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Hintergrund
der Erfindung
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Da
die genetische Information durch die Sequenz der vier DNS-Bausteine
Desoxyadenosin- (dpA), Desoxyguanosin- (dpG), Desoxycytidin- (dpC)
und Desoxythymidin-5'-phosphat
(dpT) repräsentiert
ist, ist DNS-Sequenzierung eine der grundlegendsten Technologien
in der Molekularbiologie und in den Lebenswissenschaften im Allgemeinen.
Die Leichtigkeit und die Geschwindigkeit, mit der DNS-Sequenzen
erhalten werden können,
beeinflusst stark darauf bezogene Technologien wie z. B. die Entwicklung
und Herstellung neuer therapeutischer Mittel und neuer und nützlicher
Varietäten
von Pflanzen und Mikroorganismen durch rekombinante DNS-Technologie.
Insbesondere hilft die Enträtselung
der DNS-Sequenz
beim Verständnis
menschlicher pathologischer Zustände,
einschließlich
genetischer Erkrankungen, Krebs und AIDS. In einigen Fällen können sehr
feine Unterschiede wie z. B. eine Deletion, Hinzufügung oder
Substitution eines Nukleotids schwere, in einigen Fällen sogar
fatale Konsequenzen schaffen. Vor kurzem wurde DNS-Sequenzierung
die Kerntechnologie des Humanen Genomsequenzierungsprojektes (z.
B. J. E. Bishop und M. Waldholz, 1991, Genome: The Story of the
Most Astonishing Scientific Adventure of Our Time – The Attempt
to Map All the Genes in the Human Body, Simon & Schuster, New York). Die Kenntnis
der vollständigen
humanen genomischen DNS-Sequenz hilft sicherlich, menschliche Krankheiten
zu verstehen, zu diagnostizieren, ihnen vorzubeugen und sie zu behandeln.
Um in der Lage zu sein, die Bestimmung der etwa 3 Milliarden Basenpaare
des menschlichem Genoms in einem vernünftigen Zeitrahmen und auf ökonomische
Weise in Angriff zu nehmen, müssen schnelle,
zuverlässige,
empfindliche und billige Methoden entwickelt werden, die ebenso
die Möglichkeit
zur Automation eröffnen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine solche Technologie bereit.
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Neuere
Zusammenfassungen der heutigen Methoden zusammen mit zukünftigen
Richtungen und Trends wurden von Barrell (The FASEB Journal 5, 40–45 (1991))
und Trainor (Anal. Chem. 62. 418–26, (1990)) verfasst.
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Gegenwärtig wird
DNS-Sequenzierung entweder durch das chemische Abbauverfahren von
Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology 65, 499–560 (1980)) oder durch das
enzymatische Didesoxynukleotid-Terminationsverfahren von Sanger
et al. (Proc., Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–67 (1977)) durchgeführt. Im chemischen
Verfahren führen
basenspezifische Modifikationen zu einer basenspezifischen Spaltung
des radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierten DNS-Fragments. Mit den vier getrennten basenspezifischen
Spaltungsreaktionen werden vier Sätze verschachtelter Fragmente
hergestellt, die nach der Länge
durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt werden. Nach
Autoradiographie kann die Sequenz direkt gelesen werden, da jedes
Band (Fragment) im Gel aus einem basenspezifischen Spaltungsereignis
herrührt.
Daher werden die Fragmentlängen
der vier "Leitern" direkt in eine spezifische
Position in der DNS-Sequenz übersetzt.
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Im
enzymatischen Kettenterminationsverfahren werden die vier basenspezifischen
Sätze von DNS-Fragmenten
gebildet, indem mit einem Primer/Template-System begonnen wird,
das den Primer in die unbekannte DNS-Sequenzregion verlängert und dabei das Template
kopiert und einen komplementären Strang
in Anwesenheit von kettenterminierenden Reagenzien durch DNS-Polymerasen
synthetisiert, wie z. B. durch das Klenow-Fragment von E. coli-DNS-Polymerase I,
eine DNS-Polymerase aus Thermus aquaticus, Taq-DNS-Polymerase oder eine
modifizierte T7-DNS-Polymerase, Sequenase (Tabor et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, 4767–4771
(1987)). Hier wird das kettenterminierende Ereignis durch Einschließen von
nur einem der kettenterminierenden Didesoxynukleosidtriphosphate
ddATP, ddGTP, ddTTP bzw. ddCTP in einer begrenzten kleinen Konzentration
in die vier getrennten Reaktionsmischungen zusätzlich zu den vier normalen Desoxynukleosidtriphosphaten
dATP, dGTP, dTTP und dCTP erreicht. Die vier Sätze der resultierenden Fragmente
bilden nach Elektrophorese vier basenspezifische Leitern, aus denen
die DNS-Sequenz bestimmt werden kann.
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Eine
neuere Modifikation der Sequenzierungsstrategie nach Sanger involviert
den Abbau von Phosphorthioat enthaltenden DNS-Fragmenten, die durch
Verwendung von alpha-Thio-dNTP anstatt der normalerweise verwendeten
ddNTPs während
der durch eine DNS-Polymerase vermittelten Primerverlängerungsreaktion
erhalten werden (Labeit et al., DNA 5, 173–177 (1986); Amersham, PCT-Anmeldung
GB86/00349; Eckstein et al., Nucleic Acids Res, 16, 9947 (1988)).
Hier werden die vier Sätze
basenspezifischer Sequenzierungsleitern durch beschränkten Verdau
mit Exonuklease III oder Schlangengiftphosphodiesterase, durch nachfolgende
Trennung auf PAGE und Sichtbarmachung durch Radioisotopenmarkierung
von entweder dem Primer oder von einem der dNTPs erhalten. In einer
weiteren Modifikation wird die basenspezifische Spaltung durch Alkylieren
des Schwefelatoms in der modifizierten Phosphodiesterbindung, gefolgt
von einer Wärmebehandlung,
erzielt (Max-Planck-Gesellschaft
DE 39 30 312 A1 ). Beide Methoden können mit
der Amplifizierung der DNS durch die Polymerasekettenreaktion (polymerase
chain reaction, PCR) kombiniert werden.
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Im
Voraus muss die DNS, die sequenziert werden soll, in sequenzierbare
Stücke
von gegenwärtig nicht
mehr als 500 bis 1000 Nukleotiden fragmentiert werden. Ausgehend
von einem Genom ist dies ein Mehrschrittverfahren, das Klonierungs-
und Subklonierungsschritte involviert, die verschiedene und passende
Klonierungsvektoren verwenden, wie z. B. YAC, Cosmide, Plasmide
und M13-Vektoren
(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989)). Schließlich werden zum Sequenzieren
nach Sanger die Fragmente von etwa 500 bis 1000 Basenpaaren in eine
spezifische Restriktionsstelle der replikativen Form I (RF I) eines
Derivats des M13-Bakteriophagen
(Viera und Messing, Gene 19, 259 (1982)) integriert, und dann wird
die doppelsträngige
Form in die einzelsträngige
zirkuläre
Form transformiert, die als Template für das Sequenzierungsverfahren
nach Sanger dient, die eine Bindungsstelle für einen durch chemische DNS-Synthese
(Sinha, Biernat, McManus und Köster,
Nucleic Acids Res. 12, 4539–57
(1984); US-Patent Nr. 4725677) erhaltenen universellen Primer stromaufwärts der
Restriktionsstelle hat, in die das unbekannte DNS-Fragment inseriert
ist. Unter spezifischen Bedingungen können unbekannte DNS-Sequenzen, die
in doppelsträngige
superspiralisierte Plasmid-DNS integriert sind, direkt durch das
Sanger-Verfahren sequenziert werden (Chen und Seeburg, DNA 4, 165–170 (1985)
und Lim et al., Gene Anal. Techn. 5, 32–39 (1988)), und mit der Polymerasekettenreaktion
(PCR)(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Hrsg.
Innis et al., Academic Press, San Diego (1990)) könnten Klonierungs-
oder Subklonierungsschritte durch direktes Sequenzieren von chromosomaler
DNS weggelassen werden, indem erst die DNS-Segmente durch PCR amplifiziert
werden und dann das Sequenzierungsverfahren nach Sanger angewendet
wird (Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9436–9440 (1988)).
In diesem Falle muss jedoch die DNS-Sequenz in der interessierenden
Region wenigstens soweit bekannt sein, dass sie an den Sequenzierungsprimer
bindet.
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Um
fähig zu
sein, die Sequenz von der PAGE zu lesen, müssen detektierbare Markierungen
in entweder dem Primer (sehr oft am 5'-Ende) oder in einem der Desoxynukleosidtriphosphate
dNTP verwendet werden. Die Verwendung von Radioisotopen wie z. B. 32P, 33P oder 35S ist nach wie vor die am häufigsten
verwendete Technik. Nach PAGE werden die Gele mit einem Röntgenfilm
exponiert, und die Silberkornexposition wird analysiert. Die Verwendung
von Radioisotopenmarkierungen schafft mehrere Probleme. Die meisten
Markierungen, die für
autoradiographische Detektion von Sequenzierungsfragmenten verwendbar
sind, haben relativ kurze Halbwertszeiten, was die brauchbare Zeit
der Markierungen beschränken
kann. Die Emission hochenergetischer beta-Strahlung, insbesondere
von 32P, kann zum Abbau der Produkte durch
Radiolyse führen;
so dass die Probe sehr schnell nach der Markierung verwendet werden
sollte. Des Weiteren kann hochenergetische Strahlung ebenso eine
Zerstörung
der Bandenschärfe
durch Streuung verursachen. Einige dieser Probleme können durch
Verwendung von weniger energetischen Isotopen reduziert werden,
wie z. B. 33P oder 35S (siehe
z. B. Ornstein et al., Biotechniques 3, 476 (1985)), hier müssen jedoch
längere
Expositionszeiten toleriert werden. Vor allem wirft die Verwendung
von Radioisotopen signifikante Gesundheitsrisiken für den Experimentator
auf, und in großen
Sequenzierungsprojekten sind Dekontaminierung und Handhabung des
radioaktiven Mülls
andere schwerwiegende Probleme und Lasten.
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Als
Antwort auf die oben erwähnten
Probleme, die sich auf die Verwendung von radioaktiven Markierungen
beziehen, wurden nichtradioaktive Markierungstechniken erprobt und
in den vergangenen Jahren in teilweise automatisierte DNS-Sequenzierungsverfahren
integriert. All diese Verbesserungen verwenden die Sequenzierungsstrategie
nach Sanger. Die Fluoreszenzmarkierung kann an den Primer (Smith
et al., Nature 321, 674–679
(1986) und EPO-Patent Nr.
EP
0233053 , Du Pont De Nemours EPO-Anmeldung Nr. 0359225; Ansorge
et al., J. Biochem. Biophys. Methods 13, 325–32 (1986)) oder an die kettenterminierenden
Didesoxynukleosidtriphosphate (Prober et al. Science 238, 336–41 (1987);
Applied Biosystems, PCT-Anmeldung WO 91/05060) angehängt werden.
Basierend auf entweder der Markierung des Primers oder des ddNTPs
wurden Systeme von Applied Biosystems (Smith et al., Science 235,
G89 (1987); US-Patente Nr. 570973 und 689013), Du Pont De Nemours
(Prober et al. Science 238, 336–341
(1987); US-Patente
Nr. 881372 und 57566), Pharmacia-LKB (Ansorge et al. Nucleic Acids
Res. 15, 4593–4602
(1987) und EMBL Patentanmeldung DE P3724442 und P3805808.1) und
Hitachi (JP 1-90844 und
DE
40 11 991 A1 ) entwickelt. Ein etwas ähnlicher Ansatz wurde von Brumbaugh
et al. (Proc. Natl. Sci. USA 85, 5610–14 (1988) und US-Patent Nr.
4,729,947) entwickelt. Ein verbessertes Verfahren für das Du
Pont-System ist beschrieben, welches zwei elektrophoretische Spuren
mit zwei verschiedenen spezifischen Markierungen pro Spur verwendet
(PCT-Anmeldung WO 92/02635). Ein anderer Ansatz verwendet fluoreszenzmarkiertes
Avidin und biotinmarkierte Primer. Hier reagieren die Sequenzierungsleitern,
die mit Biotin enden, während
der Elektrophorese mit dem markierten Avidin, was zur Detektion
individueller Sequenzierungsbanden führt (Brumbaugh et al., US-Patent
Nr. 594676).
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Vor
kürzester
Zeit wurden noch empfindlichere nichtradioaktive Markierungstechniken
für DNS
entwickelt, die Chemilumineszenz verwenden, die durch Enzyme triggerbar
und amplifizierbar ist (Beck, O'Keefe, Coull
und Köster,
Nucleic Acids Res. 17, 5115–5123
(1989) und Beck und Köster,
Anal. Chem. 62, 2258–2270 (1990)).
Diese Markierungsverfahren wurden mit Multiplex-DNS-Sequenzierung kombiniert
(Church et al. Science 240, 185–188
(1988), um eine Strategie bereitzustellen, die auf Hochdurchsatz-DNS-Sequenzierung
zielt (Köster
et al., Nucleic Acids Res. Symposium Ser. Nr. 24, 318–321 (1991),
University of Utah, PCT-Anmeldung Nr. WO 90/15883); diese Strategie
leidet noch am Nachteil, dass sie sehr arbeitsaufwendig und schwer
zu automatisieren ist.
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Als
Versuch, die DNS-Sequenzierung zu vereinfachen, wurden feste Träger eingeführt. In
den meisten bisher publizierten Fällen wird der Templatestrang
zur Sequenzierung (mit oder ohne PCR-Amplifizierung) auf einem festen
Träger
immobilisiert, wobei am häufigsten
die starke Biotin-Avidin/Streptavidin-Wechselwirkung verwendet wird (Orion-Yhtymä Oy, US-Patent
Nr. 277643; M. Uhlen et al. Nucleic Acids Res. 16, 3025–38 (1988);
Cemu Bioteknik, PCT-Anmeldung Nr. WO 89/09282 und Medical Research
Council, GB, PCT-Anmeldung Nr. WO 92/03575). Die Primerverlängerungsprodukte,
die auf dem immobilisierten Templatestrang synthetisiert werden,
werden von Enzymen, anderen Sequenzierungsreagenzien und Nebenprodukten
durch einen Waschschritt gereinigt und dann unter denaturierenden
Bedingungen durch Lösen
der Wasserstoffbindungen zwischen den Watson-Crick-Basenpaaren freigesetzt
und einer PAGE-Trennung unterzogen. In einem anderen Ansatz werden
die Primerverlängerungsprodukte
(nicht das Template) aus der DNS-Sequenzierungsreaktion
an einen festen Träger über Biotin/Avidin
gebunden (Du Pont De Nemours, PCT-Anmeldung WO 91/11533). Im Gegensatz
zu den oben erwähnten
Verfahren wird hier die Wechselwirkung zwischen Biotin und Avidin
durch Verwenden denaturierender Bedingungen (Formamid/EDTA) überwunden,
um die Primerverlängerungsprodukte
der Sequenzierungsreaktion vom festen Träger zur PAGE-Trennung freizusetzen.
Als feste Träger
werden Kügelchen
(z. B. magnetische Kügelchen
(Dynabeads) und Sepharose-Kügelchen),
Filter, Kapillaren, Plastikstäbchen
(z. B. Polystyrrolstreifen) und Mikrotiterlöcher vorgeschlagen.
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Alle
soweit diskutierten Verfahren haben einen zentralen Schritt gemeinsam:
Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE). In vielen Fällen stellt
dies ein hauptsächliches
Hindernis und eine hauptsächliche
Beschränkung
für jede
dieser Verfahren dar. Die Herstellung eines homogenen Gels durch
Polymerisierung, Laden der Proben, die Elektrophorese selbst, die
Detektion des Sequenzierungsmusters (z. B. durch Autoradiographie), Entfernen
des Gels und Saubermachen der Glasplatten, um ein anderes Gel herzustellen,
sind sehr arbeitsaufwendige und zeitraubende Verfahren. Überdies
ist das ganze Verfahren fehleranfällig, schwer zu automatisieren,
und es wird ein ausgebildetes und geübtes Personal benötigt, um
die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit zu verbessern. Im
Falle einer radioaktiven Markierung kann die Autoradiographie selbst
von Stunden bis Tagen dauern. Im Falle einer Fluoreszenzmarkierung
kann wenigstens die Detektion der Sequenzierungsbanden automatisch
durchgeführt
werden, wenn Vorrichtungen zum Laserscannen verwendet werden, die
in kommerziell verfügbare
DNS-Sequenzierer integriert sind. Ein Problem, das mit der Fluoreszenzmarkierung verbunden
ist, ist der Einfluss der vier verschiedenen basenspezifischen Fluoreszenz-Tags
auf die Mobilität der
Fragmente während
der Elektrophorese und eine mögliche Überlappung
bei der spektralen Bandbreite der vier spezifischen Farbstoffe,
was die Unterscheidungskraft zwischen benachbarten Banden reduziert
und dadurch die Wahrscheinlichkeit von Sequenzunklarheiten erhöht. Artefakte
werden ebenso durch basenspezifische Wechselwirkungen mit der Polyacrylamidgelmatrix
(Frank und Köster,
Nucleic Acids Res. 6, 2069 (1979)) und durch die Bildung von Sekundärstrukturen
produziert, was zu "Bandenkompressionen" führt und
es daher nicht erlaubt, die Sequenz zu lesen. Dieses Problem wurde
teilweise durch Verwendung von 7-Desazadesoxyguanosintriphosphaten
(Barr et al., Biotechniques 4, 428 (1986)) überwunden. Jedoch werden die
Gründe für einige
Artefakte und auffallende Banden noch untersucht und bedürfen weiterer
Verbesserung des gelelektrophoretischen Verfahrens.
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Eine
neuere Innovation bei der Elektrophorese ist die Kapillarzonenelektrophorese
(capillary zone electrophoresis, CZE)(Jorgenson et al., J. Chromatography
352, 337 (1986); Gesteland et al., Nucleic Acids Res. 18, 1415–1419 (1990)),
die im Vergleich mit der Schichtgelelektrophorese (PAGE) die Auflösung der Trennung
signifikant erhöht,
die Zeit für
einen elektrophoretischen Lauf reduziert und die Analyse sehr kleiner Proben
erlaubt. Hier entstehen jedoch andere Probleme aufgrund der Miniaturisierung
des ganzen Systems, wie z. B. Wandeffekte und die Notwendigkeit
eines hochempfindlichen Online-Detektionsverfahrens.
Verglichen mit PAGE wird ein anderes Hindernis durch die Tatsache
geschaffen, dass CZE nur ein "Einspur"-Verfahren ist, während PAGE
Proben in vielen Spuren simultan elektrophoretisiert werden können.
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Aufgrund
der schweren Beschränkungen
und Probleme in Bezug auf PAGE als ein integraler und zentraler
Teil des Standard-DNS-Sequenzierungsprotokolls wurden mehrere Verfahren
vorgeschlagen, DNS-Sequenzierung ohne einen elektrophoretischen
Schritt zu machen. Ein Ansatz erfordert Hybridisierung oder Fragmentierungssequenzierung
(Bains, Biotechnology 10, 757–58
(1992) und Mirzabekov et al., FEBS Letters 256, 118–122 (1989)),
wobei die spezifische Hybridisierung bekannter kurzer Oligonukleotide
(z. B. Octadesoxynukleotide, die 65.536 verschiedene Sequenzen ergeben)
an eine komplementäre
DNS-Sequenz verwendet wird. Eine positive Hybridisierung enthüllt eine
kurze Strecke der unbekannten Sequenz. Wiederholen dieses Verfahrens
durch Ausführen
von Hybridisierungen mit allen möglichen
Octadesoxynukleotiden sollte theoretisch die Sequenz bestimmen.
In einem vollständig
anderen Ansatz wird eine schnelle Sequenzierung von DNS durch unilateralen
Abbau eines einzelnen immobilisierten DNS-Fragments durch eine Exonuklease
in einem sich bewegenden Flussstrom und durch Detektion der abgespaltenen
Nukleotide durch ihren spezifischen Fluoreszenz-Tag durch Laseranregung gemacht (Jett
et al., J. Biomolecular Structure & Dynamics 7, 301–309, (1989); US-Energieministerium,
PCT-Anmeldung Nr. WO 89/03432). In einem anderen von Hyman (Anal.
Biochem. 174, 423–436
(1988)) vorgeschlagenen System wird das Pyrophosphat zum Bestimmen
der DNS-Sequenz verwendet, das erzeugt wird, wenn das korrekte Nukleotid
an die wachsende Kette auf einem Primer-Template-System gebunden
wird. Die verwendeten Enzyme und die DNS werden durch Festphasen (DEAE-Sepharose
und Sepharose) entweder durch ionische Wechselwirkungen oder durch
kovalente Bindung festgehalten. In einem kontinuierlichen Durchflusssystem
wird die Pyrophosphatmenge durch Biolumineszenz (Luciferase) bestimmt.
Ein Syntheseansatz zur DNS-Sequenzierung wird ebenso von Tsien et
al. (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/06678) verwendet. Hier werden die ankommenden
dNTPs am 3'-Ende
durch verschiedene Blockierungsgruppen geschützt, wie z. B. Acetyl- oder
Phosphatgruppen, die vor dem nächsten Verlängerungsschritt
entfernt werden, was dieses Verfahren sehr langsam im Vergleich
mit Standardsequenzierungsverfahren macht. Die Template-DNS wird auf einem
Polymerträger
immobilisiert. Um den Einbau zu detektieren, wird zusätzlich eine
fluoreszierende oder radioaktive Markierung in die modifizierten
dNTPs eingebaut. Dieselbe Patentanmeldung beschreibt ebenso einen
Apparat, der zur Automatisierung des Verfahrens konstruiert ist.
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Massenspektrometrie
stellt im Allgemeinen ein Mittel zum "Wiegen" individueller Moleküle bereit, indem man die Moleküle im Vakuum
ionisiert und man sie durch Volatilisieren "fliegen" lässt.
Unter dem Einfluss von Kombinationen von elektrischen und magnetischen
Feldern folgen die Ionen Trajektorien abhängig von ihrer individuellen
Masse (m) und Ladung (z). Im Bereich von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht
ist Massenspektrometrie seit langem Teil des physikalisch-organischen
Routinerepertoires zur Analyse und Kennzeichnung organischer Moleküle durch
die Bestimmung der Masse des Ions des Ausgangsmoleküls. Des
Weiteren wird durch Einrichten von Kollisionen dieses Ions des Ausgangsmoleküls mit anderen
Partikeln (z. B. Argonatomen) das Ion des Moleküls durch die sogenannte kollisionsinduzierte
Dissoziation (collision induced dissociation, CID) fragmentiert,
wobei Sekundärionen
gebildet werden. Das Fragmentierungsmuster/der Weg erlaubt sehr
oft die Ableitung einer detaillierten strukturellen Information.
Viele Anwendungen von massenspektrometrischen Verfahren sind im
Stand der Technik bekannt, insbesondere in den Biowissenschaften,
und können
in Methods of Enzymology, Band 193: "Mass Spectrometry" (Herausgeber J. A. McCloskey), 1990, Academic
Press, New York) zusammengefasst gefunden werden.
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Aufgrund
der anscheinenden analytischen Vorteile von Massenspektrometrie
bei der Bereitstellung einer hohen Detektionsempfindlichkeit, der
Genauigkeit der Massemessungen, der detaillierten Strukturinformationen
durch CID in Verbindung mit einer MS/MS-Konfiguration und der Geschwindigkeit
als auch einer Online-Datenübertragung
auf einen Computer besteht erhebliches Interesse an der Verwendung
von Massenspektrometrie für
die Strukturanaylse von Nukleinsäuren.
Neuere Übersichtsarbeiten,
die dieses Feld zusammenfassen, schließen K. H. Schram, "Mass Spectrometry
of Nucleic Acid Components, Biomedical Applications of Mass Spectrometry" 34, 203–287 (1990)
und P. F. Crain, "Mass
Spectrometry Techniques in Nucleic Acids Research, "Mass Spectrometry
Reviews 9, 505–554
(1990) ein. Die größte Hürde beim
Anwenden von Massenspektrometrie auf Nukleinsäuren ist die Schwierigkeit,
diese sehr polaren Biopolymere zu volatilisieren. Daher ist "Sequenzierung" auf synthetische
Oligonukleotide mit niedrigem Molekulargewicht beschränkt, indem
die Masse des Ions des Ausgangsmoleküls bestimmt wird und durch
dieses die schon bekannte Sequenz bestätigt wird oder alternativ die
bekannte Sequenz durch die Erzeugung von Sekundärionen (Fragmentionen) über CID in
einer MS/MS-Konfiguration bestätigt
wird, die insbesondere zur Ionisation und Volatilisierung das Verfahren der
schnellen Atombombardierung (fast atomic bombardment, FAB-Massenspektrometrie)
oder Plasmadesorption (PD-Massenspektrometrie) verwendet. Als ein
Beispiel wurde die Anwendung von FAB auf die Analyse von geschützten dimeren
Blöcken
zur chemischen Synthese von Oligodesoxynukleotiden beschrieben (Köster et
al. Biomedical Environmental Mass Spectrometry 14, 111–116 (1987)).
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Zwei
noch neuere Ionisations-/Desorptionstechniken sind Elektrospray/Ionenspray
(ES) und matrixassistierte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI).
ES-Massenspektrometrie wurden durch Fenn et al. eingeführt (J.
Phys. Chem. 88, 4451–59
(1984); PCT-Anmeldung Nr. WO 90/14148), und gegenwärtige Anwendungen sind
in neueren Übersichtsartikeln
zusammengefasst (R. D. Smith et al., Anal. Chem. 62, 882–89 (1990)
und B. Ardrey, Electrospray Mass Spectrometry, Spectroscopy Europe,
4, 10–18
(1992)). Die Molekulargewichte des Tetradecanukleotids d(CATGCCATGGCATG)(SEQ
ID NO: 1)(Covey et al. "The
Determination of Protein, Oligonukleotide and Peptide Molecular
Weights by Ionspray Mass Spectrometry, "Rapid Communications in Mass Spectrometry,
2, 249–256
(1988)), des 21mers d(AAATTGTGCACATCCTGCAGC)(SEQ ID NO: 2) und einer
tRNS mit 76 Nukleotiden ohne Angabe von Einzelheiten (Methods in
Enzymology, 193, "Mass
Spectrometry" (Herausgeber
McCloskey), Seite 425, 1990, Academic Press, New York) wurden publiziert.
Als Massenanalysator wird am häufigsten
ein Quadrupol verwendet. Die Bestimmung von Molekulargewichten in
femtomolaren Probenmengen ist aufgrund der Anwesenheit von vielen
Ionenpeaks sehr genau, die alle für die Massenberechnung verwendet
werden könnten.
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MALDI-Massenspektrometrie
kann im Gegensatz besonders attraktiv sein, wenn eine Flugzeit-(time-of-flight,
TOF)-Konfiguration als Massenanalysator verwendet wird. Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurde
durch Hillenkamp et al. eingeführt
("Matrix Assisted
UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry
of Large Biomolecules",
Biological Mass Spectrometry (Herausgeber Burlingame und McCloskey),
Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Seiten 49–60, 1990).
Da in den meisten Fällen
keine mehrfachen molekularen Ionenpeaks mit dieser Technik produziert
werden, sehen die Massenspektren im Vergleich zur ES-Massenspektrometrie
im Prinzip einfacher aus. Obwohl DNS-Moleküle mit einem Molekulargewicht
von bis zu 410.000 Dalton desorbiert und volatilisiert werden könnten (Williams
et al. "Volatilization
of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen
Aqueous Solutions",
Science, 246, 1585–87 (1989)),
wurde diese Technik bis jetzt nur verwendet, um die Molekulargewichte
relativ kleiner Oligonukleotide mit bekannter Sequenz zu bestimmen,
z. B. von Oligothymidylsäuren
mit bis zu 18 Nukleotiden (Huth-Fehre et al., "Matrix-Assisted Laser Desorption Mass
Spectrometry of Oligodeoxythymidylic Acids," Rapid Communications in Mass Spectrometry,
6, 209–13
(1992)) und von einer doppelsträngigen
DNS mit 28 Basenpaaren (Williams et al., "Time-of-Flight Mass Spectrometry of
Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous
Matrix," Rapid Communications
in Mass Spectrometry, 4, 348–351
(1990)). In einer Veröffentlichung
(Huth-Fehre et al., 1992, supra) wurde gezeigt, dass eine Mischung
aller Oligothymidylsäuren
mit von n = 12 bis n = 18 Nukleotiden aufgelöst werden konnte.
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In
US-Patent Nr. 5,064,754 werden RNS-Transkripte hergestellt, die
mit DNS verlängert
sind und die beide zu der zu sequenzierenden DNS komplementär sind,
indem NTPs, dNTPs und als terminierende Nukleotide ddNTPs eingebaut
werden, die an der 5'-Position
der Zuckergruppe mit einer Kombination der Isotope 12C, 13C, 14C, 1H, 2H, 3H, 16O, 17O und 18O substituiert sind. Die erhaltenen Polynukleotide
werden zu 3'-Nukleotiden
abgebaut, an der N-glycosidischen Bindung gespalten, und die isotopenmarkierte
5'-Funktionalität wird durch
Periodat-Oxidation entfernt, und die resultierende Formaldehydspezies
wird durch Massenspektrometrie bestimmt. Eine spezifische Kombination
von Isotopen dient dazu, basenspezifisch zwischen internen Nukleotiden,
die aus dem Einbau von NTPs und dNTPs herrühren, und terminalen Nukleotiden,
die durch Verbinden von ddNTPs an das Ende der Polynukleotidkette
verursacht werden, zu unterscheiden. Eine Serie von RNS/DNS-Fragmenten wird hergestellt
und in einer Ausführungsform
durch Elektrophorese getrennt, und mit Hilfe des sogenannten Matrixanalyseverfahrens
wird die Sequenz abgeleitet.
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Im
japanischen Patent Nr. 59-131909 wird ein Instrument beschrieben,
das Nukleinsäurefragmente detektiert,
die entweder durch Elektrophorese, Flüssigkeitschromatographie oder
Hochgeschwindigkeitsgelfiltration getrennt werden. Eine massenspektrometrische
Detektion wird durch Einbauen von Atomen in die Nukleinsäuren erzielt,
die normalerweise nicht in DNS auftreten, wie z. B. S, Br, I oder
Ag, Au, Pt, Os, Hg. Das Verfahren wird jedoch nicht auf Sequenzierung
von DNS unter Verwendung des Verfahrens nach Sanger angewendet.
Insbesondere schlägt
es keine basenspezifische Korrelation derartiger Elemente mit einem
individuellen ddNTP vor.
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Die
PCT-Anmeldung Nr. WO 89/12694 (Brennan et al., Proc. SPIE-Int. Soc.
Opt. Eng. 1206, (New Technol. Cytom. Mol. Biol.), Seiten 60–77 (1990);
und Brennan, US-Patent Nr. 5,003,059) verwendet die Methodologie
nach Sanger zur DNS-Sequenzierung durch Verwendung einer Kombination
von entweder den vier stabilen Isotopen 32S, 33S, 34S, 36S oder 35Cl, 37Cl, 79Br, 81B, um die kettenterminierenden ddNTPs spezifisch
zu markieren. Die Schwefelisotope können sich entweder an der Base
oder an der Alphaposition der Triphosphatgruppe befinden, während die
Halogenisotope sich entweder an der Base oder an der 3'-Position des Zuckerringes befinden.
Die Sequenzierungsreaktionsmischungen werden durch eine elektrophoretische
Technik wie z. B. CZE getrennt, in eine Verbrennungseinheit überführt, in
der die Schwefelisotope der eingebauten ddNTPs bei etwa 900°C in einer
Sauerstoffatmosphäre
umgewandelt werden. Das SO2, das mit Massen
von 64, 65, 66 oder 68 erzeugt wird, wird online durch Massenspektrometrie
bestimmt, wobei z. B. als Massenanalysator ein Quadrupol mit einem
Einzelionen-Multiplier verwendet wird, um den Ionenstrom zu detektieren.
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Ein ähnlicher
Ansatz wird in US-Patent Nr. 5,002,868 (Jacobson et al., Proc. SPIE-Int.
Soc. Opt. Eng. 1435, (Opt. Methods Ultrasensitive Detect. Anal.
Tech. Appl.), 26–35
(1991)) vorgeschlagen, wobei Sequenzierung nach Sanger mit vier
ddNTPs, die spezifisch an der Alphaposition der Triphosphatgruppe
mit einem der vier stabilen Schwefelisotope wie oben beschrieben
substituiert sind, und eine nachfolgende Trennung der vier Sätze verschachtelter
Sequenzen durch Röhrengelelektrophorese
verwendet werden. Der einzige Unterschied ist die Verwendung von
Resonanzionisationsspektroskopie (RIS) in Verbindung mit einem magnetischen
Sektormassenanalysator, wie in US-Patent Nr. 4,442,354 offenbart
ist, um die Schwefelisotope zu detektieren, die den spezifischen
Nukleotidterminatoren entsprechen und dadurch die Zuweisung der
DNS-Sequenz erlauben.
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Die
EPO-Patentanmeldungen Nr. 0360676 A1 und 0360677 A1 beschreiben
ebenfalls eine Sequenzierung nach Sanger, wobei stabile Isotopensubstitutionen
in den ddNTPs, wie z. B. D, 13C, 15N, 17O, 18O, 32S, 33S, 34S, 36S, 19F, 35Cl, 37Cl, 79Br, 81Br, und 127I oder funktionelle Gruppen wie z. B.
CF3 oder Si(CH3)3, gemäß der chemischen
Funktionalität
an der Base, dem Zucker oder der Alphaposition der Triphosphatgruppe
verwendet werden. Die Sequenzierungsreaktionsmischungen nach Sanger
werden durch Röhrengelelektrophorese
getrennt. Das Effluat wird durch das Elektrospray/Thermospray-Verneblerverfahren
in ein Aerosol verwandelt und dann durch ein heißes Plasma (7.000 bis 8.000°K) atomisiert
und ionisiert und durch einen einfachen Massenanalysator analysiert.
Es wird ein Instrument vorgeschlagen, das einen in die Lage versetzt,
die Analyse der Sequenzierungsreaktionsmischung nach Sanger zu automatisieren,
das aus einer Röhrenelektrophorese, einem
Vernebler und einem Massenanalysator besteht.
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Die
Anwendung von Massenspektrometrie zum Durchführen von DNS-Sequenzierungen durch
das Hybridisierungs-Fragmentverfahren (siehe oben) wurde kürzlich vorgeschlagen
(Bains, "DNA Sequencing
by Mass Spectrometry: Outline of a Potential Future Application", Chimicaoggi 9,
13–16
(1991)).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur DNS-Sequenzierung.
Die Verbesserungen gegenüber
den existierenden DNS-Sequenzierungstechnologien schließen hohe
Geschwindigkeit, hohen Durchsatz, keine Notwendigkeit für Elektrophorese
(und daher keine Gel-Leseartefakte aufgrund der vollständigen Abwesenheit
eines elektrophoretischen Schritts) und keine teuren Reagenzien
ein, die verschiedene Substitutionen mit stabilen Isotopen involvieren.
Die Erfindung verwendet die Sequenzierungsstrategie nach Sanger
und setzt die Sequenzinformation durch Analyse der verschachtelten
Fragmente zusammen, die durch basenspezifische Kettentermination über ihre
unterschiedlichen Molekularmassen erhalten werden, wobei Massenspektrometrie
verwendet wird, z. B. MALDI- oder ES-Massenspektrometrie. Ein weiterer
Anstieg des Durchsatzes kann erhalten werden, indem Massemodifikationen
im Oligonukleotidprimer, den kettenterminierenden Nukleosidtriphosphaten
und/oder den kettenverlängernden Nukleosidtriphosphaten
eingeführt
werden, als auch indem integrierte Tag-Sequenzen verwendet werden, die Multiplexen
durch Hybridisierung von tagspezifischen Sonden mit massedifferenzierten
Molekulargewichten ermöglichen.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 ist
eine Darstellung des Verfahrens zur Herstellung der Proben, die
durch Massenspektrometrie analysiert werden sollen. Dieses Verfahren
erfordert die Insertion eines DNS-Fragments unbekannter Sequenz
in einen Klonierungsvektor, wie z. B. Derivate von M13, pUC oder
Phagemide, Transformieren der doppelsträngigen Form in die einzelsträngige Form,
Durchführen
der vier Sequenzierungsreaktionen nach Sanger, vorübergehendes
Binden der basenspezifisch terminierten verschachtelten Fragmentfamilie
an einen festen Träger,
Entfernen aller Nebenprodukte durch einen Waschschritt, Konditionieren
der verschachtelten DNS- oder RNS-Fragmente durch z. B. ein Kationenaustausch-
oder Modifizierungsreagenz und entweder direktes Überführen der
immobilisierten verschachtelten Fragmente zur massenspektrometrischen
Analyse oder Abspalten der gereinigten Fragmentfamilie vom Träger und
Abziehen des Spaltungsreagenzes.
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2A zeigt
die Sequenzierungsprodukte nach Sanger eines hypothetischen DNS-Fragments
mit einer Länge
von 50 Nukleotiden (SEQ ID NO: 3) mit einer annähernd gleich balancierten Basenzusammensetzung
unter Verwendung von ddTTP als terminierendem Desoxynukleosidtriphosphat.
Die molekularen Massen der verschiedenen kettenterminierten Fragmente
sind angegeben.
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2B zeigt
ein idealisiertes Massenspektrum von solch einer DNS-Fragmentmischung.
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Die 3A und 3B zeigen
in Analogie zu den 2A und 2B Daten
für dieselbe
Modellsequenz (SEQ ID NO: 3) mit ddATP als Kettenterminator.
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Die 4A und 4B zeigen
Daten analog zu den 2A und 2B, wenn
ddGTP als Kettenterminator für
dieselbe Modellsequenz (SEQ ID NO: 3) verwendet wird.
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Die 5A und 5B veranschaulichen
die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn die Kettentermination
mit ddCTP als Kettenterminator auf ähnliche Weise wie in den 2A und 2B für dieselbe
Modellsequenz (SEQ ID NO: 3) durchgeführt wird.
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6 fasst
die Ergebnisse der 2A bis 5B zusammen,
wobei sie die Korrelation von Molekulargewichten der verschachtelten
vier Fragmentfamilien mit der DNS-Sequenz zeigt (SEQ ID NO: 3).
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Die 7A und 7B veranschaulichen
die allgemeine Struktur von massemodifizierten Sequenzierungsnukleinsäureprimern
oder Tag-Sequenzierungssonden
für entweder
eine DNS- oder RNS-Sequenzierung nach Sanger.
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Die 8A und 8B zeigen
die allgemeine Struktur für
die massemodifizierten Triphosphate für entweder eine DNS- oder RNS-Sequenzierung
nach Sanger. Allgemeine Formeln für die kettenverlängernden und
die kettenterminierenden Nukleosidtriphosphate werden demonstriert.
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9 umreißt beispielhaft
verschiedene Linkerchemien (X) mit entweder Polyethylenglycol oder
endständig
monoalkyliertem Polyethylenglycol (R).
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10 veranschaulicht ähnliche
Linkerchemien, wie in 8A und 8B gezeigt,
und beschreibt verschiedene massemodifizierende Gruppen (R).
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11 umreißt, wie
multiplex-massenspektrometrische Sequenzierung unter Verwendung
der massemodifizierten Nukleinsäureprimer
(UP) arbeiten kann.
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12 zeigt
das Verfahren zur multiplex-massenspektrometrischen Sequenzierung,
das massemodifizierte kettenverlängernde
und/oder terminierende Nukleosidtriphosphate verwendet.
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13 zeigt
eine multiplex-massenspektrometrische Sequenzierung durch Einbeziehen
der Hybridisierung von massemodifizierten Sonden, die für eine Tag-Sequenz
spezifisch sind.
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14 zeigt
ein MALDI-TOF-Spektrum einer Mischung von Oligothymidylsäuren d(pT)12-18.
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15 zeigt
eine Überlagerung
von MALDI-TOF-Spektren des 50mers
d(TAACGGTCATTACGGCCATTGACTGTAGGACCTGCATTACATGACTAGCT)
(SEQ ID NO: 3)(500 fmol) und dT(pdT)99 (500
fmol).
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Die 16A bis 16M zeigen
die MALDI-TOF-Spektren aller 13 DNS-Sequenzen, die die verschachtelten
dT-terminierten Fragmente der DNS-Sequenzierungssimulation nach Sanger
aus 2 darstellen. Jeweils 500 fmol wie folgt: 16A ist ein 7mer; 16B ist
ein 10mer; 16C ist ein 11mer; 16D ist ein 19mer; 16E ist
ein 20mer; 16F ist ein 24mer; 16G ist ein 26mer; 16H ist
ein 33mer; 16I ist ein 37mer; 16J ist ein 38mer; 16K ist
ein 42mer; 16L ist ein 46mer und 16M ist ein 50mer.
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Die 17A und 17B zeigen
die Überlagerung
der Spektren aus 16. Die beiden Tafeln zeigen
zwei verschiedene Maßstäbe und die
Spektren, die bei diesen Maßstäben analysiert
wurden. 17A zeigt die Überlagerung
der Spektren aus 16A bis 16F.
Der Buchstabe über
jedem Peak entspricht den originalen Spektren des Fragments in 16.
Peak B entspricht z. B. 16B,
Peak C entspricht 16C, etc.
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18 zeigt
die überlagerten
MALDI-TOF-Spektren der MALDI-MS-Analyse
von massemodifizierten Oligonukleotiden, wie in Beispiel 21 beschrieben.
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19 veranschaulicht
verschiedene Linkerchemien zwischen dem festen Träger (P)
und dem Nukleinsäureprimer
(NS) durch eine starke elektrostatische Wechselwirkung.
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Die 20A und 20B veranschaulichen
verschiedene Linkerchemien zwischen dem festen Träger (P)
und dem Nukleinsäureprimer
(NS) durch einen Ladungsübertragungskomplex
eines Ladungsübertragungsakzeptors
(A) und eines Ladungsübertragungsdonors
(D).
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21 veranschaulicht verschiedene Linkerchemien
zwischen dem festen Träger
(P) und dem Nukleinsäureprimer
(NS) durch einen stabilen organischen Rest.
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22 veranschaulicht eine mögliche Linkerchemie zwischen
einem festen Träger
(P) und dem Nukleinsäureprimer
(NS) durch Watson-Crick-Basenpaaren.
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23 veranschaulicht ein Verbinden des festen Trägers (P)
und des Nukleinsäureprimers
(NS) durch eine photolytisch spaltbare Bindung.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung beschreibt ein verbessertes Verfahren zur DNS-Sequenzierung.
Insbesondere verwendet die Erfindung Massenspektrometrie, wie z.
B. matrixassistierte Laserdesorptions/Ionisations- (MALDI) oder Elektrospray-
(ES) Massenspektrometrie (MS), um die Sequenzierungsreaktionsmischungen
nach Sanger zu analysieren.
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Bei
Sequenzierung nach Sanger werden vier Familien von kettenterminierten
Fragmenten erhalten. Die Massedifferenz pro zugefügtem Nukleotid
ist 289,19 für
dpC, 313,21 für
dpA, 329,21 für
dpG bzw. 304,2 für
dpT.
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Erfindungsgemäß können die
Molekulargewichte der vier spezifisch terminierten Fragmentfamilien
simultan durch MS bestimmt werden, entweder durch Mischen der Produkte
aller vier Reaktionsläufe
in wenigstens zwei getrennten Reaktionsgefäßen (d. h. alle laufen getrennt,
oder zwei zusammen oder drei zusammen) oder durch Laufenlassen einer
Reaktion, die alle vier kettenterminierenden Nukleotide (d. h. eine
Reaktionsmischung, umfassend dTTP, ddTTP, dATP, ddATP, dCTP, ddCTP,
dGTP, ddGTP) in einem Reaktionsgefäß hat. Durch simultanes Analysieren
aller vier basenspezifisch terminierten Reaktionsprodukte wurden
alle Molekulargewichtswerte tatsächlich
interpoliert. Ein Vergleich der Massedifferenz, die zwischen Fragmenten
mit bekannten Massen für
jedes kettenterminierende Nukleotid gemessen wird, ermöglicht die
Zuordnung einer Sequenz, die ausgeführt werden soll. In einigen
Fällen
kann es wünschenswert
sein, wie unten diskutiert, die Masse der kettenterminierenden Nukleotide
zu modifizieren, um die Differenz im Molekulargewicht zwischen jedem
Nukleotid zu erweitern. Es ist den Fachleuten klar, wann Massemodifizierung
der kettenterminierenden Nukleotide wünschenswert ist und wann sie
z. B. von der Auflösungsfähigkeit
des bestimmten verwendeten Spektrometers abhängen kann. Es kann z. B. wünschenswert
sein, vier kettenterminierende Nukleotide ddTTP, ddCTP1,
ddATP2 und ddGTP3 herzustellen,
wobei ddCTP1, ddATP2 und
ddGTP3 massemodifiziert werden, um Molekulargewichte
zu haben, die durch das bestimmte verwendete Spektrometer von einander
aufgelöst
werden können.
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Die
Begriffe kettenverlängernde
Nukleotide und kettenterminierende Nukleotide sind im Stand der Technik
gut bekannt. Für
DNS schließen
kettenverlängernde
Nukleotide 2'-Desoxyribonukleotide
ein, und kettenterminierende Nukleotide schließen 2',3'-Didesoxyribonukleotide
ein. Für
RNS schließen
kettenverlängernde
Nukleotide Ribonukleotide ein, und kettenterminierende Nukleotide
schließen
3'-Desoxyribonukleotide
ein. Der Begriff Nukleotid ist ebenso im Stand der Technik gut bekannt.
Für die
erfindungsgemäßen Zwecke
schließen
Nukleotide Nukleosidmono-, -di-, und -triphosphate ein. Nukleotide
schließen
ebenso modifizierte Nukleotide ein, wie z. B. Phosphorthioatnukleotide.
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Da
Massenspektrometrie ein serielles Verfahren ist, kann im Gegensatz
zur gegenwärtig
verwendeten Schichtgelelektrophorese, die ermöglicht, dass mehrere Proben
parallel verarbeitet werden, eine weitere Verbesserung durch multiplexmassenspektrometrische
DNS-Sequenzierung erzielt werden, die simultane Sequenzierung von
mehr als einem DNS- oder RNS-Fragment erlaubt. Wie unten detaillierter
beschrieben, kann der Bereich von etwa 300 Masseeinheiten zwischen
einem hinzugefügten
Nukleotid verwendet werden, indem entweder massemodifizierte Nukleinsäuresequenzierungsprimer
oder kettenverlängernde
und/oder terminierende Nukleosidtriphosphate verwendet werden, um
das Molekulargewicht der basenspezifisch terminierten Fragmente
einer bestimmten DNS- oder RNS-Spezies zu verschieben, die auf vorbestimmte
Weise sequenziert werden soll. Zum ersten Mal können mehrere Sequenzierungsreaktionen
parallel massenspektrometrisch analysiert werden. Multiplex-massenspektrometrische
DNS-Sequenzierung
kann durchgeführt
werden, indem die Fragmentfamilien durch spezifische Oligonukleotide
(Tag-Sonden) massemodifiziert werden, die an spezifischen Tag-Sequenzen
innerhalb jeder der Fragmentfamilien hybridisieren. Die Tag-Sonden
können
kovalent an die individuelle und spezifische Tag-Sequenz vor der
Massenspektrometrie gebunden werden.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausführungsform
werden die Molekulargewichtswerte von wenigstens zwei basenspezifisch
terminierten Fragmenten durch Verwendung von Massenspektrometrie
gleichzeitig bestimmt. Die Molekulargewichtswerte von vorzugsweise
wenigstens fünf
und stärker
bevorzugt wenigstens zehn basenspezifisch terminierten Fragmenten
werden durch Massenspektrometrie bestimmt. Ebenso sind Bestimmungen
der Molekulargewichtswerte von wenigstens 20 basenspezifisch terminierten
Fragmenten und wenigstens 30 basenspezifisch terminierten Fragmenten
in die Erfindung eingeschlossen. Weiterhin können die verschachtelten basenspezifisch
terminierten Fragmente eines spezifischen Satzes von allen Reaktanten und
den Nebenprodukten gereinigt werden, aber werden nicht voneinander
getrennt. Der gesamte Satz der verschachtelten basenspezifisch terminierten
Fragmente wird gleichzeitig analysiert, und die Molekulargewichtswerte
werden bestimmt. Wenigstens zwei basenspezifisch terminierte Fragmente
werden gleichzeitig durch Massenspektrometrie analysiert, wenn die
Fragmente in derselben Probe enthalten sind.
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Im
Allgemeinen beginnt das gesamte massenspektrometrische DNS-Sequenzierungsverfahren
mit einer Bibliothek kleiner genomischer Fragmente, die nach einem
ersten zufälligen
oder spezifischen Schneiden der genomischen DNS in große Stücke erhalten
wird, die dann in verschiedenen Subklonierungsschritten bezüglich der
Größe reduziert
und in Vektoren inseriert werden, wie Derivaten von M13 oder pUC
(z. B. M13mp18 oder M13mp19)(siehe 1). In einem
unterschiedlichen Ansatz werden die in Vektoren wie z. B. M13 inserierten
Fragmente durch Subklonierung erhalten, die mit einer cDNS-Bibliothek
startet. In noch einem anderen Ansatz werden die DNS-Fragmente,
die sequenziert werden sollen, durch die Polymerasekettenreaktion
erzeugt (z. B. Higuchi et al., "A
General Method of in vitro Preparation and Mutagenesis of DNA Fragments:
Study of Protein and DNA Interactions", Nucleic Acids Res., 16, 7351–67 (1988)).
Wie im Stand der Technik bekannt, kann Sequenzierung nach Sanger
mit einem Nukleinsäureprimer
(UP), der an den Plusstrang bindet oder mit einem anderen Nukleinsäureprimer,
der an den entgegengesetzte Minusstrang bindet, beginnen. Daher
kann entweder die komplementäre
Sequenz beider Stränge
einer gegebenen unbekannten DNS-Sequenz erhalten
werden (Verminderung der Unklarheit bei der Sequenzbestimmung vorausgesetzt),
oder die Länge der
Sequenzinformation, die aus einem Klon erhältlich ist, kann durch Erzeugen
von Sequenzinformation von beiden Enden des unbekannten vektorinserierten
DNS-Fragments verlängert
werden.
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Der
Nukleinsäureprimer
trägt vorzugsweise
am 5'-Ende eine
Bindungsfunktionalität
L, die einen Spacer mit ausreichender Länge einschließen kann
und die mit einer geeigneten Funktionalität L' auf einem festen Träger wechselwirken kann, um
eine reversible Bindung zu bilden, z. B. eine photospaltbare Bindung. Da
jede der vier Sequenzierungsfamilien nach Sanger mit einem Nukleinsäureprimer
beginnt (L-UP, 1), kann diese Fragmentfamilie
an den festen Träger
gebunden werden, indem sie mit funktionellen Gruppen L' auf der Oberfläche eines
festen Trägers
reagiert und dann intensiv gewaschen wird, um alle Puffersalze,
Triphosphate, Enzyme, Reaktionsnebenprodukte etc. zu entfernen.
Außerdem
kann es für
die massenspektrometrische Analyse auf dieser Stufe wichtig sein,
das Kation am Phosphatgerüst
des DNS-Fragments auszutauschen, um Peakverbreiterung aufgrund einer
Heterogenität
der Kationen zu eleminieren, die pro Nukleotideinheit gebunden sind.
Da die L-L'-Bindung
nur vorübergehender
Natur mit dem Ziel ist, verschachtelte DNS- oder RNS-Fragmente nach
Sanger zu fangen, um sie für
die massenspektrometrische Analyse sauber zu konditionieren, gibt
es verschiedene Chemien, die diesem Zweck dienen können. Zusätzlich zu
den angegebenen Beispielen, in denen die verschachtelten Fragmente
kovalent an den festen Träger
gebunden sind, gewaschen und vom Träger für die massenspektrometrische
Analyse abgespalten werden, kann die vorübergehende Bindung so beschaffen
sein, dass sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten
wird, d. h. eine photospaltbare Bindung wie z. B. ein Ladungsübertragungskomplex
oder ein stabiler organischer Rest. Außerdem kann die Bindung mit
L' gebildet werden,
das eine quartäre
Ammoniumgruppe ist (einige Beispiele sind in 19 gegeben).
In diesem Fall trägt
die Oberfläche
des festen Trägers
vorzugsweise negative Ladungen, die das negativ geladene Nukleinsäuregerüst abweisen
und dadurch die Desorption erleichtern. Eine Desorption findet entweder
durch die Wärme
statt, die durch den Laserpuls geschaffen wird und/oder abhängig von L' durch spezifische
Absorption von Laserenergie, die in Resonanz mit dem L'-Chromophor ist (siehe
z. B. Beispiele, die in 19 gegeben
sind). Die Funktionalitäten
L und L' können ebenso
einen Ladungsübertragungskomplex
bilden und dabei die vorübergehende
L-L'-Bindung bilden. Verschiedene
Beispiele für
geeignete Funktionalitäten
mit entweder Akzeptor- oder Donoreigenschaften sind ohne Beschränkung in
den 20A und 20B beschrieben.
Da in vielen Fällen
das "Ladungsübertragungsband" durch UV/VIS-Spektrometrie
bestimmt werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes
von R. Foster, Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf
die korrespondierende Energie der Ladungsübertragungswellenlänge abgestimmt
werden, und daher kann eine spezifische Desorption vom festen Träger initiiert
werden. Die Fachleute werden erkennen, dass mehrere Kombinationen
diesem Zweck dienen können
und dass die Donorfunktionalität
entweder auf dem festen Träger
sein kann oder an die verschachtelten DNS-/RNS-Fragmente nach Sanger
gekoppelt sein kann oder umgekehrt.
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In
noch einem anderen Ansatz kann die vorübergehende L-L'-Bindung gebildet
werden, indem homolytisch relativ stabile Reste gebildet werden,
wie in 21 beispielhaft dargestellt.
In Beispiel 4 aus 21 wird eine Kombination der
Ansätze
gezeigt, die Ladungsübertragungskomplexe
und stabile organische Reste verwenden. Hier werden die verschachtelten
DNS-/RNS- Fragmente
nach Sanger über
die Bildung eines Ladungsübertragungskomplexes
gefangen. Unter dem Einfluss des Laserpulses findet sowohl Desorption
(wie oben diskutiert) als auch Ionisation an der Position des Restes
statt. In den anderen Beispielen der 21 wird
unter dem Einfluss des Laserpulses die L-L'-Bindung
gespalten, und die verschachtelten DNS-/RNS-Fragmente nach Sanger
werden an der gebildeten Position des Restes desorbiert und nachfolgend
ionisiert. Die Fachleute erkennen, dass andere organische Reste
ausgewählt
werden können,
und dass im Verhältnis
zu den benötigten
Dissoziationsenergien, um die Bindung zwischen ihnen homolytisch
zu spalten, eine entsprechende Laserwellenlänge ausgewählt werden kann (siehe z. B.
Reactive Molecules von C. Wentrup. John Wiley & Sons, 1984). In noch einem anderen
Ansatz werden die verschachtelten DNS-/RNS-Fragmente nach Sanger über Watson-Crick-Basenpaarung
mit einem an den festen Träger
gebundenen Oligonukleotid gefangen, das entweder zu der Sequenz
des Nukleinsäureprimers
oder zu der Oligonukleotidsequenz des Tags komplementär ist (siehe 22). Die gebildete Duplex wird unter dem Einfluss
des Laserpulses gespalten, und eine Desorption kann initiiert werden.
Die an den festen Träger
gebundene Basensequenz kann durch natürliche Oligoribo- oder Oligodesoxyribonukleotide
als auch Analoga (z. B. ein thiomodifiziertes Phosphodiester- oder
Phosphotriestergerüst)
oder durch Verwenden von Oligonukleotidmimetika präsentiert
werden, wie z. B. PNS-Analoga (siehe z. B. Nielsen et al., Science,
254, 1497 (1991)), die die Basensequenz weniger empfänglich für enzymatischen
Abbau machen und daher die gesamte Stabilität der an den festen Träger gebundenen
Fängerbasensequenz
erhöhen.
Mit geeigneten L-L'-Bindungen kann eine
Spaltung direkt mit einem Laser erhalten werden, der auf die Energie
abgestimmt ist, die zur Bindungsspaltung notwendig ist. Daher können die
immobilisierten verschachtelten Fragmente nach Sanger direkt während der
massenspektrometrischen Analyse abgelöst werden.
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Um
die massenspektrometrische Leistungsfähigkeit zu erhöhen, kann
es notwendig sein, dass Phosphodiestergerüst vor der MS-Analyse zu modifizieren.
Dies kann z. B. durch Verwenden von alpha-thiomodifizierten Nukleotiden
zur Kettenverlängerung
und -termination erreicht werden. Mit Alkylierungsmitteln wie z.
B. Alkyliodiden, Iodazetamid, β-Iodethanol,
2,3-Epoxy-1-propanol (siehe 10) werden
die Monothiophosphodiesterbindungen der verschachtelten Fragmente
nach Sanger in Phosphotriesterbindungen überführt. Multiplexen durch Massemodifizierung
wird in diesem Falle durch Massemodifizieren der Nukleinsäureprimer
(UP) oder der Nukleosidtriphosphate an der Zucker- oder der Basengruppe
erhalten. Fachleute können
sich andere Modifizierungen der verschachtelten Fragmente nach Sanger
vorstellen. In einer Ausführungsform
der Erfindung ermöglicht
die Linkerchemie die Abspaltung der so gereinigten verschachtelten
DNS enzymatisch, chemisch oder physikalisch. Als Beispiel kann die
L-L'-Chemie von
der Art einer Disulfidbindung sein (zum Beispiel chemisch durch
Mercaptoethanol oder Dithioerythritol spaltbar), eines Biotin/Streptavidinsystems,
eines heterobifunktionellen Derivats einer Tritylethergruppe (Köster et
al., "A Versatile
Acid-Labile Linker for Modification of Synthetic Biomolecules", Tetrahedron Letters
31, 7095 (1990)), die unter milden sauren Bedingungen gespalten
werden kann, einer Lävulinylgruppe,
die unter nahezu neutralen Bedingungen mit einem Hydrazinium-/Acetatpuffer
spaltbar ist, einer Arginin-Arginin- oder Lysin-Lysinbindung, die durch ein Endopeptidaseenzym
wie Trypsin spaltbar ist, oder einer Pyrophosphatbindung, die durch
eine Pyrophosphatase spaltbar ist, einer photospaltbaren Bindung,
die z. B. physikalisch gespalten werden kann, oder kann ähnlicher
Art (siehe z. B. 23) sein. Gegebenenfalls kann
ein anderer Kationenaustausch vor der massenspektrometrischen Analyse
durchgeführt
werden. Falls eine enzymspaltbare Bindung verwendet wird, um die
verschachtelten Fragmente zu immobilisieren, kann das zum Spalten
der Bindung verwendete Enzym als ein interner Massestandard während der
MS-Analyse dienen.
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Das
Reinigungsverfahren und/oder das Ionenaustauschverfahren kann durch
eine Anzahl anderer Verfahren anstatt oder in Verbindung mit einer
Immobilisierung auf einem festen Träger ausgeführt werden. Zum Beispiel können die
basenspezifisch terminierten Produkte von den Reaktanten durch Dialyse,
Filtration (einschließlich
Ultrafiltration) und Chromatographie getrennt werden. Entsprechend
können
diese Techniken verwendet werden, um das Kation des Phosphatgerüstes mit
einem Gegenion auszutauschen, das die Peakverbreiterung vermindert.
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Die
basenspezifisch terminierten Fragmentfamilien können durch Standardsequenzierung
nach Sanger erzeugt werden, wobei das Große Klenowfragment aus E. coli-DNS-Polymerase
I verwendet wird, durch Sequenase, Taq-DNS-Polymerase und andere
für diesen
Zweck geeignete DNS-Polymerasen, wobei verschachtelte DNS-Fragmente
für die
massenspektrometrische Analyse erzeugt werden. Es ist jedoch ein
Teil der Erfindung, dass die basenspezifisch terminierten RNS-Transkripte
der DNS-Fragmente, die sequenziert werden sollen, ebenso für die massenspektrometrische
Sequenzbestimmung verwendet werden können. In diesem Falle können verschiedene
RNS-Polymerasen wie z. B. die SP6- oder die T7-RNS-Polymerase auf geeigneten
Vektoren verwendet werden, die zum Beispiel den SP6- oder den T7-Promotor
enthalten (z. B. Axelrod et al., "Transcription from Bacteriophage T7
and SP6 RNA Polymerase Promoters in the Presence of 3'-Deoxyribonukleoside
5'-triphosphate
Chain Terminators",
Biochemistry 24, 5716–23
(1985)). In diesem Falle werden die unbekannten DNS-Sequenzfragmente
stromabwärts
derartiger Promotoren inseriert. Eine Transkription kann ebenso
durch einen Nukleinsäureprimer
initiiert werden (Pitulle et al., "Initiator Oligonucleotides for the Combination
of Chemical and Enzymatic RNA Synthesis", Gene 112, 101–105 (1992)), der in einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform
geeignete Bindungsfunktionalitäten
L trägt,
die wie oben umrissen die Immobilisierung der verschachtelten RNS-Fragmente
vor der massenspektrometrischen Analyse zur Reinigung und/oder zur
geeigneten Modifizierung und/oder Konditionierung ermöglichen.
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Für dieses
Immobilisierungsverfahren der DNS-/RNS-Sequenzierungsprodukte zur massenspektrometrischen
Analyse können
verschiedene feste Träger
verwendet werden, z. B. Kügelchen
(Silicagel, kontrolliertes Porenglas, magnetische Kügelchen,
Sephadex-/Sepharosekügelchen,
Cellulosekügelchen
etc.), Kapillaren, Glasfiberfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen oder
Plastikmaterial. Beispiele verwendbarer Plastikmaterialien schließen Membranen
im Filter- oder Mikrotiterplattenformat ein, wobei die letzteren
die Automatisierung des Reinigungsverfahrens durch Verwenden von
Mikrotiterplatten ermöglichen,
die als eine erfindungsgemäße Ausführungsform
eine permeable Membran auf dem Boden des Loches tragen, die mit
L' funktionalisiert
ist. Membranen können
auf Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid
und ähnlichem
basieren. Beispiele geeigneter Metalloberflächen schließen Stahl, Gold, Silber, Aluminium
und Kupfer ein. Nach Reinigung, Kationenaustausch und/oder Modifizierung
des Phosphodiestergerüstes
der L-L'-gebundenen verschachtelten
Fragmente nach Sanger können
sie chemisch, enzymatisch oder physikalisch vom festen Träger abgespalten
werden. Ebenso können
die L-L'-gebundenen Fragmente
vom Träger
abgespalten werden, wenn sie einer massenspektrometrischen Analyse
unterzogen werden, wobei geeignet gewählte L-L'-Bindungen
und entsprechende Laserenergien/-intensitäten wie oben und in den 19–23 beschrieben
verwendet werden.
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Die
hochgereinigten vier basenspezifisch terminierten DNS- oder RNS-Fragmentfamilien
werden dann in Bezug auf ihre Fragmentlänge über Bestimmung ihres jeweiligen
Molekulargewichtes durch MALDI- oder ES-Massenspektrometrie analysiert.
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Für ES werden
die in Wasser oder einem flüchtigen
Puffer gelösten
Proben entweder kontinuierlich oder diskontinuierlich in ein Ionisationsinterface
bei atmosphärischem
Druck (atmospheric pressure ionization interface, API) injiziert
und dann durch einen Quadrupol massenanalysiert. Mit Hilfe eines
Computerprogramms werden die Molekulargewichtspeaks für das bekannte
Molekulargewicht des Nukleinsäureprimers (UP)
gesucht, und es wird bestimmt, welches der vier kettenterminierenden
Nukleotide an das UP hinzugefügt wurde.
Dies stellt das erste Nukleotid der unbekannten Sequenz dar. Dann
kann das zweite, dritte, n-te Verlängerungsprodukt auf eine ähnliche
Weise identifiziert werden, und dadurch wird die Nukleinsäuresequenz zugewiesen.
Die Erzeugung mehrfacher Ionenpeaks, die durch die Verwendung von
ES-Massenspektrometrie erhalten werden können, kann die Genauigkeit
der Massebestimmung erhöhen.
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Bei
der MALDI-Massenspektrometrie können
verschiedene Massenanalysatoren verwendet werden, z. B. Magnetsektor-/Magnetdeflektorinstrumente
im Einzel- oder Tripelquadrupolmodus (MS/MS). Fouriertransformation
und Flugzeit- (time-of-flight, TOF) Konfigurationen sind im Stand
der Technik für
Massenspektrometrie bekannt. Die 2A bis 6 sind
als Beispiel für
die Daten gegeben, die erhalten werden können, wenn ein hypothetisches
DNS-Fragment mit einer Länge
von 50 Nukleotiden (SEQ ID NO: 3) sequenziert wird, das ein Molekulargewicht
von 15.344,02 Dalton hat. Die Molekulargewichte werden angegeben,
die für ddT-
(2A und 2B), ddA-
(3A und 3B), ddG-
(4A und 4B) und
ddC- (5A und 5B)
terminierte Produkte berechnet wurden (entsprechend Fragmenten aus
SEQ ID NO: 3), und die idealisierten vier MALDI-TOF-Massenspektren werden
gezeigt. Alle vier Spektren werden überlagert, und hieraus kann
die DNS-Sequenz erzeugt werden. Dies wird in der zusammenfassenden 6 gezeigt,
die demonstriert, wie die Molekulargewichte mit der DNS-Sequenz korrelieren.
MALDI-TOF-Spektren wurden für
die ddT-terminierten Produkte erzeugt (16A–16M), die denjenigen in den 2A–2B entsprechen,
und diese Spektren wurden überlagert
(17A und 17B).
Die Korrelation berechneter Molekulargewichte der ddT-Fragmente
und ihrer experimentell verifizierten Gewichte ist in Tabelle 1
gezeigt. Entsprechend können,
wenn alle vier kettenterminierten Reaktionen kombiniert und dann
durch Massenspektrometrie analysiert werden, die Molekulargewichtsunterschiede
zwischen zwei benachbarten Peaks verwendet werden, um die Sequenz
zu bestimmen. Für
das Desorptions-/Ionisationsverfahren können zahlreiche Matrix-/Laserkombinationen
verwendet werden.
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TABELLE
I Korrelation
der berechneten und experimentell verifizierten Molekulargewichte
der 13 DNS-Fragmente der ABBILDUNGEN 2 und 16A–16M
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Um
den Durchsatz auf einen Level zu erhöhen, der für großvolumige genomische und cDNS-Sequenzierungsprojekte
notwendig ist, ermöglicht
die vorliegende Erfindung die Verwendung von Multiplex-Massenspektrometrie,
um mehr als eine Sequenz simultan zu bestimmen. Dies kann durch
mehrere, wenn auch unterschiedliche Methodologien erzielt werden,
wobei das Basisprinzip die Massemodifikation des Nukleinsäureprimers
(UP), der kettenverlängernden
und/oder kettenterminierenden Nukleosidtriphosphate ist, oder die Verwendung
von massedifferenzierten Tag-Sonden, die mit spezifischen Tag-Sequenzen
hybridisieren können.
Der Begriff "Nukleinsäureprimer" wie hier verwendet
umfasst Primer für
sowohl DNS- und RNS-Sequenzierung nach Sanger.
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Als
Beispiel zeigt 7A eine allgemeine Formel des
Nukleinsäureprimers
(UP) und der Tag-Sonden (TS). Die massemodifizierende Gruppe kann
zum Beispiel an entweder das 5'-Ende
des Oligonukleotids (M1), an die Nukleobase
(oder Basen)(M2, M7),
an das Phosphatgerüst
(M3) und an die 2'-Position
des Nukleosids (der Nukleoside)(M4, M6) oder/und an die terminale 3'-Position (M5)
gebunden werden. Die Primerlänge
kann zwischen einer Länge
von 1 und 50 Nukleotiden variieren. Um die DNS-Sequenzierung nach
Sanger zu primen, ist der Primer vorzugsweise im Bereich einer Länge von
etwa 15 bis 30 Nukleotiden. Um die Transkription in einer RNS-Polymerase
vermittelten Sequenzierungsreaktion nach Sanger künstlich
zu primen, ist die Länge des
Primers vorzugsweise im Bereich von etwa 2 bis 6 Nukleotiden. Wenn
eine Tag-Sonde (TS) mit einer integrierten Tag-Sequenz einer Familie kettenterminierter
Fragmente hybridisiert werden muss, beträgt seine bevorzugte Länge etwa
20 Nukleotide.
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Die
Tabelle in 7B beschreibt einige Beispiele
massemodifizierter Primer-/Tag-Sondenkonfigurationen für eine DNS-
als auch für
eine RNS-Sequenzierung
nach Sanger. Diese Liste ist jedoch nicht als limitierend gemeint,
da zahlreiche Kombinationen von massemodifizierenden Funktionen
und Positionen innerhalb des Oligonukleotidmoleküls möglich sind und als Teil der
Erfindung betrachtet werden. Die massemodifizierende Funktionalität kann zum
Beispiel ein Halogen, ein Azido oder von der Art XR sein, wobei
X eine verbindende Gruppe und R eine massemodifizierende Funktionalität ist. Die
massemodifizierende Funktionalität kann
daher verwendet werden, um definierte Masse-Inkremente in das Oligonukleotidmolekül einzuführen.
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In
einer anderen Ausführungsform
sind die Nukleotide, die für
die Kettenverlängerung
und/oder -termination verwendet werden, massemodifiziert. Beispiele
solcher modifizierten Nukleotide sind in den 8A und 8B gezeigt.
Hier kann die massemodifizierende Gruppe M entweder an die Nukleobase
M2 (im Falle des c7-Desazanukleosids
ebenso an C-7, M7), an die Triphosphatgruppe
am alpha-Phosphat M3 oder an die 2'-Position des Zuckerrings
des Nukleosidtriphosphates M4 und M6 gebunden sein. Außerdem kann die massemodifizierende
Funktionalität
hinzugefügt
werden, um die Kettentermination zu beeinflussen, zum Beispiel durch
seine Bindung an die 3'-Position
des Zuckerrings im Nukleosidtriphosphat M5.
Die Liste in 8B stellt Beispiele möglicher
Konfigurationen zur Erzeugung kettenterminierender Nukleosidtriphosphate
zur RNS- oder DNS-Sequenzierung nach Sanger dar. Für Fachleute
ist es jedoch klar, dass viele andere Kombinationen diesem erfindungsgemäßen Zweck
ebenso gut dienen können.
Auf dieselbe Weise erkennen Fachleute, dass kettenverlängernde
Nukleosidtriphosphate ebenso auf dieselbe Art mit zahlreichen Variationen
und Kombinationen in Funktionalitäts- und Bindungspositionen
massemodifiziert werden können.
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Ohne
den Umfang der Erfindung zu beschränken, gibt 9 eine
detailliertere Beschreibung bestimmter Beispiele, wie die Massemodifikation
M für X
in XR eingebracht werden kann als auch wie Oligo-/Polyethylenderivate
für R verwendet
werden können.
Das massemodifizierende Inkrement ist in diesem Falle 44, d. h.
fünf verschiedene
massemodifizierte Spezies können
erzeugt werden, indem nur m von 0 bis 4 verändert wird und dadurch Masseeinheiten
von 45 (m = 0), 89 (m = 1), 133 (m = 2), 177 (m = 3) und 221 (m
= 4) zum Nukleinsäureprimer
(UP), zur Tag-Sonde (TS) bzw. zum Nukleosidtriphosphat hinzugefügt werden.
Die Oligo-/Polyethylenglycole können
ebenso durch ein niederes Alkyl wie zum Beispiel Methyl, Ethyl,
Propyl, Isopropyl, t-Butyl und ähnliches
monoalkyliert sein. Eine Auswahl der bindenden Funktionalitäten X ist
ebenso veranschaulicht. Andere Chemien können in den massemodifizierten
Verbindungen verwendet werden, wie zum Beispiel diejenigen, die
in Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Hrsg. F.
Eckstein, IRL Press, Oxford 1991, kürzlich beschrieben wurden.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
können
verschiedene massemodifizierende Funktionalitäten R, die von Oligo-/Polyethylenglycolen
verschieden sind, ausgewählt
und über
geeignete Linkerchemien X gebunden werden. Ohne jede Beschränkung sind
einige Beispiele in 10 gegeben. Eine einfache Massemodifikation
kann durch Substituieren von H durch Halogene wie F, Cl, Br und/oder
I oder Pseudohalogene wie zum Beispiel SCN, NCS oder durch Verwendung
unterschiedlicher Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen wie zum Beispiel
Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Phenyl, substituiertes
Phenyl, Benzyl oder funktioneller Gruppen wie zum Beispiel CH2F, CHF2, CF3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5),
Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3 erzielt
werden. Noch eine andere Massemodifikation kann erhalten werden,
indem Homo- und Heteropeptide durch X an das UP, die TS oder die
Nukleosidtriphosphate gebunden werden. Ein Beispiel, das zur Erzeugung
massemodifizierter Spezies mit einem Masse-Inkrement von 57 verwendbar
ist, ist die Bindung von Oligoglycinen, d. h. es werden Massemodifikationen
von 74 (r = 1, m = 0), 131 (r = 1, m = 2), 188 (r = 1, m = 3), 245
(r = 1, m = 4) erzielt. Einfache Oligoamide können ebenso verwendet werden,
z. B. können
Massemodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 88 (r = 2, m = 0), 102
(r = 3, m = 0), 116 (r = 4, m = 0) etc. erhalten werden. Für Fachleute
ist es offensichtlich, dass es zahlreiche Möglichkeiten zusätzlich zu
denjenigen in 10 und in der oben erwähnten Referenz
gibt (Oligonucleotides and Analogues, F. Eckstein, 1991), auf vorbestimmte
Weise viele verschiedene massemodifizierende Funktionalitäten in UP,
TS und Nukleosidtriphosphate einzuführen, die für eine DNS- und RNS-Sequenzierung nach
Sanger akzeptabel sind.
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Wie
hier verwendet bezeichnet der hochgestellte Index "0 – i" i + 1 massedifferenzierte
Nukleotide, Primer und Tags. In einigen Beispielen kann der hochgestellte
Index 0 (z. B. NTP0, UP0)
eine nichtmodifizierte Spezies eines bestimmten Reaktanten bezeichnen,
und der hochgestellte Index i (z. B. NTPi,
NTP1, NTP2 etc.) kann
die i-te massemodifizierte Spezies dieses Reaktanten bezeichnen.
Wenn zum Beispiel mehr als eine Nukleinsäurespezies (z. B. DNS-Klone)
gleichzeitig durch Multiplex-DNS-Sequenzierung sequenziert werden muss,
dann können
i + 1 verschiedene massemodifizierte Nukleinsäureprimer (UP0,
UP1 ... UPi) verwendet werden,
um jeden Satz von basenspezifisch terminierten Fragmenten zu unterscheiden,
wobei jede Spezies von massemodifizierten UPi durch
Massenspektrometrie vom Rest unterschieden werden kann.
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Drei
verschiedene Basisverfahren zur multiplex-massenspektrometrischen
DNS-Sequenzierung, die die beschriebenen massemodifizierten Reagenzien
verwenden, sind unten beschrieben:
- A) Multiplexen
durch Verwenden von massemodifizierten Nukleinsäureprimern (UP) zur DNS- oder RNS-Sequenzierung
nach Sanger (siehe zum Beispiel 11),
- B) Multiplexen durch Verwenden von massemodifizierten Nukleosidtriphosphaten
als Kettenverlängerer und/oder
Kettenterminatoren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung nach Sanger (siehe
zum Beispiel 12), und
- C) Multiplexen durch Verwenden von Tag-Sonden, die spezifisch
mit Tag-Sequenzen
hybridisieren, die in einen Teil der vier basenspezifisch terminierten
DNS-RNS-Fragmentfamilien nach Sanger integriert sind. Eine Massemodifikation
kann hier erzielt werden, wie für
die 7A, 7B, 9 und 10 beschrieben
ist, oder alternativ durch Konstruktion unterschiedlicher Oligonukleotidsequenzen,
die dieselbe oder eine unterschiedliche Länge zu nichtmodifizierten Nukleotiden
haben, die auf vorbestimmte Weise passend differenzierte Molekulargewichte
(siehe zum Beispiel 13) erzeugen.
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Das
Multiplexverfahren durch massemodifizierte Nukleinsäureprimer
(UP) wird durch ein Beispiel in 11 für das gleichzeitige
Massenanalysieren von vier verschiedenen DNS-Klonen dargestellt.
Die erste Reaktionsmischung wird durch Standard-DNS-Sequenzierung
nach Sanger erhalten, wobei ein unbekanntes DNS-Fragment 1 (Klon 1) in einen geeigneten
Vektor (z. B. M13mp18) integriert ist, wobei ein nichtmodifizierter Nukleinsäureprimer
UP0 und eine Standardmischung der vier nichtmodifizierten
Desoxynukleosidtriphosphate dNTP0 mit 1/10
eines der vier Didesoxynukleosidtriphosphaten ddNTP0 verwendet
wird. Eine zweite Reaktionsmischung für das DNS-Fragment 2 (Klon
2) wird erhalten, indem ein massemodifizierter Nukleinsäureprimer
UP1 und, wie oben, die vier nichtmodifizierten
Nukleosidtriphosphate dNTP0, die in jeder
getrennten Sanger-Reaktion 1/10 der kettenterminierenden nichtmodifizierten
Didesoxynukleosidtriphosphate ddNTP0 enthalten,
verwendet werden. In den beiden anderen Experimenten haben die vier
Sanger-Reaktionen die folgenden Zusammensetzungen: DNS-Fragment
3 (Klon 3), UP2, dNTP0,
ddNTP0 und DNS-Fragment 4 (Klon 4), UP3, dNTP0, ddNTP0. Zur massenspektrometrischen DNS-Sequenzierung
werden alle basenspezifisch terminierten Reaktionen der vier Klone
gepoolt und massenanalysiert. Die verschiedenen Massepeaks, die
zu den vier didesoxyterminierten (z. B. ddT-terminierten) Fragmentfamilien gehören, werden
spezifisch verlängerten
und ddT-terminierten
Fragmenten durch Suchen (zum Beispiel durch ein Computerprogramm)
für die
bekannten molekularen Ionenpeaks von UP0,
UP1, UP2 und UP3, verlängert
durch eines der vier Didesoxynukleosidtriphosphate UP0-ddN0, UP1-ddN0, UP2-ddN0 und UP3-ddN0, zugewiesen. Auf diese Weise werden die
ersten Nukleotide der vier unbekannten DNS-Sequenzen der Klone 1
bis 4 bestimmt. Das Verfahren wird wiederholt, wobei die molekularen
Massen der vier spezifischen ersten Verlängerungsprodukte gespeichert
werden, bis die vier Sequenzen zugewiesen sind. Unzweideutige Masse/Sequenzzuweisungen
sind sogar in einem Szenario des schlimmsten Falles möglich, in
dem die vier massemodifizierten Nukleinsäureprimer durch dasselbe Didesoxynukleosidtriphosphat
verlängert
werden, wobei die Verlängerungsprodukte
dann zum Beispiel UP0-ddT, UP1-ddT,
UP2-ddT und UP3-ddt
sind, die sich durch das bekannte Masse-Inkrement unterscheiden,
das die vier Nukleinsäureprimer
voneinander unterscheddet. In einer anderen Ausführungsform wird eine analoge
Technik verwendet, die unterschiedliche Vektoren verwendet, die
zum Beispiel die SP6- und/oder die T7-Promotorsequenzen enthalten
und eine Transkription mit den Nukleinsäureprimern UP0,
UP1, UP2 und UP3 und jeweils einer RNS-Polymerase (z. B:
SP6- oder T7-RNS-Polymerase) mit kettenverlängernden und -terminierenden nichtmodifizierten
Nukleosidtriphosphaten NTP0 und 3'-dNTP0 leisten.
Dabei wird die DNS-Sequenz durch RNS-Sequenzierung nach Sanger bestimmt.
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12 veranschaulicht
das Verfahren zum Multiplexen durch massemodifizierte kettenverlängernde oder/und
-terminierende Nukleosidtriphosphate, in dem drei unterschiedliche
DNS-Fragmente (3 Klone) gleichzeitig massenanalysiert werden. Die
erste DNS-Sequenzierungsreaktion nach Sanger (DNS-Fragment 1, Klon
1) ist die Standardmischung, die nichtmodifizierte Nukleinsäureprimer
UP0, dNTP0 verwendet
und in jeder der vier Reaktionen eines der vier ddNTP0.
Die zweite (DNS-Fragment 2, Klon 2) und die dritte (DNS-Fragment
3, Klon 3) haben den folgenden Inhalt: UP0,
dNTP0, ddNTP1 bzw.
UP0, dNTP0, ddNTP2. In einer Variante dieses Verfahrens kann
die Amplifizierung des Masse-Inkrementes
beim Massemodifizieren der verlängerten
DNS-Fragmente durch die Verwendung von gleich massemodifizierten
Desoxynukleosidtriphosphaten (d. h. dNTP1,
dNTP2) zur Kettenverlängerung entweder allein oder
in Verbindung mit dem homologen gleich massemodifizierten Didesoxynukleosidtriphosphat
erzielt werden. Für
die drei oben beschriebenen Klone kann der Inhalt der Reaktionsmischung
wie folgt sein: entweder UP0/dNTP0/ddNTP0, UP0/dNTP1/ddNTP0 und UP0/dNTP2/ddNTP0 oder UP0/dNTP0/IddNTP0, UP0/dNTP1/ddNTP1 und UP0/dNTP2/ddNTP2. Wie oben beschrieben kann DNS-Sequenzierung
durch eine RNS-Sequenzierung nach Sanger durchgeführt werden,
die nichtmodifizierte Nukleinsäureprimer
UP0 und eine geeignete Mischung kettenverlängernder
und -terminierender Nukleosidtriphosphate verwendet. Die Massemodifizierung
kann wiederum entweder im kettenterminierenden Nukleosidtriphosphat
allein oder in Verbindung mit massemodifizierten kettenverlängernden
Nukleosidtriphosphaten erfolgen. Multiplexen wird durch Poolen der
drei basenspezifisch terminierten Sequenzierungsreaktionen (z. B.
die ddTTP-terminierten Produkte) und simultanem Analysieren der
gepoolten Produkte durch Massenspektrometrie erzielt. Die ersten
Verlängerungsprodukte
der bekannten Nukleinsäureprimersequenz
werden wiederum z. B. durch ein Computerprogramm zugewiesen. Masse/Sequenzzuweisungen
sind sogar im schlimmsten Falle möglich, in dem die Nukleinsäureprimer
durch dasselbe Nukleotid, z. B. ddT, in allen drei Klonen verlängert/terminiert
wurden. Die folgenden auf diese Weise erhaltenen Konfigurationen
können
durch ihre unterschiedlichen Massemodifikationen gut differenziert
werden: UP0-ddT0,
UP0-ddT1, UP0-ddT2.
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DNS-Sequenzierung
durch Multiplex-Massenspektrometrie kann durch Klonen der DNS-Fragmente, die
sequenziert werden sollen, in "Plex-Vektoren" erzielt werden,
die vektorspezifische "Tag-Sequenzen" wie beschrieben
enthalten (Köster
et al., "Oligonucleotide
Synthesis and Multiplex DNA Sequencing Using Chemiluminescent Detection", Nucleic Acids Res.
Symposium Ser. Nr. 24, 318–321
(1991)), dann durch Poolen von Klonen verschiedener Plex-Vektoren
für die
DNS-Präparation
und für
die vier getrennten Sequenzierungsreaktionen nach Sanger, wobei
Standard-dNTP0/ddNTP0 und
ein Nukleinsäureprimer
UP0 verwendet werden, durch Reinigen der
vier Multiplexfragmentfamilien durch Binden an einen festen Träger durch
die Linkergruppe L am 5'-Ende
von UP, durch Auswaschen aller Nebenprodukte und Abspalten der gereinigten
Multiplex-DNS-Fragmente vom Träger
oder Verwenden der L-L'-gebundenen
verschachtelten Sanger-Fragmente als solche zur massenspektrometrischen
Analyse wie oben beschrieben, durch Durchführen von Demultiplexen durch
Hybridisieren mit spezifischen "Tag-Sonden", wobei eine nach
der anderen hybridisiert wird, und durch darauffolgendes Analysieren
durch Massenspektrometrie (siehe zum Beispiel 13).
Als Referenzpunkt laufen die vier basenspezifisch terminierten Multiplex-DNS-Fragmentfamilien
durch das Massenspektrometer, und alle ddT0-,
ddA0-, ddC0- und
ddG0-terminierten molekularen Ionenpeaks
werden jeweils detektiert und gespeichert. Die Zuweisung von zum
Beispiel ddT0-terminierten DNS-Fragmenten
zu einer spezifischen Fragmentfamilie wird durch eine andere massenspektrometrische
Analyse nach Hybridisieren einer spezifischen Tag-Sonde (TS) an
die entsprechende Tag-Sequenz geleistet, die in der Sequenz dieser
spezifischen Fragmentfamilie enthalten ist. Nur diejenigen molekularen
Ionenpeaks, die im Stande sind, mit der spezifischen Tag-Sonde zu hybridisieren,
werden zu einer höheren
molekularen Masse durch dasselbe bekannte Masse-Inkrement (z. B.
der Tag-Sonde) verschoben. Diese verschobenen Ionenpeaks aufgrund
aller Hybridisierungen einer spezifischen Tag-Sonde gehören zu derselben Fragmentfamilie.
Für eine
gegebene Fragmentfamilie wird dies für die verbleibenden kettenterminierten
Fragmentfamilien mit derselben Tag-Sonde wiederholt, um die vollständige DNS-Sequenz
zuzuweisen. Dieses Verfahren wird i–1 mal entsprechend den i gemultiplexten Klonen
wiederholt (der i-te Klon wird standardmäßig identifiziert).
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Die
Differenzierung der Tag-Sonden für
die unterschiedlichen gemultiplexten Klone können gerade durch die DNS-Sequenz
und ihre Fähigkeit
zur Watson-Crick-Basenpaarung
an die Tag-Sequenz erhalten werden. Es ist im Stand der Technik
gut bekannt, wie stringente Bedingungen berechnet werden, um eine
spezifische Hybridisierung einer gegebenen Tag-Sonde mit einer gegebenen
Tag-Sequenz bereitzustellen (siehe zum Beispiel Molecular Cloning:
A laboratory manual. 2. Aufl., Hrsg. Sambrook, Fritsch und Maniatis
(Cold Spring Harbor Laboratory Press: NY, 1989, Kapitel 11). Außerdem kann
eine Differenzierung erhalten werden, indem die Tag-Sequenz für jeden
Plex-Vektor konstruiert wird, so dass er eine ausreichende Massedifferenz hat,
damit er gerade durch Veränderung
der Länge
oder der Basenzusammensetzung oder durch Massemodifikationen gemäß 7A, 7B, 9 und 10 einzigartig
wird. Um die Duplex zwischen der Tag-Sequenz und der Tag-Sonde während der
massenspektrometrischen Analyse intakt zu halten, stellt eine andere
erfindungsgemäße Ausführungsform
eine kovalente Bindung bereit, die zum Beispiel durch photoreaktive
Gruppen wie zum Beispiel Psoralen und Ellipticin und durch andere
Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, vermittelt wird (siehe
zum Beispiel Helene et al., Nature 344, 358 (1990) und Thuong et
al. "Oligonucleotides
Attached to Intercalators. Photoreaktive and Cleavage Agents" in F. Eckstein,
Oligonucleotides and Analogues: A practical Approach, IRL Press,
Oxford, 1991, 283–306).
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Die
DNS-Sequenz wird nochmals enträtselt,
indem nach dem Ionenpeak mit dem niedrigsten Molekulargewicht gesucht
wird, der dem bekannten UP0-Tag-Sequenz/Tag-Sondenmolekulargewicht
plus dem ersten Verlängerungsprodukt,
z. B. ddT0, entspricht, dann dem zweiten,
dem dritten etc.
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In
einer Kombination des letzteren Ansatzes mit den vorher beschriebenen
Multiplexverfahren kann eine weitere Zunahme beim Multiplexen erzielt
werden, indem zusätzlich
zu den Tag-Sonden/Tag-Sequenzwechselwirkungen massemodifizierte
Nukleinsäureprimer
(7A und 7B) und/oder
massemodifizierte Desoxynukleoside dNTP0-i und/oder
Didesoxynukleosidtriphosphate ddNTP0-i verwendet
werden. Fachleute erkennen, dass der Tag-Sequenz-/Tag-Sonden-Multiplexansatz
nicht auf die DNS-Sequenzierung
nach Sanger beschränkt
ist, die verschachtelte DNS-Fragmente mit DNS-Polymerasen erzeugt.
Die DNS-Sequenz kann ebenso bestimmt werden, indem die unbekannte
DNS-Sequenz von passenden einen Promotor enthaltenden Vektoren (siehe
oben) mit verschiedenen RNS-Polymerasen und Mischungen von NTP0-i/3'-dNTP0-i transkribiert wird und auf diese Weise
verschachtelte RNS-Fragmente
erzeugt werden.
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In
noch einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform
kann die massemodifizierende Funktionalität durch ein zwei- oder vielschrittiges
Verfahren eingeführt
werden. In diesem Fall werden in einem ersten Schritt die Nukleinsäureprimer,
die kettenverlängernden
oder -terminierenden Nukleosidtriphosphate und/oder die Tag-Sonden
durch eine Vorläuferfunktionalität modifiziert,
wie zum Beispiel Azido -N3, oder mit einer
funktionellen Gruppe modifiziert, in der das R in XR H ist (7A, 7B, 9)
und dadurch vorläufige.
Funktionen bereitstellt, d. h. -OH, -NH2,
-NHR, -SH, -NCS, -OCO(CH2)rCOOH
(r = 1–20),
-NHCO(CH2)rCOOH
(r = 1–20),
-OSO2OH, -OCO(CH2)rI (r = 1–20), -OP(O-Alkyl)N(Alkyl)2, die aber nicht darauf beschränkt sind.
Diese weniger massigen Funktionalitäten führen zu besseren Substrateigenschaften
für die
enzymatische DNS- oder RNS-Synthesereaktionen des DNS-Sequenzierungsverfahrens.
Die geeignete massemodifizierende Funktionalität wird dann nach der Erzeugung
der verschachtelten basenspezifisch terminierten DNS- oder RNS-Fragmente
vor der Massenspektrometrie eingeführt. Einige Beispiele von Verbindungen,
die als massemodifizierende Funktionalitäten dienen können, sind
in den 9 und 10 beschrieben, ohne den Umfang
der Erfindung zu beschränken.
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Kits
zur Sequenzierung von Nukleinsäuren
durch Massenspektrometrie schließen Kombinationen der oben
beschriebenen Sequenzierungsreaktanten ein. Zum Beispiel umfassen
Kits in einer Ausführungsform Reaktanten
für eine
multiplexmassenspektrometrische Sequenzierung mehrerer unterschiedlicher
Nukleinsäurespezies.
Der Kit kann einen festen Träger
einschließen,
der eine Linkerfunktionalität
(L1) zur Immobilisierung von basenspezifisch
terminierten Produkten hat, wenigstens einen Nukleinsäureprimer,
der eine Linkergruppe (L) zur reversiblen und vorübergehenden
Verbindung des Primers an den festen Träger durch zum Beispiel eine
photospaltbare Bindung, einen Satz von kettenverlängernden
Nukleotiden (z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP, oder ATP, CTP, GTP
und UTP), einen Satz kettenterminierender Nukleotide (wie z. B.
2',3'-Didesoxynukleotide zur DNS-Synthese
oder 3'-Desoxynukleotide
zur RNS-Synthese) und eine geeignete Polymerase zum Synthetisieren
komplementärer
Nukleotide. Primer und/oder terminierende Nukleotide können derartig massemodifiziert
werden, so dass die basenspezifisch terminierten Fragmente, die
aus einer der Nukleinsäurespezies,
die sequenziert werden sollen, erzeugt werden, durch Massenspektrometrie
von allen anderen unterschieden werden kann. Alternativ zur Verwendung
der massemodifizierten Synthesereaktanten kann ein Satz von Tag-Sonden (wie oben
beschrieben) in den Kit eingeschlossen werden. Der Kit kann ebenso
geeignete Puffer als auch eine Anleitung zur Durchführung der
Multiplex-Massenspektrometrie
zum gleichzeitigen Sequenzieren vieler Nukleinsäurespezies enthalten.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann der Kit zum Nukleinsäuresequenzieren
einen festen Träger wie
oben beschrieben, einen Primer zum Initiieren der Synthese der komplementären Nukleinsäurefragmente, einen
Satz kettenverlängernder
Nukleotide und eine geeignete Polymerase umfassen. Die massemodifizierten kettenterminierenden
Nukleotide werden derartig ausgewählt, dass das Hinzufügen von
einem der Kettenterminatoren zu einer wachsenden komplementären Nukleinsäure durch
Massenspektrometrie unterschieden werden kann.
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BEISPIEL 1
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Immobilisieren von Primerverlängerungsprodukten
einer DNS-Sequenzierungsreaktion
nach Sanger für
eine massenspektrometrische Analyse über Disulfidbindungen
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Als
ein fester Träger
werden Sequelonmembranen (Millipore Corp., Bedford, MA) mit Phenylisothiocyanatgruppen
als Ausgangsmaterial verwendet. Die Membranscheiben mit einem Durchmesser
von 8 mm werden mit einer Lösung
von N-Methylmorpholin/Wasser/2-Propanol (NMM-Lösung)(2/49/49 V/V/V) befeuchtet, die überschüssige Flüssigkeit
wird mit Filterpapier entfernt, und die Membranscheiben werden auf
ein Stück Plastikfilm
oder Aluminiumfolie gebracht, das sich auf einem Heizblock befindet,
der auf 55°C
eingestellt ist. Eine Lösung
von 1 mM 2-Mercaptoethylamin (Cysteamin) oder 2,2'-Dithio-bis(ethylamin)(Cystamin) oder S-(2-Thiopyridyl)-2-thio-ethylamin
(10 μl,
10 nmol) in NMM wird pro Scheibe hinzugefügt und auf 55°C erwärmt. Nach
15 min werden 10 μl
NMM-Lösung
pro Scheibe hinzugefügt
und für
weitere 5 min erwärmt.
Ein Überschuss
an Isothiocyanatgruppen kann durch Behandlung mit 10 μl einer 10
mM Lösung
von Glycin in NMM-Lösung
entfernt werden. Für
Cystamin werden die Scheiben mit 10 μl einer Lösung von 1 M wässerigem Dithiothreitol
(DTT)/2-Propanol (1 : 1 V/V) für
15 min bei Raumtemperatur behandelt. Dann werden die Scheiben ausgiebig
in einem Filtrationssammler mit 5 Aliquots von jeweils 1 ml der
NMM-Lösung
gewaschen, dann mit 5 Aliquots von 1 ml Acetonitril/Wasser (1/1
V/V) gewaschen und danach getrocknet. Wenn sie nicht sofort verwendet
werden, werden die Scheiben mit freien Thiolgruppen in einer Lösung von
1 M wässerigem
Dithiothreitol/2-Propanol (1 : 1 V/V) gelagert, und vor der Verwendung
wird DTT durch drei Waschungen mit jeweils 1 ml der NMM-Lösung entfernt.
Die Primeroligonukleotide mit einer 5'-SH-Funktionalität können durch verschiedene Verfahren
hergestellt werden (z. B. B. C. F. Chu et al., Nucleic Acids Res.
14, 5591–5603
(1986), Sproat et al., Nucleic Acids Res. 15, 4837–48 (1987)
und Oliqonucleotides and Analogues: A Practical Approach (Herausgeber
F. Eckstein), IRL Press Oxford, 1991). Sequenzierungsreaktionen
gemäß dem Protokoll nach
Sanger werden auf Standardweise durchgeführt (z. B. H. Swerdlow et al.,
Nucleic Acids Res. 18, 1415–19 (1990)).
In der Anwesenheit von etwa 7–10
mM DTT kann der freie 5'-Thiolprimer
verwendet werden, in anderen Fällen
kann die SH-Funktionalität während der
Sequenzierungsreaktion nach Sanger z. B. durch eine Tritylgruppe
geschützt
werden, die vor dem Ankern an den Träger auf die folgende Weise
entfernt wird. Die vier Sequenzierungsreaktionen (jeweils 150 μl in einem
Eppendorfröhrchen)
werden durch eine 10minütige
Inkubation bei 70°C
beendet, um die DNS-Polymerase (z. B. Klenow-Fragment, Sequenase)
zu denaturieren, und die Reaktionsmischungen werden ethanolgefällt. Die Überstände werden
entfernt, und die Pellets werden mit 25 μl einer wässerigen 1 M Silbernitratlösung gevortext,
und nach einer Stunde bei Raumtemperatur werden 50 μl einer wässerigen
1 M DTT-Lösung hinzugefügt und durch
Vortexen gemischt. Nach 15 min werden die Mischungen zentrifugiert,
und die Pellets werden zweimal mit 100 μl Ethylacetat durch Vortexen
und Zentrifugieren gewaschen, um überschüssiges DTT zu entfernen. Die
Primerverlängerungsprodukte
mit einer freien 5'-Thiolgruppe
sind nun an den thiolierten Membranträger unter milden oxidierenden
Bedingungen gekoppelt. Im Allgemeinen ist es ausreichend, die 5'-thiolierten Primerverlängerungsprodukte
in 10 μl
10 mM entgastem Triethylammoniumacetatpuffer (TEAA) pH 7,2 gelöst zu den
thiolierten Membranträgern
hinzuzufügen.
Koppeln wird durch Trocknen der Proben auf den Membranscheiben mit
einem kalten Ventilator erzielt. Das Verfahren kann wiederholt werden,
indem die Membran mit 10 μl
10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 angefeuchtet wird und wie oben getrocknet
wird. Wenn 2-Thiopyridyl-derivatisierte Verbindungen verwendet werden,
kann das Ankern durch die Freisetzung von Pyridin-2-thion spektrophotometrisch
bei 343 nm beobachtet werden.
-
In
einer anderen Variante dieses Ansatzes wird der Oligonukleotidprimer
mit einer Aminogruppe am 5'-Ende
funktionalisiert, die durch Standardverfahren während einer automatisierten
DNS-Synthese eingebaut wird. Nach der Primerverlängerung während des Sequenzierungsverfahrens
nach Sanger wird die primäre Aminogruppe
mit 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester
(SPDP) zur Reaktion gebracht und danach an die thiolierten Träger gekoppelt
und über
die Freisetzung von Pyridyl-2-thion, wie oben beschrieben, beobachtet.
Nach Denaturierung der DNS-Polymerase und Ethanolfällung der
Sequenzierungsprodukte werden die Überstände entfernt, und die Pellets
werden in 10 μl
10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 gelöst,
und 10 μl
einer 2 mM Lösung
von SPDP in 10 mM TEAA werden hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird
gevortext und für
30 min bei 25°C
inkubiert. Überschüssiges SPDP
wird dann durch drei Extraktionen (Vortexen, Zentrifugieren) mit
jeweils 50 μl
Ethanol entfernt, und die resultierenden Pellets werden in 10 μl 10 mM TEAA-Puffer
pH 7,2 gelöst
und an die thiolierten Träger
gekoppelt (siehe oben).
-
Die
Primerverlängerungsprodukte
werden gereinigt, indem die Membranscheiben dreimal mit jeweils 100 μl NMM-Lösung und
dreimal mit jeweils 100 μl
10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 gewaschen werden. Die gereinigten Primerverlängerungsprodukte
werden durch drei aufeinanderfolgende Behandlungen mit 10 μl 10 mM 2-Mercaptoethanol
in 10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 freigesetzt, lyophilisiert und mit entweder
ES- oder MALDI-Massenspektrometrie analysiert.
-
Das
Verfahren kann ebenso für
massemodifizierte Nukleinsäureprimer
UP0-i in einer analogen und geeigneten Weise
verwendet werden, wobei die chemischen Eigenschaften der massemodifizierenden
Funktionalitäten
in Betracht gezogen werden.
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BEISPIEL 2
-
Immobilisierung von Primerverlängerungsprodukten
der DNS-Sequenzierungsreaktion
nach Sanger zur massenspektrometrischen Analyse über die Lävulinylgruppe
-
5-Aminolävulinsäure wird
an der primären
Aminogruppe mit der Fmoc-Gruppe geschützt, wobei 9-Fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonat
verwendet wird, und wird dann in den N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester)
unter Verwendung von N-Hydroxysuccinimid
und Dicyclohexylcarbodiimid unter Standardbedingungen überführt. Für die Sequenzierungsreaktionen
nach Sanger werden Nukleinsäureprimer
UP0-i verwendet, die mit einer primären Aminogruppe
am 5'-Ende funktionalisiert
sind, die durch Standardverfahren während einer automatisierten
DNS-Synthese mit Aminolinker-Phosphoamiditen als letzter Syntheseschritt
eingeführt
werden. Eine Sequenzierung nach Sanger wird unter Standardbedingungen
durchgeführt
(siehe oben). Die vier Reaktionsmischungen (jeweils 150 μl in einem
Eppendorfröhrchen)
werden für
10 min auf 70°C
erwärmt,
um die DNS-Polymerase zu inaktivieren, ethanolgefällt, zentrifugiert
und in 10 μl
10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 resuspendiert. 10 μl einer 2 mM Lösung des
Fmoc-5-Aminolävulinyl-NHS-Esters
in 10 mM TEAA-Puffer werden hinzugefügt, gevortext und für 30 min
bei 25°C
inkubiert. Der Überschuss
des Reagenzes wird durch Ethanolfällung und Zentrifugation entfernt.
Die Fmoc-Gruppe wird durch Resuspendieren der Pellets in 10 μl einer Lösung von
20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid/Wasser
(1 : 1 V/V) abgespalten. Nach 15 min bei 25°C wird Piperidin durch drei
Präzipitationen/Zentrifugationen
mit jeweils 100 μl
Ethanol gründlich
entfernt, die Pellets werden in 10 μl einer Lösung von N-Methylmorpholin,
2-Propanol und Wasser (2/10/88 V/V/V) resuspendiert, und sie werden
auf den festen Träger
gekoppelt, der eine Isothiocyanatgruppe trägt. Im Falle der DITC-Sequelonmembran (Millipore
Corp., Bedford, MA) werden die Membranen wie in BEISPIEL 1 hergestellt, und
Koppeln wird auf einem Wärmeblock
bei 55°C,
wie oben beschrieben, erzielt. RNS-Verlängerungsprodukte werden auf
analoge Weise immobilisiert. Das Verfahren kann auf andere feste
Träger
mit Isothiocyanatgruppen auf ähnliche
Weise angewendet werden.
-
Die
immobilisierten Primerverlängerungsprodukte
werden ausgiebig dreimal mit jeweils 100 μl NMM-Lösung und dreimal mit 100 μl 10 mM TEAA-Puffer
pH 7,2 gewaschen. Die gereinigten Primerverlängerungsprodukte werden durch
drei aufeinanderfolgende Behandlungen mit 10 μl 100 mM Hydraziniumacetatpuffer
pH 6,5 freigesetzt, lyophilisiert und durch entweder ES- oder MALDI-Massenspektrometrie
analysiert.
-
BEISPIEL 3
-
Immobilisierung von Primerverlängerungsprodukten
einer Sequenzierungsreaktion nach Sanger zur massenspektrometrischen
Analyse über
eine trypsinempfindliche Bindung
-
Membranscheiben
aus Sequelon-DITC mit einem Durchmesser von 8 mm (Millipore Corp,
Bedford, MA) werden mit 10 μl
NMM-Lösung
angefeuchtet (N-Methylmorpholin/Propanol-2/Wasser,
2/49/49 V/V/V), und ein Linkerarm wird durch eine Reaktion mit 10 μl einer 10
mM Lösung
von 1,6-Diaminohexan in NMM eingeführt. Das überschüssige Diamin wird durch drei
Waschschritte mit 100 μl
NMM-Lösung
entfernt. Unter Verwendung von Standardpeptidsyntheseprotokollen
werden zwei L-Lysinreste durch zwei aufeinanderfolgende Kondensationen
mit N-Fmoc-N-tBoc-L-Lysinpentafluorphenylester
verbunden, die endständige
Fmoc-Gruppe wird
mit Piperidin in NNM entfernt, und die freie α-Aminogruppe wird an 1,4-Phenylendiisothiocyanat
(DITC) gekoppelt. Überschüssiges DITC
wird durch drei Waschschritte mit 100 μl 2-Propanol entfernt, und die N-tBoc-Gruppen
werden mit Trifuoressigsäure
gemäß Standardpeptidsyntheseverfahren
entfernt. Die Nukleinsäureprimerverlängerungsprodukte
werden aus Oligonukleotiden hergestellt, die eine primäre Aminogruppe
am 5'-Terminus tragen.
Die vier DNS-Sequenzierungsreaktionsmischungen
nach Sanger (jeweils 150 μl
in Eppendorfröhrchen)
werden für
10 min auf 70°C
erwärmt,
um die DNS-Polymerase zu inaktivieren, ethanolgefällt, und
die Pellets werden in 10 μl
einer Lösung
aus N-Methylmorpholin,
2-Propanol und Wasser (2/10/88, V/V/V) resuspendiert. Diese Lösung wird
auf die Lys-Lys-DITC-Membranscheiben übertragen, wobei die Scheiben
auf einem Wärmeblock,
der auf 55°C
eingestellt ist, befestigt werden. Nach dem Trocknen werden 10 μl der NMM-Lösung hinzugefügt, und
das Trockenverfahren wird wiederholt.
-
Die
immobilisierten Primerverlängerungsprodukte
werden dreimal ausgiebig mit jeweils 100 μl NMM-Lösung und dreimal mit 100 μl 10 mM TEAA-Puffer
pH 7,2 gewaschen. Für
die massenspektrometrische Analyse wird die Bindung zwischen den
Primerverlängerungsprodukten
und dem festen Träger
durch Behandlung mit Trypsin unter Standardbedingungen gespalten,
und die freigesetzten Produkte werden entweder durch ES- oder MALDI-Massenspektrometrie
analysiert, wobei Trypsin als interner Massestandard dient.
-
BEISPIEL 4
-
Immobilisierung von Primerverlängerungsprodukten
einer Sequenzierungsreaktion nach Sanger zur massenspektrometrischen
Analyse über
eine Pyrophosphatbindung
-
Die
DITC-Sequelonmembran (Scheiben mit einem Durchmesser von 8 mm) werden
wie in BEISPIEL 3 hergestellt, und 10 μl einer 10 mM Lösung von
3-Aminopyridinadenindinukleotid
(APAD) (Sigma) in NMM-Lösung
werden hinzugefügt.
Das überschüssige APAD
wird durch Waschen mit 10 μl
NMM-Lösung
entfernt, und die Scheiben werden mit 10 μl 10 mM Natriumperiodat in NMM-Lösung behandelt
(15 min, 25°C). Überschüssiges Periodat
wird entfernt, und die Primerverlängerungsprodukte der vier DNS-Sequenzierungsreaktionen nach
Sanger (jeweils 150 μl
in Eppendorfröhrchen),
die Nukleinsäureprimer
mit einer primären
Aminogruppe am 5'-Ende
verwenden, werden ethanolgefällt,
in 10 μl
einer Lösung
aus N-Methylmorpholin/2-Propanol/Wasser (2/10/88, V/V/V) gelöst und an
die 2',3'-Dialdehydgruppen des immobilisierten
NAD-Analogons gekoppelt.
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Die
Primerverlängerungsprodukte
werden ausgiebig mit der NMM-Lösung
(dreimal mit jeweils 100 μl) und
mit 10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 (dreimal mit jeweils 100 μl) gewaschen,
und die gereinigten Primerverlängerungsprodukte
werden durch Behandlung mit entweder NADase oder Pyrophosphatase
in 10 mM TEAA bei pH 7,2 bei 37°C
für 15
min freigesetzt, lyophilisiert und durch entweder ES- oder MALDI-Massenspektrometrie analysiert,
wobei die Enzyme als interner Massestandard dienen.
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BEISPIEL 5
-
Synthese von Nukleinsäureprimern,
die durch Glycinreste an der 5'-Position
des Zuckerrestes des endständigen
Nukleosids massemodifiziert sind
-
Oligonukleotide
werden durch automatisierte Standard-DNS-Synthese unter Verwendung
von β-Cyanoethylphosphoamiditen
(H. Köster,
Nucleic Acids Res. 12, 4539 (1984)) synthetisiert, und eine 5'-Aminogruppe wird
am Ende der Festphasen-DNS-Synthese
(z. B: Agrawal et al., Nucleic Acids Res. 14, 6227–45 (1986) oder
Sproat et al., Nucleic Acids Res. 15, 6181–96 (1987)) eingeführt. Die
Gesamtmenge der mit 0,25 μmol CPG-gebundenem
Nukleosid gestarteten Oligonukleotidsynthese wird mit konzentriertem
wässerigem
Ammoniak entschützt, über OligoPAKTM-Kartuschen
(Millipore Corp., Bedford, MA) gereinigt und lyophilisiert. Dieses Material
mit einer 5'-terminalen
Aminogruppe wird in 100 μl
absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und mit 10 μmol N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester
für 60
min bei 25°C
kondensiert. Nach Ethanolfällung und
Zentrifugation wird die Fmoc-Gruppe durch 10minütige Behandlung mit 100 μl einer Lösung aus
20% Piperidin in N,N-Dimethylformamid
abgespalten. Überschüssiges Piperidin,
DMF und die Spaltprodukte der Fmoc-Gruppe werden durch Ethanolfällung entfernt,
und das Präzipitat
wird aus 10 mM TEAA-Puffer pH 7,2 lyophilisiert. Dieses Material
wird nun entweder als Primer für
DNS-Sequenzierungsreaktionen nach Sanger, oder ein oder mehrere
Glycinreste (oder andere geeignete geschützte aktive Aminosäureester)
werden hinzugefügt,
um eine Serie von massemodifizierten Primeroligonukleotiden zu schaffen,
die zur DNS- oder RNS-Sequenzierung nach Sanger geeignet sind. Immobilisierung
dieser massemodifizierten Nukleinsäureprimer UP0-i kann
nach Primerverlängerung
während
des Sequenzierungsverfahrens wie z. B. in den BEISPIELEN 1 bis 4 beschrieben
erzielt werden.
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BEISPIEL 6
-
Synthese von Nukleinsäureprimern,
die am C-5 der heterocyclischen Base eines Pyrimidinnukleosids mit
Glycinresten massemodifiziert sind
-
Ausgangsmaterial
war 5-(3-Aminopropynyl-1)-3',5'-di-p-tolyldesoxyuridin,
das nach Literaturverfahren hergestellt und 3',5'-de-O-acetyliert
wurde (Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 15, 4857–76 (1987)).
0,281 g (1,0 mmol) 5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin
wurden mit 0,927 g (2,0 mmol) N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester in 5 ml
absolutem N,N-Dimethylformamid für
60 min bei Raumtemperatur in Anwesenheit von 0,129 g (1 mmol, 174 μl) N,N-Diisopropylethylamin
zur Reaktion gebracht. Lösungsmittel
wurden durch Rotationsverdampfen entfernt, und das Produkt wurde
durch Silicagel-Chromatographie
gereinigt (Kieselgel 60, Merck, Säule: 2,5 × 50 cm, Elution mit Chloroform/Methanolgemischen).
Die Ausbeute war 0,44 g (0,78 mmol, 78%). Um einen weiteren Glycinrest
hinzuzufügen,
wurde die Fmoc-Gruppe durch eine 20minütige Behandlung mit einer 20%igen
Lösung
aus Piperidin in DMF entfernt, im Vakuum abgezogen, und der verbleibende Feststoff
wurde dreimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Nach Entfernung
des verbleibenden Ethylacetats wird N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester wie
oben beschrieben gekoppelt. 5-(3-(N-Fmoc-Glycyl)-amidopropynyl-1)-2'-desoxyuridin wird
in das 5'-O-dimethoxytritylierte
Nukleosid-3'-O-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoamidit überführt und
in einer automatisierten Oligonukleotidsynthese durch Standardverfahren
(H. Köster et
al., Nucleic Acids Res. 12, 2261 (1984)) eingebaut. Diese glycinmodifizierten
thymidinanalogen Bausteine zur chemischen DNS-Synthese können verwendet
werden, um eines oder mehrere der Thymidin/Uridinnukleotide in der
Nukleinsäureprimersequenz
zu ersetzen. Die Fmoc-Gruppe wird am Ende der Festphasensynthese
mit einer 20minütigen
Behandlung mit einer 20%igen Lösung
von Piperidin in DMF bei Raumtemperatur entfernt. DMF wird durch
einen Waschschritt mit Acetonitril entfernt, und das Oligonukleotid
wird entschützt und
auf Standardweise gereinigt.
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BEISPIEL 7
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Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der am C-5 der heterocyclischen Base eines Pyrimidinnukleosids mit β-Alaninresten
massemodifiziert ist
-
Das
Ausgangsmaterial entsprach dem aus Beispiel 6. 0,281 g (1,0 mmol)
5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin wurden
mit N-Fmoc-β-Alaninpentafluorphenylester
(0,955 g, 2,0 mmol) in 5 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) für 60 min
bei Raumtemperatur in Anwesenheit von 0,129 g (174 μl, 1,0 mmol)
N,N-Diisopropylethylamin
zur Reaktion gebracht. Lösungsmittel
wurden entfernt, und das Produkt wurde durch Silicagel-Chromatographie
wie in Beispiel 6 beschrieben gereinigt. Die Ausbeute war 0,425
g (0,74 mmol, 74%). Ein weiterer β-Alaninrest
kann auf exakt dieselbe Weise nach Entfernen der Fmoc-Gruppe hinzugefügt werden.
Die Herstellung des 5'-O-dimethoxytritylierten
Nukleosid-3'-O-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoamidits
aus 5-(3-(N-Fmoc-β-Alanyl)-amidopropynyl-1)-2'-desoxyuridin und Einbau in automatisierter
Oligonukleotidsynthese wird unter Standardbedingungen durchgeführt. Dieser
Baustein kann beliebige der Thymidin/Uridinreste in den Nukleinsäureprimersequenzen
ersetzen. Im Falle von nur einem eingebauten massemodifizierten
Nukleotid hätten
die Nukleinsäureprimermoleküle, die
gemäß den BEISPIELEN
6 und 7 hergestellt würden,
einen Masseunterschied von 14 Dalton.
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BEISPIEL 8
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Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der am C-5 der heterocyclischen Base eines Pyrimidinnukleosids mit Ethylenglycolmonomethylether
massemodifiziert ist
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Als
nukleosidischer Bestandteil wurde in diesem Beispiel 5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin verwendet
(siehe BEISPIELE 6 und 7). Die massemodifizierende Funktionalität wurde
wie folgt erhalten: 7,61 g (100,0 mmol) frisch destillierter Ethylenglycolmonomethylether
gelöst
in 50 ml absolutem Pyridin wurden mit 10,01 g (100,0 mmol) umkristallisiertem
Bernsteinsäureanhydrid
in Anwesenheit von 1,22 g (10,0 mmol) 4-N,N-Dimethylaminopyridin über Nacht
bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Reaktion wurde durch
Hinzufügen
von Wasser (5,0 ml) beendet, die Reaktionsmischung wurde im Vakuum
abgezogen, zweimal zusammen mit trockenem Toluol (jeweils 20 ml)
abgezogen, und der Rückstand
wurde in 100 ml Dichlormethan wieder aufgelöst. Die Lösung wurde nacheinander zweimal
mit 10%iger wässeriger
Zitronensäure
(2 × 20
ml) und einmal mit Wasser (20 ml) extrahiert, und die organische
Phase wurde über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde
im Vakuum abgezogen, der Rückstand
wurde in 50 ml Dichlormethan gelöst
und in 500 ml Pentan ausgefällt,
und das Präzipitat
wurde im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute war 13,12 g (74,0 mmol,
74 %). 8,86 g (50,0 mmol), des succinylierten Ethylenglycolmonomethylethers wurden
in 100 ml Dioxan gelöst,
das 5% trockenes Pyridin (5 ml) enthielt, und 6,96 g (50,0 mmol)
4-Nitrophenol und 10,32 g (50,0 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid wurden
hinzugefügt,
und die Reaktion lief bei Raumtemperatur für 4 Stunden. Dicyclohexylharnstoff
wurde durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde im Vakuum abgezogen,
und der Rückstand
wurde wieder in 50 ml wasserfreiem DMF aufgelöst. 12,5 ml (etwa 12,5 mmol
4-Nitrophenylester) dieser Lösung
wurden verwendet, um 2,81 g (10,0 mmol) 5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin zu
lösen.
Die Reaktion wurde in Anwesenheit von 1,01 g (10,0 mmol, 1,4 ml)
Triethylamin bei Raumtemperatur über
Nacht durchgeführt.
Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum abgezogen, zusammen mit Toluol abgezogen,
in Dichlormethan wieder aufgelöst
und mit Silicagel (Si60, Merck, Säule 4 × 50 cm) mit Dichlormethan/Methanolmischungen
chromatographiert. Die Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthielten,
wurden gesammelt, abgezogen, in 25 ml Dichlormethan wieder gelöst und in
250 ml Pentan gefällt.
Das getrocknete Präzipitat
von 5-(3-N-(O-Succinylethylenglycolmonomethylether)-amidopropynyl-1)-2'-desoxyuridin (Ausbeute 65%) wird O-dimethoxytrityliert
und in das Nukleosid-3'-O-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoamidit überführt und
als Baustein in automatisierten Oligonukleotidsynthesen gemäß Standardverfahren
eingebaut. Das massemodifizierte Nukleotid kann einen oder mehrere
der Thymidin/Uridinreste in der Nukleinsäureprimersequenz ersetzen.
Entschützen
und Reinigen der Primeroligonukleotide folgt ebenso Standardverfahren.
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BEISPIEL 9
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Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der am C-5 der heterocyclischen Base eines Pyrimidinnukleosids mit Ethylenglycolmonomethylether
massemodifiziert ist
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Das
nukleosidische Ausgangsmaterial 5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin entsprach
dem der vorhergehenden Beispiele. Die massemodifizierende Funktionalität wurde
auf ähnliche
Weise wie in BEISPIEL 8 erhalten. 12,02 g (100,0 mmol) frisch destillierter
Diethylenglycolmonomethylether gelöst in 50 ml absolutem Pyridin
wurde mit 10,01 g (100,0 mmol) umkristallisiertem Bernsteinsäureanhydrid
in Anwesenheit von 1,22 g (10,0 mmol) 4-N,N-Dimethylaminopyridin
(DMAP) über
Nacht bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Aufarbeitung
war wie in BEISPIEL 8 beschrieben. Die Ausbeute war 18,35 g (82,3
mmol, 82,3%). 11,06 g (50,0 mmol) des succinylierten Diethylenglycolmonomethylethers
wurden in den 4-Nitrophenylester überführt, und darauf
wurden 12,5 mmol mit 2,81 g (10,0 mmol) 5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin wie
in BEISPIEL 8 beschrieben zur Reaktion gebracht. Die Ausbeute nach
Silicagel-Säulenchromatographie
und Fällung
in Pentan war 3,34 g (6,9 mmol, 69%). Nach Dimethoxytritylierung
und Überführung in
das Nukleosid-β-cyanoethylphosphoamidit
werden die massemodifizierten Bausteine in automatisierten chemischen
DNS-Synthesen gemäß Standardverfahren
eingebaut. Innerhalb der Sequenz des Nukleinsäureprimers UP0-i können ein
oder mehrere der Thymidin/Uridinreste durch dieses massemodifizierte
Nukleotid ersetzt werden. Im Falle von nur einem eingebauten massemodifizierten
Nukleotid hätten
die Nukleinsäureprimermoleküle aus den
BEISPIELEN 8 und 9 einen Masseunterschied von 44,05 Dalton.
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BEISPIEL 10
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Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der am C-8 der heterocyclischen Base eines Desoxyadenosins mit Glycin
massemodifiziert ist
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Das
Ausgangsmaterial war N6-Benzoyl-8-bromo-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin, das gemäß der Literatur
hergestellt wurde (Singh et al., Nucleic Acids Res. 18, 3339–45, (1990)).
632,5 mg (1,0 mmol) dieses 8-Bromodesoxyadenosinderivats
wurden in 5 ml absolutem Ethanol suspendiert und mit 251,2 mg (2,0
mmol) Glycinmethylester (Hydrochlorid) in Anwesenheit von 241,4
mg (2,1 mmol, 366 μl)
N,N-Diisopropylethylamin zur Reaktion gebracht und refluxiert, bis
das nukleosidische Ausgangsmaterial verschwunden war (4–6 Stunden),
was durch Dünnschichtchromatographie
(thin layer chromatography, TLC) überprüft wurde. Das Lösungsmittel
wurde abgezogen, und der Rückstand
wurde durch Silicagel-Chromatographie (Säule 2,5 × 50 cm) gereinigt, wobei Lösungsmittelmischungen
aus Chloroform/Methanol verwendet wurden, die 0,1 Pyridin enthielten.
Die Produktfraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel wurde abgezogen,
die Fraktionen wurden in 5 ml Dichlormethan gelöst und in 100 ml Pentan gefällt. Die
Ausbeute war 487 mg (0,76 mmol, 76%). Die Überführung in das entsprechende
Nukleosid-β-cyanoethylphosphoamidit
und Einbau in einer automatisierten chemischen DNS-Synthese wird
unter Standardbedingungen durchgeführt. Während der endgültigen Entschützung mit
konzentriertem wässerigem
Ammoniak werden die Methylgruppen von den Glycingruppen entfernt.
Der massemodifizierte Baustein kann einen oder mehrere Desoxyadenosin/Adenosinreste in
der Nukleinsäureprimersequenz
ersetzen.
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BEISPIEL 11
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Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der am C-8 der heterocyclischen Base eines Desoxyadenosins mit Glycylglycin
massemodifiziert ist
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Dieses
Derivat wurde analog zu dem Glycinderivat aus BEISPIEL 10 hergestellt.
632,5 mg (1,0 mmol) N6-Benzoyl-8-bromo-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin wurden in 5 ml absolutem
Ethanol suspendiert und mit 324,3 mg (2,0 mmol) Glycylglycinmethylester
in Anwesenheit von 241,4 mg (2,1 mmol, 366 μl) N,N-Diisopropylethylamin
zur Reaktion gebracht. Die Mischung wurde refluxiert, und die Vollständigkeit
der Reaktion wurde durch TLC überprüft. Aufarbeitung
und Reinigung waren zu der ähnlich,
die in BEISPIEL 10 beschrieben wurde. Die Ausbeute nach Silicagel-Säulenchromatographie
und Fällung
in Pentan war 464 mg (0,65 mmol, 65%). Die Überführung in das Nukleosid-β-cyanoethylphosphoamidit
und in synthetische Oligonukleotide wurde gemäß Standardverfahren durchgeführt. Falls
nur einer der Desoxyadenosin-/Adenosinreste im Nukleinsäureprimer
durch dieses massemodifizierte Nukleotid ersetzt ist, beträgt der Masseunterschied zwischen
den Nukleinsäureprimern
der BEISPIELE 10 und 11 57,03 Dalton.
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BEISPIEL 12
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Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der am C-2' des
Zuckerrestes des 2'-Amino-2'-desoxythymidins
mit Ethylenglycolmonomethyletherresten massemodifiziert ist
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Ausgangsmaterial
war 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-2'-amino-2'-desoxythymidin,
das gemäß veröffentlichten
Verfahren synthetisiert wurde (z. B. Verheyden et al., J. Org. Chem.
36, 250–254
(1971), Sasaki et al., J. Org. Chem. 41, 3138–3143 (1976) Imazawa et al.,
J. Org. Chem. 44, 2039–2041
(1979), Hobbs et al., J. Org. Chem. 42, 714–719 (1976), Ikehara et al.,
Chem. Pharm. Bull. Japan 26, 240–244 (1978), siehe ebenso PCT-Anmeldung
WO 88/00201). 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-2'-amino-2'-desoxythymidin (559,62 mg, 1,0 mmol) wurde
mit 2,0 mmol des 4-Nitrophenylesters eines succinylierten Ethylenglycolmonomethylethers
(siehe BEISPIEL 8) in 10 ml trockenem DMF in Anwesenheit von 1,0
mmol (140 μl)
Triethylamin für
18 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung
wurde im Vakuum abgezogen, zusammen mit Toluol abgezogen, wieder
in Dichlormethan gelöst
und mit Silicagel-Chromatographie (Si60, Merck, Säule 2,5 × 50 cm,
Elutionsmittel: Chloroform/Methanolmischungen, die 0,1% Triethylamin
enthalten) gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten,
wurden vereinigt, abgezogen und in Pentan gefällt. Die Ausbeute war 524 mg
(0,73 mmol, 73%). Die Überführung in
das Nukleosid-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoamidit
und Einbau in einem automatisierten chemischen DNS-Syntheseprotokoll
wird mit Standardverfahren durchgeführt. Das massemodifizierte
Desoxythymidinderivat kann einen oder mehrere Thymidinreste im Nukleinsäureprimer
ersetzen.
-
Auf
analoge Weise werden die entsprechenden massemodifizierten Oligonukleotide
unter Verwendung von 4-Nitrophenylester von succinyliertem Diethylenglycolmonomethylether
(siehe BEISPIEL 9) und Triethylenglycolmonomethylether hergestellt.
Im Falle von nur einem in die Sequenz eingebauten massemodifizierten
Nukleosid beträgt
der Masseunterschied zwischen den Ethylen-, Diethylen- und Triethylenglycolderivaten
44,05, 88,1 bzw. 132,15 Dalton.
-
BEISPIEL 13
-
Synthese eines Nukleinsäureprimers,
der an der Internukleotidbindung über Alkylierung von Phosphorthioatgruppen
massemodifiziert ist
-
Phosphorthioat
enthaltende Oligonukleotide wurden gemäß Standardverfahren hergestellt
(siehe z. B. Gait et al., Nucleic Acids Res. 19, 1183 (1991)). Eine,
mehrere oder alle Internukleotidbindungen können auf diese Weise modifiziert
werden. Die (–)-M13-Nukleinsäureprimersequenz
(17mer) 5'-dGTAAAACGACGGCCAGT
(SEQ ID NO: 6) wurde im 0,25-μmol-Maßstab auf
einem DNS-Synthesizer synthetisiert, wobei eine Phosphorthioatgruppe
nach dem letzten Synthesezyklus eingeführt wurde (G-zu-T-Kopplung).
Sulfurisierung, Entschützung
und Reinigung folgten Standardprotokollen. Die Ausbeute war 31,4
mmol (12,6 Gesamtausbeute), was 31,4 nmol Phosphorthioatgruppen
entsprach. Alkylierung wurde durchgeführt, indem der Rückstand in
31,4 μl
TE-Puffer (0,01 M Tris pH 8,0, 0,001 M EDTA) gelöst wurde und indem 16 μl einer Lösung von
20 mM Lösung
von 2-Iodethanol (320 nmol, d. h. 10facher Überschuss in Bezug auf Phosphorthioatdiester)
in N,N-Dimethylformamid (DMF) hinzugefügt wurden. Das alkylierte Oligonukleotid
wurde durch Standardumkehrphasen-HPLC (RP-18 Ultraphere, Beckman,
Säule:
4,5 × 250
mm, 100 mM Triethylammoniumacetat, pH 7,0 und ein Gradient von 5
bis 40% Acetonitril) gereinigt.
-
In
einer Variation dieses Verfahrens wird der Nukleinsäureprimer,
der ein oder mehrere Phosphorthioatphosphodiesterbindungen enthält, in den
Sequenzierungsreaktionen nach Sanger verwendet. Die Primerverlängerungsprodukte
der vier Sequenzierungsreaktionen werden wie exemplarisch in den
BEISPIELEN 1–4 dargestellt
gereinigt, vom festen Träger
abgespalten, lyophilisiert und jeweils in 4 μl TE-Puffer pH 8,0 gelöst und alkyliert,
indem 2 μl
einer 20 mM Lösung
von 2-Iodethanol in DMF hinzugefügt
werden. Dann wird es durch ES- und/oder MALDI-Massenspektrometrie
analysiert.
-
Auf
analoge Weise können
durch Verwendung anstatt von 2-Iodethanol von z. B. 3-Iodpropanol,
4-Iodbutanol massemodifizierte Nukleinsäureprimer mit einer Massedifferenz
von 14,03, 28,06 bzw. 42,03 Dalton im Vergleich zum nichtmodifizierten
Phosphorthioat-Phosphodiester enthaltenden Oligonukleotid erhalten
werden.
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BEISPIEL 14
-
Synthese von 2'-Amino-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat und
3'-Amino-2',3'-didesoxythymidin-5'-triphosphat, die an der 2'- oder 3'-Aminofunktion mit
Glycin- oder β-Alaninresten
massemodifiziert sind
-
Ausgangsmaterial
war 2'-Azido-2'-desoxyuridin, das
gemäß der Literatur
hergestellt wurde (Verheyden et al., J. Org. Chem. 36, 250 (1971)),
das in einer Eintopfreaktion unter Standardreaktionsbedingungen am
5'-OH mit 4,4-Dimethoxytritylchlorid
in Pyridin 4,4-dimethoxytrityliert und am 3'-OH mit Essigsäureanhydrid acetyliert wurde.
Mit 191 mg (0,71 mmol) 2'-Azido-2'-desoxyuridin als Ausgangsmaterial wurden
396 mg (0,65 mmol, 90,8%) 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-3'-O-acetyl-2'-azido-2'-desoxyuridin nach
Reinigung mit Silicagel-Chromatographie
erhalten. Eine Reduktion der Azidogruppe wurde unter Verwendung
von veröffentlichten Bedingungen
durchgeführt
(Barta et al., Tetrahedron 46, 587–594, (1990)). Die Ausbeute
von 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-3'-O-acetyl-2'-amino-2'-desoxyuridin nach
Silicagel-Chromatographie war 288 mg (0,49 mmol, 76%). Dieses geschützte 2'-Amino-2'-desoxyuridinderivat
(588 mg, 1,0 mmol) wurde mit 2 Äquivalenten
(927 mg, 2,0 mmol) N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester in 10 ml trockenem
DMF über
Nacht bei Raumtemperatur in Anwesenheit von 1,0 mmol (174 μl) N,N-Diisopropylethylamin
zur Reaktion gebracht. Lösungsmittel
wurden durch Abziehen im Vakuum entfernt, und der Rückstand
wurde durch Silicagel-Chromatographie gereinigt. Die Ausbeute war
711 mg (0,71 mmol, 82%). Detritylierung wurde durch eine einstündige Behandlung
mit 80%iger wässeriger
Essigsäure
bei Raumtemperatur erzielt. Der Rückstand wurde bis zur Trockene
abgezogen, zweimal zusammen mit Toluol abgezogen, in 1 ml trockenem
Acetonitril suspendiert und mit POCl3 gemäß der Literatur
5'-phosphoryliert
(Yoshikawa et al., Bull. Chem. Soc. Japan 42, 3505 (1969) und Sowa
et al., Bull. Chem. Soc. Japan 48, 2048 (1975)) und direkt in einer
Eintopfreaktion in das 5'-Triphosphat
unter Verwendung von 3 ml einer 0,5 M-Lösung (1,5 mmol) von tetra(tri-n-Butylammonium)pyrophosphat
in DMF gemäß der Literatur
(z. B. Seela et al., Helvetica Chimica Acta 74, 1048 (1991)) transformiert.
Die Fmoc- und die 3'-O-Acetylgruppen wurden
durch eine einstündige
Behandlung mit konzentriertem wässerigem
Ammoniak bei Raumtemperatur entfernt, und die Reaktionsmischung
wurde abgezogen und lyophilisiert. Ebenso folgte die Reinigung Standardverfahren
unter Verwendung von Anionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sephadex
mit einem linearen Gradienten von Triethylammoniumbicarbonat (0,1
M–1,0
M). Triphosphat enthaltende Fraktionen (überprüft durch Dünnschichtchromatographie auf
Polyethylenimincelluloseplatten) wurden gesammelt, abgezogen und
lyophilisiert. Die Ausbeute (durch UV-Absorption der Uracilgruppe)
war 68% (0,48 mmol).
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Ein
glycylglycinmodifiziertes 2'-Amino-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat wurde
durch Entfernen der Fmoc-Gruppe aus 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-3'-O-acetyl-2'-N-(N-9-fluorenylmethyloxycarbonyl-glycyl)-2'-amino-2'-desoxyuridin durch
eine einstündige
Behandlung mit einer 20%igen Lösung
von Piperidin in DMF bei Raumtemperatur, Abziehen von Lösungsmitteln,
zweifaches Abziehen zusammen mit Toluol und nachfolgende Kondensation
mit N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester erhalten. Ausgehend von 1,0
mmol des 2'-N-Glycyl-2'-amino-2'-desoxyuridinderivates
und folgend dem Verfahren wie oben beschrieben, wurden 0,72 mmol (72%)
des entsprechenden 2'-(N-Glycylglycyl)-2'-amino-2'-desoxyuridin-5'-triphosphats erhalten.
-
Ausgehend
von 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-3'-O-acetyl-2'-amino-2'-desoxyuridin und
Koppeln mit N-Fmoc-β-Alaninpentafluorphenylester
kann das entsprechende 2'-(N-β-Alanyl)-2'-amino-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat synthetisiert
werden. Diese modifizierten Nukleosidtriphosphate werden während des DNS-Sequenzierungsverfahrens
nach Sanger in die Primerverlängerungsprodukte
eingebaut. Die Massedifferenz zwischen den glycin-, β-alanin-
und glycylglycinmassemodifizierten Nukleosiden beträgt pro eingebautem Nukleotid
58,06, 72,09 bzw. 115,1 Dalton.
-
Wenn
man von 5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-3'-amino-2',3'-didesoxythymidin
(erhalten durch veröffentlichte
Verfahren, siehe BEISPIEL 12) ausgeht, können die entsprechenden 3'-(N-Glycyl)-3'-amino-/, 3'-(N-Glycylglycyl)-3'-amino-/ und 3'-(N-β-Alanyl)-3'-amino-2',3'-didesoxythymidin-5'-triphosphate erhalten
werden. Die massemodifizierten Nukleosidtriphosphate dienen als
eine terminierende Nukleotideinheit in den DNS-Sequenzierungsreaktionen
nach Sanger und stellen eine Massedifferenz pro terminiertem Fragment
von 58,06, 72,09 bzw. 115,1 Dalton bereit, wenn sie im Multiplexsequenzierungsmodus
verwendet werden. Die massedifferenzierten Fragmente können dann
durch ES- und/oder MALDI-Massenspektrometrie
analysiert werden.
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BEISPIEL 15
-
Synthese von Desoxyuridin-5'-triphosphat, das
am C-5 der heterocyclischen Base mit Glycin-, Glycylglycin oder β-Alaninresten
massemodifiziert ist
-
0,281
g (1,0 mmol) 5-(3-Aminopropynyl-1)-2'-desoxyuridin (siehe BEISPIEL 6) wurden
entweder mit 0,927 g (2,0 mmol) N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester
oder 0,955 g (2,0 mmol) N-Fmoc-β-Alaninpentafluorphenylester
in 5 ml trockenem DMF über
Nacht bei Raumtemperatur in Anwesenheit von 0,129 g N,N-Diisopropylethylamin
(174 μl,
1,0 mmol) zur Reaktion gebracht. Lösungsmittel wurden durch Abziehen
im Vakuum entfernt, und die Kondensationsprodukte wurden durch Flashchromatographie
auf Silicagel gereinigt (Still et al., J. Org. Chem. 43, 2923–2925 (1978)).
Die Ausbeute war 476 mg (0,85 mmol, 85%) für das Glycin- und 436 mg (0,76
mmol, 76%) für
das β-Alaninderivat.
Für die
Synthese des Glycylglycinderivates wurde die Fmoc-Gruppe von 1,0
mmol Fmoc-Glycindesoxyuridinderivat
durch eine einstündige
Behandlung mit 20%igem Piperidin in DMF bei Raumtemperatur entfernt.
Lösungsmittel
wurden im Vakuum abgezogen, der Rückstand wurde zweimal zusammen
mit Toluol abgezogen und mit 0,927 g (2,0 mmol) N-Fmoc-Glycinpentafluorphenylester
kondensiert und wie oben beschrieben gereinigt. Die Ausbeute war
455 mg (0,72 mmol, 72%). Die Glycyl-, Glycylglycyl und β-Alanyl-2'-desoxyuridinderivate,
die durch die Fmoc-Gruppe N-geschützt waren, wurden
in die 3'-O-Acetylderivate
durch Tritylierung mit 4,4- Dimethoxytritylchlorid
in Pyridin und Acetylierung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin in einer
Eintopfreaktion überführt und
danach durch eine einstündige
Behandlung mit 80%iger wässeriger
Essigsäure
gemäß Standardverfahren
detrityliert. Lösungsmittel
wurden entfernt, die Rückstände wurden
in 100 ml Chloroform gelöst
und zweimal mit 50 ml 10%igem Natriumbicarbonat und einmal mit 50
ml Wasser extrahiert, mit Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel
wurde abgezogen, und der Rückstand
wurde mit Flashchromatographie über
Silicagel gereinigt. Die Ausbeuten waren 361 mg (0,60 mmol, 71%)
für das
Glycyl-, 351 mg (0,57 mmol, 75%) für das β-Alanyl- bzw. 323 mg (0,49 mmol, 68%) für das Glycylglycyl-3-O'-acetyl-2'-desoxyuridinderivat. Phosphorylierung
am 5'-OH mit POCl3, Überführung in das
5'-Triphosphat durch
eine in situ-Reaktion mit tetra(tri-n-Butylammonium)pyrophosphat
in DMF, 3'-De-O-acetylierung,
Spaltung der Fmoc-Gruppe, die endgültige Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie
auf DEAE-Sephadex wurde wie in BEISPIEL 14 beschrieben durchgeführt. Die
Ausbeuten entsprechend der UV-Absorption
der Uracilgruppe waren 0,41 mmol 5-(3-(N-Glycyl)-amidopropynyl-1)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (84%), 0,43 mmol 5-(3-(N-β-Alanyl)-amidopropynyl-1)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (75%) und 0,38 mmol 5-(3-(N-Glycylglycyl)-amidopropynyl-1)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (78%).
-
Diese
massemodifizierten Nukleosidtriphosphate wurden während der
DNS-Primerverlängerungsreaktionen
nach Sanger eingebaut.
-
Bei
Verwendung von 5-(3-Aminopropynyl-1)-2',3'-desoxyuridin
als Ausgangsmaterial und Ausführen einer
analogen Reaktionssequenz wurden die entsprechenden Glycyl-, Glycylglycyl-
und β-Alanyl-2',3'-didesoxyuridin-5'-triphosphate in Ausbeuten von 69, 63
bzw. 71% erhalten. Diese massemodifizierten Nukleosidtriphosphate
dienen als kettenterminierende Nukleotide während der DNS-Sequenzierungsreaktionen
nach Sanger. Die massemodifizierten Sequenzierungsleitern werden
entweder durch ES- oder MALDI-Massenspektrometrie
analysiert.
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BEISPIEL 16
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Synthese von 8-Glycyl-
und 8-Glycylglycyl-2'-desoxyadenosin-5'-triphosphat
-
727
mg (1,0 mmol) von N6-(4-tert-Butylphenoxyacetyl)-8-glycyl-5'-(4,4-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin oder
800 mg (1,0 mmol) N6-(4-tert-Butylphenoxyacetyl)-8-glycylglycyl-5'-(4,4-dimethoxytrityl)-2'-desoxyadenosin,
die gemäß den BEISPIELEN
10 und 11 und der Literatur hergestellt wurden (Köster et
al., Tetrahedron 37, 362 (1981), wurden mit Essigsäureanhydrid
in Pyridin am 3'-OH
acetyliert, an der 5'-Position
mit 80% Essigsäure
in einer Eintopfreaktion detrityliert und über Phosphorylierung mit POCl3 und in situ-Reaktion mit tetra(tri-n-butylammonium)pyrophosphat
wie in BEISPIEL 14 beschrieben in die Triphosphate überführt. Entschützung der
N6-tert-Butylphenoxyacetyl-, der 3'-O-Acetyl- und der
O-Methylgruppe an
den Glycinresten wurde mit konzentriertem wässerigem Ammoniak für neunzig
Minuten bei Raumtemperatur erzielt. Das Ammoniak wurde durch Lyophilisierung
entfernt, und der Rückstand
wurde mit Dichlormethan gewaschen, das Lösungsmittel wurde durch Abziehen
im Vakuum entfernt, und das verbleibende feste Material wurde durch
Anionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sephadex unter Verwendung
eines linearen Gradienten von Triethylammoniumbicarbonat von 0,1
bis 1,0 M gereinigt. Die Nukleosidtriphosphat enthaltenden Fraktionen
(überprüft durch
TLC auf Polyethylenimincelluloseplatten) wurden vereinigt und lyophilisiert.
Die Ausbeute des 8-Glycyl-2'-desoxyadenosin-5'-triphosphats (bestimmt
durch UV-Absorption
der Adeningruppe) war 57% (0,57 mmol). Die Ausbeute des 8-Glycylglycyl-2'-desoxyadenosin-5'-triphosphats war
51% (0,51 mmol).
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Diese
massemodifizierten Nukleosidtriphosphate wurden während der
Primerverlängerung
in den DNS-Sequenzierungsreaktionen nach Sanger eingebaut.
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Bei
Verwendung der entsprechenden N6-(4-tert-Butylphenoxyacetyl)-8-glycyl- oder -glycylglycyl-5'-O-(4,4-dimethoxytrityl)-2',3'-didesoxyadenosinderivate
als Ausgangsmaterialien, die gemäß Standardverfahren
hergestellt wurden (siehe z. B. für die Einführung der 2',3'-Funktion:
Seela et al., Helvetica Chimica Acta 74, 1048–1058 (1991)) und Verwendung
einer analogen Reaktionssequenz wie oben beschrieben wurden die
kettenterminierenden massemodifizierten Nukleosidtriphosphate 8-Glycyl-
und 8-Glycylglycyl-2',3'-didesoxyadenosin-5'-triphosphate in Ausbeuten von 53 bzw.
47% erhalten. Die massemodifizierten Sequenzierungsfragmentleitern
werden entweder durch ES- oder MALDI-Massenspektrometrie analysiert.
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BEISPIEL 17
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Massemodifikation von
DNS-Sequenzierungsfragmentleitern nach Sanger durch Einbau von kettenverlängernden
2'-Desoxy- und kettenterminierenden
2',3'-Didesoxythymidin-5'-(alpha-S-)-triphosphaten
und nachfolgende Alkylierung mit 2-Iodethanol und 3-Iodpropanol
-
2',3'-Didesoxythymidin-5'-(alpha-S)-triphosphat
wurde gemäß veröffentlichten
Verfahren hergestellt (z. B. für
die alpha-S-Triphosphatgruppe: Eckstein et al., Biochemistry 15,
1685 (1976) und Accounts Chem. Res. 12, 204, (1978) und für die 2',3'-Didesoxygruppe:
Seela et al., Helvetica Chimica Acta, 74, 1048–1058 (1991)). DNS-Sequenzierungsreaktionen
nach Sanger, die 2'-Desoxythymidin-5'-(alpha-S)-triphosphat verwenden,
werden gemäß Standardprotokollen
durchgeführt
(z. B. Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54, 367 (1985)). Bei Verwendung
von 2',3'-Didesoxythymidin-5'-(alpha-S)-triphosphaten wird dieses
anstatt des nichtmodifizierten 2',3'-Didesoxythymidin-5'-triphosphates bei
Standard-DNS-Sequenzierungen
nach Sanger verwendet (siehe z. B. Swerdlow et al., Nucleic Acids
Res. 18, 1415–1419
(1990)). Das Template (2 pmol) und der M13-Nukleinsäuresequenzierungsprimer (4
pmol), die gemäß BEISPIEL
1 modifiziert sind, werden durch Erwärmen für 5 min auf 65°C in 100 μl 10 mM Tris-HCl
pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 7 mM Dithiothreitol (DTT)
annealt und langsam für
eine Stunde auf 37°C
gebracht. Die Sequenzierungsreaktionsmischung enthält, wie
für die
T-spezifische Terminationsreaktion
exemplarisch dargestellt, in einem Endvolumen von 150 μl 200 μM (Endkonzentration)
von jeweils dATP, dCTP, dTTP, 300 μM c7-Desaza-dGTP, 5 μM 2',3'-Didesoxythymidin-5'-(alpha-S)-triphosphat
und 40 Einheiten Sequenase (United States Biochemicals). Die Polymerisation wird
für 10
min bei 37°C
durchgeführt,
die Reaktionsmischung wird auf 70°C
erwärmt,
um die Sequenase zu inaktivieren, und ethanolgefällt und an thiolierte Sequelon-Membranscheiben (8
mm Durchmesser) gekoppelt, wie in BEISPIEL 1 beschrieben. Eine Alkylierung
wird durchgeführt,
indem die Scheiben mit 10 μl
10 mM Lösung
von entweder 2-Iodethanol oder 3-Iodpropanol in NMM (N-Methylmorpholin/Wasser/2-Propanol, 2/49/49, V/V/V)(dreimal)
behandelt werden, mit 10 μl
NMM gewaschen werden (dreimal), und die alkylierten T-terminierten
Primerverlängerungsprodukte
vom Träger
durch Behandeln mit DTT wie in BEISPIEL 1 beschrieben abgespalten
werden. Eine Analyse von massemodifizierten Fragmentfamilien wird
entweder durch ES- oder MALDI-Massenspektrometrie durchgeführt.
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BEISPIEL 18
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Analyse einer Mischung
von Oligothymidylsäuren
-
Oligothymidylsäure, oligo-p(dT)12-18 ist kommerziell erhältlich (United States Biochemicals,
Cleveland, OH). Im Allgemeinen wurde eine 0,5 M Matrixlösung in
Ethanol hergestellt. Verschiedene Matrizen wurden für dieses
Beispiel und die Beispiele 19–21
verwendet, wie z. B. 3,5-Dihydrobenzoesäure, Sinapinsäure, 3-Hydroxypicolinsäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon.
Oligonukleotide wurden nach Reinigung durch HPLC lyophilisiert und
in ultrareines Wasser aufgenommen (MilliQ, Millipore), wobei solche
Mengen verwendet wurden, dass eine Konzentration von 10 pmol/μl als Stammlösung erhalten
wurde. Ein Aliquot (1 μl)
dieser Konzentration oder eine Verdünnung in ultrareinem Wasser
wurde mit 1 μl
der Matrixlösung
auf einer flachen Metalloberfläche
gemischt, die als Sondenspitze diente, und mit einem Ventilator
mit kalter Luft getrocknet. In einigen Experimenten wurden Kationenaustauschkügelchen
in Säureform
zu der Mischung aus der Matrix- und Probelösung hinzugefügt.
-
MALDI-TOF-Spektren
wurden in diesem Beispiel und den Beispielen 19–21 auf verschiedenen kommerziellen
Instrumenten erhalten, wie z. B. Vision 2000 (Finnigan-MAT), VG
TofSpec (Fisons Instruments), LaserTec Research (Vestec). Die Bedingungen
in diesem Beispiel waren der lineare Negativionenmodus mit einer
Beschleunigungsspannung von 25 kV. Das erzeugte MALDI-TOF-Spektrum
wird in 14 gezeigt. Eine Massekalibrierung
wurde extern durchgeführt
und allgemein durch Verwendung definierter Peptide im geeigneten
Massebereich erzielt, wie z. B. durch Insulin, Gramicidin S, Trypsinogen,
Rinderserumalbumin und Cytochrom C. Alle Spektren wurden erzeugt,
indem ein Stickstofflaser mit 5-nsec-Pulsen bei einer Wellenlänge von
337 nm verwendet wurde. Die Laserenergie variierte zwischen 106 und 107 W/cm2. Um das Signal-Rauschverhältnis allgemein
zu verbessern, wurden die Intensitäten von 10 bis 30 Laserschüssen akkumuliert.
-
BEISPIEL 19
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Massenspektrometrische
Analyse eines 50mers und eines 99mers
-
Zwei
große
Oligonukleotide wurden durch Massenspektrometrie analysiert. Das
50mer d(TAACGGTCATTACGGCCATTGACTGTAGGACCTGCATTACATGACTAGCT) (SEQ
ID NO: 3) und dT(pdT)99 wurden verwendet.
Die Oligodesoxynukleotide wurden unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoamiditen
synthetisiert und unter Verwendung von veröffentlichten Verfahren gereinigt
(z. B. N. D. Sinha, J. Biernat, J. McManus und H. Köster, Nucleic
Acids Res. 12, 4539 (1984)), wobei kommerziell erhältliche DNS-Synthesizer
von entweder Millipore (Bedford, MA) oder Applied Biosystems (Foster
City, CA) und eine HPLC-Ausrüstung
und RP18-Umkehrphasensäulen von
Waters (Milford, MA) verwendet wurden. Die Proben für die massenspektrometrische
Analyse wurden wie in Beispiel 18 beschrieben hergestellt. Die Bedingungen, die
für die
MALDI-MS-Analyse für
jedes Oligonukleotid verwendet wurden, waren 500 fmol von jedem
Oligonukleotid, Reflektron-Positivionenmodus
mit einer Beschleunigung von 5 kV und Nachbeschleunigung von 20 kV.
Die erzeugten MALDI-TOF-Spektren wurden überlagert und sind in 15 gezeigt.
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BEISPIEL 20
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Simulation der DNS-Sequenzierungsergebnisse
aus 2
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Die
13 DNS-Sequenzen, die die verschachtelten dT-terminierten Fragmente
der DNS-Sequenzierung nach Sanger für das 50mer repräsentieren,
das in Beispiel 19 beschrieben ist (SEQ ID NO: 3), wurden wie in Beispiel
19 beschrieben synthetisiert. Die Proben wurden wie in Beispiel
18 beschrieben behandelt, und 500 fmol von jedem Fragment wurden
durch MALDI-MS analysiert, wie in Beispiel 18 beschrieben. Die resultierenden
MALDI-TOF-Spektren sind in den 16A–16M gezeigt. Die Bedingungen waren der Reflektron-Positivionenmodus
mit einer Beschleunigung von 5 kV und Nachbeschleunigung von 20
kV. Die berechneten molekularen Massen und die experimentellen molekularen
Massen sind in Tabelle 1 gezeigt.
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Die
MALDI-TOF-Spektren wurden überlagert
(17A und 17B),
um zu demonstrieren, dass die individuellen Peaks sogar zwischen
dem 10mer und 11mer (obere Tafel) und dem 37mer und 38mer (untere
Tafel) auflösbar
sind. Die zwei Tafeln zeigen zwei unterschiedliche Maßstäbe und die
in diesem Maßstab analysierten
Spektrum.
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BEISPIEL 21
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MALDI-MS-Analyse eines
massemodifizierten Oligonukleotids
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Ein
17mer wurde am C-5 von einer oder zwei Desoxyuridingruppen massemodifiziert.
5-[13-(2-Methoxyethoxyl)-tridecyn-1-yl)-5'-O-(4,4-dimethoxytrityl)-2'-desoxyuridin-3'-β-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoamidit
wurde verwendet, um die modifizierten 17mere unter Verwendung der
Verfahren wie in Beispiel 19 beschrieben zu synthetisieren.
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Die
modifizierten 17mere waren
wobei
X = -C≡C-(CH
2)
11-OH
(nichtmodifiziertes
17mer: molekulare Masse: 5273)
-
Die
Proben wurden wie in Beispiel 18 beschrieben behandelt, und 500
fmol von jedem modifizierten 17mer wurden durch MALDI-MS analysiert,
wie in Beispiel 18 beschrieben. Die Bedingungen waren der Reflektron-Positivionenmodus
mit einer Beschleunigung von 5 kV und Nachbeschleunigung von 20
kV. Die erzeugten MALDI-TOF-Spektren wurden überlagert und sind in 18 gezeigt.
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Alle
der oben zitierten Referenzen und Veröffentlichungen werden hiermit
durch die Referenz aufgenommen.
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