10 % in Wasser gelöst. Ein Milliliter dieser wässrigen Lösung wurde mit 4 ml Sojaöl emulgiert unter Verwendung von Pluronic-65 (Block-Copolymer aus Polyethylenoxid und Polypropylenoxid), um eine stabile Wasser-in-Öl-(W/O-)Mikro-Emulsion zu bilden.
3,5 ml einer 5%igen Hämoglobin-Lösung wurden mit 3,5 ml dieser W/O-Mikro-Emulsion überschichtet, die Hämoglobin enthielt. Die Zweiphasen-Mischung wurde für die Dauer von 30 Sekunden beschallt, um unlösliche Hämoglobin-Konstrukte zu gewinnen, die eine eingekapselte Mikro-Emulsion enthielten, welche ebenfalls Hämoglobin enthielt. Dieses Verfahren diente dazu, die Gesamtmenge an Hämoglobin je Mikrokugel des IHC zu erhöhen und erhöhte darum die Sauerstofftransportfähigkeit für gebundenen Sauerstoff.
Beispiel 25
In-vivo-Verabreichung von Albumin-/Fluorkohlenstoff-Konstrukten--Magnet-Resonanz-Bildgebung (¹⁹F-MRI) zum Nachweis der Bioverteilung
Albumin-Konstrukte, die Perfluornonan enthalten, wurden entsprechend Beispiel 17 hergestellt. Die Endsuspension wurde bereitet, um 20 Volumen-% Fluorkohlenstoff in steriler Salzlösung zu enthalten. Zwei Milliliter dieser Suspension wurden über die Schwanzvene einer mit Ketamin betäubten Sprague-Dawley-Ratte injiziert. Die In-vivo-Verteilung des Fluorkohlenstoffs wurde mittels ¹⁹F-MRI auf einem Bruker-500-MHz-NMR-Gerät beobachtet. Die Ratte wurde in eine 10-cm-¹⁹F-Spule gelegt und Bilder wurden gewonnen unter Verwendung einer T₁-gewichteten Sequenz mit TR = 1 Sekunde, TE = 20 Millisekunden und einer Datenmatrix von 256 × 128.
Eine Stunde nach der Verabreichung wurde das meiste des FC akkumuliert in der Leber, den Lungen und der Milz gefunden. Etwas FC konnte auch im Knochenmark nachgewiesen werden. Es würde erwartet, dass Hämoglobin-Konstrukte sich hinsichtlich Gewebe-Lokalisation und -Akkumulation gleich verhalten. Diese Beobachtungen hatten große Auswirkungen auf die Behandlung von Leber- und Lungentumoren und möglicherweise die Behandlung von neoplastischen Zellen im Knochenmark mit hohen Sauerstoffdosen in Verbindung mit der lokalen Verabreichung eines zytotoxischen Arzneimittels oder als Adjuvans bei der Strahlentherapie.
Beispiel 26
In-vivo-Verabreichung von Konstrukten, die Arzneimittel befördern
Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte, die eingekapseltes Taxol (in SBO) enthalten, wurden gemäß Beispiel 22 hergestellt. Die Endsuspension wurde bereitet, um 20 Volumen-% SBO in steriler Salzlösung zu enthalten. 2 ml dieser Suspension wurden über die Schwanzvene einer mit Ketamin betäubten Sprague-Dawley-Ratte injiziert.
Die Ratte wurde 2 Stunden nach der Injektion geopfert und die Leber entnommen. Die Leber wurde mit einer kleinen Menge Salzlösung homogenisiert und mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde lyophilisiert, in Methanol gelöst und in eine HPLC-Säule injiziert. Ungefähr 15 % der Anfangsdosis an unmetabolisiertem Taxol wurden aus der Leber zurückgewonnen. Dies bestimmte die Durchführbarkeit des Targetings von antineoplastischen Arzneimitteln auf die Leber in Verbindung mit der Zufuhr von Sauerstoff an diese Stellen.
Beispiel 27
Akut-Blut-Ersatzmodell für unlöslichen Hämoglobin-Blutersatz
Betäubte Sprague-Dawley-Ratten (350–400g) werden durch die äußere Drosselvene katheterisiert. Ungefähr 70 % ihres Blutvolumens werden während einer Zeitspanne von 10 Minuten entnommen. Die Ratten werden weitere 10 Minuten in diesem Stadium belassen, woraufhin ihnen eine isoonkotische, mit Sauerstoff angereicherte IHC-Suspension mit einem P₅₀ von 28 mm Hg rückinfundiert wird. Der mittlere arterielle Druck, Herzfrequenz und Atmungsfrequenz werden ständig beobachtet. Das Überleben dieser Ratten wird über die Zeit verfolgt.
Beispiel 28
Unlösliche Hämoglobin-Konstrukte zur Umkehr von Gewebs-Ischämie
Die Fähigkeit der IHC, bevorzugt Sauerstoff an einen ischämischen Ort zu befördern, wird ausgenutzt. IHC mit 'hoher Affinität', d.h. einem P₅₀ < 28 mm Hg sind für diesen Zweck von Nutzen, da sie Sauerstoff nur an Orten freisetzen werden, wo Sauerstoff-Gradienten größer als üblicherweise in der Zirkulation anzutreffen sind, das bedeutet, an einem ischämischen Ort. Ein IHC mit einem P₅₀ von 20 mm Hg wird für diesen Zweck verwendet.
Ein bilaterales Karotis-Verschlussmodell in einer Ratte wird als ein Modell für 'Schlaganfall' oder cerebrale Ischämie verwendet. Beide Karotis-Arterien werden durch vorübergehende Ligatur in einer mit Ketamin betäubten Sprague-Dawley-Ratte verschlossen. Bei der Kontrollratte wird die Ligatur nach 15 Minuten beseitigt, und normaler Blutfluss wird wieder aufgenommen. In die Versuchsratte wird 1 ml einer IHC-Suspension mit hoher Affinität in Salzlösung direkt in jede Karotis-Arterie infundiert nach externer Sauerstoffanreicherung der IHC-Suspension in einer Sauerstoffanreicherungsvorrichtung. 24 Stunden nach der Behandlung werden die Ratten geopfert, ihre Gehirne entnommen, fixiert, geschnitten und mit Nitro-Blautetrazolium (NBT) oder Trypanblau eingefärbt, um das Ausmaß des Zelltods zu bestimmen. Ein geringeres Zelltod-Ausmaß wie mittels der Einfärbung mit Tryptanblau festgestellt, wird bei der Versuchsratte, die das IHC der Erfindung erhält, erwartet.
Beispiel 29
Abschätzung der In-vivo-Zirkulationshalbwertszeit von unlöslichen Hämoglobin-Konstrukten
Betäubte Sprague-Dawley-Ratten (350–400g) werden durch die äußere Drosselvene katheterisiert. Eine Bolus-Injektion einer isoonkotischen IHC-Suspension, entsprechend 20 % des Volumens des Blutes des Tieres, wird durch den Katheter verabreicht. Blut wird zu Probeentnahme-Zeitpunkten von 0,25 bis 92 Stunden entnommen. Die Blutproben werden zentrifugiert und das Plasma auf Zeichen von Hämolyse oder das Vorhandensein von löslichem Hämoglobin beobachtet. Da die IHC-'Mikroblasen' ein gasförmiges Inneres haben (und daher von geringerer Dichte als Wasser sind), steigen sie nach der Zentrifugierung an die Oberfläche des Plasmas. Die Mikroblasen werden abgeschöpft, in Salzlösung resuspendiert und in einem Partikelzählgerät gezählt. Die Halbwertszeiten von IHC in Zirkulation werden dann bestimmt. Verglichen mit Blutersatz auf Hämoglobinbasis des Standes der Technik wird erwartet, dass das IHC der Erfindung eine verbesserte Zirkulationshalbwertszeit zeigen wird.
Beispiel 30
IHC zur Konservierung von Organen – Konservierung des Rattenherzens
Einer betäubten Sprague-Dawley-Ratte wird das Herz chirurgisch entfernt und künstlich mit Raumluft beatmet. Das Herz wird in ein kristalloides Medium ("Kardioplegiemedium"- CM) eingelegt, das die gleiche Zusammensetzung wie das IHC-Konservierungsmedium (entweder IHC/FC oder Albumin/FC) hat, jedoch ohne den Hämoglobin-Bestandteil. Das Herz wird für etliche Minuten mit dem CM perfundiert und dabei auf 11 °C abgekühlt. Das Herz wird dann 12 Stunden lang bei 12 °C mit 140 ml des IHC-Konservierungsmediums konserviert. Das IHC-Medium wird dabei ständig bei niedrigem Druck (18 mm Hg) durch das Herz perfundiert und beständig mit 95 % O₂/5 % CO₂ äquilibriert. Nach der Konservierungsdauer von 12 Stunden wird das kontraktile, Pump- und energetische Funktionieren des Herzens geprüft, indem eine isoliert arbeitende Rattenherzvorrichtung verwendet wird.
Beispiel 31
Nutzen von IHC-Medien in der Kardioplegie für die Operation am offenen Herzen
Ein kardiopulmonaler Bypass wird gelegt, und ein mit Sauerstoff angereichertes 'Kardioplegie-Medium', das IHC (oder IHC/FC oder Albumin/FC) enthält, als Sauerstoffträger wird bei 4 °C nach angemessener Aortenabklemmung und -öffnung als Bolus von 500 bis 100 ml in die Aortenwurzel verabreicht. Zusätzliche Dosen des kalten Mediums werden den linken und rechten Koronarostien verabreicht, und im Falle von Bypass-Operationen wird das Medium vor der abschließenden Anastomose ebenfalls den Enden der Implantate zugeführt. Das Medium wird alle 15 bis 20 Minuten in Mengen verabreicht, die ausreichen, um eine kalte Myokard-Temperatur beizubehalten. Nach Abschluss des Vorganges wird die Aortenklammer entfernt, und die Wiedererwärmung des Herzens wird begonnen.
Beispiel 32
Nutzen von IHC-Medien in der Angioplastie oder Atherektomie
Das IHC-Medium (oder IHC/FC oder Albumin/FC) wird während Eingriffsvorgängen verabreicht, die unternommen werden, um den Fluss von unterbrochenen oder unterversorgten Bereichen eines Organs wiederherzustellen. Beispiele solcher Vorgänge sind die Angioplastie und Atherektomie. Regionale Ischämie kann während des Aufblasens des Ballons bei der perkutanen transluminalen Koronar-Angioplastie gelindert werden durch die Zufuhr eines mit Sauerstoff angereicherten IHC-Mediums in einer Rate von ungefähr 60 ml/min durch das zentrale Lumen des dilatierenden Ballon-Katheters hindurch. Das Medium wird in Körpertemperatur verabreicht und enthält zum Beispiel physiologisch verträgliche Ringer-Elektrolyte und Substrate. Eine Dosis des IHC-Mediums, das mit Sauerstoff äquilibriert wird, wird während jedes Ballon-Aufblaszeitraums infundiert. Ein ähnliches Vorgehen wird während des Aufblasens des Ballons bei Atherektomie-Vorgängen eingesetzt, die verwendet werden, um Gefäßobstruktionen durch Messer oder Laser physikalisch zu beseitigen. Die Infusion des Mediums direkt in das blockierte Gefäß während enzymatischer thrombolytischer Vorgänge könnte durchgeführt werden, um eine Sauerstoffanreicherung während des Lysierens distal der Obstruktion bereitzustellen. Derzeit wird Fluosol-DA während einiger Angioplastie-Vorgänge verwendet; das IHC-Medium (oder IHC/FC oder Albumin/FC) der vorliegenden Erfindung würde Fluosol-DA ersetzen.
Beispiel 33
Synthese von Dodecafluornonan (C₉F₂₀), eingeschlossen in einer polymeren Hülle
Eine 20-ml-Glas-Reaktionszelle, Titanhorn und Kragen wurden vor der Synthese mit Alkohol und steriler Salzlösung gewaschen, wie auch die gesamte verwendete Ausrüstung. In einer typischen Reaktion wurden 3,5 ml steriles 5%iges w/v-USP-(United States Pharmacopoeia)-Humanserumalbumin (Alpha Therapeutics Corporation) in die Reaktionszelle gegeben und die Zelle an das Ultraschallhorn (Hegt Systems XL2020, 20 kHz, 400 W Maximalleistung) angeschlossen. Das Horn und die Zelle wurden dann in ein temperaturkontrolliertes Bad mit einer auf 22 °C eingestellten Temperatur getaucht. Bei 22 °C durchgeführte Reaktionen erschienen optimal, jedoch kann das Produkt in einem breiten Temperaturbereich (0 bis ungefähr 40 °C) synthetisiert werden. Die Temperaturkontrolle ist kritisch für hohe Erträge des Materials, und die optimale Temperatur hängt von der spezifischen Konfiguration des Experiments ab.
Sechs Milliliter Dodecafluornonan (C₉F₂₀) wurden als Nächstes hinzugegeben, und die Ultraschallquelle wurde mit einer Leistungseinstellung von 7 geschaltet. Die Menge des hinzugefügten Fluorkohlenstoffs kann variiert werden von weniger als einem Milliliter bis zu ungefähr 13 ml mit gutem Ertrag an Protein-Polymerhüllen. Die Reaktion ist nach ungefähr 30 Sekunden abgeschlossen. Erträge bei kürzeren oder längeren Reaktionszeiten scheinen geringer zu sein. Die hergestellte homogene Suspension enthält das in Protein-Polymerhüllen eingeschlossene Dodecafluornonan und besteht ungefähr aus 60 Volumen-% Perfluornonan. Die wässrige Suspension kann dann bei 4 °C in einem sterilen Gefäß gelagert werden.
Eine typische Reaktion ergibt eine Lösung, die ungefähr 1 × 10⁹ Hüllen je Milliliter mit einem durchschnittlichen Hüllendurchmesser von 2 μm und einer Standardabweichung von 1 μm enthält. Dieses Syntheseverfahren ergibt hohe Konzentrationen von Biomaterial in Mikrometergrößen mit engen Größenverteilungen.
Beispiel 34
Synthese von Perfluortributylamin (C₁₂F₂₇) oder Perfluortripropylamin (C₉F₂₁N), eingeschlossen in polymeren Hüllen
Das 5%ige w/v-USP-Humanserumalbumin (3,5 ml) und Fluoramin (6 ml) wurden in eine Glas-Reaktionszelle gegeben und mit Ultraschall mit hoher Intensität beschallt. Die Reaktionsbedingungen waren eine Leistungseinstellung von 7, eine Bad-Temperatur von 22 °C und eine Reaktionszeit von ungefähr 30 Sekunden. Wiederum wurden sowohl Perfluortripropylamin [(C₃F₇)₃N] als auch Perfluortributylamin [(C₄F₉)₃N], beide in hoher Konzentration eingeschlossen in einer Protein-Polymerhülle, synthetisiert (1 × 10⁹ Hüllen/ml) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 2 μm.
Beispiel 35 Synthese von Perfluordecalin (C₁₀F₁₈), eingeschlossen in einer polymeren Hülle Das 5%ige w/v-USP-Humanserumalbumin (3,5 ml) und Perfluordecalin (C₁₀F₁₈; 6 ml) wurden in eine Glas-Reaktionszelle gegeben und mit Ultraschall mit hoher Intensität beschallt. Die Reaktionsbedingungen waren eine Leistungseinstellung von 7, eine Bad-Temperatur von 22 °C und eine Reaktionszeit von ungefähr 30 Sekunden. Es wurden hohe Konzentrationen von Perfluordecalin mit engen Größenverteilungen, das in einer Protein-Polymerhülle eingeschlossen war, synthetisiert. Da ferner Perfluordecalin und Perfluortripropylamin die Hauptbestandteile des von der FDA zugelassenen Fluorkohlenstoffs, Fluosol DA, sind, sollte die medizinische Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der medizinischen Bildgebung ohne Schwierigkeiten von den Prüfungsbehörden anerkannt werden.
Beispiel 36
Synthese von Perfluor-15-Kronen-5 (C₁₀F₂₀O₅), eingeschlossen in einer polymeren Hülle
Das 5%ige w/v-USP-Humanserumalbumin (3,5 ml) und der Fluorkronenether (C₁₀F₂₀O₅; 6 ml) wurden in eine Glas-Reaktionszelle gegeben und mit Ultraschall mit hoher Intensität beschallt. Die Reaktionsbedingungen waren eine Leistungseinstellung von 7, eine Bad-Temperatur von 22 °C und eine Reaktionszeit von ungefähr 30 Sekunden. Wie vorher wurden hohe Konzentrationen von Fluorkronenether, enthalten in einer Protein-Polymerhülle, mit engen Größenverteilungen synthetisiert. Tatsächlich war dieses experimentelle Verfahren zur Synthetisierung von mit Fluorkohlenstoff gefüllten polymeren Hüllen typisch für alle der untersuchten Fluorkohlenstoffe.
Beispiel 37
Synthese von Perfluor-t-butylbuten (C₁₀F₁₈H₂), eingeschlossen in einer polymeren Hülle
Das 5%ige w/v-USP-Humanserumalbumin (3,5 ml) und C₁₀F₁₈H₂ (6 ml) können in eine Glas-Reaktionszelle gegeben werden und mit Ultraschall mit hoher Intensität beschallt werden. Reaktionsbedingungen, die eine Leistungseinstellung von 7, eine Bad-Temperatur von 22 °C und eine Reaktionszeit von ungefähr 30 Sekunden enthalten, würden typischerweise angewandt werden. Durch dieses Verfahren könnten Protein-Polymerhüllen mit einer hohen Konzentration an darin eingeschlossenem Fluor-t-butylbutan synthetisiert werden.
Beispiel 38 Toxizität von Fluorkohlenstoffen, die in Polymerhüllen enthalten sind Fünf Ratten wurden durch eine katheterisierte Drosselvene 5 ml einer 20%igen v/v-Fluorkohlenstoff-Suspension (Perfluornonan, enthalten in einer HSA-Protein-Polymerhülle) für die Dauer von 10 Minuten injiziert. Fluorkohlenstoffe sind im Allgemeinen nicht toxisch aufgrund der starken Fluor-Kohlenstoff-Bindungen; tatsächlich wurden Fluorkohlenstoffe erfolgreich als von der FDA zugelassene künstliche Blutersatzstoffe (Fluosol DA) verwendet. Die Ratten wurden zu bestimmten Zeiten getötet und einer Autopsie unterzogen. Neben der Beobachtung des allgemeinen Gesundheitszustandes der Ratte wurden die Leber, Milz, Lungen und die Nieren sorgfältig untersucht. Alle Ratten, die nach 0,5, 2, 8 und 24 Stunden untersucht wurden, waren gesund ohne entzündete Gewebe oder Organe. Die fünfte Ratte ist nach 90 Tagen immer noch am Leben und gesund. Zum Vergleich: diese Dosis des von der FDA zugelassenen Sojaöls in einer Ratte ist die LD₅₀-Menge, was weiter den Schluss zulässt, dass Fluorkohlenstoffe nicht toxisch und sicher sind.
Beispiel 39
Magnetische ¹⁹F-Kernresonanz-Spektroskopie von reinem Fluorkohlenstoff und einem Fluorkohlenstoff, eingeschlossen in einer Polymerhülle
NMR-Spektren der Fluorkohlenstoffe, die in einer Protein-Polymerhülle enthalten sind, sowie reine Fluorkohlenstoffe wurden auf einem Bruker-500-MHz-NMR-Gerät gewonnen. Das Gerät wurde für ¹⁹F eingestellt bei seiner Resonanzfrequenz von 470,56 MHz. Ein Deuterium-Lösungsmittel wurde zum Arretieren verwendet, und alle Spektren wurden extern zu Freon (CCl₃F) bei 0 ppm in Bezug gesetzt. Perfluornonan und CDCl₃ wurden in ein 5-mm-NMR-Röhrchen gegeben. Das Spektrum reinen Perfluornonans wurde mit zwei Sätzen von scharfen Peaks gewonnen, einem bei –87 ppm und dem zweiten Satz von Spitzen bei –127, –128 und –133 ppm.
Eine Perfluornonan-Suspension, eingeschlossen in HSA-Protein-Polymerhüllen, wurde in D₂O resuspendiert, und ein ähnliches NMR-Spektrum wurde gewonnen. Starke Signale wurden von der 20%igen v/v-Fluorkohlenstoff-Suspension gewonnen mit Spitzen oder Resonanzen bei –81, –121, –122 und –126 ppm. Der Einschluss des Fluorkohlenstoffs in der polymeren Hülle während der Ultraschallbeschallung hatte keine chemischen oder strukturellen Veränderungen des Perfluornonans zur Folge. Zum Beispiel wurden mit C₉F₂₀ zwei separate Resonanzen beobachtet: eine, die der CF₃ entsprach, bei ungefähr –80 ppm, und die zweite Schar von Resonanzen bei ungefähr –125 ppm, was der CF₂-Gruppe entsprach.
Beispiel 40
Magnetische ¹⁹F-Kernresonanz-Spektroskopie von Fluorkohlenstoffen zur Messung von lokaler Temperatur
Variable NMR-Temperaturspektren von Fluorkohlenstoffen wurden auf einem Bruker-500-MHz-NMR-Gerät gewonnen. Das Gerät wurde für ¹⁹F eingestellt bei seiner Resonanzfrequenz von 470,56 MHz. Ein Deuterium-Lösungsmittel (d₆-Dimethylsulfoxid[d₆-DMSO]) wurde zur Arretierung verwendet, und alle Spektren wurden extern zu Freon (CCl₃F) bei 0 ppm in Bezug gesetzt. Perfluordodecan, das einen Schmelzpunkt von 77 °C hat, sowie d₆-DMSO wurden bei Raumtemperatur in ein 5-mm-NMR-Röhrchen gegeben. Fluorspektren wurden bei verschiedenen Temperaturen gesammelt, und die Linienbreiten wurden gemessen. Linienbreiten-Daten bei –81 ppm, als eine Funktion der Temperatur, sind nachfolgend aufgeführt:

Linienbreite bei –81 ppm (Hz) Temperatur (°C)

51,1 102

57,0 82

64, 65 60
Das breite Spektrum bei niedrigeren Temperaturen beginnt schärfer zu werden, wenn die Temperatur steigt, was davon herrührt, dass das Perfluordodecan seinen Phasenübergang vom festen zum flüssigen Zustand durchläuft. Die Änderung verläuft mit der Temperatur scharf und plötzlich, wie für ein reines Material zu erwarten.
Um die Schmelztemperatur zu verbreitern und zu senken, wurde dem Perfluordodecan Pentan hinzugefügt (ungefähr 2 % v/v). Wie oben gesehen, verschärften sich die breiten Spektren bei niedrigeren Temperaturen, wenn das Perfluordodecan seinen Phasenübergang vom festen zum flüssigen Zustand durchläuft. Linienbreiten-Daten, als eine Funktion der Temperatur, für die Perfluordodecan-Pentan-Mischung sind nachfolgend dargestellt:
Die entstehende Perfluordodecan-Pentan-Mischung hat einen niedrigeren Schmelzpunkt, der sich wie erwartet verbreitert. Mit diesem System können Temperaturmessungen im Bereich von 27° bis 77 °C durchgeführt werden. Somit ist es bei gegebener linienbreite möglich, die lokale Temperatur zu bestimmen.
Ein Beispiel für die Anwendung dieses Verfahrens zur Bestimmung lokalisierter Temperaturen in vivo bezieht die Injektion von Proteinhüllen ein, die Fluorkohlenstoff-Mischungen enthalten (z.B. solche, wie oben beschrieben) mit breiten Schmelzübergängen, die Temperatur-Linienbreiten-Korrelationen (die empirisch gewonnen werden können) haben. Solch eine Zubereitung wird sich auf die Leber oder Milz begrenzen und kann zusätzlich dazu, dass sie als ein ¹⁹F-MRI-Kontrastmittel dient, gleichzeitig zur Bestimmung von lokal unterschiedlichen Temperaturen im Organ genutzt werden (was die Beleuchtung der Pathologie von auffälligen Anomalien in den Geweben erlaubt).
Beispiel 41
¹⁹F-Magnetresonanz-Bildgebung von Phantomen
Zwei Arten von eingeschlossenen Fluorkohlenstoffen, die in polymeren Hüllen enthalten sind, wurden in dieser Phantom-Studie verwendet. Perfluornonan und Perfluortributylamin, enthalten in HSA-Protein-Polymerhüllen, wurden synthetisiert, wie in den Beispielen 33 und 34 beschrieben. Die synthetisierte Suspension, die 60 Volumen-% Fluorkohlenstoff entsprach, wurde mit Salzlösung verdünnt, und 2 ml wurden in Polystyrol-Röhrchen gefüllt. Die Polystyrol-Röhrchen wurden dann in ein im Handel erhältliches Siemens-2T-MRI-Gerät (10-cm-¹⁹F-Spule) gestellt, das bei 1,5 Tesla arbeitet. ¹⁹F-Magnetresonanz-Bilder der Röhrchen wurden über einen Zeitraum von 5 Minuten mit einer Echozeit (TE) von 10 Millisekunden und einer Repetitionszeit (TR) von 300 Sekunden (256×256-Matrix) aufgenommen.
Perfluornonan, enthalten in polymeren Hüllen
Gute MR-Phantom-Bilder wurden sogar bei niedrigen Konzentrationen von Perfluornonan, eingeschlossen in polymeren Hüllen, beobachtet. Sehr ähnliche Daten wurden mit polymeren Hüllen, die Perfluortributylamin enthielten, beobachtet. Lediglich bei starker Verdünnung (1/100; 0,02 M) war das Bild von schwacher Qualität und Auflösung.
Beispiel 42
¹⁹F-Magnetresonanz-Bildgebung von Leber und Milz in vitro
300 g schweren Ratten wurden 2 ml 20%iges v/v-Perfluornonan injiziert, das in einer HSA-Protein-Polymerhüllensuspension enthalten war. Nach 2 Stunden und nach 5 Tagen wurde eine Ratte geopfert, und die Leber, Milz, Nieren und Lungen wurden entnommen. Die gesamte Leber, zum Beispiel, wurde dann in ein MRI-Gerät mit 4 Tesla, das mit einer 10-cm-¹⁹F-Spule arbeitet, gelegt. ¹⁹F-Magnetresonanz-Bilder der Leber, Milz und Niere wurden gewonnen, indem eine nach T, gewichtete Sequenz mit TR = 1 Sekunde, TE = 20 Millisekunden und einer Datenmatrix von 256 × 128 (d.h. 128 Phasen Kodierschritte, 16 Signalmittelungen) verwendet wurde.
¹⁹F-MRI-Bilder der Leber zeigten Regionen von schwankender Intensität, die mit schwankenden Ausmaßen der Aufnahme der Polymerhüllen in die Leber korrelierten. Zum Beispiel wurde eine dunkle Region, die der Pfortader entspricht, beobachtet, wo man das Vorhandensein von Perfluornonan enthaltenden Polymerhüllen nicht erwartet, da die meisten Hüllen interzellulär in dem RES der Leber konzentriert sind.
Die durchschnittliche Bildschärfe der Leberabtastung zwei Stunden nach der Injektion war ungefähr 20–30 % höher als die einer Abtastung, die 5 Tage nach der Injektion aufgenommen wurde, was ein teilweises Zerstreuen des Perfluornonan zeigt, möglicherweise durch Zusammenbrechen der polymeren Hüllen. Insgesamt wurden qualitativ ausgezeichnete Bilder gewonnen, die die Leber-Morphologie zeigten, was das Potential dieser Technik bei der Diagnose und Lokalisierung von abnormer Pathologie in der Leber zeigt.
Beispiel 43
In-vivo-¹⁹F-Magnetresonanz-Bildgebunq von Leber und Milz
Einer 150 g schweren Ratte wurden über 10 Minuten 2 ml 20%iges v/v-Perfluornonan (C₉F₂₀), das in HSA-Polymerhüllen enthalten ist, injiziert. Die ganze Ratte wurde dann in ein MRI-Gerät mit 4 Tesla gegeben, das mit einer 10-cm-¹⁹F-Spule arbeitet. Die Ratte wurde vor der Aufnahme von Bildern mit Ketamin betäubt. ¹⁹F-Magnetresonanz-Bilder der gesamten Ratte, wie auch einzelner Organe, wie der Leber, Milz und Niere, wurden gewonnen, indem eine nach T, gewichtete Sequenz mit TR = 1 Sekunde, TE = 20 Millisekunden und einer Datenmatrix von 256 × 128 (d.h. 128 Phasen Kodierschritte, 16 Signalmittelungen) verwendet wurde.
Von den Ratten wurden 15 Minuten, 2 Stunden und 24 Stunden nach der Injektion der Perfluornonan enthaltenden HSA-Protein-Polymerhüllen Bilder aufgenommen. Insgesamt wurden qualitativ ausgezeichnete Bilder gewonnen, die die Leber- und Milzmorphologie zeigen, was das Potential dieser Technik bei der Diagnose und Lokalisierung abnormer Pathologie in Organen zeigt, die Leber-RES enthalten.
Beispiel 44
Bestimmung der lokalen Temperatur unter Verwendung der In-vivo-¹⁹F-Magnetresonanz-Bildgebung
Einer 300 g schweren Ratte werden über 10 Minuten 5 ml eines 20%igen v/v-Perfluordodecans / 2%igen Pentans (oder Perfluornonadecansäure und 1 % Cholesterin), enthalten in HSA-Polymerhüllen, injiziert. Die Ratte wird dann in eine 15-cm-Spule (ein MRI-Magnet mit 1,5-Tesla von Siemens) gegeben. Ein TE-Wert von 10 Millisekunden und TR-Wert von 300 Sekunden wird verwendet, um die Bilder (256×256-Matrix) aufzunehmen. Die Ratte wird vor dem Sammeln der Daten mit Ketamin betäubt. Die Leber und Milz werden 15 Minuten lang aufgenommen, indem eine Schichtdicke von 5 mm genommen wird. Die Daten werden bei Raumtemperatur und bei ungefähr 37 °C aufgenommen, indem die bearbeitete Ratte in ein Heizkissen eingewickelt wird.
Beispiel 45
In-vivo-Sauerstoffbestimmung unter Anwendung der¹⁹F-Magnetresonanz-Bildgebung
Einer 300 g schweren Ratte werden über 10 Minuten 5 ml 20%iges v/v-Perfluornonan, enthalten in HSA-Polymerhüllen, injiziert. Daraufhin wird die Ratte in eine 15-cm-Spule (ein MRI-Magnet mit 1,5 Tesla von Siemens) gelegt. Ein TE-Wert von 70 Millisekunden und TR-Wert von 3 Sekunden wird verwendet, um die Bilder aufzunehmen (256×256-Matrix). Die Ratte wird in ein Haltegeschirr gesteckt, bevor die Daten gesammelt werden. Die Ratte wird zuerst in eine Sauerstoffkammer gelegt, um den Sauerstoff-Stoffwechsel zu erhöhen, und die Linienbreite und das Bild werden aufgenommen. Der Ratte wird anschließend Ketamin injiziert, um den Sauerstoffverbrauch zu verringern, und wiederum werden die Linienbreite und das Bild aufgenommen. Die Linienbreite und die Bildintensität werden auf Veränderungen beobachtet, entsprechend der Menge gelösten Sauerstoffs in der Ratte. Die höchste Linienbreite wird bei höheren Sauerstoff-Konzentrationen festgestellt. Die Leber und Milz werden 15 Minuten lang abgebildet, wobei eine Schichtdicke von 5 mm genommen wird. Zwei Datensätze werden gesammelt, einer bei Raumtemperatur und ein weiterer bei 37 °C, indem die betäubte Ratte in ein Heizkissen gewickelt wird.
Beispiel 46
Herstellung von Paclitaxel-Partikeln
Paclitaxel-Kristalle (Sigma Chemical) wurden in einer Kugelmühle gemahlen, bis Partikel festen Taxols mit einer Größe geringer als 10 μm gewonnen waren. Die Größe der Partikel wurde bestimmt durch Suspendieren der Partikel in isotonischer Salzlösung und Zählen mit Hilfe eines Partikelzählgeräts (Elzone, Particle Data). Das Mahlen wurde fortgesetzt, bis 100 % der Partikel eine Größe von weniger als 5 μm hatten. Die bevorzugte Partikel-Größe für die intravenöse Zufuhr ist kleiner als 5 μm und am bevorzugtesten kleiner als 1 μm.
Alternativ dazu wurden Paclitaxel-Partikel durch Beschallung einer Suspension aus Paclitaxel in Wasser gewonnen, bis alle Partikel kleiner als 10 μm waren.
Paclitaxel-Partikel, die kleiner als 10 μm sind, können auch durch Fällen von Paclitaxel aus einer Paclitaxel-Lösung in Ethanol gewonnen werden, indem Wasser hinzugefügt wird, bis eine wolkige Suspension erhalten wird. Wahlweise kann die Paclitaxel-Lösung während der Wasserzugabe beschallt werden, bis eine wolkige Suspension erhalten wird. Die entstehende Suspension wird dann gefiltert und getrocknet, um reine Paclitaxel-Partikel im gewünschten Größenbereich zu gewinnen.
Feine Paclitaxel-Partikel wurden durch Sprühtrocknen einer Lösung von Paclitaxel in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel, wie Ethanol, hergestellt. Die Lösung wurde durch eine Ultraschalldüse geleitet, die Tröpfchen aus Ethanol bildete, das Paclitaxel enthielt. Indem das Ethanol im Sprühtrockner verdampfte, wurden feine Paclitaxel-Partikel gewonnen. Die Partikelgröße kann variiert werden durch Änderung der Konzentration von Paclitaxel im Ethanol, durch Anpassung der Fließgeschwindigkeit der Flüssigkeit durch die Düse und durch die Stärke der Beschallung.

Claims

Zusammensetzung zur In-vivo-Verabreichung einer biologischen Substanz, – wobei die biologische Substanz ausgewählt ist aus: – einem Feststoff, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, – einer Flüssigkeit, dispergiert in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel, das im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, oder – Kombinationen der beiden, – wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 μm ist, – wobei die polymere Hülle ein biokompatibles Material umfasst, das im Wesentlichen durch Disulfidbindungen vernetzt ist, und – wobei die polymere Hülle wahlweise durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das Mittel wahlweise mit der polymeren Hülle durch eine optionale kovalente Bindung verbunden ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die biologische Substanz ausgewählt ist aus einem pharmazeutisch aktiven Mittel, einem Diagnosemittel oder einem Mittel mit Ernährungswert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das pharmazeutisch aktive Mittel ausgewählt ist aus analgetischen Mitteln, Betäubungsmitteln, Antiasthmatika, Antibiotika, Antidepressiva, Antidiabetika, Antimykotika, Blutdruck senkenden Mittein, entzündungshemmenden Mitteln, antineoplastischen Mitteln, anxiolytischen Mitteln, enzymatisch aktiven Mitteln, Nukfeinsäurekonstrukten, immunstimulierenden Mitteln, immunsuppressiven Mitteln oder Vakzinen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei die antineoplastischen Mittel Paclitaxel, Paclitaxel-Analoga, Taxane oder Taxotere sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, wobei das pharmazeutisch aktive Mittel ein Nukleinsäurekonstrukt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das Diagnosemittel ausgewählt ist aus Ultraschall-Kontrastmitteln, Radiokontrastmitteln oder Magnetkontrastmitteln.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das Magnetkontrastmittel ein Fluor enthaltendes bildgebendes Magnetresonanz-Mittel ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Fluor enthaltende bildgebende Magnetresonanz-Mittel ausgewählt ist aus: (a) C_xF_2x+y-zA_z, wobei: x = 1 – 30, y = 2; oder 0 oder –2, wenn x ≥ 2; oder –4 wenn x ≥ 4, z = jede ganze Zahl von 0 bis (2x+y-1), und A ausgewählt ist aus N, anderen Halogenen als F, -OR, wobei R = H, Alkyl, Fluoroalkenyl, Alkynyl, Fluoroalkynyl,Fluoroalkyl, Alkenyl, Aryl, Fluoroaryl, Alkanoyl, Fluoroalkanoyl, Alkenoyl, Fluoroalkenoyl, Alkynoyl, Fluoroalkynoyl,
x, z, A und R wie oben definiert sind, y'= +1; oder –1 oder –3, wenn x ≥ 2; oder –5 wenn x ≥ 4, J = O, S, N, P, Al oder Si, a = 1, 2, 3 oder 4, und b = 2 für ein zweiwertiges J oder 3 für ein dreiwertiges J, 4 für ein vierwertiges J, (c) A'-[(CF₂)_x-O]_c-A", wobei: x wie oben definiert ist, A' ausgewählt ist aus N, Halogenen, -CN, -OR, wobei R = H, Alkyl, Fluoroalkyl, Alkenyl, Fluoroalkenyl, Alkynyl, Fluoroalkynyl, Aryl, Fluoroaryl, Alkanoyl, Fluoroalkanoyl, Alkenoyl, Fluoroalkenoyl, Alkynoyl, Fluoroalkynoyl, A" ausgewählt ist aus H oder R, wobei R wie oben definiert ist, c = 1 – 200, vorzugsweise 2–50, oder
x wie oben definiert ist, und c' = 2 – 20, wie auch Mischungen von beliebigen zwei oder mehr davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Diagnosemittel fähig ist, sich auf Grund von Änderungen in der lokalen Sauerstoff-Konzentration einer Änderung im Entspannungsgrad zu unterziehen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, wobei das Diagnosemittel fähig ist, sich im Temperaturbereich von etwa 22 bis 55°C einem Übergang von der festen in die flüssige Phase zu unterziehen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das Mittel mit Ernährungswert ausgewählt ist aus Aminosäuren, Proteinen, Nukleinsäuren, Zuckern, Kohlenwasserstoffen, lipid-löslichen Vitaminen, Lipiden oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das pharmakologisch aktive Mittel innerhalb der Hülle in einem biokompatiblen Dispergierungsmittel gelöst oder suspendiert ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das biokompatible Dispergierungsmittel ausgewählt ist aus Sojaöl, Kokosöl, Olivenöl, Safloröl, Baumwollsamenöl, aliphatischen, zykloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen mit 4–30 Kohlenstoffatomen, aliphatischen oder aromatischen Alkoholen mit 2–30 Kohlenstoffatomen, aliphatischen oder aromatischen Estern mit 2–30 Kohlenstoffatomen, Alkyl, Aryl oder zyklischen Ethern mit 2–30 Kohlenstoffatomen, Alkyl- oder Arylhalogeniden mit 1–30 Kohlenstoffatomen, wahlweise mit mehr als einem Halogen-Substituenten, Ketonen mit 3–30 Kohlenstoffatomen, Polyalkylenglykol oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, wobei das pharmakologisch aktive Mittel innerhalb der Hülle rein enthalten ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das vernetzte Polymer ein natürlich vorkommendes Polymer, ein synthetisches Polymer oder eine Verbindung davon ist, wobei das Polymer vor der Vernetzung kovalent daran gebundene Sulfhydrylgruppen oder Disulfid-Verbindungen aufweist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das natürlich vorkommende Polymer ausgewählt ist aus Proteinen, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Polypeptiden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Lipiden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Polynukleinsäuren, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, oder aus Polysacchariden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei das Protein aus Hämoglobin, Myoglobin, Albumin, Insulin, Lysozym, Immunglobulinen, α-2-Makroglobulin, Fibronektin, Vitronektin, Fibrinogen oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon ausgewählt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Protein Albumin ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Protein Hämoglobin ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17, wobei das Protein eine Kombination aus Albumin und Hämoglobin ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 16, wobei die Polysaccharide ausgewählt sind aus Alginat, Alginaten mit hohem M-Anteil, Polymannuronsäure, Polymannuronaten, Hyaluronsäure, Hyaluronat, Heparin, Dextran, Chitosan, Chitin, Cellulose, Stärke, Glykogen, Guarmehl, Johannisbrotgummi, Dextran, Levan, Inulin, Cyklodextran, Agarose, Xanthanlösung, Karageenen, Heparin, Pektin, Gellangummi, Skleroglukan oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, wobei das synthetische Polymer ausgewählt ist aus synthetischen Polyaminosäuren, die Cystein-Reste und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus synthetischen Polypeptiden, die Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen enthalten, aus Polyvinylalkohol, der modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyhydroxyethylmethacrylat, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyacrylsäure, die modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyethyloxazolin, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyacrylamid, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyvinylpyrrolidinon, das modifiziert wurde, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, aus Polyalkylenglykolen, die modifiziert wurden, um freie Sulfhydrylgruppen und/oder Disulfidgruppen zu enthalten, wie auch aus Mischungen von beliebigen zwei oder mehr davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Disulfidbindungen in dem vernetzten Polymer durch Ultraschallbeschallung gebildet sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerhülle, die eine biologische Substanz enthält, in einem biokompatiblen Medium suspendiert ist, und wobei das biokompatible Medium ausgewählt ist aus Wasser, gepufferten wässrigen Medien, Salzlösung, gepufferter Salzlösung, Lösungen aus Aminosäuren, Proteinlösungen, Zuckerlösungen, Vitaminlösungen, Kohlenwasserstofflösungen, Lösungen aus synthetischen Polymeren, lipidhaltigen Emulsionen oder Kombinationen von beliebigen zwei oder mehr davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Polymerhülle durch ein geeignetes Mittel modifiziert ist, wobei das geeignete Mittel ausgewählt ist aus einem synthetischen Polymer, Phospholipid, einem Protein, einem Polysaccharid, einem oberflächenwirksamen Mittel, einem chemischen Modifikationsmittel oder einer Kombination daraus, wobei das Mittel mit der Polymerhülle durch eine optionale kovalente Verbindung verbunden ist.
Verfahren zur Zubereitung einer biologischen Substanz zur In-vivo-Verabreichung, wobei das Verfahren umfasst, dass ein wässriges Medium, das biokompatibles Material, das durch Disulfidbindungen vernetzt werden kann, und eine biologische Substanz enthält, Ultraschall-Bedingungen hoher Intensität für eine Zeit, die ausreicht, das biokompatible Material durch im Wesentlichen Disulfidbindungen zu vernetzen, ausgesetzt wird; – wobei die biologische Substanz im Wesentlichen vollständig in einer polymeren Hülle enthalten ist, – wobei die größte Querschnittsabmessung der Hülle nicht größer als 10 μm ist, und – wobei die biologische Substanz ein Feststoff oder eine in einem nichtwässrigen biokompatiblen Dispergierungsmittel dispergierte Flüssigkeit ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung biologischer Substanzen an einen Patienten, wobei das Medikament eine wirksame Menge der Zusammensetzung enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 25 zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung biologischer Substanzen an einen Patienten, wobei das Medikament eine wirksame Menge der Zusammensetzung enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 zur Herstellung eines Medikaments zur In-vivo-Gewinnung von Magnetresonanz-Bildern.
Zusammensetzung zur In-vivo-Verabreichung von Paclitaxel, wobei ein wasserunlösliches Paclitaxel-Derivat in einer biokompatiblen Flüssigkeit suspendiert ist, und wobei die entstehende Suspension Partikel von Paclitaxel enthält, die eine Querschnittsabmessung von nicht größer als 10 μm aufweisen.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 30, wobei Paclitaxel und geeignetes Medium Ultraschallbeschallung- oder Mahlbedingungen für eine Zeit ausgesetzt werden, die ausreicht, Partikel mit einer maximalen Querschnittsabmessung von nicht größer als 10 μm herzustellen.