DE69434024T2

DE69434024T2 - Auf humanen cortikalen thymozyten exprimierte oberflächenproteine und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69434024T2
Application number: DE69434024T
Authority: DE
Inventors: Hoe Seong Kangnam-ku PARK; Mee Young Nowon-ku BAE
Original assignee: Park, Seong Hoe
Current assignee: Dinona Inc
Priority date: 1993-05-21
Filing date: 1994-05-21
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2014-05-22
Also published as: IL109717A0; KR0149048B1; JPH08510730A; EP0726914A1; US6225286B1; ZA943549B; DE69434024D1; JP2831852B2; WO1994028023A1; AU6761294A; EP0726914B1; US5641860A; US5942404A; ES2229218T3; US5879911A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Zell-Oberflächenprotein, das auf menschlichen corticalen Thymocyten und Tumorzellen exprimiert wird, die aus dem hematopoietischen System hervorgegangen sind, und seine Verwendung. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein neues einkettiges Polypeptidglycoprotein (nachstehend als „JL1" bezeichnet) welches ein Molekulargewicht von etwa 120.000 Dalton und die Teilsequenz: V(Valin)-L(Leucin)-P(Prolin)-S(Serin)-V(Valin)-F(Phenylalanin)-C(Cystein)-A(Alanin)-I(Isoleucin)-T(Threonin) hat und ausschließlich auf corticalen Thymocyten und auf malignen Zellen von T-lymphoblastischen Leukämie-, T-lymphoblastischen Lymphomzellen, wobei das Lymphom aus corticalen Thymocyten hervorgegangen ist, und auf malignen Zellen von ungefähr 50% aller Arten von Leukämie, die mittels immunohistochemischen und durchflusscytometrischen Analysen identifiziert werden, exprimiert wird, und seine diagnostische und klinische Anwendung bei Leukämie und T-lymphoblastischem Lymphom.
Der menschliche Körper zeigt spezifische Reaktionen auf fremde Substanzen, denen er nach der Geburt ausgesetzt wird, und T- und B-Lymphocyten und Antigen präsentierende Zellen sind an Immunantworten beteiligt, um den menschlichen Körper zu schützen. Lymphocyten sind der Hauptbestandteil der Lymphorgan-Zellen und haben eine wichtige Rolle in der spezifischen Immunantwort während der Zirkulation durch Blut und Lymphe. Die Hauptfunktion von B-Lymphocyten ist es Antikörper gegen fremde Stoffe zu erzeugen. T-Lymphocyten werden in zwei Arten eingeteilt, von denen eine die Aufgabe hat die spezifische Immunantwort zu unterstützen und die andere die Aufgabe hat Zellen zu töten, die mit Pathogenen infiziert sind. Die Aufgabe von Antigen präsentierenden Zellen ist es infizierende Antigene unspezifisch einzuhüllen und sie aufzubereiten indem sie sie in kleine Peptide zerschneiden und ihre Information T-Lymphocyten bereitstellen.
T-Zell-Entwicklung im Thymus bringt eine komplexe Reihe von Proliferations-, Differenzierungs- und Selektionsstadien mit sich. T-Zellen gehen aus hematopoietischen Stammzellen hervor, die in der embryonalen Leber und im postnatalen Knochenmark produziert werden. Sie wandern in den Thymus, differenzieren sich und werden reif und danach wandern sie in die Blutgefässe aus und werden zu reifen T-Zellen. Nach der Umlagerung des T-Zellrezeptor-Keimbahngens im Thymus exprimieren Thymocyten T-Zell-Rezeptorkomplexe auf ihren Zelloberflächen. Der Genumlagerungsprozess erfordert das enzymatische System einschließlich RAG-1 und RAG-2. Als Folge kann, im Zuge eines komplexen Vorgangs eine extrem hohe T-Zell-Rezeptorvielfalt erzeugt werden. Dennoch können nicht alle erzeugten T-Zellrezeptoren ihre entsprechenden Funktionen in der Peripherie ausführen. Zellen, die Antigene, die mittels des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I und Klasse II bereitgestellt werden, nicht erkennen können und Zellen, die eine starke Reaktion zu Eigenantigenen zeigen, werden entfernt. Diese Vorgänge nennt man positive beziehungsweise negative Selektion. T-Zellrezeptoren können ihre entsprechenden Funktionen ausführen, wenn sie ein fremdes Antigen erkennen, das auf der Zelloberfläche an ihr eigenes MHC-Molekül gebunden ist. Dieses Ausbildungsverfahren findet im Thymus statt.
T-Zellen exprimieren nicht nur T-Zellrezeptoren, sondern auch verschiedene Zelloberflächenproteine. Diese Proteine sind für die T-Zellfunktion auch von Bedeutung. Die meisten dieser T-Zelloberflächenproteine werden in einem breiten Bereich der T-Zell-Subpopulation exprimiert. Einige von ihnen werden jedoch nur in einem spezifischen Entwicklungsstadium exprimiert und diese Proteine können als T-Zelloberflächenmarker zur Bestimmung der T-Zellreifungsstadien verwendet werden. Hauptsächlich wurde das Klassifikationssystem von Renherz et. al. zur Bestimmung der Differenzierungsstadien der Thymocyten verwendet, in dem T-Zelloberflächenmoleküle als Marker verwendet werden. Gemäß dieser Klassifikation werden Thymocyten in (a) frühe Thymocyten, CD4^–/CD8^– doppelt negativ, (b) einfache Thymocyten, CD4⁺/CD8⁺ doppelt positiv und (c) reife Thymocyten, CD4⁺ oder CD8⁺ einfach positiv, klassifiziert. Frühe Thymocyten exprimieren CD7-, CD38- und CD71-Proteine. Sie sind die Zellen die neu im Thymus aus dem Knochenmark ankommen und sich aktiv teilen. Die Umlagerung der T-Zellrezeptorgene – TCRβ- findet in diesem Stadium statt. Einfache Thymocyten nehmen den größten Teil des Thymus ein und exprimieren CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8 und ähnliche, neu auf der Zelloberfläche und TCRα-Gene werden umgelagert. Danach exprimieren reife Thymocyten T-Zellrezeptoren auf den Zelloberflächen. Nur einige von ihnen können überleben und ins nächste Stadium übergehen, die meisten von ihnen sterben (Nikolis-Zugic, 1991, Immunol. Today, 12, 65–70). Die Zelloberflächen-Moleküle in T-Zellen und Thymocyten können zur Bestimmung der Differenzierungsstadien und zur Klassifikation der Subpopulationen verwendet werden. Außerdem können sie zur Diagnose und Behandlung von Tumoren verwendet werden, die aus T-Zellen hervorgegangen sind. Diese Zelloberflächenproteine spielen eine wichtige Rolle in Funktion und Entwicklung der T-Zellen.
Thymocyten sollten sterben, sofern der T-Zellrezeptor nicht passend ist. Der Tod ist nicht einfach ein passiver Tod, sondern ein aktiver Tod, der gewisse Proteine oder die Synthese von gewissen metabolischen Produkten benötigt (Rothenberg, 1990, Immunol. Today, 11, 116–119). Dieser Zelltod kann spezifische Stimulationssignale von außen benötigen. Die Zelloberfächenproteine können an dem Signalweg beteiligt sein. Die Identifizierung von Zelloberfächenproteinen war jedoch bis jetzt noch nicht möglich. Falls einfache Thymocyten die spezifischen Proteine zur Übertragung der Signale für die Selektion von T-Zellrezeptoren und programmierten Zelltod exprimieren, wären diese Proteine die inhärenten Proteine dieses Stadiums. Obwohl einige corticale Thymocyten-Antigene wie CD1a, b und c bekanntlich auf dem Kortex des Thymus exprimiert werden, werden sie auch auf verschiedenen Zellarten wie zum Beispiel dentritischen Zellen, Hirn-Astrocyten und B-Lymphocyten exprimiert.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Zelloberflächenprotein, exprimiert auf menschlichen corticalen Thymocyten und Tumorzellen, die aus dem hematopoietischen System hervorgegangen sind, welches ein einkettiges Polypeptidglycoprotein ist mit einem Molekulargewicht von etwa 120.000 Dalton, von dem eine Teilsequenz wie folgt ist: V(Valin)-L(Leucin)-P(Prolin)-S(Serin)-V(Valin)-F(Phenylalanin)-C(Cystein)-A(Alanin)-I(Isoleucin)-T(Threonin), bereitzustellen.
Ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es einen monoclonalen Antikörper bereitzustellen, der dieses Protein oder ein Fragment davon, umfassend dessen Antigen-Erkennungsstelle, erkennt.
Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es einen monoclonalen Antikörper bereitzustellen, der dieses Protein oder ein Fragment davon, umfassend dessen Antigen-Erkennungsstelle, erkennt um das Entwicklungsstadium von corticalen Thymocyten zu bestimmen und Tumore, die aus dem hämatopoietischen System hervorgegangen sind, zu diagnostizieren.
Ein vierter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es einen monoclonalen Antikörper bereitzustellen, der dieses Protein oder ein Fragment davon, umfassend dessen Antigen-Erkennungsstelle, erkennt und der Tumorzellen, die aus dem hämatopoietischen System hervorgegangen sind, tötet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Zelloberflächenprotein JL-1, exprimiert auf menschlichen corticalen Thymocyten, bereit. Das vorstehend erwähnte Zelloberflächenprotein ist ein einkettiges Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 120.000 Dalton.
Das Protein der vorliegenden Erfindung wird auf menschlichen corticalen Thymocyten exprimiert und wird auch auf T-lymphoblastischen Leukämie- und Lymphomzellen exprimiert, die aus menschlichen corticalen Thymocyten hervorgegangen sind, und auf Zellen von etwa 50% der verschiedenen Arten der Leukämie.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einen monoclonalen Antikörper bereit, der das Protein JL-1 erkennt. Er ist vorzugsweise aus dem menschlichen oder tierischen Körper hervorgegangen ist. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Teile des Antikörpers, einschließlich seiner Antigen-Erkennungsstelle(V_H und V_L), und hat so die Fähigkeit das Antigen spezifisch zu erkennen. Es kann auch ein Antikörperfragment wie F(ab')2, Fab und Fv beinhalten. Vorzugsweise umfasst das Antikörperfragment (Fv) ein einkettiges Polypeptid-Fragment des Antigens, ein sogenanntes einkettiges Fv, welches durch Einfügung eines Verbindungspeptids zwischen zwei Polypeptide, V_H und V_L, hergestellt wird, um seine Wärmebeständigkeit zu erhöhen. Der Antikörper oder das Fragment davon, wie vorstehend erwähnt, kann eine Markierungs-Substanz umfassen, die aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Radioisotopen, fluoreszierenden Substanzen und Färbesubstanzen besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend erwähnten Antikörpers oder Fragments davon bereit und stellt eine Zelle bereit, die den Antikörper oder das Fragment davon herstellt, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Zelle.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose von T-Zellen-Leukämie und T-lymphoblastischem Lymphom unter Verwendung des vorstehend erwähnten Antikörpers oder Fragments davon bereit.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel für die Behandlung von Leukämie und T-lymphoblastischem Lymphom unter Verwendung des vorstehend erwähnten Antikörpers oder Fragments davon bereit. Vorzugsweise beinhaltet das Antigen-Erkennungsmaterial ein toxisches Protein, das aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus Radioisotopen, toxischen Chemikalien, toxischen Proteinen und anti-Tumorwirkstoffen besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Arzneimittel zur Behandlung von Leukämie und T-lymphoblastischem Lymphom, das aus dem hämatopoietischem System hervorgegangen ist, mittels Gentherapie bereit, indem das JL-1-Protein als Zielsubstanz und ein Antikörper oder ein Fragment davon, der JL-1 als ,Zielverfolgungssubstanz' (guiding material) erkennt, verwendet wird.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung des JL-1-Proteins bereit, das die Schritte umfasst: (a) Herstellen eines Antikörpers durch die vorstehend erwähnte Züchtung einer Zelle und dessen Reinigung daraus; (b) Sammeln des Antikörpers, welcher ausschließlich mit menschlichen corticalen Thymocyten reagiert, durch in vitro immunhistochemische Färbung des Thymus mit dem in Schritt (a) gereinigten Antikörper; (c) Sammeln des Antikörpers, welcher nur mit dem Thymus reagiert, durch in vitro immonhistochemische Färbung von normalem menschlichem Gewebe mit dem in Schritt (b) gesammelten Antikörper; und (d) Identifizierung des Proteins, welches in Leukämie- Zellen und T-lymphoblastischem Lymphom exprimiert wird, durch immunhistochemische Färbung mit dem in Schritt (c)gesammelten Antikörper.
1 ist eine Fotographie der immunhistochemischen Färbung des Thymus durch den Überstand eines Hybridom-Clons, der den anti-JL-1-Antikörper produziert;
2 ist eine Fotographie einer 10% SDS-PAGE-Analyse des entstehenden Produkts und der Zwischenprodukte bei jedem Schritt des Reinigungsverfahrens des anti-JL-1-Antikörpers.
3 ist eine Fotographie der Expression von CD4- und CD8-Molekülen auf der Zelloberfläche von JL-1 positiven Thymocyten unter Verwendung von zweifarbigem FACS;
4 ist eine Fotographie einer 15% SDS-PAGE-Analyse des anti-JL-1-Antikörpers der bei pH-Werten von 3.5 und 3.8, für verschiedene Zeit mit Pepsin verdaut wurde;
5 ist eine Fotographie einer 15% SDS-PAGE-Analyse des anti-JL-1-Antikörpers, der mit Papain verdaut wurde; und
6 ist eine Fotographie einer SDS-PAGE-Analyse des JL-1 Proteins, welches mit anti-JL-1 Antikörper konjugierten Perlen nach einer Radioisotop-Markierung der Thymocyten immunpräzipitiert wurde.
Die folgenden spezifischen Beispiele biologisch aktiver Polypeptide sind darstellend für die vorliegende Erfindung, aber sie sollen in keinem Fall als einschränkend für die vorliegende Erfindung betrachtet werden.
Beispiel 1
Um ein spezifisches Zelloberflächenprotein auf normalen Thymocyten zu entdecken, wurden nach dem folgenden Beispiel menschliche Thymocyten an Balb/c-Mäuse verabreicht um Antikörper gegen menschliche Thymocyten herzustellen.
10⁷ menschliche Thymocyten wurden intraperitoneal verabreicht und Balb/c-Mäuse wurden für sechs Wochen in zweiwöchigen Intervallen damit immunisiert. Die Milz der Balb/c-Mäuse wurde 3 Tage nach der letzten Verabreichung entfernt, um eine Milzzellen-Suspension herzustellen. Monoclonale Antikörper wurden erzeugt, indem die Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit menschlichen Thymocyten immunisiert wurden, mit SP2/0-Ag14-Mausmyelomzellen, die resistent gegen 9-Azaguanin sind, fusioniert wurden. Das Zellfusions-Verfahren folgte dem Köhler und Milstein-Verfahren (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256, 495–497). 10⁸ Milzzellen wurden mit 10⁷ Myelomzellen unter Verwendung von 50% Polyethylenglycol 4000 fusioniert. Die Zellen wurden gewaschen und in DEAE-Medium, das 20% Rinderserumalbumin, 100 μM Hypoxanthin, 0.44 μM Aminopterin und 16 μM Thymidin (HAT-Medium) enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden in vier Platten mit 96 Vertiefungen überimpft und bei 37°C in einem Inkubator unter Bereitstellung von 5% CO₂ gezüchtet. Wenn sich nach zwei Wochen Kolonien gebildet hatten, wurde der Überstand erzeugt und die Reaktivität des Antikörpers wurde unter Verwendung eines enzymverbundenen Enzymadsorptionstests (ELISA) und von Durchflusscytometrie bestimmt.
Die Vertiefung, die mehr als 10⁵ Zellen pro Vertiefung enthielt, wurde als positive Gruppe gewertet. Die Zellen wurden aus der Vertiefung, die hochreaktive Antikörper enthielt, entnommen und 0.5 Zellen pro Vertiefung wurden mittels limitierendem Verdünnungstest subcloniert, um einen stabilen Hybridomclon mit hoher Reaktivität des Antikörpers, herzustellen. Dieser Hybridomclon sonderte Antikörper in das Medium ab und der Überstand wurde für die nächsten Schritte aufbewahrt.
Beispiel 2
Um unter den in Beispiel 1 erzeugten Hybridomclonen einen Clon zu finden, der Antikörper absondert, die die spezifischen Zelloberflächenantigene auf corticalen Thymocyten erkennen, wurde unter Verwendung des Überstands des Hybridomclons, der in Beispiel 1 erzeugt wurde, eine Immunperoxidase-Färbung an einer 4 μm dicken Schicht von frischem Gewebe und von in Paraffin eingebettetem Gewebe gemäß des Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Fäbeverfahrens mittels der Bindung von Avidin mit Biotin auf einem Objektträger, durchgeführt. Der Überstand von monoclonalen Zellen wurde als primärer Antikörper verwendet. Das in Paraffin eingebettete Gewebe wurde mit normalem Mäuseserum behandelt und für 1 Stunde stehen gelassen um unspezifische Hintergrundsfärbung nach Entfernung des Paraffins zu verhindern. Nach der Zugabe eines primären Antikörpers wurde es über Nacht stehen gelassen und dreimal mit PBS gewaschen. Biotinyliertes Ziege-anti-Maus-Immunglobulin, das als sekundärer Antikörper verwendet wurde, wurde zugesetzt. Es wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen und dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Dann wurden Streptavidin und Meerrettich-Peroxidase-Konjugat hinzugefügt. Der ABC-Kit, der von Burlingame hergestellt wurde, wurde zur Färbung verwendet. H₂O₂-Aminoethyl-Carbazol-Lösung wurde hinzugefügt und es wurde dann nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten, dreimal mit PBS gewaschen. Nach Abdeckung mit Deckglas und 80% Glyceringelatine wurde es unter dem Lichtmikroskop betrachtet.
Hybridomclonlinien, die spezifische Antikörper für menschliche corticale Thymocyten erzeugten, wurden ausgewählt. Einer der Clone, dessen Antikörper nur corticale Thymocyten erkannte, wurde als H-JL1 bezeichnet. Das vom anti-JL1-Antikörper erkannte Antigen wurde als JL1 und der monoclonale Antikörper als anti-JL1-Antikörper bezeichnet. 1 ist eine Fotographie der immunhistochemischen Färbe-Analyse des Thymus mit dem Überstand des Hybridomclons, der anti-JL1-Antikörper erzeugt. Wie in 1 gezeigt wird, ist nur der corticale Thymus positiv und die meisten der corticalen Thymocyten sind positiv gefärbt. Die Zelloberfläche der corticalen Thymocyten war stark angefärbt, was darauf hindeutet, dass das Antigen, das vom anti-JL1-Antikörper erkannt wird, ein Zelloberflächenantigen ist. Thymocyten aus dem Nebennierenmark wurden mit dem anti-JL1-Antikörper nicht angefärbt. Das beweist, dass JL1 ein Antigen ist, das spezifisch für corticale Thymocyten ist.
Beispiel 3
Asciten wurden aufbereite, um eine hohe Konzentration des Antikörpers zu erhalten, der von dem Hybridom abgesondert wurde, welches anti-JL-1-Antikörper absondert. Drei Wochen, nachdem 0,5 ml Pristan intraperitoneal an Balb/c Mäuse verabreicht worden war, wurden 10⁷ H-JL-1 Hybridomclone verabreicht, die in DMEM gezüchtet wurden, das 10% Rinderserumalbumin enthielt. Nach 2 bis 3 Wochen wurden die Ascites geerntet. Die Konzentration an Antikörper beträgt dann 5 bis 10 mg/ml. Nur die Immunglobuline die auf menschliche Thymocyten reagierten, wurden gereinigt, da es im Ascites viele kontaminierende Proteine wie Albumin gibt. Q-Sepharose-Chromatographie und Hydroxyapatit (Bio-gel HTP Gel, hergestellt von Pharmacia)-Chromatographie wurden durchgeführt, um Antikörper aus Ascites zu reinigen, der einen hohen Anteil an Antikörpern enthält, und von Balb/c-Mäusen erhalten wurden, denen monoclonale anti-HJL-1-Hybridomzellen intraperitoneal verabreicht wurden.
3,14 g Ammoniumsulfat pro 10 ml Ascitesflüssigkeit wurden auf Eis langsam hinzugefügt (mit 50% (NH₄)₂SO₄) ausgefällt). Das Gemisch wurde bei 15.000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert, in deionisiertem Wasser resuspendiert und in 1 Liter Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 7,4) dialysiert. Die Lösung wurde durch eine vorher mit Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 7,4) äquilibrierte Q-Sepharose-Säule laufen gelassen und daran adsorbiert, und dann wurde nochmals Pufferlösung durch die Säule geschickt, um freie Proteine von der Säule zu entfernen. Danach wurde das an die Säule gebundene Protein mittels eines linearen Gradienten von 0 M bis 0,8 M NaCl unter Verwendung der Pufferlösung I (20 mM Phosphat, pH-Wert 7,4) und Pufferlösung II (20 mM Phosphat und 0,5 M NaCl, pH 7,4) eluiert. Jede Fraktion wurde einer SDS-PAGE Elektrophorese unterzogen und die den anti-JL-1-Antikörper enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt.
Die Fraktionen wurden dann dialysiert und durch eine vorher mit Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 6,8) äquilibrierte Hydroxyapatit-Säule laufen gelassen. Die Fraktion (20 mM Phosphat, pH 6,8), die durch die Säule geschickt wurde, um freie Proteine zu entfernen, wurde mittels eines linearen Gradienten von 0 bis 0.3 M Phosphat unter Verwendung der Pufferlösung III (20 mM Phosphat, pH 6,8) und Pufferlösung IV (300 mM Phosphat, pH 6,8) eluiert. Jede Fraktion wurde einer SDS-PAGE unterzogen und die Fraktionen, die mehr als 95% anti-JL-1-Antikörper enthielten, wurden gesammelt. Die gesammelten anti-JL-1-Antikörper wurden gegen geeignete Pufferlösungen dialysiert und aufbewahrt. Von 1 mg Ascites wurden durch wiederholte Versuchsausführungen 5 bis 10 mg anti-JL-1-Antikörper hergestellt.
Die Elektrophoresen des Zwischenprodukts und des Endprodukts in 10% SDS-PAGE werden in 2 gezeigt. Die erste Spur ist Ascites, die zweite Spur die Präcipitate durch 50% Ammoniumsulfat vor der Q-Sepharose-Chromatographie und die dritte und vierte Spur sind einige der eluierten Fraktionen der an die Q-Sepharose-Säule gebundenen Proteine, die fünfte Spur ist die Fraktion, die von den Fraktionen gesammelt wurde, die viele anti-JL-1-Antikörper unter den Fraktionen der Q-Sepharose-Chromatographie vor der Hydroxyapatit-Säulen-Chromatographie hatten, und die sechste, siebte, achte, neunte, zehnte und elfte Spur sind einige der eluierten Fraktionen der an die Hydroxyapatit-Säule gebunden Proteine.
Beispiel 4
Das vorliegende Beispiel wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 gereinigten anti-JL-1-Antikörpers als primären Antikörper gemäß dem immunochemischen Test von Beispiel 2 durchgeführt, um festzustellen, ob das JL-1-Antigen in normalem Gewebe außer im Thymus exprimiert wird. Die nachstehende Tabelle I zeigt die Verteilung des JL-1-Antigens in jedem Gewebe. Außer Thymocyten war keines der anderen Gewebe einschließlich peripherem Lymphgewebe, Zerebellum, Pankreasgewebe, Eierstock und Hoden, Haut, Lunge, Nebenniere und Niere nach der Färbung positiv. Dieses Ergebnis bestätigt, dass JL-1 ein Antigen ist, das spezifisch für corticale Thymocyten ist.
TABELLE I
Beispiel 5
Beispiel 2 und Beispiel 4 zeigen, dass das JL-1-Antigen nur auf corticalen Thymocyten exprimiert wurde. In diesem Beispiel wurde das JL-1-Antigen auf normalen Zellen und auf malignen hematopoietischen Zellen mittels Durchflusscytometrie-Analyse untersucht. 1 × 10⁶ Zellen wurden in ein Falcon-Röhrchen gegeben und bei 1.500 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, und der Niederschlag von 1 × 10⁶ Zellen pro 100 μl wurde in PBS suspendiert. 100 μl der Suspension wurden in Test-Röhrchen verteilt und 100 μl der anti-JL-1-Antikörper-Lösung, die 1 μg des gereinigten anti-JL-1-Antikörpers enthielt, wurde hinzugefügt und vermischt. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei 4°C umgesetzt, für 5 Minuten bei 1.500 UpM zentrifugiert, und der Niederschlag zweimal mit PBS gewaschen, um den Antikörper zu entfernen, der nicht reagiert hatte. Der Niederschlag wurde in 50 μl der Lösung suspendiert, die den verdünnten sekundären Antikörper (FITC konjugierten Ziege-anti-Maus-Ig, hergestellt von Zymed) enthielt, und in der Dunkelkammer für 30 Minuten bei 4°C umgesetzt. 150 μl PBS wurden hinzugefügt, zentrifugiert und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Nach der Zentrifugation wurden schließlich 200 μl PBS zum Niederschlag zugefügt. Der Anteil an positiven Zellen und die Intensität der Färbung wurden mittels Durchflusscytometrie (FACSscan, hergestellt und verkauft von Becton-Dickinson) analysiert. Direkt mit FITC (Fluoreszenz-Isothiocyanat) oder PE (Phytoerythrin) verbundene Antikörper wurden als anti-JL-1-Antikörper verwendet. In diesem Fall ist es nicht notwendig den sekundären Antikörper für die Fluoreszenz zu verwenden. Das Ergebnis wird in Tabelle II gezeigt.
Die nachstehende Tabelle II zeigt die Expression des JL-1-Antigens auf der Zelloberfläche von normalen Zellen, normalen Milzzellen, Knochenmarkszellen, PBMC (periphere mononucleäre Blutzellen), aktivierten PBMC, die in Medium gezüchtet wurden, das 10 μg/ml PHA (Phytohämaglutinin), 3 μg/ml PWM (Mitogen der Kermesbeere) und 0,5 μg/ml anti-CD3-Antikörper enthielt. Davon reagierten alle negativ mit dem JL-1-Antikörper. Eine positive Antwort zeigte sich nur auf Thymocyten und 80–90% der Zellen vor und nach der Geburt exprimierten das JL-1-Antigen. Das bedeutet, dass das JL-1-Antigen bewiesenermaßen ein Antigen ist, das, wie schon vorher in Beispiel 4 gezeigt wurde, spezifisch für Thymocyten ist.
TABELLE II
Beispiel 6
JL-1-positive Zellen wurden unter Verwendung eines JL-1 Antikörpers gereinigt, und eine Zweifarben-FACS-Analyse wurde unter Verwendung eines anti-DC4-Antikörpers und eines anti-CD8-Antikörpers durchgeführt, um zu bestimmen, wann das JL-1-Antigen während der Thymusontogenese exprimiert wird. Das Analyseverfahren ist gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt worden, indem ein FITC konjugierter anti-CD4-Antikörper, als anti-CD4-Antikörper und ein PE konjugierter anti-CD8-Antikörper, als anti-CD8-Antikörper verwendet wurde. 3 ist das Ergebnis einer Zweifarben-FACS-Analyse, die die Expression von CD4 und CD8 auf JL-1-positiven Thymocyten zeigt, die mittels der Panning-Methode gereinigt wurden. Es wurde nachgewiesen, dass mehr als 99% der JL-1-positiven Zellen zweifach-positive CD4- und CD8-Zellen waren. Das heißt, dass JL-1-positive Zellen normalen Thymocyten waren.
Die Marker-Analyse, die den anti-JL-1-Antikörper verwendet, zeigt mittels Durchlusscytometrie eine Zelloberflächenexpression des JL-1-Antigens auf Leukämiezellen. B-Lymphocyten, Monocyten und Tumorzellen, die aus Myelocyten hervorgegangen sind, waren negativ für das JL-1-Antigen. T-Lymphocyten, die aus normalen Thymocyten hervorgegangen sind, waren positiv für das JL-1-Antigen und andere T-lymphocytäre Tumorzellen waren negativ. Wie man in Tabelle III sehen kann, waren jedoch leukämische Zellen von 50–60% von verschiedenen Arten von Leukämiepatienten, positiv für das JL-1-Antigen (Tabelle III). Das JL-1-Antigen und der anti-JL-1-Antikörper könnten daher starke diagnostische und therapeutische Werkzeuge für verschiedene Arten von Leukämie und T-lymphoblastischem Lymphom sein.
TABELLE III
Beispiel 7
Das vorliegende Beispiel wurde durchgeführt, um zu zeigen, dass die spezifische immunhistochemische Färbung des Thymus in Beispiel 4 und die spezifische Fluoreszenzfärbung von Tumorzellen, die aus Thymocyten in Beispiel 5 und aus dem hematopoietischem System in Beispiel 6 hervorgegangen sind, ein Resultat der spezifischen Bindung durch die Antigenerkennungsregion (V_H + V_L) des anti-JL-1-Antikörpers ist und nicht das der Bindung durch den Fc-Rezeptor auf der Oberfläche von Tumorzellen, die aus corticalen Thymocyten hervorgegangen sind. Um das Ziel dieses Beispiels zu erfüllen wurde die Fc-Region des Antikörpers mittels Protease entfernt, das F(ab')₂-Fragment und das Fab-Fragment wurden gereinigt und es wurde eine immunhistochemische Färbung des Thymus und eine Durchflusscytometrie von Thymocyten durchgeführt. Im Allgemeinen wurden, wenn der Antikörper einer Balb/c-Maus vom IgG1-Typ ist und mit Papain behandelt wurde ein etwa 50 KDa Fab-Fragment und Fc-Fragment hergestellt und wenn mit Pepsin behandelt wurde, wurde etwa 102 KDa F(ab')2 hergestellt und das Fc-Fragment wurde in kleine Fragmente verdaut.
10 mg des anti-JL-1-Antikörpers wurden in deionisiertem Wasser aufgelöst und in 1 Liter Pufferlösung (0,1 M Citrat, pH 3,5) dialysiert, um F(ab')₂ des anti-JL-1-Antikörpers herzustellen. 0,1 bis 0,2 mg Pepsin, hergestellt und verkauft von Sigma, wurden zu der Lösung hinzugefügt, und das Ausmaß des Verdaus wurde nach einer Reaktion bei 31°C festgestellt, wobei die Lösung nach ausreichender Reaktion durch Zugabe von 1/10 Volumen an Pufferlösung neutralisiert wurde, um den Verdau der Proteine durch Pepsin zu beenden. Die Lösung wurde in Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 8,0) dialysiert, auf Q-Sepharose-Säule, die zuvor mit Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 8,0 äquilibriert worden war, aufgetragen, und dann wurde die Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 8,0) durch die Säule laufen gelassen, um freie Proteine zu entfernen, und dann mit einem Gradienten von 0 M bis 0,5 M NaCl unter Verwendung der Pufferlösung I (20 mM Phosphat, PH 8,0) und der Pufferlösung II (20 mM Phosphat und 0,5 M NaCl, pH 8,0) eluiert. Jede Fraktion wurde einer SDS-PAGE unterzogen, um die Fraktionen, die das F(ab')₂-Fragment enthielten, zu sammeln. Das gesammelte F(ab')₂-Fragment wurde in der entsprechenden Pufferlösung dialysiert und aufbewahrt.
4 ist das Ergebnis einer Elektrophorese des anti-JL-1-Antikörpers, der mit Pepsin bei 37°C in Pufferlösungen (0,1 M Citrat) bei einem pH-Wert von 3,5 und 3,8 für verschiedene Zeiten verdaut wurde. Die erste bis fünfte Spur sind bei pH 3,5 für 0, 0,5, 1, 2 und 4 Stunden, die sechste bis zehnte Spur sind bei pH 3,8 für 0, 0,5, 1, 2 und 4 Stunden und die elfte Spur sind Standardproteine mit bekannten Molekulargewichten. Die oberen dicken Banden der ersten und sechsten Spur sind anti-JL-1-Antikörper und die dicke Bande unter der anti-JL-1-Antikörperbande der zweiten bis fünften Spur und der siebten bis zehnten Spur sind das F(ab')₂-Fragment mit einem Molekulargewicht von 102 KDa.
10 mg des anti-JL-1-Antikörpers wurden in 5 ml Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 7 bis 8) aufgelöst und in 1 Liter Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 7 bis 8) dialysiert, um Fab des anti-JL-1-Antikörpers herzustellen. Cystein und EDTA wurden zu der Lösung zugegeben, um eine 15 mM und 1 mM Lösung zu ergeben, 0,2 mg Papain, hergestellt und verkauft von Boehringer Mannheim, wurden zu der Lösung zugefügt, und das Ausmaß des Verdaus wurde nach einer Reaktion bei 37°C festgestellt. Die Lösung wurde nach ausreichender Reaktion durch Zugabe von 1/10 Volumen von 1 M Iodoacetamid neutralisiert, um den Verdau der Proteine durch Papain zu beenden. Das Fab-Fragment wurde entsprechend dem Verfahren zur Herstellung von F(ab')₂ gereinigt. Das auf diese Weise gewonnene Fragment wurde in der entsprechenden Pufferlösung dialysiert und aufbewahrt.
5 ist das Ergebnis einer Elektrophorese des anti-JL-1-Antikörpers, der in einer Pufferlösung (20 mM Phosphat, pH 7,0) mit Papain bei 37°C für verschiedene Zeiten verdaut wurde. Die erste bis fünfte Spur ist für 0, 0,5, 1, 2, und 6 Stunden, die sechste Spur sind Standardproteine mit Molekulargewichten von 116, 85, 53, 39, 27 bzw. 14 KDa von oben gesehen. Die obere dicke Bande der ersten Spur war anti-JL-1-Antikörper und die dicke Bande zwischen 53 KDa und 39 KDa der Standardproteine war das Fab-Fragment mit einem Molekulargewicht von 50 KDa.
Das F(ab')₂-Fragment und das Fab-Fragment, die auf diese Weise gereinigt wurden, wurden gemäß Beispiel 4 immunhistochemisch zur Färbung des Thymus verwendet, und eine positive Reaktion wurde beobachtet. Das JL-1-Antigen von Tumorzellen, die aus Thymocyten und Cortex-Thymocyten hervorgegangen sind, wurde mittels Durchflusscytometrie gemäß der Verfahren von Beispiel 5 und Beispiel 6 beobachtet und zeigte, wie in Beispiel 5 und Beispiel 6, eine positive Reaktion. Das heißt, dass die Erkennung von Zellen, die JL-1 auf der Zelloberfläche exprimieren, durch den anti-JL-1-Antikörper aufgrund der spezifischen Erkennung durch die Antigenerkennungsregion des anti-JL-1-Antikörpers, stattfindet und nicht aufgrund der nichtspezifischen Bindung des anti-JL-1-Antikörpers durch den Fc-Rezeptor auf der Oberfläche von Tumorzellen, die aus Cortex-Thymocyten hervorgegangen sind, über die Fc-Region. Ein anti-JL-1-Antikörperfragment, das eine Antigenerkennungstelle hat, ist bei der Erkennung des JL-1-Antigens genauso nützlich wie der anti-JL-1-Antikörper.
Beispiel 8
Die folgenden in-vitro-Tests wurden durchgeführt, um die Möglichkeit der Verwendung des Antikörpers gegen das JL-1-Protein zur Behandlung von Leukämien und Lymphomen zu untersuchen. Der anti-JL-1-Antikörper in RPMI-Medium, das 30% vereinigtes menschliches Serum der Blutgruppe AB ohne Komplement-Inaktivierung enthielt, wurde zu 5 × 10⁵ T-lymphoblastischen Leukämiezellen/ml zugegeben, für 12 Stunden gezüchtet und die Überlebensfähigkeit der Tumorzellen unter der Verwendung von Tryphanblaufärbung wurde beobachtet. Dieses Ergebnis weist stark darauf hin, dass Tumorzellen getötet werden können, wenn Antikörper gegen das JL-1-Protein an Leukämiezellen verabreicht wird. Die Tötung von Tumorzellen durch den anti-JL-1-Antikörper wird durch Zelllyse vermittelt, die entweder vom Komplementsystem oder vom Fc-Teil des Antikörpers abhängig ist. Dieser Vorgang wird als Ergebnis von komplement vermittelter Lyse betrachtet.
Beispiel 9
Immunpäcipitation und SDS-PAGE wurden durchgeführt, um die biochemischen Charakteristika des JL-1-Proteins zu untersuchen. 1 × 10⁷ mit PBS (Phosphat-Pufferlösung) gewaschene menschliche Thymocyten oder Molt-4-Tumorzellen wurden in 100 ml PBS suspendiert. 5 μl Lactoperoxidase und 250 μCi Na¹²⁵I wurden zugefügt, H₂O₂ wurde zugefügt 3 Minuten umgesetzt, und der Ansatz wurde mit PBS gewaschen. Zellen, deren Zelloberfläche mit ¹²⁵I markiert war, wurden in Lysepufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Gew./vol. Nonident P-40 and 1 mM PMSF) suspendiert, um 1 × 10⁷ Zellen pro 1 ml zu erhalten, und bei 4°C für 30 Minuten geschüttelt. Das Lysat wurde bei 3.000 UpM für 7 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde zurückbehalten und der Niederschlag verworfen. Der Überstand des Lysats wurde mit 20 μl Protein-A-Sepharose CL-4B-Perlen, hergestellt von BioRad, für 2 Stunden umgesetzt und dann mit Protein-A-Sepharose-Perlen, die mit Kaninchen-anti-Maus Ig konjugiert waren, umgesetzt, um nichtspezifisches Material vorab zu entfernen. Das verbleibende Lysat wurde mit 20 μl Kaninchen-anti-Maus Ig-Protein-A-Sepharose-Perlen, die mit anti-JL-1-Antikörper konjugiert waren, für mehr als 12 Stunden umgesetzt. Das Präzipitat wurde in Elektrophorese-Pufferlösung (0,125 M Tris HCl, pH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerin und 1% β-Merkaptoethanol) für 10 Minuten gekocht, um das Antigen zu eluieren, und einer SDS-Page unterzogen, um die gewünschte Proteinbande zu finden. Ein 8% Acrylamid-Gel wurde für die Elektrophorese verwendet, danach wurde das Gel getrocknet und Hyperfilm-MP, hergestellt von Amersham, zur Autoradiographie bei –70°C für 1 Tag exponiert.
6 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse des JL-1-Proteins, das nachdem die Thymocyten mit Radioisotopen markiert worden waren, immunopräzipitiert wurde. Die erste Spur war eine Elektrophorese des JL-1-Proteins, hergestellt mittels Immunopräzipitation des Thymocytenlysats, unter nicht-reduzierenden Bedingungen und die zweite Spur war eine Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen. Eine Bande mit einem Molekulargewicht von 120.000 Dalton trat sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf. Das heißt, dass das JL-1-Protein eine einzelne Polypeptidkette enthält. Außerdem wanderte die Bande unter reduzierenden Bedingungen langsam, was darauf hindeutet, dass eine Disulfidbindung im Protein enthalten ist. Eine Elektophorese-Analyse nach der Behandlung des JL-1-Proteins mit Endoglycosidase-F resultierte in einer schnelleren Migration des Proteins, was darauf hindeutet, dass JL-1 ein Glycoprotein ist. Folglich ist das JL-1-Protein ein Glycoprotein, das eine einfache Polypeptidkette und ein Molekulargewicht von 120.000 Dalton hat. CD1a, CD1b und CD1c waren als Proteine bekannt, die nur auf corticalen Thymocyten während der T-Zell-Entwicklung exprimiert werden. CD1a ist jedoch ein Heterodimer, das aus einem Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 49.000 Dalton und aus einem Polypeptid, das als β2m bezeichnet wird und ein Molekulargewicht von 12.000 Dalton hat, besteht. CD1b ist ein Protein, das aus Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von 45.000 Dalton und β2m besteht, und CD1c ist ein Protein, das aus Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von 43.000 Dalton und β2m besteht. Diese Proteine sind jedoch anders als das Protein der vorliegenden Erfindung. Weiters tritt CD1a auf der Zelloberfläche von dentritischen Hautzellen, Langerhanszellen und Gehirn-Astrocyten auf, und CD1b tritt auf der Zelloberfläche von dentritischen Hautzellen, Gehirn-Astrocyten und B-Lymphocyten auf, und CD 1 c tritt auf dentritischen Hautzellen und B-Lymphocyten auf. Die Reinigung des JL-1-Moleküls wurde unter Verwendung einer Affinitätssäule, die aus Konjugation von 100 μg gereinigtem anti-JL-1-Antikörper an Sepharose-Perlen hergestellt wurde, durchgeführt. Ungefähr 20 μg des Antigens wurden durch Kochen der Perlen mit PAGE-Proben-Puffer gesammelt. Dieses Protein wurde mit Trypsin verdaut und eine repräsentative Fraktion wurde unter Verwendung einer HPLC ausgewählt. Die Sequenzierung wurde nach dem Edman-Degradations-Verfahren durchgeführt, die Sequenzen waren wie folgend. V(Valin)-L(Leucin)-P(Prolin)-S(Serin)-V(Valin)-F(Phenylalanin)-C(Cystein)-A(Alanin)-I(Isoleucin)-T(Threonin). Das JL-1-Protein und der anti-JL-1-Antikörper sind daher für Diagnose und Behandlung von Leukämie und T-lymphoblastischen Lymphomzellen sehr gut verwendbar.
Das JL-1-Protein der vorliegenden Erfindung ist für die Diagnose von lymphoblastischem T-Zell-Lymphom und T-Zell-Leukämie verwendbar, durch die Bestimmung ob das JL-1-Protein nach der Untersuchung von Gewebe oder der Untersuchung von peripherem Blut exprimiert wird, da das Thymocyten-spezifische Protein JL-1 nicht in normalem Gewebe oder aktiviertem peripherem Blut mit der Ausnahme von Thymocyten gefunden wird. In Paraffin eingebettetes Gewebe wird für die Diagnose von Tumoren verwendet. Ein Antikörper gegen unreife T-Zellen, der mit solchem Paraffin-eingebetteten Gewebe reagiert, wurde allerdings bis jetzt noch nicht gefunden. JL-1 ist in Paraffin-eingebettetem Gewebe stabil, sodass es für die Diagnose von Tumoren verwendbar ist. Der Antikörper oder Ligand der vorliegenden Erfindung ist verwendbar für die Behandlung von lymphoblastischem T-Zell-Lymphom und T-Zell-Leukämie, bei denen JL-1 exprimiert wird. Das vorliegende Antigen kann als Zielmaterial für Gen-Therapie verwendet werden, da es auf normalem Gewebe nicht exprimiert wird.
Die vorstehend erwähnte Beschreibung von beispielhaften Ausführungsformen biologisch aktiver Polypeptide ist illustrativ für die vorliegende Erfindung. Wegen der Variationen, die für den Fachmann offensichtlich sein werden, ist es jedoch nicht beabsichtigt die vorliegende Erfindung auf die einzelnen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen zu beschränken. Der Geltungsbereich der Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche definiert.

Claims

Zelloberflächenprotein, exprimiert auf menschlichen corticalen Thymocyten und Tumorzellen, die aus dem hematopoietischen System hervorgegangen sind, welches ein einkettiges Polypeptidglycoprotein ist mit einem Molekulargewicht von etwa 120.000 Dalton, von dem eine Teilsequenz wie folgt ist: V(Valin)-L(Leucin)-P(Prolin)-S(Serin)-V(Valin)-F(Phenylalanin)-C(Cystein)-A(Alanin)-I(Isoleucin)-T(Threonin).
Zelloberflächenprotein nach Anspruch 1, wobei das Protein auf leukämischen Zellen von 50% der Leukämiepatienten exprimiert ist.
Zelloberflächenprotein nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein auf T-lymphoblastischen Lymphomzellen exprimiert ist, die aus menschlichen corticalen Thymocyten hervorgegangen sind.
Monoclonaler Antikörper, der das Protein nach Anspruch 1 oder ein Fragment davon, umfassend dessen Antigen-Erkennungsstelle, erkennt.
Antikörperfragment nach Anspruch 4, umfassend die variable Region einer schweren Kette (V_H) und die variable Region einer leichten Kette (V_L) des Antikörpers nach Anspruch 4.
Antikörperfragment nach Anspruch 5, wobei die variable Region der schweren Kette (V_H) und die variable Region der leichten Kette (V_L) miteinander durch ein Peptid verknüpft sind.
Antikörperfragment nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Fragment ein toxisches Protein enthält.
Antikörperfragment nach Anspruch 7, wobei das Fragment und das toxische Protein verbunden sind zur Bildung eines Fusionsproteins.
Antikörperfragment nach Anspruch 8, wobei das Fusionsprotein die Struktur und antigene Spezifität des Antikörperfragmentes nach Anspruch 5 besitzt.
Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei der Antikörper oder das Fragment aus einem menschlichen oder tierischen Körper stammt.
Zelle zur Herstellung des Antikörpers nach Anspruch 4 oder des Antikörperfragmentes nach Anspruch 5 oder 6.
Antikörper oder Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder 10, wobei der Antikörper oder das Fragment einen Marker umfasst.
Antikörper oder Fragment nach Anspruch 12, wobei der Marker ein Radioisotop, fluoreszierendes Material oder anfärbbares Material ist.
In vitro-Verfahren zur Bestimmung des Entwicklungsstadiums von corticalen Thymocyten unter Verwendung von Materialien nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder 10.
In vitro-Verfahren zur Diagnose von leukämischen Zellen unter Verwendung von Materialien nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder 10.
In vitro-Verfahren zur Diagnose von Lymphomzellen unter Verwendung von Materialien nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder 10.
Arzneimittel, umfassend den Antikörper oder das Fragment nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder 10.
Arzneimittel nach Anspruch 17, wobei der Antikörper oder das Fragment für Zellen toxisches Material umfasst.
Arzneimittel nach Anspruch 18, wobei das toxische Material eine toxische Verbindung, ein toxisches Protein, ein Radioisotop oder ein Antitumor-Mittel ist.
Arzneimittel nach einem der Ansprüche 17 bis 19 zur Behandlung von Leukämie und T-lymphoblastischem Lymphom.
Verfahren zur Identifizierung des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) Herstellen eines Antikörpers durch Züchten der Zelllinie nach Anspruch 11 und dessen Reinigung daraus; (b) Sammeln des Antikörpers, welcher mit corticalen Thymocyten reagiert, durch in vitro immunchemische Färbung des Thymus mit dem in Schritt (a) hergestellten Antikörper; (c) Sammeln des Antikörpers, welcher nur mit Thymus reagiert, durch in vitro immunchemische Färbung von normalem menschlichem Gewebe mit dem Antikörper, der in Schritt (b) gesammelt wurde; und (d) Identifizieren des Proteins, welches in leukämischen Zellen und T-lymphoblastischem Lymphom exprimiert wird mit dem in Schritt (c) gesammelten Antikörper.